JP2744821B2 - インターロイキン4レセプター - Google Patents
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Description
詳細にはインターロイキン4レセプターに関する。
子またはBSF−1とも呼ばれている)はもともと、細胞
表面免疫グロブリンに特異的な抗体の低濃度に応答して
B細胞の増殖を刺激する能力により同定された。比較的
最近になつて、IL−4はT細胞、肥満細胞、顆粒球、血
小板生成細胞および赤血球の増殖の同時刺激を含めたか
なり広範囲の生物学的活性スペクトルを有することが判
明した。さらに、IL−4は数種のIL−2およびIL−3依
存性細胞系列の増殖を刺激し、休止B細胞面でのクラス
II主要組織適合複合分子の発現を誘導し、そして刺激さ
れたB細胞によるIgEおよびIgG1アイソタイプの分泌を
増強する。ネズミおよびヒトIL−4は両方とも、組換え
DNA技術および天然ネズミタンパク質の均一精製により
最終的に同定された(Yokota et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA83:5894、1986;Noma et al.,Nature 319:640、19
86;およびGrabstein et al.,J.Exp.Med.163:1405、198
6)。
よびin vitro細胞株により発現されるIL−4に特異的な
細胞表面レセプターによつて仲介される。IL−4はこの
レセプターに結合し、その後レセプターは種々の免疫エ
フエクター細胞へこの生物学的信号を伝達する。従つ
て、精製されたIL−4レセプター(IL−4Rと略記する)
組成物は、IL−4またはIL−4レセプターの診断検定
に、あるいは診断または治療に用いるためのIL−4レセ
プターに対する抗体を誘起させるのに有用であるだろ
う。さらに、精製されたIL−4レセプター組成物はIL−
4を結合または排除するために治療において直接用いら
れ、このサイトカインの生物学的活性を調節する手段を
提供するであろう。
のレセプターについての性状決定はほとんど進歩してい
ない。広範囲の細胞型にIL−4レセプターが存在するこ
とを論じた数多くの研究が発表されたが、その構造的性
状決定はレセプターと放射性標識IL−4分子との化学的
架橋によつて形成される共有結合複合体のSDS−PAGE分
析により測定されたこのタンパク質の概算分子量に限ら
れている。Oharaら(Nature 325:537、1987)およびPar
kら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:1669、1987)は、Bお
よびTリンパ球並びに広範囲の造血系統の細胞上に少数
発現された高親和性レセプターと結合する放射性ヨウ素
化組換えネズミIL−4を用いて、IL−4レセプターの存
在を初めて証明した。125I−IL−4をIL−4Rへ親和性架
橋させることにより、OharaらおよびParkらはそれぞれ6
0,000および75,000ダルトンの見掛け分子量をもつレセ
プタータンパク質を同定した。ネズミ細胞において観察
された小さい分子量のレセプターは天然レセプターの加
水分解により開裂された断片でありうる。酵母により誘
導された125I標識組換えヒトIL−4を用いるParkら(J.
Exp.Med.166:476、1987)によるその後の実験は、ヒトI
L−4レセプターがB、Tおよび造血系統の細胞に存在
するばかりでなく、ヒト線維芽細胞、上皮および内皮由
来の細胞にも見られることを示した。IL−4レセプター
はそれ以来CBA/N脾B細胞(Nakajima et al.,J.Immuno
l.139:774、1987)、バーキツトリンパ種ジシヨイ(Jij
oye)細胞(Cabrillat et al.,Biochem.& Biophys.Re
s.Commun.149:995、1987)、多種多様の造血および非造
血細胞(Lowenthal et al.,J.Immunol.140:456、198
8)、およびネズミLyt−2-/L3T4-胸腺細胞を含む他の
細胞系列にも存在することが見出されている。最近、Pa
rkら(UCLA Symposia,J.Cell Biol.,Suppl.12A、1988)
は、十分量のプレテアーゼ阻害剤の存在下で、138〜145
kDaの125I−IL−4結合性原形質膜レセプターを数種の
ネズミ細胞系列において同定したと報じている。このよ
うに、IL−4レセプターの実際の分子量および構造に関
して、かなりの論争がなお残されている。
IL−4または他のサイトカイン刺激に対する種々の細胞
集団の応答においてIL−4レセプターが演ずる役割、あ
るいは治療、診断または検定においてIL−4レセプター
を効果的に使用する方法等の研究は、十分量の精製IL−
4レセプターを得ることが困難であつたために、実行で
きなかつた。以前には、高レベルのIL−4レセプターを
構成的かつ連続的に発現する細胞系列が全く知られてい
なかつた。検出可能なレベルのIL−4レセプターを発現
することが知られている細胞系列では、一般に細胞あた
りのレセプターの発現レベルが約2000より少ない。従つ
て、生化学分析用のIL−4レセプター分子を精製する試
み、あるいはIL−4レセプターをコードする哺乳動物遺
伝子をクローン化して発現させる試みは、精製レセプタ
ーおよび適当なレセプターmRNA源の不足により妨げられ
ている。
(IL−4R)またはそのサブユニツトをコードするDNA配
列を提供する。好ましくは、このようなDNA配列は次の
群:(a)天然IL−4R遺伝子のコード領域から誘導され
るヌクレオチド配列を有するcDNAクローン;(b)適当
なストリンジエント条件下で(a)のcDNAクローンとハ
イブリダイズでき且つ生物学的に活性なIL−4R分子をコ
ードするDNA配列;および(c)遺伝暗号の結果とし
て、(a)および(b)で定義したDNA配列に対し縮重
(egeneracy)の関係にあり且つ生成学的に活性なIL−4
R分子をコードするDNA配列から選ばれる。本発明はさら
に、上記のDNA配列を含む組換え発現ベクター、組換え
発現ベクターを用いて生産された組換えIL−4R分子、お
よび発現ベクターを用いて組換えIL−4R分子を生産する
方法を提供する。
ンパク質組成物を提供する。全長ネズミ分子はSDS−PAG
Eで測定して約130,000〜約140,000Mrの分子量をもつ糖
タンパク質である。CTLL 19.4ライブラリーからのネズ
ミIL−4レセプタークローン16および18によりトランス
フエクシヨンされたCOS細胞の見掛け結合親和性(Ka)
は1〜8×109M-1である。ネズミ7B9ライブラリーから
のネズミIL−4レセプタークローン7B9−2および7B9−
4によりトランスフエクシヨンされたCOS細胞のKaは2
×109〜1×1010M-1である。成熟ネズミIL−4レセプタ
ー分子は次のようなN末端アミノ酸配列を有する:IKVLG
EPTCFSDYIRTSTCEW。
もつと考えられ、cDNA配列から推定されるそのN末端ア
ミノ酸配列は、成熟ネズミタンパク質の生化学的に決定
されたN末端配列から類推して、次のとおりである:MKV
LQEPTCVSDYMSISTCEW。
レセプタータンパク質を有効量含有する、治療、診断、
IL−4レセプターの検定、またはIL−4レセプターに対
する抗体の誘導に用いるための組成物を提供する。この
ような可溶性組換えレセプター分子には、IL−4の結合
に必要でないレセプター分子の領域が欠失されている切
断タンパク質が含まれる。本発明のこれらの面および他
の面は以下の詳細な説明および添付図面を参照すること
により明らかになるであろう。
(黒の太線で示す)を含むcDNAクローンの制限地図を示
す。制限部位EcoRI、PvuII、HincIIおよびSstIはそれぞ
れ文字R、P、HおよびSで表す。
ら誘導されるような、ネズミIL−4レセプターのコード
領域のcDNA配列および推定アミノ酸配列を示す。成熟タ
ンパク質のN末端イソロイシンはアミノ酸番号1とす
る。クローン7B9−2からの全長膜結合タンパク質のコ
ード領域はアミノ酸1−785で定められる。成熟N末端
を構成するイソロイシン残基を指定するATCコドンはタ
ンパク質配列の1位に下線が引いてあり;アミノ酸209
−232の推定トランスメンブラン領域にも下線が引いて
ある。クローン7B9−4、およびCTLL19.4ライブラリー
のクローンCTLL−18並びにCTLL−16のコード領域の配列
は次の点を除いて7B9−2と同じである。CTLL−16のコ
ード領域はアミノ酸−25から233(推定上の25個のアミ
ノ酸から成るシグナルペプチド配列を含む)により定め
られる膜結合IL−4レセプターをコードするが、オープ
ン・リーデイング・フレームを集結させるTAGターミネ
ーターコドン(図示せず)がその後に続いている。核酸
配列はこの位置(第1図に矢印で示す)にスプライス供
与部位が、そして3′末端の近傍(第二の矢印で示す)
にスプライス受容部位が存在することを示しており、CT
LL−16がスプライシングを受けていないmRNA中間体から
誘導されたものであることを示唆する。クローン7B9−
4およびCTLL−18はそれぞれアミノ酸23から199までと
−25から199までをコードする。アミ酸199の後に、114
塩基対挿入物(両方のクローンとも同じ、第1図に白の
ボツクスで示す)が6個の新たなアミノ酸を導入し、こ
の挿入物の次に終結コドンが来る。この形態のレセプタ
ーは可溶性である。
スミドpCAV/NOTの模式図である。
イブラリーより得られた、クローンT22−8からのヒトI
L−4レセプターcDNAのコード配列を示す。成熟タンパ
ク質の推定N末端メチオニンおよびトランスメンブラン
領域には下線が引いてある。
レセプターcDNAクローンの推定アミノ酸配列の比較を示
す。
“IL−4R"なる用語は、第2図と第4図に示した天然哺
乳動物インターロイキン4レセプターのアミノ酸配列と
実質的に類似したアミノ酸配列を有し、且つそれらがイ
ンターロイキン4(IL−4)分子と結合することができ
る、またはIL−4分子の結合によつて開始される生物学
的信号を細胞へ伝達することができる、あるいは天然
(すなわち非組換え)源由来のIL−4Rに対して誘導され
た抗IL−4R抗体と交差反応することができるという点で
生物学的に活性であるタンパク質を意味する。天然ネズ
ミIL−4レセプター分子はSDS−PAGEで測定して約140キ
ロダルトン(kDa)の見掛け分子量をもつと考えられ
る。“IL−4レセプター”または“IL−4R"なる用語に
は、限定するものではないが、IL−4Rと共通した生物学
的活性の一部を少なくとも示す20個以上のアミノ酸を有
する天然タンパク質の類縁体またはサブユニツトが含ま
れる。明細書全体を通して用いられる“成熟”なる用語
は、天然遺伝子の全長転写物として存在しうるような、
リーダー配列を欠く形で発現されたタンパク質を意味す
る。種々の生物学的に均等なタンパク質およびアミノ酸
類縁体は以下で詳細に説明する。
的に類似した”なる表現は、対象となる特定配列(例え
ば突然変異配列)が1以上の置換、欠失または付加によ
つて基準配列と異なるが、その最終結果としてIL−4Rタ
ンパク質の生物学的活性を保有していることを意味す
る。また、核酸サブユニツトおよび類縁体は:(a)DN
A配列が天然哺乳動物IL−4R遺伝子のコード領域から誘
導される;(b)DNA配列が適度なストリンジエント条
件下で(a)のDNA配列とハイブリダイズすることがで
き且つ生物学的に活性なIL−4R分子をコードする;また
は(c)DNA配列が遺伝暗号の結果として(a)または
(b)で定義したDNA配列に対し縮重の関係にあり且つ
生物学的に活性なIL−4R分子をコードする場合、本明細
書中で開示した特定のDNA配列に“実質的に類似してい
る。”実質的に類似した類縁タンパク質は天然IL−4Rの
対応する配列に約30%以上類似しているだろう。類似性
の度合いがより低いが匹敵する生物学的活性を有する配
列は均等物であると見なされる。より好ましくは、類縁
タンパク質は天然IL−4Rの対応する配列に約80%以上類
似しており、この場合それらは“実質的に同一”である
と定義される。核酸配列を定義する際に、実質的に類似
したアミノ酸配列をコードしうる対象の核酸配列はすべ
て、基準の核酸配列に実質的に類似していると見なされ
る。類似性のパーセントは、例えばthe University of
Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG)から入手
しうるGAPコンピユータプログラム6.0版を用いて、配列
情報を比較することにより測定できる。GAP(プログラ
ムはNeedlemanおよびWunschの整列法(J.Mol.Biol.48:4
43、1970)をSmithおよびWatermanが改変した方法(Ad
v.Appl.Math.2:482、1981)を利用している。簡単に述
べると、GAPプログラムは2つの配列の短い方の配列中
の記号(すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸)の総
数で類似した整列記号の数を割つた値として類似性を規
定している。GAPプログラムのための予め設定された好
適なパラメーターには次のものが含まれる:(1)ヌク
レオチドに対して単一の比較マトリツクス(同一性に対
して1の値および非同一性について0の値を含む)、お
よびSchwartz and Dayhoff,ed.,Atlas of Protein Sequ
ence and Structure,National Biomedical Research Fo
undation,pp.353−358,1979に開示されるような、Gribs
kov and Burgess,Nucl.Acids Res.14:6745,1986に記載
の荷重された比較マトリツクス;(2)各ギヤツプに対
して3.0のペナルテイーおよび各ギヤツプ中の各記号に
対して0.10の追加のペナルテイー;および(3)末端ギ
ヤツプに対してペナルテイーなし。
質が組換え(例えば、微生物または哺乳動物)発現系か
ら誘導されることを意味する。“マイクロバイアル(mi
crobial)”は細菌または真菌(例.酵母)発現系にお
いて生産された組換えタンパク質を意味する。生産物と
しての“組換えマイクロバイアル”は本質的に天然の内
因性物質を含まない、微生物発現系により生産されたタ
ンパク質を意味する。大部分の細菌培養物(例.E.col
i)により発現されたタンパク質はグリカンを含まない
であろう。酵母により発現されたタンパク質は、哺乳動
物細胞により発現されたものと異なるグリコシル化パタ
ーンを示すかもしれない。
いられる“生物学的に活性”なる表現は、特定の分子が
十分なアミノ酸配列の類似性をここに開示した本発明の
具体例と共有し、その結果として検出可能な量のIL−4
と結合することができ、IL−4刺激を(例えば、ハイブ
リツドレセプター構築物の一成分として)細胞へ伝達す
ることができ、または天然(すなわち、非組換え)源由
来のIL−4Rに対して誘導された抗IL−4R抗体と交差反応
することができることを意味する。好ましくは、本発明
の範囲内の生物学的に活性なIL−4レセプターは一nmol
