KR101788826B1 - 항-백혈병/림프종 치료를 위한 항 서드파티 중앙 기억 t 세포의 용도 - Google Patents
항-백혈병/림프종 치료를 위한 항 서드파티 중앙 기억 t 세포의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 질환의 치료가 필요한 대상체에서 질환의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 대상체에 비-공통유전자 세포 또는 조직 이식편을 이식하는 단계; 및 (b) 중앙 기억 T 림프구(Tcm) 표현형을 갖는, 비-이식편대숙주(GVHD)를 유도하는 항-서드파티 세포를 포함하는 세포의 단리된 개체군의 치료적 유효량을 상기 대상체에 투여하고 이것에 의해 대상체를 치료하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 세포는 내성-유도 세포이고 이식 후 림프 노드에 귀소할 수 있고, 상기 세포는 또한 (i) 상기 대상체 및 상기 이식편 모두에 비-공통유전자이거나, 또는 (ii) 상기 이식편과는 비-공통유전자이고, 대상체와는 공통유전자이다.
Description
본 발명, 이것의 일부의 구현예는 중앙 기억 T-림프구 표현형을 포함하는 비(non)-이식편대 숙주질환(GVHD)를 유도하는 항-서드파티(anti-third party) 세포에 관한 것이고, 보다 상세하게는, 그러나 배타적이지는 않게 본 발명은 이식편 대 백혈병/림프종 치료를 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
비-호치킨 림프종(NHL)과 같은 조혈 악성종양을 갖는 환자의 치료 선택권은 많고 다양하다. 이들의 현재 치료 프로토콜은 환자의 상당한 부분에서 병세의 완전한 호전(complete remission(CR))에 이르고 있다. 그러나, 궁극적으로 이들 환자의 대다수는 재발하며, 이는 잔류 종양 세포가 임상적 CR을 성취하는 환자에게 남아 있다는 것을 내포한다. 이런 도전을 다루기 위해, 이식편대백혈병/림프종(GVL) 반응성을 갖는 도너 림프구 융합(DLI)이 현재 개발되고 있다. 특히, 이식 후 DLI와 조합되는 동종이계(allogeneic) 골수 이식(BMT)이라는 면에서 진전이 있어왔다[Grigg A and Ritchie D, Biol Blood Marrow Transplant (2004) 10: 579-590]. 따라서, 이것은 줄기세포 이식편 또는 DLI에 존재하는 도너 CD8+ T 세포가 잔류 악성 세포를 죽일 수 있는 GVL 효과의 더해진 이점을 가짐을 보여주고 있다[Ho WY et al., J Clin Invest. (2002) 110: 1415-1417]. 그러나, 이 이점은 CD8 T 세포와 관련된 이식편대숙주 질환(GVHD)에 의해 상쇄되며, 이것은 이식 관련 사망률에 나쁘게 영향을 미친다.
본 발명자들에 의해 수행된 이전 작업은 IL-2 박탈하에서 서드파티 자극제에 대한 뮤린 CD8+ T 세포의 생체외 자극이 GVHD 일으킴 없이 T 세포 고갈된 BMT(TDBMT) 인그래프트먼트를 촉진할 수 있는 서드파티 억제된 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL) 클론의 선택적 성장을 이끈다는 것을 보여주었다[Bachar-Lustig E. et al., Blood (2003) 102:1943-1950; Reich-Zeliger S. et al., Immunity (2000) 13: 507-515]. 최근 본 발명자들은 중앙 기억 표현형(Tcm)을 갖는 활성화된 항-서드파티 CD8+ 세포가 BMT 수령인에서 Tcm 세포의 개선된 림프 노드 귀소성, 이들의 증식 캐패시티 및 연장된 지속성에 기인하여 골수(BM) 인그래프트먼트를 추가적으로 지지하고 개선할 수 있음을 보여주었다[Ophir E et al., Blood (2010) 115: 2095-2104].
또한, 본 발명자들은 사람에게서 항-서드파티 CTL이, 비록 고갈된 알로반응성(alloreactivity)이지만, 시험관내에서 B-CLL 및 다른 유형의 일차 림프종 세포를 죽이는데 효능있음을 보여준다는 것을 보여주었다[Lask A et al. (submitted 2010); Arditti FD et al., Blood (2005) 105:3365-3371]. 이런 독특한 형태의 GVL은 TCR 인식에 독립적임을 보여주었고, 이것은 자기조직에 의해 및 동종이계 항-서드파티 CTL들에 의해 모두 영향 받을 수 있음이 밝혀졌다. 또한, 항-서드파티 CTL에 의해 B 세포 악성종양을 죽이는 독립된 TCR은 ICAM1-LFA1 결합을 통한 빠른 접착을 통해 영향받는 것이 보여지고, 이어서 CTL 상의 CD8 및 종양 세포 상의 MHC 분류 I 사이의 중요한 상호작용에 의한 아포토시스의 느린 유도가 보여진다. 또한, 죽이는 것은 클래시컬 CTL 사멸 분자: FASL, 퍼포린, TNF, Trail에 독립적임을 보여준다[Lask A et al., supra].
추가적인 배경기술은 WO/2010/049935; Kawai T. et al., The New Eng J of Med (2008) 358(4): 353-361, Ophir E. et al., International Immunopharmacology, Elsevier, Amsterdam, NL (2009) 9(6): 694-700, WO 2007/023491 및 WO 01/49243를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예의 양태에 따라서, 본 발명은 질환의 치료가 필요한 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이며, 상기 방법은 (a) 대상체에 비-공통유전자(non-syngeneic) 세포 또는 조직 이식편을 이식하는 단계; 및 (b) 중앙 기억 T 림프구(Tcm) 표현형을 갖는, 비-이식편대숙주(GVHD)를 유도하는 항-서드파티 세포를 포함하는 세포의 단리된 개체군의 치료적 유효량을 상기 대상체에 투여하고 이것에 의해 대상체를 치료하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 세포는 내성-유도 세포이고 이식 후 림프 노드에 귀소할 수 있고, 상기 세포는 또한 (i) 상기 대상체 및 상기 이식 모두에 비-공통유전자이거나, 또는 (ii) 상기 이식편과는 비-공통유전자이고, 대상체와는 공통유전자이다.
본 발명의 일부 구현예의 양태에 따라서, 본 발명은 비-공통유전자 세포 또는 조직 이식편으로 이식되어지는 대상체에 질환의 근절을 위해 보조적인 치료법으로 사용되어지는, 내성-유도 세포이고 이식 후 림프 노드에 귀소할 수 있으며, (i) 대상체 및 상기 이식편 모두에 비-공통유전자이거나, 또는 (ii) 상기 이식편과는 비-공통유전자이고, 대상체와는 공통유전자인 중앙 기억 T 림프구(Tcm) 표현형을 갖는, 비-이식편대숙주(GVHD)를 유도하는 항-서드파티 세포를 포함하는 세포의 단리된 개체군의 용도를 제공한다.
본 발명의 일부 구현예의 양태에 따르면, 본 발명은 중앙 기억 T 림프구(Tcm) 표현형을 갖는, 비-GVHD를 유도하는 항-서드파티 세포을 포함하고, 내성-유도 세포이고 이식 후 림프 노드에 귀소할 수 있으며, (i) 숙주 대상체 및 이식편 모두에 비-공통유전자이거나, 또는 (ii) 이식편과는 비-공통유전자이고, 숙주 대상체와는 공통유전자인 세포의 단리된 개체군을 제공한다.
본 발명의 일부 구현에의 양태에 따르면, 본 발명은 질환의 치료가 필요한 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이며, 상기 방법은 (a) 대상체에 미성숙 조혈 세포를 이식하는 단계; 및 (b) 중앙 기억 T 림프구(Tcm) 표현형을 갖는, 비-이식편대숙주(GVHD)를 유도하는 항-서드파티 세포를 포함하는 세포의 단리된 개체군의 치료적 유효량을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 세포는 내성-유도 세포이고 이식 후 림프 노드에 귀소할 수 있고, 상기 미성숙 조혈 세포는 대상체와 공통유전자인 경우, 세포의 단리된 개체군은 대상체와 공통유전자이거나 또는 대상체와 비-공통유전자인 것에서 선택된다.
