DE69333027T2 - Fusionsprotein , das zwei rezeptoren des tumornekrose-faktors enthält - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Von einer Reihe von Zytokinen ist bekannt, dass sie an spezifische Rezeptorproteine auf der Oberfläche von Zielzellen binden. Unter den spezifischen Rezeptorproteinen, die identifiziert wurden, gibt es Tumornekrosefaktor-Rezeptoren und Interleukin-1-Rezeptoren. Es wird viel Aufwand für die Isolierung und Charakterisierung einer Anzahl von Rezeptoren aufgewendet, um ihre physiologischen Rollen zu studieren und mögliche therapeutische Verwendungen zu erforschen. Die Bindung eines bestimmten Zielmoleküls durch einen löslichen Rezeptor, der einem Patienten verabreicht wird, könnte Erkrankungen, die von dem Zielmolekül vermittelt werden, lindern.
  • Tumornekrosefaktor-α (TNFα, auch bekannt als Cachectin) und Tumornekrosefaktor-β (TNFβ, auch bekannt als Lymphotoxin) sind homologe endogene sekretorische Sängerproteine, die befähigt sind, eine breite Vielfalt von Wirkungen auf einer großen Anzahl von Zelttypen zu induzieren. Die großen Ähnlichkeiten in strukturellen und funktionellen Charakteristika dieser zwei Zytokine führte zu ihrer gemeinsamen Bezeichnung „TNF". Komplementäre cDNA-Clone, die TNFα (Pennica et al., Nature 312: 724, 1984) und TNFβ (Gray et al., Nature 312: 721, 1984) codieren, wurden isoliert, was eine weitere strukturelle und biologische Charakterisierung von TNF ermöglichte.
  • TNF-Proteine initiieren ihre biologische Wirkung auf Zellen, indem sie an spezifische TNF-Rezeptor(TNF-R)-Proteine, die auf der Plasmamembran einer TNF-reaktiven Zelle exprimiert werden, binden. Es wurde zuerst gezeigt, dass TNFα und TNFβ an einen gemeinsamen Rezeptor auf der humanen Zervixkarzinom-Zelllinie ME-180 (Aggarwal et al., Nature 318: 665, 1985) binden. Hohmann et a1. (J. Biol. Chem. 264: 14927, 1989) berichteten, dass mindestens zwei unterschiedliche Oberflächenrezeptoren für TNF auf unterschiedlichen Zell-typen existieren, obwohl der Zusammenhang zwischen diesen TNF-Rs unklar ist. Diese Rezeptoren haben ein apparentes Molekulargewicht von ungefähr 75–80 kDa bzw. 55–60 kDa. Zusätzlich zu Zelloberflächenrezeptoren für TNF wurden auch lösliche Proteine aus humanem Urin identifiziert, die befähigt sind, TNF zu binden (Peetre et al., Eur. J. Haematol. 41: 414, 1988; Seckinger et al., J. Exp. Med. 167: 1511, 1988; Seckinger et al., J. Biol. Chem. 264: 11966, 1989; UK-Patentanmeldung, Veröffentlichungsnr. 2 218 101 A von Seckinger et al.; Engelmann et al., J Biol. Chem. 264: 11974, 1989).
  • Interleukin-1α (1L-1β) und Interleukin-1β (IL-1β) sind entfernt verwandte Polypeptidhormone, die eine zentrale Rolle in der Regulation von Immun- und Entzündungs-Antworten spielen. Diese zwei Proteine wirken auf eine Vielzahl unterschiedlicher Zelttypen und besitzen eine Vielzahl biologischer Aktivitäten. Die biologischen Aktivitäten, die IL-1α und IL-1β zugeschrieben werden, werden über mindestens zwei Klassen von Plasmamembrangebundenen Rezeptoren vermittelt, welche sowohl IL-1α als auch IL-1β binden. Die IL-1-Rezeptoren, die auf B-Zellen exprimiert werden (auf die hierin als Typ II-IL-1-Rezeptoren Bezug genommen wird), unterscheiden sich von IL-1-Rezeptoren, die auf T-Zellen und anderen Zelttypen detektiert werden (auf die hierin als Typ I-IL-1-Rezeptoren Bezug genommen wird).
  • Peppel et al., 1991, J. Exp. Med 174: 1483–1489 offenbaren ein dimeres Fusionsprotein, das aus der extrazellulären Domäne des humanen 55 kD-TNF-R besteht, die mit dem Fc-Teil und der Gelenkregion der schweren Kette eines Maus-IgG1 über einen Thrombin-sensitiven Peptidlinker verbunden ist.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ist auf ein Fusionsprotein gerichtet mit der Formel: TNF-R – Linker – TNF-R, wobei der Linker ein Peptidlinker ist und jeder TNF-R ein löslicher TNF-R ist, der fähig ist, TNF zu binden.
  • Die Rezeptoren werden bevorzugt über rekombinante DNA-Technologie als Fusionsproteine hergestellt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch isolierte DNA-Sequenzen, die für die Fusionsproteine codieren, rekombinante Expressionsvektoren, die solche DNA-Sequenzen umfassen, Wirtszellen, die die Expressionsvektoren enthalten, und Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Fusionsproteine durch Kultivierung der Wirtszellen, zur Verfügung. Es werden auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein wie oben beschriebenes gereinigtes Fusionsprotein und ein geeignetes Verdünnungsmittel, einen Trägerstoff oder ein Exzipiens umfassen, von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt. Solche Zuammensetzungen sind nützlich in der Therapie, der Diagnose und in Assays für Krankheitszustände, die von Tumornekrosefaktor oder Interleuking-1 vermittelt werden.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt eine Restriktionskarte für einen humanen Typ-I-IL-1R-cDNA-Clou. Es sind die Stellen gezeigt, an denen bestimmte Restriktionsenzyme die cDNA schneiden.
  • 2A-2B zeigen die partielle cDNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäure-Sequenz eines humanen TNF-R-Clons. Die Nucleotide sind vom Beginn der 5'-untranslatierten Region an nummeriert. Aminosäuren sind vom Beginn der Signalpeptid-Sequenz an nummeriert. Die offenbare Signalpeptid-Sequenz wird von den Aminosäuren –22 bis –1 verkörpert. Das N-terminale Leucin des reifen TNF-R-Proteins ist an Position 1 unterstrichen. Die offenbare Transmembran-Region der Aminosäuren 236 bis 265 ist ebenfalls unterstrichen. Die C-Termini verschiedener löslicher TNF-Rs sind mit einem Pfeil (⇕) markiert. Schnittstellen für bestimmte Restriktionsendonucleasen, die bei der Konstruktion von Expressionsvektoren verwendet wurden, sind angegeben.
  • 3 zeigt einen Plasmidvektor, der ein DNA-Fragment umfasst, das für ein Fusionsprotein der Formel TNF-R-Linker-TNF-R codiert, der wie in Beispiel 11 beschrieben konstruiert wurde.
  • 4 zeigt einen Plasmidvektor, der ein DNA-Fragment umfasst, das ein Fusionsprotein der Formel IL-1R-Linker-TNF-R-Linker-TNF-R codiert, der wie in Vergleichsbeispiel 5 beschrieben konstruiert wurde.
  • 5 zeigt drei Plasmidvektoren, die Zwischenprodukte bei der Konstruktion bestimmter Vektoren der vorliegenden Erfindung sind, wie in Vergleichsbeispiel s beschrieben.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ist auf Rezeptoren gerichtet, die ein erstes TNF-R-Polypeptid kovalent verknüpft mit einem zweiten TNF-R-Polypeptid umfassen. Die TNF-R-Polypeptid-Komponenten sind miteinander unter Verwendung von Peptidlinkern verbunden. Die TNF-R-Polypeptide sind von Säugerarten abgeleitet, und bevorzugt human.
  • Die Rezeptoren werden bevorzugt über DNA-Rekombinationstechnik als Fusionsproteine hergestellt. Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein umfasst zwei TNF-R-Polypeptide und kann durch die folgende Formel dargestellt werden:
    TNF-R – Linker – TNF-R, wobei der Linker ein Polypeptidlinker ist, und jeder TNF-R ein löslicher TNF-R ist, der fähig ist, TNF zu binden.
  • Jede TNF-R-Polypeptid-Komponente der Fusionsproteine ist unabhängig voneinander fähig, Tumornekrosefaktor (TNF) zu binden. Die Aufnahme von zwei nebeneinander liegenden TNF-R-Polypeptiden im Fusionsprotein ist vorteilhaft, indem die TNF-Bindungsaffinität verglichen mit der Bindung von TNF durch ein einzelnes TNF-R-Polypeptid erhöht ist.
  • Peptidlinker, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, trennen TNF-R-Polypeptide voneinander, und zwar mit einer Distanz, die ausreicht, um sicherzustellen, dass jedes Polypeptid sich richtig in die sekundären und tertiären Strukturen faltet, die notwendig für die erwünschte biologische Aktivität sind. Der Linker sollte es den extrazellulären Domänen des TNF-R auch ermöglichen, die richtige räumliche Orientierung anzunehmen, um eine Bindestelle für TNF zu bilden. Die Peptidlinker fungieren als Abstandhalter, und zwar im Gegensatz zu den pharmazeutisch aktiven TNF-R-Polypeptid-Komponenten der Fusionsproteine. Geeignete Polypeptidlinker (1) nehmen bevorzugt eine flexible ausgestreckte Konformation an, (2) zeigen bevorzugt keine Neigung zur Entwicklung einer geordneten Sekundärstruktur, welche mit den funktionellen Proteindomänen in Wechselwirkung treten könnte, und (3) besitzen bevorzugt minimale hydrophobe oder geladene Eigenschaften, welche Wechselwirkungen mit den funktionellen Proteindomänen fördern könnten. Typische Oberflächen-Aminosäuren in flexiblen Proteinregionen umfassen Glycin (Gly), Asparagin (Asn) und Serin (Ser). Von praktisch jeder Permutation von Aminosäure-Sequenzen, die Gly, Asn und Ser enthalten, würde man annehmen, dass sie die obigen Kriterien für eine Peptid-Linker-Sequenz erfüllen. Andere beinahe neutrale Aminosäuren wie beispielsweise Threonin (Thr) und Alanin (Ala) können ebenfalls in der Linker-Sequenz verwendet werden. Geeignete Peptidlinker umfassen im Allgemeinen eine Kette von Aminosäuren, bevorzugt 5 bis zu 100 Aminosäuren lang und insbesondere 10 bis zu 20 Aminosäuren lang. Beispiele solcher Linker umfassen (G1y4Ser)n, wobei n 1–12 ist, Gly4SerGly5Ser und (Gly4SerGly5Ser)2, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • TNF-R-Polypeptide
  • Wie hierin verwendet, beziehen sich die Ausdrücke „TNF-Rezeptor" und „TNF-R" auf Proteine, die biologisch aktiv sind, indem sie fähig sind, Tumornekrosefaktor (TNF) zu binden. Native Membran-gebundene Formen der Proteine übertragen auch ein biologisches Signal, das durch die Bindung eines TNF-Moleküls an eine Zelle ausgelöst wird. Bei Fusionsproteinen, die mehr als ein TNF-R-Polypeptid umfassen, können die TNF-R-Polypeptide identisch oder unterschiedlich sein.
  • Intakte Rezeptoren umfassen im Allgemeinen eine extrazelluläre Domäne, die an einen Liganden bindet, eine hydrophobe Transmembrandomäne, welche innerhalb der Plasmamembran-Lipiddoppelschicht eingebettet bleibt, und eine zytoplasmatische oder intrazelluläre Domäne, bei welcher davon ausgegangen wird, dass sie ein biologisches Signal über eine Kaskade von chemischen Reaktionen innerhalb des Zytoplasmas der Zelle zu Effektorzellen leitet. Die hydrophobe Transmembrandomäne und eine stark geladene Region der zytoplasmatischen Domäne direkt stromabwärts der Transmembrandomäne gelegen, arbeiten kooperativ und stoppen den Transport des TNF-Rezeptors durch die Plasmamembran hindurch. Die extrazelluläre Domäne des TNF-R-Proteins, die hierin offenbart ist, ist der N-terminale Teil des Proteins, von Aminosäure 1 bis zu der Aminosäure, die der Transmembran-Region direkt vorausgeht. Die zytoplasmatische Domäne ist der Teil des Proteins, der stromabwärts der Transmembran-Region liegt.
  • Natives Volllängen-TNF-R ist ein Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 439 der Sequenz, die in 2A–2B gezeigt ist, umfasst. Diese TNF-R-DNA und -Aminosäure-Sequenz ist auch in SEQ ID NO: 1 und 2 gezeigt. Wenn die Signalsequenz miteinbezogen wird, umfasst das TNF-R-Polypeptid Aminosäuren –22 bis 439 der Sequenz der 2A-2B. Die Erwünschtheit des Einbindens der Signalsequenz hängt von solchen Faktoren wie der Position des TNF-R-Polypeptids im Fusionsprotein und davon, ob die vorgesehene Wirtszelle eine Säuger-Signalsequenz prozessieren wird, ab, wie unten diskutiert wird. Die reife native glykosilierte Volllängen-Form dieses humanen TNF-R ist ein Glykoprotein, das ein Molekulargewicht von ungefähr 80 Kilodalton (kDa) hat. Der Ausdruck „reif", wie er in der Be schreibung verwendet wird, bedeutet ein Protein, dem eine Leit- oder Signalsequenz, wie; sie in Voll-Längen-Transkripten eines nativen Gens vorhanden sein könnte, fehlt. Ein Protein kann eine Signalsequenz umfassen, wenn es anfänglich exprimiert wird. Das Abschneiden der Signalsequenz nach der Sekretion des Proteins aus der Zelle führt zu der reifen Form des Proteins.
  • Andere TNF-R-Polypeptide sind in der europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 422 339 (im Folgenden EP 422 339 ) beschrieben. Zwei TNF-R-Polypeptide umfassen Arginin (Arg) als Rest 174, sind aber ansonsten identisch mit den oben beschriebenen Polypeptiden, die die Aminosäuren 1 bis 439 bzw. –22 bis 439 der 2A-2B der vorliegenden Anmeldung umfassen. Eine TNF-R-Aminosäure-Sequenz, die zu der aus 2A-2B (der folgenden Anmeldung) mit Ausnahme einer Substitution von Arginin (Arg) durch Methionin (Met) an Position 174 der reifen Sequenz identisch ist, ist in der EP 422 339 (siehe deren 39) beschrieben.
  • Die cDNA und codierte Aminosäure-Sequenzen eines anderen TNF-R-Polypeptids sind in 21 der EP 422 339 beschrieben. Die codierende Region der cDNA-Sequenz der 21 der EP 422 339 und die davon codierte Aminosäure-Sequenz sind als SEQ ID NO: 3 und 4 der vorliegenden Anmeldung gezeigt. Obwohl auf dieses Protein in der EP 422 339 als 30-Kilodalton-Protein Bezug genommen wird, wurden für dieses Protein andere Molekulargewichte berichtet. Es wurde z. B. ein Molekulargewicht von ungefähr 55 Kilodalton von Loetscher et al. (Cell 61: 351, 1990) und in der EP 417 563 beschrieben. TNF-R-Polypeptide umfassen jene, die Aminosäuren 1 bis 415 der Sequenz SEQ ID NO: 4 oder, wenn die Signalsequenz erwünscht ist, die Aminosäuren –40 bis 415 der SEQ ID N0: 4-Sequenz umfassen. Verfahren zur Herstellung dieses TNF-R-Proteins, entweder durch Reinigung aus Urin oder aus dem Medium einer Kultur von U937-Zellen, oder durch DNA-Rekombinationstechnik, sind in der EP 422 339 beschrieben. Dieser TNF-R zeichnet sich durch die N-terminale Sequenz (für die reife Form des Proteins) Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln- aus, während die N-terminale Sequenz der reifen Form des TNF-R-Proteins aus 2A –2C Leu-Pro-Ala-Gln-Val-Ala- ist.
  • In der vorliegenden Erfindung ist das TNF-R-Polypeptid ein lösliches TNF-R-Polypeptid. Löslichen TNF-R-Polypeptiden fehlt zumindest ein Teil der (bevorzugt die ganze) Transmembran-Region, die das Zurückhalten des Proteins auf der Zelloberfläche begünstigt. Den löslichen Polypeptiden fehlt im Allgemeinen auch die geladene Region der zytoplasmatischen Domäne (die direkt stromabwärts der Transmembran-Region liegt), die zur Retention auf der Zelloberfläche beiträgt. Bevorzugt sind die gesamte Transmembran-Region und zytoplasmatische Domäne des Proteins deletiert oder mit hydrophilen Aminosäuren substituiert, um einen löslichen TNF-R zu bilden. Löslicher TNF-R wird aus der Zelle sezerniert und behält die erwünschte biologische Aktivität.
  • Beispiele von löslichen TNF-R-Polypeptiden sind jene, die Aminosäuren 1 – x der Figur 2A-Sequenz umfassen, wobei x die C-terminale Aminosäure ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus jeder der Aminosäuren 163–235 aus 2A. Spezifische Beispiele umfassen Polypeptide, die die Aminosäuren 1–163, 1–185 oder 1–235 aus 2A umfassen. Das lösliche TNF-R-Polypeptid kann zusätzlich eine Signalsequenz umfassen, z. B. Aminosäuren –22 bis –1 aus 2A.
  • Zusätzliche Beispiele löslicher TNF-R-Polypeptide sind jene, die die Aminosäuren 1–184 oder 1–182, –22–184 oder –22–182 der Sequenzen der 2A-2B umfassen. Derartige Proteine können an Position 174 entweder Methionin oder Arginin enthalten. Verfahren zur Herstellung der Beispiele solcher TNF-R-Polypeptide schließen jene mit ein, die in Beispielen 17 und 22 der EP 422 339 beschrieben sind.
  • Das TNF-R-Protein, das in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist, umfasst ein Signalpeptid (bezeichnet mit den Aminosäuren –40 bis –1) und eine Transmembran-Region, die mit dem Valin-Rest an Position 172 beginnt. Lösliche Formen dieses TNF-R-Proteins umfassen jene, die die Aminosäuren –40-w oder 1-w von SEQ 11 NO: 4 umfassen, wobei w eine ganze Zahl von 161–171 ist (d. h., irgendeine der Aminosäuren 161 bis 171 von SEQ 11 NO: 4 ist der C-Terminus). Die Verwendung von Oligonucleotid-gerichteter in vitro-Mutagenese zur Konstruktion eines Expressionsvektors, der ein biologisch aktives TNF-R-Protein mit Aminosäure 161 (Asparagin) als C-terminaler Aminosäure codiert, ist in Beispiel 7 der EP 422 339 gezeigt. Weiterhin wurden Verfahren zur Reinigung natürlich vorkommender löslicher Formen von beiden der oben beschriebenen TNF-R-Proteine (d. h., lösliche Formen der SEQ ID NO: 2- und der SEQ ID NO: 4-Proteine) aus humanem Urin von Engelmann et al. (J. Biol. Chem. 265: 1531, 1990) beschrieben.