eのレセプターあたり0.1nmole以上のIL−4と結合する
ことができ、最も好ましくは、標準結合検定(下記参
照)において1nmoleのレセプターあたり0.5nmole以上の
IL−4と結合し得る。
内因性の夾雑物質を含まない)且つ標準生化学的方法
(例えば、クローニングベクターを使用)によるその配
列およびその成分ヌクレオチド配列の同定、操作および
回収を可能にする量または濃度で少なくとも1回単離さ
れたDNAから誘導された、別個の断片の形をしたもしく
はより大きいDNA構築物の一成分としての、DNA分子を意
味する。この種の配列は好ましくは内部非翻訳配列(す
なわちイントロン;通常真核生物遺伝子中に存在する)
が介在しないオープン・リーデイング・フレームの形で
提供される。関連配列を含むゲノムDNAも使用し得るだ
ろう。非翻訳DNAの配列は、それがコード領域の操作ま
たは発現を妨害しない場合、オープン・リーデイング・
フレームから5′側にまたは3′側に存在してもよい。
のヘテロポリマーを意味する。本発明によつて提供され
るタンパク質をコードするDNA配列はcDNA断片と短いオ
リゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオリゴヌ
クレオチドから組み立てられ、これにより組換え転写単
位において発現され得る合成遺伝子が得られる。
を増幅または発現させるために用いられる複製可能なDN
A構築物を意味し、これは(1)遺伝子発現の調節的役
割を有する遺伝要素(例.プロモーターまたはエンハン
サー);(2)mRNAに転写され且つタンパク質に翻訳さ
れる構造配列またはコード配列;および(3)適当な転
写および翻訳開始配列と終結配列;の組合せから成る転
写単位を含む。酵母発現系での使用を目的とした構造要
素は、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可
能にするリーダー配列を含むのが好ましい。これとは別
に、組換えタンパク質がリーダー配列または輸送配列の
不在下で発現される場合、それはN末端メチオニン残基
を含むことができる。この残基はその後最終生産物を与
えるべく、発現された組換えタンパク質から随意に切断
され得る。
体DNAに安定して組み込んだ、または組明け転写単位を
内在プラスミドの一成分として保有する適当な宿主微生
物(例えば、E.coliのような細菌またはS.cerevisiaeの
ような酵母)の実質的に均質な単一培養物を意味する。
一般に、この系を構成する細胞は1個の原始形質転換細
胞の子孫である。ここで定義した組換え発現系は、発現
しようとするDNA配列または合成遺伝子に連結された調
節要素の誘発により異種タンパク質を発現するであろ
う。
場合によつては、天然パターンのグリコシル化を伴わな
い、実質的に均一な組換え哺乳動物IL−4Rポリペプチド
を提供する。天然ネズミおよびヒトIL−4レセプター分
子は、SDS−PAGEで測定して約130〜145キロダルトン(k
Da)の見掛け分子量を有する糖タンパク質として細胞溶
解液から回収される。本発明の哺乳動物IL−4Rには、例
えば霊長目の動物、ヒト、ネズミ、イヌ、ネコ、ウシ、
ヒツジ、ウマおよびブタのIL−4Rが含まれる。本発明の
範囲内のIL−4R誘導体には、生物学的活性を保有する一
次タンパク質の種々の構造形体が含まれる。イオン化可
能なアミノ基およびカルボキシル基の存在ゆえに、例え
ばIL−4Rタンパク質は酸性塩もしくは塩基性塩の形体、
または中性形体であり得る。個々のアミノ酸残基は酸化
または還元によつて修飾することもできる。
ル基、脂質、ホスフエート、アセチル基など)との共有
結合または凝集複合体を形成することにより、あるいは
アミノ酸配列の突然変異体を形成することにより改変し
うる。共有結合誘導体は特定の官能基をIL−4Rアミノ酸
側鎖へ、またはNもしくはC末端へ結合させることによ
り製造しうる。本発明の範囲内の他IL−4R誘導体には、
N末端またはC末端融合体として組換え培養物により合
成されるような、IL−4Rまたはその断片と他のタンパク
質またはポリペプチドとの共有結合もしくは凝集複合体
が含まれる。例えば、結合されるペプチドはタンパク質
のN末端領域におけるシグナル(またはリーダー)ポリ
ペプチド配列であり得、この配列は翻訳と同時に、また
は翻訳後に、タンパク質をその合成場所から細胞膜また
は細胞壁の内側もしくは外側のその機能場所へ移動させ
る(例、酵母のα因子リーダー)。IL−4Rタンパク質の
融合体はIL−4Rの精製または同定を容易にするために付
加されるペプチド(例、ポリ−His)を含みうる。IL−4
Rのアミノ酸配列は次のペプチド:Asp−Tyr−Tys−Asp−
Asp−Asp−Asp−Lys(DYKDDDDK)に結合させることもで
きる(Hopp et al.,Bio/Technology 6:1204、1988)。
後者の配列は高度な高原性を有し、特異的なモノクロー
ナル抗体が可逆結合するエピトープを提供し、発現され
た組換えタンパク質の速やかな検定および容易な精製を
可能にする。この配列はまたウシ粘膜エンテロキナーゼ
によってAsp−Lys対のすぐ後の残基において特異的に開
裂される。このペプチドでキヤツプされた融合タンパク
質またはE.coliによる細胞内分解に対して抵抗を示す。
アツセイ用の試薬、またはIL−4や他の結合性リガンド
のアフイニテイー精製法のための結合剤としても使用で
きる。IL−4R誘導体はまた、システイン残基およびシリ
ン残基において、M−マレイミドベンゾイルスクシンイ
ミドエステルやN−ヒドロキシスクシンイミドのような
試薬を架橋することによつても得られる。IL−4Rタンパ
ク質はまた、反応性の側基を介して、各種の不溶性支持
体(例えば、臭化シアン活性化、ビスオキシラン活性
化、カルボニルジイミダゾール活性化またはトシル活性
化アガロース構造体)へ共有結合され、あるいはポリオ
レフイン表面へ(グルタルアルデヒド架橋の存在下また
は不在下で)吸着される。ひとたび支持体へ結合される
と、IL−4Rは(検定または精製のために)抗IL−4R抗体
またはIL−4と選択的に結合させるべく使用される。
は伴わないIL−4Rを包含する。酵母または哺乳動物発現
系(例、COS−7細胞)において発現されたIL−4Rは、
その発現系に応じて、分子量およびグリコシル化パター
ンが天然分子と類似していたり、有意に相違していたり
する。E.coliのような細菌によるIL−4R DNAの発現は非
グリコシル化分子を与える。不活性化N−グリコシル化
部位を有する哺乳動物IL−4Rの機能的な突然変異類縁体
は、オリゴヌクレオチドの合成および連結により、ある
いは部位特異的変異導入法により製造できる。これらの
類縁タンパク質は酵母発現系を用いて良好な収量で均一
な還元炭水化物形体として生産される。真核生物タンパ
ク質のN−グリコシル化部位は次のアミノ酸トリプレツ
ト:Asn−A1−Z(ここでA1はPro以外のアミノ酸であ
り、ZはSerまたはThrである)によつて特徴づけられ
る。この配列において、アスパラギンは炭水化物が共有
結合するための側鎖アミノ基を与える。このような部位
はAsnまたは残基Zを他のアミノ酸で置換するか、Asnま
たはZを欠失させるか、またはA1とZの間非Zアミノ酸
を挿入するか、あるいはAsnとA1の間にAsn以外のアミノ
酸を挿入することにより取り除くことができる。
変異によつても得られる。ここで述べるIL−4R突然変異
体はIL−4Rと相同であるが、欠失、挿入または置換のた
めに天然IL−4Rと異なるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドである。大部分の哺乳動物遺伝子と同様に、哺乳動
物IL−4レセプターは恐らく多重エクソン遺伝子によつ
てコードされている。転写後の異なるmRNAスプライシン
グ現象に起因すると考えられる別のmRNA(ここに記載の
cDNAと同一性または類似性の大きい領域を共有する)
は、本発明の範囲内であるとみなされる。
ば残基または配列をいろいろに置換させるか、あるいは
生物学的活性に関与しない末端また内部の残基もしくは
配列を欠失させることにより構築しうる。例えば、シス
テイン残基は、タンパク質の再生の際に誤つた分子内ジ
スルフイド橋の形成を防止するために、欠失させるか又
は他のアミノ酸と置換することができる。その他の変異
導入法には、KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母系で
の発現を高めるために、隣接する二塩基性アミノ酸残基
を修飾することが含まれる。一般に、置換は保存的に行
われるべきであり;すなわち、最適な代替アミノ酸は置
換しようとする残基の物理化学的特性に類似した特性を
窮するものである。同様に、欠失または挿入戦略が採用
される場合、欠失または挿入が生物学的活性に及ぼしう
る影響を考慮すべきである。
は配列を欠失させることにより構築される。特に好適な
サブユニツトには、IL−4Rのトランスメンブラン領域お
よび細胞内ドメインが欠失されるか、あるいは培地への
レセプターの分泌を促進する親水性残基で置換されたも
のが含まれる。生成するタンパク質はIL−4への結合能
を保有する可溶性IL−4R分子である。可溶性IL−4Rの特
定例には、第2A図に示すアミノ酸残基1−208、および
第4A図に示す残基1−207の配列に対して実質的な同一
性を有するポリペプチドが含まれる。
配列中の変異は、もちろん、コード配列のリーデイング
・フレームを保存していなければならず、好ましくは、
レセプターmRNAの翻訳に悪影響を及ぼすmRNAの二次構造
(例えば、ループやヘアピン構造)をもたすようにハイ
ブリダイズする相補領域を形成しないであろう。変異部
位は前もつて決定しうるが、変異自体の本質を予め決定
する必要はない。例えば、所定の部位における最適特性
の変異体を選択するためき、標的コドンでランダムな変
異誘発を行つて、目的とする活性について発現されたIL
−4R変異体をスクリーニングすることができる。
異が最終生産物において発現されるわけではない。例え
ば、ヌクレオチド置換は発現を高めるために、主として
転写mRNAの二次ループ構造を避けるために(参考として
ここに引用する欧州特許公開第75444A号を参照された
い)、または所定の縮主によつて一層容易に翻訳される
コドン(例えば、E.coli発現用のE.coli優先コドン)を
与えるために行われる。
可能にする制限部位を両末端に有するオリゴヌクレオチ
ドを合成することにより、特定位置に導入することがで
きる。連結後に得られる再構築配列は所望のアミノ酸挿
入、置換または欠失を有する留縁体をコードする。
的変異導入法は、必要な置換、欠失または挿入に従つて
改変された特定コドンを有する改変遺伝子を得る際にも
使用できる。上記の改変を行うための代表的な方法はWa
lder et al.(Gene42:123、1986);Bauer et al.(Gene
37:73、1985);Craik(Bio Techniques,January 1985、
12−19);Smith et al.(Genetic Engineering:Princip
les and Methods,Plenum press,1981);および米国特
許第4518584号並びに同第4737462号に開示されている
(これらの文献は参照によりここに引用される)。
子由来の適当な転写または翻訳調節要素に機能しうる状
態で連結された、哺乳動物IL−4Rまたは生物学的に均等
な類縁体をコードする合成のもしくはcDNAから誘導され
たDNA断片を含む組換え発現ベクターを提供する。前記
の調節要素には以下で詳述するような転写プロモータ
ー、転写を調節する任意のオペレーター配列、適当なmR
NAリボソーム結合部位をコードする配列、および転写と
翻訳の終結と調節する配列が含まれる。通常、複製起点
により与えられる縮主内での複製能力、および形質転換
細胞の認識を容易にする選択遺伝子もさらに組み込むこ
とができる。DNA領域は、それらが互いに機能的い関連
している場合、機能しうる状態で連結される。例えば、
シグナルペプチド(分泌リーダー)のDNAは、それがポ
リペプチドの分泌に関係する前駆物質として発現されう
る場合、そのポリペプチドのDNAに機能しくる状態で連
結され;プロモーターは、それがコード配列の転写を調
節する場合、コード配列に機能しうる状態で連結され;
またリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするよ
うに配置される場合、コード配列に機能しうる状態で連
結される。一般に、“機能しくる状態で連結される”と
は隣接していることを意味し、分泌リーダーの場合には
隣接し且つ同じリーデイング・フレームであることを意
味する。
コードするDNA配列は、DNAのmRNAへの転写を早期に終結
させうるイントロンを含まないのが好ましい。しかしな
がら、例えば転写の早期終結が有利なC末端切断(例え
ば、細胞膜に結合しない可溶性レセプターを生成するた
めのトランスメンブラン領域の欠失)を有する変異体を
もたらす場合には、それは望ましいかもしれない。遺伝
暗号の縮重(degeneracy)ゆえに、同一のアミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列にはかなりの変動があ
り、代表的なDNAの例は図面に示したヌクレオチド配列
に相当するものである。他の例には適度なストリンジエ
ント条件(50℃,2×S2C)下で図面の配列とハイブリダ
イズし得る配列、および上記のものとハイブリダイズす
るか又は縮重の関係にあり生物学的に活性なIL−4レセ
プターポリペプチドをコードする他の配列が含まれる。
L−4Rベクターにより形質転換またはトランスフエクシ
ヨンされている細胞である。形質転換縮主細胞は通常IL
−4Rを発現するが、IL−4R DNAをクローン化または増幅
する目的で形質転換された縮主細胞はIL−4Rを発現する
必要がない。発現されたIL−4Rは、所定のIL−4R DNAに
応じて、細胞膜に付着するか、あるいは培養上清に分泌
される。哺乳動物IL−4Rの発現に適する縮主細胞は、適
当なプロモーターの支配下にある原核細胞、酵母または
高等真核細胞である。原核細胞にはグラム陰性またはグ
ラム陽性菌が含まれ、例えばE.coliまたはバシラス属の
細菌である。高等真核細胞には後述するような哺乳動物
由来の樹立された細胞系列が含まれる。また、本発明の
DNA構築物から誘導されたRNAを用いて哺乳動物IL−4Rを
生産するために、細胞を含まない翻訳系も使用し得るで
あろう。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞の縮主と
共に使用するのに適したクローニングベクターおよび発
現ベクターはPouwelsら(Cloning Vectors:A Laborator
y Manual,Elsevier,New York,1985)によつて開示され
ており、関連したその記載内容は参照によりここに引用
される。
ジスルフイドプロセツシングを必要としないIL−4Rの発
現のために使用される。原核細胞発現ベクターは一般に
1つ以上の表現型選択マーカー(例えば、抗生物質耐性
をもたらす遺伝子、または独立栄養要求物を供給するタ
ンパク質をコードする遺伝子)、および宿主によつて認
