CN102037356A - 鉴定抗炎化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明证明哺乳动物C-型凝集素受体类型结合IgG抗体或Fc片段从而诱导与各种免疫疾病相关的炎症的IVIG相关的逆转。鉴定出与IgG相互作用以促进降低与免疫疾病相关的炎症的生物反应的DC-SIGN受体类型，提供了筛选和选择可以用于治疗各种免疫疾病的化合物的方法，该化合物作用于调节DC-SIGN+1细胞以向第二效应子巨噬细胞发信号，引起FcγRIIB受体表达的增加和随之抑制细胞介导的炎性反应。

Description

鉴定抗炎化合物的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年4月22日提交的61/046,847号美国临时专利申请和2008年9月16日提交的61/097,344号美国临时专利申请的优先权，其在此通过引用整体地引入。
关于联邦资助研究的声明
本文所述的发明全部地或部分地由美国国立卫生研究院提供的基金(基金号：AI034662)支持。美国政府具有本发明的某些权利。
发明领域
本发明涉及鉴定可用于治疗自身免疫性疾病的化合物的方法。更具体地，本发明涉及筛选和选择可用于治疗患有免疫系统疾病的病人的化合物(如IgG抗体或其生物学上相关的片段)的各种方法。
发明背景
抗体和抗体-抗原复合物与免疫系统的细胞的相互作用引起各种反应，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖性细胞毒作用(CDC)、吞噬作用、炎性介质的释放、抗原的清除和抗体的半衰期。抗体恒定区不直接地参与抗体与抗原的结合，但是显示出各种不同的效应子功能。根据其重链恒定区的氨基酸序列，可以将抗体或免疫球蛋白分为不同的种类。有五大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中的一些可以被进一步划分成子类(亚型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3，和IgG4；IgA1和IgA2。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段(称为Fab片段，其各具有单个抗原结合位点)和残余的“Fc”片段(其名称反映了它容易结晶的能力)。该Fc区域对于抗体的效应子功能极其重要。
已知施用静脉内IgG(IVIG)通过由其Fc片段介导的相互作用而介导促炎的和抗炎的活性。因此，IVIG已知是已经被批准用于治疗患有多种自身免疫性疾病(包括免疫介导的血小板减少症、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(demyelinating polynueropathy)和格林-巴利综合症)，以及其它自身免疫性疾病的病人的治疗剂。
PCT国际申请号PCT/US2007/008396(WO 2007/117505)公开了IVIG的抗炎活性是Fc片段及其连接的聚糖的特性，其需要末端的α2，6唾液酸连接，表明了免疫抑制同时需要该特定的多肽主链和聚糖结构(另参见Anthony等，2008，Science 320：373-376)。
Nimmerjahn和Ravetch(2007，J.Exp.Med.204：11-15)综述并公开了关于使用高剂量IVIG治疗各种免疫疾病的技术。作者提出几个可以解释静脉内(IVIG)抑制致病的炎性反应经由的途径的相关模型。为此，作者提出的两细胞模型表明唾液酸化的IgG与在调节性细胞(如巨噬细胞)上的推定IgG受体相互作用，其随之将上调效应子巨噬细胞上的抑制性FcγR表达的表达水平。但是，没有鉴别出具体的受体。
需要鉴定可用于治疗与各种免疫疾病相关的炎症的新化合物。这种方法更可能适用于在鉴定与之相互作用和促进这一IVIG有关的抗炎活性的受体之后。为此，本发明通过鉴定与唾液酸化IgG抗体或IVIG治疗相关的Fc片段相互作用的受体型解决和满足了这一需求，从而使用于鉴定补充或替代现有的基于IVIG的自身免疫性疾病治疗的新药物的方法和试验成为可能。
发明内容
本发明部分地涉及鉴定结合IgG抗体或Fc片段，从而诱导与各种免疫疾病相关的炎症的IVIG相关逆转的受体型。本文公开的这种结合IgG抗体或Fc片段的受体是哺乳动物C型凝集素型，已知其结合细胞内粘附分子(ICAM)-3(CD50)，包括但不限于DC-SIGN(在树突细胞上发现的人树突细胞特异性粘附受体[CD209])、SIGN-R1(DC-SIGN的鼠科同源物，已知在脾边缘区巨噬细胞上表达)，以及其相关的同源物和同种型。鉴定与IgG相互作用以促进降低与免疫疾病相关的炎症的生物反应的“DC-SIGN受体型”，随之在实施本发明的其他方面时提供了有价值的和关键的组成部分，包括但不一定限于，用于治疗各种免疫疾病的方法，用途和确认的组合物。
本发明涉及鉴定“DC-SIGN受体型”(本文公开的与IgG抗体或Fc片段相互作用以促进与已知的IVIG治疗方案相关的抗炎作用的受体类型)的调节子的方法。特别感兴趣的调制子是起到DC-SIGN受体型激动剂作用的化合物。虽然不受理论的限制，假定这种化合物将显示出介导从DC-SIGN(+)细胞(如树突细胞)到效应子巨噬细胞的信号的能力，其导致FcγRIIB受体表达的增加，其随之抑制通常地由这些巨噬细胞响应相关的自身抗体而产生的细胞介导炎性反应。用于实施本发明的这部分的分析方法可以是技术人员目前可用的任何方法，包括但不限于，利用分离的DC-SIGN受体型、包含DC-SIGN受体型的分离的膜碎片的结合分析，利用DC-SIGN(+)细胞的结合或基于细胞的活化分析，以及功能传感/效应子细胞分析(其测量受试化合物刺激传感细胞(表达DC-SIGN受体型)以介导效应子细胞中FcγRIIB受体上调的能力)。虽然本说明书始终提及全长受体，但该指称并不意在限制。相反，可以理解，在实施发明的方法时可以利用这种全长受体或该受体的生物学相关的片段(如至少包含“凝集素结构域”或“糖识别域”的片断(本文以下称作“凝集素结构域”))。因此，本发明部分地涉及筛选具有以下功能的化合物的方法：(i)调节(即刺激)DC-SIGN受体型的活性，从而促进可能影响次生巨噬细胞中FcγRIIB受体表达增加的可测量细胞成分的表达的增加；(ii)调节编码DC-SIGN受体型蛋白质的DNA或RNA的表达；或(iii)促进与由DC-SIGN受体型的2，6Fc结合启动的下游信号途径连接的报告基因。因此，化合物可以通过增加或减弱编码DC-SIGN受体型的DNA或RNA的表达，促进次生效应子巨噬细胞中FcγRIIB受体的体内表达的增加，和/或通过起到DC-SIGN受体型受体蛋白质的激动剂或拮抗剂的作用调节。
为此，本发明涉及一种鉴定调节DC-SIGN受体型细胞受体从而激活或抑制与自身抗体介导的炎症相关的抗炎活性的受试化合物的方法。这种方法包括，提供包含至少DC-SIGN受体型的凝集素结构域的氨基酸序列；将该DC-SIGN受体型与受试化合物接触；以及测量受试化合物与该受体的结合程度。被证明对这种受体(本文中鉴定为参与病人炎症的静脉内IVIG改变过程的受体)有可测量的亲和力的受试化合物是作为用于治疗多种免疫疾病的潜在的化合物进行进一步测试的候选者。
本发明还涉及一种鉴定调节DC-SIGN受体型从而激活与自身抗体介导的炎症相关的抗炎活性的受试化合物的方法。这种受试化合物将起到相应的DC-SIGN受体型的激动剂的作用。因此，这种方法将包括，提供包含DC-SIGN受体型的凝集素结构域的氨基酸序列；将DC-SIGN受体类型/该受体的凝集素结构域与受试化合物接触；和测量受试化合物与凝集素结构域的结合程度。同样，任何被证明对这种DC-SIGN受体型具有可测量的亲和力的这种受试化合物将是作为类似静脉内IVIG型产物促进抗炎活性的化合物进行另外的测试的候选者。本发明的这类方法可以是无细胞的高通量的方法。这类方法作为证明受试化合物能够结合DC-SIGN受体型/凝集素结构域或者证明受试化合物影响对照抗体与DC-SIGN受体型/凝集素结构域的结合的第一步筛选方法是特别有利的。这类分析将测量受试化合物与DC-SIGN受体型(如与配体结合域)的结合，或在其它实施方式中，测量表达DC-SIGN受体型或其功能片段的细胞的反应。本发明这一部分的方法在鉴定可用作包含α2，6Fc片段的糖基化多肽的替代物，而不是这种多肽的抗炎活性的增强剂的候选化合物中特别有用。在不同的实施方式中，如本说明书中所述地测量候选化合物和受体/凝集素结构域之间的复合物的存在或数量。在其它的实施方式中，如基于细胞的分析方法中，也可以测量表达全长的DC-SIGN受体型或其功能片段的细胞的反应。
本发明进一步涉及一种鉴定调节DC-SIGN受体型，从而激活或抑制IgG介导的炎症相关的抗炎活性的受试化合物的方法，其中这种方法包括，提供包含至少DC-SIGN受体型的凝集素结构域的第一氨基酸序列；将该受体与对照抗体或其变异体接触和测量该对照抗体与受体和/或有关的凝集素结构域的结合程度，从而确定基线结合值。该基线结合值可以用来比较受试化合物的结合，其包括提供包含DC-SIGN受体型的第二氨基酸序列；将源自该第二氨基酸序列的受体和/或相关的凝集素结构域与受试化合物接触，和测量受试化合物与受体/凝集素结构域的结合程度。因此，随后可以将基线结合值与受试化合物的结合程度进行对比。
本发明的方法也可以是基于细胞的。如果使用细胞基的分析方法，也可以使用例如细胞分选的这类技术来测定目的复合物(例如，受试化合物和DC-SIGN受体型/凝集素结构域之间的复合物)的量。因此，在整个说明书中描述的分析方法可以利用DC-SIGN(+)细胞，其中该细胞是(i)用包含DC-SIGN受体型或生物学相关的片段(例如，表达凝集素结构域或表达可能地表达至少部分包含凝集素结构域的细胞外域的Fc-DC-SIGN受体型融合体)的表达载体转染或转化的宿主细胞；(ii)已被遗传修饰以过表达宿主DC-SIGN受体型，优选地导致比在选择的“野生型”宿主细胞中的过表达增加至少5倍(过表达的这种改善可以通过任何本领域中目前已知的方法实现，包括但不限于通过同源重组引入启动子而同时保持编码区完整)的宿主细胞系，和/或(iii)为了任何生物学理由表达高水平的DC-SIGN受体型的宿主细胞(例如，包括但不限于树突细胞)。此外，本文所述的方法可以进行改进修改，以使得在存在来自DC-SIGN(+)细胞的膜制剂时进行目的分析实验，或者可选择地，DC-SIGN受体型(或生物学上的相关片段)可被用来筛选对该受体显示出亲和力的受试化合物。
通过本文所述的方法鉴定的受试化合物优选地起到DC-SIGN受体型的激动剂的作用，并可能是抗体、抗体片段(如Fc片段)、肽、蛋白质、非蛋白质性的有机分子、核酶和/或反义分子，其中的任何一种可以用于促进与基于静脉内IVIG的治疗相关的抗炎活性。
本发明部分地涉及起到调节DC-SIGN受体型作用的化合物(例如，如该受体的激动剂)，从而该化合物调节DC-SIGN受体型，以便介导从DC-SIGN(+)细胞到效应子巨噬细胞的治疗有效的信号，导致FcγRIIB受体的表达增加，其随之抑制通常是由这些巨噬细胞响应相关的自身抗体而产生的细胞介导炎性反应。为此，本发明还涉及一种药物组合物，其包含与至少一种治疗有效的赋形剂结合的这种化合物，以使该药物组合物以用于施用于哺乳动物(包括但不限于人类)的治疗有效浓度存在。
