JP2003512838A - ショウジョウバエｇタンパク質結合レセプター、核酸、およびそれに関連する方法。 - Google Patents

ショウジョウバエｇタンパク質結合レセプター、核酸、およびそれに関連する方法。

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ショウジョウバエメラノガスター(Drosophila melannogasteer)のＧＰＣＲ（ＤｍＧＰＣＲ）ポリペプチド、および、そのＤｍＧＰＣＲをコードし特定するポリヌクレトチドを提供する。本発明は、また、発現ベクター、宿主細胞およびその生産方法を提供する。また、本発明は、他の動物中のホモログや、動物の疾病治療や動植物に有害な昆虫の制御のために有用なＤｍＧＰＣＲ作動薬／拮抗薬を同定するために有用な方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、一部、ショウジョウバエメラノガスターＧタンパク質結合レセプタ
ー（ＤｍＧＰＣＲ）をコード化する核酸分子、新規ポリペプチド、および、ＧＰ
ＣＲに結合し、および／またはＧＰＣＲの活動に変調をもたらす化合物をスクリ
ーニングするためのアッセイ方法に関する。
【０００２】 発明の背景 人間や他の生物は生細胞からなっている。その細胞が他の細胞と情報を伝え合
い外界からの情報や刺激を受け取るメカニズムの一つに、細胞表面にある膜レセ
プター分子を経由するものがある。そのような多くの膜レセプターが同定されて
、その特徴も調べられ、時には、構造上のモチーフやシグナル伝達の特徴などに
基づいて、主なレセプターファミリーに分類されている。このようなファミリー
としては、リガンド作動性イオンチャンネルレセプター、電位差依存性イオンチ
ャンネルレセプター、レセプターチロシンキナーゼ、レセプタータンパク質チロ
シンフォスファターゼやＧタンパク質結合レセプターなどが挙げられるが、これ
らに限定されない。これらのレセプターは、細胞外シグナルを細胞内の生理的な
応答に変換する最も重要な役割を持つ。
【０００３】 Ｇタンパク質結合レセプター（すなわち、ＧＰＣＲ）は、細胞表面レセプター
のうちで大きなファミリーを構成し、その特徴は、アミノ末端側領域が細胞外に
、カルボキシ末端側領域が細胞内に、膜を７回貫通する蛇行状タンパク質領域が
膜内に存在することである。このため、これらのレセプターは、７回貫通レセプ
ター（７ＴＭ）とも呼ばれる。これらの７回貫通領域は、前述のアミノ末端およ
びカルボキシル末端領域に加え、細胞外に３つのループ、細胞内に３つのループ
を形成する。レセプターの細胞外部分は、一つ以上の細胞外の結合対象（例えば
、リガンド）と結合し、これを認識する役割を持っている。他方、細胞内部分は
、下流の効果分子(effector molecule)を認識し、情報伝達する役割を持つ。
【０００４】 ＧＰＣＲと結合するリガンドは数多くあり、カルシウムイオン、ホルモン、ケ
モカイン、神経ペプチド、神経伝達物質、ヌクレオチド、脂質、臭気物質などが
挙げられ、光子さえも結合する。ＧＰＣＲは、多くの細胞種の正常な（時には、
異常な）機能にとって重要である。概論としては次の論文を参照せよ。［Strosb
er, Eur. J.Biochem., 1991, 196, 1-10；およびBohmら、Biochem J., 1997, 32
2, 1-18］。特定のリガンドが相当するレセプターに結合する時、リガンドは、
典型的には、レセプターの細胞内部分または領域と結合するある特定のヘテロ三
量体グアニン・ヌクレオチド結合調節タンパク質（Gタンパク質）を活性化する
。Ｇタンパク質は、次いで、細胞内の調節分子にシグナルを発信し、その調節分
子の活性を刺激するか阻害する。これらの調節分子としては、アデニレートシク
ラーゼ、ホスホリパーゼやイオンチャンネルが挙げられる。アデニレートシクラ
ーゼとホスホリパーゼは、第二のメッセンジャー分子、ｃＡＭＰ、イノシトール
トリホスフェートおよびジアシルグリセリンの産生に関与する酵素である。この
一連の現象を通し、細胞外のリガンドの刺激は、Ｇタンパク質結合レセプターを
通して細胞内の変化を引き起こす。これらのレセプターは、それぞれ特有の一次
構造、発現パターン、リガンド結合プロフィールや細胞内調節システムを持って
いる。
【０００５】 Ｇタンパク質結合レセプターは、細胞と外界との間の情報伝達に重要な役割を
持つため、これらのレセプターは、レセプターの活性化または拮抗化による治療
的処置の標的として魅力を持っている。既知のリガンドを持つレセプターに対し
ては、特にそのリガンドの持つ作用を促進または阻害させるために作動薬や拮抗
薬の特定が進められている。いくつかのＧタンパク質結合レセプターは、病原と
しての役割を持ち、（例えば、ＨＩＶのコレセプターとして働くある種のケモカ
インレセプターは、ＡＩＤＳの病原としての役割を持つ。）、このため、レセプ
ターの天然リガンドについての知識がない場合においても治療的処置の標的とし
て魅力を持っている。その他のレセプターは、組織や細胞のタイプに対するそれ
らの発現パターンのため、治療的処置の標的として魅力があり、また、これらの
組織や細胞のタイプも、治療的処置の標的として魅力を持っている。後者のカテ
ゴリーに属するレセプターの例としては、免疫細胞で発現されるレセプター（こ
のレセプターは、自己免疫応答を阻害するか、病原体あるいは癌に対する免疫応
答を刺激するための標的とすることができる。）、および、脳または他の神経器
官や組織で発現されるレセプター（このレセプターは、精神分裂症、うつ病、双
極性疾病または他の神経学的障害の治療における標的として可能性がある）を挙
げることができる。後者のカテゴリーのレセプターは、また、レセプターを発現
する細胞サブタイプを、例えば蛍光活性化細胞選別により同定および／または精
製するためのマーカーとして有用である。不幸にも、知られている中枢神経シス
テム由来のＧタンパク質レセプターの数はほんの少数である。このため、すでに
同定され人間を含む多くの動物の治療的処置の標的として有望とみなされている
Ｇタンパク質結合レセプターに対して、需要がある。
【０００６】 昆虫は、農業や人屋内環境において、主な厄介者とされている。昆虫は、また
動物や人間に寄生し（この場合外部寄生虫と呼ばれる）、疾病や死亡を引き起こ
す。昆虫は、またウィルス性や寄生性の疾病を動植物や人間に伝達するベクター
として働く。このため、昆虫の数を制御するための新しい方法や、病原種または
有害種を追い払いおよび／または殺すための新しい方法に対する、永続的で切実
な需要が存在している。昆虫を殺しまたは駆逐して昆虫数を制御する一つの方法
は、化学物質を使用する方法である。この化学物質は、殺虫剤と呼ばれ、昆虫に
選択的に毒性を発揮し、他の無脊椎動物へも作用する可能性もある。現在、農作
物や家畜などの農業生産物にダメージを与える昆虫の制御のために、殺虫剤は非
常に大きな価値をもっている。殺虫剤は、また、人の家庭環境においても、例え
ば、芝や庭園の害虫や人にダメージを与えるか悩ませる刺虫、噛虫、ハエ、ゴキ
ブリなどの昆虫の制御に使われている。殺虫剤は、家畜動物やペットに寄生する
ノミ、シラミ、ダニや噛付きハエなどの外部寄生虫により引き起こされる疾病状
態の治療や予防のためにも、大きな価値を持っている。しかし、殺虫剤として用
いられている現行の化学物質は最良とはいえない。いくらかは哺乳類に対して明
らかな毒性を示し、また標的種のいくつかには、これらの殺虫剤の一部に抵抗性
を示すものが出てきている。このため、新規な作用メカニズムを持つ新しい選択
的な殺虫剤に対する需要がある。
【０００７】 神経ペプチドリガンドを持つ昆虫ＧＰＣＲの例は、既知ではあるが、［Liら、
EMBO Journa1, 1991, 10,3221-3229; Liら、J. Biol. Chem. 1992,267,9-12; Mo
nnierら、J. Biol. Chem., 1992,267, 1298-1302;Vanden Broeckら、Int. Rev.
Cytology, 1996, 164, 189-268; Guenrero, Peptides, 1997, 18, 1-5; Hauser
ら、J. Biol. Chem., 1997,272, 1002-1010; Birgulら、 EMBO J. 1999, 18,589
2-5900; Torfsら、J. Neurochem. 2000,74,2182-2189; およびHauserら、Bioche
m. Biophys. Res. Comm. 1998, 249,822-828］、いずれもまだ新しい殺虫剤の発
見の目的で使われているという報告はない。
【０００８】 典型的に無脊椎動物（例えば昆虫）に見出され、通常長さが４〜１２アミノ酸
のペプチドの多きなファミリーは、ＦＭＲＦアミド関連ペプチド（すなわち、Ｆ
ａＲＰ）として知られる神経ペプチドの分類である。典型的なＦＭＲＦアミドペ
プチドは、C末端の「ＦＭＲＦ」コンセンサスアミノ酸配列が、一般的に、（Ｆ
，Ｙ）（Ｍ，Ｖ，Ｉ，Ｌ）Ｒ（Ｆ，Ｙ）ＮＨ２からなっているため、このように
名づけられた。神経ペプチドとして、これらの分子は神経筋の制御が求められる
重要な生物プロセスに関与している。しかし、（神経ペプチドを含む）神経伝達
物質や神経調節物質のいくつかはレセプターのリガンドとして作用することが分
かっているが、ＧＰＣＲのリガンドとしてのＦａＲＰ神経ペプチドはいまだに見
つかっていない。
【０００９】 アラトスタチンは、多くの昆虫種で変態や再生に中心的な役割を果たすことが
知られている幼弱ホルモンの合成などの多様な機能を制御する昆虫神経ホルモン
の重要な群である。最初のショウジョウバエアラトスタチン、Ｓｅｒ−Ａｒｇ−
Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２（すなわち、ドロス
タチン−３）は、ショウジョウバエの頭部の抽出物から単離された。［Birgulら
、The EMBO J., 1999, 18, 5892-5900］。最近、ショウジョウバエ・アラトスタ
チン・プレプロプホルモン遺伝子がクローン化された。この遺伝子は、次の4つ
のショウジョウバエ・アラトスタチンをコード化している。Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａ
ｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２（ドロスタチン−１）
，Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２
（ドロスタチン−２），Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２（ドロスタチン−３）および、Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２（
ドロスタチン−４）。［Lenzら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 2000,273, 112
6-1131］。これら第一のショウジョウバエ・アラトスタチンレセプターは、Ｂｉ
ｒｇｕｌらによりクローン化され、Ｇｉ／Ｇｏ経路を経由してドロスタチン−３
により機能的に活性化されていることが示された。［Birgulら、EMBO J. 1999,
18, 5892-5900］。第二の推定上のショウジョウバエアラトスタチンレセプター
（すなわち、ＤＡＲＩＩ）が、最近クローン化された。［Lenzら、Biochem. Bio
phys. Res. Comm. 2000,273,571-577］このＤＡＲＩＩレセプターｃＤＮＡ（acc
ession No. AF253526） は、第一のショウジョウバエアラトスタチンレセプター
に強く関係しているタンパク質をコードしている。しかし、アラトスタチンによ
るＤＡＲＩＩの機能的な活性化の例は、いまだに報告されていない。
【００１０】 スルファキニンは、Ｔｙｒ硫酸化昆虫神経ペプチドの科目である。それらは、
脊椎動物のペプチドであるガストリンやコレシストキニンに似た配列や機能（筋
栄養効果、筋消化酵素放出の刺激）を示す。２つのスルファキニン（ドロスルフ
ァキニンとも呼ばれる）をコード化する遺伝子、ＤＳＫＩ［Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａ
ｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ａｍｉ
ｄｅ］＜配列番号：１６０＞と、ＤＳＫＩＩ［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ
−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｍ
ｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ａｍｉｄｅ］＜配列番号：１６１＞が、ショウジョウバ
エメラノガスターにおいて同定されている。［Nichols, Mol. Cell Neuroscienc
e, 1992, 3, 342-347; Nicholsら、J. Bio1. Chem. 1988,263, 12167-12170］。
Ｃ末端のヘプタペプチド配列、Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−
Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ａｍｉｄｅ＜配列番号：１６２＞、は、進化的に大き
く異なる昆虫から今までに同定されたすべてのスルファキニンと同一である。広
く多岐にわたる昆虫分類間において、硫酸化されたＴｙｒ残基の存在も含み、こ
のぺプタペプチド配列が保存されていることは、この筋栄養の「活性中心」の持
つ機能的な重要性を反映するものと考えられる。［Nachman & Holman, in Insec
t Neuropeptides; Chemistry, biology and action, Kelly & Massler, Eds., 1
991, pp. 194-214, American Chemical Society, Washington, D.C.］。我々の
知る限り、昆虫スルファキニンに対するレセプターは今まで同定されていない。
【００１１】 発明の概要 本発明は、ショウジョウバエメラノガスターの持つ新規なポリペプチドの驚く
べき発見に関するものである。ここで、このポリペプチドを、ＤｍＧＰＣＲ（シ
ョウジョウバエメラノガスターＧタンパク質結合レセプター）と命名する。この
ポリペプチドは、他の神経ペプチドＧＰＣＲと、程度の異なる相同性を示す。本
発明は、今まで未知のGタンパク質結合レセプターをコード化する遺伝子、これ
らの遺伝子がコードするＤｍＧＰＣＲポリペプチド、これらのポリペプチドの抗
体、これらのポリヌクレオチドやポリペプチドを使ったキット、および、前記す
べてのものを製造し、および使用する方法を提供する。これらのＤｍＧＰＣＲは
、例えば、神経ペプチドの結合および／または伝達の制御において、主要成分と
しての役割を果たしていると見られる。ＤｍＧＰＣＲは、神経ペプチドまたは他
の物質による結合および/または伝達を変化させおよび／または制御することの
できる新規物質の探索に有用である。本発明のＤｍＧＰＣＲは、神経ペプチドと
結合する、結果的に治療法に結びつくヒトでのホモログを探査する上でも重要で
ある。このような治療の対象となる疾病や状態の例としては、なかでも、ＨＩＶ
−１またはＨＩＶ−２により引き起こされるウィルス感染などの感染病、疼痛、
癌、パーキンソン病、低血圧、高血圧、糖尿病、肥満、アテローム性動脈硬化、
血栓症、卒中、腎不全、炎症、リウマチ様関節炎、自己免疫疾患や、精神病など
、および、不安、精神分裂病、そううつ病、精神錯乱、痴呆、神経疾患、ひどい
精神遅滞や、ハンチントン病またはツレット症候群などの運動障害を含む神経疾
患などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。本発明のこ
れらおよび他の特徴を以下に述べる。
【００１２】 一つの実施形態において、本発明は、配列番号：２，４、６、８、１０，１２
，１４，１６，１８，２０，２２または２４のいずれかに記載されたアミノ酸を
含む精製単離されたＤｍＧＰＣＲポリペプチド、または、ＤｍＧＰＣＲに特異的
なエピトープを含むそのフラグメントを提供する。なお、「に特異的なエピトー
プ」は、後ほど述べるように、ＤｍＧＰＣＲに特異的な抗体により認識されるＤ
ｍＧＰＣＲレセプターの一部を意味している。より好ましい実施形態は、表４に
示される配列番号：２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２
２，または２４の完全アミノ酸配列を含む精製単離ポリペプチドを含む。これら
のアミノ酸配列は、ＤｍＧＰＣＲをコード化したポリヌクレオチド配列（配列番
号：１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，または２３，
以下の表４に記載）より推論したものである。ここで、用語「ＤｍＧＰＣＲ」を
単数で表したが、これは、この用語「ＤｍＧＰＣＲ」が以下に例示する１０個の
アミノ酸配列それぞれを含有することが意図されているためである。
【００１３】 ここで提供された配列は特定のショウジョウバエ配列であるが、本発明は、そ
の範囲内に、ＤｍＧＰＣＲの対立遺伝子の変異体や、他の脊椎動物における異な
ったの形状のＤｍＧＰＣＲも含んでいる。
【００１４】 細胞外のエピトープは、ＤｍＧＰＣＲなどのレセプターに結合する抗体や他の
結合物質を作成および探索するのに特に有用であると認識されている。このため
、もう一つの実施形態では、本発明は、ＤｍＧＰＣＲの細胞外領域（例えば、Ｎ
末端細胞外領域、または３種の細胞外ループの内のうちの一つ）の少なくとも一
つを含む精製単離ポリペプチドを提供する。ＤｍＧＰＣＲのＮ末端細胞外領域を
含む精製単離されたポリペプチドが特に好ましい。また、ＤｍＧＰＣＲのＮ末端
細胞外領域、ＤｍＧＰＣＲの膜貫通領域、ＤｍＧＰＣＲの膜貫通領域を連結する
細胞外ループ、ＤｍＧＰＣＲの膜貫通領域を連結する細胞内ループ、ＤｍＧＰＣ
ＲのＣ末端細胞内領域、およびこれらの融合体よりなる群から選ばれたＤｍＧＰ
ＣＲのフラグメントを含む精製単離ポリペプチドも好ましい。このようなフラグ
メントは、天然レセプターの連続部分であるかもしれない。しかし、ここに提供
されるＤｍＧＰＣＲ遺伝子やそのタンパク質配列についての知識は、この天然タ
ンパク質では隣接していないいろいろな領域の組換えを可能とすることも認識す
べきであろう。
【００１５】 もう一つの実施形態では、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコード化す
るヌクレオチド配列を含む精製単離ポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノ
ムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの混合物、単一もしくは二本鎖に
関係なく）を提供する。このようなポリヌクレオチドは、組換え的にレセプター
を発現するのに有用で、また細胞内でのレセプターの発現を（例えば、ノーザン
ハイブリダイゼーションやインサイチュハイブリッド形成法アッセイで）検出す
るためにも有用である。また、これらのポリヌクレオチドは、治療目的あるいは
異常なＤｍＧＰＣＲの発現に特徴的な疾病または状態のモデルを提供する目的で
、培養細胞、組織、または動物内でのＤｍＧＰＣＲの発現を抑制するアンチセン
ス分子や他の分子を設計する上で有用である。なお、宿主細胞中の組換えのない
天然の完全染色体は、本発明のポリヌクレオチドの定義から明らかに外れている
。好ましいポリヌクレオチドは、配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３，
１５，１７，１９，２１、または２３に示されるいずれかの配列を持っており、
それぞれ天然のＤｍＧＰＣＲ配列に相当している。普遍的遺伝暗号の縮重のため
、配列番号：２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２、ま
たは２４で規定されるＤｍＧＰＣＲをコード化している、これ以外のポリヌクレ
オチド配列も存在することもあるかもしれない。
【００１６】 本発明は、また、哺乳動物のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を
含む、次のような精製単離ポリペプチドも提供する。ここで、そのポリペプチド
は、配列番号：１，３，５，７，９，Ｉ１，１３，１５，１７，１９，２１また
は２３で規定される配列を持つポリヌクレオチド、または、これに相補的な非コ
ード鎖とハイブリッドを形成している。なお、ハイブリッドは、次の条件で形成
される。 （ａ）５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１Ｍ塩化ナトリウム、１０％デキスト
ラン硫酸を含むハイブリッド化溶液中で、４２℃、１６時間ハイブリッド化、お
よび （ｂ）０．１％ＳＳＣ、１％ＳＤＳを含む洗液中で、２回３０分間、それぞれ６
０℃で洗浄。
【００１７】 関連する実施形態として、本発明は、本発明のポリペプチドを含むベクターを
提供する。このようなベクターは、例えば、このポリヌクレオチドを有用な量に
まで宿主細胞中で増殖させるのに有用である。このベクターは、本発明のポリヌ
クレオチドが、発現を支配する配列を含むポリヌクレオチドに、実効的に結合し
ている発現ベクターであることが好ましい。このようなベクターは、本発明のポ
リペプチドの組換え生産に有用である。
【００１８】 さらに、もう一つの関連する実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオ
チドまたは本発明のベクターで形質転換あるいは形質移入された宿主細胞を提供
する。前述のように、このような宿主細胞は、ポリヌクレオチドの増幅に有用で
あり、また、ポリヌクレオチドにコード化されているＤｍＧＰＣＲポリペプチド
またはそのフラグメントの発現に有用である。
【００１９】 さらに、もう一つの関連実施形態では、本発明は、ＤｍＧＰＣＲポリペプチド
（または、そのフラグメント）の生産方法を提供する。この生産方法は、本発明
の宿主細胞を栄養培地で増殖させるステップ、および細胞または培地からポリペ
プチドまたはその変異体を単離するステップからなっている。ＤｍＧＰＣＲが７
回膜貫通レセプターであるため、用途によっては、例えば活性測定アッセイなど
の用途の場合はそのポリペプチドが埋包された細胞膜を単離することが、また他
の用途ではより完全な単離がより好ましいと考えられる。
【００２０】 さらに、もう一つの実施形態では、本発明は、本発明のＤｍＧＰＣＲに特異的
な抗体を提供する。抗体の特異性についてはより詳細に以下に述べられる。しか
し、過去の文献に記載されたポリペプチドから作りうる抗体や、偶然にＤｍＧＰ
ＣＲと交差反応することのできる抗体（例えば、両ポリペプチド中に似たエピト
ープが偶然存在するため）は、「交差反応」抗体であることは強調されるべきで
ある。このような交差反応抗体は、ＤｍＧＰＣＲに「特異的」な抗体ではない。
ある抗体がＤｍＧＰＣＲに特異的であるかどうか、または、もう一つの既知のレ
セプターと交差反応するかどうかを決めるには、公知の技術、例えば、ウェスタ
ンブロットアッセイなどいくつかのアッセイのいずれかを使って行われる。Ｄｍ
ＧＰＣＲを発現する細胞を同定し、またＤｍＧＰＣＲリガンド結合活性を調節す
るためには、ＤｍＧＰＣＲのエピトープに特異的に結合する抗体が好ましい。
【００２１】 一つの好ましい実施形態の変形として、本発明は、モノクローナル抗体を提供
する。このような抗体を産生するバイブリドーマも、本発明の態様に含まれる。
さらにもう一つの変形として、本発明はヒト化抗体を提供する。ヒト化抗体は生
体外での治療指標として有用である。
【００２２】 もう一つの変形として、本発明は、ポリクローナル抗体を含む無細胞組成物を
提供する。なお、ポリクローナル抗体の内少なくとも一つの抗体は、本発明のＤ
ｍＧＰＣＲに特異的な抗体である。動物から分離される抗血清は、一つの例示組
成物であり、水または他の希釈剤、腑形剤、または担体に再懸濁された抗血清の
抗体成分を含む組成物もまた同じである。
【００２３】 さらにもう一つの関連実施形態として、本発明は、ＤｍＧＰＣＲに特異的な抗
体に対して特異的な抗イディオタイプ抗体を提供する。
【００２４】 抗体が、化学的にあるいは組換え的に単離可能な比較的小さな抗体結合領域を
持つことは、よく知られている。このような領域は、それ自体、有用なＤｍＧＰ
ＣＲ結合分子であり、またヒト抗体に再導入されるか、毒素あるいは他のポリペ
プチドと融合されてもよい。さらにもう一つの実施形態として、本発明は、Ｄｍ
ＧＰＣＲ特異的抗体のフラグメントを含むポリペプチドを提供する。なお、この
フラグメントおよぼこのポリペプチドは、ＤｍＧＰＣＲに結合する。例を限定し
ないために、本発明は、1本鎖抗体やＣＤＲグラフト抗体であるポリペプチドを
提供する。
【００２５】 また、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体からなり、例え
ば製薬的に許容できる担体と共に製剤された組成物も、本発明の範囲の中に含ま
れる。
【００２６】 本発明は、本発明の抗体の使用方法も提供する。例えば、本発明は、抗体がレ
セプターと結合する条件下で、ＤｍＧＰＣＲとＤｍＧＰＣＲに特異的な抗体とを
接触させるステップを含むＤｍＧＰＣＲのリガンド結合を調整する方法を提供す
る。
【００２７】 脳内で発現される哺乳類のＤｍＧＰＣＲホモログは、ＤｍＧＰＣＲ伝達活性の
異常が、神経的または心理的障害と相関しているかも知れないことを示唆してい
る。本発明は、神経的または精神医学的障害の治療法を提供する。この治療法は
、このような治療を必要とする哺乳類に、本発明の抗体様ポリペプチドを、哺乳
類のニューロン中のＤｍＧＰＣＲに結合するリガンドを調節するのに足る量を投
与することを特徴とする。ＤｍＧＰＣＲの哺乳類ホモログは、他の組織、例えば
、すい臓（および、特にすい島組織）、下垂体、骨格筋、脂肪組織、肝臓や甲状
腺などで発現される可能性があるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００２８】 本発明は、ＤｍＧＰＣＲに結合する化合物を特定するためのアッセイも提供す
る。このアッセイの一つの例は、（ａ）ＤｍＧＰＣＲを含む組成物を、ＤｍＧＰ
ＣＲと結合すると予想される化合物と接触させるステップと、（ｂ）その化合物
とＤｍＧＰＣＲとの結合を測定するステップを含む。一つの変化例において、上
記組成物は、表面にＤｍＧＰＣＲを発現する細胞を含む。さらにもう一つの変化
例は、単離ＤｍＧＰＣＲ、またはＤｍＧＰＣＲを含む細胞膜が使用される。結合
を、例えば標識化合物を使用して直接測定してもよいし、あるいは、化合物によ
り引き起こされるＤｍＧＰＣＲの細胞内情報伝達を測定することなどいくつかの
間接的な技法を用いて測定してもよい。
【００２９】 本発明は、ＤｍＧＰＣＲとＤｍＧＰＣＲ結合パートナーとの間の結合のモジュ
レーターを特定する方法も提供する。この方法は、（ａ）ＤｍＧＰＣＲ結合パー
トナーと、ＤｍＧＰＣＲを含む組成物を、推定されるモジュレーターの存在下お
よび不存在下で接触させるステップ、（ｂ）結合パートナーとＤｍＧＰＣＲとの
間の結合を検出するステップ、次いで、（ｃ）推定モジュレーターの存在下で起
こる結合パートナーとＤｍＧＰＣＲ間の結合と、推定モジュレーター不存在下の
結合とを比較し、その増減から、推定モジュレーター化合物またはモジュレータ
ー化合物を特定するステップ、を含む。
【００３０】 ＤｍＧＰＣＲ活性を刺激するＤｍＧＰＣＲ結合パートナーは、ＤｍＧＰＣＲの
情報伝達が不足していることを特徴とする疾病状態や状況において、作動薬とし
て有用である。リガンドが仲介するＤｍＧＰＣＲ情報伝達をブロックするＤｍＧ
ＰＣＲ結合パートナーは、ＤｍＧＰＣＲ拮抗薬として、過度のＤｍＧＰＣＲ情報
伝達を特徴とする疾病状態や状況に対して有用である。また、ＤｍＧＰＣＲモジ
ュレーターは、ＤｍＧＰＣＲポリヌクレオチドやポリペプチドと同様に、このよ
うな疾病や状況の診断用アッセイとして有用である。
【００３１】 もう一つの態様として、本発明は、疾病や異常状況の治療方法を提供する。こ
の治療方法は、そのような治療を必要とする患者に、配列番号：２，４，６，８
，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，または２４の群から選ばれるポ
リペプチドの活性や発現を調整する物質を投与することによる。
【００３２】 もう一つの態様として、本発明は、疾病や障害の診断手段として、あるサンプ
ル中のポリペプチドを検出する方法を取り上げる。なお、この方法は、次のステ
ップからなっている。（ａ）配列番号：２，４，６，８，１０，１２，１４，１
６，１８，２０，２２，または２４の群から選ばれるポリペプチドの核酸標的領
域と、ハイブリッド化アッセイ条件下で、ハイブリッド化する核酸プローブと、
そのサンプルを接触させるステップ、（ただし、前記プローブは、そのポリペプ
チドあるいはそのフラグメントをコード化する核酸配列からなっている。）（ｂ
）プローブ：標的領域ハイブリッドの存在あるいは量を、疾病の指標として検出
するステップ。
【００３３】 本発明の好ましい実施形態において、疾病は、代謝異常、リウマチ様関節炎、
動脈硬化症、自己免疫疾患、組織移植、心筋梗塞、心筋症、卒中、腎不全、酸化
ストレス関連神経変性異常や癌などの群の中から選ばれる。
【００３４】 障害または疾病の治療に有用な物質は、問題の疾病や異常の治療に対応する活
性について、少なくとも一つの体外アッセイにおいてポジティブな結果を示すこ
とが好ましい。ポリペプチドの活性を調整する物質としては、例えば、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチド、作用薬や拮抗薬、およびプロテインキナーゼが好まし
いが、これらに限定されるものではない。
【００３５】 ハイブリッド化条件は、、他の核酸分子の存在下でのみ、遺伝子とのハイブリ
ッド化が起こるような条件でなければならない。厳格なハイブリッド化条件にお
いてのみ、高い相補性を持つ核酸配列がハイブリッド化する。２０個の隣接する
ヌクレオチド中に１または２個のミスマッチを持つような核酸のハイブリッド化
が阻害されるような条件が好ましい。このような条件は格別に規定される。
【００３６】 サンプル中の遺伝子の検出が診断に利用できる疾病には、核酸（ＤＮＡおよび
／またはＲＮＡ）が、通常の細胞と較べて増幅されているような疾病を含んでい
る。なお、［増幅］とは、細胞中のＤＮＡまたはＲＮＡの数が、正常細胞に比べ
増加していることを意味している。
【００３７】 サンプル中の核酸の検出で診断できる疾病には、好ましくは、中枢神経系およ
び代謝病が含まれる。本発明の核酸プローブ法に適する試験サンプルには、例え
ば、細胞、細胞の核酸抽出物、または生物的流体が含まれる。前述の方法に用い
られるサンプルは、アッセイ形式、検出法やアッセイされる組織、細胞または抽
出物により変動するとみられる。細胞の核酸抽出物を調整する方法は公知であり
、使用する方法に適したサンプルを得るのに利用されうる。
【００３８】 また、本発明のこれ以外の特徴や変形は、本分野に精通するものにとって、詳
細な説明も含めた本出願全体から明らかであり、これらの特徴のすべても本発明
の態様とすべきである。同様に、ここに記載の本発明の特徴は、再編成して、新
たな実施形態とすることも可能である。このことは、本願記載の特徴を結合して
、ここに本発明の態様あるいは実施形態として具体的に言及されたかどうかに係
わらない。また、ここに本発明において決定的に重要であると記載された制限の
みが、そのように見なされるべきである。ここで決定的に重要であると記載され
ていない制限条件を欠いた本発明の変形は、本発明の態様とみなすべきである。
【００３９】 発明を実施するための最良の形態 本発明は、特に、ショウジョウバエメラノガスターＧタンパク質結合レセプタ
ー（ＤｍＧＰＣＲ）またはその一部をコードする単離精製されたポリヌクレオチ
ド、これらのポリヌクレオチドを含むベクター、これらのベクターで形質転換さ
れた宿主細胞、ＤｍＧＰＣＲを生産プロセス、上記ポリヌクレオチドおよびベク
ターの使用方法、単離および精製されたＤｍＧＰＣＲ、ＤｍＧＰＣＲ活性を調節
する化合物を探索する方法、および、哺乳類あるいは他の脊椎動物のＤｍＧＰＣ
Ｒホモログを同定するための方法を、提供する。
【００４０】 本文書では、様々な定義がされている。ほとんどの用語は、当分野には公知の
用語に帰すべき意味を持つ。本文書において以下又その他のところに特に定義さ
れた用語は、本発明の文脈全体より与えられる意味を持ち、典型的には当業者に
は理解可能なものである。ここに述べられ、当業者に理解されている「合成され
た」とは、酵素法ではなく純粋に化学的方法に生産されたポリヌクレオチドをさ
す。「全」合成ＤＮＡ配列とは、したがって、完全に化学的手段で作られたもの
、また、「部分」合成ＤＮＡは、得られるＤＮＡの一部のみが化学的手段で作ら
れたものである。用語「領域」は、バイオ分子の一次構造の物理的隣接部分であ
る。タンパク質の場合、ある領域とは、そのタンパク質のアミノ酸配列の隣接部
分で定義される。用語「ドメイン」は、バイオ分子の既知のあるいは想定される
機能に寄与できる構造部分をさす。ドメインは、領域あるいはその一部分と同じ
大きさを持っていても良く、ドメインは、バイオ分子の一部分を含んでもよい。
領域の全体または一部の以外に、特定領域とは異なるバイオ分子の一部分を含ん
でもよい。ＧＰＣＲタンパク質ドメインの例としては、細胞外（すなわち、Ｎ末
端）、膜貫通および細胞内（すなわち、Ｃ末端）ドメインを含むが、これに限定
されるものではない。これらは、ＧＰＣＲの類似した名称の領域、ＧＰＣＲの７
本の各膜貫通部分、隣接する膜貫通部分を連結するループ部分（細胞外および細
胞内）と同じ広がりを持っている。
【００４１】 ここで使用される用語「活性」は、応答に影響する、すなわち暴露または刺激
に応答して測定可能な影響をもつ直接または間接的な結合を示唆または示す測定
可能な指標であり、例えば、ある物質が本発明のポリペプチドやポリヌクレオチ
ドと直接結合する際の親和性、またはある刺激または現象の後での上流または下
流のタンパク質量または他の類似機能の測定値などを含んでいる。
【００４２】 ここで使用される用語「抗体」は、完全無傷抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａ
ｂ）２、およびこれらのフラグメントをさす。完全無傷抗体には、マウスモノク
ローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などのモノクローナル抗体を含む。
【００４３】 ここで使用される用語「結合」は、タンパク質または複合体、結合タンパク質
またはその複合体、あるいはこれらの組み合わせ間の、物理的化学的相互作用を
意味する。結合は、イオン的、非イオン的、水素結合、ファンデアワールス、疎
水相互作用などを含む。物理的相互作用、結合は、直接的にも間接的にも可能で
、間接的には他のタンパク質や化合物の影響による。直接結合は、他のタンパク
質や化合物を経由したりこれらの影響に依存することなく、また、他の化学中間
体の存在が実質的に無い状態で起こる相互作用を持つことを指す。
【００４４】 ここで使用される用語「化合物」は、同定可能な化学品または分子であり、低
分子、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチド、核酸などを含むが、こ
れに限定されるものではない。これらの化合物は、天然品でも合成品でもよい。
【００４５】 ここで使用される用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチドユニット間のワ
トソンクリック塩基対形成を指す。
【００４６】 ここで使用される用語「接触」は、ある化合物を、本発明のポリペプチドまた
はポリヌクレオチドの物理的近傍に、直接的間接的に持っていくことを指す。ポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドは、どのような緩衝液、塩、溶液などに入っ
ていてもよい。接触は、例えば、化合物を、核酸分子またはＧＰＣＲまたはその
フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む、ビーカー、マイクロタイタ
ープレート、細胞培養フラスコ、またはジーンチップなどのマイクロアレーなど
に入れることも含む。
【００４７】 ここで使用される用語「相同性ヌクレオチド配列」または[相同性アミノ酸配
列」またはこれらの変化例は、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで少なくとも
特定の割合の相同性を示すこと特徴とする配列を指す。相同性ヌクレオチド配列
は、タンパク質のアイソフォームをコードする配列も含む。このようなアイソフ
ォームは、例えばＲＮＡの選択的スプライシングの結果、同一生物体の異なる組
織に発現されうる。他方、アイソフォーム」は、異なる遺伝子によりコードされ
ていてもよい。相同性ヌクレオチド配列は、昆虫を除く種、例えば哺乳類、の特
定のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。相同性ヌクレオチド配列
は、また、ここに規定するヌクレオチド配列の自然に起こる対立遺伝子の変化や
変異も含まれるが、これに限定されるものでない。しかし、相同性ヌクレオチド
