TWI328614B

TWI328614B - Product quality enhancement in mammalian cell culture processes for protein production

Info

Publication number: TWI328614B
Application number: TW092136006A
Authority: TW
Inventors: Bernhard M Schilling; Scott Gangloff; Dharti Kothari; Kirk Leister; Linda Matlock; Stephen G Zegarelli; Christoph E Joosten; Jonathan D Basch; Sivakesava Sakhamuri
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2002-12-23
Filing date: 2003-12-18
Publication date: 2010-08-11
Also published as: CA2508925C; AU2003303394B2; JP2006511224A; JP4496086B2; CN100402660C; CY1111358T1; CO5590971A2; ES2354610T5; BR0316882A; US20080070280A1; KR101088223B1; CN1820080A; SI1576182T2; HK1075474A1; EP1576182A4; WO2004058944A3; EP1576182A2; EP1576182B2; DE60335024D1; EP1576182B1

Description

1328614 (1) 玖、發明說明【發明所屬之技術領域】本發明關於用來培養可產製蛋白質產物（宜爲其涎酸含量增加且增進的醣化蛋白質產物）之哺乳動物細胞的方法和過程。由測量涎酸含量可知’從多面來進行細胞培養方法和過程可產生高品質和高產量的產品。蛋化醣的途用防預或 / 及療治於用之製產式方 U 術組技重前以先 [ 白質宜使用動物細胞之培養’尤其是哺乳動物細胞之培養來表現。重組之醣蛋白的醣化樣式很重要’因爲醣蛋白的寡醣側鏈會影響蛋白質的功能’以及蛋白質之不同區間的分子內交互作用。這類分子內交互作用係涉及醣蛋白之蛋白質構造和三級構造。（見’如：Α· Wittwer et al , 1990, Biochemistry, 29 · 4175-4 1 80 . Hart, 1992. Curr. Op. Cell Biol., 4 ： 1 0 1 7- 1 023 ； Goochee et a]., 1991，Bio/Technol.， 9: 1347-1355;和 R. B. Parekh，1991，Curr. Op. Struct. Biol·, 1 : 750-754)。另外，寡醣類可將一特殊多肽瞄準某些以特殊之細胞碳水化合物受體爲基礎的構造（M.P. Bevilacqua et a].5 1 9 9 3, J· Clin. Invest.. 91 ： 3 79-3 87 ； R.M. Nelson et a)., 1 993, J. Clin. Invest., 91 ： 1 157-1 166 ;K.E. Norgard et al.，】993, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 90 : I 06 8 · ] 0 72 ;和 Y · I m a i et a 1 ·, ] 9 9 3 , N at u r e, 3 6 1 : 555-557卜 -5 - (2) (2)f1328614 已知醣蛋白之寡醣側鏈的終端涎酸成分對醣蛋白的許多方面和性質都有作用，包括：吸附、溶解度 '熱穩定性、血淸半生期、從血淸淸除，以及其物理和化學構造/行爲和其免疫性。（A.Varki，1993，Glycobiology，3 : 97-100 ; R.B.Parekh 1 Id. > Goochee et al. > Id ； J.Paulson et al.，1989，TIBS，14 : 272-276 ; and A.Kobata，1992， Eur.J.Biochem.，2 0 9 : 4 8 3 - 5 0 1 ; E.Q.Lawson et a 1., 1 9 8 3 ’ Arch.Biochem.Biophys. ， 220 : 572-575 ； and E.Tsuda et a 1., 1 9 9 0 > Eur.J.Biochem.，188 : 405-411)。一般而言，在以哺乳動物細胞培養爲基礎之系統中的蛋白質表現程度較微生物表現系統（如：細菌或酵母表現系統）低得多。然而，細菌或酵母細胞受限於其下列能力 ’而無法使表現出之醣蛋白成熟，因而可影響產品之致免疫性及淸除率：其無法理想表現高分子量蛋白質產物、適當摺疊具複雜立體構造之蛋白質，及/或提供必須之後轉譯修改的能力。由於動物或哺乳動物細胞（尤其是可產製重組產品之動物或哺乳動物細胞）之培養限制，因此，已對多種變數之操作進行硏究，包括：使用大規格之培養瓶；改變基礎培養條件，如：培養温度 '溶解的氧濃度、pH，等；使用不同類型之介質及加入介質之添加劑；增加培養細胞之密度。另外，發展出之培養哺乳動物細胞的方法可因延長操作次數，來增加最終產物濃度，但仍維持高產物品質的能力增加而受益。一種重要的產物品質變數爲多肽產物之 -6- (3) (3)1328614 醣化構造的程度和完全性，而涎酸含量則常用來作爲醣蛋白品質的測量質。細胞培養程序，尤其是非-連續性程序的操作次數通常受限於細胞之殘餘存活力，其通常會在操作過程中下降。因此，儘可能將高細胞存活力延長是有需要的。由於細胞死亡會將涎酸酶釋入培養上淸液中，而這可能會減少表現出之蛋白質的涎酸含量，因此，關於產物品質的考量亦爲將可存活細胞密度減少的情況降至最低的推動力。關於蛋白質純化的考量亦提供另一將可存活細胞密度減少的情況降至最低，並維持高細胞存活力的推動力。培養中有細胞碎片及死細胞內容物存在時對於在培養運作終止時分離及/或純化蛋白質的能力會有不良的影響。經由將培養中之細胞維持存活較久可同時減少培養介質受到那些可引起細胞變質，而使細胞產製之所需醣蛋白的品質降低的細胞蛋白質和酶（如：細胞蛋白酶和涎酸酶）的污染。現已硏究過多種變數，以在細胞培養中取得高細胞存活力。一種變數係涉及在37°C開始培養後，單次降低培養温度的方法（例如：Roessler et al·, 1996，Enzyme and Microbial Technology, 18 ： 423 -4 2 7 ；授讓給 T. £以1^乂61^?等之美國專利號 5,705,3 64 和5,7215121，1998 ;授讓給K_ Furukawa等之美國專利號5;976,833;授讓給 1^.八(331«5〇11等之美國專利號5,8 5 1,8 00;授讓給〇61^114(：11 公司之 WO 99/61650和 WO 00/65070;授讓給 Biogen 公司之 WO 00/3 6092 ;和授讓給 Girard等之美國專利號 (4) (4)1328614 4,3 5 7,422)。其它硏究之變數涉及在培養中加入成分。生長因子抑制劑蘇拉明（Suramin)顯示出可在CHO K1 : CycE細胞之指數生長期間預防細胞凋亡（Zhangi et al., Biotechnol. Prog. 2000, 1 6, 3 1 9-325)。然而，蘇拉明並不能保護細胞在死亡相期間對抗細胞凋亡。因此，蘇拉明可維持生長相期間之高存活力，但無法延長培養之壽命。該同一作者報導：在CHO 1 1 1-1 0PF細胞株方面，類似於蘇拉明，硫酸葡聚糖和聚乙烯硫酸化物可增加第3天之存活細胞密度及存活力（此係相對於對照組而言）。然而他並未報導硫酸葡聚糖和聚乙烯硫酸化物在死亡相期間的效果。蘇拉明、硫酸葡聚糖和聚乙烯硫酸化物亦被報導爲可有效預防細胞之集結。肝素曾被加入動物細胞培養介質中，以使停駐-倚賴性細胞株能適應懸浮液環境（如：授讓給 Mckenna和 Granados之美國專利號5,348,877，1994)。亦已知：肝素可連接生長因子，如：似肝素-連接EGF生長因子（HB· EGF ; Raab and Klagsbrun, B i o ch i m. Biophys. Acta 1 997, 1 3 3 3，F179-F199)。細胞表面硫酸乙醯肝素蛋白多醣 (HSPG)經報導可增强某些細胞類型（包括野生型CHO細胞之 ΗΒ-EGF 連接性和生物活性（Raab and Klagsbrun， ]997)[硫酸乙醯肝素與肝素之不同處僅在於硫酸乙醯肝素具有較少之N-和0-硫酸化物基團及較多之N -乙醯基團 (Mckenna和Granados，]994)。爲了本揭示內容之目的， (5) 1328614 肝素和硫酸乙醯肝素被認爲係同等物，且一般稱爲肝素] 。現已有人提出’連接HSPG可增加細胞表面之局部的 FGF-2濃度，此又可提高FGF-2連接細胞之酪蛋白激酶受體的機會（（Raab and Klagsbrun，1997)。聚戊醒多硫酸化物已顯示出可阻斷在培養細胞上的肝素-連接生長因子的作用（Zugmaier et al·，J. Nat. Cancer Inst. 1992,84,1716- 1724) 〇

