ES2589678T3 - Uso de linfocitos T de memoria central anti-terceros para el tratamiento anti-leucemia/linfoma - Google Patents

Abstract

Un método de generación in vitro de una población de células aislada que comprende células anti-terceros que no inducen enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), comprendiendo dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) un distintivo CD8+/CD62L+/CD45RO+ y en el que al menos el 50 % de la población de células aislada tienen dicho distintivo, siendo dichas células, células que inducen tolerancia y capaces de alojarse en los ganglios linfáticos después del trasplante, comprendiendo el método: (a) poner en contacto las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con un antígeno o antígenos de terceros en presencia de IL-21 en condiciones que permiten la eliminación de las células reactivas GVH y (b) cultivar dichas células resultantes de la etapa (a) en presencia de IL-15 en un entorno libre de antígeno en condiciones que permiten la proliferación de células que comprenden dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), generando de ese modo la población de células aislada.

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DESCRIPCION

Uso de linfocitos T de memoria central anti-terceros para el tratamiento anti-leucemia/linfoma

La presente invencion, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a celulas anti-terceros que no inducen la enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) que comprenden un fenotipo de linfocito T de memoria central y, mas particularmente, pero no exclusivamente, al uso de las mismas para el tratamiento de injerto contra leucemia/linfoma.

Las opciones de tratamiento para pacientes con neoplasias malignas hematologicas tales como linfoma no Hodgkin (NHL) son muchas y variadas. Estos protocolos de tratamiento modernos conducen a remision completa (RC) en una proporcion considerable de los pacientes. Sin embargo, muchos de estos pacientes recaen finalmente, lo que implica que las celulas tumorales residuales permanecen en los pacientes que logran una RC clmica. Para tratar este problema, la infusion de linfocitos donantes (DLI) dotada con reactividad de injerto contra leucemia/linfoma (GVL) esta siendo actualmente desarrollada. En particular, se han hecho progresos en el contexto del trasplante alogenico de medula osea (BMT) en conjuncion con DLI despues del trasplante [Grigg A y Ritchie D, Biol Blood Marrow Transplant (2004) 10: 579-590]. De esta manera, se ha mostrado que los linfocitos T CD8+ donantes presentes en el injerto de celulas madre o en la DLI tienen el beneficio adicionado de efecto GVL que puede destruir celulas malignas residuales [Ho WY y colaboradores, J Clin Invest. (2002) 110: 1415-1417]. Sin embargo, este beneficio se anula por la enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD), asociada con linfocitos T CD8, que afectan adversamente a la mortalidad relacionada con el trasplante.

El trabajo previo realizado por los presentes inventores ha mostrado que la estimulacion ex vivo de linfocitos T CD8 + murinos contra estimuladores de terceros, bajo privacion de IL-2, conduce al crecimiento selectivo de clones de linfocitos T citotoxicos (CTL) CD8+ restringidos de terceros que pueden facilitar la incorporacion del injerto BMT agotado de linfocitos T (TdBmT) sin provocar GVHD [Bachar-Lustig E. y colaboradores, Blood (2003) 102:19431950; Reich-Zeliger S. y colaboradores, Immunity (2000) 13: 507-515]. Recientemente, los presentes inventores mostraron que los linfocitos CD8+ anti-terceros activados con fenotipo de memoria central (Tcm), pueden soportar adicionalmente y mejorar el injerto de medula osea (BM), probablemente debido a la migracion al nodo linfatico mejorada de los linfocitos Tcm, su capacidad proliferativa y persistencia prolongada en receptores de BMT [Ophir E y colaboradores, Blood (2010) 115: 20.95-2104].

Adicionalmente, los presentes inventores han mostrado que en humanos, los CTL anti-terceros, aunque agotados de alorreactividad, muestran una potente destruccion in vitro de B-CLL y diferentes tipos de celulas de linfoma primario [Lask A y colaboradores (presentado 2010); Arditti FD y colaboradores, Blood (2005) 105:3365-3371]. Se mostro que esta forma unica de GVL es independiente del reconocimiento del TCR y se descubrio que esta mediada tanto por CTL anti-terceros autologos como alogenicos. Adicionalmente, esta destruccion independiente de TCR de neoplasias malignas de linfocitos B por CTL anti-terceros se mostro que estaba mediada por una rapida adhesion a traves del enlace ICAM1-LFA1, seguido por la lenta induccion de apoptosis en una interaccion cntica entre CD8 en el CTL y el MHC clase I en la celula tumoral. Por otra parte, se mostro que la destruccion es independiente de las moleculas de muerte de CTL clasicas: FASL, perforina, TNF y Trail [Lask A y colaboradores, supra].

La tecnica adicional incluye los documentos WO/2010/049935, WO 2007/023491 y WO 01/49243.

Kawai Tatsuo y colaboradores se refiere a un trasplante renal HLA no compatible sin inmunosupresion de mantenimiento, New England Journal of Medicine, Massachussets Medical Society, Boston, MA, Estados Unidos, vol. 358, N° 4, 24 de enero de 2008, paginas 353-361.

Ophir E y colaboradores se refiere a la induccion de tolerancia en receptores de organos mediante trasplante de celulas madre hematopoyeticas, International Immunopharmacology, Elsevier, Amsterdam, NL, vol. 9, n° 6, 1 de junio 2009, paginas 694-700.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo de generacion de una poblacion de celulas aislada que comprende celulas anti-terceros que no inducen enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), comprendiendo dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) el distintivo CD8+/CD62L+/CD45RO+ y en el que al menos el 50 % de la poblacion de celulas aislada tienen dicho distintivo, siendo dichas celulas, celulas que inducen tolerancia y capaces de alojarse en los ganglios linfaticos despues del trasplante, comprendiendo el metodo:

(a) poner en contacto las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) con un antfgeno o antfgenos de terceros en presencia de IL-21 en condiciones que permiten la eliminacion de las celulas reactivas GVH; y

(b) cultivar dichas celulas resultantes de la etapa (a) en presencia de IL-15 en un entorno libre de antfgeno en condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), generando de ese modo la poblacion de celulas aislada.

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La presente invencion se refiere tambien a una poblacion de celulas aislada que comprende celulas anti-terceros que no inducen enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), comprendiendo dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) el distintivo CD8+/CD62L+/CD45RO+ y en el que al menos el 50 % de la poblacion de celulas aislada tienen dicho distintivo, siendo dichas celulas, celulas que inducen tolerancia y capaces de alojarse en los ganglios linfaticos despues del trasplante, para su uso como un tratamiento adyuvante para la erradicacion de una enfermedad en un sujeto que ha sido trasplantado con un injerto de celula o de tejido no singenico, en el que dichas celulas son:

(i) no singenicas con el sujeto y dicho injerto o

(ii) no singenicas con dicho injerto y singenicas con el sujeto.

Preferiblemente, dicha celula o tejido de injerto es no autologo y dicha poblacion de celulas aislada son autologas.

Preferiblemente, dicha celula o tejido del injerto y dicha poblacion de celulas aislada son de diferentes donantes.

Preferiblemente, dicha enfermedad comprende una neoplasia maligna y opcionalmente, una neoplasia maligna de linfocitos B.

Preferiblemente, dicho injerto comprende celulas de medula osea y opcionalmente celulas hematopoyeticas inmaduras.

Preferiblemente, cuando dichas celulas hematopoyeticas inmaduras son no singenicas con el sujeto, dicha poblacion de celulas aislada son singenicas con el sujeto.

Preferiblemente, dichas celulas hematopoyeticas inmaduras son no autologas y dicha poblacion de celulas aislada son autologas.

Preferiblemente, cuando dichas celulas hematopoyeticas inmaduras son no singenicas con el sujeto, dicha poblacion de celulas aislada son no singenicas con el sujeto y con dicho injerto.

Preferiblemente dichas celulas hematopoyeticas inmaduras y dicha poblacion de celulas aislada son de diferentes donantes.

Preferiblemente, dichos ganglios linfaticos comprenden los ganglios linfaticos perifericos o los ganglios linfaticos mesentericos.

Preferiblemente, dichas celulas no singenicas con dicho injerto y singenicas con el sujeto comprenden celulas autologas.

La presente invencion se refiere tambien a una cantidad terapeuticamente eficaz de una poblacion de celulas aislada que comprende celulas anti-terceros que no inducen enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), comprendiendo dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) el distintivo CD8+/CD62L+/CD45RO+ y en el que al menos el 50 % de la poblacion de celulas aislada tienen dicho distintivo, siendo dichas celulas, celulas que inducen tolerancia y capaces de alojarse en los ganglios linfaticos despues del trasplante, para su uso como un tratamiento adyuvante para la erradicacion de una enfermedad en un sujeto que ha sido trasplantado con celulas hematopoyeticas inmaduras y en el que ademas cuando dichas celulas hematopoyeticas inmaduras son singenicas con el sujeto, dicha poblacion de celulas aislada se selecciona para que sea singenica con el sujeto o no singenica con el sujeto.

Preferiblemente dichas celulas hematopoyeticas inmaduras y dicha poblacion de celulas aislada son autologas o dichas celulas hematopoyeticas inmaduras son autologas y dicha poblacion de celulas aislada son no autologas.

Preferiblemente dichas celulas anti-terceros que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo dichas celulas, celulas que inducen tolerancia y capaces de alojarse en los ganglios linfaticos despues del trasplante son generadas:

(a) poniendo en contacto celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) con un antfgeno o antfgenos de terceros en presencia de IL-21 en condiciones que permiten la eliminacion de las celulas reactivas GVH y

(b) cultivando dichas celulas resultantes de la etapa (a) en presencia de IL-15 en un entorno libre de antfgeno en condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), generando de ese modo la poblacion de celulas aislada.

Preferiblemente dichas condiciones que permiten la eliminacion de las celulas reactivas GVH comprenden el cultivo durante 1-5 dfas.

Preferiblemente, dicho cultivo en presencia de IL-15 se efectua durante 3-30 dfas.

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Preferiblemente, dichas condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), comprenden ademas IL-7 y/o IL-21. Preferiblemente, dicha enfermedad comprende leucemia o linfoma.

Breve descripcion de los dibujos

Algunas realizaciones de la invencion se describen en la presente memoria a manera de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos acompanantes. Con referencia espedfica ahora a los dibujos con detalle, se destaca que los detalles mostrados son a manera de ejemplo y para propositos de la discusion ilustrativa de las realizaciones de la invencion. En este aspecto, la descripcion tomada con los dibujos hace evidente a aquellas personas expertas en la tecnica como se pueden llevar a cabo las realizaciones de la invencion.

