相關申請案之交叉引用
本申請案主張2013年3月14日申請之美國臨時申請案第61/784,639號之權益，其以全文引用的方式併入本文中。
對於生物醫藥行業而言，生產一致且可再現重組醣蛋白糖型特徵仍為巨大挑戰。細胞培養製程中之變化在抗體糖基化特徵中起重要作用。細胞培養製程物理化學環境中之潛在可變性包括pH值、溫度、細胞培養基組成、原料批次之間的變化、培養基過濾材料、生物反應器規模差異、充氣策略(空氣、氧氣、二氧化碳)，以上僅為一些可潛在改變糖基化特徵之實例。
在低葡萄糖或有限葡萄糖之條件下觀測到，重組蛋白之高甘露糖糖型含量增加，然而細胞培養物之屬性(諸如容積產率、細胞活力及/或密度)降低。增加葡萄糖濃度會改良培養物屬性，但降低高甘露糖糖型含量。
本發明提供一種藉由使用低濃度或有限濃度之葡萄糖與替代碳源(尤其半乳糖或蔗糖)之組合增加高甘露糖糖型(尤其甘露糖5 (Man5))，從而實現所要產品品質屬性同時維持某些細胞培養參數(諸如容積產率、細胞活力及/或密度)之所要程度的方法。如本文中所述，葡萄糖因降低細胞培養基中之葡萄糖濃度而受限的細胞培養基中之培養細胞與替代碳源組合產生高甘露糖糖型濃度增加之重組蛋白，同時維持可接受程度之細胞生長、活力及效價。
在細胞培養之生產期期間，所要培養參數(諸如活細胞密度、細胞活力、血球容積比百分比、效價及/或血球容積比調整之效價)可藉由向細胞培養物饋入含有充分葡萄糖(5 g/L至15 g/L或15 g/L以上)之細胞培養基形成，從而形成且維持此等參數。在細胞培養生產操作期間，當希望增加所產生之重組蛋白之高甘露糖糖型含量時，隨後向細胞培養物饋入葡萄糖濃度降低的細胞培養基從而將導致高甘露糖含量之預期增加。該細胞培養基特徵在於較低濃度之葡萄糖(0至8 g/L)與替代碳源(諸如半乳糖或蔗糖)之組合。
決定葡萄糖濃度將需要降低至何種程度之因素包括使用哪種替代碳源及使用多少；細胞培養生產製程；細胞類型及質量及葡萄糖消耗。生物反應器中之細胞質量愈大，細胞培養所消耗之葡萄糖愈多且因此可饋入更多量之葡萄糖，同時仍維持將使Man5糖型濃度產生所要增加之有限葡萄糖狀態。將葡萄糖饋入細胞培養物的方式亦可影響維持將使Man5糖型濃度產生所要增加之有限葡萄糖狀態所需的葡萄糖量。舉例而言，在分批饋入細胞培養物中，可將葡萄糖調配至細胞培養基中且用團式饋料補充。在灌注細胞培養製程中，葡萄糖濃度將取決於灌注培養基之饋入速率(g/L/天)。本文提供兩個實例。另外，可諸如藉由灌注培養物之廢培養基分析量測生產期間培養基中之葡萄糖量。當廢培養基中之葡萄糖量為0 g/L或約0 g/L時，觀測到Man5含量增加。
在葡萄糖濃度降低之情況下，高甘露糖糖型產量增加。然而，低含量葡萄糖可能影響細胞培養系統中之重組蛋白產量。在葡萄糖受限之情況中，容積產量、細胞活力及活細胞密度均可受到不利影響。發現在低葡萄糖或有限葡萄糖時期向細胞培養物添加替代碳源(諸如半乳糖)未使容積產量、細胞活力及活細胞密度之降低減緩或穩定，同時保持增加之Man5糖型。或者，在低葡萄糖或有限葡萄糖時期，蔗糖亦能夠促進高甘露糖糖型產量，釋放一些葡萄糖以維持容積產量、細胞活力及活細胞密度。雖然細胞可消耗半乳糖，但在有限葡萄糖之情況下其不會消耗蔗糖。咸信蔗糖對細胞代謝及分子糖基化具有重量莫耳滲透濃度相關作用。具有在細胞培養期間操縱及維持重組蛋白之高甘露糖糖型含量，同時使產物效價損失降至最低且維持細胞活力之能力表明用於商業治療性蛋白質生產之有價值且容易實施之方法。
本文提供一種培養哺乳動物細胞之方法，其適用於藉由使用有限量之葡萄糖與替代碳源(尤其半乳糖或蔗糖)之組合增加高甘露糖糖型(尤其Man 5)以實現所要產品品質屬性同時維持可接受之產物效價及細胞活力。該方法提供在生長及/或生產期期間，在具有非限制性高葡萄糖濃度(5至15 g/L葡萄糖)之細胞培養基中培養哺乳動物細胞，該葡萄糖混合至培養基調配物中，經團式饋料或連續饋料或其二者補充。當活細胞密度、細胞活力及/或效價達到所要程度時，細胞培養基中葡萄糖之量降低至限制量，使得例如在灌注培養基饋料中，廢培養基中所量測之葡萄糖量為0 g/L或剛超過0 g/L。葡萄糖消耗速率由葡萄糖添加速率及/或細胞培養物質量決定。可饋入高達8 g/L葡萄糖。在一個實施例中，饋入高達6 g/L葡萄糖。在另一實施例中，饋入高達4 g/L葡萄糖。在另一實施例中，饋入高達3 g/L葡萄糖。在另一實施例中，饋入高達2至3 g/L葡萄糖。在又一實施例中，饋入高達2.5 g/L葡萄糖。在另一實施例中，葡萄糖為0 g/L。
結合降低之葡萄糖濃度，細胞培養基含有或補充有濃度高達20 g/L之半乳糖。在一個實施例中，半乳糖濃度為10至15 g/L。在另一實施例中，半乳糖濃度為11.5 g/L。
在另一實施例中，結合降低之葡萄糖濃度，細胞培養基含有或補充有濃度高達48 g/L之蔗糖。在一個實施例中，蔗糖濃度為16至24 g/L。
本文參考寡醣之常用命名法描述碳水化合物部分。使用此命名法之碳水化合物化學之評論可見於例如Hubbard及Ivatt, Ann. Rev. Biochem. 50:555-583 (1981)中。此命名法包括例如表示甘露糖之Man；表示半乳糖之Gal；及表示葡萄糖之Glc。
「細胞培養」或「培養」意謂多細胞有機體或組織外的細胞生長及繁殖。此項技術中已知哺乳動物細胞之適合培養條件。參見例如Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood編, Oxford University Press, New York (1992)。哺乳動物細胞可在懸浮液中培養或同時與固體受質連接。可使用具有或不具有微載體之流體化床生物反應器、中空纖維生物反應器、滾瓶、搖瓶或攪拌槽生物反應器。
在生物反應器中生長哺乳動物細胞培養物。在一個實施例中，使用500 L至20000 L生物反應器。在一較佳實施例中，使用1000 L至2000 L生物反應器。
以無血清培養基中至少0.5 × 10
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直至超過3.0 × 10
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個活細胞/毫升接種生物反應器。在一較佳實施例中，接種為1.0 × 10
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個活細胞/毫升。
一旦接種至生產生物反應器中，則哺乳動物細胞經歷指數生長期。可使用分批饋入法用具有5至8 g/L葡萄糖之無血清饋入培養基之團式饋料維持該生長期。此等補充團式饋入通常在將細胞接種至生物反應器中之後不久，在預期或確定細胞培養物需要饋料時開始。舉例而言，可在培養的第3天或第4天或約第3天或第4天或提前或推後一天或兩天開始補充饋入。培養物在生長期期間可接受兩次、三次或三次以上團式饋料。基礎細胞培養基或團式饋入培養基皆不含有半乳糖或蔗糖。
