DK175583B1 - DNA-sekvenser kodende for interleukin-4-receptorer, RNA komplementært til disse, rekombinant ekspressionsvektor omfattende disse DNA-sekvenser, værtscelle transfekteret med denne vektor, fremgangsmåde til fremstilling af. - Google Patents

Description

DK 175583 B1

Den foreliggende opfindelse angår generelt cytokinreceptorer og nærmere bestemt Interleukin-4 receptorer.

Interleukin-4 (11-4, også kendt som B-celle stimulerende faktor eller BSF-1) blev oprindelig karakteriseret ved dets evne til stimulere 5 proliferationen af B-celler som reaktion på lave koncentrationer af antistoffer rettet mod overfladeimmunoglobulin. Fornylig er IL-4 blevet vist at have et langt bredere spektrum af biologiske aktiviteter, herunder vækst-costimulation af T-celler, mastceller, granulocyter, megaka-ryocyter og erythrocyter. Desuden stimulerer IL-4 proliferationen af 10 flere IL-2 og IL-3 afhængige cellelinier, inducerer ekspressionen af klasse II hovedhistokompatibil itetskompleksmolekyler på hvilende B-celler og forstærker sekretionen af IgE og IgGl isotyper ved stimulerede B-celler. Både murin og human IL-4 er blevet karakteriseret definitivt ved rekombinant DNA-teknologi og ved rensning af det naturlige murine pro-15 tein til homogenitet (Yokota et all, Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:5894, 1985, Noma et al., Nature 319:640, 1985, og Grabstein et al., 0. Exp.

Med 163:1405, 1986).

IL-4's biologiske aktiviteter formidles af specifikke celleoverfla-dereceptorer for IL-4, som udtrykkes på primære celler og in vitro cel-20 lelinier af mammal oprindelse. IL-4 bindes til receptoren, som derefter omsætter et biologisk signal til forskellige immuneffektorceller. Præparater af renset IL-4 receptor (IL-4R) vil derfor kunne anvendes til diagnostiske analyser for IL-4 eller IL-4 receptor og til frembringelse af antistoffer mod IL-4 receptor til brug ved diagnose eller terapi. Des-25 uden kan præparater af renset IL-4 receptor anvendes direkte inden for terapien til binding eller uddrivning af IL-4 og derved tilvejebringe et middel til regulering af denne cytokins biologiske aktiviteter.

Selvom IL-4 er blevet karakteriseret ekstensivt, er der kun gjort små fremskridt med hensyn til karakterisering af dens receptor. Der er 30 publiceret talrige undersøgelser, som dokumenterer eksistensen af en IL-4 receptor på et bredt spektrum af celletyper, men den strukturelle karakterisering har været begrænset til skøn over proteinets molekylvægt bestemt ved SDS-PAGE analyse af covalente komplekser dannet ved kemisk tværbinding mellem receptoren og radiomærkede IL-4 molekyler. Ohara et 35 al. (Nature 325:537, 1987) og Park et al. (Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 84:1669, 1987) fastslog først tilstedeværelsen af en IL-4 receptor ved anvendelse af radio-ioderet rekombinant murin IL-4 til binding af en højaffinitetsreceptor udtrykt i lave antal på B- og T-lymfocyter og over DK 175583 B1 2 et bredt spektrum af celler af hæmatopoietinlinien. Ved affinitetstværbinding af 125I-IL-4 til IL-4R identificerede Ohara et al. og Park et al. receptorproteiner med tilsyneladende molekylvægte på hhv. 60.000 og 75.000 dalton. Det er muligt, at den lille receptorstørrelse, som blev 5 iagttaget på de murine celler, repræsenterer et proteolytisk spaltningsfragment af den native receptor. Efterfølgende forsøg udført af Park et al. (J. Exp. Med. 166:476, 1987) under anvendelse af gær-afledt rekombi-nant human IL-4 radiomærket med 125I viste, at human IL-4 receptor ikke kun findes på cellelinier af B, T- og hæmotopoietincellelinier, men også 10 på humane fibroblaster og celler af epithel- og endotheloprindelse. IL-4 receptorer er siden blevet vist at forekomme på andre cellelinier, herunder CBA/N milt B-celler (Nakajima et al., J. Immunol. 139:774, 1987), Burkitt-lymfoma Jijoye celler (Cabrillat et al., Biochem & Biophys. Res. Commun. 149:995, 1987), en lang række hæmopoietin- og non-hæmopoietin-15 celler (Lowenthal et al., J. Immunol. 140:456, 1988), og murine Lyt-2" /L3T4~ thymocyter. For ganske nylig har Park et al. (UCLA Symposia, J.

Cell Biol., Suppl. 12A, 1988) rapporteret, at der i nærvær af en tilstrækkelig mængde proteaseinhibitorer kunne identificeres 125I-IL-4 bindende plasmamembranreceptorer på 138-145 kDa på flere murine celle!i-20 nier. Der hersker således en betydelig uenighed om den aktuelle størrelse og struktur af IL-4 receptorer.

Yderligere undersøgelser af IL-4 receptorers struktur og biologiske egenskaber og den rolle, IL-4 receptorer spiller ved forskellige cellepopulationers reaktioner på stimulation med IL-4 eller anden cytokin el-25 ler af de metoder, hvor IL-4 reeptorer anvendes effektivt til terapi, diagnose eller analyse, har ikke været mulige på grund af vanskeligheden ved at opnå tilstrækkelige mængder af renset IL-4 receptor. Man har ikke tidligere haft kendskab til nogen cellelinier, som konstitutivt og kontinuert udtrykker høje niveauer af IL-4 receptorer, og i cellelinier, 30 som vides at udtrykke påviselige niveauer af IL-4 receptor, er ekspressionsniveauet i almindelighed begrænset til mindre end ca. 2.000 receptorer pr. celle. Bestræbelser på at rense IL-4 receptormolekylet til brug ved biokemisk analyse eller på at klone og udtrykke mammale gener, der koder for IL-4 receptor, er blevet hæmmet af mangel på renset recep-35 tor og en passende receptor mRNA-kilde.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer DNA-sekvenser, der koder for polypeptider, der er i stand til at binde mammal interleukin-4 som beskrevet i krav 1 til 9.

DK 175583 B1 3

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også rekombinante ekspressionsvektorer omfattende de ovenfor definerede DNA-sekvenser, rekombinante IL-4R molekyler fremstillet under anvendelse af de rekombinante ekspressionsvektorer og fremgangsmåder til fremstilling af 5 de rekombinante IL-4R molekyler under anvendelse af ekspressionsvektorerne.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også polypeptider, der er i stand til at binde mammal IL-4, kodet af de ovenfor definerede DNA-sekvenser.

10 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også antistoffer, der er immnureaktive med ovennævnte polypeptider og anvendelse af sådanne antistoffer.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også en værtscelle transfekteret med en vektor som ovenfor defineret.

15 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også RNA, der er i det væsentlige komplementært til DNA-sekvenserne som defineret ovenfor.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også fusionsproteiner omfattende en polypeptidsekvens koblet til en polypeptid som beskrevet ovenfor og anvendelse af disse.

20 Det murine molekyle er i sin fulde længde et glycoprotein med en molekylvægt på ca. 130.000 til ca. 140.000 Mr ved SDS-PAGE. Den tilsyneladende bindingsaffinitet (Kl for COS-celler transficeret med de α murine IL-4 receptorkloner 15 og 18 fra CTLL 19.4 biblioteket er 1 til 8 x ΙΟ9 Μ’1. K. for COS-celler transficeret med de murine IL-4 α 25 receptorkloner 7B9-2 og 7B9-4 fra det murine 7B9-bibliotek er 2 x 109 til 1 x 1010 M*. Det modne murin IL-4 receptormolekyle har følgende N-terminalaminosyresekvens: IKVLGEPTCFSDYIRTSTCEW.

Det humane IL-4R molekyle menes at have en molekylvægt mellem ca.

110.000 og 150.000 Mr og har, forudsagt ud fra cDNA-sekvensen og ved 30 analogi til den biokemisk bestemte N-terminal sekvens af det modne murine protein, følgende N-terminalaminosyresekvens: MKVLOEPTCVSDYMSISTCEW.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også præparater til brug ved terapi, diagnose, analyse af IL-4 receptor eller fremkaldelse af antistoffer mod IL-4 receptorer omfattende virksomme mængder af opløselige 35 receptorproteiner fremstillet i overensstemmelse med de foregående fremgangsmåder. Sådanne opløselige rekombinante receptormolekyler indbefatter afkortede proteiner, hvori områder af receptormolekylet, som ikke kræves til IL-4 binding, er deleteret. Disse og andre aspekter af den DK 175583 B1 4 foreliggende opfindelse vil fremgå af den efterfølgende detaljerede beskrivelse og tegningen.

Fig. 1 viser restriktionskort over cDNA-kloner indeholdende kodningsområderne (markeret ved en bjælke) af de murine og humane IL-4R 5 cDNA'er. Restriktionsstederne EcoRl, PvuII, Hine II og Sst I er hhv. vist ved bogstaverne R, P, H og S.

Fig. 2A-C viser cDNA-sekvensen og den afledte aminosyresekvens af kodningsområdet af en murin IL-4 receptor hidrørende fra klon 7B9-2 i 7B9-bi bl ioteket. N-terminal isoleueinen i det modne protein er betegnet ' 10 aminosyre nr. 1. Kodningsområdet af det membranbundne protein fra klon 7B9-2 i fuld længde er defineret af aminosyre 1-785. ATC-kodonen, der specificerer isoleueinresten, som udgør den modne N-terminal, er understreget ved position 1 i proteinsekvensen. Det formodede transmembranområde ved aminosyre 209-232 er også understreget. Sekvenserne for kod-15 ningsområderne for klonerne 7B9-4 og klonerne CTLL-18 og CTLL-16 fra CTLL 19.4 biblioteket er identiske med 7B9-2's med følgende undtagelser: kodningsområdet for CTLL-16 koder for en membranbundet IL-4 bindingsreceptor defineret af aminosyre -25 til 233 (indbefattende den formodede 25 aminosyresignalpeptidsekvens), men efterfølges af en TAG-terminator-20 kodon (ikke vist), som afslutter den åbne læseramme. Nukleinsyresekven-sen viser tilstedeværelsen af et splejsningsdonorsted i denne position (vist ved en pil i fig. 1) og et splejsningsacceptorsted nær 3'-enden (vist ved en anden pil), hvilket giver formodning om, at CTLL-16 opnåedes ud fra et usplejset mRNA-mellemprodukt. Klonerne 7B9-4 og CTLL-18 25 koder for hhv. aminosyre 23-199 og -25 til 199. Efter aminosyre 199 indeforer et 114-basepar indskud (identisk i begge kloner og vist ved en åben kasse i fig. 1) seks nye aminosyrer efterfulgt af en terminerings-kodon. Denne form af receptoren er opløselig.

Fig. 3 er en skematisk illustration af det mammale højekspressions-30 plasmid pCAV/NOT, der beskrives nærmere i eksempel 8.

Fig. 4A-C viser kodningssekvensen for et humant IL-4 receptor cDNA fra klon T22-8, som blev opnået fra et cDNA-bibliotek hidrørende fra T-cellelinien T22. Den forudsagte N-terminalmethionin i det modne protein og transmembranområdet er understreget.

35 Fig. 5A-B er en sammenligning mellem de forudsagte aminosyresekven- ser for humane (øverste linie) og murine (nederste linie) IL-4 receptor cDNA-kloner.

DK 175583 B1 5

Definitioner

Som udtrykkene "IL-4 receptor" og "IL-4R" anvendes heri, refererer de til proteiner med aminosyresekvenser, der i det væsentlige er lig de i fig. 2 og 4 viste native mammale lnterleukin-4 receptoraminosyrese-5 kvenser, og som er biologisk aktive som nedenfor defineret i og med, at de er i stand til binde Interleukin-4 (IL-4) molekyler eller omsætte et biologisk signal initieret ved binding af et IL-4 molekyle til en celle eller krydsreagere med anti-IL-4R antistoffer frembragt mod IL-4R fra naturlige (dvs. ikke rekombinante) kilder. Det native murine IL-4 recep-10 tormolekyle menes at have en tilsyneladende molekylvægt ved SOS-PAGE på ca. 140 kilodalton (kDa). Udtrykkene "IL-4 receptor" eller "IL-4R" indbefatter, men er ikke begrænset til, analoge til eller underenheder af native proteiner med mindst 20 aminosyrer og som udviser i det mindste nogen fælles biologisk aktivitet med IL-4R. Som udtrykket "moden" an-15 vendes i beskrivelsen, betegner det protein udtrykt i en form, som mangler en ledersekvens, som kan være til stede i totallængdetranskripter af ét nativt gen. Forskellige bio-ækvivalente protein- og aminosyreanaloger beskrives nærmere nedenfor.

Udtrykket "i det væsentlige lig eller lignende" betyder, når det 20 anvendes til enten at definere aminosyre- eller nukleinsyresekvenser, at en given sekvens, fx. en mutantsekvens, adskiller sig fra en referencesekvens ved en eller flere substitutioner, deletioner eller additioner, hvis nettovirkning er at bibeholde IL-4R proteinets biologiske aktivitet. Alternativt er nukleinsyreunderenheder og -analoger "i det væsent-25 lige lig" de heri beskrevne specifikke DNA-sekvenser, hvis: (a) DNA-se-kvensen er afledt af kodningsområdet af et nativt mammalt IL-4R gen, (b) DNA-sekvensen er i stand til at hybridisere til DNA-sekvenser fra (a) under moderat stringente betingelser og koder for biologisk aktive IL-4R molekyler, eller DNA-sekvenser, der som resultat af den genetiske kode 30 er degenereret til de under (a) eller (b) definerede DNA-sekvenser og koder for biologisk aktive IL-4R molekyler. Analoge proteiner, som er i det væsentlige lig, vil have mere end ca. 30% lighed med den tilsvarende sekvens i det native IL-4R. Sekvenser med mindre lighedsgrad, men sammenlignelig biologisk aktivitet, anses for at være ækvivalente. De 35 analoge proteiner vil mere foretrukket have mere end ca. 80% lighed med den tilsvarende sekvens af det native IL-4R, i hvilket tilfælde de defineres som værende "i det væsentlige identiske". Ved definering af nukleinsyresekvenser anses alle omhandlede nukleinsyresekvenser, som er DK 175583 B1 6 i stand til at kode for i det væsentlige lignende aminosyresekvnser, for i det væsentlige lig med en referencenukleinsyresekvens.

Lighedsprocenten kan fx. bestemmes ved sammenligning af sekvensinformation under anvendelse af GAP computerprogrammet, version 5 6.0, der kan fås fra University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). GAP-programmet gør brug af Need!eman og Wunsch's orienteringsmetode (J. Mol. Biol. 48/433, 1970} med de af Smith og Waterman foreslåede ændringer (Adv. Appl. Math 2:482, 1981). I korte træk definerer GAP-programmet lighed som antallet af orienterede 10 symboler (dvs. nukleotider eller aminosyrer), som er lig hinanden, divideret med det totale antal symboler i den korteste af de to sekvenser. Blandt de foretrukne sorteringsparametre til GAP-programmet er: (1) en enhedsammenligningsmatrix (indeholdende en værdi på 1 for identitet og 0 for ikke-identitet) for nukleotider og Gribskov og 15 Burgess' vægtede sammenligningsmatrix (Nuel. Acids. Res. 14:6745, 1986) som beskrevet af Schwartz og Dayhoff, ed., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979, (2) en strafværdi på 3,0 for hvert gab og en yderligere strafværdi på 0,10 for hvert symbol i hvert gab, og (3) ingen strafværdi for endegab.