  • Assay-Verfahren, die hierin beschrieben sind, können angewandt werden, um eine biologische Aktivität für zusätzliche lösliche TNF-R-Polypeptide, neben den einzelnen oben unterbreiteten Beispielen, zu bestätigen. Löslicher TNF-R kann identifiziert werden (und von dessen nicht-löslichen Membran-gebundenen Gegenstücken unterschieden werden), indem intakte Zellen, welche das erwünschte Protein exprimieren, vom Kulturmedium abgetrennt werden, z. B durch Zentrifugation, und das Medium (Überstand) auf Anwesenheit des erwünschten Proteins untersucht wird. Das Kulturmedium kann unter Verwendung von Verfahren, welche zu jenen, die in den Beispielen unten beschrieben werden, ähnlich oder identisch sind, untersucht werden. Die Anwesenheit von TNF-R im Medium zeigt an, dass das Protein aus den Zellen sezerniert wurde und daher eine lösliche Form des erwünschten Proteins ist.
  • Der N- oder C-Terminus der TNF-R-Polypeptide kann im Zusammenhang mit solchen Faktoren wie der An der Wirtszellen, die verwendet werden, wenn das Fusionsprotein über DNA-Rekombinationstechnik hergestellt wird, und der jeweiligen Zellen, von welchen das Protein aufgereinigt wird, wenn nicht-rekombinanter TNF-R verwendet wird, variieren. Sol che Variationen können beispielsweise auf unterschiedliche post-translationale Prozessierung des Proteins in verschiedenen Zelltypen zurückgeführt werden. Unterschiede in der N- oder C-terminalen Sequenz können auch von den Oligonucleotiden herrühren, die ausgewählt wurden, um jeden der Termini der TNF-R-codierenden DNA-Sequenz zu rekonstruieren, wenn Expressionsvektoren konstruiert wurden.
  • Differenzierte Prozessierung kann zu reifen TNF-R-Proteinen führen, die eine andere Nterminale Aminosäure als jene, die an Position 1 der SEQ ID NO: 2 und 4 gezeigt sind, haben. Zum Beispiel wird die post-translationale Prozessierung in bestimmten Wirtszellen den Methionin-Rest, der von einem Initiationscodon codiert wird, entfernen, während der Methionin-Rest am N-Terminus von Proteinen, die in anderen Wirtszellen hergestellt werden, am N-Terminus bleibt. Darüber hinaus ist für die N- und C-Termini bekannt, dass sie für dasselbe Protein variieren, abhängig von der Quelle des Proteins. In manchen Fällen kann die Deletion von Aminosäuren an einem der Termini des Proteins in einer Proteolyse begründet sein, die entweder intrazellulär oder während der Reinigung auftritt. Unterschiedliche N-Termini können auch vom Abschneiden des Signalpeptids herrühren, welches in bestimmten Wirtszellen an einem anderen Punkt als zwischen den Aminosäuren –1 und 1 der offenbarten Sequenzen geschieht.
  • Wie in Beispielen 10 und 11 und 31 der EP 422 339 beschrieben, fehlten einem nicht-rekombinanten reifen TNF-R-Protein, das aus humanem Urin gereinigt wurde, zwei Nterminale Aminosäuren, die in einem nicht-rekombinanten TNF-R-Protein, das aus der humanen Monozyten-ähnlichen Zelllinie U937 aufgereinigt wurde, gefunden wurden. Die Nterminale Aminosäure des Urin-abgeleiteten TNF-R war der Alanin-Rest an Position 3 von SEQ ID NO: 1. Engelmann et al. (J. Biol. Chem. 265: 1531, 1990) offenbaren ein Protein, das TNF bindet und in Formen, die zu unterschiedlichem Grad am N-Terminus verkürzt waren (siehe Abstract und Seite 1533), aus humanem Urin gereinigt wurde. Die N-terminale Aminosäure-Sequenz einer Protein-Spezies war Val-Ala-Phe-Thr-Pro-, die mit den Aminosäuren 5–9 von SEQ ID NO: 1 übereinstimmt. Andere Formen des Proteins besaßen entweder Phenylalanin (Aminosäure 7 von SEQ ID NO: 1) oder Threonin (Aminosäure 8 von SEQ ID NO: 1) als N-terminale Aminosäure.
  • Die N- und C-Termini der TNF-R-Proteine können aus Gründen, die jene umfassen, die oben diskutiert sind, variieren. Die N-terminale Aminosäure kann z. B jede der Aminosäuren an Positionen 1 bis 5 von SEQ ID NO: 2 oder 4 für TNF-R sein. Der C-Terminus kann ganz bewusst während der Konstruktion des Expressionsvektors (z. B beim Konstruieren von Vektoren, die für lösliche Proteine codieren, wie oben beschrieben), oder als Ergebnis einer differentiellen Prozessierung, welche bis zu ungefähr fünf C-terminale Aminosäuren entfernen kann, verkürzt sein, um Beispiele zu nennen.
  • Zusätzliche TNF-R-Polypeptide, die verwendet werden können, behalten die erwünschte biologische Aktivität, aber unterscheiden sich von den nativen Sequenzen, indem Aminosäure(n) hinzugefügt, deletiert oder in der nativen Sequenz substituiert sind. Die biologische Aktivität von solchen Proteinen kann unter Verwendung der hierin beschriebenen Assays bestätigt werden.
  • Derivate von TNF-R, die innerhalb des Umfangs der Erfindung liegen, umfassen auch verschiedene strukturelle Formen des primären Proteins, welche die biologische Aktivität behalten. Aufgrund der Anwesenheit von ionisierbaren Amino- und Carboxyl-Gruppen kann ein TNF-R-Protein beispielsweise in Form von Säure- oder basischen Salzen vorliegen, oder in neutraler Form vorliegen. Einzelne Aminosäurereste können auch durch Oxidation oder Reduktion modifiziert sein.
  • Die primäre Aminosäurestruktur kann durch Bildung kovalenter oder aggregativer Konjugate mit anderen chemischen Gruppen wie Glykosylgruppen, Lipiden, Phosphaten, Acetylgruppen und ähnlichen modifiziert sein. Kovalente Derivate werden hergestellt, indem bestimmte funktionelle Gruppen mit Aminosäureseiten oder den N- oder C-Termini verknüpft werden. Natürlich vorkommende Varianten können aus alternativen RNA-Spleiß-Ereignissen resultieren.
  • Andere Proteine, die in den erfinderischen Fusionsproteinen verwendet werden können, umfassen Konjugate von TNF-R mit anderen Polypeptiden, welche durch Synthese als Nterminale oder C-terminale Fusionen in rekombinanter Kultur hergestellt werden können. Zum Beispiel kann das konjugierte Peptid eine Signal- (oder Leader-)Peptidsequenz an der N-terminalen Region des Proteins sein, welche cotranslational oder posttranslational den Transfer des Proteins von dem Ort der Synthese an seinem Wirkungsort innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder -wand dirigiert (z. B der Hefe-α-Faktor-Leader). Die Fusionsproteine können Peptide umfassen, die hinzugefügt wurden, um Reinigung oder Identifizierung der Fusionsproteine zu erleichtern. Solche Proteine umfassen beispielsweise Poly-His oder die antigenischen Identifikationspeptide, die in dem US-Patent 5,011,912 und in Hopp et al., Biol Technology 6: 1204, 1988 beschrieben sind. Ein solches Peptid ist das FLAG®-Peptid, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK), welches stark antigenisch ist und ein Epitop bietet, das von einem spezifischen monoClonalen Antikörper reversibel gebunden wird; dies ermöglicht einen schnellen Assay und eine leichte Reinigung des exprimierten rekombinanten Proteins. Diese Sequenz wird außerdem spezifisch von einer Rinder-Schleimhaut-Enterokinase an dem Rest, der unmittelbar auf die Asp-Lys-Paarung folgt, geschnitten. Fusionsproteine, die mit diesem Peptid als Kappe versehen sind, können auch resistent gegen intrazellulären Abbau in E. coli sein. Ein Maus-Hybridom, das als 4E11 bezeichnet wurde, produziert einen monoklonalen Antikörper, der das Peptid DYKDDDDK in Anwesenheit von bestimmten divalenten Metallkationen bindet (wie beschrieben in dem US- Patent 5,011,912), und er wurde bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer HB 9259 hinterlegt.
  • Die erfinderischen Fusionsproteine umfassen TNF-R mit oder ohne das native Glykosylierungsmuster. TNF-R, der in Hefe- oder Säuger-Expressionssystemen exprimiert wird, z. B in COS-7-Zellen, kann in Bezug auf Molekulargewicht und Glykosylierungsmuster ähnlich oder leicht unterschiedlich zu den nativen Molekülen sein, abhängig von dem Expressionssystem. Die Expression von rekombinanten Proteinen in Bakterien wie E. coli liefert nicht-glykosylierte Proteine. Proteine, die inaktivierte N-Glykosylierungsstellen besitzen, können durch Oligonucleotid-Synthese und Ligation, oder durch ortsspezifische Mutagenesetechniken hergestellt werden. Diese mutierten Proteine können in homogener Form mit reduzierten Kohlehydraten in guter Ausbeute produziert werden, indem ein Hefe-Expressionssystem verwendet wird. N-Glykosylierungsstellen in eukaryontischen Proteinen sind durch das Aminosäure-Triplett Asn-A1-Z gekennzeichnet, wobei A1 jede Aminosäure aus der Pro sein kann, und Z Ser oder Thr ist. In dieser Sequenz stellt Asparagin eine Seitenketten-Aminogruppe für die kovalente Bindung zu einem Kohlenhydrat zur Verfügung. Solch eine Stelle kann entfernt werden, indem Asn oder der Rest Z durch eine andere Aminosäure substituiert wird, Asn oder Z deletiert wird, oder indem eine Nicht-Z-Aminosäure zwischen A1 und Z, oder eine andere Aminosäure als Asn zwischen Asn und A1 eingefügt wird. Bekannte Verfahren für die N-Glykosylierungsstellen in Proteinen umfassen jene, die in US-Patent 5,071,972 und EP 276 846 beschrieben sind. Beispiele von N-Glykosylierungsstellen im humanen Typ II-IL-1R sind die Aminosäuren 53–55, 59–61, 99–101, 206–208 und 264–266 in der SEQ ID NO: 8. Potentielle N-Glykosylierungsstellen werden im Typ-I-IL-1R-Protein (SEQ ID NO: 6) bei den Aminosäuren 80–82, 173–175, 213–215, 229–231, 243–245 und 277–279 gefunden. N-Glykosylierungsstellen werden auch bei den Aminosäuren 171–173 und 358–360 von TNF-R in den 2A-2B gefunden.
  • Cysteinreste, die für die biologische Aktivität nicht essentiell sind, können deletiert werden oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, um die Bildung von unnötigen oder falschen intramolekularen Disulfid-Brücken nach der Renaturierung zu vermeiden. Der Cysteinrest an Position 178 in der TNF-R-Sequenz der 2A-2B kann zum Beispiel deletiert werden. US-Patent 4,518,584 beschreibt die Anwendung ortsspezifischer Mutagenese, um Cysteinreste innerhalb eines Proteins zu deletieren oder zu ersetzen. Andere Ansätze zur Mutagenese umfassen die Modifikation von benachbarten dibasischen Aminosäureresten, um die Expression in Hefesystemen, in denen KEX2-Proteaseaktivität vorhanden ist, zu verstärken. Die EP 212 914 offenbart die Verwendung ortsspezifischer Mutagenese, um KEX2-Protease-Prozessierungsstellen in einem Protein zu inaktivieren. Um die biologische Aktivität von TNFR-R zu bewahren, werden Substitutionen bevorzugt zu homologen oder konservativ substituierten Sequenzen führen, was bedeutet, dass ein vorgegebener Aminosäurerest durch ei nen Rest, der ähnliche physiochemikalische Eigenschaften hat, ersetzt wird. Beispiele konservativer Substitutionen umfassen die Substitution eines aliphatischen Restes durch einen anderen, wie beispielsweise IIe, Val, Leu oder Ala jeweils untereinander, oder Substitutionen eines polaren Restes durch einen anderen, wie beispielsweise zwischen Lys und Arg; Glu und Asp; oder Gln und Asn. Es sind auch andere konservative Substitutionen, z. B Substitutionen ganzer Regionen, die ähnliche hydrophobe Eigenschaften haben, wohl bekannt. Außerdem deuten bestimmte Aminosäure-Unterschiede zwischen menschlichen, Maus- und anderen Säuger-TNF-Rs auf zusätzliche konservative Substitutionen hin, die vorgenommen werden können, ohne die essentiellen biologischen Eigenschaften von TNF-R abzuändern.
  • Änderungen der nativen Aminosäure-Sequenz können durch eine ganze Reihe von Techniken erreicht werden. Es können Mutationen an bestimmten Stellen eingefügt werden, indem Oligonucleotide synthetisiert werden, die eine mutierte Sequenz enthalten, die von Restriktionsstellen flankiert wird, welche die Ligation an Fragmente der nativen Sequenz ermöglichen. Nach der Ligation codiert die daraus hervorgehende rekonstruierte Sequenz ein Analog, das die erwünschte Aminosäure-Insertion, -Substitution oder -Deletion besitzt.
  • Alternativ dazu können Oligonucleotid-vermittelte ortsspezifische Mutagenese-Verfahren angewendet werden, um ein geändertes Gen bereitzustellen, das entsprechend der erwünschten Substitution, Deletion oder Insertion bestimmte veränderte Codons besitzt. Beispielhafte Methoden zum Erstellen der oben aufgeführten Veränderungen wurden offenbart bei Walder et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985); Craik (BioTechniques, Januar 1985, 12–19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); und die US-Patente 4,518,584 und 4,737,462 offenbaren geeignete Techniken.
  • Die abweichende Aminosäure-Sequenz ist mindestens zu 80% identisch, und insbesondere mindestens 90% identisch mit der nativen Sequenz. Die prozentuale Ähnlichkeit kann beispielsweise bestimmt werden, indem Sequenzinformationen unter Verwendung des GAP-Computerprogramms, Version 6.0, erhältlich von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG), verglichen werden. Das GAP-Programm nutzt die Methode zur vergleichenden Anordnung von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970), und zwar wie von Smith und Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981) überarbeitet. Kurz, das GAP-Programm definiert Ähnlichkeit als die Anzahl sich deckender Symbole (d. h. Nucleotide oder Aminosäuren), welche ähnlich sind, geteilt durch die Gesamtzahl von Symbolen in der kürzeren der zwei Sequenzen. Die bevorzugten Standardeinstellungs-Parameter für das GAP-Programm umfassen: (1) eine unäre Vergleichsmatrix (die einen Wert 1 für Identitäten und 0 für Nicht-Identitäten) für Nucleotide enthält, und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986, wie sie von Schwartz und Dayhoff, Hrsg., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, S. 353–358, 1979, beschrieben wurde; (2) einen Abzug („penalty") von 3.0 für jede Lücke und einen zusätzlichen Abzug von 0.10 für jedes Symbol in jeder Lücke; und (3) keinen Abzug für endständige Lücken.
  • Proteine, die fähig sind, die Bindung von IL-1 an zelluläre Rezeptoren in vivo zu blockieren, die im Allgemeinen als IL-1-Rezeptor-Antagonisten bezeichnet werden, umfassen jene, die von Eisenberg et al. (Nature 343: 341, 1990), Hannum et al. (Nature 343: 336, 1990) und Carter et al. (Nature 344: 633, 1990) beschrieben wurden. Diese Proteinantagonisten binden an IL-1-Rezeptoren, haben aber keine IL-1-ähnliche Aktivität (z. B sie transduzieren kein Signal oder bringen nicht anders die biologischen Effekte hervor, die aus der Bindung von IL-1 an einen zellulären IL-1-Rezeptor resultieren). Die Antagonisten-Proteine kompetitieren mit IL-1 um die Bindung an endogene IL-1-Rezeptoren; sie inhibieren daher biologische Effekte, die von IL-1 in vivo vermittelt werden.
  • DNA-Sequenzen, die für rekombinante Fusionsproteine codieren
  • Es werden auch isolierte DNA-Sequenzen, die für die oben beschriebenen Fusionsproteine codieren, von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt. Eine DNA-Sequenz, die für ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein codiert, wird konstruiert, indem DNA-Rekombinationstechniken angewandt werden, um DNA-Fragmente, die für die TNF-R-Polypeptide codieren, in einen geeigneten Expressionsvektor einzufügen. Eine DNA-Sequenz, die für TNF-R codiert, wird mit einer Linker-Sequenz ligiert, welche wiederum mit einer zweiten TNF-R-codierenden Sequenz ligiert wird.
  • Eine DNA-Sequenz, die für eine N-terminale Signalsequenz codiert, kann in der DNA-Sequenz, die für das N-terminale Polypeptid codiert, beibehalten werden, während Stopp-Codons, welche das Durchlesen zu den/der stromabwärts gelegenen DNA-Sequenzen/-Sequenz inhibieren, eliminiert werden. Im Gegensatz dazu wird ein Stopp-Codon, das erforderlich ist, um die Translation zu beenden, im Allgemeinen in der DNA-Sequenz, die das Cterminale Polypeptid codiert, beibehalten. DNA, die für eine Signalsequenz codiert, wird bevorzugt aus anderen DNA-Sequenzen als jenen, die das N-terminale Polypeptid codieren, entfernt.
  • Eine DNA-Sequenz, die für einen erwünschten Peptid-Linker codiert, kann im gleichen Leserahmen zwischen den DNA-Sequenzen, die TNF-R codieren, eingefügt werden, indem irgendeine geeignete konventionelle Technik angewendet wird. Zum Beispiel kann ein chemisch synthetisiertes Oligonucleotid, das den Linker codiert und geeignete Restriktionsendonuclease-Schnittstellen enthält, zwischen die Sequenzen ligiert werden, die für TNF-R codieren. Alternativ dazu kann eine chemisch synthetisierte DNA-Sequenz eine Sequenz enthalten, die zum 3'-Terminus (ohne Stopp-Codon) von TNF-R komplementär ist, gefolgt von einer Linker-codierenden Sequenz, die von einer Sequenz gefolgt wird, die komplementär zum 5'-Terminus des anderen TNF-R ist. Dann wird gerichtete Oligonucleotid-Mutagenese ange wandt, um die Linker-codierende Sequenz in einen Vektor einzufügen, der eine direkte Fusion von TNF-R enthält. Eine weitere Technik bedient sich der Polymerase-Kettenreaktion, indem Primer angewandt werden, die zum Teil Einzelstrang-Segmente umfassen, die für einen Peptid-Linker codieren. PCR-generierte DNA-Fragmente, die für zwei unterschiedliche Proteine codieren, können durch Doppelstrangbildung der komplementären einzelsträngigen Linker-codierenden Segmente, die an einem Terminus jedes Fragments vorliegen, verbunden werden. Bevorzugte Verfahren zum Einfügen eines Linker-codierenden DNA-Segments zwischen zwei TNF-R- DNA-Sequenzen sind in Beispiel 7 unten beschrieben.
  • DNA-Sequenzen, die für TNF-R codieren, können mittels jedes geeigneten konventionellen Verfahrens für die Verwendung zur Konstruktion der Fusionsprotein-codierenden DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung isoliert werden. DNA-Sequenzen, die für Fusionsproteine codieren, die in einem Mikroorganismus exprimiert werden sollen, werden bevorzugt keine Introns enthalten, die die Transkription der DNA in mRNA frühzeitig beenden könnten. Jedoch kann vorzeitige Termination der Transkription erwünscht sein, zum Beispiel wo sie zu Mutanten führen würde, die vorteilhafte C-terminale Verkürzungen besitzen, zum Beispiel Deletion einer Transmembran-Region, um einen löslichen Rezeptor zu erhalten, der nicht an die Zellmembran gebunden ist. TNF-R-cDNA kann durch Verfahren isoliert werden, die jene umfassen, die in Beispiel 2 beschrieben sind.
