ES2354610T5

ES2354610T5 - Mejora de la calidad del producto en procedimientos de cultivo de células de mamífero para la producción de proteína

Info

Publication number: ES2354610T5
Application number: ES03808535T
Authority: ES
Inventors: Bernhard Schilling; Scott Gangloff; Dharti Kothari; Kirk Leister; Linda Matlock; Stephen Zegarelli; Christoph Joosten; Jonathan Basch; Sivakesava Sakhamuri; Steven Lee
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2002-12-23
Filing date: 2003-12-18
Publication date: 2020-09-14
Anticipated expiration: 2023-12-18
Also published as: ES2354610T3; KR101088223B1; US20050084933A1; CN100402660C; AU2003303394B2; MXPA05006522A; US7332303B2; BR0316882A; TWI328614B; CA2508925A1; EP1576182B1; TW200504221A; JP2006511224A; ATE488600T1; CY1111358T1; JP4496086B2; EP1576182A4; IL168873A; EP1576182A2; KR20050103466A

Description

DESCRIPCIÓN

Mejora de la calidad del producto en procedimientos de cultivo de células de mamífero para la producción de proteína

La presente invención reivindica prioridad sobre la solicitud provisional de Estados Unidos N° 60/436.050 presentada el 23 de diciembre de 2002, que se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos métodos y procedimientos para cultivar células de mamífero que producen un producto proteico, preferentemente un producto proteico glicosilado con mayor y mejor contenido en ácido siálico. El rendimiento de los métodos y procedimientos del cultivo celular en sus diversos aspectos tiene como resultado un producto de alta cantidad y calidad, medido mediante el contenido en ácido siálico.

Antecedentes de la invención

Preferentemente se usan cultivos de células animales, principalmente cultivos de células de mamífero, para la expresión de proteínas glicosiladas producidas de forma recombinante para aplicaciones terapéuticas y/o profilácticas. Los patrones de glicosilación de las glicoproteínas recombinantes son importantes porque las cadenas laterales de oligosacáridos de las glicoproteínas afectan a la función proteica, así como a las interacciones intramoleculares entre las diferentes regiones de una proteína. Dichas interacciones intramoleculares están implicadas en la conformación de la proteína y la estructura terciaria de la glicoproteína. (Véase, por ejemplo, Wittwer y col., 1990, Biochemistry, 29: 4175-4180; Hart, 1992, Curr. Op. Cell BioI., 4:1017-1023; Goochee y col., 1991, Bio/Technol., 9:1347-1355; y R.B. Parekh, 1991, Curr. Op. Struct. BioI., 1:750-754). Además, los oligosacáridos pueden funcionar dirigidos a un polipéptido concreto frente a ciertas estructuras basadas en receptores de hidratos de carbono celulares específicos. (M. P. Bevilacqua y coI., 1993, J. Clin. Invest., 91:379-387; R.M. Nelson y coI., 1993, J. Clin. Invest., 91:1157-1166; K.E.I\lorgard y coI., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1068-1072; y Y. Imai y coI., 1993, Nature, 361-555-557).

Se sabe que el componente de ácido siálico terminal de una cadena lateral de oligosacáridos glicoproteicos tiene un efecto sobre diversos aspectos y propiedades de una glicoproteína, incluidas absorción, solubilidad, estabilidad térmica, semivida en suero, aclaramiento del suero, así como su estructura/comportamiento físico y químico, y su inmunogenicidad. (A. Varki, 1993, Glycobiology, 3:97-100; R.B. Parekh, Id., Goochee y coI., Id., J. Paulson y col., 1989, TIBS, 14:272-276; y A. Kobata, 1992, Eur. J. Biochem., 209:483-501; E.Q. Lawson y coI., 1983, Arch. Biochem. Biophys., 220:572-575; y E. Tsuda y coI., 1990, Eur. J. Biochem., 188:405-411).

En general, los niveles de expresión proteica en sistemas basados en cultivo de células de mamífero son considerablemente menores que en sistemas de expresión microbiana, por ejemplo sistemas de expresión en bacterias o levaduras. No obstante, las células bacterianas y de levaduras están limitadas en su capacidad para expresar de forma óptima productos proteicos de alto peso molecular, para plegar adecuadamente una proteína que tenga una estructura estérica compleja y/o para proporcionar las modificaciones postraduccionales necesarias para madurar una glicoproteína expresada, de modo que afecta a la inmunogenicidad y tasa de aclaramiento del producto.

Como consecuencia de las limitaciones del cultivo de células animales o de mamífero, particularmente de células animales o de mamífero que producen productos recombinantes se ha investigado la manipulación de diversos parámetros, incluidos el empleo de vasos de cultivo a gran escala; alterando las condiciones básicas de cultivo, tales como la temperatura de incubación, la concentración de oxígeno disuelto, el pH y similares; el uso de diferentes tipos de medios y aditivos del medio; e incrementando la densidad de las células cultivadas. Además, el desarrollo de un procedimiento para cultivos de células de mamífero se beneficiaría de los avances en la capacidad de extender los tiempos de ciclo para incrementar la concentración del producto final al tiempo que se mantiene una elevada calidad del producto. Un importante parámetro de la calidad del producto es el grado y finalización de la estructura de glicosilación de un producto polipeptídico, usándose habitualmente el contenido en ácido siálico como medida de la calidad de la glicoproteína.

Los tiempos de ciclo de los procedimientos de los cultivos celulares, en particular los procedimientos no continuos, normalmente están limitados mediante la restante viabilidad de las células, que habitualmente disminuye con el tiempo del ciclo. Por tanto, se desea la máxima extensión posible de viabilidades celulares elevadas. Los problemas de la calidad del producto se refieren también ofrecen una motivación para minimizar las disminuciones en la densidad de células viables y mantener una elevada viabilidad celular, ya que la muerte de las células puede liberar sialidasas en el sobrenadante del cultivo, que podrían reducir el contenido en ácido siálico de la proteína expresada. Los problemas de la purificación de proteínas ofrecen otra motivación más para minimizar las disminuciones de la densidad de células viables y mantener una viabilidad celular elevada. La presencia de restos celulares y el contenido en células muertas en el cultivo pueden afectar de forma negativa a la capacidad de aislar y/o purificar el producto proteico al final del ciclo del cultivo. Manteniendo las células viables durante un mayor periodo de tiempo en cultivo se produce una reducción concomitante de la contaminación del medio de cultivo por las proteínas y enzimas celulares, por ejemplo proteasas y sialidasas celulares, que pueden producir una degradación y, en último término, la reducción de la calidad de la glicoproteína deseada producida por las células.

Se han investigado varios parámetros para conseguir una elevada viabilidad celular en los cultivos celulares. Un parámetro implicó una única disminución de la temperatura del cultivo tras el cultivo inicial a 37°C (por ejemplo, Roessler y coI., 1996, Enzyme and Microbial Technology, 18:423-427; patentes de EE.UU. n° 5.705.364 y 5.721.121 de T. Etcheverry y col., 1998; patente de EE.UU. 5.976.833 de K. Furukawa y col., 1999; la patente de EE.UU. n° 5.851.800 de L. Adamson y col.; el documento WO 99/61650 y el documento WO 00/65070 de Genentech, Inc.; el documento WO 00/36092 de Biogen, Inc.; y la patente de EE.UU. n° 4.357.422 de Girard y col.).

Otros parámetros investigados implicaron la adición de componentes al cultivo. Se ha mostrado que el inhibidor del factor de crecimiento suramina evitaba la apoptosis durante el crecimiento exponencial de las células CHO K1:CycE (Zhangi y col., Biotechnol. Prog. 2000, 16, 319-325). No obstante, la suramina no protegía contra la apoptosis durante la fase de muerte. Como resultado, la suramina pudo mantener una viabilidad elevada durante la fase de crecimiento, pero no permitió una extensión de la longevidad del cultivo. Los mismos autores informan que para la línea celular CHO 111-10PF, el sulfato de dextrano y el polivinilsulfato pudieron, de forma similar a la suramina, incrementar el día 3 la densidad de células viables y la viabilidad respecto al cultivo control. No obstante no se notificó el efecto del sulfato de dextrano o del polivinilsulfato durante la fase de muerte. También se informó de que la suramina, el sulfato de dextrano y el polivinilsulfato eran eficaces en la prevención de la agregación celular.

El medio de cultivo de células animales se ha suplementado con heparina con el fin de adaptar las líneas celulares dependientes del anclaje a las condiciones de la suspensión (p. ej., la patente de EE.UU. n° 5,348.877 de McKenna y Granados, 1994). También se sabe que la heparina se une a factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento similar al EGF de unión a heparina (HB-EGF; Raab y Klagsbrun, Biochim. Biophys. Acta 1997, 1333, F179-F199). Se ha notificado que los proteoglucanos de sulfato de heparan de superficie celular (HSPG) potencian la unión de HB-EGF y la bioactividad para ciertos tipos de células, incluidas las células CHO salvajes (Raab and Klagsbrun, 1997). [El sulfato de heparan solo difiere de la heparina en que tiene menos grupos N-sulfato y O-sulfato y más grupos N-acetilo (McKenna and Granados, 1994). Para los fines de esta divulgación, la heparina y el sulfato de heparán se consideran equivalentes y, de forma genérica, se denominarán heparina.] Se ha propuesto, para el factor de crecimiento de unión a heparina FGF-2, que la unión a HSPG aumenta la concentración local de FGF-2 sobre la superficie celular, lo que a su vez aumenta la probabilidad de que FGF-2 se una a los receptores tirosina cinasa de las células (Raab y Klagsbrun, 1997). Se ha mostrado que el polisulfato de pentosán puede bloquear la acción de los factores de crecimiento de unión a la heparina en células cultivadas (Zugmaier y col. J. Nat. Cancer Inst. 1992, 84, 1716-1724.

La literatura de patentes sobre el uso de sulfato de dextrano en cultivos de células animales atañen a la suplementación de un medio con sulfato de dextrano con el fin de: 1) Mejorar la tasa de crecimiento e incrementar el número de duplicaciones de la población antes de la senescencia para las células endoteliales humanas (patentes de EE.UU. n° 4.994.387 y 5.132.223 de Levine y col., 1991, 1992); 2) Incrementar el rendimiento de proteína recombinante en líneas de células de mamífero (patentes de EE.UU. n° 5.318.898 de Israel, 1994); 3) Inducir la suspensión de una célula en líneas celulares de insecto (patentes de EE.UU. n° 5.728.580 de Shuler y Dee, 1996); 4) Incrementar la actividad estimuladora del crecimiento del factor de crecimiento de hepatocitos y suprimir su degradación (patentes de E.E.U.U. n° 5.545.722 y 5.736.506 de Naka, 1996 y 1998); 5) Incrementar la densidad de células viables y la expresión de proteína recombinante (documento WO 98/08934 de Gorfien y coI., 1997).

En todos los casos notificados en referencia a la presencia o suplementación de un medio con sulfato de dextrano, el sulfato de dextrano estaba presente durante todo el tiempo de cultivo en dicho medio dado. En ningún caso se notificaron los beneficios de una adición retardada. Además, nunca se ha notificado que el sulfato de dextrano pueda retrasar el inicio de la fase de muerte, extender la fase de crecimiento o detener la fase de muerte.

Al aumentar la concentración del producto en el cultivo, en los procedimientos del cultivo celular se puede observar que la calidad del producto disminuye, tal como se determina mediante el contenido medido en ácido siálico de la glicoestructura del oligosacárido. Normalmente existe un límite inferior de un contenido aceptable en ácido siálico tal como determinan los estudios de aclaramiento del fármaco. La abundancia elevada de una proteína producida por las células en cultivo, óptimamente se acompaña de una calidad elevada de la proteína que, en último término, se recupera para un uso previsto. Esta elevada calidad proteica se correlaciona con el grado y finalización de la estructura de glicosilación de una proteína, usándose habitualmente el contenido en ácido siálico como medida de estos parámetros.

Se ha notificado que la adición de D-galactosa (4 g/l) al medio basal de un cultivo celular a pequeña escala, por ejemplo biorreactores de 2 litros (2 l), incrementaba la galactosilación de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal (AcMo) producido por las células cultivadas. (S. Weikert y coI., "Engineering CHO Cells to Maximize Sialic Acid Content of Recombinant Protein", presentación en la Reunión "Protein Expression" patrocinada por el Cambridge Healthtech Institute, 5-6 de abril de 2001, McLean, VA). Como se ha notificado, se proporcionó galactosa en forma de aditivo de una vez en los cultivos a pequeña escala y no como aditivo del medio de alimentación a lo largo de todo el periodo de cultivo. El informe no contiene reconocimiento de los obstáculos implicados en la sialilación de una glicoproteína producida en cultivos mantenidos a gran escala (p. ej., mayor de 2 l).

El documento WO 01/59075 A1 (Genentech, Inc.) divulga un procedimiento para mejorar o potenciar la sialilación de glicoproteínas introduciendo en las células en cultivo una secuencia de ácido nucleico que codifica una UDP-GlcNac2-epimerasa mutada, que es una enzima limitante de la velocidad en la vía biosintética de un azúcar nucleotídico específico, ácido siálico CMP. De un modo similar, X, Gu y D. Wang (1998, Biotech. Bioeng., 58(6):642-648) describen la complementación del medio de cultivo con ManNac, un precursor específico de la síntesis del ácido siálico, para aumentar la disponibilidad de CMP-ácido siálico y mejorar la sialilación del producto.

De un modo similar al documento WO 01/59075 A1, X. Gu y D.I.C. Wang (1998, Biotech. Bioeng., 58(6):642-648) divulgan que la complementación del medio de cultivo con N-acetilmanosamina (ManNAc) aumentaba el conjunto CMP-ácido siálico en las células y, en ultimo término, el contenido en ácido siálico de la glicoproteína IFN-y humana producida de forma recombinante en cultivos de escala de 20 ml. La complementación con ManNAC implicó una adición inicial de este componente a los cultivos antes del análisis de la sialilación del producto producido después de 96 horas de cultivo.

El documento WO 01/59089 A2 (Genentech, Inc.) divulga la potenciación de la actividad de CAD intracelular en las células productoras de glicoproteína que se han hecho resistentes a los inhibidores de CAD. Esta silicita internacional publicada divulga que CAD se refiere al complejo polipeptídico multienzimático (carbamoil fosfato sintetasa (CPS II), aspartato transcarbamoilasa y dihidroorotasa) que cataliza las primeras tres reacciones en la biosíntesis de novo de pirimidinas, particularmente de UMP, que se convierte en UTP. Se ha notificado que las células resistentes a CAD tienen mayores conjuntos de UTP y mayores niveles de UDP-galactosa junto con un incremento de la glicosilación de los productos proteicos; la UDP-galactosa es un sustrato conocido en la vía de glicosilación.

Los productos proteicos producidos de forma recombinante que se glicosilan y sialilan de forma adecuada se están convirtiendo cada vez más en importantes médica y clínicamente para usar como terapéuticas, tratamientos y profilácticos. Por tanto, el desarrollo de procedimientos de cultivo celular fiables que alcanza económica y eficientemente una mayor concentración del producto proteico final, junto con un nivel elevado de la calidad del producto, tal como se determina mediante el contenido en ácido siálico, cumple un objetivo tanto deseado como necesario en la técnica.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona nuevos procedimientos para la producción de proteína, preferentemente productos proteicos recombinantes, más preferentemente productos glicoproteicos, mediante cultivos de células animales o de mamíferos. Los procedimientos de cultivo celular de la presente invención alcanzan de forma ventajosa un contenido en ácido siálico mayor y potenciado del producto glicoproteico producido por las células cultivadas a través del uso de una nueva estrategia de alimentación recién desarrollada que comprende la adición al cultivo de D-galactosa.

Es un aspecto de la presente invención proporcionar procedimientos de cultivo celular para la producción de los productos proteicos, preferentemente productos glicoproteicos, y, más preferentemente, productos glicoproteicos recombinantes, en los que el contenido siálico de las glicoproteínas está incrementando y potenciado por las condiciones de cultivo y los parámetros utilizados en los procedimientos de cultivo. De acuerdo con un aspecto preferido de la presente invención, el contenido siálico de las glicoproteínas producidas se incrementa y potencia mediante el uso de un procedimiento de alimentación en el que D-galactosa se añade al cultivo en una alimentación, preferentemente en un medio de alimentación. De acuerdo con un aspecto concreto y relacionado de la presente invención, D-galactosa se suministra diariamente a las células durante todo el periodo de cultivo, lo que condice a un incremento del contenido en D-galactosa del producto y a la adición a la glicoestructura de más restos de ácido siálico, de modo que aumenta la calidad del producto glicoproteico final.

Es otro aspecto de la presente invención proporcionar un procedimiento eficaz de invertir el problema de descenso de la sialilación de la glicoproteína, que con frecuencia acompaña a la producción escalada de proteína con un reactor de mayor escala, por ejemplo volumen del cultivo celular y tamaño del reactor. El procedimiento de alimentar cultivos a gran escala de células productoras de producto glicoproteico con sialilación de cantidades eficaces de D-galactosa permite una inversión del “efecto a escala" mencionado en lo que antecede. También se consigue la producción de grandes cantidades de glicoproteína altamente sialilada por parte de las células, con independencia de la escala del reactor.

Es otro aspecto de la presente invención proporcionar un procedimiento para incrementar la sialilación de la glicoproteína producida por las células cultivadas. El procedimiento implica la adición de galactosa, preferentemente D-galactosa, como alimentación, preferentemente a un medio de alimentación. Otro aspecto proporciona un procedimiento de cultivo celular para la producción de proteína en el que se suministra galactosa al cultivo, por ejemplo, cada día o de forma intermitente, como en días alternos, cada tres días, cada cuatro días y similares. El medio de alimentación que contiene D-galactosa se puede añadir a los cultivos una o más veces al día. Regímenes de alimentación preferidos incluyen un bolo diario de alimentación al cultivo con medio de alimentación y una alimentación continua mediante goteo o infusión del medio de alimentación en los cultivos celulares. En otros aspectos se puede añadir D-galactosa al cultivo a cualquiera de los intervalos mencionados anteriormente de algún modo distinto de en un medio de alimentación. Como ejemplos no limitantes, la D-galactosa se puede añadir al cultivo en un medio o medio de cultivo distinto a un medio de alimentación o la D-galactosa se puede añadir al cultivo en agua. Como ejemplo no limitante, el cultivo puede ser alimentado con D-galactosa y también ser alimentado con un medio de alimentación, es decir se puede alimentar a más de una composición.

En otro de sus aspectos, la presente invención proporciona un procedimiento de cultivo celular para incrementar la producción de proteína y el contenido en ácido siálico de la glicoproteína producida. El procedimiento además mantiene y sostiene un nivel elevado de sialilación de la proteína producida, así como la viabilidad celular. Este aspecto de la invención abarca una forma de realización en la que se emplean los procedimientos de cultivo que implican dos o más cambios de temperatura durante el periodo de cultivo celular junto con alimentación de los cultivos con D-galactosa. En este aspecto, los procedimientos de cultivo celular con cambio de temperatura sostienen una elevada viabilidad celular del cultivo durante la duración del ciclo de cultivo. Los dos o más cambios de temperatura pueden también permitir que las células se mantengan en cultivo durante un periodo de tiempo que puede extenderse de forma ventajosa el ciclo de cultivo para alcanzar un mayor título y elevada calidad del producto deseado, como se caracteriza mediante el contenido en ácido siálico. Los procedimientos que implican dicho ciclo de cultivo ampliado comprenden, por ejemplo, un periodo de cultivo celular total de dos, tres o cuatro semanas o más (aproximadamente de 14 a 30 días, o más), en comparación con un periodo de cultivo convencional o de dos semanas (aproximadamente 10-14 días). Como recientemente proporcionan los procedimientos de cultivo celular de la presente invención, una combinación de los cambios de temperatura y alimentación de las células con D-galactosa, preferentemente en un medio de alimentación y, preferentemente, a diario, tiene como resultado un procedimiento potenciado para la producción de mayor y mejor cantidad y calidad de producto glicoproteico sialilado por las células en cultivo. El procedimiento es particularmente ventajoso para cultivos celulares discontinuos.

En otros diversos aspectos de la presente invención, los cambios de temperatura en múltiples etapas, preferentemente cambios de temperatura cronometrados en múltiples etapas que comprenden dos o más cambios de temperatura descendentes, se usan en el cultivo de células de mamífero para producir un producto proteico deseado, particularmente un producto glicoproteico. Dos o más cambios de temperatura (es decir, al menos dos), que se pueden realizar después de la fase de crecimiento del cultivo, comprenden los procedimientos de este aspecto de la invención. Con los al menos dos cambios de temperatura, preferentemente con incrementos de aproximadamente 4 días entre los cambios, se puede conseguir un rendimiento alto de proteínas con un contenido concomitante alto en ácido siálico del producto proteico deseado. Los múltiples cambios de temperatura que comprenden los procedimientos de cultivo pueden alcanzar una cantidad y calidad elevadas del producto proteico, así como viabilidad celular sostenida durante un periodo de cultivo. Un parámetro preferido asociado con los procedimientos de cultivo celular con cambio de temperatura tal como se describe en la presente memoria descriptiva es la alimentación de los cultivos con D-galactosa, preferentemente con medio de alimentación suplementado de modo que contenga D-galactosa. Lo más preferido es un régimen de alimentación diario.

De acuerdo con los procedimientos de cultivo celular con cambio de temperatura de la presente invención, la combinación de un segundo, tercero, cuarto o más cambio de temperatura descendente con un primer cambio de temperatura permite que los cultivos celulares mantengan una viabilidad celular alta y proporciona, en una forma de realización de la invención, una fase de producción extendida durante la cual aumenta el título del producto proteico y la calidad del producto, caracterizada por el contenido en ácido siálico, permanece alta hasta el final del ciclo de cultivo.

Un ciclo de cultivo tal como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere al periodo de cultivo, preferentemente a todo el periodo de cultivo. Como se proporciona en la presente invención, la alimentación de un cultivo celular durante un ciclo que no comprende cambios de temperatura, o solo un único cambio de temperatura, con D-galactosa, preferentemente con un medio de alimentación que contiene D-galactosa, alcanza una elevada cantidad y calidad del producto proteico, medido mediante sialilación del producto producido. Para un ciclo de cultivo que comprende dos o más cambios de temperatura, como la presente invención proporciona recientemente, la alimentación de las células con medio de alimentación que contiene D-galactosa durante el ciclo de producción condujo a un incremento del contenido en ácido síálico de la glicoproteína producida. (Véase, por ejemplo, la FIG.1 en la que se empleó una alimentación en bolo diario). La longitud de un ciclo de cultivo entero puede durar tan poco como justo después del segundo cambio de temperatura (por ejemplo, aproximadamente 10-14 días) hasta aproximadamente de 28 a 30 días o más. Para un ciclo de cultivo que comprende tres (o más) cambios de temperatura, la longitud de un ciclo de cultivo entero puede durar tan poco como justo después del tercero (o último) cambio de temperatura (por ejemplo, de aproximadamente 14 a 21 días) hasta aproximadamente de 28 a 30 días o más. Por tanto, de acuerdo con los procedimientos de la presente invención, las células se pueden cultivar para un periodo de ciclo total superior a 10 días, superior a 14 días o superior a 21 días. Preferentemente, el ciclo de cultivo dura al menos de aproximadamente 10 a 14 días hasta aproximadamente 21 a 30 días, o más.

El ciclo de cultivo total puede comprender cambios de temperatura de dos, tres, cuatro o más etapas. Como ejemplo no limitante, un cambio de temperatura de dos etapas se lleva a cabo del siguiente modo: La temperatura del cultivo se mantiene inicialmente a 37°C, o a caso 37°C, desde el día 0 hasta aproximadamente el día 6; desde aproximadamente el día 6 hasta aproximadamente el día 10, la temperatura del cultivo se mantiene a 34°C, o casi a 34°C; y de aproximadamente el día 10 en adelante, por ejemplo hasta aproximadamente el día 14 a 28, hasta aproximadamente el día 14 a 18 o hasta el final del ciclo de cultivo, la temperatura del cultivo se mantiene a 32°C, o casi a 32°C. Un procedimiento de cultivo de cambio de temperatura de tres etapas de acuerdo con la presente invención comprende el siguiente formato de ejemplo no limitante: la temperatura del cultivo celular se controla a 37°C, o casi a 37°C desde el día 0, hasta aproximadamente el día 6; desde aproximadamente el día 6 hasta aproximadamente el día 10, la temperatura del cultivo se mantiene a 34°C, o casi a 34°C; desde aproximadamente el día 10 hasta aproximadamente el día 14, la temperatura del cultivo se mantiene a 32°C, o casi a 32°C; y desde aproximadamente el día 14 en adelante, por ejemplo desde aproximadamente el día 21 hasta el día 30, o mayor, es decir hasta el final del ciclo, la temperatura del cultivo se mantiene a 30°C, o a casi 30°C.

Por tanto, el empleo de los presentes procedimientos de cultivo celular que comprenden dos o más cambios de temperatura en los que se consigue una producción de proteína de alta cantidad y calidad es beneficioso no solo para los ciclos de cultivo que tienen duraciones “más cortas”, por ejemplo estándar (p. ej., de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 14 días), sino también para los ciclos de cultivo que pueden resistir más que el ciclo de producción estándar. Dichos ciclos de cultivo de mayor duración se consiguen porque los procedimientos de la presente invención proporcionan una extensión de la fase de producción inicial o estándar de la producción de proteínas por las células cultivadas (la fase de producción inicial o estándar se produce, en general a aproximadamente los días 6 a 14). Por ejemplo, empleando dos, tres o más cambios de temperatura en el ciclo de cultivo de acuerdo con la presente invención se puede mantener una elevada calidad y cantidad de la producción proteica y la viabilidad celular y sostener durante un tiempo total del ciclo de aproximadamente 10-14 días hasta un tiempo total del ciclo de aproximadamente 21 a 28 días o más, en comparación con la producción de proteína y la calidad del producto en cultivos que no emplean cambios de temperatura o, como máximo, un cambio de temperatura.

En otros de sus aspectos, la presente invención proporciona procedimientos de cultivo celular que comprenden más de dos o tres cambios de temperatura tal como se ha descrito con anterioridad. En tales ciclos de cambio de temperatura de múltiples etapas, las células se cultivan esencialmente como se ha descrito para un periodo de cultivo de tres etapas y se realizan cambios de temperatura descendentes adicionales hasta el fin del periodo de cultivo. Por ejemplo, se puede llevar a cabo un cuarto cambio descendente de la temperatura, es decir disminución de la temperatura, tras el tercer periodo de cultivo con cambio de temperatura, en el que la temperatura del cultivo celular se varía adicionalmente de aproximadamente 30°C a aproximadamente 28°C o 29°C, preferentemente aproximadamente 29°C, aproximadamente los días 15-19, preferentemente el día 18, desde el inicio del cultivo. En el procedimiento de cultivo celular se pueden incluir cambios de temperatura adicionales, en el que las células se mantienen a una temperatura inferior, por ejemplo < 29°C, para extender más la producción de proteína hasta el final del ciclo, preferentemente durante más de 28-30 días. En todos los casos, la proteína producida por las células al final del periodo de cultivo se suele recuperar, por ejemplo aislar y/o purificar sustancialmente, empleando las técnicas de la práctica habitual en la técnica tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Además, el contenido en ácido siálico se evalúa mediante procedimientos convencionales.