본 발명의 일부 구현예의 양태에 따르면, 본 발명은 질환의 치료가 필요한 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이며, 상기 방법은 (a) 대상체에 미성숙 조혈 세포를 이식하는 단계; 및 (b) 중앙 기억 T 림프구(Tcm) 표현형을 갖는, 비-이식편대숙주(GVHD)를 유도하는 항-서드파티 세포를 포함하는 세포의 단리된 개체군의 치료적 유효량을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 세포는 내성-유도 세포이고 이식 후 림프 노드에 귀소할 수 있고, 상기 미성숙 조혈 세포는 대상체와 비-공통유전자이고, 세포의 단리된 개체군은 대상체와 공통유전자이거나 또는 대상체와 비-공통유전자인 것에서 선택된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 비-공통유전자 세포 또는 조직 이식편은 HLA 동일 도너 및 HLA 비-동일 도너로 이루어진 군에서 선택된 도너로부터 유도된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 대상체 및 상기 도너는 모두 사람이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 대상체는 사람 대상체이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 세포 또는 조직 이식편은 비-자기조직(non-autolous)이고, 상기 세포의 단리된 개체군은 자기조직(autolous)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 세포 또는 조직 이식편 및 상기 세포의 단리된 개체군은 다른 도너로부터이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 질환은 악성종양을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 악성종양은 B 세포 악성종양을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 악성종양은 백혈병을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 악성종양은 림프종을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 이식편은 골수 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 골수 세포는 미성숙 조혈 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 미성숙 조혈 세포가 대상체와 비-공통유전자인 경우, 상기 세포의 단리된 개체군은 대상체와 공통유전자이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 미성숙 조혈 세포는 비-자기조직이고, 상기 세포의 단리된 개체군은 자기조직이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 미성숙 조혈 세포는 대상체와 비-공통유전자이고, 상기 세포의 단리된 개체군은 대상체 및 이식편 모두와 비-공통유전자이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 미성숙 조혈 세포 및 세포의 단리된 개체군은 다른 도너로부터이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 적어도 하나의 면역억제 약물을 대상체에 투여하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 대상체는 단계(a) 전에 반치사, 치사 또는 전치사 컨디셔닝하에서 추가로 컨디셔닝된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 단계(a) 및 단계(b)는 부수적으로 수행된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 단계(b)는 단계(a) 전에 수행된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 단계(b)는 단계(a) 후 1일에 수행된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 중앙 기억 림프구(Tcm) 표현형은 CD8+/CD62L+ 시그네이쳐(signature)를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 세포의 단리된 개체군의 적어도 50%는 상기 시그네이쳐를 갖는다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 림프 노드는 말초 림프 노드를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 림프 노드는 장간막 림프 노드를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 이식편과 비-공통유전자이고, 대상체와 공통유전자인 세포는 자기조직 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 이식편과 비-공통유전자이고, 숙주 대상체와 공통유전자인 세포는 자기조직이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 미성숙 조혈 세포 및 상기 세포의 단리된 개체군은 자기조직이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 미성숙 조혈 세포는 자기조직이고, 상기 세포의 단리된 개체군은 비-자기조직이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 미성숙 조혈 세포는 비-자기조직이고, 세포의 단리된 개체군은 자기조직이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 미성숙 조혈 세포 및 상기 세포의 단리된 개체군은 다른 도너로부터이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 중앙 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 갖고, 내성-유도 세포이고, 이식 후에 림프 노드에 귀소할 수 있는 항-서드파티 세포는 (a) 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 GVH 반응성 세포의 제거를 허용하는 조건 하에서 IL-21의 존재하 또는 부재하에서 서드파티 항원 또는 항원들과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 단계(a)에서 얻어지는 상기 세포를 상기 중앙 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 포함하는 세포의 증식을 허용하는 조건하에서 항원 없는 환경에서 IL-15의 존재하에서 배양하여, 이것에 의해 세포의 단리된 개체군을 발생시키는 단계에 의해 발생된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 GVH 반응성 세포의 제거를 허용하는 상기 조건은 1 내지 5일 동안 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 GVH 반응성 세포의 제거를 허용하는 상기 조건은 사이토카인이 박탈된 배양물에서 1 내지 5일을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 서드파티 항원 또는 항원들은 수상돌기세포를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 서드파티 항원 또는 항원들은 서드파티 세포, 세포 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 단백질 추출물, 정제된 단백질, 자기조직 제공 세포에 의해 제공된 합성 펩티드, 비-자기조직 제공 세포 또는 인공 비히클 또는 인공 항원 제공 세포로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 세포의 증식을 허용하는 조건은 IL-7을 더 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 IL-15의 존재하에서 배양은 3 내지 30일 동안 수행된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 IL-15의 존재하에서 배양은 6 내지 30일 동안 수행된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 IL-15의 존재하에서 배양은 3 내지 20일 동안 수행된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 세포의 증식을 허용하는 조건은 3 내지 10일 동안 배양하는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 세포의 증식을 허용하는 조건은 3 내지 7일 동안 배양하는 것을 포함한다.
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및/또는 과학적 용어는 본 발명이 속한 이 분야의 당업자에 의해 공통적으로 이해할 수 있는 바와 같은 동일한 의미를 갖는다. 비록 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 균등한 방법 및 물질이 본 발명의 구현예를 실시하거나 테스트하는데 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 물질은 이하에 설명된다. 갈등의 경우, 정의를 포함하는 특허 명세서가 통제할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실 예는 예시적일 뿐이며, 이것으로 한정할 의도는 아니다.
본 발명에 따른 중앙 기억 T 림프구(Tcm) 표현형을 갖는, 비-이식편대숙주(GVHD)를 유도하는 항-서드파티 세포는 악성 조혈 질환, 예를 들면 림프종 및 백혈병의 치료에 효과적이다.
본 발명의 일부 구현예는 첨부도면을 참고하여 실시예만을 통해서 기술된다. 특히 상세 도면과 관련하여 본 발명의 구현예를 예시적으로 논의할 목적으로 실시예를 통해 구체적인 사항을 나타내었다. 이러한 관점에서, 상세한 설명은 본 발명의 여러 형태가 어떻게 구체적으로 실시될 수 있는지 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확한 도면을 기초로 기술하였다.
도면에서:
도 1A 내지 1I는 공통유전자 골수 이식 후 공통유전자 유도된 항-서드파티 Tcm 세포에 의한 종양 재발의 억제를 보여준다. 치사적으로 방사선 조사된(8Gy) BALB/c 마우스들(H-2d)은 5 x 103 A20-luc 림프종 세포 (0일)의 존재 또는 부재하에서 3 x 106 공통유전자 T 세포 고갈된 골수(BALB/c-NUDE (H-2d))의 이식편을 정맥으로 수령하였다. 이어서 마우스들에게 지정된 수의 BALB/c 유도된 항-서드파티 Tcm 세포(백혈병 세포 + Tcm, n = 7; 또는 오로지 백혈병 세포만, n =7으로 나타냄, 각각)를 +1일에 정맥으로 주사하였다. 도 1A 내지 1H는 일주일 간격으로 14일부터 생물발광 이미징(BLI)에 의해 모니터된 종양 성장을 나타낸 사진이고; 도 1I는 다른 치료군으로부터 동물의 생존율을 나타낸 그래프이다. X축은 종양 세포 주입후 일(days)이고, y축은 수령 마우스들의 생존 비율을 나타낸다.
도 2A 내지 2G는 공통유전자 골수 이식 후 F1 유도된 항-서드파티 CD8 T 세포에 의한 종양 재발의 억제를 보여준다. 치사적으로 방사선 조사된(8Gy) BALB/c 마우스들(H-2d)은 5 x 103 A20-luc 림프종 세포 (0일)의 존재 또는 부재하에서 3 x 106 공통유전자 T 세포 고갈된 골수 세포(BALB/c-NUDE (H-2d)) 이식편을 정맥으로 수령하였다. 이어서 마우스들에게 2 x 107 F1 유도된 항-서드파티 Tcm 세포(백혈병 세포 + Tcm, n = 7)있이 또는 없이 또는 (백혈병 세포 단독, n = 5) 없이 +1일에 정맥으로 주사하였다. 도 2A 내지 2F는 일주일 간격으로 14일부터 생물발광 이미징(BLI)에 의해 모니터된 종양 성장을 나타낸 사진이고; 도 2G는 다른 치료군으로부터 동물의 생존율을 나타낸 그래프이다. X축은 종양 세포 주입 후 일이고, y축은 수령 마우스들의 생존 비율을 나타낸다.
도 3A 내지 3I는 동종이계 골수 이식 후 동종이계 유도된 항-서드파티 Tcm 세포에 의한 종양 재발의 억제를 보여준다. 치사적으로 방사선 조사된(8Gy) BALB/c 마우스들(H-2d)은 5 x 103 A20-luc 림프종 세포 (0일)의 존재 또는 부재하에서 3 x 106 동종이계 T 세포 고갈된 골수(C57BL/c-NUDE (H-2b)) 이식편을 정맥으로 수령하였다. 이어서 마우스들에게 C57BL/6 유도된 세포(+ 1일에)를 정맥으로 주사하였다. 도 3A-H는 일주일 간격으로 13일부터 BLI에 의해 모니터된 종양 성장을 나타낸 사진이고; 도 3I는 다른 치료군으로부터 동물의 생존율을 나타낸 그래프이다. X축은 종양 세포 주입 후 일이고, y축은 수령 마우스들의 생존 비율을 나타낸다.
도 4A 내지 4B는 본 발명의 항-서드파티 T 중앙 기억 세포의 증식 및 세포 표현형을 나타낸 그래프이다. 도 4A는 Tcm 세포 증식을 배양 0일부터 12일까지 나타낸 것이고, 도 4B는 Allo-DC에 대한 동일한 배양을 사용한 세포 표현형을 나타낸다.
도 5는 B-세포 림프종 및 플라즈마 세포 백혈병 세포주와 혼합된 림프구 반응(MLR)의 22시간 후 아포토틱(apototic) 세포의 퍼센트를 나타낸 그래프이다. 칼세인에이엠(CalceinAM) 프리-라벨된 Daudi, H.My2 C1R HLA A2 K66A 뮤턴트 또는 L363 세포주는 22시간 동안 5배 초과의 항-서드파티 Tcm 있거나 없이 배양하였다. 아넥신(Annexin) V+ 세포들을 FACS에 의해 결정하였다. 데이터는 펜타플리케이트 배양물(pentaplicate cultures)의 평균±SD로서 표현된다. ***p<0.001 값은 Tcm의 부재하에서 배양된 샘플과 비교된 통계적으로 중요한 변화를 나타낸다.