20 Som anvendt i nærværende skrift betyder "rekombinant", at et pro tein hidrører fra rekombinante (fx. mikrobielle eller mammale) ekspressionssystemer. "Mikrobiel" henviser til rekombinante proteiner fremstillet i bakterie- eller fungus- (fx. gær) ekspressionssystemer. Som produkt definerer " rekombinant mikrobiel" et protein fremstillet i et mi-25 krobielt ekspressionssystem, der i det væsentlige er fri for native endogene substanser. Protein udtrykt i de fleste bakteriekulturer, fx. E. coli, vil være frit for glycan. Protein udtrykt i gær kan have et andet glycosyleringsmønster end protein udtrykt i mammale celler.

Når udtrykket "biologisk aktiv" anvendes i beskrivelsen som karak-30 teristik for IL-4 receptorer, betyder det, at et givet molekyle har tilstrækkelig aminosyresekvenslighed med de heri beskrevne udførelsesformer af opfindelsen til at være i stand til at binde påviselige mængder af IL-4, transmittere en IL-4 stimulus til en celle, fx. som komponent i en hybridreceptorkonstruktion, eller krydsreagere med anti -1L-4R antistof-35 fer frembragt mod IL-4R fra naturlige (dvs. ikke-rekombinante) kilder. Biologisk aktive IL-4 receptorer inden for opfindelsens rammer er fortrinsvis i stand til at binde mere end 0,1 nmol IL-4 pr. nmol receptor, og mest foretrukket mere end 0,5 nmol IL-4 pr. nmol receptor, ved stan- DK 175583 B1 7 dardbindingsanalyser (se nedenfor).

"DNA-sekvens" referer til et DNA-molekyle i form af et separat fragment eller som komponent i en større DNA-konstruktion, som er afledt af DNA, isoleret i det mindste én gang i en i det væsentlige ren form, 5 dvs. fri for kontaminerende endogene materialer, og i en mængde eller koncentration, som muliggør identifikation, manipulation og udvinding af sekvensen og de deri indgående nukleotidsekvenser ved biokemiske standardmetoder, fx. ved hjælp af en kloningsvektor. Sådanne sekvenser fås fortrinsvis i form af en åben læseramme, som er uafbrudt af indre ikke-10 transiaterede sekvenser eller i ntroner, som typisk forefindes i eukaryo-tiske gener. Genomt DNA indeholdende de relevante sekvenser, vil også kunne anvendes. Sekvenser af ikke-translateret DNA kan findes 5' eller 3' fra den åbne læseramme, når samme ikke interfererer med manipulation eller ekspression af kodningsområderne.

15 "Nukleotidsekvens" henviser til en heteropolymer af deoxyribonu- kleotider. DNA-sekvenser, der koder for de ved opfindelsen tilvejebragte proteiner, kan sammensættes ud fra cDNA-fragmenter og korte oligonukleo-tidlinkere eller ud fra en række oligonukleotider til frembringelse af et syntetisk gen, som kan udtrykkes i en rekombinant transkriptionsen-20 hed.

"Rekombinant ekspressionsvektor" henviser til en replikerbar DNA-konstruktion anvendt enten til forstærkning eller ekspression af DNA, som koder for IL-4R og som indbefatter en transkriptionsenhed omfattende et arrangement af (1) et eller flere genetiske elementer med en regula-25 torisk rolle ved genekspression, fx. promotore eller forstærkere, (2) en strukturel sekvens eller en kodningssekvens, der transkriberes til mRNA og translateres til protein, og (3) passende transkriptions- og translationsinitierings og -termineringssekvenser. Strukturelle elementer beregnet til brug i gærekspressionssystemer indbefatter fortrinsvis en le-30 dersekvens, som muliggørr ekstracellulær sekretion af translateret protein hos en værtscelle. Hvor rekombinant protein udtrykkes uden en leder- eller transportsekvens, kan det som alternativ indbefatte en N-ter-minalmethioninrest. Denne rest kan eventuelt senere spaltes fra det udtrykte rekombinante protein til frembringelse af et slutprodukt.

35 "Rekombinant mikrobielt ekspressionssystem" betyder en i det væ sentlige homogen monokultur af passende værtsmikroorganismer, fx. bakterier såsom E. coli, eller gær såsom S. cerevisiae, som har en rekombinant transkriptionsenhed integreret stabilt i kromosomalt DNA, eller bæ- DK 175583 B1 8 rer den rekombinante transkriptionsenhed som en komponent i et iboende plasmid. I almindelighed er celler, som udgør systemet, afkom af en enkelt stamtransformant. Rekombinante ekspressionssystemer som heri defineret, vil udtrykke heterologt protein ved induktion af de til DNA-se-5 kvensen eller det syntetiske gen, som skal bringes til udtryk, koblede regulator!ske elementer.

Proteiner og analoger

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer i det væsentlige homoge-10 ne rekombinante mammale IL-4R polypeptider, der i det væsentlige er fri for kontaminerende endogene materialer og eventuelt er uden tilknyttet glycosylering af nativt mønster. De native murine og humane IL-4 receptormolekyler udvindes ud fra cellelysater som glycoproteiner med en tilsyneladende molekylvægt ved SDS-PAGE på ca. 130-145 kilodalton (kDa).

15 Mammal IL-4R ifølge opfindelsen indbefatter fx. primat, human, murin, kanin, felin, bovin, ovin, equin og porcin IL-4R. Inden for opfindelsens rammer indbefatter derivater af IL-4R også forskellige strukturelle former af det primære protein med bibeholdt biologisk aktivitet. På grund af tilstedeværelsen af ioniserbare amino- og carboxyl grupper kan et IL-20 4R protein fx. være i form af sure eller basiske salte eller i neutral form. Individuelle aminosyrerester kan også være modificeret ved oxidation eller reduktion.

Den primære aminosyrestruktur kan modificeres ved dannelse af cova-lente konjugater eller aggregatkonjugater med andre kemiske grupper så-25 som glycosylgrupper, lipider, phosphat, acetylgrupper o.l., eller ved frenbringelse af aminosyresekvensmutanter. Covalente derivater fremstilles ved binding af specielle funktionelle grupper til IL-4R aminosyresi-dekæder eller ved N- eller C-terminalerne. Andre IL-4R derivater inden for opfindelsens rammer indbefatter covalente konjugater eller aggregat-30 konjugater af IL-4R eller fragmenter deraf med andre proteiner eller polypeptider såsom ved syntese i rekombinantkultur som N-terminal- eller C-terminal fusioner. For eksempel kan konjugatpeptidet være en signal-(eller leder-) polypeptidsekvens ved proteinets N-terminalområde, som cotranslationelt eller posttranslationelt styrer overførsel af proteinet 35 fra dets synteseposition til dets funktionsposition inden for eller uden for cellemembranen eller -væggen (fx. gær α-faktorlederen). IL-4R proteinfusioner kan omfatte peptider adderet for at lette rensning eller identifikation af IL-4R (fx. poly-His). IL-4 receptorens aminosyrese- DK 175583 B1 9 kvens kan også være koblet til peptidet Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988). Sidstnævnte sekvens er stærkt antigenisk og giver en epitop, der bindes reversibelt af et specifikt monoklonalt antistof, hvilket muliggør hurtig analyse og 5 let rensning af udtrykt rekombinant protein. Denne sekvens spaltes også specifikt af bovin mucosal enterokinase ved resten umiddelbart efter Asp-Lys parret. Fusionsproteiner afsluttet med dette peptid kan også være modstandsdygtige over for intracellulær nedbrydning i E. coli.

IL-4R derivater kan også anvendes som immunogener, reagenser ved 10 receptor-baserede immunoanalyser eller som bindingsmidler til affinitetsrensningsprocedurer for IL-4 eller andre bindingsligander. IL-4 derivater kan også opnås ved hjælp af tværbindingsmidler såsom M-maleimi-dobenzoylsuccinimidester og N-hydroxysuccinimid ved cystein- og lysinre-ster. 1L-4R proteiner kan også via reaktive sidegrupper bindes covalent 15 til forskellige uopløselige substrater såsom cyanogenbromid-aktiverede, bisoxiran-aktiverede, carbonyl diimodazol-aktiverede eller tosyl-aktive-rede agarosestrukturer eller ved adsorption til polyolefinoverflader (med eller uden glutaraldehydtværbinding). Når først den er bundet til substratet, kan IL-4R anvendes til selektivt (i analyse-* eller rens-20 ningsøjemed) at binde anti-IL-4R antistoffer eller! IL-4.

Den foreliggende opfindelse indbefatter også IL-4R med eller uden tilknyttet glycosylering af nativt mønster. IL-4R udtrykt i gærekspressionssytemer eller mammale ekspressionssystemer, fx. C0S-7 celler, kan i molekylvægt og glycosyleringsmønster være lig eller væsentligt forskel-25 lige fra de native molekyler, alt afhængigt af ekspressionssystemet. Ekspression af IL-4R DNA'er i bakterier såsom E. coli giver ikke-glyco-sylerede molekyler. Funktionelle mutantanal oger til mammal IL-4R med in-aktiverede N-glycosyleringssteder kan fremstilles ved oligonukleotidsyn-tese og ligering eller ved positionsspecifikke mutageneseteknikker. Dis-30 se analoge proteiner kan fremstilles i en homogen carbohydratreduceret form i godt udbytte ved hjælp af gærekspressionssystemer. N-glycosyle-ringspositioner i eukaryotiske proteiner er karakteriseret ved aminosy-retripletten Asn-Aj-Z, hvor Aj er en hvilken som helst aminosyre bortset fra Pro, og Z er Ser eller Thr. I denne sekvens giver asparagin en side-35 kædeaminogruppe for covalent tilknytning af carbohydrat. En sådan position kan elimineres ved erstatning af Asn eller resten Z med en anden aminosyre, deletering af Asn eller Z, eller indføring af en ikke-Z aminosyre mellem Aj og Z, eller en anden aminosyre end Asn mellem Asn og DK 175583 Bl 10

Rr IL-4R derivater kan også fås ved mutation af IL-4R eller underenheder deraf. En IL-4R mutant er i den foreliggende sammenhæng et polypep-tid, som er homologt med IL-4R, men har en aminosyresekvens, som afviger 5 fra det native IL-4R på grund af en deletering, indføring eller substitution. Som de fleste mammale gener, indkodes mammale IL-4 receptorer formodentlig af multi-exon gener. Som alternativ anses mRNA's konstruktioner, som kan tilskrives forskellige mRNA-splejsningshændelser efter transkription og som har store identitets- eller lighedsområder med de 10 heri omhandlede cDNA'er, for at være omfattet af opfindelsen.

Bio-ækvivalente analoger til IL-4R proteiner kan fx. konstrueres ved frembringelse af forskellige substitutioner af rester eller sekvenser eller deletering af terminale eller interne rester eller sekvenser, som ikke er påkrævet for biologisk aktivitet. For eksempel kan cystein-15 rester deleteres eller erstattes med andre aminosyrer for at hindre dannelse af ukorrekte intramolekylære disulfidbroer ved renaturering. Andre metoder til mutagenese indbefatter modifikation af tilstødende dibasiske aminosyrerester til forstærkning af ekspression i gærsystemer, hvori KEX2-proteaseaktivitet forefindes. I almindelighed bør substitutioner 20 foretages konservativt, dvs. at de mest foretrukne substitutaminosyrer er sådanne, som har lignende fysisk-kemiske egenskaber som resten, der skal erstattes. I lighed hermed bør man ved iværksættelse af en deletions- eller indføringsstrategi tage den potentielle virkning af deletionen eller indføringen på den biologiske aktivitet i betragtning.

25 IL-4R underenheder kan konstrueres ved deletering af terminale el ler interne rester eller sekvenser. Blandt særligt foretrukne underenheder er sådanne, hvori transmembranområdet og det intracellulære område af IL-4 er deleteret eller erstattet med hydrofile rester for at lette sekretion af receptoren i cellekulturmediet. Det resulterende protein er 30 et opløseligt IL-4R molekyle, som kan bibeholde sin evne til at binde IL-4. Blandt specielle eksempler på opløselig 1L-4R er polypeptider med væsentlig identitet med sekvensen af aminosyreresterne 1-208 i fig. 2A og resterne 1-207 i fig. 4A.

Mutationer i nukleotidsekvenser konstrueret til ekspression af ana-35 loge IL-4R'er må naturligvis bevare læserammefasen af kodningssekvenserne og vil fortrinsvis ikke skabe komplementære områder, som kunne hybri-disere til frembringelse af sekundære mRNA-strukturer såsom løkker eller hårnåle, som ville indvirke ugunstigt på translation af receptor- DK 175583 B1 11 mRNA'et. Selvom et mutationssted kan forudbestemmes, er det ikke nødvendigt, at arten af selve mutationen forudbestemmes. For eksempel kan der for udvælgelse af optimale rautantegenskaber på et givet sted udføres tilfældig mutanogenese ved den pågældende kodon, og de udtrykte IL-4R 5 screenes for den ønskede aktivitet.

Ikke alle mutationer i nukleotidsekvensen, som koder for IL-4R, vil blive udtrykt i slutproduktet, fx. kan nukleotidsubstitutioner foretages til forstærkning af ekspression primært for at undgå sekundære strukturløkker i det transkriberede mRNA (se EPA 75.444A, inkorporeret heri ved 10 henvisning) eller til tilvejebringelse af kodoner, som lettere transia-teres af den udvalgte vært, fx. de velkendte E. coli præferencekodoner for E. coli ekspression.

Mutationer kan fremkaldes på specielle steder ved syntetisering af oligonukleotider indeholdende en mutantsekvens flankeret af restrik-15 tionssteder, som muliggør ligering til fragmenter af den native sekvens.

Efter ligering koder den resulterende rekonstruerede sekvens for en analog med den ønskede aminosyreindføring, substitution eller deletering.

Alternativt kan oligonukleotid-dirigerede positionsspecifikke muta-geneseprocedurer anvendes til tilvejebringelse af et ændret gen med spe-20 cielle kodoner ændret iht. den påkrævede substitution, deletering eller indføring. Eksempler på fremgangsmåder til frembringelse af de ovenfor anførte ændringer beskrives af Walder et al. (Gene 42:133, 1985), Bauer et al. (Gene 37:73, 1985), Craik (BioTechniques, Januar 1985, 12-19),

Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 25 1981), og US patentskrifterne nr. 4.518.584 og 4.737.462, der inkorpore res heri ved henvisning.

Ekspression af rekombinant IL-4R

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer rekombinante ekspres-30 sionsvektorer, der indbefatter syntetiske eller cDNA-afledte DNA-frag-menter, som koder for mammalt IL-4R, eller bio-ækvivalente analoger, som er operativt forbundet med egnede transkriptions- eller transiationsre-gulatoriske elementer afledt af mammale, mikrobielle eller virale gener eller insektgener. Blandt sådanne regulatoriske elementer er en trans-35 kriptionspromotor, en eventuelt operatorsekvens til styring af trans-kription, en sekvens, der koder for passende mRNA-ribosombindingssteder, og sekvenser, som styrer terminering af transkription og translation som nærmere beskrevet nedenfor. Evnen til at replikere i en vært, hvilken DK 175583 B1 12 sædvan! igvis tildeles af et repli kat i onsområde, og et udvælgelsesgen til at lette genkendelse af transformanter, kan yderligere inkorporeres. DNA-områder er operativt forbundet, når de er funktionelt relateret til hinanden. For eksempel er DNA for et signalpeptid (sekrektionsleder) 5 operativt forbundet med DNA for et polypeptid, hvis det udtrykkes som en prækursor, der deltager i sekretionen af polypeptidet. En promotor er operativt forbundet med en kodningssekvens, hvis den styrer transkrip-tionen af sekvensen. Et ribosombindingssted er operativt forbundet med en kodningssekvens, hvis det befinder sig således, at translation ti 11a-10 des. 1 almindelighed betyder operativt forbundet tilgrænsende og i tilfælde af sekretionsledere tilgrænsende og i læseramme.

