FI106044B - Menetelmä nisäkkään interleukiini-4-reseptorin (IL-4R) ja sen vasta-aineen tuottamiseksi ja IL-4R:ä koodaava DNA, vektori ja isäntäsolu - Google Patents

Description

106044

Menetelmä nisäkkään interleuki±ni-4-reseptorin (IL-4R) ja sen vasta-aineen tuottamiseksi ja IL-4R:ä koodaava DNA, vektori ja isäntäsolu 5 Keksinnön tausta Tämä keksintö koskee yleisesti sytokiinireseptorei-ta ja erityisemmin interleukiini-4-reseptoreita.

Interleukiini-4 (IL-4, tunnetaan myös B-soluja stimuloivana tekijänä tai BSF-l:nä) karakterisoitiin alunpe-10 rin perustuen sen kykyyn stimuloida B-solujen lisääntymistä vasteena alhaisiin pitoisuuksiin pintaimmunoglobuliinin vastaisia vasta-aineita. Sittemmin IL-4:llä on osoitettu olevan paljon laajempi kirjo biologisia aktiivisuuksia, joihin kuuluvat T-solujen, syöttösolujen, granulosyyttien, 15 megakaryosyyttien ja punasolujen kasvun ko-stimulaatio. Lisäksi IL-4 stimuloi useiden IL-2:sta ja IL-3:sta riippuvaisten solulinjojen lisääntymistä, indusoi luokan II pää-histokompatibiliteettikompleksin ilmentymisen lepäävissä B-soluissa ja tehostaa stimuloitujen B-solujen IgE- ja 20 IgGl-isotyyppien eritystä. Sekä hiiren että ihmisen IL-4 on karakterisoitu varmasti yhdistelmä-DNA-menetelmillä ja puhdistamalla homogeeniseksi asti luonnossa esiintyvä hiiren proteiini (Yokota ym., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83.:5894, 1986; Noma ym. , Nature 319:640, 1986 ja Grabstein - 25 ym. , J. Exp. Med. 163:1405. 1986).

IL-4:n biologisia aktiivisuuksia välittävät IL-4:n spesifiset solun pinnalla olevat reseptorit, jotka ilmentyvät primaarisoluissa ja nisäkäsalkuperää olevissa in vitro -solulinjoissa. IL-4 sitoutuu reseptoriin, joka sit-30 ten välittää biologisen signaalin eri immuuniefektoriso-luille. Puhdistetut IL-4-reseptori (IL-4R) -koostumukset ovat siksi hyödyllisiä IL-4:n tai IL-4-reseptorin diagnos- • l 2 106044 tisissa määrityksissä ja IL-4-reseptorivasta-aineiden tuottamisessa diagnoosi- tai hoitokäyttöön. Lisäksi puhdistettuja IL-4-reseptorikoostumuksia voidaan käyttää suoraan hoidossa sitomaan tai keräämään pois IL-4:ä, millä 5 saadaan käytettäväksi keino tämän sytokiinin biologisten aktiivisuuksien säätelemiseksi.

Vaikka IL-4 on perusteellisesti karakterisoitu, sen reseptorin karakterisoinnissa on edistytty vain vähän. Lukuisia IL-4-reseptorin olemassaolon monissa erilaisissa 10 solutyypeissä dokumentoivia tutkimuksia on julkaistu; kuitenkin rakenteen karakterisointi on rajoittunut proteiinin molekyylipainon arvioihin määritettyinä reseptorin ja ra-dioleimattujen IL-4-molekyylien välillä kemiallisella ris-tisidonnalla muodostettujen kovalenttisten kompleksien 15 SDS-PAGE-anälyysillä. Ohara ym. (Nature 325:537, 1987) ja Park ym. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:1669, 1987) vahvistivat ensimmäisinä IL-4-reseptorin esiintymisen käyttäen radiojoditettua hiiren rekombinantti-IL-4:ä sitoutumaan korkea-affiniteettiseen reseptoriin, joka ilmentyy 20 alhaisin lukumäärin B- ja T-lymfosyyteissä ja monissa erilaisissa hematopoieettista alkuperää olevissa soluissa. Af f initeettiristisitomalla 125I-IL-4 IL-4R:ään Ohara ym. ja Park ym. tunnistivat reseptoriproteiineja, jotka olivat näennäiseltä molekyylipainoltaan vastaavasti 60 000 ja 25 75 000 daltonia. On mahdollista, että hiiren soluissa ha- vaittu reseptorin pieni koko edustaa natiivin reseptorin proteolyyttisesti katkaistua osaa. Parkin ym. myöhemmät kokeet (J. Exp. Med. 166:476, 1987) 125I:llä radioleimattua hiivasta saatua ihmisen rekombinantti-IL-4:ä käyttäen 30 osoittivat, että ihmisen IL-4-reseptori ei esiinny vain “ B-, T- ja hematoipoieettista alkuperää olevissa solulin- * * joissa, vaan sitä löytyy myös ihmisen fibroblasteista sekä epiteeli- ja endoteelialkuperää olevista soluista. IL-4-reseptoreita on sen jälkeen osoitettu esiintyvän muissa 35 solulinjoissa, mukaan luettuina CBA/N-perna-B-solut (Naka- • · 3 106044 jima ym., J, Immunol. 139:774, 1987), Jijoye-Burkittin lymfoomasolut (Cabrillat ym., Blochem. & Biophys. Res. Commun. 149:995, 1987), monissa erilaisissa hemopoieetti-sissa ja ei-hemopoieettisissa soluissa (Lowenthal ym., 5 Immunol. 140:456, 1988) j a hiiren Lyt-2"/L3T4"-tymosyyteis-sä. Sittemmin Park ym. (UCLA Symposia, J. Cell Biol., Suppl. 12A, 1988) raportoivat, että riittävien proteaasi-inhibiittorien läsnäollessa 125I-IL-4:ä sitovia, 138 145 kDa kokoisia plasmamembraanireseptoreita voitiin tun-10 nistaa useista hiiren solulinjoista. Siis edelleen on melkoisesti kiistaa IL-4-reseptorien todellisesta koosta ja rakenteesta.

IL-4-reseptorien rakenteen ja biologisten ominaisuuksien sekä IL-4-reseptorien tehtävän vasteissa, joita 15 eri solupopulaatioilla on stimulaatiolle IL-4:llä tai muilla sytokiineillä, tai IL-4-reseptorien tehokkaiden käyttömenetelmien hoidoissa, diagnooseissa ja määrityksissä enempi tutkiminen ei ole ollut mahdollista johtuen vaikeudesta saada riittäviä määriä puhdistettua IL-4-resep-20 toria. Aikaisemmin minkään solulinjan ei ole tiedetty ilmentävän korkeita IL-4-reseptoritasoja pysyvästi ja jatkuvasti, ja solulinjoissa, joiden tiedetään ilmentävän havaittavia tasoja IL-4-reseptoria, ilmentämisen taso jää yleensä alle noin 2 000 reseptoria solua kohti. Niinpä 25 yrityksiä puhdistaa IL-4-reseptorimolekyyli käytettäväksi biokemiallisessa analyysissä tai kloonata ja ilmentää IL-4-reseptoria koodittavia nisäkäsgeenejä on estänyt puhdistetun reseptorin ja sopivan reseptori-mRNA-lähteen puute.

Keksinnön yhteenveto 30 Tämä keksintö tuo käytettäviksi nisäkkään interleu- kiini-4-reseptoria (IL-4R) tai sen alayksiköitä kooditta- • · via DNA-sekvenssejä. Edullisesti tällaiset DNA-sekvenssit voivat olla: (a) cDNA-klooneja, joilla on natiivin IL- 4R:n geenin koodittavasta alueesta peräisin oleva nukleo-35 tidisekvenssi; (b) DNA-sekvenssejä, jotka kykenevät hyb- 4 106044 ridisoitumaan kohdan a mukaisiin cDNA-klooneihin kohtalaisen vaativissa olosuhteissa ja jotka koodattavat biologisesti aktiivisia IL-4R-molekyylejä; tai (c) DNA-sekvensse-jä, jotka ovat geneettisen koodin takia degeneroituneita 5 kohdissa a ja b määriteltyjen DNA-sekvensseihin nähden ja jotka koodattavat biologisesti aktiivisia IL-4R-molekyyle-jä. Tämä keksintö tuo myös käytettäviksi edellä määriteltyjä DNA-sekvenssejä käsittäviä rekombinanttiekspressio-vektoreita, näitä rekombinanttiekspressiovektoreita käyt-10 täen tuotettuja rekombinantti-IL-4-molekyylejä ja menetelmiä rekombinantti-IL-4-molekyylien tuottamiseksi näitä ekspressiovektoreita käyttäen.

Tämä keksintö tuo käytettäviksi myös olennaisesti homogeenisia, nisäkkään IL-4R:n käsittäviä proteiinikoos-15 tumuksia. Hiiren täysipituinen molekyyli on glykoproteii-ni, jonka molekyylipaino on noin 130 000 - 140 000 Mr SDS-PAGE:n mukaan. Näennäinen sitoutumisaffiniteetti (Ka) COS-soluihin, jotka on transfektoitu hiiren IL-4-reseptori-klooneilla 16 ja 18 CTLL-19.4-kirjastosta, on 1 - 8 x 109 20 M"1. Ka COS-soluihin, jotka on transfektoitu hiiren IL-4- reseptoriklooneilla 7B9-2 ja 7B9-4 hiiren 7B9-kirjastosta, on 2 x 109 - 1 x 1010 M'1. Kypsällä hiiren IL-4-reseptorimo-lekyylillä on seuraava N-terminaalinen aminohapposekvenssi: IKVLGEPTCFSDYIRTSTCEW.

... 25 Ihmisen IL-4R-molekyylillä uskotaan olevan molekyy lipaino välillä noin 110 000 - 150 000 Mr, ja sillä on seuraava N-terminaalinen aminohapposekvenssi, ennustettu cDNA-sekvenssistä ja analogialla biokemiallisesti määri-tettyn hiiren kypsän proteiinin N-terminaalisen sekvens-30 sin kanssa: MKVLQEPTCVSDYMSISTCEW.

Tämä keksintö tuo myös tarjolle koostumuksia käytettäviksi hoidossa, diagnoosissa, IL-4-reseptorin määrityksessä tai vasta-aineiden tuottamisessa IL-4-reseptorei-ta vastaan, jotka koostumukset käsittävät tehokkaita mää-35 riä edellisten menetelmien mukaisesti valmistettuja liu- • · <-• · 5 106044 koisia reseptoriproteiineja. Tällaisiin liukoisiin rekom-binanttireseptorimolekyyleihin kuuluvat typistetyt proteiinit, joista on poistettu reseptorimolekyylin osia, joita ei vaadita IL-4:n sitomiseen. Tämän keksinnön nämä 5 ja muut puolet tulevat ilmeisiksi seuraavaan yksityiskohtaiseen kuvaukseen ja mukaan liitettyihin piirustuksiin viitaten.

Piirustusten lyhyt kuvaus

Kuviossa 1 nähdään hiiren ja ihmisen IL-4R-10 cDNA:iden koodittavat alueet (osoitettu paksulla viivalla) sisältävien cDNA-kloonien restriktiokartat. Restriktiokoh-tia EcoRI, PvuII, Hindi ja SstI esittävät vastaavasti kirjaimet R, P, H ja S.

Kuviot 2A-C esittävät hiiren IL-4-reseptorin koo-15 dittavan alueen cDNA-sekvenssiä ja johdettua aminohappo-sekvenssiä 7B9-kirjaston kloonista 7B9-2 saadun mukaisesti. Kypsän proteiinin N-terminaalinen isoleusiini on nimetty aminohappo numero l:ksi. Täysipituisen membraaniin sitoutuneen proteiinin koodittavan alueen kloonista 7B9-20 2 määrittelevät aminohapot 1 - 785. Kypsän N-pään muodos tavan isoleusiinitähteen spesifioiva kodoni ATC on alleviivattu asemassa 1 proteiinisekvenssissä; oletettu kalvon läpäisevä sekvenssi aminohappojen 209 - 232 kohdalla on myös alleviivattu. Kloonien 7B9-4 ja CTLL-19.4-kirjaston ... 25 kloonien CTLL-18 ja CTLL-16 koodittavien alueiden sekvens sit ovat identtisiä 7B9-2:n sekvenssin kanssa paitsi seuraavasti. CTLL-16:n koodittava alue koodittaa membraaniin sitoutuneen IL-4:ä sitovan reseptorin, jonka määrittelevät aminohapot -25 - 233 (mukaan luettuna oletettu 25 aminoha-30 pon signaalipeptidisekvenssi), mutta jota seuraa TAG-lope-- ** tuskodoni (ei näytetty), joka päättää avoimen lukukehyk sen. Nukleiinihapposekvenssi viittaa silmukoimisen donori-kohdan esiintymiseen tässä asemassa (merkitty nuolella kuviossa 1), ja silmukoimisen akseptorikohdan esiintymi-35 seen lähellä 3’-päätä (merkitty toisella nuolella), mikä • · 6 106044 viittaa siihen, että CTLL-16 saatiin silmukoimattomasta mRNA-välituotteesta. Kloonit 7B9-4 ja CTLL-18 koodittavat vastaavasti aminohappoja 23 - 199 ja -25 - 199. Aminohapon 199 jälkeen 114 emäsparin insertti (identtinen molemmissa 5 klooneissa ja esitetty avoimella suorakaiteella kuviossa 1) tuo mukaan kuusi uutta aminohappoa, joita seuraa lope-tuskodoni. Reseptorin tämä muoto on liukoinen.

Kuvio 3 on kaavamainen esitys nisäkkään runsaasti ilmenevästä plasmidista pCAV/NOT, joka kuvataan yksityis-10 kohtaisemmin esimerkissä 8.

Kuviot 4A-C esittävät ihmisen IL-4-reseptorin cDNArn koodittavaa sekvenssiä kloonista T22-8, joka saatiin T-solulinjasta T22 peräisin olevasta cDNA-kirjestosta. Kypsän proteiinin ennustettu N-terminaalinen metionii-15 ni ja membraanin läpäisevä alue on alleviivattu.

Kuviot 5A-B ovat ihmisen (ylärivi) ja hiiren (alarivi) IL-4-reseptorin cDNA-kloonien ennustettujen aminohapposekvenssien vertailu.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 20 Määritelmiä

Kuten niitä tässä käytetään, termit "IL-4-resepto-ri" ja "IL-4R” viittaavat proteiineihin, joilla on olennaisesti samankaltaiset aminohapposekvenssit niiden natii-vien nisäkkään interleukiini-4-reseptorin aminohapposek-25 venssien kanssa, jotka esitetään kuvioissa 2 ja 4, ja jotka ovat biologisesti aktiivisia kuten edempänä määritellään, siten että ne kykenevät sitomaan interleukiini-4-(IL-4-) -molekyylejä tai välittämään IL-4-molekyylin soluun sitoutumisen aloittaman biologisen signaalin, tai 30 ristireagoimaan sellaisten IL-4R-vasta-aineiden kanssa, jotka on tuotettu luonnollisista lähteistä (siis ei-re-kombinanttilähteistä) olevaa IL-4R:ä vastaan. Natiivilla hiiren IL-4-reseptorimolekyylillä ajatellaan olevan SDS-PAGE:n mukaan näennäinen molekyylipaino noin 140 kilodal-35 töniä (kDa). Termeihin "IL-4-reseptori" ja "IL-4R" kuulu- m m • « 7 106044 vat, näihin rajoittumatta, natiivien proteiinien analogit tai alayksiköt, joissa on ainakin 20 aminohappoa, ja joissa havaitaan ainakin jokin IL-4R:n kanssa yhteinen biologinen aktiivisuus. Kuten sitä käytetään koko patenttijul-5 kaisun ajan, termi "kypsä" tarkoittaa proteiinia, joka ilmentyy muodossa, jossa ei ole signaalisekvenssiä, jollainen natiivin geenin täysimittaisissa transkripteissä voi esiintyä. Erilaisia bioekvivalentteja proteiini- ja aminohappoanalogeja kuvataan yksityiskohtaisesti edempänä. 10 Termi "olennaisesti samankaltainen", kun sitä käy tetään määrittämään joka aminohappo- tai nukleiinihappo-sekvenssejä, tarkoittaa, että tietty puheena oleva sekvenssi, esimerkiksi mutanttisekvenssi, poikkeaa vertailukohteena olevasta sekvenssistä yhdellä tai useammalla 15 substituutiolla, deleetiolla tai lisäyksellä, joiden nettovaikutuksena IL-4R-proteiinin biologinen aktiivisuus säilyy. Vaihtoehtoisesti nukleiinihappoalayksiköt tai analogit ovat "olennaisesti samankaltaisia" tässä esitettäville spesifille DNA-sekvensseille, jos (a) DNA-sekvenssi 20 on peräisin nisäkkään natiivin IL-4R-geenin koodittavasta alueesta; (b) DNA-sekvenssi kykenee hybridisortumaan kohdan a DNA-sekvensseihin kohtalaisen vaativissa olosuhteissa, ja jotka koodattavat biologisesti aktiivisia IL-4R-molekyylejä; tai DNA-sekvenssit, jotka ovat geneettisen ... 25 koodin takia degeneroituneita kohdissa a ja b määritelty jen DNA-sekvensseihin nähden ja jotka koodattavat biologisesti aktiivisia IL-4R-molekyylejä. Olennaisesti samankaltaiset analogiproteiinit ovat enemmän kuin 30 prosenttia samankaltaisia natiivin IL-4R:n vastaavan sekvenssin kans-30 sa. Sekvenssien, joilla on pienempi samankaltaisuusaste, ' ** mutta vertailukelpoinen biologinen aktiivisuus, katsotaan olevan ekvivalentteja. Edullisemmin analogiproteiinit ovat yli 80 prosenttia samankaltaisia natiivin IL-4R:n vastaavan sekvenssin kanssa, missä tapauksessa niiden määritel-35 lään olevan "olennaisesti identtisiä". Määritettäessä nuk-

* I

• 8 106044 leiinihapposekvenssejä kaikkien puheena olevien nukleiini-happosekvenssien, jotka kykenevät koodittamaan olennaisesti samankaltaisia aminohapposekvenssejä, katsotaan olevan olennaisesti samankaltaisia vertailukohteena olevan nuk-5 leiinihapposekvenssin kanssa. Samankaltaisuusprosentti voidaan määrittää esimerkiksi vertailemalla sekvenssitie-toa käyttäen GAP-tietokoneohjelmaa, versio 6.0, joka on saatavissa University of Wisconsin Genetics Computer Groupilta (UWGCG). GAP-ohjelma käyttää Needlemanin ja 10 Wunschin kohdennusmenetelmää (J. Mol. Biol. 48:443, 1970)

Smithin ja Watermanin tarkentaman mukaan (Adv. Appi. Math. 2:482, 1981). Lyhyesti sanottuna, GAP-ohjelma määrittelee samankaltaisuuden niiden kohdennettujen symbolien (ts. nukleotidien tai aminohappojen), jotka ovat samankaltai-15 siä, lukumääränä jaettuna kahdesta sekvenssistä lyhyemmän symbolien kokonaismäärällä. Edullisiin oletusparametreihin GAP-ohjelmalle kuuluvat: (1) yksikkövertailumatriisi (joka sisältää arvon 1 identiteeteille ja 0 ei-identiteeteil-le) nukleotideille, ja Gribskovin ja Burgessin painotetun 20 vertailumatriisin, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, kuten ovat kuvanneet Schwartz ja Dayhoff (toim.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, s. 353 - 358, 1979; (2) virhepisteet 3,0 jokaiselle aukolle ja lisäksi 0,10 virhepistettä kustakin ... 25 symbolista jokaisessa aukossa; ja (3) ei virhepisteitä päiden aukoista.