도 6은 B-세포 림프종 EBV-LCL 및 플라즈마 세포 백혈병 세포주와 혼합된 림프구 반응(MLR)의 22시간 후 살아있는 세포의 수를 나타낸 그래프이다. 칼세인에이엠 프리-라벨된 Daudi, H.My2 C1R HLA A2 K66A 뮤턴트 또는 L363 세포주는 22시간 동안 5배 초과의 항-서드파티 Tcm 있이 또는 없이 배양하였다. 생존할 수 있는 칼세인에이엠+ 세포들의 수를 FACS에 의해 결정하였다. 데이터는 펜타플리케이트 배양물의 평균±SD로서 표현된다. ***p<0.001 값은 Tcm의 부재하에서 배양된 샘플과 비교된 통계적으로 중요한 변화를 나타낸다
도면에서:
도 1A 내지 1I는 공통유전자 골수 이식 후 공통유전자 유도된 항-서드파티 Tcm 세포에 의한 종양 재발의 억제를 보여준다. 치사적으로 방사선 조사된(8Gy) BALB/c 마우스들(H-2d)은 5 x 103 A20-luc 림프종 세포 (0일)의 존재 또는 부재하에서 3 x 106 공통유전자 T 세포 고갈된 골수(BALB/c-NUDE (H-2d))의 이식편을 정맥으로 수령하였다. 이어서 마우스들에게 지정된 수의 BALB/c 유도된 항-서드파티 Tcm 세포(백혈병 세포 + Tcm, n = 7; 또는 오로지 백혈병 세포만, n =7으로 나타냄, 각각)를 +1일에 정맥으로 주사하였다. 도 1A 내지 1H는 일주일 간격으로 14일부터 생물발광 이미징(BLI)에 의해 모니터된 종양 성장을 나타낸 사진이고; 도 1I는 다른 치료군으로부터 동물의 생존율을 나타낸 그래프이다. X축은 종양 세포 주입후 일(days)이고, y축은 수령 마우스들의 생존 비율을 나타낸다.
도 2A 내지 2G는 공통유전자 골수 이식 후 F1 유도된 항-서드파티 CD8 T 세포에 의한 종양 재발의 억제를 보여준다. 치사적으로 방사선 조사된(8Gy) BALB/c 마우스들(H-2d)은 5 x 103 A20-luc 림프종 세포 (0일)의 존재 또는 부재하에서 3 x 106 공통유전자 T 세포 고갈된 골수 세포(BALB/c-NUDE (H-2d)) 이식편을 정맥으로 수령하였다. 이어서 마우스들에게 2 x 107 F1 유도된 항-서드파티 Tcm 세포(백혈병 세포 + Tcm, n = 7)있이 또는 없이 또는 (백혈병 세포 단독, n = 5) 없이 +1일에 정맥으로 주사하였다. 도 2A 내지 2F는 일주일 간격으로 14일부터 생물발광 이미징(BLI)에 의해 모니터된 종양 성장을 나타낸 사진이고; 도 2G는 다른 치료군으로부터 동물의 생존율을 나타낸 그래프이다. X축은 종양 세포 주입 후 일이고, y축은 수령 마우스들의 생존 비율을 나타낸다.
도 3A 내지 3I는 동종이계 골수 이식 후 동종이계 유도된 항-서드파티 Tcm 세포에 의한 종양 재발의 억제를 보여준다. 치사적으로 방사선 조사된(8Gy) BALB/c 마우스들(H-2d)은 5 x 103 A20-luc 림프종 세포 (0일)의 존재 또는 부재하에서 3 x 106 동종이계 T 세포 고갈된 골수(C57BL/c-NUDE (H-2b)) 이식편을 정맥으로 수령하였다. 이어서 마우스들에게 C57BL/6 유도된 세포(+ 1일에)를 정맥으로 주사하였다. 도 3A-H는 일주일 간격으로 13일부터 BLI에 의해 모니터된 종양 성장을 나타낸 사진이고; 도 3I는 다른 치료군으로부터 동물의 생존율을 나타낸 그래프이다. X축은 종양 세포 주입 후 일이고, y축은 수령 마우스들의 생존 비율을 나타낸다.
도 4A 내지 4B는 본 발명의 항-서드파티 T 중앙 기억 세포의 증식 및 세포 표현형을 나타낸 그래프이다. 도 4A는 Tcm 세포 증식을 배양 0일부터 12일까지 나타낸 것이고, 도 4B는 Allo-DC에 대한 동일한 배양을 사용한 세포 표현형을 나타낸다.
도 5는 B-세포 림프종 및 플라즈마 세포 백혈병 세포주와 혼합된 림프구 반응(MLR)의 22시간 후 아포토틱(apototic) 세포의 퍼센트를 나타낸 그래프이다. 칼세인에이엠(CalceinAM) 프리-라벨된 Daudi, H.My2 C1R HLA A2 K66A 뮤턴트 또는 L363 세포주는 22시간 동안 5배 초과의 항-서드파티 Tcm 있거나 없이 배양하였다. 아넥신(Annexin) V+ 세포들을 FACS에 의해 결정하였다. 데이터는 펜타플리케이트 배양물(pentaplicate cultures)의 평균±SD로서 표현된다. ***p<0.001 값은 Tcm의 부재하에서 배양된 샘플과 비교된 통계적으로 중요한 변화를 나타낸다.
도 6은 B-세포 림프종 EBV-LCL 및 플라즈마 세포 백혈병 세포주와 혼합된 림프구 반응(MLR)의 22시간 후 살아있는 세포의 수를 나타낸 그래프이다. 칼세인에이엠 프리-라벨된 Daudi, H.My2 C1R HLA A2 K66A 뮤턴트 또는 L363 세포주는 22시간 동안 5배 초과의 항-서드파티 Tcm 있이 또는 없이 배양하였다. 생존할 수 있는 칼세인에이엠+ 세포들의 수를 FACS에 의해 결정하였다. 데이터는 펜타플리케이트 배양물의 평균±SD로서 표현된다. ***p<0.001 값은 Tcm의 부재하에서 배양된 샘플과 비교된 통계적으로 중요한 변화를 나타낸다
본 발명, 이것의 일부의 구현예는 중앙 기억 T-림프구 표현형을 포함하는 비-이식편대 숙주질환(GVHD)를 유도하는 항-서드파티 세포에 관한 것이고, 보다 상세하게는, 그러나 배타적이지 않게 본 발명은 이식편대백혈병/림프종 치료를 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 원리 및 작동은 도면 및 첨부하는 상세한 설명을 참조하여 보다 더 이해될 수 있다.
본 발명의 적어도 하나의 구현예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명이 다음의 상세한 설명에서 설명된 또는 실시예에 의해 예시된 상세한 것으로 이들의 적용을 반드시 한정하는 것이 아니라는 것이 이해되어야 한다. 본 발명은 다른 구현예가 가능하며, 다양한 방식으로 실시 또는 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 어법 및 용어는 설명하기 위한 목적이며 이것으로 한정되는 것으로 여겨져서는 안된다.
본 발명을 실제적으로 축소하면서, 본 발명자들은 항-서드파티 CD8+ T 중앙 기억(Tcm) 세포가 생체내 이식편대백혈병/림프종(GVL) 활성을 포함하고, 이에 따라서 악성 조혈 질환, 예를 들면 림프종 및 백혈병을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 밝혔다.
이하 및 실시예 섹션에서 보여지는 바와 같이, 본 발명자들은 림프종 환자에서 동종이계 골수 이식편(BMT)을 시뮬레이션하기 위해 특이적으로 디자인된 생체내 마우스 모델에서 항-서드파티 CD8+ Tcm 세포의 GVL 반응성을 보여주었다. 초기에, 발명자들은 비-알로반응성 유도된 뮤린 항-서드파티 Tcm 세포가 사람 항-서드파티 CTL과 유사하게 작용하고, A20 뮤린 림프종 세포를 직접적으로 근절하는 것을 시험관내에서 확인하였다(이하의 실시예 섹션의 실시예 1 참조). 후속적으로, 본 발명자들은 A20 B 세포 림프종 세포주를 이용한 B 세포 림프종에 대한 최소 잔류 질환 마우스 모델을 구축하였고, 여기서, 루시퍼라제 리포터 유전자는 그의 게놈으로 안정하게 통합되었다(A20-luc). 이들 세포는 생체발광 이미징(BLI)에 의해 생체내 종양 진전을 민감하게 모니터링할 수 있다. 이 모델을 사용하여 본 발명자들은 공통유전자 및 동종이계 항-서드파티 Tcm 세포 모두가 공통유전자 골수 이식편과 함께 투입되는 경우 이식편대숙주 질환(GVHD)를 일으킴 없이 표시된 GVL 반응성을 보여주었다(이하, 실시예 섹션의 실시예 2 및 3). 또한, 본 발명은 동종이계 항-서드파티 Tcm 세포(도너 타입)을 동종이계 골수 이식편과 함께 투여하는 경우 GVHD가 전혀없는 효과적인 GVL 효과를 보여주었다(이하, 실시예 섹션의 실시예 4). 이들과 함께, 이들 모든 발견은 질병을 갖는 세포의 근절(eradication)를 위해 이식편대 백혈병/림프종 세포로서 항-서드파티 Tcm 세포의 사용을 입증한다. 또한, 본 결과는 수령인 및 이식편 도너에 대하여 비-공통유전자 도너로부터 항-서드파티 Tcm 세포를 사용하는 능력을 보여준다(예를 들어 2개의 상이한 도너로부터).