  • Die codierende Sequenz von TNF-R kann man erhalten, indem eine Sequenz, die für TNF-R codiert, aus einer rekombinanten cDNA- oder einer genomischen DNA-Bank isoliert. Eine cDNA-Bank wird bevorzugt konstruiert, indem polyadenylierte mRNA aus einer bestimmten Zelllinie, die ein Säuger-TNF-R exprimiert, zum Beispiel der humanen Fibroblasten-Zelllinie WI-26 VA4 (ATCC CCL 95.1), entnommen wird und die mRNA als Matrize zum Synthetisieren doppelsträngiger cDNA verwendet wird. Die doppelsträngige cDNA wird dann in einen rekombinanten Vektor verpackt, welcher in eine Wirtszelle (z. B einen geeigneten E. ioli-Stamm) eingeführt wird und vermehrt wird. TNF-R-Sequenzen, die in der cDNA-Bank enthalten sind, können identifiziert werden, indem die Bank mit einer geeigneten Nucleinsäure-Sonde, welche in der Lage ist, mit humaner TNF-R cDNA zu hybridisieren, durchgemustert wird. Eine andere Clonierungstechnik, die verwendet werden kann, ist das direkte Expressionsverfahren, das in Beispiel 2 unten beschrieben ist. Alternativ dazu können DNAs, die für TNF-R-Proteine codieren, durch Ligation von synthetischen Oligonucleotid-Untereinheiten, die der gesamten oder einem Teil der Sequenz der 2A-2B entsprechen, zusammengefügt werden, um eine vollständige codierende Sequenz zu erstellen.
  • Zusätzliche cDNA-Clone können aus cDNA-Banken anderer Säuger-Arten durch überartliche Kreuzhybridisierung isoliert werden. Zur Verwendung in der Hybridisierung kann DNA, die für TNF-R codiert, kovalent mit einer detektierbaren Substanz wie einer fluoreszie renden Gruppe, einem radioaktiven Atom oder einer Chemiluminiszenzgruppe markiert werden, und zwar durch Verfahren, die dem Fachmann im betreffenden Feld wohl bekannt sind.
  • Wie die meisten Säugergene werden Säuger-TNF-Rezeptoren wahrscheinlich von Multi-Exon-Genen codiert. Alternative mRNA-Konstrukte, die unterschiedlichen mRNA-Spleiß-Vorgängen nach der Transkription zugeordnet werden können, und welche große Regionen der Ähnlichkeit oder Identität mit den hierin offenbarten cDNAs teilen, so dass dabei biologisch aktives TNF-R oder IL-1R codiert wird, werden als nützlich in der Herstellung der erfindungsgemäßen Fusionsproteine angesehen.
  • DNA, die für lösliche TNF-R-Polypeptide codiert, kann durch irgendeine einer ganzen Reihe konventioneller Techniken hergestellt werden. Ein DNA-Fragment, das ein gewünschtes lösliches Polypeptid codiert, kann in einen Expressionsvektor subkloniert werden. DNA-Fragmente können durch Restriktionsendonuclease-Verdau einer klonierten Volllängen-DNA-Sequenz hergestellt und durch Elektrophorese auf Agarose-Gelen isoliert werden. Alternativ dazu kann eine ewünschte DNA-Sequenz chemisch unter Verwendung bekannter Techniken synthetisiert werden. Linker, die (eine) Restriktionsendonuclease-Schnittstelle(n) enthalten, können verwendet werden, um das gewünschte DNA-Fragment in einen Expressionsvektor einzufügen, oder das Fragment kann an Schnittstellen verdaut werden, die darin natürlich vorkommen.
  • Die wohlbekannten Polymerase-Kettenreaktion(PCR)-Verfahren können auch verwendet werden, um eine DNA-Sequenz zu isolieren, die für ein gewünschtes lösliches Proteinfragment codiert. Diese Technik wird unten in den Beispielen erläutert.
  • In einem weiteren Ansatz kann enzymatische Behandlung (unter Verwendung der Bal 31-Exonuclease) dazu benutzt werden, terminale Nucleotide von einem DNA-Fragment zu deletieren, um ein Fragment zu erhalten, das einen bestimmten erwünschten Terminus besitzt. Unter den kommerziell erhältlichen Linkem sind jene, die an die glatten Enden, durch Bal 31-Verdau erzeugt, ligiert werden, und welche (eine) Restriktionsendonuclease-Schnittstelle(n) enthalten, bevorzugt. Alternativ dazu können Oligonucleotide, die den N- oder C-Terminus eines DNA-Fragments bis zu einem gewünschten Punkt rekonstruieren, synthetisiert werden. Die Oligonucleotide können eine Restriktionsendonuclease-Schnittstelle stromaufwärts der erwünschten codierenden Sequenz enthalten und ein Initiations-Codon (ATG) am N-Terminus der codierenden Sequenz platzieren.
  • Die TNF-R-DNA-Sequenzen können sich von jenen, die in SEQ m NO: 1 und 3 gezeigt sind, unterscheiden. Aufgrund der bekannten Degeneriertheit des genetischen Codes kann zum Beispiel eine erhebliche Variation bei Nucleotid-Sequenzen auftreten, die dieselbe Aminosäure-Sequenz codieren. DNA-Sequenzen, die in der Lage sind, mit den DNA-Sequenzen von SEQ ID NO: 1 und 3 unter moderat-stringenten Bedingungen (55°C, 5 X SSC) zu hybridisieren, und welche ein biologisch aktives TNF-R-Polypeptid codieren, werden ebenfalls im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung als TNF-R-codierende DNA-Sequenzen angesehen. Es können absichtlich Mutationen in die native DNA-Sequenzen eingefügt werden, um zum Beispiel die oben beschriebenen Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und – Insertionen hervorzubringen. Bestimmte Mutationen werden im End-Proteinprodukt nicht exprimiert werden. Zum Beispiel können Nucleotid-Substitutionen vorgenommen werden, um die Expression zu verstärken, vornehmlich, um Sekundärstrukturschleifen in der transkribierten mRNA zu vermeiden (siehe EP 75 444 , auf die hier expressis verbis Bezug genommen wird). Andere Änderungen der Nucleotid-Sequenz können vorgenommen werden, um damit Codons herzustellen, die vom ausgewählten Wirt einfacher translatiert werden, z. B die wohlbekannten E. coli-Vorzugscodons für E. coli-Expression. Stille Mutationen (Veränderungen in der DNA-Sequenz, die die codierte Aminosäure-Sequenz nicht ändern) können ebenfalls während der Polymerase-Kettenreaktion auftreten.
  • Mutationen in Nucleotid-Sequenzen sollten natürlich den Leserahmen der codierenden Sequenzen bewahren. Die Mutationen werden bevorzugt keine komplementären Regionen erzeugen, die unter Bildung sekundärer mRNA-Strukturen wie Schleifen oder Haarnadelschleifen hybridisieren, was die Translation der Fusionsprotein-mRNA ungünstig beeinflussen würde.
  • Die vorliegende Erfindung stellt daher erfinderische DNA-Sequenzen zur Verfügung, die die oben beschriebenen Fusionsproteine codieren, wobei jede TNF-R- DNA-Sequenz in der Fusionsprotein- DNA-Sequenz ausgewählt ist aus: (a) DNA-Sequenzen, die von der codierenden Region eines nativen Säuger-TNF-R-Gens abgeleitet sind (z. B cDNA abgeleitet von den codierenden Regionen von SEQ 11 NO: 1 oder 3); (b) DNA-Sequenzen, die zur Hybridisierung mit einer DNA-Sequenz von (a) unter moderat-stringenten Bedingungen (50°C, 2× SSC) befähig sind und welche biologisch aktiven TNF-R codieren und (c) DNA-Sequenzen, welche aufgrund des genetischen Codes gegenüber den DNA-Sequenzen, die in (a) oder (b) definiert sind, degeneriert sind, und welche biologisch aktiven TNF-R codieren.
  • Expression von rekombinanten Fusionsproteinen
  • Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Expressionsvektoren zur Verfügung, um DNA, die die erfindungsgemäßen Fusionsproteine codiert, zu exprimieren. Die erfinderischen rekombinanten Expressionsvektoren sind replizierbare DNA-Konstrukte, die eine synthetische oder cDNA-abgeleitete DNA-Sequenz enthalten, die eines der oben beschriebenen Fusionsproteine codiert, und zwar funktionell mit geeigneten Transkriptions- oder Translations-Regulationselementen verknüpft. Beispiele von genetischen Elementen, die eine regulatorische Rolle in der Genexpression besitzen, umfassen transkriptionelle Promotoren, Operatoren oder Enhancer, eine Sequenz, die geeignete ribosomale mRNA-Bindestellen codiert und geeignete Transkriptions- und Translations-Initiations- und -Terminations-Sequenzen. Die Fähigkeit, in einem Wirt zu replizieren, die für gewöhnlich von einem Replikationsursprung vermittelt wird, und ein Selektionsgen, um Erkennung von Transformanden zu erleichtern, kann zusätzlich eingebaut werden. Die regulatorischen Elemente, die in den Expressionsvektoren verwendet werden, sind üblicherweise von Säuger-, mikrobiellen, viralen oder Insekten-Genen abgeleitet. Es können auch Expressionsvektoren verwendet werden, die von Retroviren abgeleitet sind.
  • DNA-Regionen sind funktionell verknüpft, wenn sie in funktioneller Beziehung zueinander stehen. Von einer DNA-Sequenz, die für ein Fusionsprotein codiert, sagt man, dass sie funktionell mit einer oder mehreren der oben beschriebenen regulatorischen Elemente verknüpft ist, wenn die DNA-Sequenz des Fusionsproteins transkribiert wird oder die daraus hervorgehende mRNA translatiert wird, und zwar unter der Kontrolle der/des regulatorischen Elemente(s).
  • Transformierte Wirtszellen sind Zellen, die mit fremder DNA unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken transformiert oder transfiziert wurden. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung umfasst die fremde DNA eine Sequenz, die für das erfinderische Fusionsprotein codiert. Wirtszellen können für Zwecke der Clonierung oder der Vermehrung der fremden DNA transformiert werden, oder sie können mit einem Expressionsvektor zur Herstellung des Fusionsproteins unter der Kontrolle von geeigneten Promotoren transformiert werden. Geeignete Wirtszellen umfassen Prokaryonten, Hefe oder höhere eukaryontische Zellen. Geeignete Clonierungs- und Expressions-Vektoren zur Verwendung mit bakteriellen, Pilz-, Hefe- und Säugerzell-Wirten wurden von Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985) beschrieben. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls verwendet werden, um Fusionsprotein zu produzieren, indem RNAs verwendet werden, die von den erfindungsgemäßen DNA-Konstrukten abgeleitet sind.
  • Prokaryonten umfassen Gram-negative oder Gram-positive Organismen. Prokaryontische Expressionsvektoren umfassen im Allgemeinen einen oder mehrere phänotypischselektierbare Marker, zum Beispiel ein Gen, das für Proteine codiert, die Antibiotikaresistenz übertragen, oder einem autotrophen Bedürfnis nachkommen, und einen Replikationsursprung, der vom Wirt erkannt wird, um die Vermehrung innerhalb des Wirts zu sichern. Beispiele geeigneter prokaryontischer Wirte für die Transformation umfassen E. coli, Bazillen wie Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Arten innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, obwohl andere ebenfalls verwendet werden können.
  • Nützliche Expressionsvektoren zur bakteriellen Verwendung können einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung umfassen, abgeleitet von kommerziell erhältlichen Plasmiden, die genetische Elemente des wohlbekannten Clonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) umfassen. Solche kommerziellen Vektoren schließen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEMI (Promega Biotec, Madison, WI, USA) mit ein. Diese pBR322-„Rückgrat"-Abschnitte werden mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden Struktursequenz kombiniert. E. coli wird typischerweise unter Verwendung von pBR322-Derivaten transformiert, einem Plasmid, das von einer E. coli-Art abgeleitet ist (Bolivar et al., Gene 2: 95, 1977). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und bietet daher einfache Verfahren zur Identifizierung transformierter Zellen.
  • Promotoren, die allgemein in rekombinanten mikrobiellen Expressionsvektoren verwendet werden, umfassen das b-Lactamase-(Penicillinase) und Lactose-Promotorsystem (Chang et al., Nature 275: 615, 1978; und Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), das Tryptophan(trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; und EPA 36 776) und den tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborary, S. 412, 1982). Ein besonders nützliches bakterielles Expressionssystem bedient sich des Promotors Phagen λ PL und des wärmeinduzierbaren cI857ts-Repressors. Plasmidvektoren, die von der American Type Culture Collection erhältlich sind, welche Derivate des λ PL-Promotors enthalten, umfassen das Plasmid pHUB2, enthalten im E. coli-Stamm JMB9 (ATCC 37092), und das Plasmid pPLc28, enthalten in E. coli RR1 (ATCC 53082).
  • Das rekombinante Fusionsprotein kann auch in Hefewirten, bevorzugt von Saccharomyces-Arten, wie beispielsweise S. cerevisiae, exprimiert werden. Hefe von anderen Gattungen wie Pichia oder Kluyveromyces können ebenfalls verwendet werden. Hefevektoren werden im Allgemeinen einen Replikationsursprung des 2μm-Hefeplasmids oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS), einen Promotor, DNA, die das Fusionsprotein codiert, Sequenzen zur Polyadenylierung und Transkriptionstermination und ein Selektionsgen enthalten. Bevorzugt werden Hefevektoren einen Replikationsursprung und selektierbare Marker, die die Transformation von sowohl Hefe als auch E. coli erlauben, z. B das Ampicillin-Resistenzgen von E. coli und das S. cerevisiae trpl-Gen, welches einen Selektionsmarker für einen mutierten Stamm von Hefe, dem die Fähigkeit fehlt, auf Tryptophan zu wachsen, bietet, und einen Promotor, der von einem stark exprimierten Hefegen abgeleitet ist, um die Transkription einer stromabwärts gelegenen Struktursequenz zu induzieren, umfassen. Die Anwesenheit des trp1-Fehlers im Hefe-Wirtszell-Genom stellt dann eine effektive Umgebung zur Detektion der Transformation zur Verfügung, nämlich durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan.
  • Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren umfassen die Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphpglyceratekinase (Hitzeman et al., J Biol. Chem. 255: 2073, 1980) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 168; und Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978), wie Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phopsphat-isomerase, 3-Phosphoglycerat-mutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in der Hefeexpression sind weiter bei R. Hitzeman et al., EPA 73 657 beschrieben.
  • Bevorzugte Hefevektoren können assembliert werden, indem DNA-Sequenzen von pBR322 zur Selektion und Replikation in E. coli (Ampr-Gen und Replikationsursprung) und Hefe-DNA-Sequenzen einschließlich eines Glucose-reprimierbaren ADH2-Promotors und einer α-Faktor-Sekretions-Leitsequenz, verwendet werden. Der ADH2-Promotor wurde von Russel et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) und Beier et al., (Nature 300: 724, 1982) beschrieben. Vorteilhafterweise ist ein DNA-Segment, das für eine in Hefe funktionelle Leitsequenz codiert, mit dem 5'-Ende der DNA, die das Fusionsprotein codiert, funktionell verbunden. Das codierte Leitpeptid fördert die Sekretion des Fusionsproteins aus der Wirtszelle und wird im Allgemeinen bei der Sekretion vom Fusionsprotein abgeschnitten. Um ein Beispiel zu nennen, die Hefe-α-Faktor-Leitsequenz, welche die Sekretion von heterologen Proteinen regelt, kann zwischen dem Promotor und dem zu exprimierenden Strukturgen eingefügt werden. Siehe z. B Kurjan et al., Cell 30: 922, 1982; und Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984. Die Leitsequenz kann modifiziert werden, so dass sie in der Nähe ihres 3'-Endes eine oder mehrere nützliche Restriktionsstellen enthält, um die Fusion der Leitsequenz mit fremden Genen zu erleichtern.
  • Geeignete Hefe-Transformationsprotokolle sind dem Fachmann bekannt. Beispielhaft ist eine Technik von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, (1978) beschrieben, die auf Trp+-Transformanden in einem selektiven Medium bestehend aus 0.67% „yeast nitrogen Base", 0.5% Casaminosäuren, 2% Glucose, 10μg/l Adenin und 20 μg/l Uracil besteht, selektiert. Wirtsstämme, die mit Vektoren transformiert sind, die den oben beschriebenen ADH2-Promotor umfassen, können zur Expression in einem reichhaltigen Medium bestehend aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 1% Glucose, supplementiert mit 80 μg/l Adenin und 80 μg/l Uracil, gezogen werden. Die Derepression des ADH2-Promotors geschieht nach dem Verbrauch der Glucose im Medium. Die rohen Hefeüberstände werden durch Filtration geerntet und vor der weiteren Aufreinigung bei 4°C gehalten.
  • Es können verschiedene Säuger- oder Insektenzell-Kultursysteme verwendet werden, um rekombinantes Protein zu exprimieren. Baculovirus-Systeme zur Produktion heterologer Proteine in Insektenzellen werden von Luckow und Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988) im Überblick dargestellt. Es können etablierte Zelllinien von Säugern verwendet werden. Beispiele geeigneter Säuger-Wirtszelllinien schließen die COS-7-Zelllinien von Affen-Nierenzellen, beschrieben von Gluzman (Cell 23: 175, 1981), L-Zellen, C 127-, 3T3-, Chinahamster-Ovarien (CHO), HeLa- und BHK-Zelllinien ein. Säuger-Expressionsvektoren können nicht-transkribiere Elemente umfassen, wie beispielsweise einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Enhancer, verbunden mit dem zu exprimierenden Gen, und andere 5'- oder 3'-flankierende nicht-transkribierte Sequenzen, und 5'- oder 3'-nicht translatierte Sequenzen, wie notwendige Ribosom-Bindestellen, eine Poly-Adenylierungsstelle, Spleißdonor- und -Acceptor-Stellen und transkriptionelle Terminationssequenzen,umfassen.
  • Die transkpritionellen und translationalen Kontrollsequenzen in Expressionsvektoren, die für die Transformation von Wirbeltierzellen zu verwenden sind, können von viralen Quellen gestellt werden. Zum Beispiel sind allgemein verwendete Promotoren und Enhancer von Polyoma, Adenovirus 2, Simian Virus 40 (SV40) und humanem Cytomegalovirus abgeleitet. DNA-Sequenzen, die vom viralen SV40-Genom abgeleitet sind, z. B der SV40-Origin, der „early" und „late" Promotor, der Enhancer, Spleiß- und Polyadenylierungsstellen, können verwendet werden, um die anderen zur Expression heterologer DNA-Sequenz erforderlichen genetischen Elemente zur Verfügung zu stellen. Die „early" und „late" Promotoren sind besonders nützlich, da beide von dem Virus als ein Fragment erhältlich sind, das auch den viralen SV40-Replikationsursprung enthält (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978). Kleine oder große SV40-Fragmente können auch verwendet werden, vorausgesetzt dass die ungefähr 250 bp-Sequenz, die sich von der Hind III-Stelle bis zur BglI-Stelle, die im viralen Replikationsursprung liegt, erstreckt, miteingeschlossen ist. Beispielsweise können Vektoren konstruiert werden wie von Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983) offenbart. Ein nützliches System für stabile Expression auf einem hohen Niveau von Säuger-Rezeptor-cDNAs in Maus-Milchdrüsenepithelzellen C127 kann im Wesentlichen so konstruiert werden, wie von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986) beschrieben.