"Rekombinantti", kuten sitä tässä käytetään, tarkoittaa, että proteiini on peräisin rekombinantti (esim. mikrobi tai nisäkäs) -ekspressiosysteemeistä. "Mikrobi" 30 viittaa rekombinanttiproteiineihin, jotka on tehty bakteeri- tai sieniekspressiosysteemeissä (esim. hiivan). Tuotteena "rekombinanttimikrobi" määrittelee mikrobiekspres-siosysteemissä tuotetun proteiinin, joka on olennaisesti ilman natiiveja endogeenisiä aineita. Useimmissa bakteeri-35 viljelmissä, esim. E. colissa, ilmennetty proteiini on 9 106044 ilman glykaaneja. Hiivassa ilmennetyllä proteiinilla voi olla erilainen glykosylaatiotyyppi kuin nisäkässoluissa ilmennetyllä.

"Biologisesti aktiivinen", sen mukaisesti kuin sitä 5 käytetään koko patenttijulkaisun ajan IL-4-reseptorien tunnuspiirteenä, tarkoittaa, että tietty molekyyli on tämän keksinnön tässä esitettävien suoritusmuotojen kanssa aminohapposekvenssiltään riittävästi samankaltainen, että se kykenee sitomaan havaittavissa olevia määriä IL-4:ä, 10 välittämään IL-4-ärsykkeen soluun, esimerkiksi osana hyb-ridireseptorikonstruktiota, tai ristireagoimaan sellaisten IL-4R-vasta-aineiden kanssa, jotka on tuotettu luonnollisista lähteistä (siis ei-rekombinanttilähteistä) olevaa lL-4R:ä vastaan. Tämän keksinnön suoja-alaan kuuluvat 15 biologisesti aktiiviset IL-4-reseptorit kykenevät edullisesti sitomaan yli 0,1 nanomoolia IL-4:ä nanomoolia reseptoria kohti, ja edullisimmin yli 0,5 nanomoolia IL-4:ä nanomoolia reseptoria kohti tavanomaisissa sitoutumismää-rityksissä (ks. edempää).

20 "DNA-sekvenssi" viittaa DNA-molekyyliin, erillisen fragmentin muodossa tai komponenttina suurempaa DNA-kon-struktiota, joka DNA-molekyyli on peräisin DNA:sta, joka ainakin kerran on eristetty olennaisesti puhtaassa muodossa, ts. ilman kontaminoivia endogeenisia materiaaleja sekä ... 25 sellaisessa määrässä tai konsentraatiossa, joka mahdollis taa sekvenssin ja sen osanukleotidisekvenssien tunnistuksen, manipuloinnin ja talteen ottamisen normaalein biokemiallisin menetelmin, esimerkiksi kloonausvektoria käyttäen. Tällaiset sekvenssit tuodaan edullisesti käytettä-30 viksi sellaisen avoimen lukukehyksen muodossa, jota eivät m · ~ ^ keskeytä sekvenssit, joista ei tuoteta polypeptidiä, eli intronit, joita tyypillisesti tavataan eukaryoottigeeneis-sä. Relevantit sekvenssit sisältävää genomin DNA:ta voitaisiin myös käyttää. DNA-sekvenssejä, joista ei tuoteta 35 polypeptidiä, voi olla mukana 5'- tai 3'-suuntaan avoimes- » < 10 106044 ta lukukehyksestä silloin, kun nämä eivät häiritse koodattavien alueiden manipulointia tai ilmentämistä.

"Nukleotidisekvenssi" viittaa deoksiribonukleoti-dien heteropolymeeriin. Tämän keksinnön käytettäväksi tuo-5 mia proteiineja koodittavia DNA-sekvenssejä voidaan koota cDNA-fragmenteista ja lyhyistä oligonukleotidilinkkereis-tä tai sarjasta oligonukleotideja, jotta tuotaisiin käytettäväksi synteettinen geeni, joka pystyy ilmentymään rekombinanttitranskriptioyksikkönä.

10 "Rekombinanttiekspressiovektori" viittaa replikoi tavissa olevaan DNA-konstruktioon, jota käytetään joko monistamaan tai ilmentämään IL-4R:ä koodattavaa DNA:ta, ja joka sisältää transkriptioyksikön, joka käsittää yhdistelmänä (1) geneettisen elementin tai elementtejä, joilla on 15 säätelytehtävä geeni-ilmentymisessä, esimerkiksi promooto-reja tai tehostajia, (2) rakenteellisen eli koodittavan sekvenssin, jota kopioidaan transkriptiossa mRNA:ksi ja käännetään translaatiossa proteiiniksi, ja (3) asianmukaiset transkription ja translaation aloitus- ja lopetussek-20 venssit. Hiivaekspressiosysteemeissä käytettäviksi tarkoitettuihin rakenteellisiin elementteihin kuuluu edullisesti signaalisekvenssi, joka mahdollistaa isäntäsolulle translaatiossa tehdyn proteiinin erityksen solun ulkopuolelle. Vaihtoehtoisesti, silloin kun rekombinanttiproteiinia il-.. 25 mennetään ilman signaali- tai kuljetussekvenssiä, se voi sisältää N-terminaalisen metioniinitähteen. Tämä aminohappotähde voidaan mahdollisesti myöhemmin katkaista irti ilmennetystä rekombinanttiproteiinista lopullisen tuotteen saamiseksi.

30 "Rekombinanttimikrobiekspressiosysteemi" tarkoit taa sellaisten soveliaiden isäntämikro-organismien olennaisesti homogeenista puhdasviljelmää, esimerkiksi bakteerin, kuten E. colin, tai hiivan, kuten S. cerevisiaen, joihin on kromosomin DNA:hän stabiilisti integroitunut 35 rekombinanttitranskriptioyksikkö tai joissa on rekombi- » « 11 106044 nanttitranskriptioyksikkö Isännässä olevan plasmidin komponenttina. Yleensä systeemin muodostavat solut polveutuvat yhdestä ainoasta edeltäjätransformantista. Tässä määritellyn mukaisesti rekombinanttiekspressiosysteemit il-5 mentävät heterologista proteiinia, kun ilmennettävään DNA-sekvenssiin tai synteettiseen geeniin liitetyt säätelyele-mentit indusoidaan.

Proteiinit ja analogit Tämä keksintö tuo käytettäviksi olennaisesti homo-10 geenisiä nisäkkään IL-4R-rekombinanttipolypeptidejä/ jotka ovat olennaisesti vapaita kontaminoivista endogeenisistä materiaaleista ja mahdollisesti ilman niihin liittyvää natiivintyyppistä glykosylaatiota. Natiivit hiiren ja ihmisen IL-4-reseptorimolekyylit saadaan talteen solulysaa-15 teista näennäiseltä molekyylipainoltaan SDS-PAGE:n mukaan noin 130 - 145 kilodaltönin (kDa) glykoproteiineina. Tämän keksinnön mukaisiin nisäkkään IL-4R:in kuuluvat esimerkkeinä kädellisten, ihmisen, hiiren, koiran, kissan, naudan, lampaan, hevosen ja sian IL-4R. Keksinnön suoja-alas-20 sa oleviin IL-4R-johdannaisiin kuuluvat myös primaaripro-teiinin eri rakennemuodot, joissa biologinen aktiivisuus säilyy. Johtuen esimerkiksi ionisoituvien amino- ja kar-boksyyliryhmien läsnäolosta IL-4R-proteiini voi olla happamien tai emäksisten suolojen muodossa tai neutraalissa .. 25 muodossa. Myös yksittäisiä aminohappotähteitä voidaan muuntaa hapettamalla tai pelkistämällä.

Primaariaminohapporakennetta voidaan muuntaa muodostamalla kovalenttisia tai aggregatiivisia konjugaatteja muiden kemiallisten rakenneosien kanssa, kuten glykosyyli-30 ryhmien, lipidien, fosfaatin, asetyyliryhmien ja näiden - **' kaltaisten kanssa, tai luomalla aminohapposekvenssimutant- ··< teja. Kovalenttisia johdannaisia valmistetaan liittämällä tiettyjä funktionaalisia ryhmiä IL-4R:n aminohapposivuket-juihin tai N- tai C-päähän. Muihin keksinnön suoja-alassa 35 oleviin IL-4R-johdannaisiin kuuluvat IL-4R:n tai sen frag- # € » 12 106044 menttien kovalenttiset tai aggregatiiviset konjugaatit muiden proteiinien tai polypeptidien kanssa, kuten synteesillä rekombinanttiviljelmässä N-terminaalisina tai C-ter-minaalisina fuusioina. Esimerkiksi konjugoitu peptidi voi 5 olla signaali (eli leader) -polypeptidisekvenssi proteiinin N-terminaalisessa alueessa, joka kotranslationaali-sesti ja posttranslationaalisesti ohjaa proteiinin siirtymisen sen synteesikohdasta sen toimintakohtaan solukalvon tai -seinän sisä- tai ulkopuolella, (esim. hiivan a-fakto-10 rin signaali). IL-4R-proteiinifuusiot voivat käsittää peptidejä, jotka on lisätty helpottamaan IL-4R:n puhdistamista tai tunnistamista (esim. poly-His). IL-4-reseptorin aminohapposekvenssi voidaan myös liittää peptidiin Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp ym., Bio/ 15 Technology 6:1204, 1988). Viimeksi mainittu sekvenssi on erittäin antigeeninen, ja se tuottaa spesifiseen mono-klonaaliseen vasta-aineeseen reversiibelisti sitoutuvan epitoopin, mikä mahdollistaa ilmennetyn rekombinanttipro-teiinin nopean määrittämisen ja helpon puhdistuksen. Tämä 20 sekvenssi myös katkeaa irti spesifisesti naudan limakalvon enterokinaasilla välittömästi Asp-Lys-paria seuraavan aminohappotähteen kohdalta. Fuusioproteiinit, joiden päähän on laitettu tämä peptidi, voivat olla myös resistenttejä solunsisäiselle hajotukselle E. colissa.

.. 25 IL-4R-johdannaisia voidaan käyttää myös immunogee- neinä, reagensseina reseptoripohjäisissä immunologissa määrityksissä tai sitovina aineina IL-4:n tai muiden sitoutuvien ligandien af f initeettipuhdistusmenetelmissä. IL-4R-johdannaisia voidaan saada myös ristisitovilla agens-30 seilla, kuten M-maleimidobentsoyylisukkinimidiesterillä ja N-hydroksisukkinimidillä, kysteiini- ja lysiinitähdeiden kohdalla. IL-4R-proteiineja voidaan myös sitoa kovalentti-sesti reaktiivisten sivuryhmien kautta erilaisiin liukenemattomiin alustoihin, kuten syanogeenibromidiaktivoitui-35 hin, bisoksiraaniaktivoituihin, karbonyylidi-imidatsoli- • 13 106044 aktivoituihin tai tosyyliaktivoituihin agaroosirakentei-siin, tai adsorboimalla polyolefiinipinnoille (glutaralde-hydiristisitomisen kanssa tai sitä ilman). IL-4R:n sitouduttua alustaan sitä voidaan käyttää sitomaan selektiivi-5 sesti (määritys- tai puhdistustarkoituksessa) IL-4R-vas-ta-aineita tai IL-4:ä.

Tämä keksintö sisältää myös IL-4:n siihen liittyvän natiivintyyppisen glykosylaation kanssa tai sitä ilman. Hiiva- tai nisäkäsekspressiosysteemeissä, esim. COS-7-so-10 luissa, ilmennetty IL-4R voi olla molekyylipainoltaan ja glykosylaatiotyypiltään samankaltainen tai merkitsevästi erilainen kuin natiivit molekyylit, ekspressiosysteemistä riippuen. IL-4R-DNA;iden ilmentäminen bakteereissa, kuten E. colissa, tuo käytettäviksi ei-glykosyloituja molekyyle-15 jä. Funktionaalisia nisäkkään IL-4R:n mutänttianalogeja, joissa on inaktivoituja N-glykosylaatikohtia, voidaan tuottaa oligonukleotidisynteesillä ja ligaatiolla tai kohdennetun mutageneesin menetelmillä. Näitä analogiproteii-neja voidaan tuottaa homogeenisessä, vähempihiilihydraat-20 tisessa muodossa hyvällä saannolla hiivan ekspressiosys-teemejä käyttäen. N-glykosylaatiokohdille eukaryoottipro-teiineissa on tunnusmerkillinen aminohappokolmikko Asn-Ax-Z, jossa Ax on mikä vain aminohappo paitsi Pro, ja Z on Ser tai Thr. Tässä sekvenssissä asparagiini tarjoaa sivu- .. 25 ketjun aminoryhmän hiilihydraatin kovalenttiselle liittä miselle. Tällainen kohta voidaan eliminoida korvamalla Asn tai aminohappotähde Z toisella aminohapolla, poistamalla Asn tai Z, tai sijoittamalla aminohappo, joka ei ole Z, Ax:n ja Z:n väliin, tai muu aminohappo kuin Asn Asn:n ja 30 Ax:n väliin.

' w IL-4R-johdannaisia voidaan myös saada IL-4R:n tai sen alayksiköiden mutaatioilla. IL-4R-mutantti, kuten siihen tässä viitataan, on IL-4R:n kanssa homologinen poly-peptidi, mutta jolla on eri aminohapposekvenssi kuin na-35 tiivilla IL-4R:llä johtuen deleetiosta, insertiosta tai > « * 14 106044 substituutiosta. Kuten useimpia nisäkäsgeenejä, nisäkkään IL-4-reseptoreita koodattavat luultavasti monieksoniset geenit. Vaihtoehtoisten mRNA-konstruktioiden, joiden voidaan katsoa johtuvan eri mRNA-silmukointitapahtumista 5 transkription jälkeen, ja joilla on laajoja identtisyys-tai samankaltaisuusalueita niiden cDNA:iden kanssa, joista tässä esitetään patenttivaatimuksia, katsotaan kuuluvan tämän keksinnön suoja-alaan.

IL-4R-proteiinien bioekvivalentteja analogeja voi-10 daan muodostaa esimerkiksi tekemällä erilaisia aminohappotähteiden tai sekvenssien substituutioita, tai poistamalla sellaisia terminaalisia tai sisäisiä aminohappotähteitä tai sekvenssejä, joita ei tarvita biologiseen aktiivisuuteen. Esimerkiksi kysteiinitähteitä voidaan poistaa 15 tai korvata toisilla aminohapoilla väärien molekyylinsi-säisten disulfidisiltojen muodostumisen estämiseksi re-naturaatiossa. Muihin mutageneesin lähestymistapoihin kuuluu peräkkäisten kaksiemäksisten aminohappojen muuntaminen ilmentymisen tehostamiseksi hiivasysteemeissä, joissa 20 KEX2-proteaasiaktiivisuutta esiintyy. Yleensä substituutiot pitäisi tehdä konservatiivisesti; ts. edullisimmat korvaavat aminohapot ovat ne, joiden fysikokemialliset ominaisuudet muistuttavat korvattavan aminohapon vastaavia. Samaan tapaan, silloin kun käyttöön otetaan deleetio-25 tai insertiostrategia, deleetion tai insertion potentiaalista vaikutusta biologiseen aktiivisuuteen pitäisi pohtia.

IL-4R:n alayksiköitä voidaan muodostaa poistamalla terminaalisia tai sisäisiä aminohappotähteitä tai sekvens-30 sejä. Erityisen edullisiin alayksiköihin kuuluvat ne, joista IL-4R:n membraanin läpäisevä osa ja solunsisäinen »· domeeni on poistettu tai korvattu hydrofiilisillä aminohappotähteillä reseptorin erittämisen helpottamiseksi so-luviljelyelatusaineeseen. Tuloksena saatava proteiini on 35 liukoinen IL-4R-molekyyli, joka saattaa säilyttää kykynsä « <.

is 106044 sitoa IL-4:ä. Erityisiin esimerkkeihin liukoisesta IL-4R:stä kuuluvat polypeptidit, jotka ovat olennaisesti identtisiä kuvion 2A aminohappotähteiden 1 - 208 ja kuvion 4A aminohappotähteiden 1 - 207 sekvenssille.

5 Mutaatioiden analogi-IL-4R:ien ilmentämistä varten muodostetuissa nukleotidisekvensseissä täytyy tietenkin säilyttää koodittavien sekvenssien lukukehyksen vaiheistus, ja edullisesti ne eivät luo komplementaarisia alueita, jotka voisivat hybridisoitua tuottaen sekundaarisia 10 mRNA-rakenteita, kuten lenkkejä ja hiusneulasilmukoita, jotka vaikuttaisivat haitallisesti reseptori-mRNA:n translaatioon. Vaikka mutaatiokohta voi olla ennalta päätetty, ei ole välttämätöntä, että mutaation laatu per se olisi päätetty ennalta. Esimerkiksi tietyn kohdan mutanttien 15 optimiominaisuuksien valitsemiseksi voidaan suorittaa satunnainen mutageneesi kohdekodonissa ja ilmentyvistä IL-4R-mutanteista seuloa halutun aktiivisuuden suhteen.

Kaikki mutaatiot IL-4R:ä koodittavassa nukleotidi-sekvenssissä eivät ilmenny lopullisessa tuotteessa, esi-20 merkiksi nukleotidisubstituutioita voidaan tehdä ilmentymisen tehostamiseksi, etupäässä sekundaarirakennesilmukoi-den välttämiseksi transkriptiosta saadussa mRNA:ssa (ks. EPÄ 75 444A, joka liitetään tähän viitteenä), tai sellaisten kodonien tuottamiseksi, jotka valittu isäntä kääntää 25 helpommin polypeptidiksi, esim. tunnettujen E. colin suosittujen kodonien E. colissa ilmentämistä varten.