本发明还涉及通过向哺乳动物宿主(包括但不限于人类)施用激活DC-SIGN受体型(如人DC-SIGN受体)的调节剂(如DC-SIGN受体型激动剂)治疗如本文所公开的一种或多种免疫疾病的方法。这种DC-SIGN受体型激动剂可通过本文所述的方法鉴定，并可用于治疗免疫疾病，包括但不限于免疫性血小板减少症(ITP)、自身免疫性溶血性贫血(AHA)、系统性红斑狼疮(SLE)、川崎病(一种急性脉管炎综合症)、硬皮病、类风湿性关节炎(RA)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、天疱疮和其它与自身抗体介导的炎症有关的疾病。
附图简要说明
图1显示IVIG靶向于非B、非T脾细胞群。
图2A-D显示了通过流式细胞分析在野生型(A)、CD4+T细胞缺陷型小鼠(CD4-/-，B)、B细胞缺陷型小鼠(JHD-/-，C)，和B和T细胞缺陷型小鼠(Rag1-/-，D)中对脾边缘区巨噬细胞的MARCO+(y轴)和CD 169+(X轴)细胞的分析。
图3A-C显示了SIGN-R1表达细胞优先结合α2，6Fc片段。(A)用各种标记的Fc和胎球蛋白制剂激发CHO和CHO-SIGN-R1细胞，并通过流式细胞法进行分析。对代表4个单独的实验的CHO-SIGN-R1对CHO细胞的平均荧光强度(MFI)的比率进行作图。(B)平行地，α2，6Fc与Raw-SIGN-R1细胞的结合被SIGN-R1-特异性抗体(ERTR-9)阻断，但不被同种型对照(大鼠IgM)阻断，而用EDTA处理消除了所有结合。(C)用荧光染料标记的Fc制剂激发表达凝集素SIGN-R1、SIGN-R3、mDC-SIGN、hDC-SIGN和hDEC-205的细胞系并通过FACS进行分析。
图4A-D显示了与Siglecs结合的α2，6Fc。(A)通过利用流式细胞分析评估Raw-247细胞(黑色柱状图)和稳定转染的Raw-247细胞(Raw-SIGN-R1，白色柱状图)上的SIGN-R1表达，确认SIGN-R1转染的细胞。(B)用荧光染料标记的α2，6Fc激发Raw-247细胞和表达SIGN-R1的Raw-247细胞，培养基中添加或不添加C 1q，并通过FACS分析结合。对代表3个实验的Raw-SIGN-R1与Raw细胞的MFI比率进行作图。用小鼠唾液酸粘附素(sialoadhesion)(Siglec-1)细胞外域(mSND)-3)、结合缺陷的唾液酸粘附素(mSND1-3R97A4)、人CD22(hCD22)、人CD33(hCD33)、小鼠MAG(mMAG)、人Siglecs 5-10(hSiglec-5-10)和胎球蛋白的Siglec-Fc嵌合体涂布平面孔板。然后该嵌合体用(C)α2，6Fc或(D)SA tx Fc免疫复合物探测，显影并分析。
图5显示了表明SIGN-R1阻断消除了IVIG对诱发关节炎的保护作用的实验结果。用IVIG和K/BxN处理C57BI/6小鼠，其中的一些被施用对SIGN-R1(α-SIGNR1)或Marco(α-Marco)的封闭抗体，或被诱导以下调SIGN-R1表面表达(TKO-SIGN-R1)，并在后面的数天内监测足垫肿胀。对每组5个小鼠的第5天临床评分的均值和标准差作图；*表示通过Tukey′s post hoc检验确定为p＜0.001。
图6A-B显示，C1q不参与α2，6Fc与SIGN-R1的结合或需要其抗炎活性。用K/BxN血清和IVIG处理小鼠，其中一些接受SIGN-R1封闭抗体ERTR-9(α-SIGN-R1)或SIGN-R1下调抗体22D1(TKO-SIGN-R1)或适当的同种型对照(分别为大鼠IgM抗体和仓鼠IgG)。在后面的七天内监测足垫肿胀。对每组5个小鼠的第6天临床评分进行平均值和标准差的作图。B.对野生型和C1q-/-C57B1/6小鼠注射K/BxN血清，其中一些接受α2，6Fc，并在后面数天内根据监测足垫肿胀的临床评分。
图7显示，α2，6Fc在SIGN-R1-/-小鼠中不抑制诱导的关节炎。向C57B1/6和SIGN-R1-/-小鼠施用K/BxN血清(黑色条)，其中一些1小时前接受α2，6Fc(α2，6Fc+K/BxN，灰色条)。在后面数天内监测足垫肿胀的临床评分。对每组3-4个小鼠的平均值和标准差作图。*由接着Tukey′s post hoc检验的ANOVA分析确定为p＜0.05。
图8显示，用浓度增加的2，6-唾液酸化Fc(顶行)或去唾液酸的(asialylated)Fc(底行)激发从C57BL/6(左列)、FcRγ/IIB-/-(中间列)、SIGN-R1-/-(右列)小鼠分离的定居腹腔巨噬细胞。相对于游离的非结合Fc，测定结合的Fc的量并作图，并且代表两个独立的实验。
图9显示，表达SIGN-R1(左列)、hDC-SIGN(中列)或FcRγIIB(右列)的CHO细胞用2，6-Fc激发(顶行)，在2，6-Fc激发前与甘露(manna)一起孵育(中行)或用纤维蛋白原激发(底行)。测定结合的糖蛋白的量，并相对于游离的非结合蛋白质作图。
本发明的详细说明
本发明的方法部分地基于此处结合IgG抗体或片段的受体型的鉴定，其中该IgG抗体或片段已知促进免疫疾病的基于IVIG的治疗。这种受体是哺乳动物的C-型凝集素受体型，已知其结合细胞内粘附分子(ICAM)-3(CD50)，包括但不限于DC-SIGN(在树突细胞上发现的人树突细胞特异性粘附受体[CD209])、SIGN-R1(DC-SIGN的小鼠同源物，已知在脾边缘区巨噬细胞上表达)以及任何相关的哺乳动物同源物或其同种型。Geijtenbeek，等(2000，Cell 100：575-585；也参见美国专利号6,391,507)鉴别的人DC-SIGN受体是C型凝集素(钙依赖性)受体，其至少在树突细胞、巨噬细胞和激活的B细胞上表达。这种受体以四聚体的形式发挥功能，并包含糖识别域(CRD)、重复结构域、跨膜结构域和细胞内的胞质域，含有三个内化基序(综述，见Wu和KewalRamani，2006，Nat.Immunol.6(11)：859-868)。据记载，DC-SIGN受体结合多种病毒、细菌、真菌和寄生虫病原体，包括但不限于人类免疫缺陷病毒(“HIV”，例如，参见美国专利号6,391,567，Garcia等，2005，Traffic 6：488-501；Hodges等，2007，Nat.Immunol.8(6)：569-577)、丙型肝炎病毒(“HCV”，例如，参见美国专利号7,022,323)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(EP 1407965A1)、埃博拉病毒(Marzi等，2006，J.Virol.80(13)：6305-6317)、麻疹病毒(Lot de Witte等，J.Virol.80(7)：3477-3486)和登革热病毒(WO 2004/041299)。因此，这一C-型凝集素受体已经提出可能是可以调节该受体的化合物(如甘露糖、岩藻糖、植物凝集素、抗生素、糖、蛋白质或抗该受体的抗体)的靶标(参见，例如，美国专利号7,148,329)。据发明者所知，目前还没有直接地将DC-SIGN受体型与通过基于IVIG的治疗策略治疗自身免疫性疾病中获得的治疗价值相联系的在先公开。因此，如本文进一步所描述的，本发明部分地涉及筛选和选择调节(和优选地作为激动剂发挥作用)DC-SIGN受体型以促进与之前已经证明的IVIG施用相类似的抗炎反应的化合物的方法。因此，鉴定这一受体型(其在本文中公开为与IgG相互作用以激活在各种自体免疫疾病中促进抗炎状态的生物反应)提供了使筛选和选择可以用于治疗目前通过基于IVIG的技术进行治疗的各种免疫疾病的更多的化合物成为可能的重要的和关键的组成部分。
为此，本发明部分地涉及鉴定DC-SIGN受体型功能的调节剂的方法。这类方法可以使技术人员能够进行任何分析，从筛选候选受试化合物的大文库，到可能集中于化合物的相关子集或类(如抗体或相关的Fc片段)的分析，到集中于可用于选择更可能调节DC-SIGN受体型而因此介导促进FcγRIIB受体在体内表达增加的信号通路的增强Fc抗体片段(如α2，6唾液酸化Fc片段)的特定结构属性的分析。可用于鉴定调节DC-SIGN受体型(即通过与至少部分DC-SIGN受体型的氨基酸序列相互作用结合和/或调节受体)的化合物的各种分析方法包括但不限于在无细胞系统(如分离的DC-SIGN受体，含有凝集素结构域的融合构建体[例如，和Fc-LBD融合构建体]，或含有凝集素结构域的片段)中进行的分析，或利用生物体中(如转基因动物)的一个或多个分离的细胞类型(结合或功能分析)或利用相关的膜片段进行的分析，或其组合。这些分析可以鉴定同时表现出对DC-SIGN受体型的亲和力的试验性候选化合物，和特别地激活DC-SIGN受体型从而导致次级效应细胞中FcγRIIB受体表达的增加的化合物。调节剂(如激活DC-SIGN受体型以诱导效应细胞发出增加次级效应细胞中FcγRIIB受体表达的信号的化合物)可以是改变靶受体的功能的化合物，如通过受试化合物存在和/或不存在时受体的结合和/或功能测定的。
任何编码功能性DC-SIGN受体型(或至少来自相应受体的生物学有效结合域)从而影响相应DC-SIGN受体型的生物学相关氨基酸序列的正常表达的多核苷酸序列可以用于本文讨论的重组细胞和基于膜的分析。作为例子，但绝不表示为作为限制，可以被用于构建合适的DNA表达载体的多核苷酸是包含哺乳动物DC-SIGN受体型的开放阅读框的DNA分子，如SEQ ID NO：1(DC-SIGN；登录号NM 021155，具有核苷酸10-1224的开放阅读框，编码人DC-SIGN受体[见SEQ ID NO：2])和SEQ ID NO：3(SIGNR1；登录号SF3733409，具有核苷酸28-1005的开放阅读框，编码鼠SIGNR-1受体[见SEQ IDNO：4])中所示的多核苷酸序列，以及各种同源物、剪接变异体和/或同种型，如在美国专利申请公开2005/0221291A1(Ahuha等)中所公开的。
本说明书中全文描述的分析方法可以利用以下DC-SIGN(+)细胞：(i)用包含DC-SIGN受体型或生物学相关片段(例如，表达凝集素结构域或可能地表达包含凝集素结构域的至少部分细胞外域的Fc-DC-SIGN受体型融合体)的表达载体转染或转化的宿主细胞；(ii)被遗传修饰以过表达宿主DC-SIGN受体型，优选地导致比在选择的“野生型”宿主细胞中的表达提高至少5倍(这种过表达的改善可以通过任何该领域中目前已知的方法实现，包括但不限于通过同源重组引入启动子而保持编码区完整)的宿主细胞，和(iii)为了任何生物学理由表达高水平的DC-SIGN受体型的宿主细胞(例如，包括但不限于树突细胞)，可以被用来筛选和/或选择可用于治疗目前通过施用IVIG进行治疗的各种免疫疾病的调节剂。因此，任何(i)、(ii)、(iii)的这类细胞或任何其他显示出生物学相关量的DC-SIGN受体型的细胞类型在本文中可以称为“DC-SIGN(+)细胞”，并可将其用于本文公开的一个或多个方法中。如本文进一步所述，本发明部分地涉及基于细胞的和基于膜的鉴定哺乳动物DC-SIGN受体型的选择性激动剂和/或拮抗剂的方法。本发明的具体目的是提供基于DC-SIGN受体型的分析以筛选在效应细胞中调节FcγRIIB受体的体内表达的这一受体蛋白的选择性激动剂。同样，这些分析可以是基于细胞的分析；由此，编码DC-SIGN受体型的DNA分子转染或转化到宿主细胞中，并使该重组宿主细胞生长足以表达DC-SIGN受体的时间。或者，也可使用作为DC-SIGN(+)的任何“非重组”细胞系来筛选和/或选择可用于治疗各种免疫疾病的DC-SIGN调节剂。此外，源于这种DC-SIGN(+)细胞的基本上纯化的膜片段可被用于分析中以筛选和/或选择与通过在次级效应细胞中上调FcγRIIB受体而促进体内抗炎作用相关的哺乳动物的DC-SIGN受体型的调节剂。