  • Herstellung und Reinigung des Fusionsproteins
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung zur Verfügung, das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert wurde, der eine DNA-Sequenz umfasst, die das Fusionsprotein codiert, und zwar unter Bedingungen, die die Expression des Fusionsproteins begünstigen, welches dann aus dem Kulturmedium oder Zellextrakten gereinigt wird, umfasst. Es kann jeder geeignete Reinigungsprozess verwendet werden, wobei das Verfahren der Wahl entsprechend solcher Faktoren wie des Wirtszelltyps, und davon, ob das gewünschte Protein aus den Wirtszellen sezerniert wird oder nicht, variiert. Das Fusionsprotein wird in das Kulturmedium sezerniert werden, wenn es ursprünglich mit einer in den Wirtszellen funktionellen Signalsequenz oder mit einem Leitpeptid fusioniert ist, oder wenn das Protein lösliche Formen der TNF-R-Polypeptide umfasst.
  • Zum Beispiel können Überstände von Expressionssystemen, welche rekombinantes Protein in das Kulturmedium sezernieren, zunächst unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters, beispielsweise einer Amicon- oder Millipore Pellicon-Ultrafiltrationseinheit, aufkonzentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf eine geeignete Reinigungsmatrix aufgetragen werden. Eine geeignete Affini tätsmatrix kann zum Beispiel TNF umfassen. Eine Affinitätsmatrix kann hergestellt werden, indem rekombinantes humanes TNF an Bromcyan-aktivierte Sepharose (Pharmacia) oder Hydrazid-Affigel (Biorad), entsprechend den Empfehlungen der Hersteller, gebunden wird. Ein bevorzugtes Reinigungsverfahren umfasst die Immunreinigung unter Verwendung von Antikörpern, die an ein geeignetes Trägermaterial gebunden sind. Es werden Proteine gewonnen, die an einen Antikörper binden, der spezifisch für TNF-R ist. Proteine, die mit Antikörpern, die spezifisch für TNF-R sind, immunreaktiv sind, können daher identifiziert und isoliert werden. Alternativ dazu kann ein Anionenaustauscher-Harz verwendet werden, zum Beispiel eine Matrix oder ein Substrat mit anhängenden Diethylaminoethyl(DEAE)-Gruppen. Die Matrices können aus Acrylamid, Agarose, Dextran, Cellulose oder aus anderen Typen sein, die für gewöhnlich in der Proteinreinigung verwendet werden. Alternativ dazu kann ein Kationenaustauscher-Schritt verwendet werden. Geeignete Kationenaustauscher schließen verschiedene unlösliche Matrices mit ein, einschließlich Sulfopropyl- oder Carboxymethyl-Gruppen. Sulfopropyl-Gruppen sind bevorzugt. Es können auch ein oder mehrere Schritte) mit Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC), unter Anwendung hydrophober RP-HPLC-Medien, z. B Silicagel mit anhängenden Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen, verwendet werden, um eine Fusionsprotein-Zusammensetzung weiter aufzureinigen.
  • Rekombinantes Protein, das in einer bakteriellen Kultur hergestellt wird, wird üblicherweise durch die anfängliche Extraktion aus Zellpellets isoliert, gefolgt von einem oder mehreren Schritten) der Konzentrierung, des Aussalzens, wässriger Ionenaustausch- oder Größenausschluss-Chromatographie. Schließlich kann Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) für finale Aufreinigungsschritte verwendet werden. Mikrobielle Zellen, die bei der Expression von rekombinanten Fusionsproteinen verwendet werden, können durch jede übliche Methode aufgebrochen werden, einschließlich Frieren und Auftauen, Sonifikation, mechanisches Aufbrechen, oder die Verwendung von Zell-lysierenden Agentien.
  • Die Fermentation von Hefe, welche Fusionsproteine als sezerniertes Protein exprimiert, vereinfacht die Aufreinigung sehr. Sezerniertes rekombinantes Protein, das aus einer Fermentation im Großmaßstab hervorgeht, kann mittels Verfahren analog zu jenen, die von Urdal et al. (J. Chromatog. 296: 171, 1984) offenbart wurden, aufgereinigt werden; es schließt zwei aufeinanderfolgende Umkehrphasen-HPLC-Schritte zur Aufreinigung eines rekombinanten Proteins auf einer präparativen HPLC-Säule ein.
  • Einige oder alle der vorstehenden Aufreinigungsschritte können in verschiedenen Kombinationen verwendet werden, um ein im Wesentlichen homogenes rekombinantes Protein bereitzustellen. Rekombinante Zellkultur ermöglicht die Herstellung des Fusionsproteins, und zwar frei von jenen kontaminierenden Proteinen, welche normalerweise mit TNF-R verbunden sind, wie sie in der Natur in ihren jeweiligen Herkunftsarten vorkommen, z. B in Zellen, Zellexsudaten oder Körperflüssigkeiten. Die vorstehenden Reinigungsverfahren gehören zu denen, die ebenso angewendet werden können, um erfindungsgemäße nicht-rekombinante Rezeptoren zu reinigen.
  • Als eine Alternative zur Produktion der erfinderischen Rezeptoren als Fusionsproteine können die TNF-R-Proteine getrennt hergestellt und gereinigt werden, und anschließend miteinander verbunden werden. Es sind zahlreiche Reagentien, die nützlich für die Verbindung eines Proteinmoleküls mit einem anderen sind, bekannt. Es sind heterobifunktionelle und homobifunktionelle Linker für diesen Zweck erhältlich, zum Beispiel von Pierce Chemical Company, Rockford, Dlinois. Solche Linker enthalten zwei funktionelle Gruppen (z. B Ester und/oder Maleimide), die mit bestimmten funktionellen Gruppen an Aminosäureseitenketten (z. B Aminen an Lysinresten und Sulfhydrylen, die durch Reduktion von Cysteinresten erzeugt wurden) reagieren, und somit ein Polypeptid mit einem anderen verbinden. Beispiele solcher querverbindender Reagentien sind N-Maleimidobenzoylsuccinimidylester und N-Hydroxysuccinimid. Reagens und Reaktionsbedingungen sollten so ausgewählt werden, dass die Querverknüpfung die Bindung von TNF an den Rezeptor nicht beeinträchtigt. Die TNF-R-Polypeptide sind bevorzugt über einen der oben beschriebenen Peptidlinker verbunden, der als Abstandshalter fungiert. Ein Peptidlinker kann mittels irgendeines der konventionellen Verfahren, die verwendet werden, um ein Polypeptid mit einem anderen zu verbinden, mit TNF-R verbunden werden. Die querverbindenden Reagentien, die von Pierce Chemical Company wie oben beschrieben erhältlich sind, gehören zu denen, die verwendet werden können. Aminosäuren, die Seitenketten besitzen, die mit solchen Reagentien reaktiv sind, können in den Peptidlinker einbezogen werden, z. B an dessen Enden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Die vorliegende Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung, die irgendeines der oben beschriebenen Fusionsproteine und einen physiologisch annehmbaren Trägerstoff, ein Verdünnungsmittel oder Exzipiens umfassen. Solche Trägerstoffe, Exzipientien und Verdünnungsmittel werden für die Empfänger bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht-toxisch sein. Solche Zusammensetzungen können Puffer, Antioxidantien wie Ascorbinsäure, Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als ungefähr 10 Reste), Proteine, Aminosäuren, Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Saccharose oder Dextrine, Chelatoren wie EDTA, Glutathion und andere Stabilisatoren und Exzipientien umfassen. Neutral-gepufferte Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung gemischt mit konspezifischem Serumalbumin sind beispielhafte geeignete Verdünnungsmittel. Bevorzugt wird die Zusammensetzung als Lyophilisat unter Verwendung von geeigneten Exzipienslösungen (z. B Saccharose) als Verdünnungsmittel formuliert. Geeignete Dosierungen können in klinischen Untersuchungen bestimmt werden. Die Menge und Häufigkeit der Verabreichung wird natürlich von solchen Faktoren wie der Natur und Schwere der zu behandelnden Indikation, der erwünschten Reaktion, dem Zustand des Patienten, usw., abhängen.
  • Krankheitszustände, die von TNF ausgelöst werden, können durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten, der von einer solchen Krankheit betroffen ist, behandelt werden. Es wird von einer Krankheit gesagt, dass sie von TNF verursacht wird, wenn TNF (direkt oder indirekt) die Krankheit verursacht oder verschlimmert. Lösliche Rezeptorproteine können verwendet werden, um TNF kompetitiv zu binden und dabei die Bindung von TNR an Zelloberflächenrezeptoren zu inhibieren.
  • Zur therapeutischen Verwendung werden erfindungsgemäße gereinigte Fusionsproteine einem Patienten, bevorzugt einem Menschen, zur Behandlung in einer Weise, die für die Indikation geeignet ist, verabreicht. Daher können die pharmazeutischen Zusammensetzungen zum Beispiel durch Bolus-Injektion, kontinuierliche Infusion, andauernde Freisetzung aus Implantaten oder andere geeignete Techniken verabreicht werden.
  • Das Fusionsprotein, das in den pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet wird, sollte gereinigt sein, so dass das Fusionsprotein im Wesentlichen frei von anderen Proteinen natürlicher oder endogener Herkunft ist und weniger als ungefähr 1 Gew.-% Proteinmasse Kontaminanten-Rückstand von Produktionsprozessen enthält. Solche Zusammensetzungen können jedoch andere Proteine enthalten, die als Stabilisatoren, Trägerstoffe, Exzipientien oder Kotherapeutika hinzugefügt wurden. Das Fusionsprotein ist im Wesentlichen zur Homogenität gereinigt, wenn es mittels Silberfärbung in einem Polyacrylamidgel als einzelne Proteinbande detektierbar ist.
  • Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine können verabreicht werden, um Krankheitszustände zu behandeln, von denen man glaubt, dass sie zumindest zum Teil von TNF ausgelöst werden, wie Cachexia, rheumatoide Arthritis, Diabetes, Multiple Sklerose, Lungenfibrose und Silicosis, cerebrale Malaria und Allo- und Xenotransplantat-Abstoßung bei Transplantat-Wirt-Reaktionen. TNF wurde auch mit Sepsis und septischem Schock in Verbindung gebracht. Bakterielles Endotoxin kann Sepsis bei Säugern, die mit bestimmten Typen von Bakterien infiziert sind, hervorrufen, und man glaubt, dass es Makrophagen zur Herstellung von Faktoren, die TNF mit einschließen, stimuliert. Folks et al. (PNAS USA 86: 2365, 1989) vermutet, dass TNF-α eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der HN-Infektion spielt. TNF-α induzierte die Expression von HIV in einer Zelllinie, die als Modell der HIV-Latenz verwendet wird, um die Umwandlung von einer latenten zu einer produktiven Infektion zu studieren.
  • Bestimte Zytokine (IL-1, IL-2 und andere koloniestimulierende Faktoren) können eine signifikante TNF-Produktion des Wirtes induzieren. Fusionsproteine der Formel TNF-R-Linker-TNF-R können daher verwendet werden, um Nebenwirkungen, die mit einer Zytokintherapie einhergehen, zu behandeln.
  • Die Verwendung von löslichen Formen von TNF-R in den erfinderischen Fusionsproteinen ist für bestimmte Anwendungen vorteilhaft. Die Reinigung der Proteine aus rekombinanten Wirtszellen ist vereinfacht, da die löslichen Proteine aus den Zellen sezerniert werden. Darüber hinaus sind lösliche Proteine im Allgemeinen für die intravenöse Verabreichung geeigneter und können ihre therapeutische Wirkung (Bindung von TNF) im Blutstrom entfalten. Durch die Bindung von TNF werden die löslichen Fusionsproteine die Signaltransduktion über endogene Zelloberflächenrezeptoren für TNF inhibieren.
  • Die erfinderischen Fusionsproteine können auch als Reagentien in Rezeptor-basierten Immunoassays, als Reagentien in Assays für TNF oder als Bindungsmittel für die Affinitätsreinigung von TNF verwendet werden.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Eingrenzung gegeben.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • TNF-Bindungsassays
    • A. Radioaktive Markierung von TNFα und TNFβ. Rekombinantes humanes TNFα in Form eines Fusionsproteins, das ein hydrophiles Octapeptid am N-Terminus enthielt, wurde in Hefe als sezerniertes Protein exprimiert und durch Affinitätschromatographie (Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988) gereinigt. Gereinigtes rekombinantes humanes TNFβ wurde von R&D Systems (Minneapolis, MN) bezogen. Beide Proteine wurden unter Verwendung des kommerziell erhältlichen Festphasenagens, IODO-GEN (Pierce), radioaktiv markiert. Bei diesem Verfahren wurden 5 μg IODO-GEN auf dem Boden eines 10 × 75 mm Glasröhrchens ausplattiert und für 20 Minuten bei 4°C mit 75 μl 0.1 M Natriumphosphat, pH 7.4, und 20 μl (2 mCi) Na125I inkubiert. Diese Lösung wurde dann in ein zweites Glasröhrchen überführt, das 5 μg TNFα (oder TNFβ) in 45 μl PBS enthielt, und zwar für 20 Minuten bei 4°C. Das Reaktionsgemisch wurde mittels Gelfiltration fraktioniert, und zwar über 2 ml Säulenvolumen Sephadex G-25 (Sigma), equilibriert in RPMI („Roswell Park Memorial Institute") 1640-Medium, das 2.5% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin (BSA), 0.2% (Gew./Vol.) Natriumazid und 20 mM Hepes pH 7.4 (Bindungsmedium). Die Endmenge von 125I-TNF wurde zu einer Arbeitsvorratslösung mit 1 × 10–7 M in Bindungsmedium verdünnt und bis zu einem Monat bei 4°C ohne detektierbaren Verlust an Rezeptorbindungsaktivität gelagert. Die spezifische Aktivität ist routinemäßig 1 × 106 cpm/mmol TNF.
    • B. Bindung an intakte Zellen. Bindungsassays mit intakten Zellen wurden mittels zwei Verfahren durchgeführt. Bei dem ersten Verfahren wurden die Zellen zunächst entweder in Suspension (z. B U937) oder adhärent auf Gewebekulturplatten (z. B WI26-VA4- oder COS-Zellen, die den rekombinanten TNF-Rezeptor exprimierten) gezogen. Adhärente Zellen wurden anschließend durch Behandlung mit 5 mM EDTA über 10 Minuten bei 37°C abgelöst. Bindungsassays wurden dann mit dem Phthalat-Öl-Trennverfahren durchgeführt (Dower et al., J. Immunol. 132: 751, 1984), wie im Wesentlichen von Park et al. (J. Biol. Chem. 261: 4177, 1986) beschrieben. Nicht-spezifische Bindung von 125I-TNF wurde in Anwesenheit von einem 200-fachen oder größeren molaren Überschuss unmarkiertem TNF gemessen. Natriumazid (0.2%) war in einem Bindungsassay enthalten, um die Aufnahme von 125I-TNF durch Zellen zu inhibieren. Im zweiten Verfahren wurden COS-Zellen, die mit dem TNF-Renthaltenden Plasmid transfiziert waren und TNF-Rezeptoren auf der Oberfläche exprimierten, auf die Fähigkeit getestet, 125I-TNF zu binden, und zwar mittels des Platten-Bindungsassay, der von Sims et al. (Science 241: 585, 1988) beschrieben wurde.
    • C. Festphasen-Bindungsassays. Die Fähigkeit von TNF-R, aus Detergens-Extrakten von humanen Zellen stabil an Nitrocellulose adsorbiert zu werden und dabei noch die TNF-Bindungsaktivität zu behalten, bot eine Möglichkeit, TNF-R zu detektieren. Zellextrakte wurden hergestellt, indem ein Zellpellet mit einem 2-fachen Volumen PBS, die 1% Triton X-100 und einen Cocktail von Proteaseinhibitoren (2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 μM Pepstatin, 10 μM Leupeptid, 2 mM o-Phenanthrolin und 2 mM EGTA) enthielt, durch heftiges Vortexen vermischt wurde. Das Gemisch wurde 30 Minuten auf Eis inkubiert, wonach es bei 12 000 × g bei 8°C für 15 Minuten zentrifugiert wurde, um Zellkerne und andere Debris zu entfernen. Zwei-Mikroliter-Aliquots der Zellextrakte wurden auf trockene BA85/21-Nitrocellulosemembranen (Schleicher und Schüll, Keene, NH) aufgebracht und man ließ sie trocknen. Die Membranen wurden für 30 Minuten in Gewebekulturplatten in Tris (0.05 M)gepufferter Kochsalzlösung (0.15 M) pH 7.5, die 3% Gew./Vol. BSA enthielt, inkubiert, um nicht-spezifische Bindungsstellen zu blockieren. Die Membran wurde dann mit 5 x 10"" M 125I-TNF in PBS + 3% BSA bedeckt und unter Schütteln für 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Am Ende dieser Zeitspanne wurden die Membranen dreimal in PBS gewaschen , getrocknet und für 18 std. bei –70°C auf einem X-Omat-AR-Film von Kodak platziert.
    • D. Signaltransduktionsassays. Die Inhibierung einer TNF-Signaltransduktionsaktivität kann bestimmt werden, indem Zellen mit rekombinanten TNF-R-DNAs, die für Membrangebundenes TNF-R codieren, transfiziert werden, um eine Expression von rekombinantem Rezeptor auf der Zelloberfläche zu erhalten. Die Zellen werden dann mit TNF in Kontakt gebracht und die daraus resultierenden Stoffwechselwirkungen werden untersucht. Wenn eine Wirkung resultiert, die der Wirkung des Liganden zugeordnet werden kann und nicht endogenen TNF-Rezeptoren auf den Zellen zugeordnet werden kann, dann besitzt der rekombinante Rezeptor eine Signaltransduktionsaktivität. Beispielhafte Verfahren zur Bestimmung, ob ein Polypeptid eine Signaltransduktionsaktivität besitzt, wurden offenbart von Idzerda et al., J. Exp. Med. 171: 861 (1990); Curtis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3045 (1989); Prywes et al., EMBO J. 5: 2179 (1986) und Chou et al., J. Biol. Chem. 262: 1842 (1987). Die Fähigkeit eines löslichen TNF-R-Polypeptids, kompetitiv Signaltransduktion zu inhibieren, kann unter Verwendung ähnlicher Verfahren bestimmt werden. Primäre Zellen oder Zelllinien, welche einen endogenen TNF-Rezeptor exprimieren und eine detektierbare biologische Reaktion auf TNF zeigen, können als Alternative zu den Zellen verwendet werden, die rekombinantes Membran-gebundenes TNF-R exprimieren. Eine verringerte Signaltransduktion deutet, wenn dem Assay ein lösliches TNF-R-Polypeptid zugegeben wird, auf die Bindung von TNF durch den löslichen TNF-R hin, so dass weniger TNF zur Initiierung der Signaltransduktion an die Zelloberflächen-TNF-Rezeptoren bindet.