當細胞進入生長停滯期或生產期時，或細胞培養物已達到所要活細胞密度及/或細胞效價時，中斷分批饋入藥團饋料且開始灌注。灌注培養為一種細胞培養物在接受新鮮灌注饋入培養基同時移除廢培養基的培養方法。灌注可為連續灌注、逐步灌注、間歇灌注或任何此等方式中之任一者或所有的組合。灌注速率可小於每天一工作體積至許多工作體積。較佳地，將細胞保留在培養物中且移除之廢培養基實質上不含細胞或相比培養物具有顯著較少細胞。灌注可藉由包括離心、沈降或過濾之多種方式實現，參見例如Voisard等人, (2003), Biotechnology and Bioengineering 82: 751-65。較佳過濾方法為交替切向流過濾。藉由泵送培養基通過中空纖維過濾器模組保持交替切向流。參見例如美國專利第6,544,424號。中空纖維模組可為微濾器或超濾器。
當分批饋入培養達到預定觸發點(諸如所要細胞活力、細胞密度、血球容積比百分比、效價、血球容積比調整之效價、壽命或其類似物)時，可進行分批饋入與灌注之間的轉換。舉例而言，此轉換可發生在培養第7天或約第7天，但可能提前或推後一天或兩天發生。灌注饋料調配物含有濃度多達15 g/L或15 g/L以上之葡萄糖，但不含半乳糖或蔗糖。在一個實施例中，灌注培養基含有15 g/L葡萄糖。
當灌注培養達到預定觸發點(諸如所要細胞活力、細胞密度、血球容積比百分比、效價、血球容積比調整之效價、壽命或其類似物)時，細胞培養基中之葡萄糖濃度降低。舉例而言，此轉變可在培養第11天開始，但可提前或推後一天或兩天發生。此時，細胞培養物用含有較低濃度葡萄糖之細胞培養基灌注。該較低濃度之葡萄糖將導致廢培養基中所測量之葡萄糖的較低濃度為0 g/L或約0 g/L。可饋入多達8 g/L葡萄糖。在一個實施例中，饋入多達6 g/L葡萄糖。在另一實施例中，饋入多達4 g/L葡萄糖。在另一實施例中，饋入多達3 g/L葡萄糖。在另一實施例中，葡萄糖為2至3 g/L。在又一實施例中，葡萄糖為2.5 g/L。在另一實施例中，葡萄糖為0 g/L。
藉由監測細胞培養物中之葡萄糖濃度(諸如藉由測量廢培養基中之葡萄糖濃度)及調整灌注培養基調配物中之葡萄糖濃度以維持廢培養基中之含量為0 g/L或約0 g/L來維持細胞培養物中之有限葡萄糖狀態。
含有較低濃度葡萄糖之細胞培養基亦可補充濃度多達20 g/L之半乳糖。在一個實施例中，半乳糖濃度為10至15 g/L。在另一實施例中，半乳糖濃度為11.5 g/L。
或者，較低葡萄糖細胞培養基可補充濃度1至48 g/L之蔗糖。在一個實施例中，蔗糖濃度為16至24 g/L。
細胞培養物可繼續維持在補充有半乳糖或蔗糖之有限葡萄糖狀態。細胞培養物可維持在補充有半乳糖或蔗糖之有限葡萄糖狀態直至採集。細胞培養物可恢復至無半乳糖或蔗糖補充物之非葡萄糖有限狀態且整個製程再次開始。
對於生長期及生產期，細胞培養物亦可保持於灌注培養系統中。一旦接種至生產生物反應器中，則哺乳動物細胞經歷指數生長期，在此期間細胞培養物用補充有5至15 g/L葡萄糖之無血清及/或化學限定細胞培養基灌注。細胞培養基不含半乳糖或蔗糖。維持培養直至實現所要觸發點，例如所要活細胞密度、細胞活力、血球容積比百分比、效價、血球容積比調整之效價、壽命或其類似物。此時，細胞培養物用含有有限濃度葡萄糖之細胞培養基灌注。葡萄糖之該有限濃度將導致廢培養基中之葡萄糖濃度為0 g/L葡萄糖或約0 g/L葡萄糖。可饋入高達8 g/L葡萄糖。在一個實施例中，饋入高達6 g/L葡萄糖。在另一實施例中，饋入高達4 g/L葡萄糖。在另一實施例中，饋入高達3 g/L葡萄糖。在另一實施例中，葡萄糖為2至3 g/L。在又一實施例中，葡萄糖為2.5 g/L。在另一實施例中，葡萄糖為0 g/L。
含有有限量葡萄糖之細胞培養基亦可含有濃度高達20 g/L之半乳糖。在一個實施例中，半乳糖濃度為10至15 g/L。在另一實施例中，半乳糖濃度為11.5 g/L。
或者，含有有限量葡萄糖之細胞培養基可含有濃度為1至48 g/L之蔗糖。蔗糖濃度之一個實施例為16至24 g/L。
另外，含有有限量葡萄糖之細胞培養基除半乳糖或蔗糖之外亦可含有麩醯胺酸。麩醯胺酸濃度為1至20 mM且與半乳糖或蔗糖組合。在一個實施例中，麩醯胺酸之濃度為5至10 mM。
活細胞密度可為過渡至生產期或降低細胞培養基中之葡萄糖濃度的信號。亦希望生產期期間之活細胞密度維持在特定範圍或含量。在一個實施例中，活細胞密度為10 × 10
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個活細胞/毫升至至少約60 × 10
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個活細胞/毫升。在另一實施例中，活細胞密度為10 × 10
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個活細胞/毫升至50 × 10
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個活細胞/毫升。在另一實施例中，活細胞密度為10 × 10
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個活細胞/毫升至40 × 10
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個活細胞/毫升。在一較佳實施例中，活細胞密度為10 × 10
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個活細胞/毫升至30 × 10
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個活細胞/毫升。在另一較佳實施例中，活細胞密度為10 × 10
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個活細胞/毫升至20 × 10
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個活細胞/毫升。在另一較佳實施例中，活細胞密度為20 × 10
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個活細胞/毫升至30 × 10
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個活細胞/毫升。在又一較佳實施例中，活細胞密度為20 × 10
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個活細胞/毫升至25 × 10
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個活細胞/毫升。在一甚至更佳實施例中，活細胞密度為至少約20 × 10
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個活細胞/毫升。
血球容積比百分比(PCV%)亦可用作過渡至生產期或開始向細胞培養物饋入含有有限量葡萄糖之細胞培養基的信號。在生產期期間，細胞培養物亦可維持在所要血球容積比。在一個實施例中，血球容積比等於或小於30%。在一較佳實施例中，血球容積比為至少約15%至30%。在一較佳實施例中，血球容積比為至少約20%至25%。在另一較佳實施例中，血球容積比等於或小於25%。在另一較佳實施例中，血球容積比等於或小於15%。在另一較佳實施例中，血球容積比等於或小於20%。在又一較佳實施例中，血球容積比等於或小於15%。