任何如上所述的多核苷酸或技术人员可得到的用于相同的预期目的的生物学等效多核苷酸可以被插入到合适的表达载体中，并与其它的DNA分子(即DC-SIGN受体型不是自然地连接的DNA分子)连接以形成表达这种受体的“重组DNA分子”。这些载体可以由DNA或RNA组成；对于大多数的克隆目的来说DNA载体是优选的。典型的载体包括质粒、修饰的病毒、噬菌体和粘粒、酵母人工染色体和其它可以编码DC-SIGN受体型的游离的或整合的DNA的形式。为特定的用途确定适当的载体完全在技术人员的能力范围内。
各种哺乳动物表达载体可以被用来在哺乳动物细胞中表达重组的DC-SIGN受体型。如上所示，本文将表达载体定义为在适当的宿主中转录克隆的DNA和翻译它们的mRNA所需的DNA序列。这样的载体可以用来在各种宿主，例如细菌、蓝绿藻、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞中表达真核生物的DNA。特别设计的载体使得DNA能够在宿主之间(如细菌-酵母或细菌-动物细胞之间)穿梭。适当地构建的表达载体应当包含：用于在宿主细胞中自主复制的复制起点、选择标记、有限数目的有用的酶切位点、可能的高拷贝数和活性的启动子。启动子被定义为引导RNA聚合酶结合到DNA上并启动RNA合成的DNA序列。强启动子是使得mRNA以高频率启动的启动子。表达载体可以包括但不限于，克隆载体、修饰的克隆载体、专门设计的质粒或病毒。市售的可以适用于重组DC-SIGN受体型的表达的哺乳动物表达载体，包括但不限于，pcDNA3.neo(Invitrogen)、pcDNA3.1(Invitrogen)、pCI-neo(Promega)、pLITMUS28、pLITMUS29、pLITMUS38和pLITMUS39(New England Bioloabs)、pcDNAI、pcDNAIamp(Invitrogen)、pcDNA3(Invitrogen)、pMClneo(Stratagene)、pXT 1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2-neo(ATCC 37593)、pBPV-1(8-2)(ATCC 37110)、pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC 37224)、pRSVgpt(ATCC 37199)、pRSVneo(ATCC 37198)、pSV2-dhfr(ATCC 37146)、pUCTag(ATCC 37460)和IZD35(ATCC 37565)。
另外，各种细菌表达载体可以被用于在细菌细胞中表达重组的DC-SIGN受体型。可以适用于重组DC-SIGN受体型的表达的市售细菌表达载体包括但不限于，pCR2.1(Invitrogen)、pET11a(Novagen)、λgt11(Invitrogen)和pKK223-3(Pharmacia)。此外，各种真菌细胞表达载体可以被用于在真菌细胞中表达重组的DC-SIGN受体型。可以适用于重组DC-SIGN受体型的表达的市售真菌细胞表达载体包括但不限于，pYES2(Invitrogen)和毕赤酵母表达载体(Invitrogen)。另外，各种昆虫细胞表达载体可以被用于在昆虫细胞中表达重组的受体。市售的可以适用于DC-SIGN受体类型的重组表达的昆虫细胞表达载体包括但不限于，pBlueBacIII和pBlueBacHis2(Invitrogen)，以及pAcG2T(Pharmingen)。
为了确定产生最佳水平的DC-SIGN受体型的DC-SIGN受体型cDNA序列，可以构建包括但不限于以下组成的cDNA分子：包含DC-SIGN受体型的全长开放阅读框的cDNA片段，以及含有仅编码该蛋白质的特定结构域或该蛋白质的重排结构域(rearranged domain)的cDNA部分(包括但不限于编码至少DC-SIGN受体型的凝集素结构域的cDNA部分(例如，Fc-LBD的融合构建体))的各种构建体。所有构建体可以被设计成不含有或者含有全部或部分的DC-SIGN受体型的5′和/或3′非翻译区。可以在将这些构建体引入到适当的宿主细胞中之后测定DC-SIGN受体型的表达水平和活性。在瞬时检测(transient assay)中确定产生最佳表达的DC-SIGN受体型盒之后，将这一DC-SIGN受体型cDNA构建体传递到各种表达载体(包括重组病毒)中，包括但不限于用于哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、卵母细胞、细菌和酵母细胞的表达载体。
可以将被工程化以包含和/或表达编码DC-SIGN受体型的DNA序列的宿主细胞可以培养在适当的条件下以产生DC-SIGN受体型或生物学等效的形式。这些重组的宿主DC-SIGN(+)细胞可以是原核的或真核的，包括但不限于细菌如大肠杆菌；真菌细胞如酵母；哺乳动物细胞包括但不限于，人、牛、猪、猴子和啮齿动物源的细胞系；以及昆虫细胞包括但不限于，果蝇和蚕源的细胞系。例如，一种昆虫表达系统利用与杆状病毒表达载体(pAcG2T，Pharmingen)合作的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf21)昆虫细胞(Invitrogen)。此外，可能合适且可市售得到的哺乳动物细胞系包括但不限于，L细胞L-M(TK-)(ATCC CCL 1.3)、L细胞L-M(ATCC CCL 1.2)、Saos-2(ATCC HTB-85)、293(ATCC CRL 1573)、Raji(ATCC CCL 86)、CV-1(ATCC CCL 70)、COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL1651)、CHO-K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCC CRL 1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C 127I(ATCC CRL 1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)、MRC-5(ATCC CCL 171)、CPAE(ATCC CCL209)和HOS细胞(人成骨肉瘤；ATCC CRL 1543)。可以通过多种技术中的任何一种将表达载体引入到宿主细胞中，包括但不限于转化、转染、原生质体融合和电穿孔。转化是指靶细胞包含由DNA的整合产生的遗传改变。转染意思是包括该领域已知的用于将DC-SIGN受体型引入受试细胞中的任何方法。例如，转染包括磷酸钙或氯化钙介导的转染、脂质转染、用含有DC-SIGN受体型的逆转录病毒构建体转染和电穿孔。单独地分析含有表达载体的细胞以确定它们是否产生DC-SIGN受体型蛋白质。可通过几种途径鉴别表达DC-SIGN受体型的细胞，包括但不限于与抗-DC-SIGN受体型抗体的免疫反应、标记凝集素的结合和宿主细胞相关的DC-SIGN受体型活性的存在。可以特别地用于实施本发明的这些方法的宿主细胞还包括，但绝不限于，MARCO(+)边缘区巨噬细胞。
因此，对DC-SIGN受体型显示出亲和力的化合物的结合特异性通过测量该化合物对表达DC-SIGN受体型的细胞、源于该细胞的膜制剂、或者受体(或至少是含有凝集素结构域的部分；如Fc-LBD融合构建体)(其可被固定以用于筛选目的)的亲和力来证明。克隆受体的表达和结合于DC-SIGN受体型的或者抑制DC-SIGN受体型的已知配体(例如含α2，6-连接的唾液酸的Fc片段)与这些细胞或源于这些细胞的膜制剂结合的化合物的筛选提供了快速选择可能用于治疗各种免疫疾病的对DC-SIGN受体型具有高亲和力的化合物的有效方法。这种配体不一定需要被标记，而也可以是可被用于取代结合的标记化合物的或可被用作功能分析中的活化剂的非同位素化合物。通过本文所述的方法鉴定的化合物很可能是DC-SIGN受体型的激动剂或拮抗剂且，如本文中所提到的，可能是抗体、抗体片段(如Fc片段和/或包含α2，6-连接的唾液酸的Fc片段)、其它类型的肽、蛋白质以及非蛋白性有机分子，其所有的可以被用于治疗各种免疫疾病和至少可以通过IVIG技术治疗的这类免疫疾病。
本发明部分地涉及筛选化合物的方法，其中该化合物(i)调节(即刺激)DC-SIGN受体型的活性，以促进增加可测量的细胞成分的表达，其中该细胞成分可影响次生巨噬细胞中FcγRIIB受体表达的增加；或(ii)调节编码DC-SIGN受体型蛋白质的DNA或RNA的表达；(iii)刺激连接到由与DC-SIGN受体型结合的2，6Fc启动的下游信号通路的报告基因。因此，化合物可以通过增加或减弱编码DC-SIGN受体型的DNA或RNA的表达，通过促进次生效应巨噬细胞中FcγRIIB受体体内表达的增加和/或通过作为DC-SIGN受体型受体蛋白质的激动剂或拮抗剂发挥作用而进行调节。可以通过各种分析方法检测这些调节编码DC-SIGN受体型的DNA或RNA的表达或其受体的生物学功能的化合物。分析可能是简单的“是/否”分析以确定表达或功能是否发生改变。分析可以通过将受试样品的表达或功能与标准样品中的表达或功能水平相比较而进行定量。可以通过用于该用途的已知方法制备包含DC-SIGN受体型、DC-SIGN受体型的抗体或修饰的DC-SIGN受体型的试剂盒。用于鉴别其它受体的激动剂和拮抗剂的方法是该领域熟知的，并可以适用于鉴别DC-SIGN受体型的激动剂和拮抗剂。例如，Cascieri等(1992，Molec.Pharmacol.41：1096-1099)描述了用于鉴定抑制与大鼠神经激肽受体结合的激动剂并因而是潜在的神经激肽受体的激动剂或拮抗剂的受试化合物的方法。该方法包括用含有大鼠神经激肽受体的表达载体转染COS细胞，使该转染的细胞生长足以使神经激肽受体被表达的一段时间，收获转染的细胞和在存在和不存在受试化合物的情况下将该细胞重悬浮于含有已知的神经激肽受体的放射性标记的激动剂的分析缓冲液中，然后测量该已知神经激肽受体的放射性标记的激动剂与神经激肽受体的结合。如果该已知的激动剂在存在受试化合物的情况下的结合量低于不存在受试化合物的情况下的结合量，那么该受试化合物是潜在的神经激肽受体的激动剂或拮抗剂。在测量受试化合物(如DC-SIGN受体型的激动剂或拮抗剂)的结合的情况下，可以通过采用标记的受试化合物或激动剂测量这种结合。可以使用任何该领域已知的方便的方式标记该受试化合物或激动剂，如荧光标记、酶标记、放射性标记。当筛选拮抗目标受体(如DC-SIGN受体型)的调节剂时，基于细胞的分析可能依赖于包括已知的配体(如含α2，6-连接的唾液酸的Fc片段)与受试化合物相结合，以测量受试化合物激动或拮抗受体活性的功能性能力。因此，通过测量该化合物对DC-SIGN(+)细胞上的该受体的亲和力表明对DC-SIGN受体型具有亲和力的化合物的结合特异性。使用DC-SIGN(+)细胞筛选与DC-SIGN受体型结合的或抑制DC-SIGN受体型的已知的标记配体与这些细胞或由这些细胞制备的膜结合的化合物，提供了用于快速选择对DC-SIGN受体型具有高亲和力的化合物的有效方法。然而，这些配体不一定需要被标记，而也可以是可被用于取代结合的标记化合物的或可在功能分析中被用作活化剂的化合物。通过上述的方法鉴定的化合物很可能是DC-SIGN受体型的激动剂或拮抗剂和，再次，可能是抗体、抗体片段如Fc片段、肽、蛋白质或非蛋白性有机分子，其可以用于对人体施用以治疗各种免疫相关的疾病，包括但决不限于，自身免疫疾病如免疫性血小板减少症(ITP)、自身免疫性溶血性贫血(AHA)、全身性红斑狼疮(SLE)、川崎病(一种急性脉管炎综合症)、硬皮病、类风湿性关节炎(RA)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、天疱疮(phemigus)以及其它与自身介导的炎症相关的疾病。
