DD297664A5 - Tumornekrose-faktor-alpha- und -beta-rezeptoren - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Tumornekrose-Faktor-Rezeptorproteine, DNAs und Expressionsvektoren, die fuer TNF-Rezeptoren kodieren, und Verfahren zum Erzeugen von TNF-Rezeptoren als Produkte rekombinanter Zellkulturen.

Description

Hierzu 6 Seiten Zeichnungen

Beschreibung

Diese Anmeldung ist eine Continuation-in-part der USSN 421,417, eingereicht am 13. Oktober 1989 und anhängig, die eine Continuation-in-part der inzwischen aufgegebenen USSN 405,370 vom 11. September 1989 ist, die wieden: ι eine Continuationin-part der inzwischen aufgegebenen USSN 403,241 vom 05. September 1989 ist.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Cytokinrezeptoren, insbesondere auf Tumornekrose-Faktor-Rezeptoren. Tumornekrose-Faktor-a (TNFa, auch als Cachectin bekannt) und Tumornekrose-Faktor-ß (TNFß, ebenso als Lymphotoxin bekannt) sind homologe endogene sekretorische Proteine in Säugetieren, die in der Lage sind, eine Vielzahl von Wirkungen auf eine große Anzahl von Zelltypen auszuüben. Die großen Ähnlichkeiten bei den strukturellen und funktioneilen Merkmalen dieser

beiden Cytokine haben zu ihrer gemeinsamen Bezeichnung als ,TNF" geführt. Komplementäre cDNA-Klone, die für TNFa (Pennlca et al., Nature 312:724,1984) und TNFß (Gray et al., Nature 312:721,1984) kodieren, sind bereits isoliert worden und erlauben eine weitere strukturelle und biologische Charakterisierung von TNF.

TNF-Proteine initiieren ihre biologische Wirkung auf Zellen, indem sie an spezifische TNF-Rezeptor(TNF-R)-Proteine binden, die auf der Plasmamembran auf TNF reagierender Zellen exprimiert werden. Für TNFa und TNFß wurde das erste Mal mit der humanen Zervixkarzinom-Zellinie ME-180 (Aggarwal et al., Nature 318:665,1985) gezeigt, daß sie an einen gemeinsamen Rezeptor binden. Die Größenschätzungen für den TNF-R, bestimmt durch Affinitätsmarkierungsuntersuchungen, lagen im Bereich von 54-175kDa (Creasey et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3293,1987; Stauber et al., J. Biol.Chem. 263:19098,1988; Hohmann et al., J. Biol. Chüm. 264:14927,1989). Obwohl das Verhältnis zwischen diesen TNF-R's verschiedener Molekulargewichte unklar ist, berichteten Hohmann et al. (J. Biol. Chem. 264:14927,1989), c*aß mindestens zwei verschied one Zelloberflächen-Rezeptoren für TNF auf unterschiedlichen Zelltypen existieren. Diese Rezeptoren haben ein apparentes Molekulargewicht von ungefähr 8OkDa beziehungsweise ungefähr 55-6OkDa. Keine dieser Veröffentlichungen berichtete jedoch über die Reinigung der Zelloberflächen-TNF-Rezeptoren bis zur Homogenität.

Zusätzlich zu den Zelloberflächen-Rezeptoren für TNF sind in humanem Urin lösliche Proteine identifiziert worden, die in der Lage sind, TNFzu binden (Peetre et al., Eur. J. Haematol. 41:414,1988; Seckinger et al., J. Exp.Med. 167:1511,1988; Seckingeret al., J. Biol. Chem. 264:11966,1989; GB-Patentanmeldung Nr.2218101 A Seckinger et al.; Engelmann at al., J. Biol. Chem. 264:11974,1989). Das lösliche TNF-bindende Protein aus Urin, das in der GB 2218101A offenbart ist, hat eine partielle N-terminaie Aminosäuresequenz Asp-Ser-Val-Cys-Pro, die der von Engelmann et al. (1989) später offenbarten Partialsequenz entspricht. Die Beziehung der oben genannten löslichen bindenden Proteine aus Urin wurde weiter aufgeklärt, nachdem die ursprüngliche Eiteranmeldung der vorliegenden Anmeldung (USSN 403,241) bereits eingereicht war, als Engelmann et al. über die Identifizierung und Reinigung eines zweiten distinkten löslichen TNF-bindenden Proteins aus Urin mit einer N-terminalen Aminosäuresequenz Val-Ala-Phe-Thr-Pro (J.Biol. Chem. 265:1531,1990) berichteten. Für die beiden in der GB 2218101A und in den Publikationen von Engelmann et al. offenbarten Proteine wurde durch die Fähigkeit eines Antiserums gegen die bindenden Proteine, die TNF-Bindung an gewisse Zellen zu verhindern, gezeigt, daß sie immunchemisch mit zwei anscheinend unterschiedlichen Zeiloberflächenproteinen verwandt waren.

In jüngster Zeit haben zwei getrennte Gruppen über die molekulare Klonierung und Expression eines humanen 55 kDa TNF-R's berichtet (Loetscher et al., Cell 61:351,1990; Schall et al., Cell 61:361,1990). Das TNF-R beider Gruppen hat eine N-terminale Aminosäuresequenz, die der partiellen Aminosäuresequenz des bindenden Proteins aus Urin, das in der GB 2218101A und von Engelmann et al. (1989) und Engelmann et al. (1990) offenbart worden ist, entspricht.

Um das Verhältnis von multiplen Formen von TNF-R und löslichen TNF-bindenden Proteinen aus Urin zu erhellen, oder um die strukturellen und biologischen Merkmale von TNF-R's und die Rolle der TNF-R's bei der Antwort verschiedener Zellpopulationen auf die Stimulation durch TNF oder andere Cytokine zu untersuchen, oder um die TNF-R's effizient bei der Therapie, Diagnose oder im Test zu verwenden, waren gereinigte Zusammensetzungen der TNF-R vonnöten. Solche Zusammensetzungen sind jedoch in praktikablen Ausbeuten nur durch Klonierung und Expression von Genen, die für Rezeptoren kodieren, unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie erhältlich. Die Bemühungen, ein TNF-R-Molekül für die Verwendung in biochemischen Untersuchungen zu reinigen oder Säugetiergene, die für TNF-R kodieren, zu Monieren und zu exprimieren, sind jedoch mangels einer geeigneten Quelle des Rezeptor-Proteins oder der mRNA erschwert. Vor der vorliegenden Erfindung waren keine Zellinien bekan.it, die einen hohen Spiegel von TNF-R konstitutiv und kontinuierlich exprimierten, was eine Reinigung des Rezeptors für die Sequenzierung oder Konstruktion von Genbanken für die cDNA-Klonierung von vornherein ausschloß.

Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte TNF-Rezeptoren und DNA-Sequenzen, die für Tumornekrose-Faktor-Rezeptoren (TNF-R) in Säugetieren, insbesondere menschliche TNF-R's, kodieren. Solche DNA-Sequenzen umfassen (a) cDNA-Klone mit einer von dem kodierenden Bereich eines nativen TNF-R-Genes abgeleiteten Nukleotidsequenz; (b) DNA-Sequenzen, die zur Hybridisierung mit den cDNA-Klonen nach (a) unter mäßig stringenten Bedingungen in der Lage sind und für biologisch aktive TNF-R-Moleküle kodieren; oder (c) DNA-Sequenzen, die infolge des genetischen Kodes im Verhältnis zu den in (a) und (b) definierten DNA-Sequenze. '^generiert sind und die für biologisch aktive TNF-R-Moleküle kodieren. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere DNA-Sequenzen, die für lösliche TNF-Rezeptoren kodieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin rekombinante Expressionsvektoren, die die oben definierten DNA-Sequenze' umfassen, rekombinante, unter Verwendung der rekombinanton Expressionsvektoren hergestellte TNA-R-Moleküle und Verfahren zum Herstellen der rekombinanten TNF-R-Moleküle unter Verwendung der Expressionsvektoren. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin isolierte oder gereinigte Proteinzusammensetzungen, die TNF-R umfassen, insbesondere solche, die lösliche Formen von TNF-R enthalten.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Zusammensetzungen für die Verwendung zur Therapie, Diagnose oder dem Test von TNF-R oder zur Erzeugung von Antikörpern gegen TNF-R, die wirksame Mengen löslichen nativen oder rekombinanten Rezeptorproteins umfassen, das gemäß den vorstehenden Verfahren hergestellt worden ist. Aufgrund der Fähigkeit von TNF, spezifisch an TNF-Rezeptoren (TNF-R's) zu binden, werden gereinigte TNF-R-Zusammensetzungen in diagnostischen Tests für TNF sowie zum Erzeugen von Antikörpern gegen den TNF-Rezeptor für die Verwendung bei Diagnose und Therapie nützlich sein. Zusätzlich können gereinigte TNF-Rezeptor-Zusammensetzungen direkt in der Therapie zum Binden oder Abfangen von TNF verwendet werden, und so ein Mittel zum Regulieren der Immunaktivität dieses Cytokine bereitstellen

Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende detaillierte Beschreibung erläutert.

Figurenbeschreibung Figur 1 ist eine schematische Darstellung der kodierenden Region verschiedener cDNAs, die für humane und murine TNF-R's

kodieren. Die Leader(Führer)sequenz ist schraffiert und der Transmembranbereich fett gedruckt.

Figur 2 A-2 B zeigt die partielle cDNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des humanen TNF-R-Klones 1. Die Nukleotide werden am Anfang des 5'-untranslatierten Bereiches beginnend numeriert. Die Aminosäuren sind vom Beginn der

Signalpeptidsequenz numeriert. Die mutmaßliche Signalpeptidsequenz wird durch die Aminosäuren -22 bis -1 dargestellt. Das N-terminale Leucin des reifen TNF-R-Protelns ist an Position 1 unterstrichen. Die vorhergesagte Transmembranregion der Aminosäuren 23β-265 ist ebenso unterstrichen. Die C-Terminl verschiedener löslicher TNF-R's sind mit einem Pfeil (|) markiert. Figur 3A-3C zeigt die cDNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des murinen TNF-R-Klones 11. Die mutmaßliche Signalpeptidsequenz wird durch die Aminosäuren -22 bis -1 dargestellt. Das N-terminale Valin des reifen TNf-R-Proteins ist an Position 1 unterstrichen. Der vorhergesagte Transmembranbereich der Aminosäuren 234-265 Ist ebenso unterstrichen.

Definitionen

So wie sie hier verwendet werden, bezeichnen die Ausdrücke „TNF-Rezeptor" und „TNF-R" Proteine mit Aminosäuresequenzen, die Im wesentlichen gleichartig mit nativen TNF-Rezeptor-Aminosöuresequenzen aus Säugetieren sind, und die nach der unten gegebenen Definition biologisch aktiv dahingehend sind, daß sie in der Lage sind, TNF-Moleküle zu binden und ein durch die Bindung eines TNF-Moleküls an eine Zelle initiiertes biologisches Signal zu transduzieren, oder mit anti-TNF-R-Antikörpern, die gegen TNF-R natürlicher Herkunft (d. h„ nicht rekombinant) erzeugt werden, kreuzzureagieren. Der reife humane TNF-R voller Länge ist ein Glycoproteln mit einem Molekulargewicht von ungefähr 80 Kilodalton (kDa). So wie er hier in der gesamten Beschreibung verwendet wird, bezeichnet der Ausdruck „reif ein Protein, das in einer Form ohne Leadersequanz exprimiert wird, die in Transkripten gesamter Länge eines nativen Genes vorhanden sein kann.

Experimente unter Verwendung von COS-Zellen, die mit einer für TNF-rt voller Länge kodierenden cDNA transfiziert worden waren, zeigten, daßTNF-R ¹²⁶J-TNFa mit einem apparenten K, von ungefähr 5 χ 10^β M"¹ band, und daß TNF-R ^U6J-TNFß mit einem apparenten K, von ungefähr 2 χ 10* M~' band. Die Ausdrücke «TNF-Rezeptor" oder „TNF-R" umfassen Analoge oder Untereinheiten nativer Proteine mit mindestens 20 Aminosäuren, die mindestens etwas biologische Aktivität mit TNF-R gemeinsam haben, beispielsweise lösliche TNF-R-Konstrukte ohne oine Transmembranregion (die aus der Zelle sezerniert werden), aber ihre Fähigkeit.TNF zu binden, erhalten, ohne darauf beschränkt zu sein. Verschiedene bioäquivalente Protein- und Aminosäureanaloge werden im folgenden detailliert beschrieben.

Die hier für TNF-R-Analoge verwendete Nomenklatur folgt dor Konvention, das Protein (beispielsweise TNF-R) zu nennen, dem entweder hu (für human) oder mu (für murin) vorangestellt \A und dem ein Δ (um Deletionen zu bezeichnen) und die Nummer der C-termlnalen Aminosäure nachgestellt wc Ίβη. Beispielsweise bezeichnet TNF-RA235 ein humanes TNF-R mit Asp²³⁵ als C-terminaler Aminosäure (d. h., ein Polypeptid mit der Sequ inz der Aminosäuren 1-235 von Figur 2 A). In Abwesenheit irgendeiner humanen oder murinen Artbezeichnung bezieht eich TNF-R im allgemeinen auf Säugetier TNF-R. Gleichermaßen bezeichnet der Ausdruck TNF-R in Abwesenheit irgendeiner speziellen Bezeichnung für Deletionsmutanten alle Formen von TNF-R, einschließlich von Mutanten und Analogen, die die biologische Aktivität von TNF-R besitzen. „Lösliches TNF-R" oder „sTNF-R", so wie ts im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezeichnet Proteine oder im wesentlichen äquivalente Analoge mit einer Aminosäuresequenz, die dem ganzen oder einem Teil des extrazellulären Bereiches nativen TNF-R's entsprechen, beispielsweise huTNF-RA235, huTNF-RA185 und huTNF-RA163, oder Aminosäuresequenzen, die im wesentlichen den Sequenzen der Aminosäuren 1-163, den Aminosäuren 1-185, oder den Aminosäuren 1-235 von Figur 2A ähnlich sind und insofern biologisch aktiv sind, daß sie an den Liganden TNF binden. Äquivalente lösliche TNF-R's umfassen Polypeptide, die von diesen Sequenzen durch eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen oder Additionen abweichen und die Fähigkeit beibehalten, TNF zu binden oder die TNF-Signaltransduktionsaktivität via die zelloberflächengebundenen TNF-Rezeptorproteine zu inhibieren, be^!< * '«Isweise huTNF-RAx, wobei χ aus der jede der Aminosäuren 163-235 der Figur 2 A umfassenden Gruppe ausgewählt Ist. Analoge Deletionen können an muTNF-R durchgeführt werden. Die Inhibition der TNF-Signaltransduktionsaktivität kann durch Transfektion der Zellen mit rekombinanten TNF-R-DNAs zum Erhalt der Expression rekombinanten Rezeptors bestimmt werden. Die Zellen werden dann mit TNF in Berührung gebracht und die resultierenden metabolischen Wirkungen untersucht. Wenn eine Wirkung erfolgt, die der Aktion des Liganden zuzuordnen ist, dann hat der rekombinante Rezeptor Signaltransduktionsaktivität. Beispielhafte Verfahren für die Untersuchung, ob ein Polypeptid Signaltransduktionsaktivität hat, sind von Idzerda et al., J. Exp. Med. 171 ;861 (1990); Curtis et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:3045 (1989); Prywes et al., EMBOJ. 5:2179 (1986) und Chou et al., J. Biol. Chem. 262:1842 (1987) offenbart. Alternativ könnten primäre Zellen oder Zellinien, die einen endogenen TNF-Rezeptor exprimieren und eine nachweisbare biologische Antwort auf TNF aufweisen, verwendet werden.