具有降低濃度之天冬醯胺之灌注細胞培養基可用於阻滯細胞生長同時在生產期期間維持產率及活力。在一較佳實施例中，天冬醯胺之濃度為至少約0 mm至至少約5 mm天冬醯胺，參見WIPO公開案第WO 2013/006479號。
如本文所用，「灌注流動速率」為自生物反應器穿過(添加及移除)之培養基的量，通常表示為既定時間內工作體積之一些部分或倍數。「工作體積」係指用於細胞培養之生物反應器體積之量。在一個實施例中，該灌注流動速率為每天一個工作體積或小於每天一個工作體積。灌注饋入培養基可經調配以使灌注養分濃度最大且使灌注速率最小。
如本文所用，「細胞密度」係指既定體積之培養基中的細胞數目。「活細胞密度」係指既定體積之培養基中的活細胞數目，如藉由標準活力分析(諸如錐蟲藍染料排除法)所測定。
如本文所用，「血球容積比(PCV)」(亦稱為「血球容積比百分比(PCV%)」)為細胞所佔體積比細胞培養物總體積之比率，以百分比表示(參見Stettler等人, (2006) Biotechnol Bioeng. 12月20日:95(6):1228-33)。血球容積比為細胞密度及細胞直徑之函數；血球容積比之增加可由細胞密度或細胞直徑或兩者之增加引起。血球容積比為細胞培養物中固體含量之量度。在採集及下游純化期間移除固體。固體愈多意謂在採集及下游純化步驟期間自所要產物分離固體材料之努力愈多。同樣，所要產物可夾雜在固體中且在採集過程期間損失，導致產物產率降低。因為宿主細胞尺寸不同且細胞培養物亦含有死細胞及瀕死細胞及其他細胞碎片，所以與細胞密度或活細胞密度相比，血球容積比為描述細胞培養物中之固體含量的更精確方式。
對於本發明，細胞培養基為適於動物細胞(諸如哺乳動物細胞)在活體外細胞培養中生長之培養基。細胞培養基調配物為此項技術所熟知。通常，細胞培養基包含緩衝劑、鹽、碳水化合物、胺基酸、維生素及痕量必需元素。「無血清」適用於不含動物血清(諸如胎牛血清)之細胞培養基。包括限定培養基之各種組織培養基市場有售，例如可尤其使用以下細胞培養基中之任一者或組合：RPMI-1640培養基、RPMI-1641培養基、杜爾貝科改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、最小補給量之伊格爾必需培養基(Minimum Essential Medium Eagle)、F-12K培養基、Ham's F12培養基、伊思考夫改良杜爾貝科培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、麥考伊5A培養基(McCoy's 5A Medium)、萊博維茨L-15培養基(Leibovitz's L-15 Medium)及無血清培養基(諸如EX-CELL
TM
300系列(JRH Biosciences, Lenexa, Kansas))。此類培養基之無血清版本亦為可用的。視待培養細胞之需求及/或所要細胞培養物參數而定，細胞培養基可補充有額外或增加濃度之組分，諸如胺基酸、鹽、糖、維生素、激素、生長因子、緩衝劑、抗有絲分裂劑、脂質、痕量元素及其類似物。
細胞培養基可無血清、無蛋白質及/或無蛋白腖。「無血清」適用於不含動物血清(諸如胎牛血清)之細胞培養基。「無蛋白質」適用於不含外源添加之蛋白質(諸如運鐵蛋白、蛋白質生長因子IGF-1或胰島素)之細胞培養基。無蛋白質之培養基可含有或不含有蛋白腖。「無蛋白腖」適用於不含外源性蛋白質水解產物(諸如動物及/或植物蛋白質水解產物)之細胞培養基。細胞培養培養液或類似術語係指細胞培養基尤其含有活的及不能存活的哺乳動物細胞、細胞代謝物及細胞碎片(諸如核酸、蛋白質及脂質體)。
細胞培養物亦可補充有含有諸如養分及胺基酸之組分的濃縮饋入培養基，該等組分在細胞培養之生產期過程消耗。濃縮饋入培養基幾乎可基於任何細胞培養基調配物。該濃縮饋入培養基可含有細胞培養基之單個或幾乎所有組分的任何組分，例如約為其正常量的5×、6×、7×、8×、9×、10×、12×、14×、16×、20×、30×、50×、100×、200×、400×、600×、800×或甚至約1000×，參見例如WIPO公開案第WO2012/145682號。
本發明之方法可用於改良多階培養製程中重組蛋白之產量。在多階製程中，細胞在兩個或兩個以上不同階段中培養。舉例而言，細胞可首先在一或多個生長期中在使細胞增殖及活力最大之環境條件下培養，隨後轉移至生產期，使蛋白質產量最大之條件下。在由哺乳動物細胞生產蛋白質之商業製程中，通常存在多個(例如至少約2、3、4、5、6、7、8、9或10個)生長期，其在最終生產培養之前出現在不同培養容器中。生長期及生產期前可存在一或多個過渡期或由一或多個過渡期隔開。在多階製程中，本發明之方法至少可用於商業細胞培養之最終生產期的生長期及生產期期間，儘管其亦可用於前面的生長期。生產期可大規模進行。大規模製程可以至少約100、500、1000、2000、3000、5000、7000、8000、10,000、15,000、20,000 L之體積進行。在一較佳實施例中，生產在500 L、1000 L及/或2000 L生物反應器中進行。生長期可在比生產期高的溫度下進行。舉例而言，生長期可在約35℃至約38℃之第一溫度下進行，且生產期可在約29℃至約37℃，視情況約30℃至約36℃或約30℃至約34℃之第二溫度下進行。另外，蛋白質生產之化學誘導劑(諸如咖啡鹼、丁酸酯及六亞甲基二乙醯胺(HMBA))可在溫度變化的同時、之前及/或之後添加。若在溫度變化之後添加誘導劑，則可在溫度變化之後1小時至5天，視情況在溫度變化之後一天至兩天添加。在細胞生產所要蛋白質時，細胞培養可持續數天或甚至數週。
通常，在最終生產培養(N-x至N-1)之前的細胞培養物用於產生將用於接種生產生物反應器(N-1培養)之種子細胞。該種子細胞密度可對所產生之重組蛋白含量具有積極影響。產物含量傾向於隨種子密度增加而增加。效價之改良不僅依賴於較高種子密度，而且可能受投入生產之細胞的代謝及細胞週期狀態影響。
種子細胞可藉由任何培養方法產生。較佳方法為使用交替切向流過濾灌注培養。N-1生物反應器可使用交替切向流過濾操作以提供高密度之細胞，從而接種生產生物反應器。N-1階段可用於使細胞生長至＞ 90 × 10
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個細胞/毫升之密度。N-1生物反應器可用於產生團式種子培養物或可用作可維持從而以高種子細胞密度接種多個生產生物反應器的滾動式種子培養。生產之生長期的持續時間可在7天至14天範圍內且可經設計以使細胞維持在接種生產生物反應器之前的指數生長期。灌注速率、培養基調配物及時序經最佳化以使細胞以最有利於使其生產最佳之狀態生長且傳遞至生產生物反應器。可實現＞ 15 × 10
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個細胞/毫升之種子細胞密度來接種生產生物反應器。