在一个层面上，本文描述的方法需要提供包含至少DC-SIGN受体型的凝集素结构域(和至多包含全长的DC-SIGN受体型)的氨基酸序列；将受体/受体的结合域与受试化合物接触；和测量受试化合物与受体/结合域的结合程度。显示出对该受体/结合域具有可测量的亲和力的受试化合物是作为DC-SIGN受体型的调制剂(即激动剂或拮抗剂)进行进一步测试的候选者，并因此是至少治疗以前证明能够通过静脉内IVIG进行治疗的各种自体免疫疾病的潜在化合物。
本发明这一部分的另一个相关方面涉及鉴定调节DC-SIGN受体型的受试化合物的方法，其包括提供包含选自于DC-SIGN受体型的DC-SIGN受体型生物学相关结合域(包括但不限于凝集素结构域)的第一氨基酸序列，将该受体/结合域与对照抗体(例如，如含有α2，6-连接的唾液酸的Fc片段)或其变异体接触并测量对照抗体与该受体/结合域的结合程度，以便确定基线结合值。该基线结合值可以用来与受试化合物的结合相比较，其中包括提供选自于DC-SIGN受体型或其片段的第二氨基酸序列；将源自该第二氨基酸序列的受体/结合域与受试化合物接触，和测量受试化合物与受体/结合域的结合程度。因此，然后可以将基线结合值与受试化合物的结合程度相比较。
本发明的另一个实施方式部分地涉及鉴定调节DC-SIGN受体型的受体活性的受试化合物的方法，其包括：
(a)在存在和不存在DC-SIGN受体型蛋白质(包括但不限于包含如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列的DC-SIGN受体型蛋白质)的情况下混合受试化合物；以及，
(b)在存在和不存在DC-SIGN受体型蛋白质的情况下测量和比较受试化合物的效应。
本文公开了另外的几个实施方式以表明，但绝非限制，熟练的技术人员可以结合引导DC-SIGN受体型受体蛋白质表达的表达载体使用的不同类型的筛选或选择实验。另外，用于鉴定其它受体的激动剂和拮抗剂的方法是该领域熟知的，并可适用于鉴定DC-SIGN受体型的激动剂和拮抗剂。因此，这些实施方式作为实例而提出并不是作为限制。为此，本发明包含可以通过其鉴定DC-SIGN受体型调节剂(如激动剂、反向激动剂和拮抗剂)的分析方法。因此，本发明的一个实施方式包括用于确定受试化合物是否是潜在的DC-SIGN受体型的激动剂并因此是否通过起到促进宿主抗炎反应的作用而用于治疗免疫疾病的方法，其包括：
(a)用指引DC-SIGN受体型在细胞中表达的表达载体转染或转化细胞，从而产生DC-SIGN(+)细胞；
(b)使DC-SIGN(+)细胞生长足以使DC-SIGN受体型被表达的时间；
(c)在存在和不存在受试化合物的情况下，将DC-SIGN(+)细胞暴露于DC-SIGN受体型的标记配体(包括但不限于已知促进体内抗炎反应的对照抗体)，以及，
(d)测量标记配体与DC-SIGN受体型的结合，其中如果标记配体在受试化合物存在的情况下的结合量低于在不存在受试化合物的情况下的结合量，那么该受试化合物是潜在的DC-SIGN受体型的激动剂。
当筛选用于具有激活DC-SIGN受体型能力的可能开发候选者的受试化合物时，在这种结合试验的步骤(a)和(b)中可以利用任何类型的DC-SIGN(+)细胞(并不只是重组的DC-SIGN(+)细胞)。正如文中所提到的，优选的“非重组的”DC-SIGN(+)细胞可以是树突细胞，其已在促进DC-SIGN表达的条件下进行培养(例如，见Hodges等，2007，Nature Immunology 8(6)：569-570)。此外，其中实施该方法的步骤(c)的条件是通常在本领域中用于蛋白质-配体相互作用研究的条件：例如，生理pH值；盐条件例如以如PBS的常用缓冲液为代表的或组织培养基中的盐条件；大约4℃至约55℃的温度，以及足够浓度的钙，其已知影响C-型凝集素受体例如DC-SIGN受体型的活性。可以在受试化合物和标记配体存在的情况下收获和再悬浮受试细胞。在对上述方法的改进中，步骤(c)被修改以使得细胞没有被收获和再悬浮，而是在细胞附着在基质(例如，组织培养板)上的同时使已知的标记激动剂(如含有α2，6-连接的唾液酸的Fc片段)和受试化合物与细胞接触。
本发明还包括用于确定受试化合物是否能够结合于DC-SIGN受体型或相关的细胞外域或不再具有功能但仍然可以参与凝集素结合的相关突变体DC-SIGN受体型(即受试化合物是否是潜在的DC-SIGN受体型的激动剂、反向激动剂或拮抗剂)的方法，其中该方法包括：
(a)用引导DC-SIGN受体型在细胞中表达的表达载体转染或转化细胞，从而产生DC-SIGN(+)细胞；
(b)使DC-SIGN(+)细胞暴露于受试化合物；
(c)测量受试化合物与DC-SIGN受体型的结合量；以及
(d)比较受试化合物与DC-SIGN(+)细胞中的DC-SIGN受体型的结合量和受试化合物与没有用DC-SIGN受体型转化的或者已知比，比方说，树突细胞具有显著少的DC-SIGN(+)受体的对照细胞(即DC-SIGN(-)细胞)的结合量；
其中，如果受试化合物在DC-SIGN(+)细胞(即，受试细胞)中的结合量比对照细胞大，则该受试化合物能够结合DC-SIGN受体型。然后可以通过使用功能分析确定受试化合物是否确实是激动剂或拮抗剂。
此外，当筛选用于具有激活DC-SIGN受体型的能力的可能开发候选者的受试化合物时，可以在这种结合试验中利用任何类型的DC-SIGN(+)细胞。因此，在本文所描述的方法中，步骤(a)中的“重组”DC-SIGN(+)细胞可以被“非重组”的DC-SIGN(+)细胞取代，包括但不限于树突细胞。实施该方法的步骤(b)的条件是通常在本领域中用于蛋白质-配体相互作用研究的条件：例如，生理pH值；盐条件例如以如PBS的常用缓冲液为代表的或组织培养基中的盐条件；大约4℃至约55℃的温度，以及足够浓度的钙，其已知影响C-型凝集素受体例如DC-SIGN受体型的活性。可以正常地在受试化合物存在的情况下收获和再悬浮受试细胞。
本文所公开的以及技术人员进一步已知的这种基于细胞的方法也能够被建立为测量细胞反应的功能分析。如果该方法的使用者选择测量细胞的反应，则该细胞表达全长的DC-SIGN受体型或这些分子的功能性片段是有利的。通常，功能性片段不仅包括凝集素结构域，而且也包括DC-SIGN受体型的跨膜结构域和信号转导域。为此，本发明的另一个方面涉及筛选和选择能够结合和调节DC-SIGN受体型的受试化合物的方法。特别感兴趣的是有效地测定受试化合物激活DC-SIGN受体型(即，作为该受体的激动剂)的能力的分析方法。这种功能分析将单独地或与其它方法(例如，结合实验、转基因动物模型研究等)结合使用，以鉴定作为开发目标的候选者(或可以代表一类候选化合物)的受试化合物。因此，技术人员很清楚，功能分析可以预期提供DC-SIGN(+)受体调节的定量和/或定性测定。例如，Caparrós等(2006，Blood 107(10)：3950-3958)公开，在活化的树突细胞中和在用人DC-SIGN表达载体转染的细胞中人DC-SIGN受体的抗体介导的刺激激活了MAP激酶Erk1和Erk2，磷脂酰肌醇3-OH激酶(PI3K)，从而增加白细胞介素-10(IL-10)以及瞬时增加细胞内钙。此外，Hodges等(2007，Nature Immunology 8(6)：569-570)公开，DC-SIGN受体的活化导致特定的树突细胞基因的下调(MHCII，Jagged-1和干扰素反应转录物)和上调(转录因子，ATF3)。为此，本发明还涉及鉴定调节DC-SIGN受体型以便激活或抑制与各种可适用于已知的基于IVIG的治疗的免疫疾病相关的抗炎活性的受试化合物的方法，该方法包括：
(a)提供DC-SIGN(+)细胞(如树突细胞)或用编码DC-SIGN受体型的表达载体转染或转导的细胞；
(b)将DC-SIGN(+)细胞暴露于受试化合物；以及，
(c)测量DC-SIGN(+)细胞内细胞成分的增加或减少，
其中与未与受试化合物接触的细胞(或同样暴露于受试化合物的DC-SIGN(-)细胞)中相应的细胞成分水平相比，细胞成分(如Erk1和/或Erk2、PI3K、IL-10、细胞内钙、ATF3或与MHC II成分相关的mRNA转录物，Jagged-1和/或干扰素反应转录物的减少)水平的增加表明该受试化合物是相应DC-SIGN受体型的激动剂。在将DC-SIGN(+)细胞暴露于受试化合物之前，如本文所述和/或该领域内已知的，可以在适当的缓冲系统中将DC-SIGN(+)细胞培养足够的时间以使其能够表达DC-SIGN受体型并可以任选地收获和再悬浮在适当的缓冲液中。
这些类型的功能分析也可以基于在重组DC-SIGN(+)细胞中报告基因或者附加表位(epitope tag)的诱导和表达的测量。现在该领域充分地提供了适合测量受试化合物调节DC-SIGN受体型的能力的技术人员可利用的各种报告基因和附加表位多肽。技术人员无需过度的实验就能够组合和匹配这些多种研究工具。例如，各种报告基因包括但不限于绿色荧光蛋白(“GFP”)或其功能蛋白/多肽衍生物。GFP基因和各种突变体(其可以以不同的波长和改良的频谱特性发荧光)已经在水螅、刺胞动物，珊瑚动物和栉水母门中的多种生物体中被确认。选择的GFP变异体包括蓝色荧光蛋白(“BPF”)、黄色荧光蛋白(YFP)和青色荧光蛋白(CFP)。对于其它的合适的荧光蛋白质，参见Matz等，1999，Nature Biotechnology 17：969-973。其它合适的报告基因包括氯霉素乙酰转移酶(“CAT”)和其它酶检测系统，如β-半乳糖苷酶(“β-gal”)、萤火虫荧光素酶、细菌荧光素酶或分泌型碱性磷酸酶(“SEAP”)。其它合适的报告基因的实例包括那些编码赋予宿主哺乳动物细胞药物/抗生素抗性的报告基因。可以使用本领域已知的任何适当的方法测量报告基因的转录量，包括通过Northern印迹检测RNA表达，通过任何已知用于该蛋白质的检测方法检测蛋白质的表达如特征染色或内在活性(例如，如酶的活性，或基于荧光、颜色或者冷光产生检测信号，如上所述)。激活的报告基因也可能产生向细胞提供生长优势的表达蛋白(例如，增强细胞活力、缓解细胞的营养要求和/或提供药物抗性)。其他报告基因可能编码可获得其抗体或配体的细胞表面蛋白质。报告基因的表达使细胞能够被检测或亲和性能够通过表面蛋白质的存在进行纯化。另外，融合多肽是附加表位，其实例包括但不限于Myc标签、Flag标签、His标签、亮氨酸标签，IgG标签，生物素化序列位点(“BSS”，即，抗生蛋白链菌素标签)等等。
因此，如上所述，这样的报告基因分析是该领域熟知的并可以被技术人员改进以通过按照类似于对照抗体(如α2，6Fc)调节DC-SIGN受体型的方式测量受试化合物的DC-SIGN受体型信号转导的定量和/或定性效应。例如，Chen等(1995，AnalyticalBiochemistry 226：349-354)描述了利用以编码G-蛋白偶联受体的表达载体和包含具有与LacZ基因融合的cAMP反应元件的启动子的第二表达载体转染的重组细胞的比色法。以β-Gal的表达和OD测量值测量过表达的G-蛋白偶联受体的活性。
因此，本发明这一部分的另一个方面包括用于确定受试化合物是否调节DC-SIGN受体型的非放射性方法。任何来自DC-SIGN调节的下游信号可能是作为潜在的MC-3R的激动剂或拮抗剂的物质，其包括：