Der Ausdruck „isoliert" oder „gereinigt", wie er im Zusammenhang mit der Beschreibung zur Definition der Reinheit von TNF-R-Protein oder -Proteinzusammensetzungen verwendet wird, bedeutet, daß das Protein oder die Proteinzusammensetzung im wesentlichen frei von anderen Proteinen natürlichen oder endogenen Ursprungs ist und weniger als ungefähr 1 %, bezogen auf die Masse, an Proteinkontaminationen, die vom Herstellungsverfahren übrig geblieben sind, enthält. Solche Zusammensetzungen können jedoch andere, als Stabilisatoren, Träger, Korrigenzien oder Co-Therapeutika zugesetzte Proteine enthalten. TNF-R ist „isoliert", wenn es als eine einzelne Proteinbande in einem Polyacrylamidgol durch Silberfärbung nachweisbar ist.

Der Ausdruck „im wesentlichen gleichartig " bedeutet, wenn er zur Definition entweder von Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzen verwendet wird, daß eine gegebene Sequenz, beispielsweise eine Mutantensequenz, von einer Referenzsequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen oder Additionen abweicht, deren Netto-Effekt darin liegt, die biologische Aktivität des TNF-R-Proteines zu erhalten, wie beispielsweise in einem der TNF-R-Bindungstests, wie sie in Beispiel 1 (s. u.) beschrieben sind, bestimmt werden kann. Alternativ sind Nukleinsäure-Untereinheiten und -analoge „im wesentlichen gleichartig" mit den hier offenbarten spezifischen DNA-Sequenzen, wenn (a) die DNA-Soquenz von dem kodierenden Bereich eines nativen TNF-R-Genes aus Säugetieren abgeleitet ist; (b) die DNA-Sequenz zur Hybridisierung mit DNA-Sequenzen nach (a) unter mäßig stringenten Bedingungen (5O⁰C, 2 χ SSC) in der Lage ist und für biologisch aktive TNF-R-Moleküle kodiert; oder DNA-Sequenzen, die infolge des genetischen Kodes im Verhältnis zu den in (a) oder (b) definierten DNA-Sequenzen degeneriert sind und für biologisch aktive TNF-R-Moleküle kodieren.

„Rekombinant", so wie es hier verwendet wird, bedeutet, daß ein Protein mit rekombinanten (beispielsweise mikrobiellen oder Säugetier·) Expressionssystemen erhalten wird.

„Mikrobiell" bezeichnet in bakteriellen oder Pilz- (beispielsweise Hefe-) Expressionssystemen hergestellte rekombinante Proteine. Im Falle eines Produktes bezeichnet „rekombinant mikrobiell" ein Protein, das in einem mikrobiellen Expressionssystem erzeugt ist und im wesentlichen frei von nativen endogenen Substanzen ist. Das in den meisten bakteriellen

Kulturen, beispielsweise E.coll erzeugte Protein wird Glykan-frei sein. In Hefe exprlmierte Proteine können ein von der Expression in Sä'igetlerzellen unterschiedliches Glykosylierungsmuster aufweisen.

„Biologisch aktiv", sowie es in der ganzen Beschreibung als ein Merkmal derTNF-Rezeptoren verwendet wird, bedeutet, daß ein besonderes Molekül eine ausreichende Aminosäuresequenzgleichartigkeit mit den erfindungsgemäß offenbarten Ausführungsformen teilt, so daß es fähig ist, nachweisbare Mengen von TNF zu binden, einen TNF-Stimulus auf die Zelle zu übertragen, beispielsweise als ein Bestandteil eines Hybrid-Rezeptorkonstruktes, oder mit enti-TNF-R-Antikörpern, die gegen TNF-R natürlicher (d. h., niclit rekombinanter) Harkunft erzeugt werden, kreuzzureagieren. Bevorzugt sind die erfindungsgemäßen biologisch aktiven TNF-Rezeptoren zur Bindung von mehr als 0,1 nMolen TNF pro nMol Rezeptor fähig, besonders bevorzugt von mehr als 0,5nMol TNF pro nMol Rezeptor in Standardbindungstests (s. unten). „Isolierte DNA-Sequenz" bezeichnet ein DNA-Polymer in Form eines separaten Fragmentes oder als Bestandteil eines größeren DNA-Konstruktes, das von DNA abgeleitet ist, die mindestens einmal in im wesentlichen reiner Form isoliert worden ist, d. h., frei von kontaminierenden endogenen Materialien und in einer Menge oder Konzentration, die die Identifizierung, Manipulation und Rückgewinnung der Sequenz und der Nukleotidsequenzbestandteile mit Standardverfahren der Biochemie, beispielsweise unter Verwendung eines Klonierungb .',ktors, ermöglicht. Solche Sequenzen werden bevorzugt in Form eines offenen Leserahmens bereitgestellt, der durch interne, nicht translatierte Sequenzen oder Introns, die typischerweise In eukaryontischen Genen vorhanden sind, nicht unterbrochen wird. Die relevante Sequenzen enthaltende genomische DNA könnte als eine Quelle für die kodierenden Sequenzen verwendet werden. Sequenzen nicht translatierter DNA können im 5'- oder 3'-Bereich des offenen Leserahmens vorhanden sein, wo sie nicht mit der Manipulation oder Expression der kodierenden Bereiche interferieren. „Nukleotid. equenz" bezeichnet ein Heteropolymer aus Desoxyribonukleotiden. DNA-Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen Proteine kodieren, können auch aus cDNA-Fragmenten und kurzen Oligonukleotidlinkern oder aus einer Serie von Oligonukleotiden zusammengesetzt werden, um so ein synthetisches Gen bereitzustellen, das in einer rekombinanten Transkriptionseinheit exprimiert werden kann.

Isolierung von für TNF-R kodierenden cDNAs

Die kodierende Sequenz des TNF-R's wird durch Isopren einer komplementären DNA (cDNA)-Sequenz, die für TNF-R kodiert, aus einer rekombinanten cDNA- oder genomischen DNA-Bank erhalten. Eine cDNA-Bank wird bevorzugt konstruiert, indem polyadenylierte mRNA aus einer speziellen Zellinie, die Säugetier TNF-R exprimiert, beispielsweise der humanen Fibroblasten-Zellinie WI-26 VA4 (ATCC CCL 95.1), erhalten wird und die mRNA als eine Matrize für die Synthese doppelsträngiger cDNA verwendet wird. Die doppelsträngige cDNA wird dann in einen rekombinanten Vektor verpackt, der in einen geeigneten E.coli-Stamm eingeführt wird und propagiert wird. Ebenso können murine oder andere Säugetier-Zellinien, die TNF-R exprimieren, verwendet werden. In der cDNA enthaltene TNF-R-Sequenzen können leicht durch Screenen (Auslesen) der Bank mit einer geeigneten Nukleinsäureprobe, die mit der TNF-R-cDNA hybridisieren kann, identifiziert werden. Alternativ können die für TNF-R-Proteine kodierenden DNAs durch Ligieren synthetischer Oligonukleotid-Untereinheiten, die der gesamten oder einem Teil der Sequenz der Figuren 2 A-2 B oder 3A-3C entsprechen, zusammengesetzt werden, um eine vollständige kodierende Sequenz bereitzustellen.

Die erfindungsgemäßen humanen TNF-Rezeptor-cDNAs wurden durch das Verfahren der direkten Expressionsklonierung isoliert. Es wurde eine cDNA-Bank konstruiert, indem zuerst cyioplasmatische mRNA aus der humanen Fibroblasten-Zellinie WI-26 VA4 isoliert wurde. Die polyadenylierte RNA wurde isoliert und zur Herstellung doppelsträngiger cDNA verwendet. Gereinigte cDNA-Fragmente wurden dann in pCAV/NOT Vektor-DNA ligiert, die von pDC 201 (einem Derivat von pMLSV, vorbeschrieben von Cosman et al., Nature 312:768,1984), SV40- und Cytomegalovirus-DNA abgeleitete Regulationssequenzen enthält, wie im einzelnen weiter unten im Beispiel 2 beschrieben ist. pCAV/NOT ist bei der American Type Culture Collection mit der Hinterlegungsnummer ATCC 68014 hinterlegt worden. Die pCAV/NOT-Vektoren, die Wl 26-VA4 cDNA-Fragmente enthielten, wurden in den E. coll DH 5 α transformiert. Die Transformanten wurden so ausgestrichen, daß ungefähr 800 Kolonien pro Platte bereitgestellt wurden. Die resultierenden Kolonien wurden geerntet und jeder Pool verwendet, um Plasmid-DNA für die Transfektion in COS-7-Zellen, im wesentlichen wie von Cosman et al. (Nature 312:768,1984) und Luthman et al. (Nucl. Acid Res. 11:1295,1983) beschrieben, herzustellen. Biologisch aktive Zelloberflächen-TNF-Rezeptorenexprimierende Transformanten wurden durch Überprüfen ihrer Fähigkeit, ¹²⁵J-TNFzu binden, identifiziert. Für diesen Screenlng-Ansatz wurden tranfizirte COS-7-Zellen mit "⁵J-TNF enthaltendem Medium inkubiert, die Zellen gewaschen, um nicht gebundenes markiertes TNF zu entfernen, und die Zelleinzelschichten mit einem Röntgenfilm in Berührung gebracht, um die Konzentrationen der TNF-Bindung nachzuweisen, wie es von Sims et al., Science 241:585 (1988) offenbart ist. Auf diese Weise nachgewiesene Transfektanten erscheinen als schwarze Foci gegen einen relativ hellen Hintergrund.

Unter Verwendung dieses Ansatzes wurden ungefähr 240000 cDNAs in Pools van ungefähr 800 cDNAs untersucht, bis der Test eines Transfektanten-Pools auf positive Foci für die TNF-Bindung hinwies. Eine gefrorene Stammlösung von Bakterien dieses positiven Pools wurde in Kultur angezogen und ausgestrichen, um individuelle Kolonien bereitzustellen, die untersucht wurden, bis ein einzelner Klon (Klon 11) identifiziert wurde, der zur direkten Synthese eines Oberflächenproteins mit nachweisbarer TNF-Bindungsaktivität in der Lage war. Die Sequenz des mit diesem Verfahren isolierten cDNA-Klones 11 ist in den Figuren 3 A-3C widergegeben.

Zusätzliche cDNA-Klone können aus cDNA-Banken anderer Säugetierarten durch Hybridisierung zwischen den Arten isoliert werden. Für die Verwendung zur Hybridisierung kann die für TNF-R kodierende DNA kovalent mit einer nachweisbaren Substanz, beispielsweise einer fluoreszierenden Gruppe, einem radioaktiven Atom oder einer chemilumineszierenden Gruppe mit dem Fachmann bekannten Verfahren markiert werden. Solche Proben könnten ebenso für die In-vitro-Diagnose besonderer Zustände verwendet werden.

Wie die meisten Säugetiergene, werden die Säugetier-TNF-Rezeptoren wahrscheinlich von mul'i-exon Genen kodiert. Alternative mRNA-Konstrukte, die verschiedenen mRNA Spleiß-Ereignissen im Anschluß an die Transkription zugeschrieben werden können, und die große identische oder ähnliche Bereiche mit den hier beanspruchten cDNA's teilen, werden als im Bereich mit den hier beanspruchten cDNA's teilen, werden als im Bereich der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet. Weitere Säugetier TNF-R-cDNAs werden unter Verwendung von geeigneten humanen TNF-R-DNA-Sequenzen als Proben zum Screenen einer speziellen Säugetier cDNA-Bank durch Hybridisierung zwischen den Arten isoliert. *''

Proteine und Analoge

Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte rekombinante Säugetier TNF-R-Polypeptide. Erfindungsgemäße isolierte TNF-R-Polypeptide sind im wesentlichen frei von kontaminierenden Materialien natürlichen oder endrgenen Ursprungs und enthalten weniger als ungefähr 1 %, bezogen auf die Masse, Proteinkontaminationen, die aus dem Produktionsverfahren herrühren. Die nativen humanen TNF-R-Moleküle werden aus Zell-Lysaten als Glykoproteine mit einem apparenten Molekulargewicht in der SDS-PAGE von ungefähr 80 Kilodalton (kDa) gewonnen. Die erfindungsgemäßen TNF-R-Polypeptide haben gegebenenfalls keine assoziierte Glykosylierung im nativen Muster.

Erfindungsgemäße Säugetier-TNF-R umfassen beispielsweise Primaten-, Menschen-, Mäuse-, Hunde-, Katzen-, Rinder-, Schaf-, Pferde- und Schweine-TNF-R. Säugetier-TNF-R's können durch Hybridisierung zwischen den Arten erhalten werden, wobei eine einzelsträngige cDNA, die von der humanen TNF-R DNA-Sequenz abgeleitet ist, als Hybridisierungsprobe zur Isolierung TNF-R cDNAs von Säugetiere-cDNA-Banken verwendet wird.

Derivate von TNF-R im Schutzbereich dieser Erfindung umfassen weiterhin verschiedene strukturelle Formen des primären Proteins mit erhaltener biologischer Aktivität. Infolge der Gegenwart von ionisierbaren Amino- und Carboxylgruppen kann das TNF-R-Protein beispielsweise in der Form von sauren oder basischen Salzen oder in neutraler Form vorliegen. Ebenso können individuelle Aminosäurereste durch Oxidation oder Reduktion modifiziert werden.

