FI116943B - Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaava DNA ja vektori - Google Patents

Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaava DNA ja vektori Download PDF

Info

Publication number
FI116943B
FI116943B FI944516A FI944516A FI116943B FI 116943 B FI116943 B FI 116943B FI 944516 A FI944516 A FI 944516A FI 944516 A FI944516 A FI 944516A FI 116943 B FI116943 B FI 116943B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
tnf
leu
ser
thr
pro
Prior art date
Application number
FI944516A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI944516A (fi
FI944516A0 (fi
Inventor
Craig A Smith
Original Assignee
Immunex Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immunex Corp filed Critical Immunex Corp
Publication of FI944516A0 publication Critical patent/FI944516A0/fi
Publication of FI944516A publication Critical patent/FI944516A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI116943B publication Critical patent/FI116943B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

11
Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältäv: sioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaava vektori 5 Keksinnön tausta
Useiden sytokiinien tiedetään sitoutuvan ko jen pinnalla oleviin spesifisiin reseptoriprotei Tunnistettuihin spesifisiin reseptoriproteiineihir kasvainkuoliotekijäreseptoreita ja interleukiini-10 toreita. Parhaillaan ollaan kohdistamassa runsaast varoja useiden reseptorien eristämiseen ja luonneh näiden fysiologisten tehtävien tutkimiseksi ja mahd terapeuttisten käyttömuotojen selvittelemiseksi, että potilaalle annettu liukoinen reseptori sitoo 15 nimenomaista molekyyliä, johon sen vaikutus kohdis olla mahdollista lievittää sairauksia, joissa olevalla molekyylillä on osuutta.
Kasvainkuoliotekijä-α (TNFa, josta käytetc nimitystä kakektiini) ja kasvainkuoliotekijä-β (TNF 20 käytetään myös nimitystä lymfotoksiini) ovat nis endogeenisiä erittyviä homologisia proteiineja, jot nevät käynnistämään hyvin monenlaisia toimintoja lu • · · *·!·* solutyypeissä. Näiden kahden sytokiinin rakenteell: ·* *# * * toiminnallisten ominaisuuksien suuren yhdenmukaisuu * * * 25 dosta niistä on käytetty yhteisnimitystä "TNF". On ♦ ty komplementaarisia cDNA-klooneja, jotka koodaavat •l· [Pennica, et ai., Nature 312 (1984) 724] sekä «««« [Gray, et ai., Nature 312 (1984) 721] ja jotka ovat mahdollisiksi TNF:n rakennetta ja biologisia omina . ,·, 30 koskevat jatkotutkimukset.
• · * y**·' TNF-proteiinien biologinen vaikutus soluih: 2 1 1 kaulankarsinoomahumaanisolulinjaa ME-180 [Aggarwal, Nature 318 (1985) 665], Hohmann, et ai. [J. Biol. C (1989) 14927] ovat julkaisseet tutkimusraportir
mukaan eri solutyypeissä on olemassa ainakin kaksi 5 ta solun pinnalla olevaa TNF:n reseptoria, vaikkaki TNF-R-molekyylien välinen suhde on epäselvä. Näide torien näennäinen suhteellinen moolimassa on noin kDa ja noin 55 - 60 kDa, vastaavassa järjestyksess tettuna. Solun pinnalla olevien TNF-reseptorien li 10 myös ihmisen virtsasta tunnistettu liukoisia prot jotka kykenevät sitomaan TNF:ää [Peetre, et ai., Haematol. 41 (1988) 414; Seckinger, et ai., J. E
167 (1988) 1511; Seckinger, et ai., J. Biol. C. (1989) 11966; Seckinger, et ai., GB-patenttihakemu£ 15 nro 2 218 101; Engelmann, et ai., J. Biol. Chem. 2i 11974].
Interleukiini-ΐα (IL-la) ja interlei (IL—1β) ovat kaukaisesti toisiaan muistuttavia pol^ hormoneja, joilla on keskeinen osuus immuuni- j< 20 dusvasteiden säätelyssä. Nämä kaksi proteiinia vai useisiin erilaisiin solutyyppeihin ja niillä or . biologisia aktiivisuuksia. Niissä biologisissa akti • * * sissa, joiden on katsottava johtuvan IL-la IL-lp:sta, välittyvät vaikutukset ainakin kahden s * · » : 25 plasmamembraaniin sitoutuneen reseptorin välitykse] ,,ΙΓ ka sitovat sekä IL-la:aa että IL-lp:aa. B-soluiss « tyvät IL-l:n reseptorit (näistä käytetään tässä kel· :T: nimitystä IL-l:n tyypin II reseptorit) ovat erilai T-solujen ja muiden solutyyppien pinnalla ilmentyvä . 30 reseptorit (näistä käytetään tässä keksinnössä r .·**. IL-l:n tyypin I reseptorit).
3 kahta TNF-R-polypeptidiä, jotka on liitetty kovalen yhteen tai kahteen interleukiini-l-reseptori (IL-1R peptidiin.
Reseptorit valmistetaan edullisesti fuusio 5 neina yhdistelmä-DNA-menetelmiä käyttäen. Tästä kek saadaan käyttöön fuusioproteiineja, jotka sisältäv biologisesti aktiivista polypeptidikomponenttia TNF peptidiä. Keksinnön mukainen fuusioproteiini sisält TNF-R-polypeptidiä, jotka ovat peptidikytkijäjakso: 10 tämät.
Toisessa tämän keksinnön sovellutusmuodossa proteiini sisältää TNF-R:ää ja IL-lR:ää. Fuusiop sisältää edullisesti kahta TNF-R-polypeptidiä ja j tai kahta IL-lR-polypeptidiä.
15 Tästä keksinnöstä saadaan myös käyttöön nä sioproteiineja koodaavia eristettyjä DNA-jaksoja, t DNA-jaksoja sisältäviä yhdistelmä-ilmentämisvek näitä ilmentämisvektoreita sisältäviä isäntäsoluja telmiä yhdistelmä-fuusioproteiinien valmistamisek£ 20 isäntäsoluja viljelemällä. Tästä keksinnöstä saada töön farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältäväi . esitetyn kuvauksen mukaista puhdistettua fuusiopr • ti *·\ ja sopivaa laimenninta, kantaja-ainetta tai lisä Tällaiset koostumukset ovat käyttökelpoisia kasvai • · « ί·: ! 25 tekijän tai interleukiini-1 :n välityksellä tapahtuv rauksien hoidossa, diagnoosissa ja määrityksissä.
Keksinnön mukaiselle DNA:lie on tunnusoma: mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Keksinnör selle ilmentymisvektorille on tunnusomaista, että s ; 30 tää kyseistä DNA:ta. Keksinnön mukaiselle menetelmä * * · .···. sioproteiinien valmistamiseksi tai sitä sisältävä! 4
Piirrosten pääpiirteittäinen selitys
Kuvio 1 on tyypin I humaani-IL-lR: n cDNA restriktiokartta. Kuviossa on esitetty kohdat, joi: tyt restriktioentsyymit pilkkovat cDNA:ta.
5 Kuvioissa 2A - 2B on esitetty yhden humaan kloonin osittainen cDNA-jakso ja siitä päätelty ami jakso. Nukleotidit on numeroitu translaatioon os mattoman 5'-puoleisen alueen alusta lähtien. Amino] numeroitu signaalipeptidijakson alusta lähtien.
10 tunnistettavaa signaalipeptidijaksoa edustavat am -22 - -1. Asemassa 1 oleva kypsän TNF-R-proteiinii minaalinen leusiini on alleviivattu. Aminohappoje 265 alueelta peräisin oleva selvästi tunnistettava membraanialue on myös alleviivattu. Useiden erilais 15 koisten TNF-R-molekyylien C-terminaaliset päät on : nuolella ($) . Kuviossa on myös esitetty ilment torien konstruoimiseen käytettyjen tiettyjen res endonukleaasien katkaisukohdat.
Kuvio 3 esittää plasmidivektoria, joka 20 sellaista fuusioproteiinia koodaavaa DNA-fragmentti, on kaava TNF-R-kytkijäjakso-TNF-R ja joka on kon esimerkissä 11 kuvatulla tavalla.
• * *
Kuvio 4 esittää plasmidivektoria, joka . / sellaista fuusioproteiinia koodaavaa DNA-fragmentti I · · :,:e: 25 on kaava IL-1R-kytki jäjakso-TNF-R-kytki jäjakso-Tl·
• M
···! joka on konstruoitu esimerkissä 12 kuvatulla tavaili « •.ΙΓ Kuvio 5 esittää kolmea plasmidivektoria, jo • · * V ϊ tiettyjen tämän keksinnön mukaisten vektorien, j kuvattu esimerkissä 12, konstruoimisessa olevia v< ; 30 teitä.
• Φ·
Keksinnön yksityiskohtainen selitys 5 komponentit ja IL-lR-polypeptidikomponentit (millo on käytetty) voivat olla liitetyt toisiinsa millä menetelmällä yhden polypeptidin liittämiseksi Kytkemismenetelmiin, joiden käyttö voi tulla kysy 5 kuuluvat silloitusreagenssien ja peptidikytkijä käyttö. TNF-R- ja IL-lR-polypeptidit ovat nisäkäslajeista ja ne ovat edullisesti peräisin ihm Reseptorit on edullista valmistaa fuusioprc na yhdistelmä-DNA-menetelmiä käyttäen. Tästä kek 10 saadaan käyttöön fuusioproteiineja, jotka sisältävä käiden kasvainkuoliotekijäreseptoria (TNF-R). Tämän non mukainen fuusioproteiini sisältää kahta TNF-R-tidiä ja se voidaan esittää kaavalla:
15 TNF-R-kytkij äj akso-TNF-R
jossa kytkijäjakso on peptidikytkijäjakso.
Toisessa tämän keksinnön sovellutusmuodossa proteiini sisältää TNF-R:ää ja nisäkkäiden interleu 20 reseptoria (IL-lR:ää). Tässä tämän keksinnön sovell dossa fuusioproteiini voi sisältää TNF-R-polypept , yhtä IL-lR-polypeptidiä. On edullista, että fuusio • ♦ «
nin muodostamiseksi liitetään toisiinsa kaksi TNF / / peptidiä ja yksi IL-lR-polypeptidi. Nämä kaksi TNF
• t · ··· · 25 peptidiä ovat TNF:n sitoutumisen edistämiseksi p *·.; (vastakohtana sille, että IL-1R olisi sijoitetti ..ΙΓ TNF-R-molekyylin väliin). Esimerkkejä tällaisista V * proteiineista ovat proteiinit, joita edustavat kaav
j ·*: 30 TNF-R-kytkijäjakso-TNF-R-kytkijäjakso-IL-lR
»« ·
·*·*. TL-lR-kvtki iäiaksn—TNF-R—kvtlH i äi a ksn-TNF-R
6 Näiden fuusioproteiinien kukin TNF-R-pol} komponentti kykenee sitomaan itsenäisesti kasvaj tekijää (TNF). Samoin kukin näissä fuusioproteiine: tetty IL-lR-polypeptidi kykenee sitomaan itsenäis 5 terleukiini-1:tä (IL-1:ta). Kahden peräkkäisen TNI peptidin käyttö fuusioproteiinissa on edullista si lessä, että tämä lisää TNF:n sitoutumisaffir verrattuna yhden TNF-R-polypeptidin aikaansaamaan Ί toutumiseen.
10 Sellaiset peptidikytkijäjaksot, joita voidi tää tässä keksinnössä, pitävät TNF-R-polypeptide IL-lR-polypeptidejä, milloin nämä ovat käytössä) £ riittävän suuruisen etäisyyden päässä toisistaan, € varmistaa kunkin polypeptidin laskostumisen asic 15 valla tavalla halutulle biologiselle aktiivi välttämättömiin sekundäärisiin ja tertiäärisiin ι siin. Kytkijäjakson on myös annettava TNF-R- ja IL-peptidien ekstrasellulaarisille domeeneille mahc asettua asiaankuuluvaan avaruudelliseen orientaatic 20 tai IL-1:n sitoutumiskohdan muodostamiseksi. Nämä kytkijäjaksot toimivat loitontavina osina, joidei # ,· kohtana ovat fuusioproteiinien farmaseuttisesti al· * * * TNF-R- ja IL-lR-polypeptidi komponentit. Sopivat pc • * , . dikytkijäjaksot asettuvat edullisesti (1) joustavaa » · « ···/ 25 eeseen konformaatioon, {2) niillä ei ole taipumust • * * ·*·· tää järjestynyttä sekundäärirakennetta, joka saatte ritä proteiinien funktionaalisia domeeneja, ja (3 ·.· * on mahdollisimman vähän sellaisia hydrofobisia tai sellisiä ominaisuuksia, jotka saattaisivat edistä : 30 vaikutusta proteiinien funktionaalisten domeenien ·***· Tvvoillisiin oroteiinien Dinnalle siioittuviin amir 7
Kytkijäjaksossa voidaan myös käyttää muita lähes leja aminohappoja, kuten treoniinia (Thr) ja a (Ala). Sopivat peptidikytkijäjaksot sisältävät tava aminohappoketjun, jonka pituus on edullisesti 5 -5 nohappoa ja edullisimmin 10 - 20 aminohappoa. Esi tällaisista kytkijäjaksoista ovat, mainittuihin ku rajoittumatta, (Gly4Ser)n, jossa n on 1 - 12, Gly4S( ja {Gly4SerGly5Ser)2.
TNF-R- ja IL-lR-polypeptidit 10 Tässä keksinnössä termit "interleukiini-l- riM ja MIL-1R" tarkoittavat proteiineja, jotka k sitomaan interleukiini-1 (IL-1) -molekyylejä ja nii tävänä natiivissa konfiguraatiossaan humaaniplasma niproteiineina on välittää IL-1:n antama signaali 15 Tässä keksinnössä termit "TNF-reseptori" ja "TNF- koittavat proteiineja, jotka ovat biologisesti ak siinä mielessä, että ne kykenevät sitomaan kasvai tekijää (TNF) . Näiden proteiinien natiivit meir sitoutuneet muodot välittävät samalla tavoin soluun 20 lekyylin sitoutumisesta alkunsa saaneen biologisen
Iin. TNF-R-polypeptidit voivat olla identtisiä t . laisia. Tämä sama pitää paikkansa IL-lR-polypepti< *·! * * seessä ollessa.
• · • e* Täydellisiin reseptoreihin kuuluu tavallis • · · e*V 25 gandiin sitoutuva solunulkoinen domeeni, hydr • o •••j transmembraanidomeeni, joka pysyy plasmamembraanin
Ml ···· kaksois kerroksessa, ja sytoplasminen eli solunsisä V: meeni, jonka arvellaan tuovan biologisen signaalin risoluihin solun sytoplasmassa tapahtuvien perä 30 kemiallisten reaktioiden välityksellä. Hydrofobine: :***: membraanidomeeni ί a transmembraanidomeeni s ta väli 8 naalinen osa, joka alkaa aminohaposta 1 ja päätty; membraanialuetta välittömästi edeltävään aminohapp· toplasminen domeeni on transmembraanialueesta myötä oleva osa proteiinia.
5 Niihin TNF-R-polypeptideihin, joita voidaan tämän keksinnön mukaisten fuusioproteiinien kompone kuuluu polypeptidi, joka sisältää kuvioissa 2A -tetyn jakson aminohapot 1 - 439, joka on täysiin natiivin TNF-R:n jakso. Nämä TNF-R:n DNA- ja ami 10 jaksot on myös esitetty jaksotunnisteissa nro 1 j< luttaessa käyttää signaalijaksoa voi TNF-R-polypept sisältää kuvioiden 2A - 2B mukaisen jakson aminohap 439. Se, että molekyylissä halutaan käyttää signaal on riippuvainen sellaisista tekijöistä, kuten TN F 15 peptidin asema fuusioproteiinissa sekä nisäkkäiden lijakson mahdollinen muokkautuminen aiotuissa isänt sa, mitä on tarkasteltu tuonnempana. Tämän humaani kypsä täysimittainen natiivi glykosyloitunut muoto koproteiini, jonka suhteellinen moolimassa on noin 20 daltonia (kDa). Tässä patenttiselityksessä tarkoitt "kypsä" proteiinia, jossa ei ole sitä johto- e ;naalijaksoa, jollainen voi esiintyä natiivin geeni: mittaisissa transkriptiotuotteissa. Proteiini voi i t .signaalijakson heti ilmentämisen jälkeen. Proteiini * · * 25 muodon synnyttää signaalijakson pilkkoutuminen pr «·* ···· erittyessä solusta.
··· ···· Muita sopivia TNF-R-polypeptidejä on kuvatt V: tenttihakemusjulkaisussa nro 422 339 (tästä käytetä nempana nimitystä EP-422 339), joka on liitetty kok 30 dessaan tähän keksintöön siihen oikeuttavien sä ·***· non alla. Kaksi sonivaa TNF-R-nol vnenti di ä sisältä'* 9 tinen (tämän keksinnön mukaisten) kuvioiden 2A - 2 sen aminohappojakson suhteen, lukuunottamatta si1 kypsän jakson asemassa 174 olevan metioniinin (Met) on arginiini (Arg), on kuvattu julkaisussa EP-422 3 5 on käsitelty kyseisessä julkaisussa olevassa kuvios Julkaisun EP-422 339 kuviossa 21 on kuvatt käyttökelpoisen TNF-R-polypeptidin cDNA-jakso ja tä daama aminohappojakso. Julkaisun EP-422 339 kuvioi kaisen cDNA-jakson koodaava alue ja tämän koodaam 10 happojakso on esitetty tämän patenttihakemuksen j nisteena nro 3 ja 4. Vaikkakin julkaisussa EP-422 3 proteiinista on käytetty nimitystä 30 kilodaltoni] iini, niin sen suhteellisiksi moolimassoiksi on ra muunlaisia suhteellisia moolimassoja. Esimerkiksi 15 sussa Loetscher, et ai. [Cell 61 (1990) 351] ja jul EP-417 563 on suhteellisen moolimassan raportoit! noin 55 kilodaltonia. Käyttökelpoisiin TNF-R-polyp hin sisältyvät polypeptidit, jotka sisältävät jaks teen nro 4 mukaisen jakson aminohapot 1 - 415, ta 20 taessa käyttää signaalijaksoa, jaksotunnisteen nro sen jakson aminohapot -40 - 415. Menetelmiä tämä] . proteiinin valmistamiseksi joko puhdistamalla se v tai U937-soluviljelmän kasvatusmediumista tai käy • · . ^ yhdistelmä-DNA-menetelmiä, on kuvattu julkaisu: °V 25 422 339. Tälle TNF-R:Ile on tunnusomaista N-termi M* ···; jakso (proteiinin kypsää muotoa vastaava jakso), ·«· •••2 Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-, kun taas kuvioiden 2A - 2 ***** V 2 sen TNF-R-proteiinin kypsän muodon N-terminaalinen
Leu-Pro-Ala-Gln-Val-Ala-.
5β·βϊ 30 Tietyissä tämän keksinnön sovellutusmuodoi, ·*"*· R-Dolvneotidi on liukoinen TNF-R-nolvnentidi. T.-iu ίο heti transmembraanialueen jälkeen myötäsuuntaan), j tävaikuttaa molekyylin pysymiseen solun pinnalla. ' lista, että proteiinista on poistettu koko transme alue ja sytoplasminen alue tai että ne on korvatti 5 tiilisillä aminohapoilla liukoisen TNF-R:n muodosta Liukoinen TNF-R erittyy solusta ja säilyttää halutu gisen aktiivisuuden.
Esimerkkejä liukoisista TNF-R-polypeptidei; polypeptidit, jotka sisältävät kuvion 2A mukaiser 10 aminohapot 1 - x, jossa x on C-terminaalinen amino! se on mikä tahansa kuvion 2A mukaisista aminohapois 235. Erityisiin esimerkkeihin sisältyvät polypeptid ka sisältävät kuvion 2A mukaiset hapot 1 - 163, 1 -1 - 235. Liukoinen TNF-R-polypeptidi voi lisäksi 15 signaalijakson, esimerkiksi kuvion 2A mukaiset am -22-1.
Muita esimerkkejä liukoisista TNF-R-polypep
ovat polypeptidit, jotka sisältävät kuvioiden 2A
kaisen jakson aminohapot 1 - 184 tai 1 - 182, -22 - 20 -22 - 182. Nämä proteiinit voivat sisältää aseme joko metioniinin tai arginiinin. Menetelmiin tällai , *·, R-polypeptidejä edustavien esimerkkien valmistamisi • * *
sältyvät menetelmät, jotka on kuvattu julkaisun EP
* « . . esimerkeissä 17 ja 22.
* · * • · · "V 25 Jaksotunnis teessä nro 4 esitetty TNF-R-p **· *·*· sisältää signaalipeptidin (tätä esittävät aminohap* ··· •••5 -1) ja asemassa 172 olevasta valiinista alkavan t ·«· V: braanialueen. Tämän TNF-R-proteiinin edullisiin li muotoihin kuuluvat muodot, jotka käsittävät jaksotu 30 nro 4 mukaiset aminohapot -40 - w tai 1 - w, jos ;***· alueelta 161 - 171 oleva kokonaisluku (toisin sanoe 11 tiivistä TNF-R-proteiinia, jonka C-terminaalisena a pona on aminohappo 161 (asparagiini). Lisäksi me kummankin edellä kuvatun TNF-R-proteiinin luonnoss tyvien liukoisten muotojen (toisin sanoen jaksotu 5 nro 2 ja jaksotunnisteen nro 4 mukaisten proteiin koisten muotojen) puhdistamiseksi humaanivirtsasta vattu julkaisussa Engelmann, et ai. [J. Biol. Ct (1990) 1531].
Interleukiini-l-reseptoreihin, joita voida; 10 tää tämän keksinnön mukaisten fuusioproteiinien ko teinä, kuuluvat polypeptidit, joista on tässä kek käytetty merkintöjä tyypin I IL-1R ja tyypin I] Tyypin I IL-l-reseptoreita on havaittu T-solujen ja jen muiden solutyyppien pinnalla, kun taas on olema 15 kimusraportteja tyypin II IL-l-reseptoreiden ilment B-solujen pinnalla. Silloin kun mitään erikoismerk ole käytetty, tarkoittaa termi "IL-l-reseptori" tä sinnössä yhteisesti tyypin I ja tyypin II IL-toreita.
20 Niihin IL-lR-polypeptideihin, joita voidaan tässä keksinnössä, kuuluvat tyypin I IL-lR-polyp . joita on kuvattu 14.1.1992 jätetyssä US-patenttihak
kaisussa nro 07/821 716; ja 21.12.1989 jätetyssä US
• · j e. tihakemusjulkaisussa nro 455 488; ja EP-patentti • · « *V 25 julkaisussa nro 318 296; joiden patenttiselitykset tetty kokonaisuudessaan tähän keksintöön siihen o •••j vien säännösten nojalla. Tyypin I IL-lR-humaanipr V * koodaava kloonatun cDNA:n DNA-jakso ja tämän kooda nohappojakso on esitetty tässä keksinnössä jaks 30 teissä nro 5 ja 6. Tämä proteiini sisältää 569 amin :***: joista 20 muodostaa N-terminaalisen signaalipeptid: 11 12
Aivan kuten TNF-R-polypeptidien suhteen oi: laita, voidaan tässä keksinnössä fuusioproteiineisj tää liukoisia IL-lR-polypeptidejä. Liukoisista IL-peptideistä puuttuu tavallisesti transmembraanic 5 niistä puuttuu myös edullisesti sytoplasminen
Liukoiset IL-lR-proteiinit voivat myös sisältää osa: membraanialuetta tai sytoplasmista domeenia, edel että liukoinen IL-lR-proteiini kykenee erittymään s(
Esimerkkeihin liukoisista tyypin I IL-1R-] 10 tideistä kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoit polypeptidit, jotka sisältävät aminohappojakson, j( daan kuvata jaksotunnisteen nro 6 aminohapoilla jossa x on 312 - 316 ja y on -3 - 3. Toisin sanoei minaalinen aminohappo on asemissa -3, -2, -1, 1, 15 oleva Leu-, Glu-, Ala-, Asp-, Lys- tai Cys-ryhmä, tussa järjestyksessä ilmoitettuna. Liukoisen prote: terminaalinen aminohappo on asemissa 312, 313, 314, 316 oleva Thr-, Asn-, Phe-, Gin- tai Lys-ryhmä, ma, järjestyksessä ilmoitettuna. Edullisiin liukoisiin 20 polypeptideihin kuuluvat ne polypeptidit, jotka si; jaksotunnisteen nro 6 aminohapot 1 - x, jossa x c 316.
tM
Mitkä tahansa edellä kuvatuista liukoisista • · : .·, I IL-lR-polypeptideistä voivat lisäksi sisältää s: *·· * V 25 jakson, toisin sanoen jaksotunnisteessa numero 6 ai * *“** poina -20 - -1 esitetyn signaalijakson. Vaihtoeh' ··" voidaan käyttää aiotussa isäntäsolussa toiminta! ! * * erilaista signaalijaksoa (esimerkiksi hiivan sign; soa) tuonnempana tarkasteltavalla tavalla.
30 Niitä tyypin II IL-lR-polypeptidejä, joita s.„* käyttää tässä keksinnössä, ovat polypeptidit, joitc 13 tyypin II IL-lR-humaaniproteiinien näennäinen suht moolimassa on SDS-PAGE:lla määritettynä noin tava 60 - 68 kilodaltonia. Jaksotunnisteissa nro 7 ja 8 tetty tyypin II IL-lR-humaaniproteiinia koodaavan l· 5 cDNA:n DNA-jakso ja tämän koodaama aminohappojak proteiini sisältää 13-aminohappoisen signaali]: Transmembraanialue sisältää aminohapot 331 (Ai (Met)*
Liukoiset tyypin II IL-lR-proteiinit muoc 10 deletoimalla proteiinin C-terminaalinen osa, joka välttämätön IL-l:n sitoutumiselle, niin että p erittyy solusta. Asemassa 313 olevan kysteiiniryhmä laan olevan välttämätön tyypin II IL-lR-molekyy. tiäärisen rakenteen säilymiselle sekä sille, että n 15 kykenee sitomaan IL-l:tä. Esimerkkeihin liukoisist II IL-lR-polypeptidestä sisältyvät siten polyj joissa C-terminaalinen aminohappo on mikä tahans. hapoista 314 - 333. Toisin sanoen liukoinen II sisältää jaksotunnisteessä nro 8 aminohappoina 1 20 tetyn aminohappojakson, jossa x on alueelta 314 - 3 kokonaisluku. Edullisiin esimerkkeihin sopivista . sista tyypin II IL-lR-polypeptideistä kuuluvat, tuihin kuitenkaan rajoittumatta, polypeptidit, jotk « 4 j tävät jaksotunnisteen nro 8 aminohapot 1 - x, jos * * « "V 25 330 - 333. Toisin sanoen liukoisen proteiinin **· naalinen aminohappo on asemissa 330, 331, 332 tai 3 ··· **·ί Glu-, Ala-, Ser- tai Ser-ryhmä, vastaavassa järjes V: ilmoitettuna. Liukoiset tyypin II IL-lR-polypeptidi lisäksi sisältää signaalijakson, esimerkiksi amine * 30 -13 - -1 jaksotunnisteessa numero 8 esitetyn sign ;***· son. Tuonnemnana kuvattavalla tavalla voidaan vaib 14 esimerkkien lisäksi käyttää vielä muiden liukoiste ja IL-lR-polypeptidien biologisen aktiivisuuden var seksi. Liukoinen TNF-R ja liukoinen IL-1R voidaan t (ja erottaa muista liukenemattomista membraaniin 5 neista vastineistaan) erottamalla haluttua protei: mentävät kokonaiset solut soluviljelymediumista, kiksi sentrifugoimalla, ja määrittämällä halutun pr esiintyminen mediumista (supernatantista). Määrity viljelymediuruista voidaan tehdä käyttäen menetelmi. 10 muistuttavat tuonnempana olevissa esimerkeissä k menetelmiä tai jotka ovat näiden suhteen identtis* R:n ja lL-lR:n esiintyminen mediumissa viittaa siih proteiini erittyy soluista ja on siten halutun pr liukoinen muoto.
15 TNF-R- tai IL-lR-polypeptidien N- tai C-ter sessa päässä voi esiintyä vaihtelua sellaisten te mukaan, kuten fuusioproteiinia yhdistelmä-DNA-men avulla valmistettaessa käytetty isäntäsolutyyppi tietyt nimenomaiset solut, joista proteiini puhdi 20 silloin kun kyseessä ovat TNF-R tai IL-1R, joita tuotettu yhdistelmä-DNA-menetelmillä. Tällaisen v • ,·. voidaan esimerkiksi katsoa johtuvan erilaisesta pr ··« translaation jälkeisestä muokkautumisesta erityy • · • soluissa. N- tai C-terminaalisen jakson vaihtelut • # · "V 25 myös johtua niistä oligonukleotideista, jotka ilm • u ···· vektoreita konstruoitaessa on valittu TNF-R: ää tai
Ml ···· koodaavan DNA-jakson jomman kumman tai molemman ter *.· * sen pään rekonstruoimiseksi.
Muokkauksessa esiintyvät eroavuudet voivat 30 sellaisten kypsien TNF-R- tai IL-lR-proteiinien m :***; miseen, joissa on jokin muu N-terminaalinen aminoha 15 naalisessa päässä. On lisäksi tunnettua, että sama: iinin kyseessä ollessa N- ja C-terminaalisten päiss tyy proteiinilähtömateriaalin mukaista vaihtelua. J tapauksissa voi proteiinin jommassa kummassa ter 5 sessa päässä olevan aminohapon deleetio johtua p sistä, joka tapahtuu joko solunsisäisesti tai puhd aikana. Vaihtelevat N-terminaaliset päät voivat rm tulosta signaalipeptidin pilkkoutumisesta tietyissä soluissa jostakin muusta kohdasta kuin kuvattujen 10 aminohappojen -1 ja 1 välistä.
Kuten julkaisun EP-422 339 esimerkeissä 1 sekä kuviossa 31 on kuvattu, puuttui humaanivirtsa; distetusta kypsästä TNF-R-proteiinista, jonka muo seen ei ollut käytetty yhdistelmä-DNA-menetelmiä, 15 terminaalista aminohappoa, jotka esiintyivät huma syyttityyppisestä solulinjasta U937 puhdistetussa proteiinissa, jota ei oltu valmistettu yhdiste menetelmillä. Virtsasta peräisin olevan TNF-R:n naalinen aminohappo oli jaksotunnisteen numero 1 as 20 oleva alaniiniryhmä. Julkaisussa Engelmann, et
Biol. Chem. 265 (1990) 1531], on kuvattu TNF:ää . proteiini, joka oli puhdistettu ihmisen virtsasta * * * naalisesta päästä eriasteisesti typistyneissä m . . (tätä on käsitelty tiivistelmässä ja sivulla 1 533 * · :*:e: 25 proteiinityypin N-terminaalisen pään aminohappoja ♦ ·· •••ϊ Val-Ala-Phe-Thr-Pro, joka vastaa jaksotunnisteen mukaisia aminohappoja 5-9. Proteiinin muissa m • · · %· · oli N-terminaalisena aminohappona joko fenyyli, (jaksotunnisteen nro 1 mukainen aminohappo 7) tai t : 30 (jaksotunnisteen nro 1 mukainen aminohappo 8) .
♦ ♦♦ ·'"· TNF-R- ja IL-lR-proteiinien N- ja C-termina.
16 mukainen, asemissa 1-5 oleva aminohappo. C-ternu päätä voidaan typistää tarkoituksellisesti ilmentän rien konstruoinnin aikana (esimerkiksi konstri: edellä olevan kuvauksen mukaisia liukoisia proteiir 5 daavia vektoreita) tai se voi johtua eri tavalla neesta muokkautumisesta, jossa esimerkiksi voi pois keintaan noin 5 C-terminaalista aminohappoa.
Muissa TNF-R- ja IL-lR-polypeptideissä, käyttö voi tulla kysymykseen, on haluttu biologine 10 visuus jäljellä mutta niiden jakso voi poiketa na jaksosta siinä mielessä, että natiiviin jaksoon or tai siitä on poistettu aminohappoja tai siinä aminohappo (ja) on korvattu jo (i) Häkin muulla (muil nohapo(i)11a. Tällaisten proteiinien biologinen akt 15 voidaan varmistaa tässä keksinnössä kuvattuja mä£ käyttäen.
Tässä esitetyn TNF-R:n ja IL-lR:n johda kuuluu myös useita primäärisen proteiinin erilaisi nemuotoja, joiden biologinen aktiivisuus on säilyn 20 R- tai IL-lR-proteiini voi esimerkiksi siinä olevi soituvien amino- ja karboksyyliryhmien vuoksi oli . mien tai emäksisten suolojen muodossa tai se voi c • * m traalissa muodossa. Yksittäisiä aminohapporyhmiä i * . . myös modifioida hapettamalla tai pelkistämällä.