硫酸葡聚糖在動物細胞培養中之用途的專利文獻係關於在介質中補充硫酸葡聚糖，以達到下列目的：1 )改良人類內皮細胞之生長速率並在其老衰之前讓細胞數加倍（授讓給 Levine等之美國專利號4,994,387和5,132,223， 1991，1992); 2)增加在哺乳動物細胞株中之重組蛋白質產量（授讓給Israel之美國專利號5,318,898，1994); 3)在昆蟲細胞株中誘出單一細胞懸浮液（授讓給Shuler和Dee之美國專利號5,72 8,5 8 0，1 996);4)增加人類肝細胞-生長因子之生長促進活性，並抑制其變質（授讓給Naka之美國專利號 5,5 4 5，7 2 2 和 5，7 3 6，5 0 6，1 9 9 6 和 1 9 9 8 ); 5 )增加存活細胞之密度及重組蛋白質之表現（授讓給 Gorfien之 W0 98/08934 ， 1997) 〇在所有關於在介質中存在或補充硫酸葡聚糖的報告案例中，硫酸葡聚糖條在全部培養時間中均存在於該指定介質中。沒有關於延遲加入之優點的報告案例。再者，從未有關於硫酸葡聚糖可延遲死亡相之開始、延長生長相或阻止死亡相的報告。 -9 - (6) (6)1328614 隨著培養中之產物濃度增加，可在細胞培養過程中觀察到產物品質降低（由測量寡醣之糖構造的涎酸含量所測定）。由藥物淸除硏究可測定出可接受之涎酸含量通常存在著下限。培養中之細胞所產生的大量蛋白質理想中應具有高品質之最終欲回收使用的蛋白質。以涎酸含量作爲這些變數的測量値時，可知這類蛋白質之高品質與蛋白質之醣化構造的程度和完整性相關。曾有報導指出，將D-半乳糖（4克/升）加入小規模細胞培養（如：2升（2L)之生物反應器）的基礎介質中可增加由培養細胞所產製之單株抗體（MAb)重鏈的半乳糖化作用。（S. Weikert et al.. Engineering CHO Cells to Maximize Sialic Acid Content of Recombinant Protein’’，其方令 2001 年 4 月5 - 6日，在維吉尼亞州麥克林市，由康橋健康技術協會 (Cambridge Healthtech Institute)所支持之“蛋白質表現 ”（“ P r 〇 t e i η E X p r e s s i ο η ”）會議中發表）。如所報導者，半乳糖係一次添加至小規模培養中，且在整個培養期間並不以餵養介質添加物之型式提供。報導中並無關於在大規模培養（如：大於2升）中維持培養中所產製之醣蛋白的涎酸化程度時所涉及之障礙的認知。 WO 0 1 /5 90 75 Α](金泰克公司（Genetech))中揭示一種經由將編碼突變之UDP-GICNaC2·表向立體異構酶的核酸序列引入培養中之細胞來改良或增進醣蛋白之涎酸化程度的方法，該UDP- GlcNac2-表向立體異構酶爲特殊核苷糖，CMP涎酸之生物合成通路中的速度-限制酶。X. Gu和 -10- (7) (7)1328614 D · W a n g ( 1 9 9 8，B i o t e c h · B i o e n g.，5 8 (6) : 6 4 2 - 6 4 8 )描述以一類似方式，利用ManNac(—種用於合成涎酸之特殊先質）來補充培養介質，以增加CMP-涎酸之可利用性，並改良產物之涎酸化程度。類似於 WO 0 1 /5 907 5 Al，X. Gu 和 D.I.C. Wang(1998 ，Biotech.Bioeng·，58(6): 642-648)揭示以 N-乙醯基甘露糖胺（ManNac)來補充培養介質，以增加在20毫升之規模培養中的細胞所累積的CMP-涎酸，此最終可增加該以重組方式產製之人類IFN-γ醣蛋白的涎酸含量。ManNac成分係在培養9 6小時後，於所產製之蛋白質產物的涎酸化分析之前，第一次被補充入培養中。 WO 0 1 /5 90 8 9 A2(金泰克公司）中揭示用來增進對CAD 抑制劑具抗性之醣蛋白-產製細胞中的胞內CAD活性的策略。此發表之國際申請案中揭示CAD係指可催化重新生物合成嘧啶（尤其是可轉化成UTP之UMP)之反應中的前三個反應的多酶多肽複合物（胺甲醯基硫酸合成酶（CPSCD) 、天門冬酸轉胺甲醯酶及二氫乳淸酶）。報導中記載具 CAD抗性之細胞隨著蛋白質產物之醣化程度增加，其 UTP累積物會隨著增加，UDP-半乳糖量亦隨著增加； UDP·半乳糖爲醣化通路中之一種已知受質》以重組方式產生，經適當醣化及涎酸化之作爲治療劑、處置劑及預防劑的蛋白質產物在醫學及臨床上變得愈來愈重要》因此，發展能經濟且有效地增加最終蛋白質產物之濃度，及高水準之產物品質（如：由涎酸含量來測定）的 • 11 - (8) (8)1328614 可靠細胞培養方法可實現本技藝中所渴望及需要的目標。發明摘述本發明提供用於經由動物或哺乳動物細胞培養來產製蛋白質的新方法’此蛋白質產物宜爲重組之蛋白質產物，而以醋蛋白產物更佳。本發明之細胞培養方法可透過使用新硏發之在培養中加入D-半乳糖的饌養策略而很方便地增加’和增進由培養之細胞所產製的醣蛋白產物的涎酸含量〇本發明的一種觀點係提供用於產製蛋白質產物（宜爲醣蛋白產物’以重組之醣蛋白產物更佳）的細胞培養方法 ’其中該醣蛋白之涎酸含量可藉由在培養方法中所使用之培養條件及變數來增加和增進。根據本發明的一種較佳觀點係經由使用其中D-半乳糖係在餵料（宜爲餵養介質）中加入培養中的餵養方法來增加和增進所產製之醣蛋白的涎酸含量。根據本發明的一種特殊及相關觀點，D-半乳糖係在整個培養期間每日補充給細胞，以使產物之D -半乳糖含量增加，而在醣構造上加入較多之涎酸部分，以藉此增加最終醣蛋白產物之品質。本發明的另一種觀點係提供可有效逆轉醣蛋白涎酸化下降之問題的方法，此種問題常在經由增加反應器規模（如：細胞培養體積和反應器大小）來大量生產蛋白質時伴隨發生。以涎酸化有效量之D-半乳糖來餵養可產製醣蛋白產物之大規模細胞培養的方法可逆轉前述之“規模效果” -12- (9) 1328614 。本方法亦可達到使細胞不受反應器規模影響而產製出大量高度涎酸化之醣蛋白。本發明還有另一種觀點係提供能增加由培養細胞產製之醣蛋白的涎酸化程度的方法。本方法涉及將半乳糖（宜爲半乳糖）以餵料型式（以加在餵養介質中較佳）加入培養中。本發明之另一種觀點提供用於產製蛋白質之細胞培養方法，其中半乳糖係，如：每天或週期性（如：每隔一天、每三天' 每四天，等）補充入培養中。含D-半乳糖 φ 之餵養介質可每天加入培養中一或多次。較佳之餵養攝生計劃包括每日一次以大九劑餵養介質餵養細胞之餵養法，和將饌養介質滴入或注入細胞培養中之連續餵養法。在其它觀點中，除了將D-半乳糖加在餵養介質中之外，還可將D -半乳糖以其它方式，在上述任何間隔時間內加入培養中。一種非限制性的實例爲：除了將D_半乳糖加在餵養介質外，亦可將D-半乳糖加入介質或培養介質中來餵養細胞，或者，D-半乳糖可加在水中來餵養細胞。一種非 φ 限制性的實例爲：可以D-半乳糖餵養培養，亦可以餵養介質餵養培養，也就是可以餵入超過一種組成物。在本發明另一觀點中，提供一種用來增加蛋白質生產和所產製之醣蛋白的涎酸含量的細胞培養方法。此方法還可維持和支撐所產製之蛋白質的高涎酸化水準，以及細胞存活力。本發明此觀點包含其中涉及在細胞培養期間進行二或多次温度更動，加上以D ·半乳糖餵養培養的實施態樣。在比觀點中’温度更動細胞培養方法可支持在培養操 -13 - (10) 1328614 作期間培養之高細胞存活力。二或多次温度更動亦胞在培養中維持一段時間，有利地延長培養操作過增加所需產物之滴定濃度和高品質（由涎酸含量來待性）。與標準，或二週（約1 0 - 1 4天）之培養期相較及這類延長之培養操作過程的方法包含，如：二、三週或更久（約1 4至3 0天，或更久）之總細胞培養期。由明之細胞培養方法所新提供之組合温度更動及以D 糖餵養細胞（以在餵養介質中較佳，且以每日餵養較方法可使培養中之細胞產製出具增加和改良產量和品涎酸化醣蛋白產物。此方法特別利於分批-餵養之細養。在本發明之其它不同觀點中係在哺乳動物細胞之中使用多-步驟温度更動（宜爲含有二或多次向下之温動的定時多-步驟温度更動），以產製所需之蛋白質產尤其是醣蛋白產物。可在培養之生長相後實行之二或温度更動包含本發明此觀點之方法。藉由至少二次温動（在更換之間宜增加約4天）可取得所需蛋白質產物蛋白質產量，並伴隨著高涎酸含量。包含多次温度更培養方法可同時取得高品質和大量之蛋白質產物，並養期間維持細胞存活力。與此處所描述之温度更動細胞培養方法相關的較數爲以D-半乳糖饌養培養（宜以補充含有D-半乳糖之介質進行餵養）。以每日餵養攝生法爲最佳攝生法。根據本發明之新細胞培養方法，在本發明之一種『使細卜以丨定其，涉 :或四 I本發 -半乳佳）的 ;質的胞培培養度更物，多次度更之商動之在培佳變餵養實施 -14 - (11) (11)1328614 態樣中，第一次温度更動和第二、第三 '第四次或進一步之向下温度更動的組合可使細胞培養維持高細胞存活力，並可提供延長之生產相，在此延長之生產相中，蛋白質產物的滴定濃度增加，且直到培養操作完畢均可維持產物之高品質（如由涎酸含量所測定出之特性）。根據本發明之温度更動細胞培養方法，第一次温度更動和第二、第三、第四次或進一步之向下温度更動的組合可使細胞培養維持高細胞存活力，並可在本發明的一種實施態樣中提供延長之生產相，在此延長之生產相中，蛋白質產物的滴定濃度增加，且直到培養操作完畢均可維持產物之高品質（如由涎酸含量所測定出之特性）。此處所使用之培養操作過程係指培養期，宜指整個培養期。如本發明所提供者，在不含温度更動，或僅含一次温度更動之操作過程中，以D-半乳糖（以含D-半乳糖之餵養介質較佳）來餵養細胞培養可取得大量及高品質之蛋白質產物（由測量所產製之產物的涎酸含量來測定）。在含有二或多次温度更動之培養操作過程方面，如本發明所新提供之在生產操作過程期間以含D-半乳糖之餵養介質來餵養細胞的方法可使所產製之醣蛋白的涎酸含量增加。（見 ’如··第1圖，其中係每日使用大九劑饌料）。整個培養操作過程之長度可持續短如僅在第二次温度更動（如：約〗Ο-ΐ4 天）後即結束’ 亦可長至約28-30天’或更久。在包含二 (或更多）次溫度更動之培養操作方面，整個培養操作的長度可持續短如僅在第三次（或最後一次）温度更動（如：約 -15- (12) (12)1328614 14·21天）後即結束，亦可長至約2830天，或更久。因此 ’根據本發明之方法，細胞培養之總操作期可超過10天’ 超過14天’或超過21天。較合適的爲，該培養之操作持續至少約丨0 -1 4天到約2 ] - 3 0天，或更久。總培養操作可包含二、三、四或更多步驟之温度更動。一種非限制性之實例係依下述來進行二-步驟温度更動 :從第〇天至約第6天，先將培養温度維持在37 t，或接近 37°C ;從約第6天至約第1〇天，將培養温度維持在34。(：，或接近34°C ;從約第1〇天起，如：至約第！ 4至28天，至約第]4至]8天，或至培養操作結束，將培養温度維持在32 °C ’或接近32 °C。根據本發明之三-步驟温度更動的培養程序係包含下述之非限制性實例：從第0天至約第6天，先將培養温度維持在3 7 °C，或接近3 7 °C ;從約第6天至約第 1 〇天，將培養温度維持在3 4 °C，或接近3 4 °C ;從約第1 0天至約第14天，將培養温度維持在32°C，或接近32°C ;從約第14天起，如：至約第21至30天，或更久，或至培養操作結束，將培養温度維持在30°C，或接近3〇°C。因此，使用本含二或多次温度更動之細胞培養方法（其中可產製大量及高品質之蛋白質）不僅對具”較短"期間，如：標準期間（如：約至14天）的培養操作有利，亦對較標準產製操作持續久的培養操作有利。由於本發明之方法可延長培養細胞產製蛋白質的初始或標準生產相（一般而言，初始或標準生產相係在約第6天至第M天開始）’因此可取得這類較長期之培養操作。例如’與不使用温度更 (13) (13)1328614 動或至多一次溫度更動之培養中的蛋白質生產及產物品質相較下’根據本發明在培養操作中使用二 '三，或更多次的温度更動可維持高產量及高品質的蛋白質產品及細胞存活力，且可維持並將細胞存活力從約1 〇 - 1 4天之總操作時間持續至約21-28天或更久之總操作時間。在本發明之另一種觀點中，本發明提供含有超過二或三次如上述之温度更動的細胞培養方法。在這類多-步驟温度更動操作中，細胞大體上係依關於三步驟培養期之描述來進行培養，直到培養期結束時再進行額外之向下温度更動。例如：第四次向下温度更動（也就是，降低温度）可在第三次温度更動培養期之後進行，其中該細胞培養温度係在約培養開始後的第1 5 _ 1 9天，宜爲第1 8天進一步從約 3 0 °C更換爲約2 8 °C或2 9 °C，宜爲約2 9 °C。在細胞培養方法中可包含額外之温度更動（其中細胞係維持在較低之温度，如：<2 9 °C下），以進一步延長蛋白質產製，直到操作過程結束，宜長過28-30天。在所有情況中，通常會在培養期結束時藉由如本文所描述之本技藝中例常使用的技術來回收（如：依需要將其分離出及/或大致上純化）由細胞產製之蛋白質。另外，藉習知方法來評估涎酸含量。在一種特殊觀點中，本發明提供一種過程（或方法），其中經由使用二或多步驟之温度更動方法來增進產物之最終滴定濃度，且所產製之醣蛋白的涎酸含量較高。根據此特殊觀點，二或多次定時之温度更動的組合可支持培養之高細胞存活力，藉此，可延長生產相，而在此生產相期 -17- (14) (14)1328614 間’可增加產物（宜爲重組產物）之滴定濃度，並可將產物品質（如由涎酸含量所測定出之特性）維持在高水準。這類二-或多-步驟之温度更動可將細胞培養方法中產製產物時普遍存在於蛋白質滴定濃度和涎酸含量間之交換情形降至最少。因此，温度更動對加強培養過程之重要表現變數，也就是：”終點（即最終）滴定濃度"X "終點（即最終）涎酸_，（終點滴定濃度X終點诞酸"）具有正面效果。在二-或多-步驟之培養方法中’宜以含D-半乳糖之介質來餵養細胞，所餵養之量爲能使蛋白質產物（包括在延長之培養期（如：超過約2週或更久）中的大量培養的產物）維持高度涎酸化的量。因此’在另一種關於此處所描述之二-步驟培養方法的特殊觀點中’從第0天至/或約第6天，培養中之細胞係維持在37°C ’或接近37°C之温度下；在/或約第6天時，細胞培養之温度係降至34°C，或接近34°C ;在/或約第10天時，細胞培養之温度再降至32 t：，或接近32 t。在一種這類二·步驟之温度更動方法的觀點中，生產相延長超過約第1 4天’並持續至培養操作過程完畢，如：直到約第2 1天 ’或至約第2 8至3 0天，或更久，在此期間，細胞係維持在 32 °C，或接近32 °C之較低温的培養中。蛋白質產物可依本文中之進一步說明，在延長之生產相結束時回收。本發明之另一種特殊觀點中提供一種藉由在培養操作過程中使細胞接受二或多次之温度更動來增加培養中之細胞的存活力的方法。若培養中之細胞的存活力在一種條件 -18 - (15) (15)1328614 存在時可較無此條件存在時，維持較高一段時間，則表示此條件可增加細胞之存活力。根據此觀點，所描述之二. 或多次温度更動細胞培養方法可使細胞在增加的期間（如 :超過標準產製期）維持存活。如此處所討論，在可用來維持存活細胞之條件下增加培養細胞之細胞存活力的優點爲可使細胞在培養期終了時產製較大量之（高品質）產物。本發明之另一種觀點爲經由執行二-或多次温度更動細胞培養方法所造成之細胞存活力增加與在培養期間所產生之細胞碎片及釋出之已死或將死細胞的內容物的減少量呈相關性。培養中有細胞碎片及死亡細胞之內容物存在時對培養終了時分離及/或純化蛋白質產物的能力有不良影響。經由將培養中之細胞維持存活較久可同時減少細胞蛋白質和酶（如：細胞蛋白酶和涎酸酶）對培養介質的污染，因這些污染會引起降解，最終使細胞產製之所需醣蛋白的品質降低。在本發明之其它觀點中係使用涉及延遲加入多陰離子性化合物，並以D·半乳糖餵養培養的培養方法。在本發明的一種觀點中，涉及延遲加入多陰離子性化合物的培養方法和涉及二或多次温度更動的培養方法係與以D·半乳糖餵養培養一起使用。在這些涉及將多陰離子性化合物延遲加入細胞培養中的觀點中，延遲加入多陰離子性化合物可增加細胞之存活力。多陰離子性化合物以硫酸葡聚糖較佳。多陰離子性化合物係在接種後的一個時間加入培養中。 -19- (16) (16)1328614 在本發明一種涉及延遲加入多陰離子性化合物的觀點中’多陰離子性化合物係在接種後，於初始死亡相開始前 ’或在初始生長相的期間，或在初始生長相的後半段期間，或在或約在初始生長相結束時加入培養中。根據本發明此觀點’可將生長相延長且/或可將死亡相的起點延遲— 段時間’如：數天。另外’一旦死亡相開始，死亡速率可大爲減低。在本發明的另一種觀點中，多陰離子性化合物係在初始死亡相的期間加入。根據本發明此一觀點.，可將細胞死亡遏止一段時間，如：數天。在本發明的另一種觀點和此處之進一步說明中，該新發展出之涉及以含D -半乳糖之饌養介質餵養細胞的細胞培養方法，特別適合用來產製可溶性CTLA·4分子及可溶性 CTLA4突變種分子，如：CTLA4Ig 和 L104EA29YIg。在較佳之實施態樣中，可溶性 CTLA4分子及可溶性 CTLA4突變種分子係由經過遺傳工程處理，可表現和產製這些蛋白質的宿主細胞來產製大量及高品質的可溶性 CTLA4分子及可溶性ctla4突變種分子。（見實施例1-5) 。本發明之較佳實施態樣包含在培養操作過程中利用多次温度更動來培養產製CTLA4Ig和L104EA29YIg之細胞，並以含有D-半乳糖之餵養介質來餵養這些培養，以取測定得大量之高品質CTLA4Ig和L104EA29YIg產物（由測量最終產物之涎酸含量所測定出）。其它較佳實施態樣包括使用多次温度更動培養方法，並以含有有效量之D-半乳 -20- (17) (17)1328614 糖的餵養介質來餵養這些細胞培養，以取得如此處所說明之具有高涎酸含量的CTLA4Ig和L·〗04EA29YIg產物。其它較佳之實施態樣包含利用延遲加入多陰離子性化合物’ 並以含有D -半乳糖之餵養介質來饌養這些培養的方法來培養可產製可溶性CTLA4分子和可溶性CTLA4突變種分子（如：CTLA4Ig和L104EA29YIg)之細胞。其它較佳之實施態樣包含利用延遲加入多陰離子性化合物和多次温度更動，再加上以含有D-半乳糖之饌養介質來餵養這些培養的方法，來培養可產製TLA4Ig和L104EA29YIg的細胞。本發明之其它觀點、特性和優點可在硏讀本發明之詳細說明及參考圖形和圖表後察知。【發明內容】本發明描述用於在哺乳動物細胞培養中產製蛋白質（宜爲重組之蛋白質產物，以醣蛋白產物更佳）之新方法。根據本發明之細胞培養方法可增進和增加由培養之細胞所產製出的醣蛋白的涎酸含量，以在培養操作過程結束時提供高品質之蛋白質產物。涉及以D-半乳糖餵養之培養方法本發明針對一種用於經由哺乳動物細胞培養來製備醣蛋白，尤其是重組之醣蛋白的增進方法，其中所產製之醣蛋白的涎酸含量可經由使用新-描述之餵養策略來增加，在此策略中係將D-半乳糖饌入培養中。在細胞培養中提 -21 - (18) (18)1328614 供D-半乳糖，以使其在培養中之存在量可有效取得並維持所產製之蛋白質高度涎酸化，直到培養操作過程結束。如此處所描述’本發明包含多種餵養攝生法來使培養操作過程期間在培養中存在著殘餘的D -半乳糖。根據本發明’在所產製之蛋白質的醣構造中加入D-半乳糖被鑑定爲係一種產物涎酸化的速度-限制步驟。吾人發現：在整個培養過程中，餵養介質中存在著有效量之 D -半乳糖可增加產物中之D -半乳糖含量。換言之，其可在蛋白質醣構造中加入較多之涎酸部分，以藉此增加產物品質。爲了維持及/或支撐產物之高度涎酸化，宜在整個培養操作過程中維持D -半乳糖餵養策略。本發明之過程和方法適合小（如：50升·1〇〇升）和大（如：500升及較大者）規模之細胞培養。另外，本發明之方法特別適合以小規模和大規模分批-餵養之培養型式生長及維持的細胞。另外，多種本技藝中所已知之培養介質可用於本發明之培養方法中。合適之培養介質進一步描述於本文中》本發明的益處之一爲利用本文所描述之培養方法，可經由提高最終產物之總體品質（如：藉由測量涎酸含量得知）來降低蛋白質之產製費用。在一種較佳之實施態樣中 ’當供給細胞培養之餵養介質中包含D-半乳糖（宜每日餵養）時，可在整個培養操作過程中維持產物之高涎酸含量。（見，如：實施例1和2)。有趣的是，在培養操作過程之第10天中斷或停止餵養D-半乳糖會導致高產物品質變差，形成低涎酸化之蛋白質物種。（實施2)。再者，經由餵 -22- (19) (19)『1328614 養介質在產製指定之蛋白質（如：CTLA4Ig)的細胞培養（宜爲大規模培養）中加入D-半乳糖可逆較所觀察到之對產物品質有害的規模放大效果（如：增加之反應器尺寸）。當培養之每日餵養介質中存在著半乳糖時，規模放大效果被逆轉的情況最爲顯著。餵養介質中不加入D·半乳糖時，醣蛋白之涎酸化程度會隨著反應器規模增加而降低。因此，一種本發明之較佳實施態樣係涉及在整個生產操作過程中維持D -半乳糖之餵養策略（以每日餵養較佳），以不受反應器規模影響來產製大量高度涎酸化之醣蛋白。在整個細胞培養操作過程中提供含有涎酸化有效量之D-半乳糖的餵料（以含有D-半乳糖之餵養介質較佳）可使規模放大效果逆轉，並避免蛋白質涎酸化程度降低，而形成低涎酸化之醣蛋白產物物種。例如··在將細胞培養之規模放大成數千升反應器體積的過程期間，可觀察到產物品質（藉由測量醣蛋白之涎酸化程度來測定）隨著反應器規模增加而降低。此觀察到的情形可能係由在較大規模中之培養所經歷到的較大壓力所造成，此較大壓力會影響細胞之 D-半乳糖代謝情形。如此處所例示者，在培養操作過程期間，經由餵養介質在培養中加入D-半乳糖超過一次（如：每日加入）可逆轉或解除這類有害的規模放大效果，以使培養不受所使用之反應器尺寸的影響來產製具高品質和高度涎酸化特性之醣蛋白。因此，在餵料（以餵養介質較佳）中維持D-半乳糖之水準對於具有最明確之規模放大效果的大規模細胞培養特別有利。 -23- (20) (20)Γ1328614 作爲餵料中之一種成分的有效濃度之D-半乳糖（宜爲在細胞培養之餵養介質中）可在整個產製操作過程中增進、增加、維持及/或支撐產物之高涎酸含量。適合用於餵養介質中之D -半乳糖的量可由本技藝中之技術熟習人士根據培養之反應器尺寸和體積來測定。本發明方法適合所有用來產製蛋白質之反應器規模，包括但不限於：大及小生產規模和反應器規模，如：大規模之培養或商用規模之培養，如：超過5 0升，以超過5 0 0升更佳。例如：半乳糖餵養方法可應用於生產規模之培養，如：具有約50升（50 升）或更小之體積者’並可用於反應器規模之培養（其可具有數百或數千升之體積）。根據本發明方法’在餵養介質中所提供之半乳糖濃度宜爲能在培養過程中支撐或維持培養或反應器中之D —半乳糖水準的量。適合用於餵養介質中之D-半乳糖的量包含從約1克/升至約50克/升’以約3克/升至約25克/升較佳 ’以約3克/升至約2 0克/升更佳。一種特殊但非限制性的實例爲：含有12.5克/升D-半乳糖的餵養介質可適合用於本發明之培養方法中’尤其適合用於，如：50升之反應器規模中。再者’較合適的情況爲：在整個培養操作過程中 ’用於培養細胞（如：在反應器或培養容器中）之培養介質中的殘餘半乳糖濃度係維持和支撐在約〇；[克/升_1〇克/升的量’宜爲約0.1克/升-5克/升，以約〇_2克/升-5克/升較佳，以約0.2克/升-2.5克/升更佳，以約〇.5克/升-2克/升要更佳’而以約0.5克/升-】.〇克/升最佳。這些在培養介質中的 -24 - (21) (21)1328614 殘餘半乳糖濃度可適用於半乳糖係經由餵養介質或以某些其它方式餵入的情況中。細胞培養可利用多種饌養計劃或攝生法，以含D-半乳糖之餵養介質來餵養，以遞送D-半乳糖，並將培養中之D-半乳糖的量維持在可支撐涎酸化有效之D-半乳糖濃度，並增進和增加醣蛋白之涎酸化的量。一般而言，本發明之培養方法包含在培養操作過程期間，以在餵養介質中之D -半乳糖餵養細胞培養超過一次。吾人需了解：典型上，在培養操作過程結束時，餵養介質所佔有之培養體積包含約3 0 - 6 0 %之原始培養體積。細胞培養可以每日爲基準，以D-半乳糖餵養之，或者，亦可不以每日作爲餵養基準，如：較每日一次少，以及在不同的時間間隔餵養’而以定時之間隔較佳，包括：每隔一天、每三天、每四天，等。例如：以D -半乳糖饌養細胞培養（宜使用含D -半乳糖之餵養介質），可每天進行一次’每天超過一次’或每天少於一次，且可在全部培養操作過程期間進行一次、二次或超過二次，如：三、四、五或多次。在一種實施態樣中係以D -半乳糖餵養細胞超過一次。本發明亦包含一種連續餵養計劃，例如：涉及將D-半乳糖連續注入（以含D-半乳糖之餵養介質較佳）培養中的 I十劃。在這類連續韻養攝生法中，培養宜從餵養介質中接受D-半乳糖’例如：以連續-供應之“液滴，，，或注入，或其它自動加入之型式’以經過定時、調節及/或計劃的方 -25- (22) (22)1328614 式加入培養中而取得並維持培養中之適當的半乳糖量。最合適的餵養攝生法包含每日以D -半乳糖大九劑餵養一次，宜在培養操作過程中（從培養操作過程開始至收成細胞的那天）’每日以含D -半乳糖之餵養介質餵養。根據本發明，可在上述任何間隔，以除了加入餵養介質中之外的其它一些方法’將D -半乳糖饌入細胞培養中。非限制性的實施例有：可將D -半乳糖加在餵養介質以外的介質或培養介質中來餵入培養中，或者，D -半乳糖可加在水中來餵入培養中。一種非限制性的實施例爲：以 D -半乳糖餵養培養’亦以餵養介質來餵養之，也就是可餵入超過一種組成物。此處所使用之“餵養”一詞係指接種後，在培養中加入任何物質。此處所使用之“接種”一詞係指將細胞加入起始介質中，以開始培養。此處所使用之“餵養介質”和“送料介質”等詞係指在接種後的某一時間開始加入培養中之含有一或多種養分的介質。此處所使用之“基礎介質”一詞係指將細胞加入其中，以開始培養的起始介質。在本發明之另一實施態樣中，本發明包含一種增加由細胞培養所產製之醣蛋白產物的涎酸化程度的細胞培養方法或過程，其包含：將半乳糖，如：D -半乳糖加入培養介質中。一種相關之實施態樣係涉及其中在生產操作過程期 -26- (23) (23)1328614 間，在培養中補充D_半乳糖（以存在於餵養介質中較佳）的細胞培養方法。一種較佳之實施態樣係關於包含每日以含有D -半乳糖之介質饌養培養的細胞培養的方法◊本發明所提供之讓培養中的細胞可取得半乳糖的方法（在培養操作過程期間宜補充超過一次，而以每曰補充更佳）可克服培養中之半乳糖量受限的可能性，藉此，可在形成之醣蛋白構造中加入大量的涎酸部分，以增加最終產物之涎酸化程度，並逆轉上述之規模放大效果的問題。根據本發明，與未以D·半乳糖餵養之培養，和其中在培養操作過程結束前中斷或停止餵養D-半乳糖之培養相較下，於培養操作過程期間以D-半乳糖餵養細胞培養時，蛋白質之涎酸化程度平均增加約1.2至1.5倍。在涉及可產製如下述進一步說明之可溶性CTLA4醣蛋白分子（如：CTLA4Ig)和可溶性 CTLA4突變種分子（如 =L104EA29YIg)的細胞培養的較佳實施態樣中，餵養介質中存在著可在整個生產操作過程中有效維持產物之高涎酸含量的D-半乳糖濃度，且其係每日餵入細胞培養中。（實施例2)。舉例說明，在餵養介質中之D-半乳糖的有效量構成從約1克/升至約50克/升，以約3克/升至約25克/升較佳’以約3克/升至約20克/升更佳。含有約12.5克/升之 D-半乳糖的餵養介質特別適合用於根據本發明之方法的大規模培養（如：5 0升）中。將D-半乳糖加入CTLA4Ig醣構造的步驟被測定爲產物涎酸化之速度·限制步驟。干擾或中斷饌入D-半乳糖將 -27- (24) (24)1328614 導致CTLA4Ig醣蛋白產物變壞，形成低涎酸化之醣蛋白產物。因此，宜在整個生產操作過程中，於每日餵養介質中加入D-半乳糖，以取得並支撐高品質之完全涎酸化的產物。在用於產製CTLA4Ig之大規模培養的餵養介質中每曰加入D -半乳糖可逆轉所觀察到之對最終產物品質有害的規模放大效果。更具體地說，當餵養介質中不加入D-半乳糖時，CTLA4Ig醣蛋白之涎酸化程度會隨著反應器規模增加而降低。在產製CTLA4Ig之大規模培養中每日加入D-半乳糖可不受反應器規模影響而產製出大量高度涎酸化之醣蛋白。涉及在培養操作過程中以半乳糖餵養，並加上温度更動之培養方法本發明之其它實施態樣係關於可使細胞存活力增加，並可延長產物之生產相，以及增加產物和產物之高品質（由測量涎酸含量來測定）的涉及二或多次温度更動的細胞培養方法。涉及二或多次温度更動之細胞培養過程和方法揭示於2002年12月23日提出之經共同受讓的專利申請案 U.S.序號第60/436，101號，以及與其共同提出之U.S.序號第10/ 號中，其內容倂爲本文中之參考資料，並進一步說明於下。這類溫度更動之培養方法可很方便地與本文中所描述之半乳糖餵養法一起使用，以產生高水準之最終產物品質和產量。 -28- (25) (25)1328614 根據本發明之温度更動培養方法，與不涉及温度更動或僅一次温度更動的培養方法相較下，在細胞培養期間之二或多次温度更動（宜爲向下之温度更動）的組合可使培養期終了時產製出高產量和品質之蛋白質產物。舉證說明；如實施例5中所示，與不涉及温度更動或僅一次温度更動的培養方法相較下，不論培養操作過程之總長度，具有二或三次温度更動的培養方法可增加蛋白質之產量（如：終點滴定濃度）。· 在本發明另外之實施態樣中，哺乳動物細胞之培養中係使用定時之多步驟温度更動來產製所需之蛋白質產物，尤其是醣蛋白產物。更合適的爲，細胞產製一種經重組產生之蛋白質、多肽或肽產物。然而，在某些情況中，細胞可主動產製或過度產製一種能依照本發明之方法操作來收成或回收之內生性或天然產物。如此處之說明，本發明之方法中可使用二或多次温度更動（宜爲在培養期間，於適當之定時間隔中進行的受控制的向下温度更動）來取得具有高涎酸含量之高蛋白質產量。經由在操作過程結束時測量終點滴定濃度和涎酸含量得知：根據本發明之細胞培養方法和過程（亦稱爲生產或醱酵操作過程），在培養操作過程中加上二或多次温度更動之方法所培養的細胞可在操作過程中產製高產量和高品質之產物。相對於不使用温度更動或至多一次温度更動的方法，本發明方法可取得高產量和高品質之蛋白質產物，不論該培養操作過程之總操作時間係進行約1 0 · 1 4天或超 -29- (26) (26)1328614 過I4天。再者，由於在培養過程中進行二或多次温度更動 ’細胞可在培養中維持實質上超過標準或初始生產相的時間。標準或初始生產相通常約爲6至]4天。在本涉及二或多次温度更動之培養方法的延長生產相中可達到增加產製高品質蛋白質和支撐細胞存活力。亦根據本發明之培養方法，細胞培養之總培養期可超過約10天，超過約Μ天，超過約21天，或超過約28天，宜爲約14至30天，或更久。例如，在含有二或多次温度更動之本發明的培養操作過程中，整個操作過程的長度可持續短如僅在第二次（或最後）温度更動後即結束（如：約14天）至長如約21-30天’或更久，宜爲約28天，或更久。在本發明之一種實施態樣中，延長之生產相係與包含本發明之細胞培養方法的多次温度更動有關。根據本發明之新細胞培養方法’第一次温度更動和第二、第三次或進一步之温度更動的組合不僅可使細胞培養在整個培養操作過程中產製高產量和高品質之產物，亦可使培養在整個操作過程中及/或整個延長之生產相中維持高細胞存活力，直到培養操作過程結束。在此培養操作過程中（包括延長之生產相）’蛋白質產物的滴定濃度增加，且可維持產物之高品質（由涎酸含量所測定出之特性）。更特別地，在一種其特殊實施態樣中，本發明包含可延長由培養細胞產製蛋白質之初始生產相（也就是包含約第6至1 4天之標準生產相被延長）的細胞培養方法。經由根據本發明’在培養操作過程中使用二或多次温度更動，可 -30- (27) (27)1328614 取得在約第〗4-21天之延長生產相。藉由在培養操作過程中之三次（或多次）温度更動，該培養操作過程可進—步延長爲約2卜2 8或30天，或更久，同時具有高產量之高品質蛋白質產物（如：高涎酸含量），（如：實施例5)。因此，本發明可很方便地組合根據本發明之二或多次温度更動細胞培養方法與包含在餵養介質中加入D -半乳糖之顧養攝生法。吾人發現：經由在餵養介質中加入D-半乳糖作爲其中一種成分，可在整個細胞培養過程中顯著增加產物之涎酸化程度，並可在培養操作過程結束時產製出高水準之涎酸化蛋白質。在本發明之一種特殊實施態樣中，細胞培養（或醱酵 )方法包含二步驟之向下温度更動，其中在全部培養操作過程期間，細胞係維持在三種不同温度下。在此實施態樣中’在取得最終蛋白質產物（並測量涎酸含量）前，總細胞培養期係持續超過約10天，更具體地說，約14至28天或更久，也就是，約二至三週或更久。例如，在這類二步驟方法中，從第0天至約第6天之初始培養期中，細胞係維持在約36°C至38t：的第一種温度下，宜爲37°C，或接近37°C » 然後，在從約第5天至第7天起，宜爲第6天，至約第1〇天時，培養温度係維持在約33 °C至35 °C的第二種温度下，宜爲34°C，或接近34°C。在34°C，或在接近34°C培養後，將温度進行第二次更換（第二次T-更動）至約3〗°C至33°C之第三種温度，宜爲32°C，或接近32°C。第二次T-更動係在/或約第6天至約第]4天，宜爲從約第1〇天至約第14天’ -31 - (28) (28)1328614 更合適的爲在/或約第]0天，此在不同實施態樣中可能係在標準生產相期間，在生長相期間，或在死亡相期間°較合適的爲，在第一次和第二次温度更動之間約增加4天，以增加4天更佳。細胞維持在3 2 °C，或接近3 2 °C之温度下直到全部培養操作過程終了，如：較約第1 〇天久，更具體地說，至約第12-18天，或至約第】4-18天，或至約第14-28或3 0天，或更久。在培養過程終止時，通常將蛋白質產物分離出及/或純化，如：若產物係分泌入培養介質中時，則從培養上淸液中分離出或純化。或者，在本發明之多次温度更動培養方法中，温度可首先根據培養相來降低。第一次温度更動宜在死亡相開始前進行。在一種實施態樣中，温度在細胞生長減緩的同時第一次降低。例如，當細胞不再爲指數生長相且培養係在靜止相，如：在培養之第6天或約第6天時，將温度從3 7 °C ，或接近37°C更換爲34°C，或接近34°C。此時，存活細胞密度已達到適合產製蛋白質（宜爲蛋白質生產增加）之細胞濃度，例如：約2·12χ106細胞/毫升，如：2-9xl06細胞/毫升，3-7xI06細胞/毫升，4-5xl06細胞/毫升，3-4x106細胞/ 毫升，2-4xl06細胞/毫升，4-6xl〇6細胞/毫升，6-8xl06細胞/毫升，8-]0xl06細胞/毫升’或〗0-12X106細胞/毫升。不希望受限於理論，細胞生長減緩可能與細胞培養介質之養分及/或特殊成分用盡有關（如：在介質中之氮的限制）。在另一種實施態樣中’第一次温度更動係在生長相之期間進行，例如，當存活細胞濃度爲約2-12x10 6細胞/毫升 (29) (29)I328614 時’如：2-9xl06細胞/毫升，3-7x〗〇6細胞/毫升，4·5χ】〇6 細胞/毫升，3-4xl〇6細胞/毫升，2-4χ106細胞/毫升，4_ 6χ106細胞/毫升’ 6-8χ106細胞/毫升，8-IOxlO6細胞/毫升，或10-12xl〇6細胞/毫升時。而在另一種包含二-步驟温度更動之培養過程的特殊實施態樣中係將細胞進行14天之培養操作，其中從第〇天至第6天’培養温度係維持在3 7乞，或接近3 7 〇c。從約第6 天至約第1 〇天時’培養温度係維持在3 4 t，或接近3 4 〇c ; 從約第1〇天至約第I4天，培養温度係維持在32 °C，或接近 3 2 °C。而另一種實施態樣中係將細胞培養約2 ]天，其中從第〇天至第6天，培養温度係維持在3 7 °C，或接近3 7 t ;從約第6天，至約第1 0天時，培養温度係維持在3 4 t，或接近34 °C ;從約第10天至約第21天，培養温度係維持在32°C ’或接近3 2 °C。而另一種實施態樣中係將細胞培養約2 8天，其中從第0天至約第6天，培養温度係維持在37°C，或接近3 7 °C ;從約第6天，至約第1 0天時，培養温度係維持在 34°C，或接近34°C ;從約第10天至約第28天，培養温度係維持在32°C，或接近321。