Die primäre Aminosäurestruktur kann durch Bildung kovalenter oder aggregativer Konjugate mit anderen chemischen Gruppen, beispielsweise Glykosylgruppen, Lipiden, Phosphaten, Acetylgruppen oder ähnlichem oder durch Schaffen von Aminosäuresequenz-Mutanten modifiziert werden. Kovalente Derivate werH in durch Verbinden bestimmter funktioneller Gruppen mit TNF-R-Aminosäureseitenketten oder den N- oder C-Termini hergestellt. Andere Derivate von TNF-R im Schutzbereich dieser Erfindung umfassen kovalente oder aggregative Konjugate von TNF-R oder seinen Fragmenten mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, beispielsweise durch Synthese in rekombinanter Kultur als N-terminale oder C-terminale Fusionen. Beispielsweise kann das konjugierte Peptid eine Signal (oder Leador)-Polypeptidsequenz an der N-terminalen Region des Proteins sein, das co-translational oder post-translatlonal den Transfer des Proteins von der Stelle seiner Synthese zur Stelle seiner Funktion innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder -Wand (beispielsweise der Hefe a-Faktor-Leader) steuert. TNF-R-Proteinfusionen können angeheftete Peptide umfassen (beispielsweise Poly-His), um die Reinigung oder Identifizierung von TNF-R zu erleichtern. Die Aminosäuresequenz des TNF-Rezeptors kann weiterhin mit dem Peptid Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp et al., Bio/Technology 6:1204,1988) verbunden werden. Die letztgenannte Sequenz ist hoch antigen und stellt ein Epitop zur Verfugung, das von einem spezifischen monoklonalen Antikörper reversibel gebunden wird, was einen schnellen Test ermöglicht und die Reinigung des exprimierten rekombinanten Proteins erleichtert. Diese Sequenz wird außerdem spezifisch durch die Rindermukosa-Enterokinase am unmittelbar der Asp-Lys-Paarung folgenden Rest gespalten. Mit diesem Peptid geschützte Fusionsproteine können ebenso gegen den intrazellulären Abbau in E. coil beständig sein. TNF-R-Derivate können auch als Immunogene, Reagenzien in Immuntests auf Rezeptorbasis oder als Bindungsmittel für Affinitätsreinigungsverfahren von TNF oder anderen bindenden Liganden verwendet werden. TNF-R-Derivate können weiterhin durch quervernetzende Mittel, beispielsweise N-Maleimidobenzoylsuccinimidester und N-Hydroxysuccinimid, an Cystein- und Lysinresten erhalten werden. TNF-R-Proteine können weiterhin durch reaktive Seitengruppen kovalent an verschiedene unlösliche Substrate, beispielsweise Bromcyan-aktivierte, Bisoxiran-aktivierte, Carbonyldiimidazol-aktivierte oderTosylaktivierte Agarose-Strukturen oder durch Adsorbtion an Polyolefin-Oberflächen (mit oder ohne Glutaraldehyd-Quervernetzung) gebunden werden. Nach Bindung an ein Substrat kann TNF-R verwendet werden, um selektiv anti-TNF-R Antikörper oderTNFzu binden (zu Test- oder Reinigungszwecken).

Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin TNF-R im oder ohne assoziierte Glykosylierung mit nativen Muster. In Hefe- oder Säugetier-Expressionssystemen, beispielsweise COS-7-Zellen, exprimiertes TNF-R kann dem nativen Molekül ähnlich oder leicht unterschiedlich hinsichtlich des Molekulargewichtes und Glykosylierungsmusters sein, was vom Expressionssystem abhängt. Expression von TNF-R-DNAs in Bakterien, beispielsweise E.coil, führt zu nicht glykosylierten Molekülen. Funktionelle mutierte Analoge von Säugetier-TNF-R mit inaktivierten N-Glykosylierungsstellen können durch Oligonukleotidsynthese und Ligation oder mittels Stellen-spezifischer Mutageneseverfahren hergestellt werden. Diese analogen Proteine können in homogener Form mit reduzierten Kohlehydraten in guter Ausbeute unter Verwendung von Hefe-Expressionssystemen hergestellt werden. N-Glykosylierungsstellen in eukaryontischen Proteinen sind durch dasAminosäure-Triplett Asn-ApZ gekennzeichnet, wobei Ai jede Aminosäure außer Pro ist, und Z Ser oder Thr ist. In dieser Sequenz stellt Asparagin eine Seitenkettenaminogruppe für das kovalente Anheften von Kohlenhydraten zur Verfugung. Eine solche Stelle kann durch Substitution von Asn oder des Restes Z durch eine andere Aminosäure, Deletion von Asn oder Z oder durch Insertion einer nicht-Z Aminosäure zwischen Ai und Z oder einer von Asn verschiedenen Aminosäure zwischen Asn und A₁ eliminiert werden. TNF-R-Derivate können außerdem durch Mutationen von TNF-R oder seinen Untereinheiten erhalten werden. Eine TNF-R Mutante, so wie hier darauf Bezug genommen wird, ist ein mit TNF-R homologes Poly peptid, das jedoch eine von nativen TNF-R unterschiedliche Aminosäuresequenz infolge einer Deletion, Insertion oder Substitution hat.

Bioäquivalente Analoge von TNF-R-Proteinen können beispielsweise durch Einführen verschiedener Substitutionen von Resten oder Sequenzen oder Deletion terminaler oder interner Reste von Sequenzen, die für die biologische Aktivität nicht erforderlich sind, konstruiert werden. Beispielsweise können Cysteinreste (beispielsweise Cys"⁸) deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, um die Bildung unnötiger oder inkorrekter intramolekularer Disulfidbrücken nach Renaturierung zu verhindern. Andere Ansätze zur Mutagenese umfassen die Modifikation benachbarter dibasischer Amiosäruereste, um die Expression in Hefesystimen mit KEX2-Proteaseaktivität zu steigern. Im allgemeinen sollten Substitutionen konservativ vorgenommen werdei; d. h„ die bevorzugten Ersatzaminosäuren sind solche, deren physikochemische Charakteristika denen der zu ersetzenden Reste ähneln. Gleichermaßen sollte, wenn eine Deletions- oder Insertionsstrategie angewendet wird, der mögliche Effekt der Deletion oder Insertion auf die biologische Aktivität berücksichtigt werden. Im wesentlichen ähnliche Polypeptidsequenzen, so wie sie oben definiert sind, umfassen im allgemeinen eins ähnliche Anzahl von Aminosäuresequenzen, obwohl C-terminale Verkürzungen zum Zweck der Konstruktion löslicher TNF-R's weniger Aminosäuresequenzen enthalten werden. Um die biologische Aktivität von TNF-R zu erhalten, werden Deletion und Substitution bevorzugt zu homologen oder konservativ substituierten Sequenzen führen, was bedeutet, daß ein gegebener Rest durch einen biologisch ähnlichen Rest ersetzt wird. Beispiele konservativer Substitutionen umfassen Substitutionen eines aliphatischen Restes durch einen anderen,

beispielsweise lie, VaI₁ Leu oder AIa füreinander, oder Substitutionen eines polaren Restss für einen anderen wie zwischen Lys und Arg; GIu und Asp; oder GIn und Asn. Weitere solche konservativen Substitutionen, beispielsweise Substitution von ganzen Bereichen mit ähnlichen Hydrophobizitätsmerkmalen, sind gut bekannt. Darüber hinaus sind besondere Amino&äure-Unterschiede zwischen humanen, murinen und anderen Säugetier-TNF-R's ein Hinweis für zusätzliche konservative Substitutionen, die vorgenommen werden können, ohne die wesentlich biologischen Eigenschaften von TNFR zu verändern. Untereinheiten von TNF-R können durch Deletion terminate!' oder interner Reste oder Sequenzen konstruiert werden. Besonders bevorzugte Sequenzen umfassen solche, in denen die Transmembranregion und intrazellulären Domänen von TNF-R deletiert oder durch hydrophile Reste substituiert sind, und die Sekretion des Rezeptors in das Zellkulturmedium zu erleichtern. Das resultierende Protein wird als ein lösliches TNF-R-Molekül bezeichnet, das seine Fähigkeit zur Bindung von TNF beibehält. Ein besonders bevorzugtes lösliches TNF-R-Konstrukt ist TNF-R Δ235 (die Sequenz der Aminosäuren 1-235 von Figur 2A), das die gesamte extrazelluläre Region von TNF-R umfaßt und mit Asp²³⁶ unmittelbar benachbart der Transmembran-Region endet. Zusätzliche Aminosäuren können aus der Transmambran-Region unter Erhalt der TNF-Bindungsaktivität deletiert werden. Beispielsweise ist bei huTNF-RA183, das die Sequenz der Aminosäuren 1-183 von Figur 2 A umfaßt, und bei TNF-R Δ163, das die Sequenz der Aminosäuren 1-163 von Fugur 2 Aumfaßt, die Fähigkeit zur Bindung von TNF-Liganden erhalten, wie durch die unten in Beispiel 1 beschriebenen Bindungstests bestimmt wird. TNF-RA142 hat jedoch die Fähigkeit zur Bindung von TNF-Llgand nicht beibehalten. Das weist darauf hin, daß einer oder beide der Cys¹⁶⁷· und Cys¹⁶³-Reste zur Bildung einer intramolekularen Disulfidbrücke für die korrekte Faltung von TNF-R erforderlich ist. Cys¹⁷⁸, das ohne irgendeinen offensichtlichen nachteiligen Effekt auf die Fähigkeit löslichen TNF-R's zur Bindung von TNF deletiert wurde, scheint nicht essentiell für die korrekte Faltung von TNF-R zu sein. Daher würde erwartet werden, daß jede Deletion C-terminal von Cys'⁶³ zu einem biologisch aktiven löslichen TNF-R führen würde. Die vorliegende Erfindung umfaßt solche löslichen TNF-R-Konstrukte, die dem gesamten oder einem Teil des extrazellulären Bereiches von TNF-R, mit irgendeiner Aminosäure nach Cys¹⁶³ endend, entsprechen. Andere C-terminale Deletionen, beispielsweise TNF-FA157, können durch Schneiden von TNF-R-cDNA mit geeigneten Restriktionsenzymen und notfalls durch Rekonstruktion spezifischer Sequenzen mit synthetischen Oligonukleotidlinkern hergestellt werden. Die resultierenden löslichen TNF-R-Konstrukte werden dann insertiert und in angemessenen Expressionsvektoren exprimiert und auf ihre Fähigkeit zur Bindung von TNF getestet, wie in Beispiel 1 beschrieben. Biologisch aktive lösliche TNF-R's, die aus solchen Konstruktionen resultieren, werden ebenfalls als innerhalb des Schutzbereiches dieser Erfindung liegend angesehen.

Mutationen der Nukleotidsequenzen, die für die Expression von analogem TNF-R konstruiert werden, müssen natürlich das Leseraster der kodierend in Sequenzen erhalten und bevorzugt keine komplementären Regionen schaffen, die hybridisieren könnten, um sekundäre mRNA-Strukturen, beispielsweise Schleifen oder Haarnadel-Strukturen, zu erzeugen, die die Translation der Rezeptor-mRNA nachteilig beeinflussen würden. Obwohl eine Mutationsstelle vorgegeben sein kann, ist es nicht notwendig, daß die Natur der Mutation per se vorbestimmt ist. Beispielsweise kann zur Auswahl der optimalen Charakteristika von Mutanten an einer gegebenen Stelle eine Zufallsmutagenese am Zielkodon durchgeführt werden und die exprimierten TNF-R-Mutanten auf die gewünschte Aktivität untersucht werden.

Nicht alle Mutationen der Nukleotidsequenz, die für TNF-R kodiert, werden im Endprodukt exprimiert werden; beispielsweise können Nukleotidsubstitutionen vorgenommen werden, um die Expression zu beschleunigen, insbesondere, um Sekundärstrukturschleifen in der transkribierten mRNA (siehe EPA 75,444A₁ auf die hiermit Bezug genommen wird) zu vermeiden, oder um Kodons bereitzustellen, die im ausgewählten Wirtsstamm bereitwillig exprimiert werden, beispielsweise die gut bekannten, von E.coil bevorzugten Kodons für die Expression in ί. coil.

An bestimmten Orten können Mutationen durch Synthese von Oligonukleotiden, die eine Mutanten-Sequenz, flankiert von Restriktionsstellen, enthalten, die die Ligation an Fragmente der nativen Sequenz erlaubt, eingeführt werden. Nach der Ligation kodiert die resultierende konstruierte Sequenz für ein Analog mit der gewünschten Aminosäureinsertion, -substitution oder -deletion.

Alternativ können Oligonukleotid-gesteuerte stellenspezifische Mutageneseverfahren angewendet werden, um ein verändertes Gen bereitzustellen, bei dem bestimmte Kodons in Abhängigkeit von der erforderlichen Substitution, Deletion oder Insertion verändert sind. Beispielhafte Verfahren zum Durchführen der oben beschriebenen Veränderungen sind von Walder et al. (Gene 42:133,1986); Bauer et al. (Gene 37:73,1985); Craik (BioTechniques, January 1985,12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981) offenbart worden. Die US-Patente Nrn.4,518,584 und 4,737,462 offenbaren geeignete Verfahren; auf sie wird hiermit Bezug genommen.

Sowohl die monovalenten Formen als auch die polyvalenten Formen von TNF-R sind für erfindungsgemäße Zusammensetzungen und Verfahren nützlich. Die polyvalenten Formen besitzen multiple TNF-R-Bindungsstellen für den TNF-Liganden. Beispielsweise kann ein lösliches TNF-R aus zwei tandemartig angeordneten Wiederholungen der Aminosäuren 1-235 aus Figur 2A bestehen, die durch einen Linkerbereich getrennt sind. Alternative polyvalente Formen können ebenfalls unter Verwendung von herkömmlich bekannten Kopplungsverfahren konstruiert werden, beispielsweise durch chemische Kopplung von TNF-R an jedes klinisch verträgliche Trägermolekül, ein Polymer, daß aus der Gruppe ausgewählt ist, die Ficoll, Polyethylenglycol oder Dextran umfaßt. Alternativ kann TNF-R chemisch an Biotin gekoppelt werden, und das Biotin-TNF-R-Konjugat kann dann einer Bindung an Avidin ausgesetzt werden, was zur tetravalenten Avidin/Biotin/TNF-R Molekülen führt. TNF-R kann außerdem kovalent an Dinitrophenol (DNP) ocWTrinitrophenol (TNP) gekoppelt werden und das resultierende Konjugat mit anti-DNP oder anti-TNP-lgM präzipitiert werden, um so dekamere Konjugate mit einer Valenz von 10 für TNF-R Bindungsstellen zu bilden. Weiterhin können rokombinante chimäre Antikörpermoleküle hergestellt werden, bei denen die variablen Domänen einer oder beider der schweren und leichten Immunglobulinketten durch TNF-R-Sequenzen substituiert sind, bei gleichzeitig nicht modifizierten Domänen der konstanten Region.