DNA-sekvenser, der koder for mammale IL-4 receptorer, som skal udtrykkes i en mikroorganisme, vil fortrinsvis ikke indeholde nogen intro-ner, som for tidligt kunne afslutte transkription af DNA til mRNA. Imid-15 lertid kan for tidlig afslutning af transkription være ønskelig, fx. hvor den ville resultere i mutanter med fordelagtig C-terminalafkort-ning, fx. deletion af et transmembranområde til frembringelse af en opløselig receptor, som ikke er bundet til cellemembranen. På grund af ko-dedegenerering kan der være betydelig variation i nukleotidsekvenser, 20 der koder for samme aminosyresekvens. Eksempel vi se DNA-udførelsesformer er dem, der svarer til de i figurerne viste nukleotidsekvenser. Andre udførelsesformer indbefatter sekvenser, som er i stand til at hybridise-re til sekvenserne i figurerne under moderat stringente betingelser (50°C, 2 x SSC), og andre sekvenser, der hybridiserer eller degenererer 25 til de ovenfor beskrevne og som koder for biologisk aktive IL-4 recep-torpolypeptider.

Transformerede værtsceller er celler, som er blevet transformeret eller transficeret med IL-4R vektorer, konstrureret under anvendelse af rekombinant DNA teknik. Transformerede værtsceller udtrykker almindelig-30 vis IL-4R, men værtsceller, transformeret med henblik på kloning eller forstærkning af IL-4R DNA, behøver ikke at udtrykke IL-4R. Udtrykt IL-4R vil, afhængigt af det valgte IL-4R DNA, blive aflejret i cellemembranen eller udskilt i kultursupernatanten. Blandt egnede værtsceller til ekspression af mammal IL-4R er prækaryoter, gær- og højere eukaryotiske 35 celler under kontrol af passende promotorer. Prokaryoter indbefatter gram-negative eller gram-positive organismer, fx. E. coli eller bacilli.

Højere eukaryotiske celler indbefatter etablerede cellelinier af mammal oprindelse som nedenfor beskrevet. Cellefri translationssystemer vil og- DK 175583 B1 13 så kunne anvendes til fremstilling af mammalt IL-4R under anvendelse af RNA'er hidrørende fra DNA-konstruktionerne ifølge opfindelsen. Passende klonings- og ekspressionsvektorer for brug med bakterie-, svampe-, gær-og pattedyrscelleværter er beskrevet af Pouweis et al. (Cloning Vectors: 5 A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985), hvis relevante dele inkorporeres heri ved henvisning.

Prokaryotiske ekspressionsværter kan anvendes til ekspression af IL-4R'er, som ikke kræver ekstensiv proteolytisk behandling og di sulfidbehandl ing. Prokaryotiske ekspressionsvektorer omfatter i almindelighed 10 en eller flere fænotype-udvælgelige markører, fx. et gen, der koder for proteiner, som giver antibiotikaresistens eller giver et autotroft krav, og et replikationsområde, som genkendes af værten, for at sikre forstærkning i værten. Blandt egnede prokaryotiske værter til transformation er E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium og forskelli-15 ge arten inden for slægterne Pseudomonas, Streptomyces og Staphylococcus, selvom andre også vil kunne vælges.

Egnede ekspressionsvektorer til bakteriel brug kan omfatte en udvælgelig markør og et bakterielt replikationsområde hidrørende fra kommercielt tilgængelige plasmider indeholdende genetiske elementer fra den 20 velkendte kloningsvektor pBR322 (ATCC 37017). Blandt sådanne kommercielle vektorer er fx. pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) og pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Disse pBR322 "ryggrads"-sektioner kombineres med en passende promotor og den strukturelle sekvens, som skal udtrykkes. E. coli transformeres typisk under anvendelse 25 af derivater af pBR322, et plasmid hidrørende fra en E. coli art (Bolivar et al., Gene 2:95, 1977). pBR322 indeholder gener for ampicil-lin- og tetracyclinresistens og giver således simple midler til identifikation af transformerede celler.

Blandt almindeligt anvendte promotorer i rekombinante mikrobielle 30 ekspressionsvektorer er £-lactamase- (penicillinase) og lactosepromotor-systemet (Chang et al., Nature 275:515, 1978, og Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), tryptofan (trp) promotorsystemet (Goeddel et al., Nuel.

Acids Res. 8:4057, 1980, og EPA 36.776) og tac-promotor (Maniatis,

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 35 p. 412, 1982). Et særligt værdifuldt bakterieekspressionssystem benytter fag λ P^-promotoren og cl857t$ termolabil repressor. Blandt plasmidvek-torer, som kan fås fra American Type Culture Collection og som inkorporerer derivater af λ P^-promotoren, er plasmid pHUB2, boende i E. coli DK 175583 B1 14 stamme JMB9 (ATCC 37092) og pPLc28, boende i E. coli RR1 (ATCC 53082).

Rekombinante IL-4R proteiner kan også udtrykkes i gærværter, fortrinsvis af Saccharomyces-slægten såsom S. cerevisiae. Gær af andre slægter såsom Pichia eller Kluyveromyces kan også benyttes. Gærvektorer 5 vil i almindelighed indeholde et repl i kationsområde fra 2/i gærplasmidet eller en autonomt repli kerende sekvens (ARS), promotor, DNA, der koder for IL-4R, sekvenser for polyadenylering og transkriptionsterminering samt et udvælgelsesgen. Gærvektorer vil fortrinvis indbefatte et repli-kationsområde og en udvælgelig markør, som tillader omdannelse af både 10 gær og E. coli, fx. ampicillin-resistensgenet fra E. coli og S. cerevisiae trpl genet, som tilvejebringer en udvælgelig markør for en mutant stamme af gær, som mangler evne til at vokse i tryptofan, og en promotor hidrørende fra et stærkt udtrykt gærgen til induktion af transkription af en nedenstrøms strukturel sekvens. Tilstedeværelsen af trpl-læsionen 15 i gærværtscellegenomet tilvejebringer så et effektivt miljø for påvisning af transformation ved vækst i fravær af tryptofan.

Egnede promotorsekvenser i gærvektorer indbefatter promotorerne for metallothionein, 3-phosphoglyceratkinase (Hitzelman et al., J. Biol.

Chem. 255:2073, 1980) eller andre glycolytiske enzymer (Hess et al., J.

20 Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968, og Holland et al., Biochem 17:4900, 1978) såsom enolase, glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, hexokinase, pryo-vatdecarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphatisomerase, 3-phosphoglyceratmutase, pyruvatkinase, triosephosphatisomerase, phospho-glucoseisomerase og glucokinase. Egnede vektorer og promotorer til brug 25 ved gærekspression er beskrevet yderligere i Hitzeman, EPA 73.657.

Foretrukne gærvektorer kan sammensættes ved hjælp af DNA-sekvenser fra pBR322 med henblik på udvælgelse og replikation i E. coli (Ampr-gen og replikationsområde) og gær DNA-sekvenser indbefattende en glucose-undertrykkelig ADH2-promotor og α-faktor sekretionsleder. ADH2-promoto-30 ren er blevet beskrevet af Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) og Beier et al. (Nature 300:724, 1982). Gær α-faktor lederen, som styrer sekretion af heterologe proteiner, kan indføjes mellem promotoren og det strukturelle gen, som skal udtrykkes. Se fx. Furjan et al., Cell 30:933, 1982, og Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 35 1984. Ledersekvensen kan modificeres til nær ved sin 3'-ende at inde holde et eller flere værdifulde restriktionssteder for at lette fusion af ledersekvensen til fremmede gener.

Egnede gærtransformationsprotokoller er velkendte for fagmanden. Et DK 175583 B1 15 eksempel på en teknik er beskrevet af Hinnen et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 75:1929, 1978, ved hvilken der udvælges efter Trp+-transforman -ter i et selektivt medium bestående af 0,67% gærnitrogenbase, 0,5% casa-minosyrer, 2% glucose, 10 /ig/ml adenin og 20 μg/m^ uracil.

5 Værtsstammer transformeret med vektorer omfattende ADH2-promotoren kan dyrkes med henblik på ekspression i et rigt medium bestående af 1% gærekstrakt, 2% pepton og 1% glucose suppleret med 80 /xg/ml adenin og 80 /ig/ml uracil. Derepression af ADH2-promotoren finder sted efter opbrug-ning af glucose i mediet. Rå gærsupernatanter udvindes ved filtrering og 10 holdes ved 4°C forud for yderligere rensning.

Forskellige mammale cellekultursystemer eller insektcellekultursystemer kan anvendes til ekspression af rekombinant protein. En oversigt over Baculovirus-systemer til fremstilling af heterologe proteiner i insektceller gives af Luckow og Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).

15 Blandt eksempler på egnede mammale værtscellelinier er COS-7 linierne af abenyreceller, der er beskrevet af Gluzman (Cell 23:175, 1981), og andre cellelinier, som er i stand til at udtrykke en passende vektor, herunder fx. L-celler, C127, 3T3, kinesisk hamsterovarie (CHO), HeLa og BHK-cel-lelinier. Mammale ekspressionsvektorer kan omfatte ikke-transkriberede 20 elementer såsom et replikationsområde, en passende promotor og forstærker koblet til genet, som skal udtrykkes, og andre 5'- eller 3'-flanke-rende ikke-transkriberede sekvenser og ikke-translaterede 5'- eller 3'-sekvenser såsom nødvendige ribosombindingssteder, polyadenyleringssted, spaltningsdonor- og acceptorsteder og transkriptionstermineringssekven-25 ser.

Transkriptions- og translationskontrolsekvenser i ekspressionsvektorer, som skal anvendes til transformering af vertebratceller, kan leveres af viruskilder. For eksempel hidrører almindeligt anvendte promotorer og forstærkere fra Polyoma, Adenovirus 2, Simian-virus 40 (SV40) 30 og humant cytomegalovirus. DNA-sekvenser hidrørende fra SV40-virusgeno-met, fx. $V40-området, tidlig og sen promotor, forstærker, spaltnings-og polyadenyleringssteder, kan anvendes til tilvejebringelse af de andre genetiske elementer, som kræves for ekspression af en heterolog DNA-se-kvens. Den tidlige og den sene promotor er specielt værdifulde, fordi de 35 begge let opnås ud fra viruset som et fragment, der også indeholder SV40-virusreplikationsområdet (Fiers et al., Nature 273:113, 1978).

Mindre eller større SV40-fragmenter kan også anvendes, forudsat at den sekvens på ca. 250 bp, som strækker sig fra Hind III-stedet i retning DK 175583 B1 16 mod Bgll-stedet, som befinder sig i virusrepli kationsområdet, inkluderes. Yderligere kan mammale genomiske IL-4R promotor-, kontrol- og/eller signal sekvenser anvendes, forudsat at sådanne kontrolsekvenser er kompatible med den valgte værtscelle. Yderligere detaljer vedrørende brugen 5 af en mammal højespressionsvektor til frembringelse af en rekombinant mammal IL-4 receptor er anført i eksempel 8 nedenfor. Eksempel vi se vektorer kan konstrueres som beskrevet af Okayama og Berg (Mol. Cell. Biol.

3:280, 1983).

Et almindeligt system til stabil højniveauekspression af mammale 10 receptor-cDNA'er i murine Cl27 brystepitel cel ler kan konstrueres i det væsentlige som beskrevet af Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986).

En særligt foretrukke eukaryotisk vektor til ekspression af IL-4R DNA beskrives nedenfor i eksempel 2. Denne vektor, omtalt som pCAV/NOT, blev afledt af den mammale højekspressionsvektor pDC201 og indeholder 15 regulatoriske sekvenser fra SV40, adenovirus-2 og human cytomegalovirus. pCAV/NOT indeholdende en human IL-7 receptorindføring, er deponeret ved American Type Culture Collection (ATCC) under løbenummer 68014.

Rensede mammale IL-4 receptorer eller analoger fremstilles ved dyrkning af passende vært/vektorsystemer til udtrykning af de rekombi-20 nante translationsprodukter af DNA'erne ifølge opfindelsen, som derefter oprenses fra kulturmedier eller celleekstrakter.

For eksempel kan supernatanter fra systemer, som udskiller rekombinant protein i kulturmedier, først koncentreres under anvendelse af et i handelen tilgængeligt proteinkoncentreringsfilter, fx. en Amicon eller 25 Millipore Pellicon ultrafiltreringsenhed. Efter koncentreringstrinnet kan koncentratet sættes til en passende rensningsmatrix. For eksempel kan en passende affinitetsmatrix omfatte et IL-4- eller lectin- eller antistofmolekyle bundet til en passende bærer. Også en anionbytterhar-piks, fx. en matrix eller et substrat med diethylaminoethyl (DEAE) side-30 grupper, kan anvendes. Matrixerne kan være acrylamid, agarose, dextran, cellulose eller andre typer, som er almindeligt anvendt til proteinrensning. Der kan også anvendes et kationbytningstrin. Blandt egnede kation-byttere er forskellige uopløselige matrixer med sulfopropyl- eller car-boxymethylgrupper. Sulfopropylgrupper foretrækkes.

35 Endelig kan der til yderligere rensning af et IL-4R præparat an vendes et eller flere reversfase-højeffektivitetsvæskekromatografi (RP-HPLO) trin, hvortil der anvendes hydrofobe RP-HPLC medier, fx. silicagel med methyl- eller andre alifatiske sidegrupper. Nogle af eller alle de DK 175583 B1 17 foregående rensningstrin kan også i forskellige kombinationer anvendes til at give et homogent rekombinant protein.

I bakteriekultur fremstillet rekombinant protein isoleres sædvanligvis ved indledende ekstraktion fra cellepellets efterfulgt af et el-5 ler flere trin til koncentrering, udsaltning, vandig ionbytnings- eller størrelsesudelukkelseskromatografi. Endelig kan højeffektiv væskekromatografi (HPLC) anvendes som afsluttende rensningstrin. Mikrobielle celler anvendt ved ekspression af rekombinant mammal IL-4R kan sprænges ved hjælp af en hvilken som helst hensigtsmæssig metode, herunder fryse-op-10 tøningscykler, lydbehandling, mekanisk sønderdeling eller brug af celle-lyseringsmidler.

Fermentering af gær, som udtrykker mammal IL-4R som et udskilt protein, forenkler rensningen stærkt. Udskilt rekombinant protein stammende fra en fermentering i stor skala, kan renses ved fremgangsmåder analoge 15 med de af Urdal et al. (J. Chromatog. 295:171, 1984) beskrevne. Denne reference beskriver to sekventielle reversfase-HPLC-trin til rensning af rekombinant human IL-2 på en præparativ HPLC-søjle.

Human IL-4 syntetiseret i rekombinant kultur, er karakteriseret ved tilstedeværelsen af ikke-humane cellekomponenter, herunder proteiner, i 20 mængder og af en karakter, som vil afhænge af de rensningstrin, som er benyttet til udvinding af human 1L-4R fra kulturen. Disse komponenter vil almindeligvis være af gær-, prokaryotisk eller ikke-human højere eukaryotisk oprindelse, og forefindes fortrinsvis i uskadelige kontami-nantmængder af størrelsesordenen mindre end ca. 1 vægtprocent. Yderiige-25 re muliggør rekombinant cellekultur fremstilling af IL-4R, som er fri for proteiner, der normalt vil være knyttet til IL-4R, således som det forekommer i naturen i dets oprindelsesarter, fx. i celler, celleexuda-ter eller legemsfluider.

