FI105099B - Menetelmä biologisesti aktiivisen nisäkkään kasvainkuoliotekijäreseptoriproteiinin valmistamiseksi ja tätä koodittava DNA-sekvenssi - Google Patents

Description

105099

Menetelmä biologisesti aktiivisen nisäkkän kasvain-kuolio teki järesep tor iproteiinin valmistamiseksi ja tätä koodittava DNA-sekvenssi 5 Ristiviite liittyviin hakemuksiin Tämä patenttihakemus on osittaista jatkoa US-pa-tenttihakemukseen sarjanro 421 417, joka jätettiin 13. lokakuuta 1989 ja on nyt käsiteltävänä ja joka on osittaista jatkoa US-patenttihakemukseen sarjanro 405 370, 10 joka jätettiin 11. syyskuuta 1989 ja on nyt hylätty ja joka on osittaista jatkoa US-patenttihakemukseen sarjanro 403 241, joka jätettiin 5. syyskuuta 1989 ja on nyt hylätty .

Keksinnön tausta 15 Esillä oleva keksintö koskee yleisesti sytokiini- reseptoreita ja spesifisemmin kasvainkuoliotekijäesepto-reita.

Kasvainkuoliotekijä-α (TNF-a, tunnetaan myös kakek-tiinina) ja kasvainkuoliotekijä-β (TNF-β, tunnetaan myös 20 lymfotoksiinina) ovat homologisia nisäkkään endogeenisiä erittyviä proteiineja, jotka kykenevät indusoimaan laajan valikoiman vaikutuksia suuressa lukumäärässä solutyyppejä. Suurien samankaltaisuuksien johdosta näiden kahden syto-kiinin rakenteellisissa ja funktionaalisissa ominaisuuk- '1' 25 sissa niitä kutsutaan yhteisnimellä "TNF". Komplementaa risia cDNA-klooneja, jotka koodittavat TNF-a:aa (Pennica et ai. . Nature 312 (1984) 724) ja TNF-S:aa (Gray et. ai, . Nature 312 (1984) 721), on eristetty, mikä mahdollistaa TNF:n rakenteellisten ja biologisten ominaisuuksien lisä-30 karakterisoinnin.

: TNF-proteiinit käynnistävät biologisen vaikutuk sensa soluihin sitoutumalla spesifisiin TNF-reseptori-(TNF-R-) proteiineihin, jotka ilmentyvät TNF .-lie respon-siivisen solun plasmamembraanilla. TNF-α:n ja TNF-S:n 35 osoitettiin ensin sitoutuvan yhteiseen reseptoriin ihmisen kohdunkaulasyöpäsolulinjassa ME-180 (Aggarwal et ai. .

• 2 105099

Nature 318 (1985) 665). Arviot TNF-R:n koosta, joita määritettiin affiniteettileimaustutkimuksilla, vaihtelivat 54:stä 175 kDariin (Creasey et ai., Proc. Natl.Acad.Sei. USA 84 (1987) 3293, Stauber et ai. , J.Biol.Chem. 263 5 (1988) 19098; Hohmann et ai., J.Biol.Chem. 264 (1989) 14927). Vaikka näiden kahden TNF-R:n, joiden molekyylipai-no on erilainen, keskinäinen suhde on epäselvä, Hohmann et ai. (J♦Biol.Chem. 264 (1989) 14927) raportoivat, että ainakin kahta erilaista solupintareseptoria TNF:lie esiintyy 10 erilaisilla solutyypeillä. Näiden reseptorien näennäinen molekyylipaino on noin 80 kDa:ta ja vastaavasti noin 55 -60 kDa:ta. Missään edeltävistä julkaisuista ei kuitenkaan ole raportoitu solupinta-TNF-reseptorien puhdistamista homogeenisiksi.

15 Solupintareseptorien TNF:lie lisäksi on niinikään

ihmisen virtsasta identifioitu liukoisia proteiineja, jotka kykenevät sitoutumaan TNF:ään (Peetre et ai♦, Eur.-J.Haematol. 41 (1988) 414; Seckinger et ai., J.Exp.Med. 167 ( 1988) 1511; Seckinger et ai., J.Biol.Chem. 264 (1989) 20 11966; UK-patenttihakemus julkaisunro 2 218 101 A

Seckingerille et ai.; Engelmann et ai., J.Biol.Chem. 264 (1989) 11974). Liukoisen virtsaperäisen TNF:ää sitovan proteiinin, joka julkistetaan julkaisussa UK 2 218 101 A, osittainen N-pään aminohapposekvenssi on Asp-Ser-Val-Cys-. 25 Pro-, joka vastaa osittaista sekvenssiä, jonka julkistivat myöhemmin Engelmann et ai. (1989). Edeltävien liukoisten virtsaperäisten sitoutumisproteiinien keskinäistä suhdetta selvitettiin edelleen tämän hakemuksen alkuperäisen kanta-hakemuksen (US-sarjanro 403 241), jättämisen jälkeen, kun 30 Engelmann et ai. raportoivat identifioineensa ja puhdista-“ neensa toisen erillisen liukoisen virtsaperäisen TNF:ään sitoutuvan proteiinin, jonka N-pään aminohapposekvenssi on Val-Ala-Phe-Thr-Pro- (J.Biol.Chem. 265 (1990) 1531). UK-julkaisussa 2 218 101 A ja Engelmannin et ai. julkaisussa 35 julkaistujen kahden virtsaperäisen proteiinin osoitettiin 3 105099 olevan immuunikemiallisesti sukua kahdelle ilmeisesti erilliselle solupintaproteiinille sitoutumisproteiinien vastaisen vastaseerumin kyvystä inhiboida TNF:n sitoutumista tiettyihin soluihin.

5 Sittemmin kaksi erillistä ryhmää raportoivat ihmi sen 55 kDa:n TNF-R:n molekyylitason kloonauksesta ja ilmentämisestä (Loetscher et ai., Cell. 61 (1990) 351;

Schall et ai., Cell 61 (1990) 361). Kummankin ryhmän TNF-R:llä on N-pääaminohapposekvenssi, joka vastaa julkaisuis-10 sa UK 2 218 101 A, Engelmann et ai. (1989) ja Engelmann et ai. (1990) julkistetun virtsaperäisen sitoutumisproteiinin osittaista aminohapposekvenssiä.

TNF-R:n moninaisten muotojen ja liukoisten virtsa-peräisten TNF:ään sitoutuvien proteiinien välisen suhteen 15 selvittämiseksi tai TNF-R:ien rakenteellisten ja biologisten ominaisuuksien sekä roolin, joka TNF-R:illä on erilaisten solupopulaatioiden vasteissa TNF:lle tai muulle sytokiinistimulaatiolle, tutkimiseksi, tai TNF-R:ien tehokkaaksi käyttämiseksi terapiassa, diagnoosissa tai mää-20 rityksissä tarvitaan puhdistettuja TNF-R-koostumuksia. Kuitenkin tällaisia koostumuksia voidaan saada käytännöllisinä saantoina vain kloonaamalla ja ilmentämällä reseptoreita koodittavia geenejä yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttäen. Yrityksiä TNF-R-molekyylin puhdistamiseksi käy-25 tettäväksi biokemiallisessa analyysissä tai TNF-R:ää koo-dittavien nisäkäsgeenien kloonaamiseksi ja ilmentämiseksi on kuitenkin haitannut sopivan lähteen reseptoriproteii-nille tai mRNA:lle puuttuminen. Ennen esillä olevaa keksintöä minkään solulinjan ei tiedetty ilmentävän korkeita 30 TNF-R-tasoja konstitutiivisesti ja jatkuvasti, mikä sulki V pois reseptorin puhdistamisen sekventoitavaksi tai geeni- kirjastojen rakentamisen cDNA:n kloonausta silmällä pitäen .

4 105099

Yhteenveto keksinnöstä

Esillä oleva keksintö antaa käyttöön eristettyjä TNF-reseptoreita ja DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat nisäkkään kasvainkuoliotekijäreseptoreita (TNF-R), etenkin 5 ihmisen TNF-R:iä. Tällaisiin DNA-sekvensseihin kuuluu (a) cDNA-klooneja, joiden nukleotidisekvenssi on saatu natii-vin TNF-R-geenin koodialueelta; (b) DNA-sekvenssejä, jotka kykenevät hybridisoitumaan cDNA-klooneihin (a):sta keskimääräisen ankarissa olosuhteissa ja jotka koodittavat bio-10 logisesti aktiivisia TNF-R-molekyylejä; tai (c) DNA-sekvenssejä, jotka ovat degeneroituneet tuloksena geneettisestä koodista (a):ssa ja (b):ssä määriteltyihin DNA-sek-vensseihin nähden ja jotka koodittavat biologisesti aktiivisia TNF-R-molekyylejä. Erityisesti esillä oleva keksintö 15 antaa käyttöön DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat liukoisia TNF-reseptoreita.

Esillä oleva keksintö antaa niinikään käyttöön yh-distelmä-DNA-ilmennysvektoreita, jotka käsittävät edellä määriteltyjä DNA-sekvenssejä, yhdistelmä-DNA-TNF-R-mole-20 kyylejä, jotka on tuotettu käyttäen yhdistelmä-DNA-ilmen-nysvektoreita, sekä menetelmiä yhdistelmä-DNA-TNF-R-mole-kyylien tuottamiseksi käyttäen ilmennysvektoreita.

Esillä oleva keksintö antaa samoin käyttöön eristettyjä tai puhdistettuja proteiinikoostumuksia, jotka .· 25 käsittävät TNF-R:ää, ja etenkin TNF-R:n liukoisia muotoja.

Esillä oleva keksintö antaa samoin käyttöön koostumuksia käytettäviksi TNF-R-terapiassa, -diagnoosissa, -määrityksissä, tai TNF-R:n vastaisten vasta-aineiden tuotannossa, jotka käsittävät tehokkaita määriä liukoisia 30 natiiveja (reseptoriproteiineja) tai yhdistelmä-DNA-resep-toriproteiineja, jotka on valmistettu edeltävillä menetelmillä.

TNF:n kyvyn johdosta spesifisesti sitoa TNF-reseptoreita (TNF-R:iä) puhdistetut TNF-R-koostumukset ovat 35 käyttökelpoisia TNF:n diagnostisissa määrityksissä sekä , 105099

O

tuotettaessa TNF-reseptorin vastaisia vasta-aineita käytettäviksi diagnoosissa ja terapiassa. Lisäksi puhdistettuja TNF-reseptorikoostumuksia voidaan käyttää suoraan terapiassa TNF:n sitomiseksi tai sieppaamiseksi, jolloin 5 saadaan keino säädellä tämän sytokiinin immuuniaktiivi-suuksia.

Esillä olevan keksinnön nämä ja muut näkökohdat tulevat ilmeisiksi tutustuttaessa seuraavaan yksityiskohtaiseen kuvaukseen.

10 Suppea kuvaus piirroksista

Kuvio 1 on kaaviollinen esitys erilaisten humaa ni- ja hiiri-TNF-R:iä koodittavien cDNA-sekvenssien koo-dialueesta. Johtosekvenssi on vivoviivoitettu ja transmem-braanialue on umpinainen.

15 Kuviot 2-3 esittävät humaani-TNF-R-klooni-1:n osit taista cDNA-sekvenssiä ja siitä pääteltyä aminohapposekvenssiä. Nukleotidit on numeroitu alkaen 5'-ei-luetusta alueesta. Aminohapot on numeroitu signaalipeptidisekvens-sin alusta. Oletettua signaalipeptidisekvenssiä edustavat 20 aminohapot -2 - -1. Kypsän TNF-R-proteiinin N-pääleusiini on alleviivattu asemassa 1. Ennustettu transmembraanialue aminohapot 236 - 265 on samoin alleviivattu. Erilaisten liukoisten TNF-R:ien C-päät on merkitty nuolella (pysty-nuoli ).

.· 25 Kuviot 4-6 esittävät cDNA-sekvenssiä ja siitä pääteltyä aminohapposekvenssiä hiiri-TNF-R-klooni-11:lie. Oletettua signaalipeptidisekvenssiä esittävät aminohapot -22 - -1. Kypsän TNF-R-proteiinin N-päävaliini on alleviivattu asemassa 1. Ennustettu transmembraanialue aminohapot 30 234 - 265 on samoin alleviivattu.

·' Yksityiskohtainen kuvaus keksinnöstä Määritelmiä Tässä käytettynä ilmaisuilla "TNF-reseptori" ja "TNF-R" tarkoitetaan proteiineja, joilla on aminohappo-35 sekvenssejä, jotka ovat oleellisesti samankaltaisia kuin 6 105099 natiivin nisäkäs-TNF-reseptorin aminohapposekvenssit, ja jotka ovat biologisesti aktiivisia alla määritellyn mukaisesti sikäli, että ne kykenevät sitoutumaan TNF-molekyy-leihin tai transdusoimaan biologisen signaalin, jonka on 5 käynnistänyt TNF-molekyylin sitoutuminen soluun, tai ris-tireagoimaan anti-TNF-R-vasta-aineiden kanssa, jotka on tuotettu vastaan TNF-R:ää luonnollisista (eli ei-yhdis-telmä-DNA-) lähteistä. Kypsä täysimittainen ihmisen TNF-R on glykoproteiini, jonka molekyylipaino on noin 80 kilo-10 daltonia (kDa). Kuten kautta koko selityksen käytetään, ilmaisulla "kypsä" tarkoitetaan proteiinia, joka on ilmennetty muodossa, josta puuttuu johtosekvenssi, joka voi esiintyä natiivin geenin täysimittaisissa kopioissa. Kokeet, joissa käytettiin COS-soluja, jotka oli transfektoi-15 tu täysimittaista ihmisen TNF-R:ää koodattavalla cDNA:lla, osoittivat, että TNF-R sitoi 125I-TNF-a: aa näennäisen Ka:n ollessa noin 5 x 109 M'1, ja että TNF-R sitoi 125I-TNF-B:aa näennäisen Ka:n ollessa noin 2 χ 109 M'1. Ilmaisujen "TNF-reseptori" tai "TNF-R" piiriin kuuluvat mainittuihin kui-20 tenkaan rajoittumatta natiivien proteiinien analogit tai alayksiköt, joissa on ainakin 20 aminohappoa, ja jotka osoittavat ainakin jotain TNF-R:n kanssa yhteistä biologista aktiivisuutta, esimerkiksi liukoiset TNF-R-raken-teet, joista puuttuu transmembraanialue (ja jotka eritty-.· 25 vät solusta), mutta joilla on tallella kyky sitoa TNF:ää.

Erilaisia bioekvivalentteja proteiini- ja aminohappoanalo-geja kuvataan yksityiskohtaisesti alla.

Tässä käytetty TNF-R-analogien nimeämistapa seuraa tapaa, jonka mukaan proteiini (esim. TNF-R) nimetään si-30 ten, että sitä edeltää joko hu (ihmis-) tai mu (hiiri-), V. ja seuraa delta (osoittamaan deleetion) sekä C-pääamino- hapon luku. Esimerkiksi hu-TNF-R-delta-235:11a tarkoitetaan ihmisen TNF-R:ää, jossa on Asp235 C-pään aminohappona (eli polypeptidi, jonka aminohapposekvenssi · on 1 - 235 35 kuviossa 2). Merkinnän ihmis- tai hiirilajista puuttuessa 7 105099 TNF-R viittaa geneerisesti nisäkäs-TNF-R:aan. Vastaavasti minkään spesifisen merkinnän puuttuessa deleetiomutanteis-ta ilmaisulla TNF-R tarkoitetaan kaikkia TNF-R:n muotoja, mukaan lukien mutantit ja analogit, joilla on TNF-R:n bio-5 logista aktiivisuutta.