Beispielsweise kann chimäresTNF-R/lgG, auszwei Chimären Genen-einem TNF-R/human κ leichten Ketten Chimär (TNF-R/C_X) und ein TNF-R/human Yi Chimär der Schweren Kette (TNF-R/C_Y_ i)- erzeugt werden. Im Anschluß an Transkription und Translation der beiden Chimären Gsne lagern sich die Genprodukte zu einem einzelnen chimären Antikörpermolekül mit bivalentem TNF-R zusammen. Solche polyvalenten Formen von TNF-R können die Bindungsaffinität für den TNF-R Liganden erhöhen. Weitere die Konstruktion von chimären Antikörpermolekülen betreffenden Details sind in der WO 89/09622 und EP 315062 offenbart.

Expression von rekombinanten TNF-R

Die vorliegende Erfindung betrifft rekomblnante Expressionsvektoren, um die für TNF-R kodierende DNA zu amplifizieren oder ex| rimieren. Rekombinante Expressionsvektoren sind replizierbare DNA-Konstrukte, die synthetische oder cDNA-abgeleitete DNA-Fragmente aufweisen, die für Süugetler-TNF-R oder bioäquivaiente Analoge kodieren, die geeignet mit einem geeigneten Transkriptions- oder Translations-Regulationselement verbunden sind, das aus Säugetier-, mikrowellen, viralen oder Insektengenen erhalten ist. Eine Transkriptionseinheit umfaßt im allgemeinen einen Zusammenbau von (1) einem genetischen Element oder Elementen mit einer regulatorischen Rolle bei der Genexpression, beispielsweiseTranskriptions-Promotoren oder Enhancern, (2) eine Struktur- oder kodierende Sequenz, die in mRNA transkribiert und in Protein translation wird, und (3) geeignete Transkriptions- und Translationsinitiations- und -terminationssequenzen, wie im Detail unten beschrieben ist. Solche Regulationselemente können eine Operatorsequenz einfassen, um die Transkription zu steuern, eine Sequenz, die für geeignete mRNA-Ribosomen-Bindungsstellen kodiert. Die Fähigkeit, in einem Wirt zu replizieren, die im allgemeinen durch einen Replikationsursprung übertragen wird, und ein Selektionsgen zur Erleichterung der Erkennung von Transformanten können zusätzlich vorgesehen sein. DNA-Bereiche sind dann geeignet miteinander verbunden, wenn sie funktionell miteinander verwandt sind. Beispielsweise ist die DNA für ein Signalpeptid (Sekretionsieader) geeignet mit der DNA für ein Polypeptid verbunden, wenn dies als ein Vorläufer exprimiert wird, der an der Sekretion des Polypeptides teil hat. Ein Promotor ist geeignet mit einer kodierenden Sequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz kontrolliert. Eine Ribosomenbindungsstelle ist geeignet mit einer kodierenden Sequenz verbunden, wenn sie so angeordnet ist, daß sie die Translation erlaubt. Im allgemeinen bedeutet eine geeignete Verbindung „benachbart-sein" und, im Fall der Sekretionsieader, benachbart und im Leseraster. Strukturelle Elemente, die zur Verwendung in Hefe-Expressionssystemen vorgesehen sind, umfassen bevorzugt eine Leadersequenz, die die extrazelluläre Sekretion des translatierten Proteins durch die Wirtszelle ermöglicht. Alternativ kann, wo das rekombinante Protein ohrse Leader· oder Transportsequenz exprimiert wird, es einen N-terminalen Methioninrest enthalten. Ein solcher Rest kann gegebenenfalls vom exprimierten rekombinanten Protein abgespalten werden, um ein Endprodukt zur Verfügung zu stellen.

DNA-Sequenzen, die für Säugetier-TNF-Rezeptoren kodieren, die in einem Mikroorganismus exprimiert werden sollen, werden bevorzugt keine Introns enthalten, die vorzeitig die Transkription der DNA in mRNA beenden könnte; die vorzeitige Termination der Transkription kann jedoch wünschenswert sein, beispielsweise, wenn sie zu Mutanten führen würde, die vorteilhafte C-terminale Verkürzungen haben, beispielsweise Deletion einer Transmembranregion, um einen löslichen Rezeptor zu erhalten, der nicht an die Zellmembran gebunden ist. Infolge der Degeneration des Kodes kann es eine beträchtliche Variation bei den Nukleotidsequenzen, die für die gleiche Aminosäuresequenz kodieren, geben. Weitere Ausführungsformen umfassen Sequenzen, die zur Hybridisierung mit den Sequenzen der zur Verfugung gestellten cDNA unter mäßig stringenten Bedingungen (5O⁰C, 2 χ SSC) fähig sind, und weitere Sequenzen, die mit solchen Sequonzen, die für biologisch aktive TNF-Rezeptor-Polypeptide kodieren, hybridisieren oder degeneriert sind.

Rekombinante TNF-R-DNA wird in einem rekombinanten Expressionssystem exprimiert oder amplifiziert, das eine im wesentlichen homogene Monokultur eines geeigneten Wirtsmikroorgdnismus, beispielsweise Bakterien, wie E. coil, oder Hefe, wie S.cerevlslae, umfaßt, die stabil in die chromosomale DNA integriert (durch Transformation oder Transfektion) eine rekombinante Transkriptionseinheit enthalten oder die rekombinanto Transkriptionseinheit als einen Bestandteil eines ansässigen Plasmides tragen. Im allgemeinen sind die ein System konstituierenden Zellen Nachkommen einer einzigen Vorgängertransformante. Rekombinante Expressionssysteme, so wie sie hier definiert sind, exprimieren heterologes Protein nach Induktion von Regulationselementen, die mit der zu exprimierenden DNA-Sequenz oder dem synthetischen Gen verbunden sind.

Transformierte Wirtszellen sind Zellen, die mit TNF-R-Vektoren transformiert oder trarisfiziert worden sind, die unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken konstruiert worden sind. Transformierte Wirtszellen exprimieren normalerweise TNF-R, aber Wirtszellen,diezum ZweckderKlonierung oder Amplifizierung von TNF-R-DNAtransformiert worden sind, müssen kein TNF-Rexprimieren. ExprimiertesTNF-R wird in derZellmembranabgelagertoderin den Kulturüberstand sezerniert werden, was von der ausgewählten TNF-R-DNA abhängt. Geeignete Wirtszellen für die Expression von Säugetier-TNF-R umfassen Prokaryonten, Hefe oder höhere eukaryontische Zellen unter der Kontrolle geeigneter Promotoren. Prokaryonten umfassen Gram-negative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise E.coil oder Bazillen. Höhere eukaryontische Zellen umfassen etablierte, aus Säugetieren stammende Zellinien, wie unten beschrieben wird. Weiterhin könnten Zeil-freie Translationssysteme zur Erzeugung von Säugetier-TNF-R bei Verwendung von RNA's, die von den erfindungsgemäßen DNA-Konstrukten abgeleitet sind, verwendet werden. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung in bakteriellen. Pilz-, Hefe- und Säugetier-Zellwirten werden von Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985) beschrieben, auf dessen relevante Offenbarung hiermit Bezug genommen wird.

Für die Expression von TNF-R können prokaryontische Expressionswirte verwendet werden, bei denen kein extensives proteolytisches und Disulfid-Processing erforderlich ist. Prokaryontische Expressionsvektoren umfassen im allgemeinen einen oder mehrere phenotypisch selektierbare Marker, beispielsweise ein Gen, das für Proteine kodiert, die antiblotische Resistenz vermitteln oder ein autotrophes Erfordernis zur Verfügung stellen, sowie einen Replikationsursprung, der von dem Wirt erkannt wird, um die Amplikikation im Wirt sicherzustellen. Geeignete prokaryontische Wirte für die Transformation umfassen E. coil. Bacillus subtilis, Salmonella typhlmurlum und verschiedene Arten innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, wobei wahlweise ebenso andere verwendet werden können.

Nützliche Expressionsvektoren für die Verwendung in Bakterien können einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung umfassen, der von kommerziell verfügbaren Plasmiden abgeleif* ist, die genetische Elemente des gut bekannten Klonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) enthalten. Solche kommerziellen Vektoren umfassen beispielsweise pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM 1 (Promega Biotec, Madison, Wl, USA). Diese pBR322 „Rückgraf-Abschnitte werden mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden Struktursequenz kombiniert. E. coil wird typischerweise unter Verwendung von Derivaten von pBR322 transformiert, einem aus einer E. coll-Art abgeleiteten Plasmid (Bolivar et al., Gene 2:95,1977). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt daher ein einfaches Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen zur Verfügung.

In rekombinanten mikrowellen Expressionsvektoren normalerweise verwendete Promotoren umfassen das ß-Lactamase (Penlclllinase)-und Lactose-Promotorsystem (Chang et al., Nature 275:615,1978; und Goeddel et al., Nature 281:544,1979), das Tryptophan (trp)-Promptorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057,1980; und EPA 36,766) und den tac-Promotor (Manlatis, Molecular Cloni g: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S.412,1982). Besonders nützliche bakterielle Expressionssysteme verwenden den Phagen λ P_L-Promotor und den thermolabilen el 857 ts-Repressor. Plasmidvektoren, die von der American Type Culture Collection verfügbar sind und Derivate des XP_L-Promotors eingebaut haben, umfassen das Plasmid pHUB2, das in E.coll-Stamm JMB9 (ATCC 37092), und pPLc28, das in E.coll RR1 (ATCC 53082) enthalten ist.

Rekombinante TNF-R-Proteine können außerdem in Hefe-Wirtszellen, bevorzugt in solchen der Art Saccharomyces, beispielsweise Saccharomyces cerevlslae, exp-^!miert werden. Hefen anderer Gattungen, beispielsweise Pichla oder Kluyveromyces, können ebenso verwendet werden. Hefevektoren enthalten im allgemeinen einen Replikationsursprung von 2 μ Hefeplasmid oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS), einen Promotor, eine für TNF-R kodierende DNA, Sequenzen für die Polyadenylierung und Transkriptionstermination sowie ein Selektionsgen. Bevorzugt umfassen Hefevektoren einen Replikationsursprung und selektierbare Marker, die die Transformation sowohl von Hefe als auch von E.coll erlauben, beispielsweise das Ampicillin-Resistenzgen aus E.coll und das S.cerevlslae TRP1- oder UHA3-Gen, das einen Selektionsmarker für einen Hefemutantenstamm, dem die Fähigkeit, auf Tryptophan zu wachsen, fehlt, bereitstellt, und einen Promotor, der von einem hoch exprimierten Hefegen abgeleitet ist, um die Transkription der stromabwärts angeordneten Struktursequenz zu induzieren. Die Gegenwart des TRP1- oder URA3-Defektes im Hefewirtszellengenom stellt eine für den Nachweis der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan oder Uracil geeignete Umgebung dar. Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren umfassen die Promotoren für Metalfothionin, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073,1980) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149,1968; und Holland et al., Biochem. 17:4900,1978), beispielsweise Enolase, Glyceraldehyd-S-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase. Geeignete Vektoren und Promotoren für die Verwendung zur Hefeexpression sind weiter in R. Hitzeman et al., EPA 73,657, beschrieben.

Bevorzugte Hefevektoren können unter Verwendung von DNA-Sequenzen aus pUC18für die Selektion und Replikation in E.coli (Amp' Gen und Replikationsursprung) und Hefe DNA-Sequenzen einschließlich dos Glucose-reprimierbaren ADH2-Promotors und des a-Faktor-Sekretionsleaderpeptides zusammengesetzt werden. Der ADH 2-Promotor ist von Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674,1982) und Beier et al. (Nature 300:742,1982) beschrieben worden. Das Hefe a-Faktor-Leaderpeptid, das die Sekretion heterologen Proteins steuert, kann zwischen dem Promotor und dem zu exprimierenden Strukturgen eingefügt werden. Siehe beispielsweise Kurjan et al., Cell 30:933,1982; und Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:5330,1984. Die Leadersequenz kann modifiziert werden, um nahe ihrem 3'-Ende eine oder mehrere nützliche Restriktionsstellen zu enthalten und so die Fusion der Leadersequenzen mit Fremdgenen zu erleichtern.

Geeignete Protokolle für die Transformation von Hefe sind dem Fachmann bekannt; ein exemplarisches Verfahren wird von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929,1978, beschrieben, wobei in einem Selektionsmedium, das aus 0,67 % Hefe-Nitrogen-Base, 0,5% Casaminoacids, 2 % Glucose, 10 Mg/ml Adenin und 20 Mg/ml Uracil für Trp⁺-Transformanten, oder in einem 0,67% YNB enthaltenden Medium mit Aminosäuren und Basen, beschrieben von Sherman et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1986, für URA⁺-Transformaten selektioniertwird.

Die mit den ADH2-Promotor tragenden Vektoren transformierten Wirtszellen können zur Expression in einem reichen Medium wachsengelassen werden, das 1 % Hefeextrakt, 2% Pepton und 1 % oder 4% Glucose, supplementiert mit 80Mg/ml Adenin und βΟμρ/ιηΙ Uracil, enthält. Die Derepression des ADH 2-Promotors tritt nach Erschöpfung der Glucose im Medium auf. Ein roher Hefeüberstand wird durch Filtration geerntet und vor der weiteren Reinigung bei 4⁰C gelagert.

Zur Expression rekombinanten Proteins können verschiedene Säugetier- oder Insektenzellkultursysteme vorteilhaft verwendet werden. Die Expression rekombinanten Proteins in Säugetierzellen ist besonders bevorzugt, weil solche Proteine im allgemeinen korrekt gefaltet, geeignet modifiziert und vollständig funktionell sind. Beispiele geeigneter Säugetierwirtszellinien umfassen die COS-7-Linie aus Affennierenzellen, beschrieben von Gluzman (Cell 23:175,1981) und andere Zellinion, die zur Expression geeigneter Vektoren fähig sind, beispielsweise L-Zellen, C127,3T3, Chinese hamster ovary (CHO), HeLa und BHK Zellinien. Säugetier-Expressionsvektoren können nichttranskripierte Elemente, beispielsweise einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und einen mit dem zu exprimierenden Gen verbundenen Enhancer umfassen, sowie weitere 5'- oder 3'-flanklerende, nicht transkripierte Sequenzen und 5'· oder 3'-nicht-translatierte Sequenzen, wie beispielsweise die notwendigen Ribosomen-Bindungsstellen, Polyadenylierungsstellen, Splice-Donor- und -Akzeptorstellen und Transkriptionsterminationssequenzen. Baculovirussysteme für die Erzeugung von heterologen Proteinen in Insektenzellen sind von Luckow und Summers, Bio/Technology 6:47 (1988) in einem Review beschrieben worden.