IL-4R præparater fremstilles til administrering ved blanding af IL-30 4R med den ønskede renhedsgrad med fysiologisk acceptable bærere. Sådanne bærere vil være ikke-toxiske for recipienter ved de anvendte doser og koncentrationer. I almindelighed medfører fremstillingen af sådanne præparater kombinering af II-4R med puffere, antioxidanter såsom ascorbin-syre, polypeptider med lav molekylvægt (mindre end ca. 10 rester), pro-35 teiner, aminosyrer, carbohydrater, herunder glucose, saccharose eller dextriner, cheleringsmidler såsom EDTA, glutathion og andre stabiliseringsmidler og excipienser.

IL-4R præparater kan anvendes til regulering af B-cellers funktion.

DK 175583 B1 18

For eksempel inhiberer opløseligt 1L-4R (s IL-4R) den af IL-4 i nærvær af anti-Ig fremkaldte proliferation af B-cellekulturer. sIL-4R inhiberer også IL-4 induceret IgGl-sekretion ved LPS-aktiverede B-celler bestemt ved isotypespecifik ELISA og inhiberer IL-4 induceret la ekspression på 5 murine B-celler bestemt ved EPICS-analyse. sIL-4R inhiberer også IL-4 induceret IgE-syntese og kan følgelig anvendes til behandling af IgE-inducerede umiddelbare hypersensibilitetsreaktioner såsom allergisk rhinitis (almindlige høfeber), bronkial astma, atopisk dermatitis og gastrointestinal fødevareallergi.

10 IL-4R præparater kan også anvendes til regulering af funktionen af T-celler. For eksempel inhiberer IL-4R IL-4 induceret proliferation af T-celler såsom CTLL T-cel 1 elinien. sIL-4R inhiberer også funktionel aktivitet medieret af endogent fremstillet IL-4. For eksempel inhiberer s IL-4R genereringen af alloreaktive cytolytiske T-lymfocyter (CTL) i se-15 kundær blandet leukocytkultur ved tilstedeværelse i kultur sideløbende med et monoklonalt antistof over for IL-2 såsom S4B6. Neutraliseringsmidler for både IL-2 og IL-4 anvendes til inhibering af endogen IL-2 og IL-4, der begge regulerer CTL-generering og produceres i sådanne kulturer.

20 Til terapeutiske anvendelser administreres en terapeutisk virksom mængde af et IL-4 receptorpræparat til et pattedyr, fortrinsvis et menneske, i forbindelse med en farmaceutisk bærer eller diluent.

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler.

25 Eksempel 1

Bindingsanalyser for IL-4 receptor A. Radiomærkning af IL-4

Rekombinant murin og human IL-4 udtryktes i gær og rensedes til ho-30 mogenitet som beskrevet af hhv. Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5267, og Park et al., J. Exp. Med. 166:476 (1987). Det rensede protein radiomærkedes under anvendelse af et i handelen tilgængeligt enzy-mobeadradio-ioderingsmiddel (BioRad). Ved denne procedure kombineres 2,5 μq rIL-4 i 50 /il 0,2 M natriumphosphat, pH 7,2, med 50 /il enzymobeadrea-35 gens, 2 MCi natriumiodid i 20 /il 0,05 M natriumphosphat, pH 7,0, og 10 /xl 2,5% b-D-glucose. Efter 10 minutter ved 25°C tilsattes natriumazid (10 /il af 50 mM) og natri ummetabi sul fit (10 μ! af 5 mg/ml), og inkubation fortsattes i 5 minutter ved 25°C. Reaktionsblandingen fraktionere- DK 175583 B1 19 des ved gel filtrering på et 2 ml lejevolumen af Sephadex® G-25 (Sigma) ækvilibreret i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium indeholdende 2,5% (vægt/vol umen) bovint serumalbumin (BSA), 0,2% (vægt/volu-men) natriumazid og 20 mM Hepes, pH 7,4 (bindingsmedium). Den samlede 5 portion af 1251-IL-4 fortyndedes til en forrådsopløsning på 2 x 10‘8 M i bindingsmedium og opbevaredes i op til 1 måned ved 4°C uden påviseligt tab af receptorbindingsaktivitet. Den specifikke aktivitet er rutinemæssigt i området fra 1-2 x 1016 cpm/mmol IL-4.

10 B. Binding til adhærente celler

Bindingsanalyser under anvendelse af celler dyrket i suspensionskultur (dvs. CTLL og CTLL-19.4) udførtes ved en phthalatolieadski11 el -sesmetode (Dower et al., J. Immunol. 132:751, 1984), i det væsentlige som beskrevet af Park et al., J. Biol. Chem. 261:4177, 1986, og Park et 15 al., se ovenfor. Bindingsanalyser udførtes også på COS-celler transfice-ret med en mammal ekspressi onsvektor indeholdende cDNA, der koder for et IL-4 receptormolekyle. Til Scatchard-analyse af binding til adhærente celler transficeredes COS-celler med plasmid-DNA iht. den af Luthman et al., Nucl. Acids. Res. 11:1295, 1983, og McCutchan et al., J. Natl.

20 Cancer Inst. 41:351, 1968, beskrevne fremgangsmåde. Otte timer efter transfektion trypsiniseredes cellerne og genpodedes på plader med seks brønde (Costar, Cambridge, MA) ved en densitet på 1 x 104 COS-IL-4 re-ceptortransfektanter/brønd, blandet med 5 x 105 COS-kontrol transficerede celler som bærere. To dage senere analyseredes monolag for 125I-IL-4 25 binding ved 4°C, i det væsentlige iht. den af Park et al., J. Exp. Med. 166:476, 1987, beskrevne metode. Ikke-specifik binding af 125I-IL-4 måltes i nærvær af et 200-fold eller større molært overskud af umærket IL-4. Natriumazid (0,2%) inkluderedes i alle bindingsanalyser til i nhi be-ring af internalisering af 125I-IL-4 i celler ved 37°C.

30 Til analyse af inhibering af binding med opløselig IL-4R høstedes supernatanter fra COS-celler, transficeret med rekombinante IL-4R konstruktioner, tre dage efter transfektion. Tofoldige seriefortyndinger af konditionerede medier præ-inkuberedes med 3 x 10’^8M 125I-IL-4 (med en specifik aktivitet på ca. 1 x 1016 cpm/mmol) i 1 time ved 37°C før ti 1 -35 sætningen af 2 x 106 CTLL-celler. Inkubation fortsattes i 30 minutter ved 37°C før adskillelse af fri og cellebundet murin 1Z5I-IL-4.

DK 175583 B1 20 C. Fastfasebindingsanalyser IL-4 receptors evne til at blive stabilt absorberet til nitrocellulose fra detergentekstrakter af CTLL 19.4 celler, men alligevel bibeholde IL-4 bindingsaktivitet, tilvejebragte en metode til overvågning af 5 rensning. 1 ml portioner af celleekstrakter (se eksempel 3), IL-4 affinitetskolonnefraktioner (se eksempel 4) eller andre prøver anbragtes på tørre BA85/21 nitrocellulosemembraner (Schleicher og Schuell, Keene, NH) og fik lov til at tørre. Membranerne inkuberedes i vævskulturskåle i 30 minutter i Tris (0,05 M) pufferindstillet saltvand (0,15 M), pH 7,5, in-10 deholdende 3% vægt/volumen BSA, til blokering af non-specifikke bindingssteder. Membranen dækkedes dernæst med 4 x 1011 M 125I-lL-4 i PBS + 3% BSA med eller uden et 200-fold molært overskud af umærket IL-4 og inkuberedes i 2 timer ved 4°C under omrystning. Ved afslutningen af dette tidsrum vaskedes membranerne 3 gange i PBS, tørredes og anbragtes på 15 Kodak X-0mat“ AR film i 18 timer ved -70°C.

Eksempel 2

Udvælgelse af CTLL-celler med høj IL-4 receptorekspression ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) 20 Den foretrukne cellelinie til opnåelse af høj IL-4 receptorudvæl gelse er CTLL, en murin IL-2-afhængig cytotoxisk T-cellelinie (ATCC TIB 214). Til opnåelse af højere niveauer af IL-4 receptorekspression sorteredes CTLL-celler (ophavsceller) under anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesortering og fluorescein-konjugeret rekombinant murin IL-4 25 (rmIL-4), hvorved det overskydende carbohydrat, bundet til rmIL-4 af gærværten, med fordel blev anvendt ved kobling af fluorescein-hydrazid til periodat-oxiderede sukkerdele. Den fluorescein-konjugerede IL-4 fremstilledes ved kombination af portioner af hyperglycosyleret rmIL-4 (300 pg i 300 pi 0,1 M citrat-phosphatpuffer, pH 5,5) med 30 pi 10 mM 30 natrium-m-periodat (Sigma), frisk fremstillet i 0,1 M citrat-phosphat, pH 5,5, og blandingen inkuberedes ved 4°C i 30 minutter i mørke. Reaktionsblandingen tilsattes 30 pi 0,1 M glycerol og dialyseredes i 18 timer ved 4°C over for 0,1 M citrat-phosphat, pH 5,5. Efter dialyse sattes et 1/10 volumen af 100 mM 5-(((2-(carbohydrazino)methy1)thio)acetyl)-35 aminofluorescein (Molecular Probes, Eugene OR), opløst i DMS0, til prøven og inkuberedes ved 25°C i 30 minutter. IL-4-fluoresceinet dialyseredes derefter indgående ved 4°C over for PBS, pH 7,4, og proteinkoncentration bestemtes ved aminosyreanalyse. Slutproduktet opbevaredes ved DK 175583 B1 21 4°C efter tilsætning af 1% (vægt/vol urnen) BSA og steril fil trering.

Til sortering inkuberedes CTLL-celler (5 x 106) i 30 minutter ved 37°C i 150 μΐ PBS + 1% BSA indeholdende 1 x 10’9 M IL-4 fluorescein under sterile betingelser. Blandingen afkøledes dernæst til 4°C, vaskedes 5 én gang i et stort volumen PBS + 1% BSA og sorteredes under anvendelse af et EPICS® C fl owcytometer (Coulter Instruments). Cellerne, der tilvejebragte det højeste fluorescenssignalniveau (top 1,0%), opsamledes og kombineredes, og populationen ekspanderedes i flydende cellekultur. Alternativt, til enkeltcellekloning, sorteredes celler, der udviste et 10 fluorescenssignal på toppen 1,0%, i vævskul tur-mi krotiterplader med 96 brønde, med 1 celle pr. brønd.

Forløbet overvågedes ved udførelse af bindingsanalyse med 125I-IL-4 efter hver runde FACS-udvælgelse. Usorterede CTLL-celler (CTLL-ophav) udviste typisk 1000-2000 IL-4 receptorer pr. celle. CTLL-celler underka-15 stedes 19 runder FACS-udvælgelse. De endeligt udvalgte CTLL-celler (CTLL-19) udviste 5 x 105 til 1 x 106 IL-4 receptorer pr. celle. På dette punkt underkastedes CTLL-19 populationen enkeltcellekloning ved hjælp af EPICS® C, og individuelle klonale populationer ekspanderedes og testedes for 1251-IL-4 binding. En enkelt klon, betegnet CTLL-19.4, udvi-20 ste 1 x 106 IL-4 receptorer pr. celle og udvalgtes til rensnings- og kloningsundersøgelser. Selvom de to linier har lignende beregnede tilsyneladende K -værdier, udtrykker CTLL-19.4 ca. 400-fold flere receptorer på sin overflade end CTLL-ophavet.

25 Eksempel 3

Detergentekstraktion af CTLL-celler CTLL 19.4 celler opbevaredes i RPMI 1640 indeholdende 10% føtalt bovint serum, 50 U/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin og 10 ng/ml re-kombinant human IL-2. Celler dyrkedes til 5 x 105 celler/ml i rullefla-30 sker, høstedes ved centrifugering, vaskedes to gange i serumfri OMEM og sedimenteredes ved 2000 x g i 10 minutter til dannelse af en sammenpresset pellet (ca. 2 x 108 celler/ml). Til pelleten sattes et lige så stort volumen PBS indeholdende 1% Triton® X-100 og en blanding af proteasein-hibitorer (2 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 10 /zM pepstatin, 10 βΜ leu-35 peptin, 2 mM o-phenanthrolin og 2 mM EGTA). Cellerne blandedes med ekstraktionspufferen ved kraftig hvirvling, og blandingen inkuberedes på is i 20 minutter, hvorefter blandingen centrifugeredes ved 12.000 x g i 20 minutter ved 8°C til fjernelse af cellekerner og andet affald. Superna- DK 175583 B1 22 tanten anvendtes enten med det samme eller opbevaredes ved —70°C indtil brug.

Eksempel 4 5 IL-4 receptorrensning ved IL-4 affinitetskromatografi

Til opnåelse af tilstrækkelige mængder murin IL-4R til bestemmelse af dens N-terminal sekvens eller til yderligere karakterisering af human IL-4R rensedes protein opnået fra detergentekstraktionen af celler yderligere ved affinitetskromatografi. Rekombinant murin eller human IL-4 10 kobledes til Affigel®-10 (BioRad) iht. producentens forslag. For eksempel sattes 1,0 ml vasket Affigel®-10 til en opløsning af IL-4 (3,4 mg/ml i 0,4 ml 0,1 M Hepes, pH 7,4). Opløsningen vuggedes natten over ved 4°C, og en portion af supernatanten testedes for protein ved en BioRad pro-teinalayse iht. producentens anvisninger under anvendelse af BSA som 15 standard. Mere end 95% af proteinet var blevet koblet til gelen, hvilket tyder på, at kolonnen havde en slutfyldning på 1,3 mg IL-4 pr. ml gel. Glycinethylester tilsattes til en slutkoncentration på 0,05 M til blokering af eventuelle uomsatte steder på gelen. Gelen vaskedes grundigt med PBS-1% Triton® efterfulgt af 0,1 Glycine-HCl, pH 3,0. En 0,8 x 4,0 cm 20 kolonne fremstilledes med IL-4 koblet Affigel® fremstillet som beskrevet (4,0 m/1ejevolumen) og vaskedes med PBS indeholdende 1% Triton ® X-100 til rensning af murin IL-4R. Som alternativ inkuberedes 50 μΐ portioner af 20% suspension af IL-4 koblet Affigel® med 35S-cystein/methionin-mær-kede celleekstrakter til affinitetsrensning og gelelektroforese i lille 25 målestok.

Portioner (25 ml) af detergent-ekstraheret IL-4 receptor bærende CTLL 19.4 celler sattes langsomt til den murine IL-4 affinitetskolonne ved 4°C (strømningshastighed på 3,0 ml/time). Kolonnen vaskedes dernæst sekventielt med PBS indeholdende 1% Triton® X-100, RIPA-puffer {0,05 M 30 Tris, 0,15 M NaCl, 1% NP-40, 1% deoxycholat og 0,1% SDS), PBS indeholdende 0,1% Triton® X-100 og 10 mM ATP, og PBS med 1% Triton® X-100 til fjernelse af alt forurenende materiale undtagen mIL-4R. Kolonnen eluere-des dernæst med pH 3,0 glycin HC1 puffer indeholdende 0,1% Triton® X-100 til fjernelse af IL-4R'en og vaskedes derefter med PBS indeholdende 0,1% 35 Triton® X-100. 1 ml fraktioner opsamledes til eluering, og 2 ml fraktioner opsamledes under vaskningen. Umiddelbart efter eluering neutraliseredes prøver med 80 μΐ 1 M Hepes, pH 7,4. Tilstedeværelsen af receptor i fraktionerne bestemtes ved fastfase-bindingsanalyse som beskrevet oven- DK 175583 B1 23 for under anvendelse af lZ5I-mærket IL-4. Portioner fjernedes fra hver fraktion til analyse ved SDS-PAGE, og resten blev nedfrosset ved -70°C indtil brug. Til SDS-PAGE sattes 40 μΐ af hver kolonnefraktion til 40 μ] 2 X SDS prøvepuffer (0,125 M Tris HC1, pH 5,8, 4% SDS, 20% glycerol, 10% 5 2-mercaptoethanol). Prøverne anbragtes i et kogende vandbad i 3 minutter, og 80 μΐ portioner anbragtes i prøvebrønde med 10% polyacrylamidgel , idet forsøget opstilledes og udførtes iht. den af Laemmli (Nature 227:680, 1970) beskrevne fremgangsmåde. Efter elektroforese sølvfarvedes gelerne som tidligere beskrevet af Urdal et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.