Esillä olevan keksinnön yhteydessä käytettyinä "liukoisella TNF-R:llä" tai "sTNF-R:llä" tarkoitetaan proteiineja, tai oleellisesti samanarvoisia analogeja, joiden aminohapposekvenssi vastaa kokonaisuudessaan tai 10 osittain natiivin TNF-R:n solunulkoista aluetta, esimer kiksi hu-TNF-R-delta-235, hu-TNF-R-delta-185 ja hu-TNF-R-delta-163, tai aminohapposekvenssejä, jotka ovat oleellisesti samanlaisia sekvensseihin aminohapot 1 - 163, aminohapot 1 - 185, tai aminohapot 1-235 kuviossa 2 nähden, 15 ja jotka ovat biologisesti aktiivisia sikäli, että ne si toutuvat TNF-ligandiin. Samanarvoisiin liukoisiin TNF-R:iin kuuluu polypeptidejä, jotka poikkeavat näistä sekvensseistä yhdellä tai useammalla substituutiolla, delee-tiolla tai additiolla, ja joilla on tallella kyky sitoutua 20 TNF:ään tai inhiboida TNF-signaalitransduktioaktiivisuus solupintaan sitoutuneiden TNF-reseptoriproteiinien välityksellä, esimerkiksi hu-TNF-R-delta-x, jossa x valitaan ryhmästä, jonka muodostavat mitkä tahansa aminohapoista 163 - 235 kuviossa 2. Analogisia deleetioita voidaan tehdä .· 25 TNF-R:ään. TNF-signaalitransduktioaktiivisuuden inhibitio voidaan määrittää transfektoimalla soluja yhdistelmä-DNA-TNF-R-DNA-sekvensseilläyhdistelmä-DNA-reseptori-ilmennyk-sen saamiseksi. Sitten solut saatetaan kosketuksiin TNF:n kanssa ja saatuja metabolisia vaikutuksia tutkitaan. Jos 30 saadaan vaikutus, jonka voidaan katsoa johtuvan ligandin *.! toiminnasta, yhdistelmä-DNA-reseptorilla on signaalitrans- duktioaktiivisuutta. Esimerkkimenettelyitä sen määrittämiseksi, onko polypeptidillä signaalitransduktioaktiivisuut-ta, julkistavat Idzerda et a.,· J.Exp.fried. 171·(1990) 861; 35 Curtis et ai., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86 (1989) 3045; 8 105099

Prywes et ai., EMBO J. 5 (1986) 2179; ja Chou et ai., J♦Biol.Chem. 262 (1987) 1842. Vaihtoehtoisesti voitaisiin myös käyttää primaarisia soluja tai solulinjoja, jotka ilmentävät endogeenisen TNF-reseptorin ja joilla on todet-5 tava biologinen vaste TNF:lie.

Ilmaisulla "eristetty" tai "puhdistettu" käytettynä tämän selityksen yhteydessä TNF-R-proteiinin tai -proteii-nikoostumusten puhtauden määrittelemiseksi tarkoitetaan, että proteiini tai proteiinikoostumus ei oleellisesti si-10 säliä muita alkuperältään luonnollisia tai endogeenisiä proteiineja ja sisältää alle noin 1 paino-%:n tuotantomenetelmistä jääneitä proteiiniepäpuhtauksia. Tällaiset koostumukset voivat kuitenkin sisältää muita proteiineja, jotka on lisätty stabiloimisaineiksi, kantajiksi, täy-15 teaineiksi tai yhteisterapia-aineiksi. TNF-R on eristetty, jos se voidaan todeta yksittäisenä proteiininauhana po-lyakryyliamidigeelissä hopeavärjäyksellä.

Ilmaisulla "oleellisesti samanlainen" käytettynä joko aminohappo- tai nukleiinihapposekvenssien määritte-20 lemiseksi tarkoitetaan, että nimenomainen kohdesekvenssi, esimerkiksi mutanttisekvenssi, poikkeaa viitesekvenssistä yhdellä tai useammalla substituutiolla, deleetiolla tai additiolla, jolloin summavaikutus tästä on TNF-R-proteiinin biologisen aktiivisuuden säilyttäminen, joka voidaan .· 25 määrittää esimerkiksi jollain alla esimerkissä 1 esite tyistä TNF-R-sitoutumismäärityksistä. Vaihtoehtoisesti nukleiinihappoalayksiköt ja -analogit ovat "oleellisesti samanlaisia" kuin spesifiset tässä julkistetut DNA-sek-venssit, jos: (a) DNA-sekvenssi on saatu natiivin nisäkäs-30 TNF-R-geenin koodialueelta; (b) DNA-sekvenssi kykenee hyb-·· ridisoitumaan DNA-sekvensseihin (a):sta kohtuullisen anka rissa olosuhteissa (50 °C, 2x SSC), ja ne koodittavat biologisesti aktiivisia TNF-R-molekyylejä; tai DNA-sekvens-sit, jotka ovat degeneroituneet tuloksena geneettisestä 35 koodista (a):ssa tai (b):ssä määriteltyihin DNA-sekvens- 9 105099 seihin nähden ja jotka koodittavat biologisesti aktiivisia TNF-R-molekyylej ä.

Ilmaisulla "yhdistelmä-DNA" tarkoitetaan tässä käytettynä, että proteiini on saatu yhdistelmä-DNA- (esim.

5 mikrobi- tai nisäkäs-) ilmennyssysteemeistä. "Mikrobiaali-sella" tarkoitetaan yhdistelmä-DNA-proteiineja, jotka on valmistettu bakteeri- tai sieni- (esim. hiiva-) ilmennys-systeemeissä. Tuotteena "yhdistelmä-DNA-mikrobiaalinen" määrittelee proteiinin, joka on tuotettu mikrobi-ilmennys-10 systeemissä, ja joka oleellisesti ei sisällä natiiveja endogeenisiä aineita. Useimmissa bakteeriviljelmissä, esim. EL colissa, ilmennetty proteiini ei sisällä glykaa-nia. Hiivassa ilmennetyn proteiinin glykosylaatiokuvio mahdollisesti poikkeaa nisäkässoluissa ilmennetystä.

15 "Biologisesti aktiivisella" käytettynä kautta seli tyksen TNF-reseptorien ominaisuutena tarkoitetaan, että nimenomaisella molekyylillä on riittävän samanlainen aminohapposekvenssi tässä julkistettuihin esillä olevan keksinnön mukaisiin suoritusmuotoihin nähden, jotta se kyke-20 nee sitomaan todettavia määriä TNF:ää, välittämään TNF- stimulaatiota soluun, esimerkiksi hybridireseptoriraken-teen osana, tai ristireagoimaan anti-TNF-R-vasta-aineiden kanssa, jotka on tuotettu vastaan TNF-R:ää luonnollisista (eli ei-yhdistelmä-DNA-) lähteistä. Edullisesti esillä .· 25 olevan keksinnön piiriin kuuluvat biologisesti aktiiviset TNF-reseptorit kykenevät sitomaan enemmän kuin 0,1 nano-moolin (nmol) TNF:ää kohden nanomoolia reseptoria, ja edullisesti enemmän kuin 0,5 nanomoolia TNF:ää kohden nanomoolia reseptoria sitoutumisen vakiomäärityksissä (katso 30 alla).

"Eristetyllä DNA-sekvenssillä" tarkoitetaan DNA-polymeeriä erillisen fragmentin muodossa tai suuremman DNA-rakenteen osana, joka on saatu DNArsta, joka on eristetty ainakin kerran oleellisesti puhtaassa muodossa, eli 35 vapaana kontaminoivista endogeenisistä materiaaleista ja 10 105099 määränä tai pitoisuutena, joka mahdollistaa sekvenssin ja sen osanukleotidisekvenssien tunnistuksen, käsittelyn ja talteenoton tavanomaisilla biokemiallisilla menetelmillä, esimerkiksi kloonausvektoria käyttäen. Tällaiset sekvens-5 sit ovat edullisesti avoimen lukualueen muodossa, jota eivät katkaise sisäiset ei-luetut sekvenssit, tai intro-nit, joita tyypillisesti esiintyy eukaryoottisissa geeneissä. Genomi-DNA:ta, joka sisältää oleelliset sekvenssit, voitaisiin samoin käyttää koodisekvenssien lähteenä. 10 Sekvenssejä ei-luettua DNA:ta voi esiintyä 5'- tai 3'-suuntaan avoimesta lukualueesta, silloin kun ne eivät häiritse koodialueiden käsittelyä tai ilmennystä.

"Nukleotidisekvenssillä" tarkoitetaan deoksiribo-nukleotidien heteropolymeeriä. DNA-sekvenssejä, jotka 15 koodittavat tämän keksinnön käyttöön antamia proteiineja, voidaan koota cDNA-fragmenteista ja lyhyistä oligonukleo-tidiliittäjistä, tai sarjasta oligonukleotideja, synteettisen geenin saamiseksi, joka kyetään ilmentämään yhdis-telmä-DNA-kopiointiyksikössä.

20 TNF-R:ää koodattavien cDNA-sekvenssien eristäminen TNF-R:n koodisekvenssi saadaan eristämällä komplementaarinen DNA- (cDNA-) sekvenssi, joka koodittaa TNF-R:ää, yhdistelmä-cDNA- tai genomi-DNA-kirjastosta. cDNA-kirjasto rakennetaan edullisesti hankkimalla polyadeny-25 loitua mRNA:ta erityisestä solulinjasta, joka ilmentää nisäkäs-TNF-R:n, esimerkiksi ihmisen sidekudosmuodostusso-lulinjasta WI-26 VA4 (ATCC CCL 95.1) ja käyttämällä mRNArta templaattina kaksisäikeisen cDNA:n syntetisoimi-seksi. Kaksisäikeinen cDNA pakataan sitten yhdistelmä-DNA-30 vektoriin, joka viedään tarkoituksenmukaiseen E^_ coli !! -kantaan, jossa sitä lisäännytetään. Voidaan käyttää myös hiiri- tai muita nisäkässolulinjoja, jotka ilmentävät TNF-R:n. cDNA-kirjaston sisältämät TNF-R-sekvenssit voidaan tunnistaa helposti seulomalla kirjasto tarkoituksen-35 mukaisella nukleiinihappokoettimellä, joka kykenee hybri- ια 105099 disoitumaan TNF-R-cDNA:han. Vaihtoehtoisesti TNF-R-pro-teiineja koodittavia DNA-sekvenssejä voidaan koota liga-toimalla synteettisiä oligonukleotidialayksiköitä, jotka vastaavat kokonaisuudessaan tai osittain sekvenssiä ku-5 vioissa 2-3 tai kuvioissa 4-6, täydellisen koodisek-venssin saamiseksi.

Esillä olevan keksinnön mukaiset humaani-TNF-re-septori-cDNA:t eristettiin suoran ilmennyskloonauksen menetelmällä. cDNA-kirjasto rakennettiin eristämällä ensin 10 soluliman mRNArta ihmisen sidekudosmuodostussolulinjasta WI-26 VA4. Polyadenyloitu RNA eristettiin ja sitä käytettiin kaksisäikeisen cDNA:n valmistamiseksi. Puhdistetut cDNA-fragmentit ligatoitiin sitten pCAV/NOT-vektori-DNArhan, joka käyttää säätösekvenssejä, jotka on saatu 15 pDC201:stä (pMLSV-johdannainen, jota ovat aiemmin kuvanneet Cosman et ai., Nature 312 (1984) 768), SV40:stä ja sytomegalovirus-DNA:sta, joita kuvataan yksityiskohtaisesti alla esimerkissä 2. pCAV/NOT on talletettu talletuslaitokseen the American Type Culture Collection, jossa 20 sen hakunumero on ATCC 68014. Wl26-VA4-cDNA-fragmentteja sisältävät pCAV/NOT-vektorit transformoitiin coli -kantaan DH5-a. Transformantit maljoittamalla saatiin noin 800 pesäkettä maljaa kohden. Saadut pesäkkeet otettiin talteen ja kustakin poolista valmistettiin plasmidi-DNA, .· 25 joka transfektoitiin C0S-7-soluihin oleellisesti kuten kuvanneet Cosman et ai. (Nature 312 (1984) 768) ja Luthman et ai. (Nucl.Acids Res. 11 (1983) 1295). Biologisesti aktiivisia solupinta-TNF-reseptoreita ilmentävät transformantit tunnistettiin seulomalla niiden kyvyn suhteen sitoa 30 125I-TNF:ää. Tässä seulomislähestymistavassa transfektoituja V. COS-7-soluja inkuboitiin kasvualustassa, joka sisälsi 125I-TNF:ää, solut pestiin sitoutumatta jääneen leimatun TNF:n poistamiseksi ja soluyksikerrokset saatettiin kosketuksiin röntgenfilmin kanssa TNF-sitoutumispitoisuuksien 35 toteamiseksi kuten ovat julkistaneet Sims et ai., Science 12 105099 241 (1988) 585. Tällä tavalla todetut transfektantit näkyvät tummina kohtina vasten suhteellisen vaaleaa taustaa.

Käyttämällä tätä lähestymistapaa noin 240 000 cDNA:ta seulottiin noin 800 cDNArn pooleina, kunnes yhden 5 transfektanttipoolin määritys osoitti positiivisia kohtia TNF-sitoutumiselle. Jäädytettyä bakteerivarastokantaa tästä positiivisesta poolista kasvettiin viljelmänä ja maljoitettiin yksittäisten pesäkkeitten saamiseksi, joita seulottiin kunnes tunnistettiin yksittäinen klooni (kloo-10 ni-11), joka kykeni ohjaamaan pintaproteiinin synteesiä, jolla oli todettavaa TNF-sitoutumisaktiivisuutta. Edeltävällä menetelmällä eristetyn cDNA-klooni-11:n sekvenssi esitetään kuvioissa 4-6.

Lisää cDNA-klooneja voidaan eristää muiden nisäkäs-15 lajien cDNA-kirjestoista ristilajihybridisaatiolla. Hybri-disaatiossa käytettäväksi TNF-R:ää koodittava DNA voidaan leimata kovalenttisesti todettavalla aineella kuten fluoresoivalla ryhmällä, radioaktiivisella atomilla tai kemi-luminoivalla ryhmällä menetelmillä, jotka ovat alan ammat-20 tilaisille tuttuja. Tällaisia koettimia voitaisiin myös käyttää nimenomaisten tilojen in vitro -diagnoosissa.

Kuten useimpia nisäkäsgeenejä nisäkäs-TNF-resepto-reita koodittavat oletettavasti monieksonigeenit. Vaihtoehtoisten mRNA-rakenteiden, joiden voidaan katsoa synty-.· 25 vän kopioinnin jälkeisistä erilaisista mRNA-silmukoitumis- tapahtumista ja joilla on tässä patentoitavaksi vaadittujen cDNA-sekvenssien kanssa yhteisenä laajoja identtisyys-tai samanlaisuusalueita, katsotaam kuuluvan esillä olevan keksinnön piiriin.

30 Muita nisäkäs-TNF-R-cDNA-sekvenssejä eristetään käyttämällä tarkoituksenmukaista humaani-TNF-R-DNA-sek- venssiä koettimena nimenomaisen nisäkäs-cDNA-kirjaston seulomiseksi ristilajihybridisaatiolla.

13 105099

Proteiineja ja analogeja

Esillä oleva keksintö antaa käyttöön eristettyjä yhdistelmä-DNA-nisäkäs-TNF-R-polypeptidejä. Tämän keksinnön mukaiset eristetyt TNF-R-polypeptidit eivät oleelli-5 sesti sisällä muita alkuperältään luonnollisia tai endo-geenisiä kontaminoivia materiaaleja ja ne sisältävät vähemmän kuin noin 1 paino-%:n tuotantomenetelmistä jääneitä proteiiniepäpuhtauksia. Natiivit humaani-TNF-R-molekyylit otetaan talteen solulysaateista glykoproteiineina, joiden 10 näennäinen molekyylipaino SDS-PAGE:n mukaan on noin 80 kilodaltonia (kDa). Tämän keksinnön mukaisista TNF-R-polypeptideistä mahdollisesti puuttuu liittyvä natiivin kuvion mukainen glykosylaatio.

Esillä olevan keksinnön mukaiseen nisäkäs-TNF-R: ään 15 kuuluu esimerkiksi kädellis-, ihmis-, hiiri-, koira-, kissa-, nauta-, lammas-, hevos- ja sika-TNF-R. Nisäkäs-TNF-R:t voidaan saada ristilajihybridisaatiolla käyttäen yksi-säikeistä cDNA:ta, joka on saatu humaani-TNF-R-DNA-sek-venssistä, hybridisaatiokoettimena TNF-R-cDNA-sekvenssien 20 eristämiseksi nisäkäs-cDNA-kirjestoista.

Keksinnön piiriin kuuluviin TNF-R-johdannaisiin kuuluu myös primaarisen proteiinin erilaisia rakenteellisia muotoja, joilla on tallella biologinen aktiivisuus. Esimerkiksi ionisoituvien amino- ja karboksyyliryhmien ,· 25 läsnäolon johdosta TNF-R-:proteiini voi olla happamien tai emäksisten suolojen muodossa, tai se voi olla neutraalissa muodossa. Yksittäisiä aminohappotähteitä voidaan niinikään modifioida hapettamalla tai pelkistämällä.