Die Transkriptions- Translationskontrollsequenzen in den zu verwendenden Expressionsvektoren zur Transformation von Vertebratenzellen können aus viralen Quellen bereitgestellt werden. Beispielsweise sind gebräuchliche Promotoren und Enhancer die von Polyoma, Adenovirus 2, Simian Virus 40 (SV40) und humanem Cytomegalovirus abgeleiteten DNA-Sequenzen. Die aus den viralen SV40-Genom abgeleiteten DNA-Sequenzen, beispielsweise der SV40 Replikationsursprung, der früher und späte Promotor, Enhancer, Splice- und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um die anderen genetischen Elemente, die für die Expression von heterologen DNA-Sequenzen erforderlich sind, bereitzustellen. Die frühen und späten Promotoren sind besonders nützlich, weil beide leicht aus dem Virus als ein Fragment, das außerdem den viralen SV40 Replikationsursprung (Fiers et al., Nature 273:113,1978) enthält, erhalten werden können. Kleinere oder größere SV40-Fragmente können ebenso verwendet werden, vorausgesetzt, die ungefähr 250 bp-Sequenz, die sich von der Hind3-Stelle in Richtung der Bg11 -Stelle, die im viralen Replikationsursprung angeordnet ist, erstreckt, ist einbezogen. Weiterhin können der genomische TNF-R-Promotor, Kontroll- und/oder Signalsequenzen aus Säugetieren verwendet werden, vorausgesetzt, daß solche Kontrollsequenzen mit der gewählten Wirtszelle kompatibel sind. Zusätzliche Details hinsichtlich der Verwendung von Vektoren für hohe Expression in Säugetieren zur Erzeugung eines rekombinanten Säugetier-TNF-Rezeptors sind in den Beispielen 2 und 7 unten beschrieben. Beispielhafte Vektoren können wie von Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280,1983) offenbart, konstruiert werden.

Ein nützliches System für eine stabile Expression von Säugetier-Rezeptor cDNAs in C127 Mäusemammaepithelzellen kann im wesentlichen so konstruiert werden, wie es von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935,1986) beschrieben worden ist. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden TNF-R-cDNAs enthaltende rekombinante Expressionsvektoren stabil in die DNA einer Wirtszelle integriert. Erhöhte Spiegel des Expressionsproduktes werden durch Selektion von Zellinien mit amplifizierter Anzahl von Vektor-DNA erhalten. Zellinien mit amplifizierter Anzahl von Vektor-DNA werden beispielsweise durch Transformation einer Wirtszelle mit einem Vektor, der eine für ein Enzym, das von einem bekannten Wirkstoff inhibiert wird, kodierende DNA-Sequenz umfaßt, ausgewählt. Der Vektor kann außerdem eine DNA-Sequenz umfassen, die für ein gewünschtes Protein kodiert. Alternativ kann die Wirtszelle mit einem zweiten Vektor, die eine für das gewünschte Protein kodierende DNA-Sequenz umfaßt,

co-transformiert werden. Die transformierten oder co-transformierten Wirtszellen werden dann mit ansteigenden Konzentrationen des bekannten Wirkstoffes kultiviert und so auf Wirkstoff-resistente Zellen selektioniert. Solche Wirkstoffresistenten Zellen überleben in erhöhten Konzentrationen des toxischen Wirkstoffes durch eine Überproduktion des Enzymes, das durch den Wirkstoff inhibiert wird, häufig als Ergebnis einer Amplifikation des für das Enzym kodierenden Genes. Wo die Wirkstoffresistenz durch eine Steigerung der Kopienzahl der Vektor-DNA, die das inhibierbare Enzym kodiert, hervorgerufen wird, gibt es eine beigebende Co-Amplifikation der Vektor-DNA, die für dac gewünschte Protein (TNF-R) in der DNA der Wirtszelle kodiert.

Ein bevorzugtes System für eine solche Co-Amplifikation verwendet das Gen für die Dihydrofolatreduktase (DHFR), die durch den Wirkstoff Methothrexat (MTX) inhibiert werden kann. Um eine Co-Amplifikation zu erzielen, wird eine Wirtszelle, der ein aktives, für DHFR kodierendes Gen fehlt, entweder mit einem Vektor transformiert, der eine für DHFR und ein gewünschtes Protein kodierende DNA-Sequenz umfaßt, oder sie wird co-transformiert mit einem Vektor, der eine für DHFR kodierende DNA-Sequenz umfaßt, und einem Vektor, der eine für das gewünschte Protein kodierende DNA-Sequenz umfaßt. Die transformierten oder co-transformierten Wirtszellen werden in Medien kultiviert, die steigende Spiegel von MTX enthalten, und diejenigen Zellinien, die überleben, werden ausgewählt.

Ein besonders bevorzugtes Co-Amplifikationssystem verwendet das Gen für die Glutaminsynthetase (GS), die für die Synthese von Glutamat und Ammoniak verantwortlich ist, wobei die Hydrolyse von ATP zu ADP und Phosphat zur Durchführung der Reaktion verwendet wird. GS wird durch eine Vielzahl von Inhibitoren inhibiert, beispielsweise Methioninsulphoximin (MSX). TNF-R kann daher in hohen Konzentrationen durch Co-Amplifikation von Zellen, die mit einem Vektor transformiert worden sind, der eine DNA-Sequenz für GS und ein gewünschtes Protein umfaßt, oder die mit einem Vektor, de- eine für GS kodierende DNA-Sequenz umfaßt, und einem Vektor, der eine für das gewünschte Protein kodierende DNA-Sequenz umfaßt, cotransformiert worden sind, Kultivieren der Wirtszellen in Medien mit steigenden MSX-Spiegeln und Auswahl der überlebenden Zellen exprimiert werden. Das GS-Co-Amplifikationssystem, geeignete rekombinante Expressionsvektoren und Zellinien sind in den folgenden PCT-Anmeldungen beschrieben: WO 87/04462, WO 89/01036, WO 89/10404 und WO 86/05807. Rekombinante Proteine werden bevorzugt durch Co-Amplifikation von DHFR oder GS in einer Säugetier-Wirtszelle, beispielsweise Chinese Hamster Ovary (CHO) Zellen, oder alternativ in einer Mäuse-Myeloma-Zellinie, beispielsweise SP 2/0-AG14 oder NSO, oder einer Ratten-Myeloma-Zellinie, beispielsweise YB2/3.0-Ag20 exprimiert, die in den PCT-Anmeldungen WO 89/10404 und WO 86/05807 offenbart sind.

Ein bevorzugter eukaryontischer Vektor für die Expression von TNF-R-DNA ist unten in Beispiel 2 offenbart. Dieser Vektor, der als pCAV/NOT bezeichnet wird, wurde von dem Säugetier-Expressionsvektor pDC201 abgeleitet und enthält Regulationssequenzen aus SV40, Adenovirus 2 und humanem Cytomegalovirus.

Reinigung von rekomblnanten TNF-R

Gereinigte Säugetier-TNF-Rezeptoren oder Analoge werden durch Kultivieren geeigneter Wirts/Vektorsysteme zur Expression der rekombinanten Translationsprodukte der erfindungsgemäßen DNAs hergestellt und dann aus dem Kulturmedium oder den Zellextrakten gereinigt.

Beispielsweise können Überstände aus Systemen, die rekombinantes Protein in die Kulturmedien sezernieren, zuerst unter Verwendung kommerziell erhältlicher Proteinkonzentrationsfilter, beispielsweise einer Amicon oder Millipor-Pelllcon-Ultrafiltrationseinheit, konzentriert werden. Im Anschluß an den Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf eine geeignete Reinigungsmatrix aufgetragen werden. Beispielsweise kann eine geeignete Affinitätsmatrix an einen geeigneten Träger gebundenes TNF oder Lectin oder Antikörpermoleküle umfassen. Alternativ kann ein Anionaustauscherharz angewendet werden, beispielsweise eine Matrix oder ein Substrat mit freien Diethylaminoethy I (DEAE)-Gruppen. Diese Matrizes können vom Acrylamid-, Agarose-, Dextran-, Cellulose- oder einem anderen für die Proteinreinigung gebräuchlicherweise varwendetem Typ sein. Alternativ kann ein Kationaustauschschritt angewendet werden. Geeignete Kationenaustauscher umfassen verschiedene unlösliche Matrizes mit Sulfopropyl- oder Carboxymethyigruppen. Sulfopropylgruppen sind bevorzugt. Schließlich können eine oder mehrere „reversed-phase" (Umkehrphasen) Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HP-HPLC-)-Schritte unter Verwendung hydrophober RP-HPLC-Medien, beispielsweise Silikagel mit freien Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen, zur weiteren Reinigung einer TNF-R-Zusammensetzung verwendet werden. Einige oder alle der vorstehend genannten Reinigungsschritte können in verschiedenen Kombinationen ebenfalls angewendet werden, um ein homogenes rekombinantes Protein bereitzustellen.

Ein in einer bakteriellen Kultur erzeugtes rekombinantes Protein wird gewöhnlich durch eine einleitende Extraktion aus den Zellniederschlägen, gefolgt von einem oder mehreren Konzentrationsschritten, Aussalzen, wäßrigem Ionenaustausch oder Molekulargewichts(size exclusion)-Chromatographieschritten isoliert. Schließlich kann Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) für die letzten Reinigungsschritte angewendet werden. Die zur Expression von rekombinantem Säugetier-TNF-R verwendeten mikrobiellen Zellen können durch jedes geeignete Verfahren aufgebrochen werden, einschließlich von Einfrier- und Auftauzyklen, Beschallen, mechanischem Aufbrechen oder der Verwendung von die Zellen lysierenden Mitteln.

Die Fermentation von Hefen, die Säugetier-TNF-R als ein sezerniertes Protein f/xprimieren, erleichtert die Reinigung sehr. Sezernierte rekombinante Proteine, die aus einer Fermentation im großen Maßstab stammen, können mit Verfahren analog zu jenen, die von Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171,1984) offenbart sind, gereinigt werden. Diese Literaturstelle beschreibt zwei aufeinanderfolgende „reversed-phase" HPLC-Schritte für die Reinigung von rekombinantem humanem GM-CSF auf einer präparativen HPLC-Säule.

In einer rekombinanten Kultur synthetisiertos humanes TNF-R Ist durch Anwesenheit von nicht humanen Zellbestandteilen, einschließlich Proteinen, in Mengen und von einem Charakter, der von den zur Gewinnung des humanen TNF-R's aus der Kultur durchgeführten Reinigungsschritten abhängt, gekennzeichnet. Diese Bestandteile stammen normalerweise aus Hefe, prokaryontischen oder nicht menschlichen höheren Eukaryonten und sind bevorzugt in unrchädlichen kontaminierenden Mengen in der Größenordnung von weniger als ungefähr 1 Gew,-% anwesend. Weiter ermöglicht die rekombinante Zellkultur die Herstellung von TNF-R, das von Proteinen frei ist, die normalerweise mit TNF-R, so wie es in der Natur in den Arten, aus denen es stammt, gefunden wird, assoziiert sind, beispielsweise in Zellen, Zellexsudaten oder Körperflüssigkeiten.

Therapeutische Anwendung von rekomblnantem löslichen TNF-R

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Verwendung thnrnpoutischor Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge löslichen TNF-R-Proteins und ein geeignetes Verdünnungsmittel und einen Träger umfassen, sowie Verfahren zur Suppression TNF-abhängiger entzündlicher Antworten in Menschen, die das Anwenden einer effektiven Menge löslichen TNF-R-Proteins umfaßt.

Für die therapeutische Verwendung wird gereinigtes lösliches TNF-R-Protein einem Patienten, bevorzugt einem Menschen, zur Behandlung in einer der Indikation angemessenen Weise verabreicht. Daher können lösliche TNF-R-Proteinzusammensetzungen beispielsweise durch Bolus-Injektion, kontinuierliche Infusion, verzögerte Freisetzung aus Implantaten oder andere geeignete Verfahren verabreicht werden. Typischerweise wird ein lösliches therapeutisches TNF-R-Mittel in Form einerZusammensetzung angewendet werden, die gereinigtes Protein in Verbindung mit physiologisch verträglichen Trägern, Korrigentien oder Verdünnungsmittel umfaßt. Solche Träger werden für den Empfänger in den angewendeten Dosen und Konzentrationen nicht toxisch sein. Normalerweise beinhaltet die Herstellung solcher Zusammensetzungen die Kombination von TNF-R mit Puffern, Antioxidantien, wie beispielsweise Ascorbinsäure, Polypeptiden mit niedrigem Molekulargewicht (woniger als ungefähr 10 Resten), Proteinen, Aminosäuren, Kohlenhydraten einschließlich Glucose, Saccharose oder Dextrinen, Chelat-bildenden Mitteln, beispielsweise EDTA, Glutathion und anderen Stabilisatoren und Korrigentien. Neutrale gepufferte Saline oder mit einem artspezifischem Serumalbumin gemischte Saline sind beispielsweise angemessene Verdünnungsmittel. Bevorzugt wird das Prouukt als ein Lyophilisat unter Verwendung angemessener Korrigenzlösungen (beispielsweise Saccharose) als Verdünnungsmittel formuliert. Angemessene Dosierungen können in Vorversuchen bestimmt worden. Die Menge und Frequenz der Verabreichung wird natürlich von solchen Faktoren, wio Natur und Ernsthaftigkeit der behandelten Indikation, gewünschte Antwort, Zustand des Patienten usw. abhängen.