*·*/ 2 5 Primääristä aminohapporakennetta voidaan mc • » » ··*· muodostamalla kovalenttisia tai aggregatiivisia ke 9f f teja muiden kemiallisten ryhmien kanssa, kuten gl} e ♦ + · ryhmien, lipidien, fosfaatin, asetyyliryhmien jc näitä vastaavien ryhmien kanssa. Kovalenttisia j ohe S#:|: 30 valmistetaan liittämällä tiettyjä nimenomaisia fur ·***· .lisiä rvhmi ä ami nohannoi en sivu kotini hi n tai N- ta
V
17 ta voidaan valmistaa N-terminaalisina tai C-termir fuusioina syntetoimalla viljelmissä yhdistelmä-! telmien avulla. Esimerkiksi konjugoitu peptidi 1 proteiinin N-terminaalisella alueella oleva signa 5 johto) -peptidijakso, joka translaation kanssa san sesti tai translaation jälkeen ohjaa proteiinin sid synteesipaikaltaan toimintakohtaansa solumembraan: tai ulkopuolella tai soluseinämän sisä- tai ulkc (esimerkiksi hiivan α-tekijän johtojakso). Fuusiopa 10 voivat sisältää peptidejä, joita on lisätty fuui iinin puhdistamisen tai tunnistamisen edistämisek laisiin peptideihin kuuluvat esimerkiksi poly-His t geeniset tunnistuspeptidit, joita on kuvattu US-f julkaisussa nro 5 011 912 ja julkaisussa Hopp, 15 Bio/Technology 6 (1988) 1204. Yksi tällainen pe; FLAG®-peptidi, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ( joka on erittäin antigeeninen ja josta saadaan spesifiseen monoklonaaliseen vasta-aineeseen pali sitoutuva epitooppi, jonka avulla ilmennetty yhc 20 proteiini on mahdollista määrittää nopeasti ja j vaikeuksitta. Tämä jakso pilkkoutuu myös spe£ . naudan limakalvon enterokinaasilla kohdasta, joka i • ♦ · välittömästi vierekkäisten Asp-Lys-ryhmien jälkeen.
. . proteiinit, joiden pääteryhmänä on tämä peptidi ♦ · » ***/ 25 myös olla vastustuskykyisiä solunsisäiselle pii) ·· · ·*·· selle E. colissa. Muriinihybridooma, jolle on annet tys 4E11, tuottaa monoklonaalista vasta-ainetta, jc ···
V : peptidiä DYKDDDDK tiettyjen divalenttisten metaJ
neiden läsnä ollessa (US-patenttijulkaisussa 5 011 : 30 vatulla tavalla), ja se on talletettu talletusla *»» ·***. American Tvoe Culture Collection haknnumerol 1 a HR 9 i» 1 luissa, ilmennettyjen TNF-R:n ja IL-lR:n suhteelli] limassa ja glykosyloitumistapa voi olla ilmentämi telmän mukaan samanlainen tai hieman erilainen kuii veissa molekyyleissä. Ei-glykolysoituneita proteiini 5 daan yhdistelmä-proteiinien ilmentämisestä bakte kuten E. colissa. Proteiineja, joissa on inaktivo] glykosylaatiokohtia, voidaan tuottaa oligonukleotid sillä ja ligaatiolla tai kohdemutageneesimenetelmil tä mutatoituneita proteiineja voidaan valmistaa 10 saannosta tinkimättä homogeenisessa ja vähän hiili! tia sisältävässä muodossa hiivailmentämisjärjestelm. täen. Luonteenomainen piirre eukaryoottisissa prote oleville N-glykosylaatiokohdille on aminohappot Asn-Ai-Z, jossa Ai on mikä tahansa aminohappo paits: 15 Z on Ser tai Thr. Se sivuketjun aminoryhmä, johor hydraatti liittyy kovalenttisesti, tulee tässä olevasta asparagiinista. Tämä kohta voidaan hävitt vaarnalla Asn toisella aminohapolla tai ryhmällä Z, maila Asn tai Z tai liittämällä aminohappojen Ai j 20 liin aminohappo, joka ei ole Z, tai aminohappojen A väliin jokin muu aminohappo kuin Asn. Tunnettuihin i . miin proteiineissa olevien N-glykosylaatiokohtien voimiseksi sisältyvät US-patenttijulkaisussa 5 071 t * . . julkaisussa EP-276 846 kuvatut menetelmät. Esimerkki • * m "V 25 pin II humaani - IL-1R: ssä olevista N-glykosylaatio! ··" ovat jaksotunnisteessä numero 8 olevat aminohapot ! -ΙΓ 59 - 61, 99 - 101, 206 - 208 ja 264 - 266. Tyypin : V : proteiinissa (jaksotunniste nro 6) esiintyy potent: N-glykosylaatiokohtia aminohappojen 80 - 82, 17! : 30 213 - 215, 229 - 231, 243 - 245 ja 277 - 279 k<
Kuvioissa 2A - 2B esiintvv N-alvkosvlaatiokohtia 19 seksi molekyylien renaturoituessa. Voidaan esimerk
letoida kyseiiniryhmä, joka on kuvioiden 2A - 2B
TNF-Rin jakson asemassa 178. US-patenttijulkaisu 4 518 584 on kuvattu kohdemutageneesin käyttö prot 5 olevien kysteiiniryhmien deletoimiseksi tai korvaa
Muihin lähestymistapoihin mutageneesin aikaansa liittyvät vierekkäisten kaksiemäksisten aminohapp modifiointi sellaisissa hiivajärjestelmissä tapatit' mentymisen edistämiseksi, joissa esiintyy KEX2-pr 10 aktiivisuutta. Julkaisussa EP-212 914 on kuvattu ko geneesin käyttö proteiinissa olevien KEX2-proteaas kauskohtien inaktivoimiseksi. TNF-R:n ja IL-lR:n bi aktiivisuuden säilyttämiseksi on korvaamisesta t edullisesti homologisia tai konservatiivisesti sub 15 tuja jaksoja, mikä tarkoittaa sitä, että tietty ami ryhmä korvataan ryhmällä, jolla on samantyyppiset f mialliset ominaisuudet. Esimerkkeihin konservati substituutioista kuuluvat yhden alifaattisen ryhmän minen toisella, kuten Ile:n, Valin, Leuin tai Alain 20 minen toinen toisillaan, tai yhden poolisen ryhmän minen toisella, kuten Lysin ja Argin; Gluin ja Asj . .·, Ginin ja Asm n väliset korvaukset. Tunnetaan muita *···* siä konservatiivisia korvaamisia, esimerkiksi se • * . . kokonaisten alueiden korvaamisia, joiden hydrofobi, * * * ···/ 25 naisuudet ovat samanlaisia. Lisäksi tiettyjä h **· *··* muriini- tai muiden nisäkäslajien TNF-R-molekyylien ••ΙΓ olevat tietyt nimenomaiset aminohappoeroavuudet vi *** V : muihin konservatiivisiin substituutioihin, joita tehdä TNF-Rin tai IL-lRin olennaisia biologisia omi : 30 siä muuttamatta.
·#· φ 20 tion jälkeen koodaa tulokseksi saatu rekonstruoi analogia, jossa on haluttu aminohappoinsertio, -su tio tai -deleetio.
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää oligonufc 5 kohdemutageneesimenetelmiä sellaisen muunnetun ge· kaansaamiseksi, jossa on vaaditun substituution, c tai insertion mukaiset tietyt nimenomaiset kodonit via esimerkkejä edellä kuvattujen muutosten tekemi esitetty julkaisuissa Walder, et ai. [Gene 42 (198 10 Bauer, et ai. [Gene 37 (1985) 73]; Craik [BioTec (tammikuu 1985) 12 - 19]; Smith, et ai. [Genetic ring: Principles and Methods, Plenum Press (19i soveltuvia menetelmiä on kuvattu US-patenttijulk nro 4 518 584 ja 4 737 462, jotka on liitetty tähär 15 töön siihen oikeuttavien säännösten nojalla.
Aminohappojakson variantti on edullisesti 80-%:isesti identtinen ja edullisimmin ainakin 90- identtinen natiiviin jaksoon verrattuna. Samanlad voidaan määrittää esimerkiksi vertaamalla jaksoa 20 informaatiota käyttäen GAP-tietokoneohjelman versi joka on saatavilla laitoksesta University of ft , ,·, Genetics Computer Group (UWGCG) . GAP-ohjelmassa on #·5*# netty Needlemanin ja Wunschin [J. Mol. Biol. 48 (li i t . . kohdistusmenetelmää, sellaisena kun se on uudiste • · » ···/ 25 kaisussa Smith ja Waterman [Adv. Appi. Math. 2 (19£ ·* * •••5 GAP-ohjelmassa on pääpiirteittäin esitettynä kysyit^ * · f ...: laisuuden määrittämisestä sen suhteen avulla, joka * * : jakamalla samanlaisten kohdistettujen symbolien (te noen nukleotidien tai aminohappojen) lukumäärä nii ίβ:[: 30 bolien lukumäärällä, jotka ovat lyhyemmässä näistä ***** iaksosta. Edullisiin GAP-ohielman muuttui ien oletup 21
Schwartz ja Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequ< Structure, National Biomedical Research Foundat 353 - 358 (1979); (2) 3,0:n suuruinen vähennys kust kosta ja yksi ylimääräinen 0,10:n suuruinen vähenny 5 kin aukossa olevasta kustakin symbolista; ja (3) v set jätetään suorittamatta päissä olevien aukkojen ollessa.
Edellä kuvattujen IL-lR-polypeptidien tila.
daan keksinnön mukaisesti valmistetuissa fuusioprot 10 sa käyttää muita proteiineja, jotka kykenevät estä: 1: n sitoutumisen soluissa oleviin reseptoreihin -olosuhteissa. Tällaisiin proteiineihin, joita tava nimitetään IL-l:n reseptoriantagonisteiksi, sisält; vallisesti proteiinit, joita on kuvattu julkaisuiss 15 berg, et ai. [Nature 343 (1990) 341], Hannum, [Nature 343 ¢1990) 336] ja Carter, et ai. [Nat (1990) 633], jotka on liitetty kokonaisuudessaa keksintöön siihen oikeuttavien säännösten nojali antagonistiproteiinit sitoutuvat IL-l:n reseptoreih 20 niillä ei ole IL-1:tä muistuttavaa aktiivisuutta ( välitä signaalia tai tuota muulla tavoin niitä bi . .·. vaikutuksia, jotka ovat tulosta IL-1:n sitoutumises · · jen IL-1-reseptoriin). Nämä antagonistiproteiinit k * · , . vat IL-1:n kanssa sitoutumisesta endogeenisiin • · i ***/ 25 reseptoreihin ja inhiboivat siten IL-1:n välityks* *·« pahtuvia biologisia vaikutuksia in vivo -olosuhteis;
Ml ·*·! Yhdi s telmä- f uus iopro teline j a koodaavat DNA- • · * ·.· · Tästä keksinnöstä saadaan myös käyttöön eri DNA-j aksoj a, j otka koodaavat edellä kuvattuj a f uus :#s|: 30 iineja. Kyseistä fuusioproteiinia koodaava DNA-jak: ·***: truoidaan käyttäen yhdistelmä-DNA-menetelmiä IL- 22 set ovat samassa vaiheessa, jotta mRNA:n translaat mahdollista saada yksi biologisesti aktiivinen fuus iini. Vaihtoehtoisesti voidaan IL-lR:ää koodaavan D mentin 3'-puoleinen pää ligatoida (peptidikytki 5 välityksellä) TNF-R:ää koodaavan DNA-fragmentin 5' seen päähän menetellen niin, että jaksojen luku ovat samassa vaiheessa, jotta mRNArsta on mahdollis translaatiossa yksi biologisesti aktiivinen fuusio ni. Samaan lukukehykseen voidaan ligatoida vielä y 10 R:ää koodaava jakso sellaisen jakson aikaansaamisek koodaa kahta TNF-R-polypeptidiä ja yhtä IL-lR-poly sisältävää fuusioproteiinia. IL-1R:ää koodaava jaks tetaan edullisesti TNF-R:ää koodaavaan (koodaaviin) (jaksoihin) nähden vastasuuntaan. Vaikkakin fuusiop 15 voi TNF-R-peptidin (peptidien) ohella sisältää kaht polypeptidiä, on edullista käyttää yhtä lL-lR:ää. IL-lR:stä saadaan haluttu korkean affiniteetin sitomisaktiivisuus ilman niitä mahdollisia haittoj, syntyvät toisen IL-lR:n lisäämisen aiheuttamasta fu 20 teiinin koon suurentumisesta. Tällaisiin haittoi kuulua vektorin konstruktiomenetelmien tuleminen . kaisemmiksi ja mahdollinen halutun proteiinin ilm tason pieneneminen. Toisessa tämän keksinnön sov • · . muodossa ligatoidaan TNF-R:ää koodaava DNA-jakso
**V 25 jaksoon, joka puolestaan ligatoidaan toiseen TNF-R
··· daavaan jaksoon.
—2 N-terminaalista signaalijaksoa koodaava D
V: voidaan säilyttää N-terminaalista polypeptidiä koo DNA-jaksossa, kun taas myötäsuuntaan sijaitsevan (s 30 vien) DNA-jakso(je)n läpiluvun mahdollisesti estäv; ί***: tuskodonit hävitetään. Käänteisesti pitää paikkani 23
Haluttua peptidikytkijäjaksoa koodaava D voidaan liittää TNF-R:ää tai IL-1R:ää koodaavien sojen väliin näiden kanssa samaan lukukehykseen mitä tahansa sopivaa tavanomaista menetelmää. Esi 5 TNF-R:ää tai IL-1R:ää koodaavien jaksojen väliin ligatoida kemiallisesti syntetoitu oligonukleotid koodaa kytkijäjaksoa ja joka sisältää asianmukais triktioendonukleaasin katkaisukohdat. Vaihtoehtois* kemiallisesti syntetoitu DNA-jakso sisältää jakson, 10 komplementaarinen joko TNF-R:n tai IL-lR:n 31 -p terminaalisen pään suhteen (ilman lopetuskodonia seuraa kytkijäjaksoa koodaava jakso, jonka jälkee sellainen 5'-puoleisen terminaalisen pään suhteen mentaarinen jakso, joka vastaa jompaa kumpaa prote 15 TNF-R tai IL-1R. Tämän jälkeen käytetään oligonuk kohdemutageneesia kytkijäjaksoa koodaavan jakson 1 seksi vektoriin, joka sisältää TNF-R:n ja IL-lR:r fuusion. Toisessa menetelmässä käytetään sellaisiin keillä tehtyjä polymeraasiketjureaktioita, joihin 20 peptidikytkijäjaksoa koodaavia osittain yksinauhaii menttejä. PCR:n avulla muodostetut kahta erilaista . .·. nia koodaavat DNA-fragment it voidaan liittää yhtec maila kunkin fragmentin terminaalisessa päässä « t . . yksinauhaisten kytkijäjaksoa koodaavien segmenttien i « ! *V 25 pituussuunnassa yhteen. Edullisia menetelmiä kytki ··* •••| koodaavan DNA-segmentin liittämiseksi TNF-R: n ja * · —2 DNA-jaksojen väliin (tai kahden TNF-R-DNA-jakson vä V : kuvattu tuonnempana olevissa esimerkeissä 11 ja 12.
TNF-R:ää ja IL-lR:ää koodaavia DNA-jaksoja 30 eristää millä tahansa sopivalla tavanomaisella men· :***: lä, joka soveltuu käytettäväksi tämän keksinnön ] olla haluttua esimerkiksi silloin, kun tästä on t mutantteja, joiden C-terminaaliset päät ovat typ edullisella tavalla, joista kuvaava esimerkki on t braanialueen deleetio sellaisen liukoisen reseptc 5 kaansaamiseksi, joka ei ole sitoutunut solumemfc Sopivia menetelmiä tyypin I ja tyypin II IL-lR:i kloonaamiseksi ovat menetelmät, joita on esitetty keissä 8 ja 9, vastaavassa järjestyksessä ilmoi TNF-R:n cDNA voidaan eristää menetelmillä, joihin 10 esimerkissä 3 selitetyt menetelmät.
TNF-R:n koodaava jakso voidaan hankkia eristämällä TNF-R:ää koodaava jakso yhdistelmä-cl genomin DNA-kirjastoista. cDNA-kirjasto konstruoida lisesti hankkimalla käyttöön nisäkkään TNF-R:ää il 15 polyadenyloitua mRNA:ta tietystä nimenomaisesta jasta, esimerkiksi humaanifibroblastisolulinjasta w (ATCC CCL 95.1) ja käyttämällä tätä mRNA:ta temp kaksinauhaisen cDNA:n syntetoimiseksi. Tämän jälkee nauhainen cDNA pakataan yhdistelmä-vektoriin, joka 20 isäntäsoluun (esimerkiksi asiaankuuluvaan E. col taan), jota sitten kasvatetaan. cDNA-kirjaston si , ,·, TNF-R-jaksot voidaan tunnistaa seulomalla kirjasto • * · e*". kuuluvalla nukleiinihappokoettimella, joka kykenee • * . . soitumaan humaani-TNF-R:n cDNA:hän. Toinen kloon « · ♦ I I « ··*/ 25 telmä, jota voidaan käyttää, on tuonnempana esime:
• M
·*·· kuvattu suora ilmentämismenetelmä. Vaihtoehtoisesti *·.ί TNF-R-proteiineja koodaavia DNA-molekyylejä koota V· ligatoimalla synteettisiä oligonukleotidialayksikkö ka joko kokonaisuudessaan tai osittain vastaavat k :j|i 30 2A - 2B mukaista jaksoa, täydellisen koodaavan ja] :***: kaansaamiseksi.
25 fluoresoivaa ryhmää, radioaktiivista atomia tai l· nesoivaa ryhmää, asiaankuuluvan alan ammattikoke tunnetuilla menetelmillä.
TNF-reseptoreja ja IL-l-reseptoreja > 5 useimpien nisäkäsgeenien tavoin otaksuttavasti mor set geenit. Sellaisten vaihtoehtoisten mRNA-konst den, joiden voidaan katsoa syntyneen transkription tapahtuneista erilaisista mRNA;n silmukointitapahtu joissa on siinä määrin suuria tässä keksinnössä ku 10 cDNA-molekyylien suhteen identtisiä alueita tai san alueita, että ne koodaavat biologisesti aktiivista tai IL-1R:ää, katsotaan olevan käyttökelpoisia tä niistettävien fuusioproteiinien valmistamisessa.
Liukoisia TNF-R- ja IL-lR-polypeptidejä V 15 DNA:ta voidaan valmistaa millä tahansa useista ta sista menetelmistä. Haluttua liukoista polypepti< daava DNA-fragmentti voidaan jatkokloonata ilment toriin. DNA-fragmentteja voidaan valmistaa pilkkoma simittainen kloonattu DNA-jakso restriktioendonukJ 20 ja eristää ne elektroforeesilla agaroosigeeleissä.
ehtoisesti voidaan haluttu DNA-jakso syntetoida V
m sesti tunnettuja menetelmiä käyttäen. Halutun DNA- * « « tin liittämiseksi ilmentämisvektoriin voidaan käyt • · . . triktioendonukleaasin katkaisukohdan (-kohtia) si * · t 25 kytkijäjaksoja tai fragmentti voidaan pilkkoa täs ·· ··« nostaan esiintyvistä katkaisukohdista.
Haluttua liukoista proteiinit ragmenttia V
V: DNA-jakson eristämiseen voidaan käyttää myös tunnet lymeraasiketjureaktio (PCR) -menetelmiä. Tätä menet : ·*· 30 kuvattu tuonnempana olevissa esimerkeissä.
* · « ***· Toisessa ratkaisutavassa voidaan käyttää er 26 ligatoida Bal 31:llä tehdyn pilkkomisen synr tasaisiin päihin ja jotka sisältävät restriktic leaasi(e)n katkaisukohdan (-kohtia). Vaihtoehtoise daan syntetoida oligonukleotideja, joiden avulla E 5 mentin N- tai C-terminaalinen pää voidaan rekor haluttuun kohtaan. Oligonukleotidi voi sisältää res endonukleaasin katkaisukohdan, joka sijaitsee va nassa haluttuun koodaavaan jaksoon nähden ja se voi aloituskodonin (ATG) koodaavan jakson N-terminaali 10 kohdalle.
TNF-R:n ja IL-lR:n DNA-jaksot voivat erot tunnisteissa nro 1, 3, 5 ja 7 esitetyistä DNA-ja
Esimerkiksi geneettisen koodin tunnetun degeneratii vuoksi voi samaa aminohappo jaksoa koodaavissa nul< 15 jaksoissa olla huomattavaa vaihtelua. DNA-jaksoje
kykenevät hybridisoitumaan jaksotunnisteiden nro 1, 7 mukaisiin DNA-jaksoihin kohtuullisen rajoittavi suhteissa (55 °C, 5 x SSC) ja jotka koodaavat biol aktiivista TNF-R- tai IL-lR-polypeptidiä, katsotaan 20 sä keksinnössä olevan TNF-R:ää koodaavia tai IL-1F
daavia DNA-jaksoja, mainitussa järjestyksessä ilrnoi . Natiiveihin DNA-jaksoihin voidaan tehdä tarkoitukse * · « mutaatioita, esimerkiksi edellä kuvattujen aminot stituutioiden, -deleetioiden ja -insertioiden aika • » 9 ^ 9 9 9 Σ·2 i 25 seksi. Tietyt näistä mutaatioista eivät ilmenny lop .♦ΙΓ sa proteiinituotteessa. Esimerkiksi ilmentämisen ta ..*·* seksi voidaan tehdä nukleotidisubstituutioita, joi koituksena on pääasiassa välttää silmukoiden muodc transkriptiossa syntyvän mRNA:n sekundäärirake • 30 (tätä on käsitelty julkaisussa EP-75 444, joka on .*** tähän keksintöön siihen oikeuttavien säännösten r 1 27 voi myös tapahtua vaikutuksettomia mutaatioita (Dl· muutokset, jotka eivät muuta jakson koodaamaa amd jaksoa). Yhdessä tämän keksinnön sovellutusmuodo: tetaan jaksotunnisteen numero 5 (tyypin I IL-1R) nv 5 numero 437 T:stä C:ksi. Tämä vaikutukseton muta, syntynyt polymeraasiketjureaktion aikana.
Nukleotidijaksoissa olevien mutaatioiden nollisesti oltava sellaisia, että koodaavien jaksoj kehyksen oikea vaihe säilyy. Mutaatiot eivät edu 10 muodosta komplementaarisia alueita, jotka hybric sivat ja muodostaisivat sekundäärisiä mRNA-ra)< kuten silmukoita tai hiusneularakenteita, jotka ve sivat haittaavasti fuusioproteiini-mRNArn translaat Tästä keksinnöstä saadaan siten käyttöön te 15 sinnön mukaisia DNA-jaksoja, jotka koodaavat edell tuja fuusioproteiineja, joissa fuusioproteiinin sossa oleva kukin TNF-R:n DNA-jakso on: (a) jokin s DNA-jakso, joka on peräisin nisäkkään natiivin TNF-koodaavasta alueesta (esimerkiksi jaksotunnisteide 20 1 tai 3 mukaisesta koodaavasta alueesta peräisin cDNA:sta); (b) jokin sellainen DNA-jakso, joka kyke ridisoitumaan kohdan (a) mukaiseen DNA-jaksoon k ***, sesti rajoittavissa olosuhteissa (50 °C, 2 x SSC) koodaa biologisesti aktiivista TNF-R:ää; tai (c) jc * · » ·»· · 25 lainen DNA-jakso, joka on geneettisen koodin vuok mJlV neratiivinen kohdissa (a) tai (b) määriteltyjen * sojen suhteen ja joka koodaa biologisesti aktiivi : R:ää. Fuusioproteiinin DNA-jakso voi samalla tavoi tää sellaista (sellaisia) IL-lR:ää koodaavaa (ke ♦ 30 DNA-jakso (j) a, jo(t)ka on (ovat) (a) jokin sellai ··· .···. iakso, ioka on peräisin nisäkkään natiivin IL-1 28 koodaa biologisesti aktiivista IL-lR:ää; tai (c) jo lainen DNA-jakso, joka on geneettisen koodin vuoksi ratiivinen kohdissa (a) tai (b) määriteltyjen DNA-suhteen ja joka koodaa biologisesti aktiivista IL-ll 5 Yhdistelmä-fuusioproteiinien ilmentäminen Tästä keksinnöstä saadaan käyttöön yhdistel tämisvektoreita tässä esitettyjä fuusioproteiineja van DNA:n ilmentämiseksi. Tämän keksinnön mukaisel telmä-ilmentämisvektorit ovat replikoituvia DNA-k 10 tioita, jotka sisältävät synteettisen tai cDNA:sta olevan DNA-jakson, joka koodaa yhtä edellä kuvatui; sioproteiineista ja joka on liitetty toiminnallises viin transkription ja translaation säätely-yksi Esimerkkeihin geneettisistä yksiköistä, joilla on 15 tehtävä geenien ilmentämisessä, kuuluvat transkript moottorit, operaattorit tai enhancer-jaksot, mRNA:ssa olevia ribosomin sitoutumiskohtia koodaa^ sekä asiaankuuluvat transkription ja translaation ja lopetusjaksot. Vektoriin voidaan lisäksi liitt 20 naisuus, joka antaa sille kyvyn replikoitua isänr joka tavallisesti on replikaation alkukohta, sekä s . geeni transformanttien tunnistamisen edistämiseksi, I « · «Il **·, tämisvektoreissa käytetyt säätely-yksiköt ovat tava peräisin nisäkkäiden, mikrobien, virusten tai hyö
I I I
··· · 25 geeneistä. Voidaan myös käyttää retroviruksista .•ΙΓ olevia ilmentämisvektoreita.
DNA-alueet ovat toiminnallisesti liitettyjä : ovat toiminnallisessa suhteessa keskenään. Fuusiopr koodaavan DNA-jakson sanotaan olevan liitettynä • 30 nallisesti yhteen tai useampaan edellä kuvattuun • · · ··**. yksikköön, kun fuusioproteiinin DNA-jakso osallista 29 sältää tässä esitettyä fuusioproteiinia koodaavan Isäntäsolut voidaan transformoida vieraan DNA:n tai monistustarkoituksissa tai ne voidaan trans ilmentämisvektorilla fuusioproteiinin tuottamiseksi 5 kuuluvien promoottorien ohjaamina. Sopiviin isäntä kuuluvat prokaryootit, hiivasolut tai korkeampien oottien solut. Asianmukaisia kloonaus- ja ilment toreita, jotka soveltuvat käytettäviksi bakteeri-, hiiva- ja nisäkässoluisännissä, on kuvattu t 10 Pouwels, et ai. (Cloning Vectors: A Laboratory
Elsevier, New York, 1985), jossa olevat asiaar selitykset on liitetty tähän keksintöön siihen oike säännösten nojalla. Fuusioproteiinin valmistamiseer myös käyttää soluttomia translaatiojärjestelmiä, 15 käytetään tämän keksinnön mukaisista DNA-konstri: peräisin olevia RNA-molekyylejä.
Prokaryootteihin kuuluu gramnegatiivisia t positiivisia organismeja. Prokaryoottiset ilmentän rit sisältävät tavallisesti yhden tai useamman fer 20 sesti selektoitavissa olevan markkerin, esimerkiksi siä proteiineja koodaavan geenin, joka tuottaa anti . resistenssin tai täydentää auksotrofisen kasvuvaat *··\ sekä isännän tunnistaman replikaation alkukohdan i tapahtuvan monistumisen varmistamiseksi. Esime • · · ! 25 transformaatioon soveltuvista sopivista prokaryoc * ..ΙΓ isännistä kuuluvat E. coli, bacillukset, kuten „*·* subtilis, Salmonella typhimurium ja useat Pseuc :|Γ: Streptomyces- ja Staphylococcus-sukuj en erilaiset vaikka harkinnan mukaan on mahdollista käyttää . 30 bakteereita.
• · · »u ···_ Bakteerikävttöön kävttökelooiset ilmentämis 11 30 1 vat esimerkiksi pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemica sala, Ruotsi) ja pGEMl (Promega Biotec, Madison W Nämä pBR322:n "runko,T-osat yhdistetään asiaanl· promoottoriin ja ilmennettävään rakenteelliseen 5 E. coli transformoidaan tyypillisesti pBR322:n jc silla, joka plasmidi on E. coli -lajista peräis plasmidi [Bolivar, et ai., Gene 2 (1977) 95]. sisältää ampisilliini- ja tetrasykliiniresistens^ joista saadaan käyttöön yksinkertainen keino transi 10 jen solujen tunnistamiseksi.
Yhdistelmänä kr obi-ilmentämi s vektoreissa ta\ ti käytetyt promoottorit sisältävät β-laktamaasi- 1 Iinaasi-) ja laktoosipromoottorijärjestelmän [Cl ai., Nature 275 (1978) 615; ja Goeddel, et ai., Ne 15 (1979) 544]; tryptofaani (trp) -promoottorijär~ [Goeddel, et ai., Nucl. Acids Res. 8 (1980) 4057 hakemusjulkaisu 36 776] sekä tac-promoottorin [1 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Sprin Laboratory, p. 412 (1982)]. Yhdessä erityisen käytt 20 sessa bakteeri-ilmentämisjärjestelmässä käytetään f pL-promoottoria ja lämpöindusoituvaa cI857ts-repi Niihin plasmidivektoreihin, jotka ovat saatavilla t • 9 · **\ laitoksesta American Type Culture Collection ja j sältävat λ:n PL-promoottorin johdannaisia, kuuluvat ··· * 25 di pHUB2, joka on E. coli -kannassa JMB9 (ATCC 37 pPLc28, joka on E. coli RRlrssä (ATCC 53 082).
Yhdistelmäfuusioproteiinia voidaan myös • 99 : hiivaisännissä, jotka ovat edullisesti peräisin Sac ces-lajeista, kuten S. cerevisiae. Voidaan myös • :*· 30 muiden sukujen, kuten Pichian tai Kluyveromyceksen ··· ··· is . U ή ϊ v^zAk-l-n-H f- si 1 i spsti 2 nm!n hi 31 1 alkukohdan ja selektoitavissa olevat markkerit, jo dollistavat sekä hiivan että E. colin transformaati merkiksi E. colin ampisilliiniresistenssigeenin ja visiaen trpl-geenin, josta saadaan selektiomarkker 5 mutanttikannoille, joilta puuttuu kyky kasvaa ti nissa, ja voimakkaasti ilmentyvästä hiivageenistä olevan promoottorin myötäsuuntaan olevan raker transkription käynnistämiseksi. Hiivaisäntäsolun c oleva trpl-vaurio muodostaa sitten tehokkaat 10 transformaation havaitsemiselle kasvusta ilman ti nia.
Sopiviin promoottorijaksoihin hiivavektorei luvat metallotioneiinin promoottori, 3-fosfoglysei naasin promoottori [Hitzeman, et ai., J. Biol. C 15 (1980) 2073] tai muiden glykolyyttisten entsyymien torit [Hess, et ai., J. Adv. Enzyme Reg. 7 (1968) Holland, et ai., Biochem. 17 (1978) 4900], kuten er glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin, heksok pyruvaattidekarboksylaasin, fosfofruktokinaasin, c 20 6-fosfaatti-isomeraasin, 3-fosfoglyseraattimutaasii vaattikinaasin, trioosifosfaatti-isomeraasin, fosf si-isomeraasin ja glukokinaasin promoottorit. Hiiva « « · **\ tävään ilmentämiseen käytettäväksi sopivia vektoi / / promoottoreja on lisäksi kuvattu julkaisussa R. 1 * * * 25 et ai., EP-hakemusjulkaisussa 73 657.
• 4t ··.: Edulliset hiivavektorit voidaan koota pBR322:sta peräisin olevia DNA-jaksoja E. colissa V 2 vaa selektiota ja replikaatiota varten (Ampr-geeni likaation alkukohta) sekä hiivan DNA-jaksoja, joihi : 30 vat glukoosilla repressoitavissa oleva ADH2-promoo m .**·. α-tekiiän erittymisen iohtoiakso. ADH2-oromoottori 32 jaksopeptidi edistää fuusioproteiinin erittymistä ja se pilkkoutuu tavallisesti fuusioproteiinist erittyessä. Yhtenä esimerkkinä voidaan mainita : hiivan α-tekijän johtojakso, joka ohjaa heterologis 5 teiinien erittymistä, voidaan liittää promoottorir mennettävän rakennegeenin väliin. Tätä kysymystä telty esimerkiksi julkaisuissa Kurjan, et ai., (1982) 922; ja Bitter, et ai., Proc. Natl. Ac; (1984) 5330. Johtojakso voidaan modifioida sell 10 että siinä on lähellä sen 3'-puoleista päätä yksi ampi käyttökelpoinen restriktiokohta, joiden tarke on tehdä johtojakson fuusio vieraisiin geeneihin maksi.
Sopivat hiivan transformaatiomenetelmät o’ 15 nettuja alan ammattikokemuksen perusteella. Kuvaava merkiksi soveltuva menetelmä on kuvattu julkaisussa et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 192 menetelmässä Trp+-transformantit selektoidaan selefc mediumissa, jonka koostumus on 0,67 % hiivan typ 20 ravinnetta (yeast nitrogen base), 0,5 % kasaminc 2 % glukoosia, 10 pg adeniinia millilitraa kohti . urasiilia millilitraa kohti. Edellä kuvatun ADH2- * * « a « « torin sisältävillä vektoreilla transformoituja is / / toja voidaan kasvattaa niiden ilmentämiseksi rikka • · * 25 diumissa, jonka koostumus on 1 % hiivauutetta, 2 % ··.? ja 1 % glukoosia ja jota on täydennetty 80 mikrog ..ΙΓ adeniinia millilitraa kohti ja 80 mikrogrammalla u ··· 2.2 2 millilitraa kohti. Mediumissa olevan glukoosin lopu pahtuu ADH2-promoottorin derepressio. Raakaprepar ; 30 saatavat hiivan supernatantit kootaan talteen suoda «·· .···. ja niitä pidetään 4 °C:ssa ennen iatkopuhdistusta.