따라서, 본 발명의 하나의 양태에 따르면, 본 발명은 질환의 치료가 필요한 대상체의 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 대상체에 세포 또는 조직 이식편을 이식하는 단계; 및 (b) 중앙 기억 T 림프구(Tcm) 표현형을 갖는 비-이식편대숙주(GVHD)를 유도하는 항-서드파티 세포를 포함하는 세포의 단리된 개체군의 치료적 유효량을 상기 대상체에 투여하고 이것에 의해 대상체를 치료하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 세포는 내성-유도 세포이고 이식 후 림프 노드에 귀소할 수 있고, 상기 세포는 또한 (i) 상기 대상체 및 상기 이식편 모두에 비-공통유전자이거나, 또는 (ii) 상기 이식편과는 비-공통유전자이고, 대상체와는 공통유전자이다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료(treating)"은 증상(condition)의 진전을 제거, 실질적으로 억제, 둔화 또는 전환을 포함하고, 증상의 임상적 또는 심미적(aesthetical) 증후(symptoms)을 실질적으로 개선 또는 증상의 임상적 또는 심미적 증후의 출현을 실질적으로 방지하는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "대상체" 또는 "필요로 하는 대상체"는 세포 또는 조직 이식이 요구되는 모든 나이의 암수 모두의 포유류, 바람직하게는 사람을 말한다. 전형적으로 대상체(또한 본 명세서에서는 수령인으로 언급)는 세포 또는 조직 이식편의 이식을 통해 치료될 수 있는 장애 또는 병리학적 또는 바라지 않는 증상, 상태 또는 증후 또는 물리적, 형태학적 또는 생리학적 이상(abnormality)에 기인하여 세포 또는 조직 이식이 필요한 것이다. 이런 장애의 실예는 이하에서 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 "세포 또는 조직 이식편"은 신체의 세포(예를 들면, 단일 세포 또는 세포 그룹) 또는 조직(예를 들면, 고형 조직 또는 연화 조직, 이것은 완전히 또는 부분적으로 이식될 수 있다)을 말한다. 본 기술에 따른 이식될 수 있는 예시적인 조직은 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 림프/조혈 조직(예를 들면, 림프 노드, 페이스의 패치 흉선(Peyer's paches thymus) 또는 골수(bone marrow))을 포함한다. 본 기술에 따른 이식될 수 있는 예시적인 세포는 이것으로 제한되는 것은 아니지만 조혈모 세포(예를 들면, 미성숙 조혈 세포)를 포함한다.
특정 구현예에 따라, 본 발명의 조혈모세포는 CD34+이다.
적용에 따라, 상기 방법은 대상체와 공통유전자 또는 비-공통유전자인 세포 및 조직의 사용에 영향을 받을 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "공통유전자(syngeneic)"은 대상체와 필수적으로 유전적으로 동일한 개체로부터 유도된 세포 또는 조직을 말한다. 전형적으로 필수적으로 완전히 근친교배한 포유류, 포유류 클론, 동형접합체(homozygotic) 쌍생 포유류가 공통유전자이다.
공통유전자 세포 또는 조직의 실예는 대상체로부터 유도된 세포 또는 조직(예를 들면, 이 기술 분야에서 "자기조직"으로 언급), 대상체의 클론 또는 대상체의 동형접합체 쌍생을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "비-공통유전자(non-syngeneic)"은 대상체의 림프구와 동종이계 또는 이종인 개체로부터 유도된 세포 또는 조직(이 분야에서 "비-자기조직"으로 언급)을 말한다.
본 명세서에 사용된 용어 "동종이계(allogeneic)"은 대상체와 동일한 종이지만, 실질적으로 대상체와 비-클론인 도너로부터 유도된 세포 또는 조직을 말한다. 전형적으로, 동일한 종의 이계 교배된 비-접합성 쌍쌩 포유류가 서로 동종이계이다. 동종이계 도너는 대상체에 대해서 HLA 동일 또는 HLA 비-동일일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "이종(xenogeneic)"은 대상체의 림프구의 실질적 비율의 종과 관련된 다른 종의 항원을 실질적으로 발현하는 세포 또는 조직을 말한다. 전형적으로 다른 종의 이계 교배된 포유류는 서로 이종이다.
본 발명은 이종 세포 또는 조직은 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 소과 동물(예를 들어, 암소), 말과 동물 (예를 들어, 말), 돼지과 동물 (예를 들어 : 돼지), 오비디스(ovids)(예를 들어, 염소, 양), 고양이과 동물 (예를 들어 : 펠리스 도메스티카(Felis domestica)), 개과 동물 (예를 들면, 캐니스 도메스티카(Canis domestica)), 설치과 동물 (예, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 게르빌루스쥐, 햄스터) 또는 영장류 (예 : 침팬지, 붉은 털 원숭이 원숭이, 짧은 꼬리 원숭이, 비단 원숭이)와 같은 다양한 종으로부터 유도된 것을 포함한다.
이종 기원(예를 들면, 돼지 기원)의 세포 또는 조직은 동물원성 감염증이 없는 것으로 알려진 소스, 예를 들면, 돼지 내생 레트로바이러스로부터 얻는 것이 바람직하다. 유사하게, 사람 유도된 세포 또는 조직은 실질적으로 병원성 없는 소스로부터 얻는 것이 바람직하다.
본 발명의 구현예에 따르면, 대상체 및 도너 모두 사람이다.
적용 및 유용한 소스에 따라서, 본 발명의 세포 또는 조직편은 태아 생물(prenatal organism), 출생 후의 생물(postnatal organism), 성인이나 시신 기증자(cadaver donor)로부터 얻을 수 있다. 또한, 요구된 적용에 따라서, 세포 또는 조직은 천연 또는 유전자 변형된 것일 수 있다. 이런 것은 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자의 지식 능력 내에서 잘 결정될 수 있다.
이 분야에서 공지된 모든 방법이 세포 또는 조직을 얻기 위해 사용될 수 있다(예를 들면, 이식을 위해).
세포 또는 조직 이식편을 대상체로 이식하는 것은 많은 방식으로, 다양한 변수에 의존하여, 예를 들면, 세포 또는 조직 타입; 수령인의 질환의 타입, 단계 또는 심함(예를 들면, 장기 장해); 대상체에 특이적인 의학적 또는 생리학적 변수; 및/또는 요구된 치료적 결과물에 영향을 받는다.
본 발명의 세포 또는 조직을 이식하는 것은 적용에 따라서 다양한 해부 위치(anatomical locations)의 임의의 하나로 세포 또는 조직 이식편을 이식하는 것에 의해 영향을 받는다. 세포 또는 조직 이식편은 호모토픽(homotopic) 해부 위치(이식을 위한 정상 해부 위치), 또는 엑토픽(ectopic) 해부 위치(이식을 위한 비정상 해부 위치)로 이식될 수도 있다. 적용에 따라서, 세포 또는 조직 이식편은 신피막(renal capsule) 하에서 주입되거나 신장, 고환 지방, 피하조직, 장막(omentum), 간문맥, 간, 비장, 뼈, 심장 캐비티, 심장, 가슴 캐비티, 폐, 피부, 췌장 및/또는 복강내 공간으로 주입되는 것이 이롭다.
예를 들면 공통유전자 또는 비-공통유전자 도너의 골수, 고정된 말초 혈액(예를 들면 백혈구분반술(leukapheresis)에 의해), 태아 간, 난황주머니 및/또는 코드 혈액으로부터 유도될 수 있고, 미성숙 자기조직, 동종이계 또는 이종 조혈 세포(줄기세포 포함)은 질병으로 고통받는 수령인에게 이식될 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 상기 질환은 악성 질환이다. 특정 구현예에 따르면, 상기 악성 질환은 조혈 또는 림프성 조직의 악성 종양이다. 또 다른 특정 구현예에 따르면, 악성 질환은 B 세포 악성 종양(즉, B 림프구 포함)이다.
이런 질병으로는 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 백혈병[예, 급성 림프관(acute lymphatic), 급성 림프아구성(acute lymphoblastic), 급성 림프아구성 프리-B 세포(ute lymphoblastic pre-B cell), 급성 림프아구성 T 세포 백혈병(acute lymphoblastic T cell leukemia), 급성-거핵아구성(megakaryoblastic), 단구성(monocytic), 급성 골수성(acute myelogenous), 급성 골수성(acute myeloid), 호산구증가증을 갖는 급성 골수성(acute myeloid with eosinophilia), B 세포, 호염기성(basophilic), 만성 골수성(chronic myeloid), 만성, B 세포, 호산구증가증(eosinophilic), 프렌드(Friend), 과립백혈구성(granulocytic) 또는 골수성( myelocytic), 모발성 세포(hairy cell), 림프구성(lymphocytic), 거핵아구성, 단구성, 단구성-마크로파지(monocytic-macrophage), 골수아구성(myeloblastic), 골수성(myeloid), 골수단구성(myelomonocytic), 플라즈마 세포(plasma cell), 프리-B 세포, 전골수성(promyelocytic), 아급성(subacute), T 세포, 림프성 네오플라즘(lymphoid neoplasm), 골수성 악성종양에 대한 소인(predisposition to myeloid malignancy), 급성 비림프구성 백혈병(acute nonlymphocytic leukemia), T-세포 급성 림프구성 백혈병(T-ALL) 및 B-세포 만성 림프구성 백혈병(B-CLL)], 림프종[예, 호치킨(Hodgkin's) 림프종, 비-호치킨 림프종, B 세포, 미만성(diffuse) 대형 B-세포 림프종(DLBCL), B-세포 만성 림프구성 백혈병/림프종, 버킷(Burkitt)의 림프종, T 세포, 피부 T 세포, 전구체 T-세포 백혈병/림프종, 여포성 림프종, 맨틀 세포 림프종, MALT 림프종, 조직구(histiocytic), 림프아구성(lymphoblalstic), 흉선(thymic) 및 균상식육종(Mycosis fungoides)], 이식편의 이식과 관련된 질환(예, 이식 거부, 만성 이식 거부, 아급성 이식 거부, 하이퍼-급성 이식 거부, 급성 이식 거부 및 이식편대숙주 질환), 타입 1 당뇨병과 같은 자가면역 질환, 아데노신 데아미나제(ADA), 골화석증(osteopetrosis), 재생불량성 빈혈(aplastic anemia), 고셰병(Gaucher's disease), 지중해빈혈(thalassemia) 및 기타 선천적 또는 유전적-결정된 조혈 이상을 포함하는 심각한 조합된 면역결핍 증상(SCID)를 포함한다.