En un aspecto concreto, la presente invención proporciona un procedimiento (o método) en el que se potencia el título final del producto y el contenido en ácido siálico de la glicoproteína producida es superior, mediante el uso de un procedimiento de cambio de temperatura de dos o más etapas. De acuerdo con este aspecto concreto, la combinación de dos o más cambios de temperatura programados sostiene una elevada viabilidad celular del cultivo, de modo que permite una extensión de la fase de producción durante la cual aumenta el título del producto, preferentemente del producto recombinante, y la calidad del producto, caracterizada por el contenido en ácido siálico, se mantiene a un nivel elevado. Dicho cambio de temperatura de dos o más etapas puede minimizar el compromiso predominante entre el título de proteína y el contenido en ácido siálico en la producción del producto durante el procedimiento del cultivo celular. Por tanto, los cambios de temperatura proporcionan un efecto positivo sobre la potenciación de un importante parámetro para el funcionamiento del procedimiento de cultivo, es decir el producto matemático del “título final” por “ácido siálico final” (“título final x ácido siálico final”). En los procedimientos de cultivo de dos o más etapas, preferentemente las células son alimentadas con medio que contiene D-galactosa en una cantidad que permita niveles elevados de sialilación del producto proteico, incluso en cultivos grandes mantenidos durante amplios periodos de cultivo, por ejemplo superiores a aproximadamente dos semanas o más.

De acuerdo con esto, en otro aspecto concreto para un procedimiento de cultivo de dos etapas como se describe en la presente memoria descriptiva, las células se mantienen en cultivo desde el día 0 hasta, o aproximadamente, el día 6 a una temperatura de 37°C, o de casi 37°C; el día 6 o aproximadamente el día 6, la temperatura del cultivo celular se reduce a 34°C o casi 34°C; y el día 10 o aproximadamente el día 10, la temperatura se reduce de nuevo a 32°C, o casi a 32°C. En un aspecto de tal procedimiento de cambio de temperatura de dos etapas, la fase de producción se extiende más allá de aproximadamente el día 14 y continúa hasta el final del ciclo de cultivo, por ejemplo hasta aproximadamente el día 21 o hasta aproximadamente del día 28 al 30, tiempo durante el cual las células se mantienen en cultivo a la temperatura inferior de 32°C, o casi a 32°C. El producto proteico se puede recuperar al final de la fase de producción extendida como se describe en la presente memoria más adelante.

Es otro aspecto más de la presente invención proporcionar un procedimiento para incrementar la viabilidad de las células en cultivo sometiendo las células a dos o más cambios de temperatura durante el ciclo de cultivo. Una condición, tal como dos o más cambios de temperatura, produce un incremento de la viabilidad celular si la viabilidad celular en el cultivo es mayor durante un periodo de tiempo en presencia de la condición que en ausencia de la condición. De acuerdo con este aspecto, los procedimientos de cultivo celular con dos o más cambios de temperatura tal como se ha descrito permite que las células permanezcan viables durante periodos de tiempo mayores, tal como más allá del periodo de producción estándar. Como se ha comentado en la presente memoria descriptiva, una consecuencia beneficiosa del incremento de la viabilidad celular de las células cultivadas puede ser que se producen mayores cantidades de producto (de calidad alta) al final del periodo de cultivo en condiciones que conducen al mantenimiento de células viables.

Otro aspecto de la presente invención es que el incremento de la viabilidad celular resultante de la práctica de los procedimientos de cultivo con dos o más cambios de temperatura se correlaciona con una disminución de la cantidad de residuos celulares y de los contenidos liberados por células muertas o en procedimiento de morir durante el tiempo de cultivo. La presencia de restos celulares y el contenido en células muertas en el cultivo pueden afectar de forma negativa a la capacidad de aislar y/o purificar el producto proteico al final del ciclo del cultivo. Manteniendo las células viables durante un mayor periodo de tiempo en cultivo se produce una reducción concomitante de la contaminación del medio de cultivo por las proteínas y enzimas celulares, por ejemplo proteasas y sialidasas celulares, que pueden producir una degradación y, en último término, la reducción de la calidad de la glicoproteína deseada producida por las células.

En otros aspectos de la presente invención, los procedimientos de cultivo que implican la adición retrasada de compuesto polianiónico se emplean junto alimentación de los cultivos con D-galactosa. En un aspecto de la presente invención, tanto los procedimientos de cultivo que implican la adición retrasada de compuesto polianiónico como el procedimiento de cultivo que implica dos o más cambios de temperatura se emplean junto alimentación de los cultivos con D-galactosa.

En estos aspectos que implican la adición retardada de compuesto polianiónico al cultivo celular, la adición retardada de compuesto polianiónico consigue incrementar la viabilidad celular. Preferentemente, el compuesto polianiónico es sulfato de dextrano. El compuesto polianiónico se añade al cultivo un tiempo después de la inoculación.

En un aspecto de la invención que implica la adición retardada de compuesto polianiónico, el compuesto polianiónico se añade a un cultivo un tiempo después de la inoculación que es antes del comienzo de la fase inicial de la muerte o que es durante la fase de crecimiento inicial o que es durante la segunda mitad de la fase de crecimiento inicial o que es al final, o aproximadamente al final, de la fase de crecimiento inicial. De acuerdo con este aspecto de la invención, la fase de crecimiento se extiende y/o el inicio de la fase de muerte se retrasa un periodo de tiempo, tal como varios días. De forma adicional, una vez que ha comenzado la fase de muerte, la tasa de muerte se reduce considerablemente.

En otro aspecto, el compuesto polianiónico se añade a un cultivo durante la fase inicial de muerte. De acuerdo con este aspecto de la invención, la muerte celular se detiene durante un periodo de tiempo, tal como varios días.

En otro aspecto preferido de la presente invención y como se describe adicionalmente en la presente memoria descriptiva, los procedimientos de cultivo celular recién desarrollados que implican alimentación con medio de alimentación que contiene D-galactosa son especialmente adecuados para la producción de moléculas de CTLA4 soluble y moléculas mutantes de CTLA4 soluble, tal como CTLA41g y L104EA29Ylg. En formas de realización preferidas, las moléculas de CTLA4 soluble y las moléculas mutantes de CTLA4 soluble se producen con un alta cantidad y calidad en las células huésped sometidas a ingeniería genética para expresar y producir estas proteínas. (Véanse los Ejemplos 1-5). Las formas de realización preferidas de la presente invención abarcan el cultivo de células productoras de CTLA41g y L104EA29Ylg usando múltiples cambios de temperatura combinados con alimentación de los cultivos con medio de alimentación que contiene D-galactosa durante el ciclo de cultivo para conseguir cantidades granes de productos CTLA41g y L104EA29Ylg de alta calidad, tal como determina la medición del ácido siálico en los productos finales. Otras formas de realización preferidas incluyen procedimientos de cultivo con múltiples cambios de temperatura junto con alimentación de los cultivos celulares con medio de alimentación que contiene D-galactosa en una cantidad eficaz para conseguir productos CTLA4lg y L104EA29Ylg que tienen un contenido alto en ácido siálico, tal como se ha descrito en la presente memoria descriptiva. Otras formas de realización preferidas abarcan el cultivo de células productoras de moléculas de CTLA4 soluble y moléculas mutantes de CTLA4 soluble, tal como CTLA41g y L104EA29Ylg, usando la adición retardada de compuesto polianiónico combinada con la alimentación de los cultivos con medio de alimentación que contiene D-galactosa. Otras formas de realización preferidas abarcan el cultivo de células productoras de moléculas de CTLA41g y L104EA29Ylg usando la adición retardada de compuesto polianiónico y múltiples cambios de temperatura combinada con la alimentación de los cultivos con medio de alimentación que contiene D-galactosa.

Otros aspectos, características y ventajas de la presente invención se apreciarán tras leer la descripción detallada de la invención y considerar los dibujos/figuras.

Descripción de los dibujos/figuras

La FIG. 1 muestra los resultados de emplear un régimen de alimentación que comprende D-galactosa en el medio de alimentación durante el procedimiento del cultivo celular a escala de reactor de 50 litros para obtener producto glicoproteico, a saber la proteína de fusión CTLA4Ig. Como se observa a partir de la FIG, 1, el grado de sialilación aumento con una concentración mayor (12,5 g/l) de D-galactosa en el medio de alimentación a escala de reactor de 50 l. Además, un incremento adicional de la concentración de D-galactosa en el medio de alimentación a 20,0 g/l no tuvo efectos positivos sobre la sialilación de la proteína.

La FIG. 2 ilustra el impacto de D-galactosa sobre el título del producto en un ciclo de cultivo celular de 21 días a escala de reactor de 50 l empleando los procedimientos de cultivo y alimentación de la presente invención. Como se observa en la FIG. 2, no se encontró que el incremento del título (es decir, la productividad específica de la célula) se viera significativamente afectado por la adición de D-galactosa.

La FIG. 3 muestra la concentración de D-galactosa residual en el cultivo celular de la invención a la concentración de 12,5 g/l de D-galactosa en el medio de alimentación, que se encontró que era óptica a las escalas de reactor de 50 l y de 5000 l. Durante la fase de producción, cuando el título aumentaba (es decir, los días 6-21), la concentración de D-galactosa residual en el cultivo fue de, preferentemente > 0,25 g/l.

La FIG. 4 ilustra el efecto de escala observado durante el escalado del procedimiento de cultivo celular a 5000 l para la producción de CTLA4Ig. Se encontró que la sialilación de la glicoproteína disminuía con el crecimiento de la escala del reactor.

La FIG. 5 muestra la inversión del efecto de escala tras la adición de 12,5 g/l de D-galactosa en el medio de alimentación con alimentación diaria. Esta técnica de alimentación con D-galactosa permitió la producción de cantidades grandes de CTLA4Ig altamente sialiladas en reactores de producción a gran escala.

La FIG. 6 muestra el impacto de diferentes perfiles de cambios de temperatura sobre la viabilidad celular para células cultivadas a una escala de reactor de 5 litros (5 l). Estos resultados se obtuvieron de experimentos descritos en el Ejemplo 5 de la presente memoria descriptiva. La comparación se realiza entre procedimientos de cultivo que no implican cambios de temperatura (“sin cambios de T”), un único cambio de temperatura (“único cambio de T”) y dos cambios de temperatura descendente (“doble cambio de T”).

La FIG. 7 muestra el impacto de diferentes perfiles de cambios de temperatura sobre la viabilidad celular para células cultivadas a una escala de reactor de 50 litros (50 l). Estos resultados se obtuvieron de experimentos descritos en el Ejemplo 5 de la presente memoria descriptiva. La comparación se realiza entre procedimientos de cultivo que implican tres cambios de temperatura descendentes (“triple cambio de T”) y dos cambios de temperatura descendente (“doble cambio de T”).

La FIG. 8 representa una secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos codificada de un CTLA4lg que tiene un péptido señal, una secuencia de aminoácidos salvaje del dominio extracelular de CTLA4 comenzando en metionina en la posición 1 hasta ácido aspártico en la posición 124 o comenzando en alanina en la posición -1 hasta ácido aspártico en la posición 124, y una región de Ig.

La FIG. 9 representa una secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos codificada de una molécula mutante de CTLA4lg (L104EA29Ylg) que tiene un péptido señal, un dominio extracelular mutado de CTLA4 comenzando en metionina en la posición 1 y finalizando en el ácido aspártico en la posición 124 o comenzando en alanina en la posición -1 y finalizando en ácido aspártico en la posición 124, y una región de Ig.

La FIG. 10 representa la secuencia de ácido nucleico y la secuencia aminoacídica completa codificada del receptor de CTLA4 humano (denominado en la presente memoria CTLA4 “salvaje”) condensado con el péptido señal de la oncostatina M (posición -26 a -2). (patentes de EE.UU. números 5.434.131 y 5.844.095).

La FIG. 11 muestra el impacto de la adición retardada de sulfato de dextrano sobre la densidad de las células viables, la densidad celular total y la viabilidad en un cultivo en el que se añadió dextrano de sulfato al final de la fase de crecimiento inicial. Estos resultados se obtuvieron de experimentos descritos en el Ejemplo 8 de la presente memoria descriptiva. La comparación se establece entre cultivos en los que se añadió sulfato de dextrano al final de la fase de crecimiento inicial y los cultivos en los que no se añadió sulfato de dextrano. Se representan los valores medios; las barras de error representan la desviación estándar.

La FIG. 12 muestra el impacto de la adición retardada de sulfato de dextrano sobre la tasa de mortalidad. Esta es una representación logarítmica de las densidades de células viables en función del tiempo. Estos resultados se obtuvieron de experimentos descritos en el Ejemplo 8 de la presente memoria descriptiva. La comparación se establece entre cultivos en los que se añadió sulfato de dextrano al final de la fase de crecimiento inicial y los cultivos en los que no se añadió sulfato de dextrano. Se representan los valores medios. Las barras de error representan la desviación estándar.

La FIG. 13 muestra el impacto de la adición retardada de sulfato de dextrano sobre la densidad de las células viables, la densidad celular total y la viabilidad en un cultivo en el que se añadió dextrano de sulfato durante la fase inicial de la muerte. Estos resultados se obtuvieron de experimentos descritos en el Ejemplo 9 de la presente memoria descriptiva. La comparación se establece entre un cultivo en el que se añadió sulfato de dextrano durante la fase inicial de la muerte y un cultivo en el que no se añadió sulfato de dextrano.

La FIG. 14 muestra el impacto de la adición retardada de sulfato de dextrano sobre la densidad de las células viables, la densidad celular total y la viabilidad en un cultivo en el que se añadió dextrano de sulfato durante la fase inicial de la muerte. Estos resultados se obtuvieron de experimentos descritos en el Ejemplo 10 de la presente memoria descriptiva. La comparación se establece entre un cultivo en el que se añadió sulfato de dextrano durante la fase inicial de la muerte y un cultivo en el que no se añadió sulfato de dextrano.

La FIG. 15 muestra la densidad de células viables, la densidad celular total y la viabilidad en los cultivos en los que el sulfato de dextrano se añadió el día 0 del cultivo. Estos resultados se obtuvieron de experimentos descritos en el Ejemplo 11 de la presente memoria descriptiva.

La FIG. 16 muestra la densidad de células viables, la densidad celular total y la viabilidad en los cultivos en los que el sulfato de dextrano se añadió a tres tiempos diferentes (día 3, día 4 y día 5) de la fase de crecimiento inicial. Estos resultados se obtuvieron de experimentos descritos en el Ejemplo 12 de la presente memoria descriptiva. La FIG. 17 muestra el impacto de diferentes perfiles de cambio de temperatura sobre la densidad de las células viables. Estos resultados se obtuvieron de experimentos descritos en el Ejemplo 13 de la presente memoria descriptiva. La comparación se realiza entre procedimientos de cultivo que no implican cambios de temperatura (“sin cambios de T”), un único cambio de temperatura (“un cambio de T”) y dos cambios de temperatura descendente (“doble cambio de T”).

La FIG. 18 muestra el impacto de diferentes perfiles de cambio de temperatura sobre la viabilidad. Estos resultados se obtuvieron de experimentos descritos en el Ejemplo 13 de la presente memoria descriptiva. La comparación se realiza entre procedimientos de cultivo que no implican cambios de temperatura (“sin cambios de T”), un único cambio de temperatura (“un cambio de T”) y dos cambios de temperatura descendente (“doble cambio de T”). La FIG. 19 muestra el impacto de diferentes perfiles de cambio de temperatura sobre el título. Estos resultados se obtuvieron de experimentos descritos en el Ejemplo 13 de la presente memoria descriptiva. La comparación se realiza entre procedimientos de cultivo que no implican cambios de temperatura (“sin cambios de T”), un único cambio de temperatura (“un cambio de T”) y dos cambios de temperatura descendente (“doble cambio de T”).

Descripción detallada de la invención

La presente invención describe nuevos procedimientos para la producción de una molécula de CTLA4 soluble en cultivo de células CHO. Los procedimientos de cultivo celular de acuerdo con la presente invención alcanzan un contenido en ácido siálico mayor y potenciado de la glicoproteína producida por las células cultivadas, de modo que proporciona un producto proteico de elevada calidad al final del ciclo de cultivo.

Procedimientos de cultivo que implican alimentación con D-galactosa

La presente invención está dirigida a un procedimiento (procedimiento) mejorado para la preparación de glicoproteínas, particularmente glicoproteínas recombinantes, en cultivos de células de mamífero, en las que el contenido en ácido siálico de las glicoproteínas producidas se incrementa mediante el uso de la estrategia de alimentación recién descrita en la que D-galactosa se añade a los cultivos, preferentemente en un medio de alimentación. La D-galactosa se proporciona a los cultivos celulares de modo que la D-galactosa esté presente en los cultivos en una cantidad que es eficaz para conseguir y mantener una sialilación elevada de la proteína producida hasta el final de un ciclo de cultivo. Como se ha descrito en la presente memoria descriptiva, la presente invención abarca diversos regímenes de alimentación que tienen como resultado una presencia de D-galactosa residual en el cultivo durante un ciclo de cultivo.

De acuerdo con la presente invención, la adición de D-galactosa a la glicoestructura de una proteína producida se identificó como una etapa limitante de la velocidad de la sialilación del producto. Se encontró que la presencia de una cantidad eficaz de D-galactosa en el medio de alimentación durante el curso del procedimiento de cultivo daba como resultado un incremento del contenido en D-galactosa del producto. Esto, a su vez, dio como resultado la adición de más restos de ácido siálico a la glicoestructura de la proteína, de modo que aumenta la calidad del producto. Para mantener y/o sostener el mayor grado de sialilación del producto se prefiere mantener la estrategia de alimentación con D-galactosa a lo largo del ciclo de cultivo. Los procedimientos y procedimientos de la presente invención son adecuados para cultivos celulares tanto a pequeña (p. ej., 50 l, 100 l) como a gran (p. ej., 500 l y superiores) escala. Además, los procedimientos de la presente invención son particularmente adecuados para células cultivadas y mantenidas en cultivos discontinuos con alimentación, tanto a pequeña como a gran escala, como se describe más adelante en la presente memoria descriptiva. De forma adicional, en los procedimientos de cultivo de la presente invención se pueden usar diversos medios de cultivo tal como se conocen en la técnica. Más adelante se describen los medios de cultivo adecuados.

Una ventaja de la presente invención es que los costes de producción de proteína se recuden por el incremento de la calidad global (p. ej., medida por el contenido en ácido siálico) del producto final tal como se consigue mediante los procedimientos de cultivo descritos en la presente memoria descriptiva. En una forma de realización preferida, se mantuvo un alto contenido en ácido siálico del producto a lo largo del ciclo de cultivo cuando se incluyó D-galactosa en el medio de alimentación suministrado al cultivo celular, preferentemente a diario. (Véase, por ejemplo, los Ejemplos 1 y 2). Es interesante el hecho de que una interrupción o suspensión de la alimentación de D-galactosa el día 10 del ciclo de cultivo condujo a una inversión de la elevada calidad del producto y a la formación de especies proteicas menos sialiladas. (Ejemplo 2). Además, la adición de D-galactosa a los cultivos celulares, preferentemente a los cultivos a gran escala, productores de una proteína dada, p. ej., CTLA4Ig, a través del medio de alimentación pudo invertir un efecto de escala perjudicial observado (p. ej., mayor tamaño del reactor) sobre la calidad del producto. La inversión del efecto de escala fue más significativa cuando la galactosa estaba presente en el medio de alimentación diario de los cultivos. En ausencia de adición de D-galactosa al medio de alimentación, el grado de sialilación de la glicoproteína disminuyó con la escala creciente del reactor.

De acuerdo con esto, una forma de realización preferida de la invención implica el mantenimiento de la estrategia de alimentación con D-galactosa a lo largo de un ciclo de producción, preferentemente con alimentación diaria, para permitir la producción de cantidades grandes de glicoproteína altamente sialilada independiente de la escala del reactor. Proporcionar una alimentación que contiene D-galactosa, preferentemente un medio de alimentación que comprende D-galactosa, a un nivel de sialilación eficaz a lo largo de todo el procedimiento de cultivo celular produce de forma ventajosa una inversión de los efectos de escalado y evita una disminución de la sialilación proteica y la formación de especies del producto glicoproteico menos sialiladas. Por ejemplo, durante el escalado de los procedimientos de cultivo celular a varios miles de litros del volumen del reactor, se puede observar que la calidad del producto, determinada de forma cuantificable mediante el grado de sialilación de la glicoproteína, disminuye con el incremento de la escala del reactor. Esta observación puede deberse a un mayor nivel de estrés experimentado por el cultivo a mayor escala, que afecta al metabolismo de la D-galactosa de la célula. Como se pone de ejemplo en la presente memoria descriptiva, la adición de D-galactosa al cultivo a través del medio de alimentación más de una vez durante el ciclo de cultivo (p. ej., a diario) pudo invertir o deshacer tal efecto perjudicial del escalado y permitió la producción de glicoproteína de las características de calidad alta y de sialilación, con independencia del tamaño de reactor utilizado. Por tanto, la presencia de un nivel sostenido de D-galactosa en una alimentación, preferentemente en un medio de alimentación, es particularmente ventajosa para los cultivos celulares a gran escala que tienen el efecto de escala más pronunciado.

Una concentración eficaz de D-galactosa como componente en una alimentación, preferentemente en el medio de alimentación del cultivo celular, potencia, incrementa, mantiene y/o sostiene un contenido alto en ácido siálico del producto a lo largo del ciclo de producción. Un experto en la práctica puede determinar la cantidad de D-galactosa adecuada para usar en el medio de alimentación sobre la base del tamaño del reactor y del volumen del cultivo. Los procedimientos de la presente invención son adecuados para todas las escalas del reactor a las que se produce producción de proteína, incluidas, entre otras, las producciones a pequeña y a gran escala, y la escala del reactor, por ejemplo cultivos de gran escala o cultivos a escala industrial, por ejemplo por encima de 50 l, más preferentemente por encima de 500 l. Por ejemplo, los procedimientos de alimentación de galactosa son aplicables para la producción de cultivos a escala, por ejemplo que tienen un volumen de aproximadamente 50 litros (50l) o menor, así como para cultivos a escala del reactor, que pueden tener un volumen de varios cientos o miles de litros.

De acuerdo con los procedimientos de la presente invención, la concentración de galactosa en el medio de alimentación se proporciona, preferentemente, en una cantidad que da un nivel sostenido o mantenido de D-galactosa en el cultivo, o reactor, durante el procedimiento de cultivo. Una cantidad de D-galactosa adecuada para usar en el medio de alimentación comprende de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 50 g/l, preferentemente aproximadamente 3 g/l a aproximadamente 25 g/l, más preferentemente aproximadamente 3 g/l a aproximadamente 20 g/l. Como ejemplo específico aunque no limitante, 12,5 g/l de D-galactosa en el medio de alimentación son adecuados para usar en el procedimiento de cultivo de la invención, particularmente, por ejemplo, para una escala de reactor de 50 l. Además, se prefiere que la concentración de galactosa residual en el medio de cultivo usado para cultivar células (p. ej., en un reactor o vaso de cultivo) se mantiene y sostiene a lo largo del ciclo de cultivo en una cantidad de aproximadamente 0,1-10 g/l, preferentemente de aproximadamente 0,1-5 g/l, más preferentemente de aproximadamente 0,2-5 g/l, más preferentemente de aproximadamente 0,2-2,5 g/l, incluso más preferentemente de aproximadamente 0,5-2 g/l y más preferentemente de aproximadamente 0,5-1,0 g/l. Estas concentraciones residuales de galactosa en el medio de cultivo se aplican si la galactosa se añade a través de un medio de cultivo o de cualquier otro modo.

Los cultivos celulares son alimentados con medio de alimentación que contiene D-galactosa usando diversos programas o regímenes de alimentación para liberar y mantener D-galactosa en los cultivos en cantidades que sostienen una concentración de D-galactosa de sialilación eficaz y potencian e incrementan la sialilación de la glicoproteína. En general, los procedimientos de cultivo de la presente invención comprenden la alimentación de cultivos celulares con D-galactosa en el medio de alimentación más de una vez durante el ciclo de cultivo. Debe entenderse que el volumen de cultivo al que contribuye el medio de alimentación al final de un ciclo de cultivo normalmente comprende aproximadamente 30-60% del volumen de cultivo original.

Los cultivos celulares pueden ser alimentados con D-galactosa a diario o según otro régimen que no sea a diario, por ejemplo con menor frecuencia que una vez al día, y a intervalos variables, preferentemente a intervalos programados, incluidos en días alternos, cada tres días, cada cuatro días y similares. Por ejemplo, la alimentación de cultivos celulares con D-galactosa, preferentemente con medio de alimentación que contiene D-galactosa, se puede realizar una vez al día, más de una vez al día, o menos de una vez al día, y se puede producir una vez, dos veces o más de dos veces, por ejemplo tres, cuatro, cinco o más veces, durante el ciclo total de cultivo. En una forma de realización, las células se alimentan con D-galactosa más de una vez.

También se abarca en la presente invención un programa de alimentación continua que implica, por ejemplo, una infusión continua de D-galactosa, preferentemente un medio de alimentación que contiene D-galactosa, en los cultivos. En dicho régimen de alimentación continua, los cultivos reciben D-galactosa, preferentemente en medio de alimentación, por ejemplo en forma de un “goteo” suministrado de forma continua, o infusión, u otra adición automática al cultivo, de un modo cronometrado, regulado y/o programado de forma que se consigue y mantiene la cantidad adecuada de galactosa en el cultivo. Más preferido es un régimen de alimentación que comprende una alimentación en bolo una vez al día con D-galactosa, preferentemente con medio de alimentación que contiene D-galactosa cada día del ciclo de cultivo, desde el principio del ciclo de cultivo al día de recolección de las células.

De acuerdo con la invención, se puede añadir D-galactosa al cultivo celular a cualquiera de los intervalos mencionados anteriormente de algún modo distinto de en un medio de alimentación. Como ejemplos no limitantes, la D-galactosa se puede añadir al cultivo en un medio o medio de cultivo distinto a un medio de alimentación o la D-galactosa se puede añadir al cultivo en agua. Como ejemplo no limitante, el cultivo puede ser alimentado con D-galactosa y también ser alimentado con un medio de alimentación, es decir se puede alimentar a más de una composición.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “alimentación” se refiere a cualquier adición de cualquier sustancia realizada a un cultivo tras la inoculación. La alimentación puede ser una o más adiciones.

Como se usa en la presente memoria, el término “inoculación” se refiere a la adición de células al medio de partida para comenzar el cultivo.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, los términos “medio de alimento” y “medio de alimentación” se refieren a un medio que contiene uno o más nutrientes que se añaden al cultivo comenzando algún tiempo después de la inoculación.

Como se usa en la presente memoria, el término “medio basal” se refiere al medio de partida al que se añaden las células para comenzar el cultivo.