配列は、他の既知ＧＰＣＲをコードするヌクレオチド配列は含んでいない。相同
性アミノ酸配列は、少しのアミノ酸の置換をコードしたアミノ酸配列や、神経ペ
プチド結合および／または伝達活性をもつポリペプチドを含んでいる。しかし、
相同性アミノ酸配列は、他の既知ＧＰＣＲをコードするアミノ酸配列を含んでい
ない。相同性の比率は、例えば、デフォルト値を使用してGap プログラム（ウィ
スコンシン配列分析パッケージ, Ver.8 for Unix, Genetics Computer Group, U
niversity Research Park, Madison WI）によって決定でき、それはＳｍｉｔｈ
とＷａｔｅｒｍａｎ（［Adv. App1. Math., 1981,2,482-489］、出典明示して、
その全体を本明細書の一部とみなす）のアルゴリズムを用いる。
【００４８】 ここで使われる用語「単離」核酸分子は、元来の環境から分離された核酸分子
（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。単離核酸分子には、ベクター中に取り込まれた
組換えＤＮＡ分子，異種の宿主細胞に入った組換えＤＮＡ分子、完全または部分
精製核酸分子や合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含むが、これに限定するものでは
ない。
【００４９】 ここで使われる用語「調整する」または「修飾する」は、特定の活性またはタ
ンパク質の量、質または効果を、増加または減少させること意味する。
【００５０】 ここで使われる用語「オリゴヌクレオチド」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）に使われるのに十分な塩基数を持つ一連の連鎖ヌクレオチド残基を指す。こ
の短い配列は、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列により決められ（または設計され）、
特定の細胞または組織中で、同一、類似または相補性ＤＮＡまたはＲＮＡを、増
幅させ、確認し、その存在を明らかにするのに使われる。オリゴヌクレオチドは
、約１０個以上５０個までのヌクレオチドを持つＤＮＡ配列の一部であり、好ま
しくは、１５から３０のヌクレオチドを持つ。それらは化学合成され、プローブ
として利用してもよい。
【００５１】 ここで使われる用語「プローブ」は、可変長の核酸配列であり、用途にもよる
が、好ましくは１０以上６，０００まで個のヌクレオチドを持つ。それらは、同
一、類似、または相補的な核酸配列の検出に用いられる。天然または組換え源か
ら得られたプローブの長さが大きくなる程、オリゴマーに較べより特異的で、よ
りハイブリッド形成が遅くなる。それらは、一本鎖または二本鎖のいずれかで、
ＰＣＲ、膜法ハイブリッド形成、ＥＬＩＳＡなどの技法おいて特異性が発揮でき
るように設計されている。
【００５２】 用語「阻止する」は、生物体が異常な状態に変化する可能性を減少させること
を指す。
【００５３】 用語「治療する」は、治療効果をもつこと、生物体の異常な状態を、少なくと
も部分的に軽減または抑止することを指す。
【００５４】 用語「治療効果」は、異常な状態を引き起こすかそれに寄与する阻害または活
性化因子を指す。治療効果は、異常状態の症状のうち、少なくとも一つの症状を
ある程度緩和する効果をもつ。異常状態の治療に関連し、治療効果は、以下の一
つ以上を指す。（ａ）細胞の増殖、成長、および／または分化の増加、（ｂ）細
胞死の阻害（すなわち、減速または停止）、（ｃ）退化の阻害、（ｄ）異常状態
に伴う症状のうち、少なくとも一つの症状のある程度の緩和、および、（ｅ）影
響を受けた細胞群の機能の増加。異常状態に対して有効な化合物は、以下に記載
のようにして同定可能である。
【００５５】 用語「異常状態」は、ある生物体の細胞または組織が、その本来持つ機能から
外れたを機能を持つことを指す。異常状態は、細胞の増殖、細胞の分化、細胞の
情報伝達、または細胞の生存に関係する。異常状態は、また、肥満、網膜退化な
どの糖尿病合併症、グルコースの摂取と代謝や脂肪酸摂取と代謝の異常などを含
んでもよい。
【００５６】 異常な細胞増殖状態は、線維症や糸球体間質障害などの癌、異常な血管壊死、
脈管形成、創傷治癒、乾癬、真正糖尿病、炎症などを含む。
【００５７】 異常な分化状態は、神経変性障害、遅い創傷治癒速度、および遅い組織移植治
癒速度などを含むが、これに限定されない。
【００５８】 異常な細胞情報伝達状態は、過度の神経伝達物質活性などの精神障害を含むが
、これに限定されるものではない。
【００５９】 異常な細胞生存状態は、プログラム細胞死（アポトーシス）経路が活性化また
は排除されている状態などに関連する。一連のプロテインキナーゼがアポトーシ
ス経路に関係している。プロテインキナーゼのいずれの機能異常も、細胞の不死
または時期の早い細胞死につながりうる。
【００６０】 用語「投与する」は、生物体の細胞または組織に、ある化合物を受け入れさせ
る方法に関する。生物体の細胞または組織が、その生物体の内部または外部にあ
る時のいずれにおいても、異常状態は防止できるし治療することもできる。生物
体の外部に存在する細胞は、細胞培養プレート内で維持または成長させることが
可能である。 生物体内にある細胞に対して、化合物を投与する技法は、たくさん知られている
。 これらの技法は、経口、非経口、経皮、インジェクションやエアゾール投与法
などを含むが、これに限定するものではない。生物体外部にある細胞に対して化
合物を投与する方法も数多く知られている。例えば、細胞マイクロインジェクシ
ョン法、形質転換法やキャリアー法などが含まれるが、これらに限定するもので
はない。
【００６１】 ある生物体に、シグナル伝達経路に異常を持つ一群の細胞に対してある化合物
を投与することで、異常状態を予防または治療することが可能である。生物体の
機能に与える化合物投与が与える効果を、次いで測定できる。生物体は、好まし
くは、マウス、ウサギ、モルモットまたはヤギで、より好ましくは、モンキー（
猿）またはエイプ（類人猿）である。
【００６２】 「増幅」は、細胞中のＤＮＡまたはＲＮＡの数が、正常細胞に比べて、多くあ
ることを意味する。ＲＮＡの場合、いくつかの正常細胞では基礎的なＲＮＡの発
現はないため、「増幅」とは、細胞中にＲＮＡが検出可能な程度存在することと
なる。他の正常細胞では、発現の基礎レベルが存在し、このためこのような場合
は、増幅は、基礎レベルに比べ１〜２倍、好ましくはそれ以上の検出ができると
いうこととなる。
【００６３】 ここで用いる熟語「ストリンジェントハイブリッド形成条件」または「ストリ
ンジェント条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドがその標
的配列とハイブリッドを形成し、他の配列とはハイブリッド形成しない条件を指
す。ストリンジェント条件は配列に依存すし、異なる状況では異なるだろう。よ
り長い配列は、より高温でハイブリッド形成する。一般に、厳格条件には、限定
されたイオン強度とｐＨで、特定の配列の熱的融点（Ｔｍ）より約５℃低い温度
が選ばれる。その融点は、（限定されたイオン強度、ｐＨと核酸濃度下）平衡状
態で、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリッド形成する
温度をである。標的配列は通中過剰に存在するため、Ｔｍでは、プローブの５０
％が平衡状態で使われている。厳格条件は、典型的には、塩濃度が約１．０Ｍナ
トリウムイオン、典型的には約０．０１ないし１．０Ｍナトリウムイオン（また
は他の塩）、ｐＨが７．０から８．３で、短いプローブ、プライマーまたはオリ
ゴヌクレオチドでは温度が少なくとも３０℃、また長いプローブ、プライマー、
またはオリゴヌクレオチドでは温度が少なくとも６０℃の条件である。厳格条件
は、ホルムアミドなどの不安定化試薬を添加して作ってもよい。
【００６４】 アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に、左から右に表される。アミノ
基とカルボキシ基は配列には表記しない。ヌクレオチド配列は、一本鎖のみで表
され、５’から３’方向に、左から右に表記される。ヌクレオチドとアミノ酸は
、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学品命名法委員会（Biochemical Nomenclature Commi
ssion）の勧める様式、または、（アミノ酸については）三文字コードで表記さ
れる。
【００６５】 本発明のゲノムＤＮＡは、本発明のポリペプチドをコードするタンパク質コー
ド領域からなり、またこの対立遺伝子変異も含んでいる。多くの遺伝子、ゲノム
ＤＮＡは転写されてＲＮＡ転写物になり、ＲＮＡ転写物は１回以上のスプライシ
ング現象を受ける。この際、転写物のイントロン（すなわち、非コード領域）は
除去、またはスプライスアウトされる。ＲＮＡ転写物は、異なったメカニズムの
スプライスを受けることもでき、異なったＲＮＡの切除を受けることもできる。
異なったスプライシングを受けたものの同じＤｍＧＰＣＲポリペプチド配列を保
持することもある。このような転写物は、スプライス変異体とよばれ、これも本
発明の範囲内である。本発明に含まれるスプライス変異体は、したがって、同一
の元ゲノムＤＮＡによりコードされていた、異なったｍＲＮＡ転写物である。対
立遺伝子変異体は、野生型の遺伝子配列の修飾型であり、修飾は染色体の分離、
または遺伝的突然変異を引き起こす条件への暴露の間の組換えの結果として起こ
る。対立遺伝子変異体は、野生型の遺伝子と同じく、自然に発生するはいれつで
あり、体外の操作で起こる非天然発生型の変異体とは異なる。
【００６６】 本発明は、ＤｍＧＰＣＲをコードするＲＮＡポリヌクレオチドの逆転写により
得られるｃＤＮＡも含有する。（通常、相補的鎖から第二の鎖を合成し二重鎖Ｄ
ＮＡを与える。）
【００６７】 ＤｍＧＰＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、配列番号：１，３，５
，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，または２３のいずれかに規定
されるものが好ましい。本発明の好ましいＤＮＡは、ＤＮＡのワトソンクリック
塩基対形成ルールに従って、コード鎖から間違いなく推定することのできる配列
を持つ二重鎖分子ならびに相補分子（「非コード鎖」または「補体」）である。
本発明の特定ＤｍＧＰＣＲポリペプチドのいずれかをコードする他のポリヌクレ
オチドで、有名な遺伝コードの縮重により、ここの記載の特定のポリヌクレオチ
ドとは配列の異なる本発明のＤｍＧＰＣＲポリペプチドのいずれかをコードする
異なった配列を持つものも好ましい。
【００６８】 本発明は、他種、好ましくは哺乳類の、ＤｍＧＰＣＲのＤＮＡのホモログも含
んでいる。種ホモログ、時にはオルソログとも呼ばれる、は、一般に、少なくと
も３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくと
も６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくと
も８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくと
も９８％、または少なくとも９９％以上、本発明のＤＮＡと相同性を持っている
。一般に、本発明のポリヌクレオチドの配列相同性比率は、候補配列中のヌクレ
オチド塩基が持つ、特定のポリヌクレオチド配列で記載されているＤｍＧＰＣＲ
配列中のヌクレオチドと同一のヌクレオチドの比率として計算してよい。この比
率の計算は、２つの配列を整列し、必要ならギャップを入れて、配列の一致が最
大となるようにした後になされる。
【００６９】 本発明により与えられるポリペプチド配列情報により、当業界で公知で広く実
践されている技法で、コードされたポリペプチドを大量に発現することが可能と
なる。本発明のポリヌクレオチドはまた、有名な手法、サザンおよび／またはノ
ーザンハイブリッド形成法やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで、対立遺伝
子変異体や種ホモログなどの関連ＤｍＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドの同定や単離を可能とする。関連ポリヌクレオチドの例は、ゲノム配
列を含み、対立遺伝子変異体を含み、また、ＤｍＧＰＣＲのポリペプチドホモロ
グ、およびＤｍＧＰＣＲの持つ生物的免疫的および／または物理的特徴のうち一
つ以上の特徴を持つ構造類似のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含
む。ＤｍＧＰＣＲのタンパク質ホモログをコードする遺伝子は、サザンおよび／
またはＰＣＲ分析で同定され、ＧＰＣＲ障害の動物モデルで有用である。ＤｍＧ
ＰＣＲのＤＮＡ配列の知識はまた、サザンハイブリッド形成法またはポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使うことで、プロモーター、オペレーター、エンハンサ
ー、レプレッサーなどのＤｍＧＰＣＲ発現制御調整配列をコードするゲノムＤＮ
Ａ配列の同定を可能とする。本発明のポリヌクレオチドはまた、細胞のＤｍＧＰ
ＣＲ発現能力を検出するハイブリッド形成アッセイに有用である。本発明のポリ
ヌクレオチドは、また、ＤｍＧＰＣＲの遺伝子座の遺伝的変化を特定するために
有用な診断方法の基礎を提供する。また、この遺伝子座の変化に関する情報は、
診断および治療方針の決定に有用である。
【００７０】 ＤｍＧＰＣＲポリペプチドをコードする完全長ポリヌクレオチドに関する本開
示は、当業界で普通の技能を持つ労働者に、その完全長ポリヌクレオチドのあら
ゆるフラグメントを提供することとなる。本発明は、このため、ＤｍＧＰＣＲを
コードするポリヌクレオチド中の、少なくとも１４個、好ましくは少なくとも１
６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含む、ＤｍＧＰ
ＣＲをコードするポリヌクレオチドのフラグメントを提供する。好ましくは、本
発明のフラグメントヌクレオチドは、ＤｍＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチ
ド配列に独特の配列、および、このために、高度に厳格なまたは中程度に厳格な
条件でのみ（すなわち、特異的に）、ＤｍＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチ
ド（または、そのフラグメント）とハイブリッド形成する配列を含む。本発明の
ゲノム配列のポリヌクレオチドフラグメントは、コード領域に独特の配列だけで
なく、イントロン由来の完全長配列のフラグメント、調節領域、および／または
他のイントロン由来の配列も含んでいる。本発明のポリヌクレオチドに特有の配
列は、他の既知ポリヌクレオチドと配列を比較することにより認識が可能で、当
業界で広く使用されている整列プログラム、例えば公共の配列データベースから
提供されるもの、を使用することで同定が可能である。このような配列はまた、
サザンハイブリッド形成分析法により、あるポリヌクレオチドがハイブリッド形
成可能な、ゲノムＤＮＡのフラグメントの数を決定することができるようにする
。本発明のポリヌクレオチドは、検出を容易にするため、放射性、蛍光および酵
素ラベルなどの手段で標識することができる。
【００７１】 フラグメントポリヌクレオチドは、完全長またはフラグメントＤｍＧＰＣＲポ
リヌクレオチドの検出用プローブとして、特に有用である。一つ以上のポリヌク
レオチドを、ＤｍＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドの存在を検出するため
に、キット中に入れることができ、または、ＤｍＧＰＣＲをコードするポリヌク
レオチド配列の変異を検出するのに使用することができる。
【００７２】 本発明はまた、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡで、中程度厳格
条件または高度厳格条件で、配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３，１５
，１７，１９，２１，または２３のポリヌクレオチドの非コード鎖または補体と
ハイブリッド形成するＤＮＡも含んでいる。
【００７３】 高度厳格ハイブリッド化条件は、例えば、次のようなものである。 ５０％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１０％デキストラン硫酸を含むハイブリッ
ド溶液中で、４２℃でハイブリッド化、０．１ＸＳＳＣと１％ＳＤＳを含む洗浄
溶液を用い６０℃で３０分間洗浄。下記の文献のように、同程度の厳格性が、温
度や緩衝液、または塩濃度の変更で達成できることはよく知られている。［Ausu
be1ら、(編集), PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons (1994),
pp. 6.0.3 to 6.4.10］。ハイブリッド化条件の調整は、経験的に求めても、あ
るいはプローブの長さやグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対の比率から計算で
求めてもよい。このハイブリッド化条件は、次の文献に記載の方法により計算で
きる。［Sambrookら(編集)、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold S
pring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp.
9.47 to 9.51］。
【００７４】 本発明のポリヌクレオチドを含むプラスミドやウィルスＤＮＡベクターなどの
自己複製組換え発現構築物も、また提供される。ＤｍＧＰＣＲをコードするポリ
ヌクレオチドが内在性または外来発現制御ＤＮＡ配列と結合したまた他の発現構
築物や転写ターミネーターも提供される。発現制御ＤＮＡ配列には、プロモータ
ー、エンハンサー、オペレーター、および調整因子結合サイトが普通含まれ、典
型的には発現構築物が利用される発現システムにより選択される。好ましいプロ
モーターやエンハンサーの配列は、一般的には遺伝子発現の加増能力により選択
されるが、オペレーター配列は一般的に遺伝子発現の調整能力により選択される
。本発明の発現構築物には、その構築物を持つ宿主細胞の同定を可能とする一つ
以上の選択可能なマーカーをコードする配列が含まれる。発現構築物は、また宿
主細胞で相同組換えを助長する、好ましくは促進する配列を含んでいる。本発明
の好ましい発現構築物は、また宿主細胞で複製に必要な配列も含む。
【００７５】 発現構築物は、コードされたタンパク質を生産するのに利用することが好まし
い。また、ＤｍＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチド配列を単に増幅するのに
利用してもよい。
【００７６】 本発明の他の態様により、宿主細胞として、コードされたＤｍＧＰＣＲポリペ
プチドを発現させるために本発明のポリヌクレオチド（または、本発明のベクタ
ー）を含んでいる原核細胞や真核細胞などの細胞が提供される。本発明のポリヌ
クレオチドは、宿主細胞内に、孤立したタンパク質コード領域またはウィルスベ
クターなどの環状プラスミドあるいは線状ＤＮＡの一部として導入されてもよい
。ＤＮＡを宿主細胞に導入する有名な方法で、当業界で普通に使用されている方
法としては、形質転換、形質移入、エレクトロポレーション、核封入、または、
リポソーム、ミセル、ゴースト菌体やプロトプラストなどのキャリアーとの融合
などが挙げられる。本発明の発現システムとしては、バクテリア、酵母、カビ、
植物、昆虫、脊椎動物や哺乳類の細胞システムを挙げることができる。
【００７７】 本発明の宿主細胞は、ＤｍＧＰＣＲに特異的に免疫反応性の抗体を開発するた
めの免疫原の原材料として有用である。本発明の宿主細胞は、細胞は適当な培養
培地で成長させ、求めるポリペプチド生成物を細胞から下記の精製方法で単離さ
せる、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドの大規模生産方法においても有用である。この
ような精製方法としては、当分野では公知の方法、例えば、イムノアフィニティ
ークロマトグラフィー、レセプターアフィニティークロマトグラフィー、疎水相
互作用クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、サイ
ズ排除ろ過、カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー、高圧液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。さらに
、これ以外の精製方法として、目的のタンパク質が、特定のタグ、ラベルやキレ
ート成分を持つ融合タンパク質として発現、精製され、この部分が特定の結合パ
ートナーまたは試薬により認識されるような精製方法も含まれる。精製タンパク
質は、切断して目的のタンパク質に変換するか、元の融合タンパク質のまま放置
することも可能である。融合成分の切断により、切断プロセスの結果としてアミ
ノ酸残基が追加された目的タンパク質を生ずることになるかもしれない。
【００７８】 ＤｍＧＰＣＲ配列の知識は、細胞を修飾して、内在性のＤｍＧＰＣＲの発現を
許しまたは増加させるようにすることができる。（例えば、相同組換えで）細胞
を修飾して、全部または一部、天然に産生するＤｍＧＰＣＲプロモーターを異種
プロモーターの全部または一部で置換して、細胞が高レベルでＤｍＧＰＣＲを発
現するように細胞を修飾し得る。異種プロモーターは、内在性のＤｍＧＰＣＲを
コードする配列に作動可能に連結するように挿入することができる。（例えば、
［PCT International Publication No. WO 94/12650, PCT International Publi
cation No. WO 92/20808, and PCT International Publication N0. WO 91/0995
5.］を参照せよ）。異種プロモーターＤＮＡに加えて、増幅可能なマーカーＤＮ
Ａ（例えば、ａｄａ遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子、およびカルバモイルフォスフェー
トシンターゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼおよびジヒドロオロター
ゼをコードする多機能ＣＡＤ遺伝子）、および／またはイントロンＤＮＡも、異
種プロモーターと共に挿入可能であると考えられる。もしＤｍＧＰＣＲコード配
列に結合すれば、標準的な選別方法によりマーカーＤＮＡの増幅は、細胞内での
ＤｍＧＰＣＲコード配列の並列増幅につながることになる。
【００７９】 本発明により提供されるＤＮＡ配列は、また、機能を持つＤｍＧＰＣＲが発現
できない動物や、ＤｍＧＰＣＲの変異体を発現する動物を開発することを可能と
する。（相同的組み替えまたは「ノックアウト」ストラテジー。（［Capecchi,
Science 244:1288-1292 (1989)］を参照せよ）。このような動物（特に、ラット
、ウサギ、マウスなどの実験小動物）は、ＤｍＧＰＣＲおよびＤｍＧＰＣＲのモ
ジュレータのイン・ビボ活性を研究するモデルとして有用である。
【００８０】 また、ＤｍＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを認識し、ハイブリッド化
するアンチセンスポリヌクレオチドも、本発明により提供される。完全長および
フラグメントアンチセンスポリヌクレオチドの両方が、提供される。本発明のフ
ラグメントアンチセンス分子は、（ｉ）ＤｍＧＰＣＲのＲＮＡを特異的に認識し
ハイブリッド化するもの（ＤｍＧＰＣＲをコードするＤＮＡと他の既知分子をコ
ードするＤＮＡの配列比較により決定できる）。ＤｍＧＰＣＲコードポリヌクレ
オチドに特有の配列の特定は、公的に利用可能な配列データベースの使用、およ
び／または商業的に利用可能な配列比較プログラムの使用で可能となる。目的配
列の特定の後、制限的消化または当業界では既知の各種ポリメラーゼ連鎖反応を
利用た増幅などで、単離を行う。
【００８１】 アンチセンスポリヌクレオチド（好ましくは、１０から２０個の塩基対オリゴ
ヌクレオチド）は、ＤｍＧＰＣＲのｍＲＮＡを発現している細胞による、ＤｍＧ
ＰＣＲ発現の調整に特に関係している。ＤｍＧＰＣＲ発現制御配列またはＤｍＧ
ＰＣＲのＲＮＡに特異的に結合することが可能なアンチセンス核酸（好ましくは
、１０〜２０塩基対オリゴヌクレオチド）が、（例えば、ウィルスのベクターま
たはリポソームなどのコロイド分散システムで）細胞に導入される。アンチセン
ス核酸は、細胞中のＤｍＧＰＣＲ標的ヌクレオチド配列に結合し、標的配列の転
写および／または翻訳を防止する。ホスホロチオエートおよびメチルホスホネー
トアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の治療用途に特に期待される。ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’末端で、ポリ−Ｌ−リジントランスフェ
リンポリリジンまたはコレステロール群でさらに修飾してもよい。転写または翻
訳のいずれのレベルでのＤｍＧＰＣＲ発現の抑制も、異常なＤｍＧＰＣＲ発現を
特徴とする疾病／状態の、細胞または動物モデルを作り出すのに有用である。
【００８２】 本発明に説くＤｍＧＰＣＲ配列は、自然細胞や動物におけるＤｍＧＰＣＲ発現
を調整する新規転写ファクターや、ＤｍＧＰＣＲで形質転換あるいは形質移入さ
れた細胞の設計を容易とする。例えば、亜鉛フィンガードメインを通してＤＮＡ
と結合すルＣｙｓ２−Ｈｉｓ２亜鉛フィンガータンパク質は、構造変化を受けや
すく、異なる標的配列の認識が可能となる。これらの人口亜鉛フィンガータンパ
ク質は、高い親和性と低い解離係数で特定の標的を認識し、遺伝子発現を制御す
る遺伝子スイッチとして作用する。本発明のＤｍＧＰＣＲ標的配列の知識は、構
造を基礎としたモデリングやファージディスプレーライブラリー検索の組み合わ
せなど既知の方法を用いることにより、標的配列に対する亜鉛フィンガータンパ
ク質の設計を容易にする。［Segalら、Proc. Nat1. Acad. Sci. (USA) 96:2758-
2763 (1999); Liuら、Proc, Nat1. Acad. Sci. (USA) 94:5525-5530 (1997); Gr
eismanら、Science 275:657-661 (1997); Chooら、J. MoL Bio1. 273:525-532 (
1997)］。各亜鉛フィンガードメインは、通常３個以上の塩基対を認識する。１
８塩基対の配列は、一般にいずれの既知のゲノムにおいても特有の認識とするに
十分の長さを持つため、直列に６個の亜鉛フィンガーを連結した亜鉛フィンガー
タンパク質は、特定の配列に特異性を示すのに十分だと考えられる。［Segalら
］。ＤｍＧＰＣＲ配列により設計された人工反復亜鉛フィンガーは、ＤｍＧＰＣ
Ｒ発現を促進または抑制する、活性化または抑制ドメインに融合される。他方、
亜鉛フィンガードメインは、ＴＡＴＡボックス結合因子（ＴＢＰ）と融合するこ
とも可能で、亜鉛フィンガーペプチドとＴＢＰ間のリンカー領域の長さを変えて
、転写活性化または抑制作用をもたらすこともできる。［Kimら、Proc. Nat1. A
cad. Sci. (USA) 94:3616-3620(1997)］。このようなタンパク質やそれらをコー
ドするポリヌクレオチドは、生体内でのＤｍＧＰＣＲ発現の制御のため、有用性
を持つこととなる。その新規転写因子は、、転写因子を発現する構築物を移入す
ることにより（遺伝子治療）、またはそのタンパク質を導入することにより、標
的細胞に届けることができる。人工亜鉛フィンガータンパク質は、またアンチセ
ンスまたは触媒的ＲＮＡ法に代わる治療法として用いるために、ＲＮＡ配列に結
合するように設計することもできる。［McCollら、Proc. Natl. Acad. Sci. (US
A) 96:9521-9526 (1997); Wuら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92:344-348 (1
995)］。本発明は、本発明の遺伝子配列に基づき、このような転写因子を設計す
る方法や、これらの配列の遺伝的補体を持つ細胞内（天然または転換）でのＤｍ
ＧＰＣＲ発現の制御に有用なカスタム合成亜鉛フィンガータンパク質も含有して
いる。
【００８３】 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによりコードされている哺乳類Ｄｍ
ＧＰＣＲポリペプチドの精製品や単離品を提供する。現時点では、配列番号：２
，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，または２４のいず
れかのアミノ酸配列を含むＤｍＧＰＣＲポリペプチドが好ましい。
【００８４】 本発明は、本発明の好ましいポリペプチドに対し、少なくとも９９％、少なく
とも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なく
とも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なく
とも５５％、または少なくとも５０％の同一性および／または相同性を示すポリ
ペプチドを含んでいる。本発明の好ましいポリペプチドに対するアミノ酸配列の
「同一性」の比率は、ここに、ＤｍＧＰＣＲ配列中のアミノ酸残基と候補配列中
のアミノ酸残基が一致する比率であると定義する。ただし、これは、両配列を整
列させ、必要ならギャップを入れて同一性が最大となるようにし、また、保存的
置換は配列同一性とはみなさないで比較した結果である。本発明の好ましいポリ
ペプチドに対するアミノ酸配列の「相同性」の比率は、ここに、ＤｍＧＰＣＲ配
列中のアミノ酸残基と候補配列中のアミノ酸残基が一致する比率であると定義す
る。ただし、これは、両配列を整列させ、必要ならギャップを入れて同一性が最
大となるようにし、また、保存的置換は配列同一性とはみなさないで比較した結
果である。
【００８５】 一例としては、相同性比率は、配列比較される同一のアミノ酸残基が整列され
た二つの配列の内、短いほうのアミノ酸残基のパーセントとして計算される。な
お、この時、１００アミノ酸長の４個のギャップを、整列を最大とするために入
れることが許容される。（［Dayboff, in ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRU
CTURE, Vo1. 5, p.124, National Biochemical Research Foundation, Washingt
on, D.C. (1972)］、出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす。）
【００８６】 本発明のポリペプチドは、自然細胞源から単離しても、あるいは化学合成して
もよい。しかし、本発明の宿主細胞を用いた組換え法により作ることが好ましい
。哺乳類の細胞の使用は、転写後の修飾をもたらすと予測される（例えば、グリ
コシル化、切取り、脂質化、およびリン酸化）。この修飾は、本発明の組替え発
現生成物に最適の生物学的活性をもたらすのに必要と考えられる。糖鎖付きおよ
び糖鎖無しのいずれのＤｍＧＰＣＲポリペプチドも、本発明に含まれる。
【００８７】 本発明は、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドの変異体（またはアナログ）も含んでい
る。一例として、１個以上のアミノ酸残基がＤｍＧＰＣＲアミノ酸配列の中に入
った挿入変異体が挙げられる。挿入は、タンパク質の末端のいずれかまたは両方
にに起こすことも、あるいはＤｍＧＰＣＲアミノ酸配列の内部領域に起こすこと
もできる。末端のいずれかまたは両方に残基が付加された挿入変異体としては、
例えば、融合タンパク質やアミノ酸タグまたはラベルを持つタンパク質が挙げら
れる。
【００８８】 挿入変異体は、１個以上のアミノ酸残基が、ＤｍＧＰＣＲアミノ酸配列または
、その生物活性をもつフラグメントにに付加されたものも含む。
【００８９】 本発明の変異体製品として、成熟ＤｍＧＰＣＲ製品、すなわち、アミノ酸残基
の付加でリーダーまたはシグナル配列が除去されたＤｍＧＰＣＲ製品も含む。付
加アミノ末端残基は、他のタンパク質由来でもよく、あるいは特定のタンパク質
由来であると特定できない１個以上の残基を含んでいてもよい。１位にメチオニ
ン残基を付加したＤｍＧＰＣＲ製品（Ｍｅｔ−１−ＤｍＧＰＣＲ）や、２位と１
位にメチオニンとリジン残基を付加した変異体（Ｍｅｔ−２−Ｌｙｓ−１−Ｄｍ
ＧＰＣＲ）も、想定されている。Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ，Ｌｙｓ残基（または
、1個以上の塩基性残基）が付加したＤｍＧＰＣＲ変異体は、バクテリア宿主細
胞での組換えタンパク質の生産量増加に特に有用である。
【００９０】 本発明は、特定の発現システム利用の結果としてアミノ酸残基が付加したＤｍ
ＧＰＣＲ変異体も含む。例えば、目的のポリペプチドをグルタチオン−Ｓ−トラ
ンスフェラーゼ融合ポリポプペプチドとして発現するベクターは、目的ポリペプ
チドからＧＳＴ成分を切除後、1位にグリシン残基が付加された目的ポリペプチ
ドを提供する。他のベクターシステムで発現の結果できる変異体も含まれる。
【００９１】 挿入変異体は、ＤｍＧＰＣＲのアミノ末端および／またはカルボキシ末端が、
他のポリペプチドに融合されている融合タンパク質も含む。
【００９２】 他の態様とした、本発明は、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドの１個以上のアミノ酸
残基が除かれた欠失変異体を提供する。削除は、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドの両
端で起こり、ＤｍＧＰＣＲの１個以上の非末端アミノ酸残基が切断される。欠失
変異体は、このためＤｍＧＰＣＲポリペプチドのフラグメントも含んでいる。
【００９３】 本発明は、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドの生物的（例えば、リガンド結合および
／または細胞内シグナリング）免疫的特性を保持する配列番号：２，４，６，８
，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，または２４のポリペプチドフラ
グメントで規定される配列を持つ。フラグメントは、ここに記載のポリペプチド
のいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０
個の連続するアミノ酸を含む。好ましいポリペプチドフラグメントは、ＤｍＧＰ
ＣＲまたはその対立形質に特有のまたは特異的な抗原性の特性を示す。望ましい
生物的免疫的特性をもつ本発明のフラグメントは、当業界で広く公知で実施され
ているいずれかの方法により作ることができる。
【００９４】 さらに他の態様として、本発明はＤｍＧＰＣＲポリペプチドの置換変異体を提
供する。置換変異体は、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドの１個以上のアミノ酸残基が
除去されて他の残基に置換されたものである。ある面では、置換は元来保存的で
あるが、本発明は非保存的な置換も含んでいる。この目的のため、保存的置換は
、下のテーブル１、２および３のように定義してよい。
【００９５】 変異体ポリペプチドは、保存的置換が、本発明のポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドの修飾により導入されたものも含む。アミノ酸は、物理的特性や
タンパク質の二次三次構造への寄与の程度により分類することができる。保存的
置換は、あるアミノ酸を他の類似特性を持つアミノ酸に置換えることと当分野で
は考えられている。保存的置換の例を、すぐ下のテーブル１に記載した。［WO 9
7/09433, p.10, 出願日3月 13, 1997; PCT/GB96/02197, 出願日9/6/96］。
【００９６】
【表１】
【００９７】 代替として、保存的アミノ酸は、［Lehninger, Biochemistry, Second Editio
n; Worth Publishers, Inc. NY.NY (1975), pp.71-77］に記載されたように分類
し得、すぐ下のテーブル２に示す。
【００９８】
【表２】
【００９９】 さらにもう一つの代替として、保存的置換の例を下のテーブル３に示す。
【０１００】
【表３】
【０１０１】 本発明のポリペプチドの定義には、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換以外
の修飾をもつポリペプチドも含まれることを理解すべきである。例を挙げると、
修飾は本来共有結合的かもしれないが、例えば、ポリマー、リピッド、他の有機
、無機成分との化学結合も含んでいる。ポリペプチドの循環半減期を増加させた
り、ポリペプチドの目的細胞への標的能力を改善するために、このような変更を
してもよい。同様に、本発明は、１個以上のポリマーで共有結合的に修飾された
ＤｍＧＰＣＲポリペプチドも含んでいる。このようなポリマーの例としては、ポ
リエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレン
グリコールなどがある。天然のＤｍＧＰＣＲの持つリガンド結合特性を示し高レ
ベルで発現された変異体や、恒常的に活性なレセプターを供給する変異体は、本
発明のアッセイに特に有用である。その変異体は、異常なＤｍＧＰＣＲ活性を特
徴とする疾病／状態の細胞、組織や動物モデルとしても有用である。
【０１０２】 一つの関連する実施形態として、本発明は、本発明の精製ポリペプチドを含む
組成物を提供する。好ましい組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、薬学的
に受容可能な（すなわち、無菌で無毒性な）液体、半固体または固体希釈剤（薬
学的媒体、腑形剤または溶剤）などを含む。当業界で既知のいずれの希釈剤も使
用可能である。希釈剤の例には、水、生理食塩水、ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、メチル−およびプロピルヒドロ
キシ安息香酸、マニトール、グリセリン、リン酸カルシウム、ミネラルオイルや
ココアバターなどが含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１０３】 天然のＤｍＧＰＣＲの持つリガンド結合特性を示し高レベルで発現された変異
体や、恒常的に活性なレセプターを供給する変異体は、本発明のアッセイにおい
ても有用である。その変異体は、異常なＤｍＧＰＣＲ活性を特徴とする疾病／状
態の細胞、組織や動物モデルとしても有用である。
【０１０４】 本発明により開示されたヌクレオチド配列情報の知識により、当業者は、Ｄｍ
ＧＰＣＲをコードするヌクレオチド配列を、違った材料源（すなわち、異なる組
織または異なる生物体）から、当業者にとって既知で例えば次の文献に開示され
ているものなど様々な手法を用いて入手することが可能となる。（［Sambrookら
、"Molecular Cloning: a laboratory manual", Second Edition, Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)、出典明示して、その全体を本
明細書の一部とみなす。）
【０１０５】 例えば、ＤｍＧＰＣＲをコードするＤＮＡは、ここに示されたＤｍＧＰＣＲ遺
伝子配列情報により作成したオリゴヌクレオチドを用いて、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ
またはゲノムＤＮＡを検索することにより得ることができる。当業者にとっては
既知であり従来のハイブリッド形成アッセイに使われている（例えば、Sambrook
らの）方法により、プローブを、蛍光基、放射性基または化学発光基などの検出
基でラベルしてもよい。
【０１０６】 上記記載のＤｍＧＰＣＲヌクレオチド配列のいずれかを含む核酸分子は、他方
、ここで提供されたヌクレオチド配列により作成したＰＣＲオリゴヌクレオチド
プライマーを用いポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して合成してもよい。
［Mullisらへの米国特許第4,683,195、およびMullisらへの米国特許第4,683,202
号］。ＰＣＲ反応は、特定の核酸配列の濃度を選択的に増加させる方法を提供す
る。なお、この濃度増加は、その配列が前もって精製されてなくても、またある
特定のサンプル中に１個のコピーしかなくても起こる。この方法は、一本鎖また
は二本鎖ＤＮＡのいずれの増幅にも利用できる。この方法の要点は、目的核酸分
子のテンプレート依存性ポリメラーゼ仲介による複製のためのプライマーとして
、２個のオリゴヌクレオチドプローブを用いることにある。
【０１０７】 数多くのこれ以外のクローニング法や体外増幅法が、当業者に知られている。
このような技法の例は、例えば、次の文献に記載されている。（［Bergerら、Gu
ide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, 152 Academic
Press, Inc., San Diego, CA (Berger)］、出典明示して、全体を本明細書の一
部とみなす。）
【０１０８】 本発明の核酸分子およびそれ由来のフラグメントは、ある種の疾患に関連する
制限酵素ＤＮＡフラグメント長の多形性（ＲＦＬＰ）のスクリーニングや、遺伝
地図作成に有用である。
【０１０９】 本発明のＤｍＧＰＣＲをコードするヌクレオチド配列由来の、アンチセンスオ
リゴヌクレオチド、または配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３，１５，
１７，１９，２１，または２３よりなる群から選ばれたヌクレオチド配列のフラ
グメント、またはこれらに相補的な配列またはホモログは、いずれも各種の組織
での遺伝子の発現を調べる道具として有用である。例えば、従来からあるオート
ラジオグラフィー技法により、検出可能な基をもつオリゴヌクレオチドを使って
、組織中でのこの酵素の自然状態での発現やこれに関連する病理学的な状態を調
べることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号
：１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，または２３より
なる群から選ばれた一つのヌクレオチド配列の調節領域、あるいはそれに相当す
るｍＲＮＡに向けられるべきである。このような例としては、イニシエーション
コドン、ＴＡＴＡボックス、エンハンサー配列などが挙げられる。
【０１１０】 ＤｍＧＰＣＲのヌクレオチド配列を得るのにまたは検証するのに、自動シーク
エンス法を使用してもよい。本発明のＤｍＧＰＣＲヌクレオチド配列は、１００
％正確と信じられる。しかし、自動法により得られるヌクレオチド配列は、ある
程度の誤差を含むことはよく知られている。自動装置で決められたヌクレオチド
配列は、典型的には少なくとも約９０％、より典型的には約９５％から少なくと
も約９９．９％程度で与えられた核酸分子の実際のヌクレトチド配列と一致する
。本当の配列は、既知のマニュアルシークエンス法により、より正確に求めるこ
とができるだろう。１個以上のヌクレオチドの挿入または欠失につながる配列の
誤差は、転写の時点でのフレームシフトにつながり、期待されるアミノ酸配列が
、その核酸分子の持つ本来のヌクレオチド配列から変異の始めの時点で予想され
たものとは異なったものになることにつながるだろう。
【０１１１】 本発明のもう一つの態様は、上述の核酸分子のいずれかを含むベクターまたは
組換え発現ベクターに向けられている。ベクターは、ここではＤｍＧＰＣＲをコ
ードするＤＮＡまたはＲＮＡを増幅するため、および／または、ＤｍＧＰＣＲを
コードするＤＮＡを発現するために使用される。好ましいベクターとしては、プ
ラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウィルス粒子またはウィルス、統
合可能ＤＮＡフラグメント（すなわち、宿主ゲノムに相同組換えにより統合可能
なフラグメント）などを含むが、これに限定されるものではない。好ましいウィ
ルス粒子の例としては、アデノウィルス、バキュロウィルス、パルボウィルス、
ヘルペスウィルス、ポックスウィルス、アデノ関連ウィルス、セムリキフォレス
トウィルス、ワクシニアウィルスやレトロウィルスなどを挙げられるが、これに
限定されるものではない。好ましい発現ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３(Invit
rogen)とpSVL(Phaimacia Biotech)を挙げるが、これに限定されるものではない
。他の発現ベクターとしては、ｐＳＰＯＲＴベクター、ｐＧＥＭベクター(Prome
ga)、ｐＰＲＯＥＸベクター(LT1, Bethesda, MD)、ブルースクリプトベクター(S
tratagene)、ｐＱＥベクター(Qiagen)、ｐＳＥ４２０(Invitrogen)およびｐＹＥ
Ｓ２(Invitrogen)を挙げるが、これに限定されるものではない。
【０１１２】 好ましい発現ベクターは、複製可能なＤＮＡ構築物であり、ここではＤｍＧＰ
ＣＲをコードするＤＮＡ配列が、適当な宿主中のＤｍＧＰＣＲの発現に影響力を
及ぼす適当な制御配列に、作動できるように結合されている。ＤＮＡ領域は、お
互いに機能的に関連している時は、作動可能な状態で連結または結合されている
。例えば、あるプロモーターは、ある特定の配列の転写をする場合、その配列の
コード領域に作動可能な状態で連結または結合している。増幅ベクターは、発現
制御ドメインを必要としないが、宿主中で複製する能力だけは必要で、通常この
能力は、複製開始点や形質転換体の認識を助ける選択遺伝子で付与される。発現
ベクターの制御配列の必要性は、選択された宿主や用いられた形質転換法により
異なる。一般的には、制御配列には、転写プロモーター、適当なｍＲＮＡリボソ
ーム結合をコードする配列や、転写や翻訳の終了を制御する入れるが含まれる。
【０１１３】 好ましいベクターは、宿主生物体によって認識されうるプロモーターを含んで
いる。本発明のプロモーター配列は、原核、真核またはウィルスのいずれでもよ
い。適当な原核配列の例としては、バクテリオファージラムダのＰＲおよびＰＬ プロモーター（［THE BACTERIOPHAGE LAMBDA, Hershey, A. D., Ed., Cold Spri
ng Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1973)］、出典明示して、全体を本
明細書の一部とみなす；［LAMBDA II, Hendrix, R. W., Ed., Cold Spring Harb
or Press, Cold Spring Harbor, NY (1980)］、 出典明示して、全体を本明細書
の一部とみなす。）および、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ，ヒートショック、および大腸菌
のｌａｃＺプロモーター、およびSV40 アーリープロモーター（［Benoistら、Na
ture, 1981,290,304-310］、出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす）が
含まれる。これ以外にプロモーターとしては、マウス乳腺癌ウィルス、ヒト免疫
不全ウィルスの長い末端反復、モロニ−ウィルス、サイトメガロウィルス最初期
プロモーター、エプスタインバーウィルス、ラウス肉腫ウィルス、ヒトアクチン
、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンやヒトメタロチオネイ
ンなどが含まれるが、これに限定するものではない。
【０１１４】 その他の調節配列も、好ましいベクターに含まれる。適切な調整配列の好まし
い例としては、ファージＭＳ−２のレプリカーゼ遺伝子やバクテリオファージの
ｃＩＩ遺伝子のシャイン−ダルガモが代表的である。シャイン−ダルガモ配列の
後ろに、ＤｍＧＰＣＲをコードするＤＮＡが直接つながり、結果として成熟Ｄｍ
ＧＰＣＲタンパク質が発現される。
【０１１５】 さらに、適切な発現ベクターとして、形質転換宿主細胞のスクリーニングを可
能とする適当なマーカーも含めることができる。選択された宿主の形質転換は、
当業者には公知で、サンブルックらにより述べられている各種の技法のうちのい
ずれかを使って実施することができる。
【０１１６】 複製開始点は、ベクターに外来性の開始点を含ませることにより、あるいは、
宿主細胞染色体の複製メカニズムにより得られる。もし、ベクターが宿主細胞の
染色体に組み込まれれるなら、後者は十分であろう。他方、ウィルスの複製開始
点を含むベクターを使わずに、当業者は、ある選択されたマーカーとＤｍＧＰＣ
ＲＤＮＡとを共に形質転換することもできる。適切なマーカーの例としては、ハ
イドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）または、チミジンキナーゼ（［米国
特許第４，３９９，２１６］を参照せよ）を挙げることができる。
【０１１７】 ＧＰＣＲをコードするヌクレオチド配列を、従来法によりベクターＤＮＡと組
替えてもよい。そのような従来法としては、連結のための平滑またはねじれ終端
、適切な終端を得るための制限酵素消化、希望外の結合を避けるためのアルカリ
ホスファターゼ処理や、リエゾンとの連結などを挙げることができる。このよう
な操作法は、サムブルックらにより開示されており、公知である。哺乳類の発現
ベクターを作る方法として、例えば、次のものが開示されている。［Okayamaら
、Mol. Cel1. Biol., 1983, 3, 280; Cosmanら、Mol. Immuno1., 1986, 23,935;
Cosmanら、Nature, 1984, 312, 768; EP-A-0367566, および WO 91/18982］、
いずれも、出典明示して、それらの全体を本明細書の一部とみなす。）
【０１１８】 本発明の他の態様は、上述の核酸分子のいずれかを含む発現ベクターを保持す
る形質転換宿主細胞に向けられている。ヌクレオチド配列の発現は、発現ベクタ
ーが適当な宿主細胞に導入された時に起こる。本発明のポリペプチドの発現に適
当な宿主細胞としては、原核細胞、酵母や真核細胞などが挙げられるが、これに
限定されない。もし原核発現ベクターが使用されるなら、適当な宿主細胞は、ク
ローン化した配列を発現できる原核細胞のいずれかとなるだろう。適当な原核細
胞としては、エシェリキア、バチルス、サルモネラ、シュードモナス、ストレプ
トマイセスやスタフィロコッカス属のバクテリアを挙げることができるが、これ
に限定されない。
【０１１９】 もし真核発現ベクターが使用されるなら、適当な宿主細胞は、クローン化した
配列を発現できる真核細胞のいずれかとなるだろう。真核細胞は、高等真核生物
の細胞が好ましい。適当な真核細胞は、非ヒト哺乳類組織培養細胞やヒト組織培
養細胞などを含み、これに限定されない。好ましい宿主細胞は、昆虫細胞、Ｈｅ
Ｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカ緑サル肝
細胞（ＣＯＳ細胞、ヒト２９３細胞やマウス３Ｔ３線維芽細胞を含むが、これに
限定されない。これらの細胞の細胞培養での増殖は、単純作業となっている。（
［TISSUE CULTURE, Academic Press, Knise and Patterson, 編集、(1973)］を
参照せよ、出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす。）
【０１２０】 また、酵母宿主も宿主細胞として利用できる。好ましい酵母細胞としては、サ
ッカロマイセス、ピチアやクルベロマイセス属が挙げられるが、これに限定され
るものではない。好ましい酵母宿主は、S. cerevisiaeおよびP. pastorisである
。酵母ベクターは、好ましくは、２Ｔ酵母プラスミド由来の転写開始点配列、プ
ロモーター領域、ポリアデニル化配列、転写終結の配列や選択可能なマーカー遺
伝子を含んでいてよい。複製のための酵母と大腸菌間のシャトルベクターも、こ
こに含まれている。
【０１２１】 他方、昆虫細胞も宿主細胞として利用できる。好ましい実施形態の一つでは、
本発明のポリペプチドが、バキュロウィルス発現システムを使用して発現されて
いる。（［Luckowら、Bio/Technology, 1988,6,47; BACULOVIRUS EXPRESSION VE
CTORS: A Laboratory Manua1, O'Rielly et a1., 編集、W.H. Freeman and Comp
any, New York, 1992; および 米国特許第 4,879,236］、 いずれも、それらの
全体は出典明示して本明細書の一部とみなされる）。さらに、ＭＡＸＢＡＣ（商
標）完全バキュロウィルス発現システム(Invitrogen)も、例えば、昆虫細胞中で
の生産に利用できる。
【０１２２】 また、本発明に含まれるのは、ＤｍＧＰＣＲまたはそのフラグメントに特異的
な抗体である。（例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、単鎖抗体
、キメラ抗体、二機能性二特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体や、本発明のポリ
ペプチドを特異的に認識する相補決定領域（ＣＤＲ）−グラフト化抗体など）。
本発明の抗体は、好ましくは、次の特許の方法で同定、生産されたヒト抗体であ
る。（［W093/l1236, 公開 June 20, 1993］、出典明示して、全体を本明細書の
一部とみなす。）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖを含む抗体の
フラグメントも、本発明により提供される。本発明の抗体を記述する時に使われ
る用語「に特異的」は、本発明の抗体の可変領域がＤｍＧＰＣＲポリペプチドを
排他的に認識し結合することを示している。すなわち、ＤｍＧＰＣＲと他の既知
ＧＰＣＲとの間に局部的な配列の一致、同一性や類似性があるかもしれないにも
係わらず、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドと、他の既知ＧＰＣＲポリペプチドとを、
結合親和性の測定可能な大きさの差異でもって区別することができることを示し
ている。特異的抗体は、抗体の可変領域外の配列での相互作用により、また特に
、分子の固定領域との相互作用により、他のタンパク質（例えば、S. aureusタ
ンパク質ＡまたはＥＬＩＳＡ法における他のタンパク質）と相互作用することが
あるかもしれない。本発明の抗体の結合特性を決定するためのスクリーンアッセ
イは、既知であり、当業界では広く使用されている。このようなアッセイについ
て詳細に議論するには、Ｈａｒｌｏｗらの本を参照せよ。［Harlowら、編集、 A
NTIBODIES A LABORATORY MANUAL; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Sprin
g Harbor, NY (1988), Chapter 6）］。ＤｍＧＰＣＲポリペプチドのフラグメ
ントを認識し結合する抗体も、もし抗体が、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドに特異的
であれば、含まれる。本発明の抗体は、公知であり又当業界で広く使われている
方法により生産することが可能である。
【０１２３】 非ヒト抗体は、既知の方法でヒト化してもよい。一つの方法では、非ヒトＣＤ
Ｒが、ヒト抗体またはコンセンサス抗体骨組み配列に挿入される。親和性または
免疫原性を調整するため、抗体の骨組みにさらなる変化を与えてもよい。
【０１２４】 本発明の抗体は、例えば、治療目的（ＤｍＧＰＣＲの活性を調整することによ
る）、ＤｍＧＰＣＲを検出および定量するための診断目的や、ＤｍＧＰＣＲの精
製目的のために有用である。上記目的のために使われる本発明の抗体を含むキッ
トもまた含まれる。一般に、本発明のキットは、またその抗体が免疫特異的に働
く対照抗体も含んでいる。
【０１２５】 本発明の他の態様は、哺乳類に本発明のポリペプチドを、免疫応答を誘導する
のに十分な量投与し、哺乳類にそのポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方
法に向けられている。投与量は、動物種、動物の大きさなどにより異なるが、当
業者は決定できる。
【０１２６】 本発明の他の態様は、医薬組成物などの組成物に向けられている。これら組成
物は、上述の核酸分子または組換え発現ベクターや使用可能な担体や希釈剤を含
む。担体または希釈剤は、好ましくは薬学的に許容されるものである。適当な担
体は、下記文献の最新版に記載されている。［REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCI
ENCES, A. Oso1, 本分野における標準の参照書］、 出典明示して、全体を本明
細書の一部とみなす。）このような担体または希釈剤の好ましい例として、水、
生理食塩水、リンガー溶液、デキストリン溶液や５％ヒト血清アルブミンなどが
挙げられるが、これに限定されるものではない。固定油などのリポソームや非水
腑形剤も使用できる。製剤は、汎用技術で滅菌される。
【０１２７】 本発明により開示されたヌクレオチド配列の情報の知識により、当業者は、当
業者には公知の、また下記文献で開示された方法により、各種の源（例えば、異
なった組織や生物体）から、ＦａＲＰ結合ＧＰＣＲをコードするヌクレオチド配
列を同定し入手することができるようになる。（例えば、［Sambrookら、"MOLEC
ULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL". Second Edition, Cold Spring Harbor P
ress, Cold Spring Harbor, NY (1989)］、 出典明示して、全体を本明細書の一
部とみなす。）
【０１２８】 例えば、ＧＰＣＲをコードするＤＮＡは、ここに開示されたＤｍＧＰＣＲ遺伝
子配列情報により作られたオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ｍＲＮＡ，ｃ
ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡからスクリーニングすることにより入手可能となるだ
ろう。プローブは、当業者には公知の方法やサムブルックらにより述べられた従
来のハイブリッド化アッセイにより、蛍光基、放射性原子、または化学発光基な
どの検出可能な基でラベルされてもよい。
【０１２９】 単離または組換えＤｍＧＰＣＲ生成物、ＤｍＧＰＣＲ変異体または、好ましく
は、これらの生成物を発現している細胞を用いて、天然のリガンドや合成化合物
も含む特異的結合分子を、同定あるいは開発することができる。結合パートナー
は、ＤｍＧＰＣＲ生成物の精製や、既知の免疫的手法を用いた流体や組織サンプ
ル中のＤｍＧＰＣＲ生成物の検出や定量に、有用である。結合分子は、またＤｍ
ＧＰＣＲの生物的活性、特にシグナル伝達に関連する活性を調整（すなわち、遮
断、阻害または刺激）するのにとりわけ有用である。
【０１３０】 本発明で提供されるＤＮＡやアミノ酸配列の情報は、ＤｍＧＰＣＲポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチドが相互作用する結合パートナーを特定することを可能
とする。結合パートナーを特定する方法は、溶液アッセイ、ＤｍＧＰＣＲポリペ
プチドが固定化された体外アッセイや、細胞ベースのアッセイなどである。Ｄｍ
ＧＰＣＲポリペプチドの結合パートナーの特定は、正常および異常なＤｍＧＰＣ
Ｒの生物活性に伴う症状において、治療的または予防的処置のための候補物質を
提供することとなる。
【０１３１】 本発明は、ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーを特定するための多数のアッセイシス
テムを含んでいる。溶液アッセイにおいて、本発明の方法は、［ａ）ＤｍＧＰＣ
Ｒポリペプチドを１個以上の結合パートナー化合物の候補と接触させるステップ
と、［ｂ）ＤｍＧＰＣＲポリペプチドと結合する化合物を同定するステップを含
む。ＤｍＧＰＣＲポリペプチドに結合する化合物の同定は、ＤｍＧＰＣＲポリペ
プチド／結合パートナー複合体の単離と、結合パートナー化合物をＤｍＧＰＣＲ
ポリペプチドから分離により行われる。結合パートナー化合物の物理的、生物的
および／または生化学的特性をつかむためのさらなるステップも、本発明の実施
形態の一つに含められる。一例として、ＤｍＧＰＣＲポリペプチド／結合パート
ナー複合体は、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドまたは結合パートナー化合物の候補の
いずれかに免疫特異的な抗体を用いて単離される。
【０１３２】 さらに他の実施形態では、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドまたは結合パートナー化
合物候補のいずれかが、単離を容易にするラベルまたはタグを含んでいる。また
、結合パートナー化合物を同定するための本発明の方法は、ラベルまたはタグと
の相互作用を通して単離するステップを含んでいる。このタイプのタグの一例が
、ポリヒスチジン配列［一般に約６個のヒスチジン残基）で、これでラベルされ
た化合物はニッケルによるキレートかにより単離できるようになる。ＦＬＡＧタ
グ(Eastman Kodak, Rochester, NY)など当業界でよく知られ広く使われているこ
れ以外のラベルやタグも、本発明に含められる。
【０１３３】 体外アッセイの変形として、本発明は、［ａ）固定化ＤｍＧＰＣＲポリペプチ
ドを結合パートナー化合物の候補を接触させるステップと、［ｂ）候補化合物と
ＤｍＧＰＣＲポリペプチドとの結合を検出するステップを含む方法を提供する。
他の実施形態では、結合パートナー化合物の候補を固定化し、ＤｍＧＰＣＲとの
結合を検出する。固定化は、公知の方法のいずれかを使って実施され、このよう
な方法としては、ビーズまたはクロマトグラフィー樹脂などの担体への共有結合
によるものや、抗体結合またはｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ／ｂｉｏｔｉｎ結合を
利用したもの［ここで、固定化された化合物はビオチン部分を含む）など非共有
、高アフィニティー相互作用を利用したものがある。結合の検出は、［ｉ）固定
化されていない化合物状の放射性ラベルを利用して、［ｉｉ）非固定化化合物上
の蛍光ラベルを利用して、［ｉｉｉ）非固定化可能物に対し免疫特異的な抗体を
利用して、［ｉｖ）非固定化化合物上に、固定化化合物が付着している蛍光性担
体を刺激するラベルを持つものを利用して、あるいはこれ以外の既知で広く使用
されている技法を用いて実施される。
【０１３４】 本発明は、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドの結合パートナー化合物の候補を特定す
るための細胞ベースのアッセイも提供する。一つの実施形態として、本発明は、
細胞表面上で発現されたＤｍＧＰＣＲポリペプチドを、結合パートナー化合物の
候補と接触させるステップと、候補結合パートナー化合物とＤｍＧＰＣＲポリペ
プチドとの結合を検出するステップを含む方法を提供する。好ましい実施形態に
おいて、この検出は、分子の結合によるカルシウムの流動あるいは他の生理的な
現象を検出することを含む。
【０１３５】 ＤｍＧＰＣＲ活性を調節（すなわち、増加、減少または遮断）する物質は、推
測されるモジュレーターをＤｍＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドを
含む細胞と共にインキュベートし、推定されるモジュレーターがＤｍＧＰＣＲ活
性または発現に与える影響を測定することにより特定することができるだろう。
ＤｍＧＰＣＲ活性を調整する化合物の選択性は、それがＤｍＧＰＣＲに及ぼす影
響と、他のＧＰＣＲに及ぼす影響を比較することで評価できる。選択的なモジュ
レーターは、例えば、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドまたはＤｍＧＰＣＲをコードす
る核酸に特異的に結合する、抗体や他のタンパク質、ペプチドまたは有機分子な
どを含んでいる。ＤｍＧＰＣＲ活性のモジュレーターは、正常または異常なＤｍ
ＧＰＣＲ活性が関与する疾病や生理状態の処理に治療的に有用である。ＤｍＧＰ
ＣＲポリヌクレオチド、ポリペプチドやモジュレーターは、次のような疾病や症
状の処置に使用できる。例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によるウィルス感
染、疼痛、癌、パーキンソン病、低血圧、高血圧、および精神病性および神経学
的障害。なお、精神病性および神経学的障害には、不安、精神分裂症、躁鬱症、
せん妄、痴呆、重度の精神遅滞やハンチントン病またはツーレット症候群などの
運動障害が含まれている。ＤｍＧＰＣＲポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび
ＤｍＧＰＣＲモジュレーターは、このような疾病や症状の診断アッセイに用いて
もよい。
【０１３６】 本発明のモジュレーターを特定する方法は、結合パートナー化合物を特定する
上述方法のいずれの変形をも含んでいる。そのような変形例は、ある結合パート
ナー化合物が特定されており、結合アッセイが、ある候補モジュレーターの存在
下または不存在下で行われる方法をを含んでいる。これらの場合、一つのモジュ
レーターが特定されており、そのモジュレーターの存在下でのＤｍＧＰＣＲポリ
ペプチドと結合パートナー化合物間の結合は、候補モジュレーター化合物の存在
下での結合と比較すると異なっている。ＤｍＧＰＣＲポリペプチドと結合パート
ナー化合物間の結合を増加させるモジュレーターは、エンハンサーまたはアクチ
ベーターと記載し、逆にＤｍＧＰＣＲポリペプチドと結合パートナー化合物間の
結合を減少させるモジュレーターをインヒビターと記載した。
【０１３７】 本発明は、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドの生物的活性（すなわち、酵素活性、結
合活性などに影響する）と相互作用するまたは阻害する化合物を特定するための
、高スループットスクリーニングアッセイ（ＨＴＳ）も含んでいる。ＨＴＳは、
効率的に多数の化合物をスクリーニングすることを可能とする。ＤｍＧＰＣＲレ
セプター−リガンド相互作用を調べる、細胞ベースのＨＴＳシステムは、本発明
に含まれる。ＨＴＳアッセイは、目的の特性をもつ「ヒット」または「リード化
合物」を特定するもので、これらの「ヒット」または「リード化合物」から、さ
らに目的の特性の改良が進められることになる。「ヒット」または「リード化合
物」の化学修飾は、「ヒット」とＤｍＧＰＣＲポリペプチド間に見出される構造
／活性相関にしばしば基づいている。
【０１３８】 本発明の他の態様は、ＤｍＧＰＣＲまたはＤｍＧＰＣＲをコードする核酸分子
のいずれかに結合する化合物を、ＤｍＧＰＣＲまたはそれをコードする核酸分子
とある化合物とを接触させ、その化合物がＤｍＧＰＣＲまたはそれをコードする
核酸分子と結合するかどうかを決定することで特定する方法に向けられている。
結合は、公知の結合アッセイで測定される。この例としては、ウェスターンブロ
ット、放射ラベル競争アッセイ、ファージベースの発現クローニング、クロマト
グラフィーによる共分別、共沈殿、クロスリンキング、相互作用トラップ／ツー
ハイブリッド分析、サウスウェスタン分析、ＥＬＩＳＡなどがあり、例えば次の
文献に記載されている。（［CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1999,
John Wiley & Sons, NY］、出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす。）
スクリーニングされる化合物としては、細胞外、細胞内、生物由来または化学由
来のものが含まれる（ＤｍＧＰＣＲまたはそれをコードする核酸分子との結合が
推定される化合物を含んでいるかもしれない。）が、これに限定されるものでは
ない。
【０１３９】 本発明の方法は、また、放射ラベル（例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、３２Ｐ、３ ３ Ｐ、３Ｈ）、蛍光ラベル、化学発光ラベル、酵素ラベルや免疫原性ラベルなど
のラベルで標識された神経ペプチドを含んでいる。本発明の範囲に入るモジュレ
ーターとしては、非ペプチド模倣体、非ペプチドアロステリックエフェクターな
どの非ペプチド分子や、ペプチドを挙げられるが、これに限定されるものではな
い。このようなテストに使用されるＤｍＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレ
オチドは、溶液中で自由な状態で、固体の支持体に付着して、細胞表面に付着し
て、または細胞内に存在するか、細胞の一部と会合して存在しているだろう。当
業者は、ＤｍＧＰＣＲと供試化合物間の複合体形成を測定することができる。他
方、当業者は、ＤｍＧＰＣＲと、供試化合物により引き起こされるその基質との
間の複合体形成の減少を測定することが可能である。
【０１４０】 本発明の他の態様は、ＤｍＧＰＣＲの活性を調節する（すなわち、増加または
減少させる）化合物を特定する手段に向けられている。なお、ここで、その特定
手段は、ＤｍＧＰＣＲを一つの化合物と接触させ、その化合物がＤｍＧＰＣＲの
活性を調整するかどうかを決定することからなっている。試験化合物の存在下で
の活性と、試験化合物の不存在下での活性を比較する。試験化合物を含むサンプ
ルの活性が、試験化合物を欠くサンプルの活性よりも高い場合、その化合物は活
性を増加させたこととなろう。同様に、試験化合物を含むサンプルの活性が、試
験化合物を欠くサンプルの活性より低い場合、その化合物は活性を阻害したこと
となるだろう。
【０１４１】 本発明は、多くのドラッグスクリーニング手法の中で、ＤｍＧＰＣＲを用いて
化合物をスクリーニングのに特に有用である。スクリーニングされる化合物とし
ては、細胞外、細胞内、生物由来または化学由来のものが含まれる（ＤｍＧＰＣ
Ｒ活性を調整すると推定される化合物を含んでいるかもしれない）が、これに限
定されるものではない。このテストに使用されるＤｍＧＰＣＲポリペプチドは、
溶液中で自由な状態で、固体の支持体に付着、細胞表面に付着、または細胞内に
存在、或いは細胞の一部と会合などのいずれかの形で存在していてもよい。当業
者は、例えば、ＤｍＧＰＣＲと供試化合物間の複合体形成を測定することができ
る。また、当業者は、ＤｍＧＰＣＲと、供試化合物により引き起こされるその基
質との間の複合体形成の減少を測定することが可能である。
【０１４２】 本発明のＤｍＧＰＣＲポリペプチドの活性は、例えば、化学的に合成されたペ
プチドリガンドと結合するまたはそれにより活性化される能力を測定することに
より決定される。他方、ＤｍＧＰＣＲの活性は、カルシウムイオン、ホルモン、
ケモカイン、神経ペプチド、神経伝達物質、ヌクレオチド、リピッド、臭気物質
や光子などとの、それらの持つ結合能力を測定することでアッセイできる。他方
、ＧＰＣＲの活性は、イフェクター分子の活性を測定することで決定できる。な
お、このイフェクター分子としては、アデニレートシクラーゼ、ホスホリパーゼ
やイオンチャンネルが含まれるが、これらに限定されない。したがって、ＧＰＣ
Ｒ活性のモジュレーターは、ＧＰＣＲレセプターの機能、例えばレセプターの結
合特性またはＧタンパク質−仲介シグナル伝達または膜局在などの活性を、改変
するかもしれない。この方法のいろいろな実施形態において、アッセイは、イオ
ンフラックスアッセイ、酵母成長アッセイ、[３５Ｓ]−ＧＴＰアッセイなどの非
加水分解性ＧＴＰアッセイ、ｃＡＭＰアッセイ、イノシトール酸リン酸アッセイ
、ジアシルグリセリンアッセイ、アエクオリンアッセイ、ルシフェラーゼアッセ
イ、細胞内カルシウム濃度を求めるＦＬＩＰＲアッセイ、有糸分裂生起アッセイ
、ＭＡＰキナーゼ活性アッセイ、アラキドン酸放出アッセイ（例えば、［３Ｈ］
−アラキドン酸）やその他の結合または機能ベースのＤｍＧＰＣＲ活性測定用の
既知のアッセイなどの形態をとることができる。これらの実施形態の多くにおい
て、本発明は、既知のＧタンパク質（例えばＧ１６、Ｇ１５またはキメラＧｑｄ ５ 、Ｇｑｓ５、Ｇｑｏ５、Ｇｑ２５など）のいずれか含有物も含んでいる。Ｄｍ
ＧＰＣＲ活性は、当業者には既知のＦａＲＰ用のアッセイに使われる方法により
決定することができる。本発明のＤｍＧＰＣＲレセプターの生物活性としては、
天然または非天然リガンドの結合や、既知のＤｍＧＰＣＲ機能の活性のいずれか
などが含まれるが、これに限定されるものではない。ＤｍＧＰＣＲ活性の非限定
例としては、Ｇタンパク質の会合および／または各種グアニジレートヌクレオチ
ドのＧタンパク質結合に対する影響力の発揮などを伴うかもしれない、いろいろ
な形の膜を通した伝達を含んでいる。もう一つのＤｍＧＰＣＲ活性の例は、既知
のＧタンパク質とは異なるアクセサリータンパク質またはポリペプチドの結合で
ある。
【０１４３】 本発明のモジュレーターは、いろいろな化学構造を示す。これらは、一般に、
天然ＧＰＣＲレセプターの非ペプチド模倣品、ＧＰＣＲレセプターのペプチドま
たは非ペプチドアロステリックイフェクターや、ＧＰＣＲレセプターの活性化剤
または阻害剤（競争、不競争および非競争）（例えば、抗体製品）として作用す
るペプチドに、分類される。本発明は、適当なモジュレーターの入手源を制限し
ない。これらは、植物、動物またはミネラル抽出物などの天然源、あるいは、低
分子ライブラリー（コンビナトリアル化学の手法で作られたライブラリーの化合
物を含む）やペプチドライブラリーなどの非天然源からのいずれの入手源から入
手したものでもよい。ＤｍＧＰＣＲレセプターのペプチドモジュレーターの例は
、次の一次構造を示す：ＧＬＧＰＲＰＬＲＦａｍｉｄｅ、ＧＮＳＦＬＲＦａｍｉ
ｄｅ、ＧＧＰＱＧＰＬＲＦａｍｉｄｅ、ＧＰＳＧＰＬＲＦａｍｉｄｅ、ＰＤＶＤ
ＨＶＦＬＲＦａｍｉｄｅ、およびｐｙｒ０−ＥＤＶＤＨＶＦＬＲＦａｍｉｄｅ。
【０１４４】 他のアッセイが、酵素活性を測定するのに使われる。例えば、光度計、放射計
、ＨＰＬＣ、電気化学などを使用したもので、例えば、次の文献に記載されてい
る。（［ENZYME ASSAYS: A PRACTICAL APPROACH, 編集、 Eisenthal and M. J.