Primaarista aminohapporakennetta voidaan modifioida 30 muodostamalla kovalenttisia tai aggregatiivisia konjugaat-teja muiden kemiallisten ryhmien, kuten glykosyyliryhmien, lipidien, fosfaatti-, asetyyliryhmien ja vastaavien kanssa, tai luomalla aminohapposekvenssimutantteja. Kovalenttisia johdannaisia valmistetaan liittämällä nimenomaisia 35 funktionaalisia ryhmiä TNF-R-aminohapposivuketjuihin tai • 14 105099 N- tai C-päähän. Muita tämän keksinnön piiriin kuuluvia TNF-R-johdannaisia ovat TNF-R:n tai sen fragmenttien ko-valenttiset tai aggregatiiviset konjugaatit muiden proteiinien tai polypeptidien kanssa, (jotka muodostetaan) 5 esimerkiksi syntetisoimalla yhdistelmä-DNA-viljelmässä N-pää- tai C-pääfuusioina. Esimerkiksi konjugoitu peptidi voi olla signaali- (tai johto-) polypeptidisekvenssi proteiinin N-pääalueella, joka luennan aikana tai luennan jälkeen ohjaa proteiinin siirtymistä sen synteesipaikasta 10 sen toimintapaikkaan solumembraanin tai -seinän sisä- tai ulkopuolella (esim. hiiva-a-tekijäjohtosekvenssi). TNF-R-proteiinifuusiot voivat käsittää peptidejä, jotka on lisätty helpottamaan TNF-R:n puhdistusta tai tunnistusta (esim. poly-His). TNF-reseptorin aminohapposekvenssi voi-15 daan myös liittää peptidiin Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-

Lys (DYKDDDDK) (Hopp et ai. , Bio/Technology 6 (1988) 1204). Viimemainittu sekvenssi on erittäin antigeeninen ja käsittää epitoopin, jota sitoo reversiibelisti spesifinen monoklonaalinen vasta-aine, mikä mahdollistaa ilmennetyn 20 yhdistelmä-DNA-proteiinin nopean määrityksen ja helpon puhdistuksen. Tätä sekvenssiä pilkkoo niinikään spesifisesti naudan limakalvon enterokinaasi tähteen kohdalta, joka seuraa välittömästi Asp-Lys-paria. Tällä peptidillä salvatut fuusioproteiinit voivat niinikään vastustaa so-25 lunsisäistä hajoamista colissa.

TNF-R-johdannaisia voidaan myös käyttää immunogee-neina, reagensseina reseptoripohjaisissa immuunimäärityk-sissä tai sitoutumisagentteina TNF:n tai muiden sitoutu-misligandien affiniteettipuhdistusmenettelyissä. TNF-R-30 johdannaisia voidaan myös saada käyttämällä ristikytke- " misaineita, kuten M-maleimidobentsoyylisukkiini-imidies- teriä ja N-hydroksisukkiini-imidiä, kysteiini- ja lysiini-tähteiden kohdalla. TNF-R-proteiinit voidaan samoin sitoa kovalenttisesti reaktiivisten sivuryhmien välityksellä 35 erilaisiin ei-liukoisiin substraatteihin, kuten syaanibro- 15 105099 midiaktivoidut, bisoksiraaniaktivoidut, karbonyylidi-imid-atsoliaktivoidut tai tosyyliaktivoidut agaroosirakenteet, tai adsorboimalla polyolefiinipintoihin (käyttäen tai käyttämättä glutaarialdehydiristikytkemistä). Kun TNF-R on 5 sitten sidottu substraattiin, sitä voidaan käyttää anti-TNF-R-vasta-aineiden tai TNF:n selektiiviseksi sitomiseksi (määritys- tai puhdistustarkoituksissa).

Esillä olevaan keksintöön kuuluu myös TNF-R, joka käsittää liittyvän natiivin kuvion mukaisen glykosylaation 10 tai ei käsitä sitä. Hiiva- tai -nisäkäsilmennyssysteemeis-sä, esim. COS-7-soluissa, ilmennetyllä TNF-R:llä voi olla samanlaiset tai lievästi erilaiset molekyylipaino ja gly-kosylaatiokuvio kuin natiiveilla molekyyleillä ilmennys-systeemistä riippuen. Ilmentämällä TNF-R-DNA:t bakteereis-15 sa kuten colissa saadaan ei-glykosyloituja molekyylejä. Nisäkäs-TNF-R:n funktionaalisia mutanttianalogeja, joissa on inaktivoituja N-glykosylaatiokeskuksia, voidaan tuottaa oligonukleotidisynteesillä ja ligatoimalla tai käyttäen paikkaohjatun mutatoinnin tekniikoita. Näitä analogipro-20 teiineja voidaan tuottaa homogeenisessa, pelkistetty hiilihydraatti -muodossa saannon ollessa hyvä hiivailmennys-systeemejä käyttäen. N-glykosylaatiokeskuksille eukaryoot-tisissa proteiineissa on karakteristista aminohappotrip-letti Asn-A1-Z, jossa Ax on mikä tahansa aminohappo paitsi ,· 25 Pro, ja Z on Ser tai Thr. Tässä sekvenssissä asparagiinis- ta saadaan sivuketjuaminoryhmä hiilihydraatin kovalentti-seksi kiinnittämiseksi. Tällainen keskus voidaan eliminoida substituoimalla toinen aminohappo Asn:n tai tähteen Z tilalle, deletoimalla Asn tai Z tai insertoimalla ei-Z-30 aminohappo Ax:n ja Z:n väliin, tai muu aminohappo kuin Asn I! Asn:n ja A^n väliin.

TNF-R-johdannaisia voidaan saada samoin mutatoimal-la TNF-R:ää tai sen alayksiköitä. TNF-R-mutantti tässä tarkoitetussa mielessä on TNF-R:ään nähden homologinen 35 polypeptidi, joka aminohapposekvenssiltään kuitenkin poik- 16 105099 keaa natiivista TNF-R:stä deleetion, insertion tai substituution vuoksi.

TNF-R-proteiinien bioekvivalenttisia analogeja voidaan rakentaa esimerkiksi tekemällä erilaisia tähteiden 5 tai sekvenssien substituutioita tai deletoimalla päässä sijaitsevia tai sisäisiä tähteitä tai sekvenssejä, jotka eivät ole biologiselle aktiivisuudelle välttämättömiä. Esimerkiksi kysteiinitähteet voidaan deletoida (esim. Cys178) tai korvata muilla aminohapoilla tarpeettomien tai 10 virhellisten molekyylinsisäisten disulfidisiltojen muodostuksen estämiseksi renaturoinnissa. Muihin lähestymistapoihin mutatoinnin suorittamiseksi kuuluu viereisten kak-siemäksisten aminohappotähteiden modifiointi ilmennyksen tehostamiseksi hiivasysteemeissä, joissa esiintyy KEX2-15 proteaasiaktiivisuutta. Yleisesti substituutiot tulisi tehdä konservatiivisesti; eli edullisimpia korvaavia aminohappoja ovat ne, jotka fysikokemiallisilta ominaisuuksiltaan muistuttavat korvattavan tähteen vastaavia. Samoin käytettäessä deleetio- tai insertiostrategiaa deleetion 20 tai insertion mahdollinen vaikutus biologiseen aktiivisuu teen tulisi ottaa huomioon. Oleellisesti samanlaiset poly-peptidisekvenssit edellä määritellyn mukaisesti käsittävät yleensä saman lukumäärän aminohapposekvenssejä, vaikka C-päätypistelmät liukoisten TNF-R:ien rakentamista silmäl- • 25 lä pitäen sisältävät harvempia aminohapposekvenssejä.

TNF-R:ien biologisen aktiivisuuden säilyttämiseksi delee-tioiden ja substituutioiden tuloksena saadaan edullisesti homologisia tai konservatiivisesti substituoituja sekvenssejä, mikä tarkoittaa, että tietty tähde on korvattu bio-30 logisesti samanlaisella tähteellä. Esimerkkejä konserva tiivisista substituutioista ovat yhden alifaattisen tähteen sijoittaminen toisen tilalle, kuten Ile, Vai, Leu tai Ala toistensa tilalle, tai substituutiot, joissa yksi polaarinen tähde sijoitetaan toisen tilalle, kuten keskenään 35 Lys ja Arg; Glu ja Asp; tai Gin ja Asn. Muitakin tällaisia • · 17 105099 konservatiivisia substituutioita, esimerkiksi hydrofobi-suusominaisuuksiltaan samanlaisten kokonaisten alueiden substituutiot, tunnetaan hyvin. Lisäksi nimenomaiset ami-nohappoerot ihmisen, hiiren ja muun nisäkkään TNF-R:ien 5 välillä viittaa toisiin konservatiivisiin substituutioihin, joita voidaan tehdä muuttamatta TNF-R:n oleellisia biologisia ominaisuuksia.

TNF-R-alayksiköitä voidaan rakentaa deletoimalla päässä sijaitsevia tai sisäisiä tähteitä tai sekvenssejä. 10 Erityisen edullisia sekvenssejä ovat ne, joissa TNF-R:n transmembraanialue ja solunsisäinen alue on deletoitu tai substituoitu hydrofiilisillä tähteillä reseptorin erityksen solukasvualustaan helpottamiseksi. Saatua proteiinia kutsutaan liukoiseksi TNF-R-molekyyliksi, jolla on tallel-15 la kykynsä sitoa TNF:ää. Erityisen edullinen liukoinen TNF-R-rakenne on TNF-R-delta-235 (aminohappojen 1 - 235 sekvenssi kuviossa 2), joka käsittää TNF-R:n solunulkoisen alueen kokonaisuudessaan päättyen Asp235:een välittömästi transmebraanialueen vieressä. Lisää aminohappoja voidaan 20 deletoida transmembraanialueelta säilyttäen TNF:ää sitova aktiivisuus. Esimerkiksi hu-TNF-R-delta-183:11a, joka käsittää aminohappojen 1 - 183 sekvenssin kuviossa 2, ja TNF-R-delta-163:11a, joka käsittää aminohappojen 1 - 163 sekvenssin kuviossa 2, on tallella kyky sitoa TNF-ligandi, / 25 mikä määritetään käyttäen alla esimerkissä 1 kuvattuja sitoutumismäärityksiä. TNF-R-delta-142:11a ei kuitenkaan ole tallella kykyä sitoa TNF-ligandia. Tämä viittaa siihen, että jompikumpi tai kumpikin tähde Cys157 ja Cys163 on välttämätön molekyylinsisäisen disulfidisillan muodostami-30 seksi TNF-R:n laskostamiseksi oikein. Cys178, joka deletoi-I! tiin ilman mitään ilmeistä kielteistä vaikutusta liukoisen TNF-R:n kykyyn sitoa TNF:ää, ei vaikuta välttämättömältä TNF-R:n laskostamiseksi oikein. Täten minkä tahansa delee-tion, joka on C-pään puolella Cys163:een nähden, voitaisiin 35 olettaa johtavan biologisesti aktiiviseen liukoiseen ’ · 18 105099 TNF-R:ään. Esillä oleva keksintö koskee tällaisia liukoisia TNF-R-rakenteita, jotka vastaavat kokonaisuudessaan tai osittain TNF-R:n solunulkoista aluetta päättyen mihin tahansa aminohappoon Cys163:n jälkeen. Muita C-päädeleetioi-5 ta, kuten TNF-R-delta-157, voidaan tehdä kätevästi leikkaamalla TNF-R-cDNA:ta tarkoituksenmukaisilla restrik-tioentsyymeillä ja tarvittaessa rakentamalla uudestaan spesifisiä sekvenssejä käyttäen synteettisiä oligonukleo-tidiliittäjiä. Saadut liukoiset TNF-R-rakenteet insertoi-10 daan sitten ja ilmennetään tarkoituksenmukaisissa ilmen-nysvektoreissa ja määritetään niiden kyky sitoa TNF:ää, kuten kuvataan esimerkissä 1. Biologisesti aktiiviset liukoiset TNF-R:t, jotka saadaan tällaisista rakenteista, katsotaan myös esillä olevan keksinnön piiriin kuuluviksi. 15 Mutaatioiden nukleotidisekvensseissä, jotka on ra kennettu analogi-TNF-R:n ilmentämiseksi, on luonnollisesti säilytettävä koodisekvenssien lukualuevaihe ja edullisesti ne eivät muodosta komplementaarisia alueita, jotka voisivat hybridisoitua tuottaen sekundaarisia mRNA-rakenteita, 20 kuten silmukoita tai hiussilmiä, joilla olisi kielteinen vaikutus reseptori-mRNA:n luentaan. Vaikka mutaatiokohta voidaan määrittää ennalta, ei ole tarpeen, että mutaation luonne sinänsä määritetään ennalta. Esimerkiksi optimiomi-naisuuksien valitsemiseksi mutanteille tietyssä kohdassa 25 voidaan suorittaa kohdekodonin satunnaismutatointi ja seuloa ilmennetyt TNF-R-mutantit halutun aktiivisuuden suhteen.

Kaikki mutaatiot TNF-R:ää koodittavassa nukleoti-disekvenssissä eivät ilmenny lopputuotteessa, esimerkiksi 30 nukleotidisubstituutioita voidaan tehdä ilmennyksen tehostamiseksi, ensisijaisesti sekundaaristen rakennesilmukoi-den välttämiseksi kopioidussa mRNA:ssa (katso EP-A-75 444A, joka sisällytetään tähän viitteeksi), tai kodo-nien saamiseksi, jotka valittu isäntä helpommin lukee, 19 105099 esim. hyvin tunnetut coli ensisijaisuuskodonit ilmennykseen colissa.

Mutaatioita voidaan tehdä nimenomaisiin kohtiin syntetisoimalla oligonukleotideja, jotka sisältävät mu-5 tanttisekvenssin, jota sivuavat restriktiokeskukset, jotka mahdollistavat fragmenttien ligatoinnin natiiviin sekvenssiin. Ligatoinnin jälkeen saatu uudelleenrakennettu sekvenssi koodittaa analogia, jossa on haluttu aminohappoin-sertio, -substituutio tai -deleetio.

10 Vaihtoehtoisesti oligonukleotidiohjattuja paikka- spesifisiä mutatointimenettelyjä voidaan käyttää muutetun geenin saamiseksi, jossa tiettyjä kodoneja on muutettu tarvittavan substituution, deleetion tai insertion mukaisesti. Esimerkkimenetelmiä edellä esitettyjen muutosten 15 tekemiseksi julkistavat Walder et ai. (Gene 42 (1986) 133); Bauer et ai. (Gene 37 (1985) 73); Craik (BioTechn-iques 1985:tammikuu 12 - 19); Smith et ai. ("Genetic Engineering: Principles and Methods", Plenum Press, 1981); ja US-patenttijulkaisuissa nrot 4 518 584 ja 4 737 462 jul-20 kistetaan sopivia tekniikoita, ja nämä sisällytetään tähän viitteiksi.

TNF-R:n sekä yksivalenssiset muodot että moniva-lenssiset muodot ovat käyttökelpoisia tämän keksinnön mukaisissa koostumuksissa ja menetelmissä. Monivalenssisissa 25 muodoissa on useita TNF-R-sitoutumiskohtia TNF-ligandille.

Esimerkiksi kaksivalenssinen liukoinen TNF-R voi koostua kahdesta peräkkäisestä toistosta aminohappoja 1 -235 kuviossa 2, joita erottaa liittosekvenssialue. Vaihtoehtoisia monivalenssisia muotoja voidaan niinikään ra-30 kentaa esimerkiksi kemiallisesti liittämällä TNF-R mihin tahansa kliinisesti hyväksyttävään kantomolekyyliin, polymeeriin, joka valitaan ryhmästä, jonka muodostavat Ficoll, polyetyleeniglykoli tai dekstraani, käyttäen tavanomaisia kytkemistekniikoita. Vaihtoehtoisesti TNF-R voidaan ke-35 miallisesti kytkeä biotiiniin, minkä jälkeen biotiini-TNF- 20 105099 R-konjugaatin annetaan sitoutua avidiiniin, jolloin saadaan nelivalenssisia avidiini/biotiini/TNF-R-molekyylejä. TNF-R voidaan myös liittää kovalenttisesti dinitrofenoliin (DNP) tai trinitrofenoliin (TNP) ja saatu konjugaatti 5 saostaa anti-DNP:llä tai anti-TNP-IgM:llä dekameeristen konjugaattien muodostamiseksi, joiden valenssi TNF-R-si-toutumiskeskusten suhteen on 10.

