DE60225914T2 - Verfahren zum schützen eines allogenen inseltransplantats mit löslichen ctla4-mutationsmolekülen - Google Patents

Verfahren zum schützen eines allogenen inseltransplantats mit löslichen ctla4-mutationsmolekülen Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Inhibition der Abstoßung des Inselzelltransplantats. Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Behandlung von Diabetes, einschließlich des Typ-I- und Typ-II-Diabetes durch Verabreichung einer wirksamen Menge von löslichen CTLA4-Mutantenmolekülen an ein Individuum.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Organtransplantation ist als ein bevorzugtes Verfahren zur Behandlung vieler Formen von lebensbedrohlichen Erkrankungen, die mit einer Organschädigung einhergehen, hervorgegangen. Verbesserte Ergebnisse bei der klinischen Transplantation wurden primär durch die Entwicklung von zunehmend potenten, nicht spezifischen Immunsuppressiva zur Inhibition der Abstoßungsantworten erreicht (Lancet, 345: 1321–1325 (1995)). Während sich die Kurzzeitergebnisse verbessert haben, bleiben die Langzeit-Outcomes inadäquat. Zur Zeit sind lebenslang anzuwendende Immunsuppressiva zur Bekämpfung der chronischen Abstoßung des transplantierten Organs erforderlich, und die Anwendung dieser Mittel steigert dramatisch die Risiken für kardiovaskuläre Erkrankungen, Infektionen und Malignitäten.
  • Die Entwicklung von Strategien zur Förderung der Verträglichkeit allogener Gewebe ohne die Notwendigkeit für eine chronische Immunsuppression könnte das Risiko dieser lebensbedrohlichen Komplikationen reduzieren und die Applikation von Organ-, Gewebe- und Zelltransplantationen bei Erkrankungen, wie zum Beispiel Hämoglobinopathien, genetischen Immundefizienzen und Autoimmunkrankheiten, weitgehend erweitern.
  • Der insulinabhängige Diabetes mellitus (IDDM) stellt eine der am häufigsten vorkommenden metabolischen Erkrankungen auf der Welt dar. In den Vereinigten Staaten ist ca. eine von 300 bis 400 Personen von IDDM betroffen, und epidemiologische Studien deuten darauf hin, dass die Inzidenz für IDDM weiterhin im Zunehmen begriffen ist. IDDM wird durch eine Autoimmunantwort ausgelöst, die zur T-Lymphozyten vermittelten Zerstörung der Insulin produzierenden Inselzellen des Pankreas führt.
  • Sobald die klinischen Symptome des IDDM evident werden, handelt es sich bei der am häufigsten eingesetzten Therapie zur Kontrolle der klinischen Symptome des IDDM um den exogenen Insulinersatz. Obwohl die Insulinersatztherapie den meisten IDDM-Patienten ermöglicht, ein einigermaßen normales Leben zu führen, stellt sie die metabolische Homeostase nicht vollkommen wieder her, und auf Grund dessen treten bei Diabetikern unter einer Insulinersatztherapie, schwerwiegende Komplikationen, einschließlich Funktionsstörungen von Augen, Nieren, Herz und anderen Organen häufig auf.
  • Eine lange gesuchte Behandlung für IDDM-Patienten stellt die Inseltransplantation dar. Die transplantierten Insulin produzierenden Inselzellen werden jedoch häufig rasch von der gleichen Autoimmunantwort zerstört, die zuvor des Patienten eigene Inselzellen zerstört hat. Von den seit 1990 transplantierten 260 Allotransplantaten führten nur 12,4% für die Dauer von länger als eine Woche zur Insulinunabhängigkeit und nur 8,25% sind für eine Zeitdauer von länger als ein Jahr insulinunabhängig gewesen (Linsley et al., Diabetes (1997) 46: 1120-3). Für die Mehrzahl dieser Verfahren bestand das Basisregime der Immunsuppression aus der Antikörper-Induktion mit einem Antilymphozytenglobulin in Kombination mit Cyclosporin, Azathiprin und Glucocorticoiden.
  • Für jedweden Typ der Transplantationsverfahren stellt ein Gleichgewicht zwischen Wirksamkeit und Toxizität einen Schlüsselfaktor für seine klinische Verträglichkeit dar. Hinsichtlich der Inseltransplantation bestehen weitere Bedenken darin, dass viele der derzeitigen Immunsuppressiva mit insbesondere Glucocorticoiden oder einem Calcineurin-Inhibitor, wie zum Beispiel Tacrolimus, die β-Zellen schädigen oder die periphere Insulinresistenz induzieren (Zeng et al., Surgery (1993) 113: 98–102).
  • Ein steroidfreies immunsuppressives Protokoll („Edmonton-Protokoll"), das Sirolimus, Tacrolimus in niedriger Dosis und einen monoklonalen Antikörper (mAk) gegen den IL-2-Rezeptor einschließt, wurde in einer Studie zur Inseltransplantation für Patienten mit Typ-I-Diabetes allein eingesetzt (Shapiro, A. M. J. et al., (2000), N. Eng. J. Med., 343: 230–238).
  • Der kürzlich erzielte Erfolg unter Verwendung des „Edmonton-Protokolls" hat den Enthusiasmus für die Anwendung der Inseltransplantation zur Behandlung des Diabetes wieder aufleben lassen. Die Bedenken in Bezug auf die Toxizität von Tacrolimus könnten jedoch die Applikation dieser Therapie bei Menschen gegebenenfalls einschränken. Biologische Mittel, die die wichtigen costimulatorischen Signale der T-Zellen, insbesondere des CD28-Signalwegs blockieren, stellen potenzielle Alternativen zum Schutz der allogenen Inseln dar. Beispiele von Mitteln, die den CD28-Signalweg blockieren, schließen folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf lösliche CTLA4-Moleküle, einschließlich mutanter CTLA4-Moleküle.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines löslichen CTLA4-Mutantenmoleküls in der Herstellung eines Arzneimittels zum Inhibieren der Abstoßung eines Inselzelltransplantats, worin das lösliche CTLA4-Mutantenmolekül eine mutierte extrazelluläre Domäne von CTLA4 umfasst, wobei die mutierte extrazelluläre Domäne von CTLA4 Folgendes aufweist:
    • a) eine Aminosäuresequenz, die wie in 3 gezeigt mit Methionin an Position +1 beginnt und mit Asparaginsäure an +124 endet, oder die wie in 3 gezeigt mit Alanin an Position –1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet;
    • b) eine Aminosäuresequenz, die wie in 19 gezeigt mit Methionin an Position +1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet, oder die wie in 19 gezeigt mit Alanin an Position –1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet;
    • c) eine Aminosäuresequenz, die wie in 20 gezeigt mit Methionin an Position +1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet, oder die wie in 20 gezeigt mit Alanin an Position –1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet;
    • d) eine Aminosäuresequenz, die wie in 21 gezeigt mit Methionin an Position +1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet, oder die wie in 21 gezeigt mit Alanin an Position –1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet; oder
    • e) eine Aminosäuresequenz, die wie in 22 gezeigt mit Methionin an Position +1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet, oder die wie in 22 gezeigt mit Alanin an Position –1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein lösliches CTLA4-Mutantenmolekül zur Verwendung beim Inhibieren der Abstoßung eines Inselzelltransplantats, worin das lösliche CTLA4-Mutantenmolekül wie vorstehend definiert ist.
  • Gemäß einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Inselzelltransplantation zur Behandlung von Diabetes, insbesondere des Typ-I- oder Typ-II-Diabetes bestimmt. Das Inselzelltransplantat kann umhüllte Inselzellen umfassen.
  • Das Inhibieren der Abstoßung eines Inselzelltransplants kann die Verabreichung des löslichen CTLA4-Mutantenmoleküls vor, während oder nach der Inselzelltransplantation umfassen.
  • Gemäß einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die extrazelluläre Domäne von CTLA4 an einen Nicht-CTLA4-Teil fusioniert, wobei der Nicht-CTLA4-Teil einen Immunglobulin-Teil, z. B. eine konstante Region des Immunglobulins oder einen Anteil davon umfasst, wie zum Beispiel einen, der eine oder mehr Mutation(en) zum Reduzieren der Effektorfunktion umfasst. Die konstante Immunglobulinregion kann auch die Hinge-, CH2- und CH3-Regionen eines Immunglobulinmoleküls umfassen. Die konstante Immunglobulinregion oder ein Anteil davon kann ferner eine konstante Region eines Immunglobulins vom Menschen oder Affen darstellen.
  • Gemäß einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform stellt das lösliche CTLA4-Mutantenmolekül Folgendes dar:
    • a) L104EA29YIg, wie in 3 gezeigt, beginnend mit Ala an Position –1 oder Met an Position +1 und endend mit Lys an Position +357 (SEQ ID NO: 6, beginnend mit Ala an Position 26 und endend mit Lys an Position 383, oder beginnend mit Met an Position 27 und endend mit Lys an Position 383);
    • b) L104EIg, wie in 19 gezeigt, beginnend mit Ala an Position –1 oder Met an Position +1 und endend mit Lys an Position +357 (SEQ ID NO: 8, beginnend mit Ala an Position 26 und endend mit Lys an Position 383 oder beginnend mit Met an Position 27 und endend mit Lys an Position 383);
    • c) L104EA29LIg, wie in 20 gezeigt, beginnend mit Ala an Position –1 oder Met an Position +1 und endend mit Lys an Position +357 (SEQ ID NO: 10, beginnend mit Ala an Position 26 und endend mit Lys an Position 383 oder beginnend mit Met an Position 27 und endend mit Lys an Position 383);
    • d) L104EA29TIg, wie in 21 gezeigt, beginnend mit Ala an Position –1 oder Met an Position +1 und endend mit Lys an Position +357 (SEQ ID NO: 12, beginnend mit Ala an Position 26 und endend mit Lys an Position 383 oder beginnend mit Met an Position 27 und endend mit Lys an Position 383; oder
    • e) L104EA29WIg, wie in 22 gezeigt, beginnend mit Ala an Position –1 oder Met an Position +1 und endend mit Lys an Position +357 (SEQ ID NO: 14, beginnend mit Ala an Position 26 und endend mit Lys an Position 383 oder beginnend mit Met an Position 27 und endend mit Lys an Position 383).
  • Gemäß einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform stellen das lösliche CTLA4-Mutantenmolekül und mindestens eine zusätzliche Verbindung die dar, für die die zusätzliche Verbindung aus der Gruppe ausgewählt werden kann, bestehend aus immunsuppressiven Verbindungen, immunmodulatorischen Verbindungen und antiinflammatorischen Verbindungen. Die Verbindung kann insbesondere aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus: Anakinra, Adrenocorticosteroiden, Azathioprin, Basiliximab, Calcineurin-Inhibitoren, Chloroquin, Corticosteroiden, Cyclosporin, Prednison, Cyclophosphamid, Cytoxan, 15-Desoxyspergualin und Analogen davon, D-Penicillamin, Etanercept, Glatiramer-Acetat, FTY720 und Analogen davon, Glucocorticoiden, Goldsalzen, Pferde-anti-Human-Thymozytenglobulin (ATGAM), humanisiertem anti-TAC (HAT), Hydroxychloroquin, Infliximab, Interferon-beta-1a, Interferon-beta-1b, Leflunomid und Analogen davon, Lymphozyten-Immunglobulin, Lymphozyten-Homing-Mitteln, Methoxsalen, Methotrexat, Mitoxantronhydrochlorid, Mycophenolsäure, Mycophenolat-Mofetil, Mizoribin, NSAR, Kaninchen-anti-Human-Thymozytenglobulin, Rho(D)-Immunglobulin, Sirolismus (Rapamycin) und Derivaten davon (z. B. 40-0-(2-Hydroxyethyl)-rapamycin), Sulfasalazopyrin, Sulfasalzin, Tacrolimus (FK-506), Thalidomid, TNFα-Blockern und biologische Mittel, die ein inflammatorisches Cytokin targetieren, TOR-Inhibitoren, Verbindungen, die mit CD40 und CD154 interferieren, löslichem gp39, löslichen CD29, löslichen CD40, löslichen CD80 (z. B. ATCC 68627), löslichen CD86, löslichen CD28, löslichen CD56, löslichen Thy-I, löslichen CD3, löslichem TCR, löslichem VLA-4, löslichem VCAM-1, löslichem LECAM-1, löslichem ELAM-1, löslichen CD44, mit gp39 reaktiven Antikörpern (z. B. ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 und ATCC HB-12056), mit CD40 reaktiven Antikörpern (z. B. ATCC HB-9110), mit B7 reaktiven Antikörpern (z. B. ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341), mit CD28 reaktiven Antikörpern (z. B. ATCC HB-11944 oder mAk 9,3), mit LFA-1 reaktiven Antikörpern (z. B. ATCC HB-9579 und ATCC TIB-213), mit LFA-2 reaktiven Antikörpern, mit IL-2 reaktiven Antikörpern, mit IL-12 reaktiven Antikörpern, mit IFN-gamma reaktiven Antikörpern, mit CD2 reaktiven Antikörpern, mit CD48 reaktiven Antikörpern, mit jedwedem ICAM reaktiven Antikörpern (z. B. mit ICAM-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 und ICAM-3), mit CTLA4 reaktiven Antikörpern (z. B. ATCC HB-304), mit Thy-1 reaktiven Antikörpern, mit CD56 reaktiven Antikörpern, mit CD3 reaktiven Antikörpern, mit CD29 reaktiven Antikörpern, mit TCR reaktiven Antikörpern, mit VLA-4 reaktiven Antikörpern, mit VCAM-1 reaktiven Antikörpern, mit LECAM-1 reaktiven Antikörpern, mit ELAM-1 reaktiven Antikörpern, mit CD44 reaktiven Antikörpern, monoklonalen Antikörpern gegen Leukozytenrezeptoren, z. B. MHC, CD2, CD3, CD4, CDIIa/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB oder ihren Liganden, CTLA4/CD28-Ig; LFA-1-Antagonisten, Selectin-Antagonisten und VLA-4-Antagonisten und anti-humanen IL-2R-mAk. Das lösliche CTLA4-Mutantenmolekül und die zusätzliche Verbindung können miteinander verabreicht, gleichzeitig verabreicht oder der Reihe nach verabreicht werden.
  • Gemäß einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst die Abstoßung des Inselzelltransplantats ein zusätzliches immunsuppressives Regime. Das zusätzliche immunsuppressive Regime kann frei von Glucocorticoid sein oder ein Corticosteroid umfassen. Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das zusätzliche immunsuppressive Regime frei von Calcineurin-Inhibitor.
  • Das zusätzliche immunsuppressive Regime kann insbesondere eine oder mehr der vorstehenden Verbindungen umfassen, die in Kombination mit dem löslichen CTLA4-Mutantenmolekül verwendet werden sollen. Es kann Folgendes umfassen: einen TOR-Inhibitor, z. B. Rapamycin (Sirolismus) oder ein Derivat davon, und/oder ein biologisches Mittel, das IL-2, z. B. einen mit IL-2 reaktiven Antikörper oder einen anti-humanen IL-2R-mAk, wie zum Beispiel Basiliximab; Mycophenolsäure oder Mycophenolat-Mofetil; oder eine Verbindung, die mit der Bindung von CD40 an CD154 interferiert, z. B. einen anti-CD40-Antikörper oder einen anti-CD154-Antikörper, targetiert.
  • Gemäß einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst das Inhibieren der Abstoßung des Inselzelltransplantats die Verabreichung von T-zelldepletierten Knochenmarkzellen. Die Verabreichung von T-zelldepletierten Knochenmarkzellen kann ungefähr zur gleichen Zeit wie die Platzierung des Inselzelltransplantats oder vor der Platzierung des Inselzelltransplantats stattfinden. Die Verabreichung der T-zelldepletierten Knochenmarkzellen kann eine erste Dosis und eine zweite Dosis umfassen.
  • Die erfindungsgemäßen löslichen CTLA4-Mutantenmoleküle binden an CD80- und/oder CD86-Moleküle auf CD80- und/oder CD86-positiven Zellen, wodurch die endogenen CD80- und/oder CD86-Moleküle vom Binden von CTLA4 und/oder CD28 auf T-Zellen inhibiert werden, und folglich wichtige costimulatorische Signale von T-Zellen, insbesondere den CD28-Signalweg, blockieren.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 veranschaulicht das komplette Nukleotid (SEQ ID NO: 1) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) für den humanen CTLA4-Rezeptor, der an das Oncostatin M-Signalpeptid fusioniert ist. Das Oncostatin M-Signalpeptid ist an Position –25 bis –1 gezeigt.
  • 2 veranschaulicht ein Nukleotid (SEQ ID NO: 3) und eine Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 4) von einem CTLA4Ig mit einem Signalpeptid; eine Wildtyp-Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne von CTLA4, beginnend bei Methionin an Position +1 bis Asparaginsäure an Position +124 oder beginnend bei Alanin an Position –1 bis Asparaginsäure an Position +124; und eine Ig-Region.
  • 3 veranschaulicht ein Nukleotid (SEQ ID NO: 5) und eine Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 6) von einem CTLA4-Mutantenmolekül (L104EA29YIg), umfassend ein Signalpeptid; eine mutierte extrazelluläre Domäne von CTLA4, beginnend bei Methionin an Position +1 und endend bei Asparaginsäure an Position +124 oder beginnend bei Alanin an Position –1 und endend bei Asparaginsäure an Position +124; und eine Ig-Region wie in Beispiel 1 nachstehend beschrieben ist.
  • 4 stellt ein Kurvendiagramm dar, das den Nüchtern-Plasmaglucosespiegel in einem Gesunden erläutert, wie in Beispiel 3 nachstehend beschrieben ist.
  • 5 stellt ein Kurvendiagramm dar, das den Nüchtern-Plasmaglucosespiegel in pankreatektomierten Individuen mit transplantierten Pankreasinselzellen, wie in Beispiel 3 beschrieben ist, erläutert. Die Tiere wurden am Tag 0 mit Inselzellen transplantiert und entweder mit einem immunsuppressiven Regime mit L104EA29YIg behandelt oder mit einem immunsuppressiven Basisregime (Behandlung), oder einem immunsuppressiven Basisregime (Kontrolle) behandelt. Das immunsuppressive Basisregime enthielt Rapamycin und anti-humanen IL-2R.
  • 6 stellt ein Kurvendiagramm dar, das den Insulinbedarf bei Individuen mit transplantierten Inselzellen, wie in Beispiel 3 beschrieben, veranschaulicht. Die Tiere wurden am Tag 0 mit Inselzellen transplantiert und wurden mit einem immunsuppressiven Regime, enthaltend L104EA29YIg, und einem immunsuppressiven Basisregime (behandelt) oder nur mit einem immunsuppressiven Basisregime (Kontrolle) behandelt.
  • 7 stellt ein Kurvendiagramm dar, das den Blutglucosespiegel in einem intravenösen Glucosetoleranztest vor und nach der Inseltransplantation, wie in Beispiel 3 beschrieben ist, erläutert.
  • 8 veranschaulicht ein schematisches Diagramm von einem Vektor, piLN-L104EA29Y, mit dem L104EA29YIg-Insert.
  • 9A und 9B erläutern die Daten von FACS-Assays, welche die Bindung von L104EA29YIg, L104EIg und CTLA4Ig an humane CD80- oder CD86-transfizierte CHO-Zellen, wie in Beispiel 2 nachstehend beschrieben ist, zeigen.
  • 10A und 10B veranschaulichen die Inhibition der Proliferation von CD80-positiven und CD86-positiven CHO-Zellen, wie in Beispiel 2 nachstehend beschrieben ist.
  • 11A und 11B zeigen, dass L104EA29YIg beim Inhibieren der Proliferation von primären und sekundären allostimulierten T-Zellen wirksamer ist als CTLA4Ig, wie in Beispiel 2 nachstehend beschrieben ist.
  • 12A–C erläutern, dass L104EA29YIg beim Inhibieren von IL-2 (12A), IL-4 (12B) und γ-Interferon- (12C) bei der Cytokinproduktion von allostimulierten humanen T-Zellen wirksamer ist als CTLA4Ig, wie in Beispiel 2 nachstehend beschrieben ist.
  • 13 deutet darauf hin, dass das L104EA29YIg beim Inhibieren der Proliferation von Phytohämagglutinin-stimulierten (PHA-stimulierten) Affen-T-Zellen wirksamer ist als CTLA4Ig, wie in Beispiel 2 nachstehend beschrieben ist.
  • 14A–C stellen ein SDS-Gel (14A) für CTLA4Ig (Spur 1), L104EIg (Spur 2) und L104EA29YIg (Spur 3A); und die Größenausschlusschromatogramme von CTLA4Ig (14B) und L104EA29YIg (14C) dar.
  • 15A und 15B erläutern ein Banddiagramm von der extrazellulären Ig V-ähnlichen Faltung von CTLA4, die aus der mittels der NMR-Spektroskopie bestimmten Lösungsstruktur herbeigeführt wurde. 15B zeigt eine expandierte Ansicht von der S25-R33-Region und der MYPPPY-Region, die auf die Lokalisierung und Seitenkettenorientierung der die Avidität fördernden Mutationen, L104 und A29, hindeutet.
  • 16 veranschaulicht die Nüchtern-Blutglucose bezüglich LEA29YIg-behandelten (A) Empfängern und (B) Kontrollempfängern von allogenen Inseln (repräsentative Tiere) vor und nach der Transplantation. Alle Tiere unterzogen sich mindestens 2 Wochen vor der Transplantation (mittlerer Insulinbedarf vor der Transplantation 8,76 ± 0,18 Einheiten/Tag) der chirurgischen Pankreatektomie. (C) Nach der intraportalen Infusion von allogenen Inseln wurden die Empfänger schnell euglykämisch und benötigten kein exogenes Insulin nach der Transplantation. (D) Die Diabetesinduktion und Inselfraktion nach der Transplantation wurde durch einen intravenösen Glucosetoleranztest vor der Transplantation und zum Monat 1 und Monat 3 nach der Transplantation bestätigt, wie in Beispiel 3 nachstehend beschrieben ist.
  • 17 veranschaulicht (A) die Immunhistologie der funktionellen transplantierten Insel, die durch positive Färbung auf Insulin bestätigt wurde. (B) Insel von einem Tier, das das Kontrollregime erhält, umgeben von mononuklearem Infiltrat, was auf Abstoßung hindeutet, wie in Beispiel 3 nachstehend beschrieben ist.
  • 18 veranschaulicht die Suppression von Anti-Donor-T- und B-Zellantworten mittels des L104EA29Y-Regimes. (A) Die Anti-Donor-IFN-γ-ELISpot-Antwort entspricht dem richtigen Zeitpunkt der Abstoßung in den Kontrollen (ca. 1 Woche nach der Transplantation). (B) Das L104EA29Y-Regime supprimiert wirksam die Generierung der Anti-Donor-T-Zell-Antwort. (C) Tiere, die Rapamycin-anti-IL-2R-mAk erhalten, produzieren schnell nachweisbare Anti-Donor-Antikörper, wie anhand durchflusszytometrischer Verfahren zur Zeit der Abstoßung gemessen wurde. (D) Inselempfänger, die das L104EA29Y-enthaltende Regime erhalten, generieren, während sie sich unter Behandlung befinden, keine nachweisbare Anti-Donor-Antikörperantwort, wie in Beispiel 3 nachstehend beschrieben ist.
  • 19 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von L104EIg (SEQ ID NO: 7–8), wie in Beispiel 2 nachstehend beschrieben ist.
  • 20 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von L104EA29LIg (SEQ ID NO: 9–10).
  • 21 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von L104EA29TIg (SEQ ID NO: 11–12).
  • 22 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von L104EA29WIg (SEQ ID NO: 13–14).
  • 23 zeigt die Nukleotidsequenz von einem CTLA4Ig (SEQ ID NO: 15) mit einem Signalpeptid; eine Wildtyp-Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne von CTLA4, beginnend bei Methionin an Position +1 bis Asparaginsäure an Position +124 oder beginnend bei Alanin an Position –1 bis Asparaginsäure an Position +124; und eine Ig-Region.
  • 24 zeigt die Aminosäuresequenz von einem CTLA4Ig (SEQ ID NO: 16) mit einem Signalpeptid; einer Wildtyp-Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne von CTLA4, beginnend bei Methionin an Position +1 bis zur Asparaginsäure an Position +124 oder beginnend an Alanin an Position –1 bis zur Asparaginsäure an Position +124; und eine Ig-Region.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • DEFINITIONEN
  • Alle in dieser Anmeldung verwendeten wissenschaftlichen und technischen Begriffe haben die Bedeutungen, die im Stand der Technik, sofern nicht anderweitig angegeben wird, allgemein im Einsatz sind. Wie in dieser Anmeldung verwendet, weisen die folgenden Wörter und Phrasen die spezifizierten Bedeutungen auf.
  • Wie hierin verwendet, weist das „Wildtyp-CTLA4" die Aminosäuresequenz des in der Natur vorkommendem CTLA4 voller Länge auf ( US-Patente Nr. 5434131 , 5844095 , 5851795 ) oder jedweden Teil davon auf, der ein B7-Molekül (CD80 und/oder CD86) bindet oder mit einem B7-Molekül (z. B. CD80 und/oder CD86) interferiert, damit es ihre Bindung an ihren Liganden blockiert, oder ihre Bindung an die extrazelluläre Domäne von CTLA4 oder Anteile davon blockiert. In besonderen Ausführungsformen beginnt das Wildtyp-CTLA4 mit Methionin an Position +1 und endet bei Asparaginsäure an Position +124, oder das Wildtyp-CTLA4 beginnt mit Alanin an Position –1 und endet an Asparaginsäure an Position +124. In anderen Ausführungsformen besteht das Wildtyp-CTLA4 aus den 187 Aminosäuren des CTLA4-Rezeptors, wie in 3 von US-Patenten Nr. 5434131 , 5844095 , 5851795 , offenbart und hier als 1 gezeigt ist. Wildtyp-CTLA4 stellt ein Zelloberflächenprotein mit einer N-terminalen extrazellulären Domäne, einer Transmembrandomäne und einer C-terminalen zytoplasmatischen Domäne dar. Die extrazelluläre Domäne bindet an Targetantigene, wie zum Beispiel CD80 und CD86. In einer Zelle wird das in der Natur vorkommende Wildtyp-CTLA4-Protein als ein immatures Polypeptid, das ein Signalpeptid am N-terminalen Ende einschließt, translatiert. Das immature Polypeptid unterliegt dem posttranslationalen Processing, das die Spaltung und Entfernung des Signalpeptids zur Herbeiführung eines CTLA4-Spaltprodukts mit einem neu generierten N-terminalen Ende einschließt, das sich vom N-terminalen Ende in der immaturen Form unterscheidet. Ein Fachmann wird erkennen, dass zusätzliches posttranslationales Processing, das eine oder mehr der Aminosäuren aus dem neu generierten N-terminalen Ende des CTLA4-Spaltprodukts entfernt, auftreten kann. Die mature Form des CTLA4-Moleküls schließt die extrazelluläre Domäne von CTLA4 oder jedweden an CD80 und/oder CD86 bindenden Anteil davon ein.