Mutaatioita voidaan tuottaa tiettyihin lokuksiin syntetisoimalla mutanttisekvenssin sisältäviä oligonuk-leotideja, reunoillaan restriktiokohdat, jotka mahdollis-30 tavat ligaation natiivin sekvenssin fragmentteihin. Ligaa-tion jälkeen tuloksena saatu rekonstruoitu sekvenssi koo- ·· dittaa analogia, jossa on haluttu aminohappoinsertio, -substituutio tai -deleetio.

Vaihtoehtoisesti oligonukleotidein ohjattuja koh-35 dennettuja mutageneesimenettelyjä voidaan soveltaa, jotta • « 16 106044 saataisiin käytettäväksi muutettu geeni, jossa tiettyjä kodoneita on muutettu halutun substituution, deleetion tai insertion mukaisesti. Esimerkkimenetelmiä edellä esitettyjen muutosten tekemisestä ovat julkaisseet Waldre ym. (Ge-5 ne 42:133, 1986); Bauer ym. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith ym. (Genetic Engineering; Principles and Methods, Plenum Press, 1981); sekä US-patenttijulkaisut nro 4 518 584 ja 4 737 462, jotka liitetään tähän viitteinä.

10 Rekombinantti-IL-4R:n ilmentäminen Tämä keksintö tuo käytettäviksi rekombinanttieks-pressiovektoreita, joihin kuuluu synteettisiä tai cDNA:sta peräisin olevia DNA-fragmentteja, jotka koodittavat nisäkkään IL-4R:ä tai bioekvivalentteja analogeja, jotka on 15 toiminnallisesti liitetty soveliaisiin nisäkkään, mikrobin, viruksen tai hyönteisen geeneistä peräisin oleviin transkription tai translaation säätelyelementteihin. Tällaisiin säätelyelementteihin kuuluvat transkription promoottori, mahdollisesti operaattorisekvenssi transkrip-20 tion säätelemiseksi, soveliaita mRNA:n ribosominsitoutu-miskohtia koodittava sekvenssi ja sekvenssit, jotka säätelevät transkription ja translaation lopetusta, kaikki kuvataan yksityiskohtaisesti edempänä. Lisäksi voidaan liittää mukaan kyky replikoitua isännässä, yleensä replikaa-• 25 tion alkukohdan antama, ja selektiogeeni helpottamaan transformanttien tunnistamista. DNA-alueet ovat toiminnallisesti liitettyjä, kun ovat funktionaalisesti yhteydessä toisiinsa. Esimerkiksi signaalipeptidin (eritys-"leaderin") DNA on toiminnallisesti liitetty polypeptidin 30 DNA:hän, jos se ilmennetään esiasteena, joka osallistuu polypeptidin eritykseen; promoottori on toiminnallisesti liitetty koodittavaan alueeseen, jos se säätelee sekvenssin transkriptiota; ribosominsitomiskohta on toiminnallisesti liitetty koodittavaan alueeseen, jos se sijaitsee 35 niin, että translaatio tulee mahdolliseksi. Yleensä toi- 17 106044 minnallisesti liitetty tarkoittaa peräkkäistä, ja eritys-signaalien tapauksessa, peräkkäinen ja lukukehyksessä.

Nisäkkään lL-4-reseptoreja koodittavat DNA-sekvenssit, jotka tulevat ilmennettäviksi mikro-organismissa, 5 edullisesti eivät sisällä introneita, jotka voisivat ennenaikaisesti lopettaa DNA:n transkription mRNA:ksi; kuitenkin transkription lopetus voi olla haluttava, esimerkiksi silloin, kun se johtaisi mutantteihin, joissa on edullisia C-terminaalisia lyhentymiä, esimerkiksi membraa-10 nin läpäisevän alueen deleetio sellaisen liukoisen reseptorin saamiseksi, joka ei ole sitoutunut solukalvoon. Koodin degeneroituneisuudesta johtuen samaa aminohapposekvenssiä koodittavissa nukleotidisekvensseissä voi olla huomattavaa vaihtelua; esimerkki-DNA-suoritusmuotoja ovat 15 kuvioissa näkyviä nukleotidisekvenssejä vastaavat. Muihin suoritusmuotoihin kuuluvat sekvenssit, jotka kykenevät hybridisortumaan kuvioiden sekvensseihin kohtalaisen vaativissa olosuhteissa (50 °C, 2 X SSC) ja muut sekvenssit, jotka hybridisoituvat edellä kuvattuihin tai ovat niihin 20 nähden degeneroituneita, jotka sekvenssit koodittavat biologisesti aktiivisia IL-4-reseptoripolypeptidejä.

Transformoituja isäntäsoluja ovat solut, jotka on transformoitu tai transfektoitu yhdistelmä-DNA-menetelmil-lä muodostetuilla IL-4R-vektoreilla. Transformoidut isän-;· 25 täsolut tavallisesti ilmentävät IL-4R:ä, mutta kloonaus- tai monistustarkoituksissa transformoitujen isäntäsolujen ei tarvitse ilmentää IL-4R:ä. Ilmennetty IL-4R varastoidaan solukalvolle tai eritetään viljelmän supernatanttiin, riippuen valitusta IL-4R-DNA;sta. Soveliaisiin isäntäso-30 luihin nisäkkään IL-4R:n ilmentämistä varten kuuluvat pro-karyootit, hiiva- ja korkeammat eukaryoottisolut asianmukaisten promoottorien säätelyn alaisina. Prokaryootteihin kuuluvat gram-negatiiviset ja gram-positiiviset organismit, esimerkiksi E♦ coli tai basillit. Korkeampiin euka-35 ryoottisoluihin kuuluvat nisäkäsalkuperää olevat väkiin- Λ 18 106044 tuneet solulinjat edempänä kuvattavan mukaisesti. Myös soluttomia translaatiosysteemej ä voitaisiin käyttää nisäkkään IL-4R:n tuottamiseksi käyttäen tämän keksinnön mukaisista DNA-konstruktioista johdettuja RNA:ita. Asianmukai-5 siä kloonaus- ja ekspressiovektoreita käytettäviksi bakteeri-, sieni-, hiiva- ja nisäkässoluisännissä ovat kuvanneet Pouwels ym. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985), joiden merkityksellinen julkaisu liitetään täten viitteenä mukaan.

10 Prokaryoottiekspressioisäntiä voidaan käyttää il mennettäessä IL-4R:iä, joissa ei tarvita laajaa proteolyy-si- ja disulfidiprosessointia. Prokaryoottiekspressiovek-torit yleensä käsittävät yhden tai useamman fenotyyppisen selektoitavissa olevan merkkiominaisuuden, esimerkiksi 15 geenin, joka koodittaa antibioottiresistenssin antavia proteiineja tai joka täyttää autotrofisen vaatimuksen, sekä isännän tunnistaman replikaation aloituskohdan isännässä monistumisen varmistamiseksi. Soveliaisiin proka-ryootti-isäntiin transformaatioita varten kuuluvat E. co-20 li, Bacillus subtilis. Salmonella typhimurium ja useita lajeja suvuista Pseudomanas, Streptomyces ja Staphylococcus, vaikkakin muita voidaan käyttää valinnan mukaan.

Bakteerikäytössä hyödylliset ekspressiovektorit voivat käsittää selektoitavissa olevan merkkiominaisuuden • 25 ja bakteerin replikaation alkukohdan, jotka ovat peräisin kaupallisesta saatavista, tunnetun kloonausvektorin pBR322 (ATCC 37 017) geneettisiä elementtejä käsittävistä plasmi-deista. Tällaisiin kaupallisiin vektoreihin kuuluvat esimerkiksi pKK223-8 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, 30 Ruotsi) ja pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Nämä pBR322:n "runko"-osat yhdistetään asianmukaisen promoottorin ja ilmennettävän rakenteellisen sekvenssin kanssa. E. coli transformoidaan tyypillisesti käyttäen johdannaisia pBR322:sta, E. coli -lajista peräisin olevasta plasmidista 35 (Bolivar ym., Gene 2:95, 1977). pBR322 sisältää ampisil- 19 106044 liini- ja tetrasykliiniresistenssin geenit ja tarjoaa siten yksinkertaisen keinon transformoitujen solujen tunnistamiseksi .

Yleisesti rekombinanttimikrobiekspressiovektoreis-5 sa käytettyihin promoottoreihin kuuluvat B-laktamaasi-(penisillinaasi-) ja laktoosipromoottorisysteemit (Chang ym., Nature 275:615, 1978); ja Goeddel ym., Nature 281: 544, 1979), tryptofaani (trp) -promoottorisysteemi (Goeddel ym., Nucl. Acids Res. 8:4057, 180; ja EPÄ 36 776) 10 sekä tae-promoottori (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 412, 1982). Erityisen hyödyllinen bakteeriekspressiosysteemi käyttää 7,-faagin PL-promoottoria ja termolabiilia represso-ria cl857ts. American Type Culture Collectionista saata-15 vissa oleviin plasmidivektoreihin, joihin sisältyy APi.-Pro~ moottorin johdannaisia, kuuluvat plasmidi pHUB2, jonka isäntä on E. coli -kanta JMB9 (ATCC 37 092) ja pPLc28, jonka isäntä on E. coli RR1 (ATCC 53 082).

Rekombinantti-IL-4R-proteiineja voidaan ilmentää 20 myös hiivaisännissä, edullisesti Sacoharomyces-suvusta olevissa, kuten S. cerevisiaessa. Muiden sukujen, kuten Pichian tai Kluyveromyceksen, hiivaa voidaan myös käyttää. Hiivavektorit sisältävät yleensä replikaation alkukohdan hiivan 2p-plasmidista tai autonomisesti replikoituvan sek-. 25 venssin (ARS), promoottorin, IL-4R:ä koodittavan DNA:n, sekvenssit polyadenylaatiolle ja transkription lopetukselle sekä selektiogeenin. Edullisesti hiivavektorit sisältävät replikaation alkukohdan ja sekä hiivan että E. colin transformaation sallivan selektoitavan merkkiominaisuuden, 30 esim. E. colin ampisilliiniresistenssigeenin ja S♦ cere-visiaen trpl-geenin, joka tarjoaa selektiomerkkiominaisuu-den hiivan mutanttikannalle, jolta puuttuu kyky kasvaa tryptofäänissä, ja runsaasti ilmennettävästä hiivan geenistä peräisin olevan promoottorin alavirtaan olevan ra-35 kenteellisen sekvenssin transkription indusoimiseksi. Sit- 20 106044 ten trpl-vian esiintyminen isäntähiivasolun genomissa tarjoaa tehokkaan ympäristön transformaation havaitsemiseksi kasvattamalla ilman tryptofaania.

Sopiviin promoottorisekvensseihin hiivavektoreissa 5 kuuluvat metallotioneiinin, 3-fosfoglyseraattikinaasin (Hitzeman ym., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) tai muiden glykolyysin entsyymien (Hess ym., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; ja Holland ym., Biochem. _17:4900, 1978), kuten enolaasin, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin, 10 heksokinaasin, pyruvaattidekarboksylaasin, fosfofrukto- kinaasin, glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasin, 3-fosfoglyse-raattimutaasin, pyruvaattikinaasin, trioosifosfaatti-iso-meraasin, fosfoglukoosi-isomeraasin ja glukokinaasin promoottorit. Soveliaita vektoreita ja promoottoreita hiivas-15 sa ilmentämiseen käytettäviksi kuvataan enemmän Hitzemanin EPÄ 73 657:ssä.

Edullisia hiivavektoreita voidaan koota käyttäen DNA-sekvenssejä pBR322:sta E. colissa selektiota ja repii-kaatiota varten (Ampr-geeni ja replikaation alkukohta) ja 20 hiivan DNA-sekvenssejä, joihin kuuluu glukoosilla repres- soitavissa oleva ADH2-promoottori ja a-faktorin erityssig-naali. ADH2-promoottorin ovat kuvanneet Russell ym. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) ja Beier ym. (Nature 300:724, 1982). Hiivan α-faktorin signaali, joka ohjaa heterologis-• 25 ten proteiinien eritystä, voidaan sijoittaa promoottorin ja ilmennettävän rakenteellisen geenin väliin. Ks. esim. Kurjan ym., Cell 30:933, 1982; ja Bitter ym., Proc♦ Natl♦ Acad. Sei. USA 81:5330, 1984. Signaalisekvenssiä voidaan muuntaa sisältämään lähellä 3'-päätään yksi tai useampia 30 hyödyllisiä restriktiokohtia helpottamaan signaalisekvens- sin fuusiota vieraisiin geeneihin.

Soveliaat hiivan transformaatiomenettelyohjeet ovat ammattimiesten tuntemia: erään esimerkkimenetelmän ovat kuvanneet Hinnen ym., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929, 35 1978, jossa selektoidaan Trp+-transformantteja selektiivi- 21 106044 sessa elatusaineessa, joka sisältää 0,67 % hiivan typpi-lähdettä, 0,5 % kasamiinihappoja, 2 % glukoosia, 10 pg/ml adeniinia ja 20 pg/ml urasiilia.

ADH2-promoottorin käsittävillä vektoreilla trans-5 formoituja isäntäkantoja voidaan kasvattaa ilmentämistä varten rikkaassa elatusaineessa, joka sisältää 1 % hiiva-uutetta, 2 % peptonia ja 1 % glukoosia ja jota on täydennetty 80 pg/ml adeniinilla ja 80 pg/ml urasiililla. ADH2-promoottorin derepressio tapahtuu, kun elatusaineen glu-10 koosi loppuu. Raa'at hiivasupernatantit kerätään talteen suodatuksella ja pidetään 4 eC:ssa ennen jatkopuhdistusta.

Erilaisia nisäkäs- ja hyönteissoluviljelmäsysteeme-jä voidaan käyttää rekombinanttiproteiinin ilmentämiseen. Baculovirussysteemejä heterologisten preoteiinien tuotta-15 miseen hyönteissoluissa ovat selostaneet Luckow ja Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Esimerkkeihin soveliaista nisäkäsisäntäsolulinjoista kuuluvat Gluzmanin kuvaamat (Cell 23:175, 1981) apinan munuaissolujen C0S-7-linjat ja muut asianmukaista vektoria ilmentämään pystyvät solulin-20 jät, esimerkiksi L-solut, C127-, 3T3-, kiinanhamsterin munasarja- (CH0-), HeLa- ja BHK-solulinjat. Nisäkkään ekspressiovektorit voivat käsittää elementtejä, joista ei kopioida RNA:ta, kuten replikaation alkukohdan, soveliaan promoottorin ja tehostajan ilmennettävään geeniin liitet-;· 25 tyinä, ja muita 5'- tai 3'-puolen viereisiä sekvenssejä, joista ei kopioida RNA:ta, sekä 5'- tai 3'-pään sekvenssejä, joista ei tuoteta polypeptidiä, kuten tarvittavat ri-bosominsitoutumiskohdat, polyadenylaatiokohta, silmukoi-misen donori- ja akseptorikohdat ja transkription termi-30 naatiosekvenssit.

Selkärankaisten soluja transformoitaessa käytettävien ekspressiovektorien transkription ja translaation säätelysekvenssit voidaan saada käytettäviksi virusläh-teistä. Esimerkiksi yleisesti käytettyjä promoottoreita ja 35 tehostajia saadaan käytettäviksi polyomasta, adenovirus 22 106044 2:sta, simian virus 40:stä (SV40:stä) ja ihmisen sytomega-loviruksesta. SV40:n virusgenomista peräisin olevia DNA-sekvenssejä, esimerkiksi SV40:n alkukohtaa, varhais- ja myöhäispromoottoria, tehostajaa, silmukoimis- ja polyade-5 nylaatiokohtia, voidaan käyttää tarjoamaan heterologisen DNA-sekvenssin ilmentämiseen tarvittavat muut geneettiset elementit. Varhais- ja myöhäispromoottorit ovat erityisen hyödyllisiä, koska molemmat saadaan helposti viruksesta fragmenttina, joka sisältää myös SV40-viruksen replikaa-10 tion alkukohdan (Fiers ym., Nature 273:113, 1978). Pienempiä tai suurempia SV40-fragmentteja voidaan myös käyttää, sillä ehdolla että mukaan tulee noin 250 bp sekvenssi, joka ulottuu HindiII-kohdasta kohti viruksen replikaation alkukohdassa sijaitsevaa Bgll-kohtaa. Lisäksi voidaan 15 käyttää nisäkkään genomin IL-4R:n promoottoria, säätely-ja/tai signaalisekvenssejä, sillä ehdolla, että tällaiset säätelysekvenssit ovat yhteensopivia valitun isäntäsolun kanssa. Lisää yksityiskohtia, jotka koskevat nisäkkään runsaasti ilmentyvien vektorien käyttöä nisäkkään IL-4-20 reseptorin tuottamiseksi, tarjotaan edempänä esimerkissä 8. Esimerkkivektoreita voidaan muodostaa, kuten Okayama ja Berg ovat esittäneet (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983).

Hyödyllinen systeemi nisäkäsreseptorien · cDNA: iden stabiilia, runsasta ilmentämistä varten hiiren rintarauha-• 25 sen C127-epiteelisoluissa voidaan muodostaa olennaisesti

Cosmanin ym. (Mol. Immunol. 23:935, 1986) kuvaaman mukaisesti.

Erityisen edullinen eukaryoottivektori IL-4R:n DNA:n ilmentämiseen esitetään edempänä esimerkissä 2. Tämä 30 vektori, johon viitataan pCAV/NOT:na, johdettiin nisäkkään runsaasti ilmennettävästä vektorista pDC201, ja se sisältää säätelysekvenssejä SV40:stä, adenovirus-2:sta ja ihmisen sytomegaloviruksesta. Ihmisen IL-7-reseptori-insertin sisältävä pCAV/NOT on tallennettu American Type Culture 35 Collectioniin (ATCC) talletuksen hakunumerolla 68 014.

> 23 106044

Puhdistettuja IL-4-reseptoreja tai analogeja valmistetaan viljelemällä soveliaita isäntä/vektori-systeeme-jä tämän keksinnön mukaisten DNA:iden rekombinanttitrans-laatiotuotteiden ilmentämiseksi, jotka sitten puhdistetaan 5 elatusaineista tai solu-uutoksista.