En otra de sus formas de realización, la presente invención abraca un procedimiento o procedimiento de cultivo celular para incrementar la sialilación de un producto glicoproteico producido por el cultivo celular, que comprende la adición de galactosa, por ejemplo D-galactosa, al medio de cultivo. Una forma de realización relacionada implica un procedimiento de cultivo celular en el que se suministra D-galactosa al cultivo durante el ciclo de producción y, preferentemente, está presente en el medio de alimentación. Una forma de realización preferida se refiere a procedimientos de cultivo de células que comprenden una alimentación diaria del cultivo con medio que contiene D-galactosa. La disponibilidad de galactosa para las células en cultivo proporcionada mediante este procedimiento, preferentemente suministrada más de una vez durante el ciclo de cultivo, más preferentemente a diario, supera el potencial de una cantidad limitante de galactosa en el cultivo, de modo que permite que la glicoproteína forme amplios restos de ácido siálico añadidos a la estructura, de modo que se incrementa la sialilación del producto final y se invierte el problema mencionado en lo que antecede de un efecto de escalada.

De acuerdo con la presente invención, la sialilación de la proteína aumenta, de media, de aproximadamente 1,2 a 1,5 veces cuando los cultivos celulares son alimentados con D-galactosa durante el ciclo de cultivo, en comparación con cultivos celulares en ausencia de alimentación con D-galactosa o con cultivos en los que se interrumpe o detiene la alimentación con D-galactosa antes del final del ciclo de cultivo.

En una forma de realización preferida que implica el cultivo de células productoras de moléculas de glicoproteína CTLA4 soluble, tal como CTLA4Ig, y moléculas mutantes de glicoproteína CTLA4 soluble, tal como L104EA29Ylg, como se describe adicionalmente más adelante, una concentración de D-galactosa eficaz para mantener un elevado contenido en ácido siálico del producto a lo largo del ciclo de la producción estaba presente en el medio de alimentación y se añadió al cultivo celular a diario. (Ejemplo 2). De forma ilustrativa, una cantidad eficaz de D-galactosa en el medio de alimentación constituye de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 50 g/l, preferentemente de aproximadamente 3 g/l a aproximadamente 25 g/l, más preferentemente de aproximadamente 3 g/l a aproximadamente 20 g/l. La D-galactosa en la cantidad de aproximadamente 12,5 g/l en el medio de alimentación es particularmente adecuada para usar en los cultivos a gran escala (p. ej., 50 l) de acuerdo con el procedimiento de de la invención.

Se determinó que la adición de D-galactosa a la glicoestructura de CTLA4Ig era la etapa limitante de la velocidad de la sialilación del producto. Una interrupción o suspensión de la alimentación con D-galactosa condujo a una inversión y formación de producto glicoproteico de CTLA4Ig menos sialilado. De acuerdo con esto, la inclusión de D-galactosa en el medio de alimentación diario se mantuvo preferentemente a lo largo del ciclo de producción para conseguir y sostener un producto completamente sialilado de calidad elevada.

Se encontró que la adición diaria de D-galactosa al medio de cultivo para cultivos a gran escala productores de CTLA4Ig conseguía la inversión de un efecto de escala perjudicial observado sobre la calidad del producto final. Más específicamente, en ausencia de adición de D-galactosa en el medio de alimentación, el grado de sialilación de la glicoproteína CTLA4Ig disminuyó con la escala creciente del reactor. La adición diaria de D-galactosa a cultivos a gran escala productores de CTLA4Ig permitió la producción de cantidades grandes de glicoproteína altamente sialilada con independencia de la escala del reactor.

Procedimientos de cultivo que implican alimentar con galactosa en combinación con los cambios de temperatura durante el ciclo de cultivo

Otras formas de realización de la presente invención se refieren a procedimientos de cultivo celular que implican dos o más cambios de temperatura que alcanzan mayor viabilidad celular y pueden tener como resultado una extensión de las fases de producción del producto y del producto incrementado, así como una calidad alta del producto medida mediante el contenido en ácido siálico. Los procedimientos y procedimientos de cultivo celular que implican dos o más cambios de temperatura se divulgan en solicitudes de patente de asignación común de EE.UU. de número de serie 60/436.101, presentadas el 23 de diciembre de 2002 y de EE.UU. de número de serie 10/ presentada junto con el presente documento, cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia y, además, se describen a continuación. Dichos procedimientos con cambio de temperatura pueden usarse de forma cómoda en combinación con los procedimientos de alimentación con galactosa tal como se ha descrito en la presente memoria descriptiva, para dar lugar a niveles elevados de calidad y cantidad del producto final.

De acuerdo con los procedimientos de cultivo con cambio de temperatura de la presente invención, la combinación de dos o más cambios de temperatura, preferentemente cambios de temperatura descendente, durante el periodo de cultivo celular, puede permitir que las células produzcan el producto proteico en cantidad y calidad elevadas al final del periodo de cultivo, en comparación con los procedimientos de cultivo que no implican cambios de temperatura o solo un cambio de temperatura. Con fines ilustrativos, como se muestra en el Ejemplo 5, se demostró que un procedimiento de cultivo con dos o tres cambios de temperatura daba un incremento de la cantidad de proteína (p. ej., título final) en comparación sin cambio de temperatura o solo un cambio de temperatura, con independencia de la duración total del ciclo de cultivo.

En formas de realización adicionales de la presente invención, los cambios de temperatura programados en múltiples etapas se usan en el cultivo de células de mamífero para producir un producto proteico deseado, particularmente un producto glicoproteico. Más preferentemente, las células producen una proteína, polipéptido o producto peptídico producido de forma recombinante. No obstante, en algunos casos, las células pueden producir de forma activa, o superproducir, un producto endógeno o natural que se puede recolectar o recuperar siguiendo la práctica de la presente invención. Como se describe en la presente memoria descriptiva, en los procedimientos de la presente invención se pueden usar dos o más cambios de temperatura, preferentemente cambios de temperatura descendentes controlados, llevados a cabo a intervalos adecuadamente programados durante el periodo de cultivo, para alcanzar un alto rendimiento de proteína con un elevado contenido concomitante de ácido siálico.

De acuerdo con los métodos y procedimientos de cultivo celular de la presente invención (también denominados ciclos de producción o fermentación), las células cultivadas junto con dos o más cambios de temperatura durante un ciclo de cultivo pueden producir un producto en alta cantidad y calidad durante el ciclo, medido mediante el título final y el contenido en ácido siálico al final del ciclo. La alta cantidad y calidad de la producción de proteína asociada con los procedimientos de la presente invención se obtienen con respecto a los procedimientos en los que no se usa ningún cambio de temperatura o, como máximo, se usa un cambio de temperatura, con independencia de si se lleva a cabo un ciclo de cultivo para un tiempo total de ciclo de aproximadamente 10-14 días o durante más de 14 días. Además, como resultado de los dos o más cambios de temperatura durante el procedimiento de cultivo, las células se pueden mantener en cultivo durante un periodo de tiempo que esencialmente extiende la fase de producción estándar o inicial. Normalmente, una fase de producción estándar o inicial es de aproximadamente 6 a 14 días. El incremento de la producción de la proteína de calidad alta, así como la viabilidad celular sostenida, se consiguen durante la fase extendida de producción de los presentes procedimientos de cultivo que implican dos o más cambios de temperatura.

También de acuerdo con los presentes procedimientos de cultivo, las células se pueden cultivar para un periodo de ciclo total superior a aproximadamente 10 días, superior a aproximadamente 14 días, superior a aproximadamente 21 días o superior a aproximadamente 28 días, preferentemente de aproximadamente 14 a 30 días, o más. Por ejemplo, en un ciclo de cultivo de la presente invención que comprende dos o más cambios de temperatura, la duración de un ciclo de cultivo entero puede durar tan poco como justo después del segundo (o último) cambio de temperatura (por ejemplo, de aproximadamente 14 días) hasta aproximadamente de 21 a 30 días o más, preferentemente de aproximadamente 28 días o más.

En una forma de realización de la presente invención, la fase de producción extendida se asocia con los mútiples cambios de temperatura que comprenden los procedimientos de cultivo celular de la presente invención. De acuerdo con los nuevos procedimientos de cultivo de la presente invención, la combinación de un segundo, tercero o más cambio de temperatura con un prior cambio de temperatura no solo permite que los cultivos celulares produzcan el producto en alta cantidad y calidad a lo largo de la duración del ciclo de cultivo, sino que también permite que el cultivo conserve una elevada viabilidad celular durante el ciclo y/o a lo largo de la fase de producción extendida hasta el final del ciclo de cultivo. Durante el ciclo de cultivo, incluida la fase de producción extendida, el título del producto proteico aumenta y la calidad del producto, caracterizada por el contenido en ácido siálico, permanece elevada.

Más particularmente, en una de sus formas de realización específicas, la presente invención abarca procedimientos de cultivo celular que extienden la fase de producción inicial de la producción de proteína mediante células cultivadas (es decir, la fase de producción estándar que abarca aproximadamente 6-14 días se amplía). Empleando dos o más cambios de temperatura en el ciclo de cultivo de acuerdo con la presente invención se consiguió una fase de producción extendida a aproximadamente 14-21 días. Con tres (o más) cambios de temperatura en el ciclo de cultivo, el ciclo de cultivo se extendió más hasta aproximadamente 21-28 o 30 días, o más, con rendimientos concomitantemente más elevados del producto proteico de alta calidad (p. ej., contenido alto en ácido siálico), (p. ej., Ejemplo 5.

Por tanto, la presente invención combina de forma ventajosa los procedimientos de cultivo celular con dos o más cambios de temperatura de acuerdo con la presente invención con la inclusión de un régimen de alimentación que comprende la adición de D-galactosa al medio de alimentación. Incluyendo D-galactosa como componente en el medio de alimentación se encontró que se producía un incremento significativo de la sialilación del producto a lo largo del procedimiento de cultivo celular y se produjeron niveles elevados de proteína sialilada al final del ciclo de cultivo.

En una forma de realización concreta de la presente invención, el procedimiento de cultivo celular (o fermentación) abarca un cambio de temperatura descendente de dos etapas en el que las células se mantienen a tres temperaturas diferentes durante todo el ciclo de cultivo. En esta forma de realización, el periodo de cultivo celular total dura más de aproximadamente 10 días, más específicamente, de aproximadamente 14 a 28 días o más, es decir de aproximadamente dos a tres semanas o más, antes de obtener el producto proteico final (y midiendo el contenido en ácido siálico). Por ejemplo, en dicho procedimiento de dos etapas, las células se mantienen a una primera temperatura de aproximadamente 36°C a 38°C, preferentemente a 37°C, o a casi 37°C, para un periodo de cultivo inicial desde el día 0 hasta aproximadamente el día 6. Después, desde aproximadamente el día 5 hasta el día 7, preferentemente el día 6 hasta aproximadamente el día 10, la temperatura de cultivo se mantiene a una segunda temperatura de aproximadamente 33°C a 35°C, preferentemente a 34°C, o casi a 34°C. Después del cultivo celular a 34°C o a casi 34°C, la temperatura se cambia una segunda vez (cambio de T secundario) hasta una tercera temperatura de aproximadamente 31°C a 33°C, preferentemente a 32°C o casi a 32°C. El cambio de T secundario se produce el día 6 o aproximadamente el día 6 hasta aproximadamente el día 14, preferentemente desde aproximadamente el día 10 hasta aproximadamente el día 14, más preferentemente el día 10 o aproximadamente el día 10, que en varias formas de realización puede ser durante la fase de producción estándar, durante la fase de crecimiento o durante la fase de muerte. Preferentemente se producen incrementos de aproximadamente cuatro días entre el primero y el segundo cambio de temperatura, más preferentemente incrementos de cuatro días. Las células se mantienen a una temperatura de 32°C, o de casi 32°C, hasta el final de todo el ciclo de cultivo, por ejemplo durante más de aproximadamente 10 días, más específicamente hasta aproximadamente los días 12-18 o hasta aproximadamente los días 14-18 o hasta aproximadamente los días 14-28 o 30 o más. Al final del procedimiento de cultivo, el producto proteico normalmente se aísla y/o purifica, por ejemplo, a partir del sobrenadante del cultivo, si el producto se secreta en el medio de cultivo.

Como alternativa en los procedimientos de cultivo con múltiples cambios de temperatura de la presente invención, la temperatura se puede reducir primero sobre la base de la fase del cultivo. Preferentemente, el primer cambio de temperatura se produce antes del inicio de la fase de muerte. En una forma de realización, la temperatura se reduce primero de forma concurrente con la ralentización del crecimiento celular. Por ejemplo, la temperatura se cambia desde 37°C, o casi 37°C, a 34°C, o casi 34°C, cuando las células ya no están en su fase de crecimiento exponencial y el cultivo está en la fase estacionaria, por ejemplo en el día 6, o aproximadamente el día 6, de cultivo. En este momento, la concentración de células viables ha alcanzado una densidad celular adecuada para la producción de proteína, preferentemente producción potenciada de proteína, por ejemplo aproximadamente 2-12 x 106 células/ml, tales como 2- 9 x 106 células/ml, 3-7 x 106 células/ml, 4-5 x 106 células/ml, 3-4 x 106 células/ml, 2-4 x 106 células/ml, 4-6 x 106 células/ml, 6-8 x 106 células/ml, 8-10 x 106 células/ml o 10-12 x 106 células/ml. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, es posible que la ralentización del crecimiento celular se correlacione con la depleción de nutrientes y/o de componentes concretos del medio de cultivo celular, por ejemplo una limitación de nitrógeno en el medio.

En otra forma de realización, el primer cambio de temperatura se produce durante la fase de crecimiento, por ejemplo cuando la concentración de células viables es de aproximadamente 2-12 x 106 células/ml, tal como 2-9 x 106 células/ml, 3- 7 x 106 células/ml, 4-5 x 106 células/ml, 3-4 x 106 células/ml, 2-4 x 106 células/ml, 4-6 x 106 células/ml, 6-8 x 106 células/ml, 8-10 x 106 células/ml o 10-12 x 106 células/ml.

En otra forma de realización específica que abarca el procedimiento de cultivo de cambio de temperatura en dos etapas, las células se cultivan durante un ciclo de 14 días en el que la temperatura del cultivo se mantiene a 37°C o casi a 37°C desde el día 0 hasta el día 6. Desde aproximadamente el día 6 hasta aproximadamente el día 10, la temperatura del cultivo se mantiene a 34°C o casi a 34°C; y desde aproximadamente el día 10 hasta aproximadamente el día 14, la temperatura del cultivo se mantiene a 32°C o casi a 32°C. Como otra forma de realización, las células se cultivan durante aproximadamente un periodo de 21 días en el que la temperatura del cultivo se mantiene a 37°C o casi a 37°C desde el día 0 hasta aproximadamente el día 6; desde aproximadamente el día 6 hasta aproximadamente el día 10, la temperatura del cultivo se mantiene a 34°C o casi a 34°C; y desde aproximadamente el día 10 hasta aproximadamente el día 21, la temperatura del cultivo se mantiene a 32°C o casi a 32°C. Como otra forma de realización más, las células se cultivan durante un periodo de aproximadamente 28 días en el que la temperatura del cultivo se mantiene a 37°C o casi a 37°C desde el día 0 hasta aproximadamente el día 6; desde aproximadamente el día 6 hasta aproximadamente el día 10, la temperatura del cultivo se mantiene a 34°C o casi a 34°C; y desde aproximadamente el día 10 hasta aproximadamente el día 28, la temperatura del cultivo se mantiene a 32°C o casi a 32°C.

La presente invención también abarca formas de realización en las que los procedimientos de cultivo celular comprenden tres o más cambios de temperatura. En una forma de realización que implica un procedimiento de cultivo de cambio de temperatura de tres etapas, las células se cultivan inicialmente a una primera temperatura de aproximadamente 36°C a 38°C, preferentemente a 37°C o casi a 37°C durante aproximadamente 6 días; después, la temperatura del cultivo se cambia y se mantiene a aproximadamente 33°C a 35°C, preferentemente a 34°C o casi a 34°C durante un periodo de tiempo dado; después se produce un segundo cambio hasta una temperatura de aproximadamente 31°C a 33°C, preferentemente a 32°C o casi a 32°C. Tras el periodo de cultivo a 32°C o casi a 32°C se produce un tercer cambio de temperatura hasta una temperatura de aproximadamente 29°C a 31°C, preferentemente a 30°C o casi a 30°C; después, la temperatura se mantiene a 30°C o casi a 30°C hasta el final del ciclo.

En otras formas de realización se pueden realizar más cambios de temperatura, preferentemente cambios de temperatura descendente, tras el tercer cambio de temperatura del procedimiento de cultivo. Por ejemplo, un cuarto cambio de temperatura puede seguir al tercer cambio los días 15-20 o aproximadamente los días 15-20, preferentemente aproximadamente el día 18 desde el inicio del cultivo. El cuarto cambio descendente mantiene la temperatura del cultivo a 28°C-29°C o a casi 28-29°C, preferentemente a aproximadamente 29°C, e incrementa el ciclo de cultivo hasta más de aproximadamente 28 días, por ejemplo hasta aproximadamente 28-32 días o más, momento en el que se obtiene el producto.

Como ocurre en el procedimiento del ciclo de cultivo con cambios de temperatura en dos etapas de acuerdo con la presente invención, el primer cambio de temperatura en los procedimientos de múltiples cambios de temperatura de la presente invención se puede producir cuando las células han detenido esencialmente el crecimiento y están en fase estacionaria o aproximadamente estacionaria. Con fines ilustrativos, el cambio de temperatura se produce cuando la concentración de células viables es de aproximadamente 2-12 x 106 células/ml, tal como 2-9 x 106 células/ml, 3-7 x 106 células/ml, 4-5 x 106 células/ml, 3-4 x 106 células/ml, 2-4 x 106 células/ml, 4-6 x 106 células/ml, 6-8 x 106 células/ml, 8-10 x 106 células/ml o 10-12 x 106 células/ml. Como alternativa, el primer cambio de temperatura se produce durante la fase de crecimiento, por ejemplo cuando la concentración de células viables es de aproximadamente 2-12 x 106 células/ml, tal como 2-9 x 106 células/ml, 3-7 x 106 células/ml, 4-5 x 106 células/ml, 3-4 x 106 células/ml, 2-4 x 106 células/ml, 4-6 x 106 células/ml, 6-8 x 106 células/ml, 8-10 x 106 células/ml o 10-12 x 106 células/ml.

En una forma de realización preferida, el procedimiento de cultivo celular de múltiples etapas comprende tres cambios de temperatura programados y controlados durante un periodo de cultivo de aproximadamente tres a cuatro semanas, por ejemplo 21-30 días o más, preferentemente 28 días o más, lo que proporciona una producción extendida del producto por parte de las células en cultivo. Como ilustración, el procedimiento de cambio de temperatura de tres etapas comprende un periodo de cultivo inicial de 0 a aproximadamente 6 días, preferentemente 6 días, tiempo durante el cual las células se cultivan a una temperatura de 37°C, o de casi 37°C. Desde aproximadamente el día 6 hasta aproximadamente el día 10, las células se cultivan a 34°C, o a casi 34°C. Desde aproximadamente el día 10 hasta aproximadamente el día 14, la temperatura del cultivo se mantiene a 32°C, o a casi 32°C; y desde aproximadamente el día 14 en adelante, es decir hasta aproximadamente el día 21 al día 30 o más, o hasta el final del ciclo, la temperatura del cultivo se mantiene a 30°C, o a casi 30°C. De acuerdo con esto, en el procedimiento de cultivo con cambio de temperatura de tres etapas de la presente invención, la fase de producción puede también extenderse para dar un título final de proteína superior y mayor viabilidad celular durante un periodo de tiempo mayor de aproximadamente 14 días, en contraste con la fase de producción estándar de aproximadamente 6 a 14 días con solo uno o ningún cambio de temperatura. De forma ventajosa, la fase de producción y la viabilidad celular pueden extenderse adicionalmente mediante el procedimiento de cambio de T de tres etapas, es decir hasta aproximadamente tres semanas o más, acompañado de calidad elevada del producto, medida mediante el contenido en ácido siálico.

En las diversas formas de realización de la presente invención, el segundo cambio de temperatura hasta 32°C, o a casi 32°C, permite mayor cantidad y calidad de la proteína al final del ciclo de cultivo y también se asocia con una mayor producción de proteína durante un ciclo que puede durar más de aproximadamente dos semanas. Los dos o más cambios de temperatura permiten que el cultivo estabilice una lenta disminución de la viabilidad celular que se puede producir durante las dos semanas anteriores en el cultivo. Otro cambio de temperatura más desde 32°C, o de casi 32°C, hasta 30°C, o a casi 30°C, programado a aproximadamente dos semanas, o alrededor, proporciona otra extensión de la fase de producción, lo que prolonga la fase de producción del cultivo celular hasta el final del ciclo de cultivo, por ejemplo hasta aproximadamente el día 21 hasta el día 30 o más, al tiempo que mantiene la viabilidad celular sin sacrificar la calidad (determinada mediante la medición de la sialilación) del producto producido. (Véase el Ejemplo 5, Tablas 2 y 3). Cambios de temperatura adicionales pueden extender la producción celular más allá de la de los ciclos de dos y tres cambios de temperatura.

En otras formas de realización, la presente invención está dirigida a (i) un procedimiento de cultivo celular, (ii) un procedimiento de incremento de la producción de proteína, preferentemente asociada con un incremento de la viabilidad celular, (iii) un procedimiento de potenciar la sialilación de un producto proteico, (iv) un procedimiento de potenciar la viabilidad celular o (v) un procedimiento de ampliar la producción proteica que implica dos o más cambios de temperatura, que comprende Cultivar células huésped que expresan una proteína de interés a una temperatura de 37°C, o de casi 37°C, en condiciones y durante un periodo de tiempo que permite el crecimiento celular; disminuir la temperatura del cultivo celular y cultivar las células a una segunda temperatura de 34°C, o de casi 34°C, cuando el cultivo está en la fase estacionaria; disminuir de nuevo la temperatura del cultivo celular y cultivar las células a una tercera temperatura de 32°C, o de casi 32°C, en un momento durante la fase de producción estándar de aproximadamente el día 6 al día 14, por ejemplo diez días, o aproximadamente diez días, desde el inicio del cultivo, hasta el final del periodo de cultivo. Como se ha indicado en la presente memoria descriptiva, el periodo de cultivo puede comprender un tiempo de ciclo total superior a 10 días, superior a 14 días, superior a 21 días o superior a 28 30 días. Tras el cultivo de las células a 32°C, es decir al final del ciclo de cultivo, se obtiene el producto proteico producido, preferentemente una glicoproteína.

En otras formas de realización, la presente invención está dirigida a (i) un procedimiento de cultivo celular, (ii) un procedimiento de incremento de la producción de proteína, preferentemente asociada con un incremento de la viabilidad celular, (iii) un procedimiento de potenciar la sialilación de un producto proteico, (iv) un procedimiento de potenciar la viabilidad celular o (v) un procedimiento de ampliar la producción proteica que implica dos o más cambios de temperatura, que comprende cultivar células huésped que expresan una proteína de interés a una temperatura de 37°C, o de casi 37°C, en condiciones y durante un periodo de tiempo que permite el crecimiento celular; disminuir la temperatura del cultivo celular y cultivar las células a una segunda temperatura de 34°C, o de casi 34°C, comenzando aproximadamente el día 5 al día 7; disminuir de nuevo la temperatura del cultivo celular y cultivar las células a una tercera temperatura de 32°C, o de casi 32°C, comenzando aproximadamente el día 6 al día 14, por ejemplo diez días, o aproximadamente diez días, desde el inicio del cultivo, hasta el final del periodo de cultivo. Como se ha indicado en la presente memoria descriptiva, el periodo de cultivo puede comprender un tiempo de ciclo total superior a 10 días, superior a 14 días, superior a 21 días o superior a 28-30 días. Tras el cultivo de las células a 32°C, es decir al final del ciclo de cultivo, se obtiene el producto proteico producido, preferentemente una glicoproteína.

En otra de sus formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos de cultivo que comprenden además otro cambio descendente de temperatura desde 32°C, o de casi 32°C, hasta 30°C, o a casi 30°C, l4 días, o aproximadamente 14 días, desde el inicio del cultivo hasta el final del procedimiento de cultivo, de modo que extiende el periodo de cultivo bastante más allá de una fase de producción estándar. Para ampliar todavía más la producción de proteína durante el procedimiento de cultivo, así como la viabilidad celular, el procedimiento puede comprender un cuarto cambio descendente de temperatura desde 30°C, o de casi 30°C, hasta 29°C, o a casi 29°C, 15 días, o aproximadamente 15 días, hasta l9 días, preferentemente 18 días, desde el inicio del cultivo hasta el final del procedimiento de cultivo.

Normalmente, los cambios de temperatura de la presente invención se producen el día 6, o aproximadamente el día 6, del periodo de cultivo, que puede ser durante o después de la fase de crecimiento del cultivo y, después, a incrementos de aproximadamente 4 días, preferentemente incrementos de 4 días. En algunas formas de realización, el momento de realización de los cambios de temperatura puede acercarse al principio (p. ej., el día 6, o aproximadamente el día 6), en medio (p. ej., el día 10, o aproximadamente el día 10) y al final (p. ej., el día 14 o aproximadamente el día 14) de la fase de producción estándar. En los procedimientos o procedimientos de cultivo de acuerdo con la presente invención en el que el título final y el contenido en ácido siálico de una glicoproteína producida está potenciada por el uso de un perfil de cambio de temperatura de múltiples etapas (p. ej., dos etapas, tres etapas o más, la combinación de al menos dos cambios de temperatura programados permite llevar a cabo un ciclo de cultivo total superior a 10 días, superior a 14 días, superior a 21 días o superior a 28 o más días, sin sacrificar el título final y la sialilación del producto.

De acuerdo con los procedimientos de cultivo de la presente invención, los dos o más cambios de temperatura sostienen una elevada viabilidad celular del cultivo y pueden permitir que se produzca proteína de título alto y de elevada calidad en un ciclo de cultivo en comparación con un ciclo que se produce durante el mismo periodo de tiempo, pero no incluye dos o más cambios de temperatura. Asimismo, los dos o más cambios de temperatura pueden permitir que la fase de producción del cultivo se extienda más que la fase de producción estándar y/o más allá de la producción de un cultivo en el que no se ha producido un cambio de temperatura o, como máximo, en el que se ha producido un cambio de temperatura. Dichos cambios de temperatura de múltiples etapas, tal como el cambio de temperatura de dos o más etapas, puede minimizar el compromiso predominante entre el título (“título final”) y el contenido en ácido siálico en la producción del producto proteico en el procedimiento del cultivo celular. Por tanto, los cambios de temperatura proporcionan un efecto positivo sobre la potenciación del producto matemático de “título final x ácido siálico final”, que mejora en el procedimiento de producción de proteína.