本發明亦包含其中該細胞培養方法含有三或多次温度更動的實施態樣。在一種涉及三-步驟温度更動之培養過程的實施態樣中，細胞起先係在約3 6 °C至3 8 °C的第一種温度下（宜爲3 7°C，或接近37Ό )培養約6天；然後，在指定之時間期，更動培養温度並將其維持在約33 °C至35 °C ’宜爲3 4它，或接近34°C ;然後，第二次將温度更動至約3】°C -33- (30) (30)1328614 至33°C ’宜爲32°C ’或接近32。〇。在32°C，或接近32°C之培養期後，第三次將温度更動至約29。(：至3]t，宜爲3〇。(： ’或接近3 0 °C ;然後將温度維持在3 0 t，或接近3 〇〇c，直到操作結束。在其它實施態樣中，進一步之温度更動，宜爲向下之溫度更動，可在該培養方法之第三次温度更動後進行。例如：第四次温度更動可在第三次温度更動後，於培養開始後的第I5天至第20天，或約第15天至第20天進行，宜爲約第18天。第四次之向下更換係將培養温度維持在28〇c至29 °C ’或接近2 8 °C至2 9 °C，宜爲約2 9 °C，並將培養操作增加至超過約28天.，如：約28至32天或更久，此時，可取得產物。由於根據本發明之二-步驟温度更動培養操作程序中 ’在本發明之多次温度更動方法中的第一次温度更動可在細胞實質上已停止生長，並已成爲靜止相（或類似於此）時開始進行。舉例說明，温度更動係在當存活細胞濃度爲約 2-12xl〇6細胞/毫升，如：2-9xl06細胞/毫升，3-7xl06細胞 /毫升，4-5xl06細胞/毫升，3·4χ106細胞/毫升，2·4χ106細胞/毫升，4-6χ106細胞/毫升，6-8χ106細胞/毫升，8· ΙΟχΙΟ6細胞/毫升，或10-12χ106細胞/毫升時進行。或者，第一次温度更動係在生長相期間進行’例如’當存活細胞濃度爲約2·]2χ〗06細胞/毫升’如：2-9x]06細胞/毫升’ 3-7xI06細胞/毫升，4-5X106細胞/毫升，3-4χ]〇6細胞/毫升， 2-4χ106細胞/毫升，4-6χ106細胞/毫升’ 6-8χ〗06細胞/毫升 (31) (31)1328614 ，8·1〇χ1〇6細胞/毫升，或1〇-12χ]〇6細胞/毫升時。在一種較佳之實施態樣中，多·步驟之細胞培養方法在約三至四週之培養期間（如：2〗-30天，或更久，宜爲28 天或更久）含有三次定時及經過控制之温度更動。舉例說明’三-步驟之温度更動方法含有從〇至約6天（宜爲6天）之初始培養期，此時間內’細胞係培養在3 7 t，或接近3 7 °C 。從約第6天，至約第1 0天時’細胞係培養在3 4 ，或接近3 4 °C。從約第1 〇天至約第1 4天，培養温度係維持在3 2乞 ’或接近32 °C ;而從約第I4天起，也就是至約第21天，至第30天’或更久’或至操作過程結束時，培養温度係維持在30 °C，或接近30 °C。因此，相對於僅有一次或無温度更動之約6-14天的標準生產相’在本發明之三-步驟温度更動的培養過程中，亦可將生產相延長成較約1 4天來得長的期間’以產生較高之蛋白質終點滴定濃度和較高之細胞存活力。有利的是，藉三-步驟T·更動方法可進一步將生產相及細胞存活力延長，也就是延長至約三週或更久，且具有高品質之產物（藉涎酸含量來測量）。在本發明的不同實施態樣中，第二次温度更動至32 eC ，或接近32 °C可使培養操作過程結束時有高產量和高品質之蛋白質，並可在持續超過約二週之操作過程中延長蛋白質之生產。二或多次之温度更動可穩定培養之細胞存活力緩慢下降（此情況可在培養前二週之間發生）。而另一次定在約二週，或二週前後期間進行之從3 2 t，或接近3 2 °C更換至30 °C，或接近30 t的温度更動可提供更延長之生產相 (32) (32)1328614 ，因此，可將細胞培養之生產相延長至培養操作過程結束 ’如：至約第2】天，至第30天，或更久，同時仍維持細胞存活力’且不損害所產製之產物品質（藉測量涎酸化來測定）。（見實施例5 ’表2和3)。額外之温度更動可將細胞生產延長至超過二或三次溫度更動之操作過程的生產相。在其它實施態樣中，本發明係針對涉及二或多次温度更動之（i)細胞培養方法，（ii)增加蛋白質生產之方法，宜與增加細胞存活力相關，（i i i)增進蛋白質產物之涎酸化的方法，（iv)增進細胞存活力的方法，或（v)延長蛋白質生產的方法’其包含：將表現所關注之蛋白質的宿主細胞在或接近3 7 °C，於可讓細胞生長之條件下培養一段時間；當培養在靜止相時，將細胞培養之温度降低，並將細胞在或接近34°C之第二種温度下培養；在約第6天至第14天之標準生產相期間’如：在或約培養開始後1 0天，再度將細胞培養之温度降底，並將細胞在或接近32 °C之第三種温度下培養，直到培養期結束。如此處中已提示者，培養期可包含超過10天，超過14天，超過21天，或超過28-30天之總操作時間。將細胞在3 2 °C培養後，也就是培養操作過程結束時可取得所產製之蛋白質產物，宜爲一種醣蛋白。在其它實施態樣中，本發明係針對涉及二或多次温度更動之（i)細胞培養過程，（ii)增加蛋白質生產之方法，宜與增加細胞存活力相關，（iii)增加蛋白質產物之涎酸化的方法，（iv)增加細胞存活力的方法，或（v)延長蛋白質生產的方法’其包含：將表現所需蛋白質之宿主細胞在或接 -36- (33) (33)1328614 近3 7 °C下，於可讓細胞生長之條件中培養一段時間；在約第5至第7天時，開始將細胞培養之温度降低，並將細胞在或接近34 °C之第二種温度下培養；在約第6天至第14天時，如：在或約培養開始後1 〇天，開始再度將細胞培養之温度降底，並將細胞在或接近32 °C之第三種温度下培養，直到培養期結束。如此處中已提示者，培養期可包含超過]〇天，超過14天，超過21天，或超過28-30天之總培養期。將細胞在3 2 °C培養後，也就是培養操作過程結束時可取得所產製之蛋白質產物，宜爲一種醣蛋白。在本發明的另一種實施態樣中，本發明提供還包含另一次向下更換温度的培養方法，其係在或約培養開始之第 Μ天，將温度從32 °C或接近321，更換至30 °C或接近30 °C ’直到培養過程結束，以藉此將培養期延長超過標準生產相。爲了在培養過程中延長蛋白質生產，和細胞存活力，此方法可包含第四次向下之温度更動，其係在或約培養開始之第15-19天時（宜爲第18天），將温度從30°C或接近30 °C ’更換至29°C或接近29°C，直到培養過程結束。本發明之温度更動通常係在或約培養期之第6天（此可能在培養之生長相期間或之後），然後，每次温度更動之間約增加4天（宜增加4天）。在某些實施態樣中，温度更動之時間可約在標準生產相開始（如：在或約第6天），中間（如：在或約第10天）和結束（如：在或約第14天）時。在根據本發明之培養過程和方法（其中係藉由多-步驟（如：二步驟 '三步驟或更多步驟）之温度更動略圖來增加所產製 -37 - (34) (34)1328614 之醣蛋白的最終滴定濃度和涎酸含量）中，至少二次定時之温度更動可使總培養操作過程進行超過1〇天，超過]4天，超過21天，或超過28天或更多天，但不會損害產物之最終滴定濃度和涎酸化。在根據本發明之培養方法中，二或多次之温度更動可支持培養之高細胞存活力，且與不含二或多次之温度更動，但具相同時間期之培養相較下，其在培養操作過程中可產製更多高滴定濃度和高品質之蛋白質。還有，二或多次之温度更動可使培養之生產相延長超過標準生產相，及/ 或超過不具温度更動或僅一次温度更動之培養的生產相。這類多步驟温度更動，如：二或更多步驟之温度更動可將細胞培養過程中，產製蛋白質產物時，介於滴定濃度（"終點滴定濃度"）和涎酸含量間普遍之交易情形減至最少。·因此，温度更動對增進"終點滴定濃度X涎酸含量”之數學乘積具正面效果（其可改良蛋白質產製過程）。在一種特殊之實施態樣中，本發明係針對（i)一種可同時增加和增進所指定之蛋白質醣蛋白產物之涎酸化的細胞培養方法，（ii) 一種可增加蛋白質生產，並增加和增進所指定之蛋白質醣蛋白產物之涎酸化的方法，或（iii)一種可增進細胞存活力，並增加和增進所指定之蛋白質醣蛋白產物之涎酸化的方法，此方法包含如上述之二或多次温度更動步驟，還包含以D-半乳糖餵養細胞（宜以每日爲基準），所使用之介質中宜補充D-半乳糖’使介質中持續含有可在培養操作過程結束時產生涎酸化程度增加之醣蛋白產 •38- (35) (35)1328614 物的D-半乳糖濃度。一種用於產製蛋白質之細胞培養方法，其包含：將可在細胞培養中產製所關注之蛋白質的宿主細胞在可使其產製蛋白質的條件下進行培養；以D-半乳糖饌養細胞；在接種後的一個時間將多陰離子性化合物加入細胞培養中。在一種特殊之實施態樣中，本發明係針對一種用來產製蛋白質的細胞培養方法，其包含：將可在細胞培養中產製所關注之蛋白質的宿主細胞在可使其產製蛋白質的條件下進行培養；將宿主細胞在3 7 °C或接近3 7 °C之温度及可使其生長的條件下，培養一段可讓細胞生長的時間期；將細胞在 34°C或接近34°C之第二種温度下培養·，將細胞在32°C或接近32°C之第三種温度下培養；以D-半乳糖餵養細胞。涉及二或多次温度更動之根據本發明的細胞培養方法的其它實施態樣在本發明的一種實施態樣中包含一種多次温度更動的培養方法’其包含將表現所關注之蛋白質的宿主細胞在或接@ 3 7 °C之第一種温度下，於可讓細胞生長的條件及時間下進行培養。在細胞生長期後，將細胞在或接近3 4 °C之第二種温度下培養，此時細胞生長已減緩，並接近靜止。之後’在培養之標準生產相期間，也就是在或約在第6天至 ’或約至第14天，將細胞在/或接近32 °C之第三種温度下培養。在培養過程終止時可取得所產製之蛋白質產物^ 根據本發明之一種較佳實施態樣，細胞係以分批餵養的方法培養’此方法包含數種相，也就是，一種生長相， -39- (36) (36)1328614 在此期間細胞係在或接近3 7 °C之第一種温度下培養：一種初始或標準生產相，在此期間細胞係在或接近3 4 °C之第二種溫度下，及在，或接近32 °C之第三種温度下培養，以提供延長之蛋白質生產相，其可包括在/或接近30 °C之第四種温度，然後，隨意地，再另外降低温度，如·_在/或接近29 °C。在本發明之二或多步驟温度更動之操作過程的情況中，蛋白質生產相延長係與二或多次之向下温度更動有關。此培養宜以每日或連續爲基準，以含D-半乳糖之饌養介質來餵養。如此處之說明，延長之生產相包含：在第 —次將温度從3 7 °C或接近3 7 °C更換成3 4 °C或接近3 4 °C之後，於不同的時間間隔下，將培養之温度連續降低二或多次。相對於無温度更動或僅更動一次温度者，經由執行這些涉及在培養操作過程中進行二或多次向下温度更動的方法可使蛋白質產量增加及取得高品質之產物（經由測量最終產物之涎酸含量來測定）。在細胞培養之生長相期間，如：從第〇天至約第6天，由於細胞在此指數細胞生長或對數相期間通常會快速分裂，因此在培養中之細胞密度會增加。在本發明某些觀點中所呈現之非-生長相關的細胞培養和蛋白質產製方法中，生長相期間（其中在合適之生長條件下，細胞之生長實質上達到最多）並沒有生產大量之蛋白質產物。因此，由於培養中之營養限制，細胞通常在約第4至6天進入靜止相，其中快速之細胞生長變成停滞及/或衰退。在這些培養方法中，當細胞生長實質上結束時（也就是約第6至約第1〇天 -40- (37) (37)1328614 )，蛋白質生產相開始。（實施例4)。根據一種較佳實施態樣之培養方法，當細胞在約第6 天達到靜止相時，將温度從3 7 °C或接近3 7 °C向下更換成3 4 °C或接近3 4 °C。之後，在接近第一次溫度更動（約第6天）和延長之生產相開始（約第]4天）之間的中點時，再度將溫度從34°C或接近34°C降低成32°C或接近32°C »第二次温度更動可穩定培養之細胞存活力（其通常會緩慢降低至約第 ]4天）；然後，開始延長之生產相（在約第Μ至約第21天，至約第30天，或更久，宜爲至約第21天，至約第28天，或更久）。如上述已說明者，可在培養操作過程之延長的生產相期間使用其它温度更動，如：第三、四或更多次。. 涉及以半乳糖餵養，並延遲加入多陰離子性化合物之培養方法本發明之其它實施態樣關於涉及延遲加入多陰離子性化合物之細胞培養方法。涉及延遲加入多陰離子性化合物的細胞培養方法揭示於與本申請案共同提出之共同-受讓的專利申請案U.S.序號第10/ 號中，其內容倂爲本文之參考資料，並進一步說明於下。這類延遲加入多陰離子性化合物的方法可與此處所描述之半乳糖餵養方法組合使用。根據本發明之實施態樣，提供一種涉及延遲加入多陰離子性化合物的方法，其包含在接種後的一個時間將多陰離子性化合物加入細胞培養中。與不加入多陰離子性化合物或在接種時加入多陰離子性化合物所觀察到者相較下， -41 - (38) (38)1328614 延遲加入多陰離子性化合物可增加細胞之存活力。因此，在一種實施態樣中，本發明係針對一種細胞培養方法，其包含：培養表現出所關注之蛋白質的宿主細胞 ;及在接種後的一個時間將多陰離子性化合物加入細胞培養中。已發現（見實施例8):當進行本發明時，細胞培養之細胞存活力百分比增加。細胞存活力百分比（亦稱爲細胞存活力）爲在總細胞數中之存活細胞的百分比。當一種條件（如：延遲加入多陰離子性化合物）存在時，若培養中之細胞存活力可較無該條件存在時維持高過一段時間，則表示此條件可增加細胞存活力。因此，在其它實施態樣中，本發明係針對（1 )—種細胞培養過程，及（2) —種增加培養中之細胞存活力的方法，其包含：培養表現出所關注之蛋白質的宿主細胞；及在接種後的一個時間將多陰離子性化合物加入細胞培養中；其中該細胞培養之細胞存活力增加。多陰離子性化合物包括，但不限於：硫酸葡聚糖（可從史格馬·歐德里克公司（Sigma-Aldrich)，密蘇里州聖路易市取得），肝素（可從史格馬-歐德里克公司取得），硫酸乙醯肝素（可從史格馬·歐德里克公司取得），硫酸甘露蜜，硫酸軟骨膠（可從史格馬-歐德里克公司取得），硫酸皮膚素（可從史格馬-歐德里克公司取得），硫酸角蛋白素 (keratan sulfate)(可從史格馬-歐德里克公司取得），玻尿酸化物（可從史格馬-歐德里克公司取得），聚（硫酸乙烯酯） -42- (39) (39)1328614 (可從史格馬-歐德里克公司取得）-鹿角膠（可從史格馬-歐德里克公司取得），和蘇拉明（可從史格馬-歐德里克 ;公司取得）。這些化合物可很容易地從列出之來源取得，或很容易地透過本技藝中之技術熟習人士已知的方式取得。這些化合物常以鹽之形式取得，包括但不限於：鈉鹽，但亦可以非鹽形式使用。多陰離子性化合物包括其所有形式’包括但不限於鹽的形式，如：鈉鹽。較佳之多陰離子性化合物爲多硫酸化之化合物，包括 ’但不限於：硫酸葡聚糖，肝素，硫酸乙醯肝素，硫酸聚戊醣’硫酸木呋喃滿（xylofuranan sulfate)，硫酸卡德蘭凝膠’硫酸卡德蘭凝膠半乳糖，硫酸卡德蘭凝膠阿拉伯糖，硫酸甘露蜜’硫酸軟骨膠，硫酸皮膚素，硫酸角蛋白素，聚（硫酸乙烯酯），/c-鹿角膠，和蘇拉明。以.硫酸葡聚糖最佳。硫酸葡聚糖可具有5,〇〇〇至500,000道耳頓之平均分子量。較佳之硫酸葡聚糖爲具分子量5〇〇〇道爾頓者。根據本發明’多陰離子性化合物係在接種後的一個時間加入，也就是，其不存在於基礎介質中，且在接種時不存在。較合適的爲’多陰離子性化合物係在培養第丨天或梢後加入。接種係在第0天進行。根據本發明=多陰離子性化合物可在具體指明之時間期中（如：接種後的一個時間），加入細胞培養中一次、二次、三次，或任何次數。可聯合使用—或多種多陰離子性化合物。也就是’任何指定之一次加入的多陰離子性化合物可包含加入一或多種其它多陰離子性化合物。類似地， -43- (40) (40)1328614 若加入多陰離子性化合物超過一次，則不同之多陰離子性化合物可在不同次中加入。其它化合物和物質，包括多陰離子性化合物，可在加入多陰離子性化合物之前、同時或之後加入培養中…可在或不在該具體指明之時間期中。在一種較佳之實施態樣中係單次，也就是一次加入多陰離子性化合物。在一種較佳之實施態樣中係加入一種多陰離子性化合物。根據本發明，多陰離子性化合物可藉任何方式加入細胞培養中。加入多陰離子性化合物之方式包括但不限於：溶解於水中、溶解於培養介質中、溶解於餵養介質中、溶解於合適之介質中，及以其被取得之形式加入。較合適的爲’將多陰離子性化合物溶解在水中加入。根據本發明，將多陰離子性化合物加入培養中，以使其在培養中之濃度達到合適的水準。非限制性之實施例有 :加入多陰離子性化合物，使其濃度爲1_ 1 000毫克/升，如：]-2 00毫克/升，或1-1 〇〇毫克/升。較合適的爲，加入多陰離子性化合物以使濃度爲2 5 -200毫克/升，以50-100毫克/升更佳，以50毫克/升或100毫克/升最加。根據本發明，在加入多陰離子性化合物後，培養可進行任何長之時間。培養操作時間可由本技藝中之技術熟習人士根據相關因素，如：可回收之蛋白質的量和品質，以及由細胞溶解所產生之上淸液中的細胞性物種（如：蛋白質和DNA(其將使所關注之蛋白質的回收工作較複雜））的污染程度來決定。 -44 - (41) (41)1328614 在本發明之增加細胞存活力的細胞培養過程和方法的特殊實施態樣中，多陰離子性化合物係在接種後，於初始死亡相開始前加入。較合適的爲，多陰離子性化合物係在接種後，於初始生長相的期間加入。更合適的爲，多陰離子性化合物係在初始生長相的後半段期間加入。更合適的爲，多陰離子性化合物係在或約在初始生長相結束時加入〇初始生長相係指無具體指明加入之多陰離子性化合物存在時所觀察到之生長相。初始死亡相係指無具體指明加入之多陰離子性化合物存在時所觀察到之死亡相。當初始死亡相開始時，初始生長相可能結束，或者是，在初始生長相和初始死亡相之間可能有任何時間長之靜止相。在一特殊實施態樣中，在其中該初始生長相係從第0 天至第6天，而初始死亡相係從第7天開始之細胞培養中，在一種特殊實施態樣中多陰離子性化合物係在接種後及第 7天前的一個時間加入。在一種特殊實施態樣中，多陰離子性化合物係在接種後及第6天之前加入。在一種特殊實施態樣中，多陰離子性化合物係在第1和第6天之間加入。在另一種特殊實施態樣中，多陰離子性化合物係在第4、5 或6天加入。在其它特殊實施態樣中，多陰離子性化合物係在約第6天，或第6天加入。已發現（見實施例8和1 2):當多陰離子性化合物在接種後及初始死亡相開始前的一個時間加入時，生長相可延 -45 - (42) (42)1328614 長超過初始生長相。延長超過初始生長相之生長相具有較初始生長相來得長之期間’也就是長過未加入多陰離子性化合物時所觀察到之生長相。較合適的爲，該延長之生長相可取得較初始生長相期間取得之尖峰存活細胞密度來得高的存活細胞密度。因此，在其它實施態樣中’本發明係針對：（1) 一種細胞培養方法，及（2)—種用於延長細胞培養之生長相的方法，其包含：培養表現所關注之蛋白質的宿主細胞；及在接種後，於初始死亡相開始前的一個時間，將多陰離子性化合物加入細胞培養中；其中該生長相被延長。在更特殊之實施態樣中，本發明係針對：（1) 一種細胞培養方法，及（2)—種用於延長細胞培養之生長相的方法，其包含 :培養表現所關注之蛋白質的宿主細胞；及在接種後，於初始生長相的期間將多陰離子性化合物加入細胞培養中；其中該生長相被延長。在更特殊之實施態樣中，本發明係針對：（1)一種細胞培養方法，及（2) —種用於延長細胞培養之生長相的方法，其包含：培養表現所關注之蛋白質的宿主細胞；及在初始生長相的後半段期間將多陰離子性化合物加入細胞培養中；其中該生長相被延長。在其它特殊之實施態樣中，本發明係針對：（1 ) 一種細胞培養方法 ’及（2) —種用於延長細胞培養之生長相的方法，其包含 :培養表現所關注之蛋白質的宿主細胞；及在或約在初始生長相結束時將多陰離子性化合物加入細胞培養中；其中該生長相被延長。 -46 - (43) (43)1328614 生長相可延長至超過初始生長相期間至任何時間長。僅只於用來例示說明：生長相可延長天、2_9天、3_8 天’或約5天。較合適的爲，生長相延長一或多天，更合適的爲，延長二或多天，再更合適的爲，延長三或多天，最合適的爲，延長四或多天。例如：在實施例6中，生長相係延長至第11天，其中初始生長相延長至第6天。因此 ’在實施例8中，生長相已延長超過初始生長相5天。延長之生長相後面可接續著死亡相或靜止相。同樣的，初始生長相後面可接續著死亡相或靜止相。現已發現（見實施例8和〗2):當多陰離子性化合物在接種後及初始死亡相開始的一個時間加入時，死亡相之起點可延遲至超過初始死亡相之起點，也就是延遲至超過未加入多陰離子性化合物時所觀察到之死亡相的起點。其起點延遲之死亡相係在較初始死亡相來得晚的時間開始。因此，在其它實施態樣中，本發明係針對：（1)—種細胞培養過程’及（2)—種用於延遲細胞培養之死亡相的過程’其包含：培養表現所關注之蛋白質的宿主細胞；及在接種後，於初始死亡相開始前的一個時間，將多陰離子性化合物加入細胞培養中；其中該死亡相之起點被延遲。在更特殊之實施態樣中，本發明係針對：（1 ) 一種細胞培養過程，及（2) —種用於延遲細胞培養之死亡相的過程，其包含：培養表現所關注之蛋白質的宿主細胞；及在接種後，於初始生長相的期間將多陰離子性化合物加入細胞培養中；其中該死亡相之起點被延遲。在更特殊之實施態樣 -47 - (44) (44)1328614 中，本發明係針對：（I)一種細胞培養過程’及（2)—種用於延遲細胞培養之死亡相的過程，其包含：培養表現所關注之蛋白質的宿主細胞；及在初始生長相的後半段期間將多陰離子性化合物加入細胞培養中；其中該死亡相之起點被延遲。在其它特殊實施態樣中，本發明係針對一種用於延遲細胞培養之死亡相的過程，其包含：培養表現所關注之蛋白質的宿主細胞；及在或約在初始生長相結束時將多陰離子性化合物加入細胞培養中；其中該死亡相之起點被延遲。死亡相之起點可延遲至任何之時間長。僅只於用來例示說明：死亡相之起點可延遲卜10天、2-9天、3-8天，或約5天。較合適的爲，死亡相之起點延遲一或多天，更合適的爲，延遲二或多天，再更合適的爲，延遲三或多天，最合適的爲，延遲四或多天。在另一種本發明上述之增加細胞存活力的細胞培養過程和方法的特殊實施態樣中，多陰離子性化合物係在接種後，於初始死亡相期間的一個時間加入。已發現（見實施例9和]〇):當多陰離子性化合物係在初始死亡相的期間加入時，可遏止死亡相。遏止死亡相意指將在未加入多陰離子性化合物時所觀察到之存活細胞密度減少的情形停止—段時間。遏止效果可在加入多陰離子性化合物後立即開始，或稍後開始。當死亡相被遏止時，後面可接續著生長相或靜止相。當然，培養最終將會再進入一死亡相。 -48- (45) (45)1328614 因此，在其它實施態樣中，本發明係針對：（1) 一種細胞培養過程，及（2)—種用於遏止細胞培養之死亡相的過程，其包含：培養表現所關注之蛋白質的宿主細胞；及在初始死亡相的期間將多陰離子性化合物加入細胞培養中 :其中該死亡相被遏止。死亡相可被遏止至任何長之期間，直到再度進入死亡相。僅只於用來例示說明：死亡相可被遏止1-20天' 2-18 天、5-15天，或8-13天》較合適的爲，生死亡相被遏止一或多天，更合適的爲，遏止二或多天，再更合適的爲，遏止三或多天，最合適的爲，遏止四或多天β死亡受遏止的情況並不一定有連續性，也就是，在二區固定或增加存活細胞密度的範圍之間，可能有存活細胞密度”局部"減少的情形。細胞培養過程（尤其是非連續性過程）之操作時間通常受限於剩餘之存活細胞密度（其在死亡相期間降低）。較長之操作時間可取得較高之產物滴定濃度。因此，儘可能延遲死亡相，包括延長生長相，或遏止死亡相是有需要的。產物品質之考量亦爲延遲或遏止死亡相的動機之一，因爲細胞死亡會釋出涎酸酶至培養上淸液中，此可降低所表現之蛋白質的涎酸含量。蛋白質之純化考量亦爲延遲或遏止死亡相的動機。存在於培養中之細胞碎片和死細胞內容物對於培養操作終了時分離及/或純化蛋白質產物的能力有不良的影響。在特殊之實施態樣中係將此處所描述之任何涉及二或 -49- (46) (46)1328614 多次温度更動的細胞培養方法和此處所描述之任何涉及延遲加入多陰離子性化合物的細胞培養方法一起用於細胞培養中。在特殊之實施態樣中，本發明係針對：（i)一種細胞培養方法，及（i i) 一種用於增加細胞存活力的方法，其包含：a)將表現所關注之蛋白質的宿主細胞在，或接近3 7 °C下，於可讓細胞生長之條件中培養一段時間；b)從約第 5至7天開始，將細胞培養之温度降低，並將細胞在或接近 34 °C之第二種温度下培養；c)從約第6天至第14天開始，將細胞在或接近32 °C之第三種温度下培養；及d)在接種後的一個時間，將多陰離子性化合物加入細胞培養中。在一種特殊之實施態樣中，本發明係針對一種包含如上述之延遲加入多陰離子性化合物及進一步包含以D -半乳糖餵養細胞的細胞培養方法。在另一種特殊之實施態樣中，本發明係針對一種包含如上述之延遲加入多陰離子性化合物、如上述之二或多次温度更動及以D -半乳糖餵養細胞的細胞培養方法。因此，在一種特殊之實施態樣中，本發明係針對用於產製蛋白質之細胞培養方法，其包含：將可在細胞培養中產製所關注之蛋白質的宿主細胞在可產製蛋白質之條件下培養；以D_半乳糖餵養細胞；在接種後的一個時間，將多陰離子性化合物加入細胞培養中。在另一種特殊之實施態樣中，本發明係針對用於產製蛋白質之細胞培養方法，其包含：將可在細胞培養中產製所關注之蛋白質的宿主細胞在可產製蛋白質之條件下培養；將宿主細胞在’或接近3 7 °C下，於可讓細胞生長之條件中培養 -50- (47) (47)1328614 —段可讓細胞生長的時間；將細胞在或接近3 4 °C之第二種温度下培養；將細胞在或接近32 °C之第三種温度下培養；以D ·半乳糖餵養細胞；及在接種後的一個時間，將多陰離子性化合物加入細胞培養中。與醣蛋白之純化和分析相關的技術和程序在本發明所包含之培養方法中，由細胞所產製之蛋白質通常係依需要在全部細胞培養期結束時，利用本技藝中所已知並使用之分離和純化方法來收集、回收、分離，及 /或純化，或大體上純化。較合適的爲，將從培養細胞分泌出的醣蛋白從培養介質或上淸液中分離出；然而，亦可利用本技藝中所已知並使用之方法及下述之進一步說明，從宿主細胞，如：細胞之溶胞化物，回收蛋白質。若需要時，可將含有藉由本發明方法所產製之醣蛋白的複合碳水化合物藉由習知之碳水化合物分析技術進行例行分析。例如•本技藝中所熟知之技術，如：可揭露出終端甘露糖，或其它糖類，如：半乳糖之比例的外源凝集素點墨法。利用無水肼或酶的方法將糖類從蛋白質釋出，及經由離子交換色層分析、尺寸排除色層分析或本技藝中所熟知之方法來將寡醣類分級分離的方法可用來確認由涎酸終止之一·、二-、三·或四-觸角形寡醣。亦可在以神經胺酸酶去除涎酸的處理之前和之後測量醣蛋白之pi。以神經胺酸酶處理後，pi增加表示在醣蛋白上有涎酸存在。在表現出之蛋白質上的碳水化合物構造 -51 - (48) (48)1328614 通常係以N-連接或〇·連接之碳水化合物型式產生。N.連接或〇 ·連接碳水化合物之主要不同處在於其核心構造。 N-連接之醣化作用係指該碳水化合物部分係經由GlcNAc 連接至肽鏈中的天門冬素殘質。N-連接之碳水化合物類均包含—共通之 Manl-6(Man]-3)ManB]-4GlcNAcfil· 4GlcNAcfl-R核心構造，其中在此核心構造中之r代表— 天門冬素殘質。所產製之蛋白質的序列將包含一天門冬素-X-絲胺酸、天門冬素-X-蘇胺酸和天門冬素-X-半胱胺酸，其中X爲除了脯胺酸外之任何胺基酸。相反地，0·連接之碳水化合物類的特徵爲一共通之連接蘇胺酸或絲胺酸之羥基團的GalNAc核心構造。在N-連接和〇-連接之碳水化合物類中，最重要的爲複合之N-連接和〇-連接碳水化合物類。這類複合之碳水化合物類含有數種觸角形構造。一 ·-、二-、三-和四-外構造對加上終端涎酸而言是很重要的。這類外鏈構造可提供額外位置給含有該蛋白質產物之碳水化合物類的特殊糖類和連接部分〇所產生之碳水化合物類可藉本技藝中所已知之任何方法進行分析。本技藝中已知有數種用於醣化分析的方法，並可用於本發明的內容中。這些方法提供關於連接所產製之肽的寡醣的鑑定方法和組成之資訊。可與本發明銜接之碳水化合物的分析方法包括，但不限於：外源凝集素色層分析法；HPAEC-PAD，此係根據電荷，利用高pH陰離子交換色層分析法來將寡醣類分開；NMR ;質譜分析； -52- (49) (49)1328614 HPLC; GPC;單醣組成分析；和依序之酶分解。另外，用於釋出寡醣的方法爲本技藝所已知和使用。這些方法包括：1)酶的方法，其通常利用肽-N-糖苷酶F/ 內-点-半乳糖苷酶進行；2)点排除法，利用苛鹼環境來主要釋出0-連接之構造；及3)利用無水阱來釋出N-連接和〇-連接之寡醣類二者的化學方法。分析可利用下列步驟進行：1 ·將樣本對去離子化水進行透析，以移除所有的緩衝鹽類，再進行凍乾。2.以無水肼釋出完整的寡醣鏈。3. 以無水甲醇性HC1處理完整的寡醣鏈，以釋出爲0-甲基衍生物型式之個別單醣。4)將任何之一級胺基團N-乙醯基化。5_進行衍生以產生全-0 -三甲基矽烷基甲基糖苷。6. 在CP-SIL8管柱上，藉毛細氣體-液體色層分析法（GLC)將這些衍生物分開。7 .藉由GLC之持留時間和質譜學，與已知標準進行比較，以鑑定個別之糖苷衍生物。8 .藉由具內標準（13-0_甲基-D-葡萄糖）之FID來定量個別之衍生物〇中性和胺基糖類可藉由高效能陰離子交換色層分析，加上脈衝電流偵測（HPAE-PAD醣系統；廸奈（Dionex)公司 )來測定β例如：可經由在1 00°C下，於20%(體積/體積）三氟醋酸中水解6小時來釋出糖類。然後，經由凍乾法或以 Speed-Vac(沙文（Savant)儀器）將水解產物乾燥。然後，將殘質溶解在1%醋酸鈉三水合物溶液中，並在HPLC-AS6管柱上分析（依 Anumula et al·，1991, Anal. Biochem·, 195 : 269-280中之描述）。 -53- (50) (50)1328614 或者，可進行免疫點墨碳水化合物分析。在此程序中 ’蛋白質-結合之碳水化合物類係利用市售之多醣偵測系統（寶林格（Boehringer))來偵測，此係根據 Haselbeck et al-(] 993 Glycocojugate J·，7: 63)所描述之氧化免疫點墨程序來進行。依照該製造者所建議之染色計劃進行，但將蛋白質轉移至聚亞二氟乙烯膜，而不轉移至硝基纖維素膜，阻斷緩衝液中含有5%在lOmMTris緩衝液（ΡΗ7·4)中之牛血淸白蛋白，以及0 · 9 %氯化鈉。以連接一鹼性磷酸鹽共軛物之抗-異羥基洋地黃毒苷抗體（寶林格）（此抗體係在Tris 緩衝之生理食鹽水中稀釋1: 1000)，並使用在l〇〇m M Tris 緩衝液，ρΗ9·5(含100mM氯化鈉和50mM氯化鎂）中之磷酸酶受質，4_硝基藍四唑鐽氯化物，0.03%(重量/體積）和 5 -溴-4 ·氯-3 -吲哚基·磷酸化物，〇 . 〇 3 % (重量/體積），來進行偵測。含醣之蛋白質帶通常可在約]0 - 1 5分鐘內看到。與蛋白質結合之碳水化合物亦可經由以 -N -糖苷酶 F分解來分析。根據此程序，將殘質懸浮在1 4微升之含 0.18%SDS、18mM；S·毓醇、90mM 磷酸化物、3.6mM EDTA的緩衝液（pH8_6)中，並在100°C加熱3分鐘。在冷卻至室温後，將樣本分成二等份。一份（未進一步處理）作爲對照組。使另一份能適應約1%NP-40去垢劑，再加入〇.2 單位之肽-N-糖苷酶F(寶林格）。將二份樣本均在37°C加溫 2小時，然後藉SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法分析。另外，藉習知方法評估醣蛋白產物之涎酸含量。例如 :可藉由直接比色法來分別測定涎酸（Ya^ et al.: 1 9 8 9s -54 - (51) (51)1328614