* 33 käistä peräisin olevia vakiintuneita solulinjoja. keihin sopivista nisäkässolulinjoista kuuluvat apir aissolujen C0S-7-solulinjat, jotka on kuvattu jul Gluzman [Cell 23 (1981) 175], L-solut, C127-, 3T3-, 5 hamsterin munasarja (CHO)-, HeLa- ja BHK-solulinja käsilmentämisvektorit voivat sisältää yksiköitä, j tapahdu transkriptiota, kuten replikaation alkukoh mennettävään geeniin liitetyn sopivan promoottorir hancer-jakson sekä muita 51 - tai 31-puoleisia tr 10 tioon osallistumattomia vierusjaksoja ja 5'- tai 3' siä translaatioon osallistumattomia jaksoja, kuten tavat ribosomien sitoutumiskohdat, polyadenylaat silmukoinnin luovuttaja- ja akseptorikohdat ja tr tion terminaatiojaksot.
15 Selkärankaissolujen transformoinnissa käyte ilmentämisvektoreissa olevia transkription ja tran säätelyjaksoja voidaan saada käyttöön virusperäisi tömateriaaleista. Esimerkiksi tavallisesti käytet moottorit ja enhancer-jaksot ovat peräisin polyomas 20 novirus 2:sta, simian virus 40:sta (SV40) ja huma megaloviruksesta. SV4Q-viruksen genomista peräisii β· DNA-jaksoja, esimerkiksi SV40:n alkukohtaa, varh; » i · myöhäistä promoottoria, enhancer-jaksoa sekä silmuk / * ja polyadenylaatiokohtia, voidaan käyttää mater • * * ·:β: 25 josta saadaan käyttöön muut heterologisen DNA-jakso *** tämiseen vaaditut geneettiset yksiköt. Varhaiset ja ..!** set promoottorit ovat erityisen käyttökelpoisia, ke ·.· · kumpikin on saatavissa helposti viruksesta fragrr joka myös sisältää SV40:n viruksen replikaation ai • ·*; 30 [Fiers, et ai., Nature 273 (1978) 113]. Voidaan my • •f .···. tää pienempiä tai suurempia SV40:n fragmentteja 34 1 Käyttökelpoinen järjestelmä nisäkkäiden reseptori-lekyylien ilmentämiseksi pysyvästi voimakkaasti iin nä hiiren Cl27-rintarauhasepiteelisoluissa voidaan oida olennaisesti julkaisussa Cosman, et ai. [Mol.
5 23 (1986) 935] kuvatulla tavalla.
Fuusioproteiinin valmistaminen ja puhdistus Tästä keksinnöstä saadaan käyttöön menetel kuvatun yhdistelmä-fuusioproteiinin valmistamiset menetelmä käsittää sen, että mainittua fuusiopr 10 koodaavan DNA-jakson sisältävällä ilmentämisve transformoitua isäntäsolua viljellään olosuhteissa fuusioproteiinin on mahdollista ilmentyä, joka fr teiini puhdistetaan sitten soluviljelymediumeista t uutteista. Voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa pu 15 menetelmää ja paras menetelmä vaihtelee sellaisten den mukaan, joita ovat isäntäsolujen tyyppi ja se, kö haluttu proteiini isäntäsoluista vai ei. Fuusiop erittyy soluviljelymediumiin silloin, kun se heti tuttuaan on fuusioituneena isäntäsoluissa toimintak 20 signaalijaksoon tai johtopeptidiin, tai silloin, ku iini sisältää TNF-R- ja IL-lR-polypeptidien liukoi toja.
• · «
Yhdistelmäproteiinia soluviljelymediumiin • t , , vistä ilmentämisjärjestelmistä peräisin olevat sup • Ψ m ···/ 25 tit voidaan esimerkiksi aluksi konsentroida käytt.
*** ···· pallisesti saatavilla olevaa proteiinien konsentrc datinta, esimerkiksi Amicon- tai Millipore Pellicon * ** ·.· * suodatusyksikköä. Konsentraatiovaiheen jälkeen kons tia voidaan käsitellä sopivalla puhdistusmatr : 30 Sopiva affiniteettimatriksi voi esimerkiksi sisältä ***** tai IL-l:tä. Affiniteettimatriksi voidaan valmista.
11 35 tuja vasta-aineita. Proteiinit, jotka sitoutuvat Ί spesifiseen vasta-aineeseen, otetaan talteen ja £ kosketukseen liukenemattoman kantaja-aineen pinnall IL-lR:lle spesifisen vasta-aineen kanssa. Molempie 5 aineiden kanssa immunologisesti reagoivat proteii daan siten tunnistaa ja eristää. Tyypin I humaani-Π spesifinen monoklonaalinen vasta-aine on ta 13.9.1990 talletuslaitokseen American Type Culture tion hakunumerolla HB 10 556. Vaihtoehtoisesti 10 käyttää anioninvaihtohartsia, esimerkiksi matrik alustaa, jossa on ulospäin suuntautuvia dietyyliami (DEAE) -ryhmiä. Matriksit voivat olla akryyliamid roosia, dekstraania, selluloosaa tai proteiinien p misessa tavallisesti käytettyjä muita matriksit 15 Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kationinvaihto^i
Sopiviin kationinvaihtimiin kuuluvat useat erilaise nemattomat matriksit, jotka sisältävät sulfopropy karboksimetyyliryhmiä. Edullisia ovat sulfopropyyl
Fuusioproteiinikoostumuksen j atkopuhdistukseen 20 käyttää yhtä tai useampaa korkean suorituskyvyn k faasinestekromatografia (RP-HPLC) -vaihetta, joiss . #·β tään hydrofobisia RP-HPLC-mediumeja, esimerkiksi sl * * * liä, jossa on rungosta poispäin suuntautuvia mety^ * * , , tai muita alifaattisia ryhmiä.
« » ·*·β· 25 Bakteerivil jelmässä tuotettu yhdistelmä]; ·« * ···* eristetään tavallisesti suorittamalla ensin uutto •S* peistä, jonka jälkeen suoritetaan yksi tai useamp »** V : joihin kuuluvat konsentrointi, ulossuolaus ja ve sessa mediumissa suoritettu ioninvaihto- tai geel :30 exclusion) kromatografia. Viimeisinä puhdistusvaihe ·«· ·"**· daan loouksi kävttää korkean suorituskvvvn neste 1 1 36
Puhdistusta yksinkertaistaa huomattavasti s hiivan fermentaatio, joka ilmentää fuusioproteiine tyvänä proteiinina. Suurimittakaavaisesta ferment saatu eritetty yhdistelmä-proteiini voidaan puhdist 5 telmillä, jotka ovat analogiset julkaisussa Urdal, [J. Chromatog. 296 (1984) 171] kuvattujen men suhteen ja joihin sisältyy kaksi peräkkäistä käänte HPLC-vaihetta yhdistelmäproteiinin puhdistamiseksi tiivisessa HPLC-pylväässä.
10 Joitakin edellä olevia puhdistusvaiheita t kaikkia voidaan käyttää useina erilaisina yhdi olennaisesti homogeenisen yhdistelmäproteiinin aika seksi. Yhdistelmäsoluviljelmän avulla on mahdolli: mistaa fuusioproteiinia, jossa ei ole niitä konta 15 proteiineja, jotka tavallisesti liittyisivät TNF-R IL-lR:ään sellaisina kuin ne esiintyvät luonnossa omaa alkuperää edustavissa lajeissa, esimerkiksi s solueksudaateissa tai ruumiinnesteissä. Edellä ole distusmenetelmät kuuluvat myöskin niihin menetelmii 20 voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisten ei-yhd reseptorien puhdistamiseen.
, Vaihtoehtona reseptorien valmistamiselle fu
* · M
telineinä voidaan TNF-R- ja IL-lR-proteiinit valm • * . , puhdistaa erikseen ja kytkeä yhteen myöhemmin. Ί * * * ·'/ 25 useita reagensseja, jotka ovat käyttökelpoisia yhde ···* iinimolekyylin silloittamiseksi toiseen proteiini
Iin. Tähän tarkoitukseen on käytettävissä heterobi ··· ·φ* · naalisia ja homobifunktionaalisia kytkijämolekyylej on saatavilla esimerkiksi yhtiöstä Pierce Chemical ::*ί 30 Rockford, Illinois. Tällaisissa kytkijäjaksoissa < ***** funktionaalista rvhmää (esimerkiksi estereitä ia/ 37 tusreagensseista ovat N-maleimidobentsoyylisukkini esteri ja N-hydroksisukkinimidi. Reagenssi ja real· suhteet on valittava sellaisiksi, että silloitta] häiritse TNR:n tai IL-l:n sitoutumista reseptoriin 5 ja IL-lR-polypeptidit kytketään edullisesti yhdell kuvatuista peptidikytkijäjaksoista, joka toimii 1 jana. Peptidikytkijäjakso voidaan liittää TNF-R:äär lR:ään millä tahansa tavanomaisista menetelmistä, käytetty yhden polypeptidin liittämiseksi toiseen 10 kuvatut Pierce Chemical Company -yhtiöstä saatavin silloitusreagenssit kuuluvat niihin reagensseihin käyttö voi tulla kysymykseen. Peptidikytkijäjakso merkiksi tämän terminaalisiin päihin, voidaan liit nohappoja, joissa on tällaisten reagenssien kanssa 15 maan kykeneviä sivuketjuja.
Farmaseuttiset koostumukset Tästä keksinnöstä saadaan käyttöön meneteln seuttisten koostumusten valmistamiseksi, jotka si mitä tahansa edellä kuvattua fuusioproteiinia ja 20 sesti hyväksyttävää kantaja-ainetta, laimenninta t ainetta. Tällaiset kantaja-aineet, lisäaineet ja , β·β timet ovat käytetyissä annoksissa ja konsentraatio * · · **\ toksisia potilaille, joille niitä annetaan. Tällais * » , . tumukset voivat sisältää puskureita, antioksidantt • Ψ 9 ···· 25 ten askorbiinihappoa, polypeptidejä, joiden suht i«« • ••2 moolimassa on pieni (alle noin 10 ryhmää), prot ..ΙΓ aminohappoja, hiilihydraatteja, joihin kuuluvat c · sakkaroosi tai dekstriinit, kelatoivia aineita EDTAita, glutationia sekä muita stabilointiaineita : 30 aineita. Esimerkkejä asiaankuuluvista laimentimis • * · ***** neutraali puskuroitu fysiologinen suolaliuos tad 38 keissa. Annoksen määrä ja antokertojen tiheys on lisesti riippuvainen sellaisista tekijöistä kuten tavan indikaation vakavuus, haluttu vaste, potil, veydentila ja niin edelleen.
5 Sairaustiloja, joissa TNF:llä tai IL-1 osuutta, voidaan hoitaa antamalla terapeuttisesti määrä farmaseuttisen koostumuksen muodossa oleva keksinnön mukaista fuusioproteiinia potilaalle, ; tällainen sairaus. TNF:llä tai IL-l:llä sanotaai 10 osuutta sairaudessa silloin, kun TNF tai IL-1 a (suoraan tai epäsuorasti) sairauden tai pahentaa si koisia reseptoriproteiineja voidaan käyttää sit kompetitiivisesti TNF:ään tai IL-1:ään, mikä siten TNF:n ja IL-l:n sitoutumista solun pinnan reseptore 15 Terapeuttista käyttöä varten annetaan tämän non mukaisia puhdistettuja fuusioproteiineja pot joka on edullisesti ihminen, indikaation suhteen kuuluvalla tavalla annettavaa hoitoa varten. Site seuttisia koostumuksia voidaan esimerkiksi antaa 20 jektiona, jatkuvana infuusiona, antamalla niiden jatkuvasti implanteista tai käyttäen jotakin muuta , .·, menetelmää.
• « <
Farmaseuttisissa koostumuksissa käytetyn fu • * . . teiinin on oltava puhdistettua siinä mielessä, että • · * ···/ 25 proteiini ei sisällä olennaisesti mitään muita s ···· luontaisia tai endogeenisiä proteiineja ja se sisäl noin 1 massa-% tuotantomenetelmistä jäljelle jääne : teiinikontaminantteja. Tällaiset koostumukset voi1 tenkin sisältää muita proteiineja, joita on lisä : 30 bilointiaineiksi, kantaja-aineiksi, lisäaineiksi ta ;***· aikaisesti käytettäviksi terapeuttisiksi aineiksi.
39 vellaan olevan ainakin osittaisesti osuutta, joita tiloja ovat kakeksia, reumaattinen niveltulehdus, c multippeliskleroosi, keuhkotibroosi ja silikoosi se malaria, sekä allograftin ja ksenograftin hyijin-5 teishyljinnässä. On myös viitteitä siitä, että TN osuutta sepsiksessä ja septisessä sokissa. Bakteeri toksiini voi aiheuttaa sepsiksen tietyntyyppisten reiden infektoimissa nisäkkäissä ja sen arvellaan s van makrofageja tuottamaan tekijöitä, joihin sisäl 10 Folks, et ai. [PNAS USA 86 (1989) 2365], ovat ehdc että TNF-α:11a on tärkeä osuus HIV-infektion pa sissa. TNF-ot:n indusoimaa HIV:n ilmentymistä solu käytetään mallina HIV:n latenssista sen tutkimiseks latentti infektio muuttuu produktiiviseksi infektio 15 Tietyt sytokiinit (IL-1, IL-2 ja muut pesä laatiotekijät) voivat indusoida isännän tuottamaan täviä määriä TNF:ää. Kaavan TNF-R-kytkijäjakso-TNF-sia fuusioproteiineja voidaan käyttää sytokiinit liittyvien sivuvaikutusten hoitoon. Sen tärkeän 20 johdosta, joka IL-l:llä on TNF:n muodostumisessa; sekä IL-l-reseptor(e)i(t)a että TNF-reseptor(e)i(t) tavat fuusioproteiinit olla edullisia TNF:ään li * · # kliinisten indikaatioiden hoidossa.
TNF: n on raportoitu indusoivan IL-1:n eri • · 9 ·*· · 25 in vivo -olosuhteissa. Siten IL-l:n välityksellä ..ΓΓ vien sairaustilojen hoitamisessa voidaan käyttää * proteiineja, jotka sitovat sekä TNF:ää että IL-l:t •r· · keksinnön mukaisia fuusioproteiineja voidaan antaa kiksi ihmisessä esiintyvien immuunivasteiden ehkäis ; ·*; 30 koituksessa. Alloantigeenia vastaan muodostunut *#· vaste aiheuttaa useita erilaisia sairauksia tai 40 sydänsiirteet) hyljinnän ja luuydinsiirtopotilaid* teishyljintäreaktioiden kliinisessä hoidossa. IL-1 vellaan olevan tautia aiheuttava osuus allergioiss toimmuunisissa toimintahäiriöissä (kuten reumaatt: 5 veltulehdus, diabetes ja multippeliskleroosi, joi riippuvaisia T-solujen aktivaatiosta niitä antigeen taan, joita järjestelmä ei tunnista isännän omiksi neiksi.
TNFillä ja IL-l:llä on osuutta useissa sama 10 sissä sairauksissa, mikä voidaan nähdä vertaaman, esitettyjä luetteloita TNF:n välityksellä ja IL-1 tyksellä syntyvistä sairauksista. Lisäksi TNF ja I kaksi tärkeimpiin tulehduksen välittäjäaineisiin molekyyliä, jotka vaikuttavat usein yhdessä toimie 15 keksinnön mukaisten fuusioproteiinien, jotka si sekä TNF:n että IL-1:n reseptoreita, käytöstä saada etuja monien sellaisten sairauksien hoidossa, joi; TNFillä että IL-l:llä arvellaan olevan osuutta tau tymisessä.
20 Tiettyihin sovellutuksiin on tässä kuvatui sioproteiineissa edullista käyttää IL-lR:n ja TNF-koisia muotoja. Proteiinien puhdistus yhdistelmäi * * * ***. luista helpottuu, koska liukoiset proteiinit eritt . . luista. Lisäksi liukoiset proteiinit soveltuvat tav φ * * ··· · 25 ti paremmin annosteltavaksi suonensisäisesti ja ni »* · ··.! olla terapeuttista vaikutusta (IL-1:n ja/tai TNF:n ..ΙΓ nen) kiertävässä veressä. Liukoiset fuusioproteiin V : vät IL-l:tä ja/tai TNF:ää sitomalla signaalin väli solun pinnalla olevien endogeenisten IL-1:n tai Tl : 30 septorien välityksellä.
*· * .**·. Tässä kuvattuja fuusioproteiineja voida; 41
Seuraavat esimerkit on esitetty tämän k kuvaamiseksi eivätkä ne ole tarkoitettu sitä milläs rajoittaviksi.
Esimerkit 5 Esimerkki 1 TNF:n sitoutumasmääritykset A. TNFa:n ja TNFp :n varustaminen radioakti leimalla.
Yhdistelmä-humaani-TNFa:aa, joka oli sellai 10 sioproteiinin muodossa, joka sisälsi N-termina päässä olevan hydrofiilisen oktapeptidin, ilme erittyvänä proteiinina hiivassa ja se puhdistettiin teettikromatografiällä [Hopp, et ai., Bio/Techn (1988) 1204]. Puhdistettu yhdistelmä-humaani-TNFp 15 ti in yhtiöstä R&D Systems (Minneapolis, MN) . Kumpi teiini varustettiin radioaktiivisella leimalla kaupallisesti saatavilla olevaa kiinteän faasin rea Iodo-Gen'ia (Pierce). Tässä menetelmässä pipetoit Iodo-Gen'ia lasista valmistetun 10 x 75 mm:n suurui 20 putken pohjalle ja tätä inkuboitiin 20 minuuttia seoksen kanssa, jonka määrä oli 75 μΐ ja jonka k oli 0,1 M natriumfosfaatti, pH 7,4 ja 20 μΐ (2 mCi Tämän jälkeen tämä liuos pipetoitiin toiseen valmistettuun koeputkeen, joka sisälsi 5 pg TNFa !·; · 25 TNF£:ää) 45 μΐ-.ssa PBS:ää, ja sitä käsiteltiin 20 * ajan 4 °C:ssa. Reaktioseos fraktioitiin geelisuodat joka suoritettiin pakatulta tilavuudeltaan 2 ml:n ® « · : sessa Sephadex G-25:ssa (Sigma), joka oli tasapa
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 -med ; 30 joka sisälsi 2,5 % (w/v) naudan seerumialbumiini;
.·*·. 0,2 % (w/v) natriumatsidia ja 20 millimolaarista H
42 häviämistä. Spesifinen aktiivisuus rutiinipreparaat 1 x 106 cpm/mmol TNFiää.
B. Sitoutuminen kokonaisiin soluihin
Kokonaisilla soluilla tehdyt sitoutumismäc 5 suoritettiin kahdella menetelmällä. Ensimmäisessä mässä soluja kasvatettiin ensin joko suspensiossa kiksi U937) tai antamalla niiden kiinnittyä kudos maljoihin (esimerkiksi yhdistelmä-TNF-reseptoria iJ WI26-VA4- tai COS-solut). Kiinnittyneet solut poi 10 myöhemmin 37 °C:ssa 10 minuuttia kestävällä EDTA-lyllä, jossa EDTArn konsentraatio oli 5 mM. Tämän suoritettiin sitoutumismääritykset käyttäen ftalaa erotusmenetelmää [Dower, et ai., J. Immunol. 13: 751] olennaisesti julkaisussa Park, et ai. [J. Bic 15 261 (1986) 4177] kuvatulla tavalla. 125I-TNF:n epäsj sitoutuminen määritettiin siten, että määritykse 200-kertainen tai suurempi mooliylimäärä leimalla matonta TNF:ää. Sitoutumismäärityksessä käytettiin atsidia (0,2 %) inhiboimaan 125I-TNF:n sisäänottoa s 20 Toisessa menetelmässä tutkittiin sellaisten COS- jotka oli transfektoitu TNF-R:ää sisältävällä plc ja jotka ilmentävät TNF-reseptoreita pinnallaan, k **\ toa I-TNF:ää käyttäen julkaisussa Sims, et ai.
/ / 241 (1988) 585] kuvattua maljoilla tehtävää sit ···· 25 määritystä.
i·· ···: C. Kiinteän £aasin sitoutumismääritykset „15* TNF-R: n kyvystä adsorboitua pysyvästi nit * * · i toosaan humaanisolujen detergenttiuutteista ja s kuitenkin TNF:ää sitova aktiivisuus saatiin käyttö : ·*; 30 TNF-R:n havaitsemiseksi. Valmistettiin solu-uuttee .**·. tämällä solunappi kaksi kertaa omaan tilavuuteensa 43
fugoitiin 12 000 x g:n voimalla 15 minuuttia B °C
mien j a muun j ätteen poistamiseksi. Kahden mil· suuruisia eriä solu-uutteita pipetoitiin kuivien nitroselluloosamembraanien (Schleicher and Schuell 5 NH) pinnalle ja niiden annettiin kuivua. Membraane boitiin kudosviljelymaljoilla 30 minuuttia Tris:l M) puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa <
jonka pH oli 7,5 ja joka sisälsi 3 % w/v BSA
spesifisten sitoutumiskohtien tekemiseksi reagoimat 10 Tämän jälkeen membraanin päälle pipetoitiin seos, sälsi 5 x 10_11-molaartista 125I-TNF:ää PBS:n sekä BSA:n seoksessa, ja seosta inkuboitiin 2 tuntia sitä samalla ravistellen. Tämän vaiheen lopussa me pestiin 3 kertaa PBS:ssä, kuivattiin ja asetetti 15 X-Omat AR -filmille 18 tunnin ajaksi -70 °C:seen.
D. Signaalinvälittymismääritykset TNF-signaalin välittymisen inhibitioakt voidaan määrittää transfektoimalla solut yhdistein DNA-molekyyleillä, jotka koodaavat membraaniin site 20 TNF-R:ää, solun pinnalla esintyvän yhdistelmä-re ilmentymisen aikaansaamiseksi. Solut saatetaan sit . ketukseen TNF:n kanssa ja tuloksena olevat met * « · -* • · ♦ vaikutukset tutkitaan. Jos saadaan vaikutus, jonka , / sottava johtuvan ligandin toiminnasta eikä sen < « » * *··· 25 sottava johtuvan soluissa endogeenisena olevien Tl
• M
torien vaikutuksesta, niin yhdistelmä-reseptorilla ..ΙΓ naalia välittävää aktiivisuutta. Kuvaavia esimerkke 2.· · telmistä sen määrittämiseksi, onko polypeptidillä £ välittävää aktiivisuutta, on kuvattu julkaisuissa : ;*· 30 et ai., J. Exp. Med. 171 (1990) 861; Curtis, et ai
• M
.···. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 3045; Prvwes, et a 44 11 joilla on havaittava biologinen vaste TNFrää kohta, täisiin käyttää vaihtoehtona membraanin sitoutunutt telmä-TNF-R:ää ilmentävien solujen käytölle. Signa; littymisen pienentyminen lisättäessä määritykseen 1 5 TNF-R-polypeptidiä viittaa siihen, että liukoine sitoo TNF:ää, joten pienempi määrä TNF:ää sitouti pinnan TNF-reseptoreihin signaalin välittymisen miseksi.
Esimerkki 2 10 IL-l:n sitoutumismääritykset A. rIL-lp:n varustaminen radioaktiivisella i
Yhdistelmä-humaani-IL-Ιβ:aa valmistettiin mällä E. colissa ja puhdistamalla se homogeeniset kaisussa Kronheim, et ai. [Bio/Technology 4 (198i 15 kuvatulla tavalla. IL-Ιβ varustettiin leimalla Boltonin ja Hunterin di-jodi (125I) -reagenssia {New Nuclear, Glenolden, PA) . Kymmenen mikrogrammaa (0, proteiinia 10 pl:ssa fosfaatilla (0,015 mol/1) pus fysiologista suolaliuosta (PBS; 0,15 mol/1), jonka 20 7,2, yhdistettiin 10 μΐ:aan natriumboraatilla (0, puskuroitua fysiologista suolaliuosta (0,15 mol/1) , pH oli 8,5, ja tämä saatettiin reagoimaan Bolt * i « ***. Hunterin reagenssin kanssa, jonka konsentraatio o] • * , . (0,23 nmol), 12 tunnin ajan 8 °C:ssa valmistajan < * * · 25 mukaisesti. Tämän jälkeen seokseen lisättiin 30 μ] • ta ·**! senttistä gelatiinia ja 5 μΐ glysiinietyyliesteris φ.ΙΓ konsentraatio oli 1 mol/1, ja proteiini erotettiin V : mattomasta Boltonin ja Hunterin reagenssista Biog pylväässä (Biorad Laboratories, Richmond, CA) , : 30 pakattu tilavuus oli 1 ml. Leiman havaittiin rutiii *·· ;**. liittyvän 50 - 60-%:sesti. Radioaktiivisella jodilla 45 taan 17,5 kD, mikä oli yhdenmukainen tulos IL-1:11 semmin raportoitujen arvojen suhteen. Leimalla Vc proteiini oli saostettavissa yli 98-%:sesti TCA: 1 viittasi siihen, että 125I oli sitoutunut kovaler 5 proteiiniin.
B. Membrääniin sitoutuneen IL-1R:n sitoutt bitiomääxitykset "IL-1" tarkoittaa yhteisesti IL-la:aa ja 1 Xnhibitiovakio IL-lR-proteiinin sitoutumiselle voic 10 rittää sitoutumisinhibitiomäärityksillä, joissa k kilpailevan molekyylin (IL-lp:n tai IL-la:n) vai konsentraatioita, joita molekyylejä inkuboidaan se jossa on vakiomäärä radioaktiivisella leimalla vai IL-1β:aa tai IL-la:aa ja IL-lR:ää ilmentävä soluja. 15 leva yhdiste, jota ei ole varustettu radioakti leimalla, sitoutuu reseptoriin ja estää radioakti leimalla varustetun ligandin sitoutumisen reseptor toutumismääritykset suoritettiin käyttäen ftalas erotusmenetelmää olennaisesti julkaisuissa Dower, 20 J. Immunol. 132 {1984) 751 ja Park, et ai., J. Bic 261 (1986) 4177 kuvatulla tavalla. Tämä tehtiin e teittäin siten, että membraaniin sitoutunutta yhc I * « IL-lR:ää ilmentäviä isäntäsoluja inkuboitiin kuusi »M » , . silla levyillä (Costar, Cambridge, MA) 4 °C:ssa ka • | 9 *··β· 25 tia käyttäen 125I-IL-ip: aa 1 mlrssa sitoutumia •••Ϊ [Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 -mediu * .·!:* oli yhdistetty 2 % BSA:ta, Hepes-puskuria, jonka V : traatio oli 20 mM ja 0,1 % natriumatsidia, ja jonk 7,2]. Seokseen oli lisätty natriumatsidia, joka oli j ·*: 30 tettu inhiboimaan 125I-IL-l:n joutumisen solujen s ·#· .*·*. sen oilkkoutuminen soluissa 37 °C:ssa. Levviä ink 46 r ftalaattia. Käytettiin myös kontrollikoeputkia, jo spesifisen sitoutumisen määrittämiseksi sisälsivät täisen mooliylimäärän leimalla varustamatonta IL-Ιβ toutunutta 125I-IL-l:tä sisältävät solut erotettiin 5 mattomasta 125I-IL-1:stä sentrifugoimalla seoksia 5 tia 15 000 x g:n voimalla Eppendorf Microfuge1ssa. liittynyt radioaktiivisuus määritettiin sitten gam jalla.
C. Liukoisen IL-lR:n sitoutumisinhibitiomää 10 Inhibitiovakio liukoisen humaani-IL-lR:n si selle voidaan määrittää sitoutumisinhibitiomäärit jossa käytetään vaihtelevia konsentraatiota IL-Ιβ:: kilpailevaa yhdistettä, joita inkuboidaan seoksess on vakiomäärä radioaktiivisella leimalla varustett 15 lp:aa ja tyypin II IL-lR:ää ilmentäviä CB23-soli stein-Barrin viruksella transformoitu napaveren syyttisolulinja). Määrityksissä, joihin liittyy 1 tyypin I IL-lR:n käyttö, voidaan CB23-solujen tilal tää endogeenisiä tyypin I IL-l-reseptoreita ilment 20 lulinjaa. Sitoutumismääritykset suoritettiin käytt< laattiöljyerotusmenetelmää olennaisesti julkaisuiss , et ai., J. Immunol. 132 (1984) 751 ja Park, et
Biol. Chem. 261 (1986) 4177 kuvatulla tavalla. Tämä # . pääpiirteittäin siten, että CVI-EBNA (nisäkäs) * * * *··* 25 transfektoitiin esimerkissä 10 kuvatulla tavalla ·· ♦ ···! misvektorilla pDC406, joka sisälsi liukoista tyypii ..!Γ maani-IL-lR:ää koodaavaa cDNA:ta. Soluista saadut *·» V : natantit koottiin talteen kolme päivää transfektion ja niistä tehtiin sarjalaimennokset sitoutumism : 30 [Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 -medi' ··· ·***. sisälsi 2 % BSA:ta, Hepes-puskuria, jonka konsentra 47 11
Kahdet rinnakkaiset 60 μ1:η suuruiset erät ink seoksia pipetoitiin sitten polyeteenistä valmist sentrifugipytkiin, joissa oli 1,5 osaa dibutyylift ja 1 osa bis(s-etyyliheksyyli)ftalaattia sisältää 5 laattiöljyseosta. Sarjassa käytettiin myös nega kontrollikoeputkea, joka sisälsi epäspesifisen site määrittämiseksi (100-%:inen inhibitio) leimalla va tonta IL-ip:ää, jonka konsentraatio oli 3 x 10"δ M, trol li koeputkea, joka maksimaalisen sitoutumisen rr 10 miseksi sisälsi 50 ml sitoutumismediumia, jossa oli taan radioaktiivisella leimalla varustettua IL-Ιβ toutunutta 125I-IL-lp:aa sisältävät solut erotettii tumattomasta 125I-IL-ip:sta sentrifugoimalla seoksi nuuttia 15 000 x g:n voimalla Eppendorf Microf 15 Supernatantit, jotka sisälsivät soluihin sitout 125I-IL-ip:aa, heitettiin pois ja solut huuhdottiin ti jääkylmällä sitoutumismediumilla. Soluja ink seoksessa, joka sisälsi 1 ml trypsiinin ja EDTA:n 37 °C:ssa 15 minuuttia ja ne koottiin sitten talt· 20 luihin liittynyt radioaktiivisuus määritettiin sit malaskijalla. Liukoisen IL-1R;n kyky inhiboida IL-, toutumista endogeenisiin solureseptoreihin voidaan • « t **\ tää samalla menetelmällä. Analogisia menetelmiä * « , . käyttää määrityksissä, joihin liittyy liukoisen * * * *··/ 25 käyttö.
• » 9 ··· Esimerkki 3 ^ ·
Humaani - TNF-R- cDNA: n eristys ilmentämällä a V : ta proteiinia suoraan COS-7-soluissa TNF-R:n ilmentymistä koskeva seulonta suor : 30 useille erilaisille humaanisolulinjoille käyttäen p
**'· na niiden kykyä sitoa 1251-leimalla varustettua TN F
48 (Ka = 1 x ΙΟ10 M-1) ja 15 000 matala-affiniteettist; (Ka = 1 x 108 M-1) solua kohti.
Valmistettiin koon suhteen jaottelematon c jasto käyttäen sellaisesta totaali-RNA:sta eristet 5 adenyloidun mRNA:n käänteistranskriptiota, joka oli kermesmarjän mitogeenin läsnä ollessa kasvatetuis VA4 -humaanifibroblastisoluista vakiomenetelmiä [Gubler, et ai., Gene 25 (1983) 263; Ausubel, et ai Current Protocols in Molecular Biology, Voi 1, 10 Solut koottiin talteen hajottamalla solut guanidii kloridiliuoksessa ja kokonais-RNA eristettiin aiemrr tulla tavalla [March, et ai., Nature 315 (1985) 641 Poly-A+-RNA eristettiin oligo-dT-sellulooss grafiällä ja kaksinauhainen cDNA valmistettiin mer 15 lä, joka oli samanlainen kuin julkaisussa Gubler ja [Gene 25 (1983) 263] kuvattu menetelmä. Tämä pääpiirteittäin siten, että poly-A+-RNA muunnett: cDNA-hybridiksi käänteistranskriptaasilla käyttäen na oligo-dT:tä. Tämän jälkeen RNA-cDNA-hybridi muu 20 kaksinauhaiseksi cDNArksi käyttäen RNaasi H:ta yhde polymeraasi I:n kanssa. Tulokseksi saadun kaksin , .·. cDNA:n päät tasoitettiin käyttäen T4:n DNA-polyn • « f Päistään tasoitettuun cDNA:hän lisättiin EcoRI-kyt » · ( „ soadapterit (nämä sisälsivät sisäiset Notl-kohdat t t t ···/ 25 fosforyloitiin ainoastaan toisesta päästä (Invi ··« ···· Kytki jä-adapteri jaksot sisältävä cDNA käsitelti polynukleotidikinaasilla kytki jä-adapteri jakson 5' ··· ·.* · sen vapaaksi jääneen alueen fosforyloimiseksi ja li mattomat kytkijäjaksot poistettiin suorittamalla 30 käsittely Sepharose CL4B -pylväässä. Kytki jä-a jaksoilla varustettu cDNA liqatoitiin EcoRI:lla pi 49 genssipakkausta rekombinanttikirjaston aikaansa {Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA) .
nanttien lukumäärää lisättiin edelleen maljaamalJ