(a)用编码DC-SIGN受体型的表达载体转染或转化细胞，从而产生重组的DC-SIGN(+)细胞；
(b)用包含与报告基因融合的启动子的表达载体转染或转化步骤(a)的受试细胞；
(c)收获该转染的细胞和存在或不存在受试化合物的情况下在存在已知的DC-SIGN受体型的激动剂(如对照抗体)时重悬浮该细胞；以及
(d)通过测量启动子序列之外的报告基因的表达的分析测定已知的激动剂和受试化合物与过表达的MC-3R的结合，并比较在已知激动剂存在以及受试化合物的存在和不存在的情况下的表达水平，以确定受试化合物是否作为DC-SIGN受体型的潜在激动剂或拮抗剂发挥作用。
步骤(a)也可以利用非重组的DC-SIGN(+)细胞。此外，一旦建立标准对照，就可能在不使用对照抗体或其它对照化合物的情况下进行这些分析，因为报告基因表达的可检测的增加与DC-SIGN(+)细胞中已知信号分子所具有的效应相关，包括但不限于提高细胞成分水平(如Erk1和/或Erk2、PI3K、IL-10、细胞内钙、ATF3或与MHCII成分相关的mRNA转录物，Jagged 1和/或干扰素反应转录物的减少)，如人DC-SIGN调节所见的，如上所述。
可以对上述方法进行修改以使得可以从受试细胞制备膜且那些膜可暴露于受试化合物中，而不是将DC-SIGN(+)细胞(即，受试细胞)暴露于受试化合物。利用膜而不是细胞的这种修改是该领域熟知的，并被描述于，例如，Hess等，1992，Biochem.Biophys.Res.Comm.184：260-268中。因此，本发明的另一个实施方式包含用于确定受试化合物是否结合DC-SIGN受体型和/或是否是DC-SIGN受体型的潜在激动剂或拮抗剂的方法，其中利用来自DC-SIGN(+)细胞的膜制剂代替完整的DC-SIGN(+)细胞。这类方法包括以下步骤且可利用如上所述的生理条件：
(a)提供DC-SIGN(+)细胞，如树突细胞或用编码DC-SIGN受体型的表达载体转染或转导的细胞；
(b)制备含有源自DC-SIGN(+)细胞的DC-SIGN受体型的膜和在使得配体与膜中的DC-SIGN受体型结合的接条件下将该膜暴露于DC-SIGN受体型的配体；
(c)在步骤(b)之后或与步骤(b)同时将源自DC-SIGN(+)细胞的膜暴露于受试化合物；
(d)测量存在和不存在受试化合物的情况下配体与膜中DC-SIGN受体型的结合量；以及
(e)比较存在和不存在受试化合物的情况下配体与膜中DC-SIGN受体型的结合量，其中存在受试化合物的情况下配体与膜中DC-SIGN受体型的结合量的减少表明该受试化合物能够结合DC-SIGN受体型。
本发明还涉及一种用于确定受试化合物是否能够结合DC-SIGN受体型的方法，其包括：
(a)提供DC-SIGN(+)细胞，如树突细胞或用编码DC-SIGN受体型的表达载体转染或转导的细胞；
(b)制备含有来自受试细胞的DC-SIGN受体型的膜和将来自受试细胞的膜暴露于受试化合物；
(c)测量受试化合物与来自受试细胞的膜中的DC-SIGN受体型的结合量；以及
(e)将受试化合物与来自受试细胞的膜中的DC-SIGN受体型的结合量与受试化合物与来自对照细胞(如DC-SIGN(-)细胞)的膜的结合量相比较，其中如果受试化合物与来自受试细胞的膜中的DC-SIGN受体型的结合量大于受试化合物与来自对照细胞的膜的结合量，那么该受试化合物能够结合DC-SIGN受体型。
用于选择可能成为开发候选者的受试化合物的另一种方法是利用两个细胞类型如DC-SIGN(+)细胞和效应巨噬细胞(或任何的或任何其它有效地表达FcγRIIB的细胞类型)的体外功能分析，其中一个类型可以测量在该第二细胞类型中FcγRIIB表达的增加。因此，该体外功能分析将包括：
(a)提供第一细胞类型，其中该第一细胞类型是DC-SIGN(+)细胞；
(b)提供第二细胞类型，其包括源自血液或源自该世系的永生细胞系的单核/巨噬细胞(包括但不限于如THP-1、U937或HL-60细胞)；
(c)在存在和不存在受试化合物的情况下，共培养或再悬浮第一和第二细胞类型并一起孵育这些细胞类型；以及
(d)测量受试化合物影响FcγRIIB受体表达的能力，其中FcγRIIB受体表达的增加预示着促进与自身抗体介导的炎症有关的抗炎反应的潜在激动剂。
技术人员可获得对这一两细胞功能分析的方案的许多变型，包括但不限于将对照化合物(例如，作为DC-SIGN受体型的激动剂的对照化合物[例如，如含有α2，6-连接的唾液酸的Fc片段])与受试化合物结合使用。这种类型的分析可以用已知的方法监测FcRIIB表达，包括细胞表面染色、使用抗体(如2B6，高亲和力的单克隆抗体，其不与FcγRIIB受体交叉反应[参见Rankin等，2006，Blood 108(7)：2384-2391])或通过基于FcγRIIB的报告体分析，从而利用本文所述的成分和策略。此外，可以用另外的辅助细胞如骨髓源的细胞或脾细胞补充这些细胞类型的培养物，以促进生物反应。
将对DC-SIGN受体型显示出体外调节作用的筛选的化合物用于体内分析(优选地通过向转基因的或者野生型动物施用目的化合物以测量该化合物对DC-SIGN受体型受体的体内影响和进一步测量施用化合物对非人类动物的生物学和生理学效应)也在本发明的范围内。这些体内研究可以单独地进行或与已知的DC-SIGN受体型配体(如，α2，6唾液酸连接的IgG Fc片段)结合使用。可以向动物施用一种或多种候选的受试化合物，且与没有用候选的受试化合物处理的类似动物相比较，候选受试化合物改变一个或多个特性的能力确定了调制剂，如DC-SIGN受体型的激动剂。因此，这种分析可以有利的作为确认用于开发的化合物下一步骤。例如，各种KO模型和野生型小鼠可被用于候选化合物的体内测试以研究其对几种免疫疾病的影响，包括但不限于在本说明书的实施例部分中所公开的转基因和基因敲除模型。对动物(如小鼠)施用受试化合物，并根据其降低反应(如与注射K/BxN血清相关的足垫炎症)的能力评估该受试化合物。已知的DC-SIGN受体型配体(例如，α2，6唾液酸连接的IgG Fc片段)也可以用于监测或比较受试化合物的体内作用。可以用多种方法(包括，但不限于静脉内)施用受试化合物。因此，体内分析包括使用各种动物模型，包括已经进行工程化以具有特定缺陷或携带可以用来测量候选受试化合物达到和影响生物体内不同细胞的能力的标志的转基因动物。由于它们的大小、操作的方便性和有关他们的生理和遗传构成的信息，小鼠是优选的实施方式，尤其用于转基因。不过，其他动物也是适合的，包括大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、沙鼠、旱獭、猫、狗、绵羊、山羊、猪、奶牛、马和猴(包括黑猩猩、长臂猿和狒狒)。可以使用源自任何这些物种的动物模型进行调节剂的分析。
检测对照抗体(例如，标记的α2，6唾液酸连接的IgG Fc片段)和DC-SIGN受体型/凝集素结构域之间的复合物或者受试化合物和DC-SIGN受体型/凝集素结构域之间的复合物的存在或其量的方法是该领域熟知的。例如，复合物的存在或量可以通过这样的方法测定，如，例如，竞争或夹心ELISA法、放射免疫分析、斑点印迹分析、荧光偏振分析、邻近闪烁分析、均相时间分辨荧光分析(homogeneous time resolved fluorescence assay)、共振镜生物传感器分析和表面等离子体共振分析。
因此，在一个实施方式中，对照抗体、受试化合物和/或DC-SIGN受体型/凝集素结构域用可以检测的标记直接标记并可以直接检测。在另一个实施方式中，这些分子都没有被标记。相反，第二抗体或可以与受试化合物或对照抗体或受体/结合域结合的其它分子被标记。可以通过检测标记的第二抗体的存在检测复合物的量。可以结合抗体的其它分子包括，但不限于，蛋白质A和蛋白质G，这两者都可以商购得到，例如，从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL.)获得。
合适的标记物是本领域普遍已知的，并包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、磁性试剂和放射性物质。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、p-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基氨基荧光素(dichlorotriazinylaminefluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺虫荧光素、连苯三酚或异鲁米诺；磁性试剂的例子包括钆；以及适当的放射性物质的例子包括125I、131I、35S或3H。
如上所述，可以通过竞争ELISA测定受试化合物和/或对照抗体与DC-SIGN受体型/凝集素结构域的结合。在此方法中，有利的是使用对DC-SIGN受体型/凝集素结构域具有已知的亲和力的对照抗体作为用于与被标记的受试化合物反应的对照底物(如，标记的α2，6唾液酸连接的IgG Fc片段)，并使用受试化合物作为竞争剂。对照抗体和/或受试化合物可以直接被标记。在另一个实施方式中，对照抗体和受试化合物未被标记且标记的第二抗体可以在第二步中被添加到反应中。
在夹心ELISA中，DC-SIGN受体型/凝集素结构域被固定在固体载体上，并与包含受试化合物和/或对照抗体的液体接触。然后，通过添加用可检测的标记物如放射性原子、荧光的或发光的基团或者特别是酶(如辣根过氧化物酶(HRP))标记的第二抗体测定结合的受试化合物的量。如果受试化合物是人IgG，那么第二抗体可以是抗-人-IgG抗体。然后通过测量标记物的活性(例如，酶活性)测定结合的第二抗体的量。该活性是受试化合物与DC-SIGN受体型/凝集素结构域结合的量度。或者，受试化合物可以被固定化并添加包含受体/结合域和/或对照抗体的混合物。在此实施方式中，使用抗受体/结区域的第二抗体。重要的是，第二抗体结合其靶标的表位，该表位不被受试化合物和凝集素结构域的结合的影响。
放射免疫分析法也可以被用于测定DC-SIGN受体型/凝集素结构域与受试化合物和/或对照抗体的结合程度。在这一方法的第一步中，将放射性标记的受试化合物与凝集素结构域混合。该受试化合物可以通过，例如，氢、硫、碳等的放射性同位素标记。在第二步中，非标记的受试化合物以已知的量被添加到混合物中并通过，例如，沉淀将受试化合物-受体/凝集素结构域复合物从该混合物中消除。然后测定标记的未结合受试化合物的量。
斑点印迹过程也可以被用于这一分析。使用斑点印迹过程无需进行电泳，并使得能够快速分析大量样品。在这种方法的一个实施方式中，可以在膜(例如，硝酸纤维素膜)上设置不同稀释度的DC-SIGN受体型/凝集素结构域，并与放射性或荧光标记的受试化合物接触。
本领域的技术人员可以理解，受试化合物不是必须被标记。在这种情况下，在将膜结合的DC-SIGN受体型/凝集素结构域与受试化合物一起孵育后，将被标记的第二抗体添加到反应中。然后可以定量由标记物(放射性、光、颜色等)产生的信号量。
荧光偏振分析基于荧光示踪剂在被特征波长的平面偏振光激发时会发射出相对于入射激发光保持一定程度的偏振的另一特征波长的光(即荧光)的原则，该发射光的偏振与给定介质中示踪剂的旋转速率相关。作为这一特性的结果，具有受限的旋转的示踪受试化合物(例如在粘性溶液相中或者当另一个溶液成分如具有相对较低的旋转速率的抗体结合时)将比在不受限溶液中保持发射光的相对较大偏振度。因此，本领域的技术人员可以用适当的标记物标记DC-SIGN受体型/凝集素结构域和将标记的这一受体/结合域与受试化合物和/或对照抗体接触。可以在可商业购得的自动化仪器例如