Danson, 1992, Oxford University Press］、出典明示して、全体を本明細書の
一部とみなす。）
【０１４５】 ＧＰＣＲをコードするｃＤＮＡの新薬探索プログラムでの使用はよく知られて
いる。一日に何千もの未知化合物を高スループットスクリーン（ＨＴＳ）でテス
トすることのできるアッセイは、徹底的に文書化されている。文献には、ＨＴＳ
結合アッセイで新薬探索するのに放射ラベルされたリガンド使用する例が数多く
載っている。（［Williams, MEDICINAL RESEARCH REVIEWS, 1991, 11, 147-184;
および、総説、Sweetnamら、J. Natural Products, 1993, 56, 441-455］を参照
せよ。）組替えレセプターは、結合アッセイＨＴＳに好ましい。なぜならそれら
は選りすぐれた特異性（より相対純度が高い）を与え、大量のレセプター物質を
作ることができ、また広い範囲のフォーマットで使用できるからである。（［Ho
dgson, BIO/TECHNOLOGY, 1992, 10,973-980］を参照せよ、出典明示して、全体
を本明細書の一部とみなす。）
【０１４６】 いろいろな非相同システムが、組替えレセプターの機能的な発現に使用でる。
いずれも当業者には既知のものである。このようなシステムには、バクテリア［
Strosbergら、Trends in Pharmacological Sciences, 1992, 13,95-98］; 酵母
［Pausch, Trends in Biotechnology, 1997, 15,487-494］、多種の昆虫細胞［V
anden Broeck, Int. Rev. Cytology, 1996, 164, 189-268］、両生類細胞［Jaya
wickremeら、Current Opinion in Biotechnology, 1997, 8,629-634］や多種の
哺乳類セルライン(CHO, HEK293, COS, その他.; 参照。Gerhardtら、Eur. J. Ph
armacology, 1997,334, 1-23］が含まれる。これらの例は、線虫類［PCT出願 WO
98/37177］から得られたセルラインを含む他の細胞発現システムの可能性を排
除しない。
【０１４７】 本発明の好ましい実施形態では、試験化合物をＤｍＧＰＣＲと接触させ、その
化合物とＤｍＧＰＣＲ間の複合体の存在をアッセイすることから成るＧＰＣＲ活
性を調節する方法である。このようなアッセイでは、リガンドは普通ラベルされ
ている。適当なインキュベーションの後に、フリーのリガンドは結合状態で存在
するものから分離される。フリーまたは複合体を形成していないラベルは、特定
の化合物がＤｍＧＰＣＲに結合する能力の指標となる。
【０１４８】 本発明の他の実施形態において、ＤｍＧＰＣＲに対して適当な結合親和性を持
つ化合物の高スループットスクリーニングが使用される。短時間で、多数の異な
った低分子ペプチドテスト化合物が、固体の基体上に合成される。これらのペプ
チドテスト化合物は、ＤｍＧＰＣＲに接触させられ、洗浄される。結合されたＤ
ｍＧＰＣＲは、次いで既知の方法により検出される。本発明の精製プチドは、上
記新薬探索技法での使用のために、板の上に直接塗布してもよい。また、非中和
抗体も、タンパク質を捕捉し、固体担体上に固定化するのに使うことができる。
【０１４９】 一般に、発現されたＤｍＧＰＣＲは、そのはっきり規定されたリガンド（この
場合、相当するそれを活性化する神経ペプチド）と併用して、ＨＴＳ結合アッセ
イに供される。検出されたペプチドは、適当な放射性同位体（例えば、１２５Ｉ
、３Ｈ、３５Ｓ、または３２Ｐを挙げるが、これに限定されない）で、当業者に
は公知の方法でラベルされる。他方、これらのペプチドは、適当な蛍光誘導体［
Baindurら、Drug Dev. Res., 1994,33,373-398; Rogers, Drug Discovery Today
, 1997,2,156-160］を用いた有名な方法でラベルされてもよい。組換えタンパク
質を発現しているセルラインから作られた膜標本中のレセプターに特異的に結合
する放射性リガンドは、ＨＴＳアッセイにおいて数多くの標準法の一つで検出さ
れる。この標準法としては、レセプター−リガンド複合体ろ過し、結合リガンド
と非結合リガンドを分離する方法［Williams, Med. Res, Rev., 1991, 11, 147-
184、および Sweetnamら、J. Natural Products, 1993, 56,441-455］も含まれ
ている。他の方法としては、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）または、
そのような分離が不必要であるフラッシュプレート形式も、含まれる。［Nakaya
ma, Cur. Opinion Drug Disc. Dev., 1998 1, 85-91; および、Bosseら、J. Bio
molecular Screening, 1998, 3, 285-292.］蛍光リガンドの結合は、いろいろな
方法で検出可能である。例えば、蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ），直接スペク
トロフォトフルオレッセンス分極［Rogers, Drug Discovery Today, 1997, 2, 1
56-160; および、 Hil1, Cur. Opinion Drug Disc. Dev., 1998, 1,92-97］が
、挙げられる。
【０１５０】 組換えシステムで発現された非相同レセプターの活性化が、宿主細胞中に発言
されたＧタンパク質の仲介により、様々な生物的応答に導くことは、よく知られ
ている。ＧＰＣＲに作動薬作用させると、Ｇalphaサブユニット上の結合サイト
で、結合ＧＤＰのＧＴＰへの交換が引き起こされる。放射性、ＧＴＰの非加水分
解性誘導体、ＧＴＰγ［３５Ｓ］を使って、作動薬のレセプターへの結合を測定
できる。［Simら、Neuroreport, 1996, 7,729-733］。この結合を使って、同様
に、既知の作動薬の存在下ＧＴＰγ［３５Ｓ］の結合を減少させることにより、
拮抗薬のレセプターへの結合能力を測定することができる。このため、ＧＴＰγ
［３５Ｓ］結合を基礎とするＨＴＳを作り出すことができる。しかしこの方法は
、好ましい方法ではない。
【０１５１】 非相同性ＧＰＣＲの機能的な発現に必要なＧタンパク質は、宿主細胞の天然の
構成物でもよいし、よく知られている組換え技術ににより導入したものでもよい
。Ｇタンパク質は、無傷の原型でもキメラでもよい。ほぼ完全な適確性を示すＧ
タンパク質は（例えば、Ｇα１６）は、どのようなレセプターをも結合させて検
出可能な応答経路に導くことができる。Ｇタンパク質の活性化は、他の自然タン
パク質の刺激または阻害を引き起こし、これを測定可能な応答に結びつけること
ができる。
【０１５２】 このような生物学的応答の例としては、次のものがあるが、限定されるもので
はない。特別に操作された酵母細胞の制限栄養素のない状態での生存能力［Paus
ch, Trends in Biotechnology, 1997, 15,487-494］、および、蛍光染料で測定
した細胞内Ｃａ２＋濃度の変化［Murphyら、Cur. 0pinion Drug Disc. Dev., 19
98, 1, 192-199］。蛍光変化は、リガンド誘導性の膜電池または細胞内ｐＨの変
化の測定にも使われる。これらの目的のためのＨＴＳに適する自動システムにつ
いては、すでに述べられている。［Schroederら、J. Biomolecular Screening,
1996, 1,75-80］。Xenopus laevisから調整されたメラニン保有細胞は、非相Ｇ
ＰＣＲの活性化の応答として、顔料組織にリガンド依存性の変化を示す。この応
答は、ＨＴＳ形式に適合可能である。［Jayawickremeら、Cur. 0pinion Biotech
nology, 1991,5,629-634］。アッセイは、多くのセカンドメッセンジャーに対し
てでも可能である。例えば、ｃＡＭＰ、ホスホイノシチドやアラキドン酸などが
あるが、それらは普通ＨＴＳには使われていない。
【０１５３】 それらのレセプターを用いるＨＴＳ法の好ましい例としては、永久形質転換Ｃ
ＨＯ細胞が挙げられる。この細胞中で、これらの細胞から調整された膜中におけ
るＧＴＰγ［３５Ｓ］の結合を特異的に変換する能力を指標に、作動薬や拮抗薬
を特定することができる。本発明の他の実施形態においては、永久形質転換ＣＨ
Ｏ細胞が、組換えレセプタータンパク質をかなり大量に含む膜の調製に使用でき
る。こららの膜調製物は、特定のレセプターに特異的な放射ラベルリガンドを用
いることで、レセプター結合アッセイに使用できる。代わりに、これらのレセプ
ターのそれぞれを別々にまたは組み合わせて保有している永久形質転換ＣＨＯ細
胞中での内部Ｃａ２＋濃度または膜電位の変化を蛍光測定するなどの機能アッセ
イが、ＨＴＳには好ましい。ＨＥＫ２９３またはＣＯＳ細胞などの異なった種類
の哺乳類細胞も、同形式に同じように好ましいと考えられる。さらに好ましいの
は、ショウジョウバエＳ２細胞などの永久形質転換昆虫セルラインである。さら
により好ましいのが、当業者には公知のＨＴＳ形式のショウジョウバエメラノガ
スターレセプターを発現している組換え酵母細胞である（例えば、［Pausch, Tr
ends in Biotechnology, 1997, 15, 487-494］）。
【０１５４】 本発明は、ＤｍＧＰＣＲレセプターに結合するリガンドの阻害剤をスクリーン
ニングし同定する目的のアッセイを多数含んでいる。一例においては、ＤｍＧＰ
ＣＲレセプターは固定化され、結合パートナーとの相互作用を、例えば阻害剤の
ような候補モジュレーターの存在下および不存在下で測定する。他の一例では、
ＤｍＧＰＣＲレセプターとその結合パートナーの相互作用は、候補阻害化合物の
存在下および不存在下の両方で、溶液アッセイをつかって測定する。いずれのア
ッセイにおいても、阻害剤は、ＤｍＧＰＣＲレセプターとその結合パートナー間
の結合を減少させる化合物として特定される。本発明に含まれる他の一例は、ジ
ハイブリッドアッセイの変形であり、このアッセイでは、タンパク質／タンパク
質相互作用の阻害剤の特定が、形質転換されたまたは形質移入された宿主細胞中
で、正のシグナルを検出することにより行われる。
【０１５５】 本発明に含まれる候補モジュレーターは、可能性のある活性化剤または阻害剤
のいずれのライブラリーから選ばれる化合物も含んでいる。低分子も十らーたー
を特定するために使われるライブラリーは、数多くある。例えば、（１）化学ラ
イブラリー、（２）天然物ライブラリー、および（３）任意のペプチド、オリゴ
ヌクレオチドまたは有機分子を含む混合ライブラリーなどが含まれている。化学
ライブラリーは、任意の化学構造からなっており、その一部は既知物質のアナロ
グまたは他の新薬探索スクリーンでの「ヒット」または「リード」として特定さ
れた化合物のアナログであり、また一部は、特定の目的無しに合成された合成有
機化合物からなっている。天然物ライブラリーは、微生物、動物、植物または海
洋生物の収集物であり、（１）発酵、および土壌、植物または海洋微生物からブ
ロスの抽出、または（２）植物または海洋生物からの抽出などの方法により、ス
クリーニングのための混合物を作るの使用される。天然物ライブラリーは、ポリ
ペプチド、非リボゾームペプチドや、それらの変異体（非天然由来）を含んでい
る。（概説として次を参照せよ。Science 282:63-68 (1998)］。混合ライブラリ
ーは、多数のペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機化合物などを混合して
保有している。これらのライブラリーは、従来からある自動合成法、例えば、Ｐ
ＣＲ，クローニングまたは独自の合成法などにより比較的簡単に作ることができ
る。特に興味があるのは、非ペプチドコンビナトリアルライブラリーである。他
の興味あるライブラリーは、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣体、マルチパ
ラレル合成物コレクション、リコンビナトリアル、およびポリペプチドライブラ
リーなどである。コンビナトリアル化学およびそのライブラリーを概観するには
、次を参照せよ。［Myers,Cuir.0pm.Biotechno1. 8:701-707 (1997)］。ここに
述べた各種ライブラリーを用いてモジュレーターを特定することで、候補の「ヒ
ット」（または、「リード」）化合物をさらに修飾して「ヒット」化合物の調節
活性を最適化することが可能となる。
【０１５６】 さらに異なった候補阻害剤も考えられる。例えば、溶解タイプの結合パートナ
ーや、キメラまたは融合タンパク質の結合パートナーなどで、これらも本発明に
含まれる。ここに使用される「結合パートナー」は、非ペプチドモジュレーター
、天然リガンド以外の神経ペプチドなどのペプチドモジュレーター、抗体、抗体
のフラグメント、および、特定されたＤｍＧＰＣＲの発現生産物に免疫特異的な
抗体ドメインを含む修飾化合物なども、広く含んでいる。
【０１５７】 ＤｍＧＰＣＲレセプターの特定の神経ペプチドリガンドを特定するために、他
のアッセイを使用してもよい。このようなアッセイとしては、試験リガンドと標
的タンパク質との直接結合を測定することにより標的タンパク質のリガンドを特
定するアッセイ、および、イオンスプレーマススペクトル／ＨＰＬＣ法または他
の物理的分析的手法を用いて、限外ろ過で標的タンパク質のリガンドを特定する
アッセイがふくまれる。これに代えて、そのような結合相互作用を、例えば、酵
母ツーハイブリッドシステムを使用して、間接的に評価することもできる。（［
Fieldsら、Nature, 340:245-246 (1989);および Fieldsら、Trends in Genetics
, 10:286-292 (1994)］を参照せよ、 双方とも、出典明示して、全体を本明細書
の一部とみなす。）このツーハイブリッドシステムは、二つのタンパク質または
ポリペプチド間の相互作用を検出するための遺伝子アッセイである。この方法は
、既知の標的タンパク質に結合するタンパク質の特定あるいは、その相互作用に
最も必要なドメインや残基を見出すのに使われる。ＤＮＡ結合タンパク質をコー
ドする遺伝子のクローニング、タンパク質に結合するペプチドの特定や、新薬の
スクリーニングのために、この方法の変形法が、開発されている。このツーハイ
ブリッドシステムは、相互作用を持つ一対のタンパク質が持つ、転写活性領域を
、レポーター遺伝子の上流にある活性化配列（ＵＡＳ）に結合するＤＮＡ結合領
域の近傍に持っていく能力を調べるもので、通常は酵母中で実施されている。そ
のアッセイには、次の２つのハイブリッド遺伝子の確立が必要である。（１）第
一のタンパク質に融合したＤＮＡ結合領域、および（２）第二のタンパク質に融
合した活性化領域。このＤＮＡ結合領域は、第一のハイブリッドタンパク質を、
レポーター遺伝子のＵＡＳに向かわせる。しかし、ほとんどのタンパク質は活性
化領域を書くため、このＤＮＡ結合ハイブリッドタンパク質は、レポーター遺伝
子の転写を活性化しない。第二のハイブリッドタンパク質は、活性化ドメインを
もつが、ＵＡＳに結合しないため、それ自体ではレポーター遺伝子の発現を活性
化できない。しかし、両方のハイブリッドタンパク質が存在するとき、第一と第
二のタンパク質の非共有相互作用が、活性化ドメインをＵＡＳに結びつけ、レポ
ーター遺伝子の転写を活性化する。例えば、第一のタンパク質として、他のタン
パク質や核酸と相互作用を持つことが知られているＧＰＣＲ生産物またはそのフ
ラグメントを使用する時、このアッセイはその結合相互作用を妨害する薬剤を検
出するのに利用できる。異なるテスト試薬がそのシステムに添加されるため、レ
ポーター遺伝子の発現は監視される。阻害剤が存在は、レポーターシグナルは消
失につながる。
【０１５８】 ＤｍＧＰＣＲ遺伝子生成物の機能が不明で、その遺伝子生成物に結合するリガ
ンドがない場合、酵母ツーハイブリッドアッセイがその遺伝子生産物に結合する
タンパク質の同定に使用できる。ＤｍＧＰＣＲレセプターまたはそのフラグメン
トに結合するタンパク質を特定するアッセイにおいて、ＤｍＧＰＣＲレセプター
（または、そのフラグメント）とＵＡＳ結合領域（すなわち、第一のタンパク質
）の両方をコードする融合ポリヌクレオチドを使ってよい。また、本アッセイで
は、各種の活性化領域に融合された第二タンパク質をコードする多数のハイブリ
ッド遺伝子が作られ、スクリーンされる。典型的には、第二タンパク質は、ｃＤ
ＮＡまたはゲノムＤＮＡ融合ライブラリー全体中の１個以上のメンバーによりコ
ードされ、その際、第二タンパク質コード領域は、活性化ドメインに融合される
。このシステムは、広範なタンパク質に利用可能で、第二の結合タンパク質の実
体あるいはその機能を知る必要もない。このシステムは感度が高く、他の方法で
は検出できない相互作用も検出できる。一時的な相互作用でも、安定な一つのｍ
ＲＮＡの転写を引き起こし、このｍＲＮＡから繰り返し転写が起こってレポータ
ータンパク質を産生することになるかもしれない。
【０１５９】 標的タンパク質と結合する物質を調べるのに、他のアッセイを利用してもよい
。試験リガンドと標的タンパク質との直接結合を特定するためのこのようなスク
リーン法の一つが、次の特許に記載されている。（［U.S. Patent N0. 5,585,27
7］、出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす。）この方法は、タンパク
質は、一般的に、折りたたみ構造または非折りたたみ構造の混合物の状態で存在
し、常に両状態間で交代しているという原則によっている。ある試験リガンドが
、折りたたみ構造の標的タンパク質に結合する時（すなわち、試験リガンドが、
標的タンパク質のリガンドである場合）、リガンドにより結合された標的タンパ
ク質は、折りたたみ状態で存在する。このため、標的タンパク質に結合する試験
リガンドが存在するときは、リガンドの不存在下に比べ、標的タンパク質は折り
たたみ構造で存在する程度が高くなる。リガンドの標的タンパク質への結合は、
標的タンパク質の折りたたみ構造と非折りたたみ構造を区別できる方法なら、ど
のような方法でも決定可能である。このアッセイを行う上で、標的タンパク質の
機能を知る必要性はない。この方法で、どのような試験リガンドのアッセイも可
能である。このようなリガンドとしては、金属、ポリペプチド、タンパク質、リ
ピッド、多糖類、ポリヌクレオチドや低分子有機分子などが挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。
【０１６０】 標的タンパク質のリガンドを特定するもう一つの方法が、次の文献に記載され
ている。（［Wieboldtら、Ana1. Chem., 69:1683-1691(1997)］、出典明示して
、全体を本明細書の一部とみなす。）この手法は、溶液相での標的タンパク質へ
の結合を、同時に２０−３０物質しながらンビナトリアルライブラリーをスクリ
ーンする。標的タンパク質に結合する物質は、他のライブラリー成分から、単に
膜洗浄だけで分離される。フィルター上に保持された特異的に選別された分子は
、続いて標的タンパク質から遊離され、ＨＰＬＣや空気圧式エレクトロスプレー
（イオンスプレー）マススペクトルで分析される。この操作は、ライブラリー中
から標的タンパク質に最大の親和性を示すものを選別し、低分子ライブラリーに
特に有用である。
【０１６１】 本発明の他の実施形態は、競争的スクリーニングアッセイの使用も含む。競争
的スクリーニングアッセイでは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する中和
抗体が、そのポリペプチドと結合する試験化合物と競合する。このように、抗体
は、ＤｍＧＰＣＲと、一個以上の抗原性決定因子を共有するペプチドの存在を検
出するのに使うことができる。放射ラベルされた競争的結合試験は、次の文献に
記載されている。（［A.H. Linら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1
997, vo1.41, No.10. pp.2127-2131］、出典明示して、この開示の全体を本明細
書の一部とみなす。）
【０１６２】 本発明の他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、相互作用する調製
タンパク質の同定、特徴の決定や精製のための研究手段として用いる。本発明の
ポリペプチドに、いろいろな既知の方法により適当なラベルを付け、相互作用し
ている分子を捕まえるのに用いる。例えば、分子を、ラベル化ポリペプチドと共
にインキュベートし、非結合ポリペプチドを洗浄で除いた後、ポリペプチド複合
体が定量される。異なる濃度のポリペプチドから得られたデータは、ポリペプチ
ドとタンパク質複合体間の結合の数、親和性や関連性などの値の計算に用いられ
る。
【０１６３】 ラベル化ポリペプチドは、ポリペプチドが相互作用を持つ分子の精製のための
試薬としても有用である。そのようなポリペプチドが相互作用を持つ分子には、
阻害剤が含まれるが、これに限定されない。アフィニティー精製の一つの実施形
態として、あるポリペプチドがクロマトグラフィーカラムに共有結合で結合され
る。細胞やその膜は抽出され、各種細胞小成分はカラム内を通過させられる。分
子は、そのポリペプチドに対する親和性に応じてカラムに結合する。ポリペプチ
ド複合体は、カラムから回収され、解離され回収された分子はタンパク質配列決
定に供される。このアミノ酸配列は、次いで捕捉された分子の同定や、適当なｃ
ＤＮＡライブラリーからの相当する遺伝子をクローニングのためオリゴヌクレオ
チドの設計や変性に使用される。
【０１６４】 あるいは、本発明のＤｍＧＰＣＲに似た対リガンド特性を示すが、ヒトまたは
動物体中の内在性のリガンドより低分子で、半減期が長い化合物が、特定できる
かもしれない。有機化合物を設計する時、本発明の分子は、「リード」化合物と
して使用できる。既知の医薬的に活性な化合物を模倣して設計することは、「リ
ード」化合物を基礎とした医薬品開発でよく知られたアプローチである。標的と
なる特性を求めるために、多数の分子をランダムにスクリーニングすることを避
けるため、模倣の設計、模倣合成や試験が一般に行われている。さらに、本発明
のＤＮＡでコードされ推測されたアミノ酸配列の分析から得られる構造データは
、より特異的でこのためより高い薬理作用を持つ新薬の設計に有用である。
【０１６５】 本発明のタンパク質配列と、利用可能なすべてのデータベースにある配列とを
比較すると、Ｇタンパク質結合レセプターの膜貫通領域とかなり大きな同一性が
示される。したがって、入手可能な他タンパク質の膜貫通ドメインの情報をもと
に、コンピューターモデリングを使ってで、本発明のタンパク質の推定三次構造
を求めることができる。このようにして、ＤｍＧＰＣＲの予想構造をもとに、新
規なリガンドを設計することができる。
【０１６６】 ある特定の実施形態では、本発明のスクリーニング法により特定された新規分
子は、低分子量有機分子であり、この場合、錠剤などの経口摂取用の組成物また
は医薬組成物が、これから作られる。その組成物または医薬組成物は、核酸分子
、ベクター、ポリペプチド、抗体やここに記載のスクリーニング法により特定さ
れた化合物を含み、下記のどの投与経路用に作られてもよい。例えば、経口、静
脈内、皮下、鼻内、筋肉内または腹腔内などを含みむが、これに限定されない。
担体または他の成分の性質は、具体的な投与経路や投与される本発明の実施形態
による。この関係で有用な技術や手順は、なかでも、次の文献に記載されている
。（［REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th edition, Oso1, A 編集、1
980］、出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす。）
【０１６７】 これらの低分子量化合物の服用量は、治療すべき疾病状態または状況、あるい
は体重やヒトまたは動物の状態など他の臨床的要素に、およびその化合物の投与
経路に依存する。ヒトまたは動物を治療するにあたり、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重
から５００ｍｇ／ｋｇ体重当たりの投与量で化合物を投与できる。治療は、典型
的にはより少ない服用量で投与され、目的の治療効果が観測されるまで継続され
る。
【０１６８】 本発明の他の態様は、ここに開示のＤｍＧＰＣＲヌクレオチド配列の動物中の
ＤｍＧＰＣＲホモログの特定のための使用である。これらの動物としては、ヒト
および他の哺乳類、および無脊椎動物類である。ここに開示するヌクレオチド配
列またはその部分のいずれも、ホモログを特定するために、当業者には公知のス
クリーニング法を使用して、例えば、データベースまたは、例えばゲノムまたは
ｃＤＮＡライブラリーのような核酸ライブラリーを検索するのに使用できない。
この方法によれば、少なくとも５０％以上、より好ましくは少なくとも６０％以
上、より好ましくは少なくとも７０％以上、より好ましくは少なくとも８０％以
上、より好ましくは少なくとも９０％以上、より好ましくは少なくとも９５％以
上、またより好ましくは少なくとも１００％以上のＤｍＧＰＣＲと相同性をを持
つホモログが得的できる。
【０１６９】 本化合物および方法は、核酸分子、ポリペプチド、抗体、ここに記載のスクリ
ーニング法により特定された化合物などを含み、様々な薬学的用途をもち、例え
ば、癌細胞や腫瘍の成長などの無秩序な細胞の成長の治療または予防に使うこと
ができる。具体的な実施形態の一つとして、本分子は、遺伝子治療に用いられる
。遺伝子治療手順の概観には、次の文献を参照せよ。（例えば、［Anderson, Sc
ience, 1992,256, 808-813］、出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす。
）
【０１７０】 本発明は、哺乳類において、ＤｍＧＰＣＲ天然結合パートナーが関与する活性
を、作動（刺激）するまたは拮抗する方法もまた含んでいる。この方法は、上記
動物に、上記ポリペプチドに対する作動薬または拮抗薬を、前記作動または拮抗
を起こすのに必要な十分な量投与することを特徴とする。それゆえ、本発明の一
実施形態は本発明のタンパク質の作動薬または拮抗薬を用いて、哺乳類における
疾病を治療する方法であり、ＤｍＧＰＣＲ関連機能を作動または拮抗するに足る
量にて作動薬または拮抗薬を哺乳類に投与することを特徴とする。
【０１７１】 疾病の新規治療法を発見する努力として、生医学研究者や化学者は、タンパク
質ポリペプチドの機能を阻害する分子を設計、合成、試験してきた。低分子有機
分子のいくつかは、タンパク質ポリペプチドの機能を調整する化合物の分類を形
成する。プロテインキナーゼの機能を阻害すると報告されている分子の例として
は、ビスモノサイクリック、ビサイクリック、またはヘテロサイクリックアリー
ル化合物［Maguireら、PCT WO 92/20642, 11月26日1992公開］、ビニレン−アザ
インドール誘導体［Ballinariら、PCT WO 94/14808, 公開7月7日, 1994］、１−
シクロプロピル−４−ピリジル−キノン［米国特許第 5,330,992］、スチリル化
合物［米国特許第5,217,999］、スチリル−置換ピリジル化合物［米国特許第5,3
02,606］、ある種のキナゾリン誘導体［EP出願No. 0 566 266 A1］、セレオイン
ドールおよびセレニド［Dennyら、PCT W0 94/03427, 公開 2月17日, 1994.］、
トリサイクリックポリハイドロキシル化合物［Dow、PCT WO 92/21660, 公開日、
10月10日, 1992 ］、および、ベンジルホスホン酸化合物［Dowら、PCT WO 91/15
495, 公開日 10月17日, 1991］などがあるが、これに限定されない。
【０１７２】 細胞膜を通過でき又難酸加水分解性の化合物は、患者に投与後に成体利用効率
が高くなるため、治療薬として大きな長所を持っている。しかし、これらのタン
パク質阻害剤の多くは、機能阻害の程度が低い。また、多くは様々なプロテイン
キナーゼを阻害し、このため疾患に対する治療法として多数の副作用を引き起こ
す。
【０１７３】 インドリノン化合物のいくつかは、しかし、酸抵抗性、膜透過有機分子の分類
を形成する。下記文献は、オキシインドール環に融合したテトラリン、ナフタレ
ン、キノリン、およびインドール置換基を持つ水溶性インドリノン化合物を記載
している。（［WO 96/22976 Ballinariら、公開日、8月1日, 1996）。こららの
二環性置換基は、今度は、ヒドロキシル化アルキル、リン酸および他の置換基な
どの極性基で置換されている。下記特許は、他のビサイクリック構造やモノサイ
クリック構造がオキシインドールに融合したインドリノン化合物のインドリノン
化学ライブラリーについて記載している。（［Tangら、U.S. Patent Applicatio
n Serial Nos. 08/702,232, 出願日 8月23日, 1996, 名称 "INDOLINONE COMBINA
TORIAL LIBRARIES AND RELATED PRODUCTS AND THE METHODS FOR THE TREATMENT
OF DESEASE" ［Lyon & Lyon Docket N0. 221/187］;および 08/485,323, 出願日
6月7日, 1995, 名称 "BENZYLIDENE-Z-INDOLINE COMPOUNDS FOR THE TREATMENT O
F DISEASE" by Tang et a1. ［Lyon & Lyon Docket N0. 223/298);および、Ball
inariら、International Patent Publication WO 96/22976, 公開日8月1日, 199
6）］、これら全ては、出典明示して、図表も含みそれらの全体を本明細書の一
部とみなす）。下記特許は、インドリノンの合成方法、細胞中でのインドリノン
の生物活性の試験方法、およびインドリノン誘導体の阻害パターンについて教え
ている。［Tangら、出願08/702,232, 出願日8月23日, 1996, 名称 "INDOLINONE
COMBINATORIAL LIBRARIES AND RELATED PRODUCTS AND METHODS FOR THE TREATME
NT OF DISEASE" ［Lyon & Lyon Docket No. 221/187］; Tangら、08/485,323,
出願日6月7日, 1995, 名称 "BENZYLIDENE-Z-INDOLINE COMPOUNDS FOR THE TREAT
MENT OF DISEASE", ［Lyon & Lyon Docket No. 223/298］; および、Ballinari
ら、WO 96/22976, 公開日8月1日, 1996］、 いずれも、図表を含み、出典明示し
て、全体を本明細書の一部とみなす。）
【０１７４】 キナーゼ活性を調整することのできる他の例としては、チルホスチン、キナゾ
リン、キノキソリンやキノリンが挙げられるが、これに限定されない。上述のキ
ナゾリン、チルホスチン、キノリンやキノキソリンは、よく知られた化合物で、
次のような文献に記載されている。例えば、キナゾリンについて記載する代表的
な文献は、次を含む。［Barkerら、EPO Publication No. 0 520 722 Al; Jones
ら、米国特許第4,447,608; Kabbeら、米国特許第4,757,072; KaulおよびVougiou
kas, 米国特許第5,316,553; Kreighbaum and Comer, 米国特許第4,343,940; Peg
gおよびWardleworth, EPO Publication No. 0 562 734 Al; Barkerら、Proc. of
Am. Assoc. for Cancer Research 32:327 (1991); Bertino, J.R., Cancer Res
earch 3: 293-304 (1979); Berdno, J.R., Cancer Research 9(2 part l):293-3
04 (1979); Curtinら、Br. J. Cancer 53:361-368 (1986); Fernandesら、Cance
r Research 43:1117-1123 (1983); Fernsら、J. Org. Chem. 44(2): 173-178; F
ryら、Science 265:1093-1095 (1994); Jackmanら、Cancer Research 51:5579-5
586 (1981); Jonesら、J. Med. Chem. 29(6):1114-1118; Lee and Skibo, Bioch
emistry 26(23):7355-7362 (1987); Lemusら、J. Org. Chem. 54:3511-3518 (19
89); Ley and Seng, Synthesis 1975:415-522 (1975); Maxwellら、Magnetic Re
sonance in Medicine 17:189-196 (1991); Miniら、Cancer Research 45:325-33
0 (1985); Phillips and Castle, J. Heterocyclic Chem. 17(19):1489-1596 (1
980); Reeceら、Cancer Research 47(11):2996-2999 (1977); Sculierら、Cance
r Immunol. and Immunother. 23:A65 (1986); Sikoraら、Cancer Letters 23:28
9-295 (1984); およびSikoraら、Analytical Biochem. 172:344-355 (1988)］、
全て、出典明示して、図表も含む全体を本明細書の一部とみなす。
【０１７５】 キノキサリンは、ＫａｕｌおよびＶｏｕｇｉｏｕｋａｓにより述べられている
。［米国特許第5,316,553」、これらは全て、出典明示して、図表も含むその全
体を本明細書の一部とみなす。）
【０１７６】 キノリンは、下記文献に記載されている。（［Dolleら、J. Med. Chem. 37:26
27-2629 (1994); MaGuire, J. Med. Cbem, 37:2129-2131 (1994); Burkeら、J.