E. coli -kannan c600(hfl“) bakteerikasvuston pinnal] 5 Faagi-DNA puhdistettiin tulokseksi saadusta cDNA-kirjastosta ja cDNA-liitosjaksot irrotettiin maila restriktioentsyymillä Notl. Pilkotulle seokse roosigeelissä tehdyn elektroforeesin jälkeen eri yli 2 000 ep:n suuruiset cDNA-molekyylit.
10 Tulokseksi saadut cDNA-molekyylit ligatoiti ryoottiseen ilmentämisvektoriin pCAV/NOT, joka oli teltu nisäkässoluihin transfektoituna ilmentämään m kaiseen kloonauskohtaansa liitettyjä cDNA-jaksoja.
oli koottu pDC201:n [pMLSV:n johdannainen, joka on 15 aiemmin julkaisussa Cosman, et ai., Nature 312 (198 SV40:n ja sytomegaloviruksen DNA:sta ja se sisält; skription suunnassa replikaation alkukohdasta lu peräkkäiset jaksot, jotka ovat: (1) SV40-jaksot, jo peräisin koordinaateista 5 171 - 270 ja joihin kuul 20 plikaation alkukohta, enhancer-jaksot ja varhainen häinen promoottori; (2) sytomegaloviruksen jaksot, . ·. kuuluvat promoottori- ja enhancer-alueet (nukleotid • · · +63 jaksosta, joka on julkaistu julkaisussa Boecl· , , ai. [Cell 41 (1985) 521]; (3) adenovirus-2:n jakso' • · · :*·/ 25 sisältävät ensimmäisen eksonin ja osan intronia, ««· ···· jaitsee kolmiosaisen johto jakson ensimmäisen ja to: m.lV sonin välissä, toisen eksonin ja osan kolmiosaisei ««· : jakson kolmatta eksonia sekä monipaikkaisen kloona (MCS) , joka sisältää kohdat Xholrlle, Kpnl:lle, S: •i*· 30 NotI:lle ja Bgll:lle; (4) SV40:n jaksot, jotka c ·***· räisin koordinaateista 4 127 - 4 100 ja 2 770 - 2 50 keen tulevat alueilta 4 363 - 2 486 ja 1 094 - 37 pBR322:n jaksot, jotka sisältävät ampisilliinire sigeenin ja replikaation alkukohdan. pCAV/NOT on ts talletuslaitokseen American Type Culture Collectior 5 merolla ATCC 68 014.
Tulokseksi saatua pCAV/NOT:ssa olevaa W1 cDNA-kirjastoa käytettiin E. coli kannan DH5a trar miseen ja rekombinantit maljattiin, jotta saataisii noin 800 pesäkettä maljaa kohti ja riittävä määrä 10 yhteensä noin 50 000 pesäkkeen aikaansaamiseksi ε kohti. Pesäkkeet kaavittiin kultakin maljalta, yhdi ja kustakin yhdistetystä preparaatista valmistettu midi-DNA. Tämän jälkeen yhdistettyä DNA:ta ka transfektoimaan lähes konfluentti kerros apinan CO£ 15 ja käyttäen DEAE-dekstraania, jonka jälkeen suor käsittely klorokiinilla julkaisuissa Luthman, et ai Acids Res. 11 (1983) 1295] ja McCutchan, et ai. [
Cancer Inst. 41 (1986) 351] kuvatulla tavalla. Tä keen soluja kasvatettiin viljelmässä kolme päivä; 20 tarkoituksena oli saada liitetyt jaksot ilmentymä aikaisesti. Kolmen päivän kuluttua soluviljelmien . .·. tantit heitettiin pois ja kullakin maljalla olevis • # t solukerroksista määritettiin niiden kyky sitoa TNF: * ψ „ . telien tässä seuraavalla tavalla. Kuhunkin maljaa • * » *·*/ 25 tiin kolme millilitraa sitoutumismediumia, joka ··· •••j l25I-leimalla varustettua Flag®-TNF:ää, jonka konse •••J oli 1,2 x 10" M, ja maljoja inkuboitiin 4 °C:ssa **· * nuuttia. Tämän jälkeen tämä medium heitettiin pois maljoista pestiin kerran kylmällä sitoutumisme imZ*: 30 (tämä ei sisältynyt lainkaan leimalla varustettua ;***? ia kaksi kertaa kvlmällä PBSrlla. Tämän iälkeen kun 1 · 51 tetuilla filmeillä tummana kohteena suhteellisen yl· taustaa vasten.
Kun kirjastosta oli seulottu tällä ta va, 240 000 rekombinanttia, havaittiin, että yhdestä t 5 tanttiyhdistelmästä saatiin TNF:ää sitovia kohteit olivat selvästi näkyvissä taustan valottumista Tämän jälkeen käytettiin positiivisesta yhdistelm raisin olevaa pakastettua bakteerikantapreparaatt laisten maljojen valmistamiseksi, jotka sisälsivät 10 pesäkettä. Näistä maljoista tehtiin kopiokappalee selluloosasuodattimille, jonka jälkeen maljoilta ka materiaalia, valmistettiin plasmidi-DNA ja tämä t toitiin edellä kuvatulla tavalla positiivisen mal nistamiseksi. Tämän maljan nitroselluloosakopiosta 15 olevista yksittäisistä pesäkkeistä saatuja bakteer vatettiin 0,2 ml:n suuruisissa viljelmissä, joita tiin sitten sellaisen plasmidi-DNA:n valmistamise transfektoitiin COS-7-soluihin edellä kuvatulla Tällä tavoin eristettiin yksi klooni, joka kykeni 20 saamaan humaani-TNF-R:n ilmentymisen COS-soluiss
TNF-R-cDNA:ta sisältävä ilmentämisvektori pCAV/NOT
# t.t letettu talletuslaitokseen American Type Culture j”. tion, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, Ui
. / numero 68 088) ja sille on annettu nimitys pCAV/NOT
·** · 25 Esimerkki 4 ·· · ···· Liukoista huTNF-RA235: tä koodaavien cDNA- ...: lien konstruktio ··· V * Konstruoitiin cDNA, j oka koodaa liukoist.
RA235:ttä. Tämän molekyylin koodaama proteiini : :*j 30 kuvion 2A mukaisen aminohappo jakson -22 - 235. Sigr *·· ·**·. son muokkauksesta svntvv nroteiini, nolla on kuvio 52 transmembraani alueesta 5' -puoleiseen suuntaan. TIS sojen 3'-puoleisen pään uudelleenkonstruoimiseksi s tiin kaksi oligonukleotidia ja ne liitettiin pit nassa yhteen oligonukleotidikytkijäjakson muodosta 5 joka on: jaksotunniste nro 9 Pvu2 BamHl Bgl2
CTGAAGGGAGCACTGGCGACTAAGGATCCA 10 GACTTCCCTCGTGACCGCTGATTCCTAGGTCTAG
AlaGluGlySerThrGlyAspEnd Tässä oligonukleotidikytkijäjaksossa on terminaalis ja Bgl2-restriktiokohdat, se muodostaa uudelleen 15 kaksikymmentä nukleotidia, minkä jälkeen tulee terir kodoni (alleviivattuna) ja BamHl-restriktiokohta käyttökelpoinen eristettäessä kokonainen liukoine pilkkomalla Notl:n ja BamHl:n seoksella). Tämä olig tidi ligatoitiin sitten 840 ep:n suuruisen Notl/Pvu 20 liitosjakson kanssa Bgl2:n ja Notlrn seoksella pi pCAV/NOT:hen plasmidin psolhuTNF-RA235/CAVNOT aika , ,·, seksi, joka transfektoitiin COS-7-soluihin edellä k > ^ t tavalla. Tämä ilmentämisvektori indusoi sellaisen 1 • * . . humaani-TNF-R:n ilmentymisen, joka kykeni sitomaan 1 * * # ··/ 2 5 Esimerkki 5 •••| Liukoista huTNF-RA185: tä koodaavien cDNA- **** lian konstruktio
: Konstruoitiin sellaista liukoista huTNF-R
koodaava cDNA, jolla on kuvion 2A mukaisten kohti* 30 185 välinen aminohappo jakso (tai aminohapot 1 - ] ·**"· naali jakson muokkautumisen jälkeen asiaankuuluvassa 11 53 237 nukleotidiä transmembraanialueesta 5'-puoleise' taan. Syntetisoitiin oiigonukleotidikytkijajaksot olivat: 5 Jaksotunniste nro 10
Bgl2 5'-GATCTGTAACGTGGTGGCCATCCCTGGGAATGCAAGCATGGATGC-3 ACATTGCACCACCGGTAGGGACCCTTACGTTCG IleCysAsnValValAlalleProGlyAsnAlaSerMetAspAla 10
Jaksotunniste nro 11
Notl 5'- AGTCTGCACGTCCACGTCCCCCACCCGGTGAGC -3’ TACCTACGTCAGACGTGCAGGTGCAGGGGGTGGGCCACTCGCCGG 15 ValCysThrSerThrSerProThrArgEnd
Edellä olevat oligonukleotidikytkijäjaksot kons uudelleen reseptorimolekyylin 3'-puoleisen pään n diin 708 asti, jota seuraa terminaatiokodoni (ali 20 tu). Nämä oligonukleotidit ligatoitiin sitten suuruisen Notl-TNF-R-liitosjakson kanssa Notl:lla . tuun pCAV/NOT: hen, minkä tuloksena saatiin ilment « · « ”m\ tori psolTNFRA185/CAVNOT, joka transfektoitiin COS- • » . . hin edellä kuvatulla tavalla. Tämä ilmentämisvekto * * ♦ •·\· 25 soi liukoisen humaani-TNF-R:n ilmentymisen, jolla sitoa TNF:ää.
M* *··Γ Esimerkki 6 *.· · Liukoista huTNF-RA163: a koodaavien cDNA-mol konstruktio
: 30 Konstruoitiin sellaista liukoista huTNF
·** :***? koodaava cDNA, iolla on kuvion 2A mukaisten kohti· 54 1
Bgl2 Notl
Jaksotunniste nro 12 5’-GATCTGTTGAGC -3'
ACAACTCGCCGG
5 IleCysEnd Tämä edellä oleva oligonukleotidikytkijäjakso k uudelleen reseptorimolekyylin 3'-puoleisen pään n diin 642 asti {aminohappo 163), ja tämän jälkeei 10 terminaatiokodoni (alleviivattu). Tämä oligonukleo gatoitiin sitten 640 ep:n suuruisen Notl-TNF-R-liit kanssa Notl·:11a pilkottuun pCAV/NOT:hen, minkä t saatiin ilmentämisvektori psolTNFRA163/CAVNOT, jok fektoitiin COS-7-soluihin edellä kuvatulla taval^ 15 ilmentämisvektori indusoi liukoisen humaani-TNF-R:; tymisen, jolla on kyky sitoa TNF:ää esimerkissä 1 k sitoutumismäärityksessä.
Esimerkki 7
Liukoista huTNF-RAl42:ta koodaavien cDNA~ 20 lien konstruktio
Konstruoitiin liukoista huTNF-RA14 2;t a . cDNA (tällä on kuvion 2A mukaisten kohtien -22 - 1 • a · nen aminohappojakso {kohtien 1 - 142 välinen jakso * a . . lijakson muokkautumisen jälkeen), pilkkomalla pCAV/ • · · ···/ 25 R:sta 550 ep:n suuruinen fragmentti restriktioents • »« ••j Notl ja AlwNl. AlwNl: n katkaisukohta on TNF:n koo alueella nukleotidin 549 kohdalla. Syntetisoitiin o V : leotidikytkijäjaksot, jotka olivat: : 30 Jaksotunniste nro 13 ;·*** Bgl2 Notl 55 Tämä edellä oleva oligonukleotidikytkijäjakso k uudelleen reseptorimolekyylin 3’-puoleisen pään r diin 579 asti (aminohappo 142), jota seuraa termin doni (alleviivattu). Tämä oligonukleotidi ligatoit 5 ten 550 ep:n suuruisen Notl/AlwNl-TNF-R-liitosjakso Notl/Bgl2:11a pilkottuun pCAV/NOT:hen, minkä t saatiin ilmentämisvektori psolTNFRA142/CAVNOT, jok fektoitiin C0S-7-soluihin edellä kuvatulla taval-ilmentämisvektori ei indusoinut sellaisen liukoise 10 ni-TNF-R:n ilmentymistä, joka olisi kyennyt TNF:ää. Arvellaan, että tämä tietty nimenomainen k tio ei kyennyt ilmentämään biologisesti aktiivi; R:ää, koska yksi tai useampi välttämättömistä kyste mistä (esimerkiksi Cys157 tai Cys163), jotka tarvita 15 kyylin sisäiseen sitoutumiseen (TNF-R-molekyylin as luvan tertiäärisen rakenteen muodostamiseksi) oli e tunut.
Esimerkki 8
Tyypin I humaani-IL-1R: n cDNA-kloonien eris 20 cDNA, joka koodaa tyypin I humaani-IL-1R- nia, eristettiin hybridisoimalla koettimeen, joka . ,·. räisin tyypin I muriini-IL-lR:n cDNA:sta. Tämän mur * · · lR:n cDNA:n kloonaus on kuvattu julkaisun EP-318 ; • * • · merkissä 4. Muriini-cDNA:n sisältävä vektori on ta • · * *··/ 25 19.11.1987 talletuslaitokseen American Type Culture tion nimityksellä GEMBL78 ja sille on annettu ha AT CC 67 563.
·*** V · Tämän talletetun muriinikloonin 78 2 356 e (ep) suuruinen fragmentti eristettiin julkaisussa 30 ai. [Science 241 (1988) 585] kuvatulla tavalla ja s :***· tettiin radioaktiivisella leimalla käytettäväksi ko 56 11 Tätä koetinta käytettiin seulontaan, jossa IL-1R:ää haettiin humaani-cDNA-kirjastoista jul Sims, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 86 {198 kuvatulla tavalla. Konstruoitiin cDNA-kirjasto käy 5 sellaisen polyadenyloidun mRNA:n käänteistranskr joka oli eristetty kokonais-RNA:sta, joka oli uute laisen humaani-T-solulinjan viljellyistä soluista oli annettu nimitys klooni 22 ja joka on kuvattu ju sa Acres, et ai. [J. Immunol. 138 (1987) 2132] 10 soluja viljeltiin julkaisussa Acres, et ai. (edell tulla tavalla RPMI 1640 -mediumissa, joka sisälsi 1 fetaalista naudan seerumia ja jossa oli OKT3-vasta konsentraatiossa 10 ng/ml sekä humaani-IL-2:ta kon tiossa 10 ng/ml. cDNA tehtiin kaksinauhaiseksi 15 DNA-polymeraasi I;tä, sen päät tasoitettiin käytti DNA-polymeraasia, metyloitiin EcoRI-metylaasilla olevien EcoRI:n katkaisukohtien suojaamiseksi ja tiin EcoRI-kytkijäjaksoihin. Tulokseksi saadut kons pilkottiin EcoRI:lla kaikkien kytkijäjakson kopioid 20 tamiseksi cDNA:n kummastakin päästä yhtä jaksoa lu matta ja ligatoitiin XgtlO:n EcoRI:11a pilkottuihi] . fosforyloituihin käsivarsiin (Huynh, et ai., DNA Cl
Practical Approach, Glover, ed., IRL Press, pp. 4 *!* * . e. Ligatoitu DNA pakattiin faagipartikkeleihin • · ΐ •#V 25 kaupallisesti saatavilla olevaa reagenssipakkausta •••| gene Cloning Systems, San Diego, CA, USA 92121) • · • ••3 nanttikir jaston aikaansaamiseksi. Rekombinantit ma ··# V : E. coli -kannalle C600 (hfl-) ja seulottiin tavano plakkihybridisaatiomenetelmillä kohtalaisen rajoi 3j[: 30 olosuhteissa (50 °C, 6 x SSC) .
:'**· Useiden seulontakierrosten jälkeen kir tl 57 niiden hybridisoituminen tutkittiin uudelleen. Kloc kottiin EcoRI:lla, jonka jälkeen suoritettiin prepa
nen agaroosigeelielektroforeesi ja jatkokloonaus E
pilkottuun vakiokloonausvektorin pBR322:n johda 5 (pGEMBL), joka sisälsi polylinker-jakson, jossa oi kertaisena esiintyvä EcoRI-kohta, BamHl-kohta je muita ainutkertaisena esiintyviä restriktiokohtia.
esimerkki tämän tyyppisistä vektoreista on esitetty sussa Dente, et ai. [Nucl. Acids Res. 11 (1983) 164 10 4,8 ke:n suuruisen humaani-IL-1R-kloonin tiokartoitus ja sekvenssointi antoi viitteitä sir tämä klooni sisälsi 518 aminohappoa koodaavan jakso aminohappojakso vastaavaan muriinijaksoon verratt transmembraanialueesta molekyylin pään suuntaan 15 solunulkoisella eli N-terminaalisella alueella 80- identtinen, transmembraanialueella 63-%risesti id ja sytoplasmisella eli C-terminaalisella aluee % risesti identtinen. Humaani-IL-lR-kloonin 5’-puo osasta peräisin oleva 440 ep:n suuruinen EcoRI-Ns 20 mentti varustettiin katkostranslaatiota käyttäen maila edellä kuvatulla tavalla ja tätä käytettiin s , cDNA-kirjaston seulontaan, joka oli tehty satunn • · · keiden avulla edellä kuvatulla tavalla valmistetuet • * , . ni-T-solulinjan kloonin 22 mRNArsta. Eristettiin 23 • · » • * · '“Z 25 meen hybridisoituvaa kloonia ja ne analysoitiin ··· *··: tiokartoituksella. Yhdelle näistä klooneista tehdy •••Ϊ venssoinnista saatiin jaksoa koskevaa informaatiol ··· V · vastasi humaaniproteiinin 34 viimeistä N-terminaali nohappoa. Tämän tyypin I humaani-IL-lR:n täydelli: 30 daavan alueen DNA-jakso ja siitä päätelty aminoha ·***· on esitettv iaksotunnisteissa nro 5 ia 6. Tämä hum 58 1 lista N-glykosylaatiokohtaa, joista 5 on säilynyt h ihmisen välillä.
Esimerkki 9
Tyypin II IL-IR: ää koodaavien cDNA-mol 5 eristys
Tyypin II humaani-IL-lR:ää koodaava DNA-jak tettiin cDNA-kirjastosta, joka oli valmistettu va telmien avulla sellaisen polyadenyloidun RNA:n k transkription avulla, joka oli eristetty lymfobl 10 sesta humaani-B-solujen solulinjasta CB23, joka on julkaisussa Benjamin & Dover, Blood 75 (1990) 20: piirteittäin voidaan todeta, että CB23-solulinja on transformoitu napaveren (CB) lymfosyyttisolulinja, valmistettu käyttäen julkaisussa Benjamin, et ai. 15 Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 3547, kuvattuja mene' CB23-kirjasto seulottiin käyttämällä yhdis cDNA-fragmenttien modifioitua suoraa ilmentämistä munuaissolulinjassa CV1/EBNA-1 sellaisen nisäkäsilm vektorin (pCD406) avulla, joka sisältää SV40:stä, 20 Barrin viruksesta ja pBR322:sta peräisin olevat kaation alkukohdat. pDC406 on julkaisussa Dover, et . #\ Immunol. 142 (1989) 4314 kuvatun HAV-EO:n johda • · * pCD4 06 eroaa HAV-EO: sta siinä suhteessa, että s • · . . deletoitu HAV-EO:ssa olevassa adenovirus 2:n kolmio • « *··/ 25 johtojaksossa oleva introni. CV-l/EBNA-l-solulinja > *· ···· mistettu transfektoimalla CV-l-solulinja Epstein-Ba.
•••Ϊ ruksen tuma-antigeeni-1:tä (EBNA-l:tä) koodaavalla V : sekä CMV:n säätelyjaksoja sisältävällä vektorin tavoin, että EBNA-1 ilmentyy humaani-CMV:n esivarha 30 hancer-jakson ja promoottorijakson yhdistelmän oh :***: EBNA-l-geenin avulla EBV:n replikaation alkukohdan .
59 11 netelmää olennaisesti julkaisussa Gearing, et ai., 8 (1989) 3667 kuvatulla tavalla. Tämä tapahtui teittäin siten, että CV-1/EBNA-l-solut transfektoit raan objektilaseilla pDC406:ssa olevilla DNA-minip 5 teillä, joka olivat peräisin yhdistetyistä cDNA-klc ja soluja viljeltiin 2-3 päivää sillä tavoin, ett oli mahdollista ilmentää väliaikaisesti tyypin I I Tämän jälkeen transfektoituja soluja sisältäviä ot 1 Λ(7 seja inkuboitiin I-IL-lp:ää sisältävässä mediumis 10 tiin sitoutumattoman leimalla varustetun IL-Ιβίη p seksi, kiinnitettiin gluteerialdehydillä, kastettii maiseen valokuvausemulsioon ja valotettiin pimeä: objektilasit oli kehitetty, ne tutkittiin yksittäi skoopilla ja tyypin II IL-lR:ää ilmentävät positiiv 15 lut tunnistettiin autoradiografisten hopeajyvien es sen perusteella vaaleata taustaa vastaan.
Tätä lähestymistapaa käyttäen seulotti: 250 000 cDNA-molekyyliä noin 3 000 cDNA-molekyyli: telminä käyttäen autoradiografista objektilasimer 20 kunnes yhden transfektanttiyhdistelmän määritys siinä esiintyvän useita ΙΙι-1β:η sitoutumisen suht< * vasti positiivisia soluja. Tämä yhdistelmä jaettii *·!»* 500 molekyylin yhdistelmiin ja seulottiin uudellee • · . . tilasiautoradiografiällä. Tunnistettiin positiivine ! · ϊ *··/ 25 telmä. Tämä yhdistelmä jaettiin edelleen 75 mc ** ···· yhdistelmiin ja seulottiin maljoilla tehdyillä sit ·*« ···· määrityksillä, jotka analysoitiin kvantitoimalla *.· · neen 125I-IL-lp: n määrä. Solut kaavittiin mal j oil ta kettiin sen määrittämiseksi, mikä 75 ehdokasta s 30 yhdistelmä oli positiivinen. Tästä 75 ehdokkaan y ·***· mästä seulottiin vksittäisiä oesäkkeitä, kunnes tu 60 ohella jaksotunnisteissä nro 7 ja 8. Tyypin II hun 1R cDNA:ta sisältävä pDC406-kloonausvektori, jolle nettu nimitys pHu IL-1R-II 75, talletettiin E. coli -isäntäsoluissa talletuslaitokseen Americ 5 Culture Collection, Rockville, MD. USA (ATCC) hakun ATCC 68 337. Talletus tehtiin Budapestin sopimuksen mukaisesti.
Kuten on asianlaita useimpien nisäkkäiden suhteen, on nisäkkäiden tyypin II IL-1R otaksuttav 10 nieksonisten geenien koodaama. Tämän keksinnön suoj katsotaan kuuluvan sellaiset vaihtoehtoiset mRNA-k tiot, jotka ovat tulosta erilaisista mRNA:n trans jälkeisistä silmukoitumistapahtumista ja joissa suuria identtisiä tai samanlaisia jaksoja sisältävi 15 ta niihin cDNA-molekyyleihin verrattuna, joita tä sinnössä esitetyt patenttivaatimukset koskevat.
Esimerkki 10
Liukoista tyypin II humaani - IL-lR:ää ke cDNA-molekyylien konstruktio ja ilmentäminen 20 cDNA, joka koodaa liukoista tyypin II hun lR:ää {jonka aminohappojakso on jaksotunnisteen nr , .·, nohappojakson -13 - 333 mukainen), konstruoitiin • · i raasiketjureaktio (PCR) -monistuksella käyttäen terr * » . . na täysimittaista tyypin II IL-lR:n cDNA-kloonia • · t 25 68 337) vektorissa pDC406 (tämä on kuvattu esimerk •••| Konstruoitiin ensin 5' -puoleinen oligonukleotidialu m » « • ••2 sotunniste nro 14) ja 3'-puoleinen oligonukleot : (jaksotunniste nro 15), jotka olivat: jaksotunniste ; 30 5'-gcgtcgacctagtgacgctcatacaaatc-3 ' ····; <SalI> 61 5'-puoleinen aluke vastaa tyypin II humaani-IL-lF 75 (jaksotunniste nro 7) translaation osallistuma alueelta peräisin olevia nukleotideja 31 - 51, j< 51-puolelle lisätty Sall-restriktiokohdasta koostu 5 osa; tämä nukleotidijakso kykenee liittymään pitkit teen siihen (-)-nauhaan, joka on komplementaarinen kloonin 75 nukleotidien 31 - 51 suhteen. 3f-puolein on komplementaarinen nukleotidien 1 191 - 1 172 (tämä sisältää antisense-nukleotidit, jotka koodaa 10 pin II humaani-IL-1R kloonin 75 kolmea aminohappo* 5'-puoleiseen päähän on liitetty Notl-restriktiokoh 1opetuskodonista koostuva lisäosa.
1,5 ml:n vetoiseen Eppendorf-mikrosentrifug lisättiin PCR-reagenssit, jotka olivat: 10 x PCR-
15 (500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 25 °C, 15 mM
1 milligramma gelatiinia millilitrassa) (Perkins-E
tus, Norwalk, CN}, 10 μΐ kutakin dNTP:tä sisältävä
limolaarista liuosta (2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM
2 mM dTTP), 2,5 yksikköä Taq-DNA-polymeraasia (0,! 20 kioliuosta, jonka konsentraatio oli 5 000 yksi (Perkins-Elmer Cetus), 50 ng templaatti-DNA:ta ja 5 .kin edellä olevan oligonukleotidialukkeen liuosta, konsentraatio oli 20 μΜ, ja 74,5 μΐ vettä, jolla lo * · . . tilavuus säädettiin 100 uliksi. Valmiin liuokser • · ···/ 25 lisättiin 100 μΐ parafiiniöljyä. PCR suoritettiin •••j DNA-lämmityssykli-inkubointilaitetta (thermal cycle •*•2 comp, San Diego, CA) denaturoimalla templaatti V · 94 °C:ssa 90 sekunnin ajan, antamalla molekyylien pituussuunnassa uudelleen yhteen 55 °C:ssa 75 30 ajaksi ja pidentämällä cDNA 72 °C:ssa 150 sekunni Tämän jälkeen PCR:n suoritukseen käytettiin 20 m 62 Näyte poistettiin parafiiniöljystä ja DNA u käyttämällä uuttoa fenolin ja kloroformin seoksella trifugoimalla tehtyä pylväskromatografiaa G-50:ssa ringer Mannheim). 10 μ1:η suuruiset erät uutettua 5 erotettiin elektroforeesilla l-%:isessa SeaKem-aga (FMC-Bioproducts, Rockland, ME) ja värjättiin etidi dilla sen varmistamiseksi, että DNA-fragment!n koko denmukainen ennustetun tuotteen suhteen.
Tämän jälkeen pilkottiin 20 μ1:η erä PCR:1L 10 tettuja cDNA-tuotteita Sali- ja Notl-restriktioents vakiomenetelmiä käyttäen. SalI-/NotI-restriktiofr erotettiin sitten 1,2-%:isessa matalassa lämpötila: tyvässä (LGT) Seaplaque™-agaroosissa ja fragmentti tava vyöhyke eristettiin. Tämä fragmentti lig 15 pDC406-vektoriin tavallisella "geelin sisässä teh ligaatiomenetelmällä. Tulokseksi saatu vektori tran tiin CVl-EBNA-soluihin ja suoritettiin liukoisen proteiinin ilmentäminen.
Esimerkki Xl 20 Di-TNF-R:ää koodaavan vektorin konstruointi
Vektori, joka koodaa kaavan TNF-R-peptidi . jakso-TNF-R mukaista fuusioproteiinia ja joka on ' • · m kuviossa 3, konstruoitiin seuraavasti. TNF-R-jakso: vat asiaankuuluvat restriktioentsyymien katkaisukc • * * ··· : 25 myös esitetty kuvioissa 2A - 2B.
..ΓΓ Ilmentämi s vektori, joka oli konstruoitu esi: 4 ja jolle oli annettu nimitys psol huTNF-RA235, ZJ : pilkottiin Not I -restriktioentsyymillä, jonka kätki ta on pCAV/NOT-vektorin monipaikkaisen kloonauskohc j 30 dalla (toisin sanoen tähän liitettyyn TNF-R-jaksoor ··* .···. vastasuunnassa olevassa kohdassa). Not I:llä suor:
A
63 aminohappoa 235 vastaavan kodonin jälkeen sijai lopetuskodonista, esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.
Notl/Bam HI -fragmentti, jonka päät oli t saiseksi ja joka sisälsi TNF-R-jakson, eristettii: 5 omaisten menetelmien mukaisesti ja liitettiin plas toriin, josta käytettiin nimitystä pCAV/DHFR ja pilkottu Sma I:llä ja Bgl 11:11a. pCAV/DHFR-vel· ilmentämisvektori, joka sisältää monipaikkaiseen k kohtaan nähden vastasuunnassa sijaitsevat SV40:n pr 10 rijaksot sekä muita esimerkissä 3 kuvattuja pC piirteitä ja jossa selektiomarkkerina on myös di laattireduktaasi (DHFR) -geeni. Niille nisäkäss jotka ovat saaneet sisäänsä vektorin mutta jotka o toin DHFR~-tyyppisiä, on DHFR-geenistä hyötyä sele 15 jossa soluja kasvatetaan metotreksaatin (MTX} läsn sa. Pilkkomisesta Sma I:llä saadaan syntymään päät, joihin TNF-R:n sisältävän fragmentin Not 1:11 seksi tehdyt päät ligatoidaan, Bgl 11:11a syntyneet si jääneet nauhan päät ligatoidaan TNF-R:ää si 20 fragmentin päihin, jotka on saatu pilkkomalla Bam Ligaatio hävittää Bam HI- ja Bgl II -kohdat. E. col transformoidaan ligaatioseoksella tavanomaisten men * * avulla. Plasmidi-DNA otetaan talteen isäntäsolu / / haluttu konstruktio varmistetaan oikeaksi restrikti * * 9 ·*♦* 25 silla. Tulokseksi saadulle vektorille, joka sisältä *.; liitos jakson, on annettu nimitys pCAV/DHFR/TNF-R.
..ΙΓ Eristettiin DNA-fragmentit, jotka on tar V * käytettäväksi kahta sellaista TNF-R-polypeptidiä k vektorin valmistamiseksi, joissa nämä ovat peptidi : 30 jakson erottamina, ja nämä olivat: *** (A) pCAV/DHFR/TNF-R-vektorin Asp718 (restri 64 (kep) ja se sisältää vektorin jaksot ja TNF-R-ja puoleisen pään.
(B) Esimerkissä 4 konstruoidun ja plasmidi hu TNF-R A235/CAVNOT nimitetyn ilmentämisvektorin 5 PvuII -fragmentti. Asp718 pilkkoo vektorin siihen tyyn TNF-R-jaksoon nähden vastasuunnassa olevasta k Haluttu 865 ep:n suuruinen fragmentti sisältää Tl son, joka ulottuu 5'-puoleisesta signaalijaksosta kissa 4 esitettyyn Pvu II -kohtaan.
10 (C) Kaksinauhainen oligonukleotidi, jolla {jaksotunnisteet nro 16 ja 17): 5’ CTGAAGGGAGCACTGGCGACGGTGGCGGTGGATCCGGCGGTGGCGGCGGCTCATTGCCCGCCCAGi 3’ GACTTCCCTCGTGACCGCTGCCACCGCCACCTAGGCCGCCACCGCCGCCGAGTAACGGGCGGGTC! 15 GluGlySerThrGlyAspGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlyGlySerLeuProAlaGln1 (D) Esimerkissä 4 konstruoidun ja plasmidi hu TNF-R A235/CAVNOT nimitetyn ilmentämisvektorin EspI -fragmentti. Halutun fragmentin pituus on noir 20 Bgl I pilkkoo TNF-R:n aminohappoa 5 (Vai) vastaavan sisällä olevasta kohdasta; Esp I pilkkoo TNF-R:n ja viossa 2A esitetystä kohdasta; fragmentti (A) π 4 * *
loppuosan (3'-puoleisen pään) tästä liukoista TNF-F
/ / daavasta jaksosta.
• · · **· · 25 Oligonukleotidi (C) valmistetaan oligonukl mmm kemialliseen synteesiin käytettävillä tavanomaisil telmillä. Tämä oligonukleotidi konstruoi uudellee: ♦ ** V ί maisen TNF-R:n jakson 3T-puoleisen pään Pvu II - solunulkoisen domeenin viimeiseen aminohappoon ( : 30 235 oleva Asp) . Tämä oligonukleotidi sisältää my< *·· .**·. kehyksessä olevan iakson, ioka koodaa oeotidikvtki 65 nauhan 3'-puoleisessa yli jääneessä osassa olevaan (aminohappoa 5) vastaavaan osittaiseen kodoniin, mi Jcodoni muodostuu uudelleen ligatoitaessa tämä nauh komplementaariseen vapaaksi jääneeseen nauhan osa.
5 sijaitsee fragmentin D Bgl I:lla pilkotussa päässä.
Kirjaimilla A - D merkityt DNA-fragmentit tiin toisiinsa kuviossa 3 esitetyistä asemista s vektorin muodostamiseksi, jolle annettiin nimitys p Di-TNF-R ja joka koodaa tämän keksinnön mukaista 10 proteiinia. E. coli -soluja transformoidaan ligaa sella tavanomaisten menetelmien avulla. Plasmidi-] taan talteen isäntäsoluista ja haluttu konstruktio tetaan restriktioanalyysillä. Tämän ilmentämisvekto daama vastasuunnassa oleva TNF-R-polypeptidi sisäl 15 sotunnisteen nro 2 mukaiset aminohapot -22 - 235 sanoen liukoisen TNF-R:n, joka sisältää N-termi jakson ja kokonaisen solunulkoisen domeenin mutta sisällä lopetuskodonia). Myötäsuunnassa olevasta polypeptidistä puuttuu signaalijakso ja se sisältä 20 tunnisteen nro 2 mukaiset aminohapot 1 - 235 ja mästi aminohapon 235 jälkeen sijoitetun lopetus Tämän nimenomaisen konstruktion peptidikytkijäj. Gly4SerGlysSer.