  • Vergleichsbeispiel 1
  • 1L-1-Bindungsassays
    • A. Radioaktive Markierung von rIL-1β. Rekombinantes humanes lL-1β wurde durch Expression in E. coli und Reinigung bis zur Homogenität hergestellt, und zwar wie beschrieben von Kronheim et al. (BiolTechnology 4: 1078, 1986). Das IL-1β wurde mit Di-iodo (125I)-Bolton-Hunter-Reagens (New England Nuclear, Glenolden, PA) markiert. Zehn Mikrogramm (0,57 nmol) Protein in 10 μl Phosphat (0,015 mol/l-gepufferter Kochsalzlösung (PBS; 0,15 mol/l), pH 7.2, wurden mit 10 μl Natriumborat (0.1 mol/l)-gepufferter Kochsalzlösung (0,15 mol/l), pH 8.5, gemischt und entsprechend den Anweisungen des Herstellers für 12 Stunden bei 8°C mit 1 mCi (0,23 nmol) Bolton-Hunter-Reagens zur Reaktion gebracht. Anschließend wurden 30 μl 2% Gelatine und 5 μl 1 mol/l Glycinethylester hinzufügt und das Protein wurde auf einem 1 ml Säulenvolumen BiogelTM-P6-Säule (BioRad Laboratories, Richmond, CA) von nicht-reagiertem Bolton-Hunter-Reagens abgetrennt. Routinemäßig wurden 50% bis 60% Aufnahme des Markierungsmittels beobachtet. Die Radioiodierung führte zu spezifischen Aktivitäten im Bereich von 1 × 1015 bis 5 × 1015 cpm/mmol-l (0.4 bis 2 Atome I pro Proteinmolekül), und die Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS/PAGE) zeigte ein einzelnes markiertes Polypeptid von 17.5 kD, in Übereinstimmung mit zuvor berichteten Werten für IL-1. Das markierte Protein war zu mehr als 98% mit TCA präzipitierbar, was darauf hindeutet, dass das 125I kovalent an das Protein gebunden war.
    • B. Inhibierungs-Bindungsassays für Membran-gebundenen IL-1R. „lL-1" bezieht sich kollektiv auf IL-1α und IL-1β. Die Bindungsinhibierungskonstante eines IL-1R-Proteins kann durch Inhibierungs-Bindungsassays bestimmt werden, bei denen verschiedene Konzentrationen eines Kompetitors (IL-1β oder IL-1α) mit einer konstanten Menge radioaktiv markierten IL-1β oder IL-1α und mit Zellen, die den IL-1R exprimieren, inkubiert werden. Der nichtradioaktiv-markierte Kompetitor bindet an den Rezeptor und verhindert die Bindung des radioaktiv markierten Ligandens an den Rezeptor. Bindungsassays wurden mittels des Phthalat-Öl-Trennverfahrens durchgeführt, wie es im Wesentlichen von Dower et al., J. Immunol. 132: 751, 1984 und Park et al., J. Biol. Chem. 261: 4177, 1986, beschrieben wurde. Kurz, Wirtszellen, die einen Membran-gebundenen rekombinanten IL-1R exprimieren, wurden in Platten mit sechs Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA) für 2 Stunden bei 4°C mit 125I-IL- 1β in 1 ml Bindungsmedium (RPMI („Roswell Park Memorial Institute") 1640-Medium in Kombination mit 2% BSA, 20 mM Hepes-Puffer und 0.1% Natriumazid, pH 7.2) inkubiert. Natriumazid wurde zugegeben, um die Aufnahme und den Abbau von 125I-IL-1 durch Zellen bei 37°C zu inhibieren. Die Platten wurden für 1 Stunde bei 37°C auf einem Drehschüttler inkubiert. Doppelte Aliquots des Inkubationsgemisches wurden dann in Polyethylen-Zentrifugenröhrchen transferiert, die ein Phthalat-Öl-Gemisch, umfassend 1.5 Teile Dibutylphthalat zu 1 Teil Biss-ethylhexyl)phthalat, enthielten. Es wurden außerdem Kontrollröhrchen, die einen hundertfachen molaren Überschuss an unmarkiertem 1L-1β enthielten, mitaufgenommen, um nicht-spezifische Bindung zu bestimmen. Die Zellen mit gebundenem 125I-IL-1 wurden von nicht-gebundenem 125I-IL-1 durch 5-minütige Zentrifugation bei 15 000x g in einer Eppendorf-Mikrofuge abgetrennt. Dann wurde die Radioaktivität, die mit den Zellen verbunden war, auf einem Gamma-Counter bestimmt.
    • C. Inhibierungs-Bindungsassay für löslichen IL-1R. Die Bindungs-Inhibitionskonstante eines löslichen humanen IL-1R kann durch einen Bindungsinhibitions-assay untersucht werden, in welchem unterschiedliche Konzentrationen eines IL-1β-Kompetitors mit einer konstanten Menge radioaktiv markierten I-IL-1β und CB23-Zellen (eine Epstein-Barr-Virustransformierte Nabelschnurblut-B-Lymphozyten-Zeltlinie), die den Typ II IL-1R exprimieren, inkubiert werden. Eine Zelllinie, die endogene Typ I-IL-1-Rezeptoren exprimiert, kann die CB23-Zellen in Assays, die löslichen Typen I-IL-1R miteinbeziehen, ersetzen. Bindungsassays wurden mittels der Phthalat-Öl-Trennmethode durchgeführt, wie sie im Wesentlichen von Dower et al., J. Immunol. 132: 751, 1984 und Park et al., J. Biol. Chem. 261: 4177, 1986, beschrieben wurde. Kurz, CVI-EBNA-(Säuger-)Zellen wurden mit dem Expressionsvektor pDC406, der eine cDNA enthielt, die für einen löslichen humanen Typ II IL-1R, wie in Beispiel 10 beschrieben, codiert, transfiziert. Überstände der Zellen wurden 3 Tage nach der Transfektion abgenommen und seriell in Bindungsmedium (RPMI („Roswell Park Memorial Institute") 1640-Medium, das 2% BSA, 20 mM Hepes-Puffer und 0.2% Natriumazid, pH 7,2) enthielt, in Kulturplatten mit 6 Vertiefungen in einem Volumen von 50 μl/Vertiefung verdünnt. Die Überstände wurden mit 50 μl 9 × 10–10 M 125I-IL-1β plus 2,5 × 106 CB23-Zellen bei 8°C für 2 Stunden unter Schütteln inkubiert. Doppelte 60 μl-Aliquots der Inkubationsmischung wurden dann in Polyethylenzentrifugenröhrchen, die ein Phthalat-Öl-Gemisch enthielten, das 1.5 Teile Dibutylphthalat zu 1 Teil Biss-ethylhexyl)phthalat umfasste, überführt. Ein Negativkontrollröhrchen, das 3 × 10–6 M unmarkiertes IL-1β enthielt, wurde ebenfalls mitaufgenommen, um nicht-spezifische Bindung (100% Inhibierung) zu bestimmen, und ein Positivkontrollröhrchen enthaltend 50 ml Bindungsmedium nur mit radioaktiv markiertem IL-1β wurde miteingeschlossen, um die maximale Bindung zu bestimmen. Die Zellen mit gebundenem 125I-IL-1β wurden von ungebundenem 125I-IL-1β durch 5-minütige Zentrifugation bei 15 000 × g in einer Eppendorf-Mikrofuge abgetrennt. Überstände, die ungebundenes 125I- IL-1β enthielten, wurden verworfen und die Zellen wurden vorsichtig mit eiskaltem Bindungsmedium gespült. Die Zellen wurden in 1 ml Trypsin-EDTA für 15 Minuten bei 37°C inkubiert und dann geerntet. Die Radioaktivität, die den Zellen anhaftete, wurde dann auf einem Gamma-Counter bestimmt. Die Fähigkeit von löslichem IL-1R, die Bindung von IL-1α an endogene zelluläre Rezeptoren zu inhibieren, kann mittels desselben Verfahrens bestimmt werden. Analoge Techniken können in Assays verwendet werden, die löslichen TNF-R miteinbeziehen.
  • Beispiel 2
  • Isolierung humaner TNF-R-cDNA durch direkte Expression aktiven Proteins in COS-7-Zellen
  • Verschiedene humane Zelllinien wurden im Hinblick auf die Expression von TNF-R durchgemustert, und zwar basierend auf ihrer Fähigkeit, 125I-markierten TNF zu binden. Man fand heraus, dass die humane Fibroblastenzelllinie WI-26 VA4 (ATCC CCL 95.1) eine angemessene Anzahl von Rezeptoren pro Zelle exprinvert. Gleichgewichtsbindungs-Untersuchungen zeigten, dass die Zelllinie eine biphasische Bindung von 125I-TNF zeigte, mit ungefähr 4 000 hochaffinen Stellen (Ka = 1 × 1010 M–1) und 15 000 niedrigaffinen Stellen (Ka = 1 × 108 M–1) pro Zelle.
  • Durch reverse Transkription von polyadenylierter mRNA, die aus Gesamt-RNA isoliert wurde, welche aus humanen WI-26 VA4-Fibroblastenzellen, welche in Anwesenheit von Kermesbeere-Mitogen („pokeweed mitogen") unter Verwendung von Standardtechniken gezogen wurden (Gubler, et al., Gene 25: 263, 1983; Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, Band 1, 1987), extrahiert wurde, wurde eine nicht-größensortierte cDNA-Bibliothek hergestellt. Die Zellen wurden geerntet, indem die Zellen in einer Guanidinhydrochloridlösung lysiert wurden und die Gesamt-RNA wie zuvor beschrieben isoliert wurde (Manch et al., Nature 315: 641, 1985).
  • Poly A+ RNA wurde durch Oligo dT-Cellulosechromatographie isoliert und doppelsträngige cDNA wurde mittels eines Verfahrens hergestellt, das dem von Gubler und Hoffman (Gene 25: 263, 1983) ähnelt. Kurz, die Poly A+ RNA wurde durch reverse Transkriptase unter Verwendung von oligo-dT als Primer in ein RNA-cDNA-Hybrid umgewandelt. Das RNAcDNa-Hybrid wurde dann unter Verwendunng von RNAase H in Kombination mit DNA-Polymerase I in doppelsträngige cDNA umgewandelt. Die Enden der daraus hervorgehenden cDNA wurden mit T4-DNA-Polymerase glatt gemacht. Zu der cDNA, deren Enden glatt waren, wurden EcoRI-Linker-Adapter (mit internen Notl-Stellen) hinzugegeben, welche nur an einem Ende phosphoryliert waren (Invitrogen). Die mit Linker-Adaptern versehene cDNA wurde mit T4-Polynucleotidkinase behandelt, um die 5'-überhängende Region des Linker-Adapters zu phosphorylieren, und nicht-ligierte Linker wurden entfernt, indem die cDNA über eine Sepharose-CL4B-Säule geleitet wurde. Die mit Linker-Adaptern versehene cDNA wurde mit einer äquimolaren Konzentration von EcoRl-geschnittenen und dephosphorylierten Armen des Bakteriophagen λgt10 ligiert (Huynh et al., DNA Cloning: A Practical Approach, Glover, Hrsg., IRL Press, S. 49–78). Die ligierte DNA wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits in Phagenpartikel verpackt, um eine Rekombinanten-Bibliothek zu erzeugen (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA). Die Rekombinanten wurden weiterhin vermehrt, indem Phagen auf einem Bakterienrasen des E. coli-Stammes c600(hfl–) ausplattiert wurden.
  • Phagen-DNA wurde aus der daraus hervorgehenden λgt-10 cDNA-Bibliothek gereinigt und die cDNA-Insertionen wurden durch Verdau mit dem Restriktionsenzym Notl ausgeschnitten. Nach der Elektrophorese des Verdaus durch ein Agarosegel wurden cDNAs größer als 2 000 by isoliert.
  • Die daraus hervorgehenden cDNAs wurden in den eukaryontischen Expressionsvektor pCAV/NOT ligiert, welcher darauf ausgelegt wurde, cDNA-Sequenzen, die an dessen multipler Clonierungsstelle inseriert wurden, zu exprimieren, wenn er in eine Säugerzelle transfiziert wurde. PCAV/NOT wurde aus pDC201- (einem Derivat von pMLSV, der zuvor beschrieben wurde von Cosman et al., Nature 312: 768, 1984), SV40- und Cytomegalovirus-DNA zusammengesetzt und umfasst in der Reihenfolge, in Richtung der Transkription vom Replikationsursprung aus: (1) SV40 -Sequenzen der Koordinaten 5171–270, einschließlich des Replikationsursprungs, Enhancer-Sequenzen und frühe und späte Promotoren; (2) Cytomegalovirus-Sequenzen, einschließlich der Promotor- und Enhancer-Regionen (Nucleotide 671 bis +63 der Sequenz, die von Boechart et al. publiziert wurde (Cell 41: 521, 1985); (3) Adenovirus-2-Sequenzen, die das erste Exon und einen Teil des Introns zwischen dem ersten und zweiten Exon der dreigeteilten Leitsequenz, das zweite Exon und einen Teil des dritten Exons der dreigeteilten Leitsequenz und eine multiple Clonierungsstelle (MCS), die Schnittstellen für Xho1, Kpn1, Sma1, Notl und Bgl1 enthält, enthält; (4) SV40-Sequenzen der Koordinaten 4127–4100 und 2770–2533, die die Polyadenylierungs- und Terminations-Signale für frühe Transkription umfassen; (5) Sequenzen, die von pBR322 abgeleitet sind, und Virusassoziierte Sequenzen VAI und VAII von pDC201, mit Adenovirus-Sequenzen 10532-11156, die die VAI-und VAII-Gene enthalten, gefolgt von pBR322-Sequenzen von 4363–2486 und 1094–375, die das Ampicillin-Resistenzgen und den Replikationsursprung enthalten. PCAV/NOT wurde bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC 68014 hinterlegt.
  • Die daraus hervorgehende WI-26 VA4-cDNA-Bank in pCAV/NOT wurde verwendet, um den E. coli-Stamm DHSa zu transformieren, und die Rekombinanten wurden so ausplattiert, dass ungefähr 800 Kolonien pro Platte und genügend Platten entstanden, so dass ungefähr 50 000 Kolonien insgesamt pro Durchmusterung zur Verfügung gestellt wurden. Kolonien wurden von jeder Platte abgekratzt, in Pools vereinigt und von jedem Pool Plasmid-DNA präpariert. Die vereinigte DNA wurde dann verwendet, um eine nicht-konfluente Schicht von Affen-COS-7-Zellen zu transfizieren, und zwar unter Verwendung von DEAE-Dextran, gefolgt von einer Chloroquin-Behandlung, wie beschrieben von Luthman et a1. (Nucl. Acids Res. 11: 1295, 1983) und McCutchan et al. (J. Natl. Cancer Inst. 41: 351, 1986). Die Zellen wurden dann für 3 Tage in Kultur gezogen, um eine transiente Expression der inserierten Sequenzen zu erlauben. Nach drei Tagen wurden die Zellüberstände verworfen und die Zell-Monolayer in jeder Platte wurden wie folgt auf TNF-Bindung untersucht. Drei ml Bindungsmedium, das 1,2 × 10–11 M 125I-markierten FLAG®-TNF enthielt, wurden zu jeder Platte hinzugegeben und die Platten wurden für 120 Minuten bei 4°C inkubiert. Dann wurde dieses Medium verworfen und jede Platte wurde einmal mit kaltem Bindungsmedium (das kein markiertes TNF enthielt) und zweimal mit kaltem PBS gewaschen. Dann wurden die Ränder jeder Platte abgebrochen, wodurch eine flache Scheibe zurückblieb, welche für 72 Stunden bei –70°C unter Verwendung eines intensivierenden Screens mit Röntgenfilm in Kontakt gebracht wurde, wie von Sims et al., Science 241: 585 (1988) beschrieben. TNF-Bindungsaktivität wurde auf den belichteten Filmen als dunkler Fokus gegenüber einem relativ gleichförmigen Hintergrund sichtbar gemacht.
  • Nachdem ungefähr 240 000 Rekombinanten dieser Bibliothek auf diese Weise durchgemustert worden waren, wurde ein Pool von Transfektanden beobachtet, der TNF-Bindungs-Foci bildete, welche gegenüber der Hintergrundbelichtung deutlich sichtbar waren. Dann wurde eine gefrorene Stammlösung von Bakterien des positiven Pools verwendet, um Platten mit ungefähr 150 Kolonien zu erzeugen. Es wurden auf Nitrocellulose-Filtern Replicas dieser Platten erzeugt, und dann wurden die Platten abgekratzt und die Plasmid-DNA wurde präpariert und wie oben beschrieben transfiziert, um eine positive Platte zu identifizieren. Bakterien von Einzelkolonien der Nitrocellulose-Replicas dieser Platte wurden in 0,2 ml-Kulturen gezogen, welche verwendet wurden, um Plasmid-DNA zu erhalten, welche in COS-7-Zellen transfiziert wurde, wie oben beschrieben. Auf diese Weise wurde ein einzelner Clon isoliert, welcher fähig war, die Expression von humanem TNF-R in COS-Zellen zu induzieren. Der Expressions-Vektor pCAV/NOT, der diese TNF-R-cDNA enthielt, wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA (Hinterlegungsnummer 68088) unter dem Namen pCAV/NOT-TNF-R hinterlegt.
  • Beispiel 3
  • Konstruktion von cDNAs, die für löslichen huTNF-RΔ235 codieren
  • Es wurde eine cDNA konstruiert, die für einen löslichen huTNF-RΔ235 codierte. Das codierte Protein umfasst die Sequenz der Aminosäuren –22 bis 235 aus 2A. Die Prozessierung der Signalsequenz führt zu einem Protein, das die Sequenz der Aminosäuren 1 bis 235 aus 2A hat. Ein 840 bp-Fragment wurde aus pCAV/NOT-TNF-R mit den Restriktionsenzymen Notl und Pvu2 ausgeschnitten. Notl schneidet an der multiplen Clonie rungsstelle von pCAV/NOT-TNF-R und Pvu2 schneidet innerhalb der TNF-R-codierenden Region, 20 Nucleotide 5' der Transmembran-Region gelegen. Um das 3'-Ende der TNF-R-Sequenzen zu rekonstruieren, wurden zwei Oligonucleotide synthetisiert und daraus Doppelstrang gebildet, um den folgenden Oligonucleotid-Linker zu bilden:
  • Figure 00290001
  • Dieser Oligonucleotid-Linker besitzt terminale Pvu2 und Bgl2-Restriktionsstellen, und stellt 20 Nucleotide des TNF-R wieder her, gefolgt von einem Terminationscodon (unterstrichen) und einer BamH1-Restriktionsstelle (zur Erleichterung bei der Isolierung des gesamten löslichen TNF-R mittels Not1/BamH1-Verdau). Dieses Oligonucleotid wurde dann mit dem 840 by Not1/Pvu2-TNF-R-Insert in Bgl2/Not1-geschnittenen pCAV/NOT unter Erhalt von psolhuTNF-RΔ235/CAVNOT ligiert, welcher in COS-7-Zellen transfiziert wurde, wie oben beschrieben. Dieser Expressionsvektor induzierte die Expression von löslichem humanen TNF-R, welcher fähig war, TNF zu binden.