識されて縮主内での増幅を可能にする複製起点を含む。
形質転換用の適当な原核細胞縮主にはE.coli(大腸
菌)、Bacillus subtilis(枯草菌)、Salmonella typh
imurium(ネズミチフス菌)、およびシユードモナス
属、ストレプトミセス属並びにブドウ球菌属に含まれる
いろいろな菌種が含まれるが、随意に他のものも使用で
きる。
のクローニングベクターpBR322(ATCC37017)の遺伝要
素を含む市販のプラスミドから誘導される選択マーカー
および細菌の複製起点を含むことができる。この種の市
販ベクターには例えば、pKK223−3(スウエーデン国ウ
プサラ、フアルマシア・フアイン・ケミカルズ社)およ
びpGEM1(米国ウイスコンシン州マデイソン、プロメガ
・バイオテク社)が含まれる。これらのpBR322“主鎖”
部分は適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配
列と組み合わされる。E.coliは一般にE.coli種由来のプ
ラスミドであるpBR322の誘導体を用いて形質転換される
(Bolivar et al.,Gene 2:95、1977)。pBR3I2はアンピ
シリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、こう
して形質転換細胞の単純な同定主を提供する。
ーターには、β−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およ
びラクトースプロモーター系(Chang et al.,Nature 27
5:615、1978;Goeddel et al.,Nature 281:544、197
9)、トリプトフアン(trp)プロモーター系(Goeddel
et al.,Nucl.Acids Res.8:4057、1980;欧州特許公開第3
6776号)、およびtacプロモーター(Maniatis,Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor L
aboratory,p.412、1982)が含まれる。特に有用な細菌
発現系はフアージλPLプロモーターおよびcl857ts非耐
熱性リプレツサーを使用する。λPLプロモーターの誘導
体を組み込んでいるアメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨンから入手し得るプラスミドベクターにはE.
coli JMB9株中に保有されるプラスミドpHUB2(ATCC 370
92)およびE.coliRR1中に保有されるpPLc28(ATCC 5308
2)がある。
revisiaeのようなサツカロミセス属からのもの、におい
ても発現される。他の属の酵母、例えばピチア(Pichi
a)またはクルイベロミセス(Kluyveromyces)も使用で
きる。酵母ベクターは一般に2μ酵母プラスミドからの
複製起点、自立複製配列(ARS)、プロモーター、IL−4
RをコードするDNA、ポリアデニル化および転写終結のた
めの配列、並びに選択遺伝子を含むであろう。好ましく
は、酵母ベクターは酵母とE.coliの両方の形質転換を可
能にする複製起点および選択マーカー(例えば、E.coli
のアンピシリン耐性遺伝子およびトリプトフアン中での
成育能力を欠く酵母変異株に選択マーカーを提供するS.
serevisiae trp1遺伝子)、並びに下流の構造配列の転
写を誘導する高度発現酵母遺伝子からのプロモーターを
含むであろう。その後、酵母宿主細胞ゲノム中のtrp1障
害の存在は、トリプトフアンの不在下での成育により形
質転換を検出するための効果的な環境を提供する。
タロチオネイン、3−ホスホグリセリン酸キナーゼ(Hi
tzeman et al.,J.Biol.Chem.255:2073、1980)または他
の解糖系の酵素(Hess et al.,J.Adv.Enzyme Reg.7:14
9、1968;およびHolland et al.,Biochem.17:4900、197
8)、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デ
カルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グリコー
ス−6−リン酸シソメラーゼ、3−ホスホグリセリン酸
ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソ
メラーゼ、ホスホグルコースイソラーゼ、およびグルコ
キシナーゼのプロモーター類が含まれる。酵母発現に用
いられる適当なベクターおよびプロモーターはHitzeman
の欧州特許公開第73657号にさらに詳しく記載されてい
る。
ためのpBR322由来のDNA配列(複製起点およびAmpr遺伝
子)、並びにグルコス抑制ADH2プロモータおよびα因子
分泌リーダーを含む酵母DNA配列を用いて構築すること
ができる。ADH2プロモーターはRussellら(J.Bilo.Che
m.258:2674、1982)およびBeierら(Nature 300:724、1
982)によつて報じられた。異種タンパク質の分泌を支
配する酵母α因子リーダーは、プロモーターと発現され
るべき構造遺伝子の間に挿入することができる。例え
ば、Kurjan et al.,Cell 30:933、198;およびBitter et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5330、1984を参照さ
れたい。リーダ配列は外来遺伝子とリーダー配列との融
合を容易にするために、1つ以上の有用な制限部位をそ
の3′末端に含むよう修飾してもよい。
おり、代表的な技法はHinnen et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 75:1929,1978に記載され、0.67%酵母窒素塩
基、0.5%カザミノ酸、2%グルコース、10μg/mlアデ
ニンおよび20μg/mlウラシルから成る選択培地中でTrp+
形質転換細胞を選択することから成る。
主菌株は、1%酵母エキス、2%ペプトン、および1%
グルコースを含み、さらに80μg/mlアデニンおよび80μ
g/mlウラシルを補給した栄養培地中で発現のために増殖
させる。ADH2プロモーターの抑制解除は培地グルコール
の欠乏により起こる。粗製酵母上清は過により回収さ
れ、精製に先立つて4℃で保持される。
ク質の発現に利用することができる。昆虫細胞により異
種タンパク質を生産するためのバキユロウイルス系はLu
ckow and Summers.Bio/Technology 6:47(1988)に論評
されている。適当な哺乳動物宿主細胞系列の例はGluzma
n(Cell 23:175,1981)に記載のサル腎細胞のCOS−7系
列、および適当なベクターを発現しうる他の細胞系列、
例えばL細胞、C127、3T3、チヤイニーズハムスター卵
巣(CHO)、HeLaおよびBHK細胞系列などである。哺乳動
物発現ベクターは複製起点、発現されるべき遺伝子に連
結された適当なプロモーターおよびエンハンサー、他の
5′または3′フランキング(flanking)非転写配列の
ような非転写要素、並びに必要なリボソーム結合部位、
ポリアデニル化部位、スプライス供与および受容部位、
転写終結配列のような5′または3′非翻訳配列を含む
ことができる。
の転写および翻訳調節配列はウイルス源によつて供給さ
れる。例えば、一般的に用いられるプロモーターおよび
エンハンサーはポロオーマ、アデノウイルスI、シミア
ンウイルス40(SV40)、およびヒトサイトメガウイルス
から誘導される。SV40ウイルスゲノム由来のDNA配列、
例えばSV40複製起点、初期および後期プロモータ、エン
ハンサー、スプライス、およびポリアニデニル化部位は
異種DNA配列の発現に必要とされる他の遺伝要素を提供
すべく用いられる。初期および後期プロモーターは、こ
れらがSV40ウイルス複製起点をも含む断片としてウイル
スから容易に得られるので、特に有用である(Fiers et
al.,Nature 273:113,1978)。HindIII部位からウイル
ス複製起点に存在するBglI部位の方へ延びる約250bp配
列が含まれるという条件で、より小さいまたはより大き
いSV40断片も使用できる。さらに、哺乳動物ゲノムIL−
4Rプロモーター、調節および/またはシグナル配列も、
これらの調節配列が所定の宿主細胞と適合しうるという
条件で、利用できる。組換え哺乳動物IL−4レセプター
を生産するための哺乳動物高度発現ベクターの使用に関
しては、以下の実施例8においてさらに詳しく説明す
る。代表的なベクターは岡山−Berg法(Mol.Cell.Biol.
3:280、1983)により構築することができる。
NAの有用な安定した高レベル発現系は、実質的にCosman
らの方法(Mol.Immumol.23:935、1986)により構築する
ことができる。
施例2において以下で説明する。pCAV/NOTと呼ばれるこ
のベクターは哺乳動物高度発現ベクターpDC201から誘導
され、SV40、アデノウイルス−2およびヒトサイトメガ
ロウイルス由来の調節配列を含む。ヒトIL−7レセプタ
ーを含むpCAV/NOTはアメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨン(ATCC)に寄託番号68014として寄託され
ている。
は、適当な宿主/ベクター系を培養して本発明DNAの組
換え翻訳産生を発現させ、その後培地または細胞抽出物
から精製することにより得られる。
上清は、初めに市販のタンパク質濃縮過器(例えば、
AmiconまたはMillipore Pell−icon限外過装置)を用
いて濃縮する。濃縮工程後、濃縮物は適当な精製マトリ
ツクスにかける。例えば、適当なアフイニテイ−マトリ
ツクスは適当な支持体に結合されたIL−4、レクチンま
たは抗体分子でありうる。別法として、アニオン交換樹
脂、例えばペンダントジエチルアミノエチル(DEAE)基
を有するマトリツクスまたは支持体、を使用することが
できる。マトリツクスはアクリルアミド、アガロース、
デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製におい
て一般的に用いられる他のタイプであり得る。また、カ
チオン交換工程を使用してもよい。適当なカチオン交換
体にはスルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む
種々の不溶性マトリツクスが含まれる。スルホプロピル
基が好適である。
チルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲル)を用いる
逆相高性能液体クロマトグラフイー(RP−HPLC)工程を
1回以上行つて、IL−4R組成物をさらに精製する。上記
精製工程のいくつかまたは全部をいろいろな組み合わせ
で用いて、均質な組換えタンパク質を得ることができ
る。
常、初めに細胞ペレツトから抽出し、次に1回以上の濃
縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグ
ラフイー工程を行うことにより単離される。最後に、高
性能液体クロマトグラフイー(HPLC)が最終精製工程と
して使用される。組換え哺乳動物IL−4Rの発現に用いた
微生物細胞は、凍結−融解サイクル、超音波処理、機械
的破壊、または細胞溶解剤の使用を含めた有利な方法の
いずかを用いて破壊することができる。
による発酵は精製を非常に簡単にする。大規模発酵によ
り得られる分泌組換えタンパク質はUrdalらの方法(J.C
hromatog.296:171、1984)に類似した方法により精製す
ることができる。この文献は、分離用HPLCカラムによる
組換えヒトIL−2の精製のために、2回の連続逆相HPLC
L工程を開示している。
−4Rを培養物から回収する際に用いた精製工程に左右さ
れる量および性質の非ヒト細胞成分(タンパク質を含
む)の存在により特徴づけられる。これらの成分は通常
酵母、原核生物またはヒト以外の高等真核生物に由来す
るものであり、好ましくは約1重量%未満程度の無毒の
汚染量で存在するであろう。さらに、組換え細胞の培養
は、本来その起源種(例えば細胞、細胞滲出液または体
液)中に存在するようなIL−4Rと通常関連があるタンパ
ク質を含まないIL−4Rの生産を可能にする。
しうる担体と混合することにより、投与用に製剤化され
る。このような担体は投与量および使用濃度で受容者に
無毒性であるだろう。一般に、この種の組成物の製剤化
はIL−4Rを緩衝剤、酸化防止剤(例、アスコルビン
酸)、低分子量(約100残基以下)ポリペプチド、タン
パク質、アミノ酸、炭水化物(例、グルコース、スクロ
ースまたはデキストラン)、キレート化剤(例、EDT
A)、グルタチオン、並びに他の安定剤および賦形剤と
組み合わせることを伴う。
うる。例えば、可溶性IL−4R(sIl−4Rと略記する)は
抗Igの存在下でIL−4により誘導されるB細胞培養物の
増殖を阻止する。また、sIL−4Rはアイソタイプ特異的E
LISAで測定したときLPS活性化B細胞によるIL−4誘導I
gG1分泌を抑制し、且つEPICS分析で測定したときネズミ
B細胞によるIL−4誘導Ia発現を抑制する。sIL−4Rは
またIL−4誘導IgE合成を抑制し、従つてアレルギー性
鼻炎(通常の枯草熱)、気管支ぜん息、アトピー性皮膚
炎および胃腸食物アレルギーのようなIgE誘導即時型過
敏反応を治療するために使用される。
例えば、IL−4RはT細胞系列(例えばCTLL T細胞系列)
IL−4誘導増殖を阻止する。sIL−4Rはまた内因的に生
産されたIL−4により仲介される機能活性を抑制する。
例えば、sIL−4RがIL−2に対するモノクローナル抗体
(例、S4B6)と共に付随的に培養物中に存在する場合、
sIL−4Rは二次混合白血球培養でのアロ反応性細胞溶解
Tリンパ球(CTL)の生成を抑制する。IL−2とIL−4
の両方の中和剤は内因性IL−2およびIL−4(両方とも
CTLの生成を調節し、このような培養物により生産され
る)を抑制するために用いられる。
ー組成物は、製剤学的に許容しうる担体または希釈剤と
共に哺乳動物(好ましくはヒト)に投与される。
るためのものではない。
IL−4は酵母により発現させ、それぞれPark,et al.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA84:5267(1987)およびPark et a
l.,J.Exp.Med.166:476(1987)に記載の方法により均質
になるまで精製した。この精製タンパク質を市販の酵素
ビーズ(enzymobead)放射性ヨウ素化試薬(バイオラツ
ド社製)により放射製標識した。この方法では、0.2Mリ
ン酸ナトリウム(pH7.2)50μl中のrIL−4 2.5μg
を、0.05Mリン酸アトリウム(pH7.0)20μl中の酵素ビ
ーズ試薬50μl(2MCiのヨウ化ナトリウム)および2.5
%b−D−グルコース10μlと組み合わせた。10分後25
℃で、アジ化ナトリウム(50mMを10μl)およびメタ重
亜硫酸ナトリウム(5mg/mlを10μl)を加え、インキユ
ベーシヨンを25℃で5分間続けた。この反応混合物は2.