En los dibujos:

Las Figuras 1A-I representan la inhibicion de la recidiva tumoral por linfocitos Tcm anti-terceros derivados singenicos despues del trasplante de medula osea singenico. Ratones BALB/c (H-2d) letalmente irradiados (8 Gy) recibieron intravenosamente un trasplante de 3 x 106 celulas de medula osea agotadas de linfocitos T singenicas (BALB/c- NUDE (H-2d) en presencia o ausencia de 5 x 103 celulas de linfoma A20-luc (dfa 0). Los ratones se inyectaron despues intravenosamente con o sin los numeros indicados de linfocitos Tcm anti-terceros derivados BALB/c (indicados como celulas de leucemia + Tcm, n = 7; o con solamente celulas de leucemia, n =7, respectivamente) en el dfa- +1. Las Figuras 1A-H son fotograffas que representan el crecimiento tumoral monitorizado mediante imagenes de bioluminiscencia (BLI) desde el dfa 14 en intervalos semanales; la Figura II es una grafica que

representa la tasa de supervivencia de los animales de los diferentes grupos de tratamiento. El eje X indica los dfas

despues de la inyeccion de celulas tumorales y el eje y indica el porcentaje de supervivencia de los ratones receptores.

Las Figuras 2A-G representan la inhibicion de la recidiva tumoral por linfocitos T CD8 anti-terceros derivados de F1 despues del trasplante de medula osea singenico. Ratones BALB/c (H-2d) letalmente irradiados (8 Gy) recibieron intravenosamente un trasplante de 3 x 106 celulas de medula osea agotadas de linfocitos T singenicas (BALB/c- NUDE (H-2d) en presencia o ausencia de 5 x 103 celulas de linfoma A20-luc (dfa 0). Los ratones se inyectaron

despues intravenosamente con o sin 2 x 107 linfocitos Tcm anti-terceros derivados de F1 (celulas de leucemia +

Tcm, n = 7) o sin (celulas de leucemia solas, n=5) en el dfa +1; las Figuras 2A-F son fotograffas que representan el crecimiento tumoral monitorizado por BLI desde el dfa 14 en intervalos semanas. La Figura 2G es una grafica que representa la tasa de supervivencia de los animales de los diferentes grupos de tratamiento. El eje X indica los dfas

despues de la inyeccion de linfocitos tumorales y el eje y indica el porcentaje de supervivencia de los ratones

receptores.

Las Figuras 3A-I representan la inhibicion de la recidiva tumoral por linfocitos Tcm anti-terceros derivados alogenicos despues del trasplante de medula osea alogenico. Ratones BALB/c (H-2d) letalmente irradiados (8 Gy) recibieron intravenosamente un trasplante de 3 x 106 celulas de medula osea agotadas de linfocitos T alogenicos (C57BL/6- NUDE (H-2b) en presencia o ausencia de 5 x 103 celulas de linfoma A20- luc (dfa 0). Los ratones se inyectaron

despues intravenosamente con celulas derivadas C57BL/6 (en el dfa +1). Las Figuras 3A- H son fotograffas que

representan el crecimiento tumoral monitorizado por BLI desde el dfa 13 en intervalos semanales; la Figura 3I es una grafica que representa la tasa de supervivencia de los animales de los diferentes grupos de tratamiento. El eje X indica dfas despues de la inyeccion de linfocitos tumorales y el eje y indica el porcentaje de supervivencia de los ratones receptores.

Las Figuras 4A-B son graficas que representan la proliferacion y fenotipo celular de linfocitos T de memoria central anti-terceros de la presente invencion. La Figura 4A representa la proliferacion de linfocitos Tcm desde el dfa 0 hasta el dfa 12 del cultivo y la Figura 4B representa el fenotipo celular usando el mismo cultivo contra Alo-DC.

La Figura 5 es una grafica que representa el porcentaje de celulas apoptoticas despues de 22 horas de reaccion de linfocitos mezclados (MLR) con lmeas de celulas de linfoma de linfocitos By de leucemia de celulas plasmaticas. Lmeas de celulas Daudi pre-etiquetadas con CalceinAM, mutante H.My2 CIR HLA A2 K66A o L363 se incubaron durante 22 horas con o sin exceso de 5 veces de Tcm anti-terceros. Las celulas anexina V+ se determinaron por FACS. Los datos se muestran como media ±DE de cultivos pentaplicados. Los valores ***p<0,001 indican cambios estadfsticamente significativos comparados con las muestras cultivadas en la ausencia de Tcm.

La Figura 6 es una grafica que representa el numero de celulas vivas despues 22 horas de la reaccion de linfocitos mezclados (MLR) con lmeas de celulas EBV-LCL de linfoma de linfocitos By de leucemia de celulas plasmaticas. Lmeas de celulas Daudi pre-etiquetadas con CalceinAM, mutante H.My2 CIR HLA A2 K66A o L363 se incubaron durante 22 horas con o sin exceso de 5 veces de Tcm anti-terceros. Los numeros de celulas CalceinAM+ viables se determinaron por FACS. Los datos se muestran como media ±DE de cultivos pentaplicados. Los valores ***p<0,001 indican cambios estadfsticamente significativos comparados con las muestras cultivadas en la ausencia de Tcm.

Descripcion de realizaciones espedficas de la invencion

La presente divulgacion, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a celulas anti-terceros que no inducen enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) que comprenden un fenotipo de linfocito T de memoria central y, mas particularmente, pero no exclusivamente, al uso de las mismas para el tratamiento de injerto contra leucemia/linfoma.

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Los principios y operacion de la presente invencion se pueden entender mejor con referencia a los dibujos y descripciones acompanantes.

Antes de explicar por lo menos una realizacion de la invencion con detalle, ha de entenderse que la invencion no se limita necesariamente en su aplicacion a los detalles expuestos en la siguiente descripcion o ejemplificados por los ejemplos. La invencion contempla otras realizaciones o puede ser puesta en practica o ser llevada a cabo en varias formas. Tambien, se va a entender que la fraseologfa y terminologfa empleadas en la presente memoria es para el proposito de la descripcion y no se deben considerar como limitantes.

Al llevar la presente invencion a la practica, los presentes inventores han descubierto que los linfocitos T de memoria central (Tcm) CD8+ anti-terceros comprenden actividad de injerto contra leucemia/linfoma (GVL) in vivo y, por lo tanto, se pueden usar para tratar enfermedades hematopoyeticas malignas, tales como linfoma y leucemia.

Como se muestra en la presente memoria a continuacion y en la seccion de Ejemplos que sigue, los presentes inventores han mostrado la reactividad GVL de linfocitos Tcm CD8+ anti-terceros en un modelo de raton in vivo disenado espedficamente para estimular el trasplante de medula osea alogenico (BMT) en pacientes con linfoma. Inicialmente, los inventores confirmaron in vitro que los linfocitos Tcm anti-terceros murinos derivadas no alorreactivos actuan de forma similar a los CTL anti-terceros humanos y erradican directamente las celulas de linfoma murino A20 (ver el Ejemplo 1 de la seccion de Ejemplos que sigue). Posteriormente, los presentes inventores establecieron un modelo de raton de enfermedad residual minima para linfoma de linfocitos B usando la lmea de celulas de linfoma de linfocitos B A20 en las cuales el gen informador de luciferasa estaba integrado establemente en su genoma (A20-luc). Estas celulas permitfan la monitorizacion sensible de la progresion del tumor in vivo mediante formacion de imagenes de bioluminiscencia (BLI). Usando este modelo, los inventores descubrieron que tanto los linfocitos Tcm anti-terceros singenicos como alogenicos mostraban una reactividad GVL marcada sin provocar enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) cuando se administraban junto con un trasplante de medula osea singenico (Ejemplos 2 y 3, respectivamente, de la seccion de Ejemplos que sigue). Adicionalmente, los presentes inventores mostraron un efecto GVL efectivo carente de GVHD cuando se administran linfocitos Tcm anti- terceros alogenicos (tipo donante) junto con un trasplante de medula osea alogenico (Ejemplo 4, de la seccion de Ejemplos que sigue). En conjunto, todos estos descubrimientos justifican el uso de linfocitos Tcm anti-terceros como celulas de injerto contra leucemia/linfoma para la erradicacion de celulas enfermas. Por otra parte, los presentes resultados muestran la capacidad de usar linfocitos Tcm anti-terceros de un donante no singenico con respecto al receptor y al donante de trasplante (por ejemplo, de dos donantes diferentes).

De esta manera, de acuerdo con un aspecto de la presente divulgacion se proporciona un metodo para tratar una enfermedad en un sujeto en necesidad del mismo, comprendiendo el metodo: (a) trasplantar un injerto de celula o de tejido al sujeto y (b) administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de una poblacion de celulas aislada que comprende celulas anti-terceros que no inducen injerto contra hospedador (GVHD) que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo las celulas inductoras de tolerancia incapaces de alojarse en los ganglios linfaticos despues del trasplante y en el que ademas las celulas son: (i) no singenicas tanto con el sujeto como con el injerto; o (ii) no singenicas con el injerto y singenicas con el sujeto, para de esta manera tratar al sujeto.

Como se usa en la presente memoria, el termino “tratar” incluye anular, inhibir sustancialmente, desacelerar o revertir la progresion de una afeccion, mejorar sustancialmente los smtomas clmicos o esteticos de una afeccion o prevenir sustancialmente la aparicion de smtomas clmicos o estericos de una afeccion.

Como se usa en la presente memoria, el termino “sujeto” o “sujeto en necesidad del mismo” se refiere a un mairnfero, preferiblemente un ser humano, hombre o mujer de cualquier edad que este en necesidad de un injerto de celula o de tejido. Generalmente, el sujeto esta en necesidad de un injerto de celula o de tejido (tambien referido en la presente memoria como receptor, debido a un trastorno o una afeccion, estado o smdrome patologico o indeseado, o a una anomalfa ffsica, morfologica o fisiologica que es susceptible de tratamiento a traves del trasplante de un injerto de celula o de tejido. Ejemplos de tales trastornos se proporcionan a continuacion adicionalmente.

Como se usa en la presente memoria, la frase “injerto de celula o de tejido” se refiere a una celula corporal (por ejemplo una sola celula o un grupo de celulas) o tejido (por ejemplo tejidos solidos o tejidos blandos que se pueden trasplantar en totalidad o en parte). Ejemplos de tejidos que se pueden trasplantar de acuerdo con las presentes ensenanzas incluyen, pero no se limitan a, tejidos linfoides/hematopoyeticos (por ejemplo, ganglio linfatico, parches de Peyer, timo o medula osea). Ejemplos de celulas que se pueden trasplantar de acuerdo con las presentes ensenanzas incluyen, pero no se limitan a, celulas madre hematopoyeticas (por ejemplo celulas hematopoyeticas inmaduras).

De acuerdo con una realizacion espedfica, las celulas madre hematopoyeticas de la presente invencion son CD34+.