10 USA 81:6481, 1984).

Rensning iht. fremgangsmåden ovenfor tillod identifikation ved sølvfarvning af polyacrylamidgel er af to mIL-4R proteinbånd på gennemsnitlig 45-55 kDa og 30-40 kDa, der var til stede i fraktioner, som udviste IL-4 bindingsaktivitet. Forsøg, hvori celleoverfladeproteinerne af 15 CTLL 19.4 celler radiomærkedes, og 125I-mærket receptor rensedes ved affinitetskromatografi, tydede på, at disse to proteiner blev udtrykt på celleoverfladen. Forholdet mellem båndene med lavere og højere molekylvægt forøgedes ved opbevaring af fraktioner ved 4°C, hvilket tydede på et prækursorproduktforhold, der muligvis skyldes langsom proteolytisk 20 nedbrydning. Det ved fremgangsmåden ovenfor rensede mIL-4 receptorprotein kan stadig binde IL-4, både i opløsning og når den er adsorberet til nitrocellulose.

Eksempel 5 25 Sekvensbestemmelse af IL-4 receptorprotein CTLL 19.4 mIL-4 receptorholdige fraktioner fra mIL-4 affinitetskolonnerensning forberedtes til aminoterminalproteinsekvensanalyse ved fraktionering på SDS-PAGE gel og overførtes derefter til en PVDF-mem-bran. Før proteinfraktionerne sendtes gennem polyacrylamidgel er var det 30 nødvendigt at fjerne resterende detergent fra affinitetsrensningsprocessen. Til mIL-4 affinitetskolonnen bundne fraktioner indeholdende proteiner fra tre præparater optøedes og koncentreredes individuelt under vakuum i et hurtigtvirkende vakuumanlæg til et slutvolumen på 1 ml. De koncentrerede fraktioner indstilledes dernæst til pH 2 ved tilsætning af 35 50% (volumen/volumen) TFA og indsprøjtedes i en Brownlees RP-300 revers fase HPLC-kolonne (2,1 x 30 mm) ækvilibreret med 0,1% (volumen/volumen) TFA i H^O ved en strømningshastighed på 200 μΐ/minut på en Hewlett Packard Model 1090M HPLC. Kolonnen vaskedes med 0,1% TFA i H20 i 20 mi- DK 175583 B1 24 nutter efter indsprøjtning. HPLC-kolonnen, der indeholdt det bundne protein, fremkaldtes derefter med en gradient som følger:

Tid % acetonitril i 0,1% TFA

5 _ 0 0 5 30 15 30 25 70 10 30 70 35 100 40 0 1 ml fraktioner opsamledes hvert femte minut og analyseredes for 15 tilstedeværelsen af protein ved SDS-PAGE efterfulgt af sølvfarvning.

Hver fraktion opnået ved HPLC inddampedes til tørhed i et hurtigtvirkende vakuumanlæg og resuspenderedes dernæst i Laemmli-reduktionsprøvepuffer, fremstillet som beskrevet af Laemmli, U.K. Nature 227,680, 1970. Prøver sattes til en 5-20% gradient Laemmli SDS gel og kromatogra-20 feredes ved 45 mA, indtil farvefronten nåede gelens bund. Gelen overførtes derefter til PVDF-papir og farvedes som beskrevet af Matsudaira, J.

Biol. Chem. 262:10035, 1987. Farvningsbånd identificeredes tydeligt i fraktioner fra hver af de tre præparater ved ca. 30.000 til 40.000 M .

Båndene fra den tidligere PVDF-blotting blev udskåret og underka-25 stet automatiseret Edman-nedbrydning på et Applied Biosystems Model 477A proteinsekvensbestemmelsesapparat, i det væsentlige som beskrevet af March et al. (Nature 315:641, 1985), bortset fra, at PTH-aminosyrer indsprøjtedes automatisk og analyseredes on line med en Applied Biosystems Model 120A HPLC under anvendelse af en gradient og et påvisningssystem, 30 der stammede fra producenten. Følgende aminoterminalsekvens bestemtes ud fra sekvensbestemmelsesresultaterne: NH2-Ile-Lys-Val-Leu-Gly-Glu-Pro-Thr-Cys/Asn-Phe-Ser-Asp-Tyr-Ile. Båndene fra det andet præparat, der anvendtes til aminoterminalsekvensbestemmelse, behandledes med CNBr under anvendelse af den af March et al. (Nature 315:641, 1985) beskrevne in 35 situ teknik til spaltning af proteinet efter interne methioninrester. Sekvensbestemmelse af de resulterende spaltningsprodukter gav følgende data, der viser, at CNBr spaltede proteinet efter to indre methioninrester: DK 175583 B1 25

Kode Iagttagne rester 51 Val, Ser 2 Gly, Leu 3 Ile, Val 4 Tyr, Ser 5 Arg, Tyr 10 6 Glu, Thr 7 Asp, Ala 8 Asn, Leu 9 Pro, Val 10 Ala 15 11 Glu, Val 12 Phe, Gly 13 Ile, Asn 14 Val, Gin 15 Tyr, Ile 20 16 Lys, Asn 17 Val, Thr 18 Thr, Gly 25 Ved sammenligning med de af klonerne 16 og 18 (se fig. 2) afledte proteinsekvenser matchede sekvenserne som følger: 15 10 15 18

Sequence 1: (Met)-Val-Asn-Ile-Ser-Arg-Glu-Asp-Asn-Pro-Ala-Glu-Phe-lle-Val-Tyr-Asn-Val-Thr ,A 1 5 10 15 18 30 Sequence 2: (Met)-Ser-Gly-Val-Tyr-Tyr-Thr-Ala-Arg-Val-Arg-Val-Arg-Ser-Gln-!le-Leu-Thr-Gly

Identiske matches blev fundet for alle positioner af sekvens 1 med undtagelse af Asn(2), og sekvens 2 med undtagelse af Arg ved positioner-35 ne 8, 10 og 12, Ser ved position 13 og Leu ved position 16. De ovenfor anførte sekvenser svarer til aminosyreresterne 137-154 og 169-187 i fig.

2.

DK 175583 B1 26

Desuden matchede aminoterminalsekvensen til en sekvens afledt af klonen, hvor position 9 var defineret som Cys.

De ovenfor anførte data støtter den konklusion, at klonerne 16 og 18 er afledt af budskabet for IL-4 receptoren.

5

Eksempel 6

Syntese af hybrid-subtraheret cDNA-probe

Til screening af et bibliotek for kloner, der koder for en murin IL-4 receptor, opnåedes en stærkt beriget IL-4 receptor cDNA-probe under 10 anvendelse af en subtraktiv hybridiseringsstrategi. Polyadenyleret (po-lyA+) mRNA isoleredes fra to lignende cellelinier, ophavscellelinien CTLL (der udtrykker ca. 2.000 receptorer pr. celle) og den sorterede cellelinie CTLL 19.4 (der udtrykker 1 x 106 receptorer pr. celle). mRNA-indholdet af disse to cellelinier forventes at være identisk med undtag-15 else af det relative niveau for IL-4 receptor mRNA. Dernæst fremstilledes et radiomærket enkeltstrenget cDNA-præparat ud fra mRNA'et af den sorterede cellelinie CTLL 19.4 ved revers transkription af polyadenyleret mRNA fra CTLL 19.4 celler ved en fremgangsmåde lig den der er beskrevet af Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold 20 Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). I korte træk blev polyA+ mRNA renset som beskrevet af March et al. (Nature 315:641-647, 1985) og kopieret i cDNA ved revers transkriptase under anvendelse af oligo dT som primer. Til opnåelse af et højt niveau af 32P-mærkning af cDNA'et anvendtes 100 /iCl 32P-dCTP (s.a.=3000 Ci/mmol) i en 50 /il reaktionsbland-25 ing med ikke-radioaktivt dCTP ved 10 pM. Efter revers transkription ved 42°C i 2 timer tilsattes EDTA til 20 mM, og RNA'et hydrolyseredes ved tilsætning af NaOH til 0,2 M og inkubering af cDNA-blandingen ved 68°C i 20 minutter. Det enkeltstrengede cDNA ekstraheredes med en phenol/chlo-roform (50/50) blanding, der forud var ækvilibreret med 10 mM Tris-Cl, 1 30 mM EDTA. Den vandige fase overførtes til et rent testrør og gjordes igen alkalisk ved tilsætning af NaOH til 0,5 M. cDNA'et størrelsesfraktioneredes derefter ved kromatografi på en 6 ml Sephadex® G50 kolonne i 30 mM NaOH og 1 mM EDTA til fjernelse af kontaminanter med lav molekylvægt.

Det resulterende størrelsesfraktionerede cDNA fremstillet ud fra de 35 sorterede CTLL 19.4 celler hybridiseredes dernæst med et overskud af mRNA fra de usorterede CTLL ophavsceller ved ethanol-præcipitering af cDNA'et fra CTLL 19.4 celler med 30 μg polyA+ mRNA isoleret fra usorterede CTLL-celler, resuspenderedes i 16 μΐ 0,25 M NaPO^, pH 6,8, 0,2% DK 175583 B1 27 SDS, 2 mM EDTA og inkuberedes i 20 timer ved 68°C. cDNA'erne fra de sorterede CTLL 19.4 celler, der er komplementære til mRNA'er fra de usorterede CTLL-celler, danner dobbeltstrengede cDNA/mRNA-hybrider, der derefter kan adskilles fra det enkeltstrengede cDNA på basis af deres for-5 skellige bindingsaffiniteter på hydroxyapatit. Blandingen blev fortyndet med 30 volumener 0,02 M NaPO^, pH 6,8, bundet til hydroxyapatit ved stuetemperatur, og enkeltstrenget cDNA blev derefter elueret fra harpiksen ved 60°C med 0,12 M NaPO^, pH 6,8, som beskrevet af Sims et al.,

Nature 312:541, 1984. Dernæst fjernedes phosphatpuffer ved centrifuge-10 ring over 2 ml Sephadex® G50 centri fugeri nskolonner i vand. Denne hybridsubtraktionsprocedure fjerner hovedparten af almindelige sekvenser mellem CTLL 19.4 og usorterede CTLL celler og efterlader en enkelt-strenget cDNA-blånding, som er beriget med radiomærket IL-4 receptor cDNA, der kan anvendes til probning af et cDNA-bibliotek (som beskrevet 15 nedenfor).

Eksempel 7

Syntese af cDNA-bibliotek og plaque-screening

Et cDNA-bibliotek konstrueredes ud fra polyadenyleret mRNA isoleret 20 fra CTLL 19.4 celler under anvendelse af standardteknikker (Gubier et al., Gene 25:263, 1983, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, bind 1, 1987). Efter revers transkription under anvendelse af oligo dT som primer gjordes det enkeltstrengede cDNA dobbeltstrenget med DNA-polymerase I, gjordes stumpendet med T4 DNA polyme-25 rase, metbyleredes med EcoRI methylase til beskyttelse af EcoRI spaltningssteder i cDNA'et og ligeredes til EcoRI linkere. De resulterende konstruktioner blev nedbrudt med EcoRI til fjernelse af alle kopier af linkerne med undtagelse af én ved hver ende af cDNA'et og ligeret til en ækvimolær koncentration af EcoRI-skårne og dephosphorylerede AZAP®-arme, 30 og den resulterende ligationsblanding pakkedes in vitro (Gigapack®) iht. producentens anvisninger. Andre egnede fremgangsmåder og reagenser til frembringelse af cDNA-biblioteker i λ fag vektorer er beskrevet af Huynh et al., DNA Cloning Techniques: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1984), Meissner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4171 (1987) og 35 Ausubel et al., ovenfor. λΖΑΡ® er en fag λ kloningsvektor, der ligner Agt11 (US patentskrift nr. 4.788.135), indeholdende plasmidsekvenser fra pUC19 (Norrander et al., Gene 26:101, 1987), et polylinkersted, der befinder sig i et lacZ-gen fragment, og et fl fag replikationsområde, der DK 175583 B1 28 tillader udvinding af ssDNA, når værtsbakterier superinficeres med fl hjælper-fag. DNA udskæres i form af et plasmid, der omfatter de ovenfor anførte elementer, betegnet Bluescript®. Gigapack® er en lydbehandlet E. coli ekstrakt anvendt til pakning af λ fag DNA. λΖΑΡ®, Bluescript® og 5 Gigapack® er registrerede varemærker tilhørende Stratagene, San Diego, CA, USA.

Det radiomærkede hybrid-subtraherede cDNA fra eksempel 6 anvendtes derefter som probe til screening af cDNA-biblioteket. Det forstærkede bibliotek udpladedes på BB4-celler ved en densitet på 25.000 plaquer på 10 hver af 20 150 mm plader og inkuberedes natten over ved 37°C. Alle manipulationer af λΖΑΡ® og udskæring af Bluescript®-plasmidet blev udført som beskrevet af Short et al. (Nucl. Acids Res. 15:7583, 1988) og i Stratagene's produktliteratur. Dupiikat-plaqueløftefiltre inkuberedes med hybrid-subtraherede cDNA-prober fra eksempel 6 i hybridiseringspuf-15 fer indeholdende 50% formamid, 5 X SSC, 5 X Denhardt's reagens og 10% dextransulfat ved 42°C i 48 timer som beskrevet af Wahl et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 76:3583, 1979. Filtrene vaskedes så ved 58°C i 0,2 X SCC. 15 positive plaquer oprensedes til yderligere analyse.

Bluescript®-plasmider indeholdende cDNA-indføjelserne blev udskåret 20 fra fagen som beskrevet af producenten og transformeret i E. coli. Plasmid DNA blev isoleret fra individuelle kolonier, nedbrudt med EcoRI til frigørelse af cDNA-indføjelserne og behandlet ved elektroforese på 1% agarosestandardgeler. Fire duplikatgeler blottedes på nylonfiltre til fremstilling af identiske Southern blots til analyse med forskellige 25 prober, der var (1) radiomærket cDNA fra usorterede CTLL-celler, (2) radiomærket cDNA fra CTLL 19.4 sorterede celler, (3) hybrid-subtraheret cDNA fra CTLL 19.4 sorterede celler, og (4) hybrid-subtraheret cDNA fra CTLL 19.4 sorterede celler efter en anden runde hybridisering til poly A+ mRNA fra en IL-4 receptor-negativ musecellelinie (LBRM 33 1A5B6).

30 Disse prober blev i stigende grad beriget med cDNA-kopier af mRNA, der er specifik for den sorterede cellelinie CTLL 19.4. Blandt de 15 positive plaquer isoleret fra biblioteket udviste fire kloner (11A, 14, 15 og 18) en stigning af signalstyrken parallelt med probens berigelse.