Anal. Biochem·: 1 79: 3 3 2 -3 3 5 )，較合適的爲使用三份樣本。另—種測定涎酸的方法涉及依Warren et al.，1 9 5 9(J. Bio丨· Chem·，234: 1971-1975)之描述，使用硫代巴比土酸 (T B A)測定。而另一種方法涉及局效能色層分析法，如： H . K. Ogawa et a 1., 1 9 9 3 , J . Chromatography, 612 : 145-149 中之描述。舉例說明，在醣蛋白之回收' 分離及/或純化方面，將細胞培養介質或細胞溶胞化物離心，以去除顆粒細胞和細胞碎片。藉合適之純化技術，將所需多肽產物分離或純化，以使其不受可溶性蛋白質和多肽污染。下列程序提供示範性而非限制性之蛋白質純化方法：在免疫親和性或離子-交換管柱上進行分離或分餾；乙醇沈濺法；逆相HP LC ;在樹脂，如：矽石，或陽離子交換樹脂，如：DEAE上進行色層分析；色層聚焦法；SDS-PAGE;硫酸銨沈濺法 ;利用’如：聚葡糖凝膠（Sephadex)G-75、瓊脂糖凝膠進行凝膠過濾；用於去除免疫球蛋白污染物之蛋白質A瓊脂糖凝膠色層分析法；等。亦可使用其它添加物，如：蛋白酶抑制劑（如：PMSF或蛋白酶K)來抑制純化期間之蛋白水解性降解反應。技術熟習人士將會了解用於純化指定之所需肽的方法可能需要一些能使那些以重組方式表現在細胞培養中之多肽產生改變的修改。那些可用來選擇碳水化合物類及增進涎酸的純化程序爲特別佳者，如：利用陽離子-或陰離子-交換樹脂之離子-交換軟凝膠色層分析或 HPLC ’其中可收集到更多之酸性分液。

-55- (52) 1328614 細胞、蛋白質及細胞培養

在本發明之細胞培養過程或方法中，細胞可維持在本技藝中所習知之不同的細胞培養介質也就是：基礎培養介質中。例如：這些方法可應用至維持在細胞培養介質（其可補充養分，等）中之大量細胞。通常細胞培養介質 ”（亦稱爲”培養介質"）一詞在本技藝之技術熟習人士的認知中係指一種營養介質，其中可生長細胞（宜爲動物或哺乳動物細胞）’且其通常可提供至少一或多種來自下列群體之成分：能量來源（通常爲碳水化合物的形式，如：葡萄糖）；所有必須胺基酸，通常爲二十種基礎胺基酸，加上半眺胺酸；維他命及/或其它有機化合物，其通常需要低濃度；脂質或游離脂肪酸’如：亞麻油酸；和微量元素，如：無機化合物或天然元素，其通常需要非常低之濃度，通常係在微莫耳範圍內。細胞培養介質亦可經過補充，以含有多種隨意之成分，如：荷爾蒙和其它生長因子，如：胰島素、運鐵蛋白、表皮生長因子、血淸，等；鹽類，如 :鈣、鎂和磷酸鹽，及緩衝液，如：HEPES ;核苷和鹽基類’如：腺苷酸、胸腺核苷、次黄嘌呤；及蛋白質和組織水解產物’如：水解之動物蛋白質（蛋白腺或蛋白腺混合物，此可從動物副產品、純化之明膠或植物物質取得）；抗生素，如：正大黴素；及細胞保護劑，如：普朗尼 (Pluronic)多醇（普朗尼F68)。較合適的爲不含血淸及不含動物源之產物或成分的細胞營養介質。如本技藝中之人士所察知者，動物或哺乳動物細胞係

-56- (53) 1328614

培養在適合培養特殊細胞的介質中，且此可由本技藝之技術熟習人士來決定，不需做過度之實驗。可使用市售之介質，包括，如：最低必須介質（M i n i m a 1 E s s e n t i a ] Medium)(MEM，史格馬公司，密蘇里州聖路易市）；漢氏 (Ham's)Fl 0介質（史格馬公司）；杜白可氏修改之伊果氏介質（Dulbecco’ s Modified Eagles Medium)(DMEM，史格馬公司）；RPMI- 1 64 0介質（史格馬公司）；海克隆（HyClone) 細胞培養介質（海克隆公司，猶他州洛根市）；及化學-限定（CD)介質，此係爲特殊細胞型態調配，如：CD.-CHO介質（因維特金（Invitrogen)公司，加州卡斯貝市）。本技藝中之人士了解，且可利用例行技術將上述之補充要素或成分，包括：隨意之要素，依需要並以合適之濃度或量加入前述示範介質中。

另外，適合本發明方法之細胞培養條件爲那些常用且已知之用於細胞之分批培養、分批-餵養，或連續培養者，而要注意的項目除了温度外，還有：P Η値，如：約6.5 至約7.5 ;溶解的氧（〇2)，如：介於約5-90%之空氣飽和及二氧化碳（C02)、攪動及濕度。說明但非用來限制之實施例爲：適合用於本發明之分批-餵養方法中的細胞培養介質包含修改之CD-CHO介質（因維特金公司，加州卡斯貝市），和一種餵養介質，宜含有D -半乳糖。（如：實施例1 和實施例3)。動物細胞，哺乳動物細胞、培養的細胞、動物或哺乳動物宿主細胞 '宿主細胞、重組細胞' 重組宿主細胞，等 -57- (54) (54)1328614 全部爲可根據本發明方法培養之細胞的名稱。這類細胞典型上爲從哺乳動物取得或衍生之細胞株，且當其被置於含合適之養分及/或生長因子之介質中的單層培養或懸浮液培養中時’其可生長並存活。用於長成及維持特殊細胞培養所需要之生長因子和養分可由相關技藝中之技術人士很容易地根據經驗來決定，如：依下列文獻中之描述： Barnes and Sato, ( 1 980，cell,22 : 649) ； Mammalian Cell Culture，Ed.J.P.Mather, Plenum Press，NY, 1984 ;和美國專利第5,7 2 1 _，1 2 1號。可根據本發明之方法培養的細胞型態有多種。這些細胞通常爲可表現及分泌，或可經分子工程處理以表現及分泌大量之所關注的特殊蛋白質（更特別的爲醣蛋白）至培養介質中的動物或哺乳動物細胞。吾人了解：由宿主細胞所產製之醣蛋白對宿主細胞可爲內生性或同質性。或者，較合適的爲，醣蛋白對宿主細胞爲異源性，也就是外來性，例如：由中國大頰鼠卵巢（CH0)宿主細胞所產製和分泌之人類醣蛋白。較合適的情況還有，哺乳動物醣蛋白（也就是那些最初係從哺乳類有機體取得或衍生者）係藉由本發明方法取得，且宜由細胞分泌至培養介質中。可藉本發明方法很容易地產製之哺乳動物類醣蛋白的實例包括，但不限於：細胞活素、細胞活素受體、生長因子（如：EGF * HER-2 ' FGF- a ' FGF-β、TGF- a、TGF-β 、PDGF、IGF-1、IGF-2、NGF、NGF-β);生長因子受體 ’包括：融合或嵌合之蛋白質。其它非限制性實施例包括 -58- (55) (55)1328614 :生長激素（如：人類生長激素、牛生長激素）；胰島素（如：胰島素A鏈和胰島素B鏈）' 前胰島素；紅血球生成素（EPO);群落刺激因子（如：G-CSF、GM-CSF、M-CSF) ;間白素（如：IL-1至IL-2);血管內皮生長因子（VEGF)及其受體（VEGF-R);干擾素（如：IFN-α、β或r);腫瘤壞死因子（如：TNF-α和TNF-β)及其受體，TNFR-1和TNFR-2 ;血小板生成素（TPO);凝血酵素：腦部促尿鈉排泄 (BNP);凝血塊因子（如：第VIII因子、第IX因子' 馮維布蘭德氏因子，等）；抗-凝血塊因子；組織胞漿素原活化劑 (TPA)-如：尿激素或人類尿或組織型態TPA ;濾泡刺激激素（FSH);黃體化激素（LH):抑鈣素；CD蛋白質（如： CD3 ' CD4、CD8、CD28' CD19 > 等）；CTLA 蛋白質（如 :CTLA4) ; T-細胞和B-細胞受體蛋白質；骨成形蛋白質 (BNPs，如：BMP-1、BMP-2 ' BMP-3，等）；神經營養因子，如：由骨衍生之神經營養因子（BDNF);神經營養素，如：3-6腎活素；風濕樣因子；RANTES ;白蛋白；弛緩素；巨噬細胞抑制蛋白質（如：MIP-1、MIP-2);病毒蛋白質或抗原；表面膜蛋白質；離子道蛋白質；酶；調節蛋白質；抗體；免疫調節蛋白質（如：HLA、MHC、B7 —族）；回歸受體；轉運蛋白質；過氧化物岐化酶（SOD); G -蛋白質偶合之受體蛋白質（GPCRs);神經調節蛋白質；阿茲海默氏症相關之蛋白質和肽類（如：Α-β)及其它本技藝中已知者。融合蛋白質和多肽類、嵌合蛋白質和多肽類，以及前述任一項蛋白質和多肽類之片段或部分，或突變體、變 -59 - (56) 1328614 異體或同系物亦包括在可由本發明方法產製之合適蛋白質、多肽及肽類中。適合用於庇護、表現及產製用於接下去之分離及/或純化作用中之蛋白質的動物或哺乳動物宿主細胞之非限制性實例包括：中國大頰鼠卵巢細胞（CHO)，如：（^0-K 1 (ATCC CCL-6 ] )，DG44(Chasin et al., 1 986 > Som > Cell Molec.Genet. ， 1 2 : 5 5 5 - 5 5 6 ; Kolkekar et al. ,1 997 ，

Biochemistry，36: 10901-10909 ；和 WO 0 1 /923 3 7 A2)，二氫葉酸還原酶陰性 CHO細胞（CHO/DHFR，Urlaub and Chasin，1 9 8 0，Proc.Natl.Acad.Sci.USA j 77 : 4 2 1 6)，和 dp 12.CHO細胞（U.S_專利第5,72I，121號）；藉SV40轉形之猴腎 CV1 細胞（COS 細胞，COS-7，ATCC CRL-1651);人類胚胎腎細胞（如：用於在懸浮液培養中生長之293細胞，或分殖的 293 細胞，Graham et al.,1977, J. Gen. Virol·，36 :59);幼大頰鼠腎細胞（BHK， ATCC CCL-10);猴腎細胞（CV1， ATCC CCL-70)；非洲綠猴腎細胞（VERO-76， ATCC CRL- 1 5 8 7; VERO， ATCC CCL-81)；老鼠足細胞 (TM4， Mather, 1 980，Biol. Reprod.，2 3 : 243 -2 5 1 );人類子宮頸癌細胞（HELA， ATCC CCL-2);犬腎細胞（MDCK ， ATCC CCL-34)；人類肺細胞（W138， ATCC CCL-75) •，人類肝細胞（HEP-G2， HB-8065);老鼠乳腺瘤細胞 (MMT 060562， A T C C C C L-5 1);水牛大鼠肝細胞（B R L 3 A，ATCC CRL- 1442) ； TRI 細胞（M a t h e r，1 9 8 2，A η n a 1 s NY Acad Sci., 3 8 3 ： 44-6 8) ； MCR5 細胞；FS4細胞。宜爲 -60- (57) (57)1328614 CHO細胞，尤其是CHO/-DHFR細胞。適合在本發明之方法和過程中培養的細胞可含有，如 :經由轉形、轉染、感染或注射等方法引入之表現載體（構造物）’如：質體，等，該表現載體中庇有編碼用於在培養過程中表現及產製之蛋白質的編碼序列，或其部分。這類表現載體含有用於轉錄及轉譯插入之編碼序列的必須要素。本技藝中之技術熟習人士所熟知和實行之方法可用來構造含有編碼所產製之蛋白質和多肽的序列，以及合適之轉錄及轉譯控制要素的表現載體。這些方法包括：試管內重組D N A技術、合成技術及活體內遺傳重組。這類技術說明於：J.Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning， A Laboratory Manual > Cold Spring Harbor Press ， PUinview ’ N.Y.及 F.M.Ausubel et al·，1989，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons， New York，N.Y。控制要素，或調節序列爲那些與宿主細胞蛋白質交互作用，以進行轉錄及轉譯之載體非-轉譯區，如：增强因子、啓動因子、51和3’未轉譯區。這類要素之強度及特異性可有不同。根據所使用之載體系統和宿主細胞，可使用任何數目之合適的轉錄及轉譯要素，包括組成性及可誘導之啓動因子。在哺乳動物細胞系統中，以來自哺乳動物基因或哺乳動物病毒者較佳。用於蛋白質表現系統中之構造物係經過設計，以含有至少一啓動因子、增强因子序列（對哺乳動物表現系統而言爲隨意含有）及其它爲了適當轉 (58) (58)1328614 錄及調節基因表現時所必須或需要之序列（如：轉錄起始及終止序列 '複製位置之起點、多腺苷形成序列，如：牛生長激素（BGH)多腺苷酸序列》如本技藝中之技術熟習人士可察知者，如何選擇可用來適當地轉錄、表現及分離在真核（如：哺乳動物）表現系統中所產製之蛋白質的合適載體的方法已爲吾人所知，如 :質體，要素，且可由本技藝中之技術人員例行決定及使用。由根據本發明方法所培養之細胞來表現蛋白質的作用可受啓動因子之控制，如：病毒（如：巨細胞病毒（CMV) 、勞斯氏肉瘤病毒（RSV))啓動因子，磷酸甘油激酶 (PGK)、胸腺核苷激酶（TK))，或α-肌動蛋白啓動因子》再者’經調節之啓動因子可藉特殊化合物或分子來提供誘導力’如：老鼠乳腺瘤病毒（MMTV)之腎上腺促糖皮質激素反應要素（GRE)可由腎.上腺促糖皮質激素誘出（V.. Chandler et al.，1983,Cell, 33: 489-499)。還有，若必須或需要時，可使用組織·特異性啓動因子或調節要素（G. Swift et al.，1 984，CeIl, 3 8 : 63 9-646)。表現構造物可藉由多種本技藝中之技術熟習人士所已知的基因轉移方法來引入細胞中，例如：磷酸鈣共同沈澱法、脂粒轉染法 '顯微注射法、電穿孔法及感染或病毒轉導法。對於方法之選擇係在本技藝中之技術熟習人士的能力範圍內。本技藝中之技術熟習人士淸楚明白可將一或多種帶有DNA序列（用於在細胞中表現者）的構造物轉染入 '細胞中’以接著在細胞中產製出及/或取得表現產物。 (59) (59)1328614 在一種特殊觀點中，本發明之蛋白質-表現哺乳動物細胞中較適合使用包含適當之控制和調節序列的哺乳動物表現系統。常用於哺乳動物表現載體中之真核控制序列包括可與哺乳動物細胞相容之啓動因子和控制序列，例如：巨細胞病毒（CMV)啓動因子（CDM8載體）和鳥肉瘤病毒 (ASV)，（ttLN)。其它常用之啓動因子包括來自猴子病毒 40(S V40)之早期和晚期啓動因子（Fiers et al.， 1973，N at ure，273: 113)，或其它病毒啓動因子，如：那些從多瘤' 腺病毒2及牛乳頭狀瘤病毒衍生者。亦可使用可誘導之啓動因子，如：hMT Π (Karin et al·， ]982，Nature, 299 : 7 97 - 8 02)。適合真核宿主細胞之表現載體的實施例包括，但不限於：用於哺乳動物宿主細胞之載體（如，B P V · 1，p H y g， pRSV，pSV2’ pTK2(曼尼亞提斯公司（Maniatis)); pIRES( 克隆泰克公司（Clontech)) ; pRc/CMV2，pRc/RSV， pSFVl(生命技術公司）；pVPakc載體，PCMV載體，PSG5 載體（史特哈金公司（Stratagene))，逆轉錄病毒載體（如， pFB載體（史特塔金公司（Stratagene))，pCDNA-3(因維特金公司（Invitrogen)’腺病毒載體；腺-相關之病毒載體，桿狀病毒載體、酵母載體（如：pESC載體（史特塔金公司）），或前述中之任一項的改良型。載體亦可含有用於讓基因表現最優化之啓動因子區序列的增強因子序列上游或下游。亦可在重組載體（如：質體）中使用可選擇之標記來提供抗性給庇住（較合適的情況爲已穩定地嵌入）該載體之細 -63 - (60) (60)1328614 胞，以使其可在合適之選擇介質中被選出。可使用之系統有多種，包括但不限於：單純疱疹病毒胸腺核苷激酶 (HSV TK) (Wigler et al.，1977，Cell, 11 : 223)，次黃嘌呤-鳥曙啥隣酸核糖轉移酶（HGPRT) (Szybalska and Szybalski et al.，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48 : 202)，及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶（Lowy et al.，1 9 8 0:Cell，22: 817)基因，其可分別用於tk·、hgprt-，或aprt-細胞（APRT)中。抗-代謝物抗性亦可作爲下列非限制性標記基因實例的選擇根據：dhfr，其提供對胺基甲基葉酸之抗性（Wigler e t a 1.. 1 9 8 0, Proc. Natl. Acad. Sci. · USA, 77:.3 57:及 O'Hare et al·，1981，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 : 1 5 2 7) ; gpt，其提供對黴菌酚酸之抗性（Mulligan and Berg, 1981，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 ： 2072) ； neo ，其提供對胺基糖苷類.G418之抗性（Clinical Pharmacy， 12 : 488-505 ; Wu and Wu，19 9 1，Biotherapy，. 3 : 8 7-95 ；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol. > 32 : 5 73 -596 ； Mulligan， 1 993，Science，260 ： 926-93 2 ；