Dependiendo de la aplicacion, el metodo se puede llevar a cabo usando un injerto de celula o de tejido que es singenico o no singenico con el sujeto.

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Como se usa en la presente memoria, el termino “singenico” se refiere a una celula o tejido que se deriva de un individuo que es esencialmente geneticamente identico con el sujeto. Generalmente, los mairnferos completamente endogamicos, los clones de mamnfero o los mamnferos gemelos homocigoticos son singenicos.

Ejemplos de celulas o tejidos singenicos incluyen celulas o tejidos derivados del sujeto (tambien referidos en la tecnica como “autologos”), un clon del sujeto, o un gemelo homocigotico del sujeto.

Como se usa en la presente memoria, el termino “no singenico” se refiere a una celula o tejido que se deriva de un individuo que es alogenico xenogenico con los linfocitos del sujeto (tambien referido en la tecnica como “no autologos”).

Como se usa en la presente memoria, el termino “alogenico” se refiere a una celula o tejido que se deriva de un donante que es de la misma especie que el sujeto, pero que es sustancialmente no clonal con el sujeto. Generalmente, los mamfferos gemelos no zigoticos, exogamicos de la misma especie son alogenicos entre sh Se apreciara que un donante alogenico puede ser HLA identico o HLA no identico con respecto al sujeto.

Como se usa en la presente memoria, el termino “xenogenico” se refiere a una celula o tejido que expresa sustancialmente antfgenos de una especie diferente respecto a las especies de una proporcion sustancial de los linfocitos del sujeto. Generalmente, mamfferos exogamicos de diferentes especies son xenogenicos entre sh

La presente divulgacion contempla que las celulas o tejidos xenogenicos se derivan de una variedad de especies tales como, pero sin limitarse a, bovinos (por ejemplo, vacas), equidos (por ejemplo, caballos), porcinos (por ejemplo cerdos), ovidos (por ejemplo, cabra, oveja), felinos (por ejemplo, Felis domestica), caninos (por ejemplo, Canis domestica), roedores (por ejemplo, raton, rata, conejo, conejillo de Indias jerbo, hamster) o primates (por ejemplo, chimpance, mono Rhesus, mono macaco, mono titi).

Las celulas o tejidos de origen xenogenico (por ejemplo origen porcino) se obtienen preferiblemente de una fuente que es conocida por estar libre de zoonosis, tal como retrovirus endogenos porcinos. De modo similar, las celulas o tejidos derivados de humano se obtienen preferiblemente de fuentes sustancialmente sin patogenos.

De acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion, tanto el sujeto como el donante son humanos.

Dependiendo de la aplicacion y de las fuentes disponibles, los injertos de celulas o de tejido de la presente invencion se pueden obtener de un organismo prenatal, organismo postnatal, un adulto o un donante cadaver. Por otra parte, dependiendo de la aplicacion necesaria, las celulas o tejidos pueden ser indiferenciados o geneticamente modificados. Tales determinaciones estan perfectamente dentro de la capacidad de una persona de experiencia ordinaria en la tecnica.

Cualquier metodo conocido en la tecnica se puede emplear para tener una celula o tejido (por ejemplo, para trasplantes).

El trasplante del injerto de celula o tejido en el sujeto se puede efectuar en varias formas, dependiendo de varios parametros, tales como, por ejemplo, el tipo de celula o tejido; el tipo, etapa o gravedad de la enfermedad del receptor (por ejemplo insuficiencia organica); los parametros ffsicos o fisiologicos espedficos del sujeto y/o el resultado terapeutico deseado.

El trasplante de un injerto de celula o de tejido de la presente divulgacion se puede efectuar trasplantando el injerto de celula o de tejido en cualquiera de varias ubicaciones anatomicas, dependiendo de la aplicacion. El injerto de celula o de tejido se puede trasplantar en una ubicacion anatomica homotopica (una ubicacion anatomica normal para el trasplante) o en una ubicacion anatomica ectopica (una ubicacion anatomica anormal para el trasplante). Dependiendo de la aplicacion, el injerto de celula o de tejido se puede implantar ventajosamente bajo la capsula renal, o en el rinon, la grasa testicular, el tejido subcutaneo, el omento, la vena porta, el hngado, el bazo, los huesos, la cavidad cardfaca, el corazon, la cavidad toracica, el pulmon, la piel, el pancreas y/o el espacio intra-abdominal.

Por ejemplo, en los casos que requieran trasplante de celulas hematopoyeticas inmaduras, las celulas hematopoyeticas autologas, alogenicas o xenogenicas inmaduras (por ejemplo, celulas madre) que se pueden derivar, por ejemplo, de medula osea, sangre periferica movilizada (mediante por ejemplo leucaferesis), hngado fetal, saco vitelino y/o sangre del cordon umbilical del donante singenico o no singenico se pueden trasplantar a un receptor que padece una enfermedad.

De acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion, la enfermedad es una enfermedad maligna. De acuerdo con una realizacion espedfica, la enfermedad maligna es una neoplasia maligna de tejidos hematopoyeticos o linfoides. De acuerdo con otra realizacion espedfica, la enfermedad maligna es una neoplasia maligna de linfocitos B (es decir, que implica a los linfocitos B).

Tal enfermedad incluye, pero no se limita a, leucemia [por ejemplo, linfatica aguda, linfoblastica aguda, linfoblastica aguda de linfocitos pre-B, leucemia linfoblastica aguda de linfocitos T, megacarioblastica aguda, monodtica,

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mielogenica aguda, mieloide aguda, mieloide aguda con eosinofilia, de linfocitos B, basofflica, mieloide cronica, cronica, eosinofflica, de Friend, granulocftroa o mielocftica, de celulas pilosas, linfocftica, megacarioblastica, monocftica, monocftica-macrofago, mieloblastica, mieloide, mielomonocftica, de celulas plasmaticas, de linfocitos pre-B, promielocftica, subaguda, de linfocitos T, neoplasma linfoide, predisposicion a neoplasia maligna mieloide, leucemia no linfocftica aguda, leucemia linfocftica aguda de linfocitos T (T-ALL) y leucemia linfocftica cronica de linfocitos B (B-CLL)], linfoma [por ejemplo, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfocitos B, linfoma de linfocitos B grandes difusos (DLBCL), leucemia/linfoma linfocftica cronica de linfocitos B, linfoma de Burkitt, de linfocitos T, linfocitos T cutaneos, leucemia/linfoma de linfocitos T precursores, linfoma folicular, linfoma de celulas del manto, linfoma MALT, histiocitica, linfoblastica, timica y Mycosis fungoides], enfermedades asociadas con trasplante de un injerto (por ejemplo rechazo de injerto, rechazo de injerto cronico, rechazo de injerto sub-agudo, rechazo de injerto hiperagudo, rechazo de injerto agudo y enfermedad de injerto contra hospedador), enfermedades autoinmunitarias, tales como diabetes tipo 1, smdromes de inmunodeficiencia combinada graves (SCID), que incluyen adenosina desaminasa (ADA), osteoporosis, anemia aplasica, enfermedad de Gaucher, talasemia y otras anomaftas hematopoyeticas congenitas o geneticamente determinadas.

Se apreciara que las celulas hematopoyeticas singenicas o no singenicas (por ejemplo celulas hematopoyeticas inmaduras) de la presente divulgacion se pueden trasplantar en un receptor usando cualquier metodo conocido en la tecnica para el trasplante de celulas, tal como pero sin limitarse a, infusion de celulas (por ejemplo I.V.) o a traves de una via intraperitoneal.

Opcionalmente, cuando se trasplanta injerto de celula o de tejido de la presente divulgacion en un sujeto que tiene un organo defectuoso, puede ser ventajoso primero eliminar por lo menos parcialmente el organo afectado del sujeto para permitir el desarrollo optimo del injerto y la integracion estructural/funcional del mismo con la anatoirfta/fisiologfa del sujeto.

Despues del trasplante del injerto de celula o de tejido en el sujeto de acuerdo con las presentes ensenanzas, es aconsejable, de acuerdo con la practica medica estandar, controlar el desarrollo de la funcionalidad y de la inmunocompatibilidad del organo de acuerdo con una de las diversas tecnicas estandar. Por ejemplo, el desarrollo estructural de las celulas o tejidos se puede controlar mediante la obtencion de imagenes de tomograffa computarizada o ecograficas mientras que la incorporacion del injerto de la celula no singenica o los injertos de medula osea se pueden controlar por ejemplo mediante una prueba de quimerismo [por ejemplo, mediante procedimientos basados en PCR usando el analisis de repeticion en tandem corto (STR)].

Independientemente del tipo de trasplante, para evitar el rechazo del injerto y la enfermedad de injerto contra hospedador y para eliminar cualquier celula tumoral residual, el metodo de la presente divulgacion usa linfocitos Tcm anti-terceros.

De esta manera, de acuerdo con un aspecto de la presente divulgacion, al sujeto se le administra una cantidad terapeuticamente efectiva de una poblacion de celulas aislada que comprende celulas anti-terceros que no inducen enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo las celulas, celulas que inducen tolerancia y capaces de alojarse en los ganglios linfaticos despues del trasplante.

La frase “poblacion de celulas aislada” como se usa en la presente memoria se refiere a celulas que se han aislado de su medio ambiente natural (por ejemplo, el cuerpo humano).

El termino “no induce GVHD” como se usa en la presente memoria se refiere a no tener sustancialmente reactividad inductora de injerto contra hospedador. De esta manera, las celulas de la presente divulgacion se generan de forma que no provoquen significativamente enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD).

La frase “celulas anti-terceros” como se usa en la presente memoria se refiere a linfocitos (por ejemplo linfocitos T) que se dirigen (por ejemplo mediante reconocimiento de linfocitos T) contra un antfgeno o antfgenos de terceros.

Como se usa en la presente memoria, la frase “antigeno o antfgenos de terceros” se refiere a un antfgeno o antfgenos solubles o no solubles (tal como los asociados a la membrana) que no estan presentes ni en el donante ni en el receptor, como se representa con detalle a continuacion.

De acuerdo con una realizacion, el antfgeno o antfgenos de terceros de la presente divulgacion se seleccionan del grupo que consiste en celulas de terceros, un antfgeno celular, un antfgeno viral un antfgeno bacteriano, un extracto de protema, una protema purificada y un peptido sintetico presentado por celulas presentadoras autologas, celulas presentadoras no autologas o sobre una celula presentadora de vehfculo artificial o de antfgeno artificial.

Por ejemplo, los antfgenos de terceros pueden ser celulas de terceros, antfgenos de virus, tales como por ejemplo del virus de Epstein-Barr (EBV) o citomegalovirus (CMV) o antfgenos de bacterias, tal como flagelina. Los antfgenos virales o bacterianos se pueden presentar por celulas (por ejemplo, lmea de celulas) infectadas con los mismos o de otra manera fabricados para expresar protemas virales/bacterianas. Las celulas presentadoras de antfgenos

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autologas o no autologas se pueden usar para presentar peptidos sinteticos cortos fusionados o cargados en los mismos. Tales peptidos cortos pueden ser peptidos derivados virales o peptidos que representan cualquier otro antigeno.