本發明中所用之細胞株(亦稱為「宿主細胞」)經基因工程改造以表現具有商業或科學重要性之多肽。細胞株通常源自由可在培養物中維持無限時間之初級培養物產生之譜系。基因工程改造細胞株涉及用重組聚核苷酸分子轉染、轉型或轉導細胞，及/或另外改變(例如藉由重組細胞與非重組細胞同源重組及基因活化或融合)，以使宿主細胞表現所要重組多肽。用於基因工程改造細胞及/或細胞株以表現所關注多肽之方法及載體為熟習此項技術者所熟知；例如，多種技術在
Current Protocols in Molecular Biology,
Ausubel等人編(Wiley & Sons, New York, 1988, 每季度更新)；Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989)；Kaufman, R.J.,
Large Scale Mammalian Cell Culture,
1990, 第15頁-第69頁中說明。
動物細胞株源自祖細胞來源於多細胞動物之細胞。動物細胞株之一種類型為哺乳動物細胞株。許多適用於在培養物中生長之哺乳動物細胞株購自American Type Culture Collection (Manassas, Va.)及商業供應商。行業中通常所用之細胞株實例包括VERO、BHK、HeLa、CV1 (包括Cos)、MDCK、293、3T3、骨髓瘤細胞株(例如NSO、NS1)、PC12、WI38細胞及中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。CHO細胞廣泛用於複合重組蛋白(例如細胞激素、凝血因子及抗體)之生產(Brasel等人(1996),
Blood
88:2004-2012；Kaufman等人(1988),
J. Biol Chem
263:6352-6362；McKinnon等人(1991),
J. Mol Endocrinol
6:231-239；Wood等人(1990),
J. Immunol
. 145:3011-3016)。二氫葉酸還原酶(DHFR)缺乏之突變細胞株(Urlaub等人, (1980),
Proc Natl Acad Sci USA
77:4216-4220)、DXB11及DG-44為所要CHO宿主細胞株，因為有效DHFR可選及可擴增基因表現系統允許在此等細胞中高水準重組蛋白表現(Kaufman R. J. (1990),
Meth Enzvmol
185:537-566)。另外，此等細胞容易以黏著或懸浮培養物形式操作，且呈現相對良好之遺傳穩定性。CHO細胞及在其中重組表現之蛋白質已廣泛表徵且已由管理機構批准用於臨床商業製造。
本發明之方法可用於培養表現所關注重組蛋白之細胞。該等經表現重組蛋白可分泌至培養基中，自其中可回收及/或收集該等經表現重組蛋白。另外，可使用已知方法及購自商業供應商之產品自該培養物或組分(例如培養基)純化或部分純化該等蛋白質。接著可「調配」經純化之蛋白質，意謂緩衝劑更換、滅菌、散裝及/或封裝用於最終使用者。醫藥組合物之合適調配物包括
Remington's Pharmaceutical Sciences
, 第18版. 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA中所描述者。
如本文所用，「肽」、「多肽」及「蛋白質」全文可互換使用且係指包含兩個或兩個以上藉由肽鍵彼此接合之胺基酸殘基的分子。肽、多肽及蛋白質亦包括修飾，包括(但不限於)糖基化、脂質連接、硫酸化、麩胺酸殘基之γ-羧化、羥基化及ADP核糖基化。「醣蛋白」係指具有至少一個包括甘露糖殘基之寡醣側鏈之肽、多肽及蛋白質。醣蛋白可與宿主細胞同源，或可與所用宿主細胞異源(亦即外來)，諸如由中國倉鼠卵巢(CHO)宿主細胞產生的人類醣蛋白。多肽可具有科學或商業重要性，包括基於蛋白質之藥物。多肽尤其包括抗體、融合蛋白及細胞激素。肽、多肽及蛋白質是使用細胞培養方法由重組動物細胞株產生，且可稱為「重組肽」、「重組多肽」及「重組蛋白」。該等經表現之蛋白質可在細胞內產生或分泌至培養基中，自該培養基可回收及/或收集該等蛋白質。
可用本發明方法製造之多肽的實例包括包含與以下蛋白質中之一者的全部或部分一致或實質上類似之胺基酸序列的蛋白質：腫瘤壞死因子(TNF)、flt3配位體(WO 94/28391)、紅血球生成素、血小板生成素、降血鈣素、IL-2、血管生成素-2 (Maisonpierre等人(1997),
Science
277 (5322): 55-60)、NF-κB之受體活化因子的配位體(RANKL，WO 01/36637)、腫瘤壞死因子(TNF)相關之細胞凋亡誘導配位體(TRAIL，WO 97/01633)、源自胸腺基質之淋巴細胞生成素、顆粒球群落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF，澳大利亞專利第588819號)、肥大細胞生長因子、幹細胞生長因子(美國專利第6,204,363號)、表皮生長因子、角質細胞生長因子、巨核細胞生長及發育因子、RANTES、人類血纖維蛋白原樣蛋白質2 (FGL2；NCBI登錄號NM_00682；Ruegg及Pytela (1995),
Gene
160: 257-62)生長激素、胰島素、胰島素促生素、胰島素樣生長因子、副甲狀腺激素、包括α-干擾素、γ-干擾素及複合干擾素之干擾素(美國專利第4,695,623號及第4,897471號)、神經生長因子、源自腦之神經營養因子、突觸結合蛋白樣蛋白質(SLP1-5)、神經營養因子-3、升糖素、介白素、群落刺激因子、淋巴毒素-P、白血病抑制因子及抑瘤素-M。其他醣蛋白之描述可見於例如
Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research ，所有卷
(Aggarwal及Gutterman編, Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998)；
Growth Factors: A Practical Approach
(McKay及Leigh編, Oxford University Press Inc., New York, 1993)；及
The Cytokine Handbook. 第 1 卷及第 2 卷
(Thompson及Lotze編, Academic Press, San Diego, CA,2003)中。
另外，本發明之方法將適用於製造包含上述蛋白質中之任一者之受體的全部或部分胺基酸序列之蛋白質、該受體或上述蛋白質中之任一者之拮抗劑，及/或實質上類似於該等受體或拮抗劑之蛋白質。此等受體及拮抗劑包括：腫瘤壞死因子受體之兩種形式(稱為p55及p75之TNFR，美國專利第5,395,760號及美國專利第5,610,279號)、介白素-1 (IL-1)受體(I型及II型；歐洲專利第0460846號，美國專利第4,968,607號及美國專利第5,767,064號)、IL-1受體拮抗劑(美國專利第6,337,072號)、IL-1拮抗劑或抑制劑(美國專利第5,981,713號、第6,096,728號及第5,075,222號)、IL-2受體、IL-4受體(歐洲專利第0 367 566號及美國專利第5,856,296號)、IL-15受體、IL-17受體、IL-18受體、Fc受體、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子受體、顆粒球群落刺激因子受體、抑瘤素-M及白血病抑制因子之受體、NF-κB之受體活化因子(RANK，WO 01/36637及美國專利第6,271,349號)、骨保護素(美國專利第6,015,938號)、TRAIL之受體(包括TRAIL受體1、2、3及4)及包含諸如Fas之死亡結構域的受體，或細胞凋亡誘導受體(AIR)。