Voidaan samoin muostaa kimeerinen yhdistelmä-DNA-vasta-ainemolekyyli, jossa on TNF-R-sekvensseillä substi-10 tuoitu vaihtuvia alueita immunoglobuliinimolekyylin joko raskaassa tai kevyessä ketjussa tai molemmissa ja jossa on ei-modifioituja pysyvä alue -alueita. Esimerkiksi kimeerinen TNF-R/IgGi voidaan tuottaa kahdesta kimeerisestä geenistä: TNF-R/humaani-kappa-kevyt ketju-kimeeristä (TNF-15 R/Ckappa) ja TNF-R/humaani-gammaj-raskas ketju-kimeeristä (TNF-R/CgaiBBa.1). Kahden kimeerisen geenin kopioinnin ja luennan jälkeen geenituotteet kokoontuvat yhdeksi kimeeri-seksi vasta-ainemolekyyliksi, jossa TNF-R esiintyy kaksi-valenssisesti. Tällaisilla monivalenssisilla TNF-R-muo-20 doilla voi olla tehostunut sitoutumisaffiniteetti TNF-li-gandille. Lisää yksityiskohtia koskien tällaisten ki-meeristen vasta-ainemolekyylien rakentamista julkistetaan patenttijulkaisuissa WO 89/09622 ja EP-315 062.

Yhdistelmä-DNA-TNF-R:n ilmennys 25 Esillä oleva keksintö antaa käyttöön yhdistelmä- DNA-ilmennysvektoreita TNF-R:ää koodittavan DNA:n vahvistamiseksi tai ilmentämiseksi. Yhdistelmä-DNA-ilmennysvek-torit ovat replikoituvia DNA-rakenteita, joissa on synteettisiä tai cDNA-peräisiä DNA-fragmentteja, jotka koo-30 dittavat nisäkäs-TNF-R:ää tai bioekvivalenttisia analogeja ja jotka on operatiivisesti kytketty sopiviin kopiointia tai luentaa sääteleviin yksiköihin, jotka ovat peräisin nisäkäs-, mikrobi-, virus- tai hyönteisgeeneistä. Kopioin-tiyksikkö käsittää yleensä yhdistelmän, jossa oh (1) yksi 35 tai useampi geneettinen yksikkö, jolla on säätelevä osa 21 105099 geeni-ilmennyksessä, esimerkiksi kopiointipromoottorit tai -tehostimet, (2) rakenne- tai koodisekvenssi, joka kopioidaan mRNA:ksi ja luetaan proteiiniksi, ja (3) tarkoituksenmukaisia kopioinnin ja luennan käynnistäviä ja päättä-5 viä sekvenssejä, kuten kuvataan yksityiskohtaisesti alla. Tällaiset säätöyksiköt voivat käsittää operaattorisekvens-sin kopioinnin kontrolloimiseksi, joka sekvenssi koodittaa sopivia mRNA-ribosomisitoutumiskeskuksia. Kyky replikoitua isännässä, tavallisesti replikaatioalkukohdan mukanaan 10 tuomana, ja valikointigeeni transformanttien tunnistuksen helpottamiseksi voi niinikään sisältyä mukaan. DNA-alueet ovat operatiivisesti kytketyt, kun ne funktionaalisesti liittyvät toisiinsa. Esimerkiksi signaalipeptidin DNA (eritysjohtosekvenssi) on operatiivisesti kytketty poly-15 peptidin DNA:hän, jos se ilmentyy prekursorina, joka osallistuu polypeptidin eritykseen; promoottori on operatiivisesti kytketty koodisekvenssiin, jos se kontrolloi sekvenssin kopiointia; tai ribosomisitoutumiskeskus on operatiivisesti kytketty koodisekvenssiin, jos se on sijoitettu 20 siten, että luenta on mahdollista. Yleensä operatiivisesti kytketty merkitsee jatkuvaa, ja eritysjohtosekvenssien kohdalla jatkuvaa ja lukualueella olevaa. Hiivailmennys-systeemeissä käytettäviksi tarkoitettuihin rakenneyksiköi-hin kuuluu edullisesti johtosekvenssi, jonka ansiosta 25 isäntäsolu voi erittää ulkopuolelleen luetun proteiinin.

Vaihtoehtoisesti ilmennettäessä yhdistelmä-DNA-proteiini ilman johto- tai kuljetussekvenssiä se voi käsittää N-pää-metioniinitähteen. Tämä tähde voidaan mahdollisesti sittemmin lohkaista ilmennetystä yhdistelmä-DNA-proteiinista 30 lopputuotteen saamiseksi.

DNA-sekvenssit, jotka koodittavat nisäkäs-TNF-re-septoreita, jotka on määrä ilmentää mikro-organismissa, eivät edullisesti sisällä introneja, jotka saattaisivat ennenaikaisesti päättää DNA:n kopioinnin mRNA:ksi; kuiten-35 kin kopioinnin ennenaikainen päättyminen voi olla toivot- 22 105099 tavaa esimerkiksi silloin, kun se johtaisi mutantteihin, joissa on edullisia C-päätypistyksiä, esimerkiksi trans-membraanialueen deleetio liukoisen reseptorin saamiseksi, joka ei ole sitoutunut solumembraaniin. Koodin degeneraat-5 tiluonteen johdosta saattaa ilmetä huomattavaa vaihtelua nukleotidisekvensseissä, jotka koodittavat samaa aminohapposekvenssiä. Muita suoritusmuotoja ovat sekvenssit, jotka kykenevät hybridisoitumaan annetun cDNA:n sekvensseihin kohtuullisen ankarissa olosuhteissa (50 °C, 2x SSC), ja 10 muita sekvenssejä, jotka hybridisoituvat biologisesti aktiivisia TNF-reseptoripolypeptidejä koodittaviin tai ovat degeneroituneita mainittuihin nähden.

Yhdistelmä-DNA-TNF-R-DNA ilmennetään tai vahvistetaan yhdistelmä-DNA-ilmennyssysteemissä, joka käsittää 15 oleellisesti homogeenisen yksiviljelmän sopivista isäntä-mikro-organismeista, esimerkiksi bakteerista kuten co-lista tai hiivasta kuten cerevisiaestä, jotka ovat stabiilista integroineet (transformoinnista tai transfektoin-nista tuloksena) yhdistelmä-DNA-kopiointiyksikön kromoso-20 mi-DNA:han tai jotka käsittävät yhdistelmä-DNA-kopioin-tiyksikön läsnä olevan plasmidin rakenneosana. Yleensä systeemin muodostavat solut ovat yhden kantatransformantin jälkeläisiä. Tässä määritellyt yhdistelmä-DNA-ilmennyssys-teemit ilmentävät heterologisen proteiinin, kun ilmennet-25 tävään DNA-sekvenssiin tai synteettiseen geeniin kytketyt säätöyksiköt indusoidaan.

Transformoidut isäntäsolut ovat soluja, jotka on transformoitu tai transfektoitu TNF-R-vektoreilla, jotka on rakennettu käyttäen yhdistelmä-DNA-tekniikoita. Trans-30 formoidut isäntäsolut ilmentävät tavallisesti TNF-R:n, mutta isäntäsolujen, jotka on transformoitu TNF-R-DNA:n kloonaus- tai vahvistustarkoituksessa, ei tarvitse ilmentää TNF-R:ää. Ilmennetty TNF-R tallettuu solumembraaniin tai tulee eritetyksi viljelmäsupernatanttiin riippuen va-35 litusta TNF-R-DNA:sta. Sopivia isäntäsoluja nisäkäs-TNF- 23 105099 R:n ilmentämiseksi ovat prokaryootit, hiiva- tai korkeammat eukaryoottiset solut tarkoituksenmukaisten promoottorien kontrollissa. Prokaryootteihin lukeutuu gram-negatii-visia tai gram-positiivisia organismeja, esimerkiksi 5 coli tai basillit. Korkeampia eukaryoottisia soluja ovat nisäkäsalkuperää olevat vakiintuneet solulinjat kuten alla kuvataan. Soluja sisältämättömiä luentasysteemejä voitaisiin niinikään käyttää nisäkäs-TNF-R:n tuottamiseksi käyttäen RNA-sekvenssejä, jotka on saatu esillä olevan 10 keksinnön mukaisista DNA-rakenteista. Tarkoituksenmukaisia kloonaus- ja ilmennysvektoreita käytettäviksi bakteeri-, sieni-, hiiva- ja nisäkässoluisäntien kanssa kuvaavat

Pouwels et ai. ("Cloning Vectors: A Laboratory Manual", Elsevier, New York, 1985), jonka oleellinen julkistus si-15 säilytetään tähän viitteeksi.

Prokaryoottisia ilmennysisäntiä voidaan käyttää TNF-R:n ilmentämiseksi, joka ei tarvitse laajamittaista proteolyysi- ja disulfidiprosessointia. Prokaryoottiset ilmennysvektorit käsittävät yleensä yhden tai useamman 20 fenotyyppivalikointimerkin, esimerkiksi geenin, joka koo- dittaa proteiineja, jotka tuovat antibioottiresistenssin, tai täyttävät autotrofiavaatimuksen, sekä isännän tunnistaman replikaatioalkukohdan vahvistuksen isännässä varmistamiseksi. Sopivia prokaryoottisia isäntiä transformoin-25 tiin ovat E^ coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimu-rium ja eri lajit suvuista Pseudomonas, Streptomyces ja Staphylococcus, vaikka valinnan mukaan voidaan käyttää muitakin.

Bakteerikäyttöön käyttökelpoiset ilmennysvektorit 30 voivat käsittää valikointimerkin ja bakteeriperäisen replikaatioalkukohdan, joka on saatu kaupallisesti saatavina olevista plasmideista ja joka käsittää geeniyksiköitä hyvin tunnetusta kloonausvektorista pBR322 (ATCC 37017). Tällaisia kaupallisia vektoreita ovat esimerkiksi pKK223-35 3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi) ja pGEMl 24 105099 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Nämä pBR322-"runko"-osat yhdistetään tarkoituksenmukaiseen promoottoriin ja ilmennettävään rakennesekvenssiin. coli transformoidaan tyypillisesti käyttäen pBR322-johdannaisia, joka plasmidi 5 saadaan E_^ coli -lajista (Bolivar et ai., Gene 2 (1977) 95). pBR322 sisältää geenit ampisilliini- ja tetrasyklii-niresistenssille ja antaa siten yksinkertaisen keinon transformoitujen solujen tunnistamiseksi.

Yhdistelmä-DNA-mikrobi-ilmennysvektoreissa tavan-10 omaisesti käytettyjä promoottoreita ovat S-laktamaasi-(penisillinaasi-) ja laktoosipromoottorisysteemi (Chang et ai., Nature 275 (1978) 615; ja Goeddel et ai., Nature 281 (1979) 544), tryptofaani- (trp-) promoottorisysteemi (Goeddel et ai., Nucl.Acids Res. 8 (1980) 4057; ja EP-A-15 36 776) sekä tac-promoottori (Maniatis, "Molecular Clon ing: A Laboraroty Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, s. 412). Erityisen käyttökelpoisessa bakteeri-ilmen-nyssysteemissä käytetään lambdafagi-PL-promoottoria ja lä-mpölabiilia cl857ts-repressoria. Talletuslaitoksesta the 20 American Type Culture Collection saatavana olevia plas-midivektoreita, jotka sisältävät lambda-PL-promoottorijohdannaisia, ovat plasmidi pHUB2, joka on läsnä E^ coli -kannassa JMB9 (ATCC 37092), ja pPLc28, joka on läsnä E. coli RRl:ssä (ATCC 53082).

25 Yhdistelmä-DNA-TNF-R-proteiineja voidaan niinikään ilmentää hiivaisännissä, edullisesti Saccharomyces-laj is-ta, kuten §_^ cerevisiaessä. Voidaan käyttää muidenkin sukujen hiivoja, kuten Pichia tai Kluyveromyces. Hiivavek-torit sisältävät yleensä replikaatioalkukohdan 2p-hiiva-30 plasmidista tai autonomisesti replikoituvan sekvenssin (ARS), promoottorin, TNF-R:ää koodattavan DNA:n, sekvenssit polyadenylaatiolle sekä kopioinnin lopettamiseksi, ja valikointigeenin. Edullisesti hiivavektoreissa on repli-kaatioalkukohta ja valikointimerkki, jotka mahdollistavat 35 transformoinnin sekä hiivaan että E^ coliin, esim. ampi- 25 105099 silliiniresistenssigeenin E_;_ colista ja S_^ cerevisiaestä TRP1- tai URA3-geenin, josta saadaan valikointimerkki hiivan mutanttikannalle, jolta puuttuu kyky kasvaa tryptofaa-nilla, sekä promoottorin, joka on peräisin voimakkaasti 5 ilmentyvästä hiivageenistä, alavirran rakennesekvenssin kopioinnin indusoimiseksi. TRP1- tai URA3-puutoksen esiintymisestä hiivaisäntäsolugenomissa saadaan sitten tehokas ympäristö transformoinnin toteamiseksi kasvusta tryptofaa-nin tai urasiilin puuttuessa.

10 Sopivia promoottorisekvenssejä hiivavektoreihin ovat promoottorit metallotioneiinille, 3-fosfoglyseraat-tikinaasille (Hitzeman et ai., J.Blol.Chem. 255 (1980) 2073) tai muille glykolyyttisille entsyymeille (Hess et ai., J. Adv. Enzyme Reg. 7 (1968) 149; ja Holland et ai., 15 Biochem. 17 (1978) 4900), kuten enolaasi, glyseraldehydi- 3-fosfaattidehydrogenaasi, heksokinaasi, pyruvaattidekar-boksylaasi, fosfofruktokinaasi, glukoosi-6-fosfaatti-iso-meraasi, 3-fosfoglyseraattimutaasi, pyruvaattikinaasi, trioosifosfaatti-isomeraasi, fosfoglukoosi-isomeraasi ja 20 glukokinaasi. Sopivia vektoreita ja promoottoreita käytettäviksi hiiva-ilmennyksessä kuvataan edelleen julkaisussa R. Hitzeman et ai. EP-A-73 657.

Edullisia hiivavektoreita voidaan koota käyttäen DNA-sekvenssejä pUC18:sta valikointiin ja replikaatioon 25 E^ colissa (Ampr-geeni ja replikaatioalkukohta) ja hiiva-DNA-sekvenssejä, joihin kuuluu glukoosirepressoituva ADH2-promoottori ja α-tekijäeritysjohtosekvenssi. ADH2-promoot-toria ovat kuvanneet Russell et ai. (J.Biol.Chem. 258 (1982) 2674) ja Beier et ai. (Nature 300 1982 724). Hiiva-30 α-tekijäjohtosekvenssi, joka ohjaa heterologisten proteiinien eritystä, voidaan insertoida promoottorin ja ilmennettävän rakennegeenin väliin. Katso esim. Kurjan et ai., Cell 30 (1982) 933; ja Bitter et ai. , Proc.Natl. -Acad.Sci. USA 81 (1984) 5330). Johtosekvenssiä voidaan 35 modifioida sisältämään lähellä 3'-päätään yhden tai useam- 26 105099 man käyttökelpoisen restriktiokeskuksen johtosekvenssin fuusion vierasgeeneihin helpottamiseksi.

Sopivia hiivatransformointiprotokollia on alan ammattilaisten tiedossa; esimerkkitekniikkaa kuvaavat Hinnen 5 et ai., Proc.Natl.Aca.Sci. USA 75 (1978) 1929, jonka mukaan Trp*-transformantit valitaan selektiivisessä kasvualustassa, joka sisältää 0,67 % hiivatyppiemästä, 0,5 % kasaminohappoja, 2 % glukoosia, 10 pg/ml adeniinia ja 20 pg/ml urasiilia, tai URA+-transformantit kasvualustas-10 sa, joka sisältää 0,67 % YNBrtä, käyttäen aminohappoja ja emäksiä kuten ovat kuvanneet Sherman et ai. , "Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1986.