En una forma de realización concreta, la presente invención está dirigida a (i) un procedimiento de cultivo celular, (ii) un procedimiento de incrementar la producción de proteína o (iii) un procedimiento de potenciar la viabilidad celular, junto con un incremento y potenciación de la sialilación de un producto glicoproteico proteico dado, que comprende las dos o más etapas del cambio de temperatura como se ha descrito con anterioridad y que además incluye alimentar las células, preferentemente a diario, con D-galactosa, preferentemente con medio suplementado para contener D-galactosa, a una concentración sostenida que tiene como resultado un incremento de la sialilación del producto glicoproteico al final del ciclo de cultivo. ** Un procedimiento de cultivo celular para la producción de proteína, que comprende: cultivar células huésped que producen una proteína de interés en el cultivo celular en condiciones que permitan la producción de proteína; alimentar las células con D-galactosa; y añadir compuesto polianiónico al cultivo celular en un momento después de la inoculación. En una forma de realización concreta, la invención está dirigida a un procedimiento de cultivo celular para la producción de proteína, que comprende: cultivar las células huésped que producen una proteína de interés en el cultivo celular en condiciones que permitan la producción de proteína; cultivar las células huésped a una temperatura de 37°C, o de caso 37°C, en condiciones y durante un periodo de tiempo que permitan el crecimiento celular; cultivar las células a una segunda temperatura de 34°C, o de caso 34°C; cultivar las células a una tercera temperatura de 32°C, o de caso 32°C; y alimentar las células con D-galactosa.

Formas de realización adicionales de acuerdo con la invención de los procedimientos de cultivo celular que implican dos o más cambios de temperatura

En una forma de realización de la presente invención se abarca un procedimiento de cultivo con múltiples cambios de temperatura, que comprende cultivar las células huésped que expresan una proteína de interés a una primera temperatura de 37°C, o de cerca de 37°C, en condiciones y durante un tiempo que permitan el crecimiento celular. Tras el periodo de crecimiento celular, las células se cultivan a una segunda temperatura de 34°C, o de casi 34°C, cuando el crecimiento celular se ha ralentizado y se convierte en aproximadamente estacionario. Después, las células se cultivan a una tercera temperatura de 32°C, o de caso 32°C, durante la fase de producción estándar del cultivo, es decir el día 6, o aproximadamente el día 6, hasta el día 14, o aproximadamente el día 14. Las células son alimentadas a diario. Al final del procedimiento de cultivo se puede obtener el producto proteico producido.

De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, las células se cultivan en un procedimiento de alimentación discontinua que comprende varias fases, a saber una fase de crecimiento, durante la cual las células se cultivan a una primera temperatura de 37°C, o de caso 37°C; una fase de producción inicial o estándar, durante la cual las células se cultivan a una segunda temperatura de 34°C, o de casi 34°C, y a una tercera temperatura de 32°C, o de casi 32°C, de modo que se proporciona una fase de producción proteica mayor, que puede incluir una cuarta temperatura de 30°C, o de casi 30°C, y, opcionalmente, después, temperaturas adicionales menores, tales como 29°C o casi 29°C. En los casos de los ciclos de cambio de temperatura de dos o más etapas de la presente invención, la extensión de la producción proteica está relacionada con los dos o más cambios descendentes de la temperatura. Preferentemente, los cultivos son alimentados con medio de alimentación que contiene D-galactosa a diario o de forma continua. Como se ha descrito en la presente memoria descriptiva, una fase de producción extendida comprende una disminución sucesiva de la temperatura del cultivo a diferentes intervalos dos o más veces tras el primer cambio de temperatura desde 37°C, o casi 37°C, hasta 34°C o casi 34°C. Respecto a sin cambios de temperatura, o solo un cambio de temperatura, la producción de proteína aumenta y se consigue un producto de alta calidad (medida por el contenido en ácido siálico del producto final) mediante la práctica de estos procedimientos que implican dos o más cambios de temperatura descendente durante el ciclo de cultivo.

Durante la fase de crecimiento del cultivo celular, por ejemplo desde el día 0 hasta aproximadamente el día 6, la densidad celular en el cultivo aumenta, ya que las células normalmente están en división rápida en este periodo de crecimiento celular exponencial, o fase logarítmica. En los procedimientos de cultivo celular y producción de proteína no asociados con el crecimiento presentes en algunos aspectos de la presente invención no se producen cantidades significativas de producto proteico durante la fase de crecimiento en la que el crecimiento celular se maximiza esencialmente en las condiciones de crecimiento adecuadas. Por tanto, como consecuencia de las limitaciones de nutrientes en el cultivo, las células normalmente entran en una fase estacionaria aproximadamente los días 4 a 6, en la que el crecimiento celular rápido se estabiliza y/o disminuye. En estos procedimientos de cultivo, la fase de producción de proteína comienza cuando el crecimiento celular ha terminado esencialmente (p. ej., aproximadamente desde el día 6 a aproximadamente el día 10). (Ejemplo 4).

De acuerdo con el procedimiento de cultivo de una forma de realización preferida, cuando las células alcanzan una fase estacionaria aproximadamente el día 6, la temperatura se reduce desde 37°C, o casi 37°C, hasta 34°C, o casi 34°C. Después, en un momento cercano al punto central entre el primer cambio de temperatura (aproximadamente el día 6) y el inicio de la fase de producción extendida (aproximadamente el día 14), la temperatura del cultivo se disminuye de nuevo desde 34°C, o casi 34°C, hasta 32°C, o casi 32°C. El segundo cambio de temperatura permite que el cultivo estabilice la viabilidad celular, que normalmente disminuye lentamente hasta el día 14; después comienza una extensión de la fase de producción (aproximadamente el día 14 hasta aproximadamente el día 21 al día 30 o más, preferentemente hasta aproximadamente el día 21 hasta el día 28 o más). Como se ha descrito con anterioridad, durante la fase de producción extendida del ciclo de cultivo se pueden emplear otros cambios de temperatura, por ejemplo un tercero, cuarto o más.

Procedimientos de cultivo que implican alimentar con galactosa en combinación con la adición retardada de compuesto polianiónico

Otras formas de realización de la presente invención se refieren a procedimientos de cultivo celular que implican la adición retardada del compuesto polianiónico. Los procedimientos de cultivo celular que implican la adición retardada de compuesto polianiónico se divulgan en la solicitud de patente de asignación común de EE.UU. de número de serie 10/ presentada junto con el presente documento, cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia y, además, se describen a continuación. Tal adición retardada del compuesto polianiónico se puede usar en combinación con los procedimientos de alimentación de galactosa descritos en la presente memoria descriptiva.

De acuerdo con las formas de realización de la presente invención que implican la adición retardada del compuesto polianiónico, el procedimiento comprende añadir compuesto polianiónico a un cultivo celular en un momento posterior a la inoculación. La adición retardada de compuesto polianiónico consigue un incremento de la viabilidad celular en comparación con lo observado en ausencia de adición de compuesto polianiónico o en comparación con lo observado cuando el compuesto polianiónico se añade durante la inoculación.

Por tanto, en una forma de realización, la invención está dirigida a un procedimiento de cultivo celular, que comprende: cultivar células huésped que expresan una proteína de interés; y añadir compuesto polianiónico al cultivo celular en un momento posterior a la inoculación.

Se ha encontrado (véase el ejemplo 8) que al llevar a cabo la presente invención aumenta el porcentaje de viabilidad celular del cultivo celular. El porcentaje de viabilidad celular, también conocido como viabilidad celular, es el porcentaje de células viables en el número total de células. Una condición, tal como la adición retardada del compuesto polianiónico, produce un incremento de la viabilidad celular si la viabilidad celular en el cultivo es mayor durante un periodo de tiempo en presencia de la condición que en ausencia de la condición.

Por tanto, en otras formas de realización, la invención está dirigida a (1) un procedimiento de cultivo celular y (2) un procedimiento de incrementar la viabilidad celular en un cultivo, que comprende: cultivar células huésped que expresan una proteína de interés; y añadir compuesto polianiónico al cultivo celular en un momento posterior a la inoculación; en el que la viabilidad celular del cultivo celular aumenta.

Los compuestos polianiónicos incluyen, entre otros, sulfato de dextrano (disponible en Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), heparina (disponible en Sigma-Aldrich), heparán sulfato (disponible en Sigma-Aldrich), sulfato de manano, sulfato de condroitina (disponible en Sigma-Aldrich), dermatán sulfato (disponible en Sigma-Aldrich), keratán sulfato (disponible en Sigma-Aldrich), hialuronato (disponible en Sigma-Aldrich), poli(vinil sulfato) (disponible en Sigma-Aldrich), kappacarragenina (disponible en Sigma-Aldrich) y suramina (disponible en Sigma-Aldrich). Los compuestos están disponibles fácilmente en las fuentes indicadas o se pueden obtener con facilidad a través de medios conocidos para un experto en la técnica. Estos compuestos con frecuencia están disponibles en forma de una sal, incluida, entre otras, la sal de sodio, pero también pueden usarse en formas que no sean sales. Un compuesto polianiónico incluye todas las formas del mismo, incluidas, entre otras, las formas en sal tales como las sales de sodio.

Compuestos polianiónicos preferidos son los compuestos polisulfatados, incluidos, entre otros: sulfato de dextrano, heparina, heparán sulfato, pentosán sulfato, xilofuranán sulfato, sulfato de curdlano, galactosa sulfato de curdlano, sulfato arabinosa de curdlano, sulfato de manano, sulfato de condroitina, dermatán sulfato, keratán sulfato, poli(vinilsulfato), kappa-carragenina y suramina. El más preferido es el sulfato de dextrano. El sulfato de dextrano puede tener un peso molecular promedio de 5.000 a 500.000 Da. Se prefiere el sulfato de dextrano con un peso molecular de 5.000 Da.

De acuerdo con la invención, el compuesto polianiónico se añade en un momento posterior a la inoculación, es decir no está presente en el medio basal y no está presente en la inoculación. Preferentemente, el compuesto polianiónico se añade el día 1 del cultivo o más tarde. La inoculación tiene lugar el día 0.

De acuerdo con la invención, el compuesto polianiónico se puede añadir al cultivo celular una vez, dos veces, tres veces o un número cualquiera de veces durante el periodo de tiempo especificado (p. ej., en un momento posterior a la inoculación). Uno o más compuestos polianiónicos se pueden usar juntos. Es decir, cualquier adición sencilla de un compuesto polianiónico puede incluir la adición de uno o más compuestos polianiónicos. De forma similar, si hay más de una adición de un compuesto polianiónico se pueden añadir diferentes compuestos polianiónicos a las diferentes adiciones. Compuestos y sustancias adicionales, incluidos los compuestos polianiónicos, pueden añadirse al cultivo antes, con o después de la adición del compuesto polianiónico, durante o no durante el periodo de tiempo especificado. En una forma de realización preferida, existe una adición sencilla, es decir una vez, de compuesto polianiónico. En una forma de realización preferida se añade un compuesto polianiónico.

De acuerdo con la invención, el compuesto polianiónico se puede añadir al cultivo celular por cualquier medio. Los medios para añadir el compuesto polianiónico incluyen, entre otros, disuelto en agua, disuelto en medio de cultivo, disuelto en medio de alimentación, disuelto en medio adecuado y en la forma en la que se obtiene. Preferentemente, el compuesto polianiónico se añade disuelto en agua.

De acuerdo con la invención, el compuesto polianiónico se añade para llevar la concentración en el cultivo a un nivel adecuado. Como ejemplos no limitantes, el compuesto polianiónico se añade hasta una concentración de 1-1000 mg/l, 1-200 mg/l, 1-100 mg/l o 25-75 mg/l. Preferentemente, el compuesto polianiónico se añade hasta una concentración de 25-200 mg/l o 25-100 mg/l, más preferentemente de aproximadamente 50-100 mg/l o 50-1 00 mg/l, más preferentemente de aproximadamente 50 mg/l o aproximadamente 100 mg/l, más preferentemente 50mg/l o 100 mg/l.

De acuerdo con la invención, el cultivo se puede realizar durante cualquier periodo de tiempo tras la adición del compuesto polianiónico. Un experto en la técnica puede determinar el tiempo del ciclo de cultivo sobre la base de factores relevantes tales como la cantidad y la calidad de la proteína recuperable y el nivel de especie celular contaminante (p. ej., proteínas y ADN) en el sobrenadante resultantes de la lisis celular, lo que complicará la recuperación de la proteína de interés.

En formas de realización concretas del procedimiento de cultivo celular y el procedimiento de incrementar la viabilidad celular de la invención, el compuesto polianiónico se añade en un momento posterior a la inoculación que es antes del comienzo de la fase inicial de muerte. Preferentemente, el compuesto polianiónico se añade en un momento posterior a la inoculación que es durante la fase de crecimiento inicial. Más preferentemente, el compuesto polianiónico se añade durante la segunda mitad de la fase de crecimiento inicial. Más preferentemente, el compuesto polianiónico se añade durante o aproximadamente al fina de la fase de crecimiento inicial.

La fase de crecimiento inicial se refiere a la fase de crecimiento que se observa en ausencia de la adición especificada del compuesto polianiónico. La fase inicial de la muerte se refiere a la fase de muerte que se observa en ausencia de la adición especificada del compuesto polianiónico.

La fase de crecimiento inicial puede finalizar cuando comienza la fase inicial de la muerte o puede ser una fase estacionaria de cualquier duración entre la fase de crecimiento inicial y la fase inicial de muerte.

En una forma de realización específica, en un cultivo celular en el que la fase de crecimiento inicial es desde el día 0 hasta el día 6 y la fase inicial de la muerte comienza el día 7, en una forma de realización concreta, el compuesto polianiónico se añade en un momento posterior a la inoculación y antes del día 7. En una forma de realización específica, el compuesto polianiónico se añade después de la inoculación y hacia el día 6. En una forma de realización específica, el compuesto polianiónico se añade entre los días 1 y 6. En otra forma de realización específica, el compuesto polianiónico se añade el día 4, 5 o 6. En otras formas de realización específicas, el compuesto polianiónico se añade aproximadamente el día 6 o el día 6.

Se ha descubierto (véanse los Ejemplos 8 y 12) que cuando el compuesto polianiónico se añade en un momento posterior a la inoculación y antes del comienzo de la fase inicial de muerte, la fase de crecimiento se puede extender más allá de la fase de crecimiento inicial. Una fase de crecimiento que se extiende más allá de la fase de crecimiento inicial tiene una duración mayor que la fase de crecimiento inicial, es decir mayor que la fase de crecimiento observada en ausencia de adición de compuesto polianiónico. Preferentemente, durante la fase de crecimiento extendida se consigue una densidad de células viable máxima más elevada que la densidad de células viables máxima alcanzada durante la fase de crecimiento inicial.

Por tanto, en otras formas de realización, la invención está dirigida a (1) un procedimiento de cultivo celular y (2) un procedimiento para extender la fase de crecimiento de un cultivo celular, que comprende: cultivar células huésped que expresan una proteína de interés; y añadir compuesto polianiónico al cultivo celular en un momento posterior a la inoculación que es antes del comienzo de la fase inicial de muerte; en el que la fase de crecimiento se extiende. En formas de realización más concretas, la invención está dirigida a un (1) procedimiento de cultivo celular y un (2) procedimiento para extender la fase de crecimiento de un cultivo celular, que comprende: cultivar células huésped que expresan una proteína de interés; y añadir compuesto polianiónico al cultivo celular en un momento posterior a la inoculación que es durante la fase de crecimiento inicial; en el que la fase de crecimiento se extiende. En formas de realización más concretas, la invención está dirigida a (1) un procedimiento de cultivo celular y (2) un procedimiento para extender la fase de crecimiento de un cultivo celular, que comprende: cultivar células huésped que expresan una proteína de interés; y añadir compuesto polianiónico al cultivo celular durante la segunda mitad de la fase de crecimiento inicial; en el que la fase de crecimiento se extiende. En otras formas de realización concretas, la invención está dirigida a (1) un procedimiento de cultivo celular y (2) un procedimiento para extender la fase de crecimiento de un cultivo celular, que comprende: cultivar células huésped que expresan una proteína de interés; y añadir compuesto polianiónico al cultivo celular durante o aproximadamente al final de la fase de crecimiento inicial; en el que la fase de crecimiento se extiende.

La fase de crecimiento se puede extender durante cualquier periodo de tiempo más allá de la duración de la fase de crecimiento inicial. A modo de ejemplo únicamente, la fase de crecimiento se puede extender durante 1-10 días, durante 2-9 días, durante 3-8 días o durante aproximadamente 5 días. Preferentemente, la fase de crecimiento se extiende durante uno o más días, más preferentemente durante dos o más días, más preferentemente durante tres o más días, más preferentemente durante cuatro o más días. Por ejemplo, en el Ejemplo 6, la fase de crecimiento se extiende hasta el día 11 mientras que la fase de crecimiento inicial es hasta el día 6. Por tanto, en el Ejemplo 8, la fase de crecimiento se ha extendido durante 5 días más allá de la duración de la fase de crecimiento inicial. A la fase de crecimiento extendida puede sucederle una fase de muerte o una fase estacionaria. Asimismo, a la fase de crecimiento inicial extendida puede sucederle una fase de muerte o una fase estacionaria.

Se ha descubierto (véanse los Ejemplos 8 y 12) que cuando el compuesto polianiónico se añade en un momento posterior a la inoculación y antes del comienzo de la fase inicial de muerte, el inicio de la fase de muerte puede retrasarse más allá del inicio de la fase inicial de muerte, es decir más allá del inicio de la fase de muerte observada en ausencia de la adición de compuesto polianiónico. Una fase de muerte cuyo inicio se retrasa comienza después de la fase inicial de muerte.

Por tanto, en otras formas de realización, la invención está dirigida a (1) un procedimiento de cultivo celular y (2) un procedimiento para retrasar la fase de muerte de un cultivo celular, que comprende: cultivar células huésped que expresan una proteína de interés; y añadir compuesto polianiónico al cultivo celular en un momento posterior a la inoculación que es antes del comienzo de la fase inicial de muerte; en el que el inicio de la fase de muerte se ha retrasado. En formas de realización más concretas, la invención está dirigida a (1) un procedimiento de cultivo celular y (2) un procedimiento para retrasar la fase de muerte de un cultivo celular, que comprende: cultivar células huésped que expresan una proteína de interés; y añadir compuesto polianiónico al cultivo celular en un momento posterior a la inoculación que es durante la fase de crecimiento inicial; en el que el inicio de la fase de muerte se ha retrasado. En formas de realización más concretas, la invención está dirigida a (1) un procedimiento de cultivo celular y (2) un procedimiento para retrasar la fase de muerte de un cultivo celular, que comprende: cultivar células huésped que expresan una proteína de interés; y añadir compuesto polianiónico al cultivo celular durante la segunda mitad de la fase de crecimiento inicial; en el que el inicio de la fase inicial de muerte se ha retrasado. En otras formas de realización concretas, la invención está dirigida a un procedimiento para retrasar la fase de muerte de un cultivo celular, que comprende: cultivar células huésped que expresan una proteína de interés; y añadir compuesto polianiónico al cultivo celular durante o aproximadamente al final de la fase de crecimiento inicial; en el que el inicio de la fase de muerte se ha retrasado.

El inicio de la fase de muerte puede retrasarse durante cualquier periodo de tiempo. A modo de ejemplo únicamente, el inicio de la fase de muerte se puede retrasar durante 1-10 días, durante 2-9 días, durante 3-8 días o durante aproximadamente 5 días. Preferentemente, el inicio de la fase de muerte se retrasa durante uno o más días, más preferentemente durante dos o más días, más preferentemente durante tres o más días, más preferentemente durante cuatro o más días. En otra forma de realización concreta del procedimiento de cultivo celular y el procedimiento de incrementar la viabilidad celular de la invención descritos en lo que antecede, el compuesto polianiónico se añade en un momento posterior a la inoculación que es durante la fase inicial de muerte.

Se ha descubierto (véanse los Ejemplos 9 y 10) que cuando el compuesto polianiónico se añade durante la fase inicial de muerte, la fase de muerte puede detenerse. Detener la fase de muerte significa parar, durante algún periodo de tiempo, el descenso de la densidad de células viables observado en ausencia de la adición de compuesto polianiónico. La detención se puede producir inmediatamente después de la adición de compuesto polianiónico o se puede producir después. Cuando la fase de muerte se detiene, después se puede producir una fase de crecimiento o una fase estacionaria. En último término, por supuesto, el cultivo entrará de nuevo en una fase de muerte.

Por tanto, en otras formas de realización, la invención está dirigida a (1) un procedimiento de cultivo celular y (2) un procedimiento para detener la fase de muerte de un cultivo celular, que comprende: cultivar células huésped que expresan una proteína de interés; y añadir compuesto polianiónico al cultivo celular durante la fase inicial de muerte; en el que la fase de muerte se detiene.

La fase de muerte se puede detener durante cualquier periodo de tiempo antes de volver a entrar en la fase de muerte. A modo de ejemplo únicamente, la fase de muerte puede detenerse durante 1-20 días, durante 2-18 días, durante 5 15 días o durante 8-13 días. Preferentemente, la fase de muerte se detiene durante uno o más días, más preferentemente durante dos o más días, más preferentemente durante tres o más días, más preferentemente durante cuatro o más días. No necesariamente implica continuidad de la detención de la muerte, es decir, pueden producirse disminuciones “ locales” en el perfil de la densidad de células viables entre dos tramos de densidad de células viables constante o en incremento.

Los tiempos de ciclo de los procedimientos de los cultivos celulares, en particular los procedimientos no continuos, normalmente están limitados por la densidad de células viables restante, que disminuye durante la fase de muerte. Tiempos de ciclo más largos permite alcanzar títulos de producto más elevados. Por tanto es deseable retrasar la fase de muerte, incluido extender la fase de crecimiento lo más posible o detener la fase de muerte. Los problemas de la calidad del producto también ofrecen una motivación para retrasar o detener la fase de muerte, ya que la muerte de las células puede liberar sialidasas en el sobrenadante del cultivo, que podrían reducir el contenido en ácido siálico de la proteína expresada. Los problemas sobre la purificación de proteínas ofrecen otra motivación para retrasar o detener la fase de muerte. La presencia de restos celulares y el contenido en células muertas en el cultivo pueden afectar de forma negativa a la capacidad de aislar y/o purificar el producto proteico al final del ciiclo del cultivo.

En formas de realización concretas, cualquiera de los procedimientos de cultivo celular descritos en la presente memoria descriptiva que implican dos o más cambios de temperatura y cualquiera de los procedimientos de cultivo celular descritos en la presente memoria descriptiva que implican retraso de la adición de compuesto polianiónico se usan juntos en un cultivo celular. En formas de realización concretas, la invención está dirigida a (i) un procedimiento de cultivo celular y (ii) un procedimiento para incrementar la viabilidad celular, que comprende: a) cultivar las células huésped que producen una proteína de interés a una temperatura de 37°C, o de casi 37°C, en condiciones y durante un periodo de tiempo que permite el crecimiento celular; b) disminuir la temperatura del cultivo celular y cultivar las células a una segunda temperatura de 34°C, o de casi 34°C, comenzando aproximadamente el día 5 al día 7; (c) disminuir de nuevo la temperatura del cultivo celular y cultivar las células a una tercera temperatura de 32°C, o de casi 32°C, comenzando aproximadamente el día 6 al día 14; y (d) añadir compuesto polianiónico al cultivo celular en un momento posterior a la inoculación.

En una forma de realización concreta, la presente invención está dirigida a un procedimiento de cultivo celular que comprende retrasar la adición de compuesto polianiónico tal como se ha descrito con anterioridad y además incluye alimentar las células con D-galactosa. En otra forma de realización concreta, la presente invención está dirigida a un procedimiento de cultivo celular que comprende retrasar la adición de compuesto polianiónico tal como se ha descrito con anterioridad, dos o más cambios de temperatura tal como se ha descrito con anterioridad y alimentar las células con D-galactosa. Por tanto, en una forma de realización concreta, la invención está dirigida a un procedimiento de cultivo celular para la producción de proteína, que comprende: cultivar células huésped que producen una proteína de interés en el cultivo celular en condiciones que permitan la producción de proteína; alimentar las células con D-galactosa; y añadir compuesto polianiónico al cultivo celular en un momento después de la inoculación. En otra forma de realización concreta, la invención está dirigida a un procedimiento de cultivo celular para la producción de proteína, que comprende: cultivar las células huésped que producen una proteína de interés en el cultivo celular en condiciones que permitan la producción de proteína; cultivar las células huésped a una temperatura de 37°C, o de casi 37°C, en condiciones y durante un periodo de tiempo que permitan el crecimiento celular; cultivar las células a una segunda temperatura de 34°C, o de casi 34°C; cultivar las células a una tercera temperatura de 32°C, o de casi 32°C; y alimentar las células con D-galactosa; y añadir compuesto polianiónico al cultivo celular en un momento posterior a la inoculación.

Técnicas y procedimientos relacionados con la purificación y análisis de glicoproteínas

En los procedimientos de cultivo abarcados por la presente invención, normalmente la proteína producida por las células se recolecta, recupera, aísla y/o purifica, o purifica sustancialmente, según se desee, al final de todo el periodo de cultivo celular usando procedimientos de aislamiento y purificación tal como se conocen y practican en la técnica. Preferentemente, la glicoproteína secretada por las células cultivadas se aísla del medio de cultivo o del sobrenadante; no obstante, la proteína también se puede recuperar a partir de las células huésped, por ejemplo lisados celulares, usando procedimientos y prácticas conocidos en la técnica y se describen adicionalmente más adelante.

El hidrato de carbono complejo que comprende la glicoproteína producida mediante los procedimientos de la presente invención se puede analizar de forma rutinaria, si se desea, mediante técnicas convencionales de análisis de hidratos de carbono. Por ejemplo, técnicas tales como transferencia de lectina, bien conocidas en la técnica, revelan proporciones de manosa terminal u otros azúcares tales como galactosa. La terminación de oligosacáridos con uno, dos tres o cuatro antenas con ácidos siálicos se puede confirmar mediante la liberación de azúcares de la proteína usando hidracina anhidra o procedimientos enzimáticos y fraccionamiento de oligosacáridos por cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño u otros procedimientos que son bien conocidos en la técnica.

La pl de la glicoproteína también se puede medir antes y después del tratamiento con neuraminidasa para eliminar los ácidos siálicos. Un incremento de pl tras el tratamiento con neuraminidasa indica la presencia de ácidos siálicos en la glicoproteína. Las estructuras de hidratos de carbono suelen estar en la proteína expresada en forma de hidratos de carbono unidos por N o unidos por O. Los hidratos de carbono unidos por N o unidos por O difieren principalmente en sus estructuras del núcleo. La glicosilación por enlace N se refiere a la unión del resto hidrocarburo mediante GlcNAc a un residuo de asparagina en la cadena peptídica. Los hidratos de carbono unidos a través de N contienen una estructura del núcleo común de Man 1-6(Man 1-3) Manl31-4GlcNAcl31-4GlcNAcl3-R, en la que R en esta estructura del núcleo representa un residuo de asparagina. La secuencia peptídica de la proteína producida contendrá asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina y asparagina-X-cisteína, donde X es cualquier aminoácido a excepción de prolina.

Por el contrario, los hidratos de carbono unidos a través de O se caracterizan por una estructura del núcleo común que es GalNAc unida al grupo hidroxilo de una treonina o serina. De los hidratos de carbono unidos a través de N o a través de O, los más importantes son el complejo de hidratos de carbono unidos a través de N y de O. Dichos hidratos de carbono complejos contienen varias estructuras de antena. Las estructuras externas mono, bi, tri y tetra son importantes para la adición de ácidos siálicos terminales. Dichas estructuras de cadena externas proporcionan sitios adicionales para los azúcares y enlaces específicos que comprenden los hidratos de carbono de los productos proteicos.