可使用本發明製造之其他蛋白質包括包含分化抗原之全部或部分胺基酸序列之蛋白質(稱為CD蛋白質)或其配位體，或實質上與其中任一者類似之蛋白質。該等抗原揭示於
Leukocyte Typing VI
(
Proceedings of the VIth International Workshop and Conference
, Kishimoto，Kikutani等人編, Kobe, Japan, 1996)中。類似CD蛋白質在隨後研討會中揭示。該等抗原之實例包括CD22、CD27、CD30、CD39、CD40及其配位體(CD27配位體、CD30配位體等)。若干CD抗原為TNF受體家族之成員，其亦包括41BB及OX40。該等配位體通常為TNF家族之成員，41BB配位體及OX40配位體亦如此。
酶促活性蛋白質或其配位體亦可由本發明製造。實例包括包含以下蛋白質或其配位體中之一者之全部或部分的蛋白質或與其中一者實質上類似之蛋白質：解離素及金屬蛋白酶結構域家族成員，包括TNF-α轉化酶、各種激酶、葡糖腦苷脂酶、超氧化歧化酶、組織纖維蛋白溶酶原活化因子、因子VIII、因子IX、脂蛋白元E、脂蛋白元A-I、血球蛋白、IL-2拮抗劑、α-1抗胰蛋白酶、上述酶中任一者之配位體，及眾多其他酶及其配位體。
術語「抗體」包括與完整抗體競爭特異性結合之任何同型或子類之免疫球蛋白或其抗原結合區，除非另外規定，否則包括人類、人類化、嵌合、多特異性、單株、多株及寡聚物或其抗原結合片段。亦包括具有抗原結合片段或區域之蛋白質，諸如Fab、Fab'、F(ab')
2
、Fv、雙功能抗體(diabodies)、Fd、dAb、最大抗體、單鏈抗體分子、互補決定區(CDR)片段、scFv、雙功能抗體、三功能抗體(triabodies)、四功能抗體(tetrabodies)，及含有至少一部分免疫球蛋白足以賦予目標多肽特異性抗原結合之多肽。術語「抗體」包括(但不限於)藉由重組方式製備、表現、產生或分離之抗體，諸如自經轉染以表現該抗體之宿主細胞分離的抗體。
抗體之實例包括(但不限於)識別包括(但不限於)上述蛋白質及/或以下抗原之蛋白質中之任一者或組合的抗體：CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD40、CD44、CD52、CD80 (B7.1)、CD86 (B7.2)、CD147、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-7、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-2受體、IL-4受體、IL-6受體、IL-13受體、IL-18受體子單元、FGL2、PDGF-β及其類似物(參見美國專利第5,272,064號及第5,149,792號)、VEGF、TGF、TGF-β2、TGF-βl、EGF受體(參見美國專利第6,235,883號)、VEGF受體、肝細胞生長因子、骨保護素配位體、干擾素γ、B淋巴細胞刺激劑(BlyS，亦稱為BAFF、THANK、TALL-1及zTNF4；參見Do及Chen-Kiang (2002),
Cytokine Growth Factor Rev
. 13(1): 19-25)、C5補體、IgE、腫瘤抗原CA125、腫瘤抗原MUC1、PEM抗原、LCG (其為與肺癌相關表現之基因產物)、HER-2、HER-3、腫瘤相關醣蛋白TAG-72、SK-1抗原、腫瘤相關抗原決定基(其以高含量存在於患有結腸及/或胰臟癌之患者的血清中)，在乳癌、結腸癌、鱗狀細胞癌、前列腺癌、胰臟癌、肺癌及/或腎癌細胞及/或黑素瘤、神經膠質瘤或神經母細胞瘤細胞、腫瘤之壞死核心上表現的癌症相關抗原決定基或蛋白質，整合素α4β7、整合素VLA-4、B2整合素，TRAIL受體1、2、3及4，RANK、RANK配位體、TNF-α、黏附分子VAP-1、上皮細胞黏附分子(EpCAM)、細胞間黏附分子-3 (ICAM-3)、白細胞整合素黏附素、血小板醣蛋白gp IIb/IIIa、心肌肌凝蛋白重鏈、副甲狀腺激素、rNAPc2 (其為因子VIIa組織因子之抑制劑)、MHC I、癌胚抗原(CEA)、α-胎蛋白(AFP)、腫瘤壞死因子(TNF)、CTLA-4 (其為細胞毒性T淋巴細胞相關之抗原)、Fc-γ-1受體、HLA-DR 10 β、HLA-DR抗原、硬化蛋白、L-選擇素、呼吸道融合性病毒(Respiratory Syncitial virus)、人類免疫缺乏病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)、變種鏈球菌(
Streptococcus mutans
)及金黃色葡萄球菌(
Staphlycoccus aureus
)。可使用本發明方法製造之已知抗體的特定實例包括(但不限於)阿達木單抗(adalimumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、英利昔單抗(infliximab)、阿昔單抗(abciximab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、巴匹珠單抗(bapineuzumab)、巴利昔單抗(basiliximab)、貝利木單抗(belimumab)、貝伐珠單抗(briakinumab)、卡那單抗(canakinumab)、賽妥珠單抗(certolizumab pegol)、西妥昔單抗(cetuximab)、可那木單抗(conatumumab)、地諾單抗(denosumab)、依庫珠單抗(eculizumab)、吉姆單抗奧唑米星(gemruzumab ozogamicin)、戈利木單抗(golimumab)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、馬中白木單抗(mapatumumab)、馬帕木單抗(matuzumab)、美泊利單抗(mepolizumab)、莫維珠單抗(motavizumab)、莫羅單抗-CD3 (muromonab-CD3)、那他珠單抗(natalizumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧馬佐單抗(omalizumab)、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕利珠單抗(palivizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、培圖莫單抗(pemtumomab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、羅維珠單抗(rovelizumab)、托珠單抗(tocilizumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、優特克單抗(ustekinumab)、維多珠單抗(vedolizomab)、紮魯木單抗(zalutumumab)及紮木單抗(zanolimumab)。