Isäntäkantoja, jotka on transformoitu ADH2-promoot-15 torin käsittävillä vektoreilla, voidaan kasvattaa ilmennettäviksi rikkaassa kasvualustassa, joka sisältää 1 %:n hiivauutetta, 2 % peptonia, ja 1 %:n tai 4 % glukoosia ja jota on täydennetty 80 pg:lla/ml adeniinia ja 80 pg:lla/ml urasiilia. ADH2-promoottorin derepressio tapahtuu kas-20 vualustaglukoosin loppuessa. Epäpuhtaat hiivasupernatantit otetaan talteen suodattamalla ja niitä pidetään 4 °C:ssa ennen jatkopuhdistusta.

Erilaisia nisäkäs- tai hyönteissoluviljelysystee-mejä käytetään niinikään edullisesti yhdistelmä-DNA-pro-25 teiinin ilmentämiseksi. Yhdistelmä-DNA-proteiinien ilmen täminen nisäkässoluissa on erityisen edullista, koska tällaiset proteiinit ovat yleensä oikein laskostuneita, tarkoituksenmukaisesti modifioituja ja täysin funktionaalisia. Esimerkkejä sopivista nisäkäsisäntäsolulinjoista ovat 30 apinan munuaissolujen C0S-7-solulinjat, joita kuvaa Gluz-man (Cell 23 (1981) 175), sekä muut solulinjat, jotka kykenevät ilmentämään tarkoituksenmukaisen vektorin, mukaan lukien esimerkiksi L-solut, C127-, 3T3-, kiinalaisen hamsterin munasarja- (CH0-), HeLa- ja BHK-solulinjat. Nisäkäs-35 ilmennysvektorit voivat käsittää ei-kopioituja yksiköitä 27 105099 kuten replikaatioalkukohta, sopiva promoottori ja tehostin kytkettyinä ilmennettävään geeniin, ja muita sivuavia ei-kopioituja 5'- tai 3'-sekvenssejä, ja ei-luettuja 5'- tai 3'-sekvenssejä, kuten välttämättömät ribosomisitoutumis-5 keskukset, polyadenylaatiokeskus, silmukan luovuttaja- ja vastaanottajakeskukset, ja kopioinninpäätössekvenssit. Katsauksen bakulovirussysteemeistä heterologisten proteiinien tuottamiseksi hyönteissoluissa esittävät Luckow ja Summers, Bio/Technology 6 (1988) 47.

10 Kopioinnin ja luennan kontrollisekvenssit ilmennys- vektoreissa, joita on määrä käyttää selkärankaissolujen transformoimiseksi, voidaan saada viruslähteistä. Esimerkiksi tavanomaisesti käytettyjä promoottoreita ja tehosti-mia saadaan polyoomasta, adenovirus-2:sta, apinavirus-15 40:stä (SV40) ja ihmisen sytomegaloviruksesta. SV40-virus-genomista saatuja DNA-sekvenssejä, esimerkiksi SV40-alku-kohtaa, varhais- ja myöhäispromoottoria, tehostinta, sil-mukoimis- ja polyadenylaatiokeskuksia voidaan käyttää muiden geneettisten yksiköiden saamiseksi, joita tarvitaan 20 heterologisen DNA-sekvenssin ilmentämiseksi. Varhais- ja myöhäispromoottorit ovat erityisen käyttökelpoisia, koska molemmat saadaan helposti viruksesta fragmenttina, joka sisältää myös SV40-virusreplikaatioalkukohdan (Fiers et ai., Nature 273 (1978) 113). Pienempiä tai suurempia SV40-25 fragmentteja voidaan niinikään käyttää edellyttäen, että mukaan sisältyy noin 250 ep:n sekvenssi, joka ulottuu Hind3-keskuksesta Bg11-keskukseen, joka sijaitsee viruksen replikaatioalkukohdassa. Edelleen nisäkkään genomi-TNF-R-promoottori-, kontrolli- ja/tai signaalisekvenssejä voi-30 daan käyttää edellyttäen, että tällaiset kontrollisekvenssit sopivat yhteen valitun isäntäsolun kanssa. Lisää yksityiskohtia koskien nisäkäskorkeailmennysvektorin käyttöä yhdistelmä-DNA-nisäkäs-TNF-reseptorin tuottamiseksi esitetään esimerkeissä 2 ja 7 alla. Esimerkkivektoreita voi- 28 105099 daan rakentaa kuten ovat kuvanneet Okayama ja Berg (Mol.Cell.Biol. 3 (1983) 280).

Käyttökelpoinen systeemi nisäkäsreseptori-cDNA-sekvenssien stabiiliksi ilmentämiseksi korkeina tasoina 5 C127-hiiririntarauhasepiteelisoluissa voidaan rakentaa oleellisesti kuten ovat kuvanneet Cosman et ai. (Mol. Immunol. 23 (1986) 935).

Esillä olevan keksinnön edullisissa näkökohdissa TNF-R-cDNA-sekvenssejä käsittävät yhdistelmä-DNA-ilmen-10 nysvektorit on stabiilisti integroitu isäntäsolun DNA:hän.

Ilmennystuotteen korkeisiin tasoihin päästään valikoimalla solulinjoja, joissa on vahvistuneita lukuja vektori-DNA:ta. Solulinjat, joissa on vahvistettuja lukuja vek-tori-DNA:ta, valitaan esimerkiksi transformoimalla isäntä-15 solu vektorilla, joka käsittää DNA-sekvenssin, joka koo-dittaa entsyymiä, jonka inhiboi tunnettu lääke. Vektori voi niinikään käsittää DNA-sekvenssin, joka koodittaa halutun proteiinin. Vaihtoehtoisesti isäntäsolu voidaan yhteis transformoida toisella vektorilla, joka käsittää DNA-20 sekvenssin, joka koodittaa halutun proteiinin. Transformoituja tai yhteistransformoituja isäntäsoluja viljellään sitten tunnetun lääkkeen kasvavissa pitoisuuksissa, jolloin valikoidaan lääkkeelle resistenttien solujen suhteen. Tällaiset lääkeresistentit solut jäävät henkiin myrkyl-25 lisen lääkkeen kasvavissa pitoisuuksissa tuottamalla runsaasti entsyymiä, jonka lääke inhiboi, usein seurauksena entsyymiä koodattavan geenin vahvistumisesta. Silloin kun lääkeresistenssin on aiheuttanut kasvu inhiboitavaa entsyymiä koodittavan vektori-DNA:n kopioluvussa, on samalla 30 tapahtunut haluttua proteiinia (TNF-R:ää) koodittavan vek-tori-DNA:n yhteisvahvistuminen isäntäsolun DNA:ssa.

Edullisessa systeemissä tällaiseksi yhteisvahvis-tamiseksi käytetään dihydrofolaattireduktaasi- (DHFR-) geeniä, joka voidaan inhiboida lääkkeellä metotreksaatti 35 (MTX). Yhteisvahvistukseen pääsemiseksi isäntäsolu, josta 105099 puuttuu aktiivinen DHFRiää koodittava geeni, joko transformoidaan vektorilla, joka käsittää DHFRiää ja haluttua proteiinia koodittavan DNA-sekvenssin, tai se yhteistrans-formoidaan vektorilla, joka käsittää DHFRiää koodittavan 5 DNA-sekvenssin, ja vektorilla, joka käsittää haluttua proteiinia koodittavam DNA-sekvenssin. Transformoituja tai yhteistransformoituja isäntäsoluja viljellään kasvualustassa, joka sisältää kasvavia MTX-tasoja ja eloonjäävät solulinjat valitaan.

10 Erityisen edullisessa yhteisvahvistussysteemissä

käytetään glutamiinisyntetaasi-(GS-)geeniä, joka on vastuussa glutamaatin ja ammoniakin synteesistä käyttäen ATPin hydrolyysiä ADPiksi ja fosfaatiksi reaktion ylläpitämiseksi. GSiää inhiboivat monet erilaiset inhibiittorit, 15 esimerkiksi metioniinisulfoksimiini (MSX). Täten TNF-R

voidaan ilmentää korkeina pitoisuuksina yhteisvahvistamal-la soluja, jotka on transformoitu vektorilla, joka käsittää DNA-sekvenssin GSille ja halutulle proteiinille, tai yhteistransformoitu vektorilla, joka käsittää GSiää koo-20 dittavan DNA-sekvenssin, ja vektorilla, joka käsittää haluttua proteiinia koodittavan DNA-sekvenssin, minkä jälkeen isäntäsoluja viljellään kasvualustassa, joka sisältää kasvavia MSX-tasoja, ja valikoidaan eloonjääneiden solujen suhteen. GS-yhteisvahvistussysteemiä, tarkoituksenmukaisia 25 yhdistelmä-DNA-ilmennysvektoreita ja solulinjoja kuvataan seuraavissa PCT-patenttihakemusjulkaisuissai W0 87/04 462, W0 89/01 036, W0 89/10 404 ja WO 86/05 807.

Yhdistelmä-DNA-proteiinit ilmennetään edullisesti yhteisvahvistamalla DHFR tai GS nisäkäsisäntäsolussa, ku-30 ten kiinalaisen hamsterin munasarja- (CHO-) soluissa, tai vaihtoehtoisesti hiiren myeloomasolulinjassa, kuten SP2/0Agl4 tai NSO tai rotan myeloomasolulinjassa, kuten YB2/3.0-Ag20, jotka julkistetaan PCT-patenttihakemusjulkaisuissa W0 89/10 404 ja W0 86/05 807.

30 105099

Edullinen eukaryoottinen vektori TNF-R-DNA:n ilmentämiseksi julkistetaan alla esimerkissä 2. Tämä vektori, jota kutsutaan pCAV/NOT:ksi, saatiin nisäkäskorkeail-mennysvektorista pDC201 ja se sisältää säätösekvenssejä 5 SV40:stä, adenovirus-2:sta ja ihmisen sytomegalovirukses-ta.

Yhdistelmä-DNA-TNF-R:n puhdistaminen

Puhdistettuja nisäkäs-TNF-reseptoreita tai analogeja valmistetaan viljelemällä sopivia isäntä/vektorisys-10 teemejä yhdistelmä-DNA-luentatuotteiden ilmentämiseksi esillä olevan keksinnön mukaisista DNA-sekvensseistä ja puhdistamalla ne sitten viljelykasvualustasta tai solu-uutteista.

Esimerkiksi supernatantteja systeemeistä, jotka 15 erittävät yhdistelmä-DNA-proteiinin kasvualustaan, voidaan ensin konsentroida käyttäen kaupallisesti saatavana olevaa proteiinikonsentrointisuodatinta, esimerkiksi Amiconin tai Milliporen ultrasuodatusyksikköä. Konsentrointivaiheen jälkeen konsentraatti voidaan panostaa sopivaan puhdistus-20 matriisiin. Esimerkiksi sopiva affiniteettimatriisi voi käsittää TNF- tai lektiini- tai vasta-ainemolekyylin sidottuna sopivaan tukeen. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää anioninvaihtohartsia, esimerkiksi matriisia tai substraattia, jossa on riippuvia dietyyliaminoetyyli- (DEAE-) ryh-25 miä. Matriisit voivat olla akryyliamidia, agaroosia, deks-traania, selluloosaa tai muita tyyppejä, joita tavanomaisesti käytetään proteiinien puhdistuksessa. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kationinvaihtovaihetta. Sopivia ka-tioninvaihtajia ovat erilaiset ei-liukoiset matriisit, 30 jotka käsittävät sulfopropyyli- tai karboksimetyyliryhmiä.

Sulfopropyyliryhmät ovat edullisia.

Lopuksi TNF-R-koostumuksen puhdistamiseksi edelleen voidaan käyttää yhtä tai useampaa käänteisfaasikorkeapai-nenestekrömatografia- (RP-HPLC-) vaihetta käyttäen hydro-35 fobista RP-HPLC-alustaa, esim. silikageeliä, jossa on 31 105099 riippuvia metyyliryhmiä tai muita alifaattisia ryhmiä. Joitakin tai kaikkia edeltäviä puhdistusvaiheita erilaisina yhdistelminä voidaan samoin käyttää homogeenisen yh-distelmä-DNA-proteiinin saamiseksi.

5 Bakteeriviljelmässä tuotettu yhdistelmä-DNA-pro- teiini eristetään tavallisesti ensin uuttamalla solupel-lettejä, minkä jälkeen suoritetaan yksi tai useampi kon-sentrointi-, ulossuolaus-, vesi-ioninvaihto- tai kokoeks-kluusiokromatografiavaihe. Lopuksi korkeapainenestekroma-10 tografiaa (HPLC) voidaan käyttää viimeisissä puhdistus-vaiheissa. Yhdistelmä-DNA-nisäkäs-TNF-R:n ilmentämiseksi käytetyt mikrobisolut voidaan rikkoa millä tahansa kätevällä menetelmällä, mukaan lukien jäädytys/sulatuskierrä-tys, ultraäänikäsittely, mekaaninen rikkominen tai solujen 15 lyysin aikaansaavien aineiden käyttö.

Nisäkäs-TNF-R:n eritettynä proteiinina ilmentävän hiivan fermentointi yksinkertaistaa suuresti puhdistusta. Fermentaatiosta suuressa mittakaavassa saatua eritettyä yhdistelmä-DNA-proteiinia voidaan puhdistaa menetelmillä, 20 jotka ovat analogisia menetelmiin nähden, joita ovat julkistaneet Urdal et ai. (J.Chromatog. 296 (1984) 171). Tässä julkaisussa kuvataan kahta peräkkäistä käänteisfaasi-HPLC-vaihetta yhdistelmä-DNA-ihmis-GM-CSF:n puhdistamiseksi preparatiivisessa HPLC-kolonnissa.

• 25 Yhdistelmä-DNA-vil jelmässä syntetisoidulle humaani- TNF-R:lle on karakteristista ei-ihmissolurakenneosien, mukaan lukien proteiinien, läsnäolo määrinä ja tyyppinä, jotka riippuvat humaani-TNF-R:n talteenottamiseksi viljelmästä käytetyistä puhdistusmenetelmistä. Nämä rakenneosat 30 ovat tavallisesti alkuperältään hiivaprokaryooteista tai " korkeammista ei-humaanieukaryooteista, ja niitä on edul lisesti läsnä harmittomina kontaminoivina määrinä suuruusluokiltaan alle noin 1 paino-%. Edelleen yhdistelmä-DNA-soluviljelmällä on mahdollista tuottaa TNF-R:ää, joka ei 35 sisällä proteiineja, joita voi normaalisti liittyä TNF- 32 105099 R:ään sellaisena kuin se esiintyy luonnossa alkuperälajis-saan, esim. soluissa, solu-ulosvirtausnesteissä tai ruumiin nesteissä.

Liukoisen yhdistelmä-DNA-TNF-R:n antaminen 5 Esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmiä terapeuttisten koostumusten käyttämiseksi, jotka käsittävät tehokkaan määrän liukoisia TNF-R-proteiineja ja sopivan laimentimen tai kantajan, sekä menetelmiä ihmisten TNF:stä riippuvaisten tulehdusvasteiden tukahduttamiseksi, 10 joiden menetelmien mukaan annetaan tehokas määrä liukoista TNF-R-proteiinia.

Terapeuttiseen käyttöön puhdistettua liukoista TNF-R-proteiinia annetaan potilaalle, edullisesti ihmiselle, hoidon suorittamiseksi indikaatioon nähden tarkoituksenmu-15 kaisella tavalla. Täten esimerkiksi liukoinen TNF-R-pro-teiini -koostumuksia voidaan antaa kertaruiskeena, jatkuvana nestesiirtona, niitä voidaan vapauttaa hitaasti siirteistä tai antaa muulla sopivalla tekniikalla. Tyypillisesti liukoinen TNF-R-terapia-aine annetaan koostumuksen 20 muodossa, joka käsittää puhdistettua proteiinia yhdistettynä fysiologisesti hyväksyttäviin kantajiin, täyteaineisiin tai laimentimiin. Tällaiset kantajat ovat myrkyttömiä vastaanottajille käytettyinä annostuksina ja pitoisuuksina. Tavallisesti tällaisten koostumusten valmistuksessa .· 25 TNF-R yhdistetään puskureihin, hapetuksenestoaineisiin kuten askorbiinihappoon, alhaisen molekyylipainon (alle noin 10 tähdettä) polypeptideihin, proteiineihin, aminohappoihin, hiilihydraatteihin, kuten glukoosiin, sakkaroosiin tai dekstriineihin, kelatoiviin aineisiin kuten 30 EDTAihan, glutationiin ja muihin stabiloimisaineisiin ja V. täyteaineisiin. Esimerkkejä tarkoituksenmukaisista laimen- timista ovat neutraali puskuroitu suolaliuos tai suolaliuos, johon on sekoitettu saman lajin seerumialbumiinia. Edullisesti koostetaan kylmäkuivattu tuote käyttäen tar-35 koituksenmukaisia täyteaineliuoksia (esim. sakkaroosi-) • 33 105099 laimentimina. Tarkoituksenmukaiset annostukset voidaan määrittää kokeissa. Lääkkeenannon määrä ja taajuus riippuvat luonnollisesti sellaisista tekijöistä kuten hoidettavan indikaation luonne ja vakavuus, haluttu vaste, poti-5 laan tila jne.