5%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)、0.2%(w/v)
アジ化ナトリウムおよび20mMヘペス(pH7.4)を含有す
るロスウエル・パーク・メモリアル・インステイテユー
ト(RPMI)1640媒体(結合媒体)中で平衡化した2ml床
容量のSephadex G−25(シグマ社製)でゲル過する
ことにより分画化した。125I−IL−4の最終プールは結
合媒体中2×10-8Mの使用原液へ希釈し、レセプター結
合活性の検出しうる低下なしに4℃で最高1ケ月間貯蔵
した。比活性は一般に1〜2×1016cpm/mmole IL−4の
範囲である。
(すなわち、CTLLおよびCTLL−19.4)を用いて行つた結
合検定は、本質的にPark et al.,J.Biol.Chem.261:417
7、1986およびPark et al.,supraに記載されるようなフ
タレート油分離法(Dower et al.,J.Immunol.132:751、
1984)により行つた。また、結合検定はIL−4レセプタ
ー分子をコードするcDNAを含む哺乳動物発現ベクターに
よりトランスフエクシヨンしたCOS細胞に対しても行つ
た。付着細胞への結合のスカツチヤード分析のために、
COS細胞はLuthman et al.,Nucl.Acids.Res.11:1295、19
83およびMcCutchan et al.,J.Natl.Cancer Inst.41:35
1、1968に記載の方法によりプラスミドDNAでトランスフ
エクシヨンした。トランスフエクシヨンの8時間後、細
胞をトリプシン処理し、そして6ウエルプレート(マサ
チユーセツツ州ケンブリツジ、コスター社製)に1×10
4COS−IL−4レセプタートランスフエクト細胞(キヤリ
アーとしての5×105COS対照トランスフエクト細胞と十
分に混合したもの)をまいた。2日後、単層は本質的に
Park et al.,J.Exp.Med.166:476、1987に記載される方
法により4℃で125I−IL−4結合について検定した。
125I−IL−4の非特異的結合は200倍以上の過剰モル量
の未標識IL−4の存在下で測定した。37℃で125I−IL−
4が細胞内に取り込まれる(インターナリゼーシヨン)
のを防ぐために、すべての結合検定いおいてアジ化ナト
リウム(0.2%)を使用した。
換えIL−4R構築物でトランスフエクシヨンしたCOS細胞
からの上清をトランスフエクシヨンの3日後に回収し
た。連続2倍希釈のならし培地(conditioned medium)
は3×10-10M125I−IL摩耗(比活性約1×1016cpm/m mo
lを有する)と共に37℃で1時間プレインキユベート
し、その後2×106CTLL細胞を加えた。37℃で30分イン
キユベーシヨン後、遊離ネズミ125I−IL−4と細胞に結
合したネズミ125I−IL−4とを分離した。
るIL−4レセプター(IL−4結合活性をまだ保有するCT
LL19.4細胞の界面活性剤抽出物に由来するもの)の能力
は精製のモニター手段をもたらした。1mlアリコートの
細胞抽出物(実施例3参照)、IL−4アフイニテイーカ
ラム画分(実施例4参照)または他のサンプルを乾燥BA
85/21ニトロセルロース膜(ニユハンプシヤー州キー
ン、シユライチヤー&シユエル社製)上に置き、乾かし
た。この膜は非特異的結合部位をブロツクするために、
3%(w/v)BSAを含むトリス(0.05M)緩衝食塩水(0.1
5M)(pH7.5)を加えた組織培養皿において30分間イン
キユベートした。その後、膜は200倍過剰モルの未標識I
L−4の存在下または不在下に、PBS+3%BSA中の4×1
0-11M125I−IL−4を加えて、振とうしながら4℃で2
時間インキユベートした。最後に、この膜をPBSで3回
洗い、乾かしてコダツクX−OmatTMARフイルム上に−70
℃で18時間置いた。
ー発現を有するCTLL細胞の選別 高いIL−4レセプター発現を得るための好適な細胞系
列はCTLL、すなわちネズミIL−2依存製細胞溶解T細胞
系列(ATCCTIB214)である。より高レベルのIL−4レセ
プター発現を得るために、CTLL細胞(母細胞)は螢光活
性化細胞分類を用いて選択した。フルオセイン結合組換
えネズミIL−4(rmIL−4と略記する)(酵母宿主のた
めにrmIL−4には十分量の炭水化物が結合している)
は、フルオレセインヒドラジドを過ヨウ素酸塩酸化糖部
分にカツプリングすることにより有利に用いられる。フ
ルオレセイン結合IL−4は、高グリコシル化rmIL−4
(0.1Mクエン酸塩−リン酸塩緩衝液(pH5.5)300μl中
300μg)を、0.1Mクエン酸塩−リン酸塩緩衝液(pH5.
5)中で新たに調製した10mM m−過ヨウ素酸ナトリウム
(シグマ社製)30μlと混合することにより製造され、
この混合物を暗室中4℃で30分インキユベートした。こ
の反応は0.1Mグリセロール30μlで停止させ、0.1Mクエ
ン酸塩−リン酸塩(pH5.5)に対して4℃で18時間透析
した。透析後、DMSOに溶解した100mM5−(((2−(カ
ルボヒドラジノ)メチル)チオ)アセチル)−アミノフ
ルオレセイン(オレゴン州ユージーン、モレキユラー・
プローブズ社製)1/10容量をサンプルに加え、25℃で30
分インキユベートした。その後、IL−4−フルオレセイ
ンはPBS(pH7.4)に対して4℃で徹底的に透析し、アミ
ノ酸分析によりタンパク質濃度を測定した。最終生成物
は1%(w/v)BSAを添加して滅菌過した後4℃で貯蔵
した。
L−4−フルオレセインを含むPBS+1%BSA150μl中37
℃で無菌条件下に30分インキユベートした。次に、この
混合物を4℃に冷却し、多量のPBS+1%BSAで1回洗
い、EPICS Cフローサイトメーター(クールターイン
スツルメント社製)を使つて分類した。最高レベルの螢
光信号(最高1.0%)を与える細胞を大量に集めて、そ
の集団を液体培地中で増殖させた。別法として、単一細
胞クローニングのために、最高1.0%の螢光信号を示す
細胞は96ウエル細胞培養マイクロタイタープレートに1
細胞/ウエルで分配した。
定を行うことにより経路を監視した。選別していないCT
LL細胞(CTLL母細胞)は一般に1000〜2000IL−4レセプ
ター/細胞を示した。CTLL細胞は19回のFACS選別にかけ
た。選別した最終CTLL細胞(CTLL−19)は5×105〜1
×106IL−レセプター/細胞を示した。この時点でCTLL
−19集団はEPICS Cフローサイトメーターを用いて単
一細胞クローニングに付し、個々のクローン集団を増殖
させて125I−IL−4結合について試験した。CTLL−19.4
と名づけた単一クローンは1×106IL−4レセプター/
細胞を示し、精製およびクローニング実験のために選別
された。計算した見掛けKa値は2つの系列において類似
しているが、CTLL−19.4はその表面上にCTLL母細胞より
も約400倍多いレセプターを発現する。
ン、50μg/mlストレプトマイシンおよび10ng/mlの組換
えヒトIL−2を含有するRPMI1640中に維持した。細胞を
ローラボルト中で5×105細胞/mlへ増殖させ、遠心によ
り回収し、無血清DMEM中で2回洗い、2000×gで10分沈
降させて固化ペレツト(約2×108細胞/ml)を形成させ
た。このペレツトに1%Triton X−100およびプロテ
アーゼ阻害剤混合物(2mMフツ化フエニルメチルスルホ
ニル、10μMペプスチン、10μMロイペプチン、2mMo−
フエナントロリン、および2mMEGTA)を含有するPBSを等
容量加えた。細胞は激しく混合しながら抽出緩衝液と混
合し、この混合物を氷上で20分インキユベートし、その
後12000×g、8℃で20分遠心して核および他の細胞破
片を除いた。上清はすぐ使用するか、または使用するま
で−70℃で貯蔵した。
レセプターの精製 ネズミIL−4RのN末端配列を決定するのに十分な量の
ネズミIL−4Rを得るために、あるいはヒトIL−4Rの特性
をさらに決定するために、細胞の界面活性剤抽出から得
られたタンパク質を、アフイニテイ−クロマトグラフイ
ーによりさらに精製した。組換えネズミまたはヒトIL−
4は製造者の指示に従つてAffigel −10(バイオラツ
ド社製)に結合させた。例えば、IL−4溶液(0.1Mヘペ
ス(pH7.4)0.4ml中の3.4mg/ml)に洗浄したAffigel
−10 1.0mlを加えた。この溶液を4℃で一晩揺動さ
せ、上清のアリコートは標準としてBSAを用いて製造者
の指示どおりにバイオラツドタンパク質検定によりタン
パク質について試験した。95%以上のタンパク質がゲル
に結合されており、このことはカラムが1.3mgIL−4/ml
ゲルの最終負荷を有することを示す。グリシンエチルエ
ステルを0.05Mの最終濃度で加えてゲル上の未反応部位
をすべてブロツクした。このゲルはPBS−1%Trito
n 、次いで0.1グリシン−HCl(pH3.0)で十分に洗つ
た。上記のとおりに製造したIL−4結合Affigel を用
いて0.8×4.0cmカラム(床容量4.0ml)を調製し、ネズ
ミIL−4Rの精製のために1%Trfiton X−100含有PBS
で洗つた。これとは別に、IL−4結合Affigel の20%
懸濁液の50μlアリコートは、小規模アフイニテイー精
製およびゲル電気泳動のために、35S−システイン/メ
チオニン標識細胞抽出物と共にインキユベートした。
細胞のアリコート(25ml)は、4℃でネズミIL−4アフ
イニテイーカラムに遅い流速(3.0ml/時)で加えた。そ
の後、順次1%Triton X−100含有PBS、RIPA緩衝液
(0.05Mトリス、0.15M NaCl、1%NP−40、1%デオキ
シコーレートおよび0.1%SDS)、0.1%Triton X−100
および10mM ATPを含有するPBS、最後に1%Triton X
−100含有PBSでカラムを洗つて、mIL−4R以外の汚染物
質をすべて除いた。その後、カラムは0.1%Triton X
−100を含むグリシンHCl緩衝液(pH3.0)で溶出してIL
−4Rを溶離させ、次いで0.1%Triton X−100含有PBS
で洗つた。溶出の間は1ml画分を集め、洗浄の間は2ml画
分を集めた。溶出後すぐに、サンプルを1Mヘペス(pH7.