Se puede usar software especializado para analizar secuencias virales u otras para identificar peptidos cortos inmunogenicos, es decir, peptidos presentables en el contexto del MHC clase I o MHC clase II.

Las celulas de terceros pueden ser alogenicas o xenogenicas con respecto al receptor (explicado con mayor detalle posteriormente). En el caso de las celulas de terceros alogenicas, tales celulas tienen antfgenos HLA diferentes de aquellos del donante pero que no sufren reaccion cruzada con los antfgenos HLA del receptor, de tal manera que las celulas anti-terceros generadas contra tales celulas no son reactivas contra un trasplante o los antigenos del receptor.

De acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion, las celulas de terceros alogenicas o xenogenicas son celulas estimuladoras tales como, pero sin limitarse a, celulas purificadas de linfocitos de sangre periferica (PBL), bazo o ganglios linfaticos, PBL movilizadas con citocina, celulas dendnticas presentadoras de antfgeno (APC) expandidas in vitro, lmeas de linfocitos B, celulas presentadoras de antfgeno (APC) tales como APC artificiales (por ejemplo lmea de celulas K562 transfectadas con HLA y/o moleculas co-estimuladoras).

De acuerdo con una realizacion, el antfgeno o antfgeno de terceros comprenden celulas dendnticas.

Los antfgenos de terceros se pueden presentar sobre las superficies celulares, virales o bacterianas o derivadas y/o purificadas de las mismas. Adicionalmente, un antfgeno viral, bacteriano o cualquier antfgeno extrano se puede expresar en una celula infectada o se puede expresar sobre un vehmulo artificial tal como un liposoma o una APC artificial (por fibroblasto o lmea de celulas leucemicas transfectadas con el antfgeno o antfgeno de terceros).

Ademas, los antfgenos de terceros pueden, por ejemplo, ser protemas extrafdas o purificadas a partir de una variedad de fuentes. Un ejemplo de una protema purificada que puede servir como un antfgeno de terceros de acuerdo con la presente invencion es la ovalbumina. Se contemplan otros ejemplos.

El uso de celulas, virus, bacterias, celulas presentadoras viralmente infectadas, infectadas con bacterias, de peptidos virales o de peptidos bacterianos como antfgenos de terceros es particularmente ventajoso puesto que tales antfgenos de terceros incluyen una disposicion diversa de determinantes antigenicos y como tal dirigen la formacion de celulas anti-terceros de una poblacion diversa, que puede servir adicionalmente en la rapida constitucion de linfocitos T en casos donde tal reconstitucion es requerida, por ejemplo, despues del procedimiento de irradiacion letal o sub-letal o quimioterapia.

Adicionalmente, cuando las celulas anti-terceros se dirigen contra antfgenos de terceros, es ventajoso obtener por lo menos alguna actividad de injerto contra enfermedad (por ejemplo, celulas cancerosas tal como injerto contra leucemia) debido a una destruccion independiente de TCR mediada por el enlace LFA1-ICAM1 [Arditti y colaboradores, Blood (2005) 105(8):3365-71. Epub 2004 Jul 6].

De acuerdo con algunas realizaciones, las celulas anti-terceros de la presente divulgacion comprenden un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm).

La frase “fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm)” como se usa en la presente memoria se refiere a un subconjunto de linfocitos T citotoxicos que se alojan en los ganglios linfaticos. Las celulas que tienen el fenotipo Tcm, en humanos, expresan generalmente CD8+/CD62L+/CD45R0+/L- selectina+/CD45RA-. De acuerdo con una realizacion mas espedfica el fenotipo Tcm comprende un distintivo CD8+/CD62L+. Se apreciara que los linfocitos Tcm pueden expresar todos los marcadores de distintivo en una sola celula o pueden expresar solamente parte de los marcadores de distintivo en una sola celula.

Se apreciara que por lo menos 30 %, por lo menos 40 %, por lo menos 50 %, por lo menos 55 %, por lo menos 60 %, por lo menos 65 %, por lo menos 70 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 % o por lo menos l00 % de la poblacion de celulas aislada comprenden celulas que tienen el distintivo de celulas.

Como se menciona, los linfocitos Tcm se alojan generalmente en los ganglios linfaticos despues del trasplante. De acuerdo con algunas realizaciones, los linfocitos Tcm anti-terceros de la presente divulgacion pueden alojarse en cualquiera de los ganglios linfaticos despues del trasplante, como por ejemplo, en los ganglios linfaticos perifericos y en los ganglios linfaticos mesentericos. La naturaleza migratoria de estas celulas les permite ejercer su efecto de tolerancia de una manera rapida y eficiente.

De esta manera, los linfocitos Tcm anti-terceros de la presente divulgacion son celulas inductoras de tolerancia.

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La frase “celulas inductoras de tolerancia” como se usa en la presente memoria se refiere a celulas que provocan una respuesta disminuida de las celulas del receptor (por ejemplo linfocitos T del receptor) cuando entran en contacto con las mismas. Las celulas inductoras de tolerancia incluyen celulas veto (es decir linfocitos T que conducen a la apoptosis de los linfocitos T del hospedador en el contacto con las mismas) como se ha descrito previamente en las publicaciones PCT Numeros WO 2001/049243 y WO 2002/102971.

El uso de celulas inductoras de tolerancia es especialmente beneficioso en situaciones en las cuales existe una necesidad de eliminar el rechazo del injerto y superar la enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD), tal como en el trasplante de celulas o tejidos alogenicos o xenogenicos.

De acuerdo con algunas realizaciones, los linfocitos Tcm de la presente divulgacion pueden ser celulas indiferenciadas (por ejemplo no geneticamente modificadas) o celulas geneticamente modificadas (por ejemplo celulas que se han disenado geneticamente para expresar o no expresar genes espedficos, marcadores o peptidos o para secretar o no secretar citocinas espedficas). Cualquier metodo conocido en la tecnica se puede implementar a la hora de modificar geneticamente las celulas, tal como mediante inactivacion del gen/genes relevantes o mediante la insercion de un ARN antisentido que interfiere con la expresion del polipeptido (ver por ejemplo W0/2000/039294).

Cualquier metodo usado para la generacion de celulas no alorreactivas anti-terceros (carentes de actividad de injerto contra hospedador (GVH)) se puede usar de acuerdo con las presentes ensenanzas.

Los linfocitos Tcm anti-terceros de la presente divulgacion se generan generalmente primero poniendo en contacto celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) singenicas o no singenicas con un antfgeno o antfgenos de terceros (tal como se describe en lo anterior) en un cultivo privado de citocinas (es decir, sin la adicion de citocinas). Esta etapa se lleva a cabo generalmente durante aproximadamente 12-72 horas, 24-48 horas, 1-10 dfas, 1-7 dfas, 15 dfas, 2-3 dfas o 2 dfas y permite la eliminacion de celulas reactivas GVH (por ejemplo linfocitos T). En otra alternativa, los linfocitos Tcm anti-terceros se pueden generar carentes de actividad de injerto contra hospedador (GVH) al complementar el cultivo de otra manera sin citocinas con IL-21 (0,001-3000 ng/ml, 10-1000 ng/ml, 10-100 ng/ml, 1-100 ng/ml, 0,1-100 ng/ml, 0,1-10 ng/ml, 1-50 ng/ml o 1-10 ng/ml). Esta etapa se lleva a cabo generalmente durante aproximadamente 12-72 horas, 24-48 horas, 1-10 dfas, 1-7 dfas, 1-5 dfas, 2-3 dfas o 3 dfas.

Despues, las celulas anti-terceros se cultivan en presencia de IL-15 (0,05-500 ng/ml, 0,001-3000 ng/ml, 10-1000 ng/ml, 10-100 ng/ml, 1-100 ng/ml, 0,1-100 ng/ml, 0,1-10 ng/ml, 1-50 ng/ml o 1-10 ng/ml. De acuerdo con una realizacion espedfica, la concentracion es 5 ng/ml) durante un penodo de aproximadamente 3-30 dfas, 6-30 dfas, 320 dfas, 10-20 dfas, 3-15 dfas, 5-15 dfas, 7-15 dfas, 7-14 dfas, 3-10 dfas, 3-7 dfas o 14 dfas en un entorno sin antfgeno. El cultivo se puede llevar a cabo adicionalmente en presencia de citocinas adicionales tales como IL-7 (0,05-500 ng/ml, 0,001-3000 ng/ml, 10-1000 ng/ml, 10-100 ng/ml, 1-100 ng/ml, 0,1-100 ng/ml, 0,1-10 ng/ml, 1-50 ng/ml o 1-10 ng/ml. De acuerdo con una realizacion espedfica la concentracion es 5 ng/ml) y/o IL-21 (0,001

3000 ng/ml, 0,001-3000 ng/ml, 10-1000 ng/ml, 10-100 ng/ml, 1-100 ng/ml, 0,1-100 ng/ml, 0,1-10 ng/ml, 1-50 ng/ml o 20-50 ng/ml. De acuerdo con una realizacion espedfica la concentracion es 30 ng/ml). Este proceso permite la proliferacion de celulas anti-terceros que comprenden un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) y que carecen de reactividad GVHD.

Se apreciara que se puede llevar a cabo una etapa adicional que permita la seleccion de linfocitos T CD8+, tal como mediante el uso de cuentas de MACS, antes del cultivo de las celulas en presencia de IL-15. Tal etapa puede ser beneficiosa con el fin de incrementar la pureza de las celulas CD8+ dentro del cultivo (es decir eliminar otros linfocitos dentro del cultivo celular, por ejemplo, linfocitos T CD4+) o con el fin de incrementar el numero de linfocitos T CD8+. De esta manera, el aislamiento de las celulas CD8+ se puede hacer antes del cultivo con el antfgeno o antfgenos de terceros o despues del cultivo con el antfgeno o antfgenos de terceros y antes del cultivo con CD15.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las PBMC singenicas (por ejemplo del sujeto) se pueden usar de acuerdo con las presentes ensenanzas (es decir en situaciones donde los linfocitos Tcm singenicos pueden ser beneficiosos para el tratamiento). Del mismo modo, las PBMC no singenicas (por ejemplo alogenicas o xenogenicas con respecto al sujeto) se pueden usar de acuerdo con las presentes ensenanzas. La fuente de las PBMC se determinara con respecto al uso previsto de las celulas (ver detalles adicionales) posteriormente en la presente) y estaran dentro de la capacidad de una persona experta en la tecnica, especialmente en vista de la divulgacion detallada proporcionada en la presente memoria.