Liukoisia TNF-R-proteiineja annetaan TNF:stä riippuvaisten vasteiden inhiboimiseksi. TNF:n uskotaan aiheuttavan monia erilaisia sairauksia tai tiloja, kuten kuihtuminen ja verenmyrkytysshokki. Lisäksi muut avainsytokiinit 10 (IL-1, IL-2 ja muut pesäkkeitä stimuloivat tekijät) voivat myös indusoida merkittävää TNF-tuotantoa isännässä. Liukoisia TNF-R-koostumuksia voidaan siksi käyttää esimerkiksi kuihtumisen tai verenmyrkytysshokin tai sytokiiniterapiaan liittyvien sivuvaikutusten hoitamiseksi. Sen primaa-15 risen osan johdosta, jota IL-1 ja IL-2 esittävät TNF-tuotannossa, yhdistelmäterapia käyttäen sekä IL-l-resepto-reita että IL-2-reseptoreita voi olla edullista TNF-liit-teisten kliinisten indikaatioiden hoitamiseksi.

Seuraavat esimerkit esitetään havainnollistavassa 20 eikä rajäävässä tarkoituksessa.

Esimerkkejä

Esimerkki 1

Sitoutumismäärityksiä A. TNF-α:n ja TNF-B:n radioleimaus. Yhdistelmä-DNA-.· ' 25 humaani-TNF-α ilmennettiin fuusioproteiinin muodossa, joka sisältää hydrofiilisen oktapeptidin N-päässä, hiivassa erittyvänä proteiinina ja se puhdistettiin affiniteetti-kromatografisesti (Hopp et ai., Bio/Technology 6 (1988) 1204). Puhdistettu yhdistelmä-DNA-humaani-TNF-β hankittiin 30 valmistajalta R&D Systems (Minneapolis, MN). Molemmat pro-1' teiinit radioleimattiin käyttäen kaupallisesti saatavana olevaa kiinteäfaasiainetta, Iodo-Gen (Pierce). Tässä menettelyssä 5 pg Iodo-Gen-tuotetta maljoitettiin 10 x 75 mm:n lasiputken pohjalle ja inkuboitiin 20 minuutin 35 ajan 4 °C:ssa 75 pl:lla 0,1 M natriumfosfaattiliuosta, 34 105099 pH 7,4, ja 20 pl:lla (2 mCi) Na125I:tä. Tämä liuos siirrettiin sitten toiseen lasiputkeen, joka sisälsi 5 pg TNF-a:aa (tai TNF-B:aa) 45 plrssa PBS:ää, 20 minuutiksi 4 °C:ssa. Reaktioseos fraktioitiin geelisuodattamalla 5 2 ml:n petitilavuuden Sephadex G-25 -tuotetta (Sigma) lä pi, jota oli tasapainoitettu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 -kasvualustassa, joka sisälsi 2,5 % (w/v) nautaseerumialbumiinia (BSA), 0,2 % (w/v) natriumat-sidia ja pitoisuuden 20 mM Hepes, pH 7,4 (sitoutumiskas-10 vualusta). Lopullinen 125I-TNF-pooli laimennettiin sitoutu-miskasvualustaan työvarastoliuokseksi, jonka pitoisuus oli 1 x 10'7 M, ja jota varastoitiin aina kuukauden ajan 4 °C:ssa ilman todettavaa reseptorisitoutumisaktiivisuuden menetystä. Spesifinen aktiivisuus on tavanomaisesti 1 x 106 15 tuiketta/min/mmol TNF:ää.

B. Sitoutuminen ehyisiin soluihin. Sitoutumismää-ritykset ehyillä soluilla suoritettiin kahdella menetelmällä. Ensimmäisessä menetelmässä soluja kasvatettiin ensin joko lietteenä (esim. U937) tai kiinnittämällä kudos-20 viljelymaljoihin (esim. WI26-VA4-, COS-solut, jotka ilmen tävät yhdistelmä-DNA-TNF-reseptorin). Kiinnittyneet solut poistettiin sitten käsittelemällä 5 mM EDTA-liuoksella 10 minuutin ajan 37 °C:ssa. Sitoutumismääritykset suoritettiin sitten ftalaattiöljyerotusmenetelmällä (Dower et ai., 25 J. Immunol. 132 (1984) 751) oleellisesti kuten kuvanneet

Park et al^ (J.Biol.Chem. 261 ( 1986) 4177). 125I-TNF:n ei-spesifinen sitoutuminen mitattiin 200-kertaisen tai suuremman mooliylimäärän ei-leimattua TNF:ää läsnä ollessa. Natriumatsidia (0,2 %) sisällytettiin sitoutumismäärityk-30 seen 125I-TNF:n siirtymisen solujen sisään estämiseksi. Toi-1 sessa menetelmässä testattiin COS-solujen, jotka oli transfektoitu TNF-R:n sisältävällä plasmidilla ja jotka ilmensivät pinnallaan TNF-reseptoreita, kykyä sitoa 125I-TNF:ää maljasitoutumismäärityksellä, jöta ovat kuvanneet 35 Sims et ai. (Science 241 (1988) 585).

35 105099 C. Sitoutumismääritykset kiinteässä faasissa. Keino TNF-R:n toteamiseksi saatiin TNF-R:n kyvystä adsorboitua stabiilisti nitroselluloosaan ihmissolujen detergenttiuut-teista siten, että TNF-sitoutumisaktiivisuus kuitenkin 5 säilyy. Solu-uutteet valmistettiin sekoittamalla solupel-letti 2x tilavuuteen PBS:ää, joka sisälsi 1 %:n Triton X-100 -valmistetta ja koktailin proteaasi-inhibiittoreita (2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi, 10 μΜ pepstatiini, 10 μΜ leupeptiini, 2 mM o-fenantroliini ja 2 mM EGTA), 10 kiivaasti vorteks-sekoittamalla. Seosta inkuboitiin jäissä 30 minuutin ajan, minkä jälkeen sitä sentrifugoitiin 12 000 x g:ssä 15 minuutin ajan 8 °C:ssa tumien ja muun jätteen poistamiseksi. Kahden mikrolitran erät solu-uutteita sijoitettiin kuiville BA85/21-nitroselluloosamem-15 braaneille (Schleicher & Schuell, Keene, NH) ja annettiin kuivaa. Membraaneja inkuboitiin kudosviljelymaljoissa 30 minuutin ajan Tris- (0,05 M) puskuroidussa suolaliuoksessa (0,15 M), pH 7,5, joka sisälsi 3 % (w/v) BSA:ta, ei-spesi-fisten sitoutumiskeskusten salpaamiseksi. Membraani pei-20 tettiin sitten seoksella, jossa oli 5 x 10'11 M 12SI TNF:ää PBSrssä, jossa oli 3 % BSA:ta, ja inkuboitiin 2 tunnin ajan 4 °C:ssa ravistellen. Tämän ajan kuluttua membraanit pestiin 3 kertaan PBS:llä, kuivattiin ja sijoitettiin Kodak X-Omat AR -filmille 18 tunniksi -70 °C:seen.

25 Esimerkki 2

Humaani-TNF-R-cDNA:n eristäminen ilmentämällä aktiivinen proteiini suoraan C0S-7-soluissa

Erilaisia ihmissolulinjoja seulottiin TNF-R-ilmen-nyksen suhteen niiden kyvyn nojalla sitoa 125I-leimattua 30 TNF:ää. Ihmisen sidekudosmuodostussolulinjan WI-26 VA4 todettiin ilmentävän kohtuullisen lukumäärän reseptoreita solua kohden. Tasapainositoutumistutkimukset osoittivat, että solulinja osoitti kaksifaasista 125I-TNF:n sitomista käsittäen noin 4 000 korkea-affiniteettikeskusta (Ka = 1 x 36 105099 ΙΟ10 M11) ja 15 000 matala-affiniteettikeskusta (Ka = 1 x 108 M'1) solua kohden.

Koon mukaan jaottelematon cDNA-kirjasto rakennettiin suorittamalla käänteiskopiointi polyadenyloidulle 5 mRNArlle, joka oli eristetty kokonais-RNA:sta, joka oli uutettu ihmisen sidekudosmuodostus-WI-26 VA4 -soluista, joita oli kasvatettu Phytolacca americana (engl. pokeweed) -mitogeenin läsnä ollessa, käyttäen vakiotekniikoita (Gubler et ai., Gene 25 (1983) 263; Ausubel et ai., toim., 10 "Current Protocols in Molecular Biology", osa 1, 1987).

Solut otettiin talteen aikaansaamalla soluissa lyysi gua-nidiinihydrokloridiliuoksessa ja kokonais-RNA eristettiin kuten aiemmin on kuvattu (March et ai., Nature 315 (1985) 641).

15 Poly A1 -RNA eristettiin oligo-dT-selluloosakroma- tografisesti ja kaksisäikeinen cDNA valmistettiin menetelmällä, joka oli samanlainen kuin Gublerin ja Hoffmanin (Gene 25 (1983) 263). Lyhyesti, poly A’ -RNA muutettiin RNA-cDNA-hybridiksi käyttäen käänteiskopioijaentsyymiä ja 20 oligo-dT:tä alukkeena. RNA-cDNA-hybridi muutettiin sitten kaksisäikeiseksi cDNArksi käyttäen RN-aasi-H:ta yhdessä DNA-polymeraasi-I:n kanssa. Saadun kaksisäikeisen cDNA:n päistä tehtiin tasaiset käyttäen T4-DNA-polymeraasia. cDNA:han, jonka päät olivat tasaiset, lisätään EcoRI-25 liittosekvenssejä (joissa on sisäisiä Not1-keskuksia), jotka oli fosforyloitu vain toisesta päästä (Invitrogen). Liittosekvensseillä varustettua cDNA:ta käsiteltiin T4-po-lynukleotidikinaasilla liittosekvenssin 5'-ylijäämäalueen fosforyloimiseksi ja ligatoitumatta jääneet liittosekvens-30 sit poistettiin ajamalla cDNA Sepharose CL4B -kolonnissa.

!! Liittosekvensseillä varustettu cDNA ligatoitiin ekvimolaa- riseen pitoisuuteen bakteriofagi lambda-gtlO:n EcoRI;llä leikattuja ja defosforyloituja varsia (Huynh et ai., "DNA Cloning: A Practical Approach"; Glover, toim., IRL Press, 35 ss. 49 - 78). Ligatoitu DNA pakattiin fagipartikkeleihin 37 105099 käyttäen kaupallisesti saatavana olevaa pakkausta yhdis-telmä-DNA-tuotekirjaston saamiseksi (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA). Yhdistelmä-DNA-tuotteita vahvistettiin edelleen maljoittamalla fagi coli -kanta 5 c600(hfl') bakteerimatolle.

Fagi-DNA puhdistettiin saadusta lambda-gtlO-cDNA-kirjastosta ja cDNA-insertit leikattiin pilkkomalla res-triktioentsyymillä Notl. Suoritettiin pilkkomistuotteiden elektroforeesi agaroosigeelissä, minkä jälkeen eristettiin 10 2 000 ep:tä suuremmat cDNA-fragmentit.

Saadut cDNA-fragmentit ligatoitiin eukaryoottiseen ilmennysvektoriin pCAV/NOT, joka oli suunniteltu ilmentämään sen monikloonauskeskukseen insertoidut cDNA-sekvenssit nisäkässoluihin transfektoituna. pCAV/NOT koottiin 15 pDC201:stä (pMLSV-johdannainen, jota ovat aiemmin kuvan neet Cosman et ai., Nature 312 (1984) 768), SV40:stä ja sytomegalovirus-DNA:sta ja käsittää järjestyksessä kopioinnin suunnassa replikaatioalkukohdasta lukien: (1) SV40-sekvenssit koordinaatit 5171-270 mukaan lukien rep-20 likaatioalkukohta, tehostinsekvenssit ja varhais- ja myö-häispromoottorit; (2) sytomegalovirussekvenssit mukaan lukien promoottori- ja tehostinalueet (nukleotidit 671 -+63 sekvenssistä, jonka ovat julkistaneet Boechart et ai. (Cell 41 (1985) 521); (3) adenovirus-2-sekvenssit, jotka \'· ' 25 sisältävät ensimmäisen eksonin ja osan intronista kol miosaisen johtosekvenssin ensimmäisen ja toisen eksonin välissä, toisen eksonin ja osan kolmiosaisen johtosekvenssin kolmannesta eksonista sekä monikloonauskeksuksen (MCS), joka sisältää keskukset Xhol:lie, Kpnl:lie, 30 Smal:lie, Notl:lie ja Bgllrlle; (4) SV40-sekvenssit koor- ;; dinaatit 4127-4100 ja 2770-2533, joihin sisältyy polyade- nylaatio- ja päätössignaalit varhaiskopioinnille; (5) pBR322:sta peräisin olevia sekvenssejä ja virusliitteiset sekvenssit VAI ja VAII pDC201:stä, jolloin adenovirussek-35 venssit 10532-11156 sisältävät VAI- ja VAII-geenit, joita 1 38 1 0 5 0 9 9 seuraavat pBR322-sekvenssit 4363-2486:sta ja 1094-375:stä, jotka sisältävät ampisilliiniresistenssigeenin ja repli-kaatioalkukohdan.

Saadulla WI-26 VA4 -cDNA-kirjastolla pCAV/NOT:ssä 5 transformoitiin E_^ coli -kanta DH5-a, minkä jälkeen yh-distelmä-DNA-tuotteet maljoittamalla saatiin noin 800 pesäkettä maljaa kohden, jolloin maljoja käytettiin riittävästi, jotta saatiin kaikkiaan noin 50 000 pesäkettä seulontaa kohden. Pesäkkeet raaputettiin kustakin maljasta, 10 yhdistettiin pooleiksi ja kustakin poolista valmistettiin plasmidi-DNA. Pooli-DNA:11a transfektoitiin sitten ei vielä yhteenkasvanut kerros apinan C0S-7-soluja käyttäen DEAE-dekstraania, ja sitten klorokiinikäsittelyä kuten ovat kuvanneet Luthman et ai♦ (Nucl.Acids Res. 11 (1983) 15 1295) ja McCutchan et ai. (J.Natl.Cancer Inst. 41 (1986) 351). Soluja kasvatettiin sitten viljelmässä 3 päivän ajan insertoitujen sekvenssien tilapäisen ilmennyksen saamiseksi. Kolmen päivän kuluttua soluviljelmäsupernatantit heitettiin pois ja kustakin maljasta määritettiin so-20 luyksikerroksien TNF-sitoutuminen seuraavasti. Kolme ml sitoutumiskasvualustaa, joka sisälsi pitoisuuden 1,2 x 10*11 M 125I-leimattua FlagR-TNF:ää, lisättiin kuhunkin maljaan ja maljoja inkuboitiin 4 °C:ssa 120 minuutin ajan. Sitten tämä kasvualusta heitettiin pois ja kukin malja pestiin i 25 kerran kylmällä sitoutumiskasvualustalla (joka ei sisältänyt leimattua TNF:ää) ja kahdesti kylmällä PBS:llä. Sitten kunkin maljan reunat rikottiin, jolloin saatiin tasainen levy, joka saatettiin kosketuksiin röntgensädefilmin kanssa 72 tunniksi -70 °C:ssa vahvistussuodinta käyttäen. 30 TNF-sitoutumisaktiivisuus näkyi valotetuilla filmeillä I tummana kohtana suhteellisen tasaista taustaa vasten.

Kun noin 240 000 yhdistelmä-DNA-tuotetta kirjastosta oli seulottu tällä tavalla, yhden transfektanttipoo-lin havaittiin tarjoavan TNF-sitoutumiskohtia, jotka nä-35 kyivät selvästi taustan valotusta vasten.