Restriktionskortlægning (vist i fig. 1) og DNA-sekvensbestemmelse 35 af de isolerede CTLL-kloner indikerede eksistensen af mindst to distinkte mRNA-populationer. Begge mRNA-typer har homologe åbne læserammer over det meste af kodningsområdet, men afviger alligevel ved 3'-enden, således at de koder for homologe proteiner med forskellige COOH-terminalse- DK 175583 B1 29 kvenser. DNA-sekvens fra det indre af begge kloners åbne læserammer koder for proteinsekvens, der er identisk med proteinsekvens opnået ved sekvensbestemmelse af renset IL-4 receptor, hvilket er beskrevet mere detaljeret i eksempel 5. Klon 16 og klon 18 anvendtes som prototyper for 5 disse to distinkte budskabstyper. Klon 16 indeholder en åben læseramme, der koder for et 258-aminosyrepolypeptid, som omfatter aminosyrerne -25 til 233 i fig. 2A. Klon 18 koder for et 230-aminosyrepolypeptid, hvis N-terminale 224 aminosyrer er identiske med N-terminalen af klon 16, men afviger ved 3'-enden med nukleotiderne CCAAGTAATGAAAATCTG, der koder for 10 de C-terminale 6 aminosyrer, Pro-Ser-Asn-Glu-Asn-Leu, efterfulgt af en terminationskodon TGA. Begge kloner blev udtrykt i et mammalt ekspressionssystem, som beskrevet i eksempel 8.

Eksempel 8 15 Ekspression af IL-4R i mammale celler A. Ekspression i COS-7 celler

En eukaryotisk ekspressionsvektor pCAV/NOT, vist i fig. 3, blev afledt af den mammale højekspressionsvektor pDC201 beskrevet af Sims et 20 al., Science 241:585, 1988). pDC201 er et derivat af pMLSV, tidligere beskrevet af Cosman et al., Nature 312:768, 1984. pCAV/NOT er udformet til at udtrykke cDNA-sekvenser indføjet ved sit multiple kloningssted (MCS) ved transfektion i mammale celler og omfatter følgende komponenter: SV40 (skraveret kasse) indeholder SV40 sekvenser fra koordinater 25 5171-270 inklusive repli kationsområdet, forstærkersekvenser og tidlige og sene promotorer. Fragmentet er orienteret således, at transkriptions-retningen fra den tidlige promotor er som vist ved pilen. CMV indeholder promotor- og forstærkerområderne fra humant cytomegalovirus (nukleotider -671 til +7 fra sekvensen publiceret af Boshart et al., Cell 41:521-530, 30 1985). Den tredelte leder (stiplet kasse) indeholder den første exon og en del af i ntronen mellem første og anden exon af den tredelte leder af adenovirus-2, den anden exon og en del af tredje exon af den tredelte leder og et multipelt kloningssted (MCS) indeholdende steder for Xho I, Κρη I, Sma I, Not I og Bgl II. pA (skraveret kasse) indeholder SV40 se-35 kvenser fra 4127-4100 og 2770-2533, der omfatter polyadenylerings- og termineringssignaler for tidlig transkription. I retning med uret fra pA findes adenovirus-2 sekvenserne 10532-11156 indeholdende VAI og VAII generne (vist med en sort bjælke), efterfulgt af pBR322 sekvenser (ubrudt DK 175583 B1 30 linie) fra 4363-2486 og 1094-375 indeholdende ampicillinresistensgenet og repl i kationsområdet. Den resulterende ekspressionsvektor betegnedes pCAV/NOT.

Indføjelser i klon 16 og klon 18 blev begge frigjort fra Blue-5 script®-plasmid ved nedbrydning med Asp 718 og Not I. 3,5 kb indføjelsen fra klon 16 blev derefter ligeret direkte ind i ekspressionsvektoren pCAV/NOT, der også blev skåret ved Asp 718 og Not I stederne i polylin-kerområdet. Indføjelsen fra klon 18 blev gjort stumpendet med T4-polyme-rase efterfulgt af ligering i vektor pCAV/NOT, skåret med Sma I og de-10 phosphoryleret.

Plasmid-DNA fra begge IL-4 receptor ekspressionspi asmider anvendtes til transfektion af et subkonfluent lag af abe COS-7 celler under anvendelse af DEAE-dextran efterfulgt af chloroquin-behandling, som beskrevet af Luthman et al. {Nuel.Acids Res. 11:1295, 1983) og McCutchan 15 et al. (J. Natl. Cancer Inst. 41:351, 1968). Cellerne dyrkedes dernæst i kultur i 3 dage for at tillade forbigående ekspression af de indføjede sekvenser. Efter 3 dage analyseredes cel lekultursupernatanter og celle-monolagene (som beskrevet i eksempel 1), og IL-4 binding blev bekræftet.

20 B. Ekspression i CHO-celler IL-4R udtryktes også i den mammale CHO-cel1 el i ni e ved først at ligere et Asp718/NotI-restriktionsfragment fra klon 18 i pCAV/NOT-vektoren som beskrevet i eksempel 8. pCAV/NOT-vektoren, der indeholdt indføjelsen fra klon 18, co-transficeredes derefter under anvendelse af en standard 25 calciumphosphatmetode i CHO-celler, med den dihydrofolatreduktase (DHFR) cDNA-udvælgelige markør under kontrol af den tidlige SV40 promotor. DHFR-sekvensen muliggør methotrexatudvælgelse for mammale celler, der huser plasmidet. DHFR-sekvensforstærkningshændelser i sådanne celler udvalgtes under anvendelse af forhøjede methotrexatkoncentrationer. På 30 denne måde forstærkes også de tilgrænsende DNA-sekvenser, og således opnås forstærket ekspression. Massecellekulturer af transfektanterne udskilte aktiv opløselig IL-4R ved ca. 100 ng/ml.

C. Ekspression i Hela-celler 35 IL-4R udtryktes i den humane HeLa-EBNA cellelinie 653-6, der kon- stitutivt udtrykker EBV nukleært antigen-1 drevet af den umiddelbare tidlige CMV forstærker/promotor. Den anvendte ekspressionsvektor var pHAV-EO-NEO, der er beskrevet af Dower et al., J. Immunol. 142:4314, DK 175583 B1 31 1989), et derivat af pDC201, der indeholder EBV-repli kationsområdet og tillader højniveau-ekspression i 653-6 cellelinien. pHAV-EO-NEO er afledt af pDC201 ved erstatning af den sene adenovirus hovedpromotor med syntetiske sekvenser fra HIV-1, der strækker sig fra -148 til +78 i for-5 hold til kappestedet af det virale mRNA, og omfatter HIV-1 tat genet under kontrol af den tidlige SV-40 promotor. Den indeholder også et Bgl II-Sma I fragment, der indeholder neomycinresi stensgenet fra pSV2NE0 (Southern & Berg, J. Mol. Appl. Genetl:332, 1982) indføjet, i Bgl II og Hpa I stederne og subkloner nedenstrøms for Sal I kloningsstedet. Den 10 resulterende vektor tillader udvælgelse af transficerede celler for neomyci nresi stens.

Et 760 bp IL-4R fragment frigjordes fra Bluescript®-plasmidet ved nedbrydning med EcoNI og SstI restriktionsenzymer. Dette fragment af klon 18 svarer til nukleotiderne 1-672 i fig. 2A, med tilføjelse af 5'-15 terminalnukleotidsekvensen GTGCAGGCACCTTTTGTGTCCCCA, en TGA-stopkodon, der følger nukleotid 672 i fig. 2A, og en 3'-terminalnukleotidsekvens som følger: CTGAGTGACCTTGGGGGCTGCGGTGGTGAGGAGAGCT. Dette fragment gjordes derefter stumpendet under anvendelse af T4 polymerase og subklonedes på Sall stedet i pHAV-EO-NEO. Det resulterende plasmid transficeredes 20 dernæst i 653-6 cellelinien ved en modificeret polybren-transfektionsme-tode som beskrevet af Dower et al. (0. Immunol. 142-4314, 1989), med undtagelse af, at cellerne trypsini seredes 2 dage post-transfektion og spaltedes i et forhold på 1:8 i medier indeholdende G418 (Gibco Co.) ved en koncentration på 1 mg/ml. Kulturmedierne udskiftedes to gange ugent-25 ligt, indtil neomycin-resistente kolonier havde etableret sig. Derefter optoges kolonierne enten individuelt under anvendelse af kloningsringe, eller de kombineredes til frembringelse af flere forskellige cellelinier. Disse cellelinier holdtes under medikamentudvælgelse ved en G418-koncentration på 250 /xg/ml. Når cellerne nåede konfluens, optoges super-30 natanter og testedes ved inhiberingsanalysen beskrevet i eksempel IB. Cellelinier producerede fra 100 ng/ml til 600 ng/ml opløseligt IL-4R protein.

Eksempel 9 35 Ekspression af IL-4R i gærceller

Til ekspression af mIL-4R konstrueredes en gærekspressionsvektor opnået fra pIXY120 som følger. pIXY120 er identisk med pYaHuGM (ATCC 53157), med undtagelse af, at den ikke indeholder nogen cDNA-indføjelse DK 175583 B1 32 og omfatter et polylinker/multipelt kloningssted med et Nco I sted. Denne vektor omfatter DNA-sekvenser fra følgende kilder: (1) et stort Sph I (nukleotid 562) til EcoRI (nukleotid 4361) fragment udskåret fra plasmid pBR322 (ATCC 37017), inklusive replikationsområdet og ampicillinresi-5 stensmarkøren for udvælgelse i E. coli, (2) S. cerevisiae DNA, inklusive TRP-1 markøren, 2μ repl ikationsområdet og ADH2-promotoren, og (3) DNA, der koder for et 85 aminosyre signal peptid afledt af genet, der koder for den udskilte peptid o-faktor (se Kurjan et al., US patentskrift nr. 4.546.082). Et Asp 718 restriktionssted indførtes ved position 237 i o-10 faktor signalpeptidet for at lette fusion til heterologe gener. Dette tilvejebragtes ved ændring af thymidi nresten ved nukleotid 241 til en cytosinrest ved oligonukleotid-styret in vitro mutagenese som beskrevet af Craik, BioTechniques, januar 1985, pp. 12-19. Et syntetisk oligonu-kleotid indeholdende multiple kloningssteder og med den nedenfor anførte 15 sekvens indføjedes fra Asp718 stedet ved aminosyre 179 nær ved 3'-enden af α-faktor signalpeptidet til et Spel-sted i 2μ sekvensen: Αφ718 Stu\ Noo\ BamH\Smal Spe\ gtacctttggataaaagagactacaaggacgacgatgacaagaggcctccatggatcccccgggaca gaaacctattttctctgatgttcctgctgctactgttctccggaggtacctagggggccctgtgatc

20 |<-PolyEnker-»I

pBC120 adskiller sig også fra pYaHuGM ved tilstedeværelsen af et 514 bp DNA-fragment afledt af den enkeltstrengede fag fl indeholdende repli kations- og intergenområderne, der er blevet indføjet på Nrul-stedet i 25 pBR322 sekvensen. Tilstedeværelsen af et fl replikationsområde tillader dannelse af enkeltstrengede DNA-kopier af vektoren ved transformation i passende stammer af E. coli og superinfektion med bakteriofag fl, der letter DNA-sekvensbestemmelse af vektoren og danner grundlag for in vitro mutagenese. Ti) indføjelse af et cDNA nedbrydes pIXY120 med Asp718, 30 der spalter nær ved 3'-enden af α-faktor lederpeptidet (nukleotid 237), og fx. BamHI, der spalter i polylinkeren. Det store vektorfragment renses derefter og ligeres til et DNA-fragment, der koder for proteinet, som skal udtrykkes.

For at skabe en sekretionsvektor til ekspression af mIL-4R blev et 35 cDNA-fragment, der koder for mlL-4R, udskåret fra Bluescript®-plasmidet i eksempel 8 ved nedbrydning med Ppum I og Bgl II til frigørelse af et 831 bp fragment fra Ppum I stedet (se figuren) til et Bgl II sted, der befinder sig på 3'-siden af den åbne læseramme, der indeholder mIL-4R- DK 175583 B1 33 sekvensen, minus de første to 5'-kodoner, der koder for Ile og Lys. pIXY120 blev nedbrudt med Asp718 nær ved 3'-enden af α-faktor lederen og BamHI. Vektorfragmentet li geredes til Ppum I/Bgl II hIL-4R cDNA fragmentet og det følgende fragment skabt ved annelering af et par syntetiske 5 oligonukleotider til genskabelse af de sidste 6 aminosyrer eller cr-fak-tor lederen og de første to aminosyrer af moden mIL-4R.

α-faktor behandling -->|

GTA CCT CTA GAT AAA AGA ATC AAG

JO GA GAT CTA TTT TCT TAG TTC CAG

Val Pro Leu Asp Lys Arg Ile Lys {<—mlL-4Ft 01igonukleotidet omfattede også en ændring fra nukleotidsekvensen TGG 15 ATA til CTA GAT, der indfører et Xbal restriktionssted, uden at ændre aminosyresekvensen, der kodes for.

Den ovenfor beskrevne ekspressionsvektor rensedes dernæst og anvendtes til transformation af en diploid-gærstamme af S. cerevisiae (XV2181) ved standardteknikker såsom dem, der er omhandlet i EPA 20 165.554, til udvælgelse af tryptophanprototropher. De resulterende transformanter dyrkedes til ekspression af et udskilt mIL-4R protein.

Kulturer til analyse for biologisk aktivitet dyrkedes i 20-50 ml YPD-me- dium (1% gærekstrakt, 2% pepton, 1% glucose) ved 37°C til en celledensi tet på 1-5 x 108 celler/ml. Til adskillelse af celler fra medium fjerne-25 des cellerne ved centrifugering, og mediet filtreredes før analyse gennem et 0,45 μπι celluloseacetatfilter. Supernatanter fremstillet af den transformerede gærstamme, eller rå ekstrakter fremstillet ud fra sønder-brudte gærceller transformerede plasmidet og analyseredes til verifikation af ekspression af et biologisk aktivt protein.

30

Eksempel 10

Isolation af uforkortede og forkortede former af murin IL-4 receptor cDNA'er fra usorterede 7B9-celler

Polyadenyleret RNA isoleredes fra 7B9-celler, en antigen-afhængig 35 hjælper T-celle klon afledt af C57BL/6 mus, og anvendtes til konstruktion af et cDNA-bibliotek i AZAP (Stratagene, San Diego) som beskrevet i eksempel 7. λΖΑΡ-biblioteket forstærkedes én gang, og ialt 300.000 pla-quer screenedes som beskrevet i eksempel 7 med undtagelse af, at proben DK 175583 B1 34 var et vilkårligt primet 3ZP-mærket 700 bp EcoRI-fragment isoleret fra CTLL 19.4 klon 16. 13 kloner isoleredes og karakteriseredes ved restriktionsanalyse.

Nukleinsyresekvensanalyse af klon 7B9-2 afslørede, at den indehold-5 er en polyadenyleret hale, et formodet polyadenyleringssignal og en åben læseramme på 810 aminosyrer (vist i fig. 2), hvoraf de første 258 er identiske med dem, der kodes for af CTLL 19.4 klon 16, inklusive den formodede 25 aminosyre signal peptidsekvens. 7B9-2 cDNA'et subklonedes i den eukaryotiske ekspressionsvektor pCAV/NOT, og det resulterende plas-10 mid transficeredes i C0S-7 celler som beskrevet i eksempel 8. COS-7 transfektanter analyseredes som beskrevet i eksempel 12.