Como se describe con detalle en la seccion de Ejemplos que sigue, los presentes inventores han mostrado que los linfocitos Tcm anti-terceros pueden tener el mismo origen que el injerto de celula o de tejido (por ejemplo celulas de la medula osea), espedficamente, se pueden derivar tanto de un donante singenico (por ejemplo del sujeto, ver Ejemplo 2 y Figuras 1A-I) o ambos se pueden derivar de un donante no singenico (por ejemplo de un donante alogenico, ver el Ejemplo 4 y Figuras 3A-I). A la inversa, los linfocitos Tcm anti-terceros pueden provenir de un origen diferente comparado con el injerto de celula o de tejido (por ejemplo las celulas de medula osea pueden provenir del sujeto y las celulas anti-terceros pueden provenir de un donante alogenico, Ejemplo 3 y Figuras 2A-G).

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De esta manera, de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion, los linfocitos Tcm anti-terceros pueden ser no singenicos (por ejemplo alogenicos o xenogenicos) tanto con el sujeto como con el injerto.

Como se usa en la presente memoria, la frase “no singenico tanto con el sujeto como con el injerto” en relacion con los linfocitos Tcm anti-terceros de la presente divulgacion califica los linfocitos Tcm anti-terceros como alogenicos o xenogenicos con el sujeto y alogenicos o xenogenicos con el injerto en cualquier combinacion. De esta manera, los linfocitos Tcm anti-terceros se pueden obtener de un origen diferente del sujeto y del donante del injerto.

De acuerdo con una realizacion espedfica, los linfocitos Tcm anti-terceros son no singenicos tanto con el sujeto como con el injerto (por ejemplo de un segundo donante).

De acuerdo con otra realizacion, los linfocitos Tcm anti-terceros pueden ser no singenicos con respecto a solo el sujeto. De acuerdo con otra realizacion, los linfocitos Tcm anti-terceros pueden ser no singenicos con respecto a solo el injerto de celula o de tejido.

De acuerdo con una realizacion, los linfocitos Tcm anti-terceros son no singenicos con el injerto y singenicos con el sujeto (por ejemplo de un origen autologo en situaciones en las cuales el injerto es de un origen no autologo).

De acuerdo con una realizacion espedfica, cuando el injerto comprende celulas hematopoyeticas inmaduras que no son singenicas con el sujeto (por ejemplo no autologas), la poblacion de celulas aislada son singenicas con el sujeto (por ejemplo autologas).

Como se usa en la presente memoria, la expresion “celulas hematopoyeticas inmaduras” se refiere a cualquier tipo de celulas incompletamente diferenciadas que son capaces de diferenciarse en uno o mas tipos de celulas hematopoyeticas completamente diferenciadas. Las celulas hematopoyeticas inmaduras incluyen sin limitacion tipos de celulas referidas en la tecnica como “celulas progenitoras”, “celulas precursoras”, “celulas madre”, “celulas pluripotentes”, “celulas multipotentes” y similares.

Preferiblemente las celulas hematopoyeticas inmaduras son celulas madre hematopoyeticas.

Preferiblemente, cuando las celulas hematopoyeticas inmaduras se derivan de un humano, las celulas hematopoyeticas inmaduras son celulas CD34+, tales como celulas CD34+CD133+.

Tipos de injertos de la presente divulgacion que comprenden celulas hematopoyeticas inmaduras incluyen injertos de celulas de medula osea completas (agotadas de linfocitos To no agotadas de linfocitos T), injertos de celulas hematopoyeticas inmaduras de aspirados de medula osea, injertos de celulas hematopoyeticas inmaduras de sangre periferica e injertos de celulas hematopoyeticas inmaduras derivadas del cordon umbilical. Se describen posteriormente en la presente metodos para obtener tales injertos.

Un injerto que comprende celulas madre hematopoyeticas derivadas de sangre periferica humanas se puede obtener de acuerdo con metodos estandar, por ejemplo movilizando celulas CD34+ en la sangre periferica mediante el tratamiento con citocinas del donante y recolectando las celulas CD34+ movilizadas mediante leucaferesis. Se proporciona una orientacion amplia en la literatura de la tecnica para practicar el aislamiento de celulas madre derivadas de medula osea de la medula osea o la sangre (vease, por ejemplo Arai S, Klingemann HG., 2003. 10 Arch Med Res. 34:545-53; y Repka T. y Weisdorf D., 1998. Curr Opin Oncol. 10:112-7; Janssen WE. y colaboradores, 1994. Cancer Control 1:225-230; Atkinson K., 1999. Curr Top Pathol. 92:107-36).

Un injerto de celulas madre hematopoyeticas derivadas de cordon umbilical humano se puede obtener de acuerdo con metodos estandar (vease, por ejemplo Quillen K, Berkman EM., 1996. J Hematother. 5:153-5).

Un injerto de celulas madre hematopoyeticas de la presente divulgacion tambien se puede derivar de tejido del tngado o saco vitelino.

Un numero requerido de celulas madre hematopoyeticas se puede proporcionar mediante la expansion ex vivo de celulas madre hematopoyeticas primarias (revisado en Emerson, 1996, Blood 87:3082, y descrito con mas detalle por Petzer y colaboradores, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3:1470; Zundstra y colaboradores, 1994, BioTechnology 12:909 y el documento WO 95 11692). De acuerdo con otra realizacion espedfica, cuando el injerto comprende celulas hematopoyeticas inmaduras que no son singenicas con el sujeto (por ejemplo no autologas), la poblacion de celulas aislada no son singenicas tanto con el sujeto como con el injerto. (Por ejemplo las celulas hematopoyeticas inmaduras y la poblacion de celulas aislada son de diferentes donantes).

De acuerdo con otra realizacion, se proporciona un metodo para tratar una enfermedad en un sujeto en necesidad del mismo, comprendiendo el metodo: (a) trasplantar celulas hematopoyeticas inmaduras al sujeto y (b) administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de una poblacion de celulas aislada que comprende celulas anti- terceros que no inducen enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo las celulas, celulas inductoras de tolerancia y capaces de alojarse en los ganglios linfaticos despues del trasplante, en el que cuando las celulas hematopoyeticas inmaduras son singenicas con el

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sujeto, la poblacion de celulas aislada se selecciona de forma que sean singenicas con el sujeto o no singenicas con el sujeto.

De acuerdo con una realizacion espedfica, tanto las celulas hematopoyeticas inmaduras como la poblacion aislada de celulas son autologas (por ejemplo del sujeto).

De acuerdo con otra realizacion espedfica, las celulas hematopoyeticas inmaduras son autologas (por ejemplo del sujeto) y la poblacion de celulas aislada no son autologas (por ejemplo de un donante).

De acuerdo con otra realizacion, se proporciona un metodo para tratar una enfermedad en un sujeto en necesidad del mismo, comprendiendo el metodo: (a) trasplantar celulas hematopoyeticas inmaduras al sujeto y (b) administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de una poblacion de celulas aislada que comprende celulas anti- terceros que no inducen enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo las celulas, celulas inductoras de tolerancia y capaces de alojarse en los ganglios linfaticos despues del trasplante, en el que cuando las celulas hematopoyeticas inmaduras no son singenicas con el sujeto, la poblacion de celulas aislada se selecciona de forma que sean singenicas con el sujeto o no singenicas ni con el sujeto ni con las celulas hematopoyeticas inmaduras.

De acuerdo con una realizacion espedfica, las celulas hematopoyeticas inmaduras no son autologas (por ejemplo de un donante) y la poblacion de celulas aislada son autologas (por ejemplo del sujeto).

De acuerdo con otra realizacion, cuando las celulas hematopoyeticas inmaduras no son singenicas con el sujeto (por ejemplo no autologas), los linfocitos Tcm anti-terceros no son singenicos ni con el sujeto ni con el injerto (por ejemplo dos donantes diferentes).

De acuerdo con una realizacion espedfica, las celulas hematopoyeticas inmaduras y la poblacion de celulas aislada son de diferentes donantes.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente divulgacion, se proporciona una poblacion de celulas aislada que comprende celulas anti-terceros que no inducen enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo las celulas, celulas inductoras de tolerancia y capaces de alojarse en los ganglios linfaticos despues del trasplante y en el que adicionalmente las celulas no son singenicas ni con un sujeto ni con un injerto de celula o de tejido.

(i) no singenicas ni con un sujeto hospedador ni con un injerto; o

(ii) no singenicas con un injerto y singenicas con un sujeto hospedador.

De acuerdo con una realizacion, las celulas no singenicas con el injerto y singenicas con el sujeto hospedador son autologas.

De esta manera, la presente divulgacion contempla la administracion a un sujeto de linfocitos Tcm anti-terceros (por ejemplo no singenicos ni con el sujeto ni con el injerto o no singenicos con el injerto y singenicos con el sujeto) lo cual da por resultado la erradicacion de una enfermedad (por ejemplo leucemia o linfoma) y aumentara concomitantemente la incorporacion de un trasplante de celula o de tejido (por ejemplo celulas de medula osea autologas o no autologas) al ser celulas tolerogenicas y no GVHD.

Se apreciara que las celulas anti-terceros se pueden administrar concomitantemente con un injerto de celula o de tejido (por ejemplo con una terapia adyuvante), se pueden administrar antes del trasplante de un injerto de celula o de tejido (por ejemplo a fin de erradicar celulas cancerosas o residuales antes del trasplante y de eliminar el rechazo de injerto y la enfermedad de injerto contra hospedador) o se puede administrar despues del trasplante de un injerto de celula o de tejido (por ejemplo a fin de erradicar celulas cancerosas residuales despues del trasplante y de eliminar el rechazo del injerto y la enfermedad de injerto contra hospedador).

Se apreciara que las celulas anti-terceros se pueden administrar en cualquier momento despues del trasplante. Generalmente, los linfocitos Tcm anti-terceros se administran en el dfa 0, dfa 1, dfa 2, dfa 3, dfa 4, dfa 5, dfa 6, dfa 7, dfa 8 o dfa 10 despues del trasplante. Sin embargo, los linfocitos Tcm anti-terceros se pueden administrar en tiempos prolongados despues del trasplante, como por ejemplo, dos semanas, un mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 18 meses o 24 meses despues del trasplante.

Los linfocitos Tcm anti-terceros se pueden administrar a traves de cualquier metodo conocido en la tecnica para el trasplante de celulas, tal como pero sin limitarse a, infusion de celulas (por ejemplo I.V.) o a traves de una via intraperitoneal.