本發明可用於製造包含例如上述蛋白質中之任一者之重組融合蛋白。舉例而言，包含上述蛋白質中之一者之重組融合蛋白加多聚結構域(諸如白胺酸拉鏈、捲曲螺旋、免疫球蛋白之Fc部分或實質上類似之蛋白質)可使用本發明方法製造。參見例如WO94/10308；Lovejoy等人(1993),
Science
259:1288-1293；Harbury等人(1993),
Science
262:1401-05；Harbury等人(1994),
Nature
371:80-83；Håkansson等人(1999),
Structure
7:255-64。該等重組融合蛋白中特定包括受體之一部分融合至諸如依那西普(etanercept)(p75 TNFR: Fc)及貝拉西普(belatacept)(CTLA4: Fc)之抗體之Fc部分的蛋白質。在另一實施例中為抗體-藥物結合物。
儘管本申請案中所用之術語為此項技術中之標準，但本文提供某些術語之定義以確保申請專利範圍之含義清晰及明確。可以SI接受之形式表示單位、前綴及符號。本文所列舉之數值範圍包括界定範圍之數值且包括及支持所界定範圍內之各整數。除非另外指出，否則術語「一(a/an)」解釋為意謂「中之至少一者」。本文所用之章節標題僅出於組織目的而不應解釋為所述主旨之限制。除非另外指明，否則本文所述之方法及技術通常根據此項技術中熟知之習知方法且如本說明書全文所引用及論述之各種一般及更特定文獻中所述來進行。參見例如Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)及Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)，及Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)。本申請案中所引用之所有文獻或文獻部分以引用的方式明確併入本文中，包括(但不限於)專利、專利申請案、文章、著作及論文。
本發明之範疇不受本文所述之特定實施例限制，該等實施例欲作為本發明之個別態樣之單獨說明，且功能等效方法及組分在本發明之範疇內。實際上，根據前述描述及附圖，除了本文中所示及描述之修正外，本發明之多種修正對熟習此項技術者將變得顯而易知。該等修正欲在隨附申請專利範圍之範疇內。
以下實例顯示所揭示方法之實施例及態樣且不欲為限制。
實例
解決了為了操作高甘露糖糖型含量及整體蛋白質品質用替代碳水化合物物質取代生物反應器系統中之葡萄糖的問題。
實例 1
使用連續葡萄糖饋料及團式半乳糖饋料之分批饋入培養
藉由使用分批饋入法測試不同葡萄糖及半乳糖濃度來評估降低之葡萄糖及替代碳源對細胞培養物生長、效價及產物品質，尤其Man5含量之作用。實驗目的為降低細胞培養基中可用之葡萄糖量，同時藉由半乳糖饋入提供不同碳源。
在1 L無血清細胞培養基之工作體積中，表現重組IgG2抗體之CHO細胞以20e5個活細胞/毫升接種於Twelve 2L Applikon生物反應器中。將培養物維保持在36℃，30%溶解氧(DO)、290 rpm攪拌及6.95之pH值下。在第2天及第5天饋入酪胺酸-胱胺酸補充物，其體積為以初始體積計0.36%。按需添加CO
2
及1M碳酸鈉鹼用於pH值控制。
在第2天、第5天，以初始體積之9%計的9體積團式饋入培養基。
選擇兩因素實驗設計，用細胞培養基中不同量之葡萄糖及半乳糖評估細胞培養效能及產物品質屬性。實驗設計由6個處理組成，用於各處理之重複生物反應器如表1中所示。第一因素為連續葡萄糖饋入(連續葡萄糖)以自第2天起開始每天傳遞3、2或1 g葡萄糖。每天3 g葡萄糖之處理亦接受額外團式葡萄糖饋料以使葡萄糖濃度保持在3 g/L。目的為確保保持3 g/天處理作為陽性對照(從未具有葡萄糖限制)。
第二因素為具有(1+、2+、3+)及不具有(1-、2-、3-)半乳糖(團式半乳糖)之團式饋料。目標為自第2天開始保持細胞培養基中之半乳糖濃度在4 g/L以上。
表1 用於分批饋入實驗之兩因素實驗設計
| 操作 | 連續葡萄糖，g/天 | 團式半乳糖，g/L |
| 719 | 2 | 0 |
| 720 | 3 + 團式葡萄糖 | 0 |
| 721 | 3 + 團式葡萄糖 | 4 |
| 722 | 1 | 0 |
| 723 | 1 | 4 |
| 724 | 2 | 0 |
| 725 | 2 | 4 |
| 726 | 3 + 團式葡萄糖 | 0 |
| 727 | 2 | 4 |
| 728 | 1 | 0 |
| 729 | 3 + 團式葡萄糖 | 4 |
| 730 | 1 | 4 |
在培養操作期間，取每日樣品來評定培養。使用Vi-Cell (Beckman Coulter, Brea, CA)以實驗室規模測定活細胞密度(VCD)及活力。使用VoluPAC (Sartorius, Goettingen, Germany)測定血球容積比。使用Siemens 248血氣分析儀(BGA) (Chiron Diagnostics, CA.)測定pH值、溶解二氧化碳(pCO2)及溶解氧(pO2)。使用YSI型2700 Select Biochemistry分析儀(YSI Incorporated, Yellow Springs, OH)獲得半乳糖濃度。使用Polymedco Polychem分析儀(Polymedco Inc., Cortland Manor, NY)獲得代謝物資料(葡萄糖、乳酸鹽及氨)。使用Advanced Instruments 2020型微滲壓計(Advanced Instruments, Norwood, MA)測定重量莫耳滲透濃度。清液層樣品儲存於-80℃下。在實驗結束時，解凍不含細胞之冷凍清液層樣品且共同提交用於效價及聚糖分析。
使用HPLC分析測定效價。解凍來自不同時間點之細胞培養清液層樣品且在96孔板中用0.2 μm膜再過濾。使用Poros® A/20 2.1 mm D × 30 mm L柱(Applied Biosystems, Foster City, CA)在2 mL/min之流動速率下將樣品注入裝備有280 nm UV偵測之HPLC系統(Hewlett Packard 1100)。使用100 mM磷酸鈉/250 mM亞氯酸鈉及2%乙酸/100 mM甘胺酸之移動相的梯度法用於每5分鐘溶離各蛋白質樣品。