Los hidratos de carbono resultantes se pueden analizar por cualquier procedimiento conocido en la técnica. En la técnica se conocen varios procedimientos para analizar la glicosilación y son útiles en el contexto de la presente invención. Estos procedimientos proporcionan información sobre la identidad y la composición del oligosacárido unido al péptido producido. Los procedimientos para el análisis de hidratos de carbono útiles en relación con la presente invención incluyen, entre otros, cromatografía en lectinas; HPAEC-PAD, que usa cromatografía de intercambio aniónico a pH elevado para separar los oligosacáridos según la carga; RMN; espectrometría de masas; HPLC; GPC; análisis de la composición de los monosacáridos; y digestión enzimática secuencial.

Además, en la técnica se conocen y practican procedimientos para liberar los oligosacáridos. Estos procedimientos incluyen 1) procedimientos enzimáticos, que normalmente se efectúan usando péptido-N-glicosidasa F/endo-pgalactosidasa; 2) procedimientos de eliminación p usando un entorno alcalino estricto para liberar principalmente las estructuras unidas a través de O; y 3) procedimientos químicos usando hidracina anhidra para liberar los oligosacáridos unidos tanto a través de N como a través de O. El análisis se puede realizar usando las etapas siguientes: 1. diálisis de la muestra contra agua desionizada para eliminar todas las sales tampón, seguida por liofilización. 2. Liberación de las cadenas oligosacáridas intactas con hidracina anhidra. 3. Tratamiento de las cadenas oligosacáridas intactas con HCl metabólico anhidro para liberar monosacáridos individuales en forma de derivados de O-metilo. 4. N-acetilación de cualquier grupo amino primario. 5. Derivación para dar glicósidos per-O-trimetilsililmetilo.

6. Separación de estos derivados mediante cromatografía capilar de gas-líquido (GLC) en una columna de CP-SIL8.

7. Identificación de derivados glicosídicos individuales por el tiempo de retención de la GLC y la espectroscopia de masas en comparación con los patrones conocidos. 8. Cuantificación de derivados individuales mediante FID con un patrón interno (13-O-metil-D-glucosa).

Los azúcares neutros y amino se pueden determinar mediante cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento combinada con detección amperiométrica pulsada (HPAE-PAD Carbohydrate System; Oionex Corp.). Por ejemplo, los azúcares se pueden liberar mediante hidrólisis en ácido trifluoroacético al 20% (v/v) a 100°C durante 6 horas. Después, los hidrolizados se secan mediante liofilización o con un Speed-Vac (Savant Instruments). A continuación, los residuos se disuelven en solución al 1% de acetato sódico trihidrato y se analizan en una columna HPLC-AS6 (tal como describen Acumula y col., 1991, Anal. Biochem., 195:269-280).

Como alternativa se pueden analizar los hidratos de carbono mediante inmunotransferencia. En este procedimiento, los hidratos de carbono unidos a proteína se detectan usando un sistema comercial de detección de glicanos (Boehringer), que se basa en el procedimiento de inmunotransferencia oxidativa descrita por Haselbeck y col. (1993, Glycoconjllgate J., 7:63). Se sigue el protocolo de tinción recomendado por el fabricante, excepto porque la proteína se transfiere a una membrana de difluoruro de polivinilideno en lugar de una membrana de nitrocelulosa y los tampones de bloqueo contienen 5% de seroalbúmina bovina en tampón Tris 10 mM, pH 7,4, con 0,9% de cloruro sódico. La detección se lleva a cabo con anticuerpos anti-digoxigenina unidos con un conjugado de fosfato alcalino (Boehringer), dilución 1:1000 en solución salina tamponada con Tris usando los sustratos de fosfatasa 4-nitroazul cloruro de tetrazolio, 0,03% (p/v) y 0,03% (p/v) de 5-bromo-4-cloro-3-indoil-fosfato en tampón Tris 100 mM, a pH 9,5, que contiene cloruro sódico 100 mM y cloruro magnésico 50 mM. Normalmente, las bandas de proteína que contienen hidrato de carbono se visualizan en aproximadamente 10 a 15 minutos.

Los hidratos de carbono asociados con proteínas también se pueden analizar mediante digestión con péptido-N-glicosidasa F. De acuerdo con este procedimiento, el residuo se suspende en 14 |il de un tampón que contiene SDS al 0,18%, betamercaptoetanol 18 mM, fosfato 90 mM, EDTA 3,6 mM, a pH 8,6, y se calienta a 100°C durante 3 minutos. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, la muestra se divide en dos partes iguales. Una parte, que no se trata más, sirve como control. La otra parte se ajusta a aproximadamente 1% del detergente NP-40, seguido por la adición de 0,2 unidades de péptido-N-glicosidasa F (Boehringer). Ambas muestras se calientan a 37°C durante 2 horas y después se analizan mediante electroforesis SDS-gel de poliacrilamida.

Además, el contenido en ácido siálico del producto glicoproteico se evalúa mediante procedimientos convencionales. Por ejemplo, el ácido siálico se puede determinar por separado mediante un procedimiento colorimétrico directo (Yao y col., 1989, Anal. Biochem., 179:332-335), usando, preferentemente, muestras por triplicado. Otro procedimiento de determinación de ácido siálico implica el uso de ácido tiobarbitúrico (TBA) tal como han descrito Warren y col., 1959, J. Biol. Chem., 234:1971-1975. Otro procedimiento más implica cromatográfica de alto rendimiento, tal como describen Ogawa y col., 1993, J. Chromatography, 612:145-149.

Con fines ilustrativos, para la recuperación, aislamiento y/o purificación de las glicoproteínas, el medio de cultivo celular o el lisado celular se centrifugan para eliminar partículas celulares y residuos celulares. El producto polipeptídico deseado se aísla o purifica de las proteínas y polipéptidos solubles contaminantes mediante técnicas de purificación adecuadas. Los procedimientos siguientes proporcionan ejemplos, aunque no limitantes, de procedimientos de purificación de proteínas: Separación o fraccionamiento en columnas de intercambio iónico o inmunoafinidad; precipitación en etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en una resina, tal como sílice, o resina de intercambio catiónico, por ejemplo DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación en sulfato amónico; filtración en gel usando, por ejemplo Sephadex G-75, Sefarosa; cromatografía en sefarosa proteína A para eliminación de inmunoglobulinas contaminantes; y similares. Otros aditivos, tales como inhibidores de proteasa (p. ej., PMSF o proteinasa K) se pueden usar para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación. El experto en la técnica entenderá que los procedimientos de purificación para un determinado polipéptido de interés pueden requerir modificaciones que permitan cambios en el polipéptido expresado de forma recombinante en cultivo celular. Dichos procedimientos de purificación que se pueden seleccionar para los hidratos de carbono y enriquecer en ácido siálico son particularmente preferidos, por ejemplo cromatografía en gel blando de intercambio iónico o HPLC con resinas de intercambio catiónico o aniónico, en las que se recoge(n) la(s) fracción(es) más ácida(s).

Células, proteínas y cultivo celular

En los métodos o procedimientos de cultivo celular de la presente invención, las células se pueden mantener en diversos medios de cultivo celular, es decir medio de cultivo basal, como se conoce convencionalmente en la técnica. Por ejemplo, los procedimientos se pueden aplicar para usar con grandes volúmenes de células mantenidas en el medio de cultivo, que se puede suplementar con nutrientes y similares. Normalmente, “medio de cultivo celular” (también denominado “medio de cultivo”) es un término que el experto en la técnica entiende y se sabe que hace referencia a una solución nutriente en la que se cultivan las células, preferentemente células animales o de mamífero, y que generalmente proporciona al menos uno o más componentes a partir de los siguientes: una fuente de energía (normalmente en forma de un hidrato de carbono tal como glucosa); todos los aminoácidos esenciales y, generalmente, los veinte aminoácidos básicos, más cisteína; vitaminas y/u otros compuestos orgánicos normalmente necesarios a concentraciones bajas; lípidos o ácidos grasos libres, por ejemplo ácido linoleico y oligoelementos, por ejemplo compuestos inorgánicos o elementos naturales que normalmente se requieren a concentraciones muy bajas, normalmente en el rango micromolar. El medio de cultivo celular también se puede suplementar de modo que contenga una variedad de componentes opcionales, tales como hormonas y otros factores de crecimiento, por ejemplo insulina, transferrina, factor de crecimiento epidérmico, suero y similares; sales, por ejemplo de calcio, magnesio y fosfato, y tampones, por ejemplo HEPES; nucleósidos y bases, por ejemplo adenosina, timidina, hipoxantina; e hidrolizados proteicos y tisulares, por ejemplo proteína animal hidrolizada (peptona o mezclas de peptona, que se pueden obtener de subproductos animales, gelatina purificada o material vegetal); antibióticos, por ejemplo gentamicina; y agentes protectores celulares, por ejemplo un poliol Pluronic Pluronic F68). Se prefiere un medio de nutrición celular que no tenga suero y que no tenga productos o ingredientes de origen animal.

Como aprecia el técnico, las células animales o de mamífero se cultivan en un medio adecuado para las células concretas que se están cultivando y que un experto en la técnica puede determinar sin experimentación innecesaria. Se pueden utilizar medios disponibles comercialmente e incluyen, por ejemplo, medio mínimo esencial (MEM, MEM, Sigma, St. Louis, MO); medio F10 de Ham (Sigma); medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma); medio RPMI-1640 (Sigma); medio de cultivo celular HyClone (HyClone, Logan, UT); y medio definido químicamente (CD), que se formulan para tipos de células concretos, por ejemplo medio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA). A los medios de ejemplo anteriores se pueden añadir los componentes o ingredientes complementarios descritos con anterioridad, incluidos componentes opcionales, en concentraciones o cantidades adecuados, según sea necesario o se desea, y según saben y practican los en la técnica de rutina.

Además, las condiciones de cultivo celular adecuadas para los procedimientos de la presente invención son aquéllas que normalmente se emplean y conocen para el cultivo de células discontinuo, discontinuo con alimentación o continuo, prestando atención al pH, por ejemplo de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5; oxígeno disuelto (O²), por ejemplo entre aproximadamente 5-90% de saturación de aire, y dióxido de carbono (CO²), agitación y humedad, además de la temperatura. Como ejemplo ilustrativo, aunque no limitante, un medio de cultivo celular adecuado para los procedimientos discontinuos con alimentación de la presente invención comprende un medio CD-CHO modificado (Invitrogen, Carlsbad, CA) y un medio de alimentación que contiene, preferentemente, D-galactosa. (P. ej., Ejemplos 1 y 3).

Células animales, células de mamífero, células cultivadas, células huésped animales o de mamífero, células huésped, células recombinantes, células huésped recombinantes y similares, son, todos ellos, términos para las células que se pueden cultivar de acuerdo con los procedimientos de la presente invención. Normalmente, dichas células son líneas celulares obtenidas o derivadas de mamíferos y pueden crecer y sobrevivir cuando se introducen en cultivo monocapa o en cultivo en suspensión en medio que contiene los nutrientes y/o factores de crecimiento adecuados. Los expertos en la técnica pertinente pueden determinar con facilidad y empíricamente los factores de crecimiento y nutrientes que son necesarios para el crecimiento y mantenimiento de cultivos celulares concretos, tal como describen, por ejemplo, Barnes y Sato, (1980, Cell, 22:649); en Mammalian Cell Culture, Ed. J.P. Mather, Plenum Press, NY, 1984; y en la patente de EE.UU. N° 5.721.121.

Se pueden cultivar numerosos tipos de células de acuerdo con los procedimientos de la presente invención. Normalmente, las células son células animales o de mamífero que pueden expresar y secretar, o que pueden someterse a ingeniería molecular para expresar y secretar, grandes cantidades de una proteína concreta, más particularmente una glicoproteína de interés, en el medio de cultivo. Debe entenderse que la glicoproteína producida por una célula huésped puede ser endógena u homóloga de la célula huésped. Como alternativa, y preferentemente, la glicoproteína es heteróloga, es decir extraña, de la célula huésped, por ejemplo una glicoproteína humana producida y secretada por una célula huésped de ovario de hámster chino (CHO). También preferentemente, las glicoproteínas de mamífero, es decir las inicialmente obtenidas o derivadas de un organismo de mamífero, se consiguen mediante los procedimientos de la presente invención y son secretadas, preferentemente, por las células en el medio de cultivo.

Ejemplos de glicoproteínas de mamífero que se pueden producir de forma ventajosa mediante los procedimientos de la presente invención incluyen, sin limitaciones, citocinas, receptores de citocinas, factores de crecimiento (p. ej., EGF, HER-2, FGF-a, FGF-p, TGF-a, TGF-p PDGF. IGF-1, IGF-2, NGF, NGF-P); receptores del factor de crecimiento, incluidas proteínas de fusión o quiméricas. Otros ejemplos no limitantes incluyen hormonas de crecimiento (p. ej., hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento bovina); insulina (p. ej., cadena de insulina A y cadena de insulina B), proinsulina; eritropoyetina (EPO); factores estimulantes de colonias (p. ej., G-CSF' GM-CSf , M-CSF); interleucinas (p. ej., IL-1 a IL-12); factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y su receptor (VEFG-R); interferones (p. ej., IFN-a, p o y); factor de necrosis tumoral (p. ej., TNF-a y TNF-P) y sus receptores, TNFR-1 y TNFR-2; trombopoyetina (TPO); trombina; péptido natriurético cerebral (BNP); factores de coagulación (p. ej., Factor VIII, Factor IX, factor de von Willebrand y similares); factores anti-coagulación; activador del plasminógeno tisular (TPA), p. ej., urocinasa o TPA de tipo tisular o de orina humana; hormona estimuladora del folículo (FSH); hormona luteinizante (LH); calcitonina; proteínas CD (p. ej., CD3, CD4, CD8, CD28, CD19 etc.); proteínas Ct La (p. ej., CTLA4); proteínas receptoras de células T y células B; proteínas morfogénicas óseas (BNP, p. ej., BMP-1, BMP-2, BMP-3 etc.); factores neurotróficos, por ejemplo factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF); neurotrofinas, por ejemplo 3-6 renina; factor reumatoide; RANTES; albúmina; relaxina; proteína inhibidora de macrófagos (p. ej., MIP-1, MIP-2); proteínas o antígenos virales; proteínas de la membrana de superficie; proteínas de los canales iónicos; enzimas; proteínas reguladoras; anticuerpos; proteínas inmunomoduladoras (p. ej., HLA, MHC, la familia de B7); receptores domésticos; proteínas de transporte; superóxido dismutasa (SOD); proteínas receptoras acopladas a proteína G (GPCR); proteínas neuromoduladoras; proteínas y péptidos asociados con la enfermedad de Alzheimer (p. ej., A-beta) y otras tal como se conocen en la técnica. Proteínas y polipéptido de fusión, proteínas y polipéptidos quiméricos, así como fragmentos 0 porciones, o mutantes, variantes, o análogos de cualquiera de las proteínas y polipéptidos mencionados con anterioridad, también se incluyen entre las proteínas, polipéptidos y péptidos adecuados que se pueden producir mediante los procedimientos de la presente invención.

Ejemplos no limitantes de células huésped animales o de mamífero adecuadas para alojar, expresar y producir proteínas para el posterior aislamiento y/o purificación incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), tales como CHO-K1 (ATCC CCL-61), DG44 (Chasin y col., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556; Kolkekar y col., 1997, Biochemistry, 36: 10901-10909; y el documento WO 01/92337 A2), células CHO negativas para la dihidrofolato reductasa (CHO/-DHFR, Urlaub y Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216), y células dp12.CHO (patentes de EE.UU. n° 5.721.121); células CV1 de riñón de mono transformadas con SV40 (células COS, Co S-7, At Cc CRL-1651); células de riñón embrionario humano (p. ej., células 293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham y coI., 1977, J. Gen. Virol., 36:59); células de riñón de cachorro de hámster (BHK, ATCC CCL-1 0); células de riñón de mono (CV1, ATCC CCL-70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, 1980, BioI. Reprod., 23:243-251); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL-2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL-34); células de pulmón humano (W 138, ATCC CCL-75); células de hepatoma humano (HEP-G2, HB 8065); células de tumor de mama de ratón

(MMT 060562, ATCC CCL-51); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL-1442); células TRI (Mather, 1982, Annals NY Acad. Sci., 383:44-68); células MCR 5; células FS4. Se prefieren las células CHO, particularmente las células CHO/-DHFR.

Las células adecuadas para cultivar en los procedimientos y procedimientos de la presente invención pueden contener en su interior, por ejemplo mediante transformación, transfección, infección o inyección, vectores de expresión (constructos), tales como plásmidos y similares, que alojan secuencias de codificación, o porciones de las mismas, que codifican las proteínas para la expresión y la producción en el procedimiento de cultivo. Dichos vectores de expresión contienen los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación insertada. Se pueden usar procedimientos bien conocidos y practicados para los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contengan secuencias que codifican las proteínas y polipéptidos producidos, así como los elementos adecuados de control de la transcripción y la traducción. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se describen en J. Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. y en F.M. Ausubel y col., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.

Los elementos control o secuencias reguladoras son las regiones no traducidas del vector, por ejemplo potenciadores, promotores, regiones no traducidas en 5' y 3', que interaccionan con las proteínas de las células huésped para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Tales elementos pueden variar en su concentración y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y de la célula huésped utilizados, se puede usar cualquier número de elementos de transcripción y de traducción adecuados, incluidos los promotores constitutivos e inducibles. En los sistemas de células de mamíferos se prefieren los promotores de genes de mamíferos o de virus de mamíferos, Los constructos para usar en los sistemas de expresión de proteínas están diseñados para contener al menos un promotor, una secuencia potenciadora (opcional para los sistemas de expresión en mamíferos) y otras secuencias necesarias o requeridas para la adecuada transcripción y regulación de la expresión génica (p. ej., secuencias de inicio y terminación de la transcripción, sitios del origen de replicación, secuencias de poliadenilación, por ejemplo la secuencia poli A de la hormona de crecimiento bovina (BGH).

Como apreciarán los expertos en la técnica, la selección del vector adecuado, por ejemplo plásmido, componentes para la transcripción, expresión y aislamiento adecuados de las proteínas producidas en los sistemas de expresión eucarióticos (p. ej., de mamíferos) es conocida y determinada y practicada de forma rutinaria por los expertos en la técnica. La expresión de proteínas por las células cultivadas de acuerdo con los procedimientos de la presente invención se puede colocar bajo el control de promotores, tal como promotores virales, por ejemplo los promotores de citomegalovirus (CMV), del virus del sarcoma de Rous (RSV), de la fosfoglicerol cinasa (p Gk ), de la timidina cinasa (TK) o de la a-actina. Además, los promotores regulados confieren capacidad de inducción por compuestos o moléculas concretos, por ejemplo el elemento de respuesta a glucocorticoides (GRE) del virus del tumor mamario de ratón (MMTV) es inducido por glucocorticoides (V. Chandler y col., 1983, Cell, 33:489-499). Asimismo se pueden usar promotores o elementos reguladores específicos del tejido (G. Swift y coI., 1984, Cell, 38:639-646), en caso necesario o deseado.

Los constructos de expresión se pueden introducir en las células mediante diversos procedimientos de transferencia génica conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo procedimientos de transfección génica convencionales tales como co-precipitación de fosfato cálcico, transfección liposomal, microinyección, electroporación e infección o transducción viral. La elección del procedimiento está dentro de la competencia del experto en la técnica. Será evidente para los expertos en la técnica que uno o más constructos portadores de secuencias de ADN para la expresión en células se pueden transfeccionar a las células de modo que los productos de expresión se producirán después y/o se obtendrán de las células.

En un aspecto concreto, se prefieren los sistemas de expresión de mamíferos que contienen secuencias control y reguladoras adecuadas para usar en las células de mamífero que expresan proteínas de la presente invención. Secuencias control eucarióticas de uso habitual para generar vectores de expresión en mamíferos incluyen promotores y secuencias control compatibles con células de mamífero tales como, por ejemplo, el promotor del citomegalovirus (CMV) (vector CDM8) y el vector rcln del virus del sarcoma aviar (ASV). Otros promotores de uso habitual incluyen los promotores tempranos y tardíos del virus de simio 40 (SV40) (Fiers y coI., 1973, Nature, 273: 113) u otros promotores virales tales como los derivados del polioma, el adenovirus 2 y el virus del papiloma bovino. También se puede usar un promotor inducible, tal como HMTII (Karin y col., 1982, Nature, 299:797-802).

Ejemplos de vectores de expresión adecuados para las células huésped eucarióticas incluyen, entre otros, vectores para células huésped de mamífero (p. ej., BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); vectores pVPakc, vectores pCMV, vectores pSG5 (Stratagene), vectores retrovirales (p. ej., vectores pFB (Stratagene)), pcDNA-3 (Invitrogen), vectores adenovirales; vectores asociados con adenovirus, vectores de baculovirus, vectores de levaduras (p.ej., vectores pESC (Stratagene)) o formas modificadas de cualquiera de los anteriores. Los vectores también pueden contener secuencias potenciadores anteriores o posteriores a las secuencias de la región promotora para optimizar la expresión génica.

También se puede usar un marcador seleccionable en un vector recombinante (p. ej., un plásmido) para conferir resistencia a las células que alojan (preferentemente que tienen integrado de forma estable) el vector para permitir su selección en un medio de selección adecuado. Se pueden usar numerosos sistemas de selección, incluidos, entre otros, los genes de timidina cinasa del virus del herpes simple (HSV TK), (Wigler y col., 1977, Cell, 11:223), la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT), (Szybalska y Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:202) y la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y coI., 1980, Cell, 22:817), que se pueden emplear en células tk-, hgprt- o aprt-(APRT), respectivamente.

La resistencia anti-metabolito también se puede usar como base de la selección para los siguientes ejemplos no limitantes de genes marcadores: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler y col., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:357; y O'Hare y col., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G418 (Clinical Pharmacy, 12:488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy, 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:573-596; Mulligan, 1993, Science, 260:926-932; Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem., 62: 191-21; May, 1993, TIB TECH, 11 (5):155-215; e higro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre y col., 1984, Gene, 30: 147). Se pueden aplicar procedimientos habitualmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante para seleccionar los clones de células recombinantes necesarios y dichos procedimientos se describen en, por ejemplo, Ausubel y col. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; en los capítulos 12 y 13, Dracopoli y col. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin y coI., 1981. J. Mol. BioI., 150: 1, que se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad.

Además, los niveles de expresión de una molécula proteica expresada se pueden incrementar mediante amplificación vectorial (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning", Vol. 3, Academic Press, New York, 1987). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa una proteína se puede amplificar, un incremento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped aumentará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con el gen codificador de la proteína, la producción de la proteína aumentará de forma concomitante (Crouse y coI., 1983, Mol. Cell. BioI., 3:257).

Los vectores que alojan el ácido nucleico que codifica la glutamina sintasa (GS) o la dihidrofolato reductasa (DHFR) como marcadores seleccionables se pueden amplificar en presencia de los fármacos metionina sulfoximina o metotrexato, respectivamente. Una ventaja de los vectores basados en glutamina sintasa es la disponibilidad de líneas celulares (p. ej., la línea celular del mieloma murino NSO) que son negativas para la glutamina sintasa. Los sistemas de expresión de glutamina sintasa también pueden funcionar en las células que expresan glutamina sintasa (p. ej., células CHO) proporcionando inhibidor adicional para evitar el funcionamiento del gen endógeno.

Los vectores que expresan DHFR como marcador seleccionable incluyen, entre otros, el plásmido pSV2-dhfr (Subramani y col., Mol. Cell. BioI. 1:854 (1981) Los vectores que expresan glutamina sintasa como marcador seleccionable incluyen, entre otros, el vector de expresión Pee6 descrito en Stephens y Cockett, 1989, Nucl. Acids. Res., 17:7110. Un sistema de expression de glutamina sintasa y componentes del mismo se detalla en las publicaciones PCT: W087104462; W086/05807; W089/01 036; W089/10404; y W091/06657, que se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad. De forma adicional, los vectores de expresión de glutamina sintasa que se pueden usar de acuerdo con la presente invención están disponibles comercialmente en suministradores, incluido, por ejemplo, Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH).

En una forma de realización concreta, una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de CTLA4 soluble o una molécula mutante de CTLA4 soluble se puede insertar en un vector diseñado para expresar secuencias extrañas en un huésped eucariótico. Los elementos reguladores del vector pueden variar de acuerdo con el huésped eucariótico concreto. Los vectores que expresan la molécula de CTLA4 soluble o la molécula mutante de CTLA4 soluble en células huésped eucarióticas pueden incluir secuencias potenciadoras para optimizar la expresión de proteínas.

Tipos de cultivos celulares

Con el fin de entender, aunque sin limitaciones, el experto apreciará que cultivos celulares y ciclos de cultivo para la producción de proteínas pueden incluir tres tipos generales; a saber, cultivo continuo, cultivo discontinuo y cultivo discontinuo con alimentación. En un cultivo continuo, por ejemplo, se proporciona a las célula suplemento fresco del medio de cultivo (Es decir, medio de alimentación) durante el periodo de cultivo, al tiempo que se retira el medio de cultivo a diario y el productos se recolecta, por ejemplo, a diario o de forma continua. En el cultivo continuo, el medio de alimentación se puede añadir a diario y se puede añadir de forma continua, es decir en forma de goteo o de infusión. Para el cultivo continuo, las células pueden permanecer en cultivo todo el tiempo que se desee, mientras las células permanezcan vivas y se mantengan las condiciones ambientales y de cultivo.

En el cultivo discontinuo, las células se cultivan inicialmente en medio y este medio ni se retira, sustituye ni suplementa, es decir, las células no son "alimentadas” con medio nuevo ni durante ni antes del final del ciclo de cultivo. El producto deseado se recolecta al final del ciclo de cultivo.

Para los cultivos discontinuos con alimentación, el tiempo del ciclo de cultivo se aumenta suplementando el medio de cultivo una o más veces al día (o de forma continua) con medio fresco durante el ciclo, es decir, las células son "alimentadas" con medio nuevo ("medio de alimentación") durante el periodo de cultivo. Los cultivos discontinuos con alimentación pueden incluir los diversos regímenes y tiempos de alimentación que se han descrito con anterioridad, por ejemplo a diario, en días alternos, cada dos días etc., más de una vez al día o menos de una vez al día y así sucesivamente. Además, los cultivos discontinuos con alimentación se pueden alimentar de forma continua con medio de alimentación. Después, el producto deseado se recolecta al final del ciclo de cultivo/producción. Preferentemente, la presente invención abarca cultivos celulares discontinuos con alimentación, con alimentación diaria con medio de alimentación que contiene D— galactosa, en el que los dos o más cambios de temperatura durante el periodo de cultivo dan un incremento de la producción de calidad de la proteína y puede extender la fase de producción de proteína más allá de lo que se produce cuando no se usa ningún cambio de temperatura o cuando se usa solo un cambio de temperatura. Los procedimientos de cultivo celular con múltiples cambios de temperatura se describen en solicitudes de patente de asignación común de EE.UU. de número de serie 60/436.101, presentadas el 23 de diciembre de 2002 y de EE.UU. de número de serie 10/ presentada junto con el presente documento, cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad.