  • Beispiel 4
  • Konstruktion von cDNAs, die für löslichen huTNF-RΔ185 codieren
  • Es wurde eine cDNA konstruiert, die für einen löslichen huTNF-RΔ185 codierte, der die Sequenz der Aminosäuren –22–185 aus 2A (oder Aminosäuren 1–185 nach Prozessieren der Signalsequenz in einer geeigneten Wirtszelle) besitzt, und zwar indem mit den Restriktionsenzymen Notl und Bgl2 ein 640 bp-Fragment aus pCAV/NOT-TNF-R ausgeschnitten wurde. Notl schneidet an der multiplen Clonierungsstelle von pCAV/NOT-TNF-R, und Bgl2 schneidet innerhalb der TNF-R-codierenden Region bei Nucleotid 637, welches 237 Nucleotide 5' der Transmembran-Regio liegt. Die folgenden Oligonucleotid-Linker wurden synthetisiert:
    Figure 00290002
  • Die obigen Oligonucleotid-Linker stellen das 3'-Ende des Rezeptormoleküls bis zu Nucleotid 708 wieder her, gefolgt von einem Terminationscodon (unterstrichen). Diese Oligonucleotide wurden dann zusammen mit dem 640 bp-Not1-TNF-R-Insert in Notl-geschnittenen pCAV/NOT ligiert. Man erhielt den Expressionvektor psolTNFRΔ185/CAVNOT, welcher in COS-7-Zellen transfiziert wurde, wie oben beschrieben. Dieser Expressionvektor induzierte die Expression von löslichem humanen TNF-R, welcher befähigt war, TNF zu binden.
  • Beispiel 5
  • Konstruktion von cDNAs, die für löslichen huTNF-RΔ163 codieren
  • Es wurde eine cDNA konstruiert, die für einen löslichen huTNF-RΔ163 codiert, der die Sequenz der Aminosäuren –22– 163 aus 2A (1–163 nach Prozessierung der Signalsequenz) hat, und zwar indem ein 640 bp-Fragment mit den Restriktionsenzymen Notl und Bgl2 aus pCAV/NOT-TNF-R ausgeschnitten wurde, wie in Beispiel 4 beschrieben. Die folgenden Oligonucleotid-Linker wurden synthetisiert:
  • Figure 00300001
  • Dieser obige Oligonucleotid-Linker stellt das 3'-Ende des Rezeptormoleküls bis zu Nucleotid 642 (Aminosäure 163) wieder her, gefolgt von einem Terminationscodon (unterstrichen). Dieses Oligonucleotid wurde dann zusammen mit dem 640 bp-Not1-TNF-R-Insert in Notlgeschnittenen pCAV/NOT ligiert. Man erhielt den Expressionsvektor pso1TNFRΔ163/CAVNOT, welcher in COS-7-Zellen transfiziert wurde, wie oben beschrieben. Dieser Expressionsvektor induzierte die Expression von löslichem humanen TNF-R, welcher befähigt war, TNF in dem Bindungsassay, der in Beispiel 1 beschrieben ist, zu binden.
  • Beispiel 6
  • Konstruktion von cDNAs, die für löslichen huTNF-RΔ142 codieren
  • Es wurde eine cDNA konstruiert, die für einen löslichen huTNF-RΔ142 (mit der Sequenz der Aminosäuren –22–142 aus 2A (1–142 nach Prozessieren der Signalsequenz)) codiert, und zwar indem ein 550 bp-Fragment mit den Restriktionsenzymen Notl und A1wN1 aus pCAV/NOT-TNF-R ausgeschnitten wurde. A1wN1 schneidet innerhalb der TNF-Rcodierenden Region bei Nucleotid 549. Der folgende Oligonucleotid-Linker wurde synthetisiert:
    Figure 00300002
  • Dieser obige Oligonucleotid-Linker stellt das 3'-Ende des Rezeptormoleküls bis zu Nucleotid 579 (Aminosäure 142) wieder her, gefolgt von einem Terminationscodon (unterstrichen). Dieses Oligonucleotid wurde dann zusammen mit dem 550 bp-Not1/A1wN1-TNF-R-Insert in Not1/Bg12-geschnittenen pCAV/NOT ligiert. Man erhielt den Expressionsvektor pso1TNFRΔ142/CAVNOT, welcher in COS-7-Zellen transfiziert wurde, wie oben beschrieben. Dieser Expressionsvektor induzierte nicht die Expression von löslichem humanen TNF-R, welcher fähig war, TNF zu binden. Es wird vermutet, dass dieses besondere Konstrukt kein biologisch aktives TNF-R exprimieren konnte, weil ein oder mehrere essentielle Cystein-Reste (z. B Cys157 oder Cys163), die für die intramolekulare Bindung (zur Bildung der richtigen Tertiärstruktur des TNF-R-Moleküls) erforderlich sind, eliminiert wurden.
  • Vergleichsbeispiel 2
  • Isolierung von humanen Typ I-IL-1R-cDNA-Clonen
  • Es wurde eine cDNA isoliert, die für ein humanes Typ I-IL-1R-Protein codiert, und zwar mittels Hybridisierung mit einer Sonde, die von Maus-Typ I-IL-1R-cDNA abgeleitet war. Die Clonierung dieser Maus-IL-1R-cDNA ist in Beispiel 4 von EP 318 296 beschrieben. Ein Vektor, der die Maus-cDNA enthält, wurde bei der American Type Culture Collection unter dem Namen GEMBL78 am 19. November 1987 hinterlegt und ihm wurde die Hinterlegungsnummer ATCC 67563 vergeben.
  • Es wurde, wie von Sims et al. (Science 241: 585, 1988) beschrieben, ein 2356 Basenpaar (bp)-Fragment dieses hinterlegten Maus-Clons 78 isoliert und durch Nick-DNA-Neusynthese unter Verwendung der DNA-Polymerase I zur Verwendung als Sonde radioaktiv markiert. Das angewandte Verfahren war im Wesentlichen ähnlich zu dem, das von Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, S. 109) offenbart wurde.
  • Die Sonde wurde verwendet, um humane cDNA-Bibliotheken auf humanes IL-1R durchzumustern, wie beschrieben von Sims et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 8946, 1989. Eine cDNA-Bibliothek wurde durch reverse Transkription von polyadenylierter mRNA, die aus Gesamt-RNA isoliert war, welche aus den kultivierten Zellen einer humanen T-Zelllinie, die als Clon 22 bezeichnet wurde, wie beschrieben von Acres et al. (J. Immunol. 138: 2132, 1987), extrahiert worden war, konstruiert. Diese Zellen wurden in RPMI 1640-Medium plus 10% fötalem Rinderserum wie von Acres et al. (s. oben) beschrieben in Anwesenheit von 10 ng/ml OKT3-Antikörper und 10 ng/ml humanem IL-2 kultiviert. Die cDNA wurde unter Verwendung von DNA-Polymerase I doppelsträngig gemacht, mit T4-DNA-Polymerase wurden die Enden glatt gemacht, sie wurde mit EcoRI-Methylase methyliert, um EcoRI-Schnittstellen innerhalb der cDNA zu schützen, und dann an EcoRI-Linker ligiert. Die daraus hervorgehenden Konstrukte wurden mit EcoRI verdaut, um alle Kopien der Linker außer jeweils einer an jedem Ende der cDNA zu entfernen, und an Eco-RI geschnittene und dephosphorylierte Arme des Bakteriophagen λgt10 ligiert (Huynh et al., DNA Cloning: A practical Approach, Glover, Hrsg., IRL Press, S. 49–78). Die ligierte DNA wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA 92121) in Phagenpartikel verpackt, um eine Bibliothek von Rekombinanten zu erzeugen. Die Rekombinanten wurden auf dem E. coli-Stamm C600(hfl-) ausplattiert und durch Standardplaque-Hybridisierungstechniken unter Bedingungen moderater Stringenz (50°C, 6 × SSC) durchgemustert.
  • Nach mehreren Runden der Durchmusterung wurden neun Clone aus der Bibliothek isoliert, die mit der cDNA-Sonde hybridisierten. Die Clone wurden Plaque-gereinigt und verwendet, um Bakteriophagen-DNA zu präparieren, welche mit EcoRI verdaut wurde. Die verdauten Ansätze wurden auf einem Agarosegel der Elektrophorese unterzogen, auf Nylon-Filter geblottet und bezüglich der Hybridisierung nochmals getestet. Die Clone wurden mit EcoRI verdaut, gefolgt von einer präparativen Agarosegel-Elektrophorese. Dann wurden sie in EcoRI-geschnittene Derivate (pGEMBL) des Standard-Clonierungsvektors pBR322, die einen Polylinker mit einer nur einmal vorhandenen EcoRI-Schnittstelle, einer BamHI-Schnittstelle und zahlreiche andere nur einmal vorhandene Restriktionsschnittstellen besaßen, subcloniert. Beispielhaft wurde ein Vektor dieses Typs von Dente et al. (Nucl. Acids Res. 11: 1645, 1983) beschrieben.
  • Die Restriktionskartierung und Sequenzierung eines humanen 4,8 kb-IL-1R-Clons deutete darauf hin, dass der Clon eine Sequenz umfasst, die für 518 Aminosäuren codiert, welche 80% Aminosäure-Sequenzidentität mit der entsprechenden Maus-Sequenz in der extrazellulären oder N-terminalen Region distal zur Transmembran-Region, 63% Identität in der Transmembran-Region und 87% Identität in der zytoplasmatischen oder C-terminalen Region aufwies. Ein 440 bp-EcoRI-NsiI-Fragment, das von dem 5'-Teil des humanen IL-1R-Clons abgeleitet war, wurde durch Nick-DNA-Neusynthese mit 32P wie oben beschrieben markiert und verwendet, um eine cDNA-Bibliothek durchzumustern, welche hergestellt wurde, indem Zufallsprimer bei der mRNA von Clon 22 der humanen T-Zelllinie, welche wie oben beschrieben hergestellt wurde, verwendet wurden. Es wurden 23 Clone isoliert, welche mit der Sonde hybridisierten, und sie wurden durch Restriktionskartierung untersucht. Die Sequenzierung von einem dieser Clone lieferte die Sequenzinformation, die mit den übrigen Nterminalen 34 Aminosäuren des humanen Proteins übereinstimmte. Die DNA- und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz der vollständigen codierenden Region des humanen Typ I-lL-1R sind in SEQ ID NO: 5 und 6 gezeigt. Dieses humane 1L-1R-Protein umfasst 569 Aminosäuren (einschließlich eines 20 Aminosäuren-Signalpeptids), und schließt 16 Cystein-Reste mit ein, von denen 13 von den Maus- zu den humanen Genen konserviert sind. Zusätzlich umfasst die humane Sequenz sechs potentielle N-Gykosylierungsstellen, von denen fünf von der Maus- zur humanen Sequenz konserviert sind.
  • Vergleichsbeispiel 3
  • Isolierung von cDNAs, die für Typ II-IL-1R codieren
  • Eine DNA-Sequenz, die für humanen Typ II-IL-1R codiert, wurde aus einer cDNA-Bibliothek isoliert, die unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt worden war, und zwar durch reverse Transkription polyadenylierter RNA, die aus der humanen lymphoblastoiden B-Zelllinie CB23 isoliert wurde, wie beschrieben von Benjamin & Dover, Blood 75: 2017, 1990. Kurz, die CB23-Zelllinie ist eine EBV-transformierte Nabelschnurblut („cord blood" (CB))-Lymphozyten-Zelllinie, welche unter Verwendung der Methoden, die von Benjamin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3547, 1984, beschrieben wurden, hergestellt wurde.
  • Die CB23-Bibliothek wurde mittels modifizierter direkter Expression von in einem Pool vereinigten cDNA-Fragmenten in der Affennieren-Zelllinie CV-1/EBNA-1 unter Verwendung eines Säuger-Expressionsvektors (pDC406), der Replikationsursprünge enthält, die von SV40, Epstein-Barr-Virus und pBR322 abgeleitet sind, durchgemustert. pDC406 ist ein Derivat von HAV-EO, das von Dower et al., J. Immunol. 142: 4314 (1989) beschrieben wurde. pDC406 unterscheidet sich von HAV-EO durch die Deletion des Introns, das in der dreigeteilten Adenovirus 2-Leitsequenz in HAV-EO vorhanden ist. Die CV-1/EBNA-1-Zelllinie wurde durch Transfektion der CV-1-Zelllinie mit dem Gen, das für Epstein-Barr-Virus Kernantigen-1 (EBNA-1) codiert, und mit einem Vektor, der CMV-Regulationssequenzen enthält, abgeleitet, so dass EBNA-1 unter der Kontrolle der humanen unmittelbar-frühen („immediate-early") CMV-Enhancer/Promotor-Sequenzen exprimiert wird. Das EBNA-1-Gen ermöglicht die episomale Replikation von Expressionsvektoren wie pDC406, die den EBV-Replikationsursprung enthalten.
  • Transfektanden, die biologisch aktiven Typ II-IL-1R exprimieren, wurden anfänglich unter Verwendung einer modifizierten Objektträger-Autoradiographie-Technik identifiziert, im Wesentlichen wie beschrieben von Gearing et al., EMBO J. 8: 3667, 1989. Kurz, CV-1/EBNA-1-Zellen wurden direkt auf Glasobjektträgern mit Miniprep-DNA in pDC406 aus Pools von cDNA-Clonen transfiziert und für 2–3 Tage kultiviert, um transiente Expression von Typ II-IL-1R zu ermöglichen. Die Objektträger, die die transfizierten Zellen trugen, wurden dann mit Medium, das 125I-IL-1β enthielt, inkubiert, gewaschen, um nicht-gebundenes markiertes IL-1β zu entfernen, mit Glutaraldehyd fixiert, in flüssige photographische Emulsion getaucht und im Dunkeln exponiert. Nach Entwicklung der Objektträger wurden sie einzeln mit einem Mikroskop untersucht und positive Zellen, die Typ II-IL-1R exprimierten, wurden durch Anwesenheit von autoradiographischen Silberkörnchen gegen einen Licht-Hintergrund identifiziert. Unter Verwendung dieses Ansatzes wurden ungefähr 250 000 cDNAs in Pools von ungefähr 3 000 cDNAs unter Verwendung der autoradiographischen Objektträger-Methode durchgemustert, bis ein Pool von Transfektanden mehrere Zellen auf wies, die klar positiv für IL-1ß-Bindung waren. Dieser Pool wurde dann in Pools von 500 aufgeteilt und wiederum durch Objektträger-Autoradiographie durchgemustert. Es wurde ein positiver Pool identifiziert. Dieser Pool wurde weiter in Pools von 75 aufgeteilt und mittels Plattenbindungsassays durch Quantifizierung von gebundenem 125I-IL-1β analysiert. Die Zellen wurden abgekratzt und es wurde mit einem Counter bestimmt, welcher Pool der 75 positiv war. Einzelkolonien von diesem Pool von 75 wurden durchgemustert, bis ein EinzelClon identifiziert wurde, welcher die Synthese eines Oberflächenproteins mit detektierbarer IL-1β-Bindungsaktivität zeigte. Dieser Clon wurde isoliert und das Insert wurde sequenziert, um die Sequenz der humanen Typ II-IL-1R-cDNA zu bestimmen; diese ist zusammen mit der davon codierten Aminosäure-Sequenz in SEQ ID NO: 7 und 8 gezeigt. Der pDC406-Clonierungsvektor, der die humane Typ II-IL-1R-cDNA enthält, der pHu IL-1R-II 75 genannt wurde, wurde in E. coli-Wirtszellen bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD. USA (ATCC) am 5. Juni 1990 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 68337 hinterlegt. Die Hinterlegung wurde unter den Bedingungen des Budapester Abkommens vorgenommen.
  • Wie die meisten Säuger-Gene wird Säuger-Typ II-IL-1R vermutlich von Multi-Exon-Genen codiert.
  • Vergleichsbeispiel 4
  • Konstruktion und Expression von cDNAs, die für löslichen humanen Typ II-IL-1R codieren
  • Mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung des Volllängen-Typ II-IL-1R-cDNA-Clons 75 (ATCC 68337) in Vektor pDC406 (beschrieben in Vergleichsbeispiel 3) als Matritze wurde eine cDNA konstruiert, die für einen humanen löslichen Typ II-IL-1R codiert (der die Sequenz der Aminosäuren –13–333 der SEQ ID NO: 8 hat). Zuerst wurden die folgenden 5'-Oligonucleotid-Primer (SEQ ID NO: 14) und 3'-Oligonucleotid-Primer (SEQ ID NO: 15) konstruiert:
  • Figure 00340001
  • Die 5'-Primer entsprechen den Nucleotiden 31–51 der untranslatierten Region von dem humanen Typ II-IL-1R-Clon 75 (SEQ m NO: 7) mit der Hinzufügung einer SalI-Restriktionsstelle; diese Nucleotid-Sequenz ist zur Doppelstrangbildung mit dem (-)-Strang, komplementär zu Nucleotiden 31–51 des humanen Clons 75, befähigt. Der 3'-Primer ist zu Nucleotiden 1191–1172 (was Anti-Sense-Nucleotide umfasst, die 3 Aminosäuren von humanem Typ II IL-1R-Clon 75 umfasst, und besitzt eine 5'-Hinzufügung einer NotI-Restriktionsschnittstelle und eines Stop-Codons.
  • Die folgenden PCR-Reagentien wurden in ein 1,5 ml Eppendorf Mikrozentrifugenröhrchen gegeben: 10 μl 10X PCR-Puffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3 bei 25°C, 15 mM MgCl2, und 1 mg/ml Gelatine) (Perkins-Eimer Cetus, Norwalk, CN), 10 μl einer 2 mM-Lösung, die jedes dNTP enthält (2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dGTP und 2 mM dTTP), 2,5 Einheiten (0,5 μl einer Standard-Lösung mit 5000 Einheiten/ml) Taq DNA-Polymerase (Perkins-Eimer-Cetus), 50 ng Matrizen-DNA und 5 μl einer 20 μM-Lösung von jedem der obigen Oligonucleotid-Primer und 74,5 μl Wasser bis zu einem Endvolumen von 100 μl. Die Mischung wurde dann mit 100 μl Paraffinöl überschichtet. Die PCR wurde unter Verwendung eines Thermozyklers (Ericomp, San Diego, CA) durchgeführt, indem die Matrize anfangs bei 94° für 90 Sekunden denaturiert wurde, bei 55° für 75 Sekunden Doppelstrangbildung erlaubt wurde und die cDNA bei 72° für 150 Sekunden verlängert wurde. Die PCR wurde über 20 zusätzliche Zyklen der Verlängerung unter Verwendung eines Stufenprogramms (Denaturierung bei 94°, 25 s; Doppelstrangbildung bei 55°, 45 s; Verlängerung bei 72°, 150 s) durchgeführt, gefolgt von einer 5-minütigen Verlängerung bei 72°.