Lösliche TNF-R-Proteine werden zum Zweck der Inhibition TNF-abhängiger Antworten verabreicht. Von einer Vielzahl von Erkrankungen oder Zuständen wird angenommen, daß sie durch TNF verursacht werden, beispielsweise Kachexie und septischer Schock. Zusätzlich können andere Schlüsselcytokine (IL-1, IL-2 und andere Kolonie-stimulierende Faktoren) ebenso eine signifikante Produktion von TNF im Wirt induzieren. Lösliche TNF-R-Zusammensetzungen können daher beispielsweise für die Behandlung von Kachexie oder septischem Schock oder zur Behandlung von Nebenwirkungen, die mit der Cytokin-Therapie assoziiert sind, verwendet werden. Wegen der primären Rolle, die IL-1 und IL-2 bei der Produktion von TNF spielen, wird eine Xombinationstherap .e, die IL-1 -Rezeptoren und IL-2-Rezeptoren verwendet, für die Behandlung von TNF-assoziierten klinischen Indikationen bevorzugt sein

Die folgen den Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiele

Beispiel 1 Bindungstests

A. Radiomarkierung von TNFa und TNFß. Rekombinantss humanes TNFa in Form eines Fusionsproteines, das bin hydrophiles Octapeptid am N-Terminus enthielt, wurde in Hefe als sezerniertes Protein exprimiert und durch Affinitätschromatographie gereinigt (Hopp et al., Bio/Technology 6:1204,1988). Gereinigtes rekombinantes humanes TNFß wurde von R & D Systems (Minneapolis, MN) bezogen. Beide Proteine wurden unter Verwendung des kommerziell erhältlichen Festphasenmittels, IODO-GEN (Pierce), radiomarkiert. In diesem Verfahren wurden 5pglODO-GEN am Boden eines 10mm χ 75mm Glasrohras vorgelegt und 20 Minuten bei 4°C mit 75μΙ 0,1 M Natriumphosphsi, pH7,4 und 20μΙ (2mCi) Na ¹²⁶J inkubiert. Diese Lösung wurde dann in ein zweites Glasrohr transferiert, dss Rpg TNFa (oder TNFß) in 45μΙ PBS enthielt und 20 Minuten bei 4⁰C gehalten. Die Reaktionsmischung wurde durch Gelfiltration auf einem 2 ml Bettvolumen Sephadex G-25 (Sigma), equilibriert in Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640Medium, das 2,5%(w/v) Rinderserumalbumin (BSA),0,2%(w/v) Natriumazid und 1OmM Hepes pH 7,4 enthielt (Bindungsmedium), fraktioniert. C er schließliche Pool von ¹²⁶J-TNF wurde zu einer Arbeitsstammlösung von1 x 10"⁷M in Bindungsmedium verdünnt und bis zu einem Monat bei 4°C ohne nachweisbaren Verlust der Rezeptorbindungsaktivität gelagert. Die spezifische Aktivität beträgt normalerweise 1 x 10⁵cpm/mMol TNF.

B. Bindung an intakto Zellen. Bindungstests mit intakten Zellen wurden nach zwei Verfahren durchgeführt. In dem ersten Verfahren wurden die Zellen zuerst entweder in Suspension (beispielsweise U 937) oder durch Anheften an Gewebekulturplatten (beispielsweise Wl 26-VA4, COS, die den rekombinanten TNF-Rezeptor exprimieren) wachsengelassen. Die angehefteten Zellen wurden anschließend durch Behandlung mit 5mM EDTA10 Minuten bei 37⁰C entfernt. Der Bindungstest wurde dann mittels des Phthalat-Öl-Trennungsverfahrens (Dower et al., J. Immunol. 132:751,1984) im wesentlichen wie von Park et al. (J. Biol. Chem. 261:4177,1986) beschrieben, durchgeführt. Die nicht spezifische Bindung von ¹²⁵J-TNF wurde in Gegenwart eines 200fachen oder größeren molaren Überschuß unmarkierten TNF's gemessen. In den Bindungstests wurde Natriumazid (0,2%) eingeschlossen, um die Internalisierung von ¹²⁶J-TNF durch die Zellen zu inhibieren. Im zweiten Verfahren wurden mit dem TNF-R-haltigen Plasmid transfizierte COS-Zellen, ^Hie TNF-Rezeptoren auf der Oberfläche exprimierten, auf ihre Fähigkeit getestet, ¹²⁶J-TNF mittels des bei Sims et al. (Science 241:585,1988) beschriebenen Plattenbindungstest zu binden.

C. Festphasen-Bindungstests. Die Fähigkeit von TNF-R, aus Detergenz-Extrakten von humanon Zellen stabil an Nitrocellulose zu adsorbieren und gleichzeitig die TNF-bindende Aktivität beizubehalten, bot ein Mittel zum Nachweis von TNF-R. Die Zellextrakte wurden durch Mischen eines Zellniederschlages mit einem 2fachen Volumen von PBS, enthaltend 1 % Triton X-100 und ein Cocktail von Proteaseinhibitoren (2mM Phenylmethylsulfonylfluorid 1OuM Pepstatin.. 1OuM Leupeptin, 2mM o-Phenanthrolin und 2mM EGTA) durch heftiges Mischen hergestellt. Die Mischung wurde 30 Minuten auf Eis inkubiert, anschließend bei 12000xg 15 Minuten bei 8°C zentrifugiert, um Kerne und andere Debris zu entfernen. 2 Mikroliter Aliquote der Zellextrakte wurden auf trockene BA 85/21 Nitrocellulosemembranen (Schleicher und Schuell, Keene, NH) aufgebracht und getrocknet. Die Membrane wurden in Zellkulturschalen 30 Minuten in Tris (0,05M)-gepufferter Saline (0,15M) pH7,5 mit 3% w/v BSA inkubiert, um unspezifiEche Bindungsstellen zu blockieren. Die Membran wurde dan mit 5 χ 10"" M¹²⁶J-TNF in PBS + 3% BSA bedeckt und 2 Stunden bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Nach Ablauf dieser Zeit wurden die Membran dreimal in PQS gewaschen, getrocknet und 18 Stunden bei -70°C auf einen Kodak X-Omat AR-FiIm gelegt.

Beispiel 2 Isolierung humaner TNF-R-cDNA durch direkte Expression des aktiven Proteins In COS-7-Zellen

Verschiedene humane Zellinien wurden auf Ue Expression von TNF-R auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, ^I26J-markiertes TNF zu binden, untersucht. Bei der humanen Fibroblasten-Zellir \s Wl 26-VA4 wurde festgestellt, daß sie eine annehmbare Anzahl von Rezeptoren pro Zelle exprimierte. Gleichgewichts-Bindungsstudien zeigten, daß die Zellinie eine biphasische Bindung von ¹²⁶J-TNFmU ungefähr4000 Stellen hoher Affinität (K₁= 1 x 10¹⁰ M"¹) und 15000 Stellen niedriger Affinität (K. = 1 x 10⁸M-') pro Zelle aufwies.

Durch reverse Transkription polyadenylierter mRNA wurde eine nicht nach Größen sortierte cDNA-Ba.iK konstruiert, wobei die polyadenylierte mRNA aus aus humanen Fibroblasten Wl 26-VA4-Zellen extrahierter Gesamt-RNA isoliert war, wobei die Zellen in Gegenwart von Mitogen aus Kermesbeeren unter Verwendung von Standardverfahren gewachson waren (Gubler et al., Gene 25:263,1983; Ausübet et al., eds„ Current Protocols in Molecular Biology, Band 1,1987). Die Zellen wurden durch Lysieren der Zellen in einer Guanidin-Hydrochloridiösung geerntet und die Gesamt-RNA wie zuvor beschrieben (March et al.. Nature 315:641, 1985) isoliert.

Poly A⁺ RNA wurde mittels OligodT-Cellulose-Chromatographie isoliert und doppelsträngige cDNA nach einem Verfahren ähnlich dem von Gubler und Hoffman (Gene 25:263,1983) hergestellt. Kurz gesagt wurde die Poly A⁺ RNA mit reverser Transkriptase unter Verwendung von OligodTals Primer in ein RNA-cDNA-Hybrid überführt. Das RNA-cDNA-Hybrid wurde dann in doppelsträngige cDNA unter Verwendung von RNAase H in Kombination mit DNA-Polymerase I überführt. Bei der resultierenden doppelsträngigen cDNA wurden mittels T4 DNA-Polymerase stumpfe Enden erzeugt. An die stumpfendige cDNA wurden EcoR 1 Linker-Adaptoren (mit einer internen Not 1 -Stelle) angefügt, die an einem Ende phosphoryliert waren (Invitrogen). Die Linker-Adaptorversehene cDNA wurde mit T4 Polynukleotidkinase behandelt, um den 5' überstehenden Bereich des Linker-Adaptors zu phosphorylieren, und nicht ligierte Linker wurden entfernt, indem die cDNA über eine Sepharose CL4B-Säule gegeben wurde. Die Linker-Adaptorversehene cDNA wurde mit einer äquimolaren Konzentration von mit EcoR 1 geschnittenen und dephosphorylierten Armen des Bakteriophagen Agt 10 (Huynh et al., DNA Cloning: A Practical Approach Glover, ed., IRL Press, S. 49-78) ligiert. Die ligierte DNA wurde in Phagenpartikel unter Verwendung kommerziell erhältlicher Kits verpackt, um eine Rekombinantenbank zu erzeugen (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA). Die Rekombinanten wurden durch Plattieren der Phagen auf einem bakteriellen Rasen des E.coll-Stammes C600 (hfl") amplifiziert. Aus der resultierenden Xgt 10 cDNA-Bank wurde Phagen-DNA gereinigt und die cDNA-lnserts durch Verdau mit dem Restriktionsenzym Not 1 herausgeschnitten. Nach Elektrophorese des Verdaus über ein Agarosegel wurden cDNAs von mehr als 2 000 bp isoliert.

Die resultierenden oDNAs wurden in den eukaryontischen Expressionsvektor pCAV/NOT ligiert, der so gestaltet wurde, daß cDNA-Sequenzen, wenn sie in seine „multiple cloning site" eingefügt werden, nach Transfektion in Säugetierzellen exprimiert wurden. pCAV/NOT wurde aus pDC 201 (einem Derivat von pMLSV, zuvor beschrieben von Cosman et al., Nature 312:768,1984), SV40 und Cytomegalovirus-DNA zusammengesetzt und umfaßt in Folge mit der Transkriptionsrichtung vom Replikationsursprung: (1) SV40-Sequenzen von den Positionen 5171-270 einschließlich des Replikationsursprungs, Enhancer-Sequenzen und früher und später Promotoren; (2) Cytomegalovirus-Sequenzen einschließlich der Promotor- und Enhancer-Regionen (Nukleotide 671 - +63 der von Boechart et al. (Cell 41:521,1985) publizierten Sequenz); (3) Adenovirus-2-Sequenzen, die das erste Exor. und einen Teil des Introns zwischen dem ersten und zweiten Exon des Tripartitleaders, das zweite Exon Und einen Teil des dritten Exons des Tripartitleaders und eine „multiple cloning site" (MCS) mit Restriktionsstellen für Xho 1, Kpn 1, Sma 1, Not 1 und Bg11 enthält; (4) SV40-Sequenzen von den Positionen 4127-4100 und 2770-2533, die die Polyadenylierungs- und Terminationssignale für die frühe Transkription einschließen; (5) von pBR322 abgeleitete Sequenzen und Virus-assoziierte Sequenzen VAI und VAII von pDC 201, wobei die Adenovirussequenzen 10532-11156 die VAI und VAII Gene enthalten, gefolgt von pBR322-Sequenzen von 4363-2486 und 1094-375, die das Ampicillin-Resistenzgen und den Replikationsursprung enthalten. Die resultierende Wl 26-VA4 cDNA-Bank in pCAV/NOT wurde zur Transformation von E.coli-Stamm DH5a verwendet und die Rekombinanten wurden zur Bereitstellung von ungefähr 800 Kolonien pro Platte ausgestrichen und ausreichend Platten, um ungefähr 50000 Gesamtkolonien pro Screening-Schritt bereitzustellen, plattiert. Von jeder Platte wurden die Kolonien abgekratzt, gesammelt und Plasmid-DNA von jedem Pool hergestellt. Die gesammelte (gepoolte) DNA wurde dann zur Transfektion einer sub-konf luenten Schicht von Affen COS-7-Zellen verwendet, wobei DEAE-Dextran gefolgt von einer Chlorochin-Behandlung verwendet wurde, wie von Luthr.ian et al. (Nucl. Acids Res. 11 .-1295,1983) und McCutcnan et al. (J. Natl. Cancer Inst. 41:351,1986) beschrieben. Die Zellen wurden 3 Tage in Kultur wachsengelassen, um eine transiente Expression der inserierten Sequenzen zu erlauben. Nach 3 Tagen wurden die Zellkultur-Überstände verworfen und die Zell-Einzelschichten in jeder Platte wie folgt auf TNF-Bindung untersucht. 3ml Bindungsmedium, die 1,2 x 10~" M ¹²⁸J-markiertes FLAGⁿ-TNF enthielten, wurden jeder Platte zugesetzt und die Platten bei 4°C 120 Minuten inkubiert. Dieses Medium wurde dann verworfen und jede Platte einmal mit kaltem Bindungsmedium (das kein markiertes TNF enthielt) und zweimal mit kaltem PBS gewaschen. Die Ecken jeder Platte wurden dann abgebrochen, was zu einer flachen Scheibe führte, die mit einem Röntgenfilm 72 Stunden bei -7O⁰C unter Verwendung eines intensivierenden Schirmes (intensifying screen) in Kontakt gebracht wurde. Die TNF-Bindungsaktivität wurde auf dem exponierten Film als ein dunkler Fokus gegen einen relativ gleichmäßigen Hintergrund sichtbar gemacht.

Nachdem ungefähr 240000 Rekombinanten der Bank auf diese Weise untersucht worden waren, wurde bei einem Transfektanten-Pool beobachtet, daß er TNF-Bindungsfoci aufwies, die klar gegen die Hintergrundbelichtung sichtbar waren. Gefrorene Vorratsbakterien von dem positiven Pool wurden dann verwendet, um Platten mit ungefähr 150 Kolonien zu erhalten. Von diesen Platten wurden Replikas auf Nitrocellulosefiltern hergestellt; die Platten wurden dann abgekratzt und Plasmid-ONA hergestellt und wie oben beschrieben transfiziert, um eine positive Platte zu identifizieren. Bakterien individueller Kolonien von den Nitrocellulose-Replikas dieser Platte wurden in 0,2 ml Kulturen wachsengelassen, die verwendet wurden, um Plasmid-DNA zu enthalten, die wie oben beschrieben in COS-7-Zellen transfiziert wurde. Auf diese Weise wurde ein einzelner Klon, Klon 1, isoliert, der in der Lage war, die Expression humanen TNF-R's in COS-Zellen zu induzieren. Der Expressionsvektor pCAV/NOT, der den TNF-R cDNA Klon 1 enthält, ist bsi der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA mit der Hinterlegungsnummer 68088 unter den Namen pCAV/NOT-TNF-R hinterlegt worden.