Med. Chem. 36:425-432 (1993); およびBurkeら、BioOrganic Med. Chem. Lette
rs 2:1771-1774 (1992)］ 全ては、出典明示して、図表も含むその全体を本明細
書の一部とみなす。）
【０１７７】 チルホスチンは、下記文献に記載されている。［Alienら、Clin. Exp. Immuno
1. 91:141-156 (1993); Anafiら、B1ood 82:12:3524-3529 (1993); Bakerら、J.
Cell Sci. 102:543-555 (1992); Bilderら、Amer. Physio1. Soc. pp. 6363-61
43:C721-C730 (1991); Bruntonら、Proceedings of Amer. Assoc: Cancer Rsch.
33:558 (1992); Bryckaertら、Experimental Cell Research 199:255-261 (199
2); Dongら、J. Leukocyte Biology 53:53-60 (1993); Dongら、J. Immuno1. 15
1(5):2717-2724 (1993); Gazitら、J. Med. Chem. 32:2344-2352 (1989); Gazit
ら、J. Med. Chem. 36:3556-3564 (1993); Kaurら、Anti-Cancer Drugs 5:213-2
22 (1994); Kaurら、King et al., Biochem. J. 275:413-418 (1991); Kuoら、C
ancer Letters 74:197-202 (1993); Levitzid, A., The FASEB J. 6:3275-3282
(1992); Lyallら、J. Bio1. Chem. 264:14503-14509 (1989); Petersonら、The
Prostate 22:335-345 (1993); Pillemerら、Int. J. Cancer 50:80-85 (1992);
Posnerら、Molecular Pharmacology 45:673-683 (1993); Renduら、Bio1. Pharm
acology 44(5):881-888 (1992); Sauro and Thomas, Life Sciences 53:371-376
(1993); Sauro and Thomas, J. Pharm. and Experimental Therapeutics 267(3
):l 19-1125 (1993); Wolbringら、J. Bio1. Chem. 269(36): 22470-22472 (199
4); および、 Yonedaら、Cancer Research 51:4430-4435 (1991)］、 これらは
全て、出典明示して、図表も含む全体を本明細書の一部とみなす。）
【０１７８】 モジュレーターとして使用できる他の化合物としては、下記文献記載のオキシ
インドリノンを含む。［U.S. patent application Serial No. 08/702,232 出願
日8月23日, 1996］、出典明示して、図表も含み全体を本明細書の一部とみなす
。
【０１７９】 患者に投与する化合物の服用量を決定する方法および生物体に化合物を投与す
る形態は、下記文献に開示されている。（［U.S. Application Serial No. 08/7
02,282, 出願日August 23, 1996 and International patent publication numbe
r WO 96/22976, 公開日August 1 1996, いずれも、出典明示して、図表も含み全
体を本明細書の一部とみなす。） 当業者は、これらの開示が本発明に適用でき
、又容易に適合されることが分かるだろう。
【０１８０】 適当な投与量は、治療される疾病の種類、使用される特定の組成物や、患者の
サイズや生理的状態などのいろいろな要素に依存する。ここに記載の化合物の治
療的に有効な投与量は、初めは、細胞培養や動物モデルから評価できる。例えば
、投与量は、細胞培養アッセイで決定されたＩＣ５０を考慮して、ある循環濃度
領域となるように動物モデルで設定される。動物モデルデータは、ヒトへの有用
な投与量をより正確に決定するのに使うことができる。
【０１８１】 障害を防ぐため薬剤の最適選択を行うために、血漿、癌や腫瘍組織での、薬剤
や代謝性産物の血漿半減期や体内分布も決定することができる。このような測定
は、実施可能である。例えば、ＨＰＬＣ分析は、薬剤で処理された動物の血漿の
分析に、放射ラベルされた化合物は、Ｘ線、ＣＡＴスキャンやＭＲＩなどの検出
方法を使って決定することができる。スクリーニングアッセイで強い阻害作用を
示し、弱い薬物動態学的性質を示す化合物は、化学構造の変更や再試験などで最
適化することができる。この点で、優れた薬物動態学的特徴を持つ化合物が、モ
デルとして使われる。
【０１８２】 毒性試験は、血液組成を測定することで実施してもよい。例えば、毒性試験は
、適当な動物モデル中で、次のように実施される。１）化合物がマウスに投与さ
れる。（処理されない対照のマウスも又使われるべきである）、２）各処理群中
のマウス１匹から尾静脈経由で血液サンプルを定期的に抜く、３）サンプルは、
赤血球及白血球数、血液細胞組成、やリンパ球と多形核白血球の比率などが分析
される。各投与療法と対照の結果を比較することで、毒性の有無を決めることが
できる。
【０１８３】 毒性試験の最後に、動物の犠牲の上にさらなる試験をすることができる。（好
ましくは、アメリカ獣医学協会安楽死部会のアメリカ獣医学協会のガイドライン
報告による。［Journal of American Veterinary Medical Assoc., 202:229-249
, 1993］。各処置群を代表する動物は、次いで、転移、異常な疾病あるいは毒性
の直接的な証拠を探るため、巨視的解剖により調べられる。組織の巨視的な異常
は記録され、組織学的に検査される。体重または血液を減少させる化合物は、主
要臓器に悪影響を持つ化合物同様好ましくない。一般的に、悪影響が大きいほど
化合物はより好ましくなくなる。
【０１８４】 癌の治療のために使用される疎水性薬剤の一日使用量は、１から５００ｍｇ／
日であり、好ましくは１から２５０ｍｇ／日、もっとも好適には１から５０ｍｇ
／日である。活性成分の血漿レベルが治療効果を発揮するのに十分であれば、薬
剤の投与の頻度は、少なくしてもよい。血漿レベルは薬剤の効力を反映するはず
である。一般に、化合物の効果が強いほど、効果を発揮するのに必要な血漿レベ
ルは低くなる。
【０１８５】 ＤｍＧＰＣＲのｍＲＮＡ転写物は、多くの組織に見出される。このような組織
には、抹消血液リンパ球、脾臓、骨髄、唾液腺、心臓、甲状腺、副腎、すい臓、
肝臓、大腸、肺、前立腺、小腸、筋肉、胃、胎盤や胎児肝臓などが含まれる。配
列番号：１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，または、
２３で提供される配列は、ＤｍＧＰＣＲレセプターの完全長ｃＤＮＡを見つける
のに使用してもよい。そのレセプターのクローンは、上述のように、そのレセプ
ターを活性化する内在性の神経伝達物質／ホルモンや、障害を治療するのに有用
性をもつと期待される化合物のスクリーニングを可能とする。このような障害と
しては、心血管障害、再灌流障害、冠血管血栓症、凝固障害、癌などの無秩序な
細胞成長、緑内障、肥満、代謝異常、炎症性障害やＣＮＳ障害などが含まれる。
【０１８６】 例えば、ＤｍＧＰＣＲは、Ｔ細胞が疾病に関与している喘息などの呼吸器系疾
患の治療に有用であろう。気管平滑筋の収縮は、トロンビンにより刺激される。
［Cicalaら、(1999) Br. J. Phamiacol. 126:478-484）また、閉塞性細気管支炎
において、トロンビンレセプターの活性化は有害であるかもしれないとされてい
る。［Hauckら、(1999) Am. J. Physio. 1277:L22-L29］。さらに、肥満細胞は
、またトロンビンレセプターを持つことが示されている。［Cirinoら、(1996) J
. Exp. Med. 183:821-827）。ＤｍＧＰＣＲは、また線維芽細胞プロコラーゲン
合成を通して、慢性の肺炎における気管構造の再構築に有用であると考えられる
。（例えば、Chambersら、(1998) Biochem. J. 333:121-127; Trejoら、(1996)
J. Biol. Chem. 271:21536-21541］を参照せよ。）
【０１８７】 さらに他の一例では、トロンビンレセプターの活性化後のＴ細胞によるｓＣＤ
４０Ｌの放出とＣＤ４０ｌの発現の増加は、ＤｍＧＰＣＲが、Ｔ細胞の役割と炎
症に起因する不安定狭心症の治療に有用である可能性があることを示唆している
。［Aukrustら、(1999) Circulation, 100:614-620］を参照せよ。
【０１８８】 さらなる一例は、乾癬、炎症性腸疾患、多発性硬化症、リウマチ関節炎や甲状
腺炎などの炎症性疾患の治療である。ＤｍＧＰＣＲの組織発現プロファイルによ
ると、トロンビンレセプターの阻害は、これらの疾病に有益であるかもしれない
。（例えば、次の［Mornsら、(1996) Ann. Rheum. Dis. 55:841-843］を参照せ
よ。）Ｔ細胞に加えて、ＮＫ細胞や単球は、これらの疾病の原因として寄与する
決定的な細胞種である。（例えば、［Naldini & Camey, (1996) Cell Immuno1.
172:35-42; Hoffman & Cooper, (1995) B1ood Cells Mol. Dis. 21:156-167; Co
lottaら、(1994) Am. J. Pathol. 144:975-985］を参照せよ。）
【０１８９】 骨髄や脾臓でのＤｍＧＰＣＲの発現は、それが造血性前駆体細胞の増殖にある
役割を果たしているかもしれないことを示唆する。［DiCuccioら、(1996) Exp.
Hematol. 24:914-918］を参照せよ。
【０１９０】 もう一つの例として、ＤｍＧＰＣＲは、急性、および/または外傷性脳障害の
治療に有用であるかもしれない。星状膠細胞は、トロンビンレセプターを発現す
ると報告されている。トロンビンレセプターの活性化が、脳手術後の血管神経膠
症に関連しているかもしれない。したがって、レセプター活性の阻害が、神経炎
症を抑えるのに有益であるかもしれない。星状膠細胞が介在する瘢痕形成も、ま
たトロンビンレセプターの阻害で抑えることができるかもしれない。例えば、［
Pindonら、(1998) Eur. J. Biochem. 255:766-774; Ubl & Reiser., (1997) Gli
a 21:361-369; Grabham & Cunningham, (1995) J. Neurochem. 64:583-591］を
参照せよ。
【０１９１】 ＤｍＧＰＣＲレセプターの活性化は、ニューロンや星状膠細胞のアポトーシス
や、神経突起の成長の防止などを仲介するかもしれない。阻害は慢性および急性
の脳損傷の双方に効果的である。例えば、［Donovanら、(1997) J. Neurosci. 1
7:5316-5326;Turgeonら、(1998) J. Neurosci. 18:6882-6891; Smith-Swintosky
ら、(1997) J. Neurochem. 69:1890- 1896; Gillら、(1998) Brain Res. 797:3
21-327; Suidanら、(1996) Semin. Thromb. Hemost. 22:125-133.］を参照せよ
。
【０１９２】 次のテーブル４は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの配列を含んで
いる。
【０１９３】
【表４】
【０１９４】
【表５】
【０１９５】
【表６】
【０１９６】
【表７】
【０１９７】
【表８】
【０１９８】
【表９】
【０１９９】
【表１０】
【０２００】
【表１１】
【０２０１】
【表１２】
【０２０２】
【表１３】
【０２０３】
【表１４】
【０２０４】 ブダペスト条約により、本発明のクローンは、下記に寄託した。 ［the Agricultural Research Culture Collection (NRRL) International Depo
sitory Authority, 1815N. University Street, Peoria, Illinois 61604, U.S.
A.）目録番号と寄託日は下のテーブル５に記載した。
【０２０５】
【表１５】
【０２０６】 本発明は、以下に実施例にてさらに描写するが、これらは本発明を説明するた
めのものであって、本発明の範囲を制限することを意図しているのではなく、ま
た、そのように解釈されてはならない。本発明は、ここに具体的に記載のものと
は異なった形で実施可能であることは明白である。ここにある教示に照らして、
多数の本発明の改変や変形が可能であり、これらも本発明の範囲内に入る。
【０２０７】 本特許文書に記載の各特許、出願特許や文献は、ここにそれらの全体を参照と
して示すものである
【０２０８】 下に提示する実施例１は事実であるが、その他の実施例は予言的である。
【実施例】
【０２０９】 Ｃｅｌｅｒａ社ゲノムＤ．ｍeｌａｎｏｇａｓｔｅｒデータベースを、生成さ
れるｍＲＮＡを予想するための各種の遺伝子検索ソフトウェアを用い、予想タン
パク質およびｍＲＮＡデータベースに変換した。（「PnuFlyPep」データベース
）遺伝子検索ソフトウェアを用いた遺伝子データベースの検索方法は、公知であ
る。
【０２１０】 複数個の、Ｃエレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＦａＲＰ ＧＰＣＲのヌク
レオチド配列を、このｍＲＮＡデータベースのクエリー配列として使用した。こ
のデータベースで、ＦＡＳＴＡやＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴなど多くの種類の手
段を用いて類似領域を検索した。（［Altschulら、Nuc. Acids Res., 1997,25,3
389, これは、ここでその全体を参照として利用した。）
【０２１１】 簡潔に述べると、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（BLASTは、Basic Local Alignment
Search Toolを短縮したもの)は、配列の類似性を決定するのに適している。［A
ltschulら、J. Mo1. Bio1., 1990, 215,403-410, これは、ここでその全体を参
照として利用した）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するのためのソフトウェアは、国立
バイオテクノロジ-情報センター（the National Center for Biotechnology Inf
ormation）から誰でも入手可能である。(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。この
アルゴリズムは、まずデータベース中の同じ長さの単語と並べたとき、正の閾値
スコアＴとマッチするか満足させるクエリー配列中のＷの長さの短い単語を見つ
けることにより、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を見つける。Ｔは、隣接単語スコ
ア閾値と呼ばれている。［Altschulら、前出］。これらの初期に見出された隣接
単語は、ＨＳＰを見つける検索を始める上でのシードとなる。そのヒットした単
語は、、総整列スコアが増加するように、配列に沿って配列の両方に延長される
。単語の両方向への延長は、次の場合停止される。すなわち、１）総整列スコア
が、その最大値より一定量Ｘ下がった場合、２）総整列スコアが、ネガティブな
スコアを持つ整列のため、ゼロまたはそれ以下になる時、または、３）配列のど
ちらか一方の末端に達した時である。ＢＬＡＳＴアルゴリズム変数Ｗ、ＴとＸは
、整列の感度と速度を決定する。ブラストプログラムは、デフォルトとして、単
語の長さ（Ｗ）を１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（［Henikoffら、
Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 1992,89, 10915-10919］を参照せよ、 出典明示
して、全体を本明細書の一部とみなす）整列（Ｂ）を５０、期待値（Ｅ）を１０
、Ｍ＝５，Ｎ＝４、および、両鎖の比較としている。
【０２１２】 BLASTアルゴリズム（［Karlinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993,90,587
3-5787］、 出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす）、およびギャップ
ドブラストは、二つの配列間の近似性の統計分析を実施する。BLASTアルゴリズ
ムにおいて使われる近似性の尺度は、二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間
でマッチが偶然起こる確率の指標を与える最小総確率（P(N)）である。例えば、
ある核酸とあるＧＰＣＲ遺伝子またはｃＤＮＡとは、もし、その核酸とＧＰＣＲ
間の最小総確率が、約1より小さい、好ましくは約０.1より小さい、さらに好ま
しくは約０．０１より小さい、およびさらに好ましくは約0.001より小さい時、
近似していると考えられる。
【０２１３】 予想されるタンパク質に相当するｍＲＮＡは、ＰｎｕＦｌｙＰｅｐデータベー
スを構築するのに使われた予想ｍＲＮＡのデータベースから引き出される。この
ようにして次のヌクレオチド配列が特定された。その配列は、配列番号：１，３
，５，７，９，１１，１３，１５，および１７で、それぞれ、クエリー配列と統
計的に有意な重複相同性を持つ。配列番号：３，４，５，６，および９ないし１
６（ＤｍＧＰＣＲの２ａ，２ｂ，５ａ，５ｂ，６ａ，および、６ｂに相当する）
のヌクレオチド配列が、もう一つの特定された配列からＰＣＲクローニングと配
列決定より得られた。これらの配列はそれぞれ、ＤｍＧＰＣＲ遺伝子のスプライ
ス変異体である。
【０２１４】 実施例２ ｃDNAの作成 ｃＤＮＡは、成体ショウジョウバエメラノガスターのポリＡ＋ＲＮＡ［Clonte
ch Laboratories, Palo Alto, CA)、または成体ショウジョウバエメラノガスタ
ーの完全ＲＮＡ（以下に記載）より作成された。完全ＲＮＡを得るには、ショウ
ジョウバエメラノガスターの親株(Biological Supply Company, Burlington, NC
)を冷却することにより麻酔させ、５から６匹の成虫を、１０ｍｌの水、１０ｍ
ｌのフォームラ４−２４ショウジョウバエ培地と活性乾燥酵母(Biological Supp
ly Company)６から１０グレインを含む培養容器に加える。各容器の末端には発
砲ポリウレタンのプラグを取り付け、ハエを室温（ＲＴ）で４から６週間インキ
ュベートした。期限がくると、容器を冷却し、麻酔のかかったハエは液体窒素中
に入れられた５０mlのポリプロピレンチューブに移した。凍結したハエは、液体
窒素存在下で乳鉢と乳棒でするつぶす時まで、−７０℃で保存した。液体窒素を
含む組織粉末は、ドライアイス上で５０mlのポリプロピレンチューブに移しかえ
た。液体窒素を蒸発させた後、粉体組織は、−７０℃で保存した。
【０２１５】 ＲＮＡを得るために、３０００ｍｇの粉体組織を、ドライアイス上でポリプロ
ピレンチューブに移し、６Ｍのグアニジン塩酸の０．１Ｍ ＮａＯＡｃ、ｐＨ
５．２の溶液を加えた。ＲＮＡａｓｅ汚染に伴う問題を減らすため、すべての溶
液は、ＤＥＰＥで処理されたか、ＦＥＰＣで処理した蒸留水で作成され、すべて
のガラス容器は加熱されるか、未使用のプラスチック実験器具を使用した。チュ
ーブは、渦混合した後、氷上に置いた。粉体組織は２０、２１、および２２ゲー
ジの針を繰り返し通して、ホモジナイズした。チューブは、遠心分離し（１００
０ｘｇ、１０分間）、２．５から３ｍｌの上清液をＵｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ遠心
チューブ(Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA)の中に入った８ｍｌの５
．７Ｍ塩化セシウムの０．１ＭＮａＯＡｃ溶液の上に置いた。サンプルは、Ｌ８
−７０遠心分離機(Beckman Instruments, Inc.,)にて、２５０００ｒｐｍで、
１８℃で18時間遠心した。上清液は、傾けて除き、チューブを逆さまにして水抜
きした。RNAのペレットは、２００μｌのＲＮＡａｓｅフリーの蒸留水(Qiagen I
nc., Valencia, CA)に分散し、ＲＮＡａｓｅフリーの蒸留水１００μｌで2回
洗浄した。RNAは、４４μｌの３M NaOAc、ｐH5.2溶液と１ｍｌの冷１００％エ
タノールを加えて沈殿させた。−７０℃で一夜保存後、チューブは、１４０００
ｒｐｍで1時間遠心分離(Eppendorfmicroftige 5402)し、７５％エタノール（Ｄ
ＥＰＣ処理の蒸留水で作成）で洗浄した。ついで、ペレットは、ＲＮＡａｓｅフ
リーの蒸留水に溶解した。２６０または２８０ｎｍでの吸光度を、１０ｍMトリ
スＨＣｌ、ｐＨ７．５溶液で測定し、ＲＮＡの濃度と純度を見積もった。
【０２１６】 一本鎖ｃＤＮＡは、スーパースクリプトＩＩ酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｒｏ
ｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いる方法により作成した。５００ｎｇのＡ＋ＲＮＡ
または３μｇ（μｌ）の完全ＲＮＡのいずれかを、ＲＮＡａｓｅフリーの蒸留水
と２５０ｎｇ（２．５μｌ）のランダムプライマーを含む微量遠心管に添加した
。チューブ（１２μｌ）は、７０℃で１０分間インキュベートし、氷上で冷却後
、次いで４μｌの５ｘ第一ストランド緩衝液、２μｌの０．１ＭのＤＴＴおよび
１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物を添加した。２５℃で１０分間、次いで４２
℃で２分間インキュベートの後、１μｌ（２００ユニット）のスーパースクリプ
トＩＩを添加し、さらに４２℃で５０分インキュベートを継続した。酵素は、７
０℃で１５分間加熱して不活性化させた。ｃＤＮＡに相補的なＲＮＡを除くため
、２μｌ（２ユニット）のＲＮＡａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）を添加、次いで３７℃で２０分間
インキュベートした。ｃＤＮＡは、−２０℃で保存した。
【０２１７】 ＰＣＲ反応 ショウジョウバエメラノガスターＧタンパク質結合レセプターを増幅するため
、アンプリワックスビーズ(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) を用いて、標準
の５０／１００μｌＰＣＲ反応またはホットスタートＰＣＲ反応を行った。プラ
イマー(Genosys Biotechnologies, Inc., The Woodlands, TX)を溶解するのに、
蒸留水を使用した。５’と３’プライマーは１０μＭ濃度、内部プライマーは１
μＭである。各ＰＣＲ反応は、２から４ユニットのｒＴｔｈ ＸＬ ＤＮＡポリ
メラーゼ、１．２から１．５ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、２００μＭの各ｄＮＴＰ
，および２００または４００ｎＭの各プライマーを含んでいた。ホットスタート
ＰＣＲには、３２から３６μｌの「低」カクテル（蒸留水）、３．３ｘＸＬ緩衝
液、ｄＮＴＰおよびＭｇ（ＯＡｃ）２を、各プライマー２または４μｌに添加し
た。（総体積、４０μｌ）。アンプリワックスビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅ
ｒ Ｃｅｔｕｓ）を添加し、チューブを７５℃で５分間インキュベート、室温で
冷却、次いで６０μｌの「高」カクテル（ｄＨ２Ｏ，３．３ｘＸＬ−緩衝液、ｒ
Ｔｔｈ およびテンプレート）を添加した。ＰＣＲ増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ９６００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒで行った。熱
サイクルの典型的プログラムは、９４℃で１分、次いで３０サイクルの増幅（９
４℃で０．５分、６０℃で０．５分、７２℃で２分）、次いで６０℃で６分であ
った。ＰＣＲ生成物の３’Ａオーバーハング（「テーリング」）を作るため、１
μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃ
Ａ）をＰＣＲ増幅の終わりに添加し、チューブを７２℃で１０分間インキュベー
トした。反応混合物は、ＴＡＢ緩衝液で準備した１％アガロースゲルで分析した
。ＰＣＲ生成物は、通常ＱＩＡｑｕｉｃｋスパンカラムを用いて精製した。
【０２１８】 連結と形質転換 すべてのＰＣＲ反応生成物とＰＣＲ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
との連結、および、連結生成物のワンショットＴＭ ＴＯＰ１０Ｆ形質転換受容
性細胞への形質転換は、製造業者の指示通り行った。挿入のためにスクリーニン
グされる形質転換細胞は、５０μｇアンピシリン／ｍｌを含むＬＢブロス中で増
殖させた。挿入を持つコロニーは、沸騰−溶解プラスミドミニプレップ法（５）
または、形質転換細胞から直接プラスミドＤＮＡを増幅する「コロニーＰＣＲ」
法のいずれかで特定した。
【０２１９】 ＤＮＡ配列決定 配列決定用のＤＮＡは、キアゲンアニオン交換プラスミドキット(QIAGEN-tip
20) を用いて、製造業者の指示に従って、３７℃で一夜培養した５ｍｌのＬＢか
らＤＮＡを単離して得た。４種のプライマー（Ｔ７、ＭＩＳ逆、「センス」およ
び「アンチセンス」）を、各ＤＮＡの配列決定に使用した。染料−ターミネータ
ー配列決定化学では、ＢｉｇＤｙｅ ＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ 試薬（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）、
あるいは、ＤＹＥｎａｍｉｃ ＴＭ ＥＴ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．，
Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用した。配列決定反応は、製造業者の推薦法
に従った。プライマーと取り込まれなかったヌクレオチドは、Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓ
ｅｐスパンカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ， Ａｄｅｌ
ｐｈｉａ， ＮＪ）を用いて除去した。配列決定反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ
で分析した。ＤＮＡ配列は集めて、セクエンチャー （Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ）、配列分析プログラムのＧＣＧグループ （Ｗ
ｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．１， Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ）， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗ
ｌ）、 およびベクターＮＴＩ５．５プログラムで利用可能な機能 （Ｉｎｆｏ
ｒｍａｘ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）を用いて分析した。
【０２２０】 本発明のＤｍＧＰＣＲのクローニングと配列決定の結果は次の通りである。
【０２２１】 ＤｍＧＰＣＲ１ ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ３４６５１に相当するｃＤＮＡを対象としたのＰＣＲプラ
イマーは、ショウジョウバエｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡ調整品
からＰＣＲ生成物を増幅するのに使用できた。この生成物は、クローン化し、配
列を決定した。実験的に決められた配列は、予想された配列と一致した。
【０２２２】 ＤｍＧＰＣＲ２ ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ６７５８５に相当するｃＤＮＡ向けのプライマーを用いて
、ＰＣＲ生成物の増幅を試みたが、うまくいかなかった。予想配列と、Ｃ． ｅ
ｌｅｇａｎｓ レセプターおよび他の神経ペプチドレセプターとを整列比較する
と、予想配列の５’末端が異常に長いことを示し、その側の遺伝子の予想にエラ
ーがあったことを示唆した。ゲノム配列を参考にして、各種の代わりの５’ＰＣ
Ｒプライマーを設計し試験した。これらプライマーの組合せの内の一つ、完全Ｒ
ＮＡから調製したｃＤＮＡを使ったものはが、正しいサイズの生成物を与えるの
に成功した。ＰＣＲ反応由来のクローンの配列決定の結果、増幅された生成物が
期待される５’および３’末端を持つこと、また、予想配列が６個のアミノ酸か
らなる短い断片を欠くことを除き、予想配列と一致することが示された。クロー
ンの比較により、２つのスプライスアイソフォームが存在することが判明した。
一つ（「ＤｍＧＰＣＲ２ａ」と命名）は、予想配列とよく似ていた。他方（「Ｄ
ｍＧＰＣＲ２ｂ」と命名）は、分子のＴＭ ＩＩ直後から細胞内Ｃ末端に入ると
ころに位置する２３個のアミノ酸からなる断片を欠いていた。
【０２２３】 ＤｍＧＰＣＲ３ ＤｍＧＰＣＲ３が予想するタンパク質に相当する遺伝子は、文献中に報告され
ている。この遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｍ７７１６８）
は、ＭＫＤ、「発生的制御タキキニンレセプター」、として記載されている。（
ＭｏｎｎｉｅｒＤ， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９２；２６７（２）： １２９８−３０２）
。Ｍ７７１６８とＰｎｕＦｌｙＰｅｐ６８５０５配列の比較により、予想配列が
ｃＤＮＡとはかなり異なることが示された。ｃＤＮＡは、より長い５’末端を持
ち、５１アミノ酸をコードするエクソンを欠き、また３’末端もかなり短かった
。公開されている配列に向けた複数のＰＣＲプライマーを設計し、一つのＰＣＲ
生成物が完全ＲＮＡから調整されたｃＤＮＡを用いて得られた。この生成物は、
構造がすでに報告されているＮＫＤ配列と一致した。
【０２２４】 ＤｍＧＰＣＲ４ ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ ６７３９３に相当するｃＤＮＡを用いて、ＤｍＧＰＣＲ
の増幅用のＰＣＲプライマーを設計した。全ショウジョウバエｍＲＮＡから作ら
れたｃＤＮＡライブラリーを用い、ＰＣＲ生成物が得られ、クローン化された。
クローンとＰｎｕＦｌｙＰｅｐ ６７３９３から予想された」配列を比較すると
、これらの配列が、ＨＭＭＧｅｎｅがいずれのクローン化ＰＣＲにもないことを
除き、一致することが判明した。ＤｍＧＰＣＲは、最近レンツらによりクローン
化されている。［Ｌｅｎｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍ．， ２７３：５７１−５７７ （２０００））。また、第二の推定
アラトスタチンレセプターとして分類されている。
【０２２５】 ＤｍＧＰＣＲ５ ＤｍＧＰＣＲ５（ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ６７５２２）は、すでに次の文献に、「
タチキニン関連ペプチド（Ｍ７７１６８）のショウジョウバエレセプター」とし
て記載されている。［Ｌｉ ＸＪら、ＢＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １９９１；１
０（ｌｌ）：３２２１−９）。初めの外見上、ＰｎｕＦｌｙＰｅｐタンパク質に
相当する予想ｃＤＮＡは、報告されている配列に一致した。ＰＣＲプライマーを
用いて、ショウジョウバエメラノガスターのｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡから調製した
ｃＤＮＡより、適当なサイズのＰＣＲ生成物に増幅した。 クローン化されたＰＣＲ生成物の配列決定の結果、全体的なスプライシングパタ
ーンは同じであるが、配列のエラーが報告されている配列に２箇所あることが判
明した。これらのエラーは、フレームシフト変異、次いで代償性フレームシフト
変異を引き起こし、結果として実験的に求めた配列と報告されている配列に間に
４６番目のアミノ酸から始まる１３個のアミノ酸の差となった。このクローン化
遺伝子は、「ＤｍＧＰＣＲ５ａ」と命名した。
【０２２６】 又、ＤｍＧＰＣＲ５ａには、スプライシングアイソフォームが認められた。こ
の変異体は、Ｎ末端細胞外ドメインに、余分な３個のアミノ酸をコードしていた
。この変異体は、「ＤｍＧＰＣＲ５ｂ」と命名した。
【０２２７】 ＤｍＧＰＣＲ６ ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ１５７３１に相当するＧＰＣＲは、「神経ペプチドＹ」Ｍ
８１４９０として報告されている。［Ｌｉ ＸＪら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９２；２６７（ｌ）：９−１２
）。ＰｎｕＦｌｙＰｅｐから予想される配列は、 Ｍ８１４９０とは、分子の両
端で異なっていた。ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ１５７３１は、Ｍ８１４９０と比べ、Ｎ
末端に余分な１５個のアミノ酸を持っていた。ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ１５７３１に
３’末端も、Ｍ８１４９０と比べ、保存されていたＴＭＶＩおよびＴＭＶＩＩ残
基が切断され、保持していなかった。
【０２２８】 Ｍ８１４９０の配列を使い、初期ＰＣＲプライマーを設計した。これらのプラ
イマーと完全ｍＲＮＡ由来のテンプレートを使用して、ＰＣＲ生成物が得られた
。クローン化されたＰＣＲ生成物を調べた結果、それがＭ８１４９０と同じプロ