4)80μlで中和した。各画分中のレセプターの存在は
125I標識IL−4を用いる上記の固相結合検定により検出
した。SDS−PAGEによる分析のために各画分からアリコ
ートを分取し、残りは使用するまで−70℃で凍結保存し
た。SDS−PAGEのために、各カラム画分40μlは2×SDS
サンプル緩衝液(0.125MトリスHCl pH6.8、4%SDS、20
%グリセロール、10%2−メルカプトエタノール)40μ
lに加えた。このサンプルを沸騰水浴中に3分間置き、
そして80μlアリコートをLaemmliの方法(Nature 227:
680、1970)に従つて作製および注入した10%ポリアク
リルアミドゲルの試料溝に入れた。電気泳動後、レウは
Urdalらによつて以前に開示された方法(Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA81:6481、1984)によつて銀染色した。
在する平均45〜55kDa〜55kDaと30〜40kDaの2本のmIL−
4Rタンパク質バンドのポリアクリルアミドゲル銀染色に
よる同定をもたらした。CTLL−19.4細胞の細胞表面タン
パク質を放射性標識し、その後125I標識レセプターをア
フイニテイークロマトグラフイーで精製した実験は、こ
れら2つのタンパク質が細胞表面で発現されたことを示
唆した。低分子量バンド対高分子量バンドの比は4℃で
の画分の貯蔵の際に増加し、このことは前駆体生産物と
の関係(恐らく遅いタンパク質加水分解による)を示し
ている。上記方法により精製されたmIL−4レセプター
タンパク質は、溶解しているときにも、ニトロセルロー
スに吸着されているときも、IL−4を結合する能力を保
有している。
−4レセプター含有画分は、アミノ末端タンパク質配列
の分析のために、SDS−PAGEゲル上で分画化し、その後P
VDF膜に移行させた。ポリアクリルアミドゲル上でタン
パク質画分を泳動する前に、初めにアフイニテイー精製
法からの残留界面活性剤を除く必要があつた。3つの調
製物からのmIL−4アフイニテイーカラムに結合したタ
ンパク質を含む画分は融解させて、スピードバク(spee
d vac)により減圧下で最終容量1mlにそれぞれ濃縮し
た。その後、濃縮画分は50%(v/v)TFAの添加によりpH
2に調整し、0.1%(v/v)TFA/水で平衡化したブラウン
リース(Brownlees)RP−300逆相HPLCカラム(2.1×30m
m)に、ヒユーレツドパツカード(Hewlett Packard)10
90M型HPLCで流しながら200μl/mlの流速で注入した。こ
のカラムは注入後0.1%TFA/水で20分間洗つた。その
後、結合タンパク質を含むHPLCカラムは次のような勾配
を用いて展開した:時間 0.1%TFA中のアセトニトリル% 0 0 5 30 15 30 25 70 30 70 35 100 40 0 5分ごとに1ml画分を集め、SDS−PAGEおよび銀染色によ
りタンパク質の存在を調べた。
emmli,U.K.Nature 227:680、1970に記載のとおりに調製
したレムリ還元試料緩衝液中に再懸濁した。この試料を
5−20%勾配のレムリSDSゲルに加え、色素の先端がゲ
ルの底に達するまで45mAで泳動した。ゲルはその後PVDF
ペーパーに移し、Matsudaira,J.Biol.Chem.262:10035、
1987に記載されるように染色した。3つの各々の調製物
からの画分には約30,000〜40,000Mrに染色バンドがはつ
きりと認められた。
本質的にMarchらの方法(Nature 315:641、1985)に従
つてアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosyste
ms)477A型タンパク質シークエンサーで自動エドマン分
解にかけた。ただし、PTHアミノ酸は自動的に注入し、
アプライド・バイオシステムズ120A型HPLCで製造者によ
り供給される勾配および検出系を用いてon line分析し
た。次のアミノ末端配列がシークエンシングの結果から
決定された:NH2−Ile−Lys−Val−Leu−Gly−Glu−Pro
−Thr−Cys/Asn−Phe−Ser−Asp−Tyr−Ileoアミノ末端
配列決定に用いた2番目の調製物からのバンドはMarch
らのin situ法(Nature 315:641、1985)を用いてCNBr
で処理し、内部メチオニン残基の後でタンパク質を切断
した。生成した切断産物の配列決定は次のデータをもた
らし、CNBrが2個の内部メチオニン残基の後でタンパク
質を切断したことを示している:サイクル 観測された残基 1 Val,Ser 2 Gly,Leu 3 Ile,Val 4 Tyr,Ser 5 Arg,Tyr 6 Glu,Thr 7 Asp,Ala 8 Asn,Leu 9 Pro,Val 10 Ala 11 Glu,Val 12 Phe,Gly 13 Ile,Asn 14 Val,Gln 15 Tyr,Ile 16 Lys,Asn 17 Val,Thr 18 Thr,Gly クローン16および18から誘導されたタンパク質配列(第
2図参照)と比較したとき、配列は次のように合致し
た: Asn(2)を除く配列1および8、10、12位のArg、13位
のSer、16位のLeuを除く配列2のすべての位置において
一致が見られた。上記配列は第2図のアミノ酸残基137
−154および169−187に対応する。
ローンから誘導された配列と合致した。
ーの遺伝情報から誘導されたものであるという結論を支
持している。
てライブラリーをスクリーニングするために、減算ハイ
ブリダイゼーシヨン戦略(subtractivehybridization s
trategy)を用いて、高度に純化されたIL−4レセプタ
ーcDNAプローブを得た。ポリアデニル化(ポリA+)mRNA
は2つの類似した細胞系列、すなわち母細胞系列CTLL
(約2000レセプター/細胞を発現する)および選別した
細胞系列CTLL19.4(1×106レセプター/細胞を発現す
る)、から単離した。これら2つの細胞系列のmRNA含量
は、IL−4レセプターmRNAの相対レベルを除けば同じで
あると予測される。その後、放射性標識一本鎖cDNA調製
物は、Maniatis et al.,Molecular Cloning,A Laborato
ry Manual(Cold Spring Harbor Laboratory,New York,
1982)に記載の方法と類似した方法を用いて、CTLL19.4
細胞からのポリアデニル化mRNAの逆転写により作製し
た。簡単に述べると、ポリA+mRNAをMarchら(Nature31
5:641−647,1985)に記載されるとおりに精製し、プラ
イマーとしてオリゴdTを用いて逆転写酵素によりcDNAに
複製した。cDNAを32Pで高レベル標識するために、100μ
Ciの32P−dCTP(比活性=3000Ci/mmol)は10μMの非放
射性dCTPを含有する反応混合物を50μl中で使用した。
42℃で2時間逆転写後、EDTAを20mM加え、次にNaOHを0.
2M加え、cDNA混合物を68℃で20分インキユーエトするこ
とによりRNAを加水分解した。一本鎖cDNAは10mMトリス
−Cl、1mM EDTAで予め平衡化したフエノール/クロロホ
ルム(50/50)混合溶剤で抽出した。水相を清浄な試験
管に移して、NaOHを0.5M添加することにより再びアルカ
リ性にした。その後、cDNAは6ml Sephadex G50カラム
によるクロマトグラフイーにかけ、30mM NaOHおよび1mM
EDTAを流して大きさに基づいて分画化し、これにより
低分子量の汚染物質を除いた。
後、CTLL19.4細胞由来のcDNAを、選別していないCTLL細
胞から分離したポリA+mRNA 30μgと共にエタノール沈
殿させ、16μlの0.25M NaPO4(pH6.8)、0.2%SDS、2m
M EDTA中に再懸濁した後68℃で20時間インキユベートす
ることにより、密封選別CTLL母細胞由来のmRNAの過剰量
とハイブリダイズさせた。未選別CTLL細胞由来のmRNAに
相補的な選別CTLL19.4細胞由来のcDNAは二本鎖cDNA/mRN
Aハイブリツドを形成し、このハイブリツドはその後ヒ
ドロキシアパタイトに対するそれらの異なる結合親和性
に基づいて一本鎖cDNAから分離することができる。この
混合物は30倍容量の0.02M NaPO4(pH6.8)で希釈し、室
温でヒドロキシルアパタイトに結合させ、そしてSims e
t al.,Nature 312:541,1984に記載されるように60℃で
0.12MNaPO4(pH6.8)を用いて樹脂から一本鎖cDNAを溶
出した。リン酸塩緩衝液はその後水中の2ml Sephadex
G50スピンカラムでの遠心により除去した。このハイブ
リツド減算法はCTLL19.4細胞と未選別CTLL細胞との共通
配列を大部分除き、cDNAライブラリーの検索(以下で説
明する)に使用できる放射性標識IL−4レセプターcDNA
について純化された一本鎖cDNAを残存させる。
デニル化mRNAから標準技法(Gubler,et al.,Gene 25:26
3,1983;Ausubel et al.,eds.,Current Protocols in Mo
lecular Biology,Vol.1,1987)により作製した。オリゴ
dTをプライマーとして用いて逆転写した後、一本鎖cDNA
をDNAポリメラーゼIにより二本鎖となし、T4 DNAポリ
メラーゼで平滑末端を作り、EcoRIメチラーゼでメチル
化してcDNA内のEcoRI切断部位を保護し、そしてEcoRIリ
ンカーへ連結させた。得られた構築物はEcoRIで消化し
てcDNAの両末端におけるリンカーを1コピーだけ除いて
全部除去し、その後等モル濃度のEcoRI切断および脱リ
ン酸化したλZAP アームに連結させ、この連結混合物
を製造者の指示どおりにin vitro(Gigapack )バツケ
ージングした。λフアージベクター内にcDNAライブラリ
ーを作製するための他の適当な方法および試薬はHuynhe
tal.,DNA Cloning Techniques:A Practical Approach,I
RL Press,Oxford(1984);Meissner et al.,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 84:4171(1987)およびAusubel et al.,s
upra.に開示されている。λZAP はλgt11(米国特許第
4788135号)に類似したフアージλクローニングベクタ
ーであり、pUC19(Norrander et al.,Gene 26:101,198
7)からのプラスミド配列、lacZ遺伝子中に配置された
ポリリンカー部位、およびf1フアージ複製起点(宿主細
菌がf1ヘルパーフアージに重感染するとき、ssDNAの回
収を可能にする)を含む。DNAは前記要素を含むプラス
ミド(Bluescript と呼ばれる)の形で切り出される。
Gigapack はλフアージDNAのパツケージングに用いら
れる音波処理E.coli抽出物である。λZAP 、Bluescrip
t およびGigapack は米国カルフオルニア州サンジエ
ゴ、ストラタジーン社の登録商標である。
性標識cDNAはその後、cDNAライブラリーをスクリーニン
グするためのプローブとして使用した。増幅したライブ
ラリーは20枚の150mmプレートのそれぞれに25,000プラ
ークの密度でBB4細胞上にまき、37℃で一晩インキユベ
ートした。λZAP の全操作およびBluescript プラス
ミドの切り出しは、Shortら(Nucl.Acids Res.16:7585,
1988)およびストラタジーン社の製品文献に記載のとお
りに行つた。プラークを写し取つたフイルターはWahl e
t al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:3683,1979に記載さ
れるように、50%ホルムアミド、5×SSC、5×Denhard
t試薬および10%硫酸デキストランを含むハイブリダイ
ゼーシヨン緩衝液中で実施例6からのハイブリツド減算
したcDNAプローブと42℃で48時間インキユベートした。
その後、0.2×SSC中68℃でフイルターを洗つた。16個の
陽性プラークは更なる分析のために精製した。
指示どおりにフアージから切り出し、E.coliに形質転換
した。プラスミドDNAは個々のコロニーから単離し、Eco
RIで消化してcDNA挿入物を放出させ、そして標準1%ア
ガロースゲル上で電気泳動した。4枚の同じゲルをナシ
ロンフイルターへ移行させて同一のサザンブロツトをつ
くり、IL−4レセプター陰性マウス細胞系列(LBRM 331
A5B6)からのポリA+mRNAへの2回目のハイブリダイゼー
シヨン後に、数種のプローブ:すなわち(1)未選別CT
LL細胞由来の放射性標識cDNA、(2)CTLL19.4選別細胞
由来の放射性標識cDNA、(3)CTLL19.4選別細胞由来の
ハイブリツド減算したcDNA、および(4)CTLL19.4選別
細胞由来のハイブリツド減算したcDNA、を用いて分析し
た。これらのプローブは選別細胞系列CTLL19.4に特異的
なmRNAのcDNAコピーが次第に濃縮されたものであつた。
ライブラリーから単離された16個の陽性プラークのう
ち、4つのクローン(11A、14、16および18)はプロー
ブの濃縮につれて信号強度の増加を示した。
す)およびDNA塩基配列決定は、少なくとも上記つの別
個のmRNA集団の存在を明らかにした。両方の型のmRNAは
コード領域の大部分にわたつて同じオープン・リーデイ
ング・フレームを有するが3′末端では相違しており、
従つて異なるCOOH末端配列を有する相同タンパク質をコ
ードしている。両方のクローンのオープン・リーデイン
グ・フレーム内部のDNA配列は、実施例5に詳述した精
製IL−4レセプターの塩基配列決定から誘導されたタン
パク質配列と同じタンパク質配列をコードする。クロー
ン16および18はこれら2つの別個の遺伝情報の原型(プ
ロトタイプ)として用いた。クローン16は第2A図のアミ
ノ酸−25から233までを含む258個のアミノ酸から成るポ
リペプチドをコードするオープン・リーデイング・フレ
ームを含んでいる。クローン18は230個のアミノ酸から
成るポリペプチドをコードし、そのうちN末端の224個
のアミノ酸はクローン16のN末端と同一であるが、その
3′末端は次の配列:CCAAGTAATGAAAATCTG(これはC末
端の6個のアミノ酸:Pro−Ser−Asn−Glu−Asn−Leuを
コードする)および終結コドンTGAを有し、クローン16
と相違している。両方のクローンは実施例8に記載する
ように哺乳動物発現系により発現させた。
ベクターpCAV/NOTは哺乳動物の高度発現ベクターpDC201
(Sims et.al.,Science 241:585,1988)から誘導され
た。pDC201はCosman et al.,Nature312:768,1984に以前
に報じられたpMLSVの誘導体である。pCAV/NOTは、哺乳
動物細胞にトランスフエクトされたとき、その多重クロ
ーニング部位(MCS)に挿入されたcDNA配列を発現でき
るように作られており、次の成分を含む:すなわちSV40
(斜線ボツクス)は複製起点、エンハンサー配列および
初期並びに後期プロモーターを含む座標5171−270から
のSV40配列を含む。この断片は、初期プロモーターから
の転写方向が矢印で示すように方向づけられる。CMVは
ヒトサイトメガロウイルス由来のプロモーターおよびエ
ンハンサー領域(Boshart et al.,Cell 41:521−530,19
85)に発表された配列からのヌクレオチド−671から+
7まで)を含む。3分節(tripartite)リーダー(点描
ボツクス)はアデノウイルス−2 3分節リーダーの第
一エキソンおよび第一と第二エキソン間のイントロンの
一部、3分節リーダーの第二エキソンおよび第三エキソ
ンの一部、並びにXhoI、KpnI、SmaI、NotIおよびBglII
部位を含む多重クローニング部位(MCS)を包含する。p
A(斜線ボツクス)は初期転写のためのポリアデニル化
シグナルおよび終結シグナルを含む4127−4100および27
70−2533からのSV40配列を包含する。pAから時計回り
に、VAIおよびVAII遺伝子を含むアデノウイルス−2配
列10532−11156(黒の太線で示す)が存在し、これに続
いてアンピシリン耐性遺伝子と複製起点を含む4363−24
86および1094−375からのpBR322配列(実線)が存在す
る。得られた発現ベクターはpCAVF/NOTと名づけられ
た。
p718およびNotIで消化してBluescript プラスミドから
分離した。その後、クローン16からの3.5kb挿入物は、
ポリリンカー領域中のAsp718およびNotI部位で切断した
発現ベクターpCAV/NOTに直接連結した。クローン18から
の挿入物はT4ポリメラーゼで平滑末端とした後、SmaIで
切断し脱リイン酸化したベクターpCAV/NOTに連結させ
た。
ミドDNAは、Luthman et al.(Nucl.Acids Res.11:1295,
1983)およびNcCutchan et al.,(J.Natl.Cancer Inst.