Sin estar limitado por la teona, una cantidad terapeuticamente es una cantidad, de linfocitos Tcm anti-terceros eficaz para la tolerizacion, efecto anti-tumor y/o reconstitucion inmunitaria sin inducir GVHD. Puesto que los linfocitos Tcm

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de la presente divulgacion se alojan en los ganglios linfaticos despues del trasplante, pueden ser necesarias cantidades menores de celulas (comparado con la dosis de celulas previamente usada, ver por ejemplo el documento WO 2001/049243) para lograr el efecto/s beneficioso de las celulas (por ejemplo, tolerizacion, efecto anti-tumor y/o reconstitucion inmunitaria). Se apreciara que niveles menores de farmacos inmunosupresores pueden ser necesarios junto con los linfocitos Tcm de la presente divulgacion (tal como exclusion de rapamicina del protocolo terapeutico).

La determinacion de la cantidad terapeuticamente efectiva esta perfectamente dentro de la capacidad de aquellos expertos en la tecnica, especialmente en vista de la divulgacion detallada proporcionada en la presente memoria.

Para cualquier preparacion usada en los metodos de la divulgacion, la cantidad o dosis terapeuticamente eficaz se puede estimar inicialmente de ensayos de cultivo in vitro y celulares. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr una concentracion o tftulo deseado. Tal informacion se puede usar para determinar mas con precision dosis utiles en humanos.

Por ejemplo, en el caso de injerto de tejido el numero de linfocitos Tcm anti-terceros perfundidos a un receptor debe ser mas de 1 x 104/kg de peso corporal. El numero de linfocitos Tcm anti-terceros perfundidos a un receptor debe estar generalmente en el intervalo de 1 x 104/kg de peso corporal a 1 x 109/Kg de peso corporal.

A fin de facilitar la incorporacion del injerto de celula o de tejido, el metodo puede comprender ventajosamente ademas acondicionar el sujeto con un regimen inmunosupresor antes de, concomitantemente con, o despues del trasplante del injerto de celula o de tejido.

De esta manera, de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion, el sujeto se condiciona bajo condiciones subletales, letales o supraletales antes del trasplante de un injerto de celula o de tejido.

Por ejemplo, el sujeto se puede tratar con un acondicionamiento mieloablativo o no mieloablativo. El tipo de acondicionamiento se puede determinar por una persona de experiencia ordinaria en la tecnica y tiene en cuenta la edad y gravedad de la enfermedad del sujeto. De esta manera, por ejemplo, un sujeto de edad (por ejemplo una persona de mas de 40 anos de edad) se puede tratar con un regimen inmunosupresor suave.

Los ejemplos de tipos adecuados de regfmenes inmunosupresores incluyen administracion de farmacos inmunosupresores, poblaciones de celulas inductoras de tolerancia (como se describe con detalle en lo anterior en la presente memoria) y/o irradiacion inmunosupresora.

La orientacion amplia para seleccionar y administrar regfmenes inmunosupresores adecuados para el trasplante se proporcionan en la literatura de la tecnica (por ejemplo, vease: Kirkpatrick CH. and Rowlands DT Jr., 1992. JAMA. 268, 2952; Higgins RM. y colaboradores, 1996. Lancet 348, 1208; Suthanthiran M. y Strom TB., 1996. New Engl. J. Med. 331, 365; Midthun DE. y colaboradores, 1997. Mayo Clin Proc. 72, 175; Morrison VA. y colaboradores, 1994. Am J Med. 97, 14; Hanto DW, 1995. Annu Rev Med. 46, 381; Senderowicz AM. y colaboradores, 1997. Ann Intern Med. 126, 882; Vincenti F. y colaboradores, 1998. New Engl. J. Med. 338, 161; Dantal J. y colaboradores 1998. Lancet 351, 623).

Preferiblemente, el regimen inmunosupresor consiste en administrar por lo menos un agente inmunosupresor al sujeto.

Los ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen, pero no se limitan a, metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina (sulfasalazopirina), sales de oro, D- penicilamina, leflunomida, azatioprina, anakinra, infliximab (REMICADE), etanercept, bloqueadores de TNF-alfa, un agente biologico dirigido a una citocina inflamatoria y farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). Los ejemplos de AINE incluyen, pero no se limitan a, acido acetil salidlico, salicilato de colina y magnesio, diflunisal, salicilato de magnesio, salsalato, salicilato de sodio, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina, ketoprofeno, ketorolaco, meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tolmetina, paracetamol, ibuprofeno, inhibidores de Cox-2, tramadol, rapamicina (sirolimus) y analogos de rapamicina (tales como CCI-779, RAD001, AP23573). Estos agentes se pueden administrar individualmente o en combinacion.

Como se usa en la presente memoria, el termino “aproximadamente” se refiere a ± 10 %.

Los terminos y expresiones “comprende”, “que comprende”, “incluye”, “que incluye”, “que tiene” y sus conjugados significan “que incluyen pero no se limitan a”.

La expresion “que consiste en” significa “que incluye y se limita a”.

La expresion “que consiste esencialmente en” significa que la composicion, metodo o estructura pueden incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solamente si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las caractensticas basicas y novedosas de la composicion, metodo o estructura reivindicadas.

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Como se usa en la presente memoria, la forma singular “un”, “una”, y “el”, “la” incluyen referencias plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. Por ejemplo, la expresion “un compuesto” o “por lo menos un compuesto” puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

A lo largo de esta solicitud, varias realizaciones de esta invencion se pueden presentar en un formato de intervalo. Se debe entender que la descripcion en formato de intervalo es simplemente para conveniencia y brevedad y no se debe considerar como una limitacion inflexible en el alcance de la invencion. Por consiguiente, la descripcion de un intervalo se debe considerar que ha divulgado espedficamente todos los subintervalos posibles, asf como los valores numericos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, la descripcion de un intervalo tal como de 1 a 6 se debe considerar que tiene subintervalos espedficamente divulgados tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., asf como numeros individuales dentro de este intervalo, 1, 2,3, 4, 5 y 6. Esto

aplica sin considerar la amplitud del intervalo.

Siempre que un intervalo numerico se indique en la presente memoria, se pretende que incluya cualquier numero citado (fraccionario y entero) dentro del intervalo indicado. Las frases “que vana/vana entre” un primer numero indicado y un segundo numero indicado y “que vana/vana de” un primer numero indicado “a” un segundo numero indicado se usan en la presente indistintamente y se pretende que incluyan el primero y segundo numeros indicados y todos los numeros fraccionarios y enteros entre los mismos.

Como se usa en la presente memoria, el termino “metodo” se refiere a maneras, medios, tecnicas y procedimientos para lograr una tarea dada incluyendo, pero sin limitarse a, aquellas maneras, medios, tecnicas y procedimientos ya sea conocidos por, o desarrollados facilmente a partir de maneras, medios, tecnicas y procedimientos conocidos por los profesionales de las tecnicas qmmica, farmacologica, biologica, bioqmmica y medica.

Se aprecia que ciertas caractensticas de la invencion, que son, para claridad, descritas en el contexto de realizaciones separadas, tambien se pueden proporcionar en combinacion en una sola realizacion. A la inversa, varias caractensticas de la invencion, que son, por brevedad, descritas en el contexto de una sola realizacion, tambien se pueden proporcionar separadamente o en cualquier subcombinacion adecuada o como sea adecuado en cualquier otra realizacion descrita de la invencion. Ciertas caractensticas descritas en el contexto de varias realizaciones no se van a considerar caractensticas esenciales de aquellas realizaciones, a menos que la realizacion sea inoperativa sin aquellos elementos.

Varias realizaciones y aspectos de la presente invencion como se exponen anteriormente en la presente memoria y como se reivindican en la seccion de reivindicaciones posterior encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Se hace referencia ahora a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invencion en una forma no limitante.

En general, la nomenclatura usada en la presente memoria y en los procedimientos de laboratorio usados en la presente invencion incluyen tecnicas moleculares, bioqmmicas, microbiologicas y de ADN recombinante. Tales tecnicas se explican detalladamente en la literatura. Ver, por ejemplo, “Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 14, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologfas como las expuestas en las patentes US- 4.666.828; US-4.683.202; US-4.801.531; US-5.192.659 y US-5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Current Protocols in Immunology” Volumenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8a edicion), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen extensamente en la literatura de patentes y cientffica, ver, por ejemplo, patentes US-3.791.932; US-3.839.153; US-3.850.752; US-3.850.578; US-3.853.987; US-3.867.517; US-3.879.262; US-3.901.654; US-3.935.074; US-3.984.533; US-3.996.345; US-4.034.074; US-4.098.876; US-4.879.219; US- 5.011.771 y 5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., y Higgins S. J., Eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” iRl Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) y “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996). Otras referencias generales se proporcionan a lo largo de este documento. Los procedimientos de la presente memoria se cree que son bien conocidos en la tecnica y se proporcionan para la conveniencia del lector. Toda la informacion contenida en la presente memoria se incorpora en este documento a manera de referencia.

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Materiales generales y procedimientos experimental Animales

Ratones BALB/c, CB6 (Fl), FVB, C57BL/6, y BALB/c-NUDE de 6 a 12 semanas de edad hembras se obtuvieron de Hanan Laboratories. La progenie de ratones B6-NUDE se reprodujeron en el Weizmann Institute Animal Center. Todos los ratones se mantuvieron en jaulas pequenas (5 animales en cada jaula) y se alimentaron con alimento esteril y agua acida. Todos los estudios se aprobaron por el Weizmann Institute of Science Institutional Animal Care and Use Committee.

Celulas

La lmea de celulas de linfoma murino A20, lmea de linfoma/leucemia de linfocitos B derivadas de BALb/c (H-2d), descrita previamente [Kim KJ y colaboradores, J. Immunol. (1979) 122: 549-554] y el transfectante estable de A20, el A20 yfp/luc+, descrito previamente [Edinger M y colaboradores, Blood. (2003) 101: 640-648] se mantuvieron en un medio RPMI 1640 complementado con FCS al 5 %, glutamina 2 mM, aminoacidos no esenciales, antibioticos y 2-p- mercaptoetanol 50 pM.

Preparacion de Tcm anti-terceros no reactivos del hospedador

Los Tcm anti-terceros se prepararon como se describe previamente [Ophir E y colaboradores, Blood (2010) 115:2095-2104] brevemente, se cultivaron esplenocitos de los ratones donantes contra esplenocitos de terceros irradiados durante 60 horas bajo deprivacion de citocina. Subsecuentemente, se seleccionaron positivamente celulas CD8+ usando Partmulas Magneticas (BD Pharmingen) y se cultivaron en un medio sin Ag. Se anadio rhIL-15 (20 ng/ml; R&D Systems) cada segundo dfa. Para lograr una poblacion purificada al final del cultivo (dfa 16), los linfocitos Tcm se seleccionaron positivamente para la expresion de CD62L mediante clasificacion de celulas activadas magneticas [MACS, Milteny, Bergisch Gladbach, Alemania].