En los aspectos de la invención que implican dos o más cambios de temperatura que comprenden los procedimientos de cultivo celular de la presente invención tienen como resultado más células viables que sobreviven en el cultivo hasta el final del procedimiento o del ciclo de producción. Cuando mayor es el número de células que sobreviven, mayor es la cantidad de producto proteico que se produce en un procedimiento de producción de proteínas no asociado con el crecimiento, tal como algunos de los ejemplos de la presente memoria descriptiva. Por tanto, al final del procedimiento se obtiene una cantidad acumulada mayor de un producto deseado. La velocidad de la producción de la proteína o glicoproteína por células individuales en el cultivo (es decir, productividad específica de la célula) no se ve afectada ni incrementada por los procedimientos de cultivo con cambio de temperatura de la invención. (p. ej., Ejemplo 6). En contraste con ello, en procedimientos de cultivo asociados con el crecimiento, la proteína se produce principalmente en las células en crecimiento durante la fase de crecimiento del cultivo.

De acuerdo con la presente invención, se puede llevar a cabo el cultivo celular y las células pueden producir glicoproteínas en condiciones para la producción de proteínas a pequeña o gran escala, usando vasos de cultivo y/o aparatos de cultivo que se emplean convencionalmente para el cultivo de células animales o de mamífero. Como los expertos en la técnica apreciarán, a escala de laboratorio normalmente se usan placas de cultivo tisular, matraces T y matraces giratorios. Para el cultivo a mayor escala (p. ej., 500 l, 5000 l y similares) se pueden usar procedimientos entre los que se incluyen un biorreactor de lecho fluidizado, un biorreactor de fibra hueca, cultivo en frasco giratorio o sistemas de biorreactor en tanque con agitación. Los microtransportadores pueden usarse o no con el frasco giratorio o sistemas de biorreactor en tanque con agitación. Los sistemas pueden funcionar en modo discontinuo, continuo o discontinuo con alimentación. De forma adicional, el aparato o sistema de cultivo puede estar o no equipado con un separador celular usando filtros, gravedad, fuerza centrífuga y similares.

Fases del cultivo celular y parámetros asociados

El término “ inoculación” se refiere a la adición de células al medio de partida para comenzar el cultivo.

La fase de crecimiento de un cultivo es la fase durante la cual la densidad de células viables en cualquier punto de tiempo es superior a la de cualquier punto de tiempo anterior.

La fase estacionaria de un cultivo es la fase durante la cual la densidad de células viables es aproximadamente constante (es decir, dentro de un error de medición) durante un periodo de tiempo de cualquier duración.

La fase de muerte de un cultivo es la fase siguiente a la fase de crecimiento o siguiente a la fase de crecimiento y la fase estacionaria, y durante la cual la densidad de células viables en cualquier punto de tiempo es menor que la de cualquier punto de tiempo anterior durante esa fase.

En un procedimiento de cultivo asociado con crecimiento, tal como los casos en los que el compuesto polianiónico produce una fase de crecimiento extendida, la fase de producción puede comenzar durante la fase de crecimiento extendida.

En un procedimiento de cultivo no asociado con crecimiento, la fase de producción del cultivo celular puede ser la fase estacionaria.

Preferentemente, el medio de cultivo se suplementa ("alimenta”) durante la fase de producción para soportar la producción continua de proteína, particularmente en una fase de producción extendida, y para conseguir cantidades grandes de producto glicoproteico de alta calidad (como se ejemplifica y/o se determina mediante un nivel final elevado de contenido en ácido siálico tras la recuperación de la proteína). La alimentación se puede producir a diario o de acuerdo con otros programas para soportar la viabilidad celular y la producción de proteína.

Durante una fase de producción extendida a temperaturas que se cambian para ser sucesivamente menores que la(s) temperatura(s) en las fases de crecimiento y de producción (inicial) estándar, las células son alimentadas y permanecen viables. Esto tiene como resultado la producción de producto proteico deseado durante un periodo de tiempo total extendido o mayor que el que se produce a la temperatura de cultivo inicial o cuando la temperatura se varía desde la temperatura de cultivo inicial solo una vez. El procedimiento de cultivo de acuerdo con la presente invención puede dar lugar a la supervivencia de más células viables hasta el final del periodo de cultivo. De acuerdo con esto, en algunas formas de realización, cuantas más células sobreviven, más células están produciendo el producto deseado. Esto, a su vez, tiene como resultado una mayor cantidad acumulada del producto al final del procedimiento de cultivo, en la que la velocidad de la producción de proteína por las células individuales, es decir la productividad específica de las células, sigue siendo la misma. (Véase, por ejemplo, el Ejemplo 4). La productividad específica de las células o la velocidad específica de las células, como se conoce en la técnica, normalmente se refiere a la velocidad específica de expresión del producto producido por la célula o por medida de la masa o volumen celular. La productividad específica celular se mide en gramos de proteína producida por célula al día, por ejemplo, y se puede medir de acuerdo con un procedimiento integral que implica las fórmulas siguientes:

dP/dt =qp X,

o

P = qpJot X dt

en las que qp es la constate de productividad celular específica; X es el número de células o el volumen celular o los equivalentes de masa celular; y dP/dt es la velocidad de la producción de proteína. Por tanto, qp se puede obtener a partir de un gráfico de la concentración del producto frente a la integral del tiempo de las células viables (lo* Xdt “días de células viables”). De acuerdo con esta fórmula, cuando la cantidad del producto glicoproteico producido se representa frente a los días de células viables, la pendiente es equivalente a la velocidad celular específica. Las células viables se pueden determinar mediante varias medidas, por ejemplo biomasa, tasa de captación de O2, lactasa deshidrogenasa (LDH), hematocrito o turbidez. (p. ej., la patente de EE.UU. n° 5.705.364 concedida a Etcheverry y col.).

Producción de moléculas de CTLA4 solubles y de moléculas mutantes de CTAL4 solubles mediante procedimientos de cultivo de la presente invención

En otras formas de realización abarcadas por la presente invención, los procedimientos de cultivo celular se utilizan para producir una molécula de CTLA4 soluble o molécula mutante de CTLA4 soluble, tal como se describe más adelante. Preferentemente, una de CTLA4 soluble es una proteína de fusión de CTLA4, preferentemente CTLA4Ig. Se prefiere más la CTLA4Ig que comprende los aminoácidos -1 a 357 o de 1 a 357 como se muestra en la FIG. 8. Más preferida es CTLA4Ig que consiste en los aminoácidos -1 a 357 o 1 a 357 como se muestra en la FIG. 8. Preferentemente, una molécula mutante de CTLA4 soluble es L104EA29YIg que comprende los aminoácidos -1 a 357 o -1 a 357 como se muestra en la FIG. 9, más preferentemente que consiste en los aminoácidos -1 a 357 o 1 a 357 como se muestra en la FIG. 9. Los procedimientos de cultivo celular con cambio de temperatura de dos y tres etapas que implican las fases de producción extendida para el producto proteico y alimentación con medio que contiene D-galactosa son especialmente adecuados para generar cantidades grandes y de alta calidad de moléculas de CTLA4 soluble y de moléculas mutantes de CTLA4 soluble por sus células huésped en cultivo.

En una forma de realización preferida, el CTLA4Ig se produce mediante células huésped sometidas a ingeniería recombinante. La proteína de fusión CTLA4Ig se puede producir de forma recombinante por las células CHO transfeccionadas con un vector que contiene la secuenciad e ADN que codifica CTLA4Ig. (Véase, la patente de EE.UU. n° 5.844.095 concedida a Linsley y coI. y los Ejemplos de la presente memoria descriptiva). La proteína de fusión CTLA4Ig se produce en cantidades altas y se sialila de forma adecuada cuando se cultiva de acuerdo con los procedimientos con cambios de temperatura de múltiples etapas de la presente invención. La invención proporciona la producción de niveles altos de producto proteico recuperable, por ejemplo del producto proteico CTLA4Ig sialilado. En otra forma de realización preferida, la molécula mutante CTLA4 soluble L104EA29YIg que comprende los aminoácidos -1 a 357 o de 1 a 357 como se muestra en la FIG. 9 se produce mediante los procedimientos de cultivo celular de la presente invención.

Un ligando de CTLA4 es una molécula B7. Como se usa en la presente memoria descriptiva, “ligando” se refiere a una molécula que reconoce y se une de forma específica a otra molécula. La interacción de una molécula y su ligando se puede regular con los productos de los procedimientos de cultivo de la presente invención. Por ejemplo, la interacción de CTLA4 con su ligando B7 se puede bloquear mediante la administración de moléculas de CTLA4Ig. Como otros ejemplos, la interacción del factor de necrosis tumoral (TNF) con su ligando, el receptor de TNF (TNFR) se puede bloquear mediante la administración de etanercept u otras moléculas de bloqueo de TNF/TNFR.

El CTLA4 salvaje o “CTLA4 no mutado” tiene la secuencia de aminoácido del CTLA4 natural de longitud completa como se muestra en la FIG. 10 (y también como se describe en las patentes de EE.UU. n° 5.434.131, 5.844.095 y 5.851.795, que se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad) o cualquier porción del mismo que reconoce y se une a la molécula B7, o interfiere con una molécula de B7, de modo que se bloquea la union a CD28 y/o CTLA4 (p. ej., CD28 y/o CTLA4 endógeno). E CTLA4 salvaje comprende porciones concretas, incluidas, por ejemplo, el dominio extracelular del CTLA4 salvaje que comienza con metionina en la posición 1 y termina en el ácido aspártico de la posición 124, o el dominio extracelular del CTLA4 salvaje que comienza con alanina en la posición -1 y termina en el ácido aspártico de la posición 124 como se muestra en la FIG. 10.

El CTLA4 salvaje natural es una proteína de superficie celular que tiene un dominio extracelular en N terminal, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático en C-terminal. El dominio extracelular se une a una molécula diana, tal como a una molécula de B7. En una célula, la proteína CTLA4 salvaje natural se traduce como un polipéptido inmaduro que incluye un péptido señal en el extremo amino o N-terminal. El polipéptido inmaduro sufre un procesamiento postraduccional, que incluye escisión y eliminación del péptido señal para generar un producto de la escisión de CTLA4 que tiene un extremo N-terminal recién generado que difiere del extremo N-terminal en la forma inmadura. Un experto en la técnica apreciará que se puede producir el procesamiento postraduccional, que elimina uno o más de los aminoácidos del extremo N-terminal recién generado del producto de escisión de CTLA4. La proteína CTLA4 madura puede comenzar en metionina en la posición 1 o alanina en la posición -1. La forma madura de la molécula de CTLA4 incluye el dominio extracelular o cualquier porción del mismo que se une a B7.

Una molécula mutante de CTLA4, como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una molécula que comprende CTLA4 salvaje como se muestra en la FIG. 10, o cualquier porción o derivado de la misma, que tiene una mutación, o múltiples mutaciones, en la secuencia de CTLA4 salvaje, preferentemente en el dominio extracelular de CTLA4 salvaje, y se une a B7. Una molécula mutante de CTLA4 tiene una secuencia que es similar, pero no idéntica, a la secuencia de la molécula de CTLA4 salvaje, pero todavía se une a B7. Las mutaciones pueden incluir uno o más residuos de aminoácidos sustituidos con un aminoácido que tiene una estructura conservadora (p. ej., una leucina sustituida por una isoleucina) o no conservadora (p. ej., una glicina sustituida con un triptófano) o propiedades químicas, deleciones, adiciones, armazones o truncamientos de aminoácidos.

Las moléculas mutantes de CTLA4 pueden incluir en ellas una molécula que no es CTLA4 o fijada a las mismas, es decir proteínas de fusión mutantes de CTLA4. Las moléculas mutantes pueden ser solubles (es decir, circulantes) o pueden estar unidas a una superficie celular (unidas a la membrana). Las moléculas mutantes de CTLA4 incluyen L104EA29Ylg y las descritas en la solicitud de patente de EE.UU. N° de serie 09/865.321, 60/214.065 y 60/287.576; en el documento WO 01/92337 A2; en las patentes de EE.UU. N° 6.090.914, 5.844.095 y 5.773.253; y como se ha descrito en R.J. Peach y col., 1994, J Exp Med. 180:2049-2058. Las moléculas mutantes de CTLA4 pueden producirse de forma sintética o recombinante.

La CTLA4Ig es una proteína de fusión soluble que comprende un dominio extracelular de CTLA4 salvaje, o una porción del mismo que se une a B7, unido a una molécula de inmunoglobulina (Ig) o a una porción de la misma. El dominio extracelular de CTLA4 o una porción del mismo está unido a un resto de Ig que comprende toda o una porción de una molécula de inmunoglobulina, preferentemente toda o una porción de una región constante de inmunoglobulina tales como todo o una porción de IgCy1 (lgC gamma 1), IgCy2 (lgC gamma 2), IgCy3 (lgC gamma 3), IgCy4 (lgC gamma 4), IgC|i (lgC mu), IgCa1 (lgC alfa 1), IgCa2 (lgC alfa 2), IgCS (lgC delta) o IgCe (lgC epsilon), lo que da la molécula de fusión soluble. El resto Ig puede incluir los dominios bisagra, CH2 y CH3, o los dominios CH1, bisagra, CH2 y CH3, de las regiones constantes mencionadas anteriormente u otras regiones constantes. Preferentemente, el resto Ig es humano o de mono y comprende los dominios bisagra, CH2 y CH3. Más preferentemente, el resto Ig comprende los dominios bisagra, CH2 y CH3 de la IgCy1 humana o consiste en los dominios bisagra, los dominios CH2 y CH3 de la IgCy1 humana en un resto I de CTLA4Ig, la región constante de la Ig o porción de la misma se puede mutar, de modo que tiene como resultado una reducción de sus funciones efectoras (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n° 5.637.481.5.844.095 y 5.434.131). Como se usa en la presente memoria, los términos resto de Ig, región constante de Ig, dominio C (constante) de Ig, IgCy1 (IgC gamma 1), IgCy2 (IgC gamma 2), IgCy3 (IgC gamma 3), IgCy4 (IgC gamma 4), IgC|i (IgC mu), IgCa1 (IgC alfa 1), IgCa2 (IgC alfa 2), IgCS (IgC delta) o IgCe (IgC epsilon), incluyen tanto secuencias nativas como secuencias que se han mutado, tales como, por ejemplo, secuencias que tienen mutaciones en la región constante que reducen la función efectora.

Una forma de realización concreta relacionada con CTLA4 comprende el dominio extracelular de CTLA4 salvaje que comienza en la metionina en la posición 1 y termina en el ácido aspártico en la posición 124 o que comienza en la alanina de la posición -1 al ácido aspártico en la posición 124; un residuo de aminoácido de unión glutamina en la posición 125; y una porción de inmunoglobulina que abarca el ácido glutámico en la posición 126 hasta la lisina en la posición 357, como se muestra en la FIG. 8. El ADN que codifica esta CTLA4Ig se depositó el 31 de mayo de 1991, en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 2011 0-2209, según las condiciones del Tratado de Budapest, y se le ha otorgado un número de registro en la ATCC ATCC 68629; P. Linsley y col., 1994, Immunity 1:793-80. Una línea celular CHO que expresa CTLA4Ig se depositó el 31 de mayo de 1991 en la ATCC con el número de identificación CRL-1 0762. Las moléculas de CTLA4Ig solubles producidas de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente memoria pueden o no incluir una secuencia del péptido señal (líder). Las FIG. 8 Y 9 incluyen una ilustración de una secuencia del péptido señal (líder). Normalmente, las moléculas no incluyen una secuencia del péptido señal.

La L104EA29Ylg es una proteína de fusión que es una molécula mutante de CTLA4 soluble que comprende un dominio extracelular de CTLA4 salvaje con cambios aminoacídicos A29Y (un residuo de aminoácido tirosina que sustituye una alanina en la posición 29) y L104E (un residuo de aminoácido de ácido glutámico que sustituye una leucina en la posición 104) unido a una cola de Ig. La FIG. 9 ilustra el L104EA29Ylg. La secuencia de aminoácidos de L104EA29Ylg comprende una alanina en la posición aminoacídica -1 a lisina en la posición aminoacídica 357 como se muestra en la f Ig .9. Como alternativa, la secuencia de aminoácidos de L104EA29Ylg comprende metionina en la posición aminoacídica 1 a lisina en la posición aminoacídica 357 como se muestra en la FIG. 9. L104EA29Ylg comprende un residuo aminoacídico de union glutamina en la posición 125 y una porción de Ig que abarca ácido glutámico en la posición 126 a través de la lisina en la posición 357. El AND que codifica L104EA29Ylg se depositó el 20 de junio de 2000, en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) según las condiciones del Tratado de Budapest y se le ha otorgado en número de registro ATCC PTA-2104. La 104EA29Y se describe en la solicitud de patente de EE.UU. pendiente de tramitación con números de serie 09/579.927, 60/287.576 y 60/214.065, y en el documento WO/01/923337 A2, que se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad. Las moléculas de L104EA29YIg soluble producidas mediante los procedimientos de cultivo de la presente invención pueden o no incluir una secuencia del péptido señal (líder). Normalmente, las moléculas producidas de acuerdo con la invención no incluyen una secuencia del péptido señal.

Como se usa en la presente invención, el término soluble se refiere a cualquier molécula, o fragmento de la misma, no unida o fijada a una célula, es decir en circulación. Por ejemplo, CTLA4, B7 o CD28 se pueden convertir en solubles fijando un resto de Ig al dominio extracelular de CTLA4, B7 o CD28, respectivamente. Como alternativa, una molécula como CTLA4 se puede convertir en soluble eliminando su dominio transmembrana. Normalmente, las moléculas solubles producidas de acuerdo con la invención no incluyen una secuencia del péptido señal (o líder).

Una molécula de CTLA4 soluble se refiere a una molécula no unida a la superficie celular (es decir, en circulación) que comprende CTLA4 salvaje, o cualquier porción o derivado que se une a B7, incluyendo, entre otros, proteínas de fusión de CTLA4 soluble; proteínas de fusión de CTLA4 soluble tales como proteínas de fusión CTLA4Ig (p. ej., ATCC 68629), en la que el dominio extracelular de CTLA4 se condensa con un resto de Ig que es toda o una porción de una molécula de Ig, preferentemente toda o una porción de una región constante de Ig, tal como toda o una porción de IgCy1 (IgC gamma 1), IgCy2 (lgC gamma 2), IgCy3 (lgC gamma 3), IgCy4 (lgC gamma 4), IgC|i (lgC mu), IgCa1 (lgC alfa 1), IgCa2 (lgC alfa 2), IgC8 (lgC delta) o IgCe (lgC epsilon), lo que da la molécula de fusión soluble; las proteínas de fusión de CTLA4 soluble en las que el dominio extracelular está condensado u unido a una porción de una proteína biológica o químicamente activa tal como el producto del gen E7 del papilomavirus (CTLA4-E7), el antígeno asociado con el melanoma p97 (CTLA4-p97) o la proteína env del VIH (CTLA4-env gp 120), como se describe en la patente de EE.UU. n° 5.844.095, incorporada en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad; las proteínas de fusión híbridas (quiméricas) tales como CD28/CTLA4Ig como se ha descrito en la patente de EE.UU. n° 5,434.131, incorporada en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad; moléculas de CTLA4 en las que se ha eliminado el dominio transmembrana para dar la proteína soluble (véase, por ejemplo, M.K. Oaks y coI., 2000, Cellular Immunology, 201 :144-153, incorporada en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad); la molécula mutante de CTLA4 soluble L104EA29Ylg.

Una molécula de CTLA4 soluble también puede ser una molécula mutante de CTLA4 soluble. Las moléculas de de CTLA4 solubles producidas de acuerdo con la presente invención pueden o no incluir una secuencia del péptido señal (líder). El péptido señal puede ser cualquier secuencia que permita la secreción de la molécula, incluido el péptido señal de la oncostatina M (Malik y col., 1989, Molec. Cell. BioI., 9:2847-2853), o CD5 (N.H. Jones y col., 1986, Nature, 323:346-349), o el péptido señal de cualquier proteína extracelular. La molécula de CTLA4 soluble producida mediante los procedimientos de cultivo de la invención puede incluir el péptido señal de la oncostatina M unido al extremo N-terminal del dominio extracelular de CTLA4. Normalmente, en la invención, las moléculas no incluyen una secuencia del péptido señal.

La proteína de fusión de CTLA4 como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a una molécula que comprende el dominio extracelular de CTLA4 salvaje, o una porción del mismo que se une a B7, se condensa a un resto que no es CTLA4 que convierte a la molécula de CTLA4 soluble, tal como un resto de Ig. Por ejemplo, una proteína de fusión de CTLA4 puede incluir el dominio extracelular de CTLA4 condensado a toda o a una porción de una región constante de Ig. Ejemplos de dominios constantes de Ig (o porciones de los mismos) que se pueden condensar a CTLA4 incluyen todos, aunque sin limitarse a ellos, los de la lista anterior de la presente memoria. Una proteína de fusión de CTLA4 también puede ser una molécula mutante de CTLA4.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “resto que no es CTLA4” se refiere a una molécula o una porción de la misma que no se une a CD80 y/o CD86 y que no interfiere en la unión de CTLA4 a su ligando. Ejemplos incluyen, entre otros, un resto de Ig que es toda o una porción de una molécula de Ig, una porción de una proteína biológicamente activa o químicamente activa tal como el producto del gen E7 del papilomavirus (CTLA4-E7), el antígeno p97 asociado con melanoma (CTLA4-p97) o la proteína env del VIH (CTLA4-env gp120) (como se describe en el n° de serie de EE.UU. 5,844,095, incorporada en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad). Ejemplos de restos de Ig incluyen todo o una porción de un dominio constante de inmunoglobulina, tal como IgCy1 (IgC gamma 1), IgCy2 (lgCgamma2), IgCy3 (lgC gamma 3), IgCy4 (lgC gamma 4), IgC|i (lgC mu), IgCa1 (lgC alfa 1), IgCa2 (lgC alfa 2), IgC8 (lgC delta) o IgCe (lgC epsilon). El resto Ig puede incluir los dominios bisagra, CH2 y CH3, o los dominios CH1, bisagra, CH2 y CH3, de las regiones constantes mencionadas anteriormente u otras regiones constantes. Preferentemente, el resto Ig es humano o de mono e incluye los dominios bisagra, CH2 y CH3. Más preferentemente, el resto Ig incluye los dominios bisagra CH2 y CH3 de la IgCy1 humana, o es los dominios bisagra, CH2 y CH3 de la IgCy1 humana. En un resto Ig, la región constante de Ig, o porción de la misma, puede mutar de modo que se reduzcan sus funciones efectoras (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n° 5.637.481. 5.844.095 y 5.434.131).

El dominio extracelular de CTLA4 se refiere a cualquier porción de CTLA4 salvaje que reconoce y se une a B7. Por ejemplo, un dominio extracelular de CTLA4 comprende metionina en la posición 1 al ácido aspártico en la posición 124 (FIG. 10). Por ejemplo, un dominio extracelular de CTLA4 comprende alanina en la posición -1 al ácido aspártico en la posición 124 (FIG. 10).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término mutación se refiere a un cambio en la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de una molécula salvaje, por ejemplo un cambio en las secuencias de ADN y/o de aminoácidos del dominio extracelular de CTLA4 salvaje. Una mutación en el ADN puede cambiar un codón que conduce a un cambio en la secuencia de aminoácidos codificada. Un cambio en el ADN puede incluir sustituciones, deleciones, inserciones, corte y empalme alternativo o truncamientos. Un cambio de aminoácido puede incluir sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones, truncamientos o errores de procesamiento o escisión de la proteína. Como alternativa, las mutaciones en una secuencia de nucleótidos pueden tener como resultado una mutación silente en la secuencia de aminoácidos, como se entiende bien en la técnica. Como también se entiende, ciertos codones nucleotídicos codifican el mismo aminoácido. Ejemplos incluyen los codones nucleotídicos CGU, CGG, CGC y CGA, que codifican el aminoácido arginina (R); o los codones GAU y GAC, que codifican el aminoácido ácido aspártico (D)

Por tanto, una proteína puede estar codificada por una o más moléculas de ácido nucleico que difieren en su secuencia de nucleótidos específica, pero que todavía codifica moléculas proteicas que tienen secuencias idénticas. La molécula muta te puede tener una, o más de una, mutación. Como guía, la secuencia de codificación de aminoácidos es la siguiente:

Como se usa en la presente memoria descriptiva, un fragmento o porción es cualquier parte o segmento de una molécula. Par CTLA4 o CD28, un fragmento o porción es, preferentemente, el dominio extracelular de CTLA4 o CD28, o una parte o segmento del mismo, que reconoce y se une a B7 o que interfiere con B7 de modo que bloquea la unión a CD28 y/o CTLA4. Asimismo, como se usa en la presente memoria descriptiva, “correspondiente” significa que comparte la identidad de secuencia.

B7, como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a cualquier miembro de la familia B7 de moléculas incluidas, entre otras, B7-1 (CD80) (Freeman y coI., 1989, J Immunol., 143:2714-2722, incorporado en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad), B7-2 (CD86) (Freeman y col., 1993, Science, 262:909-911, incorporado en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad; Azuma y col., 1993, Nature, 366:76-79, incorporado en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad) que reconoce y se une a CTLA4 y/o CD28. CD28 se refiere a la molécula que reconoce y se une a B7 tal como se describe en e n° de serie de EE.UU., 5.580.756 y 5.521.288 (incorporados en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad). Como se usa en la presente memoria descriptiva, las células positivas para B7 incluyen cualquier célula con uno o más tipos de moléculas B7 expresadas sobre la superficie celular.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, un “derivado” es una molécula que comparte similitud de secuencia y actividad con su molécula parental. Por ejemplo, un derivado de CTLA4 incluye una molécula de CTLA4 soluble que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 70% similar al dominio extracelular del CTLA4 salvaje y que reconoce y se une a B7, por ejemplo CTLA4Ig o molécula mutante de CTLA4 L104EA29Ylg. Un derivado significa cualquier cambio en la secuencia de aminoácidos y/o la calidad química del aminoácido, por ejemplo análogos de aminoácido.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, regular una respuesta inmunitaria es activar, estimular, regular por aumento, inhibir, bloquear, reducir, atenuar, regular por disminución o modificar la respuesta inmunitaria. Diversas enfermedades, por ejemplo enfermedades autoinmunitarias, pueden tratarse regulando una respuesta inmunitaria, por ejemplo regulando las interacciones de células positivas para CTLA4 y/o CD28 funcionales con las células positivas para B7. Por ejemplo, un procedimiento de regular una respuesta inmunitaria comprende poner en contacto células positivas para B7 con una molécula de CTLA4 soluble, tal como las que se producen de acuerdo con la presente invención, para formar complejos de CTLA4/B7 solubles, en los que la molécula de CTLA4 soluble interfiere en la reacción de una molécula de CTLA4 y/o CD28 endógena con la molécula B7. “Bloquear” o “inhibir” un receptor, señal o molécula, tal como se hace referencia en la presente memoria descriptiva, significa interferir en la activación del receptor, señal o molécula, tal como se detecta mediante un ensayo reconocido en la técnica. El bloqueo o inhibición puede ser parcial o total.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “bloquear la interacción con B7” se refiere a interferir en la unión de B7 a sus ligandos, tales como CD28 y/o CTLA4, de modo que se obstruyen las interacciones con las células positivas para células T y B7. Ejemplos de agentes que bloquean las interacciones con B7 incluyen, entre otros, moléculas tales como un anticuerpo (o porción del mismo) que reconoce y se une a cualquiera de las moléculas CTLA4, CD28 o B7 (p. ej., B7-1, B7-2); una forma soluble (o porción de la misma) de las moléculas, tal como CTLA4 soluble; un fragmento peptídico u otra molécula pequeña diseñada para interferir con la señal celular a través de una interacción mediada por CTLA4/CD28/B7; En una forma de realización preferida, el agente de bloqueo es una molécula de CTLA4 soluble, tal como CTLA4Ig (ATCC 68629) o L10EA29YIg (ATCC PTA-2104); una molécula de CD28 soluble, tal como CD28Ig (ATCC 68628); una molécula de B7 soluble, tal como B7-Ig (ATc C 68627); un anticuerpo monoclonal anti-B7 (p. ej., TACC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 y anticuerpos monoclonales tal como se describen en la patente de EE.UU. N° 6.113.898 o en Yokochi y col., 1982, J. Immunol., 128(2):823-827); un anticuerpo monoclonal anti-CTLA4 (p. ej., ATCC HB-304, y anticuerpos monoclonales tales como se describen en las referencias 82-83); y/o un anticuerpo monoclonal anti-CD28 (p. ej., ATCC HB 11944 y MAb 9.3, como se describe en Hansen y col., 198o, Immunogenetics, 10: 247-260 o Martin y col., 1984, J. Clin. Immunol., 4(1):18-22). Las interacciones que bloquean B7 se pueden detectar mediante ensayos reconocidos en la técnica, tal como determinando la reducción de los síntomas asociados con la enfermedad inmunitaria (p. ej., enfermedad reumática), determinando una reducción en las interacciones célula T/célula B7 o determinando una reducción en la interacción de B7 con CTLA4/CD28. El bloqueo puede ser parcial o total.