/ / Tällä ilmentämisvektorilla transfektoidaan • * · 25 soluja tavanomaisia menetelmiä käyttäen ja niitä vi ...Γ halutun fuusioproteiinin tuottamiseksi. Yksi sopi1 ..ΙΓ kässolulinja on DH FR"-tyyppi ne n kiinanhamsterin mu M* V ί solulinja, jolle on annettu nimitys CHO-Kl ja saatavilla talletuslaitoksesta American Type Culti : 30 lection, Rockville, MD, hakunumerolla CCL61. Solut ··· .···· transfektoida ilmentämisvektorilla tavanomaisella 66 esiintyminen soluviljelymediumissa varmistetaan rr sillä, kuten esimerkeissä 1 ja 2 kuvatuilla määrity Toinen sopiva nisäkässolulinja on COS-7-sc Yhdessä kokeessa C0S-7-solut transfektoitiin edeL 5 tulla TNF-R-dimeeriä koodaavalla ilmentämisvektoi soluja viljeltiin sillä tavoin, että niiden oli mah ilmentää dimeeriä. Konsentroimattomasta superna {tämä sisälsi eritettyä dimeeriä} määritettiin ί inhiboida radioaktiivisella jodilla varustetun 10 TNFoirn sitoutumista U937-soluun {tämä on TNF:n endc reseptoreita sisältävä humaanimonosyyttiä muistutta linja). Suoritettiin sitoutumis inhibitiomääritys omaisten menetelmien mukaisesti, jotka olivat sam kuin esimerkin 2 osassa C kuvatut menetelmät. Ne 15 sissa kontrollikoeputkissa (epäspesifisen sitoutumi rittämiseen) oli radioaktiivisella leimalla varust TNFoi:aa, U937-soluja ja radioaktiivisella jodilla v tua TNFa:aa. Positiiviset kontrollikoeputket (inhib missä olosuhteissa saatavan maksimiarvon määritt 20 radioaktiivisella jodilla varustetun TNFarn sitout U937-soluihin) sisälsivät sitoutumismediumia, U93 ja radioaktiivisella jodilla varustettua TNFa:aa.
1 · sisältävä supernatantti inhiboi yli 90 % positi , / kontrollilla havaitusta TNF:n sitoutumisesta U937--S' : 25 Esimerkki 12 9 999 ···! Yhtä IL-lR-polypeptidiä ja kahta TNF-R-poly .ΙΓ sisältävä fuusioproteiini 67 jaksotunniste nro 18: 5’ ACCGAGGGACCTGAGCG 3' 5 jaksotunniste nro 19:
3' TCAATTATATAGGTCAGTGACCACCGCCACCTAGGCCGCCACCGC
CGCCGAGT 5' Nämä sekä tuonnempana tarkasteltavat oligonukleoti 10 tetoidaan tavanomaisin menetelmin, esimerkiksi automaattista DNA-synteesilaitetta, kuten yhtiöis search, Inc., San Rafael, Kalifornia, tai Applied tems, saatavilla olevia laitteita. PCR-reaktiossa templaatti on plasmidivektori, joka on valmi stet' 15 tämällä vektoriin tyypin I humaani-IL-lR:n cDNA ja annettu nimitys SF CAV. SF CAV -vektori on kuvioss tetty nisäkäsilmentämisvektori (tässä on esitetty käyttö yhdessä muussa tuonnempana kuvattavassa konstruktiossa). E. coli -soluissa oleva SF CAV t 20 tiin 27.2.1992 talletuslaitokseen American Type
Collection Budapestin sopimuksen ehtojen mukais . sille on annettu hakunumero 68 922.
• · · SF CAV:ssa olevat SV40-, CMV-, pA- ja \ t 9 . , sekä ampisilliiniresistenssigeeni ovat samanlais < · · ··· * 25 plasmidin pCAV/NOT edellä olevassa esimerkissä 3
···! jaksot ja myös PCT-patenttihakemus julkaisun WO S
..ΙΓ esimerkissä 8 ja kuviossa 3 kuvatut jaksot. Monipa ** V* ί kloonauskohta, joka sijaitsee adenovirus-2:n koin johtojakson (TPL) ja pA-jakson välissä, sisältää : ·’: 30 tioendonukleaasien Xhol, Kpnl, Smal, NotI ja Bgll •#··. tuskohdat. TPL-iakso eroaa oCAV/NOT:n TPL-iaksost, 68 1 Vähäinen humaani-IL-lR:n ilmentyminen kryptisestä torista voi olla toksista bakteereille.
SF CAV pilkotaan Smal:lla, joka tunnistaa n kaisessa kloonauskohdassa olevan ainutkertaisena es 5 restriktiokohdan ja muodostaa tasaiset päät. DNA-f ti, joka sisältää tyypin I IL-lR:n cDNAin, vain käyttämällä pilkkomista Styl:n ja Bglllin seoksell jälkeen vapaaksi jääneet päät täytetään käyttäen E meraasi I:n Klenow-fragmenttia tasaisten päiden ai 10 miseksi. Styl:n katkaisukohta on jaksotunnisteen nr leotidin 49 kohdalla ja BglII:n katkaisukohta on n din 1 997 kohdalla. IL-lR:n cDNA-fragmentti lig Smal:llä pilkottuun SF CAV -vektoriin ja E. col: transformoidaan ligaatioseokselia vakiomenetelmillä 15 seksi saatu vektori otetaan talteen E. coli -soi' tätä käytetään templaattina PCR-reaktiossa.
5'-puoleinen aluke (jaksotunniste nro 18] sitä 17 nukleotidin suuruista jaksoa, joka esiinty rissa vastasuuntaan vektoriin liitettyyn IL-1R 20 nähden. 3'-puoleinen aluke (jaksotunniste nro 19) segmentin, joka on komplementaarinen jaksotunniste' , · nukleotidien 1 060 - 1 079 suhteen, jotka koodaavat
* · J
solunulkoisen domeenin C-terminaalisen pään lähe • ♦ f , olevia aminohappoja 306 (osittainen kodoni) - 31 • » » ·*·* 25 3' -puoleinen aluke sisältää myös peptidikytki •••ί Gly4SerGly5Ser koodaavan jakson.
* •-ΓΓ Suoritetaan PCR-reaktio millä tahansa s ··· * menetelmällä, kuten menetelmillä, joita on kuvattu sussa Särki, et ai., Science 239 (1988) 487; t : 30 Recombinant DNA Methodology, Wu, et ai., eds., **t ·""· Press Inc., San Dieao (1989) dd 189 - 196; sekä t 69 tään PCR-reagenssit, jotka ovat: 10 μΐ 10 x PCR- (500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3 25 °C:ssa, 25 ja 1 mg gelatiinia millilitrassa) (Perkin-Elmer Cet walk, CN), 8 μΐ liuosta, jonka konsentraatio on 2 5 joka sisältää kutakin dNTP:tä (2 mM dATP, 2 mM dC dGTP ja 2 mM dTTP), 2,5 yksikköä Taq DNÄ-poly (Perkins-Elmer Cetus} (0,5 μΐ standardiliuosta, 5 000 yksikköä millilitrassa}, 1 ng templaatti-DNA pikomoolia kutakin oligonukleotidialuketta sekä s 10 määrä vettä, että lopulliseksi tilavuudeksi saadaan Lopullisen seoksen päälle pipetoidaan 100 μΐ para jyä. PCR suoritetaan käyttäen DNA-lämpösykli-ink laitetta (Ericomp, San Diego, CA). Templaatti denat 94 °C:ssa 5 minuutta ja PCR suoritetaan käyttäen 2 15 tussykliä ja käyttäen vaiheittaista ohjelmaa (dena 94 °C:ssa, 1,5 minuuttia; yhteenliittäminen pituuss 60 °C:ssa, 1 minuutti; pidennys 72 °C:ssa 1 minuutti Reaktioseoksesta otetun näytteen elektrofo l-%:sessa matalassa lämpötilassa sulavassa (LMT) 20 agaroosissa (FMC BioProducts, Rockland, ME) ja eti midivärjäyksestä saadaan PCR-reaktion tuotteena β·β yksi odotettua kokoa oleva DNA-fragmentti. PCR: 11; * · a ***. tettu DNA-fragmentti käsittää lyhyen vektori jaksc « · e . sisältää Asp718-restriktiokohdan, joka on vastasuun • · 25 lR:n aminohappoja 1 (Asp) - 312 (Thr) koodaavaan ··· ···! nähden ja jonka jälkeen tulee peptidikytkijäjaksoa * yksinauhainen segmentti.
V · Suoritetaan toinen PCR-reaktio liukoista T
lypeptidiä koodaavan cDNA-fragmentin eristämiseksi : ;*· 30 nistamiseksi. Templaatti oli vektori, jolle esime] *#· .··*. oli annettu nimitys psolhuTNF-R A235/CAVNOT ja jok 70 1 jaksotunniste nro 20:
5 ? GGTGGCGGTGGATCCGGCGGTGGCGGCGGCTCATTGCCCGCCCAGGTG
jaksotunniste nro 21: 5 3’ TGACGCGCGACTCGTTCG 5' 5'-puoleinen aluke (jaksotunniste nro 20) sisältää kytkijäjaksoa koodaavan segmentin, joka on kömpiem nen jaksotunnisteen numero 19 mukaisen alukkeen pep 10 kijäjaksoa koodaavan osan suhteen. Tätä kytkijäjak daavaa segmenttiä seuraa kypsän TNF-R:n kuutta ens aminohappoa vastaavat kodonit (Leu-Ala).
3’-puoleinen aluke (jaksotunniste nro 21) nukleotideja, jotka ovat komplementaarisia TNF-R:i 15 tunnisteen nro 1 mukaisten nukleotidien 461 - 478 jotka koodaavat aminohappoja 103 (Tyr, osittainen k 109 (Gin, osittainen kodoni). Tähän alukkeeseen myös Espl-restriktiokohta, joka esiintyy luontaise R-proteiinin tässä osassa.
20 PCR-reaktio suoritetaan edellä kuvatulla Tällä toisella PCR-reaktiolla monistettu DNA-fr β·β sisältää edellä kuvatun kytkijäjaksoa koodaavan se a « * jota seuraa TNF-R:n aminohappojaksoa 1 (Leu) - 1( / / osittainen kodoni) koodaava jakso. Tämä DNA-fr a · * ···· 25 visualisoidaan elektroforeesilla, jonka jälkeen ge ··.! jätään etidiumbromidilla edellä kuvatulla tavalla.
taan kolmas PCR-reaktio, jolla on tarkoitus eristää *·· V * nen monistettu kaksinauhainen DNA-fragmentti, joka kytkijäjakson erottamat IL-lR:n ja TNF-R:n jaksot.
; ·*: 30 vetoiseen koeputkeen yhdistettiin reagenssit, jotka ··· ····. 3 ui (noin 5-10 ng) edellä olevassa ensim 71 1 3 μΐ (noin 5-10 ng) edellä olevassa toise reaktiossa monistettua peptidikytkijäjakso-TNF-R-C menttia - 3 μ1:η suuruinen näyte pipetoidaan mikrop suoraan halutun vyöhykkeen sisältävästä LMT-agar 5 eesta 10 μΐ 10 x PCR-puskuria (tämä on kuvattu ed 100 pmol 5'-puoleisena alukkeena käytettävä tunnisteen nro 18 mukaista oligonukleotidia 100 pmol 3'-puoleisena alukkeena käytettävä 10 tunnisteen nro 21 mukaista oligonukleotidia 4 μΐ 2,5-millimolaarista liuosta, joka kutakin neljää dNTP:tä 0,5 μΐ Taq-DNA-polymeraasia (5 yksikköä/μΐ) vettä lopullisen tilavuuden säätämiseksi 10 15 PCR-reaktiosyklit suoritetaan edellä mai lämpötiloissa ja käyttäen edellä mainittuja aikoji tettaessa käytetyn denaturointivaiheen jälkeen 1 näiden kahden DNA-fragmentin komplementaariset pep kijäjaksoja koodaavat segmentit pituussuunnassa yht 20 aktion lopputuote on tasaiset päät sisältävä kaksin monistettu DNA-fragmentti, jonka pituus on noin 1 3 e j°ka sisältää peptidikytkijäjaksoa koodaavaan jaks • · · ]*". den vastasuunnassa olevan IL-lR:n DNA-jakson ja näi , / keen tulevan TNF-R:n DNA-jakson.
« · * :·: ! 25 Tästä kolmannesta PCR-reaktioseoksesta o <·*« μ1:η suuruinen näyte saatetaan reagoimaan puhdistani ψ restriktioentsyymien Asp718 ja EspI kanssa. Asp 71 V : kaisukohta on, kuten edellä jo mainittiin, vastas IL-1R-jakson edellä. EspI:n katkaisukohta on TNF-• 30 sisällä kuten kuviosta 2A ja edellä olevasta tarka *·**. käy ilmi. Restriktioendonukleaasi Cell II on Esp; 72 geelissä ja eristämällä haluttua fragmenttia edust hyke.
Eristetään kaksi muuta DNA-fragmenttia, j annettu nimitykset F ja G, ja nämä yhdistetään frac 5 E sellaisen ilmentämisvektorin konstruoimiseksi, toinen TNF-R-jakso, joka on liitetty (peptidikytki välityksellä) myötäsuuntaan edellä olevan esitykse sesti valmistetun IL-lR-kytkijäjakso-TNF-R-DNA-fi suhteen. Tulokseksi saatava vektori ja sen sisältän 10 mentit E, F ja G on esitetty kuviossa 4.
DNA-fragmentti, josta on käytetty nimitystä mistetaan pilkkomalla kuviossa 3 esitetty ja esimei konstruoitu vektori Espl:lla. Eristetään fragment sisältää TNF-R:n 3’-puoleisen osan (tämä ulottuu 15 2A esitetystä Espl-kohdasta aminohappoa 235 vastaa doniin), tämän jälkeen tulevan Gly4SerGly5Ser-pep kijäjaksoa koodaavan jakson ja tämän jälkeisen toi R-jakson, joka ulottuu aminohappoa 1 (Leu) vastaav donista kuvion 3 mukaisen vektorin toisessa (myötä 20 olevassa) TNF-R-jaksossa olevaan Espl-kohtaan. Täs mentista, jonka pituus on noin 739 emäsparia, on β β·β pana käytetty nimitystä fragmentti F.
* · ·
Fragmentti G, joka sisältää vektorin jaks . / kaan lukien DHFR:n) sekä TNF-R-jakson 3'-puoleis< * * * · 25 eristetään "silmukoitunutta muotoa sisältämättömäs m + · » • ••ί torista seuraavalla tavalla. Esimerkissä 11 vai pCAV/DHFR/TNF-R-vektori sisältää jakson, jonka a ··· V * olevan epäedullinen IL-lR:ää koodaavien vektorien k tiolle, mikä johtuu mahdollisesti tässä jaksossa : 30 kryptisestä promoottorista, josta haitallinen p ·#· •••"s ilmentyy E. colissa. Valmistettiin pCAV/DHFR/TNF-] 73 SF CAV pilkotaan Ndel:lla ja Asp 718:11a (a täisenä esiintyvät kohdat tässä plasmidissa) ja ei kuviossa 5 oleva noin 500 ep: n suuruinen fragmentt on käytetty nimitystä H. Fragmentista H puuttu 5 DHFR/TNF-R:n vastaavassa fragmentissa esiintyvä hai jakso.
Esimerkissä 11 valmistettu ja kuviossa 5 pCAV/DHFR/TNF-R-vektori pilkotaan Asp 718:11a, Esp Ndel:lla. Eristetään noin 495 ep:n suuruinen Asp 7 10 fragmentti (fragmentti I). Eristetään myös noin 4 suuruinen Ndel/EspI-fragmentti (fragmentti J).
Edellä olevan esityksen mukaan valmistet fragmentit H, I ja J ligatoidaan toisiinsa ku\ esitetyn vektorin SF CAV/DHFR/TNF-R muodostamisek: 15 ei sisällä silmukoitunutta muotoa. E. coli -solu' formoidaan ligaatioseoksella tavanomaisia menetelm täen. Plasmidi-DNA otetaan talteen isäntäsoluista j tu konstruktio varmistetaan oikeaksi restriktioanal Tämän jälkeen SF pCAV/DHFR/TNF-R pilkotaan Asp 71 20 Espl:lla. Fragmentti, josta kuviossa 5 on käyteti tystä G, sisältää vektorin jaksoja (mukaan lukien
. ,·, ja TNF-R:n jakson 31 -puoleisen pään (sisäisestä E
* n « dasta aminohappoa 235 koodaavaan kodoniin ja tätä
• B
. , vaan lopetuskodoniin asti) ja se eristetään tava * ψ · ··· * 25 menetelmin.
·** ·*·· Edellä valmistetut DNA-fragment it E, F ja toidaan toisiinsa sellaisen vektorin muodostamisek ««« V : on esitetty kuviossa 4 (ja jolle on annettu nimity DHFR tri-R). E. coli -solut transformoidaan ligaa 30 sella ja haluttu plasmidi otetaan talteen edellä k ·***· tavalla. Tämän vektorin koodaama fuusioDroteiini i
IA
dikytkijäjakson; ja toisen TNF-R-polypeptidin, jok tää jaksotunnisteen nro 1 mukaiset aminohapot 1-2
Nisäkässoluja transfektoidaan ilmentämisve tavanomaisia menetelmiä käyttäen ja niitä viljellä 5 tun fuusioproteiinin tuottamiseksi. Yksi sopiva solulinja on CHO-Kl:ksi nimitetty kiinanhamsterin jasolulinja, joka on tyypiltään DHFR“ ja joka on se talletuslaitoksesta American Type Culture Collectic ville, MD, hakunumerolla CCL 61. Solut voidaan t 10 toida ilmentämisvektorilla tavanomaista kalsiumfc saostusta käyttäen menetellen olennaisesti jul
Graham ja van der Eb, Virology 52 (1983) 456, V
tavalla. Transfektoituja soluja viljellään sopiviss omaisissa olosuhteissa ja halutun fuusioproteiinin 15 minen soluviljelymediumissa varmistetaan määrityksi ten esimerkeissä 1 ja 2 kuvatuilla määrityksillä.
Edellä kuvatulla tavalla konstruoidun iin vektorin DNA-sekvenssoinnissa tuli fuusioproteiinis vissa jaksoissa ilmi kaksi pistemutaatiota, jot 20 saattaneet ilmaantua PCR:n aikana. Jaksotunnistee (tyypin I IL-1R) asemassa 437 oleva "T" oli \ . "C" :ksi ja jaksotunnisteen nro 1 (TNF-R) asemassa 6 • · « "C" oli vaihtunut "T":ksi. Nämä mutaatiot ovat \ * * . . settomia, joten IL-lR-peptidikytkijäjakso-TNF-R-pep * * * ···/ 25 kijäjakso-TNF-R-fuusioproteiinin (josta tuonnempan ««* •••2 tään nimitystä "trimeerinen reseptori") aminohappo .·.! edellä esitetyn kuvauksen mukainen.
··· ; Tällä ilmentämisvektorilla transfektoitiir soluja ja soluja viljeltiin sillä tavoin, että tri : 30 reseptorin oli mahdollista ilmentyä. Viisinkertaise
«M
·**"· sentroidusta supernatant is ta (tämä sisälsi eritet 11 75 tavanomaisia menetelmiä, jotka olivat samanlaiset V merkin 2 osassa C kuvatut menetelmät. Negatiiviset likoeputket (epäspesifisen sitoutumisen määrittä sisälsivät TNFa:aa, josta puuttui radioaktiivinei 5 U937-soluja ja radioaktiivisella jodilla var TNFa:aa. Positiiviset kontrollikoeputket (inhiboima olosuhteissa saatavan maksimiarvon määrittämiseks: aktiivisella jodilla varustetun TNFa:n sitoutumisel soluihin) sisälsivät sitoutumismediumia, U937-soluj 10 dioaktiivisella jodilla varustettua TNFaraa. Tri reseptoria sisältävä supernatantti inhiboi TNF:n mistä U937-soluihin noin 100-%:sesti positiivisei trollissa havaittuun sitoutumiseen verrattuna.
Viisinkertaisesti konsentroidusta supernat 15 joka sisälsi trimeeristä reseptoria, määritettiin kyky inhiboida radioaktiivisella jodilla varustetu ni-IL-la:n (0,14 nM) sitoutuminen endogeenisiä IL-toreja sisältäviin EL4 6.1 -soluihin. EL4 6.1 -solu valmistettu muriinityoomasolulinjasta julkaisusi 20 Donald, et ai. [J. Immunol. 135 (1985) 3944] kuvat valla. Negatiivisissa kontrollikoeputkissa (epäsp . sitoutumisen määrittämiseksi) oli IL-locaa, jossa • * « radioaktiivista leimaa, EL4 6.1 -soluja ja radio sella jodilla varustettua IL-la:aa. Positiivisissa • » : 2 5 likoeputkissa (inhiboimattornissa olosuhteissa saata ,,ΙΓ simiarvon määrittämiseksi radioaktiivisella jodill tetun IL-la:n sitoutumiselle EL4 6.1 -soluihin) oi tumismediumia, EL4 6.1-soluja ja radioaktiivisella varustettua IL-la:aa. Trimeeristä reseptoria sisäl . .·. 30 pernatantti inhiboi 47 % IL-l:n sitoutumisesta EL4 *·· luihin positiivisessa kontrollissa havaittuun sitou 76
Esimerkki 13
Yhtä IL-lR-polypeptidiä ja yhtä TNF-R-poly sisältävä fuusioproteiini (vertailu)
Esimerkissä 12 valmistetut fragmentit E j; 5 daan ligatoida toisiinsa vektorin muodostamiseksi, sältää kaavan IL-1R-peptidikytkijäjakso-TNF-R, joss di kytki ja jakso on Gly4SerGlysSer, mukaista fuusiopr koodaavan DNA-jakson. IL-1R ja TNF-R ovat esimer kuvattuja liukoisia polypeptideja. Esimerkin 12 10 fuusioproteiini on edullinen siitä syystä, että Τ' toutuminen saadaan tapahtumaan tehokkaasti, kun yh R-polypeptidin tilalla käytetään kahta TNF-R-polype Tällä ilmentämisvektorilla transfektoitiir soluja ja niitä viljeltiin siten, että IL-lR-pep 15 kijäjakso-TNF-R-fuusioproteiinin oli mahdollista i
Viisinkertaisesti konsentroidusta supernatantista ( sälsi eritettyä fuusioproteiinia) määritettiin sen hiboida radioaktiivisella jodilla varustetun huir la:n (0,14 nM) sitoutumista EL4 6.1 -soluihin (esi 20 12 kuvattu muriinityoomasta peräisin oleva IL-1- reita sisältävä solulinja). Käytetty sitoutumisin . määritysmenetelmä oli samanlainen kuin esimerkin 2 ♦ · « kuvattu menetelmä ja positiiviset ja negatiiviset lit olivat esimerkissä 12 kuvattujen kontrollien rr • · * ί.ί ί 25 Fuusioproteiinia sisältävä supernatantti inhiboi 53 ..ΙΓ tiiviselle kontrollille havaitusta IL-l:n sitout EL4 6.1 -soluihin.
**· : Muut fuusioproteiinit
Alan ammattikokemuksen perusteella on selv . 30 tässä kuvattuja menetelmiä voidaan käyttää muiden ···* .*·*. proteiinien valmistamiseksi, iotka ovat muuntvvppi 77 joiden halutaan liittyvän pituussuunnassa johonki kuvattujen DNA-jaksojen osaan, mikä siten määrää fragmentin terminaaliset päät. DNA-fragmentin termi pään uudelleenmuodostamiseen käytettyihin oligonuki 5 hin (esimerkiksi esimerkissä 4 käytetty oligonul· voidaan tehdä muutoksia lopetuskodonin sijoitt minkä tahansa halutun aminohapon jälkeen. Lisäksi misvektorin valinta on riippuvainen käytettäväksi c isäntäsoluista.
10 Jaksotunnisteiden pääpiirteittäinen kuvaus
Jaksotunnisteessa numero 1 ja jaksotunniste mero 2 on esitetty humaani-TNF-R:n cDNA:n nukleot ja sen koodaama aminohappojakso. Kypsä proteiini i aminohappoihin 1 - 439. Signaalipeptidi rajoittuu £ 15 poihin -22 - -1. Transmembraanialue rajoittuu amir hin 236 - 265.
Jaksotunnisteissa nro 3 ja nro 4 on esitett ni-TNF-R:n cDNA:n nukleotidijakso ja sen koodaama £ pojakso. Tämä TNF-R on eri proteiini kuin jaksotunr 20 nro 1 ja 2 mukainen TNF-R. Kypsä proteiini rajoitti; happoihin 1 - 415. Signaalipeptidi rajoittuu amino!" , -40 - -1. Transmembraanialue rajoittuu aminohappoil :';'1 192.
Jaksotunnisteessa nro 5 ja jaksotunnistees : 25 on esitetty tyypin I humaani-IL-lR:n cDNA:n nukleot » ja sen koodaama aminohappo jakso. Kypsä proteiini i aminohappoihin 1 - 549. Ennustettu signaalipeptidi :T: tuu aminohappoihin -20 - -1. Transmembraanialue z aminohappoihin 317 - 336.
. 30 Jaksotunnisteessa nro 7 ja jaksotunnistees *· # **· on esitettv tvvnin TT hum^^ni-TL-1R: n rDNA!n nuVrl^r 78
Jaksotunnisteissa nro 9-15 ja 18-21 on oligonukleotidit, joita on käytetty useiden erilais laisten yhdistelmä-plasmidien konstruoimiseen, jotk vattu esimerkkejä käsittelevässä osassa.
5 Jaksotunnisteet nro 16 ja 17 esittävät s oligonukleotidijaksoa ja tämän koodaamaa aminohapp joka sisältää Gly4SerGlysSer-peptidikytkijäjaksor oligonukleotidia käytetään esimerkissä 11 kuvatuss. rikonstruktiossa.
« · « • · »
•M
• i» · • 1 ♦ · · • · «
··· I
M
««•f ·»!· * · · • · · « · · • · » 79
SEQUENCE LISTING
U> GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Smith, Craig A.
(ii) TITLE OF INVENTION: Fusion Proteins Comprising Necrosis Factor Receptor (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 21 {iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: {A) ADDRESSEE: Immunex Corporation (B) STREET: 51 University Street (C) CITY: Seattle (D) STATE: Washington {E> COUNTRY: U.S.A.
(F) ZIP: 9B101 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version (vi) CURRENT APPLICATION DATA: <A) APPLICATION NUMBER: <B> FILING DATE: (C) CLASSIFICATION: (vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 479,661 (B) FILING DATE: 07-FEB-1990 (vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 523,635 . (B) FILING DATE: 10-MAY-1990 • e * eee ···-; (vii) PRIOR APPLICATION DATA: , , (A) APPLICATION NUMBER: US 701,415 : : : (BJ FILING DATE: 16-JUN-1991 M· « (vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US 821,716 ...f (B) FILING DATE: 14-JAN-1992 ··· • · · *·* * (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Seese, Kathryn A.
. (B) REGISTRATION NUMBER: 32,172 ::: <a reference/docket number: 2502 ··♦ ··· • · . I . mnt ΡΛΛΐΛηηΤΤΛ»(Λ¥Α»1 — _ _ _ _ _ 80 (C) STRAHOCDUESS: single (D) TOPOLOGY: linear
<ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (G) CELL TYPE: Fibroblast (H) CELL LINE: HI-2$ VA4 (vii) IMMEDIATE SOURCE: (A) LIBRARY: WX-26 VA4 (B) CLONE: 1 (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 88..1473 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: mat_peptide (B) LOCATION: 154..1470 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: sigjpeptide (B) LOCATION: 88..153 (X) PUBLICATION INFORMATION: (A) AUTHORS: Smith, Craig A.
Davis, Terri Anderson, Dirk , ,·, Sol am, Lisabeth *·ί·* Beckmann, M. P.
Jerzy, Rita Dower, Steven K.
: Cosman, David ***** Goodwin, Raymond G.
..*** (B) TITLE: A Receptor for Tumor Necrosis Factor Defines ,·. an Unusual Family of Cellular and Viral Proteins ·.·: (C) JOURNAL: Science ··:·. (D) VOLUME: 248 V * (F) PAGES: 1015-1023 (G) DATE: 25-MAY-1990 : (Xi> SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:l: *ee • * e • : GCGAGGCAGG rar.rrTftrtif: iriiiC'rrcrT nnrzrTn.rmin finrfimifznn rrzr~ir~nr' 81
0CC CAG GTG GCA TTT AGA CCC TAC CCC CCG GAG CCC GGG AGC ACA TO
Ala Gin Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cy 5 10 15
CGG CTC AGA GAA TAC TAT GAC CAG ACA GCT CAG ATG TGC TGC AGC AA
Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys Cys Ser Ly 20 25 30
TGC TCG CCG GGC CAA CAT GCA AAA GTC TTC TGT ACC AAG ACC TCG GA
Cys Ser Pro Gly Gin His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser As 35 40 45 5
ACC GTG TGT GAC TCC TGT GAG GAC AGC ACA TAC ACC CAG CTC TGG AA
Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gin Leu Trp As 55 60 65
TGG GTT CCC GAG TGC TTG AGC TGT GGC TCC CGC TGT AGC TCT GAC CA
Trp Val Fro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp G1 70 75 80
GTG GAA ACT CAA GCC TGC ACT CGG GAA CAG AAC CGC ATC TGC ACC TG
Val Glu Thr Gin Ala Cys Thr Arg Glu Gin Asn Arg lie Cys Thr Cy 85 90 95
AGG CCC GGC TGG TAC TGC GCG CTG AGC AAG CAG GAG GGG TGC CGG CT
Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gin Glu Gly Cys Arg Le 100 105 110
TGC GCG CCG CTG C ‘ AG TGC CGC CCG GGC TTC GGC GTG GCC AGA CC
Cys Ala Pro Leu Ar Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Vai Ala Arg Pr 115 120 125 13
GGA ACT GAA ACA TCA GAC GTG GTG TGC AAG CCC TGT GCC CCG GGG AC
Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Th , 135 140 145 e e e see
TTC TCC AAC ACG ACT TCA TCC ACG GAT ATT TGC AGG CCC CAC CAG AT ·' : Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp lie Cys Arg Pro His Gin II
: 150 155 160 see • ee *
.:. TGT AAC GTG GTG GCC ATC CCT GGG AAT GCA AGC ATG GAT GCA GTC TG
***; Cys Asn Val Val Ala lie Pro Glv Asn Ala Ser Met Asp Ala Vai Cv ·:· 165 170 175 eeee : acg tcc acg tcc ccc acc cgg agt atg gcc cca ggg gca gta cac tt
Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val His Le 160 185 190 e e e e ccc cag cca gtg tcc aca cga tcc caa cac acg cag cca act cca ga • · Fro Gin Vxl Thr le» Cn» ri « u-i * τκ» κι. mi__η__ 82
ATT GTG GGT GTG ACA GCC TTG GGT CTA CTA ΑΤΑ ATA GGA GTG GTG AA
II* Vai Gly Vai Thr Ala Uu Gly Leu Leu Ile Ile Gly Vai Val As 245 250 255
TGT GTC ATC ATG ACC CAG GTG AAA AAG AAG CCC TTG TGC CTG CAG AG
Cys Val He Met Thr Gin Val Lys Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gin Ar 260 265 270
GAA GCC AAG GTG CCT CAC TTG CCT GCC GAT AAG GCC CGG GGT ACA CA
Glu Ala Lya Val Pro His Leu pro Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr G1 275 280 . 285 29
GGC CCC GAG CAG CAG CAC CTG CTG ATC ACA GCG CCG AGC TCC AGC AG
Gly Pro Glu Gin Gin His Leu Leu lie Thr Ala Pro Ser Ser Ser 5e 295 300 305
AGC TCC CTG GAG AGC TCG GCC ACT GCG TTG GAC AGA AGG GCG CCC AC
Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Ala Leu Asp Arg Arg Ala Pro Th 310 315 320
CGG AAC CAG CCA CAG GCA CCA GGC GTG GAG GCC AGT GGG GCC GGG GA
Arg Asn Gin Pro Gin Ala Pro Gly Vai Glu Ala Ser Gly Ala Gly G1 325 330 335
GCC CGG GCC AGC ACC GGG AGC TCA GAT TCT TCC CCT GGT GGC CAT GO
Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser Asp Ser Ser Pro Gly Gly His G1 340 345 350
ACC CAG GTC AAT GTC ACC TGC ATC GTG AAC GTC TGT AGC AGC TCT GA
Thr Gin Val Asn Val Thr Cys He Val Asn Val Cys Ser Ser Ser As 355 360 365 37
CAC AGC TCA CAG TGC TCC TCC CAA GCC AGC TCC ACA ATG GGA GAC AC
His Ser Ser Gin Cys Ser Ser Gin Ala Ser Ser Thr Met Gly Asd Th , 375 380 385 • e e • * «
y \ GAT TCC AGC CCC TCG GAG TCC CCG AAG GAC GAG CAG GTC CCC TTC TC
***** Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro Lys Asp Glu Gin Val Pro Phe Se : 390 395 400 • · e • ee e .:. AAG GAG GAA TGT GCC TTT CGG TCA CAG CTG GAG ACG CCA GAG ACC Cl *·*; Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser Gin Leu Glu Thr Pro Glu Thr Le ’i* 405 410 415
V : CTG GGG AGC ACC GAA GAG AAG CCC CTG CCC CTT GGA GTG CCT GAT GC
Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys Pro Leu Pro Leu Gly Val Pro Asa Ai 420 425 430 e • e e
’•2«' GGG ATG AAG CCC AGT TAACCAGGCC GGTGTGGGCT GTGTCGTAGC CAAGGTGGO
• Glv Mai- Γνϋ Prn S·* 11 83 (2) INFORMATION TOR SEQ ID 110:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; (A) LENGTH: 461 Amino acids <B> TYPE: amino acid (Di TOPOLOGY: linear <ii> MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION; SEQ ID NO;2:
Met Ala Pro Vai Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu -22 -20 -15 -10
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gin Val Ala Phe Thr -5 1 5 4la Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr 15 20
Thr Ala Gin' Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gin His 30 35 40
Val phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser cys 45 50 55 •er Thr Tyr Thr Gin Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu 60 65 70
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gin Val Glu Thr Gin Ala Cys ?5 B0 85 01u Gin Asn Arg lie Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys 95 100 a :.5 l $er Lys Gin Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys 110 115 120 • e ; ,·. Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp :.: : 125 130 135 e ···· Cys Lys Pro Cya Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser ·;· 140 145 150 «·»· • e* :.2 2 Aap He Cys Arg Pro His Gin He Cys Asn Val Val Ala He 155 160 165 . ,·, Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr *.!.· n* 1 ftn 84 Λβρ Ph· Ala Leu Pro Vai Gly l*u Ile Vai Gly Vai Thr Ala 235 240 245