Rekombinanttiproteiinia viljelmän elatusaineeseen erittävien systeemeistä saatavat supernatantit voidaan esimerkiksi ensin konsentroida käyttäen kaupallisesti saatavana olevaan proteiininkonsentrointisuodatinta, esimer-10 kiksi Amicon- tai Millipore Pellicon -ultrasuodatusyksik-köä. Konsentrointivaiheen jälkeen konsentraatti voidaan panna sopivaan puhdistusmatriisiin. Esimerkiksi sovelias affiniteettimatriisi voi käsittää IL-4- tai lektiini- tai vasta-ainemolekyylin sidottuna sopivaan kantajaan. Vaihto-15 ehtoisesti voidaan käyttää anioninvaihtohärtsia, esimer kiksi matriisia tai substraattia, jossa on varren päässä olevia diaminoetyyli (DEAE) -ryhmiä. Matriisit voivat olla akryyliamidia, agaroosia, dekstraania, selluloosaa tai muita yleisesti proteiinipuhdistuksessa käytettäviä tyyp-20 pejä. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kationinvaihtovai- hetta. Soveliaisiin kationinvaihtajiin kuuluvat erilaiset liukenemattomat kantajat, joihin sisältyy sulfopropyyli-tai karboksimetyyliryhmiä. Sulfopropyyliryhmät ovat edullisia.

.. 25 Lopuksi IL-4R-koostumuksen edelleen puhdistamiseksi voidaan käyttää yhtä tai useampaa käänteisfaasin korkea-suori tuskykyistä nestekromatografiaa (RP-HPLC) käyttäen hydrofobista RP-HPLC-materiaalia, esim. piidioksidigeeliä, jossa on varren päässä olevia metyyli- tai muita alifaat-30 tisia ryhmiä. Joitakin edeltävistä puhdistusvaiheista tai niitä kaikkia, erilaisina yhdistelminä, voidaan myös käyttää homogeenisen rekombinanttiproteiinin saamiseksi.

Bakteeri viljelmässä tuotettu rekombinanttiproteiini eristetään yleensä uuttamalla aluksi solunapeista, mitä 35 seuraa yksi tai useampia vaiheita konsentrointia, suola- 24 106044 saostusta, vesiliuoksessa tapahtuvaa ioninvaihtoa tai ko-koekskluusiokromatografiaa. Lopuksi korkeasuorituskykyistä nestekromatografiaa (HPLC) voidaan käyttää lopullisiin puhdistusvaiheisiin. Nisäkkään rekombinantti-IL-4R:n il-5 mentämisessä käytetyt mikrobisolut voidaan hajottaa millä tahansa tavanomaisella menetelmällä, mukaan lukien peräkkäiset jäädytykset ja sulatukset, sonikointi, mekaaninen hajotus tai soluja hajottavien aineiden käyttö.

Sellaisen hiivan fermentointi, joka ilmentää nisäk-10 kään IL-4R:ä eritettävänä proteiinina, yksinkertaistaa suuresti puhdistusta. Suuren mittakaavan fermentoinnista tuloksena saatava eritetty rekombinanttiproteiini voidaan puhdistaa menetelmillä, jotka ovat analogisia Urdalin ym. (J. Chromatog. 296:171, 1984) esittämille. Tämä viite ku-15 vaa kaksi peräkkäistä käänteisfaasi-HPLC-vaihetta ihmisen rekombinantti-IL-2:n puhdistamiseksi preparatiivisella HPLC-pylväällä.

Rekombinanttiviljelmässä syntetisoidulle ihmisen IL-4R:lle on tunnusomaista ei-ihmisperäisten solun kompo-20 nenttien, joihin kuuluu proteiineja, läsnäolo, joiden määrät ja laatu riippuvat ihmisen IL-4R:n viljelmästä talteen ottamiseksi suoritetuista puhdistusvaiheista. Nämä komponentit ovat tavallisesti peräisin hiivasta, prokaryooteis-ta tai muista korkeammista eukaryooteista kuin ihmisestä, ♦ 25 ja niitä esiintyy edullisesti harmittomia epäpuhtausmää- riä, luokkaa alle noin yksi painoprosentti. Lisäksi rekom-binanttisoluviljely mahdollistaa IL-4R:n tuottamisen vapaana proteiineista, jotka voivat olla normaalisti liittyneinä IL-4R:än sellaisena kuin se esiintyy luonnossa alku-30 peräisessä lajissaan, esim. soluissa, solujen tulehdusnes-teissä tai kehon nesteissä.

IL-4R-koostumuksia valmistetaan annettaviksi sekoittamalla halutun puhtausasteista IL-4R:ä fysiologisesti soveliaisiin kantajiin. Tällaiset kantajat ovat ei-toksi-35 siä saajille käytetyissä annosmäärissä ja pitoisuuksissa.

25 106044

Tavallisesti tällaisten koostumusten valmistukseen kuuluu IL-4R:n yhdistäminen puskurien, antioksidanttien, kuten askorbiinihapon, pienimolekyylipainoisten (alle noin 10 aminohappotähdettä) polypeptidien, proteiinien, aminohap-5 pojen, hiilihydraattien, mukaan lukien glukoosi, sakkaroosi ja dekstriinit, kelatoivien aineiden kuten EDTA:n, glu-tationin ja muiden stabilointiaineiden ja apuaineiden kanssa.

IL-4R-koostumuksia voidaan käyttää B-solutoiminnan 10 säätelyyn. Esimerkiksi liukoinen IL-4R (sIL-4R) estää B-soluviljelmien IL-4:n indusoimaa lisääntymistä anti-Ig:n läsnä ollessa. SIL-4R estää myös LPS-aktivoitujen B-solu-jen IL-4:n indusoimaa IgGl:n eritystä isotyyppispesifisel-lä ELISA:11a määritetyn mukaisesti, ja estää IL-4:n indu-15 soimaan Ia:n ilmentymistä hiiren B-soluissa EPICS-analyy-sillä määritetyn mukaisesti. SIL-4R estää myös IL-4:n indusoimaa IgE-synteesiä, ja sitä saatetaan sen mukaisesti käyttää IgE:n indusoimien välittömien yliherkkyysreaktioiden, kuten allergisen riniitin (tavallisen heinänuhan), 20 bronkiaaliastman, atooppisen dermatiitin ja gastrointesti-naalisen ruoka-aineallergian hoitoon.

IL-4R-koostumuksia voidaan myös käyttää T-solujen toiminnan säätelyyn. Esimerkiksi IL-4R estää IL-4:n indusoiman T-solulinjojen, kuten CTLL-T-solulinjan, lisäänty-. 25 mistä. SIL-4R estää myös endogeenisesti tuotetun IL-4:n välittämää funktionaalista aktiivisuutta. Esimerkiksi sIL-4R estää alloreaktiivisten sytolyyttisten T-lymfosyyttien (CTL) muodostumista sekundaarisessa sekoitettujen leukosyyttien viljelmässä, kun se on mukana viljelmässä yhtä 30 aikaa IL-2:n vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen, kuten S4B6:n kanssa. Neutraloivia aineita sekä IL-2:lle että IL-4:lie käytetään estämään endogeenista IL-2:ta ja IL-4:ä, jotka molemmat säätelevät CTL:ien modostumista ja joita tuotetaan tällaisissa viljelmissä.

26 106044

Hoitosovellutuksessa terapeuttisesti tehokas määrä IL-4-reseptorikoostumusta annetaan nisäkkääseen, edullisesti ihmiseen, yhdessä farmaseuttisen kantajan tai lai-mennusaineen kanssa.

5 Seuraavat esimerkit tarjotaan havainnollistavina, ei rajoittavina.

Esimerkit

Esimerkki 1 IL-4-reseptorin sitoutumismääritykset 10 A. lL-4:n radioleimaus. Hiiren ja ihmisen rekombi- nantti-IL-4:ä ilmennettiin hiivassa ja puhdistettiin homogeenisiksi, kuten ovat vastaavasti kuvanneet Park ym., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:5267 (1987) ja Park ym., J. Exp. Med. 166:476 (1987). Puhdistettu proteiini radiolei-15 mattiin käyttäen kaupallisesti saatavaa entsyymihelmira-diojoditusreagenssia (BioRad). Tässä menettelyssä 2,5 pg rIL-4:ä 50 pl:ssa 0,2 M natriumfosfaattia, pH 7,2, yhdistetään 50 μ1:η entsyymihelmireagenssia, 2 MCi:n natrium-jodidia 20 pl:ssa 0,05 M natriumfosfaattia, pH 7,0, ja 20 10 μ1:η 2,5 % b-D-glukoosia kanssa. Kymmenen minuutin jäl keen 25 °C:ssa lisättiin natriumatsidia (10 μΐ pitoisuutta 50 mM) ja natriummetabisulfiittia (10 μΐ pitoisuutta 5 mg/ ml), ja inkubaatiota jatkettiin 5 minuuttia 25 °C:ssa. Reaktioseos fraktioitiin geelisuodatuksella 2 ml:n pylväs-• 25 tilavuudessa SephadexR G-25:tä (Sigma), joka oli tasapaino tettu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 -elatus-aineeseen, jossa oli 2,5 % (paino/tilavuus), naudan seerumin albumiinia (BSA), 0,2 % (paino/tilavuus) natriumatsidia ja 20 mM Hepes pH 7,4 (sitoutumiselatusaine). Lopulli-30 set 125I-IL-4:n yhdistetyt fraktiot laimennettiin käyttökan- taliuokseksi pitoisuudeltaan 2 x 10‘8 M sitoutumiselatusai-neessa, ja sitä varastoitiin jopa kuukauden ajan 4 °C:ssa ilman havaittavaa reseptorisitoutumisaktiivisuuden menetystä. Ominaisaktiivisuus on tavanomaisesti välillä 1-2 x 35 1016 cpm/mmol IL-4.

9 27 106044 B. Sitoutuminen adherentteihin soluihin. Suspensio-viljelmissä kasvatetuilla soluilla tehdyt sitoutumismää-ritykset suoritettiin ftalaatti-öljy-erotusmenetelmällä (Dower ym., J. Immunol. 132:751, 1984) olennaisesti, kuten 5 ovat kuvanneet Park ym., J. Biol. Chem, 261:4177, 1986, ja Park ym., aiemmin mainittu teos. Sitoutumismäärityksiä tehtiin myös IL-4-reseptorimolekyyliä koodattavan cDNA:n sisältävällä ekspressiovektorilla transfektoiduilla COS-soluilla. Adherentteihin soluihin sitoutumisen Scatchard-10 analyysiä varten COS-soluja transfektoitiin plasmidi-DNArlla Luthmanin ym., Nucl. Acids Res. 11:1295, 1983, ja McCutchanin ym., J. Natl. Cancer Inst. 41:351, 1968, menetelmän mukaan. Kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut trypsinoitiin ja pantiin uudelleen kasvamaan kuusikuoppai-15 siin levyihin (Costar, Cambridge, MA) tiheydessä 1 x 104 C0S-lL-4-reseptoritransfektanttia/kuoppa sekoitettuna 5 x 105 kantajana olevan kontrollitransfektoidun COS-solun kanssa. Kaksi päivää myöhemmin yksikerroksista solumatois-ta määritettiin 125I-IL-4:n sitoutuminen 4 °C:ssa olennai-20 sesti Parkin ym., J. Exp. Med. 166:476, 1987, kuvaaman menetelmän mukaan. 125I-IL-4:n epäspesifinen sitoutuminen mitattiin 200-kertaisen tai suuremman mooliylimäärän lei-maamatonta IL-4:ä ollessa läsnä. Natriumatsidia (0,2 %) pidettiin mukana kaikissa sitoutumismäärityksissä solujen 25 125I-IL-4:n sisäänoton estämiseksi 37 eC:ssa.

Liukoisesta IL-4R:stä johtuvan sitoutumisen inhibition analysoimiseksi rekombinantti-IL-4R-konstruktioilla transfektoitujen COS-solujen supernatantteja kerättiin talteen kolme päivää transfektion jälkeen. Muokattujen 30 elatusaineiden kaksinkertaisia sarjalaimennoksia esi-inku-boitiin 3 x 10-10 M 125I-IL-4:n kanssa (jolla oli ominaisak-tiivisuus noin 1 x 1016 cpm/mmol) tunnin ajan 37 °C:ssa ennen 2 ·χ 106 CTLL-solun lisäämistä. Inkubaatiota jatkettiin 30 minuuttia 37 °C:ssa ennen vapaan ja soluihin si-35 toutuneen hiiren 125I-IL-4:n erottamista toisistaan.

* 1°δ°44 C. Kiinteän faasin sitoutumismääritykset. IL-4-re-septorin kyky pysyä stabiilisti adsorboituneena nitrosel-luloosaan CTLL-19.4-solujen detergenttiuutoksista ja silti säilyttää IL-4:n sitomiskyky tarjosi keinon puhdistuk-5 sen seuraamiseksi. Yhden millilitran näytteitä solu-uutoksista (ks. esimerkki 3), IL-4-affiniteettipylvään fraktioita (ks. esimerkki 4) tai muita näytteitä pannaan kuiville BA85/21-nitroselluloosakalvoille (Schleicher and Schuell, Keene, NH) ja annetaan kuivua. Kalvoja inkuboi-10 daan kudosviljelymaljoilla 30 minuuttia Tris-puskuroidussa (0,05 M) suolaliuoksessa (0,15 M), pH 7,5, jossa on 3 % paino/tilavuus BSA:ta epäspesifisten sitoutumiskohtien tukkimiseksi. Sitten kalvo peitetään 4 x 10"11 M 125I-IL-4:llä liuoksessa PBS + 3 % BSA, jossa on tai ei ole 200-15 kertainen molaarinen ylimäärä leimaamatonta IL-4:ä, ja inkuboidaan 2 tuntia 4 °C:ssa ravistellen. Tämän ajan loputtua kalvot pestään kolmesti PBS:llä, kuivataan ja pannaan Kodak X-0mat™ AR -filmille 18 tunniksi -70 °C:seen. Esimerkki 2 20 Runsaasti IL-4-reseptoria ilmentävien CTLL-solujen selektio fluoresenssiaktivoidulla solulajittelulla (FACS:lla)

Edullinen solulinja korkean IL-4-reseptoriselektion saavuttamiseksi on CTLL, IL-2:sta riippuva hiiren sytotok-. 25 sinen T-solulinja (ATCC TIB 214). Korkeampien IL-4-resep- torin ilmentämistasojen saamiseksi CTLL-solut (kantasolut) lajiteltiin käyttäen f luoresenssiakti voitua solulajittelua ja fluoreseiinikonjugoitua hiiren rekombinantti-IL-4:ä (rmIL-4), jossa hiivaisännän rmIL-4:ään liittämää runsasta 30 hiilihydraattia käytetään hyödyksi kytkemällä fluoreseii-nihydratsidia perjodaattihapetetuihin sokeriosiin. Fluore-seiinikonjugoitu IL-4 valmistettiin yhdistämällä eriä hy-perglykosyloitua rmIL-4:ä (300 pg 300 pl:ssa 0,1 M sit-raatti-fosfaatti-puskuria, pH 5,5) 30 μ1:η 10 mM natrium-35 m-perjodaattia (Sigma) kanssa, joka oli vasta valmistettu • 29 106044 0,1 M sitraatti-fosfaattiin, pH 5,5, ja seosta inkuboi-tiin 4 °C:ssa 30 minuuttia pimeässä. Reaktio pysäytettiin 30 pl:lla 0,1 M glyserolia ja dialysoitiin 18 tuntia 4 °C:ssa 0,1 M sitraatti-fosfaattia, pH 5,5, vastaan. Dia-5 lyysin jälkeen 1/10 tilavuus 100 mM 5-(((2-(karbohydratsi-no)metyyli)tio)asetyyli)aminofluoreseiinia (Molecular Probes, Eugene, OR) DMS0:hon liuotettuna lisättiin näytteeseen ja inkuboitiin 25 °C:ssa 30 minuuttia. Sitten IL-4-fluoreseiini dialysoitiin perinpohjaisesti 4 °C:ssa 10 PBS:ä, pH 7,4, vastaan, ja proteiinipitoisuus määritettiin aminohappoanalyysillä. Lopullinen tuote varastoitiin 4 °C:seen 1 % (paino/tilavuus) BSA:ta lisäämisen ja ste-riilisuodatuksen j älkeen.

Lajittelua varten CTLL-soluja (5 x 106) inkuboitiin 15 30 minuuttia 37 °C:ssa 150 yl:ssa liuosta PBS + 1 % BSA, joka sisälsi 1 x 10'9 M IL-4-fluoreseiinia steriileissä olosuhteissa. Sitten seos jäähdytettiin 4 °C:seen, pestiin kerran suurella tilavuudella liuosta PBS + 1 % BSA ja lajiteltiin käyttäen EPICSR-virtaussytometria (Coulter In-20 struments). Korkeimman fluoresenssisignaalitason antavat solut (ylin 1,0 %) kerättiin yhteen, ja populaatiota laajennettiin nestemäisessä soluviljelmässä. Vaihtoehtoisesti, yksittäisten solujen kloonausta varten solut, joissa nähtiin ylimpään 1,0 %:in kuuluva fluoresenssisignaali, 25 lajiteltiin 96-kuoppaisiin kudosviljelymikrotiitterilevyi- hin yksi solu kuoppaa kohti.

Edistymistä seurattiin tekemällä sitoutumismääri-tyksiä 125I-IL-4:llä jokaisen FACS-selektiokierroksen jälkeen. Lajittelemattomat CTLL-solut (kanta-CTLL) ilmensivät 30 tyypillisesti 1 000 - 2 000 IL-4-reseptoria solua kohti. CTLL-solut pantiin 19 FACS-selektiokierrokseen. Lopullisissa selektoiduissa CTLL-soluissa (CTLL-19) nähtiin 5 x 105 - 1 x 106 IL-4-reseptoria solua kohti. Tässä vaiheessa CTLL-19-populaatio pantiin EPICS’* C -avustettuun erillisten 35 solujen kloonaukseen, ja yksittäisiä kloonipopulaatioita 30 106044 laajennettiin ja niistä testattiin 125I-IL-4-sitoutuminen. Yhdellä kloonilla, nimeltään CTLL-19.4, nähtiin 1 x 106 IL-4-reseptoria solua kohti, ja se valittiin puhdistus- ja kloonauskokeisiin. Vaikka lasketut näennäiset Ka-arvot ovat 5 samankaltaiset näille kahdelle linjalle, CTLL-19.4 ilmentää noin 400-kertaa enemmän reseptoreita pinnallaan kuin kanta-CTLL.