본 발명의 공통유전자 또는 비-공통유전자 조혈 세포(예를 들면, 미성숙 조혈 세포)는 세포 이식에 대해 이 분야에 알려진 방법, 예를 들면 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 세포 주입(예를 들면, I.V.) 또는 복강내 경로를 사용하여 수령인에게 이식될 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 세포 또는 조직 이식편을 결함있는 장기를 갖는 대상체에 이식하는 경우, 이식의 최적의 전개가 가능하게 하기 위해 대상체로부터 실패한 장기, 및 이것의 구조적/기능적 인티그레이션(integration)을 대상체의 해부/생리학으로 우선 적어도 부분적으로 제거하는 것이 이로울 수 있다.
본 기술에 따른 대상체로 세포 또는 조직 이식편의 이식에 이어서, 표준 의학 실무에 따라서, 다양한 표준 기술의 임의의 하나에 따라 장기의 성장 기능성(growth functionality) 및 면역-적합성(immuno-compatability)을 모니터하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 비-공통유전자 세포 또는 골수 이식편의 인그래프트먼트가 키메리즘 테스팅[예, 쇼트 텐덤 리핏(STR)을 사용하는 PCR-기초 절차에 의해] 모니터될 수 있는 동안 세포 또는 조직의 구조적 발달은 컴퓨터화된 단층촬영 또는 초음파 이미지를 통해 모니터될 수 있다.
이식편 타입에 상관없이, 이식 거부 및 이식편대숙주 질환을 피하기 위해 및 임의의 잔류 종양 세포를 제거하기 위해, 본 발명의 방법은 항-서드파티 Tcm 세포를 이용한다.
따라서, 본 발명의 하나의 양태에 따르면, 대상체에는 중앙 기억 T 림프구(Tcm) 표현형을 갖는 비-이식편대숙주(GVHD)를 유도하는 항-서드파티 세포를 포함하는 세포의 단리된 개체군의 치료적 유효량이 투여되고, 여기서 상기 세포는 내성-유도 세포이고 이식 후 림프 노드에 귀소할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 구 "세포의 단리된 개체군(isolated population of cells)"는 이들의 천연 환경(즉, 신체)로부터 단리된 세포를 말한다.
본 명세서에서 사용된 "비(non)-GVHD"는 실질적으로 이식편대숙주 유도 반응성을 가지지 않는 것을 말한다. 따라서, 본 발명의 세포는 이식편대숙주 질환(GVHD)를 현저하게 일으킴 없이 발생된다.
본 명세서에 사용된 "항-서드파티 세포(anti-third party cells)"는 서드파티 항원 또는 항원들에 대립되는(예, T 세포 인식에 의해) 림프구(예, T 림프구)를 말한다.
본 명세서에 사용된 "서드파티 항원 또는 항원들"은 아래에 상세히 설명되는 바와 같이, 도너 또는 수령인에 존재하지 않는 가용성 또는 비-가용성(멤브레인과 관련) 항원 또는 항원들을 말한다.
하나의 구현에에 따르면, 본 발명의 서드파티 항원 또는 항원들은 서드파티 세포, 세포 항원, 바이러스성 항원, 박테리아성 항원, 단백질 추출물, 자기조직 제공 세포, 비-자기조직 세포 또는 인공적 비히클 또는 인공성 항원 제공 세포에 의해 제공된 정제된 단백질 및 합성 단백질로 이루어진 군에서 선택된다.
예를 들면, 서드파티 항원은 서프파티 세포, 바이러스의 항원, 예를 들면, 엡스테인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV) 또는 사이토-메갈로 바이러스(cyto-megalo virus, CMV) 또는 박테리아의 항원, 예를 들면, 플라겔린(flagellin)일 수 있다. 바이러스 또는 박테리아성 항원은 이것으로 감염된 세포(또는 세포주)에 의해 나타날 수 있으며, 그렇지 않으면 바이러스/박테리아 단백질을 발현하여 만들어질 수 있다. 자기조직 또는 비-자기조직 항원 제공 세포는 거기에 융합된 또는 적재된 쇼트 합성 펩티드를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 이런 쇼트 펩티드는 바이러스 유도 펩티드 또는 임의의 다른 항원을 제공하는 펩티드일 수 있다.
전용 소프트웨어가 면역원 쇼트 펩티드, 즉 분류 I MHC 또는 분류 II MHC로 제공할 수 있는 펩티드를 동정하기 위한 바이러스 또는 기타 서열을 분석하기 위해 사용될 수 있다.
서드 파티 세포는 수령인에 대해 동종이계 또는 이종일 수 있다(이하에 보다 상세히 설명). 동종이계 서드파티 세포의 경우, 이런 세포는 이런 세포에 대해 발생된 항-서드파티 세포가 이식편 또는 수령인 항원에 대해 반응적이지 않도록 도너의 그것과 다르지만 수령인 HLA 항원과 교차 반응성이 아닌 HLA 항원을 갖는다.
본 발명의 구현예에 따르면, 동종이계 또는 이종 서드파티 세포는 자극 세포, 예를 들면, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 말초 혈액 림프구(PBL), 비장, 림프 노도, 사이토카인-고정된 PBL, 시험관내 확장된 항원-제공 수지상 세포(in vitro expanded antigen-presenting dendritic cells, APC), B 세포주, 항원 제공 세포(APC), 예를 들면, 인공 APC(예, HLA 및/또는 공동자극 분자로 감염된 K562 세포주)이다.
본 구현예에 따르면, 상기 서프파티 항원 또는 항원들은 수지상 세포를 포함한다.
서드파티 항원은 세포, 바이러스 또는 박테리아 표면상에 존재될 수 있고, 이것으로부터 유도 및/또는 정제된다. 추가적으로, 바이러스, 박테리아 또는 임의의 외래 항원은 감염된 세포상에서 보여질 수 있거나 리포좀과 같은 인공 비히클 또는 인공 APC에서 보여질 수 있다(예를 들면, 서드파티 항원 또는 항원들에 의해 감염된 섬유아세포 또는 백혈병 세포주).
추가로, 서드파티 항원은 예를 들면, 다양한 소스로부터 추출된 또는 정제된 단백질일 수 있다. 본 발명에 따른 서드파티 항원으로 제공할 수 있는 정제된 단백질의 실 예는 오브알부민이다. 다른 실 예가 고려된다.
세포, 바이러스, 박테리아, 바이러스로 감염된, 박테리아 감염된, 바이러스 펩티드 또는 박테리아 펩티드를 제공하는 세포를 서드파티 항원으로 이용하는 것은 이런 서드파티 항원이 다양한 배열의 항원 결정자를 포함하고, 이런 다양한 개체군의 항-서드파티 세포의 형성을 안내하기 때문이며, 이것은 T-세포의 보다 빠른 복원(reconstitution)을 이런 복원이 요구되는 경우, 예를 들면, 이어지는 치사 또는 반치사 방사선 조사 또는 화학요법 절차로 추가로 제공할 수도 있다.
또한, 항-서드파티 세포가 서드파티 항원에 대한 것인 경우, LFA1-ICAM1 결합에 의해 달성된 TCR 독립 사멸(PCT independent killing)에 기인한 적어도 일부의 이식편대질환(예를 들면, 이식편대백혈병과 같은 암세포) 활성을 얻는 것이 유리하다[Arditti et al., Bolld(2005) 105(8):3365-71. Epub 2004 Jul 6].
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 항-서드파티 세포는 중악 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 포함한다.
본 명세서에 사용된 구 "중앙 기억 T-림프구(Tcm) 표현형(central memory T-lymphocyte(Tcm) phenotype)"은 림프 노도로 귀소하는 T 세포독성 세포의 부분집합을 말한다. 사람에서 Tcm 표현형을 갖는 세포는 전형적으로 CD8+/CD62L+/CD45RO+/L-셀렉틴+/CD45RA-을 발현한다. 보다 구체적인 구현예에서 Tcm 표현형은 CD8+/CD62L+ 시그네이쳐를 포함한다. Tcm 세포는 모든 시그네이쳐 마커를 단일 세포상에서 발현할 수 있거나 시그네이쳐 마커의 일부만을 단일 세포상에서 발현할 수 있음을 알게 된다.
세포의 단리된 개체군의 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 이상이 Tcm 세포 시그네이쳐를 갖는 세포이다.