  • Wie hierin verwendet, versteht man unter „der extrazellulären Domäne von CTLA4" den Anteil des CTLA4-Rezeptors, der sich außerhalb der Zellmembran erstreckt und schließt jedweden Anteil von CTLA4 ein, der sich außerhalb der Zellmembran erstreckt, die CTLA4-Liganden, wie zum Beispiel ein B7-Molekül (z. B. CD80- und/oder CD86-Moleküle), erkennt und bindet. Eine extrazelluläre Domäne von CTLA4 umfasst zum Beispiel Methionin an Position +1 bis Asparaginsäure an Position +124 (2). Als Alternative umfasst eine extrazelluläre Domäne von CTLA4 Alanin an Position +1 bis Asparaginsäure an Position +125 (1). Die extrazelluläre Domäne schließt Fragmente oder Derivate von CTLA4 ein, die an ein B7-Molekül (z. B. CD80 und/oder CD86) binden.
  • Wie hierin verwendet, versteht man unter einer „Nicht-CTLA4-Proteinsequenz" oder einem „Nicht-CTLA4-Molekül" jedwedes Molekül, das CD80 und/oder CD86 nicht bindet und nicht mit der Bindung von CTLA4 an sein Target interferiert. Ein Beispiel schließt Folgendes ein, ist aber nicht beschränkt auf eine konstante Immunglobulinregion (Ig-Region) oder einen Anteil davon. Die konstante Ig-Region stellt bevorzugt eine konstante Ig-Region vom Menschen oder Affen, z. B. humanes C(gamma)1, einschließlich der Hinge-, CH2- und CH3-Regionen dar. Die konstante Ig-Region kann zur Reduktion ihrer Effektorfunktionen mutiert werden ( US-Patente Nr. 5637481 ; und 6090914 ).
  • Wie hierin verwendet, verweist „löslich" auf jedwedes Molekül oder jedwede Fragmente und Derivate davon, nicht gebunden oder gebunden an eine Zelle, d. h. zirkulierend. CTLA4, L104EA29YIg, B7 oder CD28 können zum Beispiel durch Binden eines Immunglobulinteils (Ig-Teils) an die extrazelluläre Domäne von CTLA4, B7 bzw. CD28 löslich gemacht werden. Bei anderen Molekülen kann es sich um das E7-Genprodukt (E7) des Papillomavirus, das Melanom-assoziierte Antigen p97 (p97) oder HIV-Hüllprotein (env gp120) handeln. Als Alternative kann ein Molekül, wie zum Beispiel CTLA4 durch Entfernen seiner Transmembrandomäne löslich gemacht werden. In der Regel schließen in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendete lösliche Moleküle keine Signalsequenz (oder Leader-Sequenz) ein.
  • „CTLA4Ig" stellt ein lösliches Fusionsprotein dar, das eine extrazelluläre Domäne von CTLA4 oder einen Anteil davon, der CD80 und/oder CD86 bindet, gebunden an einen Ig-Schwanz umfasst. Eine bestimmte Ausführungsform umfasst die extrazelluläre Domäne des Wildtyp-CTLA4, beginnend bei Methionin an Position +1 und endend bei Asparaginsäure an Position +124; oder beginnend bei Alanin an Position –1 bis Asparaginsäure an Position +124; einen Junction-Aminosäurerest Glutamin an Position +125; und einen Immunglobulinanteil, der die Glutaminsäure an Position +125 bis Lysin an Position +357 umfasst (2). DNA, kodierend für CTLA4Ig, wurde am 31. Mai 1991 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 unter den Vorkehrungen des Budapester Vertrags hinterlegt und erhielt die ATCC-Zugangsnummer ATCC 68629; Linsley, P., et al., 1994 Immunity 1: 793-80). CTLA4Ig-24, eine Ovarialzelllinie des Chinesischen Streifenharnsters (CHO), die CTLA4Ig exprimiert, wurde am 31. Mai 1991 mit der ATCC-Kennnummer CRL-10762 hinterlegt. Die in den erfindungsgemäßen Verfahren und/oder Kits verwendeten löslichen CTLA4Ig-Moleküle können gegebenenfalls eine Signal-(Leader)-Peptidsequenz einschließen. In der Regel schließen die Moleküle in den erfindungsgemäßen Verfahren und/oder Kits keine Signalpeptidsequenz ein.
  • Wie hierin verwendet, versteht man unter „löslichen CTLA4-Molekülen" nicht an die Zelloberfläche gebundene (d. h. zirkulierende) CTLA4-Moleküle (Wildtyp oder Mutant) oder jedweden funktionellen Anteil eines CTLA4-Moleküls, das B7 bindet, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: CTLA4Ig-Fusionsproteine (z. B. ATCC 68629), worin die extrazelluläre Domäne von CTLA4 an ein Immunglobulinteil (Ig-Teil) fusioniert ist, wodurch das Fusionsmolekül löslich gemacht wird, oder Fragmente und Derivate davon; Proteine mit der extrazellulären Domäne von CTLA4, die mit einem Anteil eines biologisch aktiven oder chemisch aktiven Proteins fusioniert oder zusammengefügt sind, wie zum Beispiel dem E7-Genprodukt (CTLA4-E7) des Papillomavirus, dem Melanom-assoziierten Antigen p97 (CTLA4-p97) oder dem HIV-Hüllprotein (CTLA4-env gp120), oder Fragmente und Derivate davon; hybride (chimäre) Fusionsproteine, wie zum Beispiel CD28/CTLA4Ig oder Fragmente und Derivate davon, CTLA4-Moleküle mit entfernter Transmembrandomäne, um das Protein löslich zu machen (Oaks, M. K., et al., 2000 Cellular, Immunology 201: 144–153) oder Fragmente und Derivate davon. „Lösliche CTLA4-Moleküle" schließen auch Fragmente, Anteile oder Derivate davon und lösliche CTLA4-Mutantenmolküle mit CTLA4-Bindungsaktivität ein. Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten löslichen CTLA4-Moleküle können gegebenenfalls eine Signal-(Leader)-Peptidsequenz einschließen. In der Regel schließen die Moleküle in den erfindungsgemäßen Verfahren keine Signalpeptidsequenz ein.
  • Wie hierin verwendet, versteht man unter einem „Fusionsprotein" eine oder mehr Aminosäuresequenz(en), die unter Verwendung von im Stand der Technik liberall bekannten Verfahren und, wie im US-Patent Nr. 5434131 oder 5637481 beschrieben ist, zusammengefügt werden. Die zusammengefügten Aminosäuresequenzen bilden auf diese Weise ein Fusionsprotein.
  • Wie hierin verwendet, versteht man unter einem „CTLA4-Mutantenmolekül" ein Molekül, das ein CTLA4 voller Länge oder Anteile davon (Derivate oder Fragmente) darstellen kann, die in CTLA4 (bevorzugt in der extrazellulären Domäne von CTLA4) eine Mutation oder mehrfache Mutationen aufweisen, damit es dem Wildtyp-CTLA4-Molekül ähnlich, aber nicht mit ihm identisch ist. CTLA4-Mutantenmoleküle binden ein B7-Molekül (z. B. entweder CD80 oder CD86 oder beide). Mutante CTLA4-Moleküle können ein biologisch oder chemisch aktives Nicht-CTLA4-Molekül darin oder daran gebunden einschließen. Die Mutantenmoleküle können löslich sein (d. h. zirkulieren) oder an eine Oberfläche gebunden sein. Die CTLA4-Mutantenmoleküle können die gesamte extrazelluläre Domäne von CTLA4 oder Anteile davon, wie zum Beispiel Fragmente oder Derivate, einschließen. CTLA4-Mutantenmoleküle können synthetisch oder rekombinant hergestellt werden.
  • Wie hierin verwendet, versteht man unter dem Begriff „Mutation" eine Änderung in der Nukleotid- oder Aminosäuresequenz eines Wildtyp-Polypeptids. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Mutation oder eine Änderung in der extrazellulären Domäne des Wildtyp-CTLA4. Die Änderungen in der Wildtyp-CTLA4-Sequenz schließen übliche und nicht übliche Änderungen ein. Bei der Änderung kann es sich um eine Aminosäureänderung handeln, die Substitutionen, Deletionen, Additionen oder Trunkierungen einschließt. Ein Mutantenmolekül kann eine oder mehr Mutation(en) aufweisen. Mutationen in einer Nukleotidsequenz können gegebenenfalls zu einer Mutation in der Aminosäuresequenz führen, wie im Stand der Technik sehr wohl verstanden wird. In dieser Beziehung kodieren bestimmte Nukleotidcodonen für die gleiche Aminosäure. Beispiele schließen die Nukleotidcodonen CGT, CGG, CGC und CGA, die für die Aminosäure Arginin (R) kodieren; oder Codonen GAT und GAC, die für die Aminosäure Asparaginsäure (D) kodieren, ein. Folglich kann ein Protein durch ein oder mehr Nukleinsäuremolekül(e) kodiert werden, die sich in ihrer spezifischen Nukleotidsequenz unterscheiden, aber noch für Proteinmoleküle mit identischen Sequenzen kodieren. Die Aminosäurekodierungssequenz ist wie folgt:
    AMINOSÄURE SYMBOL EINBUCHSTABENCODE CODONEN
    Alanin Ala A GCU, GCC, GCA, GCG
    Cystein Cys C UGU, UGC
    Asparaginsäure Asp D GAU, GAC
    Glutaminsäure Glu E GAA, GAG
    Phenylalanin Phe F UUU, UUC
    Glycin Gly G GGU, GGC, GGA, GGG
    Histidin His H CAU, CAC
    Isoleucin Ile 1 AUU, AUC, AUA
    Lysin Lys K AAA, AAG
    Leucin Leu L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG
    Methionin Met M AUG
    Asparagin Asn N AAU, AAC
    Prolin Pro P CCU, CCC, CCA, CCG
    Glutamin Gin Q CAA, CAG
    Arginin Arg R CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG
    Serin Ser S UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC
    Threonin Thr T ACU, ACC, ACA, ACG
    Valin Val V GUU, GUC GUA, GUG
    Tryptophan Trp W UGG
    Tyrosin Tyr Y UAU, UAC
  • Unter "L104EA29YIg" versteht man ein Fusionsprotein, bei dem es sich um ein lösliches CTLA4-Mutantenmolekül handelt, das Folgendes umfasst: eine extrazelluläre Domäne des Wildtyp- CTLA4 mit Aminosäureänderungen A29Y (ein Tyrosin-Aminosäurerest, der für ein Alanin an Position 29 substituiert) und L104E (ein Glutaminsäure-Aminosäurerest, der für ein Leucin an Position +104 substituiert) oder einen Anteil davon, der ein B7-Molekül bindet, das an einen Ig-Schwanz gefügt ist (eingeschlossen in 3; DNA, kodierend für L104EA29YIg, wurde am 20. Juni 2000 bei der American Type Culture Collection hinterlegt und bekam die ATCC-Nummer PTA-2104 zugeteilt). Die in den erfindungsgemäßen Verfahren und/oder Kits verwendeten löslichen L104EA29YIg-Moleküle können gegebenenfalls eine Signal-(Leader)-Peptidsequenz einschließen. In der Regel schließen die Moleküle in den erfindungsgemäßen Verfahren und/oder Kits keine Signalpeptidsequenz ein.
  • Das Mutantenmolekül kann eine oder mehr Mutation(en) aufweisen. Wie hierin verwendet, versteht man unter einer „Nicht-CTLA4-Proteinsequenz` oder einem „Nicht-CTLA4-Molekül" jedwedes Proteinmolekül, das B7 nicht bindet und das nicht mit der Bindung von CTLA4 an ihr Target interferiert. Ein Beispiel schließt Folgendes ein, ist aber nicht beschränkt auf eine konstante Region des Immunglobulins (Ig) oder einen Anteil davon. Die konstante Ig-Region stellt bevorzugt eine konstante Ig-Region des Menschen oder Affen dar, z. B. humanes C(gamma)1, einschließlich der Hinge-, CH2- und CH3-Regionen. Die konstante Ig-Region kann zur Reduktion ihrer Effektorfunktionen mutiert werden ( US-Patente 5637481 , 5844095 und 5434131 ).
  • Wie hierin verwendet, versteht man unter einem „Fragment" oder „Anteil" jedweden Teil oder jedwedes Segment eines Moleküls, wie z. B. CTLA4 oder CD28, bevorzugt die extrazelluläre Domäne von CTLA4 oder CD28 oder ein Teil oder Segment davon, das sein Target, z. B. ein B7-Molekül, erkennt und bindet.
  • Wie hierin verwendet, versteht man unter „B7" die B7-Familie von Molekülen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf B7-1 (CD80) (Freeman et al., 1989, J. Immunol. 143: 2714–2722, hierin vollständig unter Bezugnahme eingeschlossen), B7-2 (CD86) (Freeman et al., 1993, Science 262: 909–911, hierin vollständig unter Bezugnahme eingeschlossen; Azuma et al., 1993, Nature 366: 76–79, hierin vollständig unter Bezugnahme eingeschlossen), die CTLA4 und/oder CD28 erkennen und binden können.
  • Wie hierin verwendet, versteht man unter „CD28" das Molekül, das B7, wie in den US-Patenten Nr. 5580756 und 5521288 beschrieben (hierin vollständig unter Bezugnahme eingeschlossen), erkennt und bindet.
  • Wie hierin verwendet, versteht man unter „B7-positiven Zellen" jedwede Zellen mit einem oder mehr B7-Molekültyp(en), die auf der Zelloberfläche exprimiert werden.
  • Wie hierin verwendet, versteht man unter einem „Derivat" ein Molekül, das sich die Sequenzähnlichkeit und Aktivität seines Elternmoleküls teilt. So schließt ein Derivat von CTLA4 zum Beispiel ein lösliches CTLA4-Molekül mit einer Aminosäuresequenz ein, die mindestens zu 70% ähnlich mit der extrazellulären Domäne des Wildtyp-CTLA4 ist, und das B7, wie z. B. CTLA4Ig oder das lösliche CTLA4-Mutantenmolekül L104EA29YIg, erkennt und bindet.
  • Wie hierin verwendet, versteht man unter „blockieren" oder „inhibieren" eines Rezeptors, eines Signals oder eines Moleküls das Interferieren mit der Aktivierung des Rezeptors, Signals oder Moleküls, wie durch einen im Stand der Technik anerkannten Test nachgewiesen wurde. So kann zum Beispiel die Blockade einer zellvermittelten Immunantwort durch die Bestimmung der Reduktion der die rheumatische Erkrankung begleitenden Symptome nachgewiesen werden. Die Blockade oder Inhibition kann partiell oder total sein.
  • Wie hierin verwendet, versteht man unter „Blockieren der B7-Interaktion" die Interferenz mit der Bindung von B7 an seine Liganden, wie zum Beispiel CD28 und/oder CTLA4, wodurch die T-Zell- und B7-positiven Zellinteraktionen blockiert werden. Beispiele von Mitteln, die die B7-Interaktionen blockieren, schließen die folgenden ein, sind aber nicht beschränkt auf Moleküle, wie zum Beispiel einen Antikörper (oder einen Anteil oder ein Derivat davon), der jedwedes der CTLA4-, CD28- oder B7-Moleküle (z. B. B7-1, B7-2) erkennt und bindet; eine lösliche Form (oder einen Anteil oder ein Derivat davon) der Moleküle, wie zum Beispiel lösliches CTLA4; ein Peptidfragment oder ein anderes kleines Molekül, das zum Interferieren mit dem Zellsignal durch die CTLA4/CD28/B7-vermittelte Interaktion bestimmt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt das Blockingmittel Folgendes dar: ein lösliches CTLA4-Molekül, wie zum Beispiel CTLA4Ig (ATCC 68629) oder L104EA29YIg (ATCC PTA-2104), ein lösliches CD28-Molekül, wie zum Beispiel CD28Ig (ATCC 68628), ein lösliches B7-Molekül, wie zum Beispiel B7Ig (ATCC 68627), einen gegen B7 gerichteten monoklonalen Antikörper (z. B. ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 und monoklonale Antikörper wie von Anderson et al. im US-Patent 6113898 oder Yokochi et al., 1982. J. Immun., 128(2):823-827) beschrieben, einen gegen CTLA4 gerichteten monoklonalen Antikörper (z. B. ATCC HB-304, und monoklonale Antikörper wie in den Literaturhinweisen 82–83 beschrieben) und/oder einen gegen CD28 gerichteten monoklonalen Antikörper (z. B. ATCC HB 11944 und mAk 9,3 wie von Hansen (Hansen et al., 1980, Immunogenetics 10: 247–260) oder Martin (Martin et al., 1984. J. Clin. Immun., 4(1): 18–22) beschrieben).
  • Wie hierin verwendet, versteht man unter „Erkrankung des Immunsystems" jedwede Erkrankung, die durch T-Zellinteraktionen mit B7-positiven Zellen vermittelt wird, einschließlich folgender, aber nicht beschränkt auf: Autoimmunkrankheiten, Transplantat bedingte Störungen und immunproliferative Erkrankungen. Zu Beispielen von Erkrankungen des Immunsystems gehören folgende: Graftversus-Hostkrankheit (GVHD) (z. B. wie sie auf Grund einer Knochenmarktransplantation oder bei der Toleranzinduktion entstehen kann), Immunstörungen, einhergehend mit der Transplantatabstoßung, die chronische Abstoßung, und Gewebe- oder Zellallo- oder -xenotransplantate, einschließlich solider Organe, Haut, Inseln, Muskeln, Hepatozyten und Neuronen. Beispiele von immunproliferativen Erkrankungen schließen folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf: Psoriasis, das T-Zelllymphom, die akute lymphoblastische T-Zellleukämie, testikuläres angiozentrisches T-Zelllymphom, benigne lymphozytische Angiitis, Lupus (z. B. Lupus erythematodes, Lupusnephropathie), Hashimoto-Thyreoiditis, primäres Myxödem, Basedow-Krankheit, perniziöse Anämie, atrophe Autoimmungastritis, Addison-Krankheit, Diabetes (z. B. Insulin abhängiger Diabetes mellitus, Typ-I-Diabetes mellitus, Typ-II-Diabetes mellitus), Goodpasture-Syndrom, Myasthenia gravis, Pemphigus, Morbus Crohn, sympathische Ophthalmie, Autoimmunuveitis, multiple Sklerose, hämolytische Autoimmunanämie, idiopathische Thrombozytopenie, primäre biliäre Zirrhose, chronisch aktive Hepatitis, ulzerative Colitis, Sjögren-Syndrom, rheumatische Erkrankungen (z. B. rheumatoide Arthritis), Polymyositis, Sklerodermie und gemischte Bindegewebserkrankung.
  • Wie hierin verwendet, schließt „Individuum" Folgendes ein, ist aber nicht beschränkt auf Menschen, nicht humane Primaten (z. B. Affen, Menschenaffen), Schafe, Kaninchen, Schweine, Hunde, Katzen, Mäuse oder Ratten.
  • Wie hierin verwendet, wird ein „Gewebetransplantat" als ein Gewebe vom gesamten Organ oder einem Teil eines Organs, das an einen Empfänger transplantiert wird, definiert. In bestimmten Ausführungsformen stammt das Gewebe von einem oder mehr soliden Organ(en). Beispiele von Geweben oder Organen schließen folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf Haut, Herz, Lunge, Pankreas, Niere, Leber, Knochenmark, Pankreas-Inselzellen, pluripotente Stammzellen, Zellsuspensionen und genetisch modifizierte Zellen. Das Gewebe kann aus einem Donor entnommen oder kann in vitro gezüchtet werden Bei dem Transplantat kann es sich um ein Autotransplantat, Isotransplantat, Allotransplantat oder Xenotransplantat oder eine Kombination davon handeln.
  • Wie hierin verwendet, wird „Transplantatabstoßung" als der nahezu vollständige oder vollständige Verlust von lebensfähigem Transplantatgewebe aus dem Empfänger definiert.
  • Wie hierin verwendet, wird „Einkapselung" als ein Vorgang, der Zellen und/oder Zellcluster, die therapeutische Substanzen, wie zum Beispiel Insulin, produzieren und sezernieren, immunisoliert, und die medizinische Anwendung dieser Formulierungen, definiert. Der Einkapselungsvorgang beinhaltet die Platzierung der Zellen und/oder Zellcluster in einer semipermeablen Membranbarriere vor der Transplantation, um die Abstoßung durch das Immunsystem zu vermeiden. Der Cutoff-Punkt des Molekulargewichts der Einkapselungsmembran kann mithilfe des Einkapselungsverfahrens kontrolliert werden, um auf diese Weise die nach innen gerichtete Diffusion des Immunglobulins und der lytischen Faktoren des Komplementsystems auszuschließen, aber die Passage kleinerer Moleküle, wie zum Beispiel Glucose und Insulin, zuzulassen. Die Einkapselung erlaubt den Inselzellen, physiologisch auf Änderungen der Blutglucose anzusprechen, verhindert aber den Kontakt mit Komponenten des Immunsystems. Verfahren zur Einkapselung von Pankreas-Inselzellen sind in US-Patent 6080412 beschrieben.
  • Wie hierin verwendet, versteht man unter „Ligand" ein Molekül, das spezifisch ein anderes Molekül erkennt und bindet, ein Ligand für CTLA4 stellt zum Beispiel ein CD80- und/oder CD86-Molekül dar.
  • Wie hierin verwendet, schließt „ein löslicher Ligand, der das CD80- und/oder CD86-Antigen erkennt und bindet" Liganden, wie zum Beispiel CTLA4Ig, CD28Ig oder andere lösliche Formen von CTLA4 und CD28; rekombinantes CTLA4 und CD28; mutante CTLA4-Moleküle, wie zum Beispiel L104EA29YIg; und jedwedes Antikörper-Molekül, Fragment davon oder rekombinantes Bindungsprotein, das ein CD80- und/oder CD86-Antigen erkennt und bindet, ein. Diese Mittel kommen auch als „Immunsuppressiva" in Betracht.
  • Wie hierin verwendet, wird ein „costimulatorischer Signalweg" als ein biochemischer Signalweg definiert, der sich aus der Interaktion von costimulatorischen Signalen an T-Zellen und Antigen präsentierenden Zellen (APCs) ergibt. Costimulatorische Signale helfen bei der Bestimmung der Größenordnung einer immunologischen Antwort auf ein Antigen. Ein costimulatorisches Signal wird durch die Interaktion mit den T-Zellrezeptoren CD28 und CTLA4 mit CD80 und/oder CD86-Molekülen an APCs bereitgestellt.
  • Wie hierin verwendet, schließt „CD80 und/oder CD86" B7-1 (auch als CD80 bezeichnet), B7-2 (auch als CD86 bezeichnet), B7-3 (auch als CD74 bezeichnet) und die B7-Familie, z. B. eine Kombination aus B7-1, B7-2, und/oder B7-3 ein.
  • Wie hierin verwendet, wird „costimulatorische Blockade" als ein Protokoll zum Verabreichen an ein Individuum von einem oder mehr Mittel(n), das/die mit einem costimulatorischen Signalweg interferiert/interferieren oder ihn blockieren, wie vorstehend beschrieben, definiert. Beispiele von Mitteln, die mit der costimulatorischen Blockade interferieren, schließen folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf: lösliches CTLA4, mutantes CTLA4, lösliches CD28, gegen B7 gerichtete monoklonale Antikörper (mAk), lösliche CD40 und anti-gp39-mAk. In einer Ausführungsform stellt L104EA29YIg ein bevorzugtes Mittel dar, das mit der costimulatorischen Blockade interferiert.
  • Wie hierin verwendet, wird „T-zelldepletiertes Knochenmark" als aus dem Knochen entferntes Knochenmark definiert, das gegenüber einem anti-T-Zellprotokoll exponiert wurde. Ein anti-T-Zellprotokoll ist als ein Verfahren zum Entfernen von T-Zellen aus dem Knochenmark definiert. Verfahren zum selektiven Entnehmen von T-Zellen sind im Stand der Technik überall bekannt. Ein Beispiel eines anti-T-Zellprotokolls besteht in der Exposition des Knochenmarks gegenüber T-zellspezifischen Antikörpern, wie zum Beispiel anti-CD3, anti-CD4, anti-CD5, anti-CD8 und gegen CD90 gerichtete monoklonale Antikörper, worin die Antikörper gegenüber den T-Zellen zytoxisch sind. Als Alternative können die Antikörper an Magnetpartikel gekoppelt werden, um das Entfernen der T-Zellen aus dem Knochenmark unter Verwendung von Magnetfeldern zu gestatten. Ein anderes Beispiel eines Anti-T-Zellprotokolls besteht in der Exposition von T-Zellen aus dem Knochenmark gegenüber Anti-Lymphozytenserum oder Anti-Thymozytenglobulin.
  • Wie hierin verwendet, ist die „tolerisierende Dosis des T-zelldepletierten Knochenmarks" als eine Initialdosis von T-zelldepletiertem Knochenmark definiert, das an ein Individuum zum Zweck des Inaktivieren potenzieller Donor-reaktiver T-Zellen verabreicht wird.
  • Wie hierin verwendet, ist die „Engraftment-Dosis des T-zelldepletierten Knochenmarks" als eine sich anschließende Dosis von T-zelldepletiertem Knochenmark definiert, das an ein Individuum zum Zweck der Etablierung eines gemischten hämatopoetischen Chimärismus verabreicht wird. Die Engraftment-Dosis des T-zelldepletierten Knochenmarks wird demgemäß nach der Tolerisierungsdosis von T-zelldepletiertem Knochenmark verabreicht.