Leu Leu Ile Ile Gly Vai Vai Asn Cys Vai Ile Met Thr Gin 255 260
Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gin Arg Glu Ala Lys Vai Pro His 270 275 280
Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gin Gly Pro Glu Gin Gin His 285 290 295
Ile Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Sex 300 305 310
Ala Leu Asp Arg Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gin Pro Gin Ala 315 320 325
Vai Glu Ala Ser Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly 335 340
Asp Ser Ser Pro Gly Gly His Gly Thr Gin Vai Asn ValThi 350 355 36C
Vai Asn vai Cys Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gin Cys Sei 365 370 375
Ala Ser Ser Thr Met Gly Asp Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu 380 385 390
Lys Asp Glu Gin Vai Pro Phe Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe 395 400 405
Gin Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu . . 415 420
Leu Pro Leu Gly Vai Pro Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser ‘ · 430 435 « · : :: ··· · *·· (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: ·*·· (i> SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1368 base pairs V : (Bi TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear :
**** (ii> MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
:· 85 tix) nXTUM:
(λ) NWa/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..1366 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: mat_peptide (B) LOCATION; 121..1363 (ix) FEATURE: (A) ΝΑΜΕ/ΚΕΪ; sig_peptide (B) LOCATION: 1..120 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION; SEQ ID NO:3:
ATG GGC CTC TCC ACC GTG CCT GAC CTG CTG CTG CCG CTG GTG CTC C
Het GXy Leu Ser Thr V«1 Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu 1 -40 -35 -30
SAG CTG TTG GTG GGA ATA TAC CCC TCA GGG GTT ATT GGA CTG GTC C
Glu Leu Leu Vel Gly lie Tyr Pro Ser Gly Val He Gly Leu Vai E
-20 -15 -10
CAC CTA GGG GAC AGG GAG AAG AGA GAT AGT GTG TGT CCC CAA GGA A
Kis Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gin Gly I
-5 15
TAT ATC CAC CCT CAA AAT AAT TCG ATT TGC TGT ACC AAG TGC CAC I
Tyr He His Pro Gin Asn Asn Ser He Cys Cys Thr Lys Cys His 1 10 15 20 GGA ACC TAC TTG TAC AAT GAC TGT CCA GGC CCG GGG CAG GAT ACG 0
Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr J
25 30 35
: TGC AGG GAG TGT GAG AGC GGC TCC TTC ACC GCT TCA GAA AAC CAC C
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His I
: 45 50 55 * e :.:: aga cac tgc ctc agc tgc tcc aaa tgc cga aag gaa atg ggt cag c
Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gin V ···· 60 65 70 e
Ml ··” GAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG GAC CGG GAC ACC GTG TGT GGC TGC / :T: Glu He Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cvs l * ?5 60 85 AAG AAC CAG TAC CGG CAT TAT TGG AGT GAA AAC CTT TTC CAG TGC 1
1*3 Asn Gin Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gin Cys I
.···_ 90 95 100 11 86
UC GAG TGT GTC TCC TGT ACT AAC TGT AAG AAA AGC CTG GAG TGC A
Aan Glu Cys Vai Ser Cys Ser Aan Cys Lys Lya Ser Leu Glu Cya T
140 145 150
AAG TTG TGC CTA CCC CAG ATT GAG AAT GTT AAG GGC ACT GAG GAC T
lya Leu Cya Leu Pro Gin Ile Glu Aan Vai Lya Gly Thr Glu Aap S
155 160 165
GGC ACC ACA GTG CTG TTG CCC CTG GTC ATT TTC TTT GGT CTT TGC C
Gly Thr Thr Val Leu Leu Pro Leu Val lie Phe Phe Gly Leu Cya L
170 175 180
TTA TCC CTC CTC TTC ATT GGT TTA ATG TAT CGC TAC CAA CGG TGG A
Leu Ser Leu Leu Phe He Gly Leu Met Tyr Arg Tyr Gin Arg Trp l 185 190 195 2
TCC AAG CTC TAC TCC ATT GTT TGT GGG AAA TCG ACA CCT GAA AAA G
ter Lya Leu Tyr Ser He Val Cys Gly Lya Ser Thr Pro Glu Lys G
205 210 215
GGG GAG CTT GAA GGA ACT ACT ACT AAG CCC CTG GCC CCA AAC CCA A
Gly Glu Leu Glu Gly Thr Thr Thr Lys Pro Leu Ala Pro Aan Pro S
220 225 230
TTC AGT CCC ACT CCA GGC TTC ACC CCC ACC CTG GGC TTC AGT CCC G
Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr Pro Thr Leu Gly Phe Ser Pro V
235 240 245
CCC AGT TCC ACC TTC ACC TCC AGC TCC ACC TAT ACC CCC GGT GAC T
Pro Ser Ser Thr Phe Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Thr Pro Gly Aao C
250 255 260
; CCC AAC TTT GCG GCT CCC CGC AGA GAG GTG GCA CCA CCC TAT CAG G
Pro Aan Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Val Ala Pro Pro Tyr Gin G
265 270 275 2 «te ·*·
GCT GAC CCC ATC CTT GCG ACA GCC CTC GCC TCC GAC CCC ATC CCC A
Ala Aap Pro He Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Asp Pro He Pro A
: 285 290 295 ··· # e
#..T CCC CTT CAG AAG TGG GAG GAC AGC GCC CAC AAG CCA CAG AGC CTA G
P*o Leu Gin Lys Trp Glu Asp Ser Ala His Lys Pro Gin Ser Leu A ...: 300 305 310 e ee • e #
ACT GAT GAC CCC GCG ACG CTG TAC GCC GTG GTG GAG AAC GTG CCC C
Thr Asp Asp Pro Ala Thr Leu Tyr Ala Vai Vai Glu Asn Val Pro P
315 320 325 • e e • e e
TTG CGC TGG AAG GAA TTC GTG CGG CGC CTA GGG CTG AGC GAC CAC G
: : Leu Xre T.UII Phe Vat Ä *-rr a Ten Clw T.en a ΐ « r.
87 ACC CTC GAG CTG CTG GGA CGC GTG CTC CGC GAC ATG GAC CTG CTG (
Thr Leu Glu Leu L«u Gly Arg Val Leu Arg Asp Met Asp Leu Leu ( 380 385 390 TGC CTG GAG GAC ATC GAG GAG GCG CTT TGC GGC CCC GCC GCC CTC (
Cys Leu Glu Asp lie Glu Glu Ala Leu Cys Gly Pro Ala Ala Leu ] 395 400 405 CCC GCG CCC AGT CTT CTC AGA TGA »ro Ala Pro Ser Leu Leu Arg 410 415 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; (A) LENGTH: 45S amino acids (8) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4:
Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu : -40 -35 -30
Glu Leu Leu Val Gly lie Tyr Pro Ser Gly Val lie Gly Leu Val 1 -20 -IS -10
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gin Gly : -5 1 5
Tyr lie His Pro Gin Asn Asn Ser lie Cys Cys Thr Lys Cys His : . 10 IS 20 ::: •«t ... : Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr ] * ’ 25 30 35 ft · • · · "Y Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His : ·:· 45 50 55 »*** * *;* Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gin 1 60 ' 65 7 0 * · · e
Glu lie Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Aso Thr Val Cys Gly Cys i 75 80 85 .
• * »
::: l*ys Asn Gln TYr A-S Kis rY- Tr? ser Glu Asn Leu Phe Gin Cys I
•ft Λ A ft- m a A
88
Ly» Leu Cys Leu Pro Gin II· Glu Aan Vai Ly» Gly Thr Glu As; 155 160 165
Gly Thr Thr Val Leu Leu Pro Leu Val lie Phe Phe Gly Leu Cyi 170 175 180
Leu Ser Leu Leu Phe He Gly Leu Met Tyr Arg Tyr Gin Arg Tri 115 190 195
Ser Lys Leu Tyr Ser He Val Cys Gly Lys Ser Thr Pro Glu Lyj 205 210 211
Gly Glu Leu Glu Gly Thr Thr Thr Lys Pro Leu Ala Pro Asn Pr( 220 225 230
Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr Pro Thr Leu Gly Phe Ser Pr< 235 240 245
Pro Ser Ser Thr Phe Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Thr Pro Gly As| 250 255 260
Pro Asn Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Val Ala Pro Pro Tyr Gli 265 270 275
Ala Asp Pro He Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Asp Pro He Pri 2B5 290 29!
Pro Leu Gin Lys Trp Glu Asp Ser Ala His Lys Pro Gin Ser Lei 300 305 310
Thr Asp Asp Pro Ala Thr Leu Tyr Ala Val Val Glu Asn Val Pr< 315 320 325
Leu Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg Arg Leu Gly Leu Ser Asp Hi; 330 335 340 • * H« Asp Arg Leu Glu Leu Gin Asn Gly Arg Cys Leu Arg Glu Al; . 345 350 355 • 9Ψ * ; .\ Tyr Ser Met Leu Ala Thr Trp Arg Arg Arg Thr Pro Arg Arg Gli :.:: 365 3?o 37! e · · *··· Thr Leu Glu Leu Leu Gly Arg Val Leu Arg Asp Met Asp Leu Lei .:· 380 385 390 ....
:T: cys Leu Glu Asp He Glu Glu Ala Leu Cys Gly Pro Ala Ala Lei * 395 400 405 . pro Ala Pro Ser Leu Leu Arg ::: 410 4is ...
89
(ill) HYPOTHETICAL: HO (lv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (vii> IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: HUIL-1R
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 84..1793 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: mat^peptide (B) LOCATION: 144..1790 (ix) FEATURE: (λ) NAME/KEY: sig_peptide (B) LOCATION: 84..143 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5: AGACGCACCC TCTGAAGATG GTGGACTCCC TCCTGAGAAG CTGGGACCCC TTGGT#
ACAAGGCCTT CTCCAAGAAG AAT ATG AAA GTG TTA CTC AGA CTT ATT TGI
Met Lys Val Leu Leu Arg Leu lie Cys -20 -15
TTC ATA GCT CTA CTG ATT TCT TCT CTG GAG GCT GAT AAA TGC AAG C
Phe lie Ala Leu Leu lie Ser Ser Leu Glu Ala Asp Lys Cys Lys C
-10 .-5 1 * e e
m*\ CGT GAA GAA AAA ATA. ATT TTA GTG TCA TCT GCA AAT GAA ATT GAT C
: Arg Glu Glu Lys Ile He Leu Vai Ser Ser Ala Asn Glu He Asp \ - . 10 15 20 * · ·
*e * * I
CGT CCC TGT CCT CTT AAC CCA AAT GAA CAC AAA GGC ACT ATA ACT 1 ·*.; Arg Pro Cys Pro Leu Asn Pro Asn Glu His Lys Gly Thr He Thr 1 .:, 25 30 35 e ***» tat aaa gat gac agc aag,aca cct gta tct aca gaa caa gcc tcc j * Tyr Lys Asp Asp Ser Lys Thr Pro Vai Ser Thr Glu Gin Ala Ser f 40 * 45 50 Ψ
\ί/ ATT CAT CAA CAC AAA GAG AAA CTT TGG TTT GTT CCT GCT AAG GTG C
··* Tift « l.v* Sin Lvi T>*n Tr» Phft Va 1 Pm Ala T.tr* 17a 1 C
90 ΤλΤ ΛλΤ GCA CAA GCC ΑΤΑ TTT AAG CAG AAA CTA CCC GTT GCA GGA Gi
Tyr Asn Ala Gin Ala lie Phe Lys Gin Lys Leu Pro Val Ala Gly A: 105 110 115
GGA GGA CTT GTG TGC CCT TAT ATG GAG TTT TTT AAA AAT GAA AAT AI
Gly Gly Leu Val Cys Pro Tyr Met Glu Phe Phe Lys Asn Glu Asn hi 120 125 130 GAG TTA CCT AAA TTA CAG TGG TAT AAG GAT TGC AAA CCT CTA CTT Cl
Glu Leu Pro Lys Leu Gin Trp Tyr Lys Asp Cys Lys Pro Leu Leu U
135 140 145
GAC AAT ATA CAC TTT AGT GGA GTC AAA GAT AGG CTC ATC GTG ATG AJ
Asp Asn lie His Phe Ser Gly Val Lys Asp Arg Leu lie Val Met hi
150 155 160 U
GTG GCT GAA AAG CAT AGA GGG AAC TAT ACT TGT CAT GCA TCC TAC AC
Val Ala Glu Lys His Arg Gly Asn Tyr Thr Cys His Ala Ser Tyr TI
170 175 180
TAC TTG GGC AAG CAA TAT CCT ATT ACC CGG GTA ATA GAA TTT ATT AC
Tyr Leu Gly Lys Gin Tyr Pro lie Thr Arg Val lie Glu Phe lie TI
1Θ5 190 195 CTA GAG GAA AAC AAA CCC ACA AGG CCT GTG ATT GTG AGC CCA GCT hi
Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr Arg Pro Val He Val Ser Pro Ala hi 200 205 210 QAG ACA ATG GAA GTA GAC TTG GGA TCC CAG ATA CAA TTG ATC TGT hi
Glu Thr Met Glu Val Asp Leu Gly Ser Gin He Gin Leu He Cys Ai 215 220 225
GTC ACC GGC CAG TTG AGT GAC ATT GCT TAC TGG AAG TGG AAT GGG TC
Val Thr Gly Gin Leu Ser Asp Ile Ala Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Se , 230 235 240 2< e e e e · ‘ ’, GTA ATT GAT GAA GAT GAC CCA GTG CTA GGG GAA GAC TAT TAC AGT Gl ***** Val He Asp Glu Asp Asp Pro Val Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Vi ; 250 255 260 • « · ♦ ·· · .:. GAA AAT CCT GCA AAC AAA AGA AGG AGT ACC CTC ATC ACA GTG CTT hi ·*** Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg Arg Ser Thr Leu He Thr Val Leu A; ·:· 265 270 275 a*«* ata tcg gaa att gaa agt aga ttt tat aaa cat cca ttt acc tgt ti
,Ile Ser Glu He Glu Ser Arg Phe Tyr Lys His Pro Phe Thr Cys PI
280 285 290 9 see *·!·’ GCC AAG AAT ACA CAT GGT ATA GAT GCA GCA TAT ATC CAG TTA ΑΤΑ Ti *·· . « _ .___ * _ _ _ ... _ .___ —___ ., . . . . _ 91 GAC ATT GTG CTT TGG TAC ACC GAT TCC TGC TAT GAT TTT CTC CCA AT,
Asp Ile Val Leu Tip Tyr Arg Asp Ser Cys Tyr Asp Phe Leu Pro II
345 350 355
AAA GOT TCA GAT GGA AAG ACC TAT GAC GCA TAT ATA CTG TAT CCA AA
Lys Ala Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Ala Tyr He Leu Tyr Pro Ly 360 365 370
ACT GTT GGG GAA GGG TCT ACC TCT GAC TGT GAT ATT TTT GTG TTT AA
Thr Vai Gly Glu Gly Ser Thr Ser Asp Cys Asp He Phe Val Phe Ly 375 380 385
OTC TTG CCT GAG GTC TTG GAA AAA CAG TGT GGA TAT AAG CTG TTC AT
Val Leu Pro Glu Val Leu Glu Lys Gin Cys Gly Tyr Lys Leu Phe II
390 395 400 40
TAT GGA AGG GAT GAC TAC GTT GGG GAA GAC ATT GTT GAG GTC ATT AA
Tyr Gly Arg Asp Asp Tyr Vai Gly Glu Asp Ile Val Glu Val He As 410 415 420
GAA AAC GTA AAG AAA AGC AGA AGA CTG ATT ATC ATT TTA GTC AGA GA
Glu Asn Val Lys Lys Ser Arg Arg Leu He He He Leu Vai Arg G1 425 430 435
ACA TCA GGC TTC AGC TGG CTG GGT GGT TCA TCT GAA GAG CAA ATA GC
Thr Ser Gly Phe Ser Trp Leu Gly Gly Ser Ser Glu Glu Gin He A1 440 445 450
ATG TAT AAT GCT CTT GTT CAG GAT GGA ATT AAA GTT GTC CTG CTT GA
Met Tyr Asn Ala Leu Val Gin Asp Gly He Lys Val Val Leu Leu G1 455 460 465
CTG GAG AAA ATC CAA GAC TAT GAG AAA ATG CCA GAA TCG ATT AAA TT
Leu Glu Lys He Gin Asp Tyr Glu Lys Met Pro Glu Ser He Lvs Ph . 470 475 480 * 48 • · · ♦ · s
%\\\ ATT AAG CAG AAA CAT GGG GCT ATC CGC TGG TCA GGG GAC TTT ACA CA
*·’*’ He Lys Gin Lys His Gly Ala He Arg Trp Ser Gly Asp Phe Thr G1 : 490 495 500 e e e • e« ·
.:. GGA CCA CAG TCT GCA AAG ACA AGG TTC TGG AAG AAT GTC AGG TAC CA
···* Gly Pro Gin Ser Ala Lys Thr Arg Phe Trp Lys Asn Val Arg Tyr Hi ·:· 505 510 515 tee e
2.:*: ATG CCA GTC CAG CGA CGG TCA CCT TCA TCT AAA CAC CAG TTA CTG TC
Met Pro Val Gin Arg Arg Ser Pro Ser Ser Lys His Gin Leu Leu Se 520 525 530 ^ *
'*!· CCA GCC ACT AAG GAG AAA CTG CAA AGA GAG GCT CAC GTG CCT CTC GG
·*· »__IKL. .--- /-1.. T-- _ .___ ., , _ , _ 192
GGCTCACGCC TATAATCCCA GCACTTTGGG AGOCTGAAGT GGGTGGATCA CCAGAC GGAGTTCGAG ACCAGCCCAG CCAACATGGC AAAACCCCAT CTCTACTAAA AATACi TGAGCTAGGC ATGGTGGCAC ACGCCTGTAA TCCCAGCTAC ACCTGAGGCT GAGGCJ AATTGCTTGA ACCGGGGAGA CGGAGGTTGC AGTGAGCCGA GTTTGGGCCA CTGCA( GCCTGGCAAC AGAGCAAGAC TCCGTCTCAA AAAAAGGGCA ATAAATGCCC TCTCTC TTTGAACTGC CAAGAAAAGG CATGGAGACA GCGAACTAGA AGAAAGGGCA AGAAGi AGCCACCGTC TACAGATGGC TTAGTTAAGT CATCCACAGC CCAAGGGCGG CGGCTJ TTGTCTGGGG ACCCTGTAGA GTCACTGACC CTGGAGCGGC TCTCCTGAGA GGTGC" OCAAAGTGAG ACTGACACCT cactgaggaa GGGAGACATA TTCTTGGAGA ACTTT( TGCTTGTATT TTCCATACAC ATCCCCAGCC AGAAGTTAGT GTCCGAAGAA GAGCT1 ACTCACTTCA ATGAACAAAG GGATTCTCCA GGATTCCAAA GTTTTGAAGT CATCT1 TTCCACAGGA GGGAGAGAAC TTAAAAAAGC AACAGTAGCA GGGAATTGAT CCACT'. ATGCTTTCCT CCCTGGCATG ACCATCCTGT CCTTTGTTAT TATCCTGCAT TTTAC( TGGAGGAACA GCTCCCTAGT GGCTTCCTCC GTCTGCAATG TCCCTTGCAC AGCCCJ TGAACCATCC TTCCCATGAT GCCGCTCTTC TGTCATCCCG CTCCTGCTGA AACAC( AGGGGCTCCA CCTGTTCAGG AGCTGAAGCC CATGCTTTCC CACCAGCATG TCACTi ' ACCACCTCCC TGCCCTGTCC T
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6: • ** ! (i> SEQUENCE CHARACTERISTICS: • J*. CA> LENGTH: 569 amino acids ***e* CB) TYPE: amino acid ·;· (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein V 1 (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6:
Met Lys Val Leu Leu Arg Leu Ile Cys Phe He Ala Leu Leu He ! ; -20 -15 -10 *»· *·· 93 L*u Trp Phe Val Pro Ale Lye Val Glu Asp Ser Gly Hi* Tyr Ty 65 70 7
Vai Vai Arg Aan Ser Set Tyr Cys Leu Arg lie Lys Ile Ser A1 Θ0 65 90
Phe Val Glu Asn Glu Pro Aan Leu Cys Tyr Asn Ala Gin Ala II 95 100 105
Lys Gin Lys Leu Pro Val Ala Gly Asp Gly Gly Leu Vai Cys Pr 110 115 120
Met Glu Phe Phe Lys Asn Glu Aan Asn Glu Leu Pro Lys Leu G1 125 130 135
Tyr Lya Asp Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn He His Phe Se 145 150 15
Val Lys Asp Arg Leu He Val Met Asn Val Ala Glu Lys His Ar 160 165 170
Asn Tyr Thr Cys His Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Gly Lys Gin Ty 175 180 165 lie Thr Arg Val He Glu Phe lie Thr Leu Glu Glu Asn Lys Pr 190 195 200
Arg Pro Val He Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr Met Glu Val As 205 210 215
Gly Ser Gin He Gin Leu He Cys Asn Val Thr Gly Gin Leu Se 225 230 23
He Ala Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Val He Asp Glu Asp As . 240 245 250 • · • · · ···
Val Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala Asn Ly * * 255 260 265 : ··* · Arg Ser Thr Leu He Thr Val Leu Asn He Ser Glu He Glu Se ·:· 270 275 280 eee* *:· Phe Tyr Lys His Pro Phe Thr Cys Phe Ala Lys Asn Thr His G1 285 290 295 • · e *·* *
Asp Ala Ala Tyr lie Gin Leu He Tyr Pro Vai Thr Asn Phe G1 305 310 31 e • e e 1 ί·* His Met He Gly He Cys Val Thr Leu Thr Val He He Val Cy 94 S*r Asp Cys Asp Ile Phe Vai Ph· Lys Vai L*u Pro Glu Vai Li 3Θ5 390 3!
Lys Gin Cys Gly Tyr Lys Leu Phe Ile Tyr Gly Arg Asp Asp Tj 400 405 410
Gly Glu Asp Ile Vai Glu Vai Ile Asn Glu Asn Vai Lys Lys Si 415 420 425
Arg Leu Ile Ile Ile Leu Vai Arg Glu Thr Ser Gly Phe Ser Ti 430 435 440
Gly Gly Ser Ser Glu Glu Gin Ile Ala Het Tyr Asn Ala Leu Vi 445 450 455
Asp Gly Ile Lys Vai Vai Leu Leu Glu Leu Glu Lys Ile Gin Ai 465 470 4:
Glu Lys Met Pro Glu Ser Ile Lys Phe Ile Lys Gin Lys His G] 480 4B5 490
Ile Arg Trp Ser Gly Asp Phe Thr Gin Gly Pro Gin Ser Ala Lj 495 500 505
Arg Phe Trp Lys Asn Vai Arg Tyr His Met Pro Vai Gin Arg hi 510 515 520
Pro Ser Ser Lys His Gin Leu Leu Ser Pro Ala Thr Lys Glu L} 525 530 535
Gin Arg Glu Ala His Vai Pro Leu Gly 545 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: • · e (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: *:**: (A) LENGTH: 1357 base pairs • β·β (B) TYPE: nucleic acid :,: : (O STRANDEDNESS: single .:. (D) TOPOLOGY: linear • ••e
··. (ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
• eee (i±i) hypothetical: no <iv) ANTI-SENSE: NO (vi) ORIGINAL SOURCE: .···. (A) ORGANISM: Homo sapiens • e ***** * _ %«.* . . , . .
95 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: matjeptide (B) LOCATION: 193..1347 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: eig_peptide ΪΒ) LOCATION: 154..192 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7: CTGGAAAATA CATTCTGCTA CTCTTAAAAA CTAGTGACGC TCATACAAAT CAACAGAi AGCTTCTGAA GGAAGACTTT AAAGCTGCTT CTGCCACGTG CTGCTGGGTC TCAGTCC1 ACTTCCCGTG TCCTCTGGAA GTTGTCAGGA GCA ATG TTG CGC TTG TAC GTG T1
Met Leu Arg Leu Tyr Vai U -13 -10 GTA ATG GGA GTT TCT GCC TTC ACC CTT CAG CCT GCG GCA CAC ACA GG<
Val Met Gly Val Ser Ala Phe Thr Leu Gin Pro Ala Ala Hia Thr Glj -5 1 5 1(
GCT GCC AGA AGC TGC CGG TTT CGT GGG AGG CAT TAC AAG CGG GAG TTC
Ala Ala Arg Ser Cys Arg Phe Arg Gly Arg His Tyr Lys Arg Glu Phi 15 20 25
AGG CTG GAA GGG GAG CCT GTA GCC CTG AGG TGC CCC CAG GTG CCC TAC
Arg Leu Glu Gly Glu Pro Val Ala Leu Arg Cys Pro Gin Val Pro Tyj 30 35 40
TGG TTG TGG GCC TCT GTC AGC CCC CGC ATC AAC CTG ACA TGG CAT AAJ
Trp Leu Trp Ala Ser Val Ser Pro Arg He Asn Leu Thr Trp His Ly: 45 50 55 e e e e AAT GAC TCT GCT AGG ACG GTC CCA GGA GAA GAA GAG ACA CGG ATG TGC ·;**; Asn Asp Ser Ala Arg Thr Val Pro Gly Glu Glu Glu Thr Arg Met Trj . . 60 65 70 • e · e « e
"V GCC CAG GAC GGT GCT CTG TGG CTT CTG CCA GCC TTG CAG GAG GAC TC
,..: Ala Gin Asp Gly Ala Leu Trp Leu Leu Pro Ala Leu Gin Glu Asp Se: .:. 75 80 85 9( mm GGC ACC TAC GTC TGC ACT ACT AGA AAT GCT TCT TAC TGT GAC AAA AT( ** * Gly Thr Tyr Val Cys Thr Thr Arg Asn Ala Ser Tyr Cys Asp Lys Mel 95 100 105 TCC ATT GAG CTC AGA GTT TTT GAG AAT ACA GAT GCT TTC CTG CCG TT< .***. Ser lie Glu Leu Arg Val Phe Glu Asn Thr Asp Ala Phe Leu Pro Ph< ♦ e 4 4 Λ < « e · aa 4 96 CAA TGG TAC AAG GAT TCT CTT CTT TTG GAT AAA GAC AAT GAG AAA TT7
Gin Trp Tyr Lys Asp Ser Leu Leu Leu Asp Lys Asp Asn Glu Lys Phe
155 160 165 17C
CTA ACT GTG AGG GGG ACC ACT CAC TTA CTC GTA CAC GAT GTG GCC CTG
Leu Ser Val Arg Gly Thr Thr His Leu Leu Val His Asp Val Ala Leu 175 180 185
GAA GAT GCT GGC TAT TAC CGC TGT GTC CTG ACA TTT GCC CAT GAA GGC
Glu Asp Ala Gly Tyr Tyr Arg Cys Val Leu Thr Phe Ala His Glu Gl> 190 195 200
CAG CAA TAC AAC ATC ACT AGG AGT ATT GAG CTA CGC ATC AAG AAA AAA
Gin Gin Tyr Asn lie Thr Arg Ser lie Glu Leu Arg lie Lys Lys Lya 205 210 215 AAA GAA GAG ACC ATT CCT GTG ATC ATT TCC CCC CTC AAG ACC ATA TCi
Lys Glu Glu Thr lie Pro Val lie lie Ser Pro Leu Lys Thr lie Sez 220 225 230 GCT TCT CTG GGG TCA AGA CTG ACA ATC CCG TGT AAG GTG TTT CTG GGi
Ala Ser Leu Gly Ser Arg Leu Thr lie Pro Cys Lys Val Phe Leu Gl*
235 240 245 25C
ACC GGC ACA CCC TTA ACC ACC ATG CTG TGG TGG ACG GCC AAT GAC ACC
Thr Gly Thr Pro Leu Thr Thr Met Leu Trp Trp Thr Ala Asn Asp Thz 255 260 265
CAC ATA GAG AGC GCC TAC CCG GGA GGC CGC GTG ACC GAG GGG CCA CGC
His lie Glu Ser Ala Tyr Pro Gly Gly Arg Val Thr Glu Gly Pro Arc 270 275 280
CAG GAA TAT TCA GAA AAT AAT GAG AAC TAC ATT GAA GTG CCA TTG ATI
Gin Glu Tyr Ser Glu Asn Asn Glu Asn Tyr lie Glu Val Pro Leu 11« , 285 290 295 V : .!!*; TTT ^T CCT GTC ACA AGA GAG GAT TTG CAC ATG **** TTT AAA TGT GT1 *·* · Phe Asp Pro Val Thr Arg Glu Asp Leu His Met Asp Phe Lys Cys Va] : .·. 300 305 310 e e · *** ·
.:. GTC CAT AAT ACC CTG AGT TTT CAG ACA CTA CGC ACC ACA GTC AAG GAJ
'*** Val His Asn Thr Leu Ser ?he Gin Thr Leu Arg Thr Thr Val Lys Gli
*;· 315 320 325 33C
«Ml
:T: GCC TCC TCC ACG TTC TCC TGG GGC ATT GTG CTG GCC CCA CTT TCA CTC
Ala Ser Ser Thr Phe Ser Trp Gly lie Val Leu Ala Pro Leu Ser Lei 335 340 345 e e · e GCC TTC TTG GTT TTG GGG GGA ATA TGG ATG CAC AGA CGG TGC AAA CAC !***· Ala Phe Leu Val Leu Gly Glv lie Trp Met His Arc Ara Cvs Lvs Hi· I (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:S: 97 I (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; I (A) LENGTH; 398 amino acids I (B) TYPE: amino acid I (D) TOPOLOGY: linear I (ii) MOLECULE TYPE; protein I (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8: I Met Leu Arg Leu Tyr Val Leu Val Met Gly Val Ser Ala Phe I -13 -10 -5 1 I Gin Pro Ala Ala His Thr Gly Ala Ala Arg Ser Cys Arg Phe I 5 10 15 I Arg His Tyr Lya Arg Glu Phe Arg Leu Glu Gly Glu Pro Val I 20 25 30 I Arg Cys Pro Gin Val Pro Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Val Ser I 40 45 I lie Asn Leu Thr Trp His Lys Asn Asp Ser Ala Arg Thr Val I 55 60 65 I Glu Glu Glu Thr Arg Met Trp Ala Gin Asp Gly Ala Leu Trp I 70 75 80 I Pro Ala Leu Gin Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Val Cys Thr Thr I 85 90 95 I Ala Ser Tyr Cys Asp Lys Met Ser lie Glu Leu Arg Val Phe I 100 105 110 I : Thr Asp Ala· Phe Leu Pro Phe lie Ser Tyr Pro Gin lie Leu I *··. 120 125 I eee - · I · « I · .^ Ser Thr Ser Gly Val Leu Val Cys Pro Asp Leu Ser Glu Phe I :.:: 135 140 145 I *·* I ...: Asp Lys Thr Asp Val Lys lie Gin Trp Tyr Lys Asp Ser Leu I .:. 150 155 160 »»♦« I ;*·*; Asp Lys Asp Asn Glu Lys Phe Leu Ser Val Arg Gly Thr Thr I · 165 170 175 I . Leu Val His Asp Val Ala Leu Glu Asp Ala Gly Tyr Tyr Arg 98
Pro Cys Lys Val Phe Uu Gly Thr Gly Thr Pro Leu Thr Thr Mot U
245 250 -255
Trp Trp Thr Ala Asn Asp Thr His lie Glu Ser Ala Tyr Pro Gly G3 260 265 270 2-
Arg Val Thr Glu Gly Pro Arg Gin Glu Tyr Ser Glu Aan Asn Glu Ai 2Θ0 2B5 290
Tyr lie Glu Val Pro Leu lie Phe Asp Pro Vai Thr Arg Glu Asp U 295 300 305
His Met Asp Phe Lys Cys Val Val His Asn Thr Leu Ser Phe Gin Ti 310 315 320
Leu Arg Thr Thr Vai Lys Glu Ala Ser Ser Thr Phe Ser Trp Gly I] 325 330 335
Val Leu Ala Pro Leu Ser Leu Ala Phe Leu Val Leu Gly Gly He Tj 340 345 350 3!
Met His Arg Arg Cys Lys His Arg Thr Gly Lys Ala Asp Gly Leu T! 360 365 370
Val Leu Trp Pro His His Gin Asp Phe Gin Ser Tyr Pro Lys 375 3Θ0 385 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear e e e e • · * • ee e txi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9: * * :.: : ctgaagggag cactggcgac taaggatcca e e e e •••| (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10: e e e ***; <i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: : <A> LENGTH: 45 base pairs <B> TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single , tD> TOPOLOGY: linear e e e ··# 99 <Β> ΓΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear <xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11: AGTCTGCACG TCCACGTCCC CCACCCGGTG AGC (2i INFORMATION FOR SEQ ID NO:12: ti) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 12 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12: GATCTGTTGA GC
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 36 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear . (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13: • 1 « • ♦ «
CTGAAACATC AGACGTGGTG TGCAAGCCCT GTTAAA
• 1 ; ... (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14: * 1 1 ··1 · .:. (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: *··ί (A) LENGTH: 29 base pairs ... (B) TYPE: nucleic acid <C> STRANDEDNESS: single :T: (D) TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14: )·( • a <xi> SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:15: 10° GCGCGGCCGC TCAGGAGGAG GCTTCCTTGA CTG (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16: U) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 66 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: CDNA to mRNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 3..65 <xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16: CT GAA GGG AGC ACT GGC GAC GGT GGC GGT GGA TCC GGC GGT GGC G Glu Gly Ser Thr Gly Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly G 15 10 GGC TCA TTG CCC GCC CAG G Gly Ser Leu Pro Ala Gin 20 . e.e (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17:
• « I
*f * ...-: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 4 (A) LENGTH: 21 amino acids : ;·. (B) TYPE: amino acid ·"/ (D) TOPOLOGY: linear see a ii.il MOLECULE TYPE; protein a <xi> SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17; I · i
Glu Gly Ser Thr Gly Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly • 15 • . .
*“··’ Ser Leu Pro Ala Gin *»· _ ? · 20 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:18: i 101
ACCGAGGGAC CTGAGCG
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:19: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 53 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single <D) TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:19: TGAGCCGCCG CCACCGCCGG ATCCACCGCC ACCAGTGACT GGATATATTA ACT (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:20: (i> SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 51 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:20:
GGTGGCGGTG GATCCGGCGG TGGCGGCGGC TCATTGCCCG CCCAGGTGGC A
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:21: !e:1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 18 base pairs *·1 : (B) TYPE: nucleic acid : .·, (C) STRANDEDNESS: single :.: : (D) TOPOLOGY: linear • a1 ···» * • · » *::! (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:21: • 1 · • 1 e
GCTTGCTCAG CGCGCAGT
__— ··· • aa a a a a « a