  • Die Probe wurde unter dem Paraffinöl entnommen und durch Phenol-Chloroform-Extraktion und durch Zentrifugationssäulen-Chromatographie über G-50 (Boehringer Mannheim) die DNA extrahiert. Ein 10 μl-Aliquot der extrahierten DNA wurde mittels Elektrophorese auf 1%-iger SeaKem-Agarose (FMC BioProducts, Rockland, ME) aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt, um zu bestätigen, dass die DNA-Fragmentgröße mit dem vorhergesagten Produkt übereinstimmte.
  • 20 μl des PCR-amplifizierten cDNA-Produktes wurden dann mit SalI- und NotI-Restriktionsenzymen unter Verwendung von Standardverfahren verdaut. Das SalI/NotI-Restriktionsfragment wurde dann in einer 1,2%-igen SeaplaqueTM-Agarose mit niedriger Gelierungstemperatur (LGT) aufgetrennt und die Bande, die das Fragment darstellte, wurde isoliert. Das Fragment wurde mittels einer Standard-Ligationsmethode im Gel in den pDC406-Vektor ligiert. Der daraus hervorgehende Vektor wurde in CV1-EBNA-Zellen transfiziert und das lösliche IL-1R-Protein wurde exprimiert.
  • Beispiel 7
  • Konstruktion eines Vektors, der für Di-TNF-R codiert
  • Ein Vektor, der für ein Fusionsprotein der Formel TNF-R – Peptidlinker – TNF-R codiert und in 3 dargestellt ist, wurde wie folgt konstruiert. Relevante Restriktionsenzym-Schnittstellen in der TNF-R-Sequenz sind auch in 2A-2B gezeigt.
  • Der Expressionsvektor, der in Beispiel 3 konstruiert wurde und als psol huTNF-RΔ235/CAVNOT genannt wurde, wurde mit dem Restriktionsenzym Not I verdaut, welches an der multiplen Clonierungsstelle des pCAV/N0T-Vektors schneidet (d. h. stromaufwärts der TNF-R-Sequenz, die darein inseriert ist). Der Überhang, der durch Not I-Verdau erzeugt wird, wurde unter Verwendung des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase I aufgefüllt, um ein glattes Ende zu erzeugen. Der Vektor wurde dann mit Bam HI verdaut, welches stromabwärts des Stopp-Codons, das auf das Codon für Aminosäure 235 folgt, wie in Beispiel 3 gezeigt, schneidet.
  • Das NotI/Bam HI-Fragment mit glatten Enden, das die TNF-R-Sequenz enthält, wurde mittels konventioneller Verfahren isoliert und in einen Plasmidvektor, der als pCAV/DHFR bezeichnet wird, welcher mit Sma I und Bgl II verdaut wurde, inseriert. Der pCAV/DHFR-Vektor ist ein Expressionsvektor, der SV40-Promotorsequenzen stromaufwärts einer multiplen Clonierungsstelle enthält, und andere Eigenschaften, wie beschrieben für pCAV/NOT in Beispiel 2, aufweist, und auch ein Dihydrofolat-Reductase (DHFR)-Gen als Selektionsmarker enthält. Das DHFR-Gen verleiht ansonsten DHFR–-Säugerzellen, die den Vektor aufgenommen haben, einen selektiven Vorteil beim Wachstum in Anwesenheit von Methotrexat (MTX). Sma I-Verdau bringt glatte Enden hervor, an welche die glatt-gemachten Not I-Enden des TNF-R-enthaltenden Fragments ligiert werden. Die Bgl II-erzeugten Überhänge werden mit den Bam HI-verdauten Enden des TNF-R-enthaltenden Fragments ligiert. Die Ligation zerstört die Bam HI- und Bgl II-Schnittstellen. Mittels konventioneller Verfahren werden E. coli-Zellen mit der Ligationsmischung transformiert. Plasmid-DNA wird von den Wirtszellen zurückgewonnen und das erwünschte Konstrukt wird durch Restriktiosanalyse bestätigt. Der daraus hervorgehende Vektor, der das TNF-R-Insert enthält, wird pCAV/DHFR/TNF-R bezeichnet.
  • Die folgenden DNA-Fragmente wurden zur Verwendung bei der Herstellung eines Vektors, der zwei TNF-R-Polypeptide, getrennt durch einen Peptidlinker, codiert, isoliert:
    • (A) Das Fragment von Asp718 (einem Restriktionsenzym) bis Esp I aus dem pCAV/DHFR/TNF-R-Vektor. Asp 718 schneidet den Vektor stromaufwärts der inserieren TNF-R-Sequenz; Esp I (erhältlich von U.S. Biochemicals) schneidet die TNF-R-Sequenz an der Position, die in 2A gezeigt ist. Das gewünschte Fragment ist ungefähr 6,7 Kilobasenpaare (kbp) lang und umfasst Vektorsequenzen und das 3'-Ende eier TNF-R-Sequenz.
    • (B) Fragment von Asp718 bis PvuII aus dem Expressionsvektor, der in Beispiel 4 konstruiert wurde und als psol hu TNF-R Δ235/CAVNOT bezeichnet wurde. Asp718 schneidet den Vektor stromaufwärts der inserierten TNF-R-Sequenz. Das gewünschte 865 bp-Fragment umfasst eine TNF-R-Sequenz, die von der 5'-Signalsequenz bis zur Pvu II-Schnittstelle, die in Beispiel 4 gezeigt ist, reicht.
    • (C) Ein doppelsträngiges Oligonucleotid mit der Sequenz (SEQ ID NO: 16 und 17):
      Figure 00370001
    • (D) Das Fragment von Bgl I bis Esp I aus dem Expressionsvektor, der in Beispiel 4 konstruiert und als psol hu TNF-R Δ235/CAVNOT bezeichnet wurde. Das gewünschte Fragment ist ungefähr 304 by lang. Bgl I schneidet innerhalb des Codons für Aminosäure 5 (Val) von TNF-R; Esp I schneidet die TNF-R-Sequenz an der Position, die in 2A gezeigt ist; der Rest (3'-Ende) dieser Sequenz, die für löslichen TNF-R codiert, wird von Fragment (A) geliefert.
  • Das Oligonucleotid (C) wird mittels konventioneller Verfahren für chemische Synthese von Oligonucleotiden hergestellt. Das Oligonucleotid stellt das 3'-Ende der ersten TNF-R-Sequenz von der Pvu II-Schnittstelle bis zur letzten Aminosäure der extrazellulären Domäne (Asp an Position 235) wieder her. Das Oligonucleotid enthält auch eine im Leserahmen befindliche Sequenz, die für den Peptidlinker Gly4SerGly5Ser codiert. Die Sequenz dieses Teils des Oligonucleotids kann verändert werden, wenn erwünscht ist, dass sie für andere Peptidlinker codiert. Oligonucleotid C baut auch das 5'-Ende der zweiten TNF-R-Sequenz um, und zwar von einem Codon für Leucin, der ersten Aminosäuren des reifen Proteins, durch ein Teilcodon für Valin (Aminosäure 5) innerhalb des hervorstehenden 3'-Überhangs, was das Val-Codon regeneriert, wenn der Überhang mit dem komplementären Überhang am Bgl Iverdauten Ende von Fragment D ligiert wird.
  • Die A-D-bezeichneten DNA-Fragmente wurden in den Positionen, die in 3 gezeigt sind, unter Bildung eines Vektors, der als pCAV DHFR Di-TNF-R bezeichnet ist, zusammenligiert, welcher ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein codiert. Mittels konventioneller Verfahren werden E. coli-Zellen mit der Ligationsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA wird von den Wirtszellen wiedergewonnen und das erwünschte Konstrukt wird durch Restriktions-Analyse bestätigt. Das stromaufwärts gelegene TNF-R-Polypeptid, das von diesem Expressionsvektor codiert wird, enthält Aminosäuren –22 bis 235 von SEQ ID NO: 2 (d. h. einen löslichen TNF-R einschließlich der N-terminalen Signalsequenz und der gesamten extrazellulären Domäne ohne ein Stopp-Codon). Dem stromabwärts gelegenen TNF-R-Polypeptid fehlt die Signalsequenz und es enthält Aminosäuren 1-235 von SEQ ID NO: 2, mit einem Stopp-Codon, das direkt nach Aminosäure 235 positioniert ist. Der Peptidlinker dieses bestimmten Konstruktes ist Gly4SerGly5Ser.
  • Säugerzellen werden mit dem Expressionsvektor mittels konventioneller Verfahren transfiziert und unter Bildung des gewünschten Fusionsproteins kultiviert. Eine geeignete Säuger-Zelllinie ist eine DHFR–-Chinahamster-Ovarien-Zelllinie, die CHO-K1 genannt wird und von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, unter der Hinterlegungsnummer CCL61 verfügbar ist. Die Zellen können durch Standard-Calciumphosphat-Präzipitation mit dem Expressionsvektor transfiziert werden, im Wesentlichen wie beschrieben von Graham und van der Eb, Virology 52: 456 (1983). Die transfizierten Zellen werden unter geeigneten konventionellen Bedingungen kultiviert, und das Vorhandensein des gewünschten Fusionsproteins in dem Kulturmedium wird mittels Assays, beispielsweise jenen, die in Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1 beschrieben sind, bestätigt.
  • Eine andere geeignete Säuger-Zelllinie ist die COS-7-Zelllinie. In einem Experiment wurden COS-7-Zellen mit dem oben beschriebenen TNF-R-Dimer-codierenden Expressionsvektor transfiziert und unter Expression des Dimers kultiviert. Nicht-konzentrierter Überstand (der das sezernierte Dimer enthielt) wurde im Hinblick auf die Fähigkeit, die Bindung von radioaktiv-iodiertem Maus-TNFα an U937-Zellen (eine humane Monozyten-ähnliche Zelllinie, die endogene Rezeptoren für TNF trägt) zu inhibieren, untersucht. Der Inhibitions-Bindungs-Assay wurde entsprechend konventionellen Verfahren, ähnlich denen, die in Beispiel 2, Sektion C beschrieben sind, durchgeführt. Negativ-Kontrollröhrchen (zur Messung nicht-spezifischer Bindung) enthielten nicht-radioaktiv markiertes TNFα, U937-Zellen und radioaktiv-iodiertes TNFα. Positiv-Kontrollröhrchen (zur Messung maximaler nichtinhibierter Bindung von radioaktiv-iodiertem TNFα an die U937-Zellen) enthielten Bindungsmedium, U937-Zellen und radioaktiv-iodiertes TNFα. Der Dimer-enthaltende Überstand inhibierte über 90% der TNF-Bindung an U937-Zellen, welche für die Positivkontrolle beobachtet wurde.
  • Vergleichsbeispiel 5
  • Fusionsprotein, das ein IL-1R-Polypeptid und zwei TNF-R-Polypeptide umfasst
  • Ein Plasmidvektor, der DNA enthält, die für ein Fusionsprotein der Formel IL-1R – Peptidlinker- TNF-R-Peptidlinker – TNF-R codiert, wird wie folgt konstruiert.
  • Es wurde cDNA, die für ein lösliches Typ I IL-1R-Polypeptid codiert, isoliert und unter Verwendung des wohlbekannten Polymerase-Kettenreaktion(PCR)-Verfahrens amplifiziert. Es wurden die folgenden Oligonucleotide zur Verwendung als Primer in der PCR-Reaktion synthetisiert:
    Figure 00380001
  • Diese Oligonucleotide, genauso wie jene, die unten diskutiert sind, werden mittels konventioneller Verfahren synthetisiert, z. B unter Verwendung einer automatisierten DNA-Synthesemaschine, wie beispielsweise jenen, die von Biosearch, Inc., San Rafael, California, oder von Applied Biosystems erhältlich sind. Die in der PCR-Reaktion verwendete Matrize ist ein Plasmidvektor, der hergestellt wurde, indem humane Typ I-IL-IR cDNA in einen Vektor, der SF CAV genannt wird, inseriert wird. Der SF CAV-Vektor ist ein Säuger-Expressionsvektor, der in 5 gezeigt ist (welche die Verwendung von SF CAV in einer weiteren Vektorkonstruktion darstellt, die unten beschrieben ist). SF CAV in E. coli-Zellen wurde bei der American Type Cultur Collection am 27. Februar 1992 unter den Bedingungen des Budapester Abkommens hinterlegt und ihm wurde die Hinterlegungsnummer 68922 zugewiesen.
  • Die SV40-, CMV-, pA- und VA-Sequenzen und das Ampicillin-Resistenzgen in SF CAV sind wie jene, die für pCAV/NOT in Beispiel 2 oben und auch in Beispiel 8 und 3 der PCT-Anmeldung WO 90/05183 beschrieben sind. Eine multiple Clonierungsstelle, die zwischen der dreigeteilten Adenovirus-2-Leitsequenz (TPL) und pA-Sequenzen positioniert wurde, enthält Erkennungsstellen für die Restriktions-Endonucleoasen XhoI, KpnI, SmaI, NotI und BglI. Die TPL-Sequenz unterscheidet sich von der von pCAV/NOT dadurch, dass eine Region, von der man glaubt, dass sie für die Konstruktion von IL-1R-codierenden Vektoren schädlich ist, von der SF CAV TPL-Sequenz deletiert wurde. Der widrige Einfluss auf IL-1R-Vektoren kann möglicherweise einem kryptischen Promotor in der unerwünschten Sequenz zugeschrieben werden, von welchem aus unerwünschte Proteine in E. coli exprimiert werden. Eine Expression auf einem geringen Niveau von humanem 1L-1R vom kryptischen Promotor aus kann für die Bakterien toxisch sein.
  • SF CAV wird mit SmaI verdaut, welches eine nur einmal vorkommende Restriktionsstelle innerhalb der multiplen Clonierungsstelle erkennt und glatte Enden hervorbringt. Ein DNA-Fragment, das Typ I-IL-1R-cDNA enthält, wird durch Styl/BglII-Verdau, gefolgt vom Auffüllen der Überhänge unter Verwendung des Klenow-Fragmentes von DNA-Polymerase I zum Erzeugen von glatten Enden, hergestellt. StyI schneidet an Nucleotid 49 und BglII schneidet an Nucleotid 1997 von SEQ ID NO: 5. Das IL-1R-cDNA-Fragment wird in den SmaIverdauten SF CAV-Vektor ligiert und E. coli-Zellen werden mittels Standardverfahren mit der Ligationsmischung transformiert. Der daraus hervorgehende Vektor wird aus den E. coli-Zellen wiedergewonnen und als Matrize in der PCR-Reaktion verwendet.
  • Der 5'-Primer (SEQ ID NO: 18) entspricht einer Sequenz von 17 Nucleotiden, die sich in dem Vektor stromaufwärts der inserierten IL-1R-cDNA befindet. Der 3'-Primer (SEQ ID NO: 19) umfasst ein Segment, das zu Nucleotiden 1060–1079 von SEQ ID NO: 5 komplementär ist, welches Aminosäuren 306 (Teil-Codon) bis 312 codiert, nahe dem C-Terminus der extrazellulären Domäne von IL-1R. Dieser 3'-Primer enthält auch eine Sequenz, die den Peptidlinker Gly4SerGly5Ser codiert.
  • Es wird eine PCR-Reaktion durchgeführt unter Verwendung irgendeines geeigneten Verfahrens, wie beispielsweise jener, die beschrieben sind in Saiki et al., Science 239: 487 (1988); in Recombinant DNA Methodology, Wu et al., Hrsg., Academic Press Inc., San Diego (1989), S. 189–196; und in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Hrsg., Academic Press, Inc. (1990). Ein Beispiel eines geeigneten PCR-Verfahrens ist das folgende. Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben. Die folgenden PCR-Reagentien werden in ein 0,5 ml-Eppendorf-Mikrozentifugen-Röhrchen gegeben: 10 μl 10x-PCR-Puffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3 bei 25°C, 25 mM MgCl2 und 1 mg/ml Gelatine) (Perkin-Eimer Cetus, Norwalk, CN), 8 μl einer 2,5 mM Lösung, die jedes dNTP enthält (2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 nM dGTP und 2 mM dTTP), 2,5 Einheiten (0,5 μl einer 5000 Einheiten/ml-Standardlösung) Taq DNA-Polymerase (Perkins-Eimer Cetus), 1 ng Matrizen-DNA, 100 Picomol von jedem der Oligonucleotid-Primer und Wasser bis zu einem Endvolumen von 100 μl. Die Endmischung wird dann mit 100 μl Paraffinöl überschichtet. Die PCR wird unter Verwendung eines DNA-Thermozyklers (Ericomp, San Diego, CA) durchgeführt. Die Matrize wird bei 94° für 5 Minuten denaturiert und die PCR wird über 25 Amplifikationszyklen unter Verwendung eines Stufenprogranuns (Denaturierung bei 94°, 1,5 Minuten; Doppelstrangbildung bei 60°, 1 Minute; Verlängerung bei 72°, 1 Minute) durchgeführt.
  • Elektrophorese eines Aliquots des Reaktionsgemisches auf 1%-iger SeaKem-Agarose mit niedriger Schmelztemperatur (LMT) (FMC BioProducts, Rockland, ME) und die Färbung mit Ethidiumbromid macht ein einzelnes DNA-Fragment der erwarteten Größe als PCR-Reaktionsprodukt sichtbar. Das PCR-amplifizierte DNA-Fragment umfasst eine kurze Vektorsequenz, die eine Asp718-Restriktionsschnittstelle stromaufwärts einer Sequenz, die für IL-1R-Aminosäuren 1(Asp) bis 312(Thr) codiert, gefolgt von einem einzelsträngigen Segment, das für den Peptidlinker codiert, umfasst.
  • Es wird eine zweite PCR-Reaktion durchgeführt, um ein cDNA-Fragment, das für ein lösliches TNF-R-Polypeptid codiert, zu isolieren und zu amplifizieren. Die Matrize war der Vektor, der in Beispiel 5 als psolhuTNF-R Δ235/CAVNOT bezeichnet wurde, welcher ein cDNA-Insert enthält, das TNF-R-Aminosäuren –22 bis 235 von SEQ ID NO: 1 codiert. Die in der Reaktion verwendeten Primer sind:
    Figure 00400001
  • Der 5'-Primer (SEQ ID NO: 20) umfasst ein für einen Peptidlinker codierendes Segment, das zu dem Peptidlinker-codierenden Teil des SEQ ID NO: 19-Primers komplementär ist. Das Linker-codierende Segment ist gefolgt von Codons für die sechs Aminosäuren von reifem TNF-R (Leu bis Ala).
  • Der 3'-Primer (SEQ ID NO: 21) umfasst Nucleotide, die komplementär zu Nucleotiden 461–478 der TNF-R-SEQ 11 NO: 1 sind, welche Aminosäuren 103 (Tyr, Teil-Codon) bis 109 (Gln, Teil-Codon) codieren. Dieser Primer umfasst auch eine EspI-Restriktionsschnittstelle, die in diesem Teil des TNF-R-Proteins natürlich vorkommt.