언급된 바와 같이, Tcm 세포는 전형적으로 이식 후 림프 노드로 귀소한다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명의 항-서드파티 Tcm 세포는 이식 후 림프 노드의 임의의 것, 예를 들면, 말초 림프 노드 및 장간막 림프 노드로 귀소할 수도 있다. 이들 세포의 귀소 특성은 이들이 빠르고 효과적인 방식으로 이들에게 이들의 내성 효과를 발휘하게 한다.
따라서, 본 발명의 항-서드파티 Tcm 세포는 내성-유도 세포이다.
본 명세서에 사용된 "내성 유도 세포(tolerance inducing cells)"는 이들이 수령인의 세포와 접촉하는 경우, 수령인의 세포(예를 들면, 수령인의 T 세포)의 감소된 반응성을 유발하는 세포를 말한다. 내성 유도 세포는 이전에 PCT 공개 공보 WO2001/049243 및 WO2002/102971에서 설명된 바와 같이 베토(veto) 세포(즉, 접촉시 숙주 T 세포의 아포토시스를 이끄는 T 세포)을 포함한다.
내성 유도 세포의 사용은 예를 들면 동종이계 EH는 이종 세포 또는 조직의 이식에서 특히 이식 거부가 제거되고 이식편대숙주 질환(GVHD)를 극복해야 할 필요가 있는 상황에서 특히 이롭다.
일부 구현예에 따르면, 본 발명의 Tcm 세포는 순수 세포(예를 들면, 유전공학적으로 변형되지 않은) 또는 유전공학적으로 변형된 세포(예를 들면, 특정 유전자, 마커 또는 펩티드를 발현하기 위해 또는 발현하지 않기 위해 또는 특이적 사이토카인을 분비하기 위해 또는 분비하지 않기 위해 유전공학적으로 처리되어진 세포). 이 분야에서 공지된 임의의 방법은 세포를 유전공학적으로 처리하여, 예를 들면 관련 유전자/들을 비활성화하는 것으로 또는 폴리펩티드 발현을 간섭하는 안티센스 RNA의 삽입에 의해 시행되어질 수 있다(WO/2000/039294 참조, 이는 참조로서 본 명세서에 포함됨).
항-서드파티 비-알로반응성 세포의 발생(이식편대숙주(GVH) 활성의 제거)을 위해서 사용된 임의의 방법은 본 기술에 따라서 사용될 수 있다.
본 발명의 항-서드파티 Tcm 세포는 사이토카인이 박탈된 배양액(즉, 사이토카인의 첨가 없이)에서 공통유전자 또는 비-공통유전자 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 서드파티 항원 또는 항원들(상기에서 설명된 바와 같은)과 우선 접촉하는 것으로 전형적으로 발생된다. 이 단계는 전형적으로 약 12 내지 72시간, 24 내지 48시간, 1 내지 10일, 1 내지 7일, 1 내지 5일, 2 내지 3일, 또는 2일 동안 수행되고, GVH 반응 세포(예를 들면, T 세포)의 제거를 허용한다. 대안적으로, 항-서드파티 Tcm 세포는 그 외에 IL-21(0.001 내지 300ng/ml, 10-1000ng/ml, 10-100ng/ml, 1-100ng/ml, 0.1-10ng/ml, 1-50ng/ml 또는 1-10ng/ml)을 갖는 사이토킨-없는 배양액을 보충하는 것으로 이식편대숙주(GVH) 활성이 전혀 없이 발생될 수 있다. 이 단계는 약 12 내지 72시간 동안, 24 내지 48시간, 1 내지 10일, 1 내지 10일, 1 내지 7일, 1 내지 5일, 2 내지 3일 또는 3일 동안 수행된다.
이어서, 항-서드파티 세포는 IL-15 (0.05-500 ng/ml, 0.001-3000 ng/ml, 10-1000 ng/ml, 10-100 ng/ml, 1-100 ng/ml, 0.1-100 ng/ml, 0.1-10 ng/ml, 1-50 ng/ml 또는 1-10 ng/ml)의 존재하에서 배양된다. 특정 구현예에 따르면, 농도는 5ng/ml이고, 항원 없는 환경에서 약 3 내지 30일, 6 내지 30일, 3 내지 20일, 10 내지 20일, 3 내지 15일, 5 내지 15일, 7 내지 15일, 7 내지 14일, 3 내지 10일, 3 내지 7일 또는 14일 동안 배양된다. 상기 배양은 예를 들면 IL-7 (0.05-500 ng/ml, 0.001-3000 ng/ml, 10-1000 ng/ml, 10-100 ng/ml, 1-100 ng/ml, 0.1-100 ng/ml, 0.1-10 ng/ml, 1-50 ng/ml 또는 1-10 ng/ml)과 같은 추가 사이토카인의 존재에 의해서 더 영향을 받을 수 있다. 특정 구현에 따르면, 농도는 5ng/ml이고/이거나 IL-21 (0.001-3000 ng/ml, 0.001-3000 ng/ml, 10-1000 ng/ml, 10-100 ng/ml, 1-100 ng/ml, 0.1-100 ng/ml, 0.1-10 ng/ml, 1-50 ng/ml 또는 20-50 ng/ml)이다. 특정 구현예에 따르면, 농도는 30ng/ml이다. 이 공정은 중앙 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 포함하고 GVHD 반응성이 제거된 항-서드파티 세포의 증식을 가능하게 한다.
CD8+ T 세포의 선택을 허용하는 추가 단계가 IL-15의 존재에서 세포를 배양하기 전에 MACS 비드의 사용과 같은 것에 의해 수행되어짐을 알게 된다. 이런 단계는 배양액 내에 CD8+ 세포의 순도를 증가시키는데 또는 CD8+ T 세포의 수를 증가시키는데 이로울 수 있다(즉, 세포 배양액 내에 다른 림프구, 예를 들면 T CD4+ 세포를 제거). 따라서, CD8+ 세포의 단리는 서드파티 항원 또는 항원들과의 배양 전에 수행되거나 서드파티와의 배양 이후에 및 CD15와의 배양 전에 수행될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 공통유전자 PBMC(예를 들면, 대상체로부터)는 본 기술에 따라 사용될 수 있다(즉, 공통유전자 Tcm 세포가 치료에 이로운 상황에서). 마찬가지로, 비-공통유전자 PBMC(예를 들면, 대상체와 동종이계 또는 이종)은 본 기술에 따라 사용될 수 있다. PBMC의 소스는 세포의 의도된 용도에 따라 결정될 수 있고(하기의 상세한 설명 참조), 이 분야의 숙련가의 능력내에서 특히, 본 명세서에 첨부된 상세한 설명에 비추어 잘 결정될 수 있다.
이하의 실시예 섹션에서 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명자들은 항-서드파티 Tcm 세포가 세포 또는 조직 이식편(예를 들면, 골수 세포)과 동일한 기원이고, 특히 이들이 모두 공통유전자 도너로부터 유도되거나(예를 들면, 대상체로부터, 실시예 2 및 도 1A-I 참조) 또는 비-공통유전자 도너(예를 들면, 동종이계 도너로부터, 실시예 4 및 도 3A-I 참조)로부터 유도될 수도 있다. 역으로, 항-서드파티 Tcm 세포는 세포 또는 조직 이식편과 비교하여 다른 기원으로부터일 수 있다(예를 들면, 골수 세포가 대상체로부터 나오고, 항-서드파티 세포가 동종이계 도너로부터 나옴. 실시예 3 및 도 2A-G 참조).
따라서, 본 발명의 구현예에 따르면, 항-서드파티 Tcm 세포는 대상체 및 이식편 모두와 비-공통유전자(예를 들면, 동종이계 또는 이종)일 수 있다.
본 명세서에 사용된 구 "대상체 및 이식편 모두와 비-공통유전자(non-syngeneic with both the subject and the graft)"는 본 발명의 항-서드파티 Tcm 세포와 관련되는 경우 대상체와 동종이계 또는 이종이고 이식편과 동종이계 또는 이종인 것으로 항-서드파티 Tcm 세포가 자격을 갖는 것이다. 따라서, 항-서드파티 Tcm 세포는 대상체와 그리고 이식편 도너와 다른 기원으로부터 얻어진 것일 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 항-서드파티 Tcm 세포는 대상체 및 이식편 모두와 비-공통유전자인 것이다(예를 들면, 제 2 도너로부터).
또 다른 구현예에 따르면, 항-서드파티 Tcm 세포는 대상체에 대해서만 오직 비-공통유전자일 수 있다. 또 다른 구현예에 따르면, 항-서드파티 Tcm 세포는 오직 세포 또는 조직 이식편에 대해서만 비-공통유전자일 수 있다.
하나의 구현예에 따르면, 항-서드파티 Tcm 세포는 이식편과 비-공통유전자이고, 대상체와 공통유전자(예를 들면, 이식편이 비-자기조직 기원인 상황에서 자기조직 기원의)이다.
특정 구현예에 따르면, 이식편은 대상체와 비-공통유전자인 미성숙 조혈 세포를 포함하는 경우(예를 들면, 비-자기조직), 세포의 단리된 개체군은 대상체와 공통유전자이다(예를 들면, 자기조직)
본 명세서에서 사용된 용어 "미성숙 조혈 세포"는 하나 이상의 타입의 완전히 구별되는 조혈 세포로 구별될 수 있는 임의의 타입의 불완전하게 구별되는 세포를 말한다. 미성숙 조혈 세포는 이 기술 분야에서 "간세포(progenitor cells)", "전구 세포", "줄기 세포", "다능성(pluripotent) 세포", "다능(multipotent) 세포로 언급되는 세포의 유형을 한정 없이 포함한다.