También como se usa en la presente memoria descriptiva, una cantidad eficaz de una molécula se refiere a una cantidad que bloquea la interacción de la molécula con su ligando. Por ejemplo, una cantidad eficaz de una molécula que bloquea la interacción de B7 con CTLA4 y/o CD28 es la cantidad de la molécula que, cuando se une a las moléculas de B7 sobre las células positivas para B7, inhibe la unión de las moléculas de B7 con los ligandos endógenos tales como CTLA4 y c D28. Como alternativa, una cantidad eficaz de una molécula que bloquea la interacción de B7 con CTLA4 y/o CD28 es la cantidad de la molécula que, cuando se une a las moléculas de b 7 sobre las células positivas para B7, inhibe la unión de las moléculas de B7 con los ligandos endógenos tales como CTLA4 y CD28. El bloqueo o inhibición puede ser parcial o completo.

Para los protocolos clínicos se prefiere que el resto de Ig de una proteína de fusión, tal como CTL4Ig o CTLA4Ig mutante, no provoque una respuesta inmunitaria perjudicial en un sujeto. El resto preferido es toda o una porción de la región constante de Ig, incluidas las regiones constantes de Ig de humano o de primate no humano. Ejemplos de regiones de Ig adecuadas incluyen IgCy1 (lgCgamma1), IgCy2 (lgCgamma2), IgCy3 (lgC gamma 3), IgCy4 (lgC gamma 4), IgC|i (lgC mu), IgCa1 (lgC alfa 1), IgCa2 (lgC alfa 2), IgC8 (lgC delta) o IgCe (lgC epsilon), incluido el dominio bisagra, CH2 y CH3, o los dominios CH1, bisagra, CH2 y CH3, que están implicados en las funciones efectoras tales como la unión a los receptores de Fc, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). El resto de Ig puede tener una o más mutaciones en su interior (p. ej., en el domino CH2 para reducir las funciones efectoras tales como CDC o ADCC), donde la mutación modula la capacidad de la Ig para unirse a su ligando incrementando o disminuyendo la capacidad de la Ig para unirse a los receptores de Fc. Por ejemplo, mutaciones en el resto de Ig pueden incluir cambios en cualquiera o todos sus residuos de cisteína dentro del dominio bisagra. Por ejemplo, como se muestra en la FIG. 8, las cisteínas en las posiciones 130, 136 y 139 están sustituidas con serina. El resto de Ig puede también incluir la prolina en la posición 148 sustituida con una serina, como se muestra en la FIG. 8. Además, las mutaciones en el resto de Ig pueden incluir tener la leucina en la posición 144 sustituida con fenilalanina; la leucina en la posición 145 sustituida con ácido glutámico; o la glicina en la posición 147 sustituida con alanina.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes exponen aspectos específicos de la invención para ilustrar la invención y proporcionan una descripción de los presentes procedimientos para los expertos en la técnica. Los ejemplos no deben interpretarse como limitantes de la invención, ya que los ejemplos simplemente proporcionan metodología y ejemplos específicos que son útiles en la comprensión y práctica de la invención y sus varios aspectos.

Los Ejemplos 1 y 2 tal como se exponen a continuación describen experimentos relacionados con los procedimientos de cultivo celular que implican una alimentación con galactosa empleada en combinación con múltiples cambios de temperatura. Los Ejemplos 3-6 describen experimentos relacionados con los procedimientos de cultivo celular que implican cambios de temperatura durante el ciclo de cultivo, sin alimentación con galactosa. Los Ejemplos 7-13 describen experimentos relacionados con los procedimientos de cultivo celular que implican la adición retardada de compuesto polianiónico en combinación con alimentación con galactosa y múltiples cambios de temperatura.

EJEMPLO 1

Este ejemplo describe, en general, el procedimiento de cultivo continuo con alimentación con D-galactosa de la presente invención para el cultivo de células recombinantes que producen la proteína de fusión CTLA4Ig de ejemplo tal como se describe en el Ejemplo 2 en la presente memoria descriptiva.

Las células se expandieron en medio CD-CHO modificado (Invitrogen, CA) que contiene glutamina, bicarbonato sódico, insulina y metotrexato (Tabla 1) usando matraces T-75, centrifugadoras de 250, 500 y 1000 ml. Los matraces T y las centrifugadoras se incubaron a 37°C y con 6% de CO².

Tabla 1

Después de generar suficiente inóculo, el cultivo se transfirió a un biorreactor de 5 o 50 l con un volumen de trabajo de 3 o 30 l, respectivamente, del mismo medio. La densidad de siembra inicial fue 200.000 células viables/ml. El vaso de 5 l fue un reactor de cristal equipado con un impulsor marino (Applikon, Foster City, CA), el vaso de 50 l era un reactor de acero inoxidable (Feldmeier, Syracuse, NY) equipado con dos impulsores marinos. Un sistema de adquisición de datos usando Intellution Fix32 registró la temperatura, el pH y el Od durante los ciclos. Los flujos de gas se controlaron con rotámetros. Se roció aire en el reactor a través de una frita sumergida (de 5 |im de tamaño de poro) y a través del espacio aéreo del reactor para la retirada de CO². Se roció oxígeno molecular a través de la misma frita para el control del OD. Se roció CO²a través de la misma frita para el control del pH en el lateral superior. El control del pH en el lateral inferior se realizó a través de la adición de NaOH 1N.

Al cultivo en el biorreactor se administró una alimentación en bolo diario usando medio eRDF modificado (Invitrogen, CA), (Tabla 2), que contiene glucosa, glutamina, insulina, TC Yeastolate (Becton Dickinson) y D-galactosa del siguiente modo: Comenzando un día después de la inoculación se añadió un mínimo de 1% del volumen de cultivo como medio de alimentación; si el nivel de glucosa disminuyó por debajo de 3 g/l se añadió un volumen calculado para devolver los niveles de glucosa a 3 g/l. El procedimiento de fermentación tuvo una duración de 14-21 días. Se extrajeron muestras del reactor a diario. La muestra usada para el recuento celular se tiñó con azul triptán (Sigma, m O). El recuento celular y la determinación de la viabilidad celular se realizaron mediante un hemocitómetro/microscopio. Para el análisis de los metabolitos se centrifugó una muestra adicional durante 20 minutos a 2000 rpm (4°C) para la separación celular. En el sobrenadante se analizaron los parámetros siguientes. título, ácido siálico, glucosa, lactato, glutamina, glutamato, pH, pO², pCO², amoniaco y LDH.

Tabla 2

Los cultivos celulares a gran escala se realizaron a escala del reactor de 5000 l con un volumen de trabajo de 4500 l usando reactores de acero inoxidable (Feldmeier, NY) con una razón de proporcionalidad de 3: 1 equipado con tres impulsores marinos. El cultivo del inóculo se expandió desde los centrifugadores a los reactores de siembra y la densidad de siembra inicial a escala de 5000 l fue 150-200.000 células viables/ml. Los procedimientos experimentales relacionados con los cultivos a gran escala y los controles del procedimiento fueron idénticos a los descritos para los procedimientos de 5 l y de 50 l.

EJEMPLO 2

Este ejemplo describe el cultivo de células productoras de CTLA4Ig, mostrado como -1 a 357 o 1 a 357 en la FIG.

3 (ADN codificador depositado como ATCC 68629) usando varios conjuntos de condiciones de cultivo experimental para las comparaciones relacionadas con el título final y los parámetros de ácido siálico final del producto proteico. Estos resultados se obtuvieron a partir de un procedimiento de cultivo celular que implica un procedimiento de cambio de temperatura de dos etapas y un régimen de alimentación diario en el que en el medio de alimentación había una cantidad eficaz para sostenimiento de ácido siálico de D-galactosa. Se observó potenciación de la calidad mejorada del producto.

Las condiciones del cultivo en los biorreactores de 5, 50 y 5000 l se controlaron del siguiente modo: pH a 7,0, oxígeno disuelto a 40-60%, agitación a 30-50 rpm, contrapresión a 0,03 MPa (presión ambiental para los reactores de cristal de 5l). Se empleó un procedimiento de cultivo celular con dos cambios de temperatura que comprende una primera temperatura de 37°C, reducida a una segunda temperatura de 34°C el día 6 y a una tercera temperatura de 32°C el día 10.

Descripción de los grupos experimentales

Grupo experimental I: Cultivo de 5 l con medio de alimentación que no contenía D-galactosa;

Grupo experimental II: cultivo de 5 l con medio de alimentación que contenía 12,5 g/l de D-galactosa;

Grupo experimental III: cultivo de 50 l con medio de alimentación que no contenía D-galactosa;

Grupo experimental IV: Cultivo de 50 l con medio de alimentación que contenía 3,0 g/l de D-galactosa; (En el grupo experimental IV, la alimentación con D-galactosa se interrumpió el día 10 y, después, desde el día 11 al día 16 se usó medio de alimentación normal (sin D-galactosa);

Grupo experimental V: cultivo de 50 l con medio de alimentación que contenía 12,5 g/l de D-galactosa;

Grupo experimental VI: cultivo de 50 l con medio de alimentación que contenía 20,0 g/l de D-galactosa;

Grupo experimental VII: cultivo de 5000 l con medio de alimentación que no contenía D-galactosa; y

Grupo experimental VIII: cultivo de 5000 l con medio de alimentación que contenía 12,5 g/l de D-galactosa.

Como se ha observado a partir de los resultados presentados en la Tabla 3, el uso de 12,5 g/l de D-galactosa en el medio de alimentación incrementó significativamente el contenido en ácido siálico del producto a escala de 5, 50 y 5000 l en comparación con los controles en los que no se incluyó D-galactosa en la alimentación. Además, la adición de 3 g/l de D-galactosa a escala de 50 l, que se interrumpió el día 10, tuvo temporalmente un impacto positivo sobre el grado de sialilación (Grupo experimental IV; Tabla 3; y FIG. 1), pero los niveles de ácido siálico disminuyeron pronto después del día 10. El grado de sialilación aumentó con una concentración mayor de D-galactosa (12,5 g/l) en el medio de alimentación a la escala de 50 l (Grupo experimental V; Tabla 3; FIG. 1). Este hallazgo soporta una mayor concentración de alimentación con D-galactosa en el medio y un régimen de alimentación diario que emplea medio de alimentación que incluye D-galactosa.

De acuerdo con estos experimentos, la adición de D-galactosa no afectó de forma significativa a la productividad celular específica (es decir, incremento del título) (FIG. 2)- Un incremento adicional de la concentración de D-galactosa en la alimentación, es decir a 20,0 g/l, no tuvo efectos beneficiosos (Grupo experimental VI; Tabla 3; FIG. 1). La FIG.

3 muestra la concentración de D-galactosa residual en el cultivo a una concentración de 12,5 g/l de D-galactosa en la alimentación, que se encontró que era óptima a las escalas de reactor de 50 l y de 5000 l. Durante la fase de producción cuando ha aumentado el título (es decir, días 6-21), se requirió mantener la concentración residual de D-galactosa en el cultivo a > 0,25 g/l. La FIG. 4 ilustra el efecto de escala observado durante el escalado del procedimiento de cultivo celular hasta 5000 l para la producción de CTLA4Ig. La sialilación de la glicoproteína disminuyó al crecer la escala del reactor. La FIG. 5 muestra la inversión del efecto de escala tras la adición de 12,5 g/l de D-galactosa en el medio de alimentación. Esta técnica de alimentación diaria con D-galactosa permitió la producción de cantidades grandes de CTLA4Ig altamente sialilada en reactores de producción a gran escala, por ejemplo > 50 l, por ejemplo 500 l.

EJEMPLO 3

Este ejemplo se refiere específicamente a los procedimientos de cultivo celular con cambio de temperatura como se ha descrito en la presente memoria descriptiva en los Ejemplos 4-6 y proporciona materiales y reactivos empleados en los procedimientos de cambio de temperatura para el cultivo de células recombinantes que producen la proteína de fusión CTLA4Ig.

1. Medio de cultivo celular

El medio de cultivo celular basal usado para todas las fases de la generación del inóculo celular y para el crecimiento de cultivos en biorreactores, incluidos los reactores de producción de 5 litros (5 l) y 50 litros (50 l), fue medio CD-CHO modificado que contenía glutamina, bicarbonato sódico, insulina y metotrexato (Invitrogen, Carlsbad, CA; véase la Tabla 1). El pH del medio se ajustó hasta un pH de 7,0 con HCl 1N.

Para alimentar las células en el procedimiento discontinuo con alimentación se empleó un medio de alimentación modificado, es decir medio eRDF-1 (Invitrogen), que contiene glucosa, glutamina, insulina y TC Yeastolate (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) (Tabla 2). Para esos experimentos no había galactosa en el medio de alimentación. El pH del medio de alimentación se ajustó a 7,0 con NaOH 1N tras la adición de todos los componentes.

2. Fase de producción en el biorreactor

El biorreactor de producción se manejó inicialmente como un reactor discontinuo, con la temperatura, la presión, el pH y la concentración de oxígeno disuelto estrechamente monitorizados y controlados. La condición del cultivo se evaluó midiendo la densidad de células viables y la concentración de varios metabolitos clave. El procedimiento de alimentación se inició un día después de la inoculación. El resto de la fermentación se realizó en modo discontinuo con alimentación.

Se usaron biorreactores de escala de 5 l (reactor de cristal con un impulsor marino) y de escala de 50 l (reactor de acero inoxidable con dos impulsores marinos). (Véase el Ejemplo 4). Un sistema de adquisición de datos (Intellution Fix 32) registró la temperatura, el pH y el oxígeno disuelto (OD) durante los ciclos. Los flujos de gas se controlaron con rotámetros. Se roció aire en el reactor a través de una frita sumergida (de 5 |im de tamaño de poro) y a través del espacio aéreo del reactor para la retirada de CO². Se roció oxígeno molecular a través de la misma frita para el control del OD. Se roció CO²a través de la misma frita para el control del pH.

3. Estrategia de alimentación

A las 24 horas de la inoculación, en el reactor se añadió un mínimo diario de 1% del volumen de cultivo del medio de alimentación modificado eRDF-1 si la concentración de glucosa era > 3,0 g/l. En los casos en los que la concentración de glucosa era inferior a 3 g/l, el volumen del bolo de alimentación diario se calculó para aumentar la concentración de glucosa de nuevo hasta 3,0 g/l. La cantidad de alimentación diaria se registró en hojas del lote.

4. Toma de muestras

Se extrajeron muestras de células del reactor a diario. Una muestra usada para el recuento celular se tiñó con azul triptán (Sigma, St. Louis, MO). El recuento celular y la determinación de la viabilidad celular se realizaron mediante hemocitometría usando un microscopio. Para el análisis de los metabolitos se centrifugó una muestra adicional durante 20 minutos a 2000 rpm (4°C) para la separación celular. En el sobrenadante se analizaron los parámetros siguientes. título, ácido siálico, glucosa, lactato, glutamina, glutamato, pH, pO², pCO², amoniaco y, opcionalmente, lactato deshidrogenasa (LDH). Muestras de refuerzo adicionales se congelaron a -20°C.

EJEMPLO 4

Este ejemplo describe la producción de CTLA4Ig, mostrada como -1 a 357 o 1 a 357 en la FIG. 8 (ADN codificador depositado como ATCC 68629), de células CHO cultivadas. El Ejemplo describe además un procedimiento de la presente invención para producir proteína CTLA4Ig de alta cantidad y calidad, que implica ciclos e cultivo que tienen cambios de temperatura de dos o tres etapas y tiempos totales de ciclo de 14, 21 o 28-30 días. Un cambio de temperatura (cambio T) de 37°C a 34°C se produjo el día 6 (final de la fase logarítmica del crecimiento) y un segundo cambio T de 34°C a 32°C se produjo el día 10. El ciclo terminó el día 14, el día 21 o el día 28, y pata el cambio de dos etapas, la temperatura se controló a 32°C desde el cambio del día 10 hasta el final del ciclo. Para el cambio en tres etapas, la temperatura se controló a 30°C desde el día del cambio hasta el final del ciclo. Los procedimientos descritos dieron lugar a un incremento del título final del producto proteico, un incremento de la viabilidad celular final y la productividad volumétrica, en comparación con los ciclos con un solo cambio de temperatura o sin cambios de temperatura. De acuerdo con la invención, los cambios T segundo y tercero extendieron el tiempo del ciclo del procedimiento de fermentación (cultivo) estándar a de dos a tres semanas (o más) al tiempo que mantenían viabilidades celulares altas. Se observó un incremento casi lineal del título del producto a lo largo del periodo de producción.

Las células CHO usadas para la expresión de CTLA4Ig se expandieron en medio CD-CHO modificado (Invitrogen, CA) que contiene glutamina, bicarbonato sódico, insulina y metotrexato (véase el Ejemplo 3) usando matraces T-75 (Corning, Corning, NY) y centrifugadoras de 250 y 500 ml (Bellco, Vineland, NJ). Los matraces T y los centrifugadores se incubaron a 37°C en 6% de Co2. Después de generar suficiente inóculo, el cultivo se transfirió a un biorreactor de 5l (Applikon, Foster City, CA) o de 50 l (Feldmeier, Syracuse, NY) con un volumen de trabajo de 3 l o de 30 l, respectivamente, del medio descrito con anterioridad. La densidad de siembra inicial fue de aproximadamente 2 x 105 células viables/ml.

El vaso de 5 l fue un reactor de cristal equipado con un impulsor marino (Applikon, Foster City, CA); el vaso de 50 l era un reactor de acero inoxidable (Feldmeier, Syracuse, NY) equipado con dos impulsores marinos. Un sistema de adquisición de datos usando Intellution Fix 32 (Intellution, Foxboro, MA) registró la temperatura, el pH y la el oxígeno (OD) durante los ciclos. Los flujos de gas se controlaron con rotámetros (Cole Parmer, Vernon Hills, IL). Se roció aire en el reactor a través de una frita sumergida (de 5 |im de tamaño de poro) y a través del espacio aéreo del reactor para la retirada de CO². Se roció oxígeno molecular a través de la misma frita para el control del OD. Se roció CO²a través de la misma frita para el control del pH en el lateral superior. El control del pH en el lateral inferior se realizó a través de la adición de NaOH 1N. Sin limitaciones, los intervalos aceptables para el Ph fueron 6-9, preferentemente 6,8-7,2 y para la osmolaridad fueron 200-500 mOsm, preferentemente 280-340 mOsm.

Al cultivo en el biorreactor se administró una alimentación en bolo diario usando medio eRDF modificado (Invitrogen, CA), con glucosa, glutamina, insulina y TC Yeastolate (Becton Dickinson) como se ha descrito en el Ejemplo 3 del siguiente modo: comenzando un día después de la inoculación se añadió un mínimo de 1% del volumen de cultivo o, si el nivel de glucosa era inferior a 3 g/l, un volumen calculado para devolver los niveles de glucosa a 3 g/l.

El procedimiento de fermentación tuvo una duración de 21 días a la escala de 5 l y de 28 días a la escala de 50 l. La mayor duración del ciclo de cultivo a la escala de 50 l se correlacionó con el cambio de temperatura añadido para ese ciclo. Se extrajeron muestras del reactor a diario para análisis. Por ejemplo, una muestra usada para el recuento celular se tiñó con azul triptán (Sigma, St. Louis, MO). El recuento celular y la determinación de la viabilidad celular se realizaron usando un hematocitómetro y contando las células viables teñidas con un microscopio. Para el análisis de los metabolitos se centrifugó un alícuota adicional de la muestra durante 20 minutos a 2000 rpm para sedimentar las células. En el sobrenadante se analizó el título proteico, el ácido siálico, la glucosa, la glutamina, el glutamato, el pH, la pO², la pCO², el amoniaco y la LDH, usando técnicas y protocolos usados convencionalmente en la técnica

EJEMPLO 5

Este ejemplo describe y presenta los resultados de evaluaciones comparativas para evaluar los diversos procedimientos de cultivo con cambio de temperatura, incluidos los procedimientos de cultivo de múltiples etapas, llevados a cabo de acuerdo con un aspecto de la presente invención. Se determinó el título final (en g/l) del producto glicoproteico, además del contenido final en ácido siálico de la proteína, la viabilidad celular al final de los ciclos (viabilidad celular final (y la densidad celular al final de los ciclos (densidad final de células viables).

Los experimentos I-A, I-B y I-C; II-A, II-B y II-C; y III-A, III-B y III-C hacen referencia al mismo ciclo de cultivo celular con el mismo perfil de cambio de temperatura evaluado a tiempos diferentes, es decir para I-A, II-A, y III-A, el producto y los parámetros celulares se evaluaron después de 14 días; para I-B, II-B y III-B después de 21 días; y para -C, II-C y III-C después de 28 días. Estos experimentos se realizaron en un biorreactor de 5 l en el que las condiciones de cultivo se controlaron del siguiente modo: pH a 7,0; oxígeno disuelto al 40%; agnación a 60 rpm; y temperatura inicial a 37°C. os datos se obtuvieron de fermentaciones del cultivo celular discontinuo con alimentación de acuerdo con los procedimientos de la presente invención.

Los Experimentos I, II y III se diseñaron del siguiente modo:

Experimento I: La temperatura del cultivo celular se controló a 37°C desde el día 0 al día 21 (sin cambio de temperatura),

Experimento II: la temperatura del cultivo celular se controló a 37°C desde el día 0 al día 6; y a 34°C desde el día 6 al día 21 (un cambio de temperatura),

Experimento III: la temperatura del cultivo celular se controló a 37°C desde el día 0 al día 6; a 34°C desde el día 6 al día 10; y a 32°C desde el día 10 al día 21 procedimiento de cambio de temperatura de dos etapas de la presente invención).

Los Experimentos IV-A y V-A muestran los resultados del título del producto, la viabilidad celular final y la densidad celular final evaluados después de un ciclo de cultivo de 14 días con una fase de producción inicial (estándar), los Experimentos IV-B y V-B muestran estos resultados evaluados tras un ciclo de cultivo de 21 días con una fase de producción extendida; y los Experimentos IV-C y V-C muestran estos resultados evaluados tras un ciclo de cultivo de 28 días con una segunda fase de producción extendida. Los experimentos IV y V se realizaron en un biorreactor de 50 l en el que las condiciones de cultivo se controlaron del siguiente modo: pH a 7,0; oxígeno disuelto a 40%; agitación a 30 rpm; y temperatura inicial a 37°C.

Los Experimentos IV y V se diseñaron del siguiente modo:

Experimento IV: la temperatura del cultivo celular se controló a 37°C desde el día 0 al día 6; a 34°C desde el día 6 al día 10; y a 32°C desde el día 10 al día 28 procedimiento de cambio de temperatura de dos etapas de la presente invención).

Experimento V: la temperatura del cultivo celular se controló a 37°C desde el día 0 al día 6; a 34°C desde el día 6 al día 10; y a 32°C desde el día 10 al día 14 y a 30°C desde el día 14 al día 28 procedimiento de cambio de temperatura de tres etapas de la presente invención). Los Experimentos V-A, V-B y V-C hacen referencia al mismo ciclo de cultivo celular con el mismo perfil de cambio de temperatura evaluado a tiempos diferentes, es decir para V-A, el producto y los parámetros celulares se evaluaron después de 14 días; para V-B después de 21 días; y para V-C después de 28 días.

Los Experimentos I-V representan cinco ciclos de cultivo diferentes tal como se ha descrito con anterioridad. Como se ha descrito, los ciclos de 14 días se designan “A”; los ciclos de 21 días se designan “B”, mientras que los ciclos de 28 días se designan “C”.

La Tabla 4 presenta los resultados de los Experimentos que demuestran el impacto de diferentes perfiles de cambio de temperatura sobre la producción de CTLA4Ig por las células en cultivo a la escala de reactor de 5 l.

Tabla 4

(continuación)

La Tabla 5 presenta los resultados de los Experimentos que demuestran el impacto de diferentes perfiles de cambio de temperatura sobre la producción de CTLA4Ig por las células en cultivo a la escala de reactor de 50 l.

Tabla 5

(continuación)

Como se ha demostrado mediante los experimentos en este Ejemplo, se encontró que los perfiles de cambio de temperatura de múltiples etapas mantenían una elevada viabilidad celular en el procedimiento del cultivo. Específicamente, en la Tabla 4, el Experimento III-B muestra que el uso del perfil de cambio programado de temperatura de dos etapas mantenido a una viabilidad celular elevada (véase también la FIG. 6) a lo largo del procedimiento de cultivo de 21 días (incluida la fase de producción extendida), lo que permite que el título alcance 3,5 g/l a un contenido elevado en ácido siálico de 6,5 [proporción molar]. El éxito del procedimiento de cultivo de dos etapas también se puede poner de manifiesto en el alto valor del producto matemático de “título final x ácido siálico final”.

Por el contrario, un procedimiento de cultivo que no implica cambio de temperatura (Tabla 4, Experimento I-B) condujo a una disminución precoz de la viabilidad celular. Además, se encontró que el uso de un cambio de temperatura de una etapa (Tabla 4, Experimento II-B) para dar un título final menor, ácido siálico final y el producto matemático "título final x ácido siálico final" en comparación con el perfil de cambio de temperatura de dos etapas y el procedimiento de acuerdo con la presente invención.