Anderson，1 9 9 3，Ann.Rev.Biochem.，62 : 19 1-21 ; May ，1993，TIB TECH，11(5): 155-215;及 hygro，其提供對潮黴素之抗性（S a n t e r r e e t a 1., 1 9 8 4 , G e n e，3 0 : 1 4 7)。在重組DNA技術之技藝中所普遍知道之方法可例行用來選擇所需之重組細胞株落，且這類方法係描述於，如： Ausubel et a 1., (e d s .) ， Current Protpcol s in Molecular Biology 1 John Wiley & Sons 5 NY( 1 993) ； Kriegler > 1990 -64 - (61) (61)1328614 ，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual， Stockton Press，NY ;第 12 和 13 章中，Dracopoli et al.(eds)，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley & Sons ， NY(1994) ; Colberre-Garapin et a 1., 1 9 8 1 . J. M ol.Biol.，150: 1中，其全文倂爲本文之參考資料。另外，表現出之蛋白質分子的表現水準可藉載體之增數放大來增加（回顧時可參考：Bebbington and Hentschel ， ''The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，Vol.3，Academic Press，New York，1987)。當載體系統中表現蛋白質之標記被增數放大時，存在於宿主細胞培養中之抑制劑水準增加時可增加標記基因的複本數。由於被增數放大之區與蛋白質-編碼基因相關：，因此可同時增加蛋白質之產量（Crouse et al.，1983，Mol. Cell. Biol., 3 ： 2 5 7.)。在藥物甲硫胺酸次硫酸亞胺或胺基甲基葉酸的存在下 ’可將庇護該作爲可選擇標記之麩醯胺合成酶（GS)或二氫葉酸還原酶（DHFR)的編碼核酸的載體分別增數放大。以麩醯胺合成酶爲基礎之載體的優點爲麩醯胺合成酶陰性之細胞株（如：老鼠骨髓瘤細胞株’ NSO)的可利用性。麩醯胺合成酶表現系統亦可經由提供額外之抑制劑來預防內生性基因之作用，而可在鍵醯胺合成酶表現細胞（如：CHO 細胞）中作用。可表現出作爲可選擇標記之DHFR的載體包括，但不 -65- (62) (62)1328614 限於：pSV2-dhfr 質體（Subramani et al·, Mo]. Cell. Biol·， 1: 854(1981))。可表現出作爲可選擇標記之麩醯胺合成酶的載體包括，但不限於：在Stephens and Cockett， 1989，Nucl· Acids Res.; 17: 7110 中所描述之 pEE6 表現質體。麩醯胺合成酶表現系統及其構成要素詳細說明於PCT 刊物中：W 087/04462 ; W086/05 807 ; W089/0 1 036 ; W0 8 9/ 1 0404 ;和 W09 1 /0665 7其全文倂爲本文之參.考資料。另外，可根據本發明使用之麩醯胺合成酶表現載體可從供應商（包括，如：隆沙生物公司（Lonza Biologies)，新罕布夏州波茲茂斯市）購得。在一種特殊之實施態樣中，可將編碼可溶性 CTLA4 分子或可溶性C T L A 4突變種分子的核酸序列插入經過設計，可在真核宿主中表現外來序列的載體中。載體之調節要素可根據特殊之真核宿ΐ而有不同。在真核宿主細胞中表現可溶性CTLA4分子或可溶性CTLA4突變種的載體可包含用來將蛋白質之表現最優化的增強因子序列。細胞培養之類型爲了便於瞭解’而非用來限制’本技藝中之技術熟習人士可察知用於產製蛋白質之細胞培養和培養操作過程可包括三種一般類型；也就是，連續培養、分批培養和分批-餵養培養。例如：在連續培養中’新鮮培養補充品（也就是餵養介質）係在培養期間提供給細胞’並同時每天去除舊培養介質，且將產物如：每日或連續收成。在連續培 -66- (63) 1328614 養中’可每天加入饌養介質，且可以連續方式（也點滴或 '注入之型式）加入。在連續培養方面，細胞要維持在培餐中，只要細胞仍維持存活，且細胞和保持著。在分批培養中，細胞先培養在介質中，且既不質移除、取代，也不補充營養，也就是：在培養操期間或結束前，並不以新介質，，饌養，，細胞。所需產培養操作過程結束前收成。在分批-餵養培養方面，培養操作時間可經由期間，每日補充培養介質一或多次（或連續地）新鮮也就是在培養期間，以新介質（"餵養介質饌養" 分批-餵養之培養法可包括如上述之不同的餵養攝次數’例如：每日，每隔一曰，每二日，等，每曰次或每日少於一次，等。再者，分批·饌養之培養餵養介質連續餵養。然後，在培養/生產操作結束所需產物。本發明宜包含每日以含D -半乳糖之觀餵養的分批-餵養細胞培養法，其中在培養期間進多次温度更動可使蛋白質產物之產量及品質增加，蛋白質生產相延長超過該未使用温度更動或僅使用度更動之培養所具者。多次温度更動培養方法描述年12月23日所提出之經共同受讓的專利申請案U.S. 60/43 6,10〗號，以及與其共同提出之 U.S.序號號中，其內容倂爲本文之參考資料。在涉及二或多次温度更動之本發明的觀點中，就是以可依需環境仍將此介作過程物係在在操作介質，細胞。生法及超過一法可以時收成養介質行二或且可將一次温於 2002 序號第 :第 10/ 包含二 -67- (64) (64)1328614 或多次温度更動之本發明細胞培養方法可使培養中有更多細胞存活至過程結束或生產操作過程結束。在非-生長相關之蛋白質產製過程中（如：本文所示範的—些實例）’存活細胞數愈多則產製之蛋白質量愈多。因此’在過程結束時可累積較多之所需產物。由培養中之個別細胞產製蛋白質或醣蛋白的速度（也就是細胞之特殊生產力）並不受本發明之温度更動培養過程影響，或因而增加（如：實施例6) 。相反的，在生長·相關之培養過程中，蛋白質主要係在培養的生長相期間由生長中之細胞所產製。根據本發明，細胞培養可在用於大規模或小規模產製蛋白質之條件下，利用傳統上用於動物或哺乳動物細胞培養之培養容器及/或培養裝置來進行，並由細胞產製醣蛋白。如本技藝中之技術人士所察知，實驗室規模通常係使用組織培養盤、T·燒瓶和旋轉燒瓶。在大規模培養方面（如：500升、5000升，等），其程序包括，但不限於：可使用流體化床生物反應器、中空纖維生物反應器、滚筒瓶培養或攪動槽生物反應器系統。顯微載體可與或不與滚筒瓶或攪動槽生物反應器系統一起使用。這些系統可以分批、連續，或分批-餵養模式操作。另外，培養裝置可配備或不配備一種利用濾器、重力、離心力，等之細胞分離器。細胞培養相及相關變數 ”接種"一詞係指將細胞加入起始介質中，以開始培養 -68- (65) (65)1328614 培養之生長相爲一種相，在此相的期間，在任何時間點之存活細胞密度均較在任何先前時間點高。培養之靜止相爲一種如下述之相：在此相的期間，存活細胞密度在任何長的時間期內約爲一致（也就是在測量誤差內）。培養之死亡相爲一種在生長相之後，或在生長相和靜止相之後來臨的相，且在此相期間，在任何時間點之存活細胞密度均較在任何先前時間點低。在生長-相關之培養過程中，如：其中多陰離子性化合物可延長生長相的案例，生產相可在延長之生長相期間開始。在非生長·相關之培養過程中，細胞培養之生產相可爲靜止相。較合適的爲，在生產相期間補充（”餵養"）培養介質，以支援蛋白質持續生產（尤其是在延長之生產相），並取得大量之高品質醣蛋白產物（由回收蛋白質時高水準之終點涎酸含量來示範及/或測定）。餵養可以每日爲基準來進行，或可根據其它計劃來支撐細胞之存活力和蛋白質產製。在其温度更動依次降低至低於生長及標準（初始）生產相之温度的延長的生產相期間，細胞被餵養且維持存活。這使得其生產所需蛋白質產物的時間期可延長，或總期間長過那些在初始培養温度下或從初始温度開始，僅更動一次温度下之培養。根據本發明之培養過程在培養期結束時可有更多之存活細胞存活下來。因此，在某些實施態樣中 -69- (66) (66)1328614 ，有較多細胞存活則有較多可產製所需產物的細胞。換言之，在培養過程結束時’可累積較多量之產物，且個別細胞產製蛋白質的速率，也就是細胞之特殊生產力，仍維持相同。（見’如：實施例4)。如本技藝中所已知，細胞之特殊生產力，或細胞特殊速率，通常係指每一細胞，或每一細胞團或體積計量所產製之產物的特殊表現速率。細胞之特殊生產力係以每天、每一細胞所產製之蛋白質克數來測量，如：可根據涉及下式之整合方法來測量： dP/dt = qp X，或 P = C|p |〇 Xdt 其中Qp爲細胞之特殊生產力常數；X爲細胞數或細胞體積，或細胞團當量；dP/dt爲蛋白質產製速率。因此 ’ q p可從產物濃度對存活細胞之時間積分的圖形取得（$ (/Xdt"存活細胞天數"）。根據此程式，當將所產製之醣蛋白產物的量對存活細胞天數作圖時，斜度等於細胞之特殊速率。存活細胞可藉數種測量來測定，如：生物團、氧氣攝取速率 '乳糖脫氫酶（LDH)、壓緊之細胞體積或濁度。（如：授讓給T.Etcheverry等人之U.S.專利第5,705,3 64號）〇藉本發明之培養方法產製可溶性CTLA4分子和可溶性CTLA4突變種分子在本發明所包含的其它實施態樣中，可使用本細胞培養方法來製造如下述說明之可溶性CTLA4分子或可溶性 (67) (67)1328614 CTLA4突變種分子。可溶性CTLA4分子宜爲一種CTLA4 融合蛋白質，以CTLA4Ig較佳。更合適的爲含有胺基酸-1至3 5 7或+]至3 5 7(如第8圖中所示）之 CTLA4Ig。最合適的爲由胺基酸-1至357或+1至357(如第8圖中所示）所組成之 CTLA4Ig。可溶性CTLA4突變種分子宜爲含有胺基酸-1至 35 7或+1至3 5 7(如第9圖中所示）之 L104EA29YIg。最合適的爲由胺基酸-1至357或+1至357(如第9圖中所示）所組成者。該涉及延長蛋白質產物之生產相的二和三-步驟温度更動及以含D-半乳糖之介質餵養的細胞培養方法特別適合用來經由培養中之可溶性CTLA4分子和可溶性CTLA4 突變種分子的宿主細胞來產生高品質和大量之可溶性 CTLA4分子和可溶性CTLA4突變種分子。在一種較佳之實施態樣中，CTLA4Ig係由以重組遺傳工程處理過之宿主細胞來產生。CTLA4Ig融合蛋白質可由經含有編碼CTLA4Ig之DNA序列的載體轉染.過的CHO 細胞以重組方式產生。（見，授讓給P. S. Linsley等人之 U.S.專利第5,844,059號，及本文之實施例）。當根據本發明之多-步驟温度更動方法培養時，可產製出大量，且經適當涎酸化之CTLA4Ig融合蛋白質。本發明提供產製高水準之可回收蛋白質產物，如：涎酸化之CTLA4Ig蛋白質產物的方法。在另一種較佳之實施態樣中，含有如第9 圖中所示之胺基酸-1至357或+1至357的可溶性CTLA4突變種分子，LI 04EA29YIg，係由本發明之細胞培養方法所生產。 -71 - (68) (68)1328614 B7分子爲一種CTLA4之配位體。本文中所使用之"配位體"係指一明確辦認並結合另一分子之分子。分子及其配位體的交互作用可由本發明之培養方法的產物來調節。例如：CTLA4與其配位體B7之交互作用可經由給予 CTLA4Ig分子來阻斷。另一種實施例爲，腫瘤壞死因子 (TNF)與其配位體，TNF受體（TNFR)，之交互作用，可經由給予伊坦塞普（etanercept)或其它TNF/ TNFR阻斷分子來阻斷。野生型CTLA4或”非-突變之CTLA4"具有如第1〇圖中所示之天然、全長CTLA4的胺基酸序列（其亦描述於US. 專利第5,434，131、5,844,095和5,851，795號中，其全文倂爲本文之參考資料）’或其任何可辨識及結合B7分子，或干擾B7分子’以阻斷B7分子結合CD28及/或CTLA4(如 :內生性CD28及/或CTLA4)的部分。野生型CTLA4包含特殊部分，包括’如：第10圖中所示之從位置+1之甲硫胺酸開始至位置+ 124之天門冬酸結束的野生型CTLA4胞外功能區，或從位置-1之胺基丙酸開始至位置+124之天門冬酸結束的野生型CTLA4胞外功能區。天然野生型CTLA4爲一種具有N-端胞外功能區、穿膜功能區和C-端細胞質功能區之細胞表面蛋白質。胞外功能區結合至一標的分子，如：B7分子。在細胞中，天然、野生型CTLA4蛋白質係以未成熟之多肽型式（其在胺基或N-端包括一訊號肽）來轉譯。此未成熟之多肽進行後轉譯處理，其包括分裂及去除訊號肽，以產生CTLA4裂解 (69) (69)1328614 產物，此產物具有新產生之與未成熟型式中之N-端不同的N-端。本技藝中之技術熟習人士可察知可能發生額外之後轉譯處理，其可從新產生之CTLA4裂解產物的N-端移除一或多個胺基酸。成熟之 CTLA4蛋白質可從位置+1 之甲硫胺酸開始，或從位置-1之胺基丙酸開始。CTLA4分子之成熟型式包括結合至 B 7的胞外功能區或其任何部分〇本文中所使用之CTLA4突變種分子係指含有如第10 圖中所示之野生型CTLA4，或其任何部分或衍生物（在該野生型 CTLA4序歹IJ中，宜爲在野生型 CTLA4之胞外功肯巨區中具有一或多種突變），且結合B 7分子的分子。CTL A 4 突變種分子具有一與野生型CTLA4分子之序列類似但不相等’且仍結合B7的序列。這些突變可包括一或多種被具有保留性（如：白胺酸取代異白胺酸）或非-保留性（如：色胺酸取代甘胺酸）構造或化學性質之胺基酸取代的胺基酸殘質，胺基酸缺失 '加入，移碼突變，或截斷。 CTLA4突變種分子可包括在其中或附著於其上之非_ CTLA4分子’也就是CTLA4突變種融合蛋白質。突變種分子可爲可溶的（也就是流通的），或者其可結合接至細胞表面（經膜結合的）。CTLA4突變種分子包括Ll〇4EA29YIg及那些描述於下列文獻中者：U.S.專利申請案序號第 09/865,321，60/2 1 4,065 和 6 0/2 8 7,5 76 號；in WO0 1 /9233 7 A2; in U_S.專利案第 6,090,914 ’ 5,844,095 和 5,773,253號，及 R.J.Peach et a 1., 1 9 9 4 > J Exp Med > 180 : 2049-2058 -73- (70) 1328614 。（:TLA4突變種分子可以合成或重組方式產生。

CTLA4Ig爲一種聯結一免疫球蛋白（Ig)分子，或其部分之可溶性融合蛋白質，其含有結合B7之野生型CTLA4 的胞外功能區或其部分。CTLA4之胞外功能區或其部分係聯結一含有免疫球蛋白分子之全部或部分的Ig部分，宜爲免疫球蛋白恆定區之全部或部分，如：全部或部分之 IgC r 1 ' IgC 7 2 ' IgC 7 3 ' IgC γ 4 ' \gC β、I gC a 1 ' I g C 0:2、IgC(5或IgCe ，以使融合分子成爲可溶。Ig部分可包括前述恆定區或其它恆定區之絞鏈區、CH2和 CH3功能區，或CHI'絞鏈區' CH2和CH3功能區。較合適的爲， Ig部分爲人類或猴子，且含有絞鏈區、CH2和CH3功能區。最合適的爲該Ig部分含有人類IgC7l之絞鏈區、CH2 和CH3功能區，或由人類IgCr 1之絞鏈區、CH2和CH3功能區所組成。在CTLA4Ig之Ig部分中，Ig恆定區或其部分可發生突變，以使其效應子之功能降低（見，如：U.S. 專利第5,637,481、5,844,095和5,434,131號）。本文所使用之Ig部分、Ig恒定區、IgC(恆定）功能區、IgCT 1、IgC r 2 ' IgCr3.、IgCr4' IgC β 、IgCa 1、IgC a 2 ' IgC δ 或IgC ε等名詞包括天然序列及已突變之序列二種，如：在恆定區中具有降低效應子功能之突變的序列。一種與CTLA4相關之特殊實施態樣係包含從位置+1 之甲硫胺酸開始至位置+]24之天門冬酸結束，或從位置-1 之胺基丙酸開始至位置+ ]24之天門冬酸的野生型CTL A 4 胞外功能區；一在位置+125處之接合胺基酸殘質麩醯胺； -74- (71) (71)1328614 及一包含從位置+126之麩胺酸開始至在位置+ 357之賴胺酸的免疫球蛋白部分，如第8圖中所示。編碼此CTLA4Ig之 DNA於]99]年5日31日存放於美國類型培養收集處 (ATCC)(大學大道1 0 8 0 1號，維吉.尼亞州馬那沙市20110-2209)，其受布達佩斯條約之監督，且已給予ATCC編號 ATCC68629 ； P. Linsley et al.,1 994, Immunity 1 ： 793 -80 。一種表現CTLA4Ig之 CHO細胞株於】991年5月31日存放於 ATCC，確認號碼CRL- 1 0762。根據此處所描述之方法所產製之可溶性CTLA4Ig分子可能包括或不包括一訊號（領導）肽序列。第8和9圖包括訊號（領導）肽序列之解說。通常，該種分子並不包括訊號肽序列。 LI 04EA29YIg係一種爲可溶性 C T L A 4突變種分子的融合蛋白質，此突變種分子包含一帶有連結至Ig尾端之胺基酸變化A29Y(酪胺酸胺基酸殘質取代在位置29之胺基丙酸）和LI04E(麩胺酸胺基酸殘質取代在位置+104之白胺酸）的野生型 CTLA4胞外功能區。第9圖說明 L104EA29YIg。L104EA29YIg之胺基酸序列包含如第9圖所示之從胺基酸位置-1的胺基丙酸至在胺基酸位置+357的賴胺酸。或者，L104EA29YIg之胺基酸序列包含如第9圖所示之從胺基酸位置+1的甲硫胺酸至胺基酸位置+ 35?的賴胺酸。L104EA29YIg包含一在位置+125處之接合胺基酸殘質麩醯胺：及一包含從位置+126之麩胺酸開始至在位置 + 3 5 7之賴胺酸的Ig部分。編碼Ll(MEA29YIg之DNA於 2000年6日20日存放於美國類型培養收集處（ATCC)(大學大 (72) (72)1328614 道10801號’維吉尼亞州馬那沙市220110-2209)，受布達佩斯條約之監督，且已給予 ATCC編號PTA-2104。 Ll〇4EA29YIg描述於共同申請之u.S.專利申請案序號第 09/5 7 9,92 7 、 60/2 8 7,5 7 6 和 60/2 1 4,0 6 5 號，及 WO/01/923337 A2號中’其全文併爲本文之參考資料。藉本發明之培養方法所產製之可溶性L104EA29Y〗g分子可能包括或不包括訊號（領導）肽序列。通常，根據本發明所產製之分子並不包括訊號肽序列。此處所使用之可溶一詞係指任何未結合或附著至細胞 (也就是流動的）之分子或其片段。例如：CTLA4、B7或 CD28可分別經由將Ig部分附著至CTLA4、B7或CD28之胞外功能區而成爲可溶。或者，如 CTLA4這類分子可經由去除其穿膜功能區而成爲可溶。通常，根據本發明所產製之可溶分子並不包括訊號（或領導）肽序列。可溶性CTLA4分子係指一種含有結合B7之野生型 CTLA4或其任何部分或衍生物的非·細胞·表面·結合（也就是流動的）分子，包括但不限於：可溶性CTLA4融合蛋白質；其中 CTLA4之胞外功能區係融合至一可使該融合分子成爲可溶的Ig部分的可溶性CTLA 4融合蛋白質，如： CTLA4Ig融合蛋白質（如：ATCC 68629)，而該Ig部分爲免疫球蛋白分子之全部或部分，宜爲免疫球蛋白恆定區之全部或部分，如：全部或部分之igcri、igcr2、igcr 3 ' IgC r 4 ' IgC μ 、IgCal' IgCa2、IgC(5 或 IgCe ；其中該胞外功能區係融合至或與一生物活性或化學活性蛋 -76- (73) (73)1328614 白質結合之可溶性CTLA4融合蛋白質，該生物活性或化學活性蛋白質爲，如：U.S.專利第5,844,095號（其全文倂爲此處之參考資料）中所描述之乳頭瘤病毒E7基因產物 (CTLA4-E7) ' 黑色瘤-相關之抗原 p97(CTLA4-p97)或 HIV env蛋白質（CTLA4-env gp 120);雜交種（嵌合的）融合蛋白質’如：U.S_專利第5,4 3 4,1 3 1號（其全文倂爲此處之參考資料）中所描述之CD28/CTLA4Ig;其穿膜功能區被去除，以使蛋白質成爲可溶之CTLA4分子（見，如：M.K. Oaks et al., 2000, Cellular Immunology, 20 1 : 1 44- 1 53，其全文併爲此處之參考資料）；可溶性 CTLA4突變種分子 L 1 04EA29YIg。可溶性 CTLA4分子亦可爲可溶性 CTLA4突變種分子。根據本發明產生之可溶性CTLA4分子可包括或不包括訊號（領導）肽序列。訊號肽可爲任何能使分子分泌之序列，包括：來自抑制瘤素Μ之訊號肽（Malik et al.,1 9 8 9， Molec.Cell.Biol.，9 : 2 84 7-28 5 3 )，或 CD5(N.H.Jones et al., 1 98 6 > Nature，323: 346-349)，或來自任何胞外蛋白質之訊號肽。經由本發明之培養方法所產生之可溶性 CTLA4分子可包括連接在CTLA4之胞外功能區N-端的制瘤素Μ之訊號肽。通常，在本發明中，該分子並不包括訊號肽序列。此處所使用之CTLA 4融合蛋白質係指一種含有結合 Β7之野生型CTLA4或其部分的胞外功能區的分子，其融合至可使CTLA4分子成爲可溶之非-CTLA4部分，如：Ig -77 - (74) (74)1328614 部分。例如：CTLA4融合蛋白質可包括融合至全部或部分 Ig恆定區之CTLA4的胞外功能區。可融合至CTLA4之Ig 恆定區（或其部分）的實例包括但不限於本文上述中所有列出者。CTLA4融合蛋白質亦可爲CTLA4突變種分子》此處所使用之"非，CTLA4部分”係指不會結合CD 80及 /或CD86，且不會干擾CTLA4結合至其配位體的分子或其部分。實例包括，但不限於：爲I g分子之全部或一部分的Ig部分，生物活性或化學活性蛋白質的一部分，如：乳頭瘤病毒E7基因產物（CTLA4-E7) '黑色瘤-相關之抗原 p97(CTLA4-p97)或 HIV env 蛋白質（CTLA_4-env gp 1.20)( 如：U.S.序號第5,844,09 5號，其全文併爲此處之參考資料 )。Ig部分之實例包括免疫球蛋白恆定功能區之全部或部分，如：全部或部分之 igC<r 1、igCr2、igc<r3、igCr 4、IgC#、IgCctl、IgCa2、IgC<5 或 IgCe 。Ig 部分可包括前述恆定區或其它恆定區之絞鏈區、CH2和CH3功能區，或CH1 '絞鏈區、CH2和CH3功能區。較合適的爲， Ig部分爲人類或猴子，且包括絞鏈區、CH2和CH3功能區。最合適的爲該Ig部分包括人類IgCr 1之絞鏈區、CH2 和CH3功能區，或爲人類IgCr 1之絞鏈區' CH2和CH3功能區。在一 Ig部分中，Ig恆定區或其部分可發生突變，以使其效應子之功能降低（見’如：U.S•專利第 5,637:481、5，844,095 和 5,434,131 號）。 CTLA4之胞外功能區係指可辨識及結合B7之野生型 CTLA4的任何部分。例如：CTLA4之胞外功能區包含從位 -78- (75) 1328614 置+1之甲硫胺酸開始至位置+124之天門冬酸（第！〇圖）。例如：CTLA4之胞外功能區包含從位置_】之胺基丙酸至位置 + 124之天門冬酸（第1〇圖）。