Esimerkki 3 CTLL-solujen detergenttiuutto 10 CTLL-19.4-soluja pidettiin yllä RPMI 1640:ssä, joka sisälsi 10 % naudan sikiön seerumia, 50 U/ml penisilliiniä, 50 pg/ml streptomysiiniä ja 10 ng/ml ihmisen rekom-binantti-IL-2:ta. Soluja kasvatettiin tiheyteen 5 x 105 solua/ml roller-pulloissa, kerättiin talteen sentrifugoi-15 maila, pestiin kahdesti seerumittomalla DMEM:llä ja sedi-mentoitiin 2 000 x g:llä 10 minuuttia pakatun solunapin muodostamiseksi (noin 2 x 10® solua/ml). Solunappiin lisättiin yhtä suuri tilavuus PBS:ä, joka sisälsi 1 % Triton® X-100:a ja sekoituksen proteaasi-inhibiittoreita (2 mM fe-20 nyylimetyylisulfonyylifluoridi, 10 μΜ pepstatiini, 10 μΜ leupeptiini, 2 mM o-fenantroliini ja 2 mM EGTA). Solut sekoitettiin uuttopuskurin kanssa voimakkaalla vortex-se-koituksella, ja seosta inkuboitiin jäissä 20 minuuttia, minkä jälkeen seos sentrifugoitiin 12 000 x g:llä 20 mi-. 25 nuuttia 8 °C:ssa tumien ja muiden hiukkasten poistamisek si. Supernatantti joko käytettiin välittömästi tai varastoitiin -70 eC:seen käyttöön asti.

Esimerkki 4 IL-4-reseptorin puhdistus IL-4-affinitteettikroma-30 tografialla

Jotta saataisiin riittäviä määriä hiiren IL-4R:ä sen N-terminaalisen sekvenssin määrittämiseksi tai ihmisen lL-4R:n edelleen karakterisoimiseksi, solujen deter-genttiuutosta saatua proteiinia puhdistettiin edelleen 35 affiniteettikromatografiällä. Hiiren tai ihmisen rekombi- 31 106044 nantti IL-4:ä kytkettiin AffigelR-10:en (BioRad) valmistajan suositusten mukaisesti. Esimerkiksi lL-4-liuokseen (3,4 mg/ml 0,4 ml:ssa 0,1 M Hepes-puskuria pH 7,4) lisättiin 1,0 ml pestyä AffigelR-10: tä. Liuosta heilutettiin yli 5 yön 4 °C:ssa, ja supernatanttinäytteestä testattiin proteiini BioRadin proteiinimäärityksellä valmistajan ohjeiden mukaan käyttäen BSA:ta standardina. Yli 95 % proteiinista oli kytkeytynyt geeliin, mikä viittasi siihen, että pylväässä oli lopullinen sisältö 1,3 mg IL-4:ä/ml geeliä. 10 Glysiinin etyyliesteriä lisättiin lopulliseen konsentraa-tioon 0,05 M mahdollisten reagoimattomien kohtien tukkimiseksi geelissä. Geeli pestiin perusteellisesti liuoksella PBS - 1 % Triton", ja sen jälkeen liuoksella 0,1 glysiini-HC1, pH 3,0. Hiiren IL-4R:n puhdistamiseksi valmistettiin 15 0,8 x 4,0 cm pylväs kuvatulla tavalla valmistetusta IL-4- kytketystä Affigelistä" (pylvään tilavuus 4,0 ml), ja sitä pestiin PBS:llä, joka sisälsi 1 % Triton" X-100:a. Vaihtoehtoisesti 50 μ1:η eriä IL-4-kytketyn Affigelin" 20 % suspensiota inkuboitiin 35S-kysteiini/metioniini-leimattujen 20 solu-uutosten kanssa pienimittakaavaisia affiniteettipuh- distuksia ja geelielektroforeesia varten.

Näytteitä (25 ml) detergenttiuutetuista IL-4-re-septorillisista CTLL-19.4-soluista pantiin hitaasti hiiren IL-4-affiniteettipylvääseen (virtausnopeus 3,0 ml tun-25 nissa). Sitten pylvästä pestiin peräkkäin PBS:llä, joka sisälsi 1 % Triton" X-100:a, RIPA-puskurilla (0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 1 % NP-40, 1 % deoksikolaatti ja 0,1 % SDS), PBS:llä, joka sisälsi 0,1 % Triton" X-100:a ja 10 mM ATP, ja PBSrllä, joka sisälsi 1 % Triton" X-100:a kaikkien epä-30 puhtausmateriaalien paitsi mIL-4R:n poistamiseksi. Sitten pylväs eluoitiin pH:n 3,0 glysiini-HCl-puskurilla, joka sisälsi 0,1 % Triton" X-100:a IL-4R:n irrottamiseksi, ja pestiin sen jälkeen PBS:llä, joka sisälsi 0,1 % Triton" X-100:a. Yhden millilitran fraktioita kerättiin eluutiossa 35 ja 2 ml fraktioita pesun aikana. Välittömästi eluution 106044 32 jälkeen näytteet neutraloitiin 80 pl:lla 1 M Hepes-pusku-ria, pH 7,4. Reseptorin läsnäolo fraktioissa havaittiin kiinteän faasin sitoutumismäärityksellä edellä kuvatun mukaisesti 125I-leimattua IL-4:ä käyttäen. Jokaisesta frak-5 tiosta otettiin näytteet SDS-PAGE:lla analysointia varten, ja loput pakastettiin -70 °C:seen käyttöön asti. SDS-PA-GE:a varten 40 pl:aan jokaista pylväsfraktiota lisättiin 40 μΐ 2 X SDS-näytepuskuria (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, 4 % SDS, 20 % glyseroli, 10 % 2-merkaptoetanoli). Näytteet 10 pantiin kiehuvaan vesihauteeseen 3 minuutiksi, ja 80 μΐ erät pantiin näytekoloihin 10 % polyakryyliamidigeelissä, joka oli tehty ja ajettiin Laemmlin menetelmän mukaisesti (Nature 227:680, 1970). Elektroforeesin jälkeen geelit hopeavärjättiin kuten Urdal ym. ovat aiemmin kuvanneet 15 (Proc. Natl. Acad. Sei, USA 81:6481, 1984).

Puhdistus edeltävällä menetelmällä salli tunnistaa polyakryyliamidigeelien hopeavärjäyksellä kaksi mlL-4R-proteiinivyöhykettä, keskimäärin 45 - 55 kDa ja 30 -40 kDa, jotka esiintyivät IL-4:n sitomisaktiivisuutta 20 osoittavissa fraktioissa. Kokeet, joissa CTLL-19.4-solu-jen solun pinnan proteiinit radioleimattiin, ja 125I-leimat-tu reseptori puhdistettiin affiniteettikromatografialla, viittasivat siihen, että nämä kaksi proteiinia ilmentyivät solun pinnalla. Alempimolekyylipainoisen vyöhykkeen suhde 25 ylempimolekyylipainoiseen kasvoi varastoitaessa fraktioita 4 °C:ssa, mikä viittaa esiaste-tuote-suhteeseen, mahdollisesti hitaan proteolyyttisen hajotuksen takia. Edeltävällä menetelmällä puhdistettu mIL-4-reseptori säilyttää kykynsä sitoa IL-4:ä, sekä liuoksessa että nitroselluloo-30 salle adsorboituna.

Esimerkki 5 IL-4-reseptoriproteiinin sekvensointi CTLL-19.4:n mIL-4-reseptoria sisältävät fraktiot mIL-4-affiniteettipylväspuhdistuksesta valmisteltiin ami-35 noterminaalista proteiinisekvenssianalyysiä varten frak- . · 33 106044 tioimalla SDS-PAGE-geelillä ja sitten siirrettiin PVDF-kalvolle. Ennen kuin proteiinifraktiot ajettiin polyakryy-liamidigeeleilla, oli ensin tarpeen poistaa affiniteetti-puhdistusmenetelmästä jäävä detergentti. mIL-4-affiniteet-5 tipylvääseen sitoutuneita proteiineja sisältäneet fraktiot kolmesta preparaatista sulatettiin ja konsentroitiin kukin erikseen alipaineessa tyhjiösentrifuugissa 1 ml:n lopulliseen tilavuuteen. Sitten konsentroitujen fraktioiden pH säädettiin arvoon 2 lisäämällä 50 % (tilavuus/tilavuus) 10 TFA:ta, ja ne injektoitiin Brownlees RP-300 -käänteisfaa-si-HPLC-pylvääseen (2,1 x 30 mm), joka oli tasapainotettu 0,1 % (tilavuus/tilavuus) TFA:11a H20:ssa virtausnopeudella 200 μΐ minuutissa, ajaen Hewlett Packardin Model 1090M HPLCrllä. Pylvästä pestiin 0,1 % TFA:11a H20:ssa 20 minuut-15 tia injektoinnin jälkeen. Sitten sitoutuneen proteiinin sisältävää HPLC-pylvästä ajettiin seuraavanlaisella gra-dientilla:

Aika Asetonitriili-% 0,1 % TFArssa 20 0 0 5 30 15 30 25 70 30 70 25 35 100 40 0

Yhden millilitran fraktioita kerättiin viiden minuutin välein, ja niistä analysoitiin proteiinin läsnäolo SDS-30 PAGE:11a ja hopeavärjäyksellä sen jälkeen.

Kukin HPLC-ajon fraktio haihdutettiin kuiviin tyhjiösentrifuugissa ja sitten jälleensuspensoitiin Laemmlin pelkistävään näytepuskuriin, joka oli valmistettu, kuten Laemmli, U. K. on kuvannut, Nature 227:680, 1970. Näytteet 35 pantiin 5 - 20 %:n Laemmlin gradientti-SDS-geelille ja 34 106044 ajettiin 45 mA:lla kunnes väriainerintama saavutti geelin alapään. Sitten geeli siirrettiin PVDF-paperille ja värjättiin kuten Matsudaira on kuvannut, J. Biol. Chem. 262: 10035, 1987. Värjäytyvät vyöhykkeet tunnistettiin selvästi 5 jokaisen kolmen preparaatin fraktioista noin 30 000 - 40 000 Mr kohdalla.

Vyöhykkeet edeltävästä PVDF-blottauksesta leikattiin irti ja pantiin automatisoituun Edmanin degradaatioon Applied Biosystemsin Model 477A Protein Sequencerillä 10 olennaisesti, kuten ovat kuvanneet March ym. (Nature 315: 641, 1985), paitsi että PTH-aminohapot injisoitiin automaattisesti ja analysoitiin suoraan laitteesta Applied Biosystemsin Model 120A HPLC:llä käyttäen valmistajan toimittamaa gradientti- ja detektiosysteemiä. Seuraava amino-15 terminaalinen sekvenssi määritettiin sekvensoinnin tuloksista : NH2-Ile-Lys-Val-Leu-Gly-Glu-Pro-Thr-Cys/Asn-Phe-Ser-Asp-Tyr-Ile. Vyöhykkeet toisesta aminoterminaaliseen sekvensointiin käytettävästä preparaatista käsiteltiin CNBr:lla käyttäen Marchin ym. (Nature 315:641, 1985) ku-20 vaarnaa in situ -tekniikkaa proteiinin pilkkomiseksi sisäisten metioniinitähteiden jälkeen. Saatujen pilkkomis-tuotteiden sekvensoinnista saatiin seuraavat tulokset, jotka viittaavat siihen, että CNBr katkaisi proteiinin kahden sisäisen metioniinitähteen jälkeen: 25

Sykli Havaitut aminohappotähteet 1 Vai, Ser 2 Gly, Leu 3 Ile, Vai 30 4 Tyr, Ser 5 Arg, Tyr 6 Glu, Thr 7 Asp, Ala 8 Asn, Leu 35 9 Pro, Vai • 35 106044 4 10 Ala 11 Glu, Vai 12 Phe, Gly 13 Ile, Asn 5 14 Vai, Gin 15 Tyr, Ile 16 Lys, Asn 17 Vai, Thr 18 Thr, Gly 10

Verrattaessa klooneista 16 ja 18 saatuihin proteiinisek-vensseihin (ks. kuvio 2), sekvenssit sopivat toisiinsa seuraavasti: 15 10 15 18 15 Sekvenssi 1: (Met)-Val-Asn-lle-Ser-Arg-Glu-Asp-Asn-Pro-AIa-Glu-Phe-lle-Val-Tyr-Asn-Val-Thr 15 10 15 18

Sekvenssi 2: (MetJ-Ser-Gly-VaHyr-Tyr-Thr-AIa-Arg-Val-Arg-Val-Arg-Ser-GIn-lle-Leu-Thr-Gly

Identtiset yhteensopivuudet löydettiin kaikille asemille sekvenssissä 1, paitsi Asn(2):lle, ja sekvenssissä 2, 20 paitsi Arg:lle asemissa 8, 10 ja 12, Ser:lle asemassa 13 ja Leu:lle asemassa 16. Yllä olevat sekvenssit vastaavat kuvion 2 aminohappotähteitä 137 - 154 ja 169 - 187.

Lisäksi aminoterminaalinen sekvenssi sopi yhteen kloonista saadun sekvenssin kanssa aseman 9 määräytyessä 25 Cys:ksi.

Edellä olevat tulokset tukevat sitä johtopäätöstä, että kloonit 16 ja 18 ovat peräisin IL-4-reseptorin lähetistä.

Esimerkki 6 30 Hybridivähennetyn cDNA-koettimen synteesi

Hiiren lL-4-reseptoria koodittavien kloonien seulomiseksi kirjastosta hankittiin erittäin rikastettu IL-4-reseptori-cDNA-koetin käyttäen vähennyshybridisaation strategiaa. Polyadenyloitu (polyA*) mRNA eristettiin kah-35 desta samankaltaisesta solulinjasta, kantasolulinjasta ·· 36 106044 CTLL (joka ilmentää noin 2 000 reseptoria solua kohti) ja lajitellusta solulinjasta CTLL-19.4 (joka ilmentää 1 x 106 reseptoria solua kohti). Näiden kahden solulinjan mRNA-sisällön odotetaan olevan identtinen lukuun ottamatta IL-5 4-reseptorin mRNA:n suhteellista tasoa. Sitten radiolei-mattu yksijuosteinen cDNA-preparaatti tehtiin lajitellun solulinjan CTLL-19.4 mRNArsta CTLL-19.4-solujen polyadeny-loidun mRNA:n käänteistranskriptiolla samankaltaisella menettelyllä kuin Maniatisin ym. kuvaama, Molecular Clo-10 ning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). Lyhyesti, polyA+-mRNA:ta puhdistettiin, kuten ovat kuvanneet March ym. (Nature 315:641-647, 1985), ja kopioitiin cDNA:ksi käänteistranskriptaasilla käyttäen oligo-dT:tä alukkeena. Jotta saataisiin korkea cDNA:n 32P-15 leimautumistaso, käytettiin 100 pCi 32P-dCTP:tä (spes. akt. = 3 000 Ci/mmol) 50 μ1:η reaktiossa ei-radioaktiivi-sen dCTP:n ollessa pitoisuudessa 10 μΜ. Kahden tunnin käänteistranskription jälkeen 42 °C:ssa, EDTA:ta lisättiin pitoisuuteen 20 mM, ja RNA hydrolysoitiin lisäämällä 20 NaOH:a pitoisuuteen 0,2 M ja inkuboimalla cDNA-seosta 68 °C:ssa 20 minuuttia. Yksijuosteinen cDNA uutettiin fe-noli/kloroformi-seoksella (50/50), joka oli ennalta tasapainotettu liuoksen 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, kanssa. Ve-sifaasi siirrettiin puhtaaseen putkeen ja tehtiin uudel-, 25 leen alkaliseksi lisäämällä NaOH:a pitoisuuteen 0,5 M.

Sitten cDNA fraktioitiin koon mukaan kromatografiällä 6 ml:n SephadexR G50 -pylväässä liuoksessa 30 mM NaOH, 1 mM EDTA, pienimolekyylipainoisten epäpuhtauksien poistamiseksi.

30 Tuloksena saatu koon mukaan fraktioitu, lajitel luista CTLL-19.4-soluista muodostettu cDNA hybridisoitiin sitten ylimäärän lajittelemattomista kanta-CTLL-soluista tulevaa mRNA:ta kanssa etanolisaostamalla CTLL-19.4-solu-jen cDNA yhdessä 30 pg:n lajittelemattomista CTLL-soluista 35 eristettyä mRNA:ta kanssa, jälleensuspensoimalla 16 pl:aan • 37 106044 liuosta 0,25 M NaP04, pH 6,8, 0,2 % SDS, 2 mM EDTA, ja in-kuboimalla 20 tuntia 68 °C:ssa. Ne cDNA:t lajitelluista 19.4-soluista, jotka ovat komplementaarisia lajittelemattomista CTLL-soluista tuleville mRNA:ille, muodostavat 5 kaksijuosteisia cDNA/mRNA-hybridejä, jotka voidaan sitten erottaa yksijuosteisesta cDNA:sta perustuen niiden erilaisiin sitoutumisaffiniteetteihin hydroksiapatiittiin. Seos laimennettiin 30-kertaisella tilavuudella 0,02 M NaP04:a, annettiin sitoutua hydroksiapatiittiin huoneenlämmössä, ja 10 sitten yksijuosteinen cDNA eluoitiin hartsista liuoksella 0,12 M NaP04, pH 6,8, 60 °C:ssa, kuten ovat kuvanneet Sims ym., Nature 312:541, 1984. Sitten fosfaattipuskuri poistettiin sentrifugoimalla 2 ml:n sentrifugoitavissa Sepha-dexR G50 -pylväissä vedessä. Tämä hybridivähennysmenettely 15 poistaa suurimman osan CTLL-19.4:n ja lajittelemattomien CTLL-solujen välisistä yhteisistä sekvensseistä ja jättää yksijuosteisen cDNA:n poolin, joka on rikastunut radiolei-matun IL-4-reseptori-cDNA:n suhteen, jota voidaan käyttää koettimena tutkittaessa cDNA-kirjastoa (kuten edempänä 20 kuvataan).