Claims (8)

1. Eristetty DNA, tunnettu siitä, että daa fuusioproteiinia, jolla on kaava: 5 TNF-R-kytkij äj akso-TNF-R jossa kytkijäjakso on peptidikytkijäjakso.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA, t u i 10 siitä, että se koodaa fuusioproteiinia, jossa pepti jajakso sisältää 5 - 100 aminohappoa, jotka on ryhmästä, johon kuuluvat glysiini, asparagiini, treoniini ja alaniini.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA, t u i 15 siitä, että se koodaa fuusioproteiinia, jossa TNF-R on liukoinen TNF-R-polypeptidi.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen DNA, t u ] siitä, että se koodaa fuusioproteiinia, jossa liukoinen TNF-R sisältää aminohapposekvenssin, 20 sekvenssin tunnusnumeron 1 mukaiset aminohapot 1 -22 - x, jossa x on kokonaisluku 163 - 235. , 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA, tui • * * siitä, että se koodaa fuusioproteiinia, jossa V f φ . , TNF-R:ää koodaa DNA, joka on sekvenssin tunnusnum • · · 25 tai 3 esitettyä nukleotidisekvenssiä sisältävä DNA • * * *··· joka kykenee hybridi s oltuinaan kohtalaisesti rajoi ...T olosuhteissa sekvenssin tunnusnumeron 1 ja/tai s€ ·.· : tunnusnumeron 3 mukaiseen nukleotidisekvenssiin, R: ää koodaava DNA koodaa biologisesti aktiivisti :.i!; 30 polypeptidiä. ·***· 6. Ilmentämisvektori, tunnettu siitä, TNF-R-polypeptidikytkij äjakso-TNF-R, tunnettu siitä, että viljellään patenttivaatiri mukaisella ilmentämisvektorilla transformoitua isä 5 olosuhteissa, jotka edistävät fuusioproteiinin mistä, ja otetaan fuusioproteiini talteen.
8. Menetelmä farmaseuttisen koostumuksen v miseksi, joka sisältää patenttivaatimuksen 1 mukais koodaamaa fuusioproteiinia, tunnettu siitä, et 10 jellään isäntäsolua, joka sisältää ilmentämisvektor sisältää mainitun DNA:n olosuhteissa, jotka edistä' sioproteiinin ilmentymistä, ja otetaan fuusioprotei, teen ja sekoitetaan se sopivan laimentimen, lisäai: tai kantaja-aineen kanssa. • · I • « ♦ ·· · ··» i • 1 • · • · 1 ♦ · 1 ··· I 9 9 9% 9 ···· • I· *99 • · · % • ♦ « • · 9 •9% 99 • « • ·
FI944516A 1992-03-30 1994-09-29 Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaava DNA ja vektori FI116943B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US86071092A 1992-03-30 1992-03-30
US86071092 1992-03-30
PCT/US1993/002938 WO1993019777A1 (en) 1992-03-30 1993-03-26 Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor
US9302938 1993-03-26