En anden cDNA-form, der ligner klon 18 i CTLL 19.4 biblioteket, isoleredes fra 7B9-biblioteket og underkastedes sekvensanalyse. Dette cDNA, klon 7B9-4, er 376 bp kortere end klon 7B9-2 ved 5'-enden og mang-15 ler de første 47 aminosyrer, der kodes for af 7B9-2, men koder for de resterende N-terminalaminosyrer 23-199 (i fig. 2). Ved position 200 har klon 7B9-4 (ligesom klon 18 fra CTLL 19.4) en 114 bp indføjelse, der ændrer aminosyresekvensen til Pro Ser Asn Glu Asn Leu, efterfulgt af en termineringskodon. 114 bp indføjelserne, der findes i både klon 7B9-4 og 20 CTLL 19.4 klon 18, har identiske nukleinsyresekvenser. Den kendsgerning, at denne cDNA-form, der fremstiller en udskilt form af IL-4 receptoren, når den udtrykkes i C0S-7 celler, blev isoleret fra disse to forskellige cellelinier, viser, at den hverken er et kloningsartefakt eller en mutantform, der er særegen for de sorterede CTLL-celler.

25

Eksempel 11

Isolation af human IL-4 receptor cDNA'er fra PBL og T22-biblioteker ved indbyrdes krydshybridi sering af arter

Polyadenyleret RNA isoleredes fra kombinerede humane perifere blod-30 lymfocyter (PBL), opnået ved standard Ficoll-rensning, og dyrkedes i IL-2 i 6 dage efterfulgt af stimulation med PMA og Con-A i 8 timer. Et oli-go dT primed cDNA-bibliotek konstrueredes i Agt 10 under anvendelse af teknikker beskrevet i eksempel 7. En probe fremstilledes ved syntetisering af et umærket RNA-transkript af 7B9-4 cDNA-indføjel sen under an-35 vendel se af T7 RNA polymerase, efterfulgt af 3zP-mærket cDNA-syntese med revers transkriptase under anvendelse af vilkårlige primere (Boehering-er-Mannheim). Denne murine enkeltstrengede cDNA-probe anvendtes til screening af 50.000 plaquer fra det humane cDNA-bibliotek i 50% forma- DK 175583 B1 35 mid/0,4 M NaCl ved 42°C, efterfulgt af vaskning i 2 X SSC ved 55°C. Tre positive plaquer rensedes, og EcoRI-indføjelserne subklonedes i Blue-script®-plasmidvektoren. Nukleinsyresekvensbestemmel se af en del af klon PBL-1, et 3,4 kb cDNA, viste, at klonen var ca. 67% homolog med den til-5 svarende sekvens af den murine IL-4 receptor. Imidlertid blev en indføjelse på 68 bp indeholdende en terminationskodon og uden homologi med muse IL-4 receptorklonerne fundet 45 aminosyrer nedenstrøms for den forud-sagte N-terminal af det modne protein, hvilket tyder på, at klon PBL-1 koder for en ikke-funktionel, forkortet form af receptoren. 9 yderligere 10 humane PBL-kloner opnåedes ved screening af samme bibliotek (under stri-gente betingelser) med en 32P-mærket vilkårligt primet probe fremstillet ud fra klon PBL-1 (3.4 kb EcoRI cDNA-indføjelsen). To af disse kloner, PBL-11 og PBL-5, strækker sig over 5'-området, der indeholder 68 bp indføjelsen i PBL-1, men mangler 68 bp indføjelsen og strækker sig ikke 15 fuldt ud til 3'-enden, hvilket bevidnes af deres størrelse, hvorved funktionel analyse ved mammal ekspression på forhånd er udelukket. Til opnåelse af en konstruktion, der kan udtrykkes i C0S-7 celler, ligeredes 5'NotI-Hinc II fragmentet af klonerne PBL-11 og PBL-5 separat til Hine II-BamH I 3'-enden af klon PBL-1 og subklonedes i pCAV/NOT ekspressions-20 vektoren skåret med NotI og Bgl II beskrevet i eksempel 8. Disse kimære humane IL-4R cDNA'er, der indeholder PBL-11/PBL-3 og PBL-5/PBL-I DNA-sekvenser, er hhv. blevet betegnet klon A5 og B4, som yderligere beskrevet i eksempel 12. Disse konstruktioner transficeredes i C0S-7 celler og analyseredes for IL-4 binding i en pladebindingsanalyse, i det væsentli-25 ge som beskrevet i Sims et al. (Science 241:585, 1988). Begge kompositkonstruktioner kodede for protein, der udviste IL-4 bindingsaktivitet.

Nukleotidsekvensen og den forudsagte aminosyresekvens af komposit A5 konstruktionen svarer til den i fi g. 4A-4C viste sekvensinformation med undtagelse af, at en GTC kodon koder for aminosyren Val ved position 50 30 i stedet for Ile. Ingen andre kloner, der blev sekvensbestemt, indeholdt denne ændring. Den samstemmende kodon fra klonerne PBL-1, PBL-5 og T22-8 er imidlertid ATC og koder for Ile50, som vist i fi g. 4A. Nukleotidse-kvensen og den forudsagte aminosyresekvens af komposit B4 konstruktionen viser også, at 25 aminosyre 1 ederskevensen af PBL-11 er erstattet med 35 sekvensen Met-Gln-Lys-Asp-Ala-Arg-Arg-Glu-Gly-Asn.

Konstruktioner, der udtrykker en opløselig form af den humane IL-4 receptor, fremstilledes ved udskæring af et 5'-terminalt 8.8 kb Sma I-Dra III fragment fra PBL-5 og det tilsvarende 0,8 kb Asp718-Dra III

DK 175583 B1 36 fragment fra PBL-11, hvis Dra III fremspringe gjordes stump-endet med T4-polymerase. PBL-5 og PBL-11 fragmenterne subklonedes separat i CAV/-NOT skåret med hhv. Sma I eller Asp 718 plus Sma I. De betegnes hhv. opløselig hIL-4R-5 og opløselig hIL-4R-ll.

5 Et andet bibliotek fremstillet ud fra CD4+/CD8- human T-celle klon, T22 {Aces et al., J. Immunol. 138:2132, 1987), screenedes (under anvendelse af duplikatfiltre) med to forskellige prober syntetiseret som beskrevet ovenfor. Den første probe opnåedes ud fra et 220 bp Pvu II fragment fra 5'-enden af klon PBL-1, og den anden probe opnåedes ud fra et 10 300 bp Pvu Il-EcoR I fragment fra 3'-enden af klon PBL-1. Fem yderligere cDNA-kloner identificeredes under anvendelse af disse to prober. To af disse kloner strakte sig over 5'-området, der indeholder 68 bp indføjelsen, men ingen af dem indeholdt indføjelsen. Den tredje af disse kloner, T22-8, havde en størrelse på ca. 3.6 kb og indeholdt en åben læseramme 15 på 825 aminosyrer, inklusive en 25 aminosyre ledersekvens, et modent eksternt område på 207 aminosyrer, et transmembranområde på 24 aminosyrer og et cytoplasmaområde på 569 aminosyrer. Sekvensen af klon T22-8 er vist i fig. 4A-4C. Fig. 5A-5B sammenligner den forudsagte humane IL-4R aminosyresekvens med den forudsagte murine IL-4R sekvens og viser, at 20 der er ca. 53% sekvensidentitet mellem de to proteiner.

Eksempel 12

Analyse og rensning af IL-4 receptor i COS transfektanter Ækvilibriumbindingsundersøgelser udførtes for COS-celler transfice-25 ret med de murine IL-4 receptorkloner 16 og 18 fra CTLL 19.4 biblioteket. I alle tilfælde gav analyse af dataene i Scatchard koordinatsystemet (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660-672, 1949) en ret lig linie, hvilket indikerer en enkelt klasse af højaffinitetsreceptorer for murin IL-4. For COS pCAV-16 celler var den beregnede tilsyneladende Ka 3,6 x -1 ° 30 109 M med 5,9 x 105 specifikke bindingssteder pr. celle. En lignende tilsyneladende K beregnedes for COS pCAV-18 celler ved 1,5 x 109 M’*, α men receptorantallet udtrykt ved cellens overflade var 4,2 x 104. Ækvi-1ibriumbindingsundersøgelser udført på COS-celler transficeret med IL-4R DNA kloner isoleret fra 7B9 cellebiblioteket viste også højaffinitets-35 binding af receptoren til IL-4. Specifikke undersøgelser under anvendelse af COS-celler transficeret med pCAV-7B9-2 demonstrerede, at den uforkortede murine IL-4 receptor bandt 1Z5I-IL-4 med en tilsyneladende K_ på -1 a ca. 1,4 x 1010 M med 4,5 x 104 specifikke bindingssteder pr. celle.

DK 175583 B1 37

Den tilsyneladende K af CAV-7B9-4 IL-4R blev beregnet til at være ca.

-1 a 1,7 x 109 M . Selvom absolute værdier for K og bindingssteder pr. cel- α le varierede for de forskellige transfektioner, lignede bindingsaffiniteterne generelt hinanden (1 x 109-1 x 10χ0 M**) og stemte godt overens 5 med de tidligere publicerede affinitetskonstanter for IL-4 binding.

Inhibering af 125I-mIL-4 binding til CTLL-celler med konditionerede medier fra COS-celler transficeret med plasmid pCAV, pCAV-18 eller pCAV-7B9-4 anvendtes til bestemmelse af, om disse cDNA'er koder for funktionelle opløselige receptormolekyler. Ca. 1,5 μΐ COS pCAV-18 konditionere-10 de medier fremstillet i et slutanalysevolumen på 150 μΐ giver ca. 50% inhibering af 125I-IL-4 binding til IL-4 receptoren på CTLL-celler. lz5I-IL-4 receptor-kompetitiv aktivitet er ikke påvist i kontrol pCAV-transficerede COS supernatanter. Ud fra kvantitativ analyse af fortyndingen af pCAV-18 supernatant, der kræves til inhibering af 125I-IL-4 15 binding med 50%, anslås det, at ca. 60-100 ng/ml opløselig IL-4 receptor er blevet udskilt af COS-celler, når der høstes 3 dage efter transfek-tion. Lignende resultater opnåedes under anvendelse af supernatanter fra COS-celler transficeret med pCAV-7B9-4.

Konditioneret medium fra COS-celler transficeret med pCAV-18 eller 20 pCAV-7B9-4 (se eksempel 8) og dyrket i DMEM indeholdende 3% FBS høstedes tre dage efter transfektion. Supernatanter centrifugeredes ved 3.000 opm i 10 minutter og blev nedfrosset indtil brug. 200 ml konditionerede medier fyldtes på en kolonne indeholdende 4 ml muIL-4 Affigel fremstillet som beskrevet ovenfor. Kolonnen vaskedes grundigt med PBS, og IL-4 re-25 ceptor elueredes med 0,1 M glycin, 0,15 MNaCl, pH 3,0. Umiddelbart efter eluering neutraliseredes prøver med 80 μΐ 1 M Hepes, pH 7,4. Prøver testedes for deres evne til at inhibere binding af 125I-muIL-4 til CTLL-celler som beskrevet i eksempel IB. Yderligere prøver testedes for renhed ved analyse på SDS-PAGE og sølvfarvning som tidligere beskrevet. Al-30 ternative metoder til testning af funktione opløselig receptor aktivitet eller IL-4 bindingsinhibering omfatter fasfase-bindindsanalyser som beskrevet i eksempel 1C, eller andre lignende celle-fri analyser, hvor der kan anvendes enten radio-ioderet eller colorimetrisk fremkaldt IL-4 binding, såsom RIA eller ELISA. Proteinet analyseret ved SDS-PAGE under 35 reducerende betingelser har en molekylvægt på ca. 37.500 og synes at have en renhed på ca. 90% ved sølvfarvningsanalyse af geler.

Renset rekombinant opløseligt murint IL-4 receptorprotein kan også testes for evne til at inhibere IL-4 induceret 3H-thymidin inkorporering DK 175583 B1 38 i CTLL-celler. Ved at følge sådanne fremgangsmåder blev det fundet, at opløselig IL-4 receptor blokerer IL-4 drevet proliferation, men ikke påvirker IL-2 stimuleret mitogen reaktion.

Molekylvægtsskøn foretoges på mIL-4 receptorkloner transficeret i 5 COS-celler. Ved anvendelse af M2 monoklonalt antistof fremstillet med murine CTLL 19.4 celler (se eksempel 13) immunpræcipiteredes IL-4 receptor fra COS-celler transficeret med CAV-16, CAV-7B9-2 og CAV-7B9-4 og mærkedes med 35S-cystein og 35S-methionin. Celle-associeret receptor fra CAV-7B9-4 udviser molekylvægtheterogenitet strækkende sig fra 32-39 kDa.

10 Udskilt CAV-7B9-4 receptor har molekylvægte mellem 36 og 41 kDa, Celleassocieret receptor fra CAV-16 transficerede COS-celler ligger på ca.

40-41 kDa. Dette er signifikant mindre end molekylvægtsskønnene i de af Park et al., J. Exp. Med. 166:476, 1987, J. Cell. Biol., Suppl. 12A, 1988, beskrevne tværbindingsundersøgelser. Immunpræcipitation af COS 15 CAV-7B9-4 celle-associeret receptor viste molekylvægte fra 130-140 kDa, hvilket lignede de af Park et al., J. Cell. Biol., Suppl. 12A, 1988, udførte skøn, og skønnedes at være den uforkortede IL-4 receptor. Lignende molekylvægtsskøn af celle-associeret CAV-16 og CAV-7B9-2 IL-4 receptor er også blevet foretaget på basis af tværbinding af 1251L-4 til 20 COS-celler transficeret med disse cDNA'er. Heterogenitet af de individuelle kloners molekylvægte kan delvist tilskrives glycosylering. Disse data tyder sammen med DNA-sekvensanalyse på, at 7B8-2 cDNA'et koder for den uforkortede celleoverflade IL-4 receptor, hvorimod både 7B9-4 og klon 18 repræsenterer opløselige former af murin IL-4 receptor.

25 Receptorkarakteriseringsundersøgelser udførtes også på COS-celler transficeret med hIL-4R-holdige ekspressionspi asmider. De to kimære humane IL-4R molekyler A5 og B4 (defineret i eksempel 11) transficeredes i COS-celler, og der foretoges ækvilibrium-bindingsundersøgelser. Selve COS-abecellen har receptorer, som er i stand til at binde hIL-4; derfor 30 repræsenterer bindingsberegningerne, udført på COS-celler, der er transficeret med og overudtrykker hIL-4R cDNA'er, baggrundsbinding fra endogene abe IL-4R molekyler subtraheret fra den totale binding. COS-celler transficeret med hIL-4R A5 havde 5,3 x 104 hIL-4 bindingssteder med en beregnet Ka på 3,48 x 109M På lignende måde bandt den i COS-celler 35 udtrykte hIL-4R B4 1251-hIL-4 med en affinitet på 3,94 x 109 M’^ og havde 3,2 x 104 receptorer pr. celle.

Der udførtes også molekylvægtsskøn af human IL-4R udtrykt i COS-celler. COS-celler transficeret med kloner A5 eller B4 i pCAV/NOT mærke- DK 175583 B1 39 des med 35S-cystein/methionin og lyseredes. Human IL-4R affinitetsrensedes ud fra de resulterende lysater med hIL-4-kobl et Affigel® (som beskrevet i eksempel 4). hIL-4R A5 og B4 elueret fra denneaffinitetsbærer migrerede til ca. 140.000 dalton på SDS-PAGE, hvilket stemte godt over-5 ens med tidligere skøn over hIL-4R molekylvægte ved tværbinding (Park et al., J. Exp. Med. 166:476, 1987) samt med heri anførte skøn for uforkortet mIL-4R.

Fordi der hidtil, i modsætning til den murine receptor (kloner 18 og 7B9-4), ikke er blevet fundet naturligt forekommende opløseligt hu-10 mant IL-4R cDNA, konstrueredes en forkortet form som beskrevet i eksempel 11. Efter ekspression i COS-celler høstedes supernatanter tre dage efter transfektion med opløselig hIL-4R-ll og opløselig hIL-4R-5 og testedes for inhibering af lz5I-hIL-4 binding til den humane B-cellelinie Raji. Supernatanter fra to af pladerne transficeret med opløselig hlL-15 4R-11 og fra en af pladerne transficeret med opløselig hIL-4R-5 indeholdt 29-149 ng/ml IL-4R kompetitiv aktivitet i mediet. Desuden kunne det forkortede protein ved SDS-PAGE påvises i 35$-methionin/cystein-mær-ket COS-celle transfektanter ved affinitetsrensing på hIL-4-koblet Affigel® som et ca. 44 kDa protein.

20

Eksempel 13

Fremstilling af monoklonale antistoffer mod IL-4R

Præparater af med renset rekombinant IL-4 receptor, fx. human eller murin IL-4 receptor, transficerede COS-celler, der udtrykker høje ni-25 veauer af IL-4 receptor, eller CTLL 19.4 celler anvendtes til fremstilling af monoklonale antistoffer mod IL-4 receptor under anvendelse af konventionelle teknikker såsom dem, der er beskrevet i US patentskrift nr. 4.411.993. Sådanne antistoffer vil sandsynligvis kunne anvendes til at indvirke på IL-4 binding til IL-4 receptorer, fx. til bedring af to-30 xiske eller andre uønskede virkninger af IL-4.

Til immunisering af rotter anvendtes som immunogen IL-4 receptor bærende CTLL 19.4 celler emulgeret i komplet Freund's adjuvans og injiceredes subkutant i Lewis-rotter i mængder fra 10-100 μΐ. Tre uger senere fik de immuniserede dyr en boosterbehandling med yderligere immunogen 35 emulgeret i ukomplet Freund's afjuvans og derefter hver tredje uge. Der blev udtaget periodiske serumprøver ved retro-orbital åreladning eller halespids-excision til testning ved dot-blot analyse, ELISA (enzym-linked immunosorbent assay) eller inhibering af binding af 125I-IL-4, DK 175583 B1 40 til ekstrakter af CTLL-celler (som beskrevet i eksempel 1). Andre analyseprocedurer er også egnede. Efter påvisning af en passende antistofti-ter modtog positive dyr en sidste intravenøs injektion af antigen i saltvand. Tre til fire dage senere aflivedes dyrene, splenocyter høste-5 des og fusioneredes til den murine myelomacellelinie AG8653. Hybridoma-cellelinier fremstillet ved denne procedure udpladedes i multiple mikro-titerplader i et HAT-selektivt medium (hypoxanthin, aminopterin og thy-midin) til inhibering af proliferation af ikke-fusionerede celler, mye-lomahybrider og miltcellehybrider.

10 Således fremstillede hybridomakloner screenedes for reaktivitet med IL-4 receptor. Ved den indledningsvise screening af hybridomasupernatan-ter anvendtes antistofopfangning og binding af delvist renset 125I-mIL-4 receptor. Denne metode viste, at to ud af over 400 screended hybridomas var positive. Disse to nomoklonale antistoffer, Ml og M2, testedes ved 15 modificeret antistoffangning til påvisning af blokerende antistof. Kun Ml var i stand til at inhibere 125I-mIL-4 binding til intakte CTLL-celler. Begge antistoffer er i stand til immunpræcipitering af nativt mlL-4R protein fra CTLL-celler eller COS-7 celler transficeret med I-4R kloner mærket med 35S-cystein/methionin. Ml og M2 injiceredes derefter i 20 peritoneal hul hederne af nøgne mus til frembringelse af ascites indeholdende høje koncentrationer (>1 mg/ml) af anti -1L-4R monoklont antistof.

Det resulterende monoklonale antistof rensedes ved ammoniumsulfatpræci-pitation efterfulgt af gel eksklusionskromatografi, og/eller affinitetskromatografi baseret på binding af antistof til Protein G.

25

Eksempel 14

Anvendelse af opløselig IL-4R til undertrykkelse af immunrespons in vivo Forsøg udførtes til bestemmelse af virkningen af opløselig IL-4R på allogenisk vært versus transplantat (HVG) respons in vivo under anvend-30 else af popliteal lymfeknudeanalyse. Ved dette forsøg injiceres mus i trædepuden med bestrålede, allogene miltceller. Bestrålede, syngene celler injiceres derefter i den skråt overfor beliggende trædepude. En al-loreaktiv respons optræder i trædepuden, der modtog de allogeniske celler, hvis udstrækning kan måles ved den relative forøgelse af størrelsen 35 og vægten af den popli teale lymfeknude, der dræner antigendeponeringsstedet.

På dag 0 injiceredes tre BALB/C-mus i trædepuden med bestrålede, allogene miltceller fra c57BL/6-mus, og i den skråt overfor beliggende DK 175583 B1 41 trædepude med bestrålede, syngene miltceller. På dag -1,0 og +1 injiceredes tre mus (intravenøst på dagene -1 og 0, og subkutant på dag +1) med 100 ng renset opløselig IL-4R (sIL-4R) i phosphatpufferindstillet saltvand, tre mus injiceredes intravenøst med 1 Ag sIL-4R, tre mus inji-5 ceredes med 2 A9 s IL-4R og tre mus injiceredes med MSA (kontrol). Middelforskellen i vægten af lymfeknuderne fra stederne for de all ogene og syngene miltceller var ca. 2,5 mg for musene behandlet med MSA, 1 mg for musene behandlet med 100 ng s IL-4R, og 0,5 mg for musene behandlet med 1 βg sIL-4R. Ingen påviselig forskel i vægt af lymfeknuder kunne fastslås 10 for mus behandlet med 2 Ag s IL-4R. Således understrykte IL-4R signifikant (p < 0,5 i alle grupper, under anvendelse af en dobbeltsidet Τ'-test) den lymfoproliterative respons in vivo på en dosisafhængig måde i sammenligning med kontrolmus.

Claims (43)

1. Isoleret DNA-sekvens, der koder for et polypeptid, der er i stand til at binde en mammal IL-4, hvor DNA-sekvensen er udvalgt fra 5 gruppen bestående af: (a) cDNA-kloner omfattende en nukleotid-sekvens udvalgt fra sekvensen, der er vist som nukleotiderne -75 til 2355 i figur 2A-2C, nukleotiderne 1 til 2355 i figur 2A-2C, nukleotiderne -75 til 2400 i 10 figur 4A-4C, og nukleotiderne 1 til 2400 i figur 4A-4C; (b) DNA-sekvenser, der er i stand til at hybridisere til et cDNA ifølge (a) under moderat stringente betingelser, og som koder for et polypeptid, der er i stand til at binde mammal IL-4, og (c) DNA-sekvenser, der som følge af den genetiske kode er degene-15 reret i forhold til de under (a) og (b) definerede DNA-sekvenser, og som koder for et polypeptid, der er i stand til at binde mammal IL-4.

2. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen omfatter en nukleotid-sekvens, der er udvalgt fra gruppen bestående af 20 nukleotiderne -75 til 2355 i figur 2A-2G, nukleotiderne 1 til 2355 i figur 2A-2C, nukleotiderne -75 til 2400 i figur 4A-4C, og nukleotiderne 1 til 2400 i figur 4A-4C.

3. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen 25 omfatter en nukleotid-sekvens, der er udvalgt fra gruppen bestående af nukleotiderne -75 til 621 i figur 4A og nukleotiderne 1 til 621 i figur 4A.

4. DNA-sekvens ifølge krav 1, der koder for en aminosyresekvens, 30 der er har mere end 80% lighed med en aminosyresekvens udvalgt blandt de i figur 4A-4C viste aminosyrerester -25 til 800, 1 til 800, -25 til 207 eller 1 til 207.

5. DNA-sekvens ifølge krav 4, der koder for en opløselig 35 receptor, der er i stand til at binde human IL-4 og omfattende en aminosyresekvens, der i det væsentlige består af de i figur 4A viste aminosyrerester -25 til 207 eller 1 til 207. DK 175583 B1 43

6. DNA-sekvens ifølge krav 1, der koder for en aminosyresekvens i det væsentlige bestående af de i figur 4A-4C viste aminosyrerester -25 til 800 eller 1 til 800.

7. DNA-sekvens ifølge krav 1, der koder for et IL-4-receptor- polypeptid, omfattende en aminosyresekvens, der er valgt blandt sekvensen af aminosyreresterne 1 til 800 vist i figur 4A-4C, 1 til 207 vist i figur 4A, 1 til 785 vist i figur 2A-2C, 1 til 208 vist i figur 2A, eller analoger deraf, der har en biologisk aktivitet som en mammal

10 IL-4-receptor.

8. Isoleret DNA-sekvens, der er a) et fragment af nukleotidsekvensen, der i figur 2A-2C er vist som 15 nukleotiderne 1-2355, og b) et fragment af nukleotidsekvensen, der i figur 4A-4C er vist som nukleotiderne 1-2400, 20 kendetegnet ved, at fragmentet koder for et polypeptid, der har biologisk aktivtet som en mammal IL-4-receptor.

9. Isoleret DNA-sekvens, der er 25 a) et DNA-fragment indeholdende mindst ca. 50 på hinanden følgende nukleotider af sekvensen, der i figur 2A-2C er vist som nukleotiderne 1-2355, og b) et DNA-fragment indeholdende mindst ca. 50 på hinanden følgende 30 nukleotider af den sekvens, der i figur 4A-4C er vist som nukleotiderne 1-2400.

10. Rekombinant ekspressionsvektor omfattende en DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9. 35

11. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid, der er i stand til at binde mammal IL-4, kendetegnet ved, at man dyrker en egnet værtscelle omfattende en vektor ifølge krav 10 under betingelser, der DK 175583 B1 44 fremmer ekspression af polypeptidet.

12. Fremgangsmåde til fremstilling af et peptid, der er istand til at binde human IL-4, kendetegnet ved, at man dyrker en egnet værtscelle 5 omfattende en vektor ifølge krav 10 under betingelser, der fremmer ekspression af polypeptidet.

13. Oprenset polypeptid, der er i stand til at binde mammal IL-4, kendetegnet ved, at polypeptidet er kodet af et DNA ifølge et hvilket 10 som helst af kravene 1-7.

14. Polypeptid ifølge krav 13, i det væsentlige bestående af murin IL-4 receptor eller human IL-4 receptor.

15. Polypeptid ifølge krav 13, der omfatter en aminosyresekvens valgt fra sekvensen af aminosyreresterne 1-800 vist i figur 4A-4C, 1-207 vist i figur 4A, 1-785 vist i figur 2A-2C, 1-208 vist i figur 2A, eller som er et fragment eller en analog deraf med biologisk aktivitet som en mammal IL-4 receptor. 20

16. Polypeptid ifølge krav 14, der er en human IL-4 receptor i form af et glycoprotein med en molekylvægt på mellem ca. 110.000 og 150.000 Mr ved SDS-PAGE og en bindingsaffinitet (Ka) for human IL-4 på fra ca. 1-8 x 109M’^. 25

17. Polypeptid ifølge krav 14, der har følgende N-terminale aminosyresekvens: Met-Lys-Val-Leu-Gln-Glu-Pro-Thr-Cys-Val-Ser-Asp-Tyr-Met-Ser-Ile-Ser-Thr-Cys-Glu-Trp.

18. Polypeptid ifølge krav 13, kendetegnet ved, at den native receptors transmembranområde og cytoplasmatiske område er deleteret.

19. Polypeptid ifølge krav 15, kendetegnet ved, at polypeptidet omfatter en aminosyresekvens, der har mere end 80% lighed med en sekvens 35 valgt blandt de i figur 4A-4C viste rester 1-800 og de i figur 4A viste rester 1-207.

20. Polypeptid ifølge krav 19, kendetegnet ved, at det omfatter en DK 175583 B1 45 aminosyresekvens i det væsentlige bestående af de i figur 4A viste rester 1 til 207.

21. Polypeptid ifølge krav 19, der er i stand til at binde human

5 IL-4, kendetegnet ved, at polypeptidet omfatter en aminosyresekvens i det væsentlige bestående af de i figur 4A-4C viste rester 1-800.

22. Oprenset polypeptid valgt fra gruppen bestående af 10 a) et fragment af polypeptidet, der har aminosyresekvensen 1-785 i figur 2A-2C, og b) et fragment af polypeptidet, der har aminosyresekvensen 1-800 i figur 4A-4C, 15 kendetegnet ved, at fragmentet har en biologisk aktivitet som IL-4-receptor.

23. Oprenset polypeptid udvalgt fra gruppen bestående af 20 a) et polypeptid omfattende mindst ca. 20 på hinanden følgende rester af den i figur 2A-2C viste sekvens af aminosyrerne 1-785, og b) et polypeptid omfattende mindst ca. 20 på hinanden følgende 25 rester af den i figur 4A-4C viste sekvens af aminosyrerne 1-800.

24. Farmaceutisk præparat til regulering af immunreaktioner i et pattedyr omfattende en virksom mængde af et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 13-23 og en passende diluent eller bærer. 30

25. Præparat ifølge krav 24 med en specifik bindingsaktivitet på mindst ca. 0,01 nanomol IL-4/nanomol af polypeptidet.

25. Præparat ifølge krav 24, kendetegnet ved, at polypeptidet 35 binder human IL-4 og forefindes i form af et glycoprotein med en bindingsaffinitet (KJ for human IL-4 på ca. 1-8 x 109M’* og den N- α terminale aminosyresekvens Met-Lys-Val-Leu-Gln-Glu-Pro-Thr-Cys-Val-Ser-Asp-Tyr-Met-$er-Ile-Ser-Thr-Cys-Glu-Trp. DK 175583 B1 46

27. Præparat ifølge krav 24, kendetegnet ved, at polypeptidet omfatter en aminosyresekvens i det væsentlige bestående af de i figur 4A viste aminosyrer 3-207. 5

28. Anvendelse af et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 13-23 i et bindingsassay til detektering af IL-4 eller IL-4-receptor-molekyler eller interaktioner af disse.

29. Polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 13-23 til anvendelse i human- eller veterinær medicin.

30. Anvendelse af et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 13-23, til fremstilling af et medikament til regulering af 15 immunreaktioner i et pattedyr.

31. Anvendelse ifølge krav 30, hvor polypeptidet er humant, og pattedyret, som skal behandles, er et menneske.

32. Antistoffer, der er immunreaktive med et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 13-23.

33. Antistof ifølge krav 32, kendetegnet ved, at antistoffet er et monoklonalt antistof. 25

34. Antistof ifølge krav 33, kendetegnet ved, at det monoklonale antistof er immunreaktivt med et humant IL-4-receptor-polypeptid.

35. Anvendelse af et antistof ifølge et hvilket som helst af 30 kravene 32-34 ved fremstillingen af et medikament for lindring af toksiske eller andre uhensigtsmæssige virkninger af IL-4.

36. Værtscelle transfekteret med en vektor ifølge krav 10.

37. RNA, der i det væsentlige er komplementært til ONA'et ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9. DK 175583 B1 47

38. Fusionsprotein omfattende en polypeptidsekvens, der er koblet til et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 13-23.

39. Fusionsprotein ifølge krav 38 til anvendelse inden for human-5 og veterinær medicin.

40. Anvendelse af fusionsproteinet ifølge krav 38 ved fremstillingen af et medikament til regulering af en immunreaktion i et pattedyr. 10

41. Anvendelse af et fusionsprotein ifølge krav 40, kendetegnet ved, at fusionsproteinet omfatter en polypeptidsekvens, der er i stand til at binde human IL-4, og ved at pattedyret er et menneske.