Beispiel 3 Konstruktion von cDNA's, die fOr lösliches huTNF-RA235 kodieren Eine cDNA. die für lösliches huTNF-RA235 kodiert (das die Sequenz der Aminosäuren 1-235 von Figur 2 A hat), wurde durch Ausschneiden eines 840 bp Fragmentes aus pCAV/NOT-1 NF-R mit den Restriktionsenzymen Not 1 und Pvu 2 konstruiert. Not 1

schneidet an der „multiple cloning site" von pCAV/NOT-TNF-R und Pvu2 schneidet innerhalb der kodierenden Region von

TNF-R20 Nukleotide 5' von der Transmembranregion. Um das 3'-Ende der TNF-R-Sequenzen zu rekonstruieren, wurden

2 Oligonukleotide synthetisiert und miteinander hybridisiert (annealt), um den folgenden Oligonukleotid-Linker zu schaffen:

Pvu2 BamHl BgI2

CTGAAGGGAGCACTGGCGACIiAGGATCCA GACTTCCCTCGTGACCGCTGATTCCTAGGTCTAG >»: aGluGlySerThrGlyAap£ü£k

Dieser Oligonukleotid-Linker hat terminate Pvu 2- und Bg 12-Restriktionssteilen, regeneriert 20 Nukleotide von TNF-R, gefolgt von einem Terminationskodon (unterstrichen) und einer BamH 1-Restriktionsstelle (zur leichteren Isolierung des gesamten löslichen TNF-R durch Not 1/BamH 1 Verdau). Dieses Oligonukleotid wurde dann mit dem 840bp Not 1/Pvu 2 TN.M? Insert in Bg 12/Not 1 geschnittenes pCAV/NOT liglert, um zu psolhuTNF-RA235/CAVNOT zu führen, das in COS-7-Zellen wie oben beschrieben transfiziert wurde. Dieser Expressionsvektor induzierte die Expression löslichen humanen TNF-R's, das zur Bindung von TNF fähig war.

Beispiel 4 Konstruktion von cDNAs, die f Qr lösliches huTNF-RA185 kodieren Eine cDNA, die für ein lösliches huTNF-RA185 (mit der Sequenz der Aminosäuren 1-185 aus Figur 2 A) kodiert, wurde konstruiert, Indem ein 640bp Fragment aus pCAV/NOT-TNF-R mit den Restriktionsenzymen Not 1 und Bg 12 ausgeschnitten wurde. Not1

nchneidet in der „multiple cloning site" von pCAV/NOT-TNF-R und Bg 12 schneidet innerhalb der kodierenden Region von TNF-Rbei Nukleotid 637, das 237 Nukleotide 5' der Transmembranregion liegt.

Die folgenden Oligonukleotid-Linker wurden synthetisiert:

Bgl2 5·-GATCTGTAACGTGGTGGCCATCCCTGGGAATGCAAGCATGGATGC-a·

ACATTGCACCACCGGTAGGGACCCTTACGTTCG IleCysAsnValValAlalleProGlyAsnAlaSerMetAspAla

Notl

5' - AGTCTGCACGTCCACGTCCCCCACCCGGIGAGC -3« TACCTACGTCAGACGTGCAGGTGCAGGGGGTGGGCCACTCGCCGG ValCysThrSerThrSerProThrArgEndt

Die oben angegebenen Oligonukleotid-Linker rekonstruieren das 3'-Ende des Rezep'.ormoleküls bis zu Nukleotid 706, gefolgt von einem Terminationskodon (unterstrichen). Diese Oligonukleotide wurden dann mit den 640bp Not 1 TNF-R Insert in Not1 geschnittene pCAVB/NOT ligiert, um den Expressionsvektor psolTNF-RA185/CAVNOT zu ergeben, der in COS-7-Zellen wie oben beschrieben transfiziert wurde. Dieser Expressionsvektor induzierte die Expression von löslichem humanen TNF-R, das zur Bindung von TNF fähig war.

Beispiel 5 Konstruktion von cDNAe, die für lösliches huTNF-RA163 kodieren Eine cDNA, die ein lösliches huTNF-RA163 (mit der Sequenz der Aminosäuren 1-163 von Figur 2 A) kodiert, wurde konstruiert,

indem ein 640bp Fragment aus pCAV/NOT-TNF-R mit den Restriktionsenzymen Not 1 und Bg 12, wie in Beispiel 4 beschrieben,ausgeschnitten wurde. Die folgenden Oligonukleotid-Linker wurden synthetisiert:

BgI2 Notl 5'-GATCTGTlGaGC -3'

ACAACTCGCCGG IIeCyaEnde

Der oben angegebene Oligonukleotid-Linker rekonstruiert das 3'-Ende des Rezeptormoleküls bis zu Nukleotld 642 (Aminosäure 163) gefolgt von einem Terminationskodon (unterstrichen). Das Oligonukleotid wurde dann mit dem 640 bp Not 1TNF-R Insert in Not 1 geschnittenen pCAV/NOT Ugiert, um den Expressionsvektor psolTNF-RA163/CAVNOTzu ergeben, der in COS-7-Zellen wie oben beschrieben transfiziert wurde. Dieser Expressionsvektor induzierte die Expression von löslichem humanem TNF-R, das zur Bindung von TNF in den in Beispiel 1 beschriebenen Bindungstests fähig war.

Beispiel β

Konstruktion von cDNAs, die für lösliches huTNF-RA142 kodieren

Eine cDNA, die ein lösliches huTNF-RA142 (mit der Sequenz der Aminosäuren 1-142 aus Figur 2A) kodiert, wurde konstruiert, indem ein 550 bp Fragment aus pCAV/NOT-TNF-R mit den Restriktionsenzymen Not 1 ui id AIwN 1 Ausgeschnitten wurde. AIwN 1 schneidet innerhalb der für TNF-R kodierenden Region bei Nukleotid 649. Der folgende Oligonukleotid-Linker wurde synthetisiert:

Bgl2 Notl

5'-CTGAAACATCAGACGTGGTGTGCAAGCCCTGTTAAA-a' CTTGACTTTGTAGTCTGCACCACACGTTCGGGACAATTTCTAGA

End

Der oben angegebene Oligonukleotid-Linker rekonstruiert das 3'-Ende des Rezeptormoleküls bis zu Nukleotid 579 (Aminosäure 142), gefolgt von einem Terminationskodon (unterstrichen). Dieses Oligonukleotid wurde dann mit dem 550bp Not 1/AIwN 1 TNF-R Insert in Not 1/Bg 12 geschnittenes pCAV/NOT ligiert, um den Expressionsvektor psolTNF-RA142/CAVNOT zu ergeben, der wie oben beschrieben in COS-7-Zellen transfiziert wurde. Dieser Expressionsvektor induzierte nicht die Expression von löslichem humanem TNF-R, das zur Bindung von TNR fähig war. Es wird angenommen, daß dieses spezielle Konstrukt bei der Expression biologisch aktiven TNF-R's versagte, weil einer oder mehrere der essentiellen Cysteinreste ,'beispielsweise Cys'⁶⁷ oder Cys¹⁶³) die für die intramolekulare Bindung (für die Bildung der korrekten tertiären Struktur des TNF-R-Moleküls) erforderlich sind, eliminiert worden war.

Beispiel 7

Expression löslicher TNF-Rezeptoren In CHO-Zellen

Lösliche TNF-Rezeptoren wurden in Chinese Hamster Ovary (CHO) Zellen unter Verwendung des Glutamin-Synthetase (GS) Gen Amplifikationssystems im wesentlichen ;o exprimiert, wie es in den PCT-Anmeldungen Nrn. WO 87/04462 und WO 89/01 u36 beschrieben ist. Kurz gesagt, wurden CHO-Zellen mit einem Expressionsvektor, dor die Gene sowohl für TNF-R als auch GS enthielt, transfiziert. CHO-Zellen wurden für GS-Genexpression auf der Grundlage der Fähigkeit transfizierter DNA, Resistenz gegen geringe Spiegel von Methioninsulphoximin (MSX) zu verleihen, selektioniert. Die GS-Sequenz-Amplifikationsereignisse in solchen Zellen werden durch erhöhte MSX-Konzentrationen selektioniert. Auf diese Weise werden angrenzende TNF-R-Sequenzen ebenso amplifiziert und eine gesteigerte TNF-R-Expression erzielt.

Der In dem GS-Expressionssystem verwendete Vektor war psolTNF-R/P6/PSVLGS, der wie folgt konstruiert wurde. Zunächst wurde der Vektor pSVLGS.1 (beschrieben in den PCT-Anmeldungen WO 87/04462 und WO 89/01036, erhältlich von Celltech, Ltd. Berkshire, UK) mit dem Restriktionsenzym BanH 1 geschnitten und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (CIAP) dephosphoryliert, um den Vektor daran zu hindern, mit sich selbst zu ligieren. Das BamH 1 geschnittene pSVLGS.1 Fragment wurde dann mit einem 2,4 kb BamH 1 -Bg 12-Fragment aus pEE6hCMV (beschrieben in der PCT-Anmeldung Nr. WO 89/01036 ebenso verfügbar von Celltech) ligiert, das mit Bg 12, BamH 1 und Fsp 1 zur Vermeidung von zwei Fragmenten ähnlicher Größe geschnitten worden war, um so einen 11,2kb Vektor mit der Bezeichnung p6/PSVLGS.1 zu ergeben. pSVLGS.1 enthält das selektierbare Glutamin-Synthetase-Markergen unter Kontrolle des späten SV40-Promotors. Das BamH 1-Bg 12-Fragment aus pEE6hCMV enthält den „major immediate early" (unmittelbar frühen Haupt-) Promotor aus humanem Cytomegalovirus (hCMV), einen Polylinker und das SV40 frühe Polyadenylierungssignal. Die kodierenden Sequenzen für lösliches TNF-R wurden zu p6/PSVLGS.1 zugefügt, indem ein Not 1-BamH 1-Fragment aus dem Expressionsvektor psolTNFR/CAVNOT (hergestellt nach Beispiel 3 oben) ausgeschnitten wurde, stumpfe Enden mit Klenow-Enzym erzeugt wurden und mit Sma1 geschnittenem dephosphorylierten p6/PSVLGS.1 ligiert wurde, wodurch die kodierenden solTNF-R-Sequenzen unter die Kontrolle des hCMV-Promotors gestellt wurden. Dies führte zu einem einzelnen Plasmidvektor, indem die SV40/GS und hCMV/solTNF-R Transkriptionseinheiten in entgegengesetzte Richtungen transkribiert werden. Dieser Vektor wurde als psolTNFR/p6/PSVLGS bezeichnet.

psolTNF/p6/PSVLGS wurde zur Transfektion von CHO-K 1-Zellen (verfügbar von der ATCC, Rochville, MD, unter der Hinterlegungsnummer CCL61) wio folgt verwendet. Eine Einzelschicht von CHO-K 1-Zellen wurde bis zur Subkonfluenz in Minimum Essential Medium (MEM) 10X (Gibco: 330-1581 AJ) ohne Glutamin und supplementiert mit 10%dialysiertem fötalem Rinderserum (Gibco: 220-6300 AJ), 1 mM Natriumpyruvat (Sigma), MEM nicht essentiellen Aminosäuren (Gibco: 320-1140AG), 50OuM Asparagin und Glutamat (Sigma) und Nukleosiden (3OuM Adenosin, Guanosin, Cytidin und Uridin und 1OuM Thymidin) (Sigma) wachsengelassen.

Ungefähr 1 x 10^βZellen pro 10-cm-Petrischaie wurden mit 10 ug psolTNFR/p6/PSVLGS mittels der Standard-Calciumphosphat-Prezipitationsmethode transfiziert, im wesentlichen, wie von Graham und van der Eb, Virology 52:456 (1983), beschrieben worden ist. Die Zellen wurden ungefähr 4 Stunden nach der Transfektion einem Glycerinschock (50% Glycerin in Serum-freien Kulturmedium, ungefähr 1,5 Minuten) im wesentlichen wie von Frost und Williams, Virology 91:39, (1978) unterworfen und dann mit Serum-freien Medium gewaschen. Einen Tag später wurden die transfizierten Zellen mit frischem selektiven Medium, das MSX in einer Endkonzentration von 25uM enthielt, versorgt. Kolonien MSX-resistenter überlebender Zellen wurden innerhalb von 3-4 Wochen sichtbar. Überlebende Kolonien wurden in Platten mit 24 Vertiefungen übertragen und bis zur Konfluenz in selektivem Medium wachsengelassen. Konditioniertes Medium aus konfluenten Vertiefungen wurde dann auf die Aktivität von löslichem TNF-R unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Bindungstests untersucht. Diese Tests wiesen darauf hin, daß die Kolonien biologisch aktives lösliches TNF-R exprimierten.

Um für GS-Gen Amplification zu selektlonieren, wurden verschiedene MSX-re3istente Zellinien mit psolTNFR/p6/PSVLGS transfiziert und in verschiedenen Konzentrationen von MSX wachsengelassen. Für jede Zellinie wurden ungefähr 1x10* Zellen in schrittweise ansteigenden Konzentrationen von 100μΜ, 250 μΜ, 500 μΜ und 1 mM MSX plattiert und 10-14 Tage inkubiert. Nach 12 Tagen erscheinen Kolonien, die gegen höhere Spiegel von MSX resistent sind. Die überlebenden Kolonien wurden auf TNF-R-Aktivität unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Bindungstests untersucht. Jede dieser hoch reslstenten Zellinien enthält Zellen, die von vielfachen unabhängigen Amplifikationsereignissen stammen. Aus diesen Zellinien wurden eine oder mehrere der höchst resistenten Zellinien isoliert. Die amplifizierten Zellen mit hohen Produktionsraten wurden dann durch Klonieren in beschränkter Verdünnung (limiting dilution cloning) Moniert. Massen-Zellkulturen derTransfektanten sezernleren aktives löslichus TNF-R.

Expression löslichen humanen TNF-R's In Hefe

Lösliches humanes TNF-R wurden in Hefe mit dem Expressions <ektorplXY 432 exprimiert, der von dem Hefe-Expresslonsvektor plXY120 und dem Plasmid pYEP352 abgeleitet ist. plXY120 ist identisch mit pYahuGM (ATCC 53157), mit der Ausnahme, daßes kein cDNA-lnsert enthält und eine Polylinker/multiple cloning site ohne eine Nco1-Restriktionsstelle enthält.