39 105099 Jäädytettyä varastokantaa positiivisen poolin bakteereista käyttäen valmistettiin sitten noin 150 pesäkettä käsittäviä maljoja. Näistä maljoista valmistettiin kopiot nitroselluloosasuodattimille, minkä jälkeen maljat raapu-5 tettiin ja valmistettiin plasmidi-DNA, joka transfektoi-tiin kuten edellä kuvattiin positiivisen maljan tunnistamiseksi. Bakteereja yksittäisistä pesäkkeistä tämän maljan nitroselluloosakopiosta kasvatettiin 0,2 ml:n viljelminä, joita käytettiin plasmidi-DNA:n saamiseksi, joka transfek-10 toitiin COS-7-soluihin kuten edellä kuvattiin. Tällä tavalla eristettiin yksi klooni, klooni-1, joka kykeni indusoimaan humaani-TNF-R:n ilmennyksen COS-soluilla. Ilmen-nysvektori pCAV/NOT, joka sisältää TNF-R-DNA-klooni-1:n, on talletettu talletuslaitokseen the American Type Culture 15 Collction, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA (hakunumero 68088) nimellä pCAV/NOT-TNF-R.

Esimerkki 3

Liukoista hu-TNF-R-delta-235:tä koodittavien cDNA-sekvenssien rakentaminen

20 Liukoista hu-TNF-R-delta-235:tä koodittava cDNA

(jonka sekvenssi on aminohapot 1 - 235 kuviossa 2) rakennettiin leikkaamalla 840 ep:n fragmentti pCAV/NOT-TNF-R:stä restriktioentsyymeillä Notl ja Pvu2. Notl leikkaa pCAV/NOT-TNF-R:n monikloonauskeskuksesta ja Pvu2 leikkaa : 25 TNF-R-koodialueelta 20 nukleotidia 5' transmembraa- nialueesta. TNF-R-sekvenssien 3'-pään uudelleenrakentamiseksi syntetisoitiin kaksi oligonukleotidia, jotka juotettiin seuraavan oligonukleotidiliittosekvenssin saamiseksi : 30 * Pvu 2 BamHl Bgl2 CTGAAGGGAGCACTGGCGACTAAGGATCCA GACTTCCCTCGTGACCGCTGATTCCTAGGTCTAG AlaGluGlySerThrGlyAspLoppu 40 105099 Tässä oligonukleotidiliittosekvenssissä on päässä sijaitsevat Pvu2- ja Bgl2-restriktiokeskukset, se luo uudelleen 20 nukleotidia TNF-R:ää, joita seuraa päätös-kodoni (alleviivattu) ja BamHI-restriktiokeskus (kätevyy-5 den vuoksi eristettäessä liukoinen TNF-R kokonaisuudessaan Notl/BamHI-pilkkomisella. Tämä oligonukleotidi ligatoitiin sitten 840 ep:n Notl/Pvu2-TNF-R-insertin kanssa Bgl2/~ Notl:llä leikattuun pCAV/NOT:hen, jolloin saatiin psolhu-TNF-R-delta-235/CAVN0T, joka transfektoitiin C0S-7-solui-10 hin kuten edellä kuvattiin. Tämä ilmennysvektori indusoi liukoisen humaani-TNF-R:n ilmennyksen, joka kykeni sitomaan TNF:ää.

Esimerkki 4

Liukoista hu-TNF-R-delta-185:tä koodittavien cDNA-15 sekvenssien rakentaminen

Liukoista hu-TNF-R-delta-185:tä koodittava cDNA (jonka sekvenssi on aminohapot 1 - 185 kuviossa 2) rakennettiin leikkaamalla 640 ep:n fragmentti pCAV/NOT-TNF-R:stä restriktioentsyymeillä Notl ja Bgl2. Notl leikkaa 20 pCAV/NOT-TNF-R:n monikloonauskeskuksesta ja Bgl2 leikkaa TNF-R-koodialueelta nukleotidin 637 kohdalta, joka on 237 nukleotidia 5' transmembraanialueesta. Syntetisoitiin seu-raavat oligonukleotidiliittosekvenssit: :- 25 Bgl2 5'-GATCTGTAACGTGGTGGCCATCCCTGGGAATGCAAGCATGGATGC-3' ACATTGCACCACCGGTAGGGACCCTTACGTTCG IleCysAsnValValAlalleProGlyAsnAlaSerMetAspAla 30 Notl ’· ' 5’- AGTCTGCACGTCCACGTCCCCCACCCGGTGAGC -3' ♦ _

TACCTACGTCAGACGTGCAGGTGCAGGGGGTGGGCCACTCGCCGG

ValCysThrSerThrSerProThrArgLoppu „ 105099 41

Edeltävät oligonukleotidiliittosekvenssit rakentavat uudelleen reseptorimolekyylin 3'-pään nukleotidiin 708, jota seuraa päätöskodoni (alleviivattu). Nämä oligo-nukleotidit ligatoitiin sitten 640 ep:n Notl-TNF-R-inser-5 tin kanssa Notl;llä leikattuun pCAV/NOT:hen, jolloin saatiin ilmennysvektori psol-TNF-R-delta-185/CAVNOT, joka transfektoitiin C0S-7-soluihin kuten edellä kuvattiin. Tämä ilmennysvektori indusoi liukoisen humaani-TNF-R:n ilmennyksen, joka kykeni sitomaan TNF:ää.

10 Esimerkki 5

Liukoista hu-TNF-R-delta-163:ea koodittavien cDNA-sekvenssien rakentaminen

Liukoista hu-TNF-R-delta-163:ea koodittava cDNA (jonka sekvenssi on aminohapot 1-163 kuviossa 2) raken-15 nettiin leikkaamalla 640 ep:n fragmentti pCAV/NOT-TNF-R:stä restriktioentsyymeillä Notl ja Bgl2 kuten kuvattiin esimerkissä 4. Syntetisoitiin seuraava oligonukleotidi-liittosekvenssi: 20 Bgll2 Notl 5'GATCTGTTGAGC -3'

ACAACTCGCCGG

IleCysLoppu /· 25 Tämä edeltävä oligonukleotidiliittosekvenssi raken tavaa uudelleen reseptorimolekyylin 3'-pään nukleotidiin 642 (aminohappo 163), jota seuraa päätöskodoni (alleviivattu). Tämä oligonukleotidi ligatoitiin sitten 640 ep:n Notl-TNF-R-insertin kanssa Notl:llä leikattuun pCAV/-30 N0T-:hen, jolloin saatiin ilmennysvektori psol-TNF-R-del-I ta-163/CAVNOT, joka transfektoitiin C0S-7-soluihin kuten edellä kuvattiin. Tämä ilmennysvektori indusoi liukoisen humaani-TNF-R:n ilmennyksen, joka kykeni sitomaan TNF:ää esimerkissä 1 kuvatussa sitoutumismäärityksessä.

42 105099

Esimerkki 6

Liukoista hu-TNF-R-delta-142:ta koodattavien cDNA-sekvenssien rakentaminen

Liukoista hu-TNF-R-delta-142:ta koodittava cDNA 5 (jonka sekvenssi on aminohapot 1 - 142 kuviossa 2) rakennettiin leikkaamalla 550 ep:n fragmentti pCAV/NOT-TNF-R:stä restriktioentsyymeillä Notl ja AlwNl. AlwNl leikkaa TNF-R-koodialueelta nukleotidin 549 kohdalta. Syntetisoitiin seuraava oligonukleotidiliittosekvenssi: 10 Bgl2 Notl

5’-CTGAAACATCAGACGTGGTGTGCAAGCCCTGTTAAA-3' CTTGACTTTGTAGTCTGCACCACACGTTCGGGACAATTTCTAGA

Loppu 15 Tämä edeltävä oligonukleotidiliittosekvenssi ra kentavaa uudelleen reseptorimolekyylin 3'-pään nukleotidiin 579 (aminohappo 142), jota seuraa päätöskodoni (alleviivattu). Tämä oligonukleotidi ligatoitiin sitten 550 ep:n Notl/AlwNl-TNF-R-insertin kanssa Notl/Bgl2:11a 20 leikattuun pCAV/NOT:hen, jolloin saatiin ilmennysvektori psol-TNF-R-delta-142/CAVNOT, joka transfektoitiin COS-7-soluihin kuten edellä kuvattiin. Tämä ilmennysvektori ei indusoinut liukoisen humaani-TNF-R:n ilmennystä, joka kykenisi sitomaan TNFrää. Arvellaan, että tämä nimenomainen : 25 rakenne ei kyennyt ilmentämään biologisesti aktiivista TNF-R:ää, koska yksi tai useampi molekyylinsisäiselle sitoutumiselle (TNF-R-molekyylin oikeanlaisen tertiaarira-kenteen muodostamiseksi) välttämätön oleellinen kysteii-nitähde (esim. Cys157 tai Cys163) oli eliminoitu.

30 Esimerkki 7 * Liukoisten TNF-reseptorien ilmennys CHO-soluissa

Liukoinen TNF-reseptori ilmennettiin kiinalaisen hamsterin munasarja-(CHO-)soluissa käyttäen glutamiinisyn-tetaasi- (GS-) geenivahvistussysteemiä, oleellisesti kuten 35 kuvataan PCT-patenttihakemusjulkaisuissa nrot W0 87/04 462 43 105099 ja WO 89/01 036. Lyhyesti, CHO-solut transfektoidaan il-mennysvektorilla, joka sisältää geenit sekä TNF-R:lie että GS:lle. CHO-solut valikoidaan GS-geeni-ilmennyksen suhteen transfektoidun DNA:n kyvyn nojalla tuottaa resistenssi 5 alhaisille metioniinisulfoksimiini- (MSX-) tasoille. GS- sekvenssivahvistustapahtumat tällaisissa soluissa valikoidaan käyttäen korkeampia MSX-pitoisuuksia. Tällä tavalla jatkuvat TNF-R-sekvenssit vahvistuvat myös ja päästään tehostuneeseen TNF-R-ilmennykseen.

10 GS-ilmennyssysteemissä käytetty vektori oli psol- TNF-R/P6/PSVLGS, joka rakennettiin seuraavasti. Ensin vektori pSVLGS.l (jota kuvataan PCT-patenttihakemusjulkaisuissa nrot W0 87/04462 ja W0 89/01036 ja jota on saatavana valmistajalta Celltech, Ltd., Berkshire, UK) lei-15 kattiin BamHI-restriktioentsyymillä ja defosforyloitiin vasikansuolen alkalisella fosfataasilla (CIAP) vektorin sisäisen uudelleenligatoitumisen estämiseksi. BamHI:llä leikattu pSVLGS.1-fragmentti ligatoitiin sitten 2,4 ke:n BamHI-Bgl2-fragmenttiin pEE6hCMV:stä (jota kuvataan PCT-20 patenttihakemusjulkaisussa nro W0 89/01036, ja jota niinikään on saatavana valmistajalta Celltech), jota leikattiin Bgl2:11a, BamHI:llä ja Fspl:llä kahden saman kokoisen fragmentin muodostumisen välttämiseksi, jolloin saatiin 11,2 ke:n vektori, joka nimettiin p6/PSVLGS.1:ksi.

**·. 25 pSVLGS.l sisältää glutamiinisyntetaasivalikointimerkki- geenin SV40-myöhäispromoottorin kontrollissa. BamHI-Bgl2-fragmentti pEE6hCMV:stä sisältää ihmisen sytomegaloviruk-sen pääasiallisen välittömän varhaispromoottorin (hCMV), polyliittäjän ja SV40-varhaispolyadenylaatiosignaalin. 30 Liukoisen TNF-R:n koodisekvenssit lisättiin p6/- .· PSVLGS.l:een leikkaamalla Not1-BamHI-fragmentti ilmennys- vektorista psol-TNF-R/CAVNOT (joka valmistettiin edeltävän esimerkin 3 mukaan) tasaamalla päät Klenow-entsyymillä ja ligatoimalla Smal:llä leikattuun defosforyloituun p6/PS-35 VLGS.l:een, jolloin sol-TNF-R-koodisekvenssit sijoitettiin • · 105099 44 hCMV-promoottorin kontrolliin. Tästä saatiin yksittäinen plasmidivektori, jossa SV40/GS- ja hCMB/sol-TNF-R-kopioin-tiyksiköt kopioidaan vastakkaisiin suuntiin. Tämä vektori nimettiin psol-TNF-R/P6/PSVLGS:ksi.

5 psol-TNF-R/P6/PSVLGS:llä transfektoitiin CHO-K1- soluja (saatavana ATCC-talletuslaitoksesta, Rockville, MD, jossa hakunumero on CCL 61) seuraavasti. CHO-Kl-soluyksi-kerros kasvatettiin lähes yhteenkasvavaksi minimivaatimus-kasvualustassa (MEM), 10X (Gibco: 330-1581AJ), joka ei 10 sisältänyt glutamiinia ja jota oli täydennetty 10 %:lla dialysoitua nautasikiöseerumia (Gibco: 220-6300AJ), pitoisuudella 1 mM natriumpyruvaatti (Sigma), MEM-ei-välttämät-tömillä aminohapoilla (Gibco: 320-1140AG), pitoisuudella 500 μΜ asparagiini ja glutamaatti (Sigma) ja nukleosideil-15 la (30 μΜ adenosiini, guanosiini, sytidiini ja uridiini ja 10 μΜ tymidiini) (Sigma).

Noin 1 x 106 solua 10 cm:n petrimaljassa transfektoitiin 10 pg:lla psol-TNF-R/P6/PSVLGS:ää käyttäen kal-siumfosfaattivakiosaostusta oleellisesti kuten ovat ku-20 vanneet Graham ja van der Eb, Virology 52 (1983) 456. Soluihin kohdistettiin glyserolishokki (15 % glyserolia seerumia ei sisältävässä kasvualustassa noin 1,5 minuutin ajan) noin 4 tunnin kuluttua transfektoinnista oleellisesti kuten ovat kuvanneet Frost ja Williams, Virology 91 ·. 25 (1978) 39, minkä jälkeen ne pestiin seerumia ei sisältä vällä kasvualustalla. Päivää myöhemmin transfektoiduille soluille annettiin tuoretta selektiivistä kasvualustaa, joka sisälsi MSX:ää loppupitoisuuden 25 μΜ. 3-4 viikon kuluttua voitiin nähdä MSX-resistenttien eloonjääneiden 30 solujen muodostamia pesäkkeitä. Eloonjääneet pesäkkeet siirrettiin 24-kuoppaisille levyille, ja niiden annettiin • · kasvaa yhteen selektiivisessä kasvualustassa. Käsitellystä kasvualustasta yhteenkasvaneita soluja käsittävistä kuopista määritettiin sitten liukoisen TNF-R:n· aktiivisuus 35 käyttäen edellä esimerkissä 1 kuvattua sitoutumismääritys- • · > ., 105099 45 tä. Määritykset osoittivat, että pesäkkeet ilmensivät biologisesti aktiivista liukoista TNF-R:ää.

GS-geenivahvistuksen suhteen valikoimiseksi useita MSX-resistenttejä solulinjoja transfektoidaan psol-TNF-5 R/P6/PSVLGS:llä ja kasvatetaan eri MSX-pitoisuuksissa. Kustakin solulinjasta noin 1 x 106 solua maljoitetaan vähittäin kasvaviin pitoisuuksiin 100 μΜ, 250 μΜ, 500 μΜ ja 1 mM MSX ja inkuboidaan 10 - 14 päivän ajan. 12 päivän kuluttua korkeammille MSX-tasoille resistenttejä pesäk-10 keitä tulee näkyviin. Eloonjääneistä pesäkkeistä määritetään TNF-R-aktiivisuus käyttäen edellä esimerkissä 1 kuvattua sitoutumismääritystä. Kukin näistä hyvin resistentistä solulinjasta sisältää soluja, jotka syntyvät monista riippumattomista vahvistustapahtumista. Näistä solulin-15 joista eristetään yksi tai useampi kaikkein resistenteim-mistä solulinjoista. Vahvistettuja soluja, joiden tuotantotehot ovat korkeita, kloonataan sitten rajaavan laimentamisen kloonauksella. Transfektanttien massasoluviljelmät erittävät aktiivista liukoista TNF-R:ää.