セシングパターンを持つことが判明した。このクローンは、「ＤｍＧＰＣＲ６ａ
」と命名した。
【０２２９】 ＤｍＧＰＣＲ６ａのクローニング中に、もう一つのスプライシングアイソフォ
ームが発見された。このアイソフォームは、異なったスプライス受容サイトを使
い、６ａ型とほぼ同じ配列を使ってはいるものの異なる読み枠を使った結果、異
なった３’末端を作り出したものである。又、このクローンの読み枠は、元の３
’ＰＣＲプライマーを超えて伸びている。３’末端のゲノム配列を調べた結果、
多数の疑わしいエクソンが明らかとなった。これらの多数のエクソンに相当する
ＰＣＲプライマーを調べ、ＰＣＲ生成物を増幅するプライマーを一つ探し当てた
。この生成物は、「６ｂ」と命名した。ゲノム配列を調べた結果は、ＰｎｕＦｌ
ｙＰｅｐ１５７３１により予想される発動因子ＡＴＧは、余分な１５個のアミノ
酸を含有するＭ８１４９０の開始コドンのフレーム中にあること、又ＰｎｕＦｌ
ｙＰｅｐ１５７３１の開始コドンが正しい開始コドンであると可能性が高いこと
を示唆した。新しいＰｎｕＦｌｙＰｅｐ１５７３１を導入した５’ＰＣＲプライ
マーを設計し、２個の３’ＰＣＲプライマーと組み合わせて、「ＤｍＧＰＣＲ６
ａＬ」と「ＤｍＧＰＣＲ６ｂＬ」の増幅およびクローン化に使用した。
【０２３０】 ＤｍＧＰＣＲ７ 当初のＤｍＧＰＣＲ７遺伝子の増幅の試みは、失敗に終わった。 予想配列［ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ６７８６３） と他のＧＰＣＲとを整列比較の結
果、間違いは、多分分子の３’末端の予想にあると考えられた。その予想配列は
、他のほとんどのＧＰＣＲの３’末端より、大幅に長い３’末端を有していた。
ゲノム配列を調べた結果は、間違いはスプライシングの予想にあるようで、スプ
ライシングによりフレーム内停止コドン［この停止コドンは分子を適当な大きさ
にする）を除去してしまったことを示唆した。３’ＰＣＲプライマーは、そのイ
ントロン内に設計した。また、予想開始コドンの直ぐ上流のフレーム内ＡＴＧを
使用するように新しい５’ＰＣＲプライマーを設計した。完全ｍＲＮＡ由来のｃ
ＤＮＡのＰＣＲ増幅は、期待したサイズの生成物を与えた。
【０２３１】 ＤｍＧＰＣＲ８ ＤｍＧＰＣＲ８は、ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ予想配列向けに設計されたＰＣＲプラ
イマーを用いて増幅できた。ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ由来のｃＤＮＡを、ＰＣＲ反応
用のテンプレートとして使用した。配列の決定されたクローン６種は、すべてＰ
ｎｕＦｌｙＰｅｐ予想配列と構造が一致した。６９位［ＤＮＡ配列）には他形性
が認められ、クローンの半分がこの位置に「Ｃ」を、他の半分は「Ａ」を持って
いた。この変化はアミノ酸配列の変化につながり、それぞれ、ＡｓｐまたはＧｌ
ｕである。セレーラ社の配列は「Ａ」を示しており、このため、以降の研究用に
は、任意に「Ａ」クローン［Ｇｌｕ）を選択した。正しい配向を持つ「Ａ」クロ
ーンはなかった。このため、Ｐｍｅ Ｉを用いて元のｐＣＲ３．１クローンおよ
びＰｍｅ Ｉ消化ｐＣＲ３．１ベクターから挿入部を除くためのサブクローニン
グのステップを使い、配向を逆転させた。
【０２３２】 ＤｍＧＰＣＲ９ ＤｍＧＰＣＲ９は、 ＰｎｕＦｌｙＰｅｐの予想する配列に向けたＰＣＲプラ
イマーと、ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから調製したｃＤＮＡテンプレートとを用いてク
ローン化した。ゲノム構造は、ＰｎｕＦｌｙＰｅｐからの予想と一致した。
【０２３３】 ＤｍＧＰＣＲ１０ ＤｍＧＰＣＲ１０［ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ７０３２５）向けのプライマーを使い
ＰＣＲ生成物を作成しようとしたが、当初はうまくいかなかった。予想されたｃ
ＤＮＡを調べた結果、予想配列が、多くの保存残基があるにもかかわらず、高度
に保存されているはずの「ＷＸＰ」モチーフがＴＭＶＩに、「ＮＰＸＸＦ」がＴ
ＭＶＩＩに欠けている点で異常であることが明らかとなった。ゲノム配列を、最
後のエクソンの８０ｋｂ下流まで調べたが、他に可能性のあるエクソンは見出さ
れなかった。ＤｍＧＰＣＲ１０用の無傷のクローンを得ようとは、試みなかった
。
【０２３４】 ＤｍＧＰＣＲ１１［アラトスタチン様ペプチドレセプター） アラトスタチン様ペプチドレセプター向けのＰＣＲプライマーを、既知の配列
を用いて設計した。［Ｂｉｒｇｕｌ Ｎ．ら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １９
９９；１８（２１）：５８９２−９００）。ＰＣＲ生成物は、完全ｍＲＮＡ調製
物由来のｃＤＮＡを用いて得られ、クローン化され、配列決定された。このｃＤ
ＮＡは、文献に記載のものと一致するタンパク質をコードしていた。
【０２３５】 実施例３、ノーザンブロット分析 ノーザンブロットは、ｍＲＮＡの発現を見るのに使える。上述のセンスおよび
アンチセンス配向オリゴヌクレオチドが、配列番号：１，３，５，７，９，１４
，１３，１５，１７，１９、および２１の群から選ばれるヌクレオチド配列のＧ
ＰＣＲのｃＤＮＡ配列の一部を増幅するプライマーとして使用できる。
【０２３６】 クロンテック社のヒト組織ノーザンブロット（Ｈｕｍａｎ ＩＩ ＃７７６７
−１） を、プローブとハイブリッド形成させた。前ハイブリッド形成は、４２
℃で４時間、５ｘＳＳＣ、ｌｘ デンハート試薬、０．１％ ＳＤＳ，５０％
ホルムアミド，２５０ｍｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ中を含む混合物中で行った。
ハイブリッド化は、４２Ｃで一夜、同じ混合物中に、約１．５ｘ１０６ｃｐｍ／
ｍｌのラベル化されたプローブを添加して行った。
【０２３７】 プローブは、レディプライムＤＮＡラベルシステム社のａｌｐｈａ−３２Ｐ−
ｄＣＴＰでラベルし、ニックカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
で精製し、ハイブリッド化溶液に添加した。ロ液は、４２℃で０．２ｘ ＳＳ
Ｃおよび０．１％ ＳＤＳで、数回洗浄した。ろ紙は、コダックＸＡＲフィルム
（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， Ｎ
．Ｙ．， ＵＳＡ）に、−８０℃で強化スクリーンを用いて露出させた。
【０２３８】 実施例４、ＤｍＧＰＣＲ真核細胞の組替え発現 Ａ．ＤｍＧＰＣＲの哺乳類細胞での発現 ＤｍＧＰＣＲタンパク質を産生するため、ＤｍＧＰＣＲをコードするポリヌク
レオチドを、適当な発現ベクターと標準的な遺伝光学技法を用いて適当な宿主細
胞中で発現させた。例えば、実施例１に述べられたＤｍＧＰＣＲをコードする配
列は、市販の発現ベクターｐｚｅｏＳＶ２ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ
Ｄｉｅｇ０， ＣＡ）にサブクローン化し、形質移入試薬ＦｕＧＥＮＥ ６
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、および 試薬添付の形質移入手
順に従い、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に形質移入した。たとえ
ばヒト胎生肝臓（ＨＥＫ ２９３）、ＣＨＯ細胞、およびＣＯＳ細胞などの他の
真核細胞のセルラインも適当である。、ＤｍＧＰＣＲを安定に発現する細胞は、
１００ ｎｇ／ｍｌ ゼオシン（Ｓｔｅｒｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ，
ＣＡ）存在下での成長により選別した。ＤｍＧＰＣＲは、標準的なクロマトグラ
フィー法により細胞から精製すればよい。精製を楽にするため、ＤｍＧＰＣＲの
アミノ酸配列の一部に相当する１つ以上の合成ペプチド配列に対して、抗血清を
作り、この抗血清をＤｍＧＰＣＲのアフィニティー精製に利用する。ＤｍＧＰＣ
Ｒは、精製を容易とするため、タグ配列（例えば、ポリヒスチジン、ヘマグルチ
ニン， ＦＬＡＧなど） のフレーム内で発現してもよい。さらに、ＤｍＧＰＣ
Ｒポリペプチドの利用分野の多くにおいては、ＤｍＧＰＣＲの宿主細胞からの精
製が必ずしも必要がないことにも留意すべきである。
【０２３９】 Ｂ，ＤｍＧＰＣＲの２９３セルでの発現 ＤｍＧＰＣＲの哺乳類ＣＨＯ細胞での発現のため、関連するＤｍＧＰＣＲコー
ド配列をもつプラスミドを、ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ ベクター（ｆａｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）を使用して作成する。ｐＳｅｃＴａｇ２Ａベクターは、分泌のためのマウ
スＩｇＫチェーンリーダー配列、ａｎｔｉ−ｍｙｃ抗体で組換えタンパク質を検
出するためのｃ−ｍｙｃ抗原決定基、ニッケルキレートクロマトグラフィーで精
製のためのＣ末端ポリヒスチジン、および安定な形質移入体の選別のためのゼオ
シン抵抗性遺伝子をを持っている。このＧＰＣＲのｃＤＮＡの増幅のための順方
向プライマーは、ルーチンな手順で決定でき、好ましくは、ＧＰＣＲ配列にマッ
チするＨｉｎｄＩＩＩクローニングサイトを導入するための５’延長ヌクレオチ
ドを持っている。逆プライマーも、同様にルーチンな手順で決定でき、好ましく
は、クローニングのためのＸｈｏＩ制限サイトとＤｍＧＰＣＲ配列の逆補体に相
当するヌクレトチドを導入するための５’延長ヌクレオチドを持っている。ＰＣ
Ｒの条件は、徐冷温度が５５Ｃであった。ＰＣＲ生成物は、ゲル精製し、ベクタ
ーのＨｉｎｄＩＩＩサイトにクローン化した。
【０２４０】 ＤＮＡは、キアゲンクロマトグラフィーカラムで精製し、ＤＯＴＡＰ移入媒体
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，
ＩＮ）を使って、２９３セルにで形質移入した。一時的に形質移入された細胞は
、移入２４時間後に、アンチひすＨｉｓとアンチＤｍＧＰＣＲペプチド抗体とを
用いるウェスターンブロット法で試験した。永久形質転換細胞は、ゼオシンで選
択し、増殖させた。組換えタンパク質の酸性は、細胞および媒体の両方から、ア
ンチＨｉｓまたはアンチＧＰＣＲペプチド抗体を用いるウェスターンブロット法
で検出した。
【０２４１】 Ｃ．ＤｍＧＰＣＲのＣＯＳ細胞での発現 ＤｍＧＰＣＲのＣＯＳ７細胞での発現のため、配列番号：１，３，５，７，９
，１１，１３，１５，１７，１９，２１、または、２３の群から選択されるヌク
レオチド配列を持つポリヌクレオチド分子を、ｐ３−ＣＩベクターにクローン化
できる。このベクターは、ｂＧＨ（ウシ成長ホルモン）ポリアデニル化配列の上
流にＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウィルス）プロモーターイントロンと、多数の
クローン化サイトを持つｐＵＣ１８由来のプラスミドである。又、このプラスミ
ドは、薬剤メトトレクセース（ＭＴＸ）の存在下で安定な形質移入体を選択する
ための役立つＤＨＦＲ（デヒドロフォレートリダクターゼ）遺伝子を持っている
。
【０２４２】 その順方向プライマーは、ルーチンな手順で決定でき、好ましくは、クローニ
ングのためのＸｂａＩ制限サイトを導入するための５’延長ヌクレオチドと、そ
れに続いて配列番号：１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２
１、または２３のよりなる群から選択されるヌクレオチド配列に相当するヌクレ
オチドを持っている。その逆プライマーも、ルーチンな手順で決定でき、好まし
くは、ＳａｉＩクローニングサイトを導入するための５’−延長ヌクレオチドと
、それに続いて配列番号：１，３，５、７，９，１１，１３，１５，１７，１９
，２１、または２３のよりなる群から選択されるヌクレオチド配列の逆補体に相
当するヌクレオチドを持っている
【０２４３】 ＰＣＲは、９５℃で５分間の初期変性ステップ、９５℃で３０秒間の変性３０
サイクル、５８℃３０秒間の徐冷、および７２℃３０秒間の伸張、続いて７２℃
５分間の伸張からなる。ＰＣＲ生成物はゲル精製され、ｐ３−ＣｌベクターのＸ
ｂａＩおよびＳａｌＩサイトに結合される。この構築物は、増幅およびＤＮＡ精
製のため大腸菌細胞に形質移入される。ＤＮＡはキアゲンクロマトグラフィーカ
ラムで精製、ＣＯＳ７細胞にリポフェクタミン試薬（ＢＲＬ）を用いて製造業者
の手順に従って形質移入される。形質移入４８時間および７２時間後、媒体と細
胞中での組換えタンパク質の発現が調べられる。
【０２４４】 ＣＯＳ細胞から発現されたＤｍＧＰＣＲは、細胞成長培地を、１０ｍｇタンパ
ク質／ｍｌ間で濃縮され、例えば、クロマトグラフィーでタンパク質が精製され
る。精製されたＤｍＧＰＣＲは、ＹＭ−１０膜を取り付けたアミコン濃縮装置で
、０．５ ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、−８０℃で保存される。
【０２４５】 Ｄ．ＤｍＧＰＣＲの昆虫細胞での発現 バキュロウィルスシステムでのＤｍＧＰＣＲの発現に、配列番号：１，３，５
，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１、または２３の軍から選ばれた
ヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド分子が、ＰＣＲにより増幅された。そ
の順方向プライマーは、ルーチンな手順で決定でき、好ましくは、ＮｄｅＩクロ
ーニングサイトを付加するための５’延長ヌクレオチドと、それに続いて配列番
号：１，３，５、７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１、または２３の
よりなる群から選択されるヌクレオチド配列に相当するヌクレオチドを持ってい
る。その逆プライマーも、ルーチンな手順で決定でき、好ましくは、ＫｐｎＩク
ローニングサイトを導入するための５’−延長ヌクレオチドと、それに続いて配
列番号：１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１、または２
３のよりなる群から選択されるヌクレオチド配列の逆補体に相当するヌクレオチ
ドを持っている
【０２４６】 ＰＣＲ生成物はゲル精製され、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで消化され、ｐＡｃＨ
ＴＬ−Ａ（Ｐｈａｒｍｍｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇ０， ＣＡ）ベクターの相
当するサイトに結合される。ｐＡｃＨＴＬ発現ベクターは、オートグラファカリ
フォミカヌクレアポリヘドロシスウィルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強いポリヘドリン
プロモーターと、多重クローニングサイトの上流にある６ＸＨｉｓタグを持って
いる。組換えタンパク質中のホスホリル化のためのプロテインキナーゼサイトと
切除のためのトロンビンサイトも、又多重クローニングサイトの前にある。もち
ろん、他の多くのバキュロウィルスベクターが、ｐＡｃＨＴＬ−Ａに代えて使用
可能であり、例えば、ｐＡｃ３７３，ｐＶＬ９４１やｐＡｃＩＭ１などがある。
ＧＰＣＲポリペプチドの発現のために、他に適当なベクターも使用可能である。
ただし、そのベクター構築物が、転写、翻訳や輸送のためのシグナル（例えば、
フレーム内ＡＵＧ）を適当な場所に、および、必要に応じてシグナルペプチドを
、含んでいるのが条件である。これらのベクターは、Ｌｕｃｋｏｗらにより報告
されている。（たくさんの中で代表は、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １
７０：３１−３９）ウィルスは、標準的なバキュロウィルス発現方法を使って、
増殖単離される。例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓらの報告がある。 ［Ａ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ
ＶＥＣＴＯＲＳ ＡＮＤ ＩＮＳＥＣＴ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ ＰＲＯ
ＣＥＤＵＲＥＳ， Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅ
ｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ． １５５５ （１９８７
））。
【０２４７】 ある好ましい実施形態は、「バキュロゴールド」形質転移キットをメーカーの
確立した方法をにしたがって使用し、ＤｍＧＰＣＲ遺伝子を含むｐＡｃＨＬＴ−
Ａをバキュロウィルスに形質移入することである。各ウィルス単離物は、感染後
２４時間に３５Ｓメチオニンで放射ラベルした感染細胞を使用してタンパク質生
産量を分析される。感染細胞は、感染後４８時間で収穫し、ラベル化されたタン
パク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化される。高度な発現レベルを示すウィルス
は単離し、スケールアップした発現に用いることができる。
【０２４８】 ＤｍＧＰＣＲポリペプチドのＳｆ９細胞での発現には、配列番号：１，３，５
，７，９，１１，１３， ５，１７，１９，２１、または２３から構成される群
の中から選択されたヌクレオチド配列を持つポリペプチド分子を、上記バキュロ
ウィルス発現に用いたプライマーや方法を用いて、ＰＣＲにより増幅してもよい
。ＤｍＧＰＣＲのｃＤＮＡは、Ｓｆ９昆虫中で発現のために、ｐＡｃＨＬＴ−Ａ
ベクター（Ｐｈａｎｎｉｎｇｅｎ） にクローン化される。この挿入断片は、内
部のＮｄｅＩサイトを（上記バキュロウィルスの発現で記載のプライマーを使い
）除去後、ＮｄｅＩやＫｐｌＩサイトにクローン化される。ＤＮＡは、キアゲン
クロマトグラフィーカラムで精製され、Ｓｆ９細胞で発現される。非精製プラー
クからの予備的なウェスターンブロット試験で、ＧＰＣＲ特異的抗体と反応する
期待サイズの組換えタンパク質があるかどうか調べられる。これらの結果は、さ
らに精製し、ＨｉＧ５細胞中で発現の最適化後に確認される。
【０２４９】 実施例５、トラップ／ツーハイブリッドシステムの相互作用 ＤｍＧＰＣＲと相互作用を持つタンパク質をアッセイするため、トラップ／ツ
ーハイブリッドライブラリースクリーニングの相互作用が使用可能である。本ア
ッセイは、最初にＦｉｅｌｄｓらにより記述されている。（［Ｆｉｅｌｄｓら、
Ｎａｔｕｒｅ， １９８９， ３４０，２４５］，全体を参照とする）。手順は
、次の文献に記載してある。［ＣＩＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ Ｍ
ＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ １９９９， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ， ＮＹ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅ１，Ｆ． Ｍ．ら、１９９２， ＳＨ
ＯＲＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，
ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−ｉｎｔ
ｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ＮＹ， 出典明示して、その全体を本明細書の一部とみ
なす。）キットは、クローンテックから入手可能である。 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ （Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ
Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ３）
【０２５０】 ＤｍＧＰＣＲの全配列または一部の配列をコードするヌクレオチド配列と酵母
転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ−ＢＤ）の融合は、標準的なサ
ブクローニング手法を用いて、ある適当なプラスミド（すなわち、ｐＧＢＫＴ７
）中で実施される。同様に、ＧＡＬ４活性ドメイン（ＡＤ）融合ライブラリーは
、第二のプラスミド（すなわち、ｐＧＡＤＴ７）中で、可能性のあるＧＰＣＲ結
合タンパク質のｃＤＮＡから形成される。ｃＤＮＡライブラリーを作るための手
順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照せよ。［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９， Ｍ
ＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡ
Ｌ， ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｉｂｏｒ， ＮＹ）］、出典
明示して、全体を本明細書の一部とみなす。ＤＮＡ−ＢＤ／ＧＰＣＲ融合構築物
は、配列決定により確認され、自律的なレセプター遺伝子活性や細胞毒性につき
試験され、その両方ともツーハイブリッド分析を阻害するであろう。同様な対照
が、宿主細胞中での発現や転写活性の欠損を確認するために、ＡＤ／ライブラリ
ー融合生成物に対しても実施される。酵母細胞は、ＧＰＣＲおよびライブラリー
融合プラスミドの両方で、下記の標準的な手順で、形質転換される（約１０５形
質転換体／ｍｌ）。［Ａｕｓｕｂｅ１ら、１９９２， ＳＨＯＲＴ ＰＲＯＴＯ
ＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， ｆｏｕｒｔｈ ｅｄ
ｉｔｉｏｎ， Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ
， ＮＹ］、出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす。ＤＮＡ−ＢＤ／Ｇ
ＰＣＲのＡＤ／ライブラリータンパク質を用いた体外結合試験は、特定の酵母プ
ラスミドレセプター遺伝子の転写につながる。（すなわち、ｌａｃＺ、ＨＩＳ３
、ＡＤＥ２、ＬＥＵ２）。酵母細胞は、栄養素欠乏培地でレポーター遺伝子の発
現をスクリーニングする。コロニーは、Ｘｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドイルｐ−ｂｅｔａ−Ｄ−ガラクトシド）補充培地中で増殖後、二重にＰ
−ガラクトシダーゼ活性の測定がされる。ｂｅｔａ−ガラクトシダーゼ活性のフ
ィルターアッセイについては、次の文献を参照せよ。［Ｂｒｅｅｄｅｎら、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．， Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏ１．，
１９８５，５０，６４３］、出典明示して、全体を本明細書の一部とみなす。
正の値を持つＡＤ−ライブラリープラスミドは、形質転移体の中なら取り出し、
ＤｍＧＰＣＲ／ライブラリータンパク質相互作用を確認するために、元の酵母菌
株や非関連ＤＮＡ−ＢＤ融合タンパク質を持つ他の菌株に再導入される。挿入Ｄ
ＮＡは、配列決定され、開放性の読み枠がＧＡＬ４ ＡＤに融合しているか確認
され、又ＤｍＧＰＣＲ結合タンパク質が何か確認される。
【０２５１】 実施例６、ゲル電気泳動を用いたモビリティ−シフトＤＮＡ結合アッセイ。 ゲル電気泳動モビリティーシフトアッセイは、特定のタンパク質−ＤＮＡ相互
作用を迅速に検出できる。手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらのマニュアルなどで広く
入手可能である。［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ Ｃ
ＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ｓｅｃｏｎｄ
ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ； および Ａｕｓｕｂｅ１，
Ｆ． Ｍ．ら。１９９２， ＳＨＯＲＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥ
ＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｒｅｅｎ
ｅ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ＮＹ］、いずれも、出
典明示して、その全体を本明細書の一部とみなす。
【０２５２】 プローブＤＮＡ（＜３００ｂｐ）は、合成オリゴヌクレオチド、制限エンドヌ
クレアーゼフラグメント、または３２Ｐで末端ラベル化したＰＣＲフラグメント
などから得ることができる。精製ＤｍＧＰＣＲ（約１５μｇ）または粗ＤｍＧＰ
ＣＲ抽出物（約１５ｎｇ）のサンプルは、低温で（２２−２７Ｃの範囲）、少な
くとも３０分間、１０−１５μｌの、放射ラベル化プローブＤＮＡ，非特異的キ
ャリアーＤＮＡ（約１μｇ）、ＢＳＡ（３００μｇ／ｍｌ）および１０％（ｖ／
ｖ）グリセリンを含む緩衝液中（すなわち、ＴＡＥまたはＴＢＥ）でインキュベ
ートした。反応混合物は、次いでポリアクリルアミドゲルに乗せ、３０−３５ｍ
Ａで、フリーのＤＮＡとタンパク質−ＤＮＡ複合体とが良好な分離を示すまで展
開した。ゲルは、次いで乾燥され、フリーのＤＮＡとタンパク質−ＤＮＡ複合体
に相当するバンドは、オートラジオグラフィーで検出した。
【０２５３】 実施例７、ＤｍＧＰＣＲの抗体 ＤｍＧＰＣＲレセプターに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗
体を作成するのに、また、それらの抗原結合フラグメントまたは、ヒト化変異体
を含むそれらの変異体を作成するのに、標準的な技法を使った。このような手順
は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらにより述べられている。［Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、（１９８９） および Ｈａｒｌｏｗら （編集）， ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ
Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，
ＮＹ （１９８８））。一つの実施形態では、組換えＤｍＧＰＣＲポリペプチ
ド（または、これらのポリペプチドを含有している細胞または細胞膜）が、抗体
を作成するための抗原として使用される。もう一つの実施形態では、ＤｍＧＰＣ
Ｒの免疫原部分に相当するアミノ酸配列（例えば、６，７，８，９，１０，１１
，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，または、これ以上
のアミノ酸）を持つ１個以上のペプチドが、抗原として使用される。ＤｍＧＰＣ
Ｒの細胞外部分に相当するペプチド、特に親水性細胞外部分が好ましい。抗原は
、抗体生産を増加させるため、アジュバントと混合してもよいし、ハプテンと結
合させてもよい。
【０２５４】 Ａ．ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体 一つの手順を例示すると、組換えＤｍＧＰＣＲまたはその合成フラグメントを
、モノクローナル抗体産生用のマウス（あるいは、ポリクローナル抗体には、ウ
サギなどのより大型哺乳類）に免疫化する。免疫原性を増加するために、ペプチ
ドはキーホールリンペットヘモシャン（Ｐｉｅｒｃｅ）に、製造業者の推薦法に
より、抱合させることが出来る。最初の注入には、抗原はフロイント完全アジュ
バントでエマルジョン化し、皮下注射される。２から３週間の間隔で、ＤｍＧＰ
ＣＲ抗原の一定量がフロイント不完全アジュバントでエマルジョン化され、皮下
注射される。最後の追加免疫の前に、血清サンプルを免疫されたマウスから取り
出し、ウェスターンブロット法でアッセイして、ＤｍＧＰＣＲと免疫反応する抗
体の存在を確認する。免疫された動物からの血清は、ポリクローナル抗血清とし
て、あるいはＤｍＧＰＣＲを認識するポリクローナル抗体を単離するのに使用し
てもよい。代わりに、モノクローナル抗体を作成するために、マウスを犠牲にし
て、脾臓を取り出してもよい。
【０２５５】 モノクローナル抗体を作るためには、脾臓を、１０ｍｌ無血清ＲＰＭＩ１６４
０中に入れる。単細胞乳濁液は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナ
トリウム、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプ
トマイシン（ＲＰＭＩ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｎａｄａ）を添加した無血清ＲＰＭ
Ｉ１６４０中で脾臓を破砕することにより得られる。細胞乳濁液は、遠心分離で
ろ過洗浄し、無血清ＲＰＭＩに再乳濁する。３匹の無処理のＢａｌｂ／ｃマウス
から取り出された胸腺細胞は、同様に取り出し、フィーダーレイヤーとして使用
した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｌｏｇａｎ， Ｕｔａｈ） を含むＲＰＭＩ中に対数期で
保存されたＮＳ−１骨髄腫細胞は、遠心分離し洗浄した。
【０２５６】 雑種細胞（ハイブリドーマ）を作るのに、免疫かされたマウス由来の脾臓細胞
が、ＮＳ−１細胞と混合され、遠心分離後、上澄みは吸引除去した。細胞のペレ
ットは、チューブから外し、２ｍｌのＰＥＧ１５００（７５ｍＭＨＲＰＥＳ、ｐ
Ｈ８．０中５０％）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）をかき混ぜな
がら注ぎ、さらに無血清ＲＰＭＩを添加した。その後、細胞は遠心分離し、１５
％ヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン（ＨＡＴ）（
Ｇｉｂｃｏ）、２５ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ）および１．５ｘ１０６胸腺細胞／ｍｌを含むＲＰＭＩに再乳濁し
、１０枚のコーニング平底９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｍｉｎｇ， Ｃｏ
ｍｉｎｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に移した。
【０２５７】 融合後、２，４，６日後に、１００μｌの培地をウェルから除き、新鮮な培地
で入れ替えた。８日後に、融合をＥＬＩＳＡでスクリーニングし、ＤｍＧＰＣＲ
に結合するマウスＩｇＧの存否をテストした。選ばれた融合ウェルは、希釈によ
りさらにクローン化して、抗ＤｍＧＰＣＲ抗体を生産するモノクローナル培養物
を得た。
【０２５８】 Ｂ．抗ＤｍＧＰＣＲモノクローナル抗体のヒト化 ここに述べられたＤｍＧＰＣＲの発現パターンや、治療的処置の標的としての
ＧＰＣＲの過去の記録は、ＤｍＧＰＣＲ阻害剤（拮抗剤）としての可能性を示唆
している。ＤｍＧＰＣＲ中和抗体は、ＤｍＧＰＣＲ抗体として、有益な治療剤の
一分類を構成する。以下に、抗ＤｍＧＰＣＲモノクローナル抗体を、モノクロー
ナル抗体を「ヒト化」して、血清半減期を改良し、ヒト宿主に対する免疫原性を
低減し（すなわち、ヒトの非ヒト抗ＤｍＧＰＣＲ抗体に対する抗体応答を抑制し
）、ヒトの治療剤としての有用性を改良する手順を記載する。
【０２５９】 ヒト化の原理は、文献中に記載されており、抗体タンパク質のモジュール状配
列のため容易となっている。結合補体の可能性を最小限に押させるため、ＩｇＧ
４アイソタイプのヒト化抗体が好ましい。
【０２６０】 例えば、あるレベルのヒト化は、興味のある非ヒト抗体タンパク質の可変ドメ
インとヒト抗体分子の固定ドメインを含むキメラ抗体により達成できる。例えば
、［Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏ１．， ４４：６５−９２
（１９８９）］を参照せよ。ＤｍＧＰＣＲ中和、抗ＤｍＧＰＣＲ抗体の可変ドメ
インは、Ｂ細胞ハイブリドーマ、または興味のあるハイブリドーマから単離され
たｍＲＮＡから作られたｃＤＮＡからクローンされる。遺伝子フラグメントのＶ
領域は、ヒト抗体固定ドメインをコードするエクソンに連結され、その構築物は
適当な哺乳類宿主細胞（例えば、ミエローマまたはＣＨＯ細胞）中で発現される
。
【０２６１】 さらに高いレベルのヒト化を達成するのに、可変領域遺伝子フラグメントの非
ヒトモノクローナル抗体遺伝子中の抗原結合性の相補的決定領域（ＣＤＲ）をコ
ードする部分が、ヒト抗体配列にクローンされる。例えば、［Ｊｏｎｅｓら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５ （１９８６）； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７ （１９８８）； Ｖｅｒｈｏｅｙ
ｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−３６ （１９８８）； および
Ｔｅｍｐｅｓｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６−７１ （１９
９１）］を参照せよ。必要なら、ヒト抗体のＣＤＲ３を囲むｂｅｔａ−シートフ
レームを、元のモノクローナル抗体の抗原結合ドメインの三次元構造を厳密に写
し取るように、修飾される。［Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇｉｎ．， ４：７７３−７８３ （１９９１）；およびＦｏｏｔｅら、
Ｊ． Ｍｏ１． Ｂｉｏ１．， ２２４：４８７−４９９ （１９９２）］を参
照せよ。
【０２６２】 これに代わるアプローチは、興味のある非ヒトモノクローナル抗体の表面を、
非ヒト抗体の内部や結合残基は保持しながら、非ヒト抗体の表面残基のいくつか
を改変（例えば、部位特異的突然変異誘発で）することにより、ヒト化すること
である（［Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｍｍｕｎｏ１．， ２８（
４／５）：４８９−９８ （１９９１）］）。
【０２６３】 上述のアプローチは、ＤｍＧＰＣＲ中和抗ＤｍＧＰＣＲモノクローナル抗体を
使って、又、ＤｍＧＰＣＲ発現またはリガンド仲介ＤｍＧＰＣＲシグナリングが
損なわれているような疾病や一時的状態を治療するために治療薬として有用なヒ