바람직하게, 미성숙 조혈세포는 조혈모 세포이다.
바람직하게, 미성숙 조혈 세포가 사람으로부터 유도되는 경우, 미성숙 조혈세포는 CD34+ 세포, 예를 들면 CD34+CD133+세포이다.
미성숙 조혈 세포를 포함하는 본 발명의 이식편의 타입은 전체 골수 세포 이식편(T-세포 고갈된 또는 비-T-세포 고갈된), 골수 애스피레이트(aspirates)로부터의 미성숙 조혈 세포의 이식편, 말초 혈액-유도된 미성숙 조혈 세포의 이식편, 및 배꼽 코드(umbilical cord)-유도된 미성숙 조혈세포의 이식편을 포함한다. 이런 이식편을 얻는 방법은 이하에 설명된다.
사람 말초 혈액-유도된 조혈모 세포를 포함하는 이식편은 표준 방법, 예를 들면 CD34+ 세포를 말초 혈액으로 도너의 사이토카인 처리에 의해 고정하고, 이어서 고정된 CD34+ 세포를 백혈구분반술을 통해 수확하는 방법에 따라 얻을 수 있다. 앰플 가이던스는 골수 또는 혈액으로부터 골수-유도된 줄기 세포의 단리를 실행하기 위한 이 분야의 문헌에서 제공된다(예를 들면, Arai S, Klingemann HG., 2003. Arch Med Res. 34:545-53; 및 Repka T. 및 Weisdorf D., 1998. Curr Opin Oncol. 10:112-7; Janssen WE. et al ., 1994. Cancer Control 1:225-230; Atkinson K., 1999. Curr Top Pathol. 92:107-36 참조).
사람 배꼽 코드 혈액-유도된 조혈모세포의 이식편은 표준 방법에 따라 얻을 수 있다(예를 들면, Quillen K, Berkman EM., 1996. J Hematother. 5:153-5)
본 발명의 조혈모 세포의 이식편은 간조직 또는 난황 주머니로부터 유도될 수도 있다.
조혈모 세포의 필요한 수는 일차 조혈모 세포의 생체외 확장에 의해 제공될 수 있다(Emerson, 1996, Blood 87:3082에서 검토, 및 Petzer et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 3:1470; Zundstra et al., 1994, BioTechnology 12:909; 및 WO 95 11692에서 보다 상세히 설명). 또 다른 특정 구현예에 따르면, 이식편이 대상체와 비-공통유전자인(예를 들면, 비-자기조직) 미성숙 조혈 세포를 포함하는 경우, 세포의 단리된 개체군은 대상체와 이식편 모두에 비-공통유전자이다(예를 들면, 미성숙 조혈세포 및 세포의 단리된 개체군은 다른 도너로부터 나온다).
또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 질환의 치료가 필요한 대상체에서 질환을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 (a) 대상체에 미성숙 조혈세포를 이식하는 단계; 및 (b) 중앙 기억 T 림프구(Tcm) 표현형을 갖는 비-이식편대숙주(GVHD)를 유도하는 항-서드파티 세포를 포함하는 세포의 단리된 개체군의 치료적 유효량을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 세포는 내성-유도 세포이고 이식 후 림프 노드에 귀소할 수 있고, 상기 미성숙 조혈세포가 대상체와 공통유전자인 경우, 세포의 단리된 개체군은 대상체와 공통유전자이거나 대상체와 비-공통유전자에서 선택된다.
특정 구현예에 따르면, 미성숙 조혈세포 및 세포의 단리된 개체군 모두는 자기조직(예를 들면, 대상체로부터)이다.
또 다른 특정 구현예에 따르면, 미성숙 조혈세포는 자기조직(예를 들면, 대상체로부터)이고, 세포의 단리된 개체군은 비-자기조직(예를 들면, 도너로부터)이다.
또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 질환의 치료가 필요한 대상체에서 질환을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 (a) 대상체에 미성숙 조혈세포를 이식하는 단계; 및 (b) 중앙 기억 T 림프구(Tcm) 표현형을 갖는 비-이식편대숙주(GVHD)를 유도하는 항-서드파티 세포를 포함하는 세포의 단리된 개체군의 치료적 유효량을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 세포는 내성-유도 세포이고 이식 후 림프 노드에 귀소할 수 있고, 상기 미성숙 조혈세포가 대상체와 비-공통유전자인 경우, 세포의 단리된 개체군은 대상체와 공통유전자이거나 대상체와 미성숙 조혈세포 모두에 비-공통유전자에서 선택된다.
특정 구현예에 따르면, 미성숙 조혈세포는 비-자기조직(예를 들면, 도너로부터)이고, 세포의 단리된 개체군 모두는 자기조직(예를 들면, 대상체로부터)이다.
또 다른 구현예에 따르면, 미성숙 조혈세포가 대상체와 비-공통유전자(예를 들면, 비-자기조직)인 경우, 항-서드파티 Tcm 세포는 대상체와 이식편 모두와 비-공통유전자(예를 들면, 2개의 다른 도너)이다.
특정 구현예에서, 미성숙 조혈세포 및 세포의 단리된 개체군은 다른 도너로부터 온다.
본 발명의 추가적인 양태에 따르면, 본 발명은 중앙 기억 T 림프구(Tcm) 표현형을 갖는 비-이식편대숙주(GVHD)를 유도하는 항-서드파티 세포을 포함하고, 상기 세포는 내성-유도 세포이고 이식 후 림프 노드에 귀소할 수 있으며, 여기서 세포는 대상체 및 세포 또는 조직 이식편과 모두 비-공통유전자인 세포의 단리된 개체군이다.
(i) 대상체 및 이식편 모두에 비-공통유전자이거나, 또는
(ii) 이식편과는 비-공통유전자이고, 숙주 대상체와는 공통유전자.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 이식편과는 비-공통유전자이고, 숙주 대상체와는 공통유전자인 세포들은 자기조직이다.
따라서, 본 발명은 질병(예를 들면, 백혈병 또는 림프종)을 근절시키고, 면역허용원(tolerogenic) 세포 및 비-GVHD에 의한 세포 또는 조직 이식편(예를 들면, 자기조직 또는 비-자기조직 골수 세포)의 인그래프트먼트를 부수적으로 강화하는 임의의 항-서드파티 Tcm 세포(예를 들면, 대상체와 이식편 모두와 비-공통유전자이거나 이식편과는 비-공통유전자이고, 대상체와는 공통유전자임)를 대상체에 투입하는 단계를 고려한다.
항-서드파티 세포는 세포 또는 조직 이식편과 함께 부수적으로 투입될 수 있거나(예를 들면, 보조 치료법으로서), 세포 또는 조직 이식편의 이식 전에 투여될 수 있거나(예를 들면, 잔류 암세포를 이식 전에 근절하고 이식 거부 및 이식편대숙주질환을 제거하기 위해), 또는 세포 또는 조직의 이식에 이어서 투여될 수 있다(예를 들면, 이식 다음에 잔류 암 세포를 근절시키기 위해 및 이식 거부 및 이식편대숙주 질환을 제거하기 위해)는 것이 이해될 것이다.
항-서드파티 세포는 이식 다음에 언제든지 투여될 수 있다고 이해될 것이다. 전형적으로 항-서드파티 Tcm 세포는 이식 다음 0일, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일 또는 10일에 투여된다. 그러나, 항-서드파티 Tcm 세포는 이식 후 연장된 시간에, 예를 들면, 2주, 한달, 2달, 3달, 4달, 5달, 6달, 7달, 8달, 9달, 10달, 11달, 12달, 18달 또는 24월에 투여될 수도 있다.
항-서드파티 Tcm 세포는 이식을 위한 이 분야의 공지된 임의의 방법을 통해, 예를 들면, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 세포 주입(예 : I.V.) 또는 복강내 경로를 통해 투여될 수도 있다.
이론에 결부됨 없이, 치료적 유효량은 GVHD 유도없이 관용화(tolerization), 항-종양 효과 및/또는 면역 회복을 위해 효과적인 항-서드파티 Tcm 세포의 양이다. 본 발명의 Tcm 세포가 이식 후 림프 노도로 귀소하기 때문에, 세포의 이로운 효과/효과들(예를 들면, 관용화, 항-종양 효과 및/또는 면역 회복)을 얻기 위해 세포의 보다 적은 양(이전에 사용된 세포의 투여량과 비교하여, 예를 들면 WO2001/049243 참조)이 요구될 수 있다. 보다 낮은 레벨의 면역억제 약물이 본 발명의 Tcm 세포와 함께 요구될 수도 있다(예를 들면, 치료 프로토콜로부터 라파마이신(rapamycin)의 배제)는 점이 이해될 것이다.
치료적 유효량은 이 분야의 당업자에 능력 내에서 특히 본 명세서에서 제공된 상세한 설명을 참조하여 잘 결정된다.
본 발명의 방법에 사용된 임의의 제법을 위해, 치료적 유효량 또는 투여량은 시험관내 및 세포 배양 어세이로부터 초기에 평가될 수 있다. 예를 들면, 투여량은 요구된 농도 또는 역가를 성취하기 위해 동물 모델에서 시험될 수 있다. 이런 정보는 사람에게 보다 정확하게 유용한 투여량을 결정하는데 사용될 수 있다.