41:351,1968)に記載されるようなDEAE−デキストラ
ン、その後のクロロキン処理を用いて、サルCOS−7細
胞の半集密細胞層をトランスフエクシヨンするために使
用した。細胞はその後挿入配列の一時的発現を起こさせ
るべく3日間培養下で増殖させた。3日後、培養上清お
よび細胞単層を(実施例1に記載したように)検定し、
IL−4の結合を確認した。
のAsp718/NotI制限断片を実施例8に記載のpCAV/NOTベ
クターに連結することにより、哺乳動物CHO細胞系列で
発現させた。クローン18からの挿入物を含むpCAV/NOTベ
クターはその後、標準リン酸カルシウム法を用いて、SV
40初期プロモーターの制限下にあるジヒドロ葉酸還元酵
素(DHFR)cDNA選択マーカーと共にCHO細胞に同時トラ
ンスフエクシヨンした。DHFR配列はこのプラスミドを保
有する哺乳動物細胞のメトトレキセート選択を可能にす
る。この種の細胞でのDHFR配列の増幅現象は高濃度のメ
トトレキセートを用いて選択した。この方法では、近傍
のDNA配列も増幅されるので、高められた発現が達成さ
れる。トランスフエクト細胞の大量の細胞培養物は、約
100ng/mlの量で可溶性の活性IL−4Rを分泌した。
−early)エンハンサー/プロモーターの支配下でEBV核
抗原1−を構成的に発現するヒトHeLa−EBNA細胞株653
−6により発現させた。用いた発現ベクターはpDC201の
誘導体であるpHAV−EO−NEO(Dower et al.,J.Immunol.
142:4314,1989)であり、このベクターはEBV複製起点を
含み、653−6細胞系列での高レベル発現を可能にす
る。pHAV−EO−NEOは、アデノウイルス主要後期プロモ
ーターを、ウイルスmRNAのキヤツプ部位に対して−148
から+78まで延びるHIV−1からの合成配列と置き換
え、そしてHIV−1 tat遺伝子をSV−40初期プロモーター
の支配下におくことによつて、pDC201か誘導された。そ
れはまたBgiIIおよびHpaI部位に挿入されたpSV2NEO(So
uthern&Berg,J.Mol.Appl.Genet.1:332,1982)のネオマ
イシン耐性遺伝子を含むBglII−SmaI断片(SalIクロー
ニング部位の下流にサブクローニングされる)を含んで
いる。得られたベクターはネオマイシン耐性によるトラ
ンスフエクト細胞の選択を可能にする。
することによりBluescript プラスミドから分離した。
クローン18のこの断片は5′末端ヌクレオチド配列:GTG
CAGGCACCTTTTGTGTCCCCA、第2A図のヌクレオチド672の後
続のTGA終止コドン、並びに3′末端ヌクレオチド配列:
CTGAGTGACCTTGGGGGCTGCGGTGGTGAGGAGAGTを追加した、第
2A図のヌクレオチド1−672に対応する。この断片はそ
の後T4ポリメラーゼを用いて平滑末端となし、pHAV−EO
−NEOのSalI部位にサブクローニングした。得られたプ
ラスミドはDower et al.,(J.Immunol.142:4314,1989)
に記載されるような改変したポリブレントランスフエク
シヨン法により653−6細胞系列ニトランスフエクシヨ
ンした。ただし、細胞はトランスフエクシヨン後2日で
トリプシン処理を行い、1mg/mlの濃度のG418(ギブコ社
製)を含有する培地に1:8の比で分配した。培地はネオ
マイシン耐製コロニーが樹立されるまで1週間に2回取
り換えた。その後、コロニーはクローニングリングを使
つて別々に採取するか、または一緒にプールして、いく
つかの異なる細胞系列を発生させた。これらの細胞系列
は250μg/mlのG418濃度で薬物選択下に維持した。細胞
が集密的生長に達した時点で上清を採取し、実施例1Bの
阻害検定により試験した。細胞系列は100〜600ng/mlの
可溶性IL−4Rタンパク質を産出した。
発現ベクターを次のように構築した。pIXY120は、それ
がcDNA挿入物を含まずかつNcoI部位を有するポリリンカ
ー/多重クローニング部位を含むことを除いて、pYαHu
GM(ATCC 53157)と同一である。このベクターは次の供
給源からのDNA配列を含む:すなわち(1)プラスミドp
BR322(ATCC 37017)から切り出した、複製起点および
E.coli選択用のアンピシリン耐性マーカーを含む大きい
SphI(ヌクレオチド562)−EcoRI(ヌクレオチド4361)
断片;(2)TRP−1マーカー、2μ複製起点、ADH2プ
ロモーターを含むS.cerevisiaeDNA;および(3)分泌ペ
プチドα因子をコードする遺伝子から誘導された、85個
のアミノ酸から成るシグナルペプチドをコードするDNA
(Kurjanらの米国特許第4546082号公報)。Asp718制限
部位は異種遺伝子への融合を容易にするために、α因子
シグナルペプチド中の237位に導入した。これはCraik,B
io Techniques,January 1985,pp.12−19に記載されるよ
うな特定オリゴヌクレオチドによるin vitro変異導入法
を用いて、ヌクレオチド241のチミジン残基をシトシン
残基に変えることによつて達成された。多重クローニン
グ部位を含み、α因子シグナルペプチドの3′末端近傍
のアミノ酸79におけるAsp718部位から2μ配列中のSpeI
部位までの次の配列を有する合成オリゴヌクレオチドが
挿入された: pBC120はpBR322配列中のNruI部位に挿入された、複製起
点および遺伝子間領域を含む一本鎖フアージf1由来の51
4bpDNA断片の存在によつてpYαHuGMと異なつている。f1
複製起点の存在は、適当なE.coli株に形質転換してバク
テリオフアージf1を重感染させる場合、ベクターの一本
鎖DNAコピーを生じさせ、これはベクターのDNA塩基配列
決定を容易にし、またin vitro変異導入の土台を提供す
る。cDNAを挿入するために、pIXY120はAsp718(α因子
リーダーペプチドの3′末端近傍(ヌクレオチド237)
で切断する)と、例えばBamHI(ポリリンカー中で切断
する)とで消化する。その後、大きいベクター断片を精
製して、発現すべきタンパク質をコードするDNA断片に
連結させる。
4RをコードするcDNA断片は、実施例8のBluescript プ
ラスミドをPpumIとBglIIで消化して、mIL−4R配列(Ile
およびLysをコードする最初の2個の5′コドンを除
く)を含むPpumI部位(図面参照)からオープン・リー
デイング・フレームの3′側にあるBglII部位までの831
bp断片を分離することにより、Bluescript プラスミド
から切り出した。pLXY120はAsp718(α因子リーダーの
3′末端近傍)およびBamHIで消化した。ベクター断片
はPpumI/BglIIhIL−4R cDNA断片、およびα因子リーダ
ーの最後の6個のアミノ酸と成熟mIL−4Rの最初の2個
のアミノ酸とを再形成させる一対の合成オリゴヌクレオ
チドのアニーリングにより作つた次の断片に連結させ
た: このオリゴヌクレオチドはまた、コードされるアミノ酸
配列を変えることなく、XbaI制限部位を導入するための
ヌクレオチド配列TGGATAからCTAGATへの変更を含んでい
た。
準技法(例えば欧州特許公開第165654号に記載される方
法)によりS.cerevisiaeの二倍体酵母株(XV2181)を形
質転換し、トリプトフアン原栄養株について選択した。
得られた形質転換細胞は分泌mIL−4Rタンパク質の発現
のために培養した。生物学的活性を検定するための培養
物は、YPD培地(1%酵母エキス、2%ペプトン、1%
グルコース)20〜50ml中37℃で1〜5×108細胞/mlの細
胞密度へ増殖させた。細胞を培地から分離するために、
遠心により細胞を除き、検定に先立つて培地を0.45μ酢
酸セルロースフイルターに通して過した。形質転換酵
母株によりもたらされた上清、またはプラスミドにより
形質転換され、その後破壊された酵母細胞からの粗製抽
出物は、生物学的に活性なタンパク質の発現を証明する
ために検定を行つた。
のネズミIL−4レセプターcDNAの分離 C57BL/6マウスより誘導された抗原依存性ヘルパーT
細胞クローンである7B9細胞からポリアデニル化RNAを分
離し、これを用いて実施例7に記載したごとくλZAP
(サンジエゴ、ストランジーン社製)にcDNAライブラリ
ーを作製した。λZAPライブラリーは一度増幅させ、そ
して実施例7に記載したように全部で300,000個のプラ
ークをスクリーニングした。ただし、プローブはCTLL1
9.4クローン16から単離し、ランダムプライマーを用い
て作つた32P標識700bpEcoRI断片であつた。13個のクロ
ーンが単離され、制限分析により同定された。
デニル化尾部、推定上のポリアデイル化シグナル、およ
び810個のアミノ酸のオープン・リーデイング・フレー
ム(第2図に示す)を含み、このうちの最初の258個はC
TLL19.4クローン16によりコードされるものと同一であ
り、25個のアミノ酸から成る推定上のシグナルペプチド
配列を含むことを明らかにした。7B9−2cDNAは真核細胞
発現ベクターpCAV/NOTにサブクローニングし、得られた
プラスミドは実施例8に記載したとおりにCOS−7細胞
にトランスフエクシヨンした。COS−7トランスフエク
ト細胞は実施例12で説明するように分析した。
cDNA形態が7B9ライブラリーから分離され、配列分析に
かけられた。このcDNA、クローン7B9−4、はその5′
末端においてクローン7B9−2よりも376bp短く、7B9−
2によりコードされる最初の47個のアミノ酸を欠くが、
残りのN末端アミノ酸23−199をコードする(第2図参
照)。200位に、クローン7B9−4は(CTLL19.4からのク
ローン18と同様に)アミノ酸配列をPro Ser Asn Glu As
n Leuに変える114bp挿入物および後続の終結コドンを含
む。クローン7B9−4とCTLL19.4クローン18の両方に存
在する114bp挿入物は核酸配列が同一である。このcDNA
形態(COS−7細胞中で発現させると分泌型のIL−4レ
セプターをもたらす)がこれが2つの異なる細胞系列か
ら分離された事実は、それがクローニング人工産物でも
なく選別CTLL細胞に特有の変異体でもないことを示して
いる。
るPBLおよびT22ライブラリーからのヒトIL−4レセプタ
ーcDNAの分離 ポリアニデル化RNAは、標準フイコール精製により分
離してIL−2中で6日間培養し、その後RMAおよびCon−
Aで8時間刺激したヒト末梢血リンパ球(PBL)から単
離した。オリゴdTをプライマーとして用いたcDNAライブ
ラリーは実施例7に記載した手法を用いてλgt10に作製
した。プローブはT7 RNAポリメラーゼを用いて7B9−4cD
NAの未標識RNA転写物を合成し、次にランダムプライマ
ー(ベーリンガー・マンハイム社製)を用いて逆転写酵
素で32P標識cDNAを合成することにより作つた。このネ
ズミ一本鎖cDNAプローブを用いて、ヒトcDNAライブラリ
ーからの50,000個のプラークを50%ホルムアミド/0.4M
NaCl中42℃でスクリーニングし、その後2×SSC中55℃
で洗つた。3個の陽性プラークを精製し、EcoRI挿入物
をBluescript プラスミドベクターにサブクローニング
した。クローンPBL−1(3.4kbのcDNA)の一部の核酸配
列決定は、このクローンがネズミIL−4レセプターの対
応配列に対し約67%相同であることを示した。しかしな
がら、終結コドンを含む且つマウスIL−4レセプターク
ローンに対し相同でない68bpの挿入物が、成熟タンパク
質の推定上のN末端から45アミノ酸下流に存在してお
り、このことはクローンPBL−1が非機能的な末端切断
形態のレセプターをコードしていることを示唆した。同
一のライブラリーを(ストリンジエント条件下で)クロ
ーンPBL−1(3.4kbのEcoRI cDNA挿入物)からランダム
プライマーを用いて作つた32P標識プローブでスクリー
ニングすることにより、9個の追加ヒトPBLクローンが
得られた。これらのクローンのうち2個(PBL−11およ
びPBL−5)は、PBL−1において68bp挿入物を含む5′
領域へ延びているが68bp挿入物を含まず、そしてそれら
の大きさから明らかであるように、完全に3′へ延びて