Ein für den TNF-Rezeptor kodierendes DNA-Fragment, das für die Klonierung in den Hefe-Expressionsvektor plXY 120 geeignet ist, wurde zunächst durch „Polymerase chain reaction" (PCR)-Amplifikation des extrazellulären Anteil des Gesamt-(full lengthlRezeptors aus pCAV/NOT-TNF-R (ATCC 68088) erzeugt. Die folgenden Primer wurden bei dieser PCR-Amplifikation verwendet:

5' End Primer

5 -TTCCGGTACCTTTGGATAAAAGAGACTACAAGGAC A3p718->ProLeuA3pLysArgAapTyrLysAsp

GACGATGACAAGTTGCCCGCCCAGGTGGCATTTACA-3' AspAapAspLys< TNF-R >

3' Erel

5' -CCCGGGATCCHAGTCGCCAGTGCTCCCTTCAGCTGGG-S' BamHl>End< TNF-R >

Der 6'-Ende Oligonukleotid-Primer, der für die Amplifikation verwendet wurde, umfaßte eine Asp718 Restriktionsstelle an seinem 5'-Ende, gefolgt von Nukleotiden, die das 3 -Ende der Hefe-ü-Faktor-Leadersequenz (Pro-Leu-Asp-Lys-Arg) kodieren und solchen, die für die 8 Aminosäuren des FLAG^R-Peptids (AspTyrLysAspAspAspAspLys) kodioren, fusioniert mit der für das 5'-Ende des reifen Rezeptors kodierenden Sequenz. Das FLAG^R-Peptid (Hopp et al., Bio/Technology 6:1204,1988) ist eine hoch antigene Sequenz, die reversibel an den monoklonalen Antikörper M1 (ATCC HB 9259) bindet. Das zur Erzeugung des 3'-Endes des PCR-abgeleiteten Fragmentes verwendete Oligonukleotid ist der Antisense (Gegensinn)-Strang der DNA, die für Sequenzen kodiert, die den offenen Leserahmen des Rezeptors nach Nukleotid 704 der reifen kodierenden Region (folgend dem Asp-Rest, der der Transmembran-Domäne vorhergeht) durch Einführen eines TAA-Stoppkodons (unterstrichen) terminiert. Dem Stoppkodon folgt dann eine BamH 1-Restriktionsstelle. Die für TNF-R kodierenden DNA-Sequenzen werden dann durch PCR amplifiziert, im wesentlichen wie von Innis et al. (Verleger), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, 1990), beschrieben.

Das durch PCR erhaltene DNA-Fragment, das für lösliches humanes TNF-R kodiert, wurde in den Hefe-Expressionsvektor plXY120 subkloniert, indem das PCR-erhaltene DNA-Fragment mit den Restriktionsenzymen BamH 1 und Asp718 verdaut wurde, plXY120 mit BamH 1 und Asp718 verdaut wurde und das PCR-Fragment In vitro in den geschnittenen Vektor mit T4 DNA-Ligase ligiert wurde. Das resultierende Konstrukt (plXY424) verband den offenen Leserahmen des FL/>^"-löslichen TNF-Rezeptors im Raster i;t der vollständigen a-Faktor-Leadersequenz und stellte die Expression in Hefe unter die Kontrolle des regulierten Hefe-Alkohol-Dehydrogenase (ADH 2) Promotors. Die Identität der Nukleotidsequenz des löslichen TNF-Rezeptors, der in plXY424 enthalten ist, mit der in cDNA-Klon 1 wurde durch DNA-Sequenzisrung unter Verwendung der Didesoxynukleotid-Kettenterminationsmethode verifiziert. plXY424 wurde dann E.coli-Stamm RR1 transformiert. Löslicher humaner TNF-Rezeptor wurde außerdem in Hefe in einem zweiten Vektor exprimiert und sezerniert. Dieser zweite Vektor wurde durch Rückgewinnung des plXY421-Plasmides aus E.coil und Verdauen mit den Restriktionsenzymen EcoR 1 und BamH 1 zur Isolierung des Fragmentes, dt s sich über die Region spannt, die für den ADH 2 Promotor, den a-Faktor-Leader, den FLAG^R-löslichen TNF-Rezeptors und das Stoppkodon kodiert, erzeugt. Das Fragment wurde in vitro in mit EcoR1 und BamH1 geschnittenes Plasmid pYEP352 (Hill et al., Yeast 2:163 [1986]) ligiert, um das Expressionsplasmid plXY432 zu ergeben, das in den E.coll-Stamm RR1 transformiert wurde.

Um die Sekretion löslichen humanen TNF-Rezeptors aus Hefe tu bestimmen, wurde plXY424 gereinigt und in einen diploiden S.cerevlslae Hefestamm (XV2181) durch Elektroporation eingeführt und auf den Erhalt des Plasmid-getragenen Hefe-TRP1⁺- Genes auf Medien ohne Tryptophan selektiert. Um die durch plXY432 gesteuerte Sekretion des Rezeptors festzustellen, wurde das Plasmid in den Hefestamm PB149-6 b durch Elektroporation eingeführt, gefolgt von Selektion für das Plasmid-getragene URA3⁺-Gen durch Wachstum auf Medien, die kein Uracil enthielten. Übernacht-Kulturen wurden bei 3O⁰C in geeigneten selektiven Medien wachsengelassen. Die PB149-6b/plXY434 Transformanten wurden in YEP-1 % Glucose Medium verdünnt und bei 30°C 38-40 Stunden wachsengelassen. Die Überstände wurden durch Entfernen der Zellen durch Zentrifugation gewonnen und durch 0,45 u FiItT filtriert.

Der Spiegel sezernierten Rezeptors in den Überständen wurden durch Immun-Dotblots bestimmt. Kurz gesagt, wurden 1 μΙ des Überstandes und Verdünnungen des Überstandes auf Nitrocellulose-Filter aufgetropft und trocknen gelassen. Nach dem Blockieren nicht spezifischer Proteinbindung mit einer 3%igen BSA-Lösung wurden die Filter mit verdünntem M1 Anti-FLAGⁿ Antikörper inkubiert, überschüssiger Antikörper wurde durch Waschen entfernt und anschließend Verdünnungen von Meerrettich-Peroxidase konjugierten anti-Maus-lgG-Antikörpern mit den Filtern inkubiert. Nach Entfernung von überschüssigen sekundären Antikörpern, wurden Peroxidasesubstrate zugesetzt und zugelassen, daß sich ungefähr 10 Minuten eine Farbe entwickelte, bevor die Substratlösung entfernt wurde.

Das Anti-FLAQ" reaktive Material, das in den Überständen gefunden wurde, zeigte, daß ein signifikanter Spiegel des Rezeptors in beiden Expressionssystemen sezerniert wurde. Vergleiche zeigten, daß das plXY432-System ungefähr &-16mal mehr löslichen humanen TNF-Rezeptor als das plXY424-System sezernierte. Die Überstände wurden auf lösliche TNF-R-Aktivität wie in Beispiel 1 beschrieben getestet, indem ihre Fähigkeit, ¹²⁵J-TNFa zu binden und die TNFa-Bindung zu blockieren, bestimmt wurde. Von den plXY432 Überständen wurde festgestellt, daß sie signifikante Spiegel aktiven löslichen TNF-R's enthalten.

Beispiel 9 Isolierung muriner TNF-R-cDNAs Murine TNF-R-cDNAs wurden aus einer mit murinen 7 B9-Zellen hergestellten cDNA-Bank isoliert, einer Antigen-abhängigen Helfer T-Zellinie, die von C57BL/6-Mäusen abgeleitet ist, Indem eine cross-species-Hybridisierung mit einer humanen TNF-R- Probe durchgeführt wurde. Die cDNA-Bank wurde i ι ZAP (Stratagene, San Diego) im wesentlichen wie in Beispiel 2 oben

konstruiert, indem die polyadenylierte RNAaus7B',)-Zellen isoliert wurde.

Eine doppelsträngige humane TNF-R cDNA-Probe wurde durch Ausschneiden eines ungefähr 3,5kb Not 1-Fragmentes aus dem

humanem TNF-R Klon 1 und ³²P-Markieren der cDNA unter Verwendung von Zufallsprimern (Boehringer-Mannheim) erzeugt.

Die murine cDNA-Bank wurde einmal amplifiziert und insgesamt 900000 Plaque:) mit der humanen TNF-R-cDNA Probe im

wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben untersucht. Ungefähr 21 positive Plaque3 wurden gereinigt und Bluescript-Plasmide,die mit EcoRI-Linkern versehene Inserts enthielten, wurden ausgeschnitten (Stntgene, San Diego). Die Nukleinsäure-

Sequenzierung eines Teiles des murinen TNF-R-Klones 11 wies darauf hin, daß die kodierende Sequenz des murinen TNF-R

ungefähr 88% homolog mit der korrespondierenden Nukleotidsequenz humanen TNF-R's ist. Eine partielle Nukleotidsequenzdes murinen TNF-R cDNA-Klones 11 ist in den Figuren 3A-3B gezeigt.

Beispiel 10 Herstellen monoklonaler Antikörper gegen TNF-R Zubereitungen von gereinigtem rekombinanten TNF-R, beispielsweise humanem TNF-R, oder transfizierte COS-Zellen, die einen

hohen Spiegel von TNF-R exprimieren, werden zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern gegen TNF-R unter Verwendunggebräuchlicher Verfahren, beispielsweise jenen, die in dem US-Patent 4,411,993 offenbart sind, verwendet. Solche Antikörpersind wahrscheinlich füreine Interferenz derTNF-BindunganTNF-Rezeptoren nützlich, beispielsweise zur Verringerung toxischeroder anderer unerwünschter Wirkungen auf TNF oder als Bestandteil für diagnostische oder Forschungstests für TNF oderlöslichen TNF-Rezeptor.

Um Mäuse zu immunisieren, wird das TNF-R Immunogen in vollständigem Freund's Adjuvanz emulgiert und in Mengen im Bereich von 10-100ug subkutan in Balb/c-Mäuse injiziert. 10-12 Tage später werden die immunisierten Tiere erneut mit

zusätzlichem, in unvollständigem rreunds'Adjuvanz emulgiertem Immunogen, behandelt und anschließend periodisch nacheinem 1-2wöchigen Immunisierungsplan geimpft.

Serumproben zum Testen mittels Dotblot-Test (Antikörper-Sandwich) oder ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

wurden periodisch durch retro-orbitale Blutung oder Schwanzspitzen-Exzision gewonnen. Andere Testverfahren sind ebensogeeignet. Im Anschluß an den Nachweis eines geeigneten Antikörper-Titers wurde positiven Tieren eine intravenöse Injektiondes Antigens in Saline gegeben. 3-4 Tage später wurden die Tiere getötet, die Splenocyten geerntet und mit der murinen

Myeioma-Zellinie NS1 fusioniert. Die mit diesem Verfahren erzeugten Hybridoma-Zellinien wurden in mehrfachen Mikrotiter- Platten in HAT-Selektionsmedium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) plattiert, um eine Proliferation von nicht-

fusionierten Zellen, Myeloma-Hybriden und Milzzellen-Hybriden zu inhibieren.

Die so erzeugten Hybridoma-Klone können mitteis ELISAauf ihre Reaktivität mit TNF-R untersucht werden, beispielsweise durch Adaptionen der von Engvall et al., Immunochem. 8:871 (1971) und Im US-Patent 4,703,004 offenbarten Verfahren. Positive Klone

werden dann in die peritonealen Räume syngenischer Balb/c-Mäuse injiziert, um eine Ascites hervorzurufen, die hohe

Konzentrationen (> 1 mg/ml) des Anti-TNF-R monoklonalen Antikörpers enthält. Der resultierende monoklonal Antikörper kann

durch Ammoniumsulfat-PrezipitBtion, gefolgt von Molekulargewichtschromatographie, und/oder Affinitätschromatographieauf der Grundlage der Bindung des Antikörpers an Protein A von Staphylococcus aureus gereinigt werden.

Claims (18)

1. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein biologisch aktives TNP-Rezeptor (TNF-R)-Protein aus Säugetieren kodiert.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, ausgewählt aus einer der folgenden Gruppen:

a) cDNA-Klone mit einer von dem kodierenden Bereich eines nativen TNF-R-Genes aus

Säugetieren abgeleiteten Nukleotidsequenz;
b). DNA-Sequenzen, die zur Hybridisierung mit den Klonen nach a) unter mäßig stringenten Bedingungen (50⁰C, 2x SSC) in der Lage sind und für biologisch aktives TNF-R-Protein

kodieren; und
c) DNA-Sequenzen, die infolge des genetischen Kodes im Verhältnis zu den in a) und b) definierten DNA-Sequenzen degeneriert sind und für biologisch aktives TNF-R-Protein kodieren.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz für ein lösliches humanes TNF-R-Protein kodiert.

4. DNA-Sequenz nach Anspruch 3, wobei das lösliche humane TNF-R-Protein eine Aminosäuresequenz hat, die die Sequenz der Aminosäurereste 1-x von Fig. 2 A umfaßt, wobei χ aus der die Aminosäuren 163-235 umfassenden Gruppe ausgewählt ist.

5. DNA· Sequenz nach Anspruch 3, wobei das lösliche humane TNF-R-Protein die Sequenz der Aminosäuren 1-235 von Fig.2A umfaßt.

6. DNA-Sequenz nach Anspruch 3, wobei das lösliche humane TNF-R-Protein die Sequenz der Aminosäuren 1-185 von Fig.2A umfaßt.

7. DNA-Sequenz nach Anspruch 3, wobei das lösliche humane TNF-R-Protein die Sequenz der Aminosäuren 1-163 von Fig.2A umfaßt.

8. DNA-Sequenz nach Anspruch 3, wobei der Aminosäurerest 46 aus der He und Thr umfassenden Gruppe und der Aminosäurerest 118 aus der VaI und He umfassenden Gruppe ausgewählt ist.

9. Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1-7.

10. Verfahren zum Herstellen eines gereinigten TNFRezeptor (TNF-R)-Proteins aus Säugetieren, wobei das Verfahren das Miteinander-Koppeln aufeinanderfolgender Aminosäurereste durch die Bildung von Peptidbindungen zur Bildung eines TNF-R-Polypeptides umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das TNF-R-Protein ein lösliches humanes TNF-R-Protein ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das lösliche humane TNF-R-Protein eine die Sequenz der Aminosäurereste 1-x von Fig. 2 A umfassende Aminosäuresequenz aufweist, wobei χ aus der Gruppe der Aminosäuren 163-235 ausgewählt ist.

13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das lösliche humane TNF-R-Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die die Sequenz der Aminosäurereste 1-235 von Fig. 2 A umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das lösliche humane TNF-R-Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die die Sequenz der Aminosäurereste 1-185 von Fig. 2 A umfaßt.

15. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das lösliche humane TNF-R-Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die die Sequenz der Aminosäurereste 1-163 von Fig. 2 A umfaßt.

16. Verwendung eines TNF-R-Proteins aus Säugetieren zum Herstellen eines Medikamentes zur Regulation von Immunantworten in Säugetieren.

17. Verwendung eines TNF-R-Proteins aus Säugetieren zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die parenteral Verabreichung an einen humanen Patienten zur Regulation der Immunantworten geeignet ist.

18. Antikörper, die mit Säugetier TNF-Rezeptoren immunreaktiv sind.