Esimerkki 7 cDNA-kirjaston synteesi ja plakkien seulonta cDNA-kirjasto muodostettiin CTLL-19.4-soluista eristetystä polyadenyloidusta mRNA:sta standardimenetelmin 25 (Gubler ym., Gene 25:263, 1983; Ausubel ym., toim., Current Protocols in Molecular Biology, Voi. 1, 1987). Oligo-dT:tä alukkeena käyttävän käänteistranskription jälkeen yksijuosteinen cDNA saatettiin kaksijuosteiseksi DNA-poly-meraasi I:llä, tasapäistettiin T4:n DNA-polymeraasilla, 30 metyloitiin EcoRI-metylaasilla cDNA:ssa olevien EcoRI-kat- kaisukohtien suojaamiseksi, ja ligatoitiin EcoRI-linkke-reihin. Saadut konstruktiot pilkottiin EcoRI:llä kaikkien paitsi yhden kopion linkkereistä poistamiseksi cDNA:n molemmista päistä ja ligatoitiin ekvimolaariseen pitoisuu-35 teen EcoRI:llä katkaistuja ja defosforyloituja %ZAPR-käsi- « 38 106044 varsia, ja saatu ligaatioseos pakattiin in vitro (Giga-packR) valmistajan ohjeiden mukaan. Muita soveliaita menetelmiä ja reagensseja cDNA-kirjastojen muodostamiseksi χ-faagivektoreissa ovat kuvanneet Huynh ym., DNA Cloning 5 Techniques: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1984); Meissner ym., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4171 (1987) ja Ausubel ym., aiemmin mainittu teos. XZAPR on Xgtll:n kanssa samankaltainen X-faagin kloonausvektori (US-patentti 4 788 135), joka sisältää plasmidisekvenssejä 10 pUC19:stä (Norrander ym., Gene 26:101, 1987), lacZ-geeni-fragmentissa sijaitsevan polylinkkerikohdan, fl-faagin replikaation alkukohdan, joka sallii ssDNA:n talteenoton, kun isäntäbakteereita superinfektoidaan fl-apufaagilla. DNA leikataan irti sellaisen plasmidin muodossa, joka kä-15 sittää edeltävät elementit, josta käytetään nimeä Bluesc-riptR. GigapackR on sonikoitu E. coli -uute, jota käytetään X-faagin DNA:n pakkaamiseen. χΖΑΡκ, BluescriptR ja GigapackR ovat Stratagenen, San Diego, CA, USA, rekisteröityjä tava-ramerkkej ä.

20 Sitten esimerkin 6 radioleimattua, hybridivähennet- tyä cDNA:ta käytettiin koettimena cDNA-kirjaston seulomiseksi. Monistettu kirjasto maljättiin BB4-soluille tiheydessä 25 000 plakkia jokaiselle 20:stä 150 mm maljasta ja inkuboitiin yli yön 37 °C:ssa. Kaikki XZAPR:n manipulaa-25 tiot ja BluescriptR-plasmidin irrotus olivat, kuten ovat kuvanneet Short ym., (Nucl. Acids Res. 16:7583, 1988) ja Stratagenen tuotekirjallisuus. Rinnakkaisia suodattimia, joihin plakit oli poimittu, inkuboitiin esimerkin 6 hybri-divähennetyjen cDNA-koettimien kanssa hybridisaatiopusku-30 rissa, joka sisälsi 50 % formamidia, 5 x SSC, 5 x Den-hardtin reagenssin ja 10 % dekstraanisulfaattia, 42 °C:ssa 48 tuntia, kuten Wahl ym. ovat kuvanneet, Proc. Natl. Acad. Sci♦ USA 76:3683, 1979. Sitten suodattimia pestiin 68 °C:ssa 0,2 X SSC:ssä. Kuusitoista positiivista plakkia 35 puhdistettiin lisäanalyysiin.

39 106044 cDNA-insert te jä sisältävät BluescriptR-plasmidit leikattiin irti faagista, kuten valmistaja on kuvannut ja transformoitiin E. coliin. Plasmidi-DNA eristettiin yksittäisistä pesäkkeistä, pilkottiin EcoRI; llä cDNA-inserttien 5 irrottamiseksi ja ajettiin elektroforeesissa tavanomaisissa 1 % agaroosigeeleissä. Neljä rinnakkaista geeliä blo-tattiin nylonsuodattimille identtisten Southernin blottien tuottamiseksi analyysiä varten eri koettimilla, jotka olivat (1) radioleimattu cDNA lajittelemattomista CTLL-so-10 luista, (2) radioleimattu cDNA lajitelluista CTLL-19.4-soluista, (3) hybridivähennetty cDNA lajitelluista CTLL-19.4-soluista, (4) hybridivähennetty cDNA lajitelluista CTLL-19.4-soluista toisen, IL-4-reseptorinegatiivisen hiiren solulinjan (LBRM 33 1A5B6) polyA*-mRNA:han tehdyn hyb-15 ridisaatiokierroksen jälkeen. Nämä koettimet olivat enenevässä määrin rikastettuja lajitellulle solulinjalle CTLL- 19. 4 spesifisen mRNA:n cDNA-kopioiden suhteen. Kuudestatoista positiivisesta, kirjastosta eristetystä plakista neljässä kloonissa (HA, 14, 16 ja 18) nähtiin signaalin 20 voimakkuudessa koettimen rikastuneisuutta vastaava kasvu.

Eristettyjen CTLL-kloonien restriktiokartoitus (esitetty kuviossa 1) ja DNA-sekvensointi osoittivat ainakin kahden erilaisen mRNA-populaation olemassaolon. Molemmissa mRNA-tyypeissä on homologiset avoimet lukukehykset 25 suurimman osan koodittavaa aluetta läpi, mutta silti ne poikkeavat toisistaan 3'-päässä, koodittaen siten homologisia proteiineja, joilla on erilaiset COOH-terminaaliset sekvenssit. Molempien kloonien avointen lukukehysten sisällä oleva DNA-sekvenssi koodittaa proteiinisekvenssiä, 30 joka on identtinen puhdistetun IL-4-reseptorin sekvens-soinnista saadun, esimerkissä 5 yksityiskohtaisemmin kuvatun proteiinisekvenssin kanssa. Kloonia 16 ja kloonia 18 käytettiin näiden kahden erilaisen lähettityypin prototyyppeinä. Klooni 16 sisältää avoimen lukukehyksen, joka 35 koodittaa 258 aminohapon polypeptidiä, johon sisältyvät • 40 106044 kuvion 2A aminohapot -25 - 233. Klooni 18 koodittaa 230 aminohapon polypeptidiä, jonka N-terminaaliset 224 aminohappoa ovat identtiset kloonin 16 N-pään kanssa, mutta joka poikkeaa 3’-päässä nukleotideilla CCAAGTAATGAAAATCTG, 5 jotka koodittavat C-terminaaliset 6 aminohappoa, Pro-Ser-Asn-Glu-Asn-Leu, joita seuraa lopetuskodoni TGA. Molempia klooneja ilmennettiin nisäkäsekspressiosysteemissä, kuten esimerkissä 8 kuvataan.

Esimerkki 8 10 XL-4R:n ilmentäminen nisäkässoluissa A.Ilmentäminen C0S-7-soluissa. Kuviossa 3 esitetty eukaryoottiekspressiovektori pCAV/NOT oli johdettu Simsin ym. kuvaamasta (Science 241:585, 1988) runsaasti ilmentyvästä nisäkäsvektorista pDC201. pDC201 on Cosmanin ym. 15 aikaisemmin kuvaaman, Nature 312:768, 1984, pMLSV:n johdannainen. pCAV/NOT on suunniteltu nisäkässoluihin trans-fektoituna ilmentämään cDNA-sekvenssejä, jotka on sijoitettu sen moninkertaiseen kloonauskohtaan (MCS), ja se käsittää seuraavat komponentit: SV40 (varjostettu suora-20 kaide) sisältää SV40:n sekvenssit koordinaateista 5 171 -270 käsittäen replikaation alkukohdan, tehostajasekvens-sin sekä varhais- ja myöhäispromoottorit. Fragmentti on niin päin, että transkription suunta varhaispromoottorista lähtien on nuolen osoittaman mukainen. CMV sisältää ihmi-25 sen sytomegaloviruksessa olevat promoottori- ja tehostaja-alueet (nukleotidit -671:stä +7:ään Boshartin ym. julkaisemasta sekvenssistä, Cell 41:521-530, 1985). Kolmiosainen "leader" (pilkutettu suorakaide) sisältää adenovirus-2:n kolmiosaisen "leaderin" ensimmäisen eksonin ja osan ensim-30 mäisen ja toisen eksonin välisestä intronista, kolmiosaisen "leaderin" toisen eksonin ja osan kolmatta eksonia ja moninkertaisen kloonauskohdan (MCS), jossa on kohdat Xholille, Kpnl:lle, Smal:lle, Notltlle ja BglII:lle. pA (varjostettu suorakaide) sisältää SV40:n sekvenssit koh-35 dista 4 127 - 4 100 ja 2 770 - 2 533, joihin sisältyy var- 41 106044 haisen transkription polyadenylaatio- ja lopetussignaalit. pA:sta myötäpäivään ovat adenovirus-2:n VAI- ja VAII-gee-nit sisältävät sekvenssit 10 532 - 11 156 (mustan paksun viivan osoittamat), joita seuraavat pBR322:n sekvenssit 5 (yhtenäinen viiva) kohdista 4 363 - 2 486 ja 1 094 - 375, joihin sisältyy ampisilliiniresistenssigeeni ja replikaa-tion alkukohta. Tuloksena saatu ekspressiovektori nimettiin pCAV/NOT:ksi.

Kloonien 16 ja 18 insertit irrotettiin molemmat 10 BluescriptR-plasmidista Asp718- ja Not I-digest iolla. Sitten klooni 16:n 3,5 kb:n insertti ligatoitiin suoraan ekspres-siovektoriin pCAV/ΝΟΤ, joka oli myös katkaistu polylinkke-rialueen Asp718- ja NotI-kohdista. Klooni 18:n insertti tasapäistettiin T4:n polymeraasilla, mitä seurasi ligaatio 15 vektoriin pCAV/ΝΟΤ, joka oli katkaistu Smalrllä ja defos-foryloitu.

Molempien IL-4-reseptoriekspressioplasmidien plas-midi-DNA:ta käytettiin transfektoimaan subkonfluentti apinan COS-7-solukerros DEAE-dekstraanin avulla, mitä seurasi 20 Luthmanin ym. (Nucl. Acids Res. 11:1295, 1983) ja McCut-chanin ym. (J. Natl. Cancer Inst. 41:351, 1968) kuvaama klorokiinikäsittely. Sitten soluja viljeltiin kolmen päivän ajan insertoitujen sekvenssien transientin ekspression sallimiseksi. Kolmen päivän kuluttua soluviljelmien super-25 natanteista ja yksikerroksisista solumatoista tehtiin mää ritykset (kuten esimerkissä 1 on kuvattu), ja IL-4:n sitoutuminen varmistettiin.

B. Ilmentäminen CHO-soluissa. IL-4R:ää ilmennettiin myös nisäkkään CHO-solulinjassa ensin ligatoimalla kloonin 30 18 Asp718/NotI-restriktiofragmentti pCAV/NOT-vektoriin, kuten esimerkissä 8 on kuvattu. Sitten klooni 18:sta olevan insertin sisältävä pCAV/ΝΟΤ-vektori kotransfektoitiin tavanomaista kalsiumfosfaattimenetelmää käyttäen CHO-so-luihin yhdessä SV40:n varhaispromoottorin säätelyn alaisen 35 selektoitavan merkkiominaisuuden, dihydrofolaattireduktaa- 1 * 42 106044 sin (DHFR), cDNA:n kanssa. DHFR-sekvenssi tekee mahdolliseksi plasmidin sisältävien nisäkässolujen selektion me-totreksaatilla. DHFR-sekvenssin monistumistapahtumia tällaisissa soluissa selektoitiin käyttämällä korkeampia me-5 totreksaattipitoisuuksia. Tällä tavalla myös viereiset DNA-sekvenssit monistuvat ja siten saadaan aikaan tehokkaampi ekspressio. Transfektanttien massasoluviljelmät erittivät aktiivista liukoista IL-4R:ä n. 100 ng/ml.

C. Ilmentäminen HeLa-soluissa. IL-4R:ää ilmennet-10 tiin ihmisen HeLa-EBNA-solulinjassa 653-6, joka ilmentää pysyvästi CMV:n erittäin varhaisen tehostaj an/promoottorin ohjaamana EBV:n tuma-antigeeni l:tä. Ekspressiovektorina käytettiin Dowerin ym. kuvaamaa pHAV-EO-NEO:ta (J. Immunol . 142:4314, 1989), joka on EBV:n replikaation alkukoh-15 dan sisältävän pDC201:n johdannainen ja sallii runsaan ilmentymisen 653-6-solulinjassa. pHAV-EO-NEO on johdettu pDC201:stä siten, että adenoviruksen pääasiallinen myö-häispromoottori on korvattu HIV-l:stä peräisin olevalla synteettisellä sekvenssillä, joka ulottuu -148:stä +78:aan 20 viruksen mRNArn "cap"-kohtaan nähden, ja joka sisältää SV40:n varhaispromoottorin säätelyn alaisena HIV-l:n tat-geenin. Lisäksi se sisältää pSV2NEO:n (Southern & Berg, J. Mol. Appi. Genet. 1:332, 1982) neomysiiniresistenssigee-nin sisältävän Bglll-Smal-fragmentin sijoitettuna Bglll-25 ja Hpal-kohtiin ja alikloonauksen alavirtaan Sall-kloo-nauskohdasta. Tuloksena saatu vektori sallii transfektoi-tujen solujen selektion neomysiiniresistenssin suhteen.

760 bp IL-4R-fragmentti irrotettiin Bluescript1-plasmidista pilkkomalla EcoNI- ja Sstl-restriktioentsyy-30 meillä. Tämä kloonin 18 fragmentti vastaa kuvion 2A nukleotideja 1 - 672, minkä lisäksi on 5'-terminaalinen sek- • · venssi GTGCAGGCACCTTTTGTGTCCCCA, TGA-lopetuskodoni, joka seuraa kuvan 2A nukleotidia 672, ja 3 1-terminaalinen nukleotidi sekvenssi CTGAGTGACCTTGGGGGCTGCGGTGGTGAGGAGAGCT. 35 Sitten tämä fragmentti tasapäistettiin T4:n polymeraasilla 2 2 · • % 43 106044 ja alikloonattiin pHAV-EO-NEO:n SalI-kohtaan. Sitten tuloksena saatu plasmidi transfektoitiin 653-6-solulinjaan Dowerin ym. (J. Immunol. 142:4314, 1989) kuvaaman mukaisella muunnetulla polybreenitransfektiomenetelmällä, sillä 5 erolla, että solut trypsinoitiin 2 päivää transfektion jälkeen ja jaettiin suhteessa 1:8 G418:aa (Gibco Co.) 1 mg/ml sisältävään elatusaineeseen. Viljelmän elatusaine vaihdettiin kahdesti viikossa, kunnes neomysiiniresistent-tejä pesäkkeitä ilmaantui. Sitten pesäkkeet joko poimitit) tiin yksittäin kloonausrenkaita käyttäen tai kerättiin yhteen useiden erilaisten solulinjojen muodostamiseksi. Näitä solulinjoja pidettiin yllä lääkeaineselektion alaisena G418-konsentraatiossa 250 pg/ml. Kun solut kasvoivat toisiinsa kiinni, supernatantit kerättiin ja ne testattiin 15 esimerkin IB inhibitiomäärityksessä. Solulinjat tuottivat 100 - 600 ng/ml liukoista IL-4R-proteiinia.

Esimerkki 9 IL-4R:n ilmentäminen hiivasoluissa mIL-4R:n ilmentämiseksi pIXY120:stä johdettu hiivan 20 ekspressiovektori muodostettiin seuraavasti. pIXY120 on identtinen pYaHuGM:n (ATCC 53 157) kanssa, paitsi että se ei sisällä cDNA-inserttiä ja sisältää polylinkkerin/monin-kertaisen kloonauskohdan, jossa on Ncol-kohta. Tämä vektori sisältää DNA-sekvenssejä seuraavista lähteistä: (1) ;;; 25 plasmidista pBR322 (ATCC 37 017) irrotetun suuren fragmen tin Sphl:stä (nukleotidi 562) EcoRI:en (nukleotidi 4 361), johon sisältyy replikaation alkukohta ja ampisilliinire-sistenssimerkkiominaisuus E. colissa selektoimiseksi; (2) S. cerevisiaen DNA:ta, mukaan lukien TRP-l-merkkiominai-30 suus, 2μ:η replikaation alkukohta, ADH2-promoottori; ja (3) eritettävää peptidiä α-faktoria koodittavasta geenistä • · peräisi oleva 85 aminohapon signaalipeptidiä koodittava DNA (ks. Kurjan ym., US-patentti 4 546 082). Asp718-re-striktiokohta pantiin mukaan asemaan 237 a-faktorin sig-35 naalipeptidissä edesauttamaan fuusiota heterologisiin gee- 1 ·

• I

44 106044 neihin. Tämä saatiin aikaan vaihtamalla tymidiinitähde nukleotidin 241 kohdalla sytosiinitähteeksi oligonukleoti-din ohjaamalla in vitro -mutageneesi1lä, kuten on kuvannut Craik, BioTechniques, tammikuu 1985, s. 12 - 19. Usei-5 ta kloonauskohtia sisältävä synteettinen oligonukleotidi, jolla oli seuraava sekvenssi, sijoitettiin A§£718-kohdasta, aminohapon 79 kohdalla lähellä α-faktorin signaalipep-tidin 3'-päätä, Spel-kohtaan 2p-sekvenssissä:

Asp7W Stu I AJfcol BamH\Sma\ Spel

10 GTACCT TTGGAT AAAAGAG ACTACAAGGACGACGATGACAAGAGGCCTCCATGGATCCCCCGGGACA

GAAACCTATTTTCTCTGATGTTCCTGCTGCTACTGTTCTCCGGAGGTACCTAGGGGGCCCTGTGATC

|<-PotySnker->| pBC120 poikkeaa pYaHuGM:stä myös sillä, että siinä on yk-sijuosteisesta faagista fl peräisin oleva 514 bp DNA-frag-15 mentti, joka sisältää replikaation alkukohdan ja geenien välisen alueen, joka fragmentti on sijoitettu NruI-kohtaan pBR322-sekvenssissä. fl:n replikaation alkukohdan läsnäolo sallii vektorin yksijuosteisten DNA-kopioiden muodostamisen transformoitaessa asianmukaisiin E. coli -kantoihin ja 20 superinfektoitaessa bakteerifaagi fl:llä, mikä helpottaa vektorin DNA-sekvensointia ja tarjoaa pohjan in vitro -mu-tageneesille. cDNA:n sijoittamiseksi pIXY120 pilkotaan Asp718:11a, joka katkaisee läheltä α-faktorin signaalipep-tidin 3'-päätä (nukleotidi 237) ja esimerkiksi BamHI:llä, .. 25 joka katkaisee polylinkkerin. Sitten suuri vektorifrag- • · mentti puhdistetaan ja ligatoidaan ilmennettävää proteiinia koodittavaan DNA-fragmenttiin.