對於聚糖分析，收集細胞培養清液層樣品且藉由蛋白質A純化。經純化之樣品用PNGase-F處理且在37℃下培育2小時以釋放N連接聚糖。在80℃下用2-胺基苯甲酸(2-AA)標記酶促釋放之聚糖75分鐘。接著用Glycoclean S 濾筒移除過量2-AA標籤。蒸發樣品隔夜且用水復原所得乾集結粒用於隨後HILIC (親水性相互作用液相層析)分析。在高有機條件中將聚糖注射且結合至管柱，且用增加梯度之水性甲酸銨緩衝液溶離。使用螢光偵測來監測聚糖溶離且計算主要及次要聚糖物質之相對百分比。
使用連續葡萄糖饋料及團式半乳糖饋料之分批饋入法的結果
接受3 g/天之連續葡萄糖饋料(操作720、721、726及729)之細胞培養物處理亦接受團式葡萄糖饋入，保持其含量高於3 g/L。未接受團式半乳糖饋料之操作720及726通常需要葡萄糖之團式饋料，而接受半乳糖之操作(操作721及729)通常不需要團式葡萄糖饋料。接受1或2 g/天連續葡萄糖饋料之細胞培養物不接受任何額外團式葡萄糖饋料。此等培養物之廢培養基分析顯示不管培養物是否接受團式半乳糖饋料，葡萄糖濃度在第4天均為0 g/L (圖1A)。
接受團式半乳糖饋料(操作721、723、725、727、729及730)之細胞培養物保持半乳糖含量高於2.5 g/L，儘管初始目標為高於4 g/L。(圖1B)當分析半乳糖消耗數時，發現對於具有有限葡萄糖(接受2 g/天或1 g/天連續葡萄糖饋料之操作)或不具有有限葡萄糖(接受3 g/天連續葡萄糖饋料加團式葡萄糖饋料之操作)的培養物，培養物消耗多少半乳糖存在統計學顯著差異。具有有限葡萄糖之培養物平均消耗總共4.60 g半乳糖，而不具有葡萄糖限制之培養物平均消耗3.81 g。
連續葡萄糖饋料及團式半乳糖饋料對活細胞密度及活力具有顯著影響。具有有限葡萄糖(接受2 g/天或1 g/天連續葡萄糖饋料之操作)以及團式半乳糖饋料之培養物保持良好活細胞密度及活力。然而，一旦葡萄糖在第4天達到限制時，未接受團式半乳糖饋料之具有有限葡萄糖(接受2 g/天或1 g/天連續葡萄糖饋料之操作)的培養物不能維持活細胞密度及活力(圖1C及圖D)。
上述資料指示當細胞培養基中之葡萄糖受限時，半乳糖可用作替代碳源。儘管具有有限葡萄糖(接受2 g/天或1 g/天連續葡萄糖饋入之操作)以及團式半乳糖饋料之培養物保持良好活細胞密度及活力，但與不具有葡萄糖限制(接受3 g/天連續葡萄糖饋料之操作)的培養物相比，效價顯著降低，參見圖1E。統計分析展示連續葡萄糖饋入含量對效價的作用最大；團式半乳糖饋料亦顯著，但程度較低。
不管是否存在半乳糖饋料，第7天樣品中之Man5含量與1 g/天至3 g/天之葡萄糖饋料增加成比例降低。有限葡萄糖為導致培養物中Man5增加之唯一統計學顯著因素(圖1F)
實例 2
具有有限葡萄糖、半乳糖作為替代碳源且添加麩醯胺酸之灌注製程
以上分批饋入研究展示限制葡萄糖為導致Man5增加之唯一因素；然而具有有限葡萄糖之培養物不能保持活細胞密度或細胞活力。替代碳源(半乳糖)雖然不導致Man5增加，但經CHO細胞分解代謝，且在添加半乳糖之彼等培養物中保持良好活細胞密度及細胞活力。然而，由於有限葡萄糖含量甚至由於替代碳源存在，效價顯著降低。實現所要產品品質而未顯著改良效價不具商業可行性，與實現顯著效價改良而未實現相當產品品質的情況相同。
為了實現保持或改良效價及實現所要產品品質之目的，在灌注細胞培養物中測試低葡萄糖及替代碳源對細胞培養物效能及Man5含量之作用。實驗設計由3個處理組成，各處理使用重複重複生物反應器。
在第0天，將表現重組IgG2抗體之CHO細胞以1 × 10
6
個活細胞/毫升接種於3 L生產生物反應器中的1300 ml工作體積之含有5至8 g/L葡萄糖的無血清限定細胞培養基中。將培養物保持於36℃、30%溶解氧、400 RPM攪拌下。培養物以分批模式生長三天。廢培養基分析中之葡萄糖濃度在1至8 g/L範圍內。
在第3天及第6天，培養物接受濃縮無血清限定饋入培養基之團式饋料，在第3天接受8%初始工作體積及在第6天接受8%初始工作體積。在第3天、第4天、第5天、第6天、第7天進行團式葡萄糖饋入以使培養物中之葡萄糖目標濃度保持在8 g/L。廢培養基分析中之葡萄糖在1至8 g/L範圍內。
在第7天，以0.48體積/天之灌注速率開始灌注。使用交替切向流灌注及具有30 kDa中空纖維過濾器(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)之過濾系統(Refine Technologies, Hanover, NJ)完成灌注。無血清限定灌注培養基(pH 7.0)含有15 g/L葡萄糖。廢培養基分析中之葡萄糖在3至8 g/L範圍內。
在第11天，轉換成目前含有半乳糖且具有降低量之葡萄糖的無血清限定灌注培養基，參見表2a。灌注培養基中之葡萄糖濃度降低至2 g/L或4 g/L。半乳糖以6 g/L混合至培養基中。視需要使用30%半乳糖儲備溶液之團式饋料以將細胞培養物中之半乳糖保持在4 g/L或4 g/L以上之濃度。
對於此實驗，灌注培養基亦包括5或10 rnM之麩醯胺酸，以確定在麩醯胺酸限制之情況下，麩醯胺酸是否像葡萄糖一樣對活細胞密度、細胞活力、效價及/或Man5含量具有任何作用。文獻表明低麩醯胺酸濃度可對細胞培養物產生負面影響。用此細胞培養基灌注培養物直至第17天採集。
表2a 第11天無血清限定灌注培養基(pH 7.0)中之葡萄糖、半乳糖及麩醯胺酸濃度
| 操作 | 葡萄糖g/L | 半乳糖g/L | 麩醯胺酸mM |
| 79 | 2 | 6 | 10 |
| 81 | 2 | 6 | 10 |
| 82 | 4 | 6 | 10 |
| 83 | 4 | 6 | 10 |
| 88 | 4 | 6 | 5 |
| 89 | 4 | 6 | 5 |
細胞培養特徵展示於圖2中。活細胞密度及活力特徵展示相當之趨勢(圖2A及圖B)。低葡萄糖(2 g/L)及低麩醯胺酸(5 mM)條件下之活力在第15天至第17天展示向下趨勢。然而，廢培養基分析中之麩醯胺酸濃度指示麩醯胺酸在任何測試條件下均不受限制(圖2C)。
出人意料地發現圖2D中所示之血球容積比調整之效價(PCV效價)接近非葡萄糖受限之灌注製程中所見的值。來自此實例中之灌注實驗的效價比僅產生50%效價之實例1的分批饋入法中所見的效價大很多。此等資料表明當在灌注製程中限制葡萄糖時，細胞呈現之生理狀態與其在分批饋入法中所呈現之生理狀態不同。
廢培養基分析顯示用灌注培養基中2 g/L葡萄糖處理之培養物清液層中的葡萄糖濃度在第12天達到零，且用4 g/L葡萄糖處理之培養物清液層中之葡萄糖濃度在第13天達到零，操作83除外(圖2E)。廢培養基分析確認培養物處於有限葡萄糖狀態。
一般而言，藉由廢培養基分析所測定之培養物中之半乳糖濃度保持在4 g/L以上(圖2F)。
表2b顯示當灌注培養基中之葡萄糖濃度降低至2 g/L時，Man5物質增加。時程資料顯示Man5物質隨培養持續時間增加(第15天至第17天)而增加。所有情況相同，當灌注培養基中之葡萄糖濃度增加至4 g/L時，Man5物質相應降低。此等結果表明限制性葡萄糖導致Man5含量增加，且有限狀態可藉由使灌注細胞培養基中之葡萄糖濃度降低至2 g/L或2 g/L以下起始且用廢培養基分析確認。然而，製程變化及細胞質量可影響葡萄糖限制及Man5物質之改變。操作83顯示比接受4 g/L葡萄糖之任何其他操作高的Man5值。在此情況下，與接受2 g/L葡萄糖(操作79及81)之任何培養物相比，操作83具有較高活細胞密度及血球容積比調整之效價(圖2A及2D)，但像操作79及81，如藉由廢培養基分析所量測，其在第12天達到較低葡萄糖濃度。此與接受4 g/L葡萄糖之任何培養物相比均較早(圖2E)。因此，諸如細胞質量及/或製程變化之因素可影響導致有限葡萄糖情況之葡萄糖饋入濃度。在此情況下，其中細胞密度在第12天較高(圖2A)導致廢培養基中之葡萄糖濃度接近0 g/L，即使向細胞培養物饋入高葡萄糖(4 g/L)灌注饋入培養基亦起始有限葡萄糖狀態。一旦葡萄糖受到限制，則Man5含量增加。