20 Esimerkki 8

Liukoisen humaani-TNF-R:n ilmentäminen hiivassa Liukoinen humaani-TNF-R ilmennettiin hiivassa käyttäen ilmennysvektoria pIXY432, joka saatiin hiivail-mennysvektorista pIXY120 ja plasmidista pYEP352. pIXY120 : 25 on identtinen pYaHuGM:ään (ATCC 53157) nähden lukuunotta matta, että se ei sisällä cDNA-inserttiä ja sisältää po-lyliittäjä/monikloonauskeskuksen, jossa on Ncol-restrik-tiokeskus.

DNA-fragmentti, joka koodittaa TNF-reseptoria ja 30 sopii kloonattavaksi hiivailmennysvektoriin pIXY120, muo-·' dostettiin ensin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) vahvis tamalla solunulkoista osaa täysimittaisesta reseptorista pCAV/NOT-TNF-R:stä (ATCC 68088). Tässä PCR-vahvistuksessa käytettiin seuraavia alukkeita: • · 46 1 0 5 0 9 9 5'-pääaluke: 5'-TTCCGGTACCTTTGGATAAAAGAGACTACAAGGAC Asp718-> ProLeuAspLysArgAspTyrLysAsp 5 GACGATGACAAGTTGCCCGCCCAGGTGGCATTTACA-3'

AspAspAspLys<--------TNF-R---------> 3'-pääaluke (ei-tietosekvenssi): 10 5'-CCCGGGATCCTTAGTCGCCAGTGCTCCCTTCAGCTGGG-3'

BamHl > Loppu <-----------TNF-R------>

Vahvistuksessa käytetty 5'-pääoligonukleotidialuke sisälsi 5’-päässään Asp718-restriktiokeskuksen, ja sen 15 jälkeen nukleotidit, jotka koodattavat hiivan a-tekijäjoh-tosekvenssin 3'-päätä (Pro-Leu-Asp-Lys-Arg), sekä nukleotidit, jotka koodattavat 8 aminohappoa FlagR-peptidistä (AspTyrLysAspAspAspAspLys) fuusioituna sekvenssiin, joka koodittaa kypsän reseptorin 5'-päätä. FlagR-peptidi (Hopp 20 et ai., Bio/Technology 6 (1988) 1204) on hyvin antigeeninen sekvenssi, joka sitoo reversiibelisti monoklonaalisen vasta-aineen Ml (ATCC HB 9259). Oligonukleotidi, jota käytettiin PCR-peräisen fragmentin 3'-pään muodostamiseksi, on ei-tietosäie DNA-koodisekvensseistä, jotka päättävät 25 reseptorin avoimen lukualueen kypsän koodialueen nukleotidin 704 jälkeen (Asp-tähteen jälkeen, joka edeltää trans-membraanialuetta) tuomalla TAA-lopetuskodonin (alleviivattu). Lopetuskodonia seuraa sitten BamHl-restriktiokeskus. TNF-R:ää koodattavat DNA-sekvenssit vahvistetaan sitten 30 PCR:llä, oleellisesti kuten ovat kuvanneet Innis et ai♦, toim., "PCR Protocols: A Guide to Methods and

Applications", Academic Press, 1990.

Liukoista humaani-TNF-R:ää koodittava PCR:llä saatu DNA-fragmentti alakloonattiin hiivailmennysvektoriin 35 p!XY120 pilkkomalla PCR:llä saatu DNA-fragmentti BamHl- ja 47 105099

Asp718-restrlktioentsyymeillä, pilkkomalla pIXY120 BamHI:lia ja Asp718:lla ja ligatoimalla PCR-fragmentti leikattuun vektoriin in vitro T4-DNA-ligaasia käyttäen. Saatu rakenne (pIXY424) fuusioi FlagR-liukoisen TNF-resep-5 torin avoimen lukualueen lukualueella täydelliseen a-tekijä johtosekvenssiin ja sijoitti ilmennyksen hiivassa säädellyn hiiva-alkoholidehydrogenaasi-(ADH2-)promoottorin säätelyyn. pIXY424:ään sisältyvän liukoisen TNF-reseptorin nukleotidisekvenssin identtisyys cDNA-klooni-l:n sisältä-10 miin nähden varmistettiin DNA-sekventoinnilla käyttäen dideoksinukleotidiketjupäämenetelmää. pIXY424 transformoitiin sitten E^ coli -kantaan RR1.

Liukoinen humaani-TNF-reseptori ilmennettiin myös ja eritettiin hiivassa toisessa vektorissa. Tämä toinen 15 vektori muodostettiin ottamalla pIXY424-plasmidi talteen E. colista ja pilkkomalla EcoRI- ja BamHI-restriktioent-syymeillä fragmentin eristämiseksi, joka käsittää ADH2-promoottoria koodittavam alueen, α-tekijäjohtosekvenssin, Flag*-liukoisen TNF-reseptorin ja lopetuskodonin. Tämä 20 fragmentti ligatoitiin in vitro EcoRI:llä ja BamHI:llä leikattuun plasmidiin pYEP352 (Hill et ai., Yeast 2 (19869 163), jolloin saatiin ilmennysplasmidi pIXY432, joka transformoitiin E^ coli -kantaan RR1.

Liukoisen humaani-TNF-reseptorin erityksen hiivasta 25 määrittämiseksi pIXY424 puhdistettiin ja vietiin diploidi-seen cerevisiae -hiivakantaan (XV2181) elektroporaa-tiolla ja valikoimalla plasmidin käsittämän hiiva-TRPl*-geenin siirtymisen suhteen kasvualustalla, josta puuttui tryptofaani. pIXY432:n ohjaaman reseptorierityksen määrit-30 tämiseksi plasmidi vietiin hiivakantaan PB149-6b elektro- poraatiolla, minkä jälkeen valikoitiin plasmidin käsittämän URA3*-geenin suhteen kasvattamalla kasvualustalla, josta puuttui urasiili. Yön yli kasvaneita viljelmiä kasvatettiin 30 °C:ssa tarkoituksenmukaisessa selektiivisessä 35 kasvualustassa. PB149-6b/pIXY434-transformantit laimennet- > ♦ · 48 105099 tiin YEP-1 % glukoosi-kasvualustaan ja kasvatettiin 30 °C:ssa 38 - 40 tunnin ajan. Supernatantit valmistettiin poistamalla solut sentrifugoimalla ja suodattamalla supernatantit 0,45 μ:n suodattimien läpi.

5 Eritetyn reseptorin taso supernatanteissa määritet tiin immuuni-piste blot -määrityksellä. Lyhyesti, 1 μΐ supernatantteja ja supernatanttien laimennoksia tiputettiin nitroselluloosasuodattimille ja annettiin kuivaa. Ei-spesifinen proteiinisitoutuminen salvattiin 3-%:isella 10 BSA-liuoksella, minkä jälkeen suodattimia inkuboitiin laimennetulla Ml-anti-FlagR-vasta-aineella ja ylimääräinen vasta-aine poistettiin pesemällä, minkä jälkeen edelleen piparjuuriperoksidaasiin konjugoitujen anti-hiiri-IgG-vas-ta-aineiden laimennoksia inkuboitiin suodattimien kanssa. 15 Ylimääräiset sekundaarivasta-aineet poistettiin, minkä jälkeen peroksidaasisubstraatit lisättiin ja värinkehityk-sen annettiin kestää noin 10 minuuttia ennen kuin sub-straattiliuos poistettiin.

Supernatanteista tavattu anti-FlagR-reaktiivinen 20 materiaali osoitti, että merkittäviä reseptoritasoja erittyi kummassakin ilmennyssysteemissä. Vertailut osoittivat, että pIXY432-systeemi eritti noin 8-16 kertaa enemmän liukoista humaani-TNF-reseptoria kuin pIXY424-systeemi. Supernatanteista määritettiin liukoisen TNF-R:n aktiivi-25 suus kuten kuvattiin esimerkissä 1 niiden kyvyn nojalla sitoa 125I-TNF-a:aa ja salava TNF-a-sitoutumista. pIXY432-supernatanttien todettiin sisältävän merkittäviä tasoja aktiivista liukoista TNF-R:ää.

Esimerkki 9 30 Hiiri-TNF-R-cDNA-sekvenssien eristäminen .. Hiiri-TNF-R-cDNA-sekvenssejä eristettiin cDNA-kir- jastosta, joka oli valmistettu hiiren 7B9-solulinjasta, joka on antigeeniriippuvainen avustaja-T-solulinja, joka saadaan C57BL/6-hiiristä, ristilajihydridisaatiolla hiimaa-35 ni-TNF-R-koettimeen. cDNA-kirjasto rakennettiin lambda- • · < 49 105099 ZAP:iin (Stratagene, San Diego), oleellisesti kuten kuvattiin edellä esimerkissä 2, eristäen polyadenyloitu RNA 7B9-soluista.

Kaksisäikeinen humaani-TNF-R-cDNA-koetin valmistet-5 tiin leikkaamalla noin 3,5 ke:n NotI-fragmentti humaani-TNF-R-klooni-1:stä ja 32P-leimaamalla cDNA käyttäen satun-naisalukkeita (Boehringer-Mannheim).

Hiiri-cDNA-kirjasto vahvistettiin kerran ja kaikkiaan 900 000 plakkia seulottiin, oleellisesti kuten ku-10 vattiin esimerkissä 2, humaani-TNF-R-cDNA-koettimella.

Noin 21 positiivista plakkia puhdistettiin ja sinikopio-plasmidit, jotka sisälsivät EcoRI-liitteisiä inserttejä, leikattiin (Stratagene, San Diego). Osan hiiri-TNF-R-klooni-llrtä nukleiinihapposekventointi osoitti, että 15 hiiri-TNF-R:n koodisekvenssi oli noin 88-%risesti homologinen vastaavaan humaani-TNF-R-nukleotidisekvenssiin nähden. Hiiri-TNF-R-cDNA-klooni-11:n osanukleotidisekvenssi esitetään kuvioissa 4-5.

Esimerkki 10 20 TNF-R-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus

Valmisteita puhdistetusta yhdistelmä-DNA-TNF-R:stä, esimerkiksi humaani-TNF-R:stä, tai transfektoituja COS-soluja, jotka ilmentävät korkeita TNF-R-tasoja, käytetään 25 TNF-R-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden muodostamiseksi tavanomaisia tekniikoita käyttäen, esimerkiksi US-patenttijulkaisussa 4 411 993 kuvattuja. Tällaiset vasta-aineet ovat todennäköisesti käyttökelpoisia TNF:n sitoutumisen TNF-reseptoreihin häiritsemiseksi, esimerkiksi TNF:n 30 myrkyllisten tai muiden epätoivottavien vaikutusten lievittämiseksi, tai osina TNF:n tai liukoisen TNF-reseptorin diagnoosi- tai tutkimusmäärityksiä.

Hiirten immunoimiseksi TNF-R-immunogeeni emulgoi-daan täydelliseen Freundin tehosteeseen ja määrä 10 -35 100 pg ruiskutetaan ihonalaisesti Balb/c-hiiriin. 10 - 12 • · · so 105099 päivän kuluttua immunoiduille eläimille annetaan tehosteena lisää immunogeenia emulgoituna epätäydelliseen Freundin tehosteeseen, minkä jälkeen annetaan ajoittainen tehoste 1-2 viikon immunointiohjelman mukaisesti. Silloin täl-5 löin otetaan seeruminäytteitä laskemalla verta silmäkuopan takaa tai leikkaamalla hännänpäätä testaamiseksi blot-pis-temäärityksellä (vasta-aine-sandwich) tai ELISA:11a (ent-syymiliitteinen immuunisorbenttimääritys). Muutkin määri-tysmenettelyt ovat sopivia. Kun tarkoituksenmukainen vas-10 ta-ainetiitteri on todettu, positiivisille eläimille annetaan laskimonsisäinenä ruiskeena antigeeniä suolaliuoksessa. 3-4 päivän kuluttua eläimet uhrataan, pernasolut otetaan talteen ja fuusioidaan hiiren myeloomasolulinjaan NS1. Tällä menettelyllä muodostettuja hybridoomasolulinjo-15 ja maljoitetaan useille mikrotiitterilevyille selektiiviseen HAT-kasvualustaan (hypoksantiini, aminopteriini ja tymidiini) ei-fuusioitujen solujen, myeloomahybridien ja pernasoluhybridien lisääntymisen estämiseksi.

Näin muodostetut hybridoomakloonit voidaan seuloa 20 ELISA:11a reaktiivsuuden suhteen TNF:lle, esimerkiksi käyttäen muunnoksia tekniikoista, joita ovat julkistaneet Engvall et ai. , Immunochem. 8 (1971) 871; ja joita julkistetaan US-patenttijulkaisussa 4 703 004. Positiivisia klooneja ruiskutetaan sitten syngeenisten Balb/c-hiirten :·. 25 vatsaonteloon vatsaontelonesteen tuottamiseksi, joka si sältää korkeita pitoisuuksia (> 1 mg/ml) anti-TNF-R-mono-klonaalivasta-ainetta. Saatu monoklonaalinen vasta-aine voidaan sitten puhdistaa ammoniumsulfaatilla seostamalla ja suorittamalla sitten geeliekskluusiokromatografia ja/-30 tai affiniteettikromatografia nojautuen vasta-aineen si- .. toutumiseen proteiini-A:han Staphylococcus aureuksesta.

• · • ·

Claims (12)

105099

1. Eristetty DNA-sekvenssi, joka koodaa biologisesti aktiivista nisäkkään TNF-reseptori (TNF-R) -pro- 5 teiinia ja joka valitaan a) kuvion 2 aminohappoja 1 - x koodaavasta DNA- sekvenssistä, jolloin x valitaan aminohapoista 163 - 235, b) kuvion 2-3 nisäkkään natiivin TNF-R-geenin koodaavan alueen DNA-sekvensseistä, 10 c) DNA-sekvensseistä, jotka kykenevät hybridisoi- tumaan b)-kohdan sekvensseihin kohtalaisen ankarissa olosuhteissa eli 50 °C:ssa 2xSSC:ssä, tai d) DNA-sekvensseistä, jotka ovat degeneroituneita geneettisen koodin seurauksena kohdan b) tai c) sekvens- 15 seihin nähden.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty DNA- sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa liukoista ihmisen TNF-R-proteiinia, joka käsittää kuvion 2 aminohapposekvenssin 1 - 235.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen eristetty DNA- sekvenssi, tunnettu siitä, aminohappotähde 46 on korvattu aminohapolla Ile tai Thr ja aminohappotähde 118 on korvattu aminohapolla Vai tai Ile.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty DNA-J* 25 sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa liu- koista ihmisen TNF-R-proteiinia, joka käsittää kuvion 2 aminohapposekvenssin 1 - 185.

5 Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa liu- 30 koista ihmisen TNF-R-proteiinia, joka käsittää kuvion 2 aminohapposekvenssin 1 - 163.

6. Yhdistelmäilmentämisvektori, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen DNA-sekvenssin.

7. Menetelmä biologisesti aktiivisen nisäkkään TNF- R-proteiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että .. viljellään sopivaa isäntäsolua, joka sisältää patent- 105099 tivaatimuksen 6 mukaisen vektorin ilmentymistä edistävissä olosuhteissa, ja eristetään ja puhdistetaan haluttu tuote.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistettu biologisesti ak- 5 tiivinen nisäkkään TNF-R-proteiini käsittää aminohapposekvenssin, joka valitaan kuvion 2 aminohappotähteistä 1 - x, jolloin x valitaan aminohapoista 163 - 235.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistettu biologisesti ak- 10 tiivinen nisäkkään TNF-R-proteiini käsittää kuvion 2 aminohapposekvenssin 1 - 235.

10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistettu biologisesti aktiivinen nisäkkään TNF-R-proteiini käsittää kuvion 2 15 aminohapposekvenssin 1 - 185.

11. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistettu biologisesti aktiivinen nisäkkään TNF-R-proteiini käsittää kuvion 2 aminohapposekvenssin 1 - 163.

12. Menetelmä terapeuttisesti tai ei- terapeuttisesti käyttökelpoisten vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka sitoutuvat spesifisesti puhdistettuun biologisesti aktiiviseen nisäkkään TNF-R-proteiiniin, joka on valmistettu jonkin patenttivaatimuksista 7-11 mukaisella :* 25 menetelmällä, tunnettu siitä, että joko a) viljellään hybridoomasolua, joka ilmentää vasta-aineita, ja otetaan vasta-aineet talteen tai b) otetaan talteen vasta-aineet, jotka sitoutuvat spesifisesti mainittuun TNF-R-proteiiniin, sopivasti 30 immunisoidusta eläimestä. • · • < • · 53 105099