Jotta luotaisiin eritysvektori mIL-4R:n ilmentämiseksi, mIL-4R:ä koodittava cDNA-fragmentti leikattiin irti 30 esimerkin 8 mukaisesta BluescriptR-plasmidista PpumI- ja . Bglll-digestjolla sellaisen 831 bp fragmentin vapauttami seksi PpumI-kohdasta (ks. kuvio) avoimen lukukehyksen 3?-puolella sijaitsevaan BglII-kohtaan, joka sisältää mIL-4R-sekvenssin, paitsi Ile:a ja Lys:ä koodittavat kaksi ensim-35 mäistä 5'-pään kodonia. pXY120 digestoitiin Asp718:lla

• I

45 106044 läheltä α-faktorin signaalin 3'-päätä ja BamHI:llä. Vekto-rifragmentti ligatoitiin hIL-4R-cDNA:n Ppuml/BglII-frag-menttiin, ja seuraava fragmentti luotiin antamalla kahden synteettisen oligonukleotidin emäspariutua α-faktorin kuu-5 den viimeisen aminohapon ja kypsän mIL-4R:n kahden ensimmäisen aminohapon uudelleenluomiseksi.

a4ador processing—>|

GTA CCT CTA GAT AAA AGA ATC AAG

GA GAT CTA TTT TCT TAG TTC CAG Vai Pro Leu Asp Lys Arg Ile I»ys

|<— mlWR

Oligonukleotidiin sisältyi myös nukleotidisekvenssin muutos TGG ATAista CTA GAT:ksi# joka tuo mukaan Xbal-restrik-tiokohdan muuttamatta kooditettua aminohapposekvenssiä.

15 Sitten edeltävä ekspressiovektori puhdistettiin ja sitä käytettiin S. cerevisiaen diploidin hiivakannan (XV2181) transformoimiseksi tavanomaisin menetelmin, kuten EPÄ 165 654:ssä kuvatuin, tryptofaaniprototrofeja selek-toiden. Saatuja transformaatteja viljeltiin eritetyn mlL-20 4R-proteiinin ilmentämiseksi. Biologisen aktiivisuuden määritykseen tulevia viljelmiä kasvatettiin 20 - 50 ml:ssa YPD-elatusainetta (1 % hiivauutetta, 2 % peptonia, 1 % glukoosia) 37eC:ssa solutiheyteen 1 - 5 x 108 solua/ml. Solujen erottamiseksi elatusaineesta solut poistettiin 25 sentrifugoimalla ja elatusaine suodatettiin 0,45 pm sellu-loosa-asetaattisuodattimen läpi ennen määritystä. Transformoidun hiivakannan tuottamista supernatanteista tai hajotetuista plasmidilla transformoiduista hiivasoluista valmistetuista raakauutteista tehtiin määritykset biologi-30 sesti aktiivisen proteiinin ilmentämisen varmistamiseksi.

. .. Esimerkki 10

Hiiren XL-4-reseptorin cDNAtn täysipituisten ja typistettyjen muotojen eristys lajittelemattomista 7B9-soluista 35 Polyadenyloitu RNA eristettiin 7B9-soluista, anti- geeniriippuvaisesta avustaja-T-solukloonista, joka oli • i 46 106044 peräisin C57BL/6-hiiristä, ja sitä käytettiin cDNA-kirjas-ton muodostamiseksi XZAPrssa (Stratagene, San Diego), kuten esimerkissä 7 on kuvattu. XZAP-kirjastoa monistettiin kerran, ja yhteensä 300 000 plakkia seulottiin, kuten esi-5 merkissä 7 on kuvattu, sillä erolla, että koetin oli CTLL-19.4-kloonista 16 eristetty 32P-leimattu 700 bp EcoRI-fragmentti, jossa oli käytetty satunnaisalukkeita. Kolmetoista kloonia eristettiin ja karakterisoitiin restriktio-analyysillä.

10 Kloonin 7B9-2 nukleiinihappoanalyysi paljasti sen sisältävän polyadenyloidun loppupään, oletetun polyadeny-laatiosignaalin ja 810 aminohapon avoimen lukukehyksen (esitetty kuviossa 2), joista ensimmäiset 258 ovat identtisiä CTLL-19.4-kloonin 16 koodittamien kanssa, mukaan 15 luettuna 25 aminohapon oletettu signaalipeptidisekvenssi.

7B9-2:n cDNA alikloonattiin ekukaryoottiekspressiovekto-riin pCAV/NOT, ja tuloksena saatu plasmidi transfektoitiin C0S-7-soluihin kuten esimerkissä 8 on kuvattu. COS-7-transfektantit analysoitiin esimerkin 12 suuntaviivojen 20 mukaisesti.

Toinen cDNA-muoto, samankaltainen kuin klooni 18 CTLL-19.4-kirjastossa, eristettiin 7B9-kirjastosta ja pantiin sekvenssianalyysiin. Tämä cDNA, klooni 7B9-4, on 5'-päästä 376 bp lyhyempi kuin klooni 7B9-2, ja siitä puuttuu ;* 25 47 ensimmäistä 7B9-2:n koodittamaa aminohappoa, mutta se koodittaa loput N-terminaaliset aminohapot 23 - 199 (kuviossa 2). Asemassa 200 kloonilla 7B9-4 (kuten kloonilla 18 CTLL-19.4:stä) on 114 bp insertti, joka muuttaa aminohapposekvenssiksi Pro Ser Asn Glu Asn Leu, joiden jälkeen 30 tulee lopetuskodoni. Sekä kloonista 7B9-4 että CTLL 19.4- j* kloonista 18 löydetyt 114 bp insertit ovat identtisiä nuk- leiinihapposekvenssiltään. Se, että tämä cDNA-muoto, joka tuottaa IL-4-reseptorin liukoisen muodon C0S-7-soluissa ilmennettäessä, eristettiin näistä kahdesta eri solulin-

• I

47 106044 jasta osoittaa, ettei se ole kloonausartefakta eikä lajitelluille CTLL-soluille ominainen mutanttimuoto.

Esimerkki 11

Ihmisen IL-4-reseptorin cDNAciden eristys PBL- ja 5 T22-kirjasioista lajien välisellä hybridisaatiolla

Yhdistetyistä ihmisen perifeerisen veren lymfosyyteistä (PBL), jotka oli saatu tavanomaisella Ficoll-puh-distuksella ja viljelty IL-2:n kanssa kuusi päivää ja sen jälkeen stimuloitu PMA:lla ja Con-Ailla kahdeksan tuntia, 10 eristettiin polyadenyloitu RNA. cDNA-kirjasto, jossa oli-go-dT:tä oli käytetty alukkeena, muodostettiin >.gtlO:een käyttäen esimerkissä 7 kuvattuja tekniikoita. Koetin tuotettiin syntetisoimalla 7B9-4:n cDNA:n insertin leimaama-ton RNA-transkripti T7:n RNA-polymeraasia käyttäen, mitä 15 seurasi 32P-leimattu cDNA-synteesi käänteistranskriptaasil-la satunnaisalukkeita (Boehringer-Mannheim) käyttäen. Tätä hiiren yksijuosteista cDNA-koetinta käytettiin 50 000 plakin seulomiseen ihmisen cDNA-kirjastosta, liuoksessa 50 % formamidi/0,4 M NaCl 42 °C:ssa, jota seurasi pesu 2 X 20 SSC:ssä 55 °C:ssa. Kolme positiivista plakkia puhdistettiin, ja EcoRI-insertit alikloonattiin BluescriptR-plasmi-divektoriin. Osan kloonia PBL-1, 3,4 kb cDNArta, nukleii-nihapposekvensointi osoitti kloonin olevan noin 67 % homologinen vastaavan hiiren IL-4-reseptorin sekvenssin kans- ;;· 25 sa. Kuitenkin 68 bp insertti, joka sisälsi lopetuskodonin ja jolla ei ollut homologiaa hiiren IL-4-reseptorikloonien kanssa, tavattiin 45 aminohappoa alavirtaan ennustetusta kypsän proteiinin N-päästä, mikä viittaa siihen, että klooni PBL-1 koodittaa reseptorin ei-funktionaalista, ty-30 pistynyttä muotoa. Yhdeksän ihmisen PBL-kloonia lisää saatiin seulomalla sama kirjasto (vaativissa olosuhteissa) • < kloonista PBL-1 (3,4 kb EcoRI-cDNA-insertistä) tehdyllä 32P-leimatulla koettimella, jossa oli käytetty satunnaisalukkeita. Kaksi näistä klooneista, PBL-11 ja PBL-5, ulot-35 tuvat yli 5'-pään alueen, joka sisältää 68 bp insertin • · 48 106044 PBL-l:ssä, mutta niistä puuttuu 68 bp:n insertti, eivätkä ne ulotu perille 3'-suunnassa, kuten niiden koko todistaa, mikä estää nisäkäsekspression toimivuuden analyysin. Jotta saataisiin COS-7-soluissa ilmennettävissä oleva konstruk-5 tio, kloonien PBL-11 ja PBL-5 5’-pään Notl-HincII-fragmentit ligatoitiin erikseen kloonin PBL-1 Hindi-BamHI 3'-päähän ja alikloonattiin esimerkissä 8 kuvattuun NotI:llä ja BglII:lla katkaistuun pCAV/NOT-ekspressiovektoriin. Näille kimeerisille PBL-ll/PBL-1- ja PBL-5/PBL-l-sekvens-10 sejä sisältäville ihmisen IL-4R-cDNA:ille on annettu vastaavasti nimet klooni A5 ja B4, kuten esimerkissä 12 edelleen kuvataan. Nämä konstruktiot transfektoitiin COS-7-soluihin ja määritettiin IL-4:n sitoutuminen maljasitoutu-mismäärityksellä olennaisesti Simsin ym. (Science 241:585, 15 1988) kuvaaman mukaan. Molemmat yhdistelmäkonstruktiot koodittivat proteiinia, jolla nähtiin IL-4:n sitomisaktii-visuus. Yhdistelmän A5 nukleotidisekvenssi ja ennustettu aminohapposekvenssi vastaavat kuvioissa 4A - 4C esitettyjä sekvenssitietoja, sillä poikkeuksella, että kodoni GTC 20 koodittaa aminohappoa Vai asemassa 50 Ile:n sijasta. Muissa klooneissa, jotka sekvensoitiin, ei ollut tätä muutosta. Konsensuskodoni klooneista PBL-1, PBL-5 ja T22-8 on kuitenkin ATC, ja se koodittaa Ile50:tä, kuten kuviossa 4A esitetään. Yhdistelmäkonstruktion B4 nukleotidi- ja ennus-25 tetusta aminohapposekvenssistä nähdään myös, että PBL-11:n 25 aminohapon signaalisekvenssi on korvautunut sekvenssillä Met-Gln-Lys-Asp-Ala-Arg-Arg-Glu-Gly-Asn.

Ihmisen IL-4-reseptorin liukoista muotoa ilmentäviä konstruktioita tehtiin leikkaamalla irti PBL-5:stä 5'-30 pään 0,8 kb Smal-Dralll-fragmentti ja PBL-11:stä vastaava 0,8 kb Asp718-DraIII-fragmentti, joista Drain:n jättämät • « yli tulevat päät tasattiin T4:n polymeraasilla. PBL-5- ja PBL-11-fragmentit alikloonattiin erikseen vastaavasti Smal:llä tai Smal:llä ja Asp718:lla katkaistuun CAV/ • · 49 106044 NOT:hen; näitä kutsutaan vastaavasti liukoiseksi hIL-4R-5:ksi ja hIL-4R-ll:ksi.

Toinen, ihmisen CD4+/CD8-T-solukloonista T22 (Acres ym., J. Immunol. 138:2132, 1987), tehty kirjasto seulot-5 tiin (rinnakkaisia suodattimia käyttäen) kahdella eri koettimella, jotka oli syntetisoitu edellä kuvatun mukaisesti. Ensimmäinen koetin saatiin 220 bp PvuII-fragmentis-ta kloonin PBL-1 5'-päästä ja toinen koetin saatiin 300 bp PvuII-EcoRI-fragmentista kloonin PBL-1 3'-päästä. Viisi 10 cDNA-kloonia lisää tunnistettiin näitä kahta koetinta käyttäen. Kaksi näistä klooneista ulottuvat 68 bp insertin sisältävän 5’-pään alueen yli, mutta kummassakaan ei ole tätä inserttiä. Kolmas näistä klooneista, T22-8, oli kooltaan noin 3,6 kb ja sisälsi 825 aminohapon avoimen lukuke-15 hyksen, mukaan luettuina 25 aminohapon signaalisekvenssi, 207 aminohapon kypsä ulkoinen domeeni, 24 aminohapon kalvon läpäisevä alue ja 569 aminohapon sytoplasminen domeeni. Kloonin T22-8 sekvenssi esitetään kuvioissa 4A - 4C. Kuviot 5A - 5B vertailevat ihmisen IL-4R:n ennustettua 20 aminohapposekvenssiä ennustettuun hiiren IL-4R:n sekvenssiin, ja niissä nähdään noin 53 %:n sekvenssien identtisyys näiden kahden proteiinin välillä.

Esimerkki 12 IL-4-reseptorin analyysi ja puhdistus COS-transfek-” 25 tanteissa

Tasapainositoutumiskokeita suoritettiin CTLL-19.4-kirjastosta olevilla hiiren IL-4-reseptoriklooneilla 16 ja 18 transfektoiduilla COS-soluilla. Kaikissa tapauksissa tulosten analyysista Scatchardin koordinaattisysteemissä 30 (Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sei. 51:660-672, 1949) saatiin suora viiva, mikä viittaa siihen, että hiiren IL- • t 4:lie on vain yksi luokka korkea-affiniteettisia reseptoreita. COS pCAV-16 -soluille laskettu näennäinen Ka oli 3,6 x 109 M"1, 5,9 x 105 spesifisellä sitoutumiskohdalla

35 solua kohti. Samankaltainen näennäinen Ka laskettiin COS

• · * 50 106044 pCAV-18 -soluille arvolla 1,5 x 109 M"1, mutta solun pinnalla ilmentyvien reseptorien lukumäärä oli 4,2 x 104. Myös 7B9-solukirjastosta eristetyillä IL-4R-DNA-klooneilla transfektoiduilla COS-soluilla tehdyt tasapainösitoutumis-5 kokeet osoittivat reseptorin korkea-affiniteettista sitoutumista IL-4:ään. Erityisesti kokeet, joissa käytettiin pCAV-7B9-2:lla transfektoituja COS-soluja, osoittivat täy-sipituisen hiiren IL-4-reseptorin sitovan 125I-IL-4:ä näennäisellä Ka:lla noin 1,4 x 1010 M'1 ja 4,5 x 104 sitoutumis-10 kohdalla solua kohti. Näennäisen Ka:n CAV-7B9-4 IL-4R:lle laskettiin olevan noin 1,7 x 109 M-1. Vaikka Ka:n ja sitoutumiskohtien solua kohti absoluuttiset arvot vaihtelivat transfektioiden välillä, sitoutumisaffiniteetit olivat yleensä samankaltaisia (1 x 109 - 1 x 1010 M-1) ja sopivat 15 hyvin yhteen aiemmin julkaistujen IL-4:n sitoutumisen af-finiteettivakioiden kanssa.

125I-mIL-4:n CTLL-soluihin sitoutumisen inhibitiota plasmidilla pCAV, pCAV-18 tai pCAV-7B9-4 transfektoitujen COS-solujen muokatun elatusaineen vaikutuksesta käytet-20 tiin sen määrittämiseen, koodittavatko nämä cDNA:t funktionaalisia liukoisia reseptorimolekyylejä. Noin 1,5 μΐ COS pCAV-18:n muokattua elatusainetta 150 μ1:η lopullisessa määritystilavuudessa antaa noin 50 % inhibition 125i-il-4:n IL-4-reseptoriin sitoutumiselle CTLL-soluissa. 125I-IL- ” 25 4:n reseptorin kanssa kilpailevaa aktiivisuutta ei havait tu kontrollina olevissa pCAV:llä transfektoiduissa COS-supernatanteissa. 125I-IL-4:n sitoutumisen 50 %:lla inhiboi-miseksi tarvittavan pCAV-18-supernatantin laimennuksen kvantitatiivisen analyysiin perustuen arvioitiin, että 30 COS-solut ovat erittäneet liukoista IL-4-reseptoria noin 60 - 100 ng/ml, kun se kerätään talteen kolme päivää

• I

transfektion jälkeen. Samankaltaiset tulokset saatiin käytettäessä supernatantteja pCAV-7B9-4: llä transfektoiduista COS-soluista.

·« 51 106044

Muokattu elatusaine COS-soluista, jotka oli trans-fektoitu pCAV-18:lla tai pCAV-7B9-4:llä (ks. esimerkki 8) ja kasvatettu DMEMissä, jossa oli 3 % FBSiä, kerättiin talteen kolme päivää transfektion jälkeen. Supernatantit 5 sentrifugoitiin nopeudella 3 000 cpm 10 minuuttia ja pakastettiin siihen asti, kuin niitä tarvittiin. 200 ml muokattua elatusainetta ladattiin pylvääseen, joka sisälsi 4 ml aiemmin kuvatun mukaisesti valmistettua muIL-4-Affi-geliä. Pylväs pestiin perusteellisesti PBS:llä, ja IL-4-10 reseptori eluoitiin liuoksella 0,1 M glysiini, 0,15 M NaCl, pH 3,0. Välittömästi eluution jälkeen näytteet neutraloitiin 80 piillä 1 M Hepes-puskuria, pH 7,4. Näytteistä testattiin niiden kyky inhiboida 125I-muIL-4:n sitoutumista CTLL-soluihin esimerkin IB suuntaviivojen mukaan. Lisäksi 15 näytteistä testattiin puhtaus SDS-PAGE:llä ja hopeavär-jäyksellä analysoiden kuten on kuvattu aiemmin. Vaihtoehtoisiin menetelmiin funktionaalisen liukoisen reseptorin aktiivisuuden tai IL-4:n sitoutumisen inhibition testaamiseksi kuuluvat kiinteän faasin sitoutumismääritykset esi-20 merkissä 1C kuvatun mukaisesti, tai muut samankaltaiset soluttomat määritykset, joissa voidaan käyttää joko radio-jodi tettua tai kolorimetrisesti kehitettyä IL-4:n sitoutumista, kuten RIA tai ELISA. SDS-PAGE:lla pelkistävissä olosuhteissa analysoidulla proteiinilla on molekyylipaino 25 noin 37 500, ja se vaikuttaa noin 90 % puhtaalta geelien hopeavärjäysanalyysillä.