表2b 灌注培養基調配物在第11天變化後，第15天及第17天之Man5%
| 操作 | 葡萄糖g/L | 半乳糖g/L | 麩醯胺酸mM | 第15天Man5% | 第17天Man5% |
| 79 | 2 | 6 | 10 | 9.29 | 9.84 |
| 81 | 2 | 6 | 10 | 9.28 | 9.49 |
| 82 | 4 | 6 | 10 | 4.64 | 5.62 |
| 83 | 4 | 6 | 10 | 7.56 | 8.91 |
| 88 | 4 | 6 | 5 | 5.19 | 5.65 |
| 89 | 4 | 6 | 5 | 5.09 | 5.63 |
實例 3
使用降低之葡萄糖及高半乳糖之組合的灌注製程
使用用濃度為0、1.5或3 g/L之葡萄糖調配之無血清限定灌注培養基(pH 7.0)進行實驗。基於上文所述之實驗的總消耗速率，以10、11.5或13 g/L添加半乳糖。葡萄糖及半乳糖皆混合至灌注培養基中，因此可維持培養物而無需葡萄糖或半乳糖之團式饋料。混合降低製程之複雜性且改良一致性。如上所述進行實驗；在第0天至第10天使用相同饋入策略。表3提供在第11天至第17天所使用之灌注培養基調配物之組合。
表 3. 灌注培養基中之葡萄糖及半乳糖之實驗設計。 | 操作 | 葡萄糖g/L | 半乳糖g/L |
| 103 | 3 | 13 |
| 104 | 0 | 10 |
| 105 | 0 | 13 |
| 106 | 0 | 10 |
| 107 | 1.5 | 11.5 |
| 108 | 0 | 13 |
| 109* | 3 | 10 |
| 111 | 3 | 13 |
| 112 | 3 | 10 |
| 113 | 1.5 | 11.5 |
*由於生物反應器操作故障，因此自該等數字排除操作109。
圖3中之細胞培養特徵顯示測試之所有細胞培養條件在第11天轉換之後為葡萄糖受限的(圖3A)，且廢培養基分析中所量測之半乳糖濃度保持在4至8 g/L(圖3B)，其與混合至灌注培養基中之半乳糖濃度成比例。一旦葡萄糖在第12天達到限制，則乳酸鹽含量降至零(圖3C)。在葡萄糖達到限制之前，氨含量在第10天開始增加(圖3D)。極有趣地發現，葡萄糖濃度在第11天開始降低，導致生長、活力及效價較低(圖3E至3G)。此等結果表明有限葡萄糖(非麩醯胺酸限制)引起灌注製程以及實例1中之分批饋入法中之效價降低。同樣，由於葡萄糖含量為2至3 g/L且甚至高達4 g/L，因此導致Man5含量升高，葡萄糖含量對維持較高效價水準亦提供一些幫助。
使用JMP軟體(JMP Inc. Cary, NC)之統計分析揭示葡萄糖濃度為影響效價之唯一統計學顯著(p值＝0.032)因素。半乳糖並非效價之統計學顯著因素(圖4A)。另一方面，葡萄糖及半乳糖皆並非影響Man5物質之統計學顯著因素，但葡萄糖與半乳糖之間的相互作用為統計學顯著的(p值= 0.0613)(圖4B)。半乳糖濃度愈高，有限葡萄糖對Man5物質之作用愈大。
當葡萄糖在0至3 g/L範圍內時，Man5含量整體增加及趨於平衡，且當葡萄糖含量為4 g/L或4 g/L以上時，此含量降低。圖5顯示在第11天、第13天、第15天及第17天，Man5物質百分比增加。對於所有培養條件，Man5物質百分比在第11天始於約2%，且隨後逐漸增加至第17天的10%以上。當葡萄糖變得受限時，在第11天至第13天Man5物質之百分比增加最顯著。
由於葡萄糖影響效價，所以應以最高濃度饋入葡萄糖，該濃度將仍然支持Man5增加，同時基於細胞培養物之條件(諸如細胞質量、細胞培養製程及所用替代碳源)使細胞活力、密度及效價保持在可接受水準。舉例而言，對於具有15至25 × 10
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個細胞/毫升、0至4 g/L之葡萄糖濃度以及10至13 g/L半乳糖之灌注細胞培養物，將引起Man5增加。
實例 4
使用有限葡萄糖及作為替代碳源之蔗糖的灌注製程
蔗糖鑑別為與Man5含量增加有關之另一碳源。在此實驗中，使用與實例3中所述相同之培養條件，除在第11天，葡萄糖濃度為2、4及6 g/L且使用濃度為16、20及24 g/L之蔗糖代替半乳糖。葡萄糖及蔗糖皆混合至灌注培養基中，而在第11天之後就無任一種糖的額外團式饋料，參見表4。
表4. 灌注培養基中之葡萄糖及蔗糖之實驗設計。
| 操作 | 葡萄糖g/L | 蔗糖g/L |
| 153 | 6 | 24 |
| 164 | 2 | 16 |
| 155 | 2 | 24 |
| 156 | 2 | 24 |
| 157 | 4 | 20 |
| 158 | 6 | 16 |
| 159* | 2 | 16 |
| 160 | 6 | 24 |
| 162 | 6 | 16 |
| 163 | 4 | 20 |
*由於第14天生物反應器操作故障，因此自JMP分析排除操作159
圖6A顯示所有細胞培養物條件在第12天均實現有限葡萄糖狀態。藉由廢培養基分析所測定之蔗糖含量顯示細胞培養基中之蔗糖濃度基本上無變化(圖6B)。灌注培養基與廢培養基中之蔗糖濃度之間的1 g/L差源自蔗糖分析可變性及稀釋作用。此資料表明蔗糖未經CHO細胞分解代謝。蔗糖在細胞培養物中用作可影響蛋白質糖基化之高滲應力，參見Schmelzer及Miller, Biotechnol. Prog. (2002) 18:346-353；Schmeizer及Miller Biotechnol. Bioeng (2002) 77 (4) 2月15日；美國專利8,354,105。
由灌注培養基中之葡萄糖濃度自2 g/L增至6 g/L導致活細胞密度、活力及效價略微提高(圖6C、D及F)。一旦葡萄糖在第12天達到限制，則乳酸鹽含量降至零(圖6G)。在葡萄糖達到限制且添加蔗糖之後，氨含量在第11天開始增加(圖6E)。
使用JMP軟體(JMP Inc. Cary, NC)之統計分析揭示葡萄糖濃度(p值= 0.0021)及蔗糖(p值= 0.0823)皆為影響效價之統計學顯著因素(圖7A)。葡萄糖之影響最顯著(圖7B)；蔗糖對效價之影響可作為重量莫耳滲透濃度應力之結果(Schmelzer及Miller, 前述；美國專利8,354,105)。
葡萄糖濃度(p值= 0.001)及蔗糖(p值= 0.0012)皆為影響活力之統計學顯著因素(圖7C)。較高之葡萄糖濃度改良活力，而較高之蔗糖濃度降低活力。葡萄糖為影響Man5物質之唯一統計學顯著因素(p值= 0.019)。當細胞培養基中之葡萄糖濃度在2至6 g/L範圍內時，Man5含量整體增加。