いない。そのため、これらのクローンは哺乳動物発現に
よる機能分析を妨げる。COS−7細胞において発現可能
な構築物を得るために、クローンPBL−11およびPBL−5
の5′NotI−HincII断片を別々にクローンPBL−1の
3′HincII−BamHI末端に連結させ、そして実施例8に
記載のNotIとBglIIで切断したpCAV/NOT発現ベクターに
サブクローニングした。PBL−11/PBL−1およびPBL−5/
PBL−1 DNA配列を含むこれらのキメラヒトIL−4R cDNA
は、実施例12で詳述するように、それぞれクローンA5お
よびB4と名づけられた。これらの構築物はCOS−7細胞
にトランスフエクシヨンし、実質的にSims et al.(Sci
ence 241:585,1988)に記載されるようなプレート結合
検定でIL−4結合について分析した。両方の複合構築物
はIL−4結合活性を示すタンパク質をコードしていた。
複合A5構築物のヌクレオチド配列および推定上のアミノ
酸配列は第4A〜4C図に示した配列情報に一致するが、た
だしGTCコドンが50位のIleの代わりにValをコードす
る。塩基配列の決定を行つた他のクローンにはこの変更
が見られなかつた。クローンPBL−1、PBL−5およびT2
2−8からのコンセンサスコドンはATCであつて、第4A図
に示すようにIle50をコードする。複合B4構築物のヌク
レオチド配列および推定上のアミノ酸配列もまた、PBL
−11の25個のアミノ酸から成るリーダー配列が次の配
列:Met−Gln−Lys−Asp−Ala−Arg−Arg−Glu−Gly−As
nによつて置き換えられていることを示す。
は、PBL−5から5′末端の0.8kb SmaI−DraIII断片
を、そしてPBL−11から対応する0.8kb Asp718−DraIII
断片を、それぞれ切り出し、DraIII突出部分をT4ポリメ
ラーゼで平滑末端とすることにより作つた。PBL−5お
よびPBL−11断片は別々に、SmaIまたはAsp718+SmaIで
それぞれ切断したCAV/NOTにサブクローニングした;こ
れらはそれぞれ可溶性hIL−4R−5および可溶性hIL−4R
−11と呼ばれる。両方の構築物とも、最後のIL−4レセ
プターアミノ酸Thr194コドンの後で、しかも終結コドン
の前に、ベクターによりコードされるアミノ酸:Gly Gln
Arg Pro Leu Gln Ile Tyr Ala Ileが存在する。
l.,J.Immunol.138:2132,1987)から作製した第二のライ
ブラリーは、上記のように合成した2つの異なるプロー
ブで(写し取つたフイルターを用いて)スクリーニング
した。第一のプローブはクローンPBL−1の5′末端か
らの220bp PvuII断片より得られ、第二のプローブはク
ローンPBL−1の3′末端からの300bp PvfuII−EcoRI断
片より得られた。5個の追加のcDNAクローンがこれら2
つのプローブを用いて同定された。これらのクローンの
うち2つは68bp挿入物を含む5′領域へ延びているが、
この挿入物のどちらも含んでいない。これらのクローン
の3番目のもの、T22−8、は大きさが約3.6kbであり25
個のアミノ酸から成るリーダー配列、207個のアミノ酸
から成る成熟外部ドメイン、24個のアミノ酸から成るト
ランスメンブラン領域および569個のアミノ酸から成る
細胞質ドメインを含む、825個のアミノ酸のオープン・
リーデイング・フレームを含んでいた。クローンT22−
8の配列は第4A〜4C図に示す。第5Aおよび5B図は推定上
のヒトIL−4Rアミノ酸配列と推定上のネズミIL−4R配列
とを比較するものであり、これら2種類のタンパク質間
での約53%の配列同一性を示す。
に作製した。cDNAクローンT22−8をThr194コドン中のD
raIII部位で切断し、合成オリゴヌクレオチドで修復し
てThr194コドンおよびLys195コドン、後続の終結コド
ン、並びにNotI制限部位を生成させた。その後、このク
ローンの0.68kb StyI−NotI制限断片をStyI部位で平滑
末端となし、SmaI−NotIで切断したpCAV/NOTベクターに
サブクローニングした。このcDNA発現ベクターはhIL−4
R−8と名づけた。
プターの分析および精製 平衡結合実験はCTLL19.4ライブラリーからのネズミIL
−4レセプタークローン16および18でトランスフエクシ
ヨンしたCOS細胞に対して実施した。すべての場合に、
スカツチヤード座標系(Scatchard,Ann,N.Y.Acad.Sci.5
1:660−672,1949)でのデータの分析は直線をもたし、
ネズミIL−4に対する単一クラスの高親和性レセプター
を示した。COS pCAV−16細胞の場合、計算された見掛け
Kaは3.6×109M-1であり、細胞あたりの特異的結合部位
数は5.9×105であつた。同様の見掛けKa1.5×109M-1がC
OSpCAV−18細胞に対して算出されたが、細胞表面に発現
されたレセプター数は4.2×104であつた。7B9細胞ライ
ブラリーから分離したIL−4R DNAクローンでトランスフ
エクシヨンしたCOS細胞に対して実施した平衡結合実験
もまた、IL−4へのレセプターの高親和性結合を示し
た。特に、pCAV−7B9−2でトランスフエクシヨンしたC
OS細胞を用いた実験は、全長ネズミIL−4レセプターが
125I−IL−4に見掛けKa約1.4×1010M-1で結合し、細胞
あたりの特異的結合部位が4.5×104であることを証明し
た。CAV−7B9−4 IL−4Rの見掛けKaは約1.7×109M-1で
あると算出された。Kaの絶対値および細胞あたりの結合
部位数はトランスフエクシヨン間で変化したが、結合親
和性は一般に近似しており(1×109〜1×1010M-1)、
以前に発表されたIL−4の結合親和性定数とよく合致し
た。
ランスフエクシヨンしたCOS細胞からのならし培地(con
ditioned medium)によるCTLL細胞への125I−mIL−4結
合の阻害は、これらのcDNAが機能的な可溶性レセプター
分子をコードするのかどうかを調べるために用いられ
た。最終検定容量150μl中のCOS pCAV−18ならし培地
約1.5μlは、CTLL細胞上のIL−cレセプターへの125I
−IL−4結合の約50%阻害を与える。125I−IL−4レセ
プターの競合活性は対照のpCAVトランスフエクトCOS細
胞上清において検出されない。125I−IL−4結合を50%
阻害するのに要するpCAV−18上清の希釈物の定量分析か
ら、約60〜100ng/mlの可溶性IL−4レセプターが、トラ
ンスフエクシヒョンの3日後に回収した場合、COS細胞
によつて分泌されたと概算される。同様の結果がpCAP−
7B9−4でトランスフエクシヨンしたCOS細胞からの上清
を用いても得られた。
ランスフエクシヨンを行い、3%FBSを含むDMEM中で増
殖させたCOS細胞からのならし培地はトランスフエクシ
ヨン後3日目に回収した。上清は3000cpmで10分遠心
し、使用するまで凍結保存した。ならし培地200mlは、
上記のように調製したmuIL−4Affigel4mlを含むカラム
にかけた。カラムをPBSで十分に洗い、IL−4レセプタ
ーを0.1Mグリシン、0.15M NaCl(pH3.0)で溶出した。
溶出直後に、試料を1Mヘペス(pH7.4)で中和した。試
料は実施例1Bで説明したようにCTLL細胞への125I−muIL
−4の結合を阻害するそれらの能力について試験した。
さらに、試料は先に述べたようなSDS−PAGE上での分析
および銀染色により純度について調べた。機能的な可溶
性レセプターの活性またはIL−4結合の阻害を試験する
他の方法には、実施例ICに記載したような固相結合検
定、または放射性ヨウ素化されたあるいは比色定量用に
開発されたIL−4の結合を利用するRIAまたはELISAのよ
うな無細胞検定が含まれる。SDS−PAGEで還元条件下に
分析したタンパク質は約37500の分子量を有し、ゲルの
銀染色分析により約90%の純度であると思われる。
ク質は、CTLL細胞内へのIL−4誘導3H−チミジン取込み
を阻害するその能力についても試験すことができる。こ
のような方法によつて、可溶性IL−4レセプターはIL−
4で刺激される増殖を阻止することが判明したが、IL−
2によつて誘起されるマイトジエン応答には影響を及ぼ
さない。
たmIL−4レセプタークローンについて行つた。ネズミC
TLL19.4細胞に対して作られたM2モノクローナル抗体
(実施例13参照)を用いて、CAV−16、CAV−7B9−2お
よびCAV−7B9−4でトランスフエクシヨンし、その後35
S−システインおよび35S−メチオニンで標識したCOS細
胞からIL−4レセプターを免疫沈降させた。CAV−7B9−
4からの細胞関連レセプターは32〜39kDaの範囲の分子
量不均一性を示す。分泌されたCAV−7B9−4レセプター
は36〜41kDaの分子量を有する。CAV−16トランスフエク
トCOS細胞からの細胞関連レセプターは約40〜41kDaであ
る。これはPark et al.,J.Exp.Med.166:476,1987;J.Cel
l.Biol.,Suppl.12A,1988に開示された架橋実験からの分
子量概算値よりもはるかに小さい。COS CAV−7B9−2細
胞関連レセプターの免疫沈降は、Park et al.,J.Cell.B
iol.,Suppl.124A,1988の概算値に類似した130〜140kDa
の分子量を示し、全長IL−4レセプターであると見なさ
れた。細胞関連CAV−16およびCAV−7B9−2 IL−4レセ
プターの同様の分子量概算はまた、これらのcDNAでトラ
ンスフエクシヨンしたCOS細胞への125I−IL−4の架橋
に基づいても行われた。個々のクローンの分子量の不均
一性は幾分かはグリコシル化のためであると考えられ
る。このデータは、DNA塩基配列の解析と合わせて、7B9
−2 cDNAが全長細胞表面IL−4レセプターをコードし、
一方7B9−4およびクローン18が両方とも可溶性形態の
ネズミIL−4レセプターを表すことを示唆している。
ラスミドでトランスフエクシヨンしたCOS細胞を用いて
行つた。2つのキメラヒトIL−4R分子A5およびB4(実施
例11に記載)をCOS細胞にトランスフエクシヨンし、そ
の後平衡結合実験を行つた。COSサル細胞はそれ自体がh
IL−4に結合可能なレセプターを持つている;それ故
に、hIL−4R cDNAでトランスフエクシヨンされ、それを
過剰発現するCOS細胞に対して行つた結合計算値は、内
因性サルIL−4R分子からのバツクグラウンド結合を全結
合から減じた値を表す。hIL−4R A5でトランスフエクシ
ヨンされたCOS細胞は5.3×104のhIL−4結合部位を有
し、算出されたKaは3.48×109M-1であつた。同様に、CO
S細胞により発現されたhIL−4R B4は3.94×109M-1の親
和性で125I−hIL−4を結合し、3.2×104レセプター/
細胞を示した。
も行つた。pCAV/NOT中のクローンA5またはB4でトランス
フエクシヨンしたCOS細胞は35Sシステイン/メチオニン
で標識し、その後溶解した。hIL−4結合Affigel を用
いて、(実施例4に記載したように)この細胞溶解液か
らヒトIL−4Rをアフイニテイー精製した。このアフイニ
テイー担体から溶出されたhIL−4R A5およびB4はSDS−P
AGE上を約140,000ダルトンで泳動し、これは架橋による
hIL−4R分子量の従来の概算値(Park et al.,J.Exp.Me
d.166:476,1987)、並びに本明細書中で示した全長mIL
−4Rの概算値とよく一致する。
合と同様に、可溶性ヒトIL−4R cDNAはこれまで自然界
に存在していなかつたので、実施例11に記載したように
して末端切断形態を構築した。COS細胞での発現後、上
清は可溶性hILA−4R−11および可溶性hIL−4R−5でト
ランスフエクシヨン後3日目に回収して、ヒトB細胞系
列Rajiへの125I−hIL−4結合の阻害について試験し
た。可溶性hIL−4R−11でトランスフエクシヨンしたプ
レートのうち2つからの上清と、可溶性hIL−4R−5で
トランスフエクシヨンしたプレートのうち1つからの上
清は29〜149ng/mlのIL−4R競合活性お培地中に含んでい