此處所使用之突變一詞係指在野生型分子之核苷酸或胺基酸序列中的變化’例如：在野生型CTLA4胞外功能區之DNA及/或β女基酸序列中的變化。在dna中之突變可能改變一密碼子而導致所編碼之胺基酸序列改變。DNA 之改變可能包括：取代、缺失、插入、替換之DNA剪接或截斷。胺基酸改變可能包括取代、缺失、插入 '加入、截斷，或蛋白質之處理或裂解錯誤。或者，如本技藝中所熟知，核苷酸序列中之突變可造成胺基酸序列中之無表型突變。本技藝中亦知，某些核苷酸密碼子編碼相同之胺基酸。其實例包括：編碼精胺酸（R)之核苷酸密碼子CGU、 CGG、CGC和CGA;或編碼天門冬酸（D)之密碼子gaU和 GAC。

因此，一種蛋白質可由一或多種核酸分子編碼，這些核酸分子之特異核苷酸序列不同’但仍編碼具相等序列之蛋白質分子。突變種分子可具有一’或超過一種突變。作爲指導之用’胺基酸編碼序列如下： -79- (76)1328614

胺基酸符號單字母符號密碼子胺基丙酸 Ala A GCU，GCC，GCA, GCG 半胱胺酸 Cys c UGU, UGC 天門冬酸 Asp D GAU，GAC 麩胺酸 Glu E GAA, GAG 苯胺基丙酸 Phe F UUU, UUC 甘胺酸 Gly G GGU, GGC，GGA，GGG 組胺酸 His H CAU, CAC 異白胺酸 lie 1 AUU，AUC, AUA 賴胺酸 Lys K AAA, AAG 白胺酸 Leu L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA，CUG 甲硫胺酸 Met M AUG 天門冬素 Asn N AAU, AAC 脯胺酸 Pro P CCU, CCC, CCA, CCG 鍵酿胺 Gin Q CAA，CAG 精胺酸 Arg R CGU，CGC, CGA，CGG, AGA，AGG 絲胺酸 Ser S UCU，UCC, UCA, UCG, AGU，AGC 蘇胺酸 Thr T ACU，ACC, ACA，ACG 纈胺酸 Val V GUU, GUC, GUA, GUG 色胺酸 Trp w UGG 酪胺酸 Tyr Y UAU, UAC

此處所使用之片段或部分一詞係指分子之任何部分或節段。在CTLA4或CD28方面，片段或部分宜爲可辨識及結合87，或干擾87，以阻擋其結合至〇0 28及/或（：1'1^4 之CTLA4或CD28，或其部分或節段的胞外功能區。再者，此處所使用之”相對應’'係指分享序列之同等性。此處所使用之B7—詞係指分子之B7族的任何成員，包括但不限於：可辨識及結合CTLA4及/或CD28 2B7-1(CD80) (Freeman et al., 1 9 8 9, J. Immunol., 143 ： 2714-2 72 2 ，其全文倂爲此處之參考資料）、87- 2 (C D 8 6) (F r e e m a n et a 1., 1 9 9 3, Science. 262 : 909-9 1 1 > 其全文倂爲此處之參考資料；Azuma et al.，1993: Nature， -80- (77) 1328614 366: 76-79，其全文倂爲此處之參考資料）。如US.專利序號第5,580,756和5,521,288號（其全文倂爲本文之參考資料）中所描述者，CD28係指可辨識及結合B7之分子。如此處所使用者，B7 -陽性細胞包括任何帶有一或多種，表現在細胞表面上之B7分子類型的細胞。

此處所使用之”衍生物係指一種與其母分子分享序列相似性及活性的分子。例如：CTLA4之衍生物包括一種可溶性CTLA4分子，其胺基酸序列與野生型CTLA4之胞外功能區至少有70%之相似性，且其可辨識並結合B7，如： CTLA4Ig或可溶性CTLA4突變種分子，L 1 0 4 E A 2 9 YI g »衍生物意指胺基酸序列及/或胺基酸之化學性質的任何變化，如：胺基酸同系物。

此處所使用之調節免疫反應一詞係指活化、刺激、正-調節、抑制、阻斷、減少、減弱、負-調節或修改免疫反應。多種疾病’如：自體免疫疾病，可經由調節免疫反應來治療，如：調節功能性C T L A 4 •及/或C D - 2 8陽性細胞與B7-陽性細胞之交互作用。例如：調節免疫反應的方法包含將B7 -陽性細胞與可溶性CTLA4分子（如：那些根據本發明製備者）接觸，以形成可溶性CTLA4/B7複合物，其中該可溶性CTLA4分子會干擾內生性CTLA4及/或 C D 2 8分子與B 7 -分子之反應。此處所指之"阻斷”或"抑制" 受體、訊號或分子意指干擾受體、訊號或分子之活化（此係藉本技藝中所認知之試驗來偵察）。阻斷或抑制可爲部分或全面。 -81 - (78) 1328614

此處所使用之"阻斷B7交互作用"係指干擾B7結合至其配位體，如：CD28及/或CTLA4，以藉此妨礙T-細胞和 B7-陽性細胞交互作用。阻斷B7交互作用之試劑的實例包括，但不限於：分子，如一種可辨識及結合 CTLA4、 CD28或B7-分子（如：B7-1，B7-2)中之任一項的抗體（或其部分）；這些分子之可溶型（或其部分），如：可溶性 CTLA4 ;經過設計以透過 CTLA4/CD28/B7-傳介之交互作用干擾細胞訊號的肽片段或其它小分子。在一種較佳之實施態樣中，阻斷劑爲一種可溶性 CTLA4分子，如： CTLA4Ig(ATCC 6 8 629)或 L 1 0 4 E A 2 9 YI g (A T C C PTA-2 1 04) ;可溶性CD28分子，如：CD28Ig(ATCC 68628);可溶性 B7分子，如：B7-Ig(ATCC 68627);抗-B7單株抗體（如： ATCC HB-25 3 ，ATCC CRL-2223 ，ATCC CRL-2226 > ATCC HB-301 ， ATCC HB-11341 和如 U-S.專利第

6，1 1 3,8 9 8 號或 Yokochi 等人，1 9 82，J.Immunol., 128(2): 823 - 82 7中所描述之單株抗體）；抗-CTLA4單株抗體（如： ATCC HB-304 ’和參考資料82-8 3中所描述之單株抗體）；及/或抗-CD28單株抗體（如：如 Hansen et al.,1980， Immunogenetics > 1 0 : 2 4 7-260 > or Martin et al., 1 984 > J.C】in.Immunol_，4(1): 18-22 中所描述之 ATCC HB- 11944，和Mab 9.3)。阻斷B7之交互作用可經由本技藝中所認知之試驗來偵測，如：經由測定T-細胞/B 7-細胞間之交互作用減少，或經由測定37與CTLA4/CD28間之交互作用減少來測定與免疫疾病（如：類風濕性疾病）相關之症 -82- (79) (79)1328614 狀的減少情形。阻斷可爲部分或全面。還有，如此處所使用之分子有效量係指能阻斷分子與其配位體間之交互作用的量。例如：可阻斷87與CTLA4 及/或CD28間之交互作用的分子有效量爲當分子結合至在 B7 -陽性細胞上之B7分子時，可抑制B7分子不與內生性配位體（如：CTLA4和CD28)結合的分子量。或者，阻斷 B7與CTLA4及/或CD28間之交互作用的分子有效量爲當分子結合至在T細胞上之CTLA4及/或CD28時，可抑制 B 7分子不與內生性配位體（如：C T L A 4和C D 2 8 )結合的分子量。抑制或阻斷可爲部分或全面。在臨床實驗計劃方面，較合適的爲，融合蛋白質，如 :CTLA4 Ig或突變種CTLA4Ig，之Ig部分不會誘出個體內之有害的免疫反應。較佳之部分爲Ig恆定區（包括人類或非·人類靈長類Ig恆定區）的全部或一部分。合適之Ig 區的實例包括 IgCy 1、IgCr2、IgCr 3、IgCr4、IgC// 、IgC a: 1 ' IgC a: 2、IgC δ或IgC ε ，包括涉及效應子功能之絞鏈區、CH2和 CH3功能區，或CH1、絞鏈區、CH2 和CH3功能區，這些效應子功能有，如：結合至Fc受體、補體-倚賴性細胞毒性（CD C)，或抗體-倚賴性細胞·傳介之細胞毒性（ADCC)。Ig部分中可具有一或多種突變（如：在 CH2功能區中，以減少效應子功能，如：CDC或 ADCC) ’其中突變係經由增力口或降低Ig結合至FC受體的能力來調節Ig結合其配位體的能力。例如：在Ig部分中之突變可包括在其絞鏈區中之半胱胺酸殘質內之任何或全 -83- (80) (80)1328614 部變化。例如：如第8圖中所示，在位置+ 1 3 0、+ I 3 6、和 + 139之半胱胺酸被絲胺酸所取代。如第8圖中所示，Ig部分亦可包括在位置+ 1 4 8被絲胺酸所取代之脯胺酸。再者，在Ig部分中之突變可包括在位置+144之白胺酸被苯基胺基丙酸所取代；在位置+】45之白胺酸被麩胺酸所取代；或在位置+]47之甘胺酸被胺基丙酸所取代。【實施方式】下列實施例舉出本發明之特殊觀點，以說明本發明，並對本技藝中之技術熟習人士提供本發明方法之說明。這些實施例不應用來限制本發明，因其僅提供特殊方法學及例證’以用來了解及實行本發明及其不同觀點。下列實施例1和2描述關於涉及使用半乳糖餵養加上多次温度更動之細胞培養方法的實驗。實施例3 _ 6描述關於在培養操作過程中涉及温度更動，且無半乳糖餵料之細胞培養方法的實驗。實施例7-13描述關於涉及將多陰離子性化合物延遲加入培養中，並加上半乳糖餵料，再加上多次温度更動之細胞培養方法的實驗。實施例1 此實施例槪述用於培養重組細胞之本發明的D_半乳糖連續餵養培養方法，該重組細胞可產製如本文中實施例 2所描述之示範性CTLA4Ig融合蛋白質。利用T-75燒瓶，250、500和1 000毫升旋轉瓶，將細 -84- (81)1328614 胞在含有麩醯胺、碳酸氫鈉、胰島素和胺基甲基葉酸（表 ])之修正的CD-CHO介質中增殖。將T-75燒瓶和旋轉瓶在3 7 °C和6 % C 0 2中培養。

-85- (82)1328614 表 1 修改的c D - C Η 0 介質成分濃度 CD-CHO 25χ 酸類 I (因維特金，加州卡斯貝市） 40毫升/升 CD-CHO 25x 酸類 II (因維特金，加州卡斯貝市） 4 0毫升/升 CD-CHO 25x 鹽類 I (因維特金，加州卡斯貝市） 40毫升/升 CD-CHO 25x 鹽類 II (因維特金，加州卡斯貝市） 40毫升/升麩醯胺 (因維特金） 0.5 8 5克/升 7 -人類胰島素 (1 0毫克/毫升） (因維特金） 0.1毫升/升胺基甲基葉酸 (20mM溶液） (ICN，加州卡塔梅莎市） 5微升/升碳酸氫鈉 (馬蘭克洛貝可公司 (Mallenkrodt Baker)，紐澤西州菲利浦柏格市） 2.22克/升 -86- (83) (83)1328614 在產生足夠之接種量後，將培養轉移至分別具有3升或30升操作容積之具相同介質的5升或50升生物反應器中。起始接種密度爲200,000個存活細胞/毫升。5升容器爲配備一個海水推進器的玻璃反應器（艾普利康（Applikon)，加州佛斯特市），50升容器爲一配備二個海水推進器的不銹鋼反應器（非米爾公司（Feldmeier)，紐約州西若可斯市）。在整個操作過程中係以利用因特迅固定32(Intellution Fix3 2)的資料取得系統來記錄温度、pH和DO。經由轉子流速計來控制氣流。經由一被浸沒之玻璃料（5微米細孔大小）將空氣引入反應器中，並通過反應器頭部空間排出 C 〇2。氧分子係透過相同之玻璃料引入，以用來控制D Ο 。C02係透過相同之玻璃料引入，以用來控制高側pH。經由加入IN NaOH來控制低側pH。依下述方式’利用含葡萄糖、麩醯胺、TC酵母酸化物（TC Yeastolate)(貝通迪金生公司）和D -半乳糖之修正的 eRDF介質（因維特金公司，加州）（表2)，每日以大九劑餵料餵養生物反應器中之培養：接種後一天，加入爲1 %培養容積之最低量作爲饌養介質；若葡萄糖濃度低於3克/升，則加入一計算過之容積’以使葡萄糖濃度回升至3 · 0克/ 升°發酵過程之期間爲1121天。以每日爲基準，從反應器中取出樣本。以錐蟲藍（史格馬公司，密蘇里卅）將用於計算細胞之樣本染色。並經由血球細胞計算器/顯微鏡來進行細胞之計數和細胞存活力之測定。在代謝物分析方面，將另外之樣本在2000rpm(4°C )下離心20分鐘，以分離出 (84)1328614 細胞。對上淸液分析下列變數：滴定濃度、涎酸、葡萄糖、乳酸化物、麩醯胺、麩胺酸化物和 LDH。表2 、pH ' p〇2、pC02、氨修改之eRDF介質的成分濃度 eRD F-1 (因維特金公司，加州卡斯貝市） 16.8克/升右旋糖 (VWR_馬蘭克洛貝可公司） 30.94克/升 L-魅醯胺 (因維特金公司） 4.1克/升人類胰島素 (10毫克/毫升）因維特金公司 1毫升/升 TC酵母酸化物 (貝通迪金生公司，紐澤西州富蘭克村市） 5克/升 D -半乳糖〇，3.0，12.5，或 20.0 (費洛-凡斯提公司（Ferro-Pfanstiehl)伊利諾州瓦奇根市）克/升大規模之細胞培養係利用配備有三個海水推進器之不銹鋼反應器（非米爾公司，紐約州），在具4500升操作容積 -88- (85) (85)1328614 的5 000升反應器中進行。將接種體培養從旋轉瓶中移至種籽反應器中增殖，而在5000升規模中之起始接種密度爲 1 50-200,000個存活細胞/毫升。關於大規模培養和過程控制的實驗方法與5升和50升方法之相關描述相同。實施例2 本實施例描述培養可產製 CTLA4Ig(如第3圖中所示之-1至3 5 7或+1至3 5 7)(編碼DNA係以 ATCC6 8 629編號存放）之細胞的方法，此係利用數組關於蛋白質產物之終點滴定濃度和終點涎酸變數之比較的實驗培養條件來進行。這些結果係從同時涉及二步驟温度更動方法及每日餵養攝生法（其中在餵養介質中含有涎酸-支持有效量之D-半乳糖 )的細胞培養方法取得。結果可觀察到產物品質增進之改良情形。在5、50和5000升生物反應器中之培養條件控制如下 :pH爲7_0;溶解之氧爲40-60%;在30-50rpm攪動；反壓爲5psi(5升玻璃反應器之周圍壓力）。使用二次-温度更動細胞培養法，其包含爲37 °C之第一種温度，在第6天時降至爲34□之第二種温度，以及在第1〇天時降至爲32 °C之第二種温度。實驗組之描述實驗組I:餵養介質中不含D-半乳糖之5·升培養；實驗組Π :餵養介質中含有12.5克/升D-半乳糖之5- -89- (86) (86)1328614 升培養；實驗組ΠΙ :餵養介質中不含D-半乳糖之50-升培養；實驗組IV :餵養介質中含有3.0克/升D-半乳糖之50_ 升培養；（在實驗組IV中，在第]〇天中斷D·半乳糖餵料，然後從第Π天至第]6天使用一般餵養介質（不含D·半乳糖 )); 實驗組V :餵養介質中含有12.5克/升D-半乳糖之50-升培養；實驗組VI :餵養介質中含有20.0克/升D-半乳糖之50-升培養；實驗組W :餵養介質中不含D-半乳糖之5000-升培養 :及實驗組VD1 :餵養介質中含有12.5克/升 D-半乳糖之 5 000-升培養。從表3中呈現之結果可觀察到：與餵養介質中不含D-半乳糖之對照組相較下，使用含有12.5克/升D-半乳糖之餵養介質可顯著增加5、50和5000 -升規模培養中之產物的涎酸含量。再者，在50-升規模培養中加入3克/升D-半乳糖，但在第10天中斷D·半乳糖餵料時（實驗組IV ;表3; 和第1圖），可暫時性地對涎酸化程度產生正面影響，但涎酸含量在第10天後會很快地減少。在50升規模之培養中，涎酸化程度會隨著餵養介質中之較高的D·半乳糖濃度 (12.5克/升）而增加。此發現肯定在介質中之較高D_半乳糖饌料濃度，及使用含有D-半乳糖之餵養介質的每曰餵 -90- (87) (87)1328614 養攝生法。表3 實施例# 反應器規模[L] 餵養策略 S A(N ANA) [對全部蛋白質之莫耳比] 半乳糖 [對全部蛋白質之莫耳比] 滴定濃度 [克/升] I 5 在餵養介質中 7.5 8.8 1.8 不含D -半乳糖 (第12天） (第12天） (第14天） II 5 在餵養介質中 9.1 15.9 1 .9 含12.5克/升之 (第12天） (第12天） (第Μ天） D-半乳糖 III 50 在餵養介質中 6.1 9.2 1.4 不含D-半乳糖 (第13天） (第13天） (第13天） 5.0 8.1 2.0 (第16天） (第16天） (第16天） IV 50 在餵養介質中 7.8 n/a 1.2 含3.0克/升 D- (第13天） n/a (第13天）半乳糖在第10天中斷 5 . 5 1 .9 顧養D_半乳糖 (第16天） (第16天） (88) (88)1328614 V 50 在餵養介質中含12.5克/升之 D-半乳糖 9.4 (第14天） 8.2 (第20天） 13.3 (第14天） 14.4 (第20天） ---- 1.4 (第1 4天） 2.4 (第2 0午、 VI 50 在餵養介質中 8.4 14.5 1.4 含20.0克/升之 (第14天） (第天） (第14天） D-半乳糖 6.2 11.2 2.7 (第2 1天） (第21天） (第2 1天、 VII 5000 在餵養介質中 5.3 9.1 0.85 無D-半乳糖 (第12天） (第12天） (第1 2天） VIII 5000 在餵養介質中 9.7 11.5 0.80 含12.5克/升之 (第1 4天） (第14天） (第1 4天） D -半乳糖根據這些實驗，加入D-半乳糖不會顯著影響細胞之特殊產製力（也就是，增加滴定濃度），（第2圖）。在餵料中將D -半乳糖進一步增加成20.0克/升時並無進一步之有利效果（實驗組VI ;表3 ;第1圖）。第3圖示爲在餵料中之D-半乳糖的濃度爲12.5克/升時，培養中的殘餘D-半乳糖濃度，此12.5克/升之濃度對50升和5 000升規模而言爲理想之濃度》在生產相期間，當滴定濃度增加時（也就是第6· 21天），培養中之殘餘D-半乳糖濃度需維持在>0.25克/升。第4圖說明在將用於產製CTLA4Ig之細胞培養的規模放大爲5000升的過程期間所觀察到的規模放大效果。醣蛋白 •92- (89) (89)1328614 之涎酸化隨著反應器規模增加而降低。第5圖示爲將12.5 克/升之D-半乳糖加入餵養介質後。規模放大效果之逆轉情形。每日D-半乳糖餵養技術可在大規模，如：>50升（如：50 00升）生產反應器中產製出大量之高度涎酸化的 CTLA4Ig。實施例3 本實施例特別關於如本文中實施例4 - 6中所描述之温度更動細胞培養方法，並提供用於培養可產製 CTLA4Ig 融合蛋白質之重組細胞的温度更動方法中的物質及試劑。 1.細胞培養介質用於細胞接種代之所有相，及養育在生物反應器（包括5升（5L)及50升（50L)之生產反應器）中之培養的基礎細胞培養介質爲含有麩醯胺、碳酸氫鈉、胰島素和胺基甲基葉酸（因維特金公司，加卅卡斯貝市；見表1)之修正的CD · CHO介質。WlNHCl將介質之pH値調整爲7.0。在分批餵養方法中係使用含下列物質之修正的餵養介質，也就是eRDF-Ι介質（因維特金公司）來餵養細胞：葡萄糖' 麩醯胺、胰島素和TC酵母酸化物（貝通-迪金生公司，紐澤西卅富蘭克林湖市）（表2)。在這些實驗方面，餵養介質中沒有半乳糖存在。加入所有成分後，以IN NaOH 將餵養介質之pH値調整爲7.0。 -93 - (90) (90)1328614 2. 在生物反應器中之生產相生產之生物反應器先以分批反應器之型式操作’操作時密切監測及控制温度' 壓力、pH和溶解之氧濃度。經由測量存活細胞密度及數種關鍵代謝物之濃度來評估培養情況。餵養過程係在接種後一天開始。剩餘之醱酵過程係以分批-餵養模式進行。使用5升規模（具有一個海水推進器的玻璃反應器）及 50升規模（具有二個海水推進器的不銹鋼反應器）之生物反應器。（見實施例4)。在整個操作過程中，以資料取得系統（因特迅固定32)記錄溫度、PH和溶解之氧（DO)。經由轉子流速計來控制氣流。經由一浸沒之玻璃料（5微米細孔大小）將空氣引入反應器中，並通過反應器頭部空間排出 C Ο2 °氧分子係透過相同之玻璃料引入，以用來控制d Ο 。C〇2係透過相同之玻璃料引入，以用來控制ρΗ ^ 3. 餵養策略接種後24小時，若葡萄糖濃度a』克/升，則在反應器中加入每日最低量之修正的eRDF-Ι餵養介質，此爲1 % 运養容積。在其中葡萄糖濃度^3〇克/升之情況中，計算每曰之大九劑餵料的容積’以使葡萄糖濃度回升至3〇克/ 升。將每日餵養量記錄在分批工作單上。 4. 採樣以每日爲基準’從反應器中移出細胞樣本。以錐蟲藍 -94 - (91) (91)1328614 (史格馬公司，密蘇里州聖路易市）將用於細胞計數之樣本染色。利用顯微鏡，經由血球細胞計算器來計算細胞並測定細胞存活力。在代謝物分析方面’將另外之樣本在 2000rpm(4°C )下離心20分鐘，以分離出細胞。對上淸液分析下列變數：滴定濃度、涎酸、葡萄糖、乳酸化物、麩醯胺、麩胺酸化物、pH、p02、pC02 '氨及隨意地加上乳酸脫氫酶（LDH)。將其它備用樣本冷凍在- 20°C。實施例4 本實施例描述從培養之CHO細胞產製CTLA4Ig(如第 8圖中所示之-1至3 5 7或+1至3 5 7)(編碼 DNA以 ATCC 68629之編號存放）的方法。本實施例進一步描述用於產製高產量和高品質之CTLA4Ig蛋白質的本發明方法，本發明之方法涉及具有二-或三-步驟温度更動，且總操作時間爲I4' 21或28-30天的培養操作過程。一次温度更動（T-更動）係在第6天（對數生長相結束時），從37 t：降至34 °C，而第二次T-更動係在第1〇天，從34 降至32它。該操作過程在第14天、第21天或第28天結束，而在二-步驟更動方面，温度從第1 0天之更動開始，直到操作過程結束皆控制在32 °C。在三-步驟温度更動方面，温度從該次更動的那天開始’直到操作過程結束皆控制在3 0它。與—次温度更動或無温度更動之操作過程相較下，所描述之過程可增加蛋白質產物之終點滴定濃度、增加最終細胞存活力及容量生產力。根據本發明’第二和第三次了_更動可將標準醱 -95- (92) 1328614 酵（培養）過程之操作時間延長至二至三週（或更久），但仍維持高細胞存活力。在整個產製期間可觀察到產物滴定濃度接近線性增加。