Puhdistetusta liukoisesta hiiren rekombinantti-IL-4-reseptoriproteiinista voidaan myös testata sen kyky inhiboida IL-4:n indusoimaa 3H-tymidiinin inkorporaatiota 30 CTLL-soluihin. Tällaisia menetelmiä noudattaen liukoisen ' IL-4-reseptorin on havaittu estävän IL-4:n stimuloiman lisääntymisen, mutta se ei vaikuta IL-2:sta johtuvaan mi-togeeniseen vasteeseen.

Molekyylipainoarviot tehtiin käyttäen COS-soluihin 35 transfektoituja mIL-4-reseptoriklooneja. Käyttäen hiiren ·« « 106044 52 CTLL-19.4-soluja vastaan tehtyä monoklonaalista vasta-ainetta M2 (ks. esimerkki 13), IL-4-reseptori immunopresipi-toidaan CAV-16:lla, CAV-7B9-2:lla ja CAV-7B9-4:llä trans-fektoiduista ja 35S-kysteiinillä ja 35S-metioniinilla leima-5 tuista COS-soluista. Soluihin liittyvän reseptorin COS-CAV-7B9-4:n immunopresipaatiosta nähdään 32 - 39 kDa välillä vaihtelevaa molekyylipainon heterogeenisyyttä. Eritetyllä CAV-7B9-4-reseptorilla on molekyylipaino välillä 36 - 41 kDa. Soluihin liittyvä reseptori CAV-16-transfek-10 toiduista COS-soluista on noin 40 - 41 kDa. Tämä on merkitsevästi pienempi kuin molekyylipainoarviot Parkin ym. kuvaamista ristisidontakokeista, J. Exp. Med ♦ 166:476, 1987; J. Cell. Biol., Suppl. 12A, 1988. COS CAV-7B9-2 -soluihin liittyvällä reseptorilla nähtiin molekyylipaino 15 130 - 140 kDa, samankaltainen Parkin ym. arvioiden kanssa, J. Cell. Biol., Suppl. 12A, 1988, jonka arvioidaan olevan täysipituinen IL-4-reseptori. Samankaltaisia soluihin liittyvän CAV-16- ja CAV-7B9-2-IL-4-reseptorin molekyyli-painoarvioita on tehty myös ristisitomalla 125IL-4:ä näillä 20 cDNA:illa transfektoituihin COS-soluihin. Yksittäisten kloonien molekyylipainon heterogeenisyys voidaan osittain katsoa johtuvan glykosylaatiosta. Nämä tiedot yhdessä DNA-sekvenssianalyysin kanssa viittavat siihen, että 7B9-2 cDNA koodittaa täysipituista solun pinnan IL-4-resepto- ” 25 ria, kun taas sekä 7B9-4 että klooni 18 edustavat hiiren IL-4-reseptorin liuokoisia muotoja.

Reseptorin karakterisointikokeita tehtiin myös hlL-4R:n sisältävillä ekspressioplasmideilla transfektoiduilla COS-soluilla. Kaksi kimeeristä ihmisen IL-4R-molekyyliä A5 30 ja B4 (määritelty esimerkissä 11) transfektoitiin COS-so-luihin, ja tasapainositoutumiskokeita suoritettiin. COS- • · apinasolussa on itsessään hIL-4:ä sitomaan kykeneviä reseptoreita; siksi hIL-4R-cDNA:illa transfektoiduilla ja niitä yli-ilmentävillä COS-soluilla suoritetut sitoutumis-35 laskut edustavat endogeenisistä apinan IL-4R-molekyyleistä • · 53 106044 tulevaa taustasitoutumista vähennettynä kokonaissitoutumi-sesta. hIL-4R A5:llä transfektoiduilla COS-soluilla oli 5,3 x 104 hIL-4:n sitoutumiskohtaa ja laskettu Ke 3,48 x 109 M-1. Samaan tapaan, COS-soluissa ilmennetty hIL-4R B4 sitoi 5 125I-hIL-4:ä affiniteetilla 3,94 x 109 M'1 ja reseptoreita oli 3,2 x 104 solua kohti.

COS-soluissa ilmennetystä ihmisen IL-4R:stä tehtiin myös molekyylipainoarvioita. Klooneilla A5 tai B4 plasmi-dissa pCAV/NOT transfektoidut COS-solut leimattiin 35S-kys-10 teiini/metioniinilla ja hajotettiin. Ihmisen IL-4R affini-teettipuhdistettiin saaduista lysaateista hIL-4-kytketyllä AffigelilläR (kuten esimerkissä 4 on kuvattu). Tästä affi-niteettikantajasta eluoidut hIL-4R A5 ja B4 kulkeutuivat noin 140 000 daltonin kohdalla SDS-PAGE:ssa, mikä sopii 15 hyvin yhteen hIL-4R:n molekyylipainon aikaisempien risti-sitomisella saatujen arvioiden kanssa (Park ym., J. Exp. Med. 166:476, 1987), kuten myös tässä esitettyjen täysipi-tuisen mIL-4R:n arvioiden kanssa.

Koska tähän mennessä mitään ihmisen liukoisen IL-20 4R:n cDNA:ta ei ole löydetty luonnossa esiintyvänä, kuten oli laita hiiren reseptorin kanssa (kloonit 18 ja 7B9-4), muodostettiin typistetty muoto esimerkissä 11 kuvatun mukaisesti. COS-soluissa ilmentämisen jälkeen supernatant-teja kerättiin talteen kolme päivää liukoisella hIL-4R-25 ll:llä ja liukoisella hIL-4R-5:llä transfektion jälkeen, ja niistä testattiin 125I-hIL-4:n ihmisen B-solulinjaan Raji sitoutumisen inhibitio. Supernatantit kahdesta liukoisella hIL-4R-ll:llä ja yhdestä liukoisella hIL-4R-5:llä trans-fektoidusta maljasta sisälsivät 29 - 149 ng/ml IL-4R:n 30 kanssa kilpailevaa aktiivisuutta elatusaineessa. Lisäksi typistetty proteiini voitiin havaita 35S-metioniini/kys- ·· teiini-leimatuissa COS-solutransfektanteissa affiniteetti-puhdistuksella hIL-4-kytketyllä AffigelilläR noin 44 kDa proteiinina SDS-PAGE:n mukaan.

·· • < 54 106044

Esimerkki 13

Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus IL-4R:ä vastaan

Puhdistetun rekombinantti-IL-4-reseptörin prepa-5 raatteja, esimerkiksi ihmisen tai hiiren IL-4-reseptoreja, korkeita IL-4-reseptoritasoja ilmentäviä COS-soluja tai CTLL-19.4-soluja käytetään monoklonaalisten vasta-aineiden muodostamiseksi IL-4-reseptoria vastaan käyttäen tavanomaisia tekniikoita, kuten US-patentissa 4 411 993 esi-10 tettyjä. Tällaiset vasta-aineet ovat luultavasti hyödyllisiä olemaan esteenä IL-4:n IL-4-reseptoreihin sitoutumiselle, esimerkiksi IL-4:n toksisten tai muiden ei-toivot-tujen vaikutusten lievittämisessä.

Rottien immunisoimiseksi immunogeeninä käytet-15 tiin IL-4-reseptorillisia CTLL-19.4-soluja emulsioituina Freundin täydelliseen adjuvanttiin, ja niitä injisoitiin välillä 10 - 100 μΐ vaihtelevia määriä ihonalaisesti Le-wis-rottiin. Kolme viikkoa myöhemmin immunisoiduille eläimille annettiin tehosteena lisää immunogeeniä emulsioituna 20 epätäydelliseen Freundin adjuvanttiin, ja tehoste annettiin sen jälkeen joka kolmas viikko. Seeruminäytteitä otettiin ajoittain silmäkuopan takaisella verenotolla tai hännän kärjen katkaisulla testattaviksi "dot-blot"-määrityksellä, ELISA:11a (entsyymiin kytketyllä immuunisorbent-” 25 timäärityksellä) tai 125I-IL-4:n CTLL-solu-uutoksiin sitou tumisen inhibitiolla (kuten esimerkissä 1 on kuvattu). Myös muut määritysmenetelmät ovat soveliaita. Asianmukaisen vasta-ainetiitterin havaitsemisen jälkeen positiivisille eläimille annettiin lopullinen laskimonsisäinen in-30 jektio antigeeniä suolaliuoksessa, kolme - neljä päivää myöhemmin eläimet uhrattiin, pernasolut kerättiin talteen ja fuusioitiin hiiren myeloomasolulinjan AG8653 kanssa. Tällä tavalla muodostetut hybridoomasolut maljättiin useille mikrotiitterilevyille selektiivisessä HAT-elatus-35 aineessa (hypoksantiini, aminopteriini ja tymidiini), jot- • · « 55 106044 ta estettäisiin fuusioitumattomien solujen, myeloomahybri-dien ja pernasoluhybridien lisääntyminen.

Näin muodostetut hybridoomakloonit seulottiin IL-4-reseptorin kanssa reaktiivisuuden suhteen. Hybridooma-5 supernatanttien alkuseulonnassa käytettiin vasta-ainepyy-dystystä ja osittain puhdistetun 125I-mIL-4-reseptorin sitoutumista. Kaksi seulotuista yli 400 hybridoomasta oli positiivisia tämän menetelmän mukaan. Nämä kaksi monoklo-naalista vasta-ainetta, Ml ja M2, testattiin muunnetulla 10 vasta-ainepyydystyksellä estävien vasta-aineiden havaitsemiseksi. Vain Ml kykeni inhiboimaan 125I-rmIL-4:n sitoutumista kokonaisiin CTLL-soluihin. Molemmat vasta-aineet kykenevät immunopresipitoimaan natiivia mIL-4R-proteiinia 35S-kysteiini/metioniini-leimatuista CTLL-soluista tai IL-15 4R-klooneilla transfektoiduista COS-soluista. Sitten Ml:tä ja M2:ta injisoitiin "nude"-hiirien vatsaonteloihin, jotta tuotettaisiin korkeita pitoisuuksia (>1 mg/ml) IL-4R:n vastaista monoklonaalista vasta-ainetta sisältävää asci-testa. Tuloksena saatu monoklonaalinen vasta-aine puhdis-20 tettiin ammoniumsulfaattisaostuksella ja sen jälkeisellä geeliekskluusiokromatografiällä ja/tai vasta-aineen proteiini G:hen sitoutumiseen perustuvalla affiniteettikroma-tografiällä.

Esimerkki 14 " 25 Liukoisen XL-4R:n käyttö immunivasten suppressoimi- seksi in vivo

Kokeita suoritettiin liukoisen IL-4R:n vaikutuksen määrittämiseksi allogeeniseen host versus graft (HVG) -vasteeseen in vivo käyttäen polvitaipeen imusolmukemääri-30 tystä. Tässä mallissa hiirille injisoidaan anturaan sätei-lytettyjä allogeenisiä pernasoluja. Sitten säteilytettyjä syngeenisiä soluja injisoidaan toisenpuoleiseen anturaan. Allogeeniset solut saaneessa anturassa esiintyy alloreak-tiivinen vaste, jonka määrä voidaan mitata polvitaipeen > · · 56 106044 sen imusolmukkeen koon ja painon suhteellisesta lisääntymisestä, johon imuneste virtaa antigeenin laittokohdasta.

Päivänä 0 kolmeen BALB/C-hiireen injisoitiin anturaan säteilytettyjä allogeenisiä pernasoluja c57BL/6-hii-5 ristä ja toisenpuoleiseen anturaan säteilytettyjä syn-geenisiä pernasoluja. Päivinä -1, 0 ja +1 kolmelle hiirelle injisoitiin (laskimonsisäisesti päivinä -1 ja 0 ja ihonalaisesti päivänä +1) 100 ng puhdistettua liukoista IL-4R:ä (sIL-4R:ä) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksesa, 10 kolmelle hiirelle injisoitiin 1 pg sIL-4R:ä, kolmelle hiirelle injisoitiin 2 pg sIL-4R:ä ja kolmelle hiirelle injisoitiin MSA:ta (kontrolli). Allogeenisten ja syngeenis-ten pernasolujen kohdista olevien imusolmukkeitten keskimääräinen painoero oli noin 2,5 mg MSArlla käsitellyillä 15 hiirillä, 1 mg hiirillä, joita oli käsitelty 100 ng:lla sIL-4R:ä ja 0,5 mg hiirillä, joita oli käsitelty 1 pg:lla sIL-4R:ä. Havaittavaa painoeroa ei voitu todeta hiirillä, joita oli käsitelty 2 pg:lla sIL-4R:ä. Siis IL-4R suppressor merkitsevästi (p < 0,5 kaikissa ryhmissä, kaksireu-20 naista T-testiä käyttäen) lymfoproliferatiivista vastetta in vivo, annoksesta riippuvalla tavalla, verrattuna kont-rollihiiriin.

• · · • · « . -

Claims (18)

106044

1. Nisäkkään IL-4-reseptoria (IL-4R) koodittava eristetty DNA, tunnettu siitä, että se valitaan 5 joukosta, jonka muodostavat: a) cDNA-kloonit, jotka sisältävät nukleotidisek-venssin, joka on esitetty kuvioissa 2A-2C nukleotideina -75 - 2355, kuvioissa 2A-2C nukleotideina 1 - 2355, kuvioissa 4A-4C nukleotideina -75 - 2400 tai kuvioissa 4A-4C 10 nukleotideina 1 - 2400; b) DNA-sekvenssit, jotka kykenevät hybridisoitu-maan kohdan a) mukaisen cDNA:n kanssa kohtalaisen vaativissa olosuhteissa, ja jotka koodittavat polypeptidin, joka kykenee sitomaan nisäkkään IL-4:ä; ja 15 c) DNA-sekvenssit jotka geneettisen koodin perus teella ovat degeneroituneet kohdan a) tai b) mukaisen DNA-sekvenssin suhteen, ja jotka koodittavat polypeptidin, joka kykenee sitomaan nisäkkään IL-4:ä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA, t u n - 20. e t t u siitä, että IL-4R oleellisesti koostuu hiiren IL-4R:stä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA, tunnettu siitä, että IL-4R oleellisesti koostuu ihmisen IL-4R:stä. 25 4 . Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA, tun nettu siitä, että IL-4R sisältää aminohapposekvenssin, joka on yli 80 %-isesti samanlainen kuin kuvioissa 2A-2C tai 4A-4C esitetty aminohapposekvenssi.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA, t u n - 30. e t t u siitä, että IL-4R on liukoinen IL-4R, joka sisältää aminohapposekvenssin, joka on yli 80 %-isesti samanlainen kuin kuvion 4A ryhmien 1-207 sekvenssi.

6. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen DNA, tunnettu siitä, että IL-4R on kuvioissa 2A-2C esi- 35 tetyn hiiren IL-4R-proteiinin fragmentti, tai kuvioissa • · 106044 4A-4C esitetyn ihmisen IL-4R-proteiinin fragmentti, jotka fragmentit kykenevät sitomaan IL-4:ä.

7. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA, tunnettu siitä, että IL-4R sisältää aminohapposekvens- 5 sin, joka on kuvioiden 2A-2C ryhmien -25-785, kuvioiden 2A-2C ryhmien 1-785, kuvion 2A ryhmien -25-208 tai kuvion 2A ryhmien 1-208 sekvenssi.

8. Patenttivaatimuksen 3 mukainen DNA, tunnettu siitä, että IL-4R sisältää aminohapposekvens- 10 sin, joka on kuvioiden 4A-4C ryhmien -25-800, kuvioiden 4A-4C ryhmien 1-800, kuvion 4A ryhmien -25-207 tai kuvion 4A ryhmien 1-207 sekvenssi.

9. Patenttivaatimuksen 3 mukainen DNA, tunnettu siitä, että se sisältää kuvion 4A nukleotidit 15 -75-621 tai 1-621.

10. Rekombinanttiekspressorivektori, tunnet-t u siitä, että se sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-9 mukaisen DNA:n.

11. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se 20 sisältää patenttivaatimuksen 10 mukaisen ekspressiovekto- rin.

12. Menetelmä IL-4R-polypeptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään patenttivaatimuksen 11 mukaista isäntäsolua olosuhteissa, jotka suosivat • «i • 25 IL-4R-polypeptidin ekspressiota, minkä jälkeen IL-4R- polypeptidi puhdistetaan.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että IL-4R oleellisesti koostuu hiiren IL-4R:stä tai ihmisen IL-4R:stä.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että IL-4R sisältää aminohapposekvenssin, joka on kuvioiden 4A-4C ryhmien 1-800 tai kuvion 4A ryhmien 1-207 sekvenssi.

15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että ekspressorivektori sisältää kuvion 4A nukleotidit -75-621 tai 1-621. • · 106044

16. Menetelmä vasta-aineiden tuottamiseksi, jotka ovat immunoreaktiivisia IL-4R:n kanssa, tunnettu siitä, että immunisoidaan eläin IL-4R-polypeptidillä ja otetaan vasta-aineet talteen immunisoidusta eläimestä, 5 jolloin vasta-aineet ovat immunoreaktiivisia IL-4R:n kanssa, joka sisältää aminohapposekvenssin, joka on kuvioiden 2A-2C ryhmien 1-785, kuvion 2A ryhmien l-208> kuvioiden 4A-4C ryhmien 1-800 tai kuvion 4A ryhmien 1-207 sekvenssi.

17. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmis- 10 tamiseksi, joka on immunoreaktiivinen IL-4R:n kanssa, tunnettu siitä, että (a) immunisoidaan eläin IL-4R-polypeptidillä, (b) otetaan talteen immunisoidun eläimen perna- soluja, 15 (c) fuusioidaan talteenotetut pernasolut myelooma- solulinjan kanssa, tuottaen täten hybridoomasolulinjoja, (d) tunnistetaan hybridoomasolulinja, joka tuottaa monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat immunoreaktiivisia IL-4R:n kanssa, 20 (e) otetaan monoklonaaliset vasta-aineet talteen, jolloin monoklonaaliset vasta-aineet ovat immunoreaktiivisia IL-4R:n kanssa, joka sisältää aminohapposekvenssin, joka on kuvioiden 2A-2C ryhmien 1-785, kuvion 2A ryhmien 1-208, kuvioiden 4A-4C ryhmien 1-800 tai kuvion 4A ryhmien »· · • 25 1-207 sekvenssi.

18. Patenttivaatimuksen 16 tai 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aineet ovat immunoreaktiivisia IL-4R:n kanssa, joka sisältää aminohappo-sekvenssin, joka on kuvioiden 4A-4C ryhmien 1-800 tai ku- 30 vion 4A ryhmien 1-207 sekvenssi. ·· - 106044