De forma adicional, los resultados presentados en la Tabla 5 que implica cultivos celulares realizados a una escala de reactor de 50 l demuestran las ventajas de la técnica de cultivo de cambio de temperatura de múltiples etapas de la presente invención. El tercer cambio de temperatura hasta 30°C se programó para que tuviera lugar el día 14. En particular, los beneficios de un triple cambio de temperatura sobre la viabilidad celular y el título final (Tabla 5, Experimento V-C; también la FIG. 7) se pueden ver comparados con un doble cambio de temperatura. De acuerdo con los presentes procedimientos, el triple cambio de temperatura extendió adicionalmente la viabilidad celular y, por tanto, la producción de proteína con respecto a los procedimientos sin cambios o con solo un cambio, como se puede observar a partir de la Tabla 5, particularmente, por ejemplo, para los ciclos de cultivo extendido de 21 y 28 días. Debido al efecto de escalado, que es habitual en el cultivo celular, se encontró que la generación del título a la escala del reactor de 50 l era algo más lenta que a la escala de 5 l. No obstante, se puede apreciar fácilmente que tal efecto no resta valor a las ventajas de dos o más ciclos de cultivo con cambio de temperatura como proporciona la presente invención.

Como ponen de manifiesto los resultados presentados en el Ejemplo 5, para los ciclos en los que se realizó un cambio de temperatura el día 6, es decir, al final de la fase logarítmica del crecimiento, se obtuvieron mucho mejores resultados en el título final y la viabilidad celular, en comparación con los ciclos de control en ausencia de un cambio de temperatura. Como se observa a partir de los resultados, la productividad volumétrica se duplicó mediante el uso de un solo cambio de temperatura. Un segundo cambio de temperatura el día 10 dio una mayor viabilidad celular e incrementó adicionalmente la productividad volumétrica (aproximadamente por 3 en comparación con los ciclos sin cambio de T), mientras que la calidad del producto permaneció alta, determinado por el contenido en ácido siálico del producto glicoproteico.

EJEMPLO 6

Este ejemplo presenta datos que muestran que el procedimiento de cultivo celular que comprende dos cambios de temperatura descendentes de acuerdo con la presente invención no tiene un efecto estadísticamente significativo sobre la cantidad de proteína, por ejemplo CTLA4Ig, que se produce por célula por unidad de tiempo. De acuerdo con los procedimientos de cultivo celular (fermentación) con múltiples cambios de temperatura, la producción global de proteína en el procedimiento es el resultado de más células viables que sobreviven hasta el final del procedimiento. Dado que más células sobreviven durante un tiempo de producción extendido, más células viables están produciendo la proteína deseada al final del procedimiento. Esto, a su vez, da una cantidad mayor del producto proteico deseado al final del procedimiento o del ciclo de cultivo.

La Tabla 6 ilustra la productividad celular específica a varios tiempos en el procedimiento abarcado por la presente invención. La productividad celular específica viene determinada por la fórmula presentada anteriormente. El procedimiento de cultivo diseñado para la producción de CTLA4Ig, otras moléculas de CTLA4 soluble y moléculas mutantes de CTLA4 soluble es, por tanto, un procedimiento no asociado con crecimiento en el que la producción de proteína comienza durante o aproximadamente el día 6, es decir aproximadamente al principio de la fase estacionaria, tras el crecimiento exponencial de las células. Los datos presentados en la Tabla 6 se refieren a los experimentos realizados en el Ejemplo 5.

Tabla 6

(continuación)

La productividad específica de la célula en la Tabla 6 se calculó usando mediciones de la densidad celular y del título, tal como se han descrito en lo que antecede en la presente memoria descriptiva. Como apreciará un experto en la técnica, normalmente, las mediciones de la densidad celular tienen una desviación estándar (SD) de aproximadamente 10-20%, es decir una SD alta, y son imprecisa. Por tanto, la determinación de la productividad específica de la célula tiene una desviación estándar correspondiente del 10-20%. Por tanto, en vista de la alta SD implicada en estos tipos de cálculos, la cantidad de producto producido por célula al día para los diferentes tempos de ciclo no difiere significativamente entre un procedimiento que no tiene cambio de T, con un cambio de T o con dos cambios de T. Los altos niveles de producto proteico de alta calidad producidos por los procedimientos de cultivo celular recién proporcionados por la presente invención y el incremento global de la producción de proteína se atribuyen a las elevadas cifras de células viables que sobreviven a lo largo de todo el procedimiento de cultivo que comprende múltiples cambios de temperatura descendentes.

EJEMPLO 7

Ejemplo 7A

Este Ejemplo 7A proporciona materiales y reactivos empleados en los procedimientos de la presente invención para el cultivo de células recombinantes que producen la proteína de fusión L104EA29YIg de ejemplo tal como se describe en los Ejemplos 7B-13.

Medio de cultivo celular El medio de cultivo celular basal usado para todas las fases de la generación del inóculo celular fue medio CD-CHO modificado que contenía glutamina, bicarbonato sódico, insulina y metotrexato (Invitrogen, Carlsbad, CA), como se pone de ejemplo en la Tabla 6. El pH del medio se ajustó a 7,0 con HCl 1N. El medio de cultivo celular basal usado para todas las fases de la generación del inóculo celular y para el crecimiento de cultivos en biorreactores, incluidos los reactores de producción de 5 litros (5 l), 10 litros (10l) y 50 litros (50 l), también fue medio CD-CHO modificado mostrado en la Tabla 6, a excepción de que no tenía metotrexato. El pH del medio se ajustó hasta un pH de 7,0 con HCl 1N.

Tabla 7

En todos los Ejemplos excepto en el Ejemplo 19, para alimentar las células en el procedimiento discontinuo con alimentación se empleó un medio de alimentación modificado, es decir medio eRDF-1 (Invitrogen), que contiene glucosa, glutamina, insulina y TC Yeastolate (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), como se muestra en la Tabla 8.

El pH del medio de alimentación se ajustó a 7,0 con NaOH 1N después de la adición de todos los componentes.

Tabla 8

Para el Ejemplo 10, el medio de alimentación fue el descrito con anterioridad con una modificación: eRDF-1 a una concentración de 25,2 g/l.

2. Fase de producción en el biorreactor

Se usaron biorreactores de escala de 5 l (reactor de cristal con un impulsor marino), a escala de 10 l (de cristal con dos impulsores marinos) y a escala de 50 l (reactor de acero inoxidable con dos impulsores marinos). (Véase el Ejemplo 2). Un sistema de adquisición de datos (Intellution Fix 32) registró la temperatura, el pH y la el oxígeno (OD) durante los ciclos. Los flujos de gas se controlaron con rotámetros. Se roció aire en el reactor a través de una frita sumergida (de 5 |j/m de tamaño de poro) y a través del espacio aéreo del reactor para la retirada de CO². Se roció oxígeno molecular a través de la misma frita para el control del OD. Se roció CO²a través de la misma frita para el control del pH.

3. Estrategia de alimentación

A las 24 horas de la inoculación, en el reactor se añadió un mínimo diario de 1 % del volumen de cultivo del medio de alimentación modificado eRDF-1 si la concentración de glucosa era 3,0 g/l. En los casos en los que la concentración de glucosa era inferior a 3 g/l, el volumen del bolo de alimentación diario se calculó para aumentar la concentración de glucosa de nuevo hasta 3,0 g/l. La cantidad de alimentación diaria se registró en hojas del lote.

4. Toma de muestras

Se extrajeron muestras de células del reactor a diario. Una muestra usada para el recuento celular se tiñó con azul triptán (Sigma, St. Louis, MO). El recuento celular y la determinación de la viabilidad celular se realizaron mediante hemocitometría usando un microscopio o mediante un contador automático de células Cedex (Innovatis AG, Bielefeld, Alemania). Para el análisis de los metabolitos se centrifugó una muestra adicional durante 20 minutos a 2000 rpm (4°C) para la separación celular. En el sobrenadante se analizaron los parámetros siguientes. título, ácido siálico, glucosa, lactato, glutamina, glutamato, pH, pO², pCO², amoniaco y, opcionalmente, lactato deshidrogenasa (LDH). Muestras de refuerzo adicionales se congelaron a -20°C.

Ejemplo 7B

Este Ejemplo 7B describe la producción de L104EA29Ylg, mostrada como -1 a 357 o 1 a 357 en la FIG. 9 (ADN codificador depositado como ATCC PTA-2104), de células CHO cultivadas.

Este Ejemplo también describe un procedimiento de la presente invención que implica la adición de compuesto polianiónico, más específicamente sulfato de dextrano, a un cultivo celular.

Las células CHO usadas para la expresión de L104EA29Ylg se expandieron en medio CD-CHO modificado (Invitrogen, CA) que contiene glutamina, bicarbonato sódico, insulina y metotrexato (Tabla 1) usando matraces T-75 y matraces de agitación. Los matraces T y los matraces de agitación se incubaron a 37°C y al 6% de CO². Después de generar suficiente inóculo, el cultivo se transfirió a biorreactores de 5 o de 10 l usando medio CD-CHO modificado como se ha descrito en lo que antecede, excepto que sin metotrexato. La densidad de siembra inicial fue 200.000 células viables/ml o 106 células/ml.

Los vasos de 5 l y de 10 l fueron reactores de cristal equipados con uno y dos impulsores marinos respectivamente (Applikon, CA). Los flujos de gas se controlaron con rotámetros. Se roció aire en el reactor a través de una frita sumergida (de 5 |im de tamaño de poro) y a través del espacio aéreo del reactor para la retirada de CO². Se roció oxígeno molecular a través de la misma frita para el control del OD. Se roció CO²a través de la misma frita para el control del pH en el lateral superior. El control del pH en el lateral inferior se realizó a través de la adición de NaOH o Na2CO3.1N.

Al cultivo en el biorreactor se administró una alimentación en bolo diario usando medio eRDF modificado (Invitrogen, CA) con glucosa, galactosa, glutamina, insulina y TC Yeastolate (Becton Dickinson) del siguiente modo: comenzando un día después de la inoculación se añadió un mínimo de 1% del volumen de cultivo o, si el nivel de glucosa era inferior a 3 g/l, un volumen calculado para devolver los niveles de glucosa a 3 g/l.

En todos los ejemplos, excepto el Ejemplo 13, la temperatura se controló a 37°C desde el día 0 al día 6; a 34°C desde el día 6 al día 10; a 32°C desde el día 10 en adelante.

El procedimiento de fermentación tuvo una duración típica de 14-19 días. Se extrajeron muestras del reactor a diario. La muestra usada para el recuento celular se tiñó con azul triptán (Sigma, MO). El recuento celular y las determinaciones de la viabilidad celular se realizaron usando un contador celular automático Cedex (Innovatis AG, Bielefeld, Alemania). En el sobrenadante se analizó: Título de LEA29Y, glucosa, lactato, glutamina, glutamato, pH, pO², pCO², amoniaco.

El sulfato de dextrano (sal de sodio, a partir de dextrano de peso molecular medio de 5000 Da, Sigma, MO) se disolvió en agua o en medio. La solución se filtró en esterilidad y se añadió al reactor hasta una concentración de 50 mg/l. El volumen de la adición constituyó, como máximo, el 2% del volumen de trabajo del reactor en el momento que tuvo lugar la adición.

EJEMPLO 8

Este Ejemplo describe y presenta los resultados de un estudio comparativo para evaluar el efecto de la adición de compuesto polianiónico, más específicamente sulfato de dextrano, en un momento posterior a la inoculación.

En los biorreactores de 5 l y 10 l se inoculó 0,2 x 106 células/ml de células productoras de L104EA29Y.

Los Experimentos 8a y 8b se diseñaron del siguiente modo:

Ejemplo 8-a: no se añadió sulfato de dextrano a los cultivos (cultivos “control”: 4 cultivos en biorreactores de 5 l, 4 cultivos en biorreactores de 10 l).

Ejemplo 8-b: se añadió a los cultivos sulfato de dextrano hasta una concentración de 50 mg/l el día 6 (cultivos “DS día 6”: 2 cultivos en biorreactores de 5 l, 1 cultivo en biorreactores de 10 l). 2 cultivos en biorreactores de 5 l, 1 cultivo en biorreactores de 10 l).

La viabilidad media, la densidad de células viables y los perfiles de densidad celular total y sus desviaciones estándar para los ejemplos 8-a y 8-b se indican en la Figura 11.

En los cultivos control se observó una estabilización en la densidad de células viables entre los días 6 y 7, correspondiente a la fase estacionaria. Se observó una disminución en la densidad de células viables y en la viabilidad después del día 7 (de media) para los cultivos control, correspondiente a la fase de muerte. Cuando se añadió a los cultivos sulfato de dextrano el día 6, la fase de crecimiento se extendió hasta el día 11. La densidad de células viables alcanzó de media de 5,2 x 106 células/ml, frente a las 3,5 x 106 células/ml para el control. La viabilidad permaneció por encima del 90% durante esta fase de crecimiento extendida. Después del día 11, la densidad de células viables y la densidad celular total disminuyeron de un modo proporcional, que indica lisis celular y, como resultado, el índice de viabilidad permaneció por encima del 90% hasta el día 15.

La figura 12 es una representación logarítmica de las densidades de células viables en función del tiempo para los cultivos con adición de sulfato de dextrano y para los ciclos control. Las tasas de muerte (proporcionadas por las pendientes de las densidades de células viables en la Figura 11) difirieron en función de la presencia o no de sulfato de dextrano. En presencia de sulfato de dextrano, la tasa de muerte fue aproximadamente constante entre el día 12 y el día 19, a un valor de 0,0012 h- . En contraste con esto, la tase de muerte en la media de los controles fue, entre los días 8 y 12 donde fue máx ima, 0,0024 h-1. Por tanto, el sulfato de dextrano añadido el día 6 ralentizó la tasa de muerte celular durante la fase de muerte por un factor de dos.

A pesar de los efectos beneficiosos del sulfato de dextrano descritos con anterioridad, el título del producto L104EA29Ylg fue similar con o sin adición de sulfato de dextrano (Tabla 9).

Tabla 9: impacto de la adición de sulfato de dextrano el día 6 sobre el título del producto L104EA29Ylg el día 14

La extensión de la sialilación de L104EA29Ylg para diferentes ciclos se indica en la Tabla 10. Dada la relativamente grande variabilidad entre ciclos, se puede considerar que la sialilación de L104EA29Ylg no se ve significativamente afectada por la adición de sulfato de dextrano el día 6.

Tabla 10: impacto de la adición de sulfato de dextrano el día 6 sobre la sialilación del producto L104EA29Ylg

EJEMPLO 9

Este ejemplo muestra el efecto de la adición de sulfato de dextrano a un cultivo celular que está en la fase de muerte. En un biorreactor de 5 l de células productoras de L104EA29Ylg se inoculó a una densidad de 106 células/ml y la fase de muerte comenzó el día 5. El día 6 se añadió sulfato de dextrano.

La viabilidad, la densidad de células viables y el perfil de densidad celular total se presentan en la Figura 13. La adición de sulfato de dextrano el día 6 de dicho cultivo podría prevenir que se produjera un gran descenso de la densidad de células viables hasta el día 17. Por tanto, cuando se añade sulfato de dextrano durante la fase de muerte, la muerte celular se puede detener durante varios días.

En este ciclo, el día 14 se obtuvo un título de 1,9 g/l con una proporción molar de NANA de 6,6.

EJEMPLO 10

Este ejemplo muestra el efecto de la adición de sulfato de dextrano a un cultivo celular que está en la fase de muerte. En un biorreactor de 10 l se inoculó 0,2 x 106 células/ml de células productoras de L104EA29Y. En este ejemplo concreto, la alimentación diaria fe de una formulación más concentrada y, como resultado, el inicio de la fase de muerte se retrasó hasta el día 10 (Figura 14). El sulfato de dextrano no se añadió hasta el día 14.

La viabilidad, la densidad de células viables y el perfil de densidad celular total se presentan en la Figura 14. La adición de sulfato de dextrano el día 14 permitió una estabilización de la densidad de células viables durante un periodo de 4 días, tras el cual se interrumpió el cultivo.

Este ejemplo es otra ilustración de la detención de la muerte celular durante la fase de muerte tras la adición al cultivo de sulfato de dextrano.

EJEMPLO 11

Este ejemplo muestra el efecto de añadir sulfato de dextrano el día 0. El efecto de la adición retardada de sulfato de dextrano puede verse comparando el efecto observado en este experimento con los efectos observados en otros experimentos en los que se retrasó la adición de sulfato de dextrano.

En dos biorreactores de 5 l duplicados se inoculó 0,2 x 106 células/ml de células productoras de L104EA29Ylg y se añadió sulfato de dextrano hasta una concentración de 50 mg/l el mismo día de la inoculación (día 0).

La viabilidad, la densidad de células viables y los perfiles de densidad celular total se presentan en la Figura 15. Ningún cultivo alcanzó una densidad celular mayor que los cultivos desprovistos de sulfato de dextrano (Compárese las Figuras 11 y 15). Las células entraron en la fase de muerte el día 7 u 8, frente al día 11 cuando se añade sulfato de dextrano el día 6 (Compárese las Figuras 11 y 15). Los títulos de L104EA29Ylg obtenidos el día 14 de estos ciclos fueron 0,57 g/l (ciclo n° 1) y 0,86 g/l (ciclo n° 2), que son significativamente menores que los títulos obtenidos en el procedimiento control o en el procedimiento con adición de sulfato de dextrano el día 6 (véase el Ejemplo 8).

Estos resultados demuestran la importancia del momento de la adición de sulfato de dextrano sobre el resultado de la adición.

Sin quedar ligados por teoría alguna, los inventores proponen que los efectos observados de la adición de sulfato de dextrano y su dependencia del momento de la adición se pueden explicar por la unión del sulfato de dextrano a diversos factores autocrinos, de un modo similar a la unión de polisulfato de pentosán a los factores de crecimiento de unión a heparina (Zugmaier y col., 1992). Los inventores proponen que el sulfato de dextrano se une a estos factores en su dominio de unión a heparina, que queda no disponible para su unión a los proteoglicanos de sulfato de heparán de la superficie celular. Como resultado, los factores unidos a sulfato de dextrano no se concentran en la superficie celular, lo que reduce considerablemente la probabilidad de su unión a sus receptores. El efecto neto es que estos factores ya no ejercen su acción normal sobre las células. En los primeros días después de la inoculación, las células producen ciertos factores de crecimiento, cuya función es señalizar el crecimiento celular. El sulfato de dextrano añadido el día 0 se une de forma irreversible a los factores como se han producido. No obstante, la unión del sulfato de dextrano a estos factores no afecta considerablemente al crecimiento celular de forma adversa, posiblemente porque las células pueden responder incrementando la producción del factor de crecimiento. Más tarde en la fase de crecimiento, la producción de los factores de crecimiento cesa y las células comienzan a producir factores autocrinos de un tipo diferente, cuyo efecto a una concentración alta es señalizar el fin de la fase de crecimiento y el inicio de la muerte celular. Estos factores se acumulan desde una concentración baja el día 0 a una concentración alta más tarde. En este punto, estos factores señalizan de forma eficaz las células para que detengan su crecimiento y entren el las fases estacionaria y de muerte. Los inventores proponen que el sulfato de dextrano se une preferentemente a estos factores de señalización de muerte, de modo que se desactiva su función de señalización y permite una extensión de la fase de crecimiento. La inducción continua por estos factores parece ser necesaria para que progrese la muerte celular, con el resultado de que las células que han entrado en la fase de muerte pueden volver a una fase estacionaria cuando el sulfato de dextrano desactiva los factores de señalización de muerte (Ejemplos 9 y 10), incluso tan tarde como el día 14 del cultivo. Por el contrario, el sulfato de dextrano añadido el día 0, que se ha unido a los factores de crecimiento, todavía está unido a estos factores al final de la fase de crecimiento, lo que hace que no esté disponible para unirse a las moléculas de señalización de muerte. Por tanto, la extensión de la fase de crecimiento y el retraso del inicio de la muerte celular no se producen en caso de cultivos en los que se añade sulfato de dextrano el día 0 (Ejemplo 11) del mismo modo que en el caso en el que el sulfato de dextrano se añade al final de la fase de crecimiento.

Se ha postulado la hipótesis de que la detención del crecimiento celular y el inicio de la muerte celular el día 11 en los cultivos suplementados con sulfato de dextrano el día 6 en el Ejemplo 6 es el resultado de mecanismos diferentes de la inducción por la unión de sulfato de dextrano a factores autocrinos. Posiblemente, el agotamiento de nutrientes concretos en el medio tras 11 días de crecimiento puede ser la causa del fin de la fase de crecimiento en estos cultivos.

EJEMPLO 12

Este ejemplo compara el efecto de la adición de sulfato de dextrano a tres tiempos diferentes durante la fase de crecimiento inicial.

En los cultivos de células productoras de L104EA29Ylg se inoculó 106 células/ml en biorreactores de 5 l. El sulfato de dextrano se añadió a los cultivos hasta una concentración de 50 mg/l a diferentes tiempos. En un cultivo, se añadió sulfato de dextrano el día 3, en otro el día 4 y en un tercero el día 5.

La viabilidad y los perfiles de densidad de células viables se indican en la Figura 16. En los tres casos de adiciones (día 3, 4 o 5) se consiguieron densidades de células viables elevadas (> 107 células/mol), pero las primeras adiciones (día 3 o 4) no evitaron una disminución de la densidad de células viables inmediatamente después de la fase de crecimiento. En contraste con esto, la adición del día 5 estabilizó la densidad de células viables durante 4 días antes de la fase de crecimiento. En los puntos de tiempo después de 250 horas, la densidad de células viables en el cultivo en el que se añadió sulfato de dextrano el día 5 siempre fue superior o igual (dentro del error de medición) que en el cultivo en el que se añadió sulfato de dextrano el día 4 y la densidad de células viables en el cultivo en el se añadió sulfato de dextrano el día 4 siempre fue superior o igual dentro del error de medición) que en el cultivo en el que se añadió sulfato de dextrano el día 3. Por tanto, a partir de este ejemplo parece que el tiempo óptimo de la adición de sulfato de dextrano es al final de la fase de crecimiento inicial (en referencia a la fase de crecimiento que se habría observado en ausencia de cualquier adición de sulfato de dextrano). La adición más temprana puede extender la fase de crecimiento, pero no será tan eficaz en la estabilización de la densidad de células viables tras la fase de crecimiento extendida inducida por sulfato de dextrano, mientras que la adición tardía (durante la fase de muerte) estabilizará la densidad de células viables, pero puede no proporcionar un incremento sustancial en la densidad de células viables (véanse los Ejemplos 9 y 10). De acuerdo con esto, el día 14 se obtuvo un título de 2,7 g/l con la adición de sulfato de dextrano el día 5, mientras que el día 14 se obtuvieron títulos de 2,6 g/l con la adición de sulfato de dextrano el día 3 o el día 4 y el día 14 se obtuvo un título de 1,9 g/l con la adición de sulfato de dextrano el día 6 (en el Ejemplo 9). Las proporciones molares de NANA fueron 6,3, 6,6, 6,0 y 6,6, respectivamente en los ciclos mencionados en lo que antecede, lo que muestra que los títulos mayores obtenidos con la programación óptima de la adición de sulfato de dextrano conllevaron un nivel consistente de sialilación.

EJEMPLO 13

Este ejemplo muestra el efecto de uno y dos cambios de temperatura en un cultivo productor de L104EA29Ylg. El cultivo también se somete a adición retardada de sulfato de dextrano.

En reactores de 5 l se inoculó a una densidad de 200.000 células/ml.

Se aplicaron dos, uno o ningún cambio de T. Para un cambio de temperatura, la temperatura se varía desde 37°C a 34°C el día 6. Para dos cambios de temperatura, la temperatura se varía desde 37°C a 34°C el día 6, y desde 34°C a 32°C el día 10. En todos los casos el sulfato de dextrano se añadió el día 6. El caso de dos cambios de T es la media de tres ciclos y las desviaciones estándar se muestran en forma de barras.

La densidad de células viables, la viabilidad y el título se indican en las Figuras 17, 18 y 14, respectivamente.

Los resultados muestran los beneficios de aplicar al menos un cambio de temperatura. En el caso en el que la temperatura se mantiene a 37°C a lo largo del ciclo, el cultivo entre en la fase de muerte el día 10 y la reducción de la densidad de células viables y la viabilidad es aguda. Como resultado, hay una clara disminución de la productividad volumétrica de L104EA29Ylg tras 12 días de cultivo. Para los tiempos de cultivo de 14 días y mayores, está claro que los cultivos que tienen uno o dos cambios de temperatura superan el cultivo a temperatura constante en términos del título,

En el caso en el que solo se implementa un cambio de temperatura (el día 6, a 34°C) se observa una disminución aguda de la densidad de células viables y la viabilidad después del día 16. El cultivo en el que se implementa un segundo cambio de temperatura (el día 10, hasta 32°C además del primero no muestra una disminución aguda de la densidad de células viables y la viabilidad después del día 16. A tiempos de cultivo de más de 18 días, la productividad volumétrica en el cultivo con un cambio de T es claramente inferior a la observada en el cultivo con dos cambios de T. En contraste con esto, la productividad volumétrica en el cultivo con un cambio de T es superior a la observada en el cultivo con dos cambios de T a los tiempos de cultivo entre el día 11 y el día 15.

En conclusión, el primer cambio de temperatura es beneficioso con independencia del tiempo de recolección deseado, mientras que el beneficio del segundo cambio de temperatura depende del tiempo de recolección previsto y de los requisitos de viabilidad para un procesamiento posterior eficaz. La ausencia de un segundo cambio de temperatura permitirá que se alcance un mayor título del producto hasta el día 10, pero para los cultivos que duran más de 20 días, el ciclo con dos cambios de temperatura superará al ciclo con un cambio de temperatura en términos de título. Además, debe considerarse que las recolecciones después del día 12 contendrán una cantidad mayor de productos de lisis celular en el caso de un cambio de temperatura con respecto al caso de dos cambios de temperatura, lo que puede complicar el procesamiento posterior. La disminución aguda de la densidad de células viables observada tras el día 12 en el caso del perfil de un cambio de temperatura puede ser un problema para la calidad del producto, ya que la correspondiente muerte celular puede liberar al sobrenadante una carga significativa de sialidasas que pueden disminuir la sialilación del producto.

Los contenidos de todas las patentes emitidas y concedidas, solicitudes de patentes, PCT publicadas y solicitudes de EE.UU., artículos, libros, referencias, manuales de referencia e instrucciones y resúmenes a los que se hace referencia o se cita en la presente memoria descriptiva se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad, con el fin de describir más detalladamente el estado de la técnica a la que pertenece la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de cultivo celular para la producción de una molécula de CTLA4 soluble, que comprende: a) cultivar células CHO que producen una molécula de CTLA4 soluble en cultivo celular en condiciones que permiten la producción de CTLA4; y

b) alimentar las células con D-galactosa.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa de alimentación b) se produce a diario.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las células en medio de alimentación son alimentadas con D-galactosa.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la D-galactosa se sostiene o mantiene en el cultivo celular a una concentración de aproximadamente 0,1 a 10 g/l.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el cultivo celular es un cultivo celular a gran escala.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el cultivo celular a gran escala es de 500 l y superior.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la molécula de CTLA4 soluble es CTLA4Ig que comprende los aminoácidos -1 a 357 o 1 a 357 como se muestra en la FIG. 8.

8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la molécula mutante de CTLA4 soluble es L104EA29Ylg que comprende los aminoácidos -1 a 357 o 1 a 357 como se muestra en la FIG. 9.

9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que además comprende purificar la molécula de CTLA4 soluble.