將用於表現CTLA4Ig之CHO細胞利用T-75燒瓶（康寧公司，紐約州康寧市），及250和500毫升旋轉燒瓶（貝可公司，紐澤西州維尼蘭市）在含下列物質之修正的CD-CHO介質中增殖：麩酿胺、碳酸氫鈉、胰島素和胺基甲基葉酸（見實施例3)。將 T-燒瓶，及旋轉燒瓶在37 t、 6%C02中培養。產生足夠接種量後，將培養轉移至分別具有3升或30升操作容積之上述介質的5升生物反應器（艾普利康公司，加州佛斯特市）或5 〇升生物反應器（非米爾公司，紐約州西若可斯市）中。起始接種密度爲約2xl05存活細胞/毫升。

5升容器爲配備一個海水推進器的玻璃反應器（艾普利康公司，加州佛斯特市）；50升容器爲一配備二個海水推進器的不銹鋼反應器（非米爾公司，紐約州西若可斯市）。在整個操作過程中，以利用因特迅固定3 2之資料取得系統 (因特迅公司，麻州佛斯布洛市）記錄温度、pH和溶解之氧（DO)。經由轉子流速5十（寇帕馬公司（Cole Prmer)，伊利諾州維儂丘市）來控制氣流。經由一被浸沒之玻璃料（5微米細孔大小）將空氣引入反應器中，並通過反應器頭部空間排出C 02。氧分子係透過相同之玻璃料引入，以用來控制D Ο。C Ο2係透過相同之玻璃料引入，以用來控制高側 p Η。經由加入1 N N a Ο Η來控制低側p Η。不作爲限制用， -96- (93) (93)1328614 可接受之pH値範圍爲6-9，宜爲6.8-7.2，而克分子滲透壓濃度方面爲200-500 mOsm，較合適的爲280-340mOsm。利用如實施例3中所描述之含葡萄糖、麩醯胺、胰島素和TC酵母酸化物（貝通迪金生公司）的修正的eRDF介質（因維特金公司，加卅），依下述每日以大九劑餵料餵養反應器中之培養：在接種後第1天，加入1 %培養容積之最低量；若葡萄糖濃度低於3克/升時，則加入一計算過之容積，以使葡萄糖濃度回升至3.0克/升。 5升規模之醱酵過程期間爲2]天，50升規模者爲28天。5 0升規模之培養操作期較長與該操作過程所加之温度更動有關。以每日爲基準，從反應器中取出樣本以進行分析。例如：以錐蟲藍（史格馬公司，密蘇里州聖路易市）將用於細胞計數之樣本染色。利用血球細胞計算器來計算細胞，並測定細胞存活力，在顯微鏡下計算存活之染色細胞。在代謝物分析方面，將另外之樣本份在2000rpm(4°C)下離心2 0分鐘，以將細胞沈澱成小九。利用本技藝中傳統使用之技術和實驗計劃對上淸液分析下列變數：蛋白質滴定濃度、涎酸、葡萄糖、乳酸化物、麩醯胺、麩胺酸化物、 pH ' p02 ' pC〇2 ' 氛及 LDH。實施例5 此實施例描述及呈現比較性評估的結果，以評定不同温度更動培養程序，包括根據本發明之觀點進行的多步驟培養方法。醣蛋白產物之最終滴定濃度（以克/升計）係以蛋 -97- (94) (94)1328614 白質之最終滴定濃度涎酸含量，操作過程結束時之細胞存活力（最終細胞存活力）及操作過程結束時之細胞密度（存活之終點細胞密度）來測定。實驗 I-A、I-B 和 Ι-C; ΙΙ-Α、Π-Β 和 ΙΙ-C;及 HJ-A、 1Ή · B和III - C係指在不同時間評估之具相同温度更動略圖的相同細胞培養操作過程，也就是，在I-A、II-A及III-A 方面’產物和細胞變數係在1 4天後評估，在I - B、11 - B及 m-B方面，產物和細胞變數係在天後評估，而在丨-c、 11 - C及m - C方面’產物和細胞變數係在2 8天後評估。這些實驗係在一 5升生物反應器中進行，其中之培養條件控制如下：pH爲7.0;溶解之氧爲40%;在60 rpm攪動；而起始温度爲37 °C »這些資料係從根據本發明之分批-餵養的細胞培養醱酵反應中取得。實驗I、π和m之設計如下：實驗I :從第〇天至第2 1天，細胞培養之温度係控制在37°C (無温度更動）。實驗Π :從第0天至第6天，細胞培養之温度係控制在 37°C ;而從第6天至第21天，則在34°C(—次温度更動）。實驗m :從第〇天至第6天，細胞培養之温度係控制在 37 °C ;從第6天至第10天，在34 t ;而從第1〇天至第21天 ’則在32 °C (本發明之二步驟温度更動程序）。實驗IV-A和V-A顯示在具初始（標準）生產相之Μ天培養操作過程結束時所評估之產物滴定濃度、最終細胞存 -98- (95) (95)1328614 活力及存活之終點細胞密度的結果；實驗1 v _ B和V - B顯示具延長之生產相的2 1天培養操作過程結束時所評估的這些結果；實驗IV-C和V-C顯示具第二次延長之生產相的 28天培養操作過程結束時所評估的結果。實驗iv和V係在一 5 0升生物反應器中進行，其中之培養條件控制如下： pH爲7.0，溶解之氧爲40% :在3〇rpm攪動；而起始温度爲 3 7 °C。實驗IV和V之設計如下：實驗IV:從第〇天至第6天’細胞培養之温度係控制在37°C ;從第6天至第1〇天’在34。(：；而從第10天至第28 天，則在32 °C (本發明之二步驟温度更動程序）。實驗V:從第0天至第6天，細胞培養之温度係控制在 37°C ;從第6天至第1〇天，在34°C ;從第10天至第14天，在32°C :從第14天至第28天，則在30°C (本發明之三-步驟温度更動程序）。實驗V-A、V_B和V-C係指在不同時間評估之具相同温度更動略圖的相同細胞培養操作過程，也就是，在 V.A方面，產物和細胞變數係在14天後評估 ’在V-B方面，在21天後評估，而在V-C方面，則在28 天後評估。實驗Ι-V代表如上述之5種不同培養操作過程。如上述，I 4天之操作過程定名爲"a"，2 1天之操作過程定名爲"B" ’而28天之操作過程定名爲"C"。表4呈現之實驗結果係證明不同温度更動略圖對5升反 -99- (96) 1328614 應器規模之培養中的細胞產製CTLAqg之能力的影表4 實反應溫最終滴最終滴定終點SA 終點滴定最終存活之終點驗器規度定濃度濃度（％) (Nana*) 濃度*終細胞細胞密度 # 模更 (克/升） (實驗I-A (莫耳比）點SA 存活 (χΙΟ6細 (升）動設疋爲 (NANA) 力胞/毫升） 100%) (%) 在具初始（標準）生產相之1 4天培養操作過程結束時所評估之產斤滴定濃度、最終細胞存活力及存妖之終點細胞密度 I-A 5 3 7 °C ( 0 - 1 4 天） -無τ·更動- 0.73 100 7.3 5.3 56 0.8 II-A 5 37°C (0-6天） 34°C (6-] 4天） -單一步驟T-更動- 1.30 178 8.1 10.5 82 1 .5 III-A 5 37°C (0-6天） 34°C (6-1 0天） 3 2 °C (1 0 - 1 4 天） -二步驟T-更動- 2.30 3 15 7.6 17.5 8 1 3.1 在具延長之生產相的21天培養操作過程結束時所評估之產物滴定濃度、最終細胞存活力及存活之終點細胞密度 -100- (97) 1328614 I-B 5 3 7 °C (〇 · 2 1 天） -無T -更動- 1.30 1 78 6.6 ______ 8.6 20 0.3 1I-B 5 37°C (0-6 天） 3 4 °C (6 - 2 1 天） -單一步驟T-更動- 2.70 3 70 5.3 14.3 28 0.4 III-B 5 3 7 〇C (0 - 6 天） 3 4 °C (6 -1 0 天） 3 2。(：（ 1 0 - 2 1 天） -二步驟T-更動- 3.50 480 6.5 22.8 57 1.7 ·** * : ”NANA”（N-胺基-N-神經胺酸）係指涎酸（SA) ° "終舅 NANA”係指在培養結束時之產物的NANA。表5呈現之實驗結果係證明不同温度更動略圖對50升反應器規模之培養中的細胞產製CTLA4Ig之能力的影響表5 實驗反應器溫度最終滴定最終細存活之終點細胞密 # 規模更動濃度胞存活度（X 1 06細胞/毫升） [升] (克/升）力（％) 在具初始（標準）生產相之]4天培養操作過程結束時所評估之產物滴定濃度、最終細胞存活力及存活之終點細胞密度 -101 - (98) 1328614 IV-A 50 3 7 °C (0 - 6 天） 3 4 °C (6 -1 0 天） 3 2。。（ 1 0 -1 4 天） -二步驟T-更動· 1.4 95 5.5 V-A 50 3 7 °C (0 - 6 天） 3 4 °C (6 -1 0 天） 3 2 °C (1 0 - 1 4 天） 3 Ot (1 4 - 2 1 天） -三步驟T-更動- 1 .4 9 1 5.4 在具延長之生產相的2 1天培養操作過程結束時所評估之產物滴定濃度、最終細胞存活力及存活之終點細]§ 泡密度 IV-B 50 3 7 °C (0 - 6 天） 3 4 〇C (6 · 1 0 天） 3 2 °C (1 0 - 2 1 天） -二步驟T-更動- 2.5 67 2.5 V-B 50 37°C (0-6 天） 3 4 °C (6 -1 0 天） 3 2 °C (1 0 -1 4 天） 3 0 °C (I 4 - 2 1 天） -三步驟T·更動- 2.6 82 3.2

在具進一步延長之生產相的28天培養操作過程結束時所評估之產物滴定濃度、最終細胞存活力及存活之終點細胞密度 -102- (99) (99)1328614 IV-C 50 37。。（0-6天） 3 4 °C (6 -1 0 天） 3 2 t (1 0 - 2 8 天） -二步驟T-更動· 2.8 47 1 . 1 V-C 50 37〇C (0-6天） 34°C (6-1 0天） 3 2 °C (1 0 -1 4 天） 3 0 °C (1 4 - 2 8 天） -三步驟T-更動- 3.1 69 1.4 從本實施例中之實驗已證明多-步驟温度更動略圖可在整個培養過程維持高細胞存活力。具體地說，在表4中 ’實驗11I-B顯示出在整個21天之培養過程（包括延長之生產相）中使用定時之二步驟温度更動略圖可維持高細胞存活力（亦見第6圖）’讓滴定濃度在6.5 [莫耳比]之高涎酸含里時達到3 5克/升。—·步驟培養程序之成功亦可從，，終點滴定濃度X終點涎酸”之高數學乘積値得到證明。對照下’無温度更動之培養方法（表4，實施例導致細胞存活力早期哀退。再者，與根據本發明之二步驟温度更動略圖和過程相較下，使用單一-步驟之温度更動（表 4，實施例Π-Β)會產生較低之最終滴定濃度、終點涎酸和 "終點滴定濃度X終點涎酸數學乘積値。另外’表5中所呈現之涉及在5〇升反應器規模中進行的細胞培養的結果證明本發明之多步驟温度更動培養技術 -103- (100) 的優點。第三次温度更動至30 〇C係定時在其是’與二次温度更動相比下，三次温度力和最終滴定濃度的益處是可見的（表5，第2圖）。從表5中可觀察到，與無或一次下’根據本發明之三次温度更動，尤其是 21和28天培養操作過程方面，可進—步延及蛋白質生產。由於規模-放大效應（此常 )’在50升反應器規模中產生滴定濃度的努中者稍慢。然而，吾人可很容易地察知：害由本發明所提供之二或多次温度更動培從實施例5中所呈現之結果證明，與照操作過程相比下，那些其中在第6天（也相結束時）進行温度更動之操作過程可取定濃度和細胞存活力。從這些結果可觀察次温度更動可使容積生產力增加二倍。第次温度更動可產生較高之細胞存活力，並生產力（與無T-更動之操作過程相比下，經由測定醣蛋白產物之涎酸含量可知產物實施例6 本實施例呈現之資料顯示出：根據本向下温度更動的細胞培養過程對每單位時之蛋白質（如：CTLA4Ig)量並無統計上有第14天進行。尤更動對細胞存活實驗V _ C ;亦見更動之方法相比，如：在延長之長細胞存活力，見於細胞培養中 I度較在5升規模這類作用不會損養操作的優點。無温度更動之對就是在指數生長得較佳之最終滴到，經由使用一 10天進行之第二進一步增加容積約爲其3倍），而仍可維持高品質發明之包含二次間每細胞所產製意義的效果。根 -104 - (101) 1328614 據多次温度更動之細胞培養（醱酵）方法，在本方法中之蛋白質的全部產量爲有較多細胞存活至過程結束所得的結果。由於有更多細胞在延長之生產時間存活’因此在過程結束時有較多細胞可存活著生產所需蛋白質。換言之’可在過程或培養操作結束時產生較多量之所需蛋白質。表6說明在本發明所包含之方法的不同時間中的細胞特異生產力。細胞特異生產力係藉上述程式來測定。因此，設計用來產製 CTLA4Ig'其它可溶性 CTLA4分子及可溶性CTLA4突變種分子的培養過程爲一種非-生長相關之過程’其中蛋白質係在第6天或約第6天，也就是在指數細胞生長後，約在靜止相開始時開始生產。呈現在表6中之資料係關於實施例5中所進行之實驗。表6 實施例/T-更動變數細胞特異性蛋白質產製（時間）細胞特異性蛋白質產製量 I-A/無T-更動 14天後 44.7微微克/細胞/天 I-B/無T-更動 21天後 64.1微微克/細胞/天 ΙΙ·Α/—次T·更動 14天後 55.5微微克/細胞/天 ΙΙ-Β/—次Τ-更動 21天後 60.9微微克/細胞/天 ΙΙΙ-Α/二次Τ-更動 14天後 47.5微微克/細胞/天 ΙΙΙ-Β/二次Τ-更動 21天後 5 1 .9微微克/細胞/天 -105- (102) (102)1328614 在表6中之細胞特異性生產力係依本文前述’利用細胞密度及滴定濃度測量値來計算。本技藝中之技術熟習人士可察知，細胞密度測量値通常具有約10-20%標準差（SD) ，也就是高SD，因而並不精確。因此，細胞特異性生產力之測定値具相對應之1 0-20%標準差。因此，由於涉及這些計算類型之SD較高，因此在不同之操作時間中，每天每細胞所產製之產物量在無T·更動、一次T·更動或二次 T-更動的過程間並無顯著差異。由本發明新提供之細胞培養過程所產製之大量的高品質蛋白質產物，及全部增加之蛋白質產量係歸因於在包含多次向下温度更動的整個培養過程中有較多存活細胞數。

實施例7 實施例7 A 本實施例7A提供在本發明方法中，用來培養可產製如實施例7 B _ 1 3中所描述之例示的L 1 0 4 E A 2 9 YI g的重組細胞的物質和試劑。 1.細胞培養介質用於細胞接種代之所有相，及用來養育在生物反應器（包括5升（5L)及50升（50L)之生產反應器）中之培養的基礎細胞培養介質爲如表7中所示範之修正的 CD-CHO介質’其含有麩醯胺、碳酸氫鈉、胰島素和胺基甲基葉酸（因維特金公司，加卅卡斯貝市）。以1NHC1將介質之pH値調整爲7.0。 -106- (103) 1328614 表7 修正之CD-CHO介質成分濃度 CD-CHO 25x 酸類 I (因維特金公司，加州卡斯貝市） 40毫升/升 CD-CHO 25x 酸類 II (因維特金公司，加州卡斯貝市） 40毫升/升 CD-CHO 25x 鹽類 I (因維特金公司，加州卡斯貝市） 40毫升/升 CD-CHO 25x 鹽類 II (因維特金公司，加州卡斯貝市） 40毫升/升 L-麩醯胺 (因維特金公司） 0.5 8 5克/升 r-人類胰島素 (10毫克/毫升） (因維特金公司） 0.1毫升/升胺基甲基葉酸 (20mM溶液） (ICN，加州，卡塔梅莎市） 5毫升/升碳酸氫鈉 (馬蘭克洛貝可公司，紐澤西州菲利浦柏格市） 2.22克/升

在除了實施例]0外之所有實施例中，在分批餵養過程中係使用如表8中所示之含有下列物質的修正餵養介質， -107- (104) 1328614 也就是eRDF-】介質（因維特金公司）來餵養細胞：葡萄糖、麩醯胺、胰島素和TC酵母酸化物（貝通-迪金生公司，紐澤西卅富蘭克林湖市），。加入所有成分後，以]N NaOH將餵養介質之pH値調整爲7.0。表8 修正之eRDF介質成分濃度 eRDF- 1 (因維特金公司，加州卡斯貝市） 16.8克/升右旋糖 (VWR-馬蘭克洛貝可公司） 30.94克/升 L-麩醯胺 (因維特金公司） 4. 1克/升 r-人類胰島素 (10毫克/毫升） (因維特金公司） 1毫升/升 T C酵母酸化物 (貝通迪金生公司，紐澤西州法蘭克林湖市） 5克/升 D-半乳糖 (費洛-凡斯提公斤（Ferro-Pfanstiehl)，伊利諾州瓦奇根市） 12.5克/升

在實施例10方面，餵養介質爲如前述之介質再加上一 -108- (105) (105)1328614 項修正：eRDF-1濃度爲25.2克/升。 2. 在生物反應器中之生產相生產之生物反應器先以分批反應器之型式操作，操作時密切監測及控制温度、壓力、pH和溶解之氧濃度。經由測量存活細胞密度及數種關鍵代謝物之濃度來評估培養情況。饌養過程係在接種後一天開始。剩餘之醱酵過程係以分批-餵養模式進行。使用5升規模（具有一個海水推進器的玻璃反應器）、 1〇升規模（具有二個海水推進器的不銹鋼反應器）及50升規模（具有二個海水推進器的不銹鋼反應器）的生物反應器。 (見實施例2)。在整個操作過程中，以資料取得系統（因特迅固定32)記錄温度、pH和溶解之氧濃度（DO) »經由轉子流速計來控制氣流。經由一浸沒之玻璃料（5微米細孔大小 )將空氣引入反應器中，並通過反應器頭部空間排出C Ο 2 。氧分子係透過相同之玻璃料引入，以用來控制DO。 C〇2係透過相同之玻璃料引入，以用來控制pH。 3. 餵養策略接種後2 4小時，若葡萄糖濃度> 3 · 0克/升，則在反應器中加入每日最低量之修正的eRDF-Ι餵養介質，此爲1% 培養容積。在其中葡萄糖濃度<3.0克/升之情況中，計算每曰之大九劑餵料的容積，以使葡萄糖濃度回升至3.0克/ 升。將每日餵養量記錄在分批工作單上》 -109- (106) 1328614 4.採樣

以每日爲基準，從反應器中移出細胞樣本。以錐蟲藍 (史格馬公司，密蘇里州聖路易市）將用於細胞計數之樣本染色。利用顯微鏡，經由血球細胞計算器，或經由塞得克 (Cedex)自動細胞計數器（伊諾瓦提斯，德國畢勒非德市）來計算細胞並測定細胞存活力。在代謝物分析方面，將另外之樣本在2000rpm(4°C)下離心20分鐘，以將細胞分開。對上淸液分析下列變數：滴定濃度、涎酸、葡萄糖、乳酸化物 '麩醯胺、麩胺酸化物、pH、p02 ' pC02、氨及隨意地加上乳酸脫氫酶（LDH)。將其它備用樣本冷凍在-20°C。

實施例7B 本實施例7B 描述從培養之 CHO 細胞產製 L104EA29YIg (如第9圖中所示之-1至3 5 7或+1至3 5 7)(編碼 DNA以PTA-2104之編號存放在ATCC)的方法。