ト化ＤｍＧＰＣＲ中和抗体を産生するハイブリドーマを使って行われる。
【０２６４】 実施例８、ＤｍＧＰＣＲ活性のモジュレーターを特定するためのアッセイ
【０２６５】 以下に、ＤｍＧＰＣＲ活性のモジュレーターを特定するための、各種の非限定
的なアッセイについて述べるの。これらのアッセイで特定されるモジュレーター
の中には、レセプターの天然リガンド化合物、天然リガンドの合成アナログおよ
び誘導体、抗体、抗体のフラグメント、および／または天然抗体または高スルー
プットスクリーニングで特定された合成化合物由来の抗体類似化合物等が含まれ
る。ＤｍＧＰＣＲに結合するすべてのモジュレーターは、組織サンプル中にある
ＤｍＧＰＣＲを特定する（すなわち、診断目的、病理学目的などで）のに有用で
ある。抗原および抗体モジュレーターは、ＤｍＧＰＣＲ活性を、ＤｍＧＰＣＲの
異常なレベルに特徴される疾病状態の治療のために、それぞれ情報制御および下
方制御するのに有用である。アッセイは、推定上のモジュレーターで行われても
よいし、および／または、既知の作動薬を候補拮抗薬と組み合わせて（またはそ
の逆）行われてもよい。
【０２６６】 Ａ、ｃＡＭＰアッセイ 第一のタイプのアッセイでは、候補モジュレーター化合物に露出されたＤｍＧ
ＰＣＲ形質移入細胞の中のサイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）のレベ
ルが、測定される。ｃＤＮＡアッセイの手順は、文献に記載されている。例えば
、［Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ３７：２７９ （１９
６８）； Ｆｒａｎｄｓｅｎら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １８： ５２９
−５４１ （１９７６）； Ｄｏｏｌｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉ
ｃｓ ２８３ （２）：７３５−４１ （１９９７）； および Ｇｅｏｒｇｅ
ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
２ （４）： ２３５−４０ （１９９７）］を参照せよ。その手順の一例、ア
デニリルシクラーゼ活性化フラッシュプレートアッセイ（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を以下に述べる。
【０２６７】 手短に述べると、ＤｍＧＰＣＲコード配列（例えば、ｃＤＮＡまたはイントロ
ンの無いゲノムＤＮＡ）は、市販の発現ベクター、例えばｐｚｅｏＳＶ２（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にサブクローン化され、一時的にチャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）細胞に、ベーリンガーマンハイム社からＦｕＧＥＮＥ形質移入試
薬につけて提供される形質移入手順のような既知の方法で形質移入される。形質
移入されたＣＨＯ細胞は、フラッシュプレートアッセイキットからの９６ウェル
マイクロプレートに播種される。このマイクロプレートは、ｃＡＭＰに対する抗
血清が前もって結合されている固体シンチラントでコートされている。 このトロールとして、いくらかのウェルには野生型（形質移入されていない）Ｃ
ＨＯ細胞が播種される。プレート上の他のウェルは、標準曲線を作成するために
使われるいろいろな量のｃＡＭＰ標準溶液を受け取る。
【０２６８】 １つ以上の試験化合物（すなわち、候補モジュレーター）、および、水および
／またはその化合物を含まない培地／希釈剤を対照として、各ウェル中の細胞に
加える。処理後、ｃＡＭＰを、室温でちょうど１５分間、細胞内に集まらせる。
アッセイは、［１２５Ｉ］−ラベルされたｃＡＭＰを含む溶解緩衝液の添加で停
止し、プレートをパッカードトップカウント９６ウェルマイクロプレートシンチ
レーションカウンターを使用して測定する。溶解されたラベル細胞から（あるい
は、標準から）のラベルされていないｃＡＭＰ、および固定量の［１２５Ｉ］−
ｃＡＭＰは、プレートに結合している抗体に対し競争する。標準曲線が作成され
、未知物のｃＡＭＰ値は、内挿により決定される。試験化合物への暴露の応答と
しての細胞の細胞内ｃＡＭＰレベルの変化は、ＤｍＧＰＣＲ活性の調整能力の指
標となる。Ｇタンパク質のＧｓサブタイプに結合する、レセプターの作動道薬と
して働くモジュレーターは、ｃＡＭＰの産生を刺激し、３−１０倍と測定可能な
ほどｃＡＭＰレベルを増加させる。Ｇタンパク質のＧｉ／ｏサブタイプと結合す
る、レセプターの作動薬は、フォルスコリン刺激性のｃＡＭＰ産生を阻害し、５
０−１００％と測定可能なほどｃＡＭＰレベルを減少させる。逆作動薬として働
くモジュレーターは、恒常的に活性化されているか既知の作動薬により活性化さ
れているレセプターでのこれらの影響を逆転させる。
【０２６９】 Ｂ，エクオリンアッセイ もう一つのアッセイでは、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）が一時的に ＤｍＧＰＣＲ発現構築物および発光タンパク質アポアクオリンをコードする構築
物の両方で形質移入される。コファクターのコエレンテラジンの存在下、アポア
クオリンは、細胞内（細胞質）の自由カルシウム量に比例して、測定可能な発光
をする。一般的、［Ｃｏｂｂｏｌｄら、“Ａｅｑｕｏｒｉｎ ｍｅａｓｕｒｅｍ
ｅｎｔｓ ｏｆ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｆｒｅｅ ｃａｌｃｉｕｍ，” Ｉ
ｎ： ＭｃＣｏｒｍａｃｋ Ｊ．Ｇ． ａｎｄ Ｃｏｂｂｏｌｄ Ｐ．Ｈ．，
編集、 ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＣＡＬＣＩＵＭ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ Ａ
ＰＰＲＯＡＣＨ， ０ｘｆｏｉｄ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９１）； Ｓｔ
ａｂｌｅｓら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５２：
１１５−２６ （１９９７）； および Ｈａｕｇｌａｎｄ， ＨＡＮＤＢＯＯ
Ｋ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ
ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ． Ｓｉｘｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ
： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ （１９９６）］を参照せよ。
【０２７０】 あるアッセイを例にとると、ＤｍＧＰＣＲは、市販の発現ベクターｐｚｅｏＳ
Ｖ２ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） にサブクローンされ、一時的に、発光タンパ
ク質アポアクオリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ，
ＯＲ）をコードする構築物と共に、形質移入試薬ＦｕＧＥＮＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および製品と共に供給された形質移入手順を使って
、ＶＨＯ細胞内に共形質移入される。
【０２７１】 その細胞は、３７℃で２４時間、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１
０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０ｎｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加した血清
ＭＥＭ中（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ， Ｇａｋｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）で培養
された。２４時間後、培地は、５ｐＭコエレンテラジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）を含む無血清ＭＥＭに変更した。培養
はさらに２時間、３７℃で続けられた。次いで、細胞はプレートから、ＶＥＲＳ
ＥＮを用いて剥離、洗浄し、無血清ＭＥＭ中に２００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
となるように再乳濁した。
【０２７２】 無血清ＭＥＭで、候補ＤｍＧＰＣＲモジュレーター化合物の希釈液をつくり、
不透明な９６ウェルアッセイプレートのウェルに、５０μｌ／ｗｅｌｌ量を投入
した。プレートは、次いでＭＬＸマイクロタイタープレート発光計（Ｄｙｎｅｘ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ， ＶＡ）に
乗せた。その装置は、５０μｌの細胞乳濁液を、各ウェルに一液づつ投入し、直
後に１５秒間発光を読み取るようにプログラムされている。各光シグナルピーク
の曲線間の面積を使って、候補モジュレーターの容量反応曲線が作られる。Ｓｌ
ｉｄｅＷｒｉｔｅで、一サイトリガンドに対する式を用いて、分析されたデータ
、およびＥＣ５０の値が得られる。化合物により引き起こされる発光の変化は、
モジュレーター活性の指標と考えられる。Ｇタンパク質のＧｑサブタイプと結合
するレセプターで作動薬として働くモジュレーターは、最大１００倍の発光の増
加を与える。逆作動薬として作用するモジュレーターは、恒常的に活性化してい
るあるいは既知の作動薬で活性化されているレセプターでこの影響を逆転させる
だろう。
【０２７３】 Ｃ．ルシフェラーゼレセプター遺伝子アッセイ 発光タンパク質ルシフェラーゼは、ＤｍＧＰＣＲ活性のモジュレーターをアッ
セイするためのもう一つの有用な道具を提供する。細胞（例えば、ＣＨＯ細胞ま
たはＣＯＳ７細胞）は、一時的に ＤｍＧＰＣＲ発現生産物（例えば、ｐｚｅｏＳＶ２中のＤｍＧＰＣＲ）、および
、ルシフェラーゼタンパク質の遺伝子を転写因子結合サイト（例えばｃＡＭＰ応
答因子（ＣＲＥ）、ＡＰ−１またはＮＦ−ｋａｐｐａＢなど）から下流に持つリ
ポーター生産物の両方で、共形質移入される。Ｇタンパク質のＧｓサブタイプに
結合したレセプターに結合する作動薬は、ｃＡＭＰの増加を引き起こし、ＣＲＥ
転写因子を活性化してルシフェラーゼ遺伝子の発現をもたらす。Ｇタンパク質の
Ｇｑサブタイプに結合するレセプターに結合する作動薬は、プロテインキナーゼ
Ｃを活性化するジアシルグリセリンの生産を引き起こし、又その結果ルシフェラ
ーゼ遺伝子の発現を引き起こす。ルシフェラーゼの発現レベルは、この情報伝達
減少の活性化の状態を反映する。一般的、［Ｇｅｏｒｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ２（４）： ２３５−
２４０ （１９９７）； および、Ｓｔｒａｔｏｗａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐ
ｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： ５７４−５８１ （１
９９５）］を参照せよ。ルシフェラーゼ活性は、例えば、プロメガ（Ｍａｄｉｓ
ｏｎ， ＷＴ）から入手可能な市販ルシフェラーゼアッセイ試薬を使って定量的
に測定することが出来る。
【０２７４】 アッセイの一例を示すと、ＣＨＯ細胞を、形質移入の前日に、２４ウェル培養
プレートに１００，０００細胞／ウェルの密度で入れ、３７Ｃで、１０％ウシ胎
児血清、２ｍＭグルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリン、および１０μｇストレプ
トマイシンを添加したＭＥＭ中で培養する。細胞は、ＤｍＧＰＣＲ発現生産物お
よびルシフェラーゼ遺伝子を含むリポーター生産物の両方で、共形質移入される
。リポータープラスミドＣＲＥルシフェラーゼ、ＡＰ−１ルシフェラーゼ、およ
びＮＦ−ｋａｐｐａＢルシフェラーゼは、スツラタジーン（ＬａＪｏｌｌａ，
ＣＡ）から購入可能である。形質移入は、ＦｕＧＥＮＥ−６形質移入試薬（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｉｍｈｅｉｍ） を用い、提供会社の支持にしたがって
実施した。レセプター生産物のみで形質移入された細胞を対照として用いた。形
質移入２４時間後、細胞は３７℃に前もって暖められたＰＢＳで一度洗浄された
。次いで、無血清ＭＥＭのみ（対照）を細胞に添加、あるいは１個以上の候補モ
ジュレーターを添加したＭＥＭを細胞に添加し、こららの細胞は、３７℃で５時
間インキュベートした。その後、細胞は、氷冷されたＰＢＳで一度洗浄し、一ウ
ェル当たり１００μｌの溶解緩衝液を添加しで溶解した。なお、溶解緩衝液は、
プレメガのルシフェラーゼアッセイキットのものである。室温で１５分間インキ
ュベート後、溶解混合物１５μｌは、不透明白色９６ウェルプレート中で５０μ
ｇの基質溶液と混合され、直後に発光を、Ｗａｌｌａｃｅ ｍｏｄｅｌ １４５
０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｕｍｉｎｅ
ｓｃｅｎｃｅ ｃｏｕｎｔｅｒ （Ｗａｌｌａｃｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）で測定した。
【０２７５】 候補モジュレーターの存否による発光の差異は、モジュレーター活性の指標で
ある。恒常的に活性化されている、あるいは作動薬により活性化されるレセプタ
ーは、リポーター遺伝子のみを形質移入した細胞に較べ、典型的には３−２０倍
の発光量の増加を与える。逆作動薬として働くモジュレーターは、この影響の逆
を示す。
【０２７６】 Ｄ、ＦＬＩＰＲを用いた細胞内カルシウムの測定 細胞内のカルシウムレベルの変動は、Ｇタンパク質結合レセプター活性のもう
一つの指標であることはよく認められており、このようなアッセイを、ＤｍＧＰ
ＣＲ活性のモジュレーターのスクリーニングに使用してもよい。例えば、ＤｍＧ
ＰＣＲ発現ベクターが形質移入されたＣＨＯ細胞を、４ｘ１０４細胞／ウェルの
密度で、プレート上のいろいろなウェルから出る発光シグナルを区別するように
特に設計されたパッカード社の黒壁９６ウェルプレート上乗せる。細胞は、３７
Ｃで６０分間、１％ ウシ胎児血清および４種のカルシウム指示染料（Ｆｌｕｏ
−３ ＡＭ， Ｆｌｕｏ−４ ＡＭ， Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ−１ ＡＭ
， または、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８ ＢＡＰＴＡ−１ ＡＭ）の内
の一つを，それぞれ４μＭで添加した、３６ ｍｇ／Ｌ ピルビン酸、１ ｇ／
Ｌ グルコースを含む、デュルベコ社のＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）中で、インキュベ
ータした。プレートは、１％ウシ胎児血清を含まない修正Ｄ−ＰＢＳで一度洗い
、細胞膜から残存染料を除くため３７℃で１０分間インキュベートした。さらに
、カルシウム応答の活性化の前に、１％ウシ胎児血清を除いた修正Ｄ−ＰＢＳで
数回洗った。
【０２７７】 カルシウム応答は、１個以上の候補レセプター作動薬化合物、カルシウムイオ
ノフォアＡ２３１８７（１０μＭ，正の対照）またはＡＴＰ（４μＭ、正の対照
）、の添加で開始した。蛍光は、モレキュラーデバイス社のＦＬＩＰＲで、アル
ゴンレーザーを使用して行った。例えば、Ｋｕｎｔｚｗｅｉｌｅｒら、Ｄｒｕｇ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４４（ｌ）：１４−２０（１
９９８）］を参照せよ。なお、検出カメラのＦストップは２．５で、露出時間は
０．４ミリ秒であった。細胞の持つ基礎蛍光は、候補作動薬、ＡＴＰまたはＡ２
３１８７，の添加前約２０秒間測定し、この基礎蛍光量を応答シグナルから差し
引いた。カルシウムシグナルは、２秒ごとに記録をとりながら約２００秒間測定
した。カルシウムイオノフォアＡ２３１８７およびＡＴＰは、カルシウムシグナ
ルを、ベースラインレベルより２００％上に増加させる。一般に、活性化された
ＧＰＣＲは、カルシウムシグナルを、ベースラインシグナルより、約１０−１５
％増加させる。
【０２７８】 Ｅ、分裂促進性アッセイ 分裂促進性アッセイでは、候補モジュレーターの持つ、ＤｍＧＰＣＲ仲介細胞
分裂の誘起または阻害能力が、測定される。例えば、［Ｌａｊｉｎｅｓｓら、Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｉｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２６７（３）：１５７３−１５８１ （１
９９３）］を参照せよ。例えば、ＤｍＧＰＣＲを安定に発現しているＣＨＯ細胞
を、９６ウェルプレートに、５０００細胞／ウェルの密度で播種し、３７Ｃで１
０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ中で４８時間増殖させる。４８時間後、細胞は、
無決死ＭＥＭで２回洗浄される。洗浄後、８０μｌの新鮮なＭＥＭ、または既知
の分裂促進因子を含むＭＥＭを、２０μｌの１個以上の候補モジュレーターまた
は無血清培地で希釈された試験化合物ををいろいろな濃度で含むＭＥＭと共に、
添加する。対照として、各プレート上のいくつかのウェルには、無血清培地だけ
を入れ、またいくつかには、１０％ウシ胎児血清を含む培地を入れる。形質移入
されていない細胞またはベクターだけで形質移入された細胞も、対照として使え
る。
【０２７９】 １６−１８時間培養後、［３Ｈ］−チミジン（２Ｃｉ／ｍｍｏｌ）１μｌをウ
ェルに投入し、３７Ｃでさらに２時間インキュベートした。細胞は、トリプシン
処理され、細胞収穫器 （Ｔｏｍｔｅｃ）でフィルターマット上に捕集された。
そのフィルターは、次いでベータプレートカウンターで測定された。無血清試験
ウェルに取り込まれた［３Ｈ］−チミジンは、血清で刺激された細胞での結果（
正の対照）と比較された。試験化合物を複数の濃度で測定することで、次の重回
帰式で表される容量反応曲線の作成と分析が可能となる。 Ａ ＝ Ｂ ｘ ［Ｃ／ （Ｄ＋ Ｃ）］ ＋Ｇ 。ここで、Ａは血清刺激のパ
ーセント、Ｂは最大効果マイナスベースライン、ＣはＥＣ５０、Ｄは化合物の濃
度、又Ｇは最大効果である。Ｂ、Ｃ、およびＧの変数は、シンプレックス最適化
法で決定される。レセプターに結合する作動薬は、［３Ｈ］−チミジンの細胞内
への取り込みを増加させ、血清への応答の最大８０％程度まで増加させると考え
られる。
【０２８０】 レセプターに結合する拮抗薬は、既知の作動薬で見られる刺激を、最大１００
％阻害するだろう。
【０２８１】 Ｆ、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイ
【０２８２】 Ｇタンパク質結合レセプターは、ＧＴＰと結合し加水分解して結合ＧＤＰを形
成する機能を持つ細胞内Ｇタンパク質を通して情報を伝達しているため、非加水
分解性ＧＴ候補モジュレーターの存在および不存在下での、ＧＴＰアナログ［３ ５ Ｓ］ＧＴＰγＳの結合の測定は、モジュレーター活性のもう一つのアッセイと
なる。 例えば、Ｋｏｗａｌら、Ｎｅｕｒｏｐｈａｎｎａｃｏｌｏｇｙ ３７：１７９−
１８７ （１９９８）］を参照せよ。
【０２８３】 一つの例を示すと、ＤｍＧＰＣＲ発現ベクターを安定に形質移入された細胞を
、１０ｃｍ組織培養プレート中で密集前まで増殖させ、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋フリ
ーでリン酸で緩衝された氷冷生理食塩水５ｍｌで１回洗浄後、同緩衝液５ｍｌ中
に入れる。細胞は、遠心分離（５００ｘｇ、５分間）によりペレット化され、Ｔ
ＥＦ緩衝液（２５ｍＭ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭ−ＥＤＴＡ，５ｍＭ−Ｅ
ＧＴＡ）に再乳濁され、液体窒素中で凍結される。解凍後、細胞は、ダウンスホ
モジナイザーを使用してホモゲナイズされ、１０００ｘｇで５分間の遠心分離で
核酸や非破壊細胞が除かれる。
【０２８４】 ホモジネートの上澄液から、２００００ｘｇで２０分間の遠心分離で膜成分が
除かれる。膜ペレットは、ＴＥＥで一度洗浄後、結合緩衝液（２０ｍＭ−ＨＥＰ
ＥＳ，ｐＨ７．５、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１ｍＭ−Ｅ
ＤＴＡ）に最乳濁される。再入濁された膜は、液体窒素で凍結され、−７０℃で
使用される時まで保存される。
【０２８５】 上記のように調整され保存された細胞膜の一部は、解凍され、ホモジナイズさ
れ、２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， １０ ｍＭ ＭｇＣｌ２， １ ｍＭ ＥＤ
ＴＡ， １２０ ｍＭ ＮａＣ１， １０ ｐＭ ＧＤＰ， および ０．２
ｍＭ アスコルビン酸（濃度１０−５０ ｎｇ／ｍ１）を含む緩衝液に希釈され
る。最終的に９０μｌの量で、ホモジネートは、いろいろな濃度の候補モジュレ
ータ−化合物、または１００μＭのＧＴＰと共に、３０℃で３０分間インキュベ
ートされ、次いで氷冷される。各サンプルに、グアノシン５’−Ｏ−（３［３５ Ｓ］ｔｈｉｏ）三リン酸（ＮＥＮ， １２００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ； ［３５Ｓ］
−ＧＴＰγＳ）を１０μｌ、最終濃度が１００−２００ｐＭとなるように添加す
る。サンプルは、３０℃でさらに３０分間インキュベートし、１ ｍｌ ｏｆ
１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ ７．４， １０ ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液を
４Ｃで添加し、反応はろ過で停止される。
【０２８６】 サンプルは、ワットマンＧＦ／Ｂフィルターでろ過され、ろ紙は２０ｍｌの氷
冷ＨＥＰＥＳ，ＰＨ７．４、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２で洗浄される。フィルターは
、液体シンチレーションカウンターで測定される。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの非特
異的結合は、１００μＭＧＴＰの存在下で測定され、合計から差し引かれる。細
胞中で結合している［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの量を調整する化合物が選択され、非
形質移入対照細胞と比較される。作動薬によるレセプターの活性化は、［３５Ｓ
］ＧＴＰγＳ結合に最大５倍の増加をもたらす。この応答は、拮抗薬によりブロ
ックされる。
【０２８７】 Ｇ、ＭＡＰキナーゼ活性アッセイ ＤｍＧＰＣＲを発現している細胞中のＭＡＰキナーゼ活性の測定は、ＧＰＣＲ
のモジュレーターを特定するためのもう一つのアッセイを提供する。例えば、Ｌ
ａｊｉｎｅｓｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２６７（３）：１５
７３−１５８１ （１９９３）； および、Ｂｏｕｌｔｏｎら、Ｃｅｌｌ ６５
：６６３−６７５ （１９９１）］を参照せよ。
【０２８８】 一つの例としては、ＤｍＧＰＣＲを安定に形質移入されたＣＨＯ細胞を、アッ
セイの４８時間前に、６ウェルプレートに７０，０００細胞／ウェルの密度で播
種する。この４８時間の間、細胞は３７℃で、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグル
タミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０ｎｇ／ｍｌストレプトマイシンを含
むＭＥＭ培地で培養される。 細胞は、刺激剤の添加前の１−２時間は、血清−欠乏状態とする。
【０２８９】 アッセイには、細胞は、培地のみで、あるいは、培地に候補作動薬または２０
０ｎＭのフォルボルエステルー酢酸メリストイル（すなわち、ＰＭＡ，正対照）
を添加したもので処理され、次いで、細胞は３７℃でいろいろな時間インキュベ
ートされる。反応を停止するために、プレートを氷上に乗せ、培地を吸引除去し
た後に、細胞は、氷冷されたＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ１ｍｌで洗浄される。その
後、細胞溶解緩衝液（１２．５ ｍＭ ＭＯＰＳ， ｐＨ ７．３， １２．５
ｍＭ グリセロリン酸， ７．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．５ ｍＭ ＥＧ
ＴＡ， ０．５ ｍＭ バナジン酸ナトリウム， Ｉ ｍＭ ベンズアミジン，
１ ｍＭ ジチオスレイトール， １０ μｇ／ｍｌ ロイペプチン， １０
μｇ／ｍｌ アプロチニン， ２ ＠ｇ／ｍｌ ペプスタチンＡ，および １
μＭ オカダ酸）２００μｌが、細胞に添加される。細胞は、プレートから剥
ぎ取り、２３ ３／４針を通過させることでホモジナイズした。サイトソル部分
は、２００００ｘｇで１５分間遠心分離することにより得られた。
【０２９０】 サイトソルの一部（１−５μｇのタンパク質を含む５−１０μｌ）は、１ｍＭ
サブストレートペプチド（ＡＰＲＴＰＧＧＲＲ （配列番号： １６３）、Ｕｐ
ｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ．）および［γ
−３２Ｐ］ＡＴＰ（ＮＥＮ， ３０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）５０μｌと混合され
、希釈して最終的に比活性約２０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌを持つ溶液合計２５μｌ
とした。サンプルは３０℃で５分間インキュベートし、反応は、２０μｌを２ｃ
ｍ２の面積のワットマンＰ８１ホスホセルロースろ紙片にスポットすることで停
止させた。ろ紙片は、１％Ｈ３ＰＯ４で４回洗浄後、ロ紙片は、液体シンチレー
ションスペクトルにかけて結合ラベルを定量した。同一のサイトソル抽出物を、
ＭＡＰＫサブストレートペプチド抜きでインキュベートし、これらのサンプルか
らの結合ラベルが、サブストレートペプチド含有の相当するサンプルから差し引
かれた。各ウェルからのサイトソル抽出物は、別ポイントとして使用された。タ
ンパク質濃度は、染料結合タンパク質アッセイ（Ｂｉ０−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）で求められた。レセプターの作動薬活性化は、ＭＡＰＫ酵素活性
に最大５倍の増加をもたらすと考えられる。この増加は、拮抗薬によりブロック
される。
【０２９１】 Ｈ、［３Ｈ］アラキドン酸放出 ＧＰＣＲの活性化が細胞中のアラキドン酸の放出を活性化することはすでに観
察されており、こらはまた、ＧＰＣＲ活性のモジュレーターを特定するためのも
う一つの有用なアッセイを提供する。例えば、Ｋａｎｔｅｒｍａｎら、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３９：３６４−３６９ （１９９１）
］を参照せよ。例えば、ＤｍＧＰＣＲ発現ベクターが安定に形質ＣＨＯ細胞移入
されたＣＨＯ細胞は、２４ウェルプレートに、１５，０００細胞／ウェルの密度
で播種され、１０％ ウシ胎児血清、２ ｍＭ グルタミン、 １０ Ｕ／ｍｌ
ペニシリン、および １０ ｎｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加した ＭＥ
Ｍ培地で、４８時間３７℃で増殖させられる。各ウェルの細胞は、１０ ｍＭ
ＨＥＰＥＳ， ｐＨ ７．５、および０．５％ 脂肪酸非含有ウシ血清アルブミ
ンを含むＭＥＭ倍地０．５ｍｉｃｒｏＣｉ／ｍｌ中で、［３Ｈ］アラキドン酸（
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．， ２１０ Ｃｉ／ｍｍｏｌ） で、３７℃で２
時間ラベルされる。細胞は、２回、同緩衝液１ｍｌで洗浄される。
【０２９２】 候補モジュレーター化合物は、同緩衝液１ｍｌ中に、単独でまたは１０ｍＭＡ
ＴＰと一緒に入れられ、細胞は３７℃で３０分間インキュベートされる。緩衝液
単独および偽形質転移細胞が、対照として用いられた。各ウェルからのサンプル
（０．５ｍｌ）は、液体シンチレーションスペクトルで計測した。レセプターを
活性化する作動薬は、ＳＴＰ刺激性の［３Ｈ］アラキドン酸の放出を活性化する
はずである。この活性化は、拮抗薬でブロックされる。
【０２９３】 Ｉ、細胞外酸性化速度 さらにもう一つのアッセイでは、ＤｍＧＰＣＲ活性の候補モジュレーターの影
響は、試験化合物により誘起される細胞外のｐＨ変化を測定することでアッセイ
できる。例えば、Ｄｕｎｌｏｐら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
ｏｇｉｃａｌ、および Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４０（
ｌ）：４７−５５ （１９９８）］を参照せよ。一つの実施形態において、Ｄｍ
ＧＰＣＲ発現ベクターが形質移入されたＣＨＯ細胞は、１２ｍｍカプセルカップ
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．） に、１０％ ウシ胎児
血清、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ Ｕ／ｍｌ ペニシリン、および１０
＠ｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含むＭＥＭ培地中で４ｘ１０５細胞／カップ
の密度で播種される。細胞は、この培地中で５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間イ
ンキュベートされる。
【０２９４】 細胞外酸性化速度は、サイトセンサーミクロフィジオメーター（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）を使用して測定された。カプセルカップ
は、ミクロフィジオメーターのセンサー室に入れられ、その室は、流動緩衝液（
４ ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリン、１０ ｕｇ
／ｍｌ ストレプトマイシン、２６ ｍＭ ＮａＣｌを含む炭酸塩ＭＥＭ）を使
って、１００ｍｌ／分の流速で灌流した。候補作動薬または他の試薬は、流動緩
衝液で希釈され、第二の流体経路を灌流させられた。６０秒のポンプサイクルの
うち、３８秒間はポンプがオン、２２秒はオフと設定した。センサー室中の流動
緩衝液のｐＨは、このサイクルの４３−５９秒の間に測定された。なお、ポンプ
は６０秒後に新しい次のサイクルを開始する。流動緩衝液の記録時間中の酸性化
の速度は、サイトソフトプログラムにより計算された。酸性化速度の変化は、ベ
ースライン値（モジュレーター候補添加の直前の４回の速度測定の平均値）を、
モジュレーター候補の添加後得られた最大速度から差し引くことで求めた。その
装置の検出感度は、６１ｍＶ／ｐＨ単位である。レセプターの作動薬として作用
するモジュレーターは、細胞外酸性化速度を、作動薬不存在下の速度と較べ、増
加させることとなる。この応答は、レセプターの拮抗剤として作用するモジュレ
ーターによりブロックされる。
【０２９５】 実施例９、ＤｍＧＰＣＲとペプチドリガンドの整合性 細胞培養と形質移入 野生種のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞（入手元、ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）は、３７℃で、空気中５％のＣＯ２を含む湿った雰
囲気下、１０％ 熱不活性化ＦＢＳ、１０ μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン、およ
びＤＭＥＭ完全培地を与えるための０．１ ｍＭ 非必須アミノ酸を含む、ＤＭ
ＥＭ培地中で、培養した。細胞は、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳを用
い、基本的には製造業者の指示に従って、ｐＣＲ３．１ベクター中のオーファン
ＧＰＣＲ ＤＮＡで形質移入された。簡潔に述べると、ＣＨＯ細胞は、１０ｃｍ
滅菌組織培養プレート（Ｃｏｍｉｎｇ Ｇｌａｓｓ Ｗｏｒｋｓ， Ｃｏｍｉｎ
ｇ， ＮＹ）に乗せた。それらは、形質移転の日には、５０−６０％の密集度で
あった。プラスチックチューブ中で、上記ＰＬＵＳ（２０ ｍｉｃｒｏＩ／ｐｌ
ａｔｅ）を、前もって０．７５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭに希釈されたｃＤＮＡ（５
ｎＧ／プレート）に添加、混合し、室温で１５分間インキュベートされた。別途
、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（３０ μｌ／プレート）は、０．７５ ｍｌ
のＯｐｔｉＭＥＭと混合され、前もって複合体形成されたＤＮＡ／ＰＬＵＳ混合
物中に添加され、室温で１５分間インキュベートされた。細胞の培地は、無血清
形質移転培地（ｐｌａｉｎ ＤＭＥＭ， ５ ｍｌ／ｐｌａｔｅ）で置換され、
ＤＮＡ−ＰＬＵＳ−ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ 複合体が添加（プレート当た
り、１．５ ｍｌ ）後、３時間、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートされた
。続いて、培地に、２０％ＦＢＳを含む完全ＤＭＥＭ培地（６．５ ｍｌ ｍｌ
／プレート）を追加し、さらに３７℃／５％ＣＯ２で、２４から４８時印急べ戸
を継続した。グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ，４μｇ・プレート）
を、ＧＰＣＲも使用したのと同じ条件での形質移入収率を見積もるため、ＣＨＯ
細胞中での一時的なＧＦＰ発現に使用した。
【０２９６】 膜標本 形質移入細胞は、氷冷したダルベコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で一回洗
浄（１０ｃｍのプレート当たり５ｍｌ）し、剥ぎ取って同緩衝液５ｍｌ中に乳濁
した。多数のプレートからのセル乳濁液は混合して、４℃で５００ｘｇで１０分