  • Wie hierin verwendet, ist der „gemischte hämatopoetische Chimärismus" als die Anwesenheit von Progenitorzellen und maturen Zellen (z. B. sich von Blut herleitenden Zellen) in Donor- und Empfängerblut in der Abwesenheit (oder der nicht nachweisbaren Anwesenheit) einer Immunantwort definiert.
  • Wie hierin verwendet, sind die „Donor-Empfänger-Paarungen" basierend auf der Molekulartypisierung unter Verwendung eines Panels von zuvor definierten Major Histocompatibility-Allelen (8 Klasse I und 12 Klasse H) definiert (Lobashevsky A, et al., Tissue Antigens 54: 254–263, (1999); Knapp LA, et al., Tissue Antigens 50: 657–661, (1997); Watkins D. L., Crit. Rev. Immunol. 15: 1–29, (1995)). Die Paarungen maximierten die Disparität an den Loci von sowohl Klasse I als auch II.
  • Wie hierin verwendet, schließt „verabreichen" oder „Verabreichung" an ein Individuum Folgendes ein, ist aber nicht beschränkt auf: die intravenöse (i. v.) Verabreichung, intraperitoneale (i. p.) Verabreichung, intramuskuläre (i. m.) Verabreichung, subkutane Verabreichung, orale Verabreichung, Verabreichung durch Injektion, als ein Suppositorium oder die Implantation einer Vorrichtung zur langsamen Freisetzung, wie zum Beispiel eine miniosmotische Pumpe, in ein Individuum ein.
  • Wie hierin verwendet, schließt „pharmazeutisch verträglicher Träger" jedwedes Material ein, das wenn es mit dem reaktiven Mittel kombiniert wird, die biologische Aktivität des reaktiven Mittels, z. B. die Bindungsspezifität, beibehält und mit dem Immunsystem des Individuums nicht reaktiv ist. Die Beispiele schließen folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf irgendeinen der standardmäßigen pharmazeutischen Träger, wie zum Beispiel eine Phosphat-gepufferte Salzlösung, Wasser, Emulsionen, wie zum Beispiel eine Öl-Wasser-Emulsion und verschiedene Benetzungsmitteltypen. Andere Träger können auch sterile Lösungen, Tabletten, einschließlich beschichteter Tabletten und Kapseln einschließen. In der Regel enthalten derartige Träger Hilfsstoffe, wie zum Beispiel Stärke, Milch, Zucker, bestimmte Tontypen, Gelatine, Stearinsäure oder Salze davon, Magnesium- oder Calciumstearat, Talkum, pflanzliche Fette oder Öle, Gummis, Glykole oder andere bekannte Hilfsstoffe. Derartige Träger können auch Geschmacksstoff- und Farbstoffadditive oder andere Bestandteile einschließen. Zusammensetzungen, die derartige Träger umfassen, werden mithilfe überall bekannter üblicher Verfahren formuliert.
  • Wie hierin verwendet, sind „Immunsuppressiva" als eine Zusammensetzung mit einem oder mehr Molekültyp(en) definiert, die das Auftreten einer Immunantwort verhindern oder das Immunsystem eines Individuums abschwächen. Die Mittel reduzieren oder verhindern bevorzugt die T-Zellproliferation. Einige Mittel können die T-Zellproliferation durch Inhibieren der Interaktion von T-Zellen mit anderen Antigen präsentierenden Zellen (APCs) inhibieren. Ein Beispiel von APC stellen B-Zellen dar. Beispiele von Mitteln, die mit den T-Zellinteraktionen mit APC interferieren und dadurch die T-Zellproliferation inhibieren, schließen folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf: Liganden für CD80- und/oder CD86-Antigene, Liganden für das CTLA4-Antigen und Liganden für das CD28-Antigen. Beispiele von Liganden für CD80- und/oder CD86-Antigene schließen folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf: lösliches CTLA4, einen löslichen CTLA4-Mutanten, lösliches CD28, oder monoklonale Antikörper, die CD80- und/oder CD86-Antigene oder Fragmente davon erkennen und binden. Ein bevorzugtes Mittel stellt L104EA29YIg dar. Liganden für CTLA4- oder CD28-Antigene schließen monoklonale Antikörper ein, die CTLA4 und/oder CD28 oder Fragmente davon erkennen und binden. Andere Liganden für CTLA4 oder CD28 schließen lösliche CD80- und/oder CD86-Moleküle ein, wie zum Beispiel CD80 und/oder CD86Ig. Der Fachmann wird ohne weiteres verstehen, dass andere Mittel oder Liganden zum Inhibieren der Interaktion von CD28 mit CD80 und/oder CD86 verwendet werden können.
  • Immunsuppressiva schließen folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf: Methotrexat, Cyclophosphamid, Cyclosporin, Cyclosporin A, Chloroquin, Hydroxychloroquin, Sulfasalazin (Sulfasalazopyrin), Goldsalze, D-Penicillamin, Leflunomid, Azathioprin, Anakinra, Infliximab (REMICADE®), Etanercept, TNFα-Blocker, ein biologisches Mittel, das ein inflammatorisches Cytokun targetiert, und ein nicht-steroidales antiinflammatorisches Arzneimittel (NSAR). NSAR schließen folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf: Acetylsalicylsäure, Cholinmagnesiumsalicylat, Diflunisal, Magnesiumsalicylat, Salsalat, Natriumsalicylat, Diclofenac, Etodolac, Fenoprofen, Flurbiprofen, Indomethacin, Ketoprofen, Ketorolac, Meclofenamat, Naproxen, Nabumeton, Phenylbutazon, Piroxicam, Sulindac, Tolmetin, Acetaminophen, Ibuprofen, Cox-2-Inhibitoren und Tramadol.
  • ERFINDUNGSGEMÄSSE ZUSAMMENSETZUNGEN
  • CTLA4-Moleküle mit Mutanten- oder Wildtyp-Sequenzen können durch Deletieren des CTLA4-Transmembransegments löslich gemacht werden (Oaks, M. K., et al., 2000 Cellular Immunology 201: 144–153).
  • Als Alternative können lösliche CTLA4-Moleküle mit Mutanten- oder Wildtyp-Sequenzen Fusionsproteine darstellen, worin die CTLA4-Moleküle an Nicht-CTLA4-Teile, wie zum Beispiel Immunglobulinmoleküle (Ig-Moleküle), die die CTLA4-Moleküle löslich machen, fusioniert sind. Zum Beispiel kann ein CTLA4-Fusionsprotein die extrazelluläre Domäne von CTLA4 fusioniert an eine konstante Domäne des Immunglobulins enthalten, was zum CTLA4Ig-Molekül führt (2) (Linsley, P. S., et al., 1994 Immunity 1: 793–80).
  • Für klinische Protokolle wird bevorzugt, dass der Immunglobulinteil keine nachteilige Immunantwort in einem Individuum auslost. Die konstante Region des Immunglobulins, einschließlich der konstanten Regionen des Immunglobulins vom Menschen und Affen, stellen den bevorzugten Teil dar. Ein Beispiel einer geeigneten Immunglobulinregion stellt humanes Cγ1, einschließlich der Hinge-, CH2- und CH3-Regionen dar, die Effektorfunktionen, wie zum Beispiel die Bindung an Fc-Rezeptoren, die Vermittlung der Komplement abhängigen Zytotoxizität (CDC) vermitteln können, oder eine Antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) vermitteln kann. Der Immunglobulinteil kann eine oder mehr Mutation(en) dann aufweisen (z. B. in der CH2-Domäne zur Reduktion der Effektorfunktionen, wie zum Beispiel CDC oder ADCC), bei denen die Mutation die Bindungsfähigkeit des Immunglobulins an seinen Liganden durch Zunahme oder Abnahme der Bindungsfähigkeit des Immunglobulins an Fc-Rezeptoren moduliert. Mutationen im Immunglobulinteil können zum Beispiel Änderungen in jedwedem Cysteinrest oder allen seiner Cysteinreste in der Hinge-Domäne einschließen, zum Beispiel werden die Cysteine an den Positionen +130, +136 und +139 durch Serin substituiert (24). Der Immunglobulinteil kann auch das Prolin an Position +148, substituiert durch ein Serin, wie in 24 ersichtlich ist, einschließen. Die Mutationen im Immunglobulinteil können ferner das Leucin an Position +144, substituiert durch Phenylalanin, Leucin an Position +145, substituiert durch Glutaminsäure oder Glycin an Position +147, substituiert durch Alanin einschließen.
  • Nicht-CTLA4-Teile zum Gebrauch in den löslichen CTLA4-Molekülen oder löslichen CTLA4-Mutantenmolekülen schließen zusätzlich folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf: das p97-Molekül, env gp120-Molekül, E7-Molekül und OVA-Molekül (Dash, B. et al., 19941 Gen. Virol 75 (Teil 6): 1389–97; Ikeda, T., et al. 1994 Gene 138(1–2): 193–6; Falk, K., et al. 1993 Cell. Immunol. 150(2): 447–52; Fujisaka, K. et al. 1994 Virology 204(2): 789–93). Andere Moleküle sind auch möglich (Gerard, C. et al., 1994 Neuroscience 62(3): 721; Bym, R. et al. 1989 63(10): 4370; Smith, D. et al., 1987 Science 238: 1704; Lasky, L. 1996 Science 233: 209).
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung löslicher CTLA4-Moleküle, einschließlich einer Signalpeptidsequenz, die mit dem N-terminalen Ende der extrazellulären Domäne des CTLA4-Anteils des Moleküls verknüpft ist. Das Signalpeptid kann jedwede Sequenz darstellen, die die Sekretion des Mutantenmoleküls, einschließlich des Signalpeptids aus Oncostatin M (Malik, et al., 1989 Molec. Cell. Biol. 9: 2847–2853), oder CD5 (Jones, N. H. et al., 1986 Nature 323: 346–349) oder des Signalpeptids aus jedwedem extrazellulärem Protein zulässt. Das erfindungsgemäße lösliche CTLA4-Molekül kann das Oncostatin M-Signalpeptid einschließen, das am N-terminalen Ende der extrazellulären Domäne von CTLA4 verknüpft ist und das humane Immunglobulin-Molekül (z. B. Hinge, CH2 und CH3) mit dem C-terminalen Ende der extrazellularen Domäne (Wildtyp oder mutiert) von CTLA4 verknüpft ist. Dieses Molekül schließt das Oncostatin M-Signalpeptid ein, das eine Aminosäuresequenz mit Methionin an Position –26 bis Alanin an Position –1 umfasst, wobei der CTLA4-Anteil eine Aminosäuresequenz mit Methionin an Position +1 bis Asparaginsäure an Position +124, einen Junction-Aminosäurerest Glutamin an Position +125 umfasst und wobei der Immunglobulinanteil eine Aminosäuresequenz mit Glutaminsäure an Position +126 bis Lysin an Position +357 umfasst.
  • In einer Ausführungsform stellen die erfindungsgemäßen löslichen CTLA4-Mutantenmoleküle, die die nachstehend beschriebenen mutierten CTLA4-Sequenzen umfassen, Fusionsmoleküle dar, die humanes IgC(gamma)1-(d. h. IgCγ1-)Teile umfassen, die an die mutierten CTLA4-Fragmente fusioniert sind. Die löslichen CTLA4-Mutantenmoleküle können eine oder mehr Mutation(en) (z. B. Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -insertionen) in der extrazellulären Domäne von CTLA4 umfassen.
  • Die löslichen CTLA4-Mutantenmoleküle können zum Beispiel eine Mutation oder Mutationen in der oder in unmittelbarer Nähe zur Region einschließen, die durch Serin an Position +25 bis Arginin an Position +33 (z. B. S25-R33 unter Verwendung der standardmäßigen Einbuchstaben-Aminosäuresymbole) eingeschlossen sind. Die mutanten CTLA4-Moleküle können eine Aminosäuresubstitution an jedwedem einen oder mehr der folgenden Positionen einschließen: S25, P26, G27, K28, A29, T30, E31 oder R33.
  • In einer anderen Ausführungsform können die löslichen CTLA4-Mutantenmoleküle eine Mutation oder Mutationen in der oder in ummittelbarer Nähe zu der Region einschließen, die durch Glutaminsäure an Position +95 bis Glycin an Position +107 (z. B. E95-G107) eingeschlossen ist. Die mutanten CTLA4-Moleküle können eine Aminosäuresubstitution an jedweder einen oder mehr der folgenden Positionen einschließen: K93, L96, M97, Y98, P99, P100, P101, Y102, Y103, L104, G105, I106 und G107.
  • Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Bereitstellung löslicher CTLA4-Mutantenmoleküle mit einer Mutation oder Mutationen in oder in unmittelbarer Nähe zur Region, die von Asparagin an Position +108 bis Isoleucin an Position +115 (z. B. N108-I115) eingeschlossen ist. Das mutante CTLA4-Molekül kann eine Aminosäuresubstitution an jedweder einen oder mehr der folgenden Positionen einschließen: L104, G105, I106, G107, Q111Y113 oder I115.
  • In einer Ausführungsform umfassen die löslichen CTLA4-Mutantenmoleküle IgCγ1, das an ein CTLA4-Fragment fusioniert ist, das eine „single-site"-Mutation in der extrazellulären Domäne umfasst. Die extrazelluläre Domäne von CTLA4 umfasst Methionin an Position +1 bis Asparaginsäure an Position +124 (z. B. 1). Der extrazelluläre Anteil des CTLA4 kann Alanin an Position –1 bis Asparaginsäure an Position +124 (z. B. 1) umfassen.
  • Beispiele von „single-site"-Mutationen schließen die folgenden ein, worin das Leucin an Position +104 in jedwede andere Aminosäure verändert ist:
    „SINGLE-SITE"-MUTANTE: CODONÄNDERUNG:
    L104EIg Glutaminsäure GAG
    L104SIg Serin AGT
    L104TIg Threonin ACG
    L104AIg Alanin GCG
    L104WIg Tryptophan TGG
    L104QIg Glutamin CAG
    L104KIg Lysin AAG
    L104RIg Arginin CGG
    L104GIg Glycin GGG
  • Gegenstand der Erfindung ist ferner die Bereitstellung von Mutantenmolekülen, die die extrazelluläre Domäne von CTLA4 mit zwei Mutationen aufweisen, die an einen Ig Cγ1-Teil fusioniert sind. Beispiele schließen die folgenden ein, worin das Leucin an Position +104 in eine andere Aminosäure (z. B. Glutaminsäure) verändert ist und das Glycin an Position +105, das Serin an Position +25, das Threonin an Position +30 oder das Alanin an Position +29 in jedwede andere Aminosäure verändert ist:
    „DOUBLE-SITE"-MUTANTEN: CODONÄNDERUNG:
    L104EG105FIg Phenylalanin TTC
    L104EG105WIg Tryptophan TGG
    L104EG105LIg Leucin CTT
    L104ES25RIg Arginin CGG
    L104ET30GIg Glycin GGG
    L104ET30NIg Asparagin AAT
    L104EA29YIg Tyrosin TAT
    L104EA29LIg Leucin TTG
    L104EA29TIg Threonin ACT
    L104EA29WIg Tryptophan TGG
  • Gegenstand der Erfindung ist überdies die Bereitstellung von Mutantenmolekülen mit der extrazellulären Domäne von CTLA4, umfassend drei Mutationen, die an einen Ig Cγ1-Teil fusioniert sind. Beispiele schließen die folgenden ein, worin das Leucin an Position +104 in eine andere Aminosäure (z. B. Glutaminsäure) verändert ist, das Alanin an Position +29 in eine andere Aminosäure (z. B. Tyrosin) verändert ist und das Serin an Position +25 in eine andere Aminosäue verändert ist:
    „TRIPLE-SITE"-MUTANTEN: CODONÄNDERUNGEN:
    L104EA29YS25KIg Lysin AAA
    L104EA29YS25KIg Lysin AAG
    L104EA29YS25NIg Asparagin AAC
    L104EA29YS25RIg Arginin CGG
  • Lösliche CTLA4-Mutantenmoleküle können einen Junction-Aminosäurerest aufweisen, der sich zwischen dem CTLA4-Anteil und dem Ig-Anteil des Moleküls befindet. Die Junction-Aminosäure kann jedwede Aminosäure, einschließlich Glutamin darstellen. Die Junction-Aminosäure kann durch im Stand der Technik bekannte molekulare oder chemische Syntheseverfahren eingeführt werden.
  • Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung löslicher CTLA4-Mutantenmoleküle, die eine „single-site"-Mutation in der extrazellulären Domäne von CTLA4, wie zum Beispiel L104EIg (wie in 19 eingeschlossen) umfassen, worin L104EIg und L104SIg in ihren CTLA4-Sequenzen mutiert sind, so dass Leucin an Position +104 durch Glutaminsäure bzw. Serin substituiert ist. Die „single-site"-Mutantenmoleküle schließen ferner CTLA4-Anteile ein, die Methionin an Position +1 bis Asparaginsäure an Position +124, einen Junction-Aminosäurerest Glutamin an Position +125 umfassen und einen Immunglobulinanteil, der Glutaminsäure an Position +126 bis zum Lysin an Position +357 umfasst. Der Immunglobulinanteil des Mutantenmoleküls kann auch mutiert sein, so dass die Cysteine an Positionen +130, +136 und +139 durch Serin substituiert sind und das Prolin an Position +148 durch Serin substituiert ist. Als Alternative kann das lösliche „single-site"-CTLA4-Mutantenmolekül einen CTLA4-Anteil aufweisen, der Alanin an Position –1 bis Asparaginsäure an Position +124 umfasst.
  • Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung löslicher CTLA4-Mutantenmoleküle, die eine „double-site"-Mutation in der extrazellulären Domäne von CTLA4, wie zum Beispiel L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg oder L104EA29WIg, umfassen, worin Leucin an Position +104 durch eine Glutaminsäure substituiert ist und Alanin an Position +29 in Tyrosin, Leucin, Threonin bzw. Tryptophan verändert ist. Die Sequenzen für L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg und L104EA29WIg, beginnend bei Methionin an Position +1 und endend mit Lysin an Position +357, plus einer Signal-(Leader)-Peptidsequenz sind wie in den in 3 bzw. 20–22 ersichtlich eingeschlossen. Die „double-site"-Mutantenmoleküle umfassen ferner CTLA4-Anteile, die Methionin an Position +1 bis Asparaginsäure an Position +124, einen Junction-Aminosäurerest Glutamin an Position +125 umfassen, und einen Immunglobulinanteil, der Glutaminsäure an Position +126 bis Lysin an Position +357 umfasst. Der Immunglobulinanteil vom Mutantenmolekül kann auch mutiert sein, so dass die Cysteine an Positionen +130, +136 und +139 durch Serin substituiert sind und das Prolin an Position +148 durch Serin substitutiert ist. Als Alternative können diese Mutantenmoleküle einen CTLA4-Anteil aufweisen, der Alanin an Position –1 bis Asparaginsäure an Position +124 umfasst.
  • Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung löslicher CTLA4-Mutantenmoleküle, die eine „double-site"-Mutation in der extrazellulären Domäne von CTLA4, wie zum Beispiel L104EG105FIg, L104EG105WIg und L104EG105LIg umfasst, worin Leucin an Position +104 durch eine Glutaminsäure substituiert ist und Glycin an Position +105 durch Phenylalanin, Tryptophan bzw. Leucin substituiert ist. Die „double-site"-Mutantenmoleküle umfassen ferner CTLA4-Anteile, die Methionin an Position +1 bis Asparaginsäure an Position +124, einen Junction-Aminosäurerest Glutamin an Position +125 und einen Immunglobulinanteil, der Glutaminsäure an Position +126 bis Lysin an Position +357 umfasst. Der Immunglobulinanteil kann auch mutiert sein, so dass die Cysteine an Positionen +130, +136 und +139 durch Serin substituiert sind, und das Prolin an Position +148 durch Serin substituiert ist. Als Alternative können diese Mutantenmoleküle einen CTLA4-Anteil aufweisen, der Alanin an Position –1 bis Asparaginsäure an Position +124 umfasst.
  • Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung von L104ES25RIg, das ein „double-site"-Mutantenmolekül darstellt, einschließlich eines CTLA4-Anteils, der Methionin an Position +1 bis Asparaginsäure an Position +124, eines Junction-Aminosäurerests Glutamin an Position +125, und des Immunglobulinanteils, der Glutaminsäure an Position +126 bis Lysin an Position +357 umfasst. Der Anteil, der die extrazelluläre Domäne von CTLA4 aufweist, ist mutiert, so dass Serin an Position +25 durch Arginin substituiert ist, und Leucin an Position +104 durch Glutaminsäure substituiert ist. Als Alternative kann L104ES25RIg einen CTLA4-Anteil aufweisen, der Alanin an Position –1 bis Asparaginsäure an Position +124 umfasst.
  • Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung löslicher CTLA4-Mutantenmoleküle, die eine „double-site"-Mutation in der extrazellulären Domäne von CTLA4 umfassen, wie zum Beispiel L104ET30GIg und L104ET30NIg, worin Leucin an Position +104 durch eine Glutaminsäure substituiert ist und Threonin an Position +30 durch Glycin bzw. Asparagin substituiert ist. Die „double-site"-Mutantenmokeküle umfassen ferner CTLA4-Anteile, die Methionin an Position +1 bis Asparaginsäure an Position +124 umfassen, einen Junction-Aminosäurerest Glutamin an Position +125, und einen Immunglobulinanteil, der Glutaminsäure an Position +126 bis Lysin an Position +357 umfasst. Der Immunglobulinanteil des Mutantenmoleküls kann auch mutiert sein, so dass die Cysteine an Positionen +130, +136 und +139 durch Serin substituiert sind, und das Prolin an Position +148 durch Serin substituiert ist. Als Alternative können diese Mutantenmoleküle einen CTLA4-Anteil aufweisen, der Alanin an Position –1 bis Asparaginsäure an Position +124 umfasst.
  • Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung der löslichen CTLA4-Mutantenmoleküle, die eine „triple-site"-Mutation in der extrazellulären Domäne von CTLA4, wie zum Beispiel L104EA29YS25KIg, L104EA29YS25NIg und L104EA29YS25RIg umfassen, worin Leucin an Position +104 durch eine Glutaminsäure substituiert ist, Alanin an Position +29 zu Tyrosin verändert ist und Serin an Position +25 in Lysin, Asparagin bzw. Arginin verändert ist. Die „triple-site"-Mutantenmoleküle umfassen ferner CTLA4-Anteile, die Methionin an Position +1 bis Asparaginsäure an Position +124 umfassen, einen Junction-Aminosäurerest an Position +125, und einen Immunglobulinanteil, der Glutaminsäure an Position +126 bis Lysin an Position +357 umfasst. Der Immunglobulinanteil des Mutantenmoleküls kann auch mutiert sein, so dass die Cysteine an Positionen +130, +136 und +139 durch Serin substituiert sind und das Prolin an Position +148 durch Serin substituiert ist. Als Alternative können diese Mutantenmoleküle einen CTLA4-Anteil aufweisen, der Alanin an Position –1 bis Asparaginsäure an Position +124 umfasst.
  • Zusätzliche Ausführungsformen von löslichen CTLA4-Mutantenmolekülen schließen homologe chimäre homologe CTLA4/CD28-Mutantenmoleküle, die ein B7 binden, ein (Peach, R. J., et al., 1994 J. Exp. Med. 180: 2049–2058). Beispiele dieser chimären CTLA4/CD28-Mutantenmoleküle schließen HS1, HS2, HS3, HS4, HS5, HS6, HS4A, HS4B, HS7, HS8, HS9, HS10, HS11, HS12, HS13 und HS14 ein ( US-Patent Nr. 5773253 ).
  • Bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen stellen lösliche CTLA4-Moleküle dar, wie zum Beispiel CTLA4Ig (wie in 2 gezeigt, beginnend mit Methionin an Position +1 und endend bei Lysin an Position +357) und der lösliche CTLA4-Mutant L104EA29YIg (wie in 3 gezeigt, beginnend bei Methionin an Position +1 und endend bei Lysin an Position +357).
  • Gegenstand der Erfindung ist ferner die Bereitstellung der Nukleinsäuremoleküle, umfassend Nukleotidsequenzen, die für die den erfindungsgemäßen löslichen CTLA4-Molekülen entsprechenden Aminosäuresequenzen kodieren. In einer Ausführungsform stellt das Nukleinsäuremolekül eine DNA (z. B. cDNA) oder eine Hybride davon dar. DNA, kodierend für CTLA4Ig (2) wurde am 31. Mai 1991 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110–2209, hinterlegt und bekam die ATCC-Zugangsnummer ATCC 68629 zugeteilt. DNA, kodierend für L104EA29YIg (die Sequenz ist in 3 eingeschlossen), wurde am 19. Juni 2000 bei der ATCC hinterlegt und bekam die ATCC-Zugangsnummer PTA-2104 zugeteilt. Als Alternative stellen die Nukleinsäuremoleküle RNA oder eine Hybride davon dar.