Figure BPA00001256431300281
Figure BPA00001256431300282
和TDxFLxTM(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)中实施荧光偏振分析。
在闪烁邻近分析中，可以将DC-SIGN受体型/凝集素结构域与填充闪烁剂的微球偶联。放射标记的受试化合物和/或对照抗体的结合将导致可以通过闪烁计数器定量的发射光。目前用于闪烁邻近分析的商业试剂盒已可获得，并可以从例如Amersham Life Science(Piscataway，NJ)购买。
在均相特异性结合分析中，在结合的受试化合物(即受试化合物、DC-SIGN受体型/凝集素结构域或对照抗体)之间形成偶联物并与标记物偶联，标记物的选择使得其根据受试化合物是结合的或游离的而具有不同的表现。因此，在本方法的一个实施方式中，可以将液体介质中含有已知量的标记受试化合物和/或对照抗体的不同样品与用DC-SIGN受体型/凝集素结构域涂覆或浸渍的固体基质接触。在另一个实施方式中，受试化合物和/或对照抗体可以被置于固体载体上，并与含有已知量的标记DC-SIGN受体型/凝集素结构域的不同液体样品接触。适合于该方法的标记物的实例是如上所公开的化学发光化合物和酶。化学发光的变化可以被测量，从而反映结合的修饰抗体候选物的相对量。
表面等离子体共振分析是基于定量可能存在于金属和电介质之间的边界处的电磁波(也被称为表面等离子波)的强度。这种波可以被使其电场平行于入射平面极化的(即横向磁(TM)偏振的)光消退。在这种方法中，试剂之一(即DC-SIGN受体型/凝集素结构域、受试化合物或任选地对照抗体)与传感芯片的葡聚糖层(覆盖金属薄膜)偶联并使含有不同浓度的其它试剂(即，在其中DC-SIGN受体型/凝集素结构域与葡聚糖层偶联的实施方式中，受试化合物和/或对照抗体)的溶液流过该芯片。用质量敏感检测监测结合(缔合和解离)。
Figure BPA00001256431300291
(Biacore AB，Uppsala，Sweden)仪器可用于此方法。没有在本申请中公开的这些分析方法的其它修改是该领域的普通技术人员显而易见的。本发明的权利要求包含所有这些修改。
对于本文所公开的分析方法，技术人员会明白，在某些情况下，目标复合物(例如，DC-SIGN受体型/凝集素结构域和受试化合物之间的复合物)的量可被间接地测量。例如，如果已知受试化合物或受体/凝集素结构域的总量，则可测定未结合的受试化合物或未结合的DC-SIGN受体型/凝集素结构域的量。未结合的化合物的量是复合物中化合物的量的间接量度。
本发明还涉及通过施用直接影响DC-SIGN受体型的调节剂(如DC-SIGN受体型的激动剂)治疗如本文所公开的一种或多种免疫疾病的方法，和最初通过如本文公开的这些基于细胞的或基于膜的筛选和/或通过利用适当的转基因动物的分析鉴定的调节剂。这样的DC-SIGN受体型激动剂可以通过本文所述的方法鉴定，并可用于治疗免疫疾病，包括但不限于免疫性血小板减少症(ITP)、自身免疫性溶血性贫血(AHA)、全身性红斑狼疮(SLE)、川崎病(一种急性脉管炎综合症)、硬皮症、类风湿性关节炎(RA)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、天疱疮和其它自身抗体介导的炎性疾病。本发明部分地涉及起到调节DC-SIGN受体型作用的化合物(如，该受体的激动剂)，以至于该化合物调节DC-SIGN受体型以介导由DC-SIGN(+)细胞到第二效应巨噬细胞的治疗有效信号，其导致FcγRIIB受体的表达增加，其随之抑制通常是由从这些巨噬细胞响应相关的自身抗体而产生的细胞介导的炎性反应。为此，本发明进一步涉及药物组合物，其包含与至少一种药学有效的赋形剂结合的这种化合物，以至于该药物组合物以治疗有效的浓度存在。
在本文中描述的任何组合物可以被包含在试剂盒中。在非限制的实例中，DC-SIGN受体型、对照抗体和/或其它试剂可以被包含在试剂盒中。因此该试剂盒将在适当的容器装置中包含DC-SIGN受体型。该试剂盒的成分可以在液体介质中或以冻干的形式包装。该试剂盒的容器装置一般包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置，其中可以放置和优选地适当地分装成分。当该试剂盒中有一个以上的成分时，该试剂盒一般还包含第二个、第三个或更多的其它容器，其中附加成分可以被单独地放置。然而，成分的各种组合可以被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常还包括用于容纳DC-SIGN受体型、对照抗体和/或其它试剂的装置，以及用于商业销售的封闭物中的任何其它试剂容器。这些容器可能包括注塑或吹塑成型的塑料容器，其中保持所需的小瓶。
本文中所使用的术语“DC-SIGN受体型”可以是任何已知结合细胞内粘附分子(ICAM)-3(CD50)的哺乳动物的C-型凝集素受体型，包括但不限于DC-SIGN(在树突细胞上发现的人树突细胞特异性粘附受体[CD209])、SIGN-R1(DC-SIGN鼠同源物，已知在脾边缘区巨噬细胞上表达)和DC-SIGNR(“DC-SIGN-相关的”，在肝窦状内皮细胞和淋巴结组织中的内皮细胞上表达的DC-SIGN的人同源物)，以及其任何有关的哺乳动物同源物或同型体，如以及各种同源物、剪接变异体和/或同型体，如美国2005/0221291Al(Ahuha等)中所公开的。
本文中所使用的术语“受试化合物”或“化合物”可以指任何可能潜在地提高DC-SIGN受体型的活性(即作为该受体的激动剂)或潜在地抑制DC-SIGN受体型的活性(即作为该受体的拮抗剂)的分子。这种受试化合物可以是蛋白质或其片段、小分子如有机分子，或甚至是核酸分子。鉴于通过施用IVIG治疗自身免疫疾病的本领域的现状，通过本文公开的分析方法鉴定的最有效的受试化合物有可能是与DC-SIGN受体型“相互作用”以便结合、介导和刺激次生效应细胞的抗体，其导致FcγRIIB受体表达增加。有可能，所说的抗体可能作为Fc片段和可能含有唾液酸的Fc片段(如WO 2007/117505中所述，本文特此通过引用将其全部引入)更有用。使用先导化合物以帮助开发更好的化合物被称为“合理的药物设计”，且不仅包括与该受体的已知激动剂或拮抗剂的比较，还包括与目标分子结构有关的预测。另一方面，人们可以从各种不同的商业来源简单地获取被认为“强力推进”有用化合物的鉴定的工作中满足有用药物的基本标准的小分子文库。筛选这样的文库(包括组合性生成的文库，例如肽库)是一种筛选大量的相关的(或无关的)化合物的活性的快速和有效的方式。也可以通过模拟活性的、但在其它方面不合适的化合物的第二、第三和第四代化合物，将组合的方法用于潜在药物的快速评估。受试化合物可以包括自然产生的化合物的片段或部分，或可以作为已知化合物的活性组合形成，该化合物在其它形式中无活性。这种受试化合物可以从天然来源分离和鉴定，例如，动物、细菌、真菌、植物来源(包括树叶和树皮)，且海洋样品可以作为存在潜在有用的药物剂的候选者进行分析。可以理解，将被筛选潜在的药物剂的受试化合物也可源于或者合成自化学组合物或人造化合物。因此，正如本说明书始终指出的，应该理解本发明鉴定的候选受试化合物可以是抗体(包括但不限于Fc片段或单链抗体)、肽、多肽、多核苷酸、反义分子、核酶或可以通过从已知的抑制剂或刺激物开始通过合理的药物设计被设计的任何其它化合物。
本文所使用的术语“Fc片段”或“Fc区域”用来定义免疫球蛋白重链的C-末端区域。“Fc区域”可以是天然序列的Fc区域或变异的Fc区域。虽然免疫球蛋白重链的Fc区域的边界可能发生变化，人IgG重链的Fc区域通常定义为从Cys226或从Pro230位的氨基酸残基延伸至其羧基末端。
本文所使用的术语“结合域”是指多肽结合另一个分子的区域。在FcR的情况中，该结合域可以包含负责结合Fc区域的其多肽链的一部分(例如其α链)。一种典型结合域是FcR链的细胞外结构域。
本文中所使用的术语“凝集素结构域”或“LBD”可以指凝集素结构域的一部分，也被称为DC-SIGN受体型的C-型凝集素结构域(见Geijtenbeek等，2000，Cell 100：575-585)或糖识别域[CRD；参见Wu和KewalRamani，2006，Nat.Rev.Immun.6(11)：859-868](例如，源自人DC-SIGN的大约氨基酸241-404)。本文有用的LBD将是可能对已知的调节剂或受试化合物具有亲和力的LBD。
本文所使用的“对照抗体”指对DC-SIGN受体型的凝集素结构域具有可测量的亲和力从而可用于与受体结合的基线值的抗体或Fc片段等。对照抗体的实例(但不是作为限制提供)是包含具有α2，6唾液酸连接的2，6Fc的抗体或片段(如Fc片段)。这种对照抗体可能具有(但不是必须具有)本文所述的促进体内抗炎反应的能力。
本文所使用的“抗体”以最广泛的含义使用且特别地包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出预期的生物学活性。
本文所使用的“抗体片段”可以包括完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合或可变区或保留了FcR结合能力的抗体Fc区域。抗体片段的例子包括线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段优选地保留至少部分铰链和任选地IgG重链的CH1区域。更优选地，抗体片段保留了IgG重链的整个恒定区，并包括IgG轻链。
本领域的技术人员应该理解，本文所公开的技术代表将在发明的实施中起到很好作用的技术，并因此可以被认为是用于实施本发明的优选方式。然而，本领域的技术人员根据本公开应该理解，可以对被公开的特定实施方式进行许多变化并仍然获得相同或类似的结果而不偏离本发明的精神和范围。为了更详细地描述本发明，如下给出一些非限制性的说明性实施例。
实施例
材料和方法-下面的材料和方法应用于所有的实施例，除非另外特别地注明。
小鼠-C57BL/6、NOD、JHD-/-、CD4-/-和Rag1-/-小鼠是从Jackson实验室(Bar Harbor，ME)购买的。KRN TCR C57BL/6小鼠由D.Mathis和C.Benoist(Harvard Medical School，Boston，MA)赠送并与NOD小鼠繁殖产生K/BxN小鼠。SIGN-R1-/-小鼠由A.McKenzie和C.G.Park提供，和M.Carroll和M.Botto提供C1q-/-小鼠。所有的实验使用5-8周龄的年龄匹配的雌性小鼠并在Rockefeller大学动物中心饲养。所有的实验依照联邦法律和机构准则进行，并已经通过Rockefeller大学(New York，NY)批准。如前所述地制备K/BxN血清(Bruhns等，Immunity18，573(Apr，2003))。在注射K/BxN血清前1小时注射IVIG或α2，6(分别为1g/kg或0.033g/kg)。各个爪子的炎症评分0-3分(0，无肿胀；3完全地肿胀)并相加得到总临床评分。对于外科手术，麻醉小鼠和在无菌条件下灼烧脾脏，缝合伤口，并使小鼠恢复一周。接受封闭抗体处理的小鼠在IVIG之前1小时(对于α-SIGN-R1和α-MARCO)或24小时(对于TKO-SIGN-R1)接受100μg抗体。