間遠心分離した。細胞のペレットは、氷冷ＴＥＥ （２５ ｍＭ ＴＲＩＳ，
５ ｍＭ ＥＧＴＡ， ５ ｍＭ ＥＤＴＡ）に再乳濁させた。適当な量は、液
体窒素中で急速凍結され、−７０℃で保存された。解凍後、細胞はホモジナイズ
され、４℃、５００ｘｇで５分間遠心分離で、核酸と非破壊細胞をペレット化し
た。上澄み液は、４℃で、４７，０００ｘｇで３０分間遠心分離された。膜ペレ
ットは、一回ＴＥＥで洗浄後、２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、 ｐＨ７．４、１００
ｍＭ ＮａＣ１， １０ ｍＭ ＭｇＣｌ２， Ｉ ｍＭ ＥＤＴＡ （アッ
セイ緩衝液）に再乳濁され、適量は取り出され、液体窒素中で凍結された。膜画
分は、−７０Ｃで保存された。タンパク質濃度は、ピアス社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ
， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）のＢＣＡタンパク質アッセイ試薬、および標準としてＢ
ＳＡを用いて、測定された。
【０２９７】 ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイ 適量の細胞膜は解凍、ホモジナイズされ、２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ
７．４， １００ ｍＭ ＮａＣ１， １０ ｍＭ ＭｇＣｌ２， １ ｍＭ
ＥＤＴＡ を含む緩衝液（アッセイ緩衝液）で希釈された。初めに、反抗混合物
が、９６ウェルポロプロピレンプレートに作成された。各ウェル中で、ペプチド
水溶液（２０ ｍｉｃｒｏ１， １０ Ｘ）または水対照（２０ ｍｉｃｒｏ１
）、アッセイ緩衝液中のＧＤＰ（０．１１ ｍ１， 最終１０ μＭ）、および
アッセイ緩衝液に乳濁された膜（５０ ｍｉｃｏｒ１， １０ μｇ 膜タンパ
ク質）を混合し、氷上に置いた。リガンド−ＧＤＰ−膜混合物は、室温で２０分
間振とうしながらインキュベートされ、次いで氷上で冷却された。各サンプルに
、２０ ｍｉｃｒｏ１ グアノシン−５’−Ｏ−（３−［３５Ｓ］ｔｈｉｏ）−
三リン酸 （［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ） （６００−１，２００ Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ） が
添加された。インキュベーション混合物と共にプレートは、室温で４５分間イン
キュベートされた。反応混合物の適量（０．１７５ｍｌ）は、次いで、洗浄緩衝
液で前処理（１００μｌ／プレート）された９６ウェルＦＢマルチスクリーンフ
ィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移され、バキュームマニホールド（
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して真空ろ過された。次いで、膜は３回、０．２５
ｍｌの氷冷洗浄緩衝液／ウェル（１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， １０ ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２， ｐＨ ７．４） で、洗浄された。最後の洗浄の後、スーパーミック
スオプチフェーズシンチレーション流体（２５ ｍｉｃｒｏ１／ｗｅｌ１，
Ｗａｌｌａｃ）を添加し、プレートは封をされて、とリラックス１４５０ミクロ
ベータカウンター（Ｗａｌｌａｃ） で、１分／ウェルの速度で測定された。正
の対照として、ドーパミン２型レセプターを安定して発現しているＣＨＯ細胞の
膜が、１ｍＭのドーパミン、０．０２５％アスコルビン酸、またはベヒクル（０
．００２５％最終アスコルビン酸）で処理されたた。非特異的結合は、１００ｐ
Ｍの冷ＧＴＰγＳの存在下での測定で求め、トータルから差し引いた。各処理は
、三回行われた。
【０２９８】 データ分析 リガンド誘起性の［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の刺激活性は、リガンドの添加が
ない場合の基礎活性の何倍の増加があるかで表現されている。各処理は、三回、
または、場合によっては二回行われ、結合（ｃｐｍ）は、平均値＋／−標準偏差
で表されている。レセプター／リガンドシステムの容量応答曲線は、非線形最小
自乗ＳＡＳモデル、ｙ＝ＢｍａｘＸ／（Ｋｄ＋Ｘ）、を使って分析された。他の
容量応答曲線は、プリズムおよび次の式を使って分析された。（ＧｒａｐｈＰａ
ｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇ０， ＣＡ）。ｙ＝Ｂｏ
ｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（Ｉ＋１０ＬＯＧＥＣ５０−ｘ）
【０２９９】 結果 当初、我々は、ＧＰＴγＳアッセイを、一つの機能アッセイとして選択した。
その理由は、作動薬駆動のＧＰＴγＳアッセイは 多くの下流の情報伝達現象の活性化経路とは無関係に、ＧＰＣＲ活性化カスケイ
ドの初期の現象を反映するからである。これは、機能がや情報伝達経路が未知の
オーファン（孤児）ＧＰＣＲの活性化を評価するのに特に有用と考えられる。Ｇ
ＰＴγＳアッセイは、ショウジョウバエＧＰＣＲをコードするＤＮＡで一時的に
形質移入されたＣＨＯ細胞から調整された膜を使用し、９６ウェルマルチスクリ
ーンＧ／ＦＢフィルタープレートとマルチスクリーンバキュームマニホールド（
Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ）をろ過に用いて、実施される。ＧＰＴγＳアッセイは、Ｇ
タンパク質のＧｑクラスに結合するＧＰＣＲを認識する力が弱いことはすでに知
られているため、ＧＬＩＰＲ読み出しを基礎とするＣａ＋２可動化アッセイも、
ショウジョウバエＧＰＣＲをコードするＤＮＡで一時的に形質移入されたＣＨＯ
細胞中のＧｑ結合オーファンＧＰＣＲの評価に使用した。
【０３００】 ＧＰＴγＳアッセイを用い、ＤｍＧＰＣＲ（ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ３４６５１）
が、二つのペプチド、ＤＰＫＱＤＦＭＲＦ−ＮＨ２ ＜配列番号：２６＞ ａｎ
ｄ ＰＤＮＦＭＲＦ−ＮＨ２ ＜配列番号：２７＞により最も大きく活性化され
ることが明らかとなった。（ＥＣＨＯの領域、３７０から５７０ｎＭ）。Ｎａｍ
ｂｕらにより報告されているように［Ｎａｍｂｕ ｅｔ ａ１． （Ｎｅｕｒｏ
ｎ １，５５− ６１， １９８８）、これらの２個のペプチドは、同じ前駆
体遺伝子上に、他の９個のＦａＲＰと共に、コードされている。効率は低いもの
の（ＥＣ５０が、５ からｌＯ μＭの領域）ＧＰＴγＳ結合を刺激することの
できる他のＦＡＲＰや他の神経ペプチドとしては、次のペプチドが含まれる。Ｔ
ＤＶＤＨＶＦＬＲＦ−ＮＨ２ ＜配列番号：２５＞， ＴＰＡＥＤＦＭＲＦ−Ｎ
Ｈ２ ＜配列番号：２８＞， ＳＬＫＱＤＦＭＨＦ−ＮＨ２ ＜配列番号：２９
＞， ＳＶＫＱＤＥＭＨＦ−ＮＨ２ ＜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０， ＡＡＭ
ＤＲＹ−ＮＨ２＜配列番号：３１＞， ａｎｄ ＳＶＱＤＮＦＭＨＦ−ＮＨ２＜
配列番号：３２＞さらに、ＦＬＩＰＲアッセイは、コロラドポテトハムシペプチ
ド、ＡＲＧＰＱＬＲＬＲＦ− ＮＨ２ ＜配列番号：３３＞が、ＥＣ５０が１０
０−２００ｎＭを持つＤｍＧＰＣＲレセプターに相当することを示した。
【０３０１】 ＧＰＴγＳ応答によって示されるように、ＤｍＧＰＣＲ（ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ
６７３９３）は、ショウジョウバエメラノガスターアラトスタチン、ＥＣ５０
が低いナノモラー領域にあるドロスタチンー３（ＳＲＰＹＳＦＧＬ−ＮＨ２ ＜
配列番号：１６１）、およびＤｉｐｌｏｔｅｒａ ｐｕｎｃｔａｔａ （ゴキブ
リ）のアラトスタチン類、すなわちＧＤＧＲＬＹＡＦＧＬ−ＮＨ２＜配列番号：
３４＞， ＤＫＬＹＳＦＧＬ−ＮＨ２ ＜配列番号：３５＞， ＡＰＳＧＡＱＲ
ＬＹＧＦＧＬ−ＮＨ２ ＜配列番号：３６＞， ａｎｄ ＧＧＳＬＹＳＦＧＬ−
ＮＨ２＜配列番号：３７＞ （ＥＣ５０、約２０−２８０ ｎＭの領域）。上記
ペプチドは、ＦＬＩＰＲで１０ｍｉｃｏｒＭでの試験で、非常に強いカルシウム
シグナルを引き起こしている。ＤｍＧＰＣＲは、最近レンツらによるクローン化
され、第二の推定上のアラトスタチンレセプター（ＤＡＲＩＩ）と分類されてい
る。しかし、レセプター活性化についての薬理的データは、今までに報告されて
いない。我々の知る限り、これが、各種のアラトスタチンが本レセプターを活性
化する最初の実験的な証拠である。
【０３０２】 ＤｍＧＰＣＲ６ａ（Ｍ８１１４９０）は、ＰＹＹレセプターとして、リにより
報告されている。 Ｌｉ ｅｔ ａ１． ［Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６
７，９−１２， １９９２）。ＤＴＰγＳアッセイを用いた試験では、テーブル
６に記載のペプチドが、５μＭの試験において、ＤｍＧＰＣＲをコードするＤＮ
Ａを形質移入されたＣＨＯ細胞由来の膜への、ＤＴＰγＳの結合を刺激（ベース
の１．７から４倍の増加）している。本レセプターを活性化する一連の昆虫やＣ
． ｅｌｅｇａｎｓ由来のペプチドに加えて、ヒトＮＰＦＦ（ＦＬＦＱＰＱＲＦ
−ＮＨ２ ＜配列番号：５９ ）も、ＤｍＧＰＣＲに対するリガンドであること
が明らかとなった（５ｍｉｃｏｒＭのＮＰＦＦで、ＤＴＰγＳ結合の４倍の増加
）。
【０３０３】 ＤｍＧＰＣＲ６ａＬ、とＤｍＧＰＣＲ６ｂＬは、ＤｍＧＰＣＲ６ａ（Ｍ８１１
４９０）の二つのスプライス変異体である。後者は、ＰＹＹレセプターであると
、リらにより報告されている。［Ｌｉら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６
７， ９−１２， １９９２）。我々は、ＤｍＧＰＣＲ６ａＬおよびＤｍＧＰＣ
Ｒ６ｂＬを、いずれも、Ｃ末端にＡｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ＲＦａ）配列を持つ
ペプチドのみを認識するため、ＲＦ−アミドレセプターと命名する。これらのＧ
ＰＣＲが「見ない」ペプチドは、Ｃ末端にＲＦａ配列とは異なった配列を持つ。
カルシウム可動化アッセイ（ＦＬＩＰＲ）において、ＤｍＧＰＣＲ６ａＬおよび
ＤｍＧＰＣＲ６ｂＬは、１０ｍｉｃｏｒＭの試験で、一連のＦａＲＰに対してた
いへん強いＣａ＋２応答を示した。以下のテーブル６に記載の配列は、様々な種
に属するすでに特定された活性ＦａＲＰのすべてを示している。これらの種とし
ては、ショウジョウバエ、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ， Ａ ｓｕｕｍ， 軟体動物
， Ｐ． ｒｅｄｉｖｉｖｕｓ， 吸血網、ロブスター、ヒト、およびヒルなど
を含んでいる。Ｃ末端の「ＲＦアミド法則」から外れる唯一の例外は、ペプチド
ｐＧｌｕＤＲＤＹＲＰＬＱＦ−ＮＩ＠ ＜配列番号：１２０＞で、Ｃ末端は、
Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ＱＦａ）配列で終わっている。面白いことに、ＤｍＧ
ＰＣＲ６ａＬとＤｍＧＰＣＲ６ｂＬは、ＮＰＦＦ（ＦＬＦＱＰＱＲＦ−ＮＨ２
＜配列番号：１５２＞）、ＲＦアミド配列をＣ末端に持つ哺乳類ペプチドを認識
する。（注。上記結果において、ｐ−ＧｌｕまたはｐＱは、ピログルタミン酸を
指す。）
【０３０４】 ＤｍＧＰＣＲ９は、カルシウム可動化アッセイにおけるたいへん強いシグナル
の点で、ＦＤＤＹ（Ｓ０３Ｈ）ＧＨＬＲＦ−ＮＨ２ ＜配列番号：１５７＞と似
ている。（ＥＣ５０は、低ナノモラー領域）このペプチドに対して、ＤｍＧＰＣ
Ｒ９をコードするＤＮＡを形質移入されたＣＨＯ細胞由来の膜で、ＤＴＰγＳ応
答がないという事実は、ＤｍＧＰＣＲ９が、Ｇｑ情報伝達経路と共役している可
能性が高いことを示唆している。ＦＤＤＹ（Ｓ０３Ｈ）ＧＨＬＲｊＦ−ＮＨ２
＜配列番号：１５７＞は、天然のドロスルファキニン−１（ＤＳＫ−１）のＭｅ
ｔ→Ｌｅｕ７アナログ、ＦＤＤＹ（Ｓ０３Ｈ）ＧＨＭＲＦ−ＮＨ２ ＜配列番号
：１５９＞を代表する。このため、我々はＤｍＧＰＣＲ９レセプターを、スルフ
ァキニンレセプターであると指定する。ＦＤＤＹ（Ｓ０３Ｈ）ＧＨＬＲＦ−ＮＨ
２＜配列番号：１５７＞の非硫酸化体であるＦＤＤＹＧＨＬＲｆ−ＮＨｚ ＜配
列番号：１５８＞ が、１０μＭでの試験で、非常に弱いカルシウムシグナルを
示し、また、他の１１７個の試験されたＦａＲＰおよび関連ペプチドのいずれも
が、ＤｍＧＰＣＲレセプターのＦＬＩＰＲまたはＤｍＧＰＣＲ９アッセイで活性
を示さなかったことから、このマッチは、非常に特異的である。
【０３０５】 リガンドとそのレセプターの対照表を、以下のテーブル６に示す。
【０３０６】
【表１６】
【０３０７】
【表１７】
【０３０８】
【表１８】
【０３０９】
【表１９】
【０３１０】 実施例１０、競合アッセイ モノ−ヨウ素化ペプチドの調整 ペプチドは、典型的なクロラミンＴ手法で、ヨウ素化される。２ｍｌのガラス
バイアルに、１０μｌの１ｍＭペプチド水溶液、１０μｌの０．１Ｍ（ｐＨ７．
９９）リン酸ナトリウム緩衝液、１．０ｍＣｉ［１２５Ｉ］ヨウ化ナトリウムお
よび５μｌの２ｍｇ／ｍｌクロラミンＴ溶液（リン酸緩衝液中）が添加される。
混合物は、６０秒間振とうし、反応は２５μｌの５ｍｇ／ｍｌメタ重亜硫酸ナト
リウムのリン酸緩衝液溶液の添加で停止する。混合物は、ＨＰＬＣにかけ、バイ
ダックＣ１８カラム（０．４５ｘ１５ｃｍ）を使用し、グラジエント分離させる
。使用のグラジエントは、タイム０で、Ａ７０％とＢ３０％、タイム２５分でＡ
２０％，Ｂ８０％である。（Ａ：０．１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液、Ｂ：０．１
Ｍ酢酸アンモニウム水溶液、ＣＨ３ＣＮ６０％ｖ／ｖ）。流速は、１．０ｍｌ／
分。サンプルは、０．２５ｍｌの捕集緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
中、０．５％ウシ血清アルブミン、０．１％トリトンＸ１００，および０．０５
％ツイーン２０を含む）に、３０秒間隔で、ｔ＝８からｔ＝２０分まで捕集する
。モノヨウ素化ペプチドは、典型的には、ｔ＝１１分で溶離する。収率は、０．
７５ｍｌ中約１００ｍｉｃｒＣｉである。
【０３１１】 結合アッセイ 使用の９６ウェルプレートは、ミリポリマルチスクリーンろ過プレート（ＦＢ
不透明 １．０ μＭ ガラス繊維Ｂ型，カタログ番号ＭＡＦＢＮＯＢ５０）
である。フィルターアッセイにおいて、ミリポリペプチドアマルチスクリーン溶
媒耐性マニホールド（カタログ番号ＭＡＶＭ０９６０Ｒ ）を、プレートと共に
最後に用いた。各重複アッセイは、１ウェルで、容量は１００μｌ、５μｇのタ
ンパク質を含んでいる（調整法は、上に記載）。各テスト群は、２個の重複アッ
セイを持つ。各テスト化合物に対し、１グル−プは［１２５Ｉ］ペプチドのみで
（総結合を測定）、もう一つの群は、１μＭ（または、指定された）濃度のテス
ト化合物および［１２５Ｉ］ペプチド（非特異的結合を測定）で試験を行う。各
重複アッセイに試薬を入れる順番は、アッセイ緩衝液（２０ ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ， １０ ｍＭ ＭｇＣｌ２， １％ ウシ血清アルブミン、ｐＨ ７．４
）、テスト化合物（アッセイ緩衝液中で作成）、および膜乳濁液（アッセイ緩衝
液中）である。膜乳濁液の添加は、結合反応を開始させる。反応は室温（２２℃
）で３０分行う。３０分のインキュベート後、各プレートは、ろ過マニホールド
に取り付け、真空をかけて、ろ紙をとおして液体を引き（捨てる）、タンパク質
を各ウェルのろ紙上に捕集する。洗浄には、真空を開放し、２００μｌのアッセ
イ緩衝液を各ウェルに添加し、次いで真空を再印加する。この洗浄は、２回異常
繰り返される。（各重複に対し合計３回の洗浄）。洗浄後、各プレートの裏側を
覆うプラスチックを除去し、プレートは底のシールされたミクロベータシンチレ
ーションカウンターのカセット（カタログ番号１４５０− １０５）にセットさ
れる。各ウェルに２５μｌのシンチラントを添加し、プレートはロータリーシェ
ーカー上で８０ｒｐｍで１時間振とうし、その後位置や放置される。次の日に、
プレートは、ミクロベータシンチレーションカウンターで計測される。総結合の
平均値から、非特異的結合の平均値を差し引いて、標準（ペプチドアミド）およ
び未知物質の特異的結合値が計算される。
【０３１２】 上述の本発明の好ましい実施形態のいくつかは、いかに説明されるが、次に続
く実施形態を含むが、それに限定はされない。当業者が理解するように、本発明
の範囲から逸脱することなく、本発明の好ましい実施形態の改変や修正すること
は、多数可能である。そのような改変のすべてが、本発明の範囲内に入るものと
する。
【０３１３】 ここに引用した各報文の全開示は、出典明示して本明細書の一部とみなされる
。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 3/10 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 3/04 7/02 ４Ｃ０８５ 3/10 9/00 ４Ｃ０８６ 7/02 9/02 ４Ｈ０４５ 9/00 9/10 １０１ 9/02 9/12 9/10 １０１ 13/12 9/12 19/02 13/12 25/00 19/02 25/04 25/00 25/10 25/04 25/14 25/10 25/16 25/14 25/18 25/16 25/24 25/18 29/00 25/24 １０１ 29/00 31/12 １０１ 31/18 31/12 35/00 31/18 37/06 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 37/06 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/19 16/28 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 テレサ・エイ・クビアック アメリカ合衆国49083ミシガン州リッチラ ンド、イースト・ビー・アベニュー5844番 (72)発明者 マーサ・ジェイ・ラーセン アメリカ合衆国49009ミシガン州カラマズ ー、ネイプルズ・コート56番 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA41 BA63 CA01 DA02 DA06 DA12 EA02 EA04 FA02 GA11 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR32 QR55 QS34 QS36 QX01 4B064 AG20 AG27 CA02 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA80X AA90X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA08 BA21 BA22 CA49 CA53 DC50 NA14 ZA01 ZA08 ZA15 ZA18 ZA36 ZA42 ZA43 ZA45 ZA54 ZA81 ZA96 ZB08 ZB11 ZB15 ZB26 ZB33 ZC41 ZC42 ZC55 4C085 AA13 AA14 BB11 CC21 CC31 DD62 EE01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZA08 ZA15 ZA18 ZA36 ZA42 ZA43 ZA45 ZA54 ZA81 ZA96 ZB08 ZB11 ZB15 ZB26 ZB33 ZC41 ZC42 ZC55 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA51 DA50 EA20 EA50

Claims (62)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離核酸分子であって、 ａ）配列番号：１，３，５，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，もしく
    は２３、またはそのフラグメント； ｂ）配列番号：１，３，５，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１、もしく
    は２３、またはそのフラグメントに相同な配列； ｃ）配列番号：２，４，６，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２もしく
    は２４、またはそのフラグメントを含むポリペプチドをコードする配列；および
    ｄ）配列番号：２，４，６，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２もしく
    は２４、またはそのフラグメントに相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコ
    ードする配列 よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、ＤｍＧＰＣＲの少なくとも
    一部分をコードする前記単離核酸分子。
  2. 【請求項２】 前記核酸分子がＤＮＡである請求項１記載の核酸分子。
  3. 【請求項３】 前記核酸分子がＲＮＡである請求項１記載の核酸分子。
  4. 【請求項４】 前記ヌクレオチド配列が配列番号：１，３，５，９，１１，
    １３，１５，１７，１９，２１，または２３を含む請求項２記載の核酸分子。
  5. 【請求項５】 配列番号：１，３，５，９，１１，１３，１５，１７，１９
    ，２１または２３の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記核
    酸分子の補体がＤｍＧＰＣＲの少なくとも一部をコードする単離核酸分子。
  6. 【請求項６】 前記分子が、配列番号：１，３，５，９，１１，１３，１５
    ，１７，１９，２１または２３に向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドで
    ある請求項５記載の核酸分子。
  7. 【請求項７】 前記オリゴヌクレオチドが配列番号：１，３，５，９，１１
    ，１３，１５，１７，１９，２１または２３の調節領域に向けられる請求項６記
    載の核酸分子。
  8. 【請求項８】 請求項１または５の核酸分子を含む発現ベクター。
  9. 【請求項９】 前記核酸分子が、配列番号：１，３，５，９，１１，１３，
    １５，１７，１９，２１または２３を含む請求項８記載の発現ベクター。
  10. 【請求項１０】 前記ベクターがプラスミドである請求項８記載のベクター
    。
  11. 【請求項１１】 前記ベクターがウィルス粒子である請求項８記載のベクタ
    ー。
  12. 【請求項１２】 前記ベクターが、アデノウィルス、バキュロウィルス、パ
    ルボウィルス、ヘルペスウィルス、ポックスウィルス、アデノ随伴ウィルス、セ
    ムリキ森林ウィルス、ワクシニアウィルス、およびレトロウィルスよりなる群か
    ら選択される請求項１１記載のベクター。
  13. 【請求項１３】 前記核酸分子が、サルウィルス４０、マウス乳腺腫瘍ウィ
    ルス、ヒト免疫不全ウィルスの末端反復配列、マロニーウィルス、サイトメガロ
    ウィルス最初期プロモーター、エプスタインバーウィルス、ラウス肉腫ウィルス
    、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およ
    びヒトメタロチオネンよりなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結
    されている請求項８記載のベクター。
  14. 【請求項１４】 請求項８記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
  15. 【請求項１５】 前記細胞がバクテリア細胞である請求項１４記載の形質転
    換宿主細胞。
  16. 【請求項１６】 前記バクテリア細胞がＥ．ｃｏｌｉである請求項１５記載
    の形質転換宿主細胞。
  17. 【請求項１７】 前記細胞が酵母である請求項１４記載の形質転換宿主細胞
    。
  18. 【請求項１８】 前記酵母がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項１７記
    載の形質転換宿主細胞。
  19. 【請求項１９】 前記細胞が昆虫細胞である請求項１４記載の形質転換宿主
    細胞。
  20. 【請求項２０】 前記昆虫がＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａである請求項１９記
    載の形質転換宿主細胞。
  21. 【請求項２１】 前記細胞が哺乳類細胞である請求項１４記載の形質転換宿
    主細胞。
  22. 【請求項２２】 哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬ
    ａ細胞、アフリカミドリザル肝臓細胞、ヒト２９３細胞、およびマウス３Ｔ３フ
    ィブロブラストよりなる群から選択される請求項２１記載の形質転換宿主細胞。
  23. 【請求項２３】 配列番号：２，４，６，１０，１２，１４，１６，１８，
    ２０，２２もしくは２４、またはそのホモログもしくはフラグメントを含むポリ
    ペプチドの製造方法であって、 ａ）請求項８の組換え発現ベクターを適合性の宿主細胞に導入し； ｂ）前記宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現条件下で培養し；および ｃ）前記ポリペプチドを回収するステップを含むポリペプチドの製造方法。
  24. 【請求項２４】 前記宿主細胞を溶菌し、および前記ポリペプチドを前記宿
    主細胞の溶菌液から回収する請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記宿主細胞を溶菌することなく培養培地を精製すること
    によって、前記ポリペプチドを回収する請求項２３記載の方法。
  26. 【請求項２６】 請求項１または５記載の核酸分子および許容される担体ま
    たは希釈剤を含む組成物。
  27. 【請求項２７】 請求項８記載の組換え発現ベクターおよび許容される担体
    または希釈剤を含む組成物。
  28. 【請求項２８】 請求項１記載の核酸分子にコードされる単離ポリペプチド
    。
  29. 【請求項２９】 前記ポリペプチドが配列番号：２，４，６，１０，１２，
    １４，１６，１８，２０，２２または２４を含む請求項２８記載のポリペプチド
    。
  30. 【請求項３０】 前記ポリペプチドが配列番号：２，４，６，１０，１２，
    １４，１６，１８，２０，２２または２４に相同なアミノ酸配列を含む請求項２
    ８記載のポリペプチド。
  31. 【請求項３１】 前記配列番号：２，４，６，１０，１２，１４，１６，１
    ８，２０，２２または２４に相同な前記配列が、配列番号：２，４，６，１０，
    １２，１４，１６，１８，２０，２２または２４と比べて、少なくとも１箇所の
    保存的アミノ酸置換を含む請求項３０記載のポリペプチド。
  32. 【請求項３２】 前記ポリペプチドが配列番号：２，４，６，１０，１２，
    １４，１６，１８，２０，２２または２４のフラグメントを含む請求項２８記載
    のポリペプチド。
  33. 【請求項３３】 請求項２８のポリペプチドと許容される担体または希釈剤
    を含む請求項２８記載の組成物。
  34. 【請求項３４】 請求項２８記載のポリペプチドのエピトープに結合する単
    離抗体。
  35. 【請求項３５】 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項３４記載の抗
    体。
  36. 【請求項３６】 請求項３４記載の抗体と、許容される担体または希釈剤と
    を含む組成物。
  37. 【請求項３７】 請求項２８のポリペプチドに対する免疫応答を哺乳類に誘
    起させる方法であって、前記哺乳類に前記免疫応答を誘起させるのに十分な前記
    ポリペプチドの量を投与することを特徴とする該方法。
  38. 【請求項３８】 ＤｍＧＰＣＲに結合する化合物を特定する方法であって、 ａ）ＤｍＧＰＣＲを化合物と接触させ；および ｂ）前記化合物がＤｍＧＰＣＲに結合するか決定するステップを含む該方法。
  39. 【請求項３９】 ＤｍＧＰＣＲへの前記化合物の結合が、タンパク質結合ア
    ッセイで決定される請求項３８記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記タンパク質結合アッセイが、ゲル−シフトアッセイ、
    ウェスターンブロット、放射ラベル競争アッセイ、ファージ−ベース発現クロー
    ニング、クロマトグラフィーによる共分画、共沈殿、架橋、相互トラップ／ツー
    ハイブリッド分析、サウスウェスタン分析、およびＥＬＩＳＡよりなる群から選
    択される請求項３９記載の方法。
  41. 【請求項４１】 ＤｍＧＰＣＲをコードする核酸分子に結合する化合物を特
    定する方法であって、 ａ）ＤｍＧＰＣＲをコードする前記核酸分子を化合物と接触させ；および ｂ）前記化合物が前記核酸分子に結合するかどうか決定するステップを含む該
    方法。
  42. 【請求項４２】 結合をゲル−シフトアッセイで決定する請求項４１記載の
    方法。
  43. 【請求項４３】 ＤｍＧＰＣＲの活性を調整する化合物を特定する方法であ
    って、 ａ）ＤｍＧＰＣＲを化合物と接触させ；および ｂ）ＤｍＧＰＣＲ活性が調整されたかどうか決定するステップを含む該方法。
  44. 【請求項４４】 前記活性が、神経ペプチド結合である請求項４３記載の方
    法。
  45. 【請求項４５】 前記活性が、神経ペプチド伝達である請求項４３記載の方
    法。
  46. 【請求項４６】 ＤｍＧＰＣＲとＤｍＧＰＣＲ結合パートナーとの間の結合
    のモジュレーターを特定する方法であって、 ａ）ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーとＤｍＧＰＣＲを含む組成物とを、推定モジ
    ュレーター化合物の存在下および不存在下で接触させ； ｂ）結合パートナーとＤｍＧＰＣＲ間の結合を検出し；および ｃ）推定されるモジュレーター化合物の存在下での結合が、前記推定モジュレ
    ーター化合物の不存在下での結合と比較して、増加または減少しているかを決定
    するステップを含む該方法。
  47. 【請求項４７】 ＤｍＧＰＣＲがＤＭＧＰＣＲ１であって、結合パートナー
    が配列番号：２５ないし３３よりなる群から選択されるペプチドである請求項４
    ６記載の方法。
  48. 【請求項４８】 結合パートナーが配列番号：２６で表されるペプチドであ
    る請求項４７記載の方法。
  49. 【請求項４９】 結合パートナーが配列番号：２７で表されるペプチドであ
    る請求項４７記載の方法。
  50. 【請求項５０】 ＤｍＧＰＣＲがＤＭＧＰＣＲ４であって、結合パートナー
    が配列番号：３４ないし３７よりなる群から選択されるペプチドである請求項４
    ６記載の方法。
  51. 【請求項５１】 結合パートナーが配列番号：３４で表されるペプチドであ
    る請求項５０記載の方法。
  52. 【請求項５２】 結合パートナーが配列番号：３５で表されるペプチドであ
    る請求項５０記載の方法。
  53. 【請求項５３】 結合パートナーが配列番号：３６で表されるペプチドであ
    る請求項５０記載の方法。
  54. 【請求項５４】 結合パートナーが配列番号：３７で表されるペプチドであ
    る請求項５０記載の方法。
  55. 【請求項５５】 ＤｍＧＰＣＲがＤＭＧＰＣＲ６ａであって、結合パートナ
    ーが配列番号：３８ないし５９よりなる群から選択されるペプチドである請求項
    ４６記載の方法。
  56. 【請求項５６】 ＤｍＧＰＣＲがＤｍＧＰＣＲ６ａＬであって、結合パート
    ナーが配列番号：６０ないし１５７よりなる群から選択されるペプチドである請
    求項４６記載の方法。
  57. 【請求項５７】 ＤｍＧＰＣＲがＤＭＧＰＣＲ６ｂＬであり、結合パートナ
    ーが、配列番号：６０ないし１５７よりなる群から選択されるペプチドである請
    求項４６記載の方法。
  58. 【請求項５８】 ＤｍＧＰＣＲがＤＭＧＰＣＲ６ｂＬであって、結合パート
    ナーが配列番号：６０ないし１５６よりなる群から選択されるペプチドである請
    求項４６記載の方法。
  59. 【請求項５９】 ＤｍＧＰＣＲがＤＭＧＰＣＲ９であって、結合パートナー
    が配列番号：１５７で表されるペプチドである請求項４６記載の方法。
  60. 【請求項６０】 請求項３８、４１、４３または４６のいずれかに記載の方
    法で特定された化合物。
  61. 【請求項６１】 ＤｍＧＰＣＲの動物ホモログを特定する方法であって、 ａ）配列番号：１，３，５，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１もしく
    は２３またはその一部で動物の核酸データベースをスクリーニングし；および ｂ）前記ライブラリーまたはデータベースの一部が前記配列番号：１，３，５
    ，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１もしくは２３、またはその一部
    と相同かどうか決定するステップを含む該方法。
  62. 【請求項６２】 ＤｍＧＰＣＲの動物ホモログを特定する方法であって、 ａ）配列番号：１，３，５，９，３０，１１，１３，１５，１７，１９，２１
    または２３よりなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその一部を有する
    核酸分子で動物の核酸ライブラリーをスクリーニングし；および ｂ）前記ライブラリーまたはデータベースの一部が、前記配列番号：１，３，
    ５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１もしくは２３、またはその一
    部と相同かどうか決定するステップを含む該方法。
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