た。さらに、末端切断タンパク質はhIL−4結合Affigel
でのアフイニテイー精製により、SDS−PAGEで約44kDa
タンパク質として、35S−メチオニン/システイン標識
トランスフエクトCOS細胞においても検出することがで
きた。hIL−4R−8(可溶性末端切断IL−4Rをコードす
る)でトランスフエクシヨンされたCOS細胞からの上清
は、25倍に濃縮したとき、Raji細胞へのヒトIL−4結合
を阻害し、約16ng/mlの競合活性を含んでいた。
たはネズミIL−4レセプター)、高レベルのIL−4レセ
プターを発現するトランスフエクトCOS細胞、またはCTL
L19.4細胞の調製物は、米国特許第4411993号に記載され
るような慣用技法を用いて、IL−4レセプターに対する
モノクローナル抗体をつくるために用いられる。この種
の抗体はIL−4レセプターへのIL−4の結合を防げるの
に有用であり、例えばIL−4の有毒なまたは他の望まし
くない作用を改善するのに有用であるだろう。
るCTLL19.4細胞は完全フロインドアジユバント中に乳化
して免疫原として使用し、10〜100μlの量でLewisラツ
トに皮下注射した。3週間後、免疫した動物は不完全フ
ロインドアジユバント中に乳化した追加の免疫原で二次
免疫を施し、その後3週間ごとに追加免疫を施した。血
清試料はドツト−ブロツト検定、ELISA(酵素結合免疫
吸着検定)、またはCTLL細胞抽出物への125I−IL−4の
結合阻害(実施例1に記載)により調べるために、眼窩
後の出血または尾先端部の切除により定規的に採決す
る。他の検定法も適している。適当な抗体価の検出後、
陽性動物には最後に食塩液中の抗原を静脈注射した。3
〜4日後、動物を殺滅し、脾細胞を採取し、そしてネズ
ミ黒色腫細胞系列AG8653に融合させた。この方法により
得られたハイブリドーマ細胞系列は多重マイクロタイタ
ープレート中の非融合細胞、黒色腫細胞ハイブリツドお
よび脾細胞ハイブリツドの増殖を阻止するHAT選択培地
(ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン)
にまいた。
−4レセプターとの反応性についてスクリーニングし
た。ハリブリドーマ上清の初期スクリーニングは部分精
製した125I−mIL−4レセプターの抗体捕獲・結合を利
用したものであつた。スクリーニングした400個以上の
ハイブリドーマのうち4個がこの方法で陽性であつた。
これら2つのモノクローナル抗体、M1およびM2、は阻止
抗体を検出する抗体捕獲の変法により支援した。M1のみ
が完全なCTLL細胞への125I−rmIL−4結合を阻止するこ
とができた。両方の抗体はIL−4Rクローンでトランスフ
エクシヨンされ、35S−システイン/メチオニンで標識
されたCOS−7細胞またはCTLL細胞からの天然mIL−4Rタ
ンパク質を免疫沈降させることができる。その後、M1お
よびM2はヌードマウスの腹腔内に注入し、高濃度(>1m
g/ml)の抗IL−4Rモノクローナル抗体を含む腹水を生じ
させた。得られたモノクローナル抗体は硫安沈殿とその
後のゲル排除クロマトグラフイー、および/またはプロ
テインGに対する抗体の結合に基づいたアフイニテイー
クロマトグラフィーにより精製した。
宿主対移植片(HVG)応答に対する可溶性IL−4Rの影響
を調べるために行つた。このモデルでは、マウスの足裏
のふくらみ(footpad)に、照射した同種異系の脾細胞
を注入する。その後、反対側の足裏に、照射した同種同
系細胞を注入する。同種異系細胞を受容する足裏にはア
ロ反応性応答(alloreactive response)が起こり、こ
の応答の度合いは抗原沈着部位から排出される膝窩リン
パ節の大きさおよび重さの相対的増加により測定するこ
とができる。
7BL/6マウス由来の照射した同種異系脾細胞を注入し、
反対側の足裏に照射した同種同系脾細胞を注入した。−
1日目、0日目および+1日目に、3匹のマウスいリン
酸緩衝溶液中の精製可溶性IL−4R(sIL−4R)100ngを
(−1日目と0日目には静脈に、+1日目には皮下に)
注射し、3匹のマウスにsIL−4R 1μgを静脈注射し、
3匹のマウスにsIL−4R 2μgを注射し、そして3匹の
マウスにMSA(対照)を注射した。同種異系および同種
同系脾細胞の部位からのリンパ節お重さの平均差は、MS
A処置マウスの場合が約2.5mg、sIL−4R100ngで処置した
マウスの場合が1mg、そしてsIL−4R 1μgで処置したマ
ウスの場合が0.5mgであつた。sIL−4R 2μgで処置した
マウスの場合には、リンパ節の重さの検出可能な差を確
認できなかつた。こうして、IL−4Rは対照マウスに対し
て用量依存の関係でin vivoリンパ節増殖応答を有意に
(両側Tテストを用いて、すべてのグループにおいて、
p<0.5)抑制した。
(黒の太線で示す)を含むcDNAクローンの制限地図を示
す。 第2A〜C図は、7B9ライブラリーのクローン7B9−2から
誘導されるような、ネズミIL−4レセプターのコード領
域のcDNA配列および推定アミノ酸配列を示す配列図であ
る。 第3図は哺乳動物高度発現プラスミドpCAV/NOTの模式図
である。 第4A〜C図は、T細胞系列T22から誘導されたcDNAライ
ブラリーより得られた、クローンT22−8からのヒトIL
−4レセプターcDNAのコード配列を示す配列図である。 第5A〜B図はヒト(上段)とネズミ(下段)のIL−4レ
セプターcDNAクローンの推定アミノ酸配列を示す配列図
である。
Claims (31)
- 【請求項1】以下の(a)および(b)からなるグルー
プから選択される、IL−4に結合できる哺乳類IL−4レ
セプター(以下、「IL−4R」という)タンパク質または
その類縁体をコードする、単離されたDNA: (a)図2A−2Cの−25〜785のアミノ酸配列、図2A−2C
の1〜785のアミノ酸配列、図4A−4Cの−25〜800のアミ
ノ酸配列、または図4A−4Cの1〜800のアミノ酸配列を
含むタンパク質 (b)(a)のアミノ酸配列において1もしくは複数の
アミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸
配列を含み、かつIL−4に結合可能なタンパク質。 - 【請求項2】図2A−2Cの−75〜2355の核酸配列、図2A−
2Cの1〜2355の核酸配列、図4A−4Cの−75〜2400の核酸
配列、または図4A−4Cの1〜2400の核酸配列を含む、請
求項1に記載のDNA。 - 【請求項3】請求項1または2のDNAとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、IL
−4に結合可能なタンパク質をコードする、単離された
DNA。 - 【請求項4】図4A−4Cの−25〜207のアミノ酸配列また
は図4A−4Cの1−207のアミノ酸配列を含む、可溶性ヒ
トIL−4Rをコードする、請求項1または3に記載のDN
A。 - 【請求項5】図4A−4Cの−75〜621の核酸配列または図4
A−4Cの1〜621の核酸配列を含む、請求項4に記載のDN
A。 - 【請求項6】以下の(a)−(c): (a)図2A−2CのマウスIL−4Rポリペプチド; (b)図4A−4CのヒトIL−4Rポリペプチド;および (c)(a)または(b)のポリペプチドの断片であっ
て、IL−4に結合可能な前記断片 から選択されるIL−4Rをコードする単離されたDNA。 - 【請求項7】請求項1−6のいずれか1項に記載のDNA
を含む、組換え発現ベクター。 - 【請求項8】請求項7に記載のベクターを含む、宿主細
胞。 - 【請求項9】請求項8に記載の宿主細胞を、IL−4Rまた
はその類縁体の発現を促進する条件下で培養することを
含む、哺乳動物IL−4Rまたはその類縁体の調製方法。 - 【請求項10】前記ベクターが請求項5に記載のDNAを
含むものである、請求項9に記載の調製方法。 - 【請求項11】請求項1−6のいずれか1項に記載のDN
Aによってコードされる、IL−4に結合可能な、精製さ
れたIL−4Rポリペプチドまたその類縁体。 - 【請求項12】請求項5に記載のDNAによってコードさ
れる、請求項11に記載のIL−4Rポリペプチドまたはその
類縁体。 - 【請求項13】本質的にマウスに由来する、請求項11に
記載のIL−4Rポリペプチドまたはその類縁体。 - 【請求項14】本質的にヒトに由来する、請求項11に記
載のIL−4Rポリペプチドまたはその類縁体。 - 【請求項15】SDS−PAGEによる約130と145キロダルト
ンの間の分子量を有し、かつヒトIL−4に対する結合親
和性(Ka)約1〜8×109M-1を有する糖タンパク質の形
態である、請求項14に記載のIL−4Rポリペプチドまたそ
の類縁体。 - 【請求項16】以下の(a)−(b): (a)図2A−2Cの1〜785のアミノ酸配列または図4A−4
Cの1〜800のアミノ酸配列を含むポリペプチド;または (b)(a)のアミノ酸配列において1もしくは複数の
アミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸
配列を含み、かつIL−4に結合可能な、(a)のポリペ
プチドの類縁体 から選択される、IL−4に結合可能な、精製されたIL−
4Rポリペプチドまたその類縁体。 - 【請求項17】天然のIL−4タンパク質の細胞膜領域お
よび細胞質領域を欠失させた、請求項16に記載のIL−4R
またはその類縁体。 - 【請求項18】図2A−2Cの残基1〜785、図2Aの残基1
〜208、図4A−4Cの残基1〜800、または図4Aの残基1〜
207の配列から選択されるアミノ酸配列と80%以上同一
のアミノ酸配列を含む、請求項16に記載のIL−4Rまたは
その類縁体。 - 【請求項19】図2A−2Cの残基1〜785、図2Aの残基1
〜208、図4A−4Cの残基1〜800、または図4Aの残基1〜
207の配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1
8に記載のIL−4Rまたはその類縁体。 - 【請求項20】図4Aの残基1〜207の配列から選択され
るアミノ酸配列を含む、請求項19に記載のIL−4Rまたは
その類縁体。 - 【請求項21】以下の(a)−(c): (a)図2A−2CのマウスIL−4Rポリペプチド; (b)図4A−4CのヒトIL−4Rポリペプチド;および (c)(a)または(b)のポリペプチドの断片であっ
て、IL−4Rの生物学的活性を有する前記断片 から選択される、精製されたIL−4Rまたその類縁体。 - 【請求項22】IL−4に結合可能な、図4A−4CのヒトIL
−4Rポリペプチドの可溶性断片である、請求項21に記載
のIL−4Rまたはその類縁体。 - 【請求項23】哺乳動物中の免疫応答を制御するための
組成物であって、有効量の請求項12、17、20または22の
いずれか1項に記載のIL−4Rまたはその類縁体、並びに
適当な希釈剤または担体を含む、前記組成物。 - 【請求項24】請求項22に記載のIL−4Rタンパク質また
はその類縁体を含む、請求項23に記載の組成物。 - 【請求項25】ヒトの喘息を治療するための組成物であ
って、有効量の請求項12、0または22のいずれか1項に
記載のヒトIL−4Rまたはその類縁体、並びに適当な希釈
剤または担体を含む、前記組成物。 - 【請求項26】ヒトのアレルギー反応を治療するための
組成物であって、有効量の請求項12、20または22のいず
れか1項に記載のヒトIL−4Rまたはその類縁体、並びに
適当な希釈剤または担体を含む、前記組成物。 - 【請求項27】請求項11ないし22のいずれか1項に記載
のIL−4Rポリペプチドまたはその類縁体、並びに異種の
ポリペプチドを含む、融合タンパク質。 - 【請求項28】図2A−2Cまたは図4A−4Cに示された核酸
配列のうちの、少なくとも60の連続した核酸を含む、単
離されたDNA。 - 【請求項29】請求項11ないし22のいずれか1項に記載
のIL−4Rポリペプチドまたはその類縁体と免疫反応する
抗体。 - 【請求項30】モノクローナル抗体である、請求項29に
記載の抗体。 - 【請求項31】モノクローナル抗体がヒトIL−4Rポリペ
プチドと免疫反応するものである、請求項30に記載の抗
体。
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