  • Das PCR-Reaktionsverfahren ist genauso wie oben beschrieben. Das DNA-Fragment, das von dieser zweiten PCR-Reaktion amplifiziert wird, umfasst das oben beschriebene Linkercodierende Segment, gefolgt von einer Sequenz, die Aminosäuren 1 (Leu) bis 109 (Gln, Teil-Codon) von TNFR-R codiert. Dieses DNA-Fragment wird durch Elektrophorese, gefolgt von Ethidiumbromid-Färbung des Gels, wie oben beschrieben, sichtbar gemacht. Eine dritte PCR-Reaktion wird durchgeführt, um ein amplifiziertes doppelsträngiges DNA-Fragment, das IL-1R- und TNF-R-Sequenzen, getrennt durch die Linker-Sequenz, umfasst, zu isolieren. Die folgenden Reagentien wurden in einem 0,5 ml-Reaktionsgefäß kombiniert:
    3 μl (ungefähr 5–10 ng) des in der ersten PCR-Reaktion (oben) amplifizierten IL-1R-Peptidlinker- DNA-Fragmentes – ein 3 μl-Aliquot wird direkt von der LMT-Agarose unter Verwendung von UV-Licht, um die gewünschte Bande im Ethidiumbromid-gefärbten Gel sichtbar zu machen, mittels einer Mikropipette abgenommen.
    3 μl (ungefähr 5–10 ng) des in der zweiten PCR-Reaktion (oben) amplifizierten Peptidlinker-TNF-R- DNA-Fragmentes – ein 3 μl-Aliquot wird direkt aus der Region des LMT-Agarosegels, die die gewünschte Bande enthält, mikropipettiert.
    10 μl 10x PCR-Puffer (oben beschrieben)
    100 pmol des SEQ ID NO: 18-Oligonucleotids als 5'-Primer
    100 pmol des SEQ ID NO: 21-Oligonucleotids als 3'-Primer
    4 μl einer 2.5 mM Lösung, die jedes der vier dNTPs enthält
    0.5 μl Taq DNA-Polymerase (5 Einheiten/μl)
    Wasser bis zu einem Endvolumen von 100 μl.
  • Die PCR-Reaktionszyklen werden bei den oben angegebenen Temperaturen und Zeitspannen durchgeführt. Nach dem anfänglichen Denaturierungsschritt bilden die komplementären Peptidlinker-codierenden Segmente der zwei DNA-Fragmente Doppelstränge. Das Endprodukt der Reaktion ist ein doppelsträngiges amplifiziertes DNA-Fragment mit glatten Enden von ungefähr 1370 by Länge, das eine IL-IR-DNA-Sequenz stromaufwärts einer Sequenz enthält, die für einen Peptidlinker codiert, gefolgt von einer TNF-R-DNA-Sequenz.
  • Ein 25 μl-Aliquot dieses dritten PCR-Reaktionsgemisches wird ohne Aufreinigung mit den Restriktionsenzymen Asp718 und EspI zur Reaktion gebracht. Asp718 schneidet stromaufwärts der IL-1R-Sequenz, wie oben erläutert. EspI schneidet innerhalb der TNF-R-Sequenz, wie in 2A gezeigt und oben erläutert. Die Restriktionsendonuclease Cell II ist ein Isoschizomer von EspI und kann EspI ersetzen. Das gewünschte Fragment, auf das im Folgenden als Fragment E Bezug genommen wird, wird mittels konventioneller Verfahren wie Trennung duch Gelelektrophorese, z. B auf einem 1,0%-igen Seaplaque-Agarosegel mit niedriger Schmelztemperatur, und Isolierung der Bande, die das gewünschte Fragment darstellt, gereinigt.
  • Zwei zusätzliche DNA-Fragmente, die als F und G bezeichnet wurden, werden isoliert und mit Fragment E verknüpft, um einen Expressionsvektor zu konstruieren, der eine zweite TNF-R-Sequenz aufweist, die (über eine Peptidlinker-Sequenz) stromabwärts des oben präparierten IL-1R-Linker-TNF-R-DNA-Fragmentes damit fusioniert wird. Der daraus hervorgehende Vektor und die Positionen der darin enthaltenen Fragmente E, F und G sind in 4 dargestellt.
  • Das als F bezeichnete DNA-Fragment wird durch Verdau des Vektors, der in 3 dargestellt ist, präpariert und in Beispiel 11 mit EspI konstruiert. Ein Fragment, das einen 3'-Teil von TNF-R enthält (das sich von der in 2A gezeigten EspI-Schnittstelle bis zu einem Codon für Aminosäure 235 erstreckt), gefolgt von einer Sequenz, die für einen Gly4SerGly5Ser-Peptidlinker codiert, die von einer zweiten TNF-R-Sequenz gefolgt wird, die sich vom Codon für Aminosäure 1 (Leu) bis zu der EspI-Schnittstelle in der zweiten (stromabwärts gelegenen) TNF-R-Sequenz des Vektors aus 3 erstreckt, wird isoliert. Dieses Fragment, das ungefähr 739 Basenpaare lang ist, wird im Folgenden als Fragment F bezeichnet.
  • Fragement G, das Vektorsequenzen (einschließlich DHFR) und einen 3'-Teil einer TNF-R-Sequenz enthält, wird wie folgt aus einem „Spleiß-freien" Vektor isoliert. Der pCAV/DHFR/TNF-R-Vektor, der in Beispiel 11 hergestellt wird, enthält eine Sequenz, von der man glaubt, dass sie nachteilig für die Konstruktion von IL-1R-codierenden Vektoren ist, möglicherweise aufgrund eines kryptischen Promotors innerhalb dieser Sequenz, von dem unerwünschtes Protein in E. coli exprimiert wird. Es wurde ein Derivat von pCAV/DHFRfTNF-R präpariert, indem ein NdeUAsp 718-Vektorfragment, das die unerwünschte Sequenz enthält, durch ein NdeUAsp 718-Fragment aus dem Spleiß-freien Vektor SF CAV (ATCC 68922, oben beschrieben) ersetzt wurde. Die Konstruktion ist in 5 abgebildet.
  • SF CAV wird mit NdeI und Asp 718 (in diesem Plasmid nur einmal vorkommende Schnittstellen) verdaut, und das Fragment von ungefähr 500 bp, in 5 mit dem Buchsta ben H markiert, wird isoliert. Dem Fragment H fehlt die unerwünschte Sequenz, die sich in dem entsprechenden Fragment von pCAV/DHFR/TNF-R befindet.
  • Der in Beispiel 11 präparierte und in 5 gezeigte pCAV/DHFR/TNF-R-Vektor wird mit Asp 718, EspI und NdeI verdaut. Es wird ein Asp 718/EspI-Fragment von ungefähr 495 by isoliert (Fragment I). Ein NdeI/EspI-Fragment von ungefähr 4647 by wird ebenfalls isoliert (Fragment J).
  • Die oben präparierten DNA-Fragmente H, I und J werden unter Bildung des in 5 gezeigten Spleiß-freien Vektors SF CAV/DHFR/TNF-R zusammenligiert. Mittels konventioneller Verfahren werden E. coli-Zellen mit dem Ligationsgemisch transformiert. Plasmid-DNA wird von den Wirtszellen zurückgewonnen und das gewünschte Konstrukt wird durch Restriktionsanalyse bestätigt. Dann wird SF pCAV/DHFFt/TNf-R mit Asp718 und EspI verdaut. Das als G bezeichnete Fragment in 5 enthält Vektorsequenzen (einschließlich DHFR) und das 3'-Ende einer TNF-R-Sequenz (von der internen EspI-Schnittstelle bis zu dem Codon für Aminosäure 235, gefolgt von einem Stopp-Codon) und wird mittels konventioneller Verfahren isoliert.
  • Die oben präparierten DNA-Fragmente E, F und G werden unter Bildung des in 4 gezeigten (und mit SF CAV DHFR tri-R bezeichneten) Vektors zusammenligiert. E. coli-Zellen werden mit dem Ligationsgemisch transformiert und das gewünschte Plasmid wird wie oben beschrieben zurückgewonnen. Das Fusionsprotein, das von diesem Vektor codiert wird, umfasst (vom N- zum C-Terminus) Aminosäuren –20 bis 312 vom Typ I IL-1R (SEQ ID NO: 5); einen Gly4SerGly5Ser-Peptidlinker; Aminosäuren 1 bis 235 von TNF-R (SEQ ID NO: 1); einen Gly4SerGly5Ser-Peptidlinker; und ein zweites TNF-R-Polypeptid, das Aminosäuren 1 bis 235 von SEQ ID NO: 1 umfasst.
  • Mittels konventioneller Verfahren werden Säugerzellen mit dem Expressionsvektor transfiziert und zur Produktion des gewünschten Fusionsproteins kultiviert. Eine geeignete Säuger-Zelllinie ist eine DHFR–-Chinahamster-Ovarien-Zelllinie, die als CHO-K1 bezeichnet wird, und von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, unter der Hinterlegungsnummer CCL61 zur Verfügung steht. Die Zellen können mit dem Expressionsvektor mittels Standard-Calciumphosphat-Präzipitation transfiziert werden, wie sie im Wesentlichen von Graham und van der Eb, Virology 52: 456 (1983) beschrieben ist. Die transfizierten Zellen werden unter geeigneten konventionellen Bedingungen kultiviert, und das Vorhandensein des gewünschten Fusionsproteins im Kulturmedium wird mittels Assays wie jenen, die in Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1 beschrieben sind, bestätigt.
  • Die DNA-Sequenzierung eines wie oben beschrieben konstruierten Expressionsvektors ließ zwei Punktmutationen in den Fusionsprotein-codierenden Sequenzen erkennen, welche während der PCR aufgetreten sein konnten. Das „T" an Position 437 von SEQ ID NO: 5 (Typ I-IL-1R) war zu einem „C" verändert und das „C" an Position 687 von SEQ ID NO: 1 (TNF- R) war zu einem „T" verändert. Diese Mutationen sind still, daher ist die Aminosäure-Sequenz des IL-1R – Peptidlinker – TNF-R – Peptidlinker – TNF-R-Fusionsproteins (im Folgenden als „trimerer Rezeptor" bezeichnet) so wie oben beschrieben.
  • COS-7-Zellen wurden mit dem Expressionsvektor transfiziert und kultiviert, um die Expression des trimeren Rezeptors zu ermöglichen. Fünffach konzentrierter Überstand (der das sezernierte trimere Rezeptorprotein enthielt) wurde auf die Fähigkeit hin untersucht, die Bindung von radioaktiv-iodiertem Maus-TNFα (0,5 nM) an U937-Zellen (eine humane Monozyten-ähnliche Zelllinie, die endogene Rezeptoren für TNF trägt) zu inhibieren. Der Inhibitions-Bindungs-Assay wurde entsprechend den konventionellen Verfahren, ähnlich zu jenen, die in Beispiel 2, Abschnitt C beschrieben sind, durchgeführt. Negativ-Kontrollröhrchen (um nichtspezifische Bindung zu messen) enthielten nicht-radioaktiv-markiertes TNFα, U937-Zellen und radioaktiv-iodiertes TNFα. Positv-Kontrollröhrchen (um maximale, nicht-inhibierte Bindung von radioaktiv-iodiertem TNFα an die U937-Zellen zu messen) enthielten Bindungsmedium, U937-Zellen und radioaktiv-iodiertes TNFα. Der den trimeren Rezeptor enthaltende Überstand inhibierte ungefähr 100% der TNF-Bindung an U937-Zellen, die bei der Positivkontrolle beobachtet wurde.
  • Der fünffach konzentrierte, den trimeren Rezeptor enthaltende Überstand wurde auch auf die Fähigkeit hin untersucht, die Bindung von radioaktiv-iodiertem humanen IL-1α (0,14 nM) an EL4 6.1-Zellen, welche endogene IL-1-Rezeptoren tragen, zu inhibieren. Die EL4 6.1-Zelllinie war von einer Maus-Thyoma-Zelllinie abgeleitet, wie von MacDonald et al. (J. Immunol. 135: 3944, 1984) beschrieben. Negativ-Kontrollröhrchen (um nicht-spezifische Bindung zu messen) enthielten nicht-radioaktiv-markiertes IL-1α, EL4 6.1-Zellen und radioaktiv-iodiertes IL-1α. Positiv-Kontrollröhrchen (um maximale, nicht-inhibieree Bindung von radioaktiv-iodiertem IL-1α an die ELA 6.1-Zellen zu messen) enthielten Bindungsmedium, ELA 6.1-Zellen und radioaktiv-iodiertes IL-1α. Der den trimeren Rezeptor enthaltende Überstand inhibierte 47% der IL-1-Bindung an ELA 6.1-Zellen, die für die Positivkontrolle beobachtet wurde. Der Überstand von COS-7-Zellen, die einen monomeren löslichen Typ I-IL-1R exprimierten, der als Kontrolle untersucht wurde, inhibierte 52% der IL-1-Bindung an EL4 6.1-Zellen, die für die Positivkontrolle beobachtet wurde.
  • Vergleichsbeispiel 6
  • Fusionsprotein, das ein IL-1R-Polypeptid und ein TNF-R-Polypeptid umfasst
  • Die in Vergleichsbeispiel 5 hergestellten Fragmente E und G können zusammenligiert werden, um einen Vektor zu bilden, der eine DNA-Sequenz enthält, die für ein Fusionsprotein der Formel IL-1R – Peptidlinker – TNF-R codiert, wobei der Peptidlinker Gly4SerGly5Ser ist. IL-1R und TNF-R sind lösliche Polypeptide, wie in Vergleichsbeispiel s beschrieben. Das Fusionsprotein von Vergleichsbeispiel 5 ist aufgrund der verstärkten TNF-R-Bindung, die erreicht wird, wenn zwei anstatt eines TNF-R-Polypeptids verwendet werden, bevorzugt.
  • COS-7-Zellen werden mit dem Expressionsvektor transfiziert und kultiviert, um die Expression des IL-1R – Peptidlinker – TNF-R-Fusionsproteins zu ermöglichen. Fünffach konzentrierter Überstand (der die sezernierten Fusionsproteine enthält) wurde auf die Fähigkeit hin untersucht, die Bindung von radioaktiv-iodiertem humanen IL-1α (0,14 nM) an ELA 6.1-Zellen (eine Maus-Thyoma-abgeleitete Zelllinie, die IL-1-Rezeptoren trägt, wie in Vergleichsbeispiel 5 beschrieben) zu inhibieren. Das Verfahren des Inhibitions-Bindungs-Assays war ähnlich zu dem, der in Vergleichsbeispiel 1, Abschnitt C, beschrieben ist, und die Positiv- und Negativ-Kontrollen waren so, wie in Vergleichsbeispiel 5 beschrieben. Der Fusionsprotein-enthaltende Überstand inhibierte 53% der IL-1-Bindung an EL4 6.1-Zellen, die für die Positivkontrolle beobachtet wurde.
  • Zusätzliche Fusionsproteine
  • Der Fachmann wird anerkennen, dass die hierin offenbarten Techniken verwendet werden können, um zusätzliche erfindungsgemäße Fusionsproteine herzustellen, und zwar über jene veranschaulichenden Ausführungsformen, die in den vorstehenden Beispielen gezeigt sind, hinaus. Zum Beispiel kann der Peptidlinker verändert werden, indem ein Oligonucleotid synthetisiert wird, das für eine andere Peptidlinker-Sequenz codiert. Außerdem können alternative Fragmente der TNF-R-Proteine isoliert werden, indem PCR-Primer verwendet werden, die sich an andere gewünschte Teile der offenbarten DNA-Sequenzen anlagern und somit die Enden der gewünschten Fragmente definieren. Oligonucleotide, die verwendet werden, um ein Ende eines DNA-Fragmentes zu erzeugen (z. B die Oligonucleotide, die in Beispiel 5 verwendet sind), können variiert werden, so dass sie ein Stopp-Codon nach jeder erwünschten Aminosäure platzieren. Weiterhin wird die Wahl des Expressionsvektors von den in Erwägung gezogenen Wirtszellen abhängen.
  • Kurze Beschreibung des Sequenzprotokolls
  • SEQ 11 NO: 1 und SEQ ID NO: 2 zeigen die Nucleotid-Sequenz und die codierte Aminosäure-Sequenz einer humanen TNF-R-cDNA. Das reife Protein wird durch Aminosäuren 1– 439 definiert. Das Signalpeptid wird durch Aminosäuren –22 bis –1 definiert. Die Transmembran-Region wird durch Aminosäuren 236–265 definiert.
  • SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 zeigen die Nucleotid-Sequenz und die codierte Aminosäure-Sequenz der codierenden Region einer humanen TNF-R-cDNA. Dieses TNF-R-Protein unterscheidet sich von dem TNF-R der SEQ ID NO: 1 und 2. Das reife Protein wird durch Aminosäuren 1–415 definiert. Das Signalpeptid wird durch Aminosäuren –40 bis –1 definiert. Die Transmembran-Region wid durch Aminosäuren 172–192 definiert.
  • SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 zeigen die Nucleotid-Sequenz und die codierte Aminosäure-Sequenz einer humanen Typ I-IL-1R-cDNA. Das reife Protein wird durch die Aminosäuren 1–549 definiert. Das vorhergesagte Signalpeptid wird duch Aminosäuren –20 bis –1 definiert. Die Transmembran-Region wird durch Aminosäuren 317–336 definiert.
  • SEQ ID NO: 7 und SEQ m NO: 8 zeigen die Nucleotid-Sequenz und die codierte Aminosäure-Sequenz einer humanen Typ II-IL-1R-cDNA. Das reife Protein wird durch Aminosäuren 1–385 definiert. Das vorhergesagte Signalpeptid wird durch Aminosäuren –13 bis –1 definiert. Die Transmembran-Region wird durch Aminosäuren 331–356 definiert.
  • SEQ ID NO: 9–15 und 18–21 zeigen Oligonucleotide, die bei der Konstruktion verschiedener rekombinanter Plasmide, wie sie in den Beispielen beschrieben werden, verwendet wurden.
  • SEQ ID NO: 16 und 17 zeigen ein Oligonucleotid und die davon codierte Aminosäure-Sequenz, welche eine Gly4SerGly5Ser-Peptid-Linker-Sequenz umfasst. Dieses Oligonucleotid wird in der Vektor-Konstruktion, die in Beispiel 11 beschrieben ist, verwendet.
  • Sequenzprotokoll
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Claims (8)

  1. Fusionsprotein der Formel: TNF-R – Linker – TNF-R wobei der Linker ein Peptidlinker ist und jeder TNF-R ein löslicher TNF-R ist, der fähig ist, TNF zu binden.
  2. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei der Peptidlinker 5 bis 100 Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycin, Asparagin, Serin, Threonin und Alanin, umfasst.
  3. Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei jeder lösliche TNF-R eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 1–x und –22–x von SEQ ID NO: 1, wobei x eine ganze Zahl von 163 bis 235 ist, umfasst.
  4. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei jeder TNF-R von einer TNF-R-codierenden DNA codiert wird, die ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus DNA, die die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 gezeigte Nucleotidsequenz umfasst, und DNA, die fähig ist, unter moderat stringenten Bedingungen mit der Nucleotidsequenz von SEQ ID N0:1 oder SEQ ID NO: 3 zu hybridisieren, wobei die TNF-R-codierende DNA für ein biologisch aktives TNF-R-Polypeptid codiert.
  5. Isolierte DNA-Sequenz, die ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.
  6. Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz nach Anspruch 5 umfasst.
  7. Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins der Formel: TNF-R – Peptidlinker – TNF-R das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 6 transformiert wurde, unter Bedingungen, die eine Expression des Fusionsproteins fördern, und Gewinnen des Fusionsproteins umfasst.
  8. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und geeignete(n/s) Verdünnungsmittel, Vehikel oder Trägersubstanz.
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