IVIG Fc制剂-如前所述地产生源自IVIG的Fc片段(Kaneko，Nimmerjahn和Ravetch，Science 313，670(Aug 4，2006)；Samuelsson，Towers，and Ravetch，Science 291，484(Jan 19，2001))。通过使用用于α2，6唾液酸连接和用于α2，3唾液酸连接的SNA-生物素(Vector)的凝集素印迹分析确认制剂。按照制造商的使用说明用神经氨酸酶(New England Biolabs)或PNGaseF(New England Biolabs)处理Fc制剂以去除唾液酸或N-连接的聚糖。部分神经氨酸酶处理的Fc在体外用α2，3唾液酸转移酶唾液酸化，以产生α2，3Fc。按照制造商的使用说明(Invitrogen)用Alexa-647标记蛋白质。
FACS分选-移除小鼠脾脏，用Liberase blendzyme 3(Roche)消化并制成单细胞悬液。接下来，溶解红血球，并用2.4G2(BDBiosciences)封闭FcR。然后细胞用α-MARCO-PE(AbD Serotec)、α-CD 169-FITC(AbD Serotec)和α-F4/80-生物素(AbD Serotec)染色，接着用PerCP-抗生蛋白链菌素染色，并使用FACS Aria(BDBiosciences)分选。然后分选的细胞群用1μg的Alexa647标记Fc激发并使用FACSCalibur(BD Biosciences)重新分析。
α2，6Fc结合-在24孔板中每孔接种1×105个细胞并孵育过夜。第二天，用2.4G2处理细胞，然后用1μg/孔的Alexa-647标记蛋白质在37℃激发1小时。机械移除细胞和用流式细胞仪分析。对于免疫组织化学，相同数量的细胞接种在放置于24孔板中的圆形盖玻片上，这些细胞被同样地激发，用DAPI染色并将盖玻片转移到载玻片上和使用Axiovert荧光显微镜(Zeiss)分析。荧光强度和曝光时间对于所有样本进行标准化。
组织学-移除脾，在OCT冷冻培养基中冷冻(Sakura Finetek，Japan)，并切成4μm的切片，在冷丙酮中固定，用α-SIGN-R1-Alexa647(eBioscience)、α-MARCO(Serotec)、α-CD 169(Serotec)、α-CD11c-FITC、F4/80-PE染色，并在Zeiss Axiovert荧光显微镜上成像。如前所述地进行踝关节组织学分析(Bruhns等，Immunity 18，573(Apr，2003))，并使用Axiovert光学显微镜(Zeiss)以100x放大率成像。
脾脏中IVIG累积的动力学-对小鼠施用IVIG并在0分钟、10分钟、60分钟和1天以后处死小鼠。检查脾切片的IVIG定位(α-人IgG Fc)以及CD 169+嗜金属边缘区巨噬细胞、MARCO+边缘区巨噬细胞或CD11c+树突细胞和红髓F4/80+巨噬细胞。200x荧光图像对于曝光时间和强度进行标准化。
表达SIGN-R1的细胞系和α2，6Fc与Siglecs结合的确认-通过利用流式细胞仪评估在Raw-247细胞和稳定转染的Raw-247细胞上的SIGN-R1表达来确认SIGN-R1转染的细胞(图4A)。接下来，用FITC-葡聚糖激发Raw-247细胞或SIGN-R1表达细胞，用DAPI染色并成像。对于400x的图像进行曝光时间和强度的标准化。
用荧光染料标记的α2，6Fc激发Raw-247细胞和SIGN-R1表达Raw-247细胞(培养基中添加或者不添加C 1q)，并通过FACS分析结合。对Raw-SIGN-R1与Raw细胞的比例作图，表示3个实验。用小鼠唾液酸粘附素(Siglec-1)细胞外结构域(mSND1-3)、结合缺陷的唾液酸粘附素(mSND1-3R97A4)、人CD22(hCD22)、人CD33(hCD33)、小鼠MAG(mMAG)、人Siglecs 5-10(hSiglec-5-10)和胎球蛋白的Siglec-Fc嵌合体涂布平面孔板，然后用α2，6Fc或SA tx Fc免疫复合物探测该嵌合体，显影和分析。
实施例1：巨噬细胞是IVIG的抗炎效果所需要的
为了检验IVIG介导的免疫抑制所需要的调节性巨噬细胞群的性质，用关节炎诱导血清(K/BxN)结合IVIG(图1)处理一组特定免疫细胞群缺陷的确定小鼠品系。与以前的结果一致，IVIG保护野生型C57B 1/6小鼠免于IVIG炎症的影响，和B细胞(JHD-/-)和CD4+T细胞(CD4-/-)缺陷的小鼠一样免受炎症影响。但是，IVIG在同时缺失B和T细胞的Rag1-/-小鼠中和切除脾的小鼠中或者如前面在遗传品系op/op中所确定的(Bruhns等，2003Immunity8：573)无效。实施例2：脾脏非B、非T群和边缘区结构是IVIG免疫抑制所需要的
使用一组边缘区巨噬细胞标记，包括具有胶原结构域(collagenous domain)的巨噬细胞受体(MARCO)(Elomaa等，Cell 80，603(Feb 24，1995))、唾液酸结合IVIG-样凝集素-1(Siglec-1，CD169)(Crocker等，Embo J 10，1661(Jul，1991)；Crocker，J.C.Paulson，A.Varki，Nat Rev Immunol7，255(Apr，2007))和SIGN-R1(CD209b)(Rang等，Int Immunol 15，177(Feb，2003)；Geijtenbeek等，Blood 100，2908(Oct 15，2002))，检验这些小鼠品系的脾结构。
野生型Bl/6小鼠的边缘区显示出被MARCO+边缘区巨噬细胞(其中一些还表达SIGN-R1)环绕的CD169+边缘区嗜金属巨噬细胞的特征性内环，和具有可被流式细胞仪检测的MARCO+和CD 169+细胞(图2A)。虽然在B细胞和CD4+T细胞缺陷的小鼠中确定的结构被破坏，但是所有的这些巨噬细胞群仍存在(图2B和2C)。相反，Rag1-/-小鼠(图2D)显示严重破坏的边缘区结构，CD169+细胞和MARCO+细胞数量明显减少，并且没有可检测的SIGN-R1染色。总之，这些结果表明脾脏非B、非T细胞群和边缘区结构是IVIG免疫抑制所需要的。
实施例3：IVIG的抗炎作用是由MARCO+边缘区巨噬细胞介导
为了确定其中哪些脾巨噬细胞群与IVIG的生物活性成分相互作用，从C57B 1/6野生型小鼠的脾脏中分选出α2，6Fc、F4/80+红髓巨噬细胞、CD 169+嗜金属巨噬细胞和MARCO+边缘区巨噬细胞。然后将该细胞群在体外用具有以α2，6唾液酸为末端的聚糖的荧光标记IVIG Fc制剂(α2，6Fc)、缺乏唾液酸的Fc(唾液酸酶(SA)tx Fc)或酶促去糖基化的Fc(PNGaseF tx Fc)激发，并用流式细胞仪重新分析。F4/80+红髓巨噬细胞不结合任何Fc制剂，而MARCO+巨噬细胞与CD 169+巨噬细胞相比优先地结合α2，6Fc。这些结果与表明IVIG随MARCO+边缘区巨噬细胞定位的静脉注射IVIG的体内检验一致。在这些实验中，向小鼠施用IVIG，并在0分钟、10分钟、60分钟和1天以后处死小鼠。检查脾脏切片的IVIG定位以及CD 169+嗜金属边缘区巨噬细胞、MARCO+边缘区巨噬细胞或CD 11c+树突细胞和红髓F4/80+巨噬细胞。对200x荧光图像进行曝光时间和强度的标准化。
实施例4：IVIG的抗炎效应由SIGN-R1介导
由于MARCO+边缘区巨噬细胞优先被IVIG靶向，因此进行实验以确定这些细胞上表达的特定受体是否负责结合α2，6唾液酸化的Fc。这些巨噬细胞表达许多模式识别受体，包括清道夫受体MARCO(Elomaa等，Cell80，603(Feb 24，1995))和SIGN-R1，参与循环的肺炎链球菌与聚糖的结合的C-型凝集素(Kang等，Proc NatlAcad Scl USA 101，215(Jan 6，2004)；Lanoue等，J Exp Med 200，1383(Dec 6，2004))。因此，在巨噬细胞(RAW-247)和用SIGN-R1或者对照凝集素(例如SIGN-R3和mDC-SIGN)转染的CHO细胞系上进行结合研究(参见图3A-C和图4A-D)。只有SIGN-R1表达细胞表现出明显增强的结合α-2，6Fc。相反，具有以α2，3唾液酸连接为末端的聚糖的Fc(α2，3Fc)、去唾液酸的Fc(SA tx Fc)、去糖基化的Fc(PNGaseF tx Fc)或胎球蛋白(具有类似于在IgG Fc上发现的双触角复合唾液酸化聚糖的血清蛋白)(图3A)没有表现出特异性结合。此外，α2，6Fc的结合被识别SIGN-R1的凝集素结合位点的抗体阻断(Kang等，Int Immunol 15，177(Feb，2003))(图3B)，如同添加钙螯合剂EDTA一样，表明该结合是凝集素介导的。通过证明不存在α2，6Fc与其它凝集素(包括SIGN-R3、人DEC-205(hDEC-205)及小鼠和人Siglecs)的结合(图3C及图4C、D)进一步证实了这一结合反应的特异性。SIGN-R1的人同源物，DC-SIGN，显示了与SIGN-R1类似的结合特征(图3C)。相反，mDC-SIGN没有表现出对α2，6Fc的特异性。
实施例5：经典补体途径不参与IVIG的抗炎作用
先前的研究报道了C1q(经典补体途径的引发剂)能够结合SIGN-R1(Kang等，Cell 125，47(Apr 7，2006))。因为该分子也与IgGFc部分相互作用，因此研究了C1q参与α2，6Fc和SIGN-R1的相互作用的可能。在唾液酸化的α2，6Fc与表达SIGN-R1的RAW-247细胞的结合反应中加入C1q导致α2，6Fc与SIGN-R1的结合减少(图4B)，表明C1q不是α2，6Fc与SIGN-R1的结合所必须的，且很可能干扰该结合相互作用。因此，SIGN-R1以依赖于Fc片段、其抗炎活性所必需的特定糖连接以及C-型凝集素结合所必需的钙离子的方式结合IVIG的活性成分。
实施例6：SIGN-R1介导IVIG的体内抗炎活性
接下来，检查通过IVIG结合SIGN-R1介导其抗炎活性的体内需求。用K/BxN血清在野生型C57Bl/6小鼠中诱导关节炎症和在存在破坏SIGN-R1表达(TKO-SIGN-R1)或者其凝集素结构域(α-SIGN-R1)的抗体的情况下检测IVIG减弱组织病情的能力(Kang等，Proc Natl Acad Sci USA 101，215(Jan 6，2004))。用K/BxN血清和IVIG处理小鼠，其中有些获得SIGN-R1封闭抗体ERTR-9(α-SIGN-R1)或SIGN-R1下调抗体22D1(TKO-SIGN-R1)或适当的同种型对照(分别为大鼠IgM和仓鼠IgG)。在接下来的七天内监测足垫肿胀。，根据平均值和标准差对每组5个小鼠的第6天临床评分作图。两种抗体都消除了IVIG的抗炎活性(图5)。与此相反，α-MARCO抗体(van der Laan等，J Immunol162，939(Jan 15，1999))和SIGN-R1抗体的同种型对照都对IVIG活性没有影响(图5和图6A)。这些结果与本发明者先前的观察一致，即op/op小鼠无法介导IVIG的抗炎活性(Bruhns等，Immunity 18，573(Apr，2003))，因为OP/OP小鼠没有可被荧光免疫组织化学检测到的SIGN-R1表达。类似地，在TKO-SIGN-R1处理中没有检测到SIGN-R1表达，表明这种处理有效地下调SIGN-R1的表达，但不影响边缘区的结构，而α-SIGN-R1同种型对照抗体不影响SIGN-R1的表达。因此，受IVIG保护的小鼠中的SIGN-R1表达、α2，6Fc与SIGN-R1的结合以及在体内炎症模型中通过阻断这种受体调节IVIG保护的能力之间的相互关系强烈地支持该C-型凝集素在IVIG的抗炎活性中的作用。