  • CTLA4-HYBRIDEN Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung löslicher CTLA4-Mutantenmoleküle, umfassend mindestens die extrazelluläre Domäne von CTLA4 oder Anteile davon, die CD80 und/oder CD86 binden. Der extrazelluläre Anteil von CTLA4 umfasst Methionin an Position +1 bis Asparaginsäure an Position +124 (z. B. 1). Der extrazelluläre Anteil des CTLA4 kann Alanin an Position –1 bis Asparaginsäure an Position +124 (z. B. 1) umfassen. Der extrazelluläre Anteil des CTLA4 kann Glutaminsäure an Position +95 bis Cystein an Position +120 umfassen. Der extrazelluläre Anteil des CTLA4 kann Methionin an Position +1 bis Cystein an Position +21 und Glutaminsäure an Position +95 bis Asparaginsäure an Position +122 umfassen. Der extrazelluläre Anteil des CTLA4 kann Methionin an Position +1 bis Tyrosin an Position +23 und Valin an Position +32 bis Asparaginsäure an Position +122 umfassen. Der extrazelluläre Anteil des CTLA4 kann Alanin an Position +24 bis Glutaminsäure an Position +31 und Glutaminsäure an Position +95 bis Asparaginsäure an Position +122 umfassen. Der extrazelluläqre Anteil des CTLA4 kann Alanin an Position +24 bis Glutaminsäure an Position +31 und Glutaminsäure an Position +95 bis Isoleucin an Position +112 umfassen. Der extrazelluläre Anteil des CTLA4 kann Alanin an Position +24 bis Glutaminsäure an Position +31 und Tyrosin an Position +113 bis Asparaginsäure an Position +122 umfassen. Der extrazelluläre Anteil des CTLA4 kann Alanin an Position +50 bis Glutaminsäure an Position +57 und Glutaminsäure an Position +95 bis Asparaginsäure an Position +122 umfassen. Der extrazelluläre Anteil des CTLA4 kann Alanin an Position +24 bis Glutaminsäure an Position +31; Alanin an Position +50 bis Glutaminsäure an Position +57; und Glutaminsäure an Position +95 bis Asparaginsäure an Position +122 umfassen. Der extrazelluläre Anteil der CTLA4 kann Alanin an Position +50 bis Glutaminsäure an Position +57 und Glutaminsäure an Position +95 bis Isoleucin an Position +112 umfassen. Der extrazelluläre Anteil des CTLA4 kann Alanin an Position +24 bis Glutaminsäure an Position +31; Alanin an Position +50 bis Glutaminsäure an Position +57; und Glutaminsäure an Position +95 bis Asparaginsäure an Position +122 umfassen. Der extrazelluläre Anteil von CTLA4 kann Alanin an Position +24 bis Valin an Position +94 umfassen. Der extrazelluläre Anteil von CTLA4 kann Alanin an Position –1 bis Cystein an Position +21 umfassen. Der extrazelluläre Anteil von CTLA4 kann Methionin an Position +1 bis Cystein an Position +21 umfassen. Der extrazelluläre Anteil von CTLA4 kann Glutaminsäure an Position +95 bis Asparaginsäure an Position +122 umfassen. Der extrazelluläre Anteil von CTLA4 kann Alanin an Position –1 bis Valin an Position +94 umfassen. Der extrazelluläre Anteil von CTLA4 kann Methionin an Position +1 bis Valin an Position +94 umfassen. Der extrazelluläre Anteil von CTLA4 kann Alanin an Position +24 bis Glutaminsäure an Position +31 umfassen. Der extrazelluläre Anteil von CTLA4 kann Alanin an Position –1 bis Tyrosin an Position +23 umfassen. Der extrazelluläre Anteil von CTLA4 kann Methionin an Position +1 bis Tyrosin an Position +23 umfassen. Der extrazelluläre Anteil von CTLA4 kann Valin an Position +32 bis Asparaginsäure an Position +122 umfassen. Der extrazelluläre Anteil von CTLA4 kann Tyrosin an Position +113 bis Asparaginsäure an Position +122 umfassen. Der extrazelluläre Anteil von CTLA4 kann Glutaminsäure an Position +95 bis Isoleucin an Position +112 umfassen. Der extrazelluläre Anteil von CTLA4 kann Alanin an Position +50 bis Glutaminsäure an Position +57 umfassen.
  • VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG DER ERFINDUNGSGEMÄSSEN MOLEKÜLE
  • Die Expression von CTLA4-Mutantenmolekülen kann in prokaryoten Zellen stattfinden. Die Prokaryoten werden am häufigsten durch verschiedene Bakterienstämme dargestellt. Die Bakterien können grampositiv oder gramnegativ sein. Andere mikrobielle Stämme können auch verwendet werden.
  • Nukleotidsequenzen, die für CTLA4-Mutantenmoleküle kodieren, können in einen Vektor insertiert werden, der zur Expression von Fremdsequenzen in prokaryoten Zellen, wie zum Beispiel E. coli, bestimmt ist. Diese Vektoren können allgemein verwendete prokaryote Kontrollsequenzen einschließen, die hierin definiert sind, um Promotoren für die Transkriptionsinitiation einzuschließen, optional mit einem Operator, zusammen mit Ribosomen-Bindungsortsequenzen, die derartige allgemein verwendeten Promotoren wie die β-Lactamase-(Penicillinase) und Lactose-(lac)-Promotorsysteme (Chang, et al., (1977) Nature 198: 1056), das Tryptophan-(trp)-Promotorsystem (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057) und den von Lambda hergeleiteten PL-Promoter und den N-Gen-Ribosomenbindungsort (Shimatake, et al., (1981) Nature 292: 128) einschließen.
  • Derartige Expressionsvektoren schließen auch Replikationsstartpunkte und selektierbare Marker, wie zum Beispiel ein β-Lactamase- oder Neomycinphosphotransferasegen ein, das Resistenz gegen Antibiotika verleiht, so dass sich die Vektoren in Bakterien replizieren können, und Zellen, die die Plasmide tragen, können ausgewählt werden, wenn sie in Anwesenheit von Antibiotika, wie zum Beispiel Ampicillin oder Kanamycin, gezüchtet werden.
  • Das Expressionsplasmid kann über viele verschiedene Standardverfahren, in prokaryote Zellen eingeführt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf CaCl2-Schock (Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110, und Sambrook et al. (Hrsg.), „Molecular Cloning: A Laborstory Manual". 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, (1989)) und Elektroporation.
  • Gemäß der erfindungsgemäßen praktischen Ausführung stellen eukaryote Zellen auch geeignete Wirtszellen dar. Beispiele von eukaryoten Zellen schließen jedwede Tierzelle, ob primäre oder immortalisierte Hefe (z. B. Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe und Pichia pastoris) und Pflanzenzellen ein. Myelom-, COS- und CHO-Zellen stellen Beispiele von Tierzellen dar, die als Wirte verwendet werden können. Insbesondere CHO-Zellen schließen folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf: DG44 (Chasin, et al., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555–556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36: 10901–10909), CHO-K1 (ATCC Nr. CCL-61), CHO-K1 Tet-On-Zelllinie (Clontech), CHO, bezeichnet als ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO-Klon 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO-Klon B (GEIMG, Genova, IT), CHO-K1/SF bezeichnet als ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) und RR-CHOK1, bezeichnet als ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Beispielhafte Pflanzenzellen schließen Tabak- (ganze Pflanzen, Zellkultur oder Kallus), Mais-, Sojabohnen- und Reiszellen ein. Mais-, Sojabohnen- und Reissamen sind auch zulässig.
  • Nukleotidsequenzen, die für die CTLA4-Mutantenmoleküle kodieren, können auch in einen zur Expression von Fremdsequenzen in einem eukaryoten Wirt bestimmten Vektor insertiert werden. Die Regulationselemente des Vektors können gemäß dem bestimmten eukaryoten Wirt variieren. Das Nukleinsäuremolekül, das für L104EA29YIg kodiert, ist in pD16 L104EA29YIg enthalten und wurde am 19. Juni 2000 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110–2209 (ATCC Nr. PTA-2104) hinterlegt. Der pD16 L104EA29YIg-Vektor stellt ein Derivat des pcDNA3-Vektors (INVITROGEN) dar.
  • Allgemein verwendete eukaryote Kontrollsequenzen zur Verwendung in Expressionsvektoren schließen Promotoren und Kontrollsequenzen ein, die mit Säugerzellen, wie zum Beispiel dem CMV-Promotor (CDM8-Vektor) und dem Vogelsarkomvirus (ASV) (πLN-Vektor) kompatibel sind. Andere allgemein verwendete Promotoren schließen die frühen und späten Promotoren vom Simian-Virus 40 (SV40) (Fiers, et al., (1973) Nature 273: 113) oder andere Viruspromotoren, wie zum Beispiel die vom Polyom, Adenovirus 2 und dem bovinen Papillomavirus hergeleiteten ein. Ein induzierbarer Promotor, wie zum Beispiel hMTII (Karin, et al., (1982) Nature 299: 797–802), kann auch verwendet werden.
  • Vektoren zur Expression von CTLA4-Mutantenmolekülen in Eukaryoten können auch Sequenzen tragen, die als Enhancer-Regionen bezeichnet werden. Diese sind wichtig bei der Optimierung der Genexpression und werden entweder stromaufwärts oder stromabwärts von der Promotorregion gefunden.
  • Beispiele der Expressionsvektoren für eukaryote Wirtszellen schließen die folgenden ein, sind aber nicht beschränkt auf Vektoren für Säugerwirtszellen (z. B. BPV-1, pHyg, pRSV-, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); pVPakc-Vektoren, pCMV-Vektoren, pSG5-Vektoren (Stratagene)), retrovirale Vektoren (z. B. pFB-Vektoren (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) oder modifizierte Formen davon, Adenovirus-Vektoren; Adeno-assoziierte Virusvektoren, Baculovirus-Vektoren, Hefevektoren (z. B. pESC-Vektoren (Stratagene)).
  • Nukleotidsequenzen, die für CTLA4-Mutantenmoleküle kodieren, können in das Genom der eukaryoten Wirtszelle integrieren und als die Wirtsgenomreplikate replizieren. Als Alternative kann der die CTLA4-Mutantenmoleküle tragende Vektor Replikationsstartpunkte enthalten, welche die extrachromosomale Replikation ermöglichen.
  • Zur Expression der Nukleotidsequenzen in Saccharomyces cerevisiae kann der Replikationsstartpunkt aus dem endogenen Hefeplasmid, der 2 μ große Kreis verwendet werden (Broach, (1983) Meth. Enz. 101: 307). Als Alternative können Sequenzen aus dem Hefegenom verwendet werden, die zur Promotion der autonomen Replikation fähig sind (siehe zum Beispiel Stinchcomb et al., (1979) Nature 282: 39); Tschemper et al., (1980) Gene 10: 157; und Clarke et al., (1983) Meth. Enz. 101: 300).
  • Transkriptionale Kontrollsequenzen für Hefevektoren schließen Promotoren für die Synthese von glykolytischen Enzymen ein (Hess et al., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149; Holland et al., (1978) Biochemistry 17: 4900). Im Stand der Technik bekannte zusätzliche Promotoren schließen folgende ein: den CMV-Promotor, der im CDM8-Vektor bereitgestellt wird (Toyama und Okayama, (1990) FEBS 268: 217–221); den Promotor für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chem. 255: 2073) und die für andere glykolytische Enzyme.
  • Andere Promotoren sind induzierbar, weil sie durch Umweltstimuli oder das Wachstumsmedium der Zellen reguliert werden können. Diese induzierbaren Promotoren schließen die aus den Genen für Hitzeschockproteine, Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoffkatabolismus assoziierte Enzyme und Enzyme, die für die Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind, ein.
  • Regulationssequenzen können auch an das 3'-Ende der Kodierungssequenzen platziert werden. Diese Sequenzen können zur Stabilisierung der Messenger-RNA wirken. Solche Terminatoren werden in der 3'-untranslatierten Region nach den Kodierungssequenzen in mehreren sich von Hefe herleitenden Genen und Säugergenen gefunden.
  • Beispielhafte Vektoren für Pflanzen und Pflanzenzellen schließen folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf Agrobacterium-Ti-Plasmide, das Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) und das Tomato-Golden-Mosaic-Virus (TGMV).
  • Allgemeine Aspekte der Transformationen von Säugerzellwirtssystemen wurden von Axel ( US-Patent Nr. 4399216 , erteilt am 16. August 1983) beschrieben. Säugerzellen können durch Verfahren transformiert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Transfektion in Anwesenheit von Calciumphosphat, Mikroinjektion, Elektroporation oder über die Transduktion mit Virusvektoren. Verfahren zum Einführen von Fremd-DNA-Sequenzen in Pflanzen- und Hefegenome schließen Folgendes ein: (1) mechanische Verfahren, wie zum Beispiel die Mikroinjektion von DNA in Einzelzellen oder Protoplasten, Vortexen der Zellen mit Glasperlen in Anwesenheit von DNA, oder Schießen von mit DNA beschichteten Wolfram- oder Goldsphären in Zellen oder Protoplasten; (2) Einführen von DNA, indem die Zellmembranen für Makromoleküle durch Polyethylenglykolbehandlung oder dem Aussetzen gegenüber elektrischen Pulsen bei hoher Spannung (Elektroporation) permeabel gemacht werden; oder (3) die Verwendung von Liposomen (enthaltend cDNA), die an Zellmembranen fusionieren.
  • Die Expression von CTLA4-Mutantenmolekülen kann mithilfe von im Stand der Technik bekannten Verfahren nachgewiesen werden. So können die Mutantenmoleküle durch Coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gele und Immunblotting unter Verwendung von Antikörpern, die CTLA4 binden, nachgewiesen werden. Die Proteinwiedergewinnung kann unter Verwendung von standardmäßigen Proteinreinigungsmitteln, z. B. Affinitätschromatographie oder Ionen-Austauschchromatographie zum Erhalt eines im Wesentlichen reinen Produkts durchgeführt werden (R. Scopes in: „Protein Purification, Principles and Practice", Dritte Auflage, Springer-Verlag (1994)).
  • Gegenstand der Erfindung ist ferner die Bereitstellung löslicher CTLA4-Mutantenproteinmoleküle, die durch das Verfahren hierin produziert werden.
  • AUF DEM CTLA4Ig-CODON BASIERENDE MUTAGENESE
  • In einer Ausführungsform wurden die ortsgerichtete Mutagenese und ein neues Screening-Verfahren zur Identifikation mehrerer Mutationen in der extrazellulären Domäne von CTLA4 verwendet, die die Bindungsavidität für CD86 verbessern. In dieser Ausführungsform wurden die Mutationen in Resten in den Regionen der extrazellulären Domäne von CTLA4 von Serin 25 bis Arginin 33, dem C'-Strang (Alanin 49 und Threonin 51), dem F-Strang (Lysin 93, Glutaminsäure 95 und Leucin 96) und in der Region von Methionin 97 bis Tyrosin 102, Tyrosin 103 bis Glycin 107 und im G-Strang an den Positionen Glutamin 111, Tyrosin 113 und Isoleucin 115 durchgeführt. Diese Orte wurden basierend auf Studien an chimären CD28/CTLA4-Fusionsproteinen (Peach et al., J. Exp. Med. 1994, 180: 2049–2058) und auf einem Modell zur Prädiktion, welche Seitenketten von Aminosäureresten dem Lösungsmittel ausgesetzt würden, und einem Mangel an Aminorestidentität oder -homologie an bestimmten Positionen zwischen CD28 und CTLA4 ausgewählt. Auch jedweder Rest, der sich in räumlich dichter Nähe (5 bis 20 Ångstrom-Einheiten) zu den identifizierten Resten befindet, wird als erfindungsgemäßer Teil erachtet.
  • Zum Synthetisieren und Screening löslicher CTLA4-Mutantenmoleküle mit veränderten Affinitäten zu CD80 und/oder CD86 wurde eine Zweistufenstrategie eingesetzt. Die Experimente beinhalteten zuerst das Generieren einer Bibliothek aus Mutationen an einem spezifischen Codon von einem extrazellulären Anteil von CTLA4 und dann Screening derselben mittels der BIAcore-Analyse zum Identifizieren von Mutanten mit veränderter Reaktivität gegenüber CD80 oder CD86. Das BIAcore-Assaysystem (Pharmacia, Piscataway, N. J.) verwendet ein Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Detektorsystem, das im Wesentlichen die covalente Bindung von entweder CD80Ig oder CD86Ig an ein Dextran-beschichtetes Sensorchip, das sich in einem Detektor befindet, beinhaltet. Das Testmolekül kann dann in die Kammer injiziert werden, die das Sensorchip enthält, und die Menge an komplementärem Protein, das bindet, kann basierend auf der Änderung der Molekülmasse, die physikalisch mit der Dextranbeschichteten Seite des Sensorchips assoziiert ist, beurteilt werden; die Änderung der Molekülmasse kann mithilfe des Detektorsystems gemessen werden.
  • PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN DER ERFINDUNG
  • Gegenstand der Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung in der Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems, umfassend pharmazeutisch wirksame Mengen löslicher CTLA4-Mutantenmoleküle. In bestimmten Ausführungsformen werden die Erkrankungen des Immunsystems durch CD28- und/oder CTLA4-positive Zellinteraktionen mit CD80- und/oder CD86-positiven Zellen vermittelt. Die löslichen CTLA4-Moleküle stellen bevorzugt lösliche CTLA4-Moleküle mit Wildtyp-Sequenz und/oder löslichen CTLA4-Molekülen mit einer oder mehr Mutation(en) in der extrazellulären Domäne von CTLA4 dar. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann lösliche CTLA4-Moleküle oder CTLA4-Mutantenproteinmoleküle und/oder Nukleinsäuremoleküle und/oder für die Moleküle kodierende Vektoren einschließen. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das lösliche CTLA4-Mutantenmolekül die Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne von CTLA4, wie in einer der beiden 3 (L104EA29Y) ersichtlich ist, auf. Noch bevorzugter ist das lösliche CTLA4-Mutantenmolekül L104EA29YIg wie hierin offenbart und in 3 ersichtlich ist. Die Zusammensetzungen können zusätzlich andere Therapeutika einschließen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Immunsuppressiva, NSAR, Corticosteroide, Glucocorticoide, Arzneimittel, Toxine, Enzyme, Antikörper oder Konjugate.
  • Eine Ausführungsform der pharmazeutischen Zusammensetzung umfasst eine wirksame Menge eines löslichen CTLA4-Moleküls, allein oder in Kombination mit einer wirksamen Menge von mindestens einem anderen Therapeutikum, einschließlich eines Immunsuppressivums oder eines NSAR.
  • Wirksame Mengen von löslichem CTLA4 in der pharmazeutischen Zusammensetzung können in einem Bereich von ca. 0,1 bis 100 mg/kg Gewicht des Individuums liegen. In einer anderen Ausführungsform kann die wirksame Menge eine Menge wie folgt darstellen: ca. 0,5 bis 5 mg/kg Gewicht eines Individuums, ca. 5 bis 10 mg/kg Gewicht eines Individuums, ca. 10 bis 15 mg/kg Gewicht eines Individuums, ca. 15 bis 20 mg/kg Gewicht eines Individuums, ca. 20 bis 25 mg/kg Gewicht eines Individuums, ca. 25 bis 30 mg/kg Gewicht eines Individuums, ca. 30 bis 35 mg/kg Gewicht eines Individuums, ca. 35 bis 40 mg/kg Gewicht eines Individuums, ca. 40 bis 45 mg/kg Gewicht eines Individuums, ca. 45 bis 50 mg/kg Gewicht eines Individuums, ca. 50 bis 55 mg/kg Gewicht eines Individuums, ca. 55 bis 60 mg/kg Gewicht eines Individuums, ca. 60 bis 65 mg/kg Gewicht eines Individuums, ca. 65 bis 70 mg/kg Gewicht eines Individuums, ca. 70 bis 75 mg/kg Gewicht eines Individuums, ca. 75 bis 80 mg/kg Gewicht eines Individuums, ca. 80 bis 85 mg/kg Gewicht eines Individuums, ca. 85 bis 90 mg/kg Gewicht eines Individuums, ca. 90 bis 95 mg/kg Gewicht eines Individuums oder ca. 95 bis 100 mg/kg Gewicht eines Individuums. In einer Ausführungsform beträgt die Menge 2 mg/kg Gewicht eines Individuums. In einer anderen Ausführungsform beträgt die wirksame Menge 10 mg/kg Gewicht eines Individuums. In einer Ausführungsform beträgt die wirksame Menge eines löslichen CTLA4-Moleküls 2 mg/kg Gewicht eines Individuums. In einer Ausführungsform beträgt die wirksame Menge eines löslichen CTLA4-Moleküls 10 mg/kg Gewicht eines Individuums.
  • Die Menge eines an ein Individuum verabreichten Immunsuppressivums variiert in Abhängigkeit von mehreren Faktoren, einschließlich der Wirksamkeit des Arzneimittels auf ein spezifisches Individuum und die Toxizität d. h. die Verträglichkeit) eines Arzneimittels auf ein spezifisches Individuum.
  • Methotrexat wird üblicherweise in einer Menge von ca. 0,1 bis 40 mg pro Woche in einer üblichen Dosierung im Bereich von ca. 5 bis 30 mg pro Woche verabreicht. Methotrexat kann an ein Individuum in verschiedenen Inkrementen verabreicht werden: ca. 0,1 bis 5 mg/Woche, ca. 5 bis 10 mg/Woche, ca. 10 bis 15 mg/Woche, ca. 15 bis 20 mg/Woche, ca. 20 bis 25 mg/Woche, ca. 25 bis 30 mg/Woche, ca. 30 bis 35 mg/Woche, oder ca. 35 bis 40 mg/Woche. In einer Ausführungsform stellt eine wirksame Menge eines Immunsuppressivums, einschließlich Methotrexat, eine Menge von ca. 10 bis 30 mg/Woche dar.
  • Wirksame Methotrexatmengen liegen im Bereich von ca. 0,1 bis 40 mg/Woche. In einer Ausführungsform liegt die wirksame Menge im Bereich von ca. 0,1 bis 5 mg/Woche, ca. 5 bis 10 mg/Woche, ca. 10 bis 15 mg/Woche, ca. 15 bis 20 mg/Woche, ca. 20 bis 25 mg/Woche, ca. 25 bis 30 mg/Woche, ca. 30 bis 35 mg/Woche oder ca. 35 bis 40 mg/Woche. In einer Ausführungsform wird Methotrexat in einer Menge im Bereich von ca. 10 bis 30 mg/Woche verabreicht.
  • Cyclophosphamid, ein Alkylierungsmittel, kann in Dosierungen im Bereich von ca. 1 bis 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht werden.
  • Cyclosporin (z. B. NEORAL®), auch als Cyclosporin A bekannt, wird üblicherweise in Dosierungen im Bereich von ca. 1 bis 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht. Dosierungen, im Bereich von ca. 2,5 bis 4 mg pro Körpergewicht pro Tag werden üblicherweise verwendet.
  • Chloroquin oder Hydroxychloroquin (z. B. PLAQUENIL®) wird üblicherweise in Dosierungen im Bereich von ca. 100 bis 1000 mg täglich verabreicht. Bevorzugte Dosierungen liegen im Bereich von ca. 200 bis 600 mg, die täglich verabreicht werden.
  • Sulfasalazin (z. B. AZULFIDIN EN-Tabletten®) wird im Allgemeinen in Mengen im Bereich von ca. 50 bis 5000 mg pro Tag, in einer üblichen Dosierung von ca. 2000 bis 3000 mg pro Tag für Erwachsene verabreicht. Die Dosierungen für Kinder liegen üblicherweise bei ca. 5 bis 100 mg/kg Körpergewicht bis zu 2 g pro Tag.
  • Goldsalze werden für zwei Verabreichungstypen formuliert: für Injektionszwecke oder oral. Injizierbare Goldsalze werden üblicherweise in Dosierungen von ca. 5 bis 100 mg Dosen, alle zwei bis vier Wochen, verschrieben. Oral verabreichte Goldsalze werden üblicherweise in Dosen im Bereich von ca. 1 bis 10 mg pro Tag verschrieben.
  • D-Penicillamin oder Penicillamin (CUPRIMIN®) wird üblicherweise in Dosierungen von ca. 50 bis 2000 mg pro Tag verabreicht, wobei die bevorzugten Dosierungen bei ca. 125 mg pro Tag bis zu 1500 mg pro Tag liegen.
  • Azathioprin wird üblicherweise in Dosierungen von ca. 10 bis 250 mg pro Tag verabreicht. Bevorzugte Dosierungen liegen im Bereich von ca. 25 bis 200 mg pro Tag.
  • Anakinra (z. B. KINERET®) stellt einen Interleukin-1-Rezeptor-Antagonist dar. Ein üblicher Dosierungsbereich für Anakinra liegt bei ca. 10 bis 250 mg pro Tag, mit einer empfohlenen Dosierung von ca. 100 mg pro Tag.
  • Infliximab (REMICADE®) stellt einen chimären monoklonalen Antikörper dar, der an den Tumornekrosefaktor α (TNFα) bindet. Infliximab wird üblicherweise in Dosierungen von ca. 1 bis 20 mg/kg Körpergewicht, alle vier bis acht Wochen, verabreicht. Dosierungen von ca. 3 bis 10 mg/kg Körpergewicht können alle vier bis acht Wochen in Abhängigkeit vom Individuum verabreicht werden.
  • Etanercept (z. B. ENBREL®) stellt ein dimeres Fusionsprotein dar, das den Tumornekrosefaktor (TNF) bindet und seine Interaktionen mit TNF-Rezeptoren blockiert. Üblicherweise verabreichte Dosierungen von Etanercept liegen bei 10 bis 100 mg pro Woche für Erwachsene mit einer bevorzugten Dosierung von ca. 50 mg pro Woche. Die Dosierungen für juvenile Individuen liegen im Bereich von ca. 0,1 bis 50 mg/kg Körpergewicht pro Woche mit einem Maximum von ca. 50 mg pro Woche.
  • Leflunomid (ARAVA®) wird üblicherweise in Dosierungen von ca. 1 und 100 mg pro Tag verabreicht. Eine übliche tägliche Dosierung liegt bei ca. 10 bis 20 mg pro Tag.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen schließen bevorzugt auch geeignete Träger und Adjuvanzien ein, die jedwedes Material einschließen, das wenn es mit dem erfindungsgemäßen Molekül (z. B. einem löslichen CTLA4-Mutantenmolekül, z. B. L104EA29YIg) kombiniert wird, die Aktivität des Moleküls beibehält und mit dem Immunsystem des Individuums nicht reaktiv ist. Beispiele geeigneter Träger und Adjuvanzien schließen folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf humanes Serumalbumin; Ionenaustauscher; Aluminiumoxid; Lecithin; Puffersubstanzen, wie zum Beispiel Phosphate; Glycin; Sorbinsäure; Kaliumsorbat; und Salze oder Elektrolyte, wie zum Beispiel Protaminsulfat. Andere Beispiele schließen jedwede standardmäßigen pharmazeutischen Träger, wie zum Beispiel eine Phosphat-gepufferte Salzlösung; Wasser; Emulsionen, wie zum Beispiel eine Öl-Wasser-Emulsion; und verschiedene Benetzungsmitteltypen ein. Andere Träger können auch sterile Lösungen; Tabletten, einschließlich beschichteter Tabletten, und Kapseln einschließen. In der Regel enthalten solche Träger Hilfsstoffe, wie zum Beispiel Stärke, Milch, Zucker, bestimmte Tontypen, Gelatine, Stearinsäure oder Salze davon, Magnesium- oder Calciumstearat, Talkum, pflanzliche Fette oder Öle, Gummis, Gykole oder andere bekannte Hilfsstoffe. Solche Träger können auch Geschmacks- und Farbstoffadditive oder andere Bestandteile einschließen. Zusammensetzungen, die solche Träger umfassen, werden durch überall bekannte, übliche Verfahren formuliert. Solche Zusammensetzungen können auch in verschiedenen Lipidzusammensetzungen, wie zum Beispiel Liposomen ebenso wie in verschiedenen polymeren Zusammensetzungen, wie zum Beispiel Polymermikrosphären, formuliert werden.
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können unter Verwendung üblicher Verabreichungsweisen verabreicht werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: die intravenöse (i. v.) Verabreichung, intraperitoneale (i. p.) Verabreichung, intramuskuläre (i. m.) Verabreichung, subkutane Verabreichung, orale Verabreichung, Verabreichung als ein Suppositorium oder als ein topisches Kontaktmittel, oder die Implantation einer Vorrichtung zur langsamen Freisetzung, wie zum Beispiel durch eine miniosmotische Pumpe, an das Individuum.
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können in vielen verschiedenen Arzneiformen vorliegen, die die folgenden einschließen, aber nicht beschränkt sind auf: flüssige Lösungen oder Suspensionen, Tabletten, Dragees, Pulver, Suppositorien, polymere Mikrokapseln oder Mikrovesikel, Liposomen und injizierbare oder infundierbare Lösungen. Die bevorzugte Form hängt ab von der Verabreichungsweise und der therapeutischen Applikation.
  • Die wirksamste Verabreichungsweise und das Dosierungsregime für diese erfindungsgemäßen Zusammensetzungen hängen ab vom Schweregrad und dem Krankheitsverlauf, dem Gesundheitszustand des Patienten und das Ansprechen auf die Behandlung und nach dem Ermessen des behandelnden Arztes. Demgemäß sollten die Dosierungen der Zusammensetzungen auf den individuellen Patienten abgestimmt titriert werden.
  • Die löslichen CTLA4-Mutantenmoleküle können an das Individuum in einer Menge und für eine Zeitspanne (z. B. Zeitdauer und/oder mehrfache Zeitdauern) verabreicht werden, die zum Blockieren der endogenen Moleküle von B7 (z. B. CD80 und/oder CD86) vom Binden ihrer entsprechenden Liganden im Individuum ausreichend sind. Die Blockade der endogenen B7-/Ligandenbindung inhibiert auf diese Weise Interaktionen zwischen B7-positiven Zellen (z. B. CD80- und/oder CD86-positiven Zellen) mit CD28- und/oder CTLA4-positiven Zellen. Die Dosierung eines Therapeutikums ist von vielen Faktoren abhängig einschließlich, aber nicht beschränkt auf den Typ des betroffenen Gewebes, den Typ der zu behandelnden Autoimmunkrankheit, den Schweregrad der Krankheit, den Gesundheitszustand eines Individuums und das Ansprechen eines Individuums auf die Behandlung mit den Mitteln. Demzufolge können die Dosierungen der Mittel von dem Individuum und der Verabreichungsweise abhängig variieren. Die löslichen CTLA4-Mutantenmoleküle können in einer Menge zwischen 0,1 bis 20,0 mg/kg Gewicht des Patienten/Tag, bevorzugt zwischen 0,5 bis 10,0 mg/kg/Tag verabreicht werden. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen kann über verschiedene Zeiten erfolgen. In einer Ausführungsform kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung für eine oder mehr Stunde(n) verabreicht werden. Die Verabreichung kann, wie im Stand der Technik verstanden wird, außerdem, vom Schweregrad der Erkrankung ebenso wie von anderen Faktoren abhängig, wiederholt werden.
  • ERFINDUNGSGEMÄSSE VERFAHREN
  • Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems und Autoimmunkrankheiten in einem Individuum, die die Verabreichung einer wirksamen Menge eines löslichen CTLA4-Moleküls oder eines CTLA4-Mutantenmoleküls, das CD80- und/oder CD86-Moleküle auf CD80- und/oder CD86-positiven Zellen bindet, um auf diese Weise die Bindung von CD80 und/oder CD86 an CTLA4 und/oder CD28 zu inhibieren, an ein Individuum umfasst. Die Verfahren umfassen die Verabreichung einer therapeutischen Zusammensetzung, die die erfindungsgemäßen löslichen CTLA4-Moleküle oder CTLA4-Mutantenmoleküle umfasst, an ein Individuum in einer Menge, die zur Linderung von mindestens einem der mit den Erkrankungen des Immunsystems einhergehenden Symptome wirksam ist. Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Bereitstellung einer Langzeittherapie für Erkrankungen des Immunsystems durch Blockieren der T-Zell-/B7-positiven Zellinteraktionen, wodurch die T-Zellaktivierung/-stimulation durch costimulatorische Signale, wie zum Beispiel B7-Bindung an CD28, blockiert wird, was zur Induktion der T-Zellanergie oder -toleranz führt.
  • Die erfindungsgemäßen löslichen CTLA4-Moleküle oder CTLA4-Mutantenmolküle weisen inhibitorische Eigenschaftens in vivo auf Unter Bedingungen, unter denen T-Zell-/B7-positive Zellinteraktionen, zum Beispiel T-Zell/B-Zellinteraktionen, aufgrund des Kontakts zwischen T-Zellen und B7-positiven Zellen auftreten, kann die Bindung von eingeführten CTLA4-Molekülen zur Reaktion auf B7-positive Zellen, wie zum Beispiel B-Zellen, interferieren, d. h. die T-Zell-B7-positiven Zellinteraktionen inhibieren, was zur Regulation der Immunantworten führt. Die Inhibition von T-Zellantworten durch Verabreichung eines löslichen CTLA4-Moleküls kann auch zur Behandlung von Autoimmunstörungen nützlich sein. Viele Autoimmunstörungen ergeben sich aus einer unangemessenen Aktivierung von T-Zellen, die gegen Autoantigene reaktiv sind und die die Produktion von an der Pathologie der Krankheit beteiligten Cytokinen und Autoantikörpern fördern. Die Verabreichung eines L104EA29YIg-Moleküls an ein Individuum, das an einer vermuteten Autoimmunstörung leidet oder dafür suszpetibel ist, kann die Aktivierung von autoreaktiven T-Zellen verhindern und die Krankheitssymptome reduzieren oder eliminieren. Dieses Verfahren kann auch die Verabreichung eines erfindungsgemäßen L104EA29YIg-Moleküls, allein oder zusammen, mit zusätzlichen Liganden, wie zum Beispiel denen, die mit IL-2, IL-4 oder γ-Interferon reaktiv sind, an das Individuum umfassen.
  • Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Regulation von Immunantworten. Die Immunantworten können durch die erfindungsgemäßen löslichen CTLA4-Moleküle oder CTLA4-Mutantenmoleküle downreguliert (reduziert) werden, was möglicherweise durch das Inhibieren oder Blockieren einer bereits stattfindenden Immunantwort oder gegebenenfalls die Verhinderung der Induktion einer Immunantwort erfolgen kann. Die erfindungsgemäßen löslichen CTLA4-Moleküle oder CTLA4-Mutantenmoleküle können die Funktionen von aktivierten T-Zellen, wie zum Beispiel die T-Lymphozytenproliferation und Cytokinsekretion, durch Suppression der T-Zellantworten oder durch Induktion einer spezifischen Toleranz in T-Zellen oder beides, inhibieren. Die erfindungsgemäßen löslichen CTLA4-Moleküle oder CTLA4-Mutantenmoleküle, die mit dem CTLA4-/CD28-B7-Signalweg interferieren, können die T-Zellproliferation und/oder die Cytokinsekretion inhibieren und folglich zur reduzierten Gewebezerstörung und Induktion von nicht ansprechenden T-Zellen oder zur T-Zellanergie führen.
  • Gegenstand der Erfindung ist ferner die Bereitstellung von Verfahren zum Inhibieren der Abstoßung von Organ- und Gewebetransplantaten in Individuen, die die Verabreichung einer wirksamen Menge von mindestens einem löslichen CTLA4-Molekül oder CTLA4-Mutantenmolekül, z. B. L104EA29YIg, an das Individuum vor, während und/oder nach der Transplantation umfasst. In einer anderen Ausführungsform schließt das erfindungsgemäße Verfahren die Verabreichung an ein Individuum von mindestens einem löslichen CTLA4-Molekül oder einem CTLA4-Molekül in Kombination mit mindestens einem anderen Therapeutikum ein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf ein Arzneimittel, ein Toxin, ein Enzym, einen Antikörper oder ein Konjugat.
  • Das Organ- oder Gewebetransplantat kann von jedwedem Organ- oder Gewebetyp stammen, der zur Transplantation zugänglich ist. In einer Ausführungsform kann das transplantierte Gewebe ein Pankreasgewebe darstellen. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt das Transplantatgewebe Pankreasinselzellen dar. Gegenstand der Erfindung ist auch die Bereitstellung von Verfahren zur Behandlung von Typ-I- und/oder Typ-II-Diabetes bei Individuen durch Inhibition der Abstoßung des Inselzelltransplantats.
  • Gegenstand der Erfindung ist ferner die Bereitstellung eines Verfahrens zum Inhibieren der Abstoßung des Pankreasinseltransplantats in einem Individuum, wobei das Individuum einen Empfänger des Transplantatgewebes darstellt. In der Regel wird bei Gewebetransplantaten die Abstoßung des Transplantats durch seine Erkennung als Fremdkörper durch T-Zellen initiiert, gefolgt von einer Immunantwort, die das Transplantat zerstört. Die Verabreichung eines löslichen CTLA4-Moleküls im erfindungsgemäßen Verfahren inhibiert die Proliferation von T-Lymphozyten und/oder die Sekretion von Cytokinen, was zur reduzierten Gewebezerstörung und Induktion von Antigen-spezifischem Nichtansprechen der T-Zellen führt, was zur langzeitigen Transplantatverträglichkeit ohne die Notwendigkeit einer generalisierten Immunsuppression führen kann.
  • Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform umfasst die Verwendung des löslichen CTLA4-Mutantenmoleküls L104EA29YIg zum Regulieren funktioneller Interaktionen von CTLA4- und CD28-positiven Zellen mit B7-positiven Zellen zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems, wie zum Beispiel Diabetes und/oder zur Downregulation von Immunantworten. Das erfindungsgemäße L104EA29YIg stellt ein lösliches CTLA4-Mutantenmolekül dar, das mindestens zwei Aminosäureänderungen umfasst, die Änderung von Leucin (L) zu Glutaminsäure (E) an Position +104 und von Alanin (A) zu Tyrosin (Y) an Position +29. Das L104EA29YIg-Molekül kann weitere Mutationen über die beiden hierin spezifizierten hinausgehend umfassen.
  • Das Verfahren kann ferner die Verabreichung mit den löslichen CTLA4-Mutantenmolekülen, eines immunsuppressiven Basisregimes, an das Individuum umfassen. Das immunsuppressive Basisregime kann Folgendes einschließen (ist aber nicht beschränkt auf): Cyclosporin, Azathioprin, Methotrexat, Cyclophosphamid, Lymphozytenimmunglobulin, anti-CD3-Antikörper, Rho-(D)-Immunglobulin, Adrenocorticosteroide, Sulfasalzin, FK-506, Methoxsalen, Mycophenolat-Mofetil (CELLCEPT), Pferdeanti-Human-Thymozytenglobulin (ATGAM), humanisiertes anti-TAC (HAT), Basiliximab (SIMULECT), Kaninchen-anti-Human-Thymozytenglobulin (THYMOGLOBULIN), Sirolimus, Thalidomid, Methotrexat, Chloroquin, Hydroxychloroquin, Sulfasalazin, Sulfasalazopyrin, Leflunomid, Goldsalze, D-Penicillamin, Azathioprin, Anakinra, Infliximab, Etanercept, TNFα-Blocker oder ein biologisches Mittel, das ein inflammatorisches Cytokin targetiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das immunsuppressive Basisregime frei von Steroid. Das immunsuppressive Basisregime umfasst bevorzugt Rapamycin und anti-humane IL-2R-mAk.
  • Eine erfindungsgemäße Ausführungsform umfasst die Verwendung eines Moleküls zum Blockieren der Interaktion zwischen B7 und CTLA4 zusammen mit einem Immunsuppressivum zum Regulieren einer Immunantwort, um eine Erkrankung des Immunsystems, wie zum Beispiel Diabetes, zu behandeln. Das zum Blockieren der B7-/CTLA4-Interaktion verwendete Molekül kann ein lösliches CTLA4, wie zum Beispiel CTLA4Ig, CTLA4Ig/CD28Ig oder L104EA29YIg, ein lösliches CD28, wie zum Beispiel CD28Ig, ein lösliches B7 (B7-1 oder B7-2), wie zum Beispiel B7Ig, gegen CTLA4 gerichtete monoklonale Antikörper, gegen CD28 gerichtete monoklonale Antikörper oder gegen B7 gerichtete monoklonale Antikörper darstellen.
  • Die durch die vorliegende Erfindung behandelten Individuen schließen Säuger, einschließlich Menschen, Affen, Menschenaffen, Hunde, Katzen, Kühe, Pferde, Ziegen, Schweine, Kaninchen, Mäuse und Ratten ein.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung verschiedener Verfahren, lokal oder systemisch, zur Verabreichung der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen, wie zum Beispiel ein lösliches CTLA4-Molekül allein oder zusammen mit einem Immunsuppressivum und/oder einem anderen Therapeutikum. Die Verfahren schließen intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, orale, Inhalation- und subkutane Verfahren ebenso wie eine implantierbare Pumpe, eine kontinuierliche Infusion, die Gentherapie, Liposomen, Suppositorien, topische Kontaktmittel, Vesikel, Kapseln und Injektionsverfahren ein. Das aus einem Träger aufgebaute Therapeutikum wird üblicherweise zur Lagerung lyophilisiert und wird mit Wasser oder einer gepufferten Lösung mit einem neutralen pH (ca. pH 7 bis 8, z. B. pH 7,5) vor der Verabreichung rekonstituiert.
  • Im Rahmen der im Stand der Technik praktischen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in jedweder pharmazeutisch verträglichen Form an das Individuum verabreicht werden.
  • Gemäß der erfindungsgemäßen praktischen Ausführungsform umfassen die Verfahren die Verabreichung der erfindungsgemäßen löslichen CTLA4-Moleküle zum Regulieren der Interaktionen der CD28- und/oder CTLA4-positiven Zellen mit B7-positiven Zellen an das Individuum. Die B7-positiven Zellen werden mit einer wirksamen Menge der erfindungsgemäßen löslichen CTLA4-Moleküle, oder Fragmenten oder Derivaten davon, in Kontakt gebracht, um auf diese Weise lösliche CTLA4-B7-Komplexe zu bilden. Die Komplexe interferieren mit der Interaktion zwischen endogenen CTLA4- und CD28-Molekülen mit den Molekülen der B7-Familie.
  • Die löslichen CTLA4-Moleküle können an ein Individuum in einer Menge und für eine Zeitspanne (z. B. Zeitdauer und/oder mehrfache Zeitspannen) verabreicht werden, die zum Blockieren endogener B7-Moleküle zum Binden ihrer entsprechenden Liganden in dem Individuum ausreichend ist. Die Blockade der endogenen B7-/Ligandenbindung inhibiert dadurch Interaktionen zwischen B7-positiven Zellen mit CD28- und/oder CTLA4-positiven Zellen.
  • Die Dosierung eines Therapeutikums hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich, aber nicht beschränkt auf den Typ des betroffenen Gewebes, den Typ der zu behandelnden Autoimmunkrankheit, den Schweregrad der Erkrankung, den Gesundheitszustand eines Individuums und das Ansprechen auf die Behandlung mit den Mitteln. Infolgedessen können die Dosierungen der Mittel in Abhängigkeit von jedem Individuum und der Verabreichungsweise variieren. Die löslichen CTLA4-Moleküle können in einer Menge von ca. 0,1 bis 100 mg/kg Gewicht des Patienten/Tag verabreicht werden.
  • Die Erfindung umfasst auch die Anwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zusammen mit anderen Pharmazeutika zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems. Diabetes kann zum Beispiel mit erfindungsgemäßen Molekülen zusammen mit, aber nicht beschränkt auf Immunsuppressiva, wie zum Beispiel Corticosteroiden, Cyclosporin (Mathiesen 19S9 Cancer Lett. 44(2): 151–156), Prednison, Azathioprin (R. Handschumacher, in: „Drugs Used for Immunosuppression", Seiten 1264–1276), TNFα-Blocker oder -Antagonisten (New England Journal of Medicine, Vol. 340: 253–259, 1999; The Lancet Vol. 354: 1932–39, 1999, Annals of Internal Medicine, Vol. 130: 478–486), oder jedwedem anderen biologischen Mittel, das jedwedes inflammatorische Cytokin targetiert, nicht-steroidalen antiinflammatorischen Arzneimitteln/Cox-2-Inhibitoren, Hydroxychloroquin, Sulfasalazopyrin, Goldsalzen, Etanercept, Infliximab, Rapamycin, Mycophenolat-Mofetil, Azathioprin, Tacrolimus, Basiliximab, Cytoxan, Interferon-beta-1a, Interferon-beta-1b, Glatiramer-Acetat, Mitoxantron-Hydrochlorid, Anakinra und/oder anderen biologischen Mitteln behandelt werden.
  • Die löslichen CTLA4-Moleküle (bevorzugt L104EA29YIg) können auch in Kombination mit einem oder mehr der folgenden Mittel zum Regulieren einer Immunantwort angewendet werden: löslichem gp39 (auch bekannt als CD40-Ligand (CD40L), CD154, T-BAM, TRAP), löslichem CD29, löslichem CD40, löslichem CD80 (z. B. ATCC 68627), löslichem CD86, löslichem CD28 (z. B. 68628), löslichem CD56, löslichem Thy-1, löslichem CD3, löslichem TCR, löslichem VLA-4, löslichem VCAM-I, löslichem LECAM-I, löslichem ELAM-I, löslichem CD44, mit gp39 reaktiven Antikörpern (z. B. ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 und ATCC HB-12056), mit CD40 reaktiven Antikörpern (z. B. ATCC HB-9110), mit B7 reaktiven Antikörpern (z. B. ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341, usw.), mit CD28 reaktiven Antikörpern (z. B. ATCC HB-11944 oder mAk 9,3 wie von Martin et al. (J. Clin. Immun. 4(1); 18–22, 1980) beschrieben, mit LFA-1 reaktiven Antikörpern (z. B. ATCC HB-9579 und ATCC TEB-213), mit LFA-2 reaktiven Antikörpern, mit IL-2 reaktiven Antikörpern, mit IL-12 reaktiven Antikörpern, mit IFN-gamma reaktiven Antikörpern, mit CD2 reaktiven Antikörpern, mit CD48 reaktiven Antikörpern, mit jedwedem ICAM reaktiven Antikörpern (z. B. ICAM-I (ATCC CRL-2252), ICAM-2 und ICAM-3), mit CTLA4 reaktiven Antikörpern (z. B. ATCC HB-304), mit Thy-1 reaktiven Antikörpern, mit CD56 reaktiven Antikörpern, mit CD3 reaktiven Antikörpern, mit CD29 reaktiven Antikörpern, mit TCR reaktiven Antikörpern, mit VLA-4 reaktiven Antikörpern, mit VCAM-1 reaktiven Antikörpern, mit LECAM-1 reaktiven Antikörpern, mit ELAM-1 reaktiven Antikörpern und mit CD44 reaktiven Antikörpern. In bestimmen Ausführungsformen sind monoklonale Antikörper bevorzugt. In anderen Ausführungsformen sind Antikörperfragmente bevorzugt. Wie der Fachmann ohne weiteres verstehen wird, kann die Kombination die erfindungsgemäßen löslichen CTLA4-Moleküle und ein anderes Immunsuppressivum, die löslichen CTLA4-Moleküle mit zwei anderen Immunsuppressiva, die löslichen CTLA4-Moleküle mit drei anderen Immunsuppressiva usw. einschließen. Die Ermittlung der optimalen Kombination und die optimalen Dosierungen kann unter Verwendung von im Stand der Technik überall bekannten Verfahren erfolgen und optimiert werden.
  • Zu einigen spezifischen Kombinationen gehören die folgenden: L104EA29YIg und monoklonale CD80-Antikörper (mAk); L104EA29YIg und CD86-mAk; L104EA29YIg, CD80-mAk und CD86-mAk; L104EA29YIg und gp39-mAk; L104EA29YIg und CD40-mAk; L104EA29YIg und CD28-mAk; L104EA29YIg, CD80- und CD86-mAk, und gp39-mAk; L104EA29YIg, CD80- und CD86-mAk und CD4-mAk; und L104EA29YIg, anti-LFA1-mAk und anti-gp39-mAk. Ein spezifisches Beispiel eines gp39-mAk stellt MR1 dar. Andere Kombinationen werden vom Fachmann ohne weiteres erkannt und verstanden werden.
  • Die erfindungsgemäßen löslichen CTLA4-Moleküle, wie zum Beispiel L104EA29YIg, können als der einzige Wirkstoff oder zusammen mit anderen Arzneimitteln in immunmodulierenden Regimen oder anderen antiinflammatorischen Mitteln, z. B. zur Behandlung oder der Verhinderung der akuten oder chronischen Abstoßung des Allo- oder Xenotransplantats oder inflammatorischen Erkrankungen oder Autoimmunstörungen oder zum Induzieren der Toleranz verabreicht werden. Er kann zum Beispiel in Kombination mit folgenden verwendet werden: einem Calcineurin-Inhibitor, z. B. Cyclosporin A oder FK506; einem immunsuppressiven Makrolid, z. B. Rapamycin oder einem Derivat davon (z. B. 40-O-(2-Hydroxy)ethyl-rapamycin); einem Lymphozyten-Homing-Mittel, z. B. FTY720 oder einem Analog davon; Corticosteroiden; Cyclophosphamid; Azathiopren; Methotrexat; Leflunomid oder einem Analog davon; Mizoribin; Mycophenolsäure; Mycophenolat-Mofetil; 15-Desoxyspergualin oder einem Analog davon; immunsuppressive monoklonale Antikörper, z. B. monoklonale Antikörper gegen Leukozytenrezeptoren, z. B. MHC, CD2, CD3, CD4, CD 11a/CD18, CD7, CD25, CD 27, B7, CD40, CD45, CD58, CD 137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB oder ihre Liganden; oder anderen immunmodulatorischen Verbindungen, Z. B. CTLA4/CD28-Ig oder anderen Adhäsionsmolekülinhibitoren, z. B. mAk oder niedermolekularen Inhibitoren, einschließlich LFA-1-Antagonisten, Selectin-Antagonisten und VLA-4-Antagonisten. Die Verbindung ist insbesondere nützlich in Verbindung mit einer Verbindung, die mit CD40 und seinem Liganden, z. B. Antikörpern gegen CD40 und Antikörpern gegen CD40-L interferiert.
  • Werden die erfindungsgemäßen löslichen CTLA4-Mutantenmoleküle zusammen mit einer anderen immunsuppressiven/immunmodulatorischen oder antiinflammatorischen Therapie, z. B. wie hierin vorstehend spezifiziert, verabreicht, so werden die Dosierungen der gleichzeitig miteinander verabreichten immunsuppressiven, immunmodulatorischen oder antiinflammatorischen Verbindung selbstverständlich in Abhängigkeit vom Typ des gleichzeitig eingesetzten Arzneimittels, z. B. ob es ein Steroid oder ein Cyclosporin ist, vom spezifisch eingesetzten Arzneimittel, von dem zu behandelnden Zustand und so weiter variieren.
  • Gemäß dem Vorstehenden stellt die vorliegende Erfindung in einem noch weiteren Aspekt wie vorstehend definierte Verfahren bereit, umfassend die Coadministration, z. B. gleichzeitig oder in Sequenz, einer therapeutisch wirksamen Menge von erfindungsgemäßen löslichen CTLA4-Molekülen, z. B. CTLA4Ig und/oder L104EA29YIg, in freier Form oder in einer pharmazeutisch verträglichen Salzform, und eine zweite Arzneimittelsubstanz, wobei die zweite Arzneimittelsubstanz ein immunsuppressives, immunmodulatorisches oder antiinflammatorisches Arzneimittel, z. B. wie vorstehend angezeigt ist, bereitstellt.
  • Weiter bereitgestellt werden therapeutische Kombinationen, z. B. ein Kit, umfassend ein lösliches CTLA4-Molekül, in freier Form oder in einer pharmazeutisch verträglichen Salzform, die gleichzeitig oder in Sequenz mit mindestens einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden sollen, die ein immunsuppressives, immunmodulatorisches oder antiinflammatorisches Arzneimittel, z. B. NSAR, Glucocorticoid oder Corticosteroid, umfasst. Das Kit kann Anleitungen für seine Verabreichung enthalten. Die erfindungsgemäßen Kits können in jedwedem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
  • In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Abstoßung von Gewebe- und Organtransplantaten durch Verabreichung von löslichen CTLA4 an ein Individuum und T-Zell-depletierten Knochenmarkzellen an das Individuum inhibiert. Die Verabreichung von T-zelldepletiertem Knochenmark kann ca. zur gleichen Zeit, zu der das Individuum das Gewebe- oder Organtransplantat empfängt oder zu einem anderen Zeitpunkt vorgenommen werden. Die Verabreichung von Knochenmark zu ca. dem gleichen Zeitpunkt deutet darauf hin, dass das Knochenmark an das Individuum als Teil der Vorbereitung für die Verfahren zur Verabreichung des Gewebe- oder Organtransplantats verabreicht wird. Es ist nicht erforderlich, dass das Knochenmark an genau dem gleichen Zeitpunkt wie das (d. h. innerhalb von Minuten von dem) Organtransplantat transplantiert wird.
  • In bevorzugten Ausführungsformen wird das T-zelldepletierte Knochenmark vor der Organtransplantation verabreicht. Bestimmte Ausführungsformen schließen die Verabreichung des T-zelldepletierten Knochenmarks innerhalb von einem Tag, innerhalb von zwölf Stunden oder innerhalb von sechs Stunden der soliden Organtransplantation ein. Das T-zelldepletierte Knochenmark kann jedoch früher verabreicht werden, vorausgesetzt, dass die sich ergebenden Wirkungen des T-zelldepletierten Knochenmarks in Verbindung mit der Organ- oder Gewebetransplantation noch erreicht werden. In alternativen Ausführungsformen kann erwünscht sein, dass man das T-zelldepletierte Knochenmark nach der Organtransplantation verabreicht.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung einer Dosis T-zelldepletierter Knochenmarkzellen (tolerisierende Dosis) an ein Individuum und anschließend die Verabreichung einer zusätzlichen Dosis T-zelldepletierter Knochenmarkzellen (zum Anwachsen (Engrafting) benötigte Dosis) an das Individuum. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Immunsuppressivum mindestens einen oder mehr Typ(en) von Liganden, die mit der Bindung von CD28-Antigen an das CD80- und/oder CD86-Antigen interferieren. Wie vorstehend beschrieben, stellt der Ligand bevorzugt ein mutantes CTLA4-Molekül, wie zum Beispiel L104EA29YIg, dar.
  • Die Menge des T-zelldepletierten Knochenmarks kann überdies mithilfe der Routineexperimentierung bestimmt und empirisch optimiert werden. So kann zum Beispiel die Menge von T-zelldepletiertem Knochenmark während der Routineexperimentierung zur Bestimmung der Menge titriert werden, die zum Erreichen der gewünschten Wirkungen ausreicht.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch durch Verabreichung, zusätzlich zu dem löslichen CTLA4-Mutantenmolekül, von zwei oder mehr Dosen von T-zelldepletiertem Knochenmark an das Individuum, allein oder in Kombination mit einem Immunsuppressivum oder mehr Immunsuppressiva, auch praktisch ausgeführt werden.
  • Wie hierin in den erfindungsgemäßen Verfahren besprochen, kann die Verabreichung eines löslichen CTLA4-Moleküls oder mutanten CTLA4-Moleküls auf viele verschiedene Weisen erreicht werden, einschließlich lokaler oder systemischer Verabreichungsrouten. So können die löslichen CTLA4-Mutantenmoleküle zum Beispiel intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal verabreicht werden. Als Alternative kann das mutante CTLA4 oral oder subkutan verabreicht werden. Andere Verabreichungsverfahren werden vom Fachmann erkannt werden. Ebenso kann das T-zelldepletierte Knochenmark, wie dem Fachmann bekannt ist, auf viele verschiedene Weisen verabreicht werden. Ein Beispiel stellt der intravenöse Infusionsweg dar.
  • Das Immunsuppressivum/Die Immunsuppressiva kann/können vor oder nach der Verabreichung des löslichen CTLA4-Mutanten und/oder vor oder nach der Organ-/Gewebetransplantation verabreicht werden. Das Knochenmark und das Immunsuppressivum werden bevorzugt vor der Verabreichung des löslichen CTLA4-Mutantenmoleküls verabreicht. In einer Ausführungsform wird eine erste Dosis von T-zelldepletiertem Knochenmark (tolerisierende Dosis) und des Immunsuppressivums in etwa zum gleichen Zeitpunkt wie das Organtransplantat verabreicht.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung vorgelegt. Die Methodologie und Ergebnisse können in Abhängigkeit von dem angestrebten Behandlungsziel und den eingesetzten Verfahren variieren. Die Beispiele sind in keiner Weise dazu beabsichtigt, den Umfang der Erfindung anderweitig einzuschränken.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • Dieses Beispiel stellt eine Beschreibung der Verfahren bereit, die zum Generieren der Nukleotidsequenzen, die für die erfindungsgemäßen löslichen CTLA4-Mutantenmoleküle kodieren, verwendet werden. Ein „single-site" mutantes L104EIg wurde generiert und auf die Bindungskinetik an CD80 und/oder CD86 getestet. Die Nukleotidsequenz von L104EIg wurde als ein Template zum Generieren der „double-site" mutanten CTLA4-Sequenz, L104EA29YIg, das auf die Bindungskinetik an CD80 und/oder CD86 getestet wurde, verwendet.
  • AUF EINEM CTLA4Ig-CODON BASIERENDE MUTAGENESE:
  • Zur Identifikation von mutanten CTLA4Ig-Molekülen, die langsamere Dissoziationsraten („Off"-Raten) vom Binden von CD86-Molekülen aufwiesen, wurde eine Mutagenese- und Screening-Strategie entwickelt. Die „single-site” mutanten Nukleotidsequenzen wurden unter Verwendung von CTLA4Ig ( US-Patente Nr. 5844095 ; 5851795 ; und 5885796 ; ATCC-Zugangsnummer 68629) als ein Template generiert. Mutagene Oligonukleotid-PCR-Primer wurden zur zufälligen Mutagenese eines spezifischen cDNA-Codons konzipiert, wobei jedwede Base an den Positionen 1 und 2 des Codons, aber nur Guanin oder Thymin an Position 3 (XXG/T; auch als NNG/T bekannt) erlaubt wurden. Auf diese Weise konnte ein spezifisches Codon, das für eine Aminosäure kodiert, zum Kodieren für jede der 20 Aminosäuren zufällig mutiert werden. Diesbezüglich ergab die XXG/T-Mutagenese 32 potenzielle Codonen, die für jede der 20 Aminosäuren kodieren. PCR-Produkte, die für Mutationen in unmittelbarer Nachbarschaft zu -M97-G107 von CTLA4Ig kodieren (siehe 1 oder 2), wurden mit SacI/XbaI verdaut und zu einem ähnlich geschnittenen CTLA4Ig-πLN-Expressionsvektor subkloniert. Dieses Verfahren wurde zum Generieren des „single-site"-CTLA4-Mutantenmoleküls L104EIg verwendet.
  • Für die Mutagenese in unmittelbarer Nachbarschaft zu S25-R33 von CTLA4Ig, wurde zuerst durch die PCR-Primer-gerichtete Mutagenese eine „silent" NheI-Restriktionstelle an 5' zu dieser Loop eingeführt. Die PCR-Produkte wurden mit NheI/XbaI verdaut und in ähnlich geschnittene CTLA4Ig- oder L104EIg-Expressionsvektoren subkloniert. Dieses Verfahren wurde zur Generierung des „double-site"-CTLA4-Mutantenmoleküls L104EA29YIg verwendet (3). Insbesondere wurde das Nukleinsäuremolekül, das für das „single-site"-CTLA4-Mutantenmolekül, L104EIg, kodiert, als ein Template zum Generieren des „double-site"-CTLA4-Mutantenmoleküls, L104EA29YIg, verwendet.
  • BEISPIEL 2
  • Folgendes stellt eine Beschreibung der Screening-Verfahren bereit, die zur Identifikation der „single-site" und „double-site" mutanten CTLA4-Polypeptide verwendet wurden, die aus den in Beispiel 1 beschriebenen Konstrukten exprimiert wurden, die im Vergleich zu nicht mutierten CTLA4Ig-Molekülen eine höhere Bindungsavidität für CD80- und CD86-Antigene aufwiesen.
  • Aktuelle in vitro- und in vivo-Studien deuten darauf hin, dass CTLA4Ig allein nicht fähig ist, das Priming von Antigen-spezifischen aktivierten T-Zellen vollkommen zu blockieren. In vitro-Studien mit CTLA4Ig und einer der beiden für CD80 oder CD86 spezifischen monoklonalen Antikörper, die die Inhibition der T-Zellproliferation messen, deuten darauf hin, das der gegen CD80 gerichtete monoklonale Antikörper die CTLA4Ig-Inhibition nicht verstärkte. Der gegen CD86 gerichtete monoklonale Antikörper verstärkte jedoch die Inhibition, was darauf hindeutet, dass CTLA4Ig beim Blockieren der CD86-Interaktionen nicht wirksam war. Diese Daten stützen frühere Befunde von Linsley et al., (Immunity, (1994), 1: 793–801), die eine Inhibition der CD80-vermittelten Zellantworten zeigten, die um das ca. 100fache niedrigere CTLA4Ig-Konzentrationen als für die CD86-vermittelten Antworten erforderten. Basierend auf diesen Befunden wurde gemutmaßt, dass lösliche CTLA4-Mutantenmoleküle, die eine höhere Avidität für CD86 als das Wildtyp-CTLA4 aufweisen, besser dazu in der Lage sein sollten, das Priming von Antigen-spezifischen aktivierten Zellen zu blockieren als CTLA4Ig.
  • Zu diesem Zweck wurden die in Beispiel 1 vorstehend beschriebenen löslichen CTLA4-Mutantenmoleküle unter Verwendung eines neuen Screening-Verfahrens zur Identifikation mehrerer Mutationen in der extrazellulären Domäne von CTLA4, das die Bindungsavidität für CD80 und CD86 verbessert, gescreent. Diese Screening-Strategie stellte ein wirksames Verfahren zur direkten Identifikation von Mutanten mit scheinbar langsameren „Off"-Raten ohne die Notwendigkeit der Proteinreinigung oder Quantifizierung bereit, da die Bestimmung der „Off"-Rate konzentrationsunabhängig ist (O'Shannessy et al., (1993) Anal. Biochem. 212: 457–468).
  • Die COS-Zellen wurden mit durch individuelle Miniprep gereinigte Plasmid-DNA transfiziert und mehrere Tage propagiert. Über drei Tage konditioniertes Kulturmedium wurde auf BIAcore-Biosensorchips (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden), die mit löslichem CD80Ig oder C086Ig beschichtet waren, appliziert. Die spezifische Bindung und Dissoziation von mutanten Proteinen wurde mittels Oberflächen-Plasmon-Resonanz gemessen (O'Shannessy, D. J., et al., (1993) Anal. Biochem. 212: 457–468).
  • Alle Experimente wurden auf BIAcoreTM oder BIAcoreTM 2000 Biosensoren bei 25°C laufen lassen. Die Liganden wurden auf NCM5-Sensorchips vom Gütegrad für Forschungszwecke (Pharmacia) unter Verwendung von standardmäßiger N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)carbodiimid-N-Hydroxysuccinimid-Kopplung immobilisiert (Johnsson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268–277; Khilko, S. N., et al., (1993) J. Biol. Chem. 268: 5425–15434).
  • SCREENING-VERFAHREN
  • Die in 24-Well-Gewebekulturplatten gezüchteten COS-Zellen wurden transient mit für mutantes CTLA4Ig kodierender DNA transfiziert. Das Kulturmedium, das sezerniertes lösliches mutantes CTLA4Ig enthielt, wurde 3 Tage später gesammelt.
  • Das konditionierte COS-Zellkulturmedium durfte über mit CD86Ig oder CD80Ig derivatisierte BIAcore-Biosensorchips fließen (wie in Greene et al., 1996 J. Biol. Chem. 271: 26762–26771, beschrieben), und mutante Moleküle wurden mit „Off"-Raten identifiziert, die langsamer als die waren, die für Wildtyp-CTLA4Ig beobachtet wurden. Die cDNAs, die den ausgewählten Mediumproben entsprachen, wurden sequenziert, und die DNA wurde zur Durchführung einer größer angelegten transienten COS-Zelltransfektion präpariert, aus der nach der Protein A-Reinigung des Kulturmediums mutantes CTLA4Ig-Protein hergestellt wurde.
  • Unter BIAcore-Analysebedingungen und Äquilibrium wurde die Bindungsdatenanalyse wie in J. Greene et al. 1996 J. Biol. Chem. 271: 26762–26771, beschrieben, und wie hierin beschrieben, durchgeführt.
  • BIAcore-DATENANALYSE
  • Die Sensorgramm-Baselines wurden vor der Analyse auf null Response Units (RU) normalisiert. Die Proben wurden über scheinderivatisierte Durchflusszellen zur Bestimmung der Response-Einheitswerte (RU-Werte) des Hintergrunds aufgrund der Unterschiede des Volumenbrechungsindex zwischen Lösungen laufen lassen. Die Dissoziationskonstanten (Kd) im Äquilibrium wurden aus Kurvenaufragungen von Req versus C, worin Req die Steady-state-Response minus der Response auf einem scheinderivatisierten Chip darstellt, und C die molare Konzentration des Analyts darstellt. Die Bindungskurven wurden unter Verwendung von gewerblich erhältlicher nicht linearer Kurvenanpassungs-Software (Prism, GraphPAD Software) analysiert.
  • Die experimentellen Daten wurden zuerst an ein Modell für eine einzelne Ligandenbindung an einen einzelnen Rezeptor („one-site"-Modell, d. h. ein einfaches Langmuir-System, A + B AB) angepasst, und Assoziationskonstanten (Kd = [A]·[B]\[AB]) im Äquilibrium wurden aus der Gleichung R = Rmax·C/(Kd + C) berechnet. Daran anschließend wurden die Daten an das einfachste „two-site"-Modell von der Ligandenbindung (d. h. an einen Rezeptor mit zwei nicht interagierenden unabhängigen Bindungsorten wie durch die Gleichung R = Rmax1·C\Kd1 + C) + Rmax2·C\Kd2 + C) beschrieben) angepasst.
  • Der „Goodness of Fit"-Test von diesen beiden Modellen wurde visuell durch Vergleich mit experimentellen Daten und statistisch durch einen F-Test der Quadratsummen analysiert. Das einfachere „one-site"-Modell wurde als die beste Anpassung gewählt, es sei denn, dass die Anpassung des „two-site"-Modells signifikant besser ist (p < 0,1).
  • Die Assoziations- und Disassoziationsanalysen wurden unter Verwendung der BIAevaluation 2.1 Software (Pharmacia) durchgeführt. Die Assoziationsratenkonstanten kon wurden auf zweierlei Weisen berechnet, wobei sowohl homogene „single-site"-Interaktionen als auch parallele „two-site"-Interaktionen vorausgesetzt wurden. Für „single-site"-Interaktionen wurden die kon-Werte gemäß der Gleichung Rt = Req(1 – exp–ks(t-t) 0) berechnet, worin eine Response bei einer gegebenen Zeit t, darstellt die Response im Steady-state darstellt; t0 die Zeit am Beginn der Injektion darstellt; und ks = dR/dt = kon·Ckoff ist, und worin C eine Konzentration des Analyts, berechnet hinsichtlich der monomeren Bindungsorte, darstellt. Für „two-site"-Interaktionen wurden die kon-Werte gemäß der Gleichung Rt = Req1(1-exp–ks1(t-t) 0) + Req2(1-exp–ks2(t-t) 0 berechnet. Für jedes Modell wurden die Werte von kon aus der berechneten Steigung (auf ca. 70% maximale Assoziation) von Kurvenaustragungen von ks versus C bestimmt.
  • Die Dissoziationsdaten wurden gemäß einem „one-site"-Modell (AB = A + B) oder „two-site"-Modell (AiBj – Ai + Bj) analysiert, und die Ratenkonstanten (koff) wurden aus Kurven der besten Anpassung berechnet. Das Bindungsortmodell wurde verwendet, außer wenn die Restgrößen größer als der Maschinenhintergrund (2–10 RU, gemäß der Maschine) waren, in welchem Fall das Modell des „two-site"-Bindungsorts eingesetzt wurde. Die Halbwertzeiten der Rezeptorbesetzung wurden unter Verwendung der Beziehung t½ = 0,693/koff berechnet.
  • DURCHFLUSSZYTOMETRIE:
  • Murine mAk L307.4 (anti-CD80) wurden von Becton Dickinson (San Jose, California) und IT2.2 (anti-B7-0 [auch als CD86 bekannt]), von Pharmingen (San Diego, California) käuflich erworben. Für die Immunfärbung wurden CD80-positive und/oder CD86-positive CHO-Zellen aus ihren Kulturgefäßen durch Inkubation in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit 10 mM EDTA entfernt. Die CHO-Zellen (1–10 × 105) wurden zuerst mit mAk oder Immunglobulin-Fusionsproteinen in DMEM mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) inkubiert, dann gewaschen und mit Fluorescein-Isothiocyanat-konjugiertem Ziegen- anti-Maus- oder anti-Human-Immunglobulin – Reagenzien für den zweiten Schritt (Tago, Burlingame, California) inkubiert. Die Zellen wurden abschließend gewaschen und an einem FACScan (Becton Dickinson) analysiert.
  • SDS-PAGE- UND GRÖSSENAUSSCHLUSS-CHROMATOGRAPHIE
  • SDS-PAGE wurde auf Tris/Glycin 4–20% Acrylamidgelen (Novex, San Diego, CA) durchgeführt. Die analytischen Gele wurden mit Coomassie-Blau gefärbt, und es wurden Bilder von nassen Gelen mittels Digital-Scanning erhalten. CTLA4Ig (25 μg) und L104EA29YIg (25 μg) wurden mittels der Größenausschlusschromatographie unter Verwendung einer TSK-GEL G30Q SWXL-Säule (7,8 × 300 mm, Tosohaas, Montgomeryville, PA), äquilibriert in Phosphat-gepufferter Salzlösung mit 0,02% NAN3 bei einer Fließrate von 1,0 ml/min, analysiert.
  • CTLA4XC120S UND L104EA29YXC120S
  • Die einkettige CTLA4XC120S wurde wie zuvor beschrieben hergestellt (Linsley et al., (1995) J. Bol. Chem. 270: 15417–15424). Kurz gesagt wurde ein Oncostatin M-CTLA4-(OMCTLA4)-Expressionsplasmid als eine Template verwendet, der Vorwärtsprimer, GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG (SEQ ID NO: 17) wurde gewählt, um Sequenzen im Vektor passend zusammenzustellen; und der Rückwärtsprimer, GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC (SEQ ID NO: 18) entsprach den letzten sieben Aminosäuren (d. h. Aminosäuren 118–124) in der extrazellulären Domäne von CTLA4 und enthielt einen Restriktionsenzymort und ein Stoppcodon (TGA). Der Rückwärtsprimer spezifizierte eine C120S-Mutation (Cystein bis Serin an Position 120). Insbesondere wird die Nukleotidsequenz GCA (Nukleotide 34–36) des vorstehend gezeigten Rückwärtsprimers durch eine der folgenden Nukleotidsequenzen ersetzt: AGA, GGA3 TGA, CGA, ACT oder GCT. Wie der Fachmann verstehen wird, stellt die Nukleotidsequenz GCA eine umgekehrte komplementäre Sequenz des Codons TGC für Cystein dar. Ebenso stellen die Nukleotidsequenzen AGA, GGA, TGA, CGA, ACT oder GCT die umgekehrten komplementären Sequenzen des Codons für Serin dar. Die Produkte von der Polymerasenkettenreaktion wurden mit HindIII/XbaI verdaut und direktional in den Expressionsvektor πLN (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ) subkloniert. L104EA29Y3CC120S wurde auf die gleiche Weise hergestellt. Jedes Konstrukt wurde durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
  • IDENTIFIKATION UND BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG VON HOCHAVIDEN MUTANTEN
  • Vierundzwanzig Aminosäuren wurden für die Mutagenese gewählt und die resultierenden ca. 2300 Mutantenproteine wurden auf CD86Ig-Bindung durch Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR; wie vorstehend beschrieben) bestimmt. Die prädominanten Wirkungen der Mutagenese an jedem Ort sind in Tabelle II zusammengefasst. Die zufällige Mutagenese einiger Aminosäuren in den S25-R33 veränderten scheinbar nicht die Ligandenbindung. Die Mutagenese von E31 und R33 und den Resten M97-Y102 resultierten scheinbar in einer reduzierten Ligandenbindung. Die Mutagenese der Reste S25, A29 und T30, K93, L96, Y103, L104 und G105 resultierten in Proteinen mit langsamen „On"- und/oder langsamen „Off"-Raten. Diese Ergebnisse bestätigen vorherige Befunde, dass Reste in der S25-R33-Region und Reste in oder in der Nähe von M97-Y102 die Ligandenbindung beeinflussen (Peach et al., (1994) J. Exp. Med 180: 2049–2058.
  • Die Mutagenese der Orte S25, T30, K93, L96, Y103 und G105 führte zur Identifikation einiger Mutantenproteine, die langsamere „Off"-Raten als CD86Ig aufwiesen. In diesen Fällen wurde jedoch die langsame „Off"-Rate durch eine langsame „On"-Rate kompromittiert, die zu Mutantenproteinen mit einer Gesamtavidität für CD86Ig führte, die scheinbar der ähnlich war, die mit dem Wildtyp-CTLA4Ig gesehen wurde. Außerdem führte die Mutagenese von K93 zu einer signifikanten Aggregation, die für die beobachteten kinetischen Änderungen verantwortlich gewesen sein könnte.
  • Die zufällige Mutagenese von L104, gefolgt von der COS-Zelltransfektion und dem Screening mittels SPR der Kulturmediumproben über immobilisiertem CD86Ig ergab sechs Mediumproben, die Mutantenproteine mit ca. um das 2fache langsameren „Off"Raten als das Wildtyp-CTLA4Ig enthielten. Wenn die entsprechende cDNA dieser Mutanten sequenziert wurde, wurde festgestellt, das jede für eine Mutation von Leucin zu Glutaminsäure (L104E) kodierte. Die Substitution von Leucin 104 zu Asparaginsäure (L104D) wirkte sich scheinbar nicht auf die CD86Ig-Bindung aus.
  • Die Mutagenese wurde dann an jedem in Tabelle II aufgelisteten Ort wiederholt, diesmal unter Verwendung von L104E als die PCR-Template anstelle des Wildtyp-CTLA4Ig, wie vorstehend beschrieben. Die SPR-Analyse, wieder unter Verwendung von immobilisiertem CD86Ig, identifizierte sechs Kulturmediumproben von der Mutagenese von Alanin 29 mit Proteinen mit ca. den um das 4fache langsameren „Off"-Raten als das Wildtyp-CTLA4Ig. Die beiden langsamsten stellen die Tyrosinsubstitutionen (L104EA29Y) dar, bei zweien handelte es sich um Leucin (L104EA29L), eine war Tryptophan (L104EA29W), und eine stellte Threonin (L104EA29T) dar. In Wildtyp-CTLA4Ig wurden scheinbar keine Mutanten mit langsamen „Off"-Raten identifiziert, wenn Alanin 29 zufällig, allein, mutiert wurde.
  • Die relative Molekülmasse und der Aggregationszustand von gereinigtem L104E und L104EA29YIg wurde mittels SDS-PAGE und der Größenausschlusschromatographie untersucht. L104EA2YIg (ca. 1 μg; Spur 3) und L104EIg (ca. 1 μg; Spur 2) wies scheinbar die gleiche elektrophoretische Mobilität wie CTLA4Ig (ca. 1 μg; Spur 1) unter reduzierenden (ca. 50 kDa; +βME; plus 2-Mercaptoethanol) und nicht reduzierenden (ca. 100 kDa; –βME) Bedingungen (14A) auf. Anhand der Größenausschlusschromatographie konnte nachgewiesen werden, dass L104EA29YIg (14C) scheinbar die gleiche Mobilität wie dimeres CTLA4Ig (14B) aufwies. Die bedeutenden Peaks stellen ein Protein-Dinier dar, während der schneller eluierende unbedeutendere Peak in 14B Aggregate eines höheren Molekulargewichts darstellt. Circa 5,0% CTLA4Ig waren als Aggregate mit höherem Molekulargewicht anwesend, es lagen jedoch keine Hinweise auf eine Aggregation von L104EA29YIg oder L104EIg vor. Deshalb konnte die stärkere Bindung an CD86Ig, die mit L104EIg und L104EA29YIg gesehen wurde, nicht der durch Mutagenese induzierten Aggregation zugeschrieben werden.
  • ÄQUILIBRIUM- UND KINETISCHE BINDUNGSANALYSE
  • Die Äquilibrium- und kinetische Bindungsanalyse wurde auf Protein A gereinigtem CTLA4Ig, L104EIg und L104EA29YIg unter Verwendung der Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I ersichtlich. Die beobachteten Dissoziationskonstanten im Äquilibrium (Kd; Tabelle I) wurden aus den über einen Konzentrationsbereich (5,0–200 nM) erstellten Bindungskurven berechnet. L104EA29YIg bindet starker an CD86Ig als L104EIg oder CTLA4Ig. Der niedrigere Kd von L104EA29YIg (3,21 nM) als von L104EIg (6,06 nM) oder CTLA4Ig (13,9 nM) deutet auf eine höhere Bindungsavidität von L104EA29YIg an CD86Ig. Der niedrigere Kd von L104EA29YIg (3,66 nM) als von L104EIg (4,47 nM) oder CTLA4Ig (6,51 nM) deutet auf eine höhere Bindungsavidität von L104EA29YIg an CD80Ig.
  • Die kinetische Bindungsanalyse ließ erkennen, dass die vergleichenden „On"-Raten für die CTLA4Ig-, L104EIg- und L104EA29YIg-Bindung an CD80 ebenso wie auch die „On"-Raten für CD86Ig ähnlich waren (Tabelle I). Die „Off"-Raten für diese Moleküle waren jedoch nicht äquivalent (Tabelle I). Im Vergleich zu CTLA4Ig wies L104EA29YIg eine um das 2fache langsamere „Off"-Rate als CD80Ig und eine um das 4fache langsamere „Off"-Rate als CD86Ig auf. L104E wies „Off"-Raten intermediär zwischen L104EA29YIg und CTLA4Ig auf. Da sich die Einführung dieser Mutationen nicht signifikant auf „On"-Raten auswirkte, war die Zunahme der mit L104EA29YIg beobachteten Avidität für CD80Ig und CD86Ig wahrscheinlich hauptsächlich auf die Abnahme der „Off"-Raten zurückzuführen.
  • Zur Bestimmung, ob die Zunahme der Avidität von L104EA29YIg für CD86Ig und CD80Ig auf die Mutationen zurückzuführen war, die sich auf die Weise auswirkten, wie sich jedes Monomer als ein Dimer assoziierte, oder ob in jedes Monomer eingeführte, die Avidität verstärkende Strukturänderungen vorlagen, wurden wie vorstehend und von Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270: 15417–15424 beschrieben, nach der Mutagenese von Cystein 120 zu Serin Einzelkettenkonstrukte von extrazellulären CTLA4- und L104EA29Y-Domänen hergestellt. Es wurde anhand der Gelpermeationschromatographie gezeigt, dass die gereinigten Proteine CTLA4XC1205 und L104EA29YXC120S monomer waren (Linsley et al., (1995), vorstehend), bevor ihre Ligandenbindungseigenschaften mittels SPR analysiert wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass die Bindungsaffinitiät von beiden monomeren Proteinen zu CD86Ig um das ca. 35- bis 80fache geringer war, als die, die für ihre entsprechenden Dimeren gesehen wurde (Tabelle I). Dies verleiht den zuvor veröffentlichten Daten Unterstützung, die etablierten, dass eine Dimerisierung von CTLA4 für die Ligandenbindung mit hoher Avidität erforderlich war (Greene et al., (1996) J. Biol. Chem., 271: 26762–26771).
  • L104EA29YXCI20S band mit einer um das ca. 2fache höheren Affinität als CTLA4XC120S sowohl an CD80Ig als auch CD86Ig. Die gesteigerte Affinität war auf die ca. um das 3fache langsamere Dissoziationsrate von beiden Liganden zurückzuführen. Folglich war die stärkere Ligandenbindung durch L104EA29Y sehr wahrscheinlich auf die Avidität fördernde Strukturänderungen zurückzuführen, die in jede Monomerkette anstelle von Veränderungen, bei denen das Molekül dimerisierte, eingeführt worden waren.
  • LOKALISIERUNG UND STRUKTURANALYSE DER DIE AVIDITÄT FÖRDERNDEN MUTATIONEN
  • Die Lösungsstruktur der extrazellulären IgV-ähnlichen Domäne von CTLA4 wurde in letzter Zeit mittels der NMR-Spektroskopie (Metzler et al., (1997) Nature Struct. Biol. 4: 527–531 bestimmt. Dies ermöglichte die genaue Lokalisierung von Leucin 104 und Alanin 29 in der dreidimensionalen Faltung (15A–B). Leucin 104 befindet sich in der Nähe der hoch konservierten Aminosäuresquenz MYPPPY. Alanin 29 befindet sich in der Nähe des C-terminalen Endes der S25-R33-Region, die sich räumlich nachbarständig zur MYPPPY-Region befindet. Während eine signifikante Interaktion zwischen Resten an der Base dieser beiden Regionen vorhanden ist, besteht scheinbar keine direkte Interaktion zwischen L104 und A29, obwohl sie beide einen Teil eines benachbarten hydrophoben Kerns im Protein umfassen. Die strukturellen Konsequenzen der beiden die Avidität fördernden Mutanten wurden mithilfe des Modelling beurteilt. Die A29Y-Mutation kann leicht in der Spalte zwischen der S25-R33-Region und der MYPPPY-Region untergebracht werden, und kann dazu dienen, die Konformation der MYPPPY-Region zu stabilisieren. Im Wildtyp-CTLA4 bildet L104 ausgeprägte hydrophobe Interaktionen mit L96 und V94 in der Nähe der MYPPPY-Region. Es ist sehr unwahrscheinlich, dass die Glutaminsäure-Mutation eine Konformation annimmt, die der von L104 aus zwei Gründen ähnlich ist. Erstens ist nicht genügend Raum zur Unterbringung der längeren Glutaminssäure-Seitenkette in der Struktur ohne signifikante Störung an der S25-R33-Region vorhanden. Zweitens waren die energetischen Kosten beim Vergraben der negativen Ladung der Glutaminsäure-Seitenkette in der hydrophoben Region groß. Anstelle dessen sagen Modelling-Studien voraus, dass sich die Glutaminsäure-Seitenkette auf der Oberfläche dreht ("flip out"-Bewegung), wo ihre Ladung mittels Solvatisierung stabilisiert werden kann. Eine derartige konformationale Änderung kann von G105 mit minimaler Distortion an den anderen Resten in den Regionen leicht Rechnung getragen werden.
  • BINDUNG VON HOCHAVIDEN MUTANTEN AN CD80 ODER CD86 EXPRIMIERENDE CHO-ZELLEN
  • Die FACS-Analyse (9) der CTLA4Ig- und Mutantenmolekülbindung an stabil transfizierte CD80+- and CD86+-CHO-Zellen wurde wie hierin beschrieben durchgeführt. Die CD80-positiven und CD86-positiven CHO-Zellen wurden mit zunehmenden Konzentrationen von CTLA4Ig, L104EA29YIg oder L104EIg inkubiert und dann gewaschen. Gebundenes Immunglobulin-Fusionsprotein wurde unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat-konjugiertem Ziegen-anti-Human-Immunglobulin nachgewiesen.
  • Wie in 9 ersichtlich, wurden CD80-positive oder CD86-positive CHO-Zellen (1,5 × 105) mit den angegebenen Konzentrationen von CTLA4Ig (ausgefüllte Quadrate), L104EA29YIg (Kreise) oder L104EIg (Dreiecke) 2 h bei 23°C inkubiert, gewaschen und mit Fluorescein-Isothiocyanat-konjugiertem Ziegen-anti-Human-Immunglobulin-Antikörper inkubiert. Die Bindung an insgesamt 5000 lebensfähige Zellen wurde an einem FACScan analysiert (Einzelbestimmung), und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) wurde mithilfe von Datenhistogrammen unter Verwendung von PC-LYSYS bestimmt. Die Daten wurden auf Hintergrundfluoreszenz bereinigt, die an Zellen gemessen wurde, die nur mit einem Reagenz vom zweiten Schritt inkubiert wurden, (MFI = 7). Der Kontroll-L6-mAk (80 μg/ml) ergab eine MFI von < 30. Diese Ereignisse von vier unabhängigen Experimenten sind repräsentativ.
  • Die Bindung von L104EA29YIg, L104EIg und CTLA4Ig an humane CD80-transfizierte CHO-Zellen ist ca. äquivalent (9A). L104EA29YIg und L104EIg binden stärker an CHO-Zellen, die mit humanen CD86 stabil transfiziert sind, als CTLA4Ig (9B).
  • FUNKTIONSASSAYS:
  • Humane CD4-positive T-Zellen wurden durch immunmagnetische negative Selektion isoliert (Linsley et al., (1992) J. Exp. Med. 176: 1595–1604). Isolierte CD4-positive T-Zellen wurden mit Phorbal-Myristatacetat (PMA) plus CD80-positiven oder CD86-positiven CHO-Zellen in Anwesenheit von Inhibitor in Titrationskonzentrationen stimuliert. CD4-positive T-Zellen (8–10 × 104/Well) wurden in Anwesenheit von 1 nM PMA mit oder ohne bestrahlte CHO-Zellstimulatoren kultiviert. Proliferative Responses wurden durch das Zufügen von 1 μCi/Well [3H]-Thymidin während der abschließenden 7 Stunden einer 72-stündigen Kultur gemessen. Die Inhibition wurde von mit PMA plus CD80-positiven CHO oder CD86-positiven CHO stimulierten T-Zellen durch L104EA29YIg und CTLA4Ig durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 10 ersichtlich. L104EA29YIg inhibiert die Proliferation von mit CD80-positiven, mit PMA behandelten CHO-Zellen mehr als CTLA4Ig (10A). L104EA29YIg ist beim Inhibieren der Proliferation von CD86-positiven, mit PMA behandelten CHO-Zellen auch wirksamer als CTLA4Ig (10B). Folglich stellt L104EA29YIg einen potenteren Inhibitor von sowohl der CD80- als auch CD86-vermittelten Costimulation von T-Zellen dar.
  • 11 zeigt die Inhibition durch L104EA29YIg und CTLA4Ig von den vorstehend hergestellten allostimulierten humanen T-Zellen und ferner allostimuliert mit einer als PM bezeichneten humanen B-Lymphoblastoid-Zelllinie (LCL), die CD80 und CD86 (T-Zellen bei 3,0 × 104/Well und PM bei 8,0 × 103/Well) exprimierte. Die primäre Allostimulation trat 6 Tage lang auf, dann wurden die Zellen 7 Stunden mit 3H-Thymidin gepulst, bevor die Inkorporation der Radiomarkierung bestimmt wurde.
  • Die sekundäre Allostimulation wurde wie folgt durchgeführt. Über sieben Tage primär allostimulierte T-Zellen wurden über Lymphozytentrennungsmedium (LSM) (ICN, Aurora, OH) geerntet und 24 Stunden ruhen lassen. Die T-Zellen wurden dann in Anwesenheit von Titrationsmengen von CTLA4Ig oder L104EA29YIg durch Zufügen von PM im gleichen Verhältnis wie vorstehend erneut stimuliert (sekundär). Die Stimulation trat 3 Tage lang auf, dann wurden die Zellen mit der Radiomarkierung wie vorstehend gepulst und geerntet. Die Wirkung von L104EA29YIg auf primär allostimulierte T-Zellen wird in 11A gezeigt. Die Wirkung von L104EA29YIg auf sekundär allostimulierte T-Zellen ist in 11B ersichtlich. L104EA29YIg inhibiert die proliferativen Responses von sowohl primären als auch sekundären T-Zellen besser als CTLA4Ig.
  • Zum Messen der Cytokinproduktion (12) wurden sekundäre Allostimulationsplatten im Duplikat hergestellt. Nach 3 Tagen wurde das Kulturmedium unter Verwendung von ELISA-Kits (Biosource, Camarillo, CA) unter Verwendung der vom Hersteller empfohlenen Bedingungen analysiert. Es wurde festgestellt, dass L104EA29YIg beim Blockieren der Produktion von IL-2, IL-4 und γ-IFN-Cytokin von T-Zellen nach einem sekundären allogenen Stimulus potenter als ist CTLA4Ig (12A–C).
  • Die Wirkungen von L104EA29YIg und CTLA4Ig auf die gemischten Lymphozytenantworten (MLR) von Affen sind in 13 ersichtlich. Mononukleare Zellen im peripheren Blut von 2 Affen (PBMC'S; 3,5 × 104 Zellen/Well von jedem Affen) wurden über Lymphozytentrennungsmedium (LSM) gereinigt und mit 2 μg/ml Phytohämagglutinin (PHA) gemischt. Die Zellen wurden 3 Tage stimuliert, dann mit der Radiomarkierung 16 Stunden vor dem Ernten gepulst. L104EA29YIg inhibierte die T-Zellprolferation von Affen besser als CTLA4Ig.
    TABELLE I
    Äquilibrium und scheinbare kinetische Konstanten sind in der folgenden Tabelle ersichtlich (bei den Werten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung von drei verschiedenen Experimenten):
    Immobilisiertes Protein Analyt kon(× 105)M–1S–1 koff (× 10–3)S–1 Kd nM
    CD80Ig CTLA4Ig 3,44 ± 0,29 2,21 ± 0,18 6,51 ± 1,08
    CD80Ig L104EIg 3,02 ± 0,05 1,35 ± 0,08 4,47 ± 0,36
    CD80Ig L104EA29YIg 2,96 ± 0,20 1,08 ± 0,05 3,66 ± 0,41
    CD80Ig CTLA4Xc1ms 12,0 ± 1,0 230 ± 10 195 ± 25
    CD80Ig L104EA29YXc1205 8,3 ± 0,26 71 ± 5 85,0 + 2,5
    CD86Ig CTLA4Ig 5,95 ± 0,57 8,16 ± 0,52 13,9 ± 2,27
    CD86Ig Ll04EIg 7,03 ± 0,22 4,26 ± 0,11 6,06 ± 0,05
    CD86Ig L 104EA29YIg 6,42 + 0,40 2,06 ± 0,03 3,21 ± 0,23
    CD86Ig CTLA4XC120S 16,5±0,5 840 ± 55 511 ± 17
    CD86Ig L104EA29YXC120S 11,4 ± 1,6 300 ± 10 267 ± 29
    TABELLE II
    Die Wirkung auf die CD86Ig-Bindung durch Mutagenese von CTLA4Ig an dn angegebenen Orten wurde mittels der vorstehend beschriebenen SPR bestimmt. Die prädominante Wirkung ist mit einem „+"Zeichen angezeigt
    Mutageneseort Wirkungen der Mutagenese
    Keine offensichtliche Wirkung Langsame „On"-Rate/langsame „Off"-Rate Reduzierte Ligandenbindung
    S25 +
    P26 +
    G27 +
    K28 +
    A29 +
    T30 +
    E31 +
    R33 +
    K93 +
    L96 +
    M97 +
    Y98 +
    P99 +
    P100 +
    P101 +
    Y102 +
    Y103 +
    L104 +
    G105 +
    I106 +
    G107 +
    Q111 +
    Y113 +
    I115 +
  • BEISPIEL 3
  • Dieses Beispiel stellt eine Beschreibung der Donor-Pankreatektomie und -Inselisolierung und Inseltransplantationsverfahren in einem Tiermodell dar.
  • MATERIALIEN UND VERFAHREN:
  • TIERE
  • In der Gefangenschaft aufgezogene adoleszente männliche Rhesusaffen (Macaca mulatta) (ca. 4–20 kg) wurden als Empfänger und Donoren verwendet. Die Abwesenheit von vorgeformten Donorspezifischen Antikörpern im Empfänger wurde vor der Transplantation bestätigt. Alle potenziellen Donoren und Empfänger wurden auf anti-CMV-Antikörper getestet, und es wurden nur für CMV seropositive Tiere als Empfänger verwendet.
  • DONOR-PANKREATEKTOMIE UND -INSELISOLIERUNG
  • Die Donor-Pankreatektomie wurde einen Tag vor der Transplantation durchgeführt. Das Verfahren wurde unter Allgemeinanästhesie (einer Kombination aus parenteralem Ketamin und Isolfluran durch Inhalation) mittels eines abdominellen Medianschnitts durchgeführt. Die splenorenalen und splenokolischen Ligamente wurden durchtrennt, so dass die Milz zusammen mit dem Schwanz des Pankreas mobilisiert wurde. Der Kopf des Pankreas und der zweite Abschnitt des Duodenums wurden nach dem Kocher-Duodenalmanöver mobilisiert. Nach Verabreichung von Heparin (200 U/kg), wurde die Aorta knapp oberhalb ihrer Bifurkation kanüliert, und das Tier wurde ausgeblutet. In die Bauchfelltasche hinter den Körper des Pankreas wurde sofort kaltes Eiswasser eingebracht. Der Körper und Hals des Pankreas wurden sorgfältig mittels scharfer Dissektion exzidiert, wobei darauf geachtet wurde, dass die Pankreaskapsel nicht verletzt wurde. Der Hauptgallengang, der Ductus pancreaticus und der Ductus pancreaticus accessorius wurden identifiziert und ligiert, und der Kopf des Pankreas wurde aus dem zweiten Abschnitt des Duodenums herauspräpariert.
  • Beim Rhesusaffen wurde die Inselisolierung über geringfügige Modifikationen des automatisierten Verfahrens für die humane Inselisolierung (Ricordi, (1988) Diabetes, 37: 413; Ramincoli, (2000) Cell Transplant 9: 409) unter Verwendung von Liberase (Roche/Boehringer Mannheim, Indpls, IN) in einer Konzentration von 0,47–0,71 mg/ml abgeschlossen. Ein dreischichtiger, diskontinuierlicher Euroficoll-Gradient (Dichten 1,108, 1,097, 1,037; Meditech, Hemdon, VA) und ein Cobe 2991 Blutzellen-Prozessor (Gambro, Lakewood, CO) wurden zur Reinigung von Inseln aus dem Pankreasverdau verwendet. Proben von der endgültigen Inselpräparation wurden mit Dithizon (Sigma, St. Louis, MO) gefärbt, und die Präparation wurde durch Zählen der Anzahl von Inseln in jedem der folgenden Größenbereiche beurteilt: 50–100, 100–150, 150–200, 200–250, 250–300, 300–350 und 350–400 μm. Die Daten wurden zur Bestimmung der Anzahl von Inseln mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 150 μm mathematisch umgewandelt und wurden als Inseläquivalente (IEQ) ausgedrückt (Ricordi C et al., Acta Diabetol. Lat. 27: 185–195, 1990).
  • EMPFÄNGER-PANKREATEKTOMIE UND INTRAHEPATISCHE INSELZELL-TRANSPLANTATION
  • Die Totalpankreatektomie ohne Duodenektomie oder Splenektomie wurde mindestens eine Woche vor der Transplantation durchgeführt. Der Schwanz und Körper des Pankreas wurden zusammen mit der Milzarterie und -vene herauspräpariert, die durch Ligieren und Durchtrennen von nur den Pankreasästen sorgfältig konserviert wurden. Die untere Mesenterialvene und die mittlere Kolonvene wurden identifiziert und während der Dissektion des Körpers des Pankreas erhalten. Die Pfortader und die obere Mesenterialvene wurden identifiziert und die Pankreasvenen wurden ligiert und durchtrennt.
  • Das Duodenum wurde mobilisiert und die Äste der pankreatikoduodenalen Gefäße, die in den Pankreas eintraten wurden ligiert und durchtrennt, wobei die duodenalen Äste intakt gelassen wurden. Der Hauptgallengang wurde identifiziert und während der stumpfen Dissektion zwischen dem Kopf des Pankreas und der C-Schleife des Duodenums konserviert. Der Ductus pancreaticus und der Ductus pancreaticus accessorius wurden ligiert, durchtrennt und der Pankreas wurde aus der Bauchhöhle entfernt. Alle Tiere mussten sich zur Bewertung der Wirksamkeit des Pankreatektomieverfahrens einem intravenösen Glucosetoleranztest unterziehen. Alle wurden vor der Inseltransplantation als C-Peptid-negativ dokumentiert.
  • Über Nacht kultivierte Inseln wurden in Transplantatmedium, das aus RPME-Medium 1640 (Mediatech), supplementiert mit 2,5% humanem Serumalbumin bestand, gewaschen und zur Bestimmung der IEQ-Zahl gezählt. Die Inseln wurden dann pelletiert und in 20 ml Transplantatmedium, supplementiert mit 200 Einheiten Heparin, resuspendiert. Die intrahepatische Inseltransplantation wurde über die Schwerkraftdrainage der Inseln durch einen intravenösen Katheter von 22 Gauge in eine der Venae sigmoideae oder einen Ast der Vena colica sinistra in die Pfortader durchgeführt.
  • BLUTGLUCOSEÜBERWACHUNG, INSULINVERABREICHUNG UND DEFINITION VON ABSTOSSUNG
  • Die Nüchtern-Blutglucosewerte und postprandialen Blutglucosewerte wurden über die Gewinnung des Blutes aus dem Ohr zweimal täglich (vor dem Frühstück und nach dem Mittagessen), gefolgt vom Testen des Bluts mit einem Glucometer Elite (Bayer, Elkhart, IN) überwacht. Insulin (NPH, Ultralente; Eli Lilly, Indianapolis, IN) wurde dreimal täglich in einem Versuch verabreicht, die Nüchtern-Blutglucose bei <300 mg/dl bei pankreatektomierten Tieren vor der Transplantation oder bei denen eine Abstoßung ihrer Allotransplantate aufgetreten war, aufrechtzuerhalten.
  • EXPERIMENTELLE GRUPPEN UND IMMUNSUPPRESSIVE PROTOKOLLE
  • Es wurden zwei Behandlungsprotokolle geprüft: (1) Das Edmonton-Protokoll – unter Anwendung von Tacrolimus, Sirolimus und anti-IL-2R-mAk (Shapiro, A. M. J. et al., (2000), N. Eng. J. Med., 343: 230–238) und (2) das L104EA29Y-Edmonton-Protokoll – unter Anwendung von L104EA29YIg, Sirolimus und anti-IL-2R-mAk. Die Kontrollgruppe schloss mit dem „immunsuppressiven Basisregime" mit Rapamycin und anti-IL-2R allein behandelte Empfänger ein. Tacrolimus wurde in einer Dosis von 0,05 mg/kg zweimal täglich an den postoperativen Tagen (POD) 0–14 (Targetspiegel 5–8) und 0,06 mg/kg täglich (Targetspiegel 3–5) POD 15–120 verabreicht. L104EA29YIg wurde intraoperativ intravenös (10 mg/kg) und an den postoperativen Tagen 4 (15 mg/kg), 14, 28, 42, 56, 70, 84, 98, 112, 126 (20 mg/kg) zur Aufrechterhaltung der Serumtalspiegel von größer als 30 μg/ml verabreicht. Der chimäre anti-humane IL-2R-mAk (0,3 mg/kg iv) wurde intraoperativ am POD 4 verabreicht. Sirolimus (Rapamun®) wurde oral in einer Dosis von 1,25 mg/kg zweimal täglich (Targetspiegel 10–15) POD 0–50, 1 mg/kg zweimal täglich (Targetspiegel 7–10) POD 50–100 verabreicht und dann zur Terminierung der Dosierung zum POD 130 ausgeschlichen. Sirolimus (Rapamun®) und Tacrolimus (Prograf®) wurden von der Emory University Hospital Pharmacy erworben. Der chimäre anti-humane IL-2R-mAk (Simulect®) wurde von Novartis Pharma AG (Basel, Schweiz) bereitgestellt.
  • AUTOPSIE
  • An allen Empfängern wurde zum Zeitpunkt ihres Todes von den veterinärmedizinischen Mitarbeitern von Yerkes eine vollkommene Autopsie durchgeführt.
  • NACHWEIS VON ANTI-DONOR-ANTIKÖRPERN
  • Die Anwesenheit nachweisbarer Donor-spezifischer Alloantikörper wurde unter Verwendung der Durchflusszytometrie bestimmt. Die Leukozyten im peripheren Blut dienten als Targetzellen für die Analyse vor der Transplantation. Aus den Mesenteriallymphknoten isolierte Leukozyten, die zum Zeitpunkt der Transplantation gewonnen wurden, dienten als Targetzellen für die Assays nach der Transplantation.
  • STATISTIK
  • Das Überleben der Inseltransplantate unter den experimentellen Gruppen wurde unter Verwendung des Mann-Whitney-Wilcoxon-Tests verglichen (Armitage et al. (1987) Statistical Methods in Medical Research, Blackwell Scientific Publication, Oxford).
  • ANTI-DONOR-ENZYME-LINKED IMMUNOSPOTTING-ASSAY
  • Die Responses wurden mittels einem Interferon-γ-(IFN-γ)-Enzyme-linked-Immunospot-(ELISpot)-Assay unter Verwendung von Leukozyten im peripheren Blut, die aus Empfänger- oder Donor-Tieren gewonnen wurden, gemessen. Eine gleiche Anzahl bestrahlter Stimulatoren (Donor-Leukozyten) und Responders (Empfänger-Leukozyten) wurden den Platten mit Estercelluloseboden (Millipore, Redford, MA), beschichtet mit dem Capture-Antikörper, Maus-anti-Human-IFN-γ (Klon GZ-4; Mabtech, Schweden) zugefügt. Nach 14- bis 16-stündiger Inkubation wurde das biotinylierte Maus-anti-Human-IFN-γ (Klon 7-B6-1; Mabtech, Schweden) zugefügt, ungebundener Antikörper wurde entfernt, und Meerettichperoxidase-Avidin D (Vector, Burlingame, CA) wurde zugefügt. Mit dem Substrat 3-Amino-9-ethyl-carbazol (Sigma) wurden Spots entwickelt. Jeder Spot stellt eine IFN-γ-sezernierende Zelle dar; die Frequenz dieser Zellen kann durch Dividieren der Anzahl der generierten Spots durch die Gesamtzahl der ausplattierten Responderzellen bestimmt werden.
  • ERGEBNISSE:
  • DIE AUF DER BLOCKADE DES CD28-SIGNALWEGS BASIERENDE THERAPIE VERLÄNGERT DAS ÜBERLEBEN DER INSELALLOTRANSPLANTATE IN RHESUSMAKAKEN.
  • Diabetes wurde durch die chirurgische Pankreatektomie von Empfängertieren induziert und durch den intravenösen Glucosetoleranztest vor der Transplantation bestätigt. Donor-Empfänger-Paarungen wurden basierend auf der Molekulartypisierung unter Verwendung eines Panels von zuvor definierten Major Histocompatibility-Allelen (8 Klasse I und 12 Klasse H) definiert (Lobashevsky A, et al., Tissue Antigens 54: 254–263, (1999); Knapp LA, et al., Tissue Antigens 50: 657–661, (1997); Watkins D. I., Crit. Rev. Immunol. 15: 1–29, (1995)). Paarungen maximierten die Disparität an den Loci sowohl von Klasse I als auch II. Abstoßung wurde definiert als zwei konsekutive Nüchtern-Blutglucosewerte von >125 mg/dl an den nachfolgenden Tagen. Die intraportale Infusion von allogenen Inseln (>10,000 IEQ/kg) führte zur initialen Wiederherstellung der Euglykämie und Insulinunabhängigkeit bei diabetischen Affen in beiden Gruppen.
  • Die Behandlung von pankreatektomierten Makakaffen mit L104EA29YIg/Rapamycin/anti-IL-2R-mAk-Regime verlängerte signifikant das Überleben des Inseltransplantats (204, 190, 216, > 220 bzw. 56 Tage). Bei den Tieren, die das L104EA29YIg/Rapamycin/anti-IL-2R-Regime erhielten, wurde eine angemessene Glucosekontrolle erreicht, wie anhand der Nüchtern-Plasmaglucosespiegel gezeigt wurde (5 und 16B). Außerdem war bei diesen Tieren keine Insulinersatztherapie für eine signifikant verlängerte Zeitdauer erforderlich (6). Im Gegensatz dazu stießen die Tiere, die das Basisregime (Rapamycin/anti-IL-2R-mAk) allein erhielten, die transplantierten Inseln innerhalb von einer Woche ab (16C). Die Kontrolltiere zeigten deutlich erhöhte Nüchtern-Plasmaglucosespiegel (5). Die Kontrolltiere benötigten überdies innerhalb von einer Woche nach der Inseltransplantation eine Insulinersatztherapie (6). Vier von fünf Tieren, die das L104EA29YIg-Regime erhielten, kamen in den Genuss einer abstoßungsfreien Überlebenszeit für die Dauer der Behandlungsperiode (Table III). Der intravenöse Glucosetoleranztest mit Messung der Insulin- und Glucosespiegel bestätigte die Inselfunktion nach der Transplantation (repräsentatives Tier, 7 und 16D).
    TABELLE III
    Überleben und Behandlung bei einem Inselallotransplantat
    IEQ/kg Überleben* Behandlung MHC-Mismatches (n)
    Klasse I Klasse II
    RKf-7 22250 204 LEA29Y/Rapa/αIL-2R 2 ND
    RUf-7 17087 190 LEA29Y/Rapa/αIL-2R ND 3
    RRe-7 20266 216 LEA29Y/Rapa/αIL-2R 2 6
    RWt-6 16033 56 LEA29Y/Rapa/αIL-2R 2 3
    RMv-6 8201 >220 LEA29Y/Rapa/αIL-2R 1 3
    RQz-6 12980 7 Rapa/αIL-2R 2 5
    RIb-7 10903 7 Rapa/αIL-2R 1 4
    Insulinunabhängigkeit. ND, in Allelen, die typisiert wurden, wurde keine nachgewiesen.
  • 100 Tage nach der Transplantation wurde die Dosierung von Rapamycin herabgesetzt und bis zum Tag 121 auf null ausgeschlichen. Die Tiere blieben, während sie die L104EA29YIg-Monotherapie erhielten, weiterhin insulinunabhängig. Ca. 150 Tage nach der Transplantation, erhielten die übrigen Inselempfänger ihre abschließende L104EA29YIg-Dosis, womit jedwede zusätzliche Therapie mit Immunsuppressiva eingestellt wurde.
  • Wie erwartet, wurden die Empfänger ca. 1–2 Monate nach Absetzen der Therapie hyperglykämisch und benötigten eine exogene Insulintherapie. Die histologische Analyse gab ein mononukleares Infiltrat zu erkennen, was stark auf die Abstoßung als Ätiologie des Verlustes der Glucosekontrolle hindeutet (17). In einem intravenösen Glucosetoleranztest wurde bei den Testtieren, die das L104EA29YIg/Rapamycin/anti-IL-2R-mAk-Regime erhalten, nach der Inseltransplantation normale Glucosespiegel nachgewiesen (7 und 16D).
  • Die Frequenz von gegen den Donor gerichteten IFN-γ-produzierenden Zellen wurde durch den ELISpot-Assay nachgewiesen und unter Verwendung eines Immunspot-Imagingsystems analysiert. Die Tiere, die das immunsuppressive Basisregime allein erhielten, wiesen signifikant erhöhte Zahlen von Donor-reaktiven IFNγ produzierenden T-Zellen (84 ± 4,6 Zellen) auf, während Tiere, die das L104EA29YIg-Regime erhielten, keine nachweisbare Response aufwiesen (2 ± 0,56 Zellen).
  • DIE L104EA29YIG-THERAPIE INHIBIERT DAS PRIMING VON ANTI-DONOR-T- UND -B-ZELL-ANTWORTEN
  • Die Frequenz von geprimten alloreaktiven T-Zellen kann unter Verwendung des ELISpot-Assays wirksam nachgewiesen werden, der die Produktion von IFN-γ auf der Einzelzellebene diskriminieren kann. Peripherblutproben von Inselempfängern wurden an verschiedenen Zeitpunkten sowohl vor als auch nach der Transplantation auf ihre Fähigkeit zum Generieren von IFN-γ als Antwort auf Donor-Antigen analysiert. Mit dem Basisregime allein behandelte Tiere entwickelten schnell eine messbare Anti-Donor-Antwort, die mit der Abstoßung eine Woche nach der Transplantation zusammenfiel. Im Gegensatz dazu war die Frequenz der gegen den Donor gerichteten IFN-γ produzierenden Zellen in Tieren, die das L104EA29YIg-enthaltende Regime erhielten, nicht nachweisbar, bis die Therapie abgesetzt wurde (repräsentative Tiere, 18A und B). Folglich blockierte das L104EA29YIg-Regime wirksam die Generierung von Anti-Donor-T-Zellantworten, wie durch die Fähigkeit, IFN-γ zu produzieren, gemessen wurde.
  • Die Durchflusszytometrie wurde zur Untersuchung der Entwicklung von gegen den Donor gerichteten Antikörperantworten verwendet. Ein Tier in der Kontrollgruppe generierte eine starke gegen den Donor gerichtete Ak-Antwort, wohingegen das andere keine nachweisbare Antwort entwickeln konnte, vermutlich weil es euthanasiert wurde, bevor die Antikörperantwort gemessen werden konnte (18C). Im Gegensatz dazu konnten vier von fünf Tieren keine Antikörperantwort generieren, während sie sich unter der L104EA29YIg-Therapie befanden. Dies ist konsistent mit zuvor berichteten Ergebnissen unter Verwendung von CTLA4-Ig in einem Inseltransplantatmodell (Levisetti, M. G. et al., J. Immunol. 159: 5187–5191, 1997) ebenso wie anhand unserer Erfahrung in einem Nierenallotransplantatmodell, wo die Empfänger keine gegen den Donor gerichteten Antikörper generieren konnten (Pearson T, et al., (Abstract). In Programs and Abstracts of the 17th American Society of Transplant Physicians Annual Meeting, Chicago, 10–14 May 1997. Chicago, American Society of Transplant Physicians). Ein Tier von fünf Empfängern unterlag einer Abstoßungsepisode, während es sich unter der L104EA29YIg-Therapie befand und entwickelte anschließend eine gegen den Donor gerichtete Antikörperantwort. Die übrigen vier Tiere, die sich unter dem L104EA29YIg-Regime befanden, entwickelten wie erwartet um den Zeitpunkt der Abstoßung herum (ca. 200 Tage nach der Transplantation, 50 Tage nach der letzen L104EA29YIg-Dosis) konsistent gegen den Donor gerichtete Antikörperantworten.
  • Die Inseltransplantation wird schnell zu einer realisierbaren Behandlungsoption für Patienten mit insulinabhängigem Diabetes mellitus Typ I. Neuere Berichte, die steroidfreie immunsuppressive Regime beschreiben, die nach der Inseltransplantation zu einer erfolgreichen Insulinunabhängigkeit führen, haben einen erneuten Optimismus für die praktische Applikation der Inseltransplantation eingeleitet. Wohingegen die Elimination der Glucocorticoide aus den immunsuppressiven Regimen im Rahmen der Bemühungen zur Behandlung des Typ I-Diabetes einen bedeutenden Schritt nach vom darstellt, kann der Verlass auf die Calcineurin-Therapie für die primäre Immunsuppression die Applikation dieses Ansatzes einschränken. Calcineurin-Inhibitoren sind von zahlreichen unerwünschten Nebenwirkungen begleitet, einschließlich Nephrotoxizitat, Diabetes, Hypertonie, gestörtem Lipidmetabolismus und Hirsutismus (Kahan B. D. et al., N. Engl.. J. Med. 321: 1725–1738, 1989; Group TUSMFLS: A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunsuppression in liver transplantation: the U. S. Multicenter FK506 Liver Study Group [Gruppe TUSMFLS: Ein Vergleich von Tacrolimus (FK 506) und Cyclosporin für die Immunsuppression in der Lebertransplantation]. N. Engl. J. Med. 331: 1110–1115, 1994; de Mattos A. M. et al., Am. J. Kidney Disease 35: 333–346, 2000). Selbst wenn die Arzneimitteldosen niedrig gehalten werden, können sich signifikante Nebenwirkungen entwickeln. Dies trifft besonders auf die Diabetikerpopulation zu, bei der die Nierenfunktion bereits geschädigt sein kann. Tatsächlich wiesen in den neuesten Berichten von Edmonton zwei Patienten mit leicht erhöhten Kreatininspiegeln vor der Transplantation signifikante Reduktionen der Nierenfunktion auf, während sie sich unter der Calcineurin-Inhibitortherapie befanden, und bei ihnen dieses Arzneimittel letztendlich abgesetzt werden musste (Ryan E. A., et al., Diabetes 50: 710–719, 2001). Im gleichen Bericht entwickelten Zweidrittel der Empfänger einen Grad der Glucoseintoleranz, wobei Einviertel sehr offensichtlich nach der Transplantation Diabetes entwickelte, von dem angenommen wird, dass er mit der Anwendung von Tacrolimus im Zusammenhang steht. Dies unterstreicht die attraktive und wesentliche Beschaffenheit eines immunsuppressiven Regimes, frei von Calcineurin-Inhibitor, insbesondere für die Inseltransplantation.
  • Die Blockade der costimulatorischen Signalwege der T-Zellen stellt eine vielversprechende Strategie für die Entwicklung nicht toxischer immunsuppressiver und potenziell tolerogener Regime bereit. Dieser Ansatz targetiert die T-Zellen, die das „Signal 1" während der Periode der Arzneimittelverabreichung erhalten. Es wird zum Beispiel angenommen, dass die Behandlung während der Peritransplantationsperiode allospezifische T-Zellen, wenn sie dem neuen Organ oder Gewebe begegnen, unwirksam machen, wohingegen andere T-Zellen ungeschädigt zurückbleiben (Li Y, et al., Nat. Med. 5: 1298–1302, 1999). Die Blockade des CD28B7-Wegs hat bemerkenswerte Aussichten in experimentellen Autoimmunitäts- und Transplantationsmodellen nachgewiesen, was es zu einem besonders attraktiven immunsuppressiven Target bei der Inseltransplantation macht, bei der vermutlich sowohl auto- als auch alloimmune Hindernisse existieren. Das Potenzial der CD28-Blockade in einem großen Tiertransplantationsmodell wurde von Levisetti M. G., et al., (J. Immunol. 159: 5187–5191, 1997) beschrieben. Es wurde festgestellt, dass die Behandlung mit CTLA4-Ig bei der Verlängerung des Überlebens des Inselallotransplantats in nicht humanen Primaten signifikant, obwohl mäßig war (Levisetti M. G., et al., J. Immunol. 159: 5187–5191, 1997). Die CTLA4-Ig-Monotherapie trägt wenig zur Verlängerung des Überlebens des Nierenallotransplantats bei (Pearson T. et al., (Abstract). In Programs and Abstracts- of the 17th American Society of Transplant Physicians Annual Meeting, Chicago, 10–14 May 1997. Chicago, American Society of Transplant Physicians). Vor kurzem sind mehrere Berichte zum Langzeitüberleben von Inseltransplantaten in nicht humanen Primatenmodellen erschienen. Es wurde gezeigt, dass die Anti-CD40L-mAk-Therapie bisher die beeindruckendsten Ergebnisse erbrachte; in ähnlichen Experimenten unter Verwendung eines Nierentransplantmodells wurde jedoch keine Toleranz erreicht, da das Absetzen der Therapie schließlich zur Abstoßung führte (Kenyon, N. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8132–8137 (1999); Kirk, A. D., et al., Nat. Med. 5, 686–693 (1999). In einem anderen ermutigenden Bericht beschrieben Thomas et al. (Diabetes 50: 1227–1236, (2001)) kürzlich, dass die Anwendung eines anti-CD3-Immuntoxins und des immunmodulatorischen Mittels DSG (15-Desoxyspergualin) das Inselüberleben bei Streptozotocin-induzierten diabetischen Primaten dramatisch verlängerte. Obwohl vielversprechend, wurden in diesen Berichten Therapeutika angewendet, deren klinisches Potenzial derzeit noch ungewiss ist.
  • Die in vivo-Daten unter Verwendung von L104EA29YIg, einer Mutantenform von CTLA4-Ig, im Inselallotransplantatmodell des Rhesusaffen ist konsistent mit den Hinweisen in vitro, die darauf hindeuten, dass dieses Molekül der zweiten Generation einen potenteren Inhibitor der T-Zellantworten darstellt, als das Elternmolekül. Da CTLA4-Ig bereits Wirksamkeit in einer klinischen Studie mit Psoriasispatienten gezeigt hat (Abrams, J. R. et al., J. Clin. Invest. 103: 1243–1252 (1999)), besteht ein signifikanter Enthusiasmus für die Versuche unter Verwendung von L104EA29YIg als das primäre Immunsuppressivum. Es ist mit klinisch zugelassenen Immunsuppressiva (anti-IL-2R-mAk und Rapamycin) eindeutig kompatibel, wenn nicht synergistisch, was das Design klinischer Studien erleichtert. Initiale Studien am Menschen mit L104EA29YIg laufen bereits mit Patienten, die an rheumatoider Arthritis leiden und denen, die sich einer Nierentransplantation unterziehen. Obwohl ein direkter Vergleich eines auf Tacrolimus basierenden Protokolls und des L104EA29YIg-Regimes aufgrund berichteter nicht tolerierbarer Toxizitäten an nicht humanen Primaten nicht in Angriff genommen wurden (Montgomery, S. P., et al., Am. J. Transplant 1 (Suppl. 1): 438, 2001), weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass L104EA29YIg das Potenzial besitzt, mindestens als ein primäres Immunsuppressivum genauso wirksam zu sein wie Tacrolimus.
  • SCHLUSSFOLGERUNGEN:
  • Es wird ein neues Calcineurin-Inhibitor-/steroidfreies immunsuppressives Regime beschrieben, das einen signifikanten Schutz vor Abstoßung bereitstellt und das Überleben von Inselallotransplantaten in nicht humanen Primaten verlängert. Das biologische Mittel L104EA29YIg stellt ein potentes Immunsuppressivum dar. L104EA29YIg könnte im Edmonton-Protokoll gegebenenfalls Tacrolimus ersetzen, wodurch die unerwünschten Nebenwirkungen des Calcineurin-Inhibitors eliminiert würden.
  • Wie vom Fachmann, für den diese Erfindung von Bedeutung ist, erkannt werden wird, kann die vorliegende Erfindung in Formen, mit Ausnahme der hierin vorstehend spezifisch offenbarten, ausgeführt werden, ohne aus dem Umfang der im Wesentlichen erfindungsgemäßen Merkmale zu kommen. Die vorstehend beschriebenen bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind deshalb als erläuternd und nicht als einschränkend zu verstehen. Der Umfang der vorliegenden Erfindung ist in den anhängenden Ansprüchen dargelegt, anstelle dass er auf die in der vorstehenden Beschreibung enthaltenen Beispiele beschränkt ist. SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (34)

  1. Verwendung eines löslichen CTLA4-Mutantenmoleküls in der Herstellung eines Arzneimittels zum Inhibieren der Abstoßung eines Inselzelltransplantats, worin das lösliche CTLA4-Mutantenmolekül eine mutierte extrazelluläre Domäne von CTLA4 umfasst, wobei die mutierte extrazelluläre Domäne von CTLA4 Folgendes aufweist: a) eine Aminosäuresequenz, die wie in 3 gezeigt mit Methionin an Position +1 beginnt und mit Asparaginsäure an +124 endet, oder die wie in 3 gezeigt mit Alanin an Position –1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet; b) eine Aminosäuresequenz, die wie in 19 gezeigt mit Methionin an Position +1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet, oder die wie in 19 gezeigt mit Alanin an Position –1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet; c) eine Aminosäuresequenz, die wie in 20 gezeigt mit Methionin an Position +1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet, oder die wie in 20 gezeigt mit Alanin an Position –1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet; d) eine Aminosäuresequenz, die wie in 21 gezeigt mit Methionin an Position +1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet, oder die wie in 21 gezeigt mit Alanin an Position –1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet; oder e) eine Aminosäuresequenz, die wie in 22 gezeigt mit Methionin an Position +1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet, oder die wie in 22 gezeigt mit Alanin an Position –1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Inselzelltransplantation zur Behandlung von Diabetes bestimmt ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, worin es sich beim Diabetes um Typ-I-Diabetes oder Typ-II-Diabetes handelt.
  4. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Inselzelltransplantat umhüllte Inselzellen umfasst.
  5. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Inhibieren der Abstoßung des Inselzelltransplantats die Verabreichung des löslichen CTLA4-Mutantenmoleküls vor, während oder nach der Inselzelltransplantation umfasst.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die extrazelluläre Domäne an einem Nicht-CTLA4-Teil fusioniert ist.
  7. Verwendung nach Anspruch 6, worin der Nicht-CTLA4-Teil einen Immunglobulinteil umfasst.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, worin der Immunglobulinteil eine konstante Region des Immunglobulins oder einen Anteil davon darstellt.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, worin die konstante Region des Immunglobulins oder ein Anteil davon eine oder mehr Mutation(en) zum Reduzieren der Effektorfunktion umfasst.
  10. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, worin die konstante Region des Immunglobulins die Hinge-, CH2- und CH3-Regionen eines Immunglobulinmoleküls umfasst.
  11. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, worin die konstante Region des Immunglobulins oder ein Anteil davon eine konstante Region eines humanen Immunglobulins oder eines Affen-Immunglobulins darstellt.
  12. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das lösliche CTLA4-Mutantenmolekül Folgendes darstellt: a) L104EA29YIg wie in 3 gezeigt, beginnend mit Ala an Position –1 oder Met an Position +1 und endend mit Lys an Position +357 (SEQ ID NO: 6, beginnend mit Ala an Position 26 und endend mit Lys an Position 383, oder beginnend mit Met an Position 27 und endend mit Lys an Position 383); b) L104EIg wie in 19 gezeigt, beginnend mit Ala an Position –1 oder Met an Position +1 und endend mit Lys an Position +357 (SEQ ID NO: 8, beginnend mit Ala an Position 26 und endend mit Lys an Position 383, oder beginnend mit Met an Position 27 und endend mit Lys an Position 383); c) L104EA29LIg wie in 20 gezeigt, beginnend mit Ala an Position –1 oder Met an Position +1 und endend mit Lys an Position +357 (SEQ ID NO: 10, beginnend mit Ala an Position 26 und endend mit Lys an Position 383, oder beginnend mit Met an Position 27 und endend mit Lys an Position 383); d) L104EA29TIg wie in 21 gezeigt, beginnend mit Ala an Position –1 oder Met an Position +1 und endend mit Lys an Position +357 (SEQ ID NO: 12, beginnend mit Ala an Position 26 und endend mit Lys an Position 383, oder beginnend mit Met an Position 27 und endend mit Lys an Position 383; oder e) L104EA29WIg wie in 22 gezeigt, beginnend mit Ala an Position –1 oder Met an Position +1 und endend mit Lys an Position +357 (SEQ ID NO: 14, beginnend mit Ala an Position 26 und endend mit Lys an Position 383, oder beginnend mit Met an Position 27 und endend mit Lys an Position 383).
  13. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin das lösliche CTLA4-Mutantenmolekül in Kombination mit mindestens einer zusätzlichen Verbindung verwendet wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus immunsuppressiven Verbindungen, immunmodulatorischen Verbindungen und antiinflammatorischen Verbindungen.
  14. Verwendung nach Anspruch 13, worin die Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: Anakinra, Adrenocorticosteroiden, Azathioprin, Basiliximab, Calcineurin-Inhibitoren, Chloroquin, Corticosteroiden, Cyclosporin, Prednison, Cyclophosphamid, Cytoxan, 15-Desoxyspergualin und Analogen davon, D-Penicillamin, Etanercept, Glatiramer-Acetat, FTY720 und Analogen davon, Glucocorticoiden, Goldsalzen, Pferde-anti-Human-Thymozytenglobulin (ATGAM), humanisiertem anti-TAC (HAT), Hydroxychloroquin, Infliximab, Interferon-beta-1a, Interferon-beta-1b, Leflunomid und Analogen davon, Lymphozyten-Immunglobulin, Lymphozyten-Homing-Mitteln, Methoxsalen, Methotrexat, Mitoxantronhydrochlorid, Mycophenolsäure, Mycophenolat-Mofetil, Mizoribin, NSAR, Kaninchen-anti- Human-Thymozytenglobulin, Rho(D)-Immunglobulin, Sirolismus (Rapamycin) und Derivaten davon (z. B. 40-0-(2-Hydroxyethyl)-rapamycin), Sulfasalazopyrin, Sulfasalzin, Tacrolismus (FK-506), Thalidomid, TNFα-Blockern und biologischen Mitteln, die ein inflammatorisches Cytokin targetieren, TOR-Inhibitoren, Verbindungen, die mit CD40 und CD154 interferieren, löslichem gp39, löslichem CD29, löslichem CD40, löslichem CD80 (z. B. ATCC 68627), löslichem CD86, löslichem CD28, löslichem CD56, löslichem Thy-I, löslichem CD3, löslichem TCR, löslichem VLA-4, löslichem VCAM-1, löslichem LECAM-1, löslichem ELAM-1, löslichem CD44, mit gp39 reaktiven Antikörpern (z. B. ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 und ATCC HB-12056), mit CD40 reaktiven Antikörpern (z. B. ATCC HB-9110), mit B7 reaktiven Antikörpern (z. B. ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341, mit CD28 reaktiven Antikörpern (z. B. ATCC HB-11944 oder mAk 9,3), mit LFA-1 reaktiven Antikörpern (z. B. ATCC HB-9579 und ATCC TIB-213), mit LFA-2 reaktiven Antikörpern, mit IL-2 reaktiven Antikörpern, mit IL-12 reaktiven Antikörpern, mit IFN-gamma reaktiven Antikörpern, mit CD2 reaktiven Antikörpern, mit CD48 reaktiven Antikörpern, mit jedwedem ICAM reaktiven Antikörpern (z. B. mit ICAM-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 und ICAM-3), mit CTLA4 reaktiven Antikörpern (z. B. ATCC HB-304), mit Thy-1 reaktiven Antikörpern, mit CD56 reaktiven Antikörpern, mit CD3 reaktiven Antikörpern, mit CD29 reaktiven Antikörpern, mit TCR reaktiven Antikörpern, mit VLA-4 reaktiven Antikörpern, mit VCAM-1 reaktiven Antikörpern, mit LECAM-1 reaktiven Antikörpern, mit ELAM-1 reaktiven Antikörpern, mit CD44 reaktiven Antikörpern, monoklonalen Antikörpern gegen Leukozytenrezeptoren, z. B. MHC, CD2, CD3, CD4, CDIIa/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB oder ihren Liganden, CTLA4/CD28-Ig; LFA-1-Antagonisten, Selectin-Antagonisten und VLA-4-Antagonisten und anti-humanen IL-2R-mAk.
  15. Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, worin das lösliche CTLA4-Mutantenmolekül und die zusätzliche Verbindung gemeinsam zu verabreichen sind.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, worin das lösliche CTLA4-Mutantenmolekül und die zusätzliche Verbindung gleichzeitig oder in Sequenz zu verabreichen sind.
  17. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin das Inhibieren der Abstoßung des Inselzelltransplantats ein zusätzliches immunsuppressives Regime umfasst.
  18. Verwendung nach Anspruch 17, worin das zusätzliche immunsuppressive Regime frei von Glucocorticoid ist.
  19. Verwendung nach Anspruch 17, worin das zusätzliche immunsuppressive Regime ein Corticosteroid umfasst.
  20. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, worin das zusätzliche immunsuppressive Regime frei von Calcineurin-Inhibitor ist.
  21. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, worin das zusätzliche immunsuppressive Regime eine oder mehr Verbindung(en) nach Anspruch 14 umfasst.
  22. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 21, worin das zusätzliche immunsuppressive Regime einen TOR-Inhibitor und/oder ein biologisches Mittel umfasst, das IL-2 targetiert.
  23. Verwendung nach Anspruch 22, worin der TOR-Inhibitor Rapamycin (Sirolismus) oder ein Derivat davon darstellt.
  24. Verwendung nach Anspruch 22, worin das biologische Mittel, das ein IL-2 targetiert, einen mit IL-2 reaktiven Antikörper oder einen anti-humanen IL-2R-mAk dargestellt.
  25. Verwendung nach Anspruch 24, worin der anti-humane IL-2R-mAk Basiliximab darstellt.
  26. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 25, worin das zusätzliche immunsuppressive Regime Mycophenolsäure oder Mycophenolat-Mofetil umfasst.
  27. Verwendung nach Anspruch 16, worin das zusätzliche immunsuppressive Regime eine Verbindung umfasst, die mit der Bindung von CD40 an CD154 interferiert.
  28. Verwendung nach Anspruch 27, worin die Verbindung, die mit der Bindung von CD40 an CD154 interferiert, einen anti-CD40-Antikörper darstellt.
  29. Verwendung nach Anspruch 27, worin die Verbindung, die mit der Bindung von CD40 an CD154 interferiert, einen anti-CD154-Antikörper darstellt.
  30. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Inhibierung der Abstoßung des Inselzelltransplantats die Verabreichung von T-zelldepletierten Knochenmarkzellen umfasst.
  31. Verwendung nach Anspruch 30, worin die Verabreichung von T-zelldepletierten Knochenmarkzellen ca. zur gleichen Zeit wie die Platzierung des Inselzelltransplantats erfolgt.
  32. Verwendung nach Anspruch 30, worin die Verabreichung von T-zelldepletierten Knochenmarkzellen vor der Platzierung des Inselzelltransplantats erfolgt.
  33. Verwendung nach einem der Ansprüche 30 bis 32, worin die Verabreichung von T-zelldepletierten Knochenmarkzellen eine erste Dosis und eine zweite Dosis umfasst.
  34. Lösliches CTLA4-Mutantenmolekül zur Anwendung in einem Verfahren zum Inhibieren der Abstoßung eines Inselzelltransplantats, worin das lösliche CTLA4-Mutantenmolekül eine mutierte extrazelluläre Domäne von CTLA4 umfasst, wobei die mutierte extrazelluläre Domäne von CTLA4 Folgendes aufweist: a) eine Aminosäuresequenz, die wie in 3 gezeigt mit Methionin an Position +1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet, oder die wie in 3 gezeigt mit Alanin an Position –1 beginnt und mit Asparagunsäure an Position +124 endet; b) eine Aminosäuresequenz, die wie in 19 gezeigt mit Methionin an Position +1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet, oder die wie in 19 gezeigt mit Alanin an Position –1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet; c) eine Aminosäuresequenz, die wie in 20 gezeigt mit Methionin an Position +1 beginnt und mit Asparagunsäure an Position +124 endet, oder die wie in 20 gezeigt mit Alanin an Position –1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet; d) eine Aminosäuresequenz, die wie in 21 gezeigt mit Methionin an Position +1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet, oder die wie in 21 gezeigt mit Alanin an Position –1 beginnt und mit Asparagunsäure an Position +124 endet; oder e) eine Aminosäuresequenz, die wie in 22 gezeigt mit Methionin an Position +1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet, oder die wie in 22 gezeigt mit Alanin an Position –1 beginnt und mit Asparaginsäure an Position +124 endet.
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