Analisis citometrico de flujo

Se llevo a cabo el analisis de clasificacion de celulas activadas con fluorescencia (FACS) usando un FACScan de Becton Dickinson modificado. Las celulas se tineron con anticuerpos etiquetados espedficos para CD8-ficoeritrina (PE)/isotiocianato de fluorescema (FITQ/aloficocianina (APC) (BD Pharmingen), CalceinAM (Molecular Probes, INC., Eugene, OR, EE.UU.). La tincion se realizo con Anexina V y 7-amino-actinomicina D (7AAD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BD Pharmingen).

Cultivo MLR y ensayo de citotoxicidad

Las celulas de linfoma y los linfocitos Tcm anti-terceros obtuvieron mediante centrifugacion por gradiente de densidad Ficoll y las celulas de linfoma se etiquetaron con 0,15 pg/ml de CalceinAM (Molecular Probes, INC. Eugene, OR, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se llevo a una concentracion de 1 x 106 celulas/ml en el medio requerido. Se incubaron 3 x 105 de las celulas de linfoma con CTL anti-terceros de acuerdo con las relaciones indicadas e intervalos de tiempo para placas de 24 pocillos. Las celulas se recubrieron y se analizaron para supervivencia usando marcadores de superficie tales como Anexina-V (BD) y midiendo el numero de celulas de linfoma tenidas con CalceinAM mediante FACS.

Deteccion de apoptosis mediante tincion con Anexina V

Se uso APC Anexina V para detectar celulas apoptoticas. Las muestras de cultivos in vitro se incubaron con una mezcla de anticuerpos monoclonales seleccionados etiquetados con fluorocromos diferentes durante 20 minutos a 4° C. Despues de lavar el anticuerpo libre no unido usando una solucion tampon de union a Anexina-V, las muestras se complementaron con 5 pl de Anexina V-APC (BD). A continuacion, las celulas se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad y se lavaron con una solucion tampon de union a Anexina-V. Las muestras se analizaron mediante FACS para determinar las celulas vivas que se tineron positivamente de Anexina- V.

Modelo in vivo de enfermedad residual minima

Ratones receptores BALB/c hembra de 12 semanas de edad se expusieron a una sola dosis de irradiacion de cuerpo total (TBI) de 8 Gy de una fuente de rayos Gamma 150-A 60 Co (fabricado por Atomic Energy of Canada, Kanata, ON, Canada) (dia -1). Al siguiente dia (dia 0) los ratones receptores se infundieron intravenosamente con 3 x 106 de medula osea agotada de linfocitos T de ratones BALb/c-Nude (singenicos) o con 3 x 106 de medula osea agotada de linfocitos T de ratones B6-Nude, complementadas con 5 x 103 celulas de linfoma A20 luc por raton. Al siguiente dfa (dfa +1) los ratones recibieron o no recibieron 10 x 106 de Tcm anti-terceros derivados de BALB/c (singenicos) o 5 x 106 de Tcm anti-terceros derivados de C57BL/6 (alogenicos), intravenosamente. La localizacion

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del tumor, los patrones migratorios de las celulas A20 y la reactividad anti-linfoma de los CTL anti-terceros se examinaron usando un sistema de estudio de imagen in vivo.

Estudio de imagen in vivo

Se anestesiaron ratones con cetamina (100 mg/kg intraperitonealmente (i.p) (Kepro Holand, Holanda) y xilazina (Kepro Holand, Holanda) (20 mg/kg i.p), y se inyecto una solucion acuosa de D-Luciferina (150 mg/kg i.p). (N.° Cat XR-1001, 30 mg/ml en PBS; Xenogen) 10 minutos antes del estudio de imagen. Los animales se colocaron en la camara a prueba de luz del sistema estudio de imagen In vivo Imaging system (IVIS® 100, Xenogen) acoplada con una camara de dispositivo de carga acoplada (CCD) Pixelfly QE (PCO, K, Alemania) en el Department of Veterinary Resources del Weizmann Institute. Se tomo una imagen de referencia de la superficie corporal en escala de grises (fotograffa digital) despues de una exposicion de 10 segundos, bajo iluminacion potente. El procesamiento de los datos de las imagenes y el analisis se llevaron a cabo con el software Living Image 2.5. Se hizo un control del crecimiento del tumor de los ratones desde el dfa 14 en intervalos semanales.

Analisis estadfstico

El analisis de los datos de supervivencia se llevo a cabo usando curvas de Kaplan-Meier (prueba del rango logantmico). La comparacion de medios se condujo usando la prueba t de Student.

EJEMPLO 1

Establecimiento de un modelo de raton

Para establecer un modelo de raton apropiado, los inventores verificaron inicialmente que los linfocitos Tcm anti- terceros derivados de (B6 x BALB/c)Fl muestran destruccion independiente de TCR de las celulas de linfoma A20 de origen BALB/c (34,8 ± 12,1 % en 4 experimentos, relacion de linfocitos Tcm/celulas de linfoma 5:1, en comparacion con celulas A20 incubadas sin Tcm, p<0,05). Por otra parte, despues de 16 horas de incubacion con linfocitos Tcm, la tincion con AnexinaV de celulas a20 se aumento significativamente comparado con el nivel de tincion basal (14,8 ± 4,5 % y 5,2 ± 2,2 % respectivamente, en 3 experimentos, p<0,05), lo que sugieren un mecanismo basado en la apoptosis, similar a aquel descrito previamente para la destruccion de celulas de linfoma humano [Lask A y colaboradores (enviado 2010); Arditti FD y colaboradores, Blood (2005) 105:3365-3371],

EJEMPLO 2

Protocolo de tratamiento para trasplante de medula osea singenico y linfocitos Tcm

Usando celulas A20 que expresan luciferasa, los inventores fueron capaces de seguir el destino de las celulas malignas in vivo y estudiar el efecto anti-linfoma de los Tcm anti-terceros del donante anadidos al trasplante de medula osea (BMT, en lo sucesivo) singenico o alogenico en un modelo de simulacion de enfermedad residual minima. En el modelo singenico, 3 x 106 celulas de medula osea Nude BALB/c se trasplantaron en ratones BALB/c letalmente irradiados junto con 5000 celulas A20. Al siguiente dfa, se infundieron Tcm singenicos. Como se puede observar en las Figuras 1A-D, ninguno de los ratones no tratados sobrevivio (0/7) 100 dfas despues del trasplante de medula osea (BMT, mediana de la supervivencia 23 dfas). Sin embargo, la administracion de 1 x 107 o 2 x 107 linfocitos Tcm singenicos condujo a una carga tumoral significativamente disminuida (Figuras 1E-H) y un aumento de la supervivencia total del 28 % de los ratones (2/7, P<0,0001) y 40 % de los ratones (2/5, P<0,002) 100 dfas despues del BMT, con una mediana de la supervivencia de 49 y 80 dfas, respectivamente (Figura 1I).

EJEMPLO 3

Protocolo de tratamiento para trasplante de medula osea singenico y linfocitos Tcm alogenicos

Un estudio previo llevado a cabo en el laboratorio de los inventores [Ophir E. y colaboradores, Blood (2010) 115: 2095-2104] mostro que los linfocitos Tcm anti-terceros estaban dotados de actividad tolerizante, lo que se traduda en persistencia prolongado despues del BMT, incluso cuando se usaban donantes parcialmente compatibles. Los inventores sometieron a prueba por lo tanto en el modelo de BMT singenico descrito anteriormente el efecto anti- linfoma de 2 x 107 linfocitos Tcm derivados de F1 (CB6), reemplazando los linfocitos Tcm singenicos administrados previamente. Aunque era de esperar que estos linfocitos Tcm derivados de F1 se rechazasen debido a la incompatibilidad MHC, estos estaban continuamente presentes y no se rechazaron aun 2 meses despues del trasplante (datos no mostrados). Su persistencia a largo plazo fue probablemente el resultado de su actividad tolerizante descrita anteriormente. El efecto clmico significativo de estos linfocitos Tcm, derivados de F1 se demostro por una supervivencia total mejorada del 57,1 % de los ratones (4/7, Figuras 2D-G) en comparacion con la supervivencia del 0 % de los ratones (0/5, Figuras 2A-C y 2G) en el grupo no tratado. De esta manera, estos resultados muestran concluyentemente que los linfocitos Tcm anti-terceros, derivados de donantes alogenicos, se pueden usar como terapia celular contra neoplasias malignas de linfocitos B, ya sea solos o combinados con celulas de la medula osea.

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EJEMPLO 4

Protocolo de tratamiento para trasplante de medula osea alogenico y linfocitos Tcm alogenicos

Cuando se examinaba en el contexto alogenico, se observaba una mayor erradicacion del tumor. Este efecto fue probablemente debido a la alorreactividad residual que proporciono un efecto de injerto contra leucemia/linfoma (GVL) adicional sobre la destruccion de celulas independientes del receptor de linfocitos T (TCR) recientemente descubierto. Significativamente, este efecto aditivo se logro sin provocar GVHD. En este modelo alogenico, se trasplantaron 3 x 106 celulas de medula osea Nude B6 alogenicas junto con 5000 celulas A20 en ratones BALB/c letalmente irradiados. Al siguiente dfa, los ratones se trataron con Tcm de tipo donante. De forma similar a los resultados obtenidos en el modelo singenico (descrito en el Ejemplo 2 y 3, anterior), ninguno de los ratones no tratados sobrevivio 100 dfas despues del BMT (0/8, mediana de la supervivencia 23 dfas, Figuras 3A-D y 3l), mientras que la administracion de 5 x 106 linfocitos Tcm de tipo donante, condujo a una supervivencia total notable de 100 % (7/7) 100 dfas despues del BMT (Figuras 3E-I). Aunque los linfocitos Tcm alogenicos mostraron actividad de GVL aumentada comparado con los linfocitos Tcm singenicos, este efecto no se asocio con ninguna manifestacion de GVHD. De esta manera, como se ha descrito previamente, el peso y apariencia total de los ratones que reciben linfocitos Tcm anti-terceros alogenicos fueron los mismos que los de los ratones en el grupo de control, radioprotegidos con un trasplante de medula osea Nude solo.

En conjunto, los presentes inventores demostraron por primera vez, mediante estudios de imagen in vivo, la reactividad GVL de los Tcm anti-terceros murinos. Estos resultados sugieren que los linfocitos Tcm anti-terceros pueden proporcionar un “doble efecto de apoyo” al promover tanto la incorporacion del injerto de medula osea, como inducir concurrentemente la reactividad GVL sin provocar GVHD. Dicha terapia celular es muy atractiva, en particular para pacientes de edad con B-CLL y otras neoplasias malignas de linfocitos B que no podnan tolerar el acondicionamiento agresivo y se puede desarrollar potencialmente en un producto comercial facilmente disponible, que se usa como una terapia de celulas anti-cancer.