实施例7：IVIG抗炎活性在SIGN-R1-/-小鼠中被消除
SIGN-R1表达对IVIG抗炎活性的必要性的确定性证据是通过SIGN-R1敲除小鼠中缺乏IVIG保护来证明的(SIGN-R1-/-，Figure 7)(Lanoue等，JExp 5Med 200，1383(Dec 6，2004))。虽然α2，6Fc抑制野生型C57B1/6小鼠中的K/BxN诱导的关节炎，但其保护能力在SIGN-R1缺陷的小鼠(SIGN-R1-/-)中被消除。相反，C1q-/-显示受α2，6Fc保护的K/BxN诱导的关节炎症(图6B)，这与表明C1q没有参与α2，6Fc与SIGN-R1的结合或需要其抗炎活性的数据一致。这些体内数据在表1中概述。
表1
各种不同小鼠品系中的IVIG保护和SIGN-R1表达
Figure BPA00001256431300391
本文中该实施例部分显示的结果证实SIGN-R1为IVIG和α2，6Fc的抗炎活性的所必需的受体，并确认唾液酸化的IgG促进抗炎状态的一个新途径。虽然是通过不同的靶细胞，该途径在借助于凝集素与α2，6Fc结合的特异性方面在小鼠和人类中是保守的。SIGN-R1的人同源物，DC-SIGN，在树突细胞上被表达，并因此比mSIGN-R1更广泛地分布，其中mSIGN-R1在脾边缘区巨噬细胞上的表达对IVIG的活性是必须的。这种解剖学条件的不同与IVIG在脾切除患者中作为高效的抗炎剂的临床观察一致，与小鼠中的情况相反。SIGN-R1和hDC-SIGN(Kang等，Int Immunol 15，177(2003年2月)；Galustian等，Int Immunol 1G，853(2004年6月))已被证明与病毒和细菌(Tailleux等，J Exp Meet 197，121(2003年1月6日)；Pohlmann等，J Virol11，4070(2003年4月)；Geijtenbeek等，Cell 100，587(2000年3月3日))病原体相互作用的事实也表明了这些生物体可以将唾液酸化Fc的置换从稳定状态反应转换为活性的、炎性状态反应的机制。该途径的被某些病原体破坏可能不利地维持抗炎状态，从而阻碍建立有效的免疫。
实施例8：SIGN-R1结合2，6唾液酸化Fc
为了确定SIGN-R1是否具有结合该唾液酸化糖蛋白配体的能力。将表达选择性结合唾液酸化Fc的SIGN-R1(RAW-SIGN-R1)的转染巨噬细胞系与未转染的细胞相比较(图8)。为了证明2，6唾液酸化Fc和去唾液酸化Fc结合巨噬细胞上特定的非重叠受体，我们收获源于野生型C57BL/6小鼠、源于缺乏全部IgG Fc受体的小鼠(Takai等，1994Cell76：519-529；Takai等，1996 Nature 379：346-349)(FcRγ/IIb-/-)或源于SIGN-R1缺陷小鼠(Lanoue A等，2004 J Exp Med200：1383-1393)(SIGN-R1-/-)的定居腹膜、SIGN-R1+巨噬细胞用于定量结合分析。Fcγ受体缺陷的巨噬细胞(FcRγ/RIIb-/-)结合α2，6-Fc，而SIGN-R1-/-巨噬细胞优先结合去唾液酸化的Fc(图8)。这些结果与我们先前的结果一致，即典型的IgG Fc受体以比去唾液酸化的Fc低10倍的亲和力结合唾液酸化的Fc(Nimmerjahn等，2007JExp Med204：11-15，Kaneko等，2006 Science 313：670-673，Anthony等，2008Science 320：373-376)。因此，IVIG Fc聚糖的2，6-唾液酸化将该分子从能够有效地结合FcγR和介导炎症反应的分子转变成具有降低的FcγR结合但获得了结合表达凝集素(SIGN-R1)的巨噬细胞和介导抗炎反应的的能力的类型。
实施例9：DC-SIGN结合2，6唾液酸化Fc
检查与表达SIGN-R1的CHO细胞相比转染的CHO细胞中DC-SIGN的结合特异性。表达DC-SIGN和SIGN-R1的CHO细胞都结合2，6-唾液酸化的Fc(图9和表2)。表2显示了通过线性回归分析确定的Ka值。甘露聚糖(已知的DC-SIGN的配体)能够与2，6-唾液酸化Fc竞争结合转染的CHO细胞，表明这两个配体在CRD上的结合位点可能是重叠的。没有观察到与纤维蛋白原的结合，纤维蛋白原具有类似于IgG Fc上所发现的唾液酸化双触角聚糖成分的丰富的血清糖蛋白，但缺乏Fc连接的聚糖观察到的高度有序的结构(图9)，这表明2，6-唾液酸化Fc与这些凝集素之间的相互作用同时需要聚糖和氨基酸骨架以获得其特异性。
表2
SIGN-R1、hDC-SIGN和hFc·RIIb对唾液酸化、去唾液酸化IgG Fc的Ka
Figure BPA00001256431300411
在本公开中提到的所有专利和非专利出版物在这里被引入，就象这些专利和非专利出版物各通过引用被全文引入本文一样。此外，尽管本发明已经参照具体的实施例和实施方式进行了描述，但应该理解，这些实施例和实施方式只是用来说明本发明的原则和应用。因此应该理解，可以对该说明性的实施方式进行许多修改，以及不背离如下面的权利要求所定义的本发明的精神和范围而设计其它的方案。
Figure IPA00001256430800011
Figure IPA00001256430800021
Figure IPA00001256430800031
Figure IPA00001256430800041
Figure IPA00001256430800051
Figure IPA00001256430800061

Claims (32)

1.一种鉴定用于激活或抑制与IgG自身抗体介导的炎症相关的抗炎活性的受试化合物的方法，其包括：
(a)在DC-SIGN受体型蛋白质存在下混合受试化合物；以及，
(b)与适合的对照比较，测量和比较在DC-SIGN受体型蛋白质存在下受试化合物的效应。
2.权利要求1的方法，其中所述DC-SIGN受体型蛋白质选自于SIGN-R、DC-SIGN和DC-SIGNR。
3.权利要求1和2的方法，其中步骤a)是在Ca++存在下进行的。
4.权利要求1的方法，其中所述DC-SIGN受体型蛋白质是以DC-SIGN(+)细胞形式提供的。
5.权利要求4的方法，其中所述DC-SIGN受体型蛋白质选自于SIGN-R、DC-SIGN和DC-SIGNR。
6.权利要求4的方法，其中所述DC-SIGN(+)细胞是以重组地编码选自于SIGN-R、DC-SIGN和DC-SIGNR的凝集素结构域的核酸分子转染的培养细胞形式提供的。
7.权利要求1的方法，其中步骤a)是在无细胞的环境中进行的。
8.权利要求7的方法，其中所述DC-SIGN受体型蛋白质选自于SIGN-R、DC-SIGN和DC-SIGNR。
9.权利要求4-8的方法，其中步骤a)是在Ca++存在下进行的。
10.一种鉴定用于激活或抑制与IgG自身抗体介导的炎症相关的抗炎活性的受试化合物的方法，其包括：
(a)提供DC-SIGN(+)细胞；
(b)使DC-SIGN(+)细胞接触受试化合物；以及
(c)与DC-SIGN(-)细胞或没有接触受试化合物的DC-SIGN(+)细胞相比，测量所述DC-SIGN(+)细胞内的细胞成分的增加或减少，其中该细胞成分的增加或减少已知与DC-SIGN受体型的调节相关。
11.权利要求10的方法，其中所述DC-SIGN(+)细胞是以重组地编码选自于SIGN-R、DC-SIGN和DC-SIGNR的凝集素结构域的核酸分子转染的培养细胞提供的。
12.权利要求10和11的方法，其中步骤a)是在Ca++存在下进行的。
13.一种鉴定用于激活或抑制与IgG自身抗体介导的炎症相关的抗炎活性的受试化合物的方法，其包括：
a)提供包含DC-SIGN受体型或至少含凝集素结构域的片段的氨基酸序列；
b)将步骤a)的受体或片段与受试化合物接触；以及
c)测量受试化合物与凝集素结构域的结合程度。
14.权利要求13的方法，其中所述DC-SIGN受体型蛋白质选自于SIGN-R、DC-SIGN和DC-SIGNR。
15.权利要求13的方法，其中步骤b)是在无细胞的环境中进行的。
16.权利要求13的方法，其中所述DC-SIGN受体型蛋白质选自于SIGN-R、DC-SIGN和DC-SIGNR。
17.权利要求13-16的方法，其中步骤b)是在Ca++存在下进行的。
18.一种鉴定用于激活或抑制与IgG自身抗体介导的炎症相关的抗炎活性的受试化合物的方法，其包括：
a)提供包含DC-SIGN受体型的凝集素结构域的第一氨基酸序列；
b)将步骤a)的凝集素结构域与对照抗体或其变异体接触；
c)测量对照抗体与凝集素结构域的结合程度，以确定基线结合值；
d)提供包含DC-SIGN受体型的凝集素结构域的第二氨基酸序列；
e)将步骤d)的凝集素结构域与受试化合物接触；
f)测量受试化合物与凝集素结构域的结合程度；以及
g)将步骤c)的基线结合值与步骤f)中测量的受试化合物的结合程度相比较。
19.权利要求18的方法，其中步骤b)和步骤e)是在无细胞的环境中进行的。
20.权利要求19的方法，其中所述对照抗体是包含糖链的IgG抗体，其中半乳糖部分通过α2，6唾液酸化作用连接到末端唾液酸部分上。
21.权利要求19的方法，其中所述对照抗体或变异体是包含糖链的Fc片段，其中半乳糖部分通过α2，6唾液酸化作用连接到末端唾液酸部分上。
22.权利要求20的方法，其中步骤e)包括将配体结合域与受试化合物和Fc片段接触。
23.权利要求17的方法，其中步骤a)和步骤d)的氨基酸序列由表达选自于SIGN-R、DC-SIGN和DC-SIGNR的凝集素结构域的培养细胞提供。
24.权利要求18-23的方法，其中步骤b)和步骤e)是在Ca++存在下进行的。
25.一种治疗免疫疾病的方法，其包括向病人施用结合和激活DC-SIGN受体型或其信号转导途径的成员并介导与该免疫疾病相关的抗炎活性的化合物，条件是该化合物不是IVIG。
26.权利要求25的方法，其中所述DC-SIGN受体型是人DC-SIGN受体。
27.权利要求26的方法，其中所述免疫疾病选自于下组的免疫疾病：免疫性血小板减少症、自身免疫性溶血性贫血症、全身性红斑狼疮、川崎病、硬皮病、类风湿性关节炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、天疱疮、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、牛皮癣、多发性硬化症、阿尔茨海默氏症和帕金森氏症或与自身抗体介导的炎症相关的状态。
28.一种治疗抗炎疾病的方法，其中包括向病人施用结合和激活DC-SIGN受体型或其信号转导途径的成员并介导与该抗炎疾病相关的抗炎活性的化合物，条件是该化合物不是IVIG。
29.一种药物组合物，包含：
(a)结合和激活DC-SIGN受体型的化合物，其导致促进与免疫疾病相关的抗炎活性；以及
(b)至少一种药学上可接受的赋形剂，其中配制该组合物以达到一定的效果。
30.权利要求28的药物组合物，其中所述化合物是抗体。
31.权利要求28的药物组合物，其中所述化合物是Fc片段。
32.权利要求28的药物组合物，其中所述化合物是包含糖链的Fc片段，其中半乳糖部分通过α2，6唾液酸化作用连接到末端唾液酸部分上。
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