本實施例亦描述涉及將多陰離子性化合物，更具體地說爲硫酸葡聚糖加入細胞培養中的本發明方法。將用於表現L104EA29YIg之CHO細胞利用T-75燒瓶，及搖動-燒瓶在含下列物質之修正的CD-CHO介質（因維持公司，加卅）中增殖：麩醯胺、碳酸氫鈉、胰島素和胺基甲基葉酸。將T-75燒瓶及搖動·燒瓶在37°C和6%(：02中培養。產生足夠之接種量後，將培養轉移至利用上述之修正的CD-CHO介質的5升或10升生物反應器中。起始接種密度爲約200,000個存活細胞/毫升或1〇6細胞/毫升。 -110- (107) (107)1328614 5升和1 0升容器分別爲配備一個及二個海水推進器的玻璃反應器（艾普利康，加州佛斯特市）。經由轉子流速計來控制氣流。經由一浸沒之玻璃料（5微米細孔大小）將空氣引入反應器中’並通過反應器頭部空間排出C〇2。氧分子係透過相同之玻璃料引入，以用來控制DO。（：02係透過相同之玻璃料引入’以用來控制高側p Η。低側p Η係經由加入INNaOH或Na2C03來控制。利用含葡萄糖、半乳糖、魅醯胺 '膜島素和TC酵母酸化物（貝通-迪金生公司）之修正的eRDF介質（因維特金公司），以下述方式，每日以大九劑餵料來饌養反應器中之培養：在接種後第1天，加入爲1 %培養容積之最低量；或者’若葡萄糖濃度低於3克/升，則加入—計算過之容積，以使葡萄糖濃度回升至3.0克/升。在除了貫施例13外之所有實施例中，從第〇天至第6天，温度係控制在3 7 t ;從第6天至第1 〇天，温度控制在3 4 °C ;從第1 0天起，温度控制在3 2 °C。醱酵過程之典型期間爲14-19天。以每日爲基準，從反應器中取出樣本以進行分析。以錐蟲藍（史格馬公司，密蘇里州）將用於細胞計數之樣本染色。利用塞得:克；自動^ 細胞計數器（伊諾瓦提斯AG，德國畢勒菲德市）來計算，細胞’並測定細胞存活力。對上淸液進行下列分析： LEA29Y滴定濃度、葡萄糖 '乳酸化物、麩醯胺、鍵胺酸化物、pH' p〇2、pC〇2' 氣。將硫酸葡聚糖（鈉鹽’來自平均分子量爲5〇〇〇道耳頓 -111 - (108) 1328614 之葡聚糖’史格馬公司’密蘇里州）溶入水中或介質中。將溶液進行無菌過濾，並將其加入反應器中，使濃度爲50 毫克/升。加入之容積至多構成加入當時之反應器操作容積的2 % » 實施例8 本實施例描述及呈現比較性硏究之結果，以評估在接種後的一個時間加入多陰離子性化合物（更具體地說爲硫酸葡聚糖）之效果。在5升和10升生物反應器中接種〇. 2χ 106細胞/毫升之 L104EA29Y-產製細胞。實驗8-a和8-b設計如下：實施例8-a :培養中不加入硫酸葡聚糖（"對照組"培養 :有4個培養在5升生物反應器中，4個培養在10升生物反應器中）。實施例8-b :在第6天時，將培養中之硫酸葡聚糖的濃度加成50毫克/升（"DS第6天”培養：有2個培養在5升生物反應器中，1個培養在1〇升生物反應器中）。實施例8 - a和8 - b之平均存活力、存活細胞密度和總細胞密度略圖，及其標準差記載於第]1圖中。在對照培養中，在第6和7天之間可觀察到存活細胞密度之高原期，相當於靜止相。對照培養在第7天（平均而言 )後可觀察到存活細胞密度和存活力下降，相當於死亡相 -112- (109) 1328614 。當第6天在培養中加入硫酸葡聚糖後，生長相可延長至第1 1天。相對於對照組之3.5x]06細胞/毫升，加入硫酸葡聚糖者之存活細胞密度可達到平均5·2χ106細胞/毫升。在此延長之生長相期間，存活力維持高於9 0 %。第1 1天後，存活細胞密度及總細胞密度以比例方式下降，這表示有細胞溶解，結果’存活力指數直到第15天仍維持高於90 %

第12圖爲加入硫酸葡聚糖之培養及對照操作中，以存活細胞密度作爲時間函數的對數表示。死亡率（由第11圖中之存活細胞密度的斜度得知）根據硫酸葡聚糖是否存在而有不同。在硫酸葡聚糖之存在下，死亡率在第12天和第 1 9天之間約爲固定’數値爲〇 . 〇〇 1 21Γ 1。相反的，對照組之平均死亡率在第8天和第12天之間的數値最高，〇.〇〇241Γ1 。因此，在第6天加入硫酸葡聚糖可以2倍速度減緩死亡相期間之細胞死亡率。

不管上述之硫酸葡聚糖的益處，加入或不加入硫酸葡聚糖所得之產物Ll〇4EA29YIg的滴定濃度類似（表9)。· 表9:在第6天加入硫酸葡聚糖對第14天之產物 L 1 04EA29YIg的滴定濃度的影響。_ 條件操作數第Μ天之平均滴定濃度之標滴定濃度準差對照過程 8 1.60 0.18 第6天硫酸葡聚糖 3 1.57 0.13 -113- (110) 1328614 表]0中記載不同操作過程中，L104EA29YIg涎酸化的程度。由於操作過程間之變化性相當大，在第6天加入硫酸葡聚糖可被認爲未顯著影響L104EA29YIg之涎酸化。表1 〇 :在第6天加入硫酸葡聚糖對產物LI 04EA29YIg之涎酸化的影響。條件操作數 NANA莫耳比對照過程 1 6.8(14) 對照過程 2 5.5(14) 對照過程 3 5.7(15) 對照過程 4 5.5(15) 對照過程 5 5.5(15) 對照過程 6 6.3(16) 第6天硫酸葡聚糖 7 5.4(14) 第6天硫酸葡聚糖 8 6.9(14) 第6天硫酸葡聚糖 9 6.9(16) 實施例9 此實施例顯示將硫酸葡聚糖加入在死亡相中之細胞培養的效果。在L104EA29YIg-產製細胞之5升生物反應器中進行接種，接種密度爲1〇6細胞/毫升，而死亡相從第5天開始。在第6天加入硫酸葡聚糖。存活力、存活細胞密度及總細胞密度略圖呈現在第]3 -114- (111) 1328614 圖中。在這類培養之第6天加入硫酸葡胞密度發生大幅下降，直到第17天。因間加入硫酸葡聚糖時，可將死亡相遏制在此操作過程中，可在第1 4天取得度，NANA莫耳比爲6.6。實施例1 0 此實施例顯示將硫酸葡聚糖加入在養的效果。在 L104EA29YIg-產製細胞之10升接種，接種密度爲0.2x1 〇6細胞/毫升。，每日餵養者爲一種更濃縮之調和物，第10天才開始（第14圖）。直到第Μ天才存活力、存活細胞密度及總細胞密圖中。在第14天加入硫酸葡聚糖可使存天，之後便中斷培養。此實施例爲在死亡相期間將硫酸葡遏制細胞死亡的另一說明。實施例1 1 此實施例顯示在第0天加入硫酸葡將本實驗中可見到之效果與其中延遲加它實驗中所見到的效果進行比較可知道糖的效果。聚糖可預防存活細此，當在死亡相期數天。 1.9克/升之滴定濃死亡相中之細胞培生物反應器中進行在此特殊實施例中結果，死亡相延至口入硫酸葡聚糖。度略圖呈現在第1 4 活細胞密度穩定4 聚糖加入培養中來糖的效果。經由入硫酸葡聚糖的其遲加入硫酸葡聚 -115 - (112) (112)1328614 在2個重複之5升生物反應器中接種入0.2x 106細胞/毫升之Ll04EA29YIg-產製細胞，並在接種之同一天（第0天）加入濃度爲50毫克/升之硫酸葡聚糖。存活力、存活細胞密度及總細胞密度略圖呈現在第15 圖中。沒有一個培養可達到比缺乏硫酸葡聚糖之培養來得高的細胞密度（比較第1 1圖和第1 5圖）。相對於在第6天加入硫酸葡聚糖之培養中的細胞於第11天進入死亡相，此細胞係在第7或8天進入死亡相（比較第11圖和第15圖）。在這些操作過程之第Μ天所取得之L104EA29YIg滴定濃度爲 0.57克/升（操作過程#1)及0.86克/升（操作過程#2)，其顯著低於在對照過程中，或在第6天加入硫酸葡聚糖之過程中所取得之滴定濃度（見實施例8)。這些結果證明加入硫酸葡聚糖之時間對加入結果的重要性。不受限於任何理論，我們提出：加入硫酸葡聚糖所觀察到之效果及這些效果對加入時間之倚賴性可由硫酸葡聚糖以類似於多硫酸聚戊醣結合肝素-結合生長因子的方式 (Zugmaier et al·，1992)來結合多種自動分泌因子而獲得解釋。我們提出：硫酸葡聚糖在這些因子之肝素-結合功能區塊與這些因子結合，而使該功能區塊變成無法連接細胞表面硫酸乙醯肝素蛋白多醣。因此，硫酸葡聚糖·結合因子無法集中在細胞表面，這使得這些因子結合至其受體之可能性大爲降低。最終效果爲這些因子無法再在細胞上行使其正常作用。在接種後的最先幾天，細胞產生某些生長 -116- (113) (113)1328614 因子，其功能爲傳遞細胞生長的訊息。在第0天加入之硫酸葡聚糖可在這些因子產生時即與其以不可逆轉的方式結合。然而，硫酸葡聚糖與這些因子結合不會以不利的方式大大影響細胞的生長，這可能是因爲細胞可經由增加產生生長因子來反應。在生長相期間後期，生長因子停止產生 ’細胞開始產生不同型態之自動分泌因子，其在高濃度之作用爲傳遞生長相結束及細胞死亡開始的訊號。這些因子從第〇天之低濃度累積至稍後之高濃度。那時，這些因子可有效傳遞細胞停止生長，及進入靜止和死亡相的訊息。我們提出：硫酸葡聚糖優先與這些死亡-傳訊因子結合，因此使其無法傳訊，而使生長相延長。細胞死亡之進行似乎需要由這些死亡·傳訊因子持續誘導，結果，當硫酸葡聚糖使其無法作用時（即使是遲至培養之第1 4天），已進入死亡相之細胞仍可重新被安排進入靜止相（實施例9和10) 。相反地，在第0天加入之已與生長因子結合的硫酸葡聚糖在生長相結束時仍與這些因子結合，這使得其無法與死亡·傳訊分子結合。因此，其中硫酸葡聚糖係在第0天加入培養中之情況（實施例Π )並無法像硫酸葡聚糖係在生長相結束時加入的情況般延長生長相及延遲死亡相開始。在實施例6中，造成該於第6天補充硫酸葡聚糖之培養在第11天停止細胞生長，並開始細胞死亡的機制被假設爲與該由硫酸葡聚糖-結合自動分泌因子所誘導者不同。可能的情形爲，在生長11天後，介質中之特殊營養用盡而使這些培養之生長相結束。 -117- (114) (114)1328614 實施例】2 本實施例比較在初始生長相期間的三種不同時間加入硫酸葡聚糖的效果。將 L104EA29YIg-產製細胞之培養以1〇6細胞/毫升接種入5-升之生物反應器。在不同時間將濃度爲50毫克/升之硫酸葡聚糖加入培養中。在一種培養中，硫酸葡聚糖係在第3天加入，在另一種培養中’在第4天加入，而在第三種培養中，硫酸葡聚糖係在第5天加入。存活力及存活細胞密度略圖記載於第1 6圖中。在所有加入硫酸葡聚糖之三種情況（第3' 4或5天）中均得到高存活細胞密度（>1〇7細胞/毫升），但較早加入（第3或4天）者則無法預防存活細胞密度在生長相之後立即下降。相反的，第5天加入可在生長相之後將存活細胞密度穩定4天。在經過250小時後之時間點，在第5天加入硫酸葡聚糖之培養中的存活細胞密度總是較在第4天加入硫酸葡聚糖之培養中的存活細胞密度來得高或與其相等（在測量誤差內），而在第4天加入硫酸葡聚糖之培養中的存活細胞密度總是較在第3天加入硫酸葡聚糖之培養中的存活細胞密度來得高或與其相等（在測量誤差內）。因此，從此實施例顯示出加入硫酸葡聚糖之理想時間爲初始生長相（指可在未加入任何硫酸葡聚糖時所觀察到之生長相）結束時。較早加入硫酸葡聚糖可延長生長相’但無法在由硫酸葡聚糖所誘導之延長生長相之後仍一樣有效地穩定存活細胞的密度，然而，較晚（在死亡相期間）加入硫酸葡聚糖可穩定存活細胞密度 (115) (115)1328614 ’但可能無法實質增加存活細胞密度（見實施例9和10)。因此，在第5天加入硫酸葡聚糖可在第Μ天取得2.7克/升之滴定濃度，而在第3或第4天加入硫酸葡聚糖可在第14天取得2.6克/升之滴定濃度，在第6天加入硫酸葡聚糖可在第1 4天得到1.9克/升之滴定濃度（在實施例9中）。在上述之操作過程中，NANA莫耳比分別爲6.3、6.6、6.0和6.6，其顯示出在理想時間加入硫酸葡聚糖可得到較高之滴定濃度’並伴隨著固定之涎酸化水準。實施例1 3 本實施例顯示一和二次温度更動在產製L104EA29YIg 之培養中的效果。此培養亦進行延遲加入硫酸葡聚糖的實驗。在5升反應器中接種細胞，密度爲200,000細胞/毫升〇使用二次、一次或無T-更動。在一次温度更動方面 ’溫度係在第6天從37 °C更動至34 °C。在二次温度更動方面，温度係在第6天從37 °C更動至34 °C，並在第10天從34 °C更動至32 °C。在所有情況中，硫酸葡聚糖係在第6天加入。二次T-更動之情况爲三次操作過程之平均，而標準差以粗帶表示。存活細胞密度、存活力和滴定濃度分別記載於第17、 1 8和1 9圖中》結果顯示使用至少一次温度更動的益處。在其中整個 -119- (116) (116)^1328614 操作過程温度均維持在37 °C的情況中，培養在第10天進入死亡相’且存活細胞密度和存活力之下降快速。結果，在培養12天後，L104EA29YIg容積生產力明顯降低。在14天和更久之培養時間方面’很明顯地，具—或二次温度更動之培養在滴定濃度方面將勝過固定温度之培養。在其中僅進行一次温度更動（在第6天，更動至34。(：）的情況中’在第1 6天後可觀察到存活細胞密度和存活力快速下降。其中除了第一次温度更動外還進行第二次温度更動（在第10天，更動至32 °C)的培養中，在第16天後未顯示存活細胞密度和存活力快速下降。培養時間經過1 8天後，在一次T-更動之培養中的容積產製力不如在二次T-更動之培養中的容積產製力》相反的，在介於第11天和第15天之培養時間中，具一次T-更動之培養中的容積產製力優於具二次T-更動之培養中的容積產製力。結論，第一次温度更動之益處與所需之收成時間無關，然而，第二次温度更動之益處則視所欲收成之時間及取得有效之下游處理所需的存活力而定。無第二次温度更動將直到第2 0天才能達到較高之產物滴定濃度’但對操作長過20天之培養而言，具二次温度更動之培養在滴定濃度方面將勝過具一次温度更動之培養。另外’必須考慮到：在具一次T-更動之培養中，超過第12天之收成將較具二次 Τ -更動之培養含有較多之細胞溶解產物’此點將使下游處理複雜化。在具一次Τ-更動略圖之情況中’第12天後所觀察到之存活細胞密度快速下降的情形將爲對產物品質的 -120- (117) (117)1328614 顧慮之一，因爲相對應之細胞死亡可能在上淸液中釋入大量之涎酸酶，而降低產物之涎酸化。所有此處所參考和列舉之核發及准予的專利、專利申請書、出版之PCT和U.S.申請案、文章、書籍 '參考資料和教育手冊及摘要的全文倂爲本文之參考，以更詳細描述本發明相關之技藝狀態。由於上述主題內容可做多種變化而不背離本發明之範圍和精神，所有包含在上述說明，或附屬之申請專利範圍中所定義者均解釋爲本發明之描述和說明。根據上述之教示內容可對本發明做多種改良和變化。【圖式簡單說明】第1圖示爲在50·升反應器規模之細胞培養過程中，使用在餵養介質中包含D-半乳糖的餵養攝生法來取得醣蛋白產物（也就是CTLA4Ig融合蛋白質）的結果。如第1圖中所觀察到者，在50_升反應器規模下，餵養介質中的D-半乳糖濃度較高（12.5克/升）時，涎酸化程度會增加》再者，將餵養介質中之D-半乳糖濃度進一步增加至2〇.〇克/升時，對蛋白質之涎酸化作用並無正面效果》第2圖說明在使用本發明之培養和饌養方法的50·升反應器規模中，D ·半乳糖對於在2 1 -天細胞培養操作過程中之產物滴定濃度的影響。從第2圖中可觀察到，加入D -半乳糖並未被發現可顯著影響滴定濃度（也就是細胞特殊生產力）之增加情形。 -121 - (118) 1328614 第3圖示爲在餵養介質中之D-半乳糖濃 (對50-升和5 000-升反應器規模而言，此爲3 本發明細胞培養中之殘餘D -半乳糖濃度。加之生產相期間（也就是第6-21天），培養中. 糖濃度宜>0.25克/升。第4圖說明在將產製CTLA4Ig之細胞培 5000升的期間內所觀察到之規模放大效果。化程度被發現隨著反應器規模增加而減少。第5圖示爲以每日餵養爲基準，在餵 12.5克/升D-半乳糖後，規模放大效果之逆丨半乳糖餵養技術可在大規模生產反應器中產酸化的CTLA4Ig。第6圖示爲不同之温度更動略圖對於在器規模中培養的細胞之細胞存活力的影響。本文實施例5中所描述之實驗中取得。所比温度更動（"無T-更動”）、一次温度更動（"單二次向下温度更動（"二次T-更動”）的培養方第7圖示爲不同之温度更動略圖對於在應器規模中培養的細胞之細胞存活力的影響從本文實施例3中所描述之實驗中取得。所三次向下温度更動（"三次T-更動”）和二次向二次T-更動"）的培養方法。第8圖描述一核苷酸序列（SEQ ID NO: CTLA4Ig 的胺基酸序歹IJ (SEQ ID NO: 2)，ll 度爲12.5克/升理想濃度）時，在滴定濃度增之殘餘D-半乳 •養規模放大爲醣蛋白之涎酸養介質中加入轉情形。此D-製大量高度涎 5升（5L)反應這些結果係從較的爲不涉及一 T-更動"）和法。 50升（50L)反。這些結果係比較的爲涉及下温度更動（" 1)和所編碼之 b CTLA4Ig 具 -122- (119) (119)1328614 —訊號肽、一CTL A4之胞外功能區塊的野生型胺基酸序列（其係從位置+1之甲硫胺酸開始至位置+124之天門冬酸，或從位置-1之胺基丙酸開始至位置+ 1 24之天門冬酸）’ 及一 Ig區。第9圖描述一核苷酸序列（SEQ ID NO: 3)和所編碼之 CTLA4突變種分子（L104EA29YIg)的胺基酸序歹IJ (SEQ ID NO : 4)，此CTLA4突變種分子（LI 04EA29YIg)具一訊號、突變之CTLA4的胞外功能區塊（其係從位置+1之甲硫胺酸開始至位置+1 24之天門冬酸結束，或從位置-1之胺基丙酸開始至位置+124之天門冬酸結束），及一 Ig區》第10圖描述一核酸序列（SEQ ID NO: 5)和所編碼出之人類CTLA4受體（此處稱爲"野生型"CTLA4)的完全胺基酸序列（SEQ ID NO: 6)，該人類CTLA4受體係融合至抑制瘤素 Μ訊號肽（位置-26至-2) (U.S.專利第5,434,1 3 1和 5,844,095號）。第Π圖示爲其中硫酸葡聚糖係在初始生長相結束時加入之培養中，延遲加入硫酸葡聚糖對存活細胞密度、總細胞密度，和存活力的影響。這些結果係從本文實施例8中所描述之實驗中取得。所比較的爲在初始生長相結束時加入硫酸葡聚糖之培養和其中不加入硫酸葡聚糖之培養》標繪平均値；誤差帶代表標準差。第12圖示爲延遲加入硫酸葡聚糖對死亡率的影響。此爲存活細胞密度作爲時間函數的對數表示。這些結果係從本文實施例8中所描述之實驗中取得。所比較的爲其中在 -123- (120) (120)1328614 初始生長相結束時加入硫酸葡聚糖之培養和其中不加入硫酸葡聚糖之培養。標繪平均値；誤差帶代表標準差。第1 3圖示爲其中硫酸葡聚糖係在初始死亡相期間加入之培養中，延遲加入硫酸葡聚糖對存活細胞密度、總細胞密度，和存活力的影響。這些結果係從本文實施例9中所描述之實驗中取得。所比較的爲在初始死亡相期間加入硫酸葡聚糖之培養和其中不加入硫酸葡聚糖之培養。第1 4圖示爲其中硫酸葡聚糖係在初始死亡相期間加入之培養中，延遲加入硫酸葡聚糖對存活細胞密度、總細胞密度，和存活力的影響。這些結果係從本文實施例1 0中所描述之實驗中取得。所比較的爲在初始死亡相期間加入硫酸葡聚糖之培養和其中不加入硫酸葡聚糖之培養。第15圖示爲其中硫酸葡聚糖係在培養第0天加入之培養中的存活細胞密度、總細胞密度，和存活力。這些結果係從本文實施例11中所描述之實驗中取得。第16圖示爲其中硫酸葡聚糖係在初始生長相之三種不同時間（第3天、第4天和第5天）加入之培養中的存活細胞密度和存活力。這些結果係從本文實施例12中所描述之實驗中取得。第I7圖示爲不同温度更動略圖對存活細胞密度之影響。這些結果係從本文實施例1 3中所描述之實驗中取得。所比較的爲不涉及温度更動Γ無T-更動"）、一次溫度更動（" —次T-更動"）和二次向下温度更動（"二次T-更動"）的培養方法。 -124 - (121) 1328614 第18圖示爲不同温度更動略圖結果係從本文實施例1 3中所描述之爲不涉及温度更動（”無T-更動”）、更動"）和二次向下温度更動（"二次T -第19圖示爲不同温度更動略圖f 些結果係從本文實施例1 3中所描述；^ 的爲不涉及温度更動（"無T-更動"） T-更動"）和二次向下温度更動（"二次存活力之影響。這些驗中取得。所比較的次温度更動（"一次T-更動"）的培養方法。滴定濃度之影響。這實驗中取得。所比較一次温度更動（"一次 τ -更動"）的培養方法 -125-

Claims

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(1) G 拾、申請專利範圍啲玍c El , ~Ί η年s月（3日埯;,<)正衣附件B : "~ -- 第92 1 36006號專利申請案中文申請專利範圍替換本民國99年5月1 3曰修正 1· 一種用於產製可溶性CTLA4分子之細胞培養方法，其包含： a) 將在細胞培養中產製可溶性CTLA4分子的中國倉鼠卵巢（CHO)細胞在可產製蛋白質的條件下進行培養；及 b) 以D-半乳糖餵養該細胞。 2.如申請專利範圍第1項之方法，其中該餵養步驟b) 係每日進行。 3 ·如申請專利範圍第丨項之方法，其中該餵養步驟b) 係連續進行。 4 _如申請專利範圍第1項之方法，其中D-半乳糖係在餵養基質中餵予細胞。 5·如申請專利範圍第1項之方法，其中餵予細胞之D-半乳糖的量爲1至50克/升。 6.如申請專利範圍第5項之方法，其中餵予細胞之D-半乳糖的量爲3至25克/升。 7·如申請專利範圍第1項之方法，其中在細胞培養中 D-半乳糖的濃度係持續或維持在〇·2至5克/升。 8·如申請專利範圍第ί項之方法，其中該細胞培養爲超過50升之細胞培養。 (2) (2)132.8614 9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中所產製之可溶性CTLA4分子的涎酸化程度增加。 10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該可溶性 CTLA4分子爲CTLA4融合蛋白質。 11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該可溶性 CTLA4融合蛋白質爲CTLA4Ig。 12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該可溶性 CTLA4融合蛋白質爲包含如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸-1 至 3 5 7 或 +1 至 357 之 CTLA4Ig。 1 3 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該可溶性 CTLA4分子爲可溶性CTLA4突變分子。 14. 如申請專利範圍.第13項之方法，其中該可溶性 CTLA4突變分子爲包含如SEQ ID NO : 4所示之胺基酸-1 至 3 5 7或+1 至 3 57的 Ll04EA29YIg。 15. 如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含： c) 將CHO細胞在37°C或接近37°C之温度下且於可讓細胞生長的條件下培養一段可讓細胞生長的時期； d) 然後將該CHO細胞在34°C或接近34°C之第二温度下培養；及 e) 再將該CHO細胞在32t或接近32°C之第三温度下培養。 16. 如申請專利範圍第1項之方法·，其進一步包含： c)在接種後的一個時間，將多陰離子性化合物加入細胞培養中。

-2 - (3) (3)1328614 17. 如申請專利範圍第15項之方法，其進一步包含： f)在接種後的一個時間，將多陰離子性化合物加入細胞培養中。 18. 如申請專利範圍第15項之方法，其進一步包含： c) 將CHO細胞在37°C或接近37°C之温度下且於可讓細胞生長的條件下培養一段可讓細胞生長的時期； d) 從培養之約第6天開始，將該CHO細胞在34°C或接近34°C之第二温度下培養；及 e) 從培養之約第1 0天開始，將該C Η 0細胞在3 2 °C或接近32°C之第三温度下培養》 19·如申請專利範圍第18項之方法，其進一步包含： f) 在接種後的一個時間’將多陰離子性化合物加入細胞培養中。 20.如申請專利範圍第1及I5至19項中任一項之方法，其進一步包含在接種後的一個時間’將硫酸葡聚糖加入細胞培養中。

-3- 1328614 附件4:第92136006號專利申請案中文圖式替換頁民國99年5月13日修正 -Α·存活力-DS第6天（3次操作過程）-ό·存活力-對照组（8次操作過程）-♦-存活細胞-DS第6天（3次操作ig程） -〇存活細胞-對照组（8次操作過程）-*總細ft數-DS第6天(3次《作過程）總細胞數-對照组（8次操作過

間時 rL 第圖