EJEMPLO 5

Generacion de linfocitos T de memoria central anti-terceros MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Enriquecimiento de linfocitos T CD8+ indiferenciados

Se obtuvieron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) mediante centrifugacion con gradiente de densidad Ficoll de capas leucocitarias de donantes sanos. Las PBMC del donante se transfirieron a continuacion a una solucion de congelacion de DMSO al 10 % y se crioconservaron en nitrogeno lfquido.

En el dfa -2: las PBMC congeladas del donante se descongelaron rapidamente en un bano de agua a 37 ° C y se transfirieron a un medio de descongelacion caliente (Cellgro DC complementado con suero humano al 10 % y medio Pen/Strep suplementado con Nucleasa Benzonase® para evitar la formacion de grumos de celulas como resultado de la deshidratacion de las celulas). Las PBMC del donante descongeladas se lavaron dos veces con medio de descongelacion caliente. A fin de agotar las celulas adherentes, las PBMC del donante se resuspendieron despues en un medio de cultivo (Cellgro DC complementado con suero humano al 5 % y Pen/Strep y 10 ng/ml de IL-7) y se colocaron en placas en placas de 6 pocillos especialmente recubiertas para incubacion durante la noche a 37° C.

En el dia -1: Se extrajeron las celulas no adherentes (este proceso incremento la concentracion de los linfocitos T deseados, eliminado los monocitos adheridos y ademas se permitio que las celulas descongeladas se recuperaran del proceso de descongelacion antes de ser sometidos al proceso de enriquecimiento magnetico).

En el dia 0: Se aislaron linfocitos T CD8+ no tocados usando el equipo de aislamiento CD8 de Miltenyi de acuerdo con el protocolo del fabricante. Despues, los linfocitos T CD8 con fenotipo indiferenciado se obtuvieron de la poblacion CD8 total mediante el agotamiento de las celulas que expresan el marcador de activacion CD45RO usando cuentas magneticas CD45RO.

Generacion de celulas dendnticas (DC) derivadas de monocitos

Las DC derivadas de monocitos se generaron de PBMC crioconservadas alogenicas. Los monocitos se enriquecieron de las PBMC mediante adherencia plastica y se cultivaron en GM-CSF e IL-4 durante el transcurso de 3 dfas. Se indujo la maduracion durante las ultimas 24 horas del cultivo con la adicion de LPS e IFN- y.

Generacion de linfocitos Tcm anti-terceros (linfocitos T CD8 indiferenciados dirigidos a DC derivadas de monocitos)

Los linfocitos T CD8+ indiferenciados se activaron con DC derivadas de monocitos irradiadas (30 gy) en una relacion de 1:0,25, en un medio de cultivo (Cellgro DC complementado con suero humano al 5 % y Pen/Strep)

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complementado con IL-21 durante 3 dfas. Despues, los linfocitos T CD8+ no recibieron activacion adicional y se desarrollaron con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 12.

RESULTADOS

En el dfa 11 de cultivo, la composicion celular y el fenotipo de las celulas se evaluaron usando analisis FACS y el numero de celulas se determino por exclusion con azul de tripano. Los resultados indicaron que la composicion de celulas (de Lymphogate, los datos no se muestran) comprendfa predominantemente 94,6 % de linfocitos T CD8+ (CD3+CD8+), con trazas de 1,2 % de celulas NK CD56+ (CD3- CD56+) y 1,1 % de linfocitos T NK (CD3+CD56+). Adicionalmente, los linfocitos T CD8+ comprendfa predominantemente 76 % de linfocitos Tcm, 9 % de linfocitos indiferenciados, 8,5 % de Teff/Tem y 6,5 % de Temra.

EJEMPLO 6

Ensayo de injerto de Tcm contra leucemia (GVL)

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Ensayo GVL

Las lmeas de linfocitos B se etiquetaron con 0,15 pg/ml de CalceinAM, un tinte vital que se libera durante la muerte de las celulas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuacion, 0,3 x 106 de lmeas de celulas etiquetadas con calcema se incubaron con o sin 1,5 x 106 Tcm anti-terceros durante 22 horas en placas de 24 pocillos. Las citocinas no exogenas se anadieron al MLR. Despues de 22 horas las celulas se recuperaron y se analizaron para determinar la supervivencia midiendo el numero de linfocitos tenidos con calcema supervivientes mediante FACS.

Para obtener valores absolutos de celulas, las muestras se suspendieron en volumen constante y se obtuvieron los recuentos citometricos de flujo para cada muestra durante un penodo de tiempo predeterminado, constante y se compararon los recuentos citometricos de flujo obtenidos con volumen fijo y numeros fijos de celulas de entrada.

Deteccion de apoptosis

Para la deteccion de la apoptosis por tincion con AnexinaV, las muestras se incubaron con 5 pl de AnexinaV-APC (BD) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, la AnexinaV no unida se lavo y las muestras se analizaron mediante FACS.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de generacion in vitro de una poblacion de celulas aislada que comprende celulas anti-terceros que no inducen enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), comprendiendo dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) un distintivo CD8+/CD62L+/CD45RO+ y en el que al menos el 50 % de la poblacion de celulas aislada tienen dicho distintivo, siendo dichas celulas, celulas que inducen tolerancia y capaces de alojarse en los ganglios linfaticos despues del trasplante, comprendiendo el metodo:

   (a) poner en contacto las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) con un antigeno o antigenos de terceros en presencia de IL-21 en condiciones que permiten la eliminacion de las celulas reactivas GVH y

   (b) cultivar dichas celulas resultantes de la etapa (a) en presencia de IL-15 en un entorno libre de antigeno en condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), generando de ese modo la poblacion de celulas aislada.
2. 2. Una poblacion de celulas aislada que comprende celulas anti-terceros que no inducen enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), comprendiendo dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) un distintivo CD8+/CD62L+/CD45RO+ y en el que al menos el 50 % de la poblacion de celulas aislada tienen dicho distintivo, siendo dichas celulas, celulas que inducen tolerancia y capaces de alojarse en los ganglios linfaticos despues del trasplante, para su uso como un tratamiento adyuvante para la erradicacion de una enfermedad en un sujeto que ha sido trasplantado con un injerto de celula o de tejido no singenico, en el que dichas celulas son:

   (i) no singenicas con el sujeto y dicho injerto o

   (ii) no singenicas con dicho injerto y singenicas con el sujeto.
3. 3. La poblacion de celulas aislada para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que dicho injerto de celula o de tejido no es autologo y dicha poblacion de celulas aislada son autologas.
4. 4. La poblacion de celulas aislada para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que dicho injerto de celula o de tejido y dicha poblacion de celulas aislada son de diferentes donantes.
5. 5. La poblacion de celulas aislada para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que dicha enfermedad comprende una neoplasia maligna y opcionalmente una neoplasia maligna de linfocitos B.
6. 6. La poblacion de celulas aislada para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que dicho injerto comprende celulas de medula osea y opcionalmente celulas hematopoyeticas inmaduras.
7. 7. La poblacion de celulas aislada para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que dichas celulas hematopoyeticas inmaduras no son singenicas con el sujeto y dicha poblacion de celulas aislada son singenicas con el sujeto.
8. 8. La poblacion de celulas aislada para su uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que dichas celulas hematopoyeticas inmaduras no son autologas y dicha poblacion de celulas aislada son autologas.
9. 9. La poblacion de celulas aislada para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que dichas celulas hematopoyeticas inmaduras no son singenicas con el sujeto y dicha poblacion de celulas aislada no son singenicas ni con el sujeto ni con dicho injerto.
10. 10. La poblacion de celulas aislada para su uso de acuerdo con la reivindicacion 9, en la que dichas celulas hematopoyeticas inmaduras y dicha poblacion de celulas aisladas son de diferentes donantes.
11. 11. El metodo de la reivindicacion 1 o la poblacion de celulas aislada para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que dichos ganglios linfaticos comprenden ganglios linfaticos perifericos o ganglios linfaticos mesentericos.
12. 12. La poblacion de celulas aislada para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que dichas celulas no singenicas con dicho injerto y singenicas con el sujeto comprenden celulas autologas.
13. 13. Una cantidad terapeuticamente eficaz de una poblacion de celulas aislada que comprende celulas anti-terceros que no inducen enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), comprendiendo dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) un distintivo CD8+/CD62L+/CD45RO+ y en el que al menos el 50 % de la poblacion de celulas aislada tienen dicho distintivo, siendo dichas celulas, celulas que inducen tolerancia y capaces de alojarse en los ganglios linfaticos despues del trasplante, para su uso como un tratamiento adyuvante para la erradicacion de una enfermedad en un sujeto que ha sido trasplantado con celulas hematopoyeticas inmaduras y en el que ademas cuando dichas celulas

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    hematopoyeticas inmaduras son singenicas con el sujeto, dicha poblacion de celulas aislada se selecciona para que sea singenica con el sujeto o no singenica con el sujeto.
14. 14. La poblacion de celulas aislada para su uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en la que dichas celulas hematopoyeticas inmaduras y dicha poblacion de celulas aislada son autologas o en la que dichas celulas hematopoyeticas inmaduras son autologas y dicha poblacion de celulas aislada no es autologa.
15. 15. La poblacion de celulas aislada para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2 o 13, en la que dichas celulas anti-terceros tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo dichas celulas, celulas que inducen tolerancia y capaces de alojarse en los ganglios linfaticos despues de un trasplante se genera:

    (a) poniendo en contacto las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) con un antfgeno o antfgenos de terceros en presencia de IL-21 en condiciones que permiten la eliminacion de las celulas reactivas GVH y

    (b) cultivando dichas celulas resultantes de la etapa (a) en presencia de IL-15 en un entorno libre de antfgeno en condiciones que permiten la proliferacion de celulas que comprenden dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), generando de ese modo la poblacion de celulas aislada.
16. 16. El metodo de la reivindicacion 1, o poblacion de celulas aislada para su uso de acuerdo con la reivindicacion 15, en el que dichas condiciones que permiten la eliminacion de las celulas reactivas GVH comprenden cultivar durante 1-5 dfas.
17. 17. El metodo de la reivindicacion 1, o poblacion de celulas aislada para su uso de acuerdo con la reivindicacion 15, en el que dicho cultivo en presencia de IL-15 se efectua durante 3-30 dfas.
18. 18. El metodo de la reivindicacion 1, o poblacion de celulas aislada para su uso de acuerdo con la reivindicacion 15, en el que dichas condiciones que permiten la proliferacion de las celulas que comprenden dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) comprenden ademas IL-7 y/o IL-21.
19. 19. La poblacion aislada para su uso de celulas de acuerdo con la reivindicacion 2 o 13, en la que dicha enfermedad comprende leucemia o linfoma.