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI944516A0 FI944516A0 (fi) 1994-09-29
FI944516A FI944516A (fi) 1994-11-22
FI116943B true FI116943B (fi) 2006-04-13

Family

ID=25333845

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI944516A FI116943B (fi) 1992-03-30 1994-09-29 Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaava DNA ja vektori
FI20051161A FI120042B (fi) 1992-03-30 2005-11-15 Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaavia polynukleotideja ja vektoreita

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20051161A FI120042B (fi) 1992-03-30 2005-11-15 Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaavia polynukleotideja ja vektoreita

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20060275868A1 (fi)
EP (2) EP1239043A3 (fi)
JP (1) JPH07508639A (fi)
KR (1) KR950700937A (fi)
AT (1) ATE242322T1 (fi)
AU (1) AU671116B2 (fi)
CA (1) CA2133326C (fi)
DE (1) DE69333027T2 (fi)
ES (1) ES2197149T3 (fi)
FI (2) FI116943B (fi)
NO (1) NO323197B1 (fi)
NZ (1) NZ251820A (fi)
WO (1) WO1993019777A1 (fi)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995006737A1 (en) * 1993-09-03 1995-03-09 Kenneth Francis Prendergast Glycophorin binding protein (gbp130) fusion compositions
AU705595B2 (en) * 1994-09-09 1999-05-27 Neurocrine Biosciences, Incorporated Interleukin-1 type 3 receptors
US6239268B1 (en) 1994-09-09 2001-05-29 Neurocrine Biosciences, Inc. Interleukin-1 type 3 receptors
US5849501A (en) * 1994-10-19 1998-12-15 Genetics Institute, Inc. TNF receptor death domain ligand proteins and method to identify inhibitors of ligand binding
US5852173A (en) * 1994-10-19 1998-12-22 Genetics Institute, Inc. TNF receptor death ligand proteins and inhibitors of ligand binding
US5712381A (en) 1994-10-19 1998-01-27 Genetics Institute, Inc. MADD, a TNF receptor death domain ligand protein
US5847099A (en) * 1994-10-19 1998-12-08 Genetics Institute, Inc. TNF receptor death domain ligand proteins
US6194177B1 (en) 1996-02-20 2001-02-27 Applied Research Systems Ars Holding N.V. DNA encoding a hybrid heterodimeric protein
NZ331539A (en) 1996-02-20 2000-01-28 Applied Research Systems Hybrid proteins from two coexpressed receptors to form a heterodimer
EP2002846B1 (en) 1996-12-06 2017-01-25 Amgen Inc. Combination therapy using an IL-1 inhibitor for treating IL-1 mediated diseases
US7070771B1 (en) 1996-12-09 2006-07-04 Regents Of The University Of California Methods of expressing chimeric mouse and human CD40 ligand in human CD40+ cells
US6893838B1 (en) 1998-04-07 2005-05-17 Genetics Institute Llc DADD, death activator death domain protein
JP2002530273A (ja) * 1998-07-13 2002-09-17 パーカシュ エス． ギル， 脈管形成および腫瘍増殖の新規インヒビター
US6472179B2 (en) * 1998-09-25 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
US6927044B2 (en) 1998-09-25 2005-08-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. IL-1 receptor based cytokine traps
US7083949B2 (en) 1998-09-25 2006-08-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
AU2000236029A1 (en) * 1999-02-23 2000-09-14 Anne Chew Receptor isogenes: polymorphisms in the tissue necrosis factor receptor
US6627199B1 (en) 1999-07-09 2003-09-30 Amgen Inc Isolation, identification and characterization of tmst2, a novel member of the TNF-receptor supergene family
MXPA02001264A (es) 1999-08-04 2002-07-22 Amgen Inc Fhm, nuevo miembro de la familia de supergenes de ligando de factor de necrosis tumoral.
AU6517800A (en) 1999-08-04 2001-03-05 Amgen, Inc. Ntr3, a member of the tnf-receptor supergene family
US6808902B1 (en) 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
KR100408017B1 (ko) * 2000-11-15 2003-12-06 김영상 종양괴사인자와 인터루킨-4의 융합단백질
NZ530765A (en) 2001-06-26 2006-11-30 Amgen Fremont Inc Antibodies that bind OPGL and compositions and methods for the treatment of bone diseases
AU2002324625B2 (en) * 2001-08-07 2008-05-08 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors in the treatment of diseases
WO2003026695A1 (en) * 2001-09-21 2003-04-03 Genset S.A. Agonists and antagonists of cylixin for the treatment of metabolic disorders
US7786282B2 (en) 2001-12-06 2010-08-31 The Regents Of The University Of California Nucleic acid molecules encoding TNF-α ligand polypeptides having a CD154 domain
CN1304425C (zh) * 2002-07-01 2007-03-14 上海兰生国健药业有限公司 含可溶性肿瘤坏死因子II型受体和白介素I受体拮抗剂IL1Ra的融合蛋白及其制备方法
EP1781684A4 (en) * 2004-08-25 2008-05-21 Amprotein Corp NEW CHIMERE POLYPEPTIDE AND USE THEREOF
US7833527B2 (en) 2006-10-02 2010-11-16 Amgen Inc. Methods of treating psoriasis using IL-17 Receptor A antibodies
US8277650B2 (en) 2009-03-13 2012-10-02 Terrasep, Llc Methods and apparatus for centrifugal liquid chromatography
TW201117824A (en) 2009-10-12 2011-06-01 Amgen Inc Use of IL-17 receptor a antigen binding proteins
US9321999B2 (en) 2009-11-19 2016-04-26 Solis Biodyne Oü Compositions for increasing polypeptide stability and activity, and related methods
EA201891433A3 (ru) 2010-01-15 2019-02-28 Кирин-Эмджен, Инк. Состав антитела и терапевтические режимы
US20140234330A1 (en) 2011-07-22 2014-08-21 Amgen Inc. Il-17 receptor a is required for il-17c biology
KR102530900B1 (ko) 2014-03-31 2023-05-12 암젠 케이-에이, 인크. 손발톱 및 두피 건선의 치료 방법
WO2019060695A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 Kite Pharma, Inc. CHIMERIC POLYPEPTIDES AND USES THEREOF
CN115073607A (zh) * 2021-03-12 2022-09-20 上海康岱生物医药技术股份有限公司 Tnfr2与baff受体的融合蛋白
CN115944714B (zh) * 2022-10-20 2023-12-15 苏州大学 能够同时抗白细胞介素1和肿瘤坏死因子炎症的纳米材料及其制备方法与应用

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4769326A (en) * 1980-02-29 1988-09-06 The Regents Of The University Of California Expression linkers
JPS61139317U (fi) * 1985-02-19 1986-08-29
US5342921A (en) * 1985-03-28 1994-08-30 Chiron Corporation Superoxide dismutase fusion polypeptides for expression of mammalian proteins
US4935233A (en) * 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US5071972A (en) * 1986-01-31 1991-12-10 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding novel thrombolytic proteins
US5098702A (en) * 1986-04-09 1992-03-24 Cetus Corporation Combination therapy using interleukin-2 and tumor necrosis factor
IL80005A (en) * 1986-09-10 1992-11-15 Yeda Res & Dev Compositions for modulating the effect of tnf and il-1
US5258498A (en) * 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5512544A (en) * 1987-09-13 1996-04-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Pharmaceutical compositions comprising an anticytokine
US4968607A (en) * 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
EP0721983A1 (en) * 1988-01-22 1996-07-17 ZymoGenetics, Inc. Methods of producing biologically active peptide dimers
DE3817955A1 (de) * 1988-05-27 1989-11-30 Hoechst Ag Tnf-inhibitor enthaltendes arzneimittel
US5075222A (en) * 1988-05-27 1991-12-24 Synergen, Inc. Interleukin-1 inhibitors
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
DE3922089A1 (de) * 1989-05-09 1990-12-13 Basf Ag Neue proteine und ihre herstellung
IL95031A (en) * 1989-07-18 2007-03-08 Amgen Inc A method of producing a recombinant human necrotic factor absorber
US6143866A (en) * 1989-07-18 2000-11-07 Amgen, Inc. Tumor necrosis factor (TNF) inhibitor and method for obtaining the same
US5073627A (en) * 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
US5605690A (en) * 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
US5395760A (en) * 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
NZ235148A (en) * 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
US5945397A (en) * 1989-09-05 1999-08-31 Immunex Corporation Purified p75 (type II) tumor necrosis factor receptor polypeptides
EP0417563B1 (de) * 1989-09-12 2000-07-05 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
DE69022559T2 (de) * 1989-12-13 1996-05-02 Yeda Res & Dev Expression des rekombinanten Tumor-Nekrosisfaktor-Bindungsproteins I (TBP-I).
US5136021A (en) * 1990-02-27 1992-08-04 Health Research, Inc. TNF-inhibitory protein and a method of production
WO1991017184A1 (en) * 1990-04-27 1991-11-14 The Upjohn Company Modified interleukin-1 inhibitors
AU651596B2 (en) * 1990-06-05 1994-07-28 Immunex Corporation Type II interleukin-1 receptors
US20030064480A1 (en) * 1990-06-28 2003-04-03 Leander Lauffer Fusion proteins with immunoglobulin portions, the preparation and use thereof
GB9022648D0 (en) * 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
DE4037837A1 (de) * 1990-11-28 1992-06-04 Behringwerke Ag Zellfreie rezeptorbindungsteste, ihre herstellung und verwendung
US5270181A (en) * 1991-02-06 1993-12-14 Genetics Institute, Inc. Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules
IL99120A0 (en) * 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5447851B1 (en) * 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
CA2123593C (en) * 1992-09-15 2000-03-14 Craig A. Smith Method of treating tnf-dependent inflammation using tumor necrosis factor antagonists
EP0959897B1 (en) * 1996-11-27 2009-04-22 Immunex Corporation Method of regulating nitric oxide production

Also Published As

Publication number Publication date
WO1993019777A1 (en) 1993-10-14
CA2133326C (en) 2005-03-01
US20060275868A1 (en) 2006-12-07
EP1239043A3 (en) 2003-01-02
DE69333027D1 (de) 2003-07-10
EP0670730A4 (en) 1997-02-26
KR950700937A (ko) 1995-02-20
FI944516A (fi) 1994-11-22
CA2133326A1 (en) 1993-10-14
ATE242322T1 (de) 2003-06-15
AU671116B2 (en) 1996-08-15
NZ251820A (en) 1996-07-26
DE69333027T2 (de) 2004-05-06
NO943617D0 (no) 1994-09-29
JPH07508639A (ja) 1995-09-28
FI20051161A (fi) 2005-11-15
NO323197B1 (no) 2007-01-15
EP1239043A2 (en) 2002-09-11
FI120042B (fi) 2009-06-15
NO943617L (no) 1994-11-29
ES2197149T3 (es) 2004-01-01
EP0670730B1 (en) 2003-06-04
FI944516A0 (fi) 1994-09-29
EP0670730A1 (en) 1995-09-13
AU3970293A (en) 1993-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI116943B (fi) Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaava DNA ja vektori
AU646695B2 (en) Isolated viral protein cytokine antagonists
FI106044B (fi) Menetelmä nisäkkään interleukiini-4-reseptorin (IL-4R) ja sen vasta-aineen tuottamiseksi ja IL-4R:ä koodaava DNA, vektori ja isäntäsolu
US6541610B1 (en) Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor
AU647566B2 (en) Leukemia inhibitory factor receptors
WO1989004838A1 (en) Interleukin-1 receptors
IE883523L (en) Interleukin-1 Receptors
WO1994026290A1 (en) Cytokine designated 4-1bb ligand and human receptor that binds thereto
AU629958B2 (en) Interleukin-7 receptors
IE903467A1 (en) Granulocyte-colony stimulating factor receptors
JPH10511266A (ja) ヒト・インターロイキン−１１受容体
AU625534B2 (en) Interleukin-1 receptors
DK175810B1 (da) Interleukin-1 receptor
CA1340761C (en) Interleukin-4-receptors
IE911108A1 (en) Isolated Viral Protein Cytokine Antagonists
NZ280051A (en) Tnf-r dimers (tumour necrosis factor - receptor), dna coding for same and vectors including the dna

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 116943

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed