ES2615861T3 - Células T de memoria central anti-terceros, métodos de producción de las mismas y uso de las mismas en trasplante y tratamiento de enfermedades - Google Patents
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Abstract
Una población de células aislada que comprende células anti-terceros que no inducen EICH que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), en la que dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) comprende un distintivo CD8+, CD62L+, CD45RA-, CD45 RO+, y en la que al menos el 50 % de la población de células aislada tienen dicho distintivo, siendo dichas células, células que inducen tolerancia y capaces de dirigirse a los ganglios linfáticos después de un trasplante.
Description
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DESCRIPCION
Celulas T de memoria central anti-terceros, metodos de produccion de las mismas y uso de las mismas en trasplante y tratamiento de enfermedades
Campo y antecedentes de la invencion
La presente invencion, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a celulas anti-terceros que no inducen EICH que comprenden fenotipo de linfocitos T de memoria central y, mas particularmente, pero no exclusivamente, a la generacion de las mismas y al uso de las mismas en trasplante y en el tratamiento de enfermedades.
El trasplante de medula osea (MO) ofrece un tratamiento curativo para muchos pacientes con neoplasias hematologicas y otros trastornos hematologicos. Sin embargo, el injerto de MO contiene celulas T del donante que responden a los antfgenos del huesped (Ag) y causan enfermedad de injerto contra huesped (EICH) multisistemica. A principios de los anos 80, el trasplante de medula osea (TMO), sin el efecto perjudicial de EICH, se demostro en los entornos haploidenticos (tres loci de ALH emparejados erroneamente), en pacientes de inmunodeficiencia combinada grave (IDCG). El problema de EICH, que es letal de forma casi uniforme en dichos entornos, se impidio completamente mediante disminucion de celulas T.
Sin embargo, en pacientes de leucemia, el desenlace clmico de MO empobrecida en celulas T fue decepcionante, dado que el beneficio de la prevencion de EICH estaba compensado por una tasa de rechazo de injerto incrementada marcadamente. Se demostro que el rechazo estaba mediado por celulas T derivadas del huesped resistentes a radioquimioterapia [Reisner et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU. (1986) 83: 4012-4015]. Una manera de superar este problema es realizar TMO despues de acondicionamiento supra-letal e inactivacion funcional de celulas T del huesped usando farmacos inmunosupresores. No obstante, esta estrategia esta lastrada por infecciones oportunistas debido a la lenta reconstitucion inmunitaria y las considerables toxicidades de los inmunosupresores.
Aunque en pacientes de leucemia de alto riesgo dicha mortalidad asociada a trasplante puede ser aceptable, sena intolerable si se aplicara a pacientes con una esperanza de vida larga. Por lo tanto, el uso de acondicionamiento de intensidad reducida, con ablacion inmunitaria menos severa, para permitir el prendimiento de injerto de MO empobrecida en celulas T (MOET), que esta asociado con un riesgo reducido de EICH, esta justificado. El establecimiento que quimerismo de tipo donante en dicho acondicionamiento reducido representa el objetivo mas deseable en biologfa de trasplante, dado que esta asociado, en general, con tolerancia duradera hacia celulas o tejidos del donante original. No obstante, los marcados niveles de celulas inmunitarias del huesped que sobreviven a los regfmenes preparatorios moderados, representan una barrera diffcil para el prendimiento de celulas del donante.
Un enfoque para superar el rechazo de celulas madre hematopoyeticas alogenicas utilizo grandes dosis de celulas de MO. En primer lugar se demostro en modelos en roedor que una “megadosis” de trasplante de MOET puede superar el rechazo de injerto mediado por celulas T [Lapidot et al., Blood (1989) 73: 2025-2032; Bachar-Lustig et al., Nat Med. (1995) 1: 1268-1273; Uharek et al., Blood (1992) 79: 1612-1621]. Sin embargo, un incremento significativo en el inoculo de MO ha sido diffcil de conseguir en seres humanos. Para superar este problema se ha usado el factor estimulador de colonias de granulocitos (FEC-G), que facilita la movilizacion de celulas madre hematopoyeticas (CMH, celulas CD34+ en seres humanos) desde la MO, para incrementar la produccion de CMH recogidas de la sangre y estas CMH se suplementaron a la MOET convencional [Aversa et al., N Engl J Med. (1998) 339: 1186-1193; Aversa et al., J Clin Oncol. (2005) 23: 3447-3454; Reisner y Martelli, Immunol Today (1999) 20: 343-347; Handgretinger et al., Bone Marrow Transplant. (2001) 27: 777-783].
Los trasplantes con “megadosis” de CD34 generaron preguntas interesantes sobre como estas celulas superan la barrera presentada por precursores de linfocitos T citotoxicos del huesped (LTC-p). Esta pregunta fue respondida, en parte, por el descubrimiento de que celulas dentro de la fraccion de CD34 estan dotadas de potente actividad de veto [Gur et al., Blood (2005) 105: 2585-2593; Gur et al., Blood (2002) 99: 4174-4181; Rachamim et al., Transplantation (1998) 65: 1386-1393]. Otros tipos de celulas tambien han demostrado mediar en la actividad de veto, incluyendo linfocitos T (por ejemplo LTC CD8+), linfocitos citolfticos naturales y celulas dendnticas. La comparacion directa de la reactividad de veto de diversos tipos celulares revelo que los LTC comprenden el efecto de veto mas potente [Reich-Zeliger et al., J Immunol. (2004) 173: 6654-6659].
Un enfoque desarrollado para generar LTC de veto sin reactividad de ICH fue descrito por Reisner y colaboradores, en el que se estimularon LTC contra estimuladores de terceros en ausencia de IL-2 exogena. Este enfoque se basaba en la observacion de que solamente LCTp fueron capaces de sobrevivir al empobrecimiento de IL-2 en el cultivo primario. Este metodo se demostro in vitro e in vivo para reducir la reactividad de ICH a partir de los LTC de veto anti-terceros [publicacion PCT N.° WO 2001/049243, Bachar-Lustig et al., Blood. 2003; 102: 1943-1950; Aviner et al., Hum Immunol. (2005) 66: 644-652]. La introduccion de estos LTC de veto anti-terceros en un receptor (junto con un trasplante) impedfa el rechazo de injerto sin inducir EICH (publicacion PCT N.°WO 2001/049243).
Se han contemplado diversos enfoques para trasplante de injerto sin rechazo de injerto y/o enfermedad de injerto contra huesped, algunos se resumen a continuacion.
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La publicacion PCT N.° WO 2007/023491 desvela el uso de celulas tolerogenicas para reducir o prevenir el rechazo de injerto de un injerto no singenico en un sujeto. Las celulas tolerogenicas desveladas (por ejemplo celulas CD4+CD25+) pueden derivarse de cualquier donante que es no singenico tanto con el sujeto como con el injerto (celulas tolerogenicas "de terceros"). El injerto (por ejemplo medula osea) puede derivarse de cualquier donante de injerto que es alogenico o xenogenico con el sujeto.
La publicacion PCT N.°WO 2002/102971 desvela el uso de celulas progenitoras hematopoyeticas cultivadas (CPH) que comprenden actividad de veto potenciada para inducir tolerancia a un trasplante trasplantado a partir de un donante en un receptor. Las celulas tolerogenicas desveladas expresan preferentemente CD33 y se administran antes de, conjuntamente con o despues del trasplante del trasplante (por ejemplo trasplante de celulas u organos).
La publicacion PCT N.° WO 2002/043651 desvela el uso de una poblacion no inductora de EICH de celulas efectoras inmunitarias para el tratamiento de enfermedades. Con el fin de llegar a la poblacion no inductora de EICH de celulas efectoras inmunitarias, una primera poblacion de celulas (por ejemplo linfocitos T) se cocultivan con una segunda poblacion de celulas que no son singenicas con el sujeto y no son singenicas con la primera poblacion de celulas (por ejemplo linfocitos B infectados con VEB) en condiciones que incluyen carencia de IL-2 seguida por suplementacion con IL-2. Las celulas efectoras inmunitarias resultantes pueden usarse para tratar enfermedades tales como enfermedades malignas, enfermedades vmcas y enfermedades autoinmunitarias.
La patente de Estados Unidos N.° 6.759.035 desvela metodos de inhibicion del rechazo de injerto e induccion de tolerancia a celulas T en una recepcion de trasplante de organo solido. Los metodos desvelados comprenden retirar celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP) de un donante y un receptor, cultivar las celulas del donante y el receptor juntas en presencia de un compuesto que induce actividad supresora de celulas T (por ejemplo TGF-p, IL-15 e IL-2), y administrar las celulas T supresoras del receptor al receptor junto con el trasplante para impedir que las celulas T del receptor destruyan celulas del donante, induciendo de este modo tolerancia y supervivencia a largo plazo del trasplante.
La patente de Estados Unidos N.° 6.803.036 desvela metodos para tratar celulas de donante para mejorar enfermedad de injerto contra huesped en un paciente receptor. Los metodos desvelados comprenden retirar CMSP de un donante y tratar las celulas con una composicion supresora (por ejemplo IL-10, IL-2, IL-4, IL-15 y TGF-P) durante un tiempo suficiente para inducir tolerancia a celulas T. Las celulas se introducen a continuacion en un paciente receptor. Las celulas tratadas pueden anadirse a celulas madre del donante antes de la introduccion en el paciente.
Sumario de la invencion
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion, se proporciona una poblacion de celulas aislada que comprende celulas anti-terceros que no inducen EICH que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo las celulas, celulas que inducen tolerancia y capaces de dirigirse a los ganglios linfaticos despues de un trasplante.
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion, se proporciona un uso de la poblacion de celulas aislada de la reivindicacion 1, para tratar una enfermedad en un sujeto que lo necesita.
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion, se proporciona un uso de la poblacion de celulas aislada de la reivindicacion 1, como un tratamiento adyuvante para un trasplante de celulas o de tejido en un sujeto, en el que el sujeto necesita un trasplante de celulas o de tejido.
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion, se proporciona un metodo de tratamiento de un sujeto que necesita un trasplante de celulas o de tejido, comprendiendo el metodo: (a) trasplantar un trasplante de celulas o de organos en el sujeto; y (b) administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de la poblacion de celulas aislada de la reivindicacion 1, tratando de este modo al sujeto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el metodo comprende ademas acondicionar al sujeto en condiciones subletales, letales o supraletales antes del trasplante.
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion, se proporciona un metodo de generacion de la poblacion de celulas aislada de la reivindicacion 1, comprendiendo el metodo: (a) poner en contacto celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP) no singenicas con un antfgeno o antfgenos de terceros en condiciones que permiten la eliminacion de celulas reactivas en ICH; y (b) cultivar las celulas que resultan de la etapa (a) en presencia de IL-15 en condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden el fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm).
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las condiciones que permiten la eliminacion de celulas reactivas en ICH comprenden un cultivo derivado de citocinas.
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De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las condiciones que permiten la eliminacion de celulas reactivas en ICH comprenden al menos 2 dfas de cultivo.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden el fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) comprenden IL-7 y/o IL-21.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden el fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) comprenden un entorno libre de antigenos.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden el fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) comprenden al menos 14 dfas del cultivo.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el antigeno o antigenos de terceros se seleccionan entre el grupo que consiste en celulas de terceros, un antigeno celular, un antigeno viral, un antfgeno bacteriano, un extracto de protema, una protema purificada y un peptido sintetico presentado por celulas presentadoras autologas o no autologas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas de terceros son celulas alogenicas o xenogenicas con respecto al sujeto y/o donante.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas alogenicas son celulas estimuladoras seleccionadas entre el grupo que consiste en celulas purificadas a partir de linfocitos de la sangre periferica, bazo o ganglios linfaticos, LSP movilizados por citocinas y celulas dendnticas presentadoras de antfgenos expandidas in vitro (CPA).
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP) no singenicas son alogenicas con respecto al sujeto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP) no singenicas son xenogenicas con respecto al sujeto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la enfermedad se selecciona entre el grupo que consiste en una enfermedad maligna, una enfermedad vmca y una enfermedad autoinmunitaria.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la poblacion de celulas aislada se administra antes de, conjuntamente con o despues del trasplante de celulas o de tejido.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) comprende un distintivo CD8+, CD62L+, CD45RA", CD45 RO+.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) comprende CD8+/CD62L+/CD45RO+/L-selectina+/CD45RA-.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, al menos el 50 % de la poblacion de celulas aislada tienen el distintivo.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, los ganglios linfaticos comprenden ganglios linfaticos perifericos.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, los ganglios linfaticos comprenden ganglios linfaticos mesentericos.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el sujeto es un sujeto humano.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el trasplante de celulas o de tejido se deriva de un donante seleccionado entre el grupo que consiste en un donante alogenico ALH identico, un donante alogenico no ALH identico y un donante xenogenico.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el sujeto y el donante son ambos seres humanos.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la poblacion de celulas aislada que comprende celulas anti- terceros que no inducen EICH que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) se genera: (a) poniendo en contacto celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP) no singenicas con un antfgeno o antfgenos de terceros en condiciones que permiten la eliminacion de celulas reactivas en ICH; y (b) cultivando las celulas resultantes de la etapa (a) en presencia de IL-15 en condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden el fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm).
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De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las condiciones que permiten la eliminacion de celulas reactivas en ICH comprenden un cultivo derivado de citocinas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las condiciones que permiten la eliminacion de celulas reactivas en ICH comprenden al menos 2 dfas de cultivo.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden el fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) comprenden IL-7 y/o IL-21.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden el fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) comprenden al menos 14 dfas del cultivo.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden el fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) comprenden un entorno libre de antigenos.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el antigeno o antigenos de terceros se selecciona entre el grupo que consiste en celulas de terceros, un antigeno celular, un antfgeno viral, un antfgeno bacteriano, un extracto de protema, una protema purificada y un peptido sintetico presentado por celulas presentadoras autologas o no autologas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas de terceros son celulas alogenicas o xenogenicas con respecto al sujeto y/o donante.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas alogenicas o xenogenicas son celulas estimuladoras seleccionadas entre el grupo que consiste en celulas purificadas a partir de linfocitos de la sangre periferica, bazo o ganglios linfaticos, LSP movilizados por citocinas y celulas dendnticas presentadoras de antfgenos expandidas in vitro (CPA).
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP) no singenicas son alogenicas con respecto al sujeto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP) no singenicas son xenogenicas con respecto al sujeto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la poblacion de celulas aislada se genera: (a) poniendo en contacto celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP) no singenicas con un antfgeno o antfgenos de terceros durante al menos dos dfas en un cultivo derivado de citocinas en condiciones que permiten la eliminacion de celulas reactivas en ICH; y (b) cultivando las celulas resultantes de la etapa (a) en presencia de IL-15 durante al menos 14 dfas en un entorno libre de antfgenos en condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden el fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm).
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el cultivo de las celulas resultantes de la etapa (a) comprende IL-7 y/o IL-21.
A menos que se definan de otra manera, todos los terminos tecnicos y/o cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comunmente por un experto en la materia a la que pertenece la invencion. Aunque pueden usarse metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la puesta en practica o ensayos de realizaciones de la invencion, a continuacion se describen metodos y/o materiales ejemplares. En caso de conflicto, la memoria descriptiva de patente, que incluye definiciones, prevalecera. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son ilustrativos solamente y no pretenden ser necesariamente limitantes.
Breve descripcion de los dibujos
En el presente documento se describen algunas realizaciones de la invencion, a modo de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia espedfica ahora a los dibujos en detalle, se hace hincapie en que los particulares mostrados son a modo de ejemplo y con fines de descripcion ilustrativa de realizaciones de la invencion. A este respecto, la descripcion tomada con los dibujos hace evidente para los expertos en la materia como pueden ponerse en practica realizaciones de la invencion.
En los dibujos:
Las figuras 1A-D son fotograffas que representan patrones de anidamiento de LTC de veto anti-terceros en comparacion con celulas T indiferenciadas singenicas y alogenicas, 36 horas despues de la inoculacion. Ratones FVB (H-2q) irradiados letalmente recibieron un aloinjerto de medula osea de BALB/C (H-2d) empobrecido en celulas T, 5 x 106, (figura 1A) y 104 celulas T singenicas (figuras 1C-D). Ademas, los ratones receptores
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recibieron 2 x 106 CTH indiferenciadas marcadas con DIR singenicas (figura 1B), 7 x 106 celulas T marcadas con DIR alogenicas indiferenciadas (figura 1C) o 7 x 106 LTC de veto activadas anti-terceros alogenicos marcados con DIR (figura 1D).
Las figuras 2A-B son graficos que representan que la privacion de citocinas breve in vitro favorece la induccion de celulas T de memoria central (Tcm) mediante IL-15. Se estimularos esplenocitos de BALB/C o CB6 con esplenocitos de FVB irradiados durante 60 horas (2 dfas) o 6 dfas en ausencia de citocinas y se evaluaron para la expresion de CD62L por celulas T CD8+ usando analisis FACS (figura 2A). Posteriormente, celulas T CD8+ se seleccionaron positivamente y se cultivaron adicionalmente con rhIL-2 (40 Ul/ml) y se reactivaron con esplenocitos de FVB, con rhIL-2 (40 Ul/ml), o con rhIL-15 (20 ng/ml) en entorno libre de Ag. Se anadieron medio fresco y citocinas cada dos dfas. El dfa 15 del cultivo, las celulas se evaluaron para porcentaje de celulas Tcm (CD44+CD62L+) usando analisis FACS (figura 2B).
La figura 2C es un diagrama de flujo que representa las etapas emprendidas para inducir el fenotipo Tcm de las celulas de la presente invencion. Se estimularon esplenocitos de raton con estimuladores de terceros irradiados durante 60 horas sin la adicion de citocinas. Posteriormente, celulas T CD8+ supervivientes se seleccionaron positivamente y se cultivaron adicionalmente con rhIL-15 (20 ng/ml) en un entorno libre de antfgenos durante 14 dfas. Despues de 14 dfas, el cultivo comprende aproximadamente un 70 % de celulas Tcm, tal como se indica en la figura 2B.
Las figuras 3A-B son fotograffas que representan la presencia de celulas Tcm CD8+ CD62L+ en los ganglios linfaticos del huesped y en numeros mas elevados en comparacion con celulas LTC de veto (60 horas despues de trasplante adoptivo). Ratones BALB/C (H-2d) irradiados letalmente recibieron 5 x 106 celulas de aloinjerto (H- 2b) de medula osea de C57BL/6 y 104 celulas T singenicas. A los ratones se les trasplantaron a continuacion 10 x 106 celulas Tcm CD8+ marcadas con DIR (figura 3A) o celulas LTC de veto (H-2bd, figura 3B). 60 horas despues, se sacrificaron receptores seleccionados. Se tomaron imagenes ex-vivo usando IVIS.
Las figuras 4A-D son graficos que representan la deteccion de celulas Tcm CD8+ CD62L+ en ganglios linfaticos tanto perifericos como mesentericos y en mayores numeros en comparacion con celulas LTC de veto (60 horas despues de trasplante adoptivo). Ratones BALB/C (H-2d) irradiados letalmente recibieron 5 x 106 celulas de aloinjerto (H-2b) de medula osea de C57BL/6 desnudos y 104 celulas singenicas. A los ratones se les trasplantaron a continuacion 10 x 106 celulas Tcm CD8+ marcadas con DIR (figuras 4A-B) o celulas LTC de veto (H-2bd, figura 4C-D). Dos dfas despues, se sacarificaron receptores seleccionados y los ganglios linfaticos perifericos (figuras 4A y 4C) y los ganglios linfaticos mesentericos (figuras 4B y 4D) se extrajeron y se machacaron. Las suspensiones celulares se analizaron mediante FACS y se seleccionaron tomando como base CD8.
Las figuras 5A-C son fotograffas que representan la presencia de celulas Tcm CD62L+ en todos los organos linfoides secundarios (OLS) y en numeros de celulas elevados, en contraste con celulas LTC de veto CD8+, que se concentran principalmente en el hugado y el bazo (6,5 dfas despues de trasplante adoptivo). Ratones BALB/C (H-2d) irradiados letalmente recibieron 5 x 106 celulas de aloinjerto (H-2b) de medula osea de C57BL/6 desnudos y 104 celulas T singenicas (control, figura 5A). A los ratones se les trasplantaron a continuacion 10 x 106 celulas Tcm CD8+ marcadas con DIR (figura 5B) o celulas LTC de veto (H-2bd, figura 5C). 6,5 dfas despues, se sacarificaron los receptores seleccionados y se tomaron imagenes ex-vivo usando IVIS.
Las figuras 6A-K son graficos que representan la presencia de celulas Tcm CD62L+ en todos los OLS y en cantidades de celulas elevadas, en contraste con celulas LTC de veto CD8+ (6,5 dfas despues de trasplante adoptivo). Ratones BALB/C (H-2d) irradiados letalmente recibieron 5 x 106 celulas de aloinjerto (H-2b) de medula osea de C57BL/6 desnudos y 104 celulas T singenicas. A los ratones se les trasplantaron a continuacion 10 x 106 Tcm CD8+ marcadas con DIR (figuras 6A-E) o celulas LTC de veto (H-2bd, figuras 6F-J). 6,5 dfas despues, se sacarificaron los receptores seleccionados, los organos internos se extrajeron y las celulas purificadas se analizaron mediante FACS. Los numeros representan las celulas H-2bd totales, con seleccion basandose en CD8, recogidas en un tiempo constante. El numero total de Tcm o LTC recogidas de todos los organos ensayados, a los 2 dfas (barras negras) o a los 6,5 dfas (barras grises) post-trasplante se muestra en la figura 6K.
La figura 7 es un grafico que representa el uso de transferencia adoptiva a celulas Tcm para superar el rechazo de aloinjertos (MOET) de medula osea empobrecida en celulas T. ratones C3H (H-2K) irradiados letalmente recibieron 1,25 x 104 celulas T singenicas. A los ratones se les trasplantaron a continuacion 3 x 106 celulas de MO (H-2d) de BALB/C desnudos con o sin la adicion de 107 celulas Tcm CD8+ (C3H*BALB/C)F1 (H-2kd).
La figura 8 es un grafico que representa porcentaje de quimerismo del donante (80 dfas post-trasplante de MO). A ratones C3H (H-2K) irradiados letalmente se les trasplantaron 3 x 106 celulas de aloinjerto de MO (H-2d) de BALB/C desnudos (columna A), o recibieron ademas 1,25 x 104 celulas T singenicas y 107 Tcm CD8+ de (C3H*BALB/C)F1 (H-2kd) (columna B). 80 dfas post-trasplante, el porcentaje de quimerismo del donante en sangre periferica de ratones se analizo mediante FACS.
Las figuras 9A-B son graficos que representan niveles en sangre periferica de celulas Tcm infundidas a los 80 dfas post-trasplante de MO. A ratones C3H (H-2K) irradiados letalmente se les trasplantaron 3 x 106 celulas de MO de BALB/C desnudos (H-2d) (figura 9A), o recibieron ademas 1,25 x 104 celulas T singenicas y 107 celulas Tcm CD8+ de (C3H*BALB/C)F1 (H-2kd) (figura 9B). Los niveles en sangre periferica de celulas Tcm se analizaron mediante analisis FACS midiendo celulas doble positivas H2KkH2Dd en el punto de seleccion basada en CD8+. Las figuras muestran ratones representativos desde cada grupo.
Las figuras 10A-C son graficos que muestran que Tcm' estan dotadas de marcadas capacidades de induccion de tolerancia, y persisten in-vivo al menos 1 ano post-TMO. Figura 10A - Ratones C3H (H-2K) irradiados letalmente
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(10 Gy) recibieron 1,25x104 CTH singenicas. A los ratones se les trasplantaron a continuacion 3x106 celulas de MO BALB/c-DESNUDOS (H-2d,"BA-NU MO") en presencia o ausencia de diferentes dosis de “Tcm” de CD8+ purificadas de (C3HXBALB/c)F1 (H-2Kd,"C3BF1"). Los datos representan n = 22 animales para el grupo de irradiacion solamente, 30 para el grupo de irradiacion+MO, 59 para el grupo de irradiacion+MO+CTH, y n = 16, 23 o 18 para los siguientes grupos de ratones respectivamente: irradiacion+MO+CTH+(2*106) o (5*106) o (107) Tcm'. Se combinaron los datos de seis experimented independientes. Figura 10B - El modelo de rechazo de injerto se establecio como en 9C. A los ratones se les trasplantaron 3x106 celulas de MO de BALB/c- DESNUDOS (H-2d,"BA-NU MO") en presencia o ausencia de 5x106 “Tcm” de (C3H*BALB/c)F1 (H-2Kd,"C3BF1") purificadas o 107 “LTC” de (C3H*BALB/c)F1. Los datos representan n = 14 animales para el grupo de irradiacion solamente, 12 para el grupo de irradiacion+MO, 21 para el grupo de irradiacion+MO+CTH y n = 23 o 16 para los grupos de ratones que recibieron irradiacion+MO+CTH+(5x106) 'Tcm' o (107) 'LTC', respectivamente. Se combinaron los datos de cinco experimentos independientes. Figura 10C - Los niveles en sangre periferica de 'Tcm' 1 ano post-TMO mediante FACS midiendo celulas doble positivas H2KkH2Dd en el punto de seleccion basada en CD8+. La figura muestra ratones representativos de siete ratones trasplantados con MO solamente ("MO en solitario") o siete ratones trasplantados con MO+CTH+5x106 “Tcm” CD8+ de (C3H*BALB/c)F1 ("MO+Tcm").
Las figuras 11A-C son graficos que ilustran que “Tcm” anti-terceros completamente alogenicas estan empobrecidas en reactividad de ICH y apoyan el prendimiento de aloinjertos de MOET. Figuras 11A-B - Ratones C3H irradiados supra-letalmente (11 Gy) se protegieron contra radiacion con 5x106 celulas de MO de BALB/c- DESNUDOS en presencia o ausencia de 5x106 o 2x106 “Tcm” purificadas CD8+ derivadas de BLAB/c ("MO + Tcm 5" o "MO + Tcm 2", respectivamente) o celulas indiferenciadas ("MO + indiferenciadas 5" o "MO + indiferenciadas 2", respectivamente). La reactividad de ICH de las celulas 'Tcm' o indiferenciadas se reflejo mediante el porcentaje de supervivencia (figura 11A) o mediante el cambio de peso promedio (figura 11B) durante 100 dfas post-trasplante. Los datos representan promedios de tres experimentos independientes, con al menos cinco ratones para cada grupo, en cada experimento. (**) Representa el valor p <0,01, en comparacion con el grupo de ratones que recibieron solamente MO. Figura 11C - Ratones C3H irradiados letalmente (10 Gy) recibieron 1,25x104 CTH singenicas. A los ratones se les trasplantaron a continuacion 3x106 celulas de MO de BALB/c-DESNUDOS ("BA-NU MO") en presencia o ausencia de 5x106 'Tcm' purificadas CD8+ de BALB/c o 107 'LTC' de BALB/c. Los datos representan n = 17 ratones para el grupo de irradiacion solamente, 11 para el grupo de irradiacion+MO, 24 para el grupo de irradiacion+MO+CTH, y n = 27 o 25 para los grupos de ratones que recibieron irradiacion+MO+CTH+107 'LTC' o 5x106 'Tcm', respectivamente. Se combinaron los datos de tres experimentos independientes.
Las figuras 12A-E son graficos que muestran que Tcm' presentan baja actividad de veto in vitro, pero tras la reactivacion adquieren un fenotipo efector, que esta asociado con actividad de veto potente y espedfica. Figura 12A- se estimularon esplenocitos 2c con esplenocitos (H-2d) de BALB/c irradiados en presencia o ausencia de “Tcm” purificadas derivadas de CB6 (H-2bd), “LTC” o “Tcm” purificadas reactivadas in-vitro con sus estimuladores de terceros consangumeos durante 60 horas ("R' Tcm"). Las celulas de veto se anadieron a las proporciones veto/efector indicadas. La actividad de veto se analizo mediante analisis FACS 3 dfas despues del inicio de la RLM, para monitorizar la inhibicion de la expansion de celulas 2c CD8+1B2+. Los resultados se presentan como media ± SD del porcentaje de inhibicion de cinco experimentos independientes. Figura 12B, analisis FACS de niveles de Anexina V en celulas 2c (7AAD-) CD8+1B2+ vivas, al final de la RLM, sembradas en placas con o sin celulas de veto a una proporcion de veto/efector de 0,02. Los resultados se presentan como media ± SD del porcentaje de Anexina V en siete experimentos independientes. Figura 12C, la RLM se establecio como en A. La inhibicion de la expansion de celulas 2c se evaluo cuando se anadieron celulas de veto derivadas de ratones C3B6F1 "espedficos" de CB6 (H-2bd,"espec"') o "no espedficos" (H-2bk,"no espec"') a una proporcion de veto/efector de 0,02. Los resultados se presentan como media ± SD del porcentaje de inhibicion de cuatro experimentos independientes. Las celulas 2c tambien se analizaron para niveles de Anexina V (figura 12D). Figura 12E ratones BALB/c irradiados letalmente (8 Gy) recibieron 4x106 celulas de MO de C57BL/6- DESNUDOS y 1,25x104 celulas T singenicas. A los ratones se les trasplantaron a continuacion 2-10x106 'Tcm' de CB6 CD8+ purificadas, que se analizaron para el fenotipo CD62L antes de la transferencia adoptiva (panel izquierdo, “Tcm”). Los ratones fueron sacrificados 4 dfas despues de la transferencia adoptiva, y los Gl se recogieron y se machacaron; la expresion de CD62L en celulas T CD8+ de CB6, aisladas a partir de los GL, se analizo mediante FACS (panel derecho, “Tcm de GL”). Se presenta un resultado representativo de 'Tcm' aisladas a partir de GL de un raton de 20 ratones ensayados en cuatro experimentos independientes. En las figuras 12A- F, (***) representa valor p<0,001, (**) representa valor p<0,01 y (*) representa valor p<0,05.
Las figuras 13A-D son graficos que muestran que las Tcm eliminan espedficamente celulas T anti-donante in- vivo. Figuras 13A-B - Ratones C57BL/6 irradiados letalmente (10 Gy) recibieron 1x105 celulas 2c CD8+ purificadas y 5x105 esplenocitos de BALB/c irradiados. Al dfa siguiente, a los ratones se les trasplantaron 1x106 celulas de MO de C57BL/6-DESNUDOS o recibieron, ademas, 5x106 “Tcm” “espedficas”, derivadas de CB6 (barras negras), o “no espedficas”, derivadas de C57BL/6 (barras grises) purificadas. Los receptores fueron sacarificados 8 dfas post-trasplante, se recogieron sus bazos, y la eliminacion de celulas T 2c se monitorizo mediante FACS. (A) Resultado representativo que demuestra el nivel de celulas 2c (7AAD-) supervivientes en ausencia (panel izquierdo, “2c en solitario”) o presencia de 'Tcm' “espedficas” (panel derecho “2c+Tcm espedficas”). (B) Cuantificacion de resultados que miden la inhibicion de las celulas 2c mediante “Tcm” “espedficas” y “no espedficas”. Los datos representan promedio ± SD del porcentaje de inhibicion de al menos 10 animales en cada grupo, combinados de dos experimentos independientes. Figuras 13C-D - El modelo de
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TMO singenico se establecio como en A-B, pero se administraron 5x105 celulas 2c CD8+ purificadas y 2,5x106 esplenocitos de BALB/c irradiados. Los receptores fueron sacarificados 8 d^as post-trasplante, se recogieron sus bazos y se llevo a cabo analisis FACS de los niveles de Anexina V en celulas 2c (7AAD-) CD8+1B2+ vivas. Figura 13C - Resultado representativo que demuestra los niveles de Anexina V en celulas 2c en ausencia (panel izquierdo, “2c en solitario”) o presencia de “Tcm” “espedficas” (panel derecho “2c+Tcm espedficas”). Figura 13D - Cuantificacion de resultados que miden los niveles de Anexina V en las celulas 2c despues de las interacciones con “Tcm” “espedficas” o “no espedficas”. Los datos presentan promedio ± SD del porcentaje de niveles de Anexina V en al menos cuatro animales de cada grupo, en un experimento representativo, de los tres realizados. (**) Representa valor p<0,01 (***) Representa valor p<0,001.
Descripcion de realizaciones espedficas de la invencion
La presente invencion, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a celulas anti-terceros que no inducen EICH que comprenden fenotipo de linfocitos T de memoria central y, mas particularmente, aunque no exclusivamente, a la generacion de las mismas y el uso de las mismas en trasplante y en tratamiento de enfermedades.
Los principios y el funcionamiento de la presente invencion pueden entenderse mejor con referencia a los dibujos y las descripciones adjuntas.
Antes de explicar al menos una realizacion de la invencion en detalle, debe entenderse que la invencion no esta necesariamente limitada en su solicitud a los detalles expuestos en la siguiente descripcion o ejemplificada mediante los ejemplos. La invencion es capaz de otras realizaciones o de ser puesta en practica o llevarse a cabo de diversas maneras. Ademas, debe entenderse que la fraseologfa y la terminologfa empleada en el presente documento son con el fin de descripcion y no deben considerarse como limitantes.
Mientras se reduce la presente invencion a la practica, el inventor de la presente invencion ha descubierto una nueva poblacion de celulas T de memoria central (Tcm) anti-terceros que anida en los ganglios linfaticos despues del trasplante e induce tolerancia sin inducir una reaccion de injerto contra huesped (ICH).
Tal como se muestra a continuacion en el presente documento y en la seccion de ejemplos que sigue, el inventor de la presente invencion ha generado una nueva poblacion de celulas Tcm que inducen tolerancia exponiendo en primer lugar a celulas T CD8+ a un estfmulo anti-terceros en ausencia de citocinas durante 2 dfas y a continuacion cultivando las celulas resultantes en presencia de IL-15 en un entorno libre de antfgenos durante 2 semanas (vease la figura 2C). Las celulas Tcm generadas por el inventor de la presente invencion comprendfan un fenotipo de Tcm (por ejemplo celulas que expresan CD44+CD62L+, figura 2B) y anidaban en los ganglios linfaticos despues del trasplante (figuras 3A-B). Ademas, estas celulas eran claramente visibles en los ganglios linfaticos varios dfas despues del trasplante (figuras 5B y 6A-E). El destacable efecto de tolerancia de las celulas Tcm de la presente invencion era evidente despues de cotrasplante de medula osea empobrecida en celulas T (MOET) junto con las celulas Tcm anti-terceros en receptores sin ningun tratamiento adicional (figuras 7, 10 y 11). Estas celulas Tcm presentaban fuerte proliferacion y prolongada persistencia en receptores de trasplante de MO (figura 6K y figuras 9C-E). El uso de las celulas Tcm anti-terceros permitio la aceptacion de injerto sin enfermedad de injerto contra huesped (EICH), tal como se muestra en las figuras 12 y 13. Tomados conjuntamente, todos estos descubrimientos corroboran el uso de celulas Tcm anti-terceros como celulas que facilitan el injerto para uso en la supervivencia a largo plazo de trasplantes.
Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invencion, se proporciona una poblacion de celulas aislada que comprende celulas anti-terceros que no inducen EICH que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo las celulas, celulas que inducen tolerancia y capaces de dirigirse a los ganglios linfaticos despues de un trasplante.
La frase “poblacion de celulas aislada”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a celulas que han sido aisladas de su entorno natural (por ejemplo, el cuerpo humano).
La expresion “sin EICH”, tal como se usa en el presente documento, se refiere que no tiene sustancialmente ninguna reactividad de induccion de injerto contra huesped. Por lo tanto, las celulas de la presente invencion se generan para no causar significativamente enfermedad de injerto contra huesped (EICH) tal como se pone de manifiesto mediante supervivencia, peso y aspecto global de los ratones trasplantados 100 dfas despues del trasplante.
La frase “celulas anti-terceros”, tal como se usa en el presente documento, se refiere un linfocitos (por ejemplo linfocitos T) que estan dirigidos (por ejemplo mediante reconocimiento de celulas T) contra un antfgeno o antfgenos de terceros.
Tal como se usa en el presente documento, la frase “antigeno o antfgenos de terceros” se refiere a un antfgeno o antfgenos solubles o insolubles (tales como asociados a membrana) que no estan presentes en el donador o el receptor, tal como se representa en detalle a continuacion.
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Por ejemplo, antfgenos de terceros pueden ser celulas de terceros, antigenos de virus, tales como por ejemplo, virus Epstein-Barr (VEB) o citomegalovirus (CMV) o antfgenos de bacterias, tales como flagelina. Los antfgenos virales o bacterianos pueden ser presentados por celulas (por ejemplo, lmea celular) infectadas con ellos o a las que se hizo de otro modo expresar protemas virales/bacterianas. Pueden usarse celulas que presentan antfgenos autologos o no autologos para presentar peptidos sinteticos cortos fusionados o cargados en ellos. Dichos peptidos cortos pueden ser peptidos derivados de virus o peptidos que representan cualquier otro antigeno.
Puede usarse software dedicado para analizar secuencias virales u otras para identificar peptidos cortos inmunogenos, es decir, peptidos presentables en el contexto de CMH de clase I o CMH de clase II.
Celulas de terceros pueden ser alogenicas o xenogenicas con respecto al receptor (explicadas con mas detalle a continuacion en el presente documento). En el caso de celulas de terceros alogenicas, dichas celulas tienen antfgenos ALH diferentes de los del donador pero que no son reactivos de forma cruzada con los antfgenos ALH del receptor, de modo que celulas anti-terceros generados contra dichas celulas no son reactivos contra un trasplante o antfgenos del receptor.
De acuerdo con una realizacion de la presente invencion, las celulas de terceros alogenicas o xenogenicas son celulas estimuladoras seleccionadas entre el grupo que consiste en celulas purificadas a partir de linfocitos de la sangre periferica (LSP), bazo o ganglios linfaticos, LSP movilizados por citocinas y celulas dendnticas presentadoras de antfgenos expandidas in vitro (CPA).
Antfgenos de terceros pueden presentarse en las superficies celulares, virales o bacterianas o derivarse y/o purificarse a partir de ellas. Adicionalmente, un antfgeno viral o bacteriano puede ser presentado en una celula infectada y un antfgeno celular puede presentarse en un vehmulo artificial tal como un liposoma.
Ademas, antfgenos de terceros pueden ser, por ejemplo, protemas extrafdas o purificadas a partir de diversas fuentes. Un ejemplo de una protema purificada que puede servir como un antfgeno de terceros de acuerdo con la presente invencion es ovoalbumina. Estan previstos otros ejemplos.
Utilizar celulas, virus, bacterias, celulas infectadas por virus, infectadas por bacterias, que presentan peptidos virales o peptidos bacterianos como antfgenos de terceros es particularmente ventajoso, dado que dichos antfgenos de terceros incluyen una diversa disposicion de determinantes antigenicos y, por lo tanto, dirigen la formacion de celulas anti-terceros de una poblacion diversa, que pueden servir ademas en la reconstitucion mas rapida de celulas T en casos donde se requiere dicha reconstitucion, por ejemplo, despues de irradiacion letal o subletal o un procedimiento de quimioterapia.
Ademas, cuando celulas anti-terceros se dirigen contra antfgenos de terceros, es plausible obtener al menos alguna actividad de celula de injerto contra enfermedad (por ejemplo celula cancerosa tal como injerto contra leucemia) debido a destruccion independiente de TCR mediada por union a LFA1-I/CAM1 [Arditti et al., Blood (2005) 105(8): 3365-71. Publicacion en lmea 6 de julio de 2004].
De acuerdo con algunas realizaciones, las celulas anti-terceros de la presente invencion comprenden a fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm).
La frase “fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm)”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un subconjunto de celulas T citotoxicas que anidan en los ganglios linfaticos. Las celulas que tienen el fenotipo Tcm, en seres humanos, normalmente comprenden CD8+/CD62L+/CD45RO+/L-selectina+/CD45RA-. De acuerdo con una realizacion mas espedfica, el fenotipo Tcm comprende CD8+/CD62L+/CCR7+/CD45RO+/L-selectina+/CD45RA. Se apreciara que las celulas Tcm pueden expresar todos los marcadores de distintivo en una unica celula o pueden expresar solamente parte de los marcadores de distintivo en una unica celula.
Se apreciara que al menos al menos el 30 %, al menos el 40 %, el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 100 % de la poblacion de celulas aislada comprenden celulas que tienen el distintivo celular de Tcm.
Tal como se ha mencionado, las celulas Tcm normalmente anidan en los ganglios linfaticos despues del trasplante. De acuerdo con algunas realizaciones, las celulas Tcm anti-terceros de la presente invencion pueden dirigirse a cualquiera de los ganglios linfaticos despues del trasplante, como por ejemplo, los ganglios linfaticos perifericos y los ganglios linfaticos mesentericos (tal como se representa en detalle en el ejemplo 4 de la seccion de ejemplos que siguen). La naturaleza migratoria de estas celulas les permite ejercer su efecto de tolerancia de manera rapida y eficiente.
Por lo tanto, las celulas Tcm anti-terceros de la presente invencion son celulas que inducen tolerancia.
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La frase “celulas que inducen tolerancia”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a celulas que provocan un menor grado de respuesta de las celulas del receptor (por ejemplo celulas T del receptor) cuando entran en contacto con las mismas. Las celulas que inducen tolerancia incluyen celulas de veto (es decir, celulas T que causan apoptosis de celulas T del huesped tras el contacto con las mismas) tal como se describio anteriormente en las publicaciones PCT N.°WO 2001/049243 yWO 2002/102971.
De acuerdo con algunas realizaciones, las celulas Tcm de la presente invencion pueden ser celulas indiferenciadas (por ejemplo no modificadas geneticamente) o celulas modificadas geneticamente (por ejemplo celulas que han sido manipuladas geneticamente para expresar o no expresar genes, marcadores o peptidos espedficos o para secretar o no secretar citocinas espedficas). Cualquier metodo conocido en la tecnica puede ser implementado en la manipulacion genetica de las celulas, tales como mediante inactivacion de los uno o mas genes relevantes o mediante insercion de un ARN antisentido que interfiere en la expresion de polipeptidos (vease, por ejemplo el documento WO/2000/039294, que se incorpora por el presente como referencia).
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, se proporciona un metodo de generacion de la poblacion de celulas aislada, comprendiendo el metodo: (a) poner en contacto celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP) no singenicas con un antfgeno o antfgenos de terceros en condiciones que permitan la eliminacion de celulas reactivas en ICH; y (b) cultivar las celulas resultantes de la etapa (a) en presencia de IL-15 en condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden el fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm).
Realizaciones espedficas del metodo descrito anteriormente se proporcionan en detalle en los ejemplos 1 y 3, a continuacion en el presente documento. Por lo tanto, de acuerdo con una realizacion ejemplar de la invencion, las celulas anti-terceros se generan poniendo el contacto en primer lugar celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP) no singenicas con un antfgeno o antfgenos de terceros en un cultivo derivado de citocinas (por ejemplo sin la adicion de citocinas). Esta etapa se lleva a cabo normalmente durante aproximadamente 2 dfas y permite la eliminacion de celulas reactivas en ICH (por ejemplo, celulas T). A continuacion, las celulas anti-terceros se cultivan en presencia de IL-15 durante un periodo de aproximadamente 14 dfas en un entorno libre de antfgenos. El cultivo puede efectuarse, ademas, en presencia de citocinas adicionales tales como IL-7 y/o IL-21. Este proceso permite la proliferacion de celulas anti-terceros que comprenden un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) y que estan privadas de reactividad de EICH.
Se apreciara que puede llevarse a cabo una etapa adicional que permite la seleccion de celulas CD8+, tal como mediante el uso de perlas MACS, antes de cultivar las celulas en presencia de IL-15. Dicha etapa puede ser beneficiosa con el fin de incrementar la pureza de las celulas CD8+ dentro del cultivo (es decir eliminar otros linfocitos dentro del cultivo celular, por ejemplo celulas T CD4+) o con el fin de incrementar el numero de celulas T CD8+.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las CMSP no singenicas de la presente invencion pueden ser alogenicas o xenogenicas con respecto al sujeto (se explican con mas detalle a continuacion en el presente documento). La fuente de las CMSP se determinara con respecto al uso pretendido de las celulas (vease detalles adicionales a continuacion en el presente documento) y esta bien dentro de la capacidad de un experto en la materia, especialmente a la luz de la divulgacion detallada proporcionada en el presente documento.
Se apreciara que tambien pueden usarse CMSP singenicas (por ejemplo del sujeto) de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion (es decir en situaciones cuando celulas Tcm singenicas pueden ser beneficiosas para el tratamiento, vease detalles a continuacion). La generacion de dichas celulas puede llevarse a cabo tal como se ha descrito en detalle para celulas no singenicas.
El uso de celulas que inducen tolerancia es especialmente beneficioso en situaciones en las que existe una necesidad de eliminar rechazo de injerto y superar enfermedad de injerto contra huesped (EICH), tal como en el trasplante de celulas o tejidos alogenicos o xenogenicos.
Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo de tratamiento de un sujeto que necesita un trasplante de celulas o de tejido, comprendiendo el metodo realizar un trasplante de celulas o de organos en el sujeto y administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de la poblacion de celulas aislada.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “tratar” incluye abolir, sustancialmente inhibir, ralentizar o revertir la progresion de una afeccion, mejorando sustancialmente smtomas clmicos o esteticos de una afeccion o previniendo sustancialmente la aparicion de smtomas clmicos o esteticos de una afeccion.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “sujeto” o “sujeto que lo necesita” se refiere a un mamffero, preferentemente un ser humano, masculino o femenino de cualquier edad, que necesita un trasplante de celulas o de tejido. Normalmente el sujeto necesita un trasplante de celulas o de tejido (tambien denominado en el presente documento receptor) debido a un trastorno o una afeccion, estado o smdrome patologico o no deseado, o una anomalfa ffsica, morfologica o fisiologica que es viable para el tratamiento mediante trasplante de celulas o de tejido.
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A continuacion en el presente documento, se proporcionan ejemplos de dichos trastornos.
Tal como se usa en el presente documento, la frase “trasplante de celulas o de tejido” se refiere a una celula corporal (por ejemplo una unica celula o un grupo de celulas) o tejido (por ejemplo tejidos solidos o tejidos blandos, que pueden ser trasplantados en todo o en parte). Los tejidos ejemplares que pueden trasplantarse de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion incluyen, aunque sin limitarse a, tejidos de hngado, pancreas, bazo, rinon, corazon, pulmon, piel, intestino y linfoide/hematopoyetico (por ejemplo ganglios linfaticos, placas de Peyer, timo o medula osea). Las celulas ejemplares que pueden trasplantarse de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion incluyen, aunque sin limitarse a, celulas hematopoyeticas inmaduras. Ademas, la presente invencion tambien contempla el trasplante de organos completos, tales como por ejemplo, rinon, corazon, tngado o piel.
Dependiendo de la aplicacion, el metodo puede efectuarse usando una celula o tejido que es singenico o no singenico con el sujeto.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “singenico” se refiere a una celula o tejido que se deriva de un individuo que es esencialmente geneticamente identico al sujeto. Normalmente, mairnferos esencialmente completamente consangumeos, clones de mai^eras, o mai^eras gemelos homocigoticos son singenicos.
Los ejemplos de celulas o tejidos singenicos incluyen celulas o tejidos derivados del sujeto (tambien denominados en la tecnica “autologos”), un clon del sujeto, o un gemelo homocigotico del sujeto.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion “no singenico” se refiere a una celula o tejido que se deriva de un individuo que es alogenico o xenogenico con los linfocitos del sujeto.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “alogenico” se refiere a una celula o tejido que se deriva de un donador que es de la misma especie que el sujeto, pero que es sustancialmente no clonal con el sujeto. Normalmente, mamnferos no consangumeos, gemelos no cigoticos de la misma especie son alogenicos entre st Se apreciara que un donante alogenico puede ser identico a ALH o no identico a ALH con respecto al sujeto.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “xenogenico” se refiere a una celula o tejido que sustancialmente expresa antfgenos de una especie diferente con respecto a la especie de una proporcion sustancial de los linfocitos del sujeto. Normalmente, mai^eras no consangumeos de diferentes especies son xenogenicos entre st
La presente invencion preve que celulas o tejidos xenogenicos se deriven de diversas especies tales como, aunque sin limitarse a, bovinos (por ejemplo, vaca), equidos (por ejemplo, caballo), porcinos (por ejemplo cerdo), ovidos (por ejemplo, cabra, oveja), felinos (por ejemplo, Felis domestica), caninos (por ejemplo, Canis domestica), roedores (por ejemplo, raton, rata, conejo, cobaya, jerbo, hamster) o primates (por ejemplo, chimpance, mono Rhesus, macaco, titf).
Celulas o tejidos de origen xenogenico (por ejemplo origen porcino) se obtienen preferentemente de una fuente que se sabe que esta libre de zoonosis, tal como retrovirus endogenos porcinos. Analogamente, celulas o tejidos derivados de ser humano se obtienen preferentemente de fuentes sustancialmente libres de patogenos.
De acuerdo con una realizacion de la presente invencion, tanto el sujeto como el donante son seres humanos.
Dependiendo de la aplicacion y las fuentes disponibles, las celulas o tejidos de la presente invencion pueden obtenerse de un organismo prenatal, organismo postnatal, un adulto o un donante cadaver. Ademas, dependiendo de la aplicacion necesaria, las celulas o tejidos pueden ser indiferenciados o geneticamente modificados. Dichas determinaciones estan bien dentro de la capacidad de un experto en la materia.
Puede emplearse cualquier metodo conocido en la tecnica para obtener una celula o tejido (por ejemplo, para trasplante).
El trasplante de la celula o tejido en el sujeto puede efectuarse de numerosas maneras, dependiendo de diversos parametros, tales como, por ejemplo, el tipo de celula o de tejido; el tipo, estadio o gravedad de la enfermedad del receptor (por ejemplo, insuficiencia organica); los parametros ffsicos o fisiologicos espedficos del sujeto; y/o el desenlace terapeutico deseado.
La realizacion de un trasplante de celulas o de tejido de la presente invencion puede efectuarse trasplantando el trasplante de celulas o de tejido en una cualquiera de diversas ubicaciones anatomicas, dependiendo de la aplicacion. El trasplante de celulas o de tejido puede trasplantarse en una ubicacion anatomica homotopica (una ubicacion anatomica normal para el trasplante), o en una ubicacion anatomica ectopica (una ubicacion anatomica anormal para el trasplante). Dependiendo de la aplicacion, el trasplante de celulas o de tejido puede implantarse ventajosamente bajo la capsula renal, o en el rinon, la grasa testicular, el tejido subcutaneo, el omento, la vena porta, el hngado, el bazo, la cavidad cardiaca, el corazon, la cavidad toracica, el pulmon, la piel, el pancreas y/o el
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espacio intraabdominal.
Por ejemplo, un tejido hepatico de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion puede trasplantarse en el hngado, la vena porta, la capsula renal, el tejido subcutaneo, el omento, el bazo y el espacio intraabdominal. El trasplante de un hngado en diversas ubicaciones anatomicas tales como estas se realiza comunmente en la tecnica para tratar enfermedades susceptibles de tratamiento mediante trasplante hepatico (por ejemplo insuficiencia hepatica). Analogamente, el trasplante de un tejido pancreatico de acuerdo con la presente invencion puede efectuarse ventajosamente trasplantando el tejido en la vena porta, el hngado, el pancreas, la grasa testicular, el tejido subcutaneo, el omento, un asa intestinal (la subserosa de un asa en U del intestino delgado) y/o el espacio intraabdominal. El trasplante de tejido pancreatico puede usarse para tratar enfermedades susceptibles a tratamiento mediante trasplante pancreatico (por ejemplo diabetes). Del mismo modo, el trasplante de tejidos tales como un rinon, un corazon, un pulmon o tejido cutaneo puede llevarse a cabo en cualquier ubicacion anatomica descrita anteriormente con el fin de tratar receptores que padecen, por ejemplo, insuficiencia renal, insuficiencia cardiaca, insuficiencia pulmonar o dano cutaneo (por ejemplo, quemaduras).
El metodo de la presente invencion tambien puede usarse, por ejemplo, para tratar a un receptor que padece una enfermedad que requiere trasplante de celulas hematopoyeticas inmaduras.
En el ultimo caso, celulas hematopoyeticas alogenicas o xenogenicas inmaduras (incluyendo celulas madre) que pueden derivarse, por ejemplo, de medula osea, sangre periferica movilizada (mediante por ejemplo leucoferesis), hngado fetal, saco vitelino y/o sangre del cordon umbilical del donante y que son preferentemente celulas hematopoyeticas inmaduras CD34+ empobrecidas en celulas T, pueden trasplantarse a un receptor que padece una enfermedad. Dicha enfermedad incluye, aunque sin limitarse a, leucemia tal como leucemia linfoblastica aguda (LLA), leucemia no linfoblastica aguda (LNLA), leucemia mielocftica aguda (LMA) o leucemia mielocftica cronica (LMC), smdromes de inmunodeficiencia combinada grave (IDCG), incluyendo adenosina desaminasa (ADA), osteopetrosis, anemia aplasica, enfermedad de Gaucher, talasemia y otras anomaftas hematopoyeticas congenitas o determinadas geneticamente.
Se apreciara que las celulas hematopoyeticas alogenicas o xenogenicas inmaduras de la presente invencion pueden trasplantarse en un receptor usando cualquier metodo conocido en la tecnica para el trasplante de celulas, tal como aunque sin limitarse a, infusion celular (por ejemplo I.V.) o mediante una via intraperitoneal.
Opcionalmente, cuando se trasplanta un trasplante de celulas o de tejido de la presente invencion en un sujeto que tiene un organo defectuoso, puede ser ventajoso en primer lugar extirpar, al menos parcialmente, el organo con insuficiencia del sujeto para permitir el desarrollo optimo del trasplante, y la integracion estructural/funcional del mismo con la anatoirna/fisiologfa del sujeto.
El metodo de la presente invencion tambien preve cotrasplante de varios organos (por ejemplo tejidos cardiacos y pulmonares) en caso de que dicho procedimiento pueda tener efectos beneficiosos para el sujeto.
Despues de trasplante del trasplante de celulas o de tejido en el sujeto de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion, es previsible, de acuerdo con la practica medica estandar, monitorizar la funcionalidad del crecimiento y la inmuno-compatabilidad del organo de acuerdo con una cualquiera de diversas tecnicas estandar en la tecnica. Por ejemplo, la funcionalidad de un trasplante de tejido pancreatico puede monitorizarse siguiendo el trasplante mediante ensayos estandar de la funcion pancreatica (por ejemplo analisis de los niveles sericos de insulina). Del mismo modo, un trasplante de tejido hepatico puede monitorizarse despues del trasplante mediante ensayos estandar de la funcion hepatica (por ejemplo analisis de los niveles sericos de albumina, protema total, ALT, AST y bilirrubina, y analisis del tiempo de coagulacion sangumea). El desarrollo estructural de las celulas o tejidos puede monitorizarse mediante tomograffa computarizada, o imaginologfa ultrasonica.
Dependiendo del contexto del trasplante, con el fin de facilitar el prendimiento del trasplante de celulas o de tejido, el metodo puede, mas ventajosamente, comprender acondicionar el sujeto con un regimen inmunosupresor antes de, conjuntamente con o despues de trasplantar el trasplante de celulas o de tejido.
Los ejemplos de tipos adecuados de regfmenes inmunosupresores incluyen administracion de farmacos inmunosupresores, poblaciones de celulas que inducen tolerancia (tal como se describe en detalle a continuacion en el presente documento), y/o irradiacion inmunosupresora.
En la bibliograffa de la tecnica se proporciona amplia orientacion para seleccionar y administrar regfmenes inmunosupresores para trasplante (por ejemplo, consultar: Kirkpatrick CH. y Rowlands DT Jr., 1992. JAMA. 268, 2952; Higgins RM. et al., 1996. Lancet 348, 1208; Suthanthiran M. y Strom Tb., 1996. New Engl. J. Med. 331, 365; Midthun DE. et al., 1997. Mayo Clin Proc. 72, 175; Morrison VA. et al., 1994. Am J Med. 97, 14; Hanto DW., 1995. Annu Rev Med. 46, 381; Senderowicz AM. et al., 1997. Ann Intern Med. 126, 882; Vincenti F. et al., 1998. New Engl. J. Med. 338, 161; Dantal J. et al. 1998. Lancet 351, 623).
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Preferentemente, el regimen inmunosupresor consiste en administrar al menos un agente inmunosupresor al sujeto.
Los ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen, aunque sin limitarse a, metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina (sulfasalazopirina), sales de oro, D- penicilamina, leflunomida, azatioprina, anakinra, infliximab (REMICADE), etanercept, bloqueantes de TNF-alfa, un agente biologico que se dirige a una citocina inflamatoria y antiinflamatorios no esteroides (AINE). Los ejemplos de AINE incluyen, aunque sin limitarse a, acido acetil salidlico, salicilato de colina y magnesio, diflunisal, salicilato de magnesio, salsalato, salicilato de sodio, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina, quetoprofeno, quetorolac, meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tolmetina, acetaminofeno, ibuprofeno, inhibidores de COX-2, tramadol, rapamicina (sirolimus) y analogos de rapamicina (por ejemplo, CCI-779, RAD001, AP23573). Estos agentes pueden administrarse individualmente o en combinacion.
Independientemente del tipo de trasplante, para evitar el rechazo del injerto y la enfermedad de injerto contra huesped, el metodo de la presente invencion utiliza las novedosas celulas Tcm anti-terceros (tal como se ha descrito en detalle anteriormente en el presente documento).
De acuerdo con el metodo de la presente invencion, estas celulas Tcm anti-terceros se administran conjuntamente con, antes de o despues de trasplantar el trasplante de celulas o de tejido.
Las celulas Tcm anti-terceros pueden administrarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica para el trasplante de celulas, tal como aunque sin limitarse a, infusion de celulas (por ejemplo I.V.) o mediante una via intraperitoneal.
Sin desear quedar ligados a la teona, una cantidad terapeuticamente eficaz es una cantidad de celulas Tcm anti- terceros eficientes para tolerizacion, efecto anti-tumoral y/o reconstitucion inmunitaria sin inducir EICH. Dado que las celulas Tcm de la presente invencion anidan en los ganglios linfaticos despues del trasplante, pueden ser necesarias cantidades menores de celulas (en comparacion con la dosis de celulas usada previamente, vease por ejemplo el documento WO 2001/049243) para conseguir el uno o mas efectos beneficiosos de las celulas (por ejemplo tolerizacion, efecto anti-tumoral y/o reconstitucion inmunitaria). Se apreciara que pueden ser necesarios niveles mas bajos de farmacos inmunosupresores, junto con las celulas Tcm de la presente invencion (tal como exclusion de rapamicina del protocolo terapeutico).
La determinacion de la cantidad terapeuticamente eficaz esta bien dentro de la capacidad de los expertos en la materia, especialmente a la luz de la divulgacion detallada proporcionada en el presente documento.
Para cualquier preparacion usada en los metodos de la invencion, la cantidad o dosis terapeuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo in vitro y celular. Por ejemplo, una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir una concentracion o valor cuantitativo deseado. Dicha informacion puede usarse para determinar, de forma mas precisa, dosis utiles en seres humanos.
Por ejemplo, en el caso de trasplante de tejido, el numero de celulas Tcm anti-terceros infundidas en un receptor debe ser mayor de 1 x 104 /kg de peso corporal. El numero de celulas Tcm anti-terceros infundidas en un receptor normalmente debe estar en el intervalo de 1 x 104/kg de peso corporal a 1 x 108/kg de peso corporal.
Por lo tanto, las novedosas celulas Tcm anti-terceros de la presente invencion pueden usarse como terapia adyuvante para un trasplante de celulas o de tejido (tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento). Ademas, las novedosas celulas Tcm de la presente invencion tambien estan dotadas de actividad de injerto contra celulas enfermas (descrita en detalle anteriormente) y, por lo tanto, pueden usarse per se para el tratamiento de enfermedades.
De acuerdo con una realizacion espedfica, con el fin de obtener una actividad de injerto contra celulas enfermas (por ejemplo efecto anti-tumoral tal como tratamiento anti-leucemia), pueden usarse celulas singenicas asf como celulas no singenicas.
Por lo tanto, el metodo de la presente invencion puede aplicarse para tratar cualquier enfermedad tal como, aunque sin limitarse a, una enfermedad maligna, una enfermedad asociada con el trasplante de un injerto, una enfermedad infecciosa tal como una enfermedad vmca o una enfermedad bacteriana, una enfermedad inflamatoria y/o una enfermedad autoinmunitaria.
Enfermedades que pueden tratarse usando los metodos de la presente invencion incluyen, aunque sin limitarse a, enfermedades malignas tales como leucemia [por ejemplo, linfatica aguda, linfoblastica aguda, linfoblastica aguda pre-celulas B, leucemia de celulas T linfoblastica aguda, aguda - megacarioblastica , monodtica, mielogena aguda, mieloide aguda, mieloide aguda con eosinofilia, de celulas B, de basofilos, mieloide cronica, cronica, de celulas B, eosinofflica, de Friend, granulodtica o mieloide, de celulas pilosas, linfocftica, megacarioblastica, monoctica, monodtica-de macrofagos, mieloblastica, mieloide, mielomonocftica, de celulas plasmaticas, pre-celulas B, promielocftica, subaguda, de celulas T, neoplasia linfoide, predisposicion a neoplasias mieloides, leucemia no
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linfocftica aguda, leucemia linfocftica aguda de celulas T (LLA-T) y leucemia linfocftica cronica de celulas B (LLC-B)], linfoma (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, de celulas B, de Burkitt, de celulas T cutaneas, histiodtico, linfoblastico, de celulas T, del timo), carcinoma, blastoma y sarcoma; enfermedades asociadas con el trasplante de un injerto (por ejemplo, rechazo de injertos, rechazo de injerto cronico, rechazo de injerto subagudo, rechazo de injerto hiperagudo, rechazo agudo del injerto y enfermedad de injerto contra huesped); enfermedades infecciosas incluyendo, aunque sin limitarse a, enfermedades infecciosas cronicas, enfermedades infecciosas subagudas, enfermedades infecciosas agudas, enfermedades vfticas (por ejemplo, VEB, CMV, VIH), enfermedades bacterianas, enfermedades por protozoos, enfermedades parasitarias, enfermedades fungicas, enfermedades por micoplasma y enfermedades prionicas; enfermedades inflamatorias (por ejemplo, enfermedades inflamatorias cronicas y enfermedades inflamatorias agudas); y enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumaticas, enfermedades glandulares, enfermedades gastrointestinales, enfermedades cutaneas, enfermedades hepaticas, enfermedades neurologicas, enfermedades musculares, enfermedades renales, enfermedades relacionadas con la reproduccion, enfermedades del tejido conectivo y enfermedades sistemicas).
Por lo tanto, el metodo de la presente invencion puede aplicarse, ademas, ventajosamente al tratamiento de una enfermedad en un sujeto mientras se facilita conjuntamente el prendimiento de un trasplante de celulas o tejido singenico con las celulas Tcm anti-terceros (por ejemplo en situaciones en las que el trasplante de celulas o de tejido and y las celulas anti-terceros se derivan del mismo donante).
Tal como se usa en el presente documento, el termino “aproximadamente” se refiere a ± 10 %.
Los terminos “comprende”, “que comprende”, “incluye”, “que incluye”, “que tiene” y sus conjugados significan “incluyendo aunque sin limitarse a”.
La expresion “que consiste en” significa “que incluye y limitado a”.
El termino “que consiste esencialmente en” significa que la composicion, metodo o estructura puede incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solamente si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las caractensticas basicas y novedosas de la composicion, metodo o estructura reivindicada.
Tal como se usa en el presente documento, la forma singular “un”, “una” y “el/la” incluyen referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresion “un compuesto” o “al menos un compuesto” puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.
En toda esta solicitud, pueden presentarse diversas realizaciones de esta invencion en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripcion en formato de intervalo es meramente por comodidad y brevedad y no debe interpretarse como una limitacion inflexible al alcance de la invencion. Por consiguiente, debe considerarse que la descripcion de un intervalo ha desvelado espedficamente todos los posibles subintervalos asf como valores numericos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, debe considerarse que la descripcion de un intervalo tal como de 1 a 6 ha desvelado espedficamente subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., asf como numeros individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
En cualquier lugar en el que se indica un intervalo numerico en el presente documento, esto significa que incluye cualquier numero citado (fraccionario o entero) dentro del intervalo indicado. Las frases “que vana/vana entre” un primer numero indicado y un segundo numero indicado y “que vana/vana de” un primer numero indicado “hasta” un segundo numero indicado se usan en el presente documento de forma intercambiable y pretenden incluir los primer y segundo numeros indicados y todos los numeros fraccionario y enteros entre ambos.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “metodo” se refiere a maneras, medios, tecnicas y procedimientos para conseguir una tarea dada incluyendo, aunque sin limitarse a, aquellas maneras, medios, tecnicas y procedimientos conocidos por, o desarrollados facilmente a partir de maneras, medios, tecnicas y procedimientos conocidos por profesionales de las tecnicas qmmicas, farmacologicas, biologicas, bioqmmicas y medicas.
Se aprecia que deltas caractensticas de la invencion, que, por claridad, se describen en el contexto de realizaciones independientes, tambien pueden proporcionarse en combinacion con una realizacion individual. A la inversa, diversas caractensticas de la invencion, que, por brevedad, se describen en el contexto de una realizacion individual, tambien pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinacion adecuada o segun sea adecuado en cualquier otra realizacion de la invencion descrita. Ciertas caractensticas descritas en el contexto de diversas realizaciones no deben considerarse caractensticas esenciales de esas realizaciones, a menos que la realizacion sea inoperante sin esos elementos.
Diversas realizaciones y aspectos de la presente invencion tal como se han perfilado anteriormente en el presente documento y tal como se reivindica en la seccion de reivindicaciones a continuacion encuentran apoyo experimental
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en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
A continuacion se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invencion de manera no limitante.
Generalmente, la nomenclature usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invencion incluyen tecnicas moleculares, bioqmmicas, microbiologicas y de ADN recombinante. Dichas tecnicas se explican exhaustivamente en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, “Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 14, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologfas tal como se exponen en las patentes de Estados Unidos N.° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Current Protocols in Immunology” Volumenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8a Edicion), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular); inmunoensayos disponibles se describen exhaustivamente en la bibliograffa de patentes y cientifica, vease, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) y “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996); todos los cuales se incorporan como referencia tal como se describe en su totalidad en el presente documento. Otras referencias generales se proporcionan en todo este documento. Se cree que los procedimientos en ellos son bien conocidos en la tecnica y se proporcionan para la comodidad del lector. Toda la informacion contenida en ellos se incorpora en el presente documento como referencia.
EJEMPLO 1
Materiales y procedimientos experimental generales Animales
Ratones hembra de 6-12 semanas de edad BALB/c (H-2d), CB6 (H-2bd), FVB (H-2q), SJL (H-2s), C57BL/6 (H-2b), C3H (H-2k), BALB/C desnudos y C57BL/6 desnudos se obtuvieron del Weizmann Institute Animal Center (Rehovot, Israel). Se cruzaron ratones C3H y BALB/C para generar ratones (C3HxBALB/C)F1. Un par de cna de ratones transgenicos (Tg) H-2b que expresan el TCR del clon 2c de LTC con especificidad por H-2Ld fue proporcionado amablemente por Janko Nikolic-Zugic (Sloan-Kettering, NY). La progenie de estos ratones Tg se crio en el Weizmann Institute Animal Breeding Center. Todos los ratones se mantuvieron en jaulas pequenas (cinco animales por jaula) y se les alimento con alimento esteril y agua acida.
Preparacion de LTC anti-terceros de donante, no reactivos con el huesped
Se prepararon LTC anti-terceros, tal como se describio anteriormente por Bachar et al. [Bachar-Lustig et al., Blood. (2003) 102: 1943-1950]. En resumen, se cultivaron esplenocitos del raton donante contra esplenocitos de raton FVB irradiados (20 Gy). Los que respondfan (4 x 106/ml) y los estimuladores (4 x 106/ml) se cultivaron durante 6 dfas en un medio de cultivo tisular completo RPMI (MC) a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 %/aire. Seis dfas despues del inicio del cultivo, las celulas se fraccionaron sobre Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia Biotech AB) y la fraccion linfoide se sometio a seleccion positiva de celulas CD8+ usando partfculas magneticas BD IMag™ CD8 (BD Pharmingen). Las celulas aisladas (1 x 106/ml) se reestimularon con esplenocitos de terceros irradiados (20 Gy) (4 x 106/ml) y se anadio rIL-2 humana (40 U/ml, Eurocetus) al cultivo de reaccion de linfocitos mixto cada dos dfas. El dfa 16, los cultivos de RLM se recogieron, se fraccionaron sobre Ficoll-Paque y se analizaron mediante FACS para su pureza de CD8.
Preparacion de celulas Tcm anti-terceros
Se cultivaron esplenocitos de los ratones donantes contra esplenocitos de raton FVB de terceros irradiados (20 Gy) FVB. Los que respondfan (4 x 106/ml) y los estimuladores (4 x 106/ml) se cultivaron durante 60 horas en un medio de cultivo tisular completo RPMI (MC) a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 %/aire. 60 horas despues del inicio del cultivo, las celulas se fraccionaron sobre Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia Biotech AB) y la fraccion linfoide se sometio a seleccion positiva de celulas CD8+ usando partfculas magneticas BD IMag™ CD8 (BD Pharmingen). Las
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celulas aisladas (1 x 106/ml) se sembraron en placas con rIL-15 (20 ng/ml, R&D). El medio y las citocinas se sustituyeron cada dos dfas. El d^a 16, las celulas se recogieron, se fraccionaron sobre Ficoll-Paque y se analizaron mediante FACS para su pureza de Tcm (expresion de CD8, CD62L y CD44).
Modelo de rechazo de aloinjerto mediado por celulas T
Ratones huesped hembra (13-14 semanas de edad) se expusieron a una unica dosis de 10 Gy (acondicionamiento supraletal) de irradiacion corporal total el dfa -2. El dfa siguiente, los ratones recibieron por via intravenosa 1,25 x 104 celulas T del huesped no separadas. El trasplante de 3 x106 celulas de MO desnudas alogenicas se realizo el dfa 0 junto con las celulas de veto a evaluar.
Preparacion de celulas T del huesped
Esplenocitos de ratones huesped se fraccionaron sobre Ficoll/Paque y las celulas mononucleares aisladas se sometieron a una seleccion positiva de celulas T (CD4+ mas CD8+) mediante clasificacion celular magnetica (MACS).
Imaginolog^a in-vivo
Se incubaron 1 x 107 celulas diana con el colorante carbocianina lipofila cercana al infrarrojo (DIR, Invitrogen) en 10 ml de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) que contema 1,5 |ig/ml de colorante DIR y etanol al 0,5 % durante 60 minutos a temperatura ambiente. Seguidamente, las celulas se lavaron dos veces con PBS y la viabilidad de las celulas marcadas se verifico mediante tincion con azul de tripano. Las celulas marcadas con DIR se trasplantaron a continuacion, junto con MO empobrecida en T, en ratones huesped irradiados de forma supraletal a los que se infundio previamente celulas T del huesped purificadas como inductoras de rechazo del injerto (tal como se ha representado en detalle anteriormente). En el momento especificado despues del trasplante, los ratones se monitorizaron mediante el sistema de imaginologfa de cuerpo entero optico (IVIS® 100, Xenogen) acoplado con una camara de dispositivo de carga acoplada (CCD) Pixelfly QE (PCO, Kelheim, Alemania). El filtro de excitacion y emision instalado en el IVIS era de 710 a 760 nm y de 810 a 860 nm, respectivamente. El procesamiento de imagenes y el analisis de datos se realizaron usando el software Living Image 2.5.
Rastreo in - vivo de celulas CD8+ usando analisis citofluorimetrico
Se recogieron ganglios linfaticos, MO, hngados y bazos de ratones huesped sesenta horas y 6,5 dfas despues del trasplante de MO y transferencia adoptiva a las celulas diana (tal como se ha descrito para el protocolo de imaginologfa in-vivo anteriormente). Se preparo una unica suspension celular a partir de cada organo y las celulas se fraccionaron sobre Ficoll. Las celulas se tineron a continuacion con anticuerpos anti-H-2kb, anti-H-2Dd, anti-CD8 y anti-CD62L (BD bioscience), y se suspendieron en suspended un volumen constante de PBS. Se realizo analisis FACS en recuentos temporales fijos de cada muestra.
Ensayo para actividad de veto en el modelo de raton 2c TCR Tg
Celulas esplenicas de ratones 2c Tg H-2b, que expresan el TCR con especificidad por ratones H-2Ld se usaron en todo el ensayo como celulas efectoras en el ensayo de veto. Las celulas esplenicas se recogieron, se lisaron en tampon de lisis de globulos rojos (RBC) (tampon ACK) fno, para retirar globulos rojos, y se llevaron a una concentracion de 2 x 106 celulas /ml en medio de cultivo tisular completo RPMI (CTMC). Las celulas se estimularon a continuacion con esplenocitos de BALB/c irradiados (20 Gy) (2 x 106/ml) en presencia de las celulas de veto a evaluar (origen de CB6 H-2bd) a las concentraciones especificadas. Los cultivos se incubaron durante 72 horas en placas de 96 pocillos en forma de U. La eliminacion de celulas T efectoras espedficas se monitorizo mediante analisis citofluorimetrico que mide el nivel de celulas, CD8+ 2C vivas living [celulas negativas para 7- aminoactinomicina-D (7AAD; Invitrogen)], tenidas espedficamente mediante el anticuerpo 1B2, dirigido contra el TCR anti-H-2Ld clonotfpico. La actividad de inhibicion se calculo mediante la siguiente formula:
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El numero de celulaslB2+CD8+en el pocillo valorado El numero de celulas lB2+CD8+en el pocillo de control^,
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Evaluacion de apoptosis mediante citometna de flujo usando anexina V
Se tineron celulas (1-2 x 105) con Fitc-anexina V (MBL Medical & Biological Laboratories, Naka-ku Nagoya, Japon) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, las celulas se suspendieron en 100 |il de tampon de union (HEPES 10 mM/NaOH, pH 7,4; NaCl 140 mM; CaCl2 2,5 mM) y se incubaron durante 10 minutos. Las celulas se lavaron a continuacion con tampon de union y se analizaron mediante citometna de flujo.
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Analisis de quimerismo
El quimerismo se determino mediante citometna. Celulas de la sangre periferica se fraccionaron sobre Ficoll-Paque plus, y las celulas mononucleares aisladas de cada raton se tineron doblemente mediante inmunofluorescencia directa con anticuerpo monoclonal anti-H2d espedfico para el donante y anti-H2k espedfico para el huesped.
Analisis citometricos de flujo
Se realizo analisis FACS usando un FACScan de Becton Dickinson modificado. Las celulas se tineron con anticuerpos marcados espedficos para CD8a-PE/FITC/CPA, CD3-PE/FITC/CPA, CD62L-PE/FITC/CPA, CD44- PE/FITC/CPA, H2Kb-PE/FITC, H2Dd-PE/FITC, H2Kk-PE/FITC (BD Pharmigen), 1B2 biotiniladas y estreptavidina- CPA (Jackson Laboratories). Las tinciones con Anexina V y 7AAD se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BD Pharmigen).
Ensayo in-vitro para actividad de veto en el modelo en raton 2c TCR Tg.
El ensayo in-vitro para actividad de veto se realizo tal como se ha descrito anteriormente30 En resumen, se estimularon esplenocitos 2c con esplenocitos de BALB/c irradiados en presencia de las celulas de veto a evaluar a las concentraciones especificadas. Los cultivos se incubaron durante 72 h en placas de 96 pocillos. La eliminacion de celulas T efectoras espedficas se monitorizo mediante analisis FACS midiendo el nivel de celulas (7AAD-), CD8+ 2C supervivientes, tenidas espedficamente mediante el anticuerpo 1B2. La actividad inhibidora se calculo mediante la siguiente formula:
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El numero de celulaslB2+CD8+en el pocillo valorado El numero de celulas lB2+CD8+en el pocillo de control^
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Ensayo in-vivo para actividad de veto en el modelo en raton 2c TCR Tg.
Ratones C57BL/6 irradiados letalmente (10 Gy) recibieron 1x105 celulas 2c CD8+ purificadas (MACS) y 5x105 esplenocitos de BALB/c irradiados (20 Gy). Al dfa siguiente, a los ratones se les trasplantaron 1x106 celulas de MO de C57BL/6-DESNUDOS y 5x106 Tcm. Los receptores fueron sacarificados 8 dfas post-trasplante, se recogieron sus bazos, y la eliminacion de las celulas T 2c se monitorizo mediante FACS, tal como se ha descrito en la seccion anterior para el ensayo in-vitro.
Analisis estad^stico
El analisis de los datos de supervivencia se realizo usando curvas de Kaplan-Meier (ensayo de rangos logantmicos). La comparacion de los medios se llevo a cabo usando la prueba de la t de Student.
EJEMPLO 2
Patrones de anidamiento de LTC de veto anti-terceros (descritos anteriormente) en comparacion con celulas T nativas singenicas y alogenicas
Mientras se generaban LTC de veto no reactivos con el huesped, las celulas se sometieron a activacion ex-vivo prolongada contra estimuladores de terceros en presencia de IL-2. Como resultado, las celulas se han desarrollado probablemente a LTC efectores, que se demostro previamente que mostraban un fenotipo buscador de inflamacion con perdida de capacidades de anidamiento en los ganglios linfaticos (GL) [Reinhardt et al., Nature (2001) 410: 101105; Weninger et al., J Exp Med. (2001) 194: 953-966; Masopust et al., Science (2001) 291: 2413-2417]. Dicho patron migratorio podna ser una de las razones para la discrepancia entre eficiencia de LTC de veto anti-terceros in vitro e in vivo. Para ensayar esta posibilidad, el inventor de la presente invencion ha usado un modelo in-vivo para ensayar la eficacia de LTC de veto anti-terceros. Este modelo riguroso comprendfa ratones irradiados letalmente que recibieron medula osea empobrecida en celulas T alogenica (MOET) en presencia o ausencia de un numero graduado de celulas T del huesped que indujeron rechazo y anemia mortal en la tercera semana despues de trasplante de medula osea (TMO).
En resumen, ratones FVB irradiados de forma supraletal se protegieron de la radiacion con MOET alogenica de ratones Balb/c, en presencia o ausencia de celulas T del huesped purificadas y transferidas de forma adoptiva (CTH), lo que indujo rechazo del aloinjerto. A estos receptores de MO (que experimentaban rechazo de aloinjerto de MO) se les infundieron adicionalmente diferentes tipos de celulas T marcadas con colorante DIR que podfan ser rastreadas mediante un sistema de imaginologfa in-vivo (IVIS).
Tal como puede verse en las figuras 1A-D, 36 horas despues de la infusion de las celulas marcadas, celulas T singenicas (CTH) e indiferenciadas alogenicas mostraban anidamiento marcado en los GL, mientras que LTC de
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veto anti-terceros alogenicos (descritos anteriormente) se concentraban en el Imgado, los pulmones y la MO y estaban excluidas de los GL (figura 1D). La capacidad de las celulas T indiferenciadas alogenicas de colocalizarse con CTH implica que las celulas T alogenicas, que muestran el fenotipo apropiado, pueden dirigirse a los GL en el contexto del medio especial del modelo de rechazo del injerto.
EJEMPLO 3
Induccion de celulas Tcm anti terceros in vitro
El inventor de la presente invencion ha desarrollado previamente LTC anti-terceros que mostraban actividad de veto marcada (debido a su expresion de FasL) y que estan desprovistas de reactividad de EICH en virtud de su prolongada activacion contra un tercero [Bachar-Lustig et al., Blood. (2003) 102: 1943-1950]. Sin embargo, tal como se representa en el ejemplo 2 anteriormente, estas celulas muestran mal anidamiento en los GL. Estos resultados han llevado al inventor de la presente invencion a intentar mejorar adicionalmente la reactividad in-vivo de estas celulas intentando inducir fenotipo de memoria central (Tcm) en estas celulas tras su activacion contra una tercera parte. El fenotipo Tcm ha demostrado previamente estar asociado con celulas activadas (CD44+), que expresan, entre otros antfgenos de superficie, CD62L y CCR7 que permiten su anidamiento en los GL [Sallusto et al., Nature (1999) 401: 708-712; Weninger et al, anteriormente; Masopust et al., anteriormente].
Por lo tanto, el inventor de la presente invencion ha ensayado la capacidad de IL-2 o IL-15 para su capacidad para inducir fenotipo de Tcm en celulas T CD8+ anti-terceros. Dado que la reduccion de reactividad de ICH requena carencia de citocinas antes de la expansion en presencia de las citocinas ensayadas, se realizaron comparaciones entre los diferentes protocolos despues de periodos de privacion de citocinas de corta duracion y de larga duracion. Por lo tanto, las celulas T CD8+ experimentaron 2 dfas o 6 dfas de estimulacion con estimuladores de terceros irradiados, en ausencia de citocinas, y se cultivaron a continuacion en presencia de IL-2 o IL-15 y se monitorizaron para expresion de CD62L y CD44 (tal como se ha representado en detalle en el ejemplo 1, anteriormente en el presente documento).
Tal como se muestra en la figura 2A, despues de 60 horas de estimulacion con estimuladores de terceros, en ausencia de citocinas, las celulas T CD8+ manteman la expresion de CD62L (el 90 ± 5 % de las celulas expresaban CD62L), mientras que despues de 6 dfas de estimulacion, solamente el 18 + 6 % de las celulas T CD8+ manteman la expresion de CD62L (valor p < 0,001). En lmea con esta observacion, cuando las celulas T CD8+ se cultivaron adicionalmente con IL-15 en entorno libre de Ag, despues del periodo de estimulacion, significativamente mas celulas con fenotipo Tcm CD44+CD62L+ fueron inducidas los decimoquintos dfas del cultivo cuando las celulas experimentaron 60 horas de estimulacion (figuras 2B-C), en contraste con las celulas que experimentaron 6 dfas de estimulacion (valor p = 0,005). El uso de IL-2 no consiguio apoyar induccion significativa de celulas Tcm anti-terceros despues de corta (2 dfas) estimulacion de las celulas con terceros (figura 2B, valor p = 0,007).
Ademas, al final del periodo de cultivo, las LTC anti-terceros que experimentaron 6 dfas de estimulacion con terceros y se cultivaron posteriormente con IL-2 y se reactivaron con su Ag consangumeo, presentaban en su mayona un fenotipo efector y solamente el 4 ± 2 % de estas celulas habfan presentado un fenotipo Tcm (figura 2B), estos resultados estaban en lmea con el patron de anidamiento periferica de estas celulas descritas en el ejemplo 2, anteriormente (figura 1D).
Los resultados presentados indicaban que celulas T CD8+ (que se someten a un lago protocolo de activacion, por ejemplo 6 dfas) son menos propensas a cambiar a un fenotipo Tcm, estan en lmea con estudios previos que indicaban que hay una ventana temporal en la que celulas T activadas con Ag pueden ser impulsadas por IL-15 a un fenotipo Tcm [Manjunath et al., J Clin Invest. (2001) 108: 871-878; Carrio et al., J Immunol. (2004) 172: 7315-7323].
EJEMPLO 4
Comparacion del anidamiento en los GL de celulas Tcm con respecto a LTC de veto
Tal como se muestra en el ejemplo 3 anterior, los resultados de la presente invencion demostraron claramente que un fenotipo similar a Tcm podfa ser inducido mediante aloactivacion de corta duracion y cultivo de las celulas en un entorno libre de Ag en presencia de IL-15. Sin embargo, era importante validar, en las condiciones del modelo de rechazo del injerto, que las celulas que expresan este fenotipo similar a Tcm mostraban anidamiento en los GL superior en comparacion con el mostrada por LTC de veto.
Por lo tanto, las celulas Tcm (descritas en el presente documento) y LTC de veto (presentados anteriormente) se generaron tan como se ha descrito en el ejemplo 1, anteriormente en el presente documento. Despues de 2 semanas de expansion in vitro, en presencia de IL-15, las celulas anteriores se seleccionaron positivamente para expresion de CD62L para crear una poblacion pura de celulas Tcm (> 96 % de pureza de CD62L+) en oposicion a los LTC de veto que mostraban baja expresion de CD62L (> 95 % de pureza de CD62L-). Las celulas se marcaron con DIR y se transfirieron de forma adoptiva a huespedes BALB/C en el contexto del modelo de rechazo del injerto descrito en los ejemplos 1 y 2, anteriormente en el presente documento. Dado que las celulas Tcm se sometieron
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solamente a 60 horas de carencia de IL-2, en lugar del metodo de carencia de 6 d^as que demostro previamente in vitro e in vivo reducir la actividad de EICH de LTC de veto [Bachar-Lustig et al., anteriormente], el presente experimento utilizo ratones CB6 [(C57BL/6*BALB/b)F1, H2-bd] como fuente para las celulas transferidas de forma adoptiva. Dos dfas (figuras 3A-B y figuras 4A-D) o 6,5 dfas (figuras 5A-C y figuras 6A-J) despues de la transferencia adoptiva, los ratones fueron sacrificados y la distribucion de celulas de origen de CB6 en los diferentes organos se determino usando imaginologfa ex-vivo de cuerpo entero (figuras 3A-B y figuras 5A-C) y mediante analisis FACS de la suspension celular obtenida despues del machacado de los organos (figuras 4A-D y figuras 6A-J).
Tal como queda claro a partir de los resultados, sesenta horas post-trasplante el analisis tanto con IVIS (figuras 3A- B) como el FACS (figuras 4A-D) demostraron indudablemente una diferencia distinta en los patrones de migracion entre las dos poblaciones celulares. Mientras que las celulas Tcm eran claramente visibles en los GL perifericos y mesentericos (figuras 3A y 4A-B), los LTC de veto apenas fueron detectados en estos organos y se descubrieron principalmente en los organos internos (tngado, pulmon, bazo) y la MO (figuras 3B y 4C-D).
Tambien se descubrio un patron similar despues de 6,5 dfas, dado que las celulas Tcm, en contraste con LTC de veto, se observaron claramente en los GL (figura 5B). Usando analisis FACS y recuento directo de las celulas en los organos machacados (figuras 6A-J) era evidente que LTC de veto estan localizados principalmente en el bazo, el tngado y la MO (figuras 6F-J), mientras que se descubrieron 23 veces mas celulas Tcm que LTC de veto en los GL (figuras 6A-E) 6,5 dfas post-TMO. Se obtuvieron resultados similares ya 2 dfas post-TMO (no mostrados). Ademas, se descubrio que el numero total de 'Tcm', recogidas de todos los organos ensayados, se incremento en 9 veces entre 2 y 6,5 dfas post-TMO, en claro contraste con los 'LTC', que presentaban proliferacion insignificante (figura 6K). Por lo tanto, se concluyo que las 'Tcm' no solamente anidan en los GL de receptores de TMO sino que tambien proliferan exhaustivamente en el periodo temprano post-trasplante.
EJEMPLO 5
Efecto de transferencia adoptiva a celulas Tcm sobre la supervivencia de receptores de aloinjerto de MOET
Dado que las celulas Tcm anidan eficazmente en los GL y muestran un fenotipo asociado a veto (no se muestran los datos) que podna permitir la tolerizacion de celulas T del huesped (CTH) colocalizadas, el inventor de la presente invencion valoro la capacidad de celulas Tcm anti-terceros transferidas de forma adoptiva para potenciar la supervivencia de receptores de aloinjerto de MOET, sin ningun tratamiento adicional. Este estudio se llevo a cabo en el modelo de rechazo del injerto descrito anteriormente (vease el ejemplo 1, anteriormente en el presente documento), que esta disenado espedficamente para medir el rechazo del aloinjerto de MOET mediado por celulas T, sin interferencia a partir de competencia con celulas madre, que podna producirse en ratones expuestos a acondicionamiento de intensidad reducida.
Por lo tanto, ratones C3H fueron irradiados letalmente y se les infundieron CTH antes del trasplante de aloinjerto de MOET a partir de donantes BALB/C desnudos, en presencia o ausencia de celulas Tcm anti-terceros purificadas transferidas de forma adoptiva (> 95 % de pureza). Se usaron ratones (C3HxBALB/C)F1 como fuente para las celulas Tcm para excluir la potenciacion potencial de prendimiento o letalidad mediante EICH y/o alorreactividad de las celulas Tcm.
Tal como puede verse en la figura 7, todos los ratones en el grupo de control de irradiacion, no protegidos contra radiacion con el injerto de MO, murieron brevemente despues del tratamiento de irradiacion. En contraste, todos los ratones que recibieron el trasplante de MO sobrevivieron, mientras que la adicion de CTH causo rechazo del injerto y letalidad. Sorprendentemente, el rechazo mediado por CTH se supero de forma extraordinaria tras la transferencia adoptiva de 107 celulas Tcm, sin ningun tratamiento adicional (7/8 ratones sobrevivieron).
Para valorar el fallo de CTH en rechazar el injerto de MO cuando se administro junto con celulas Tcm anti-terceros, el quimerismo en ratones receptores se ensayo a los 80 dfas post-trasplante mediante analisis FACS de sangre periferica. Tal como se muestra en la figura 8, ratones que recibieron trasplante de MO en solitario, sin ninguna CTH para inducir rechazo (columna A), presentaban niveles comparables de quimerismo con el donador que ratones que recibieron, ademas de la MO, CTH y 107 celulas Tcm (columna B, > 90 % de quimerismo con el donador). Por lo tanto, las celulas Tcm permitieron un prendimiento con exito a pesar de la presencia de CTH alorreactivas.
Ademas, 80 dfas post-trasplante, las celulas Tcm se detectaron facilmente en la sangre periferica del receptor y comprendfan el 44 ± 6 % de las celulas CD8 totales en la periferia (figuras 9A-B).
Esta elevada persistencia de celulas Tcm en los receptores de aloinjerto de MOET indicaba que, ademas de sus marcadas capacidades de induccion de tolerancia, estas celulas pueden hacer una importante contribucion a la reconstitucion inmunitaria, despues del severo acondicionamiento empleado en receptores de trasplante de MO.
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EJEMPLO 6
Comparacion directa de capacidades de induccion de tolerancia entre celulas Tcm y LTC de veto
Con el fin de comparer directamente las capacidades de induccion de tolerancia de las celulas Tcm anti-terceros de la presente invencion con los LTC de veto anti-terceros descritos anteriormente, el inventor de la presente invencion transfirio de forma adoptiva 107 Tcm o LTC de veto derivadas de ratones (C3HxBALB/C)F1 a ratones C3H, receptores de aloinjerto de MOET de BALB/C, en el contexto del modelo de rechazo de injerto descrito anteriormente (vease el ejemplo 1, anteriormente en el presente documento).
Para valorar la capacidad a largo plazo de 'Tcm' anti-terceros de tipo donante transferidas de forma adoptiva de superar el rechazo de aloinjerto de MO, se uso el modelo de rechazo del injerto descrito anteriormente, que esta disenado espedficamente para medir el rechazo de aloinjerto de MOET mediado por celulas T, sin interferencia de competencia de celulas madre, que podna producirse en ratones expuestos a RlC. Por lo tanto, a ratones C3H se les irradio letalmente y se les infundieron con CTH antes del trasplante de un aloinjerto de MOET procedente de donadores BALB/c-DESNUDOS, en presencia o ausencia de 'Tcm' purificados. Se usaron ratones (C3HxBALB/c)F1 como fuente de 'Tcm' para excluir potenciacion potencial del prendimiento de letalidad mediante EICH y/o mediante alorreactividad residual de las 'Tcm'. Tal como puede verse en la figura 10A, todos los ratones en el grupo de control de irradiacion, no protegidos contra radiacion con el injerto de MO, murieron brevemente despues de la irradiacion. En contraste, 29 de 30 ratones que recibieron MOET sobrevivieron, mientras que la adicion de CTH causo rechazo del injerto y letalidad de los 59 ratones que recibieron este tratamiento. Sorprendentemente, este rechazo mediado por CTH se supero en 16/18 ratones y en 19/23 ratones tras la transferencia adoptiva a 1x107 o 5x106 'Tcm', respectivamente, mientras que numeros inferiores de 'Tcm' fueron menos eficaces (figura 10A). Todos los ratones supervivientes presentaban un quimerismo con el donante duradero (>90 %), que persisrta durante mas de 1 ano (no se muestran los datos, el quimerismo con CD8 se presentan en la figura 10C). De hecho, tal como puede verse en la figura 10B, solamente 3/16 de los ratones receptores, que recibieron 1x107 LTC,', sin rapamicina, sobrevivieron (p<0,0001). Ademas, las 'Tcm' presentaron sorprendente persistencia in-vivo y podfan detectarse en la sangre periferica de los pacientes durante un periodo de tiempo prolongado. Por lo tanto, incluso a 1 ano post-trasplante, celulas T CD8 positivas H2kd (es decir progenie de las 'Tcm' infundidas) comprendfa 19 ± 6 % del compartimento de celulas T CD8 T total en la sangre periferica (figura 10C).
EJEMPLO 7
Las “Tcm” anti-terceros completamente alogenicas tienen reactividad de ICH reducida y apoyan el prendimiento de aloinjertos de MOET
Despues de demostrar la capacidad de las 'Tcm' para superar el rechazo de aloinjerto de MO mediado por celulas T, usando donantes de F1 (HostxDonor), desprovistos de alorreactividad, se llevo a cabo una valoracion adicional del potencial completo de estas celulas usando donantes alogenicos completamente incompatibles con CMH. En particular, considerando que 'Tcm' anti-terceros se generan a traves de estimulacion alogenica inicial durante solamente 60 horas con privacion de citocinas (para evitar la regulacion negativa de CD62L), en lugar del metodo de privacion de 6 dfas convencional19 para generar 'LTC' anti-terceros, era importante evaluar la reactividad de ICH de 'Tcm' completamente alogenicos.
Por lo tanto, 'Tcm' anti-terceros purificadas derivadas de BALB/c en comparacion con celulas CD8+ indiferenciadas derivadas de BALB/c para su reactividad de ICH tras la transferencia adoptiva en receptores C3H irradiados de forma supra-letal, trasplantados tambien con MO de BALB/c-DSNUDOS. Los ratones se monitorizaron para supervivencia y signos de EICH: pelaje encrespado, lomo encorvado y peso corporal reducido. Tal como puede verse en la figura 11A, la infusion de 5x106 o 2x106 'Tcm' no indujo EICH letal y 14/17 de los ratones en cada uno de los grupos sobrevivieron, similar a los receptores de DESNUDO-TMO sin celulas T adicionales (18/20 de los ratones sobrevivieron). En claro contraste, solamente 1/15 y 2/22 de los ratones que recibieron 5x106 o 2x106 celulas T CD8+ indiferenciadas, respectivamente, sobrevivieron. Ademas, el aspecto global de ratones que recibieron 'Tcm', asf como el peso, no fueron significativamente diferentes de los mostrados por ratones de control trasplantados con DESNUDO-Mo en solitario (figura 11B). Esto tambien contrasta con los resultados en ratones que reciben celulas T indiferenciadas, que presentaban perdida de peso significativa (p<0,05) y presentaban un aspecto global compatible con EICH.
Finalmente, la capacidad de estas “Tcm” anti-terceros completamente alogenicas, con reactividad de ICH reducida, para superar el rechazo mediado por celulas T se evaluo en el contexto del modelo de rechazo del injerto descrito previamente. Tal como puede verse en la figura 11C, 21/25 de los ratones que recibieron 5x106 'Tcm' derivadas de BALB/c, sobrevivieron despues del trasplante, y presentaron quimerismo con el donante estable (>95 %). En contraste, la infusion de 1x1o7 'LTC' derivados de BALB/c, solamente pudo rescatar 7/27 de los ratones receptores (p<0,0001), y numeros inferiores de 'LTC' (5x106 o 2x106) fueron completamente ineficaces para prevenir este rechazo mediado por CTH (no se muestran los datos).
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EJEMPLO 8
Las 'Tcm' presentan baja actividad de veto in - vitro, pero tras la reactivacion adquieren un fenotipo efector, acompanado por actividad de veto potente y espedfica
Aunque las 'Tcm' anti-terceros anidan de forma eficiente en los GL, la induccion de tolerancia mediante estas celulas tambien requiere que estas celulas esten dotadas de una potente actividad de veto. En general, celulas T CD8+ que potan un fenotipo de Tcm demostraron previamente mostrar mecanismos efectores de LTC debiles, pero su actividad de veto no ha sido descrita nunca.
Para evaluar la actividad de veto de 'Tcm', se uso un ensayo con celulas efectoras CD8+ TCR transgenicas (el modelo 2c). Las celulas 2c CD8+ expresan un TCR transgenico contra H-2d y, por lo tanto, son propensas a eliminacion de veto solamente mediante 'LTC' de veto de origen de H-2d y no mediante 'LTC' espedficos de un tipo diferente a H-2, que no son reconocidos por las celulas 2c1®. Las celulas 2c pueden identificarse espedficamente usando el anticuerpo 1B2 clonotipico. Se usaron ratones CB6 como fuente para celulas de veto para excluir hipotetica alorreactividad residual contra las celulas 2c. De acuerdo con estudios previos, las 'LTC', que portan un fenotipo efector, mostraban inhibicion eficiente de la expansion de celulas 2c (figura 12A), causada por apoptosis, tal como se indica mediante tincion con Anexina V (figura 12B). En contraste, las 'Tcm' mostraban mala reactividad inhibidora (figura 12A) y no consegman inducir apoptosis en las celulas 2c, tal como se sugena mediante niveles mas bajos de tincion con Anexina V (figura 12B).
Sin embargo, la reactivacion breve de las 'Tcm', causo la regulacion negativa de la expresion de CD62L (no se muestran los datos) y una actividad supresora marcadamente potenciada (figura 12A) mediada probablemente a traves de un mecanismo basado en eliminacion, tal como se ha indicado mediante tincion con Anexina V (figura 12B). Ademas, 'Tcm' reactivadas, de forma similar a 'LTC', presentaban actividad de veto espedfica, tal como se muestra comparando 'Tcm' “espedficas” reactivadas o 'LTC' derivados de CB6 (H2bd) o celulas T CD8+ de (C57xC3H)F1 (H2bk) “no espedficas”, que no expresan la molecula H-2d y no son reconocidas por las celulas T 2c CD8+. Por lo tanto, solamente 'Tcm' reactivadas “espedficas” o 'LTC', inhidan eficazmente la expansion de celulas 2c (figura 12C) y fueron capaces de inducir expresion de Anexina V en las celulas efectoras 2c (figura 12D). Colectivamente, estos resultados sugieren que las 'Tcm' no poseen actividad de veto intrmseca, pero tras la reactivacion, adquieren un fenotipo efector y actividad de veto. Esto es coherente con la rapida induccion del fenotipo y la funcion efectores descritos anteriormente para celulas T CD8+ que portan un fenotipo de Tcm tras la reactivacion. Colectivamente, los datos descritos anteriormente sugieren que el anidamiento potenciado a los GL y la actividad de veto eficiente in-vitro, son mutuamente excluyentes. No obstante, dado que la reactivacion de las 'Tcm' mejoraba drasticamente su actividad de veto, resultaba de interes determinar si las 'Tcm' transferidas de forma adoptiva pueden reactivarse en los GL de receptores de aloinjerto de MO, en los que celulas T de tipo del huesped, transferidas de forma adoptiva pueden montar respuestas anti-donante. De hecho, 4 dfas despues de la transferencia adoptiva a las 'Tcm' purificadas, un numero significativo de las celulas infundidas recuperadas de los GL mostraban expresion marcadamente reducida de CD62L (figura 12E), indicando que la reactivacion podna haberse producido, posiblemente como resultado de estfmulos inducidos mediante el acondicionamiento letal y/o la alorreactividad de CTH.
EJEMPLO 9
Las ’Tcm’ eliminan espedficamente celulas T anti-donante in-vivo
Considerando que las 'Tcm' anidan de forma eficiente en los GL de ratones receptores y muestran un fenotipo asociado a veto, lo que podna permitir la tolerizacion de CTH colocalizadas, se valoro la capacidad de 'Tcm' transferidas de forma adoptiva para suprimir celulas T espedficas de Ag in-vivo. Para evaluar exclusivamente la actividad de tolerizacion de las 'Tcm', sin interferencia de la actividad de veto bien documentada de celulas de MO y celulas derivadas de MO ’’ , se establecio un modelo de TMO singenico en el que ratones huesped C57BL/6 (H2b) irradiados letalmente se protegieron contra la radiacion con celulas de Mo de C57BL/6-DESNUDOS singenicas. Ademas, los ratones receptores recibieron celulas T 2C (H2b) CD8+ y esplenocitos de BALB/c (H2d) irradiados, lo que induce la expansion de celulas 2c in-vivo. Despues de 1 dfa tras la transferencia de las celulas 2c y sus estimuladores, los receptores recibieron “Tcm” purificadas (H2bd) derivadas de CB6 “espedficas”, o “Tcm” purificadas derivadas de C57BL/6 “no espedficas”, que no expresan la molecula H-2d y, por lo tanto, no son reconocidas por las celulas T 2c CD8+. Se recogieron bazos de los receptores, y se evaluaron 8 dfas post-trasplante para la presencia de las celulas 2c. Sorprendentemente, las 'Tcm' “espedficas” inhidan de forma eficaz (71 % de inhibicion) la expansion de las celulas 2c (figuras 13A-B), en comparacion con 'Tcm' “no espedficas”, que mostraban solamente el 20 % de inhibicion. Ademas, la tincion con Anexina V indicaba que el mecanismo de inhibicion, presentado por las 'Tcm' “espedficas”, estaba mediado a traves de induccion de apoptosis tras reconocer celulas 2c (figuras 13C-D).
Claims (16)
- 51015202530354045505560REIVINDICACIONES1. Una poblacion de celulas aislada que comprende celulas anti-terceros que no inducen EICH que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), en la que dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) comprende un distintivo CD8+, CD62L+, CD45RA", CD45 RO+, y en la que al menos el 50 % de la poblacion de celulas aislada tienen dicho distintivo, siendo dichas celulas, celulas que inducen tolerancia y capaces de dirigirse a los ganglios linfaticos despues de un trasplante.
- 2. La poblacion de celulas aislada de la reivindicacion 1, para uso en el tratamiento de una enfermedad en un sujeto humano que lo necesita, en el que dicha enfermedad se selecciona entre el grupo que consiste en una enfermedad maligna, una enfermedad asociada con el trasplante de un injerto y una enfermedad autoinmunitaria.
- 3. La poblacion de celulas aislada de la reivindicacion 1, para uso como un tratamiento adyuvante para un trasplante de celulas o de tejido en un sujeto humano, en el que dicho sujeto necesita un trasplante de celulas o de tejido.
- 4. La poblacion de celulas aislada para uso de la reivindicacion 3, en la que dicha poblacion de celulas aislada se administra antes de, conjuntamente con, o despues de dicho trasplante de celulas o de tejido.
- 5. La poblacion de celulas aislada para uso de la reivindicacion 3, en la que dicha poblacion de celulas aislada es singenica con el sujeto.
- 6. La poblacion de celulas aislada para uso de la reivindicacion 3, en la que dicha poblacion de celulas aislada no es singenica con el sujeto.
- 7. La poblacion de celulas aislada para uso de la reivindicacion 3, en la que dicho trasplante de celulas o de tejido se deriva de un donante seleccionado entre el grupo que consiste en un donante alogenico ALH identico, un donante alogenico no ALH identico y un donante xenogenico.
- 8. La poblacion de celulas aislada para uso de la reivindicacion 3, en la que dicho trasplante de celulas o de tejido es singenico con el sujeto.
- 9. La poblacion de celulas aislada para uso de la reivindicacion 3, en la que dicho trasplante de celulas o de tejido comprende celulas hematopoyeticas inmaduras.
- 10. La poblacion de celulas aislada para uso de la reivindicacion 3, en la que dicho trasplante de celulas o de tejido comprende un cotrasplante de varios organos.
- 11. La poblacion de celulas aislada para uso de la reivindicacion 3, en la que dicho trasplante de celulas o de tejido y dicha poblacion de celulas aislada se derivan del mismo donante.
- 12. Un metodo de generacion de la poblacion de celulas aislada de la reivindicacion 1, comprendiendo el metodo:(a) poner en contacto celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP) no singenicas con un antfgeno o antfgenos de terceros en condiciones que permitan la eliminacion de celulas reactivas en ICH, en el que dichas condiciones que permiten la eliminacion de celulas reactivas en ICH comprenden un cultivo derivado de citocinas; y(b) cultivar dichas celulas que resultan de la etapa (a) en presencia de IL-15 en condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), en el que dichas condiciones comprenden un entorno libre de antfgenos,generando de este modo la poblacion de celulas aislada de la reivindicacion 1.
- 13. El metodo de la reivindicacion 12, en el que dichas condiciones que permiten la eliminacion de celulas reactivas en ICH comprenden al menos 2 dfas de cultivo.
- 14. El metodo de la reivindicacion 12, en el que dichas condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) comprenden la presencia de IL-7 o IL-21.
- 15. El metodo de la reivindicacion 12, en el que dichas condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) comprenden la presencia de IL-7 e IL-21.
- 16. El metodo de la reivindicacion 12, en el que dichas condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) comprenden al menos 14 dfas de dicho cultivo.
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