예를 들면, 조직 이식편의 경우, 수령인에게 주사되는 항-서드파티 Tcm 세포의 수는 체중 kg 당 1 x 104 이상이어야 한다. 수령인에게 주사된 항-서드파티 세포의 수는 전형적으로 체중 kg 당 1 x 104 내지 1 x 109의 범위 내이어야 한다.
세포 또는 조직 이식편의 인그래프트먼트를 촉진하기 위해, 상기 방법은 세포 또는 조직 이식편의 이식 전, 부수적으로 또는 이후에 대상체를 추가적인 면역억제 약물 및/또는 면역억제 조사로 컨디셔닝하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
따라서, 본 발명의 구현에에 따르면, 대상체는 세포 또는 조직 이식편의 이식 전에 반 치사(sublethal), 치사(lethal) 또는 전 치사(suprlethal) 조건하에서 컨디셔닝된다.
예를 들면, 대상체는 골수제거성(myeloablative) 또는 비-골수제거성 컨디셔닝으로 치료될 수 있다. 이런 컨디셔닝의 타입은 이 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있고 대상체의 나이 및 질환의 심한 정도를 고려한다. 따라서, 예를 들면, 보다 나이 든 대상체(예를 들면, 40세 이상)는 완화된 면역억제 섭생으로 치료될 수 있다.
면역억제 섭생의 적합한 타입의 실예는 면역억제 약물, 내성 유도 세포 개체군(본 명세서 상세히 설명된 바와 같은), 및/또는 면역억제 방사선 조사의 투여를 포함한다.
이식을 위한 적합한 면역억제 섭생을 선택 및 투여하기 위한 앰플 가이던스는 종래 문헌(예를 들면, Kirkpatrick CH. 및 Rowlands DT Jr., 1992. JAMA. 268, 2952; Higgins RM. et al., 1996. Lancet 348, 1208; Suthanthiran M. 및 Strom TB., 1996. New Engl. J. Med. 331, 365; Midthun DE. et al., 1997. Mayo Clin Proc. 72, 175; Morrison VA. et al., 1994. Am J Med. 97, 14; Hanto DW., 1995. Annu Rev Med. 46, 381; Senderowicz AM. et al., 1997. Ann Intern Med. 126, 882; Vincenti F. et al., 1998. New Engl. J. Med. 338, 161; Dantal J. et al. 1998. Lancet 351, 623 참조)에서 제공된다.
바람직하게, 면역억제 섭생은 적어도 하나의 면역억제 제제를 대상체에 투여하는 단계로 이루어진다.
면역억제 제제의 실예는 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 메토트렉세이트(methotrexate), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시클로스포린(cyclosporine), 시클로스포린 A, 클로로퀴닌(chloroquine), 히드록시클로로퀴닌, 설파살라진(설파살라조피린)(sulfasalazine(sulphasalazopyrine)), 골드염(gold salts), D-페니실아민(D-penicillamine), 레플루노미드(leflunomide), 아자티오프린(azathioprine), 아나킨라(anakinra), 인플릭시맵(infliximab (REMICADE)), 에탄에르셉트(etanercept), TNF.알파.블록커, 염증 사이토카인을 타겟하는 생물학적 제제, 및 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID들)을 포함한다. NSAID들의 실예로는 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 아세틸 살리실산, 클로린 마그네슘 살리실레이트, 디플루니살(diflunisal), 마그네슘 살리실레이트(magnesium salicylate), 살살레이트(salsalate), 소듐 살리실레이트(sodium salicylate), 디클로페낙(diclofenac), 에토돌락(etodolac), 페노프로펜(fenoprofen), 플루비프로펜(flurbiprofen), 인도메타신(indomethacin), 케토프로펜(ketoprofen), 케토로락(ketorolac), 메클로페나메이트(meclofenamate), 나프록센(naproxen), 나부메톤(nabumetone), 페닐부타존(phenylbutazone), 피록시캄(piroxicam), 술린닥(sulindac), 톨메틴(tolmetin), 아세트아미노펜(acetaminophen), 이부프로펜(ibuprofen), Cox-2 억제제, 트라마돌(tramadol), 라파마이신(시롤리무스(sirolimus)) 및 라파마이신 유사체(예를 들면, CCI-779, RAD001, AP23573)를 포함한다. 이들 제제는 개별적으로 또는 조합하여 투여될 수있다.
본 명세서에 사용된 용어 "약"은 ±10%을 말한다.
상기 용어 "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "포함하다(inculdes)", "포함하는(including)", "갖는(having)" 및 이들의 활용어는 "포함하지만 제한되는 것은 아니다"의 의미이다.
용어 "~로 이루어진(consisting of)"은 "포함하고 제한되는 것이다"의 의미이다.
용어 "~필수적으로 이루어진(consisting essentially of)"는 조성물, 방법 또는 구조가 추가적인 성분, 단계 및/또는 파트를 포함할 수 있지만, 추가적인 성분, 단계, 및/또는 파트가 청구된 조성물, 방법 또는 구조체의 기본적이고 신규한 특성을 실질적으로 변경하는 것은 아님을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는 문맥에서 다르게 특정적으로 지시하지 않는 이상 복수형을 포함한다. 예를 들어, "화합물(a compound)" 또는 "적어도 하나의 화합물(at least one compound)"는 혼합물을 포함하여 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 구현예는 범위 방식으로 나타낼 수 있다. 범위 방식의 설명은 단지 편의 및 간결성을 위한 것이며, 본 발명의 범위를 융통성없이 한정하는 것으로 구속되어서는 안 되는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 설명은 모든 가능한 부분범위(subrange) 뿐만 아니라 그 범위 내의 개개의 숫자를 개시한 것으로 여겨져야 한다. 예를 들면, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6과 같은 부분 범위 뿐만 아니라 범위 내의 개별 숫자, 예를 들면 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 여겨져야 한다. 이것은 범위의 폭에 상관없이 적용한다.
숫자 범위를 본 명세서에 나타낸 어떤 경우에도, 지적된 범위 내의 모든 인용된 수(분수 또는 정수)를 포함하는 것으로 이해된다. 상기 제 1 수 및 제 2 수 "의 범위/사이의 범위(ranging/ranges between)" 및 제 1 수 "내지" 제 2 수 "범위/의 범위(ragning/ragnes from)"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 지칭된 제 1 수 및 제 2 수, 및 이들 사이의 모든 분수 및 정수를 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "방법"은 주어진 업무를 성취하기 위한 방식(manner), 수단(means), 기술(techniques) 및 절차(procedures)를 말하며, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 화학, 약학, 생물학, 생화학 및 의학 분야의 전문가들에 의해 공지된 방식, 수단, 기술 및 절차 또는 이들로부터 용이하게 발전된 방식, 수단, 기술 및 절차를 포함한다.
보다 명확히 하기 위하여, 별개의 구현예로 설명된 본 발명의 특정의 특징은 단일 구현예에서 조합되어 제공될 수도 있음을 알게 된다. 거꾸로 말하면, 간결함을 위해 단일 구현예로 설명된 본 발명의 다양한 특징은 별개로 또는 임의의 적합한 부분 조합으로 또는 본 발명의 임의의 다른 구현예에서 적합하게 제공될 수도 있다. 다양한 구현예에서 설명된 특정 특징은 구현예가 다른 요소 없이 이용될 수 없지 않는 이상 이들 구현예의 필수적인 특징으로 여겨져서는 안 된다.
또한 상기 설명되고 이하 청구 범위에서 청구하는 본 발명의 다양한 구현예 및 양태는 하기 실시예를 통해 실험적으로 입증될 것이다.
실시예
상기한 설명과 함께 다음의 실시예를 참고하여 본 발명을 비한정적으로 설명한다.
일반적으로, 본 발명에 사용되는 명칭 및 본 발명에 사용되는 실험실 방법은 분자, 생화학, 분자생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 상기 기술은 전체적으로 문헌에 설명되어 있다. 문헌["Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology "Volumes I-III Ausubel, R.M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons,Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombination DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al.(eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허 제 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 및 5,272,057 호에 설명된 방법들; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al.(eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)]을 참조하기 바라며 이용가능한 면역에세이는 전체적으로 특허 및 과학 문헌에 기술되어 있다[참조예, 미국특허 제3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 및 5,281,521호; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R.I.,ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)](상기한 문헌은 모두 본 명세서에서 전체적으로 참조 문헌으로서 인용된다). 이 문서 전체를 통해 다른 일반 문헌이 제공된다. 그 안의 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있고 독자의 편의를 위해 제공된다. 거기에 포함된 모든 정보는 본 명세서에서 참고적으로 인용된다.
일반적인 물질 및 실험 절차
동물
6 내지 12주령 암컷 BALB/c, CB6 (F1), FVB, C57BL/6, 및 BALB/c-NUDE 마우스들을 할랜 래보래토리 엘티디(Harlan Laboratories Ltd)에서 모두 구매하였다. B6-NUDE 마우스의 프로제니(progeny)는 웨이쯔만 인슈티튜드 애니멀 센터에서 사육하였다. 모든 마우스들은 작은 케이지(각 케이지 당 5마리)에서 보호되고 무균 식품 및 산성 물을 공급하였다. 모든 연구는 웨이쯔만 인슈티튜드 오브 사이언스(Weizmann Institute of Science)의 동물실험윤리심의위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다.
세포
문헌 [Kim KJ et al., J. Immunol. (1979) 122: 549-554]에서 이전에 설명된 A20 뮤린 림프종 세포주, B 세포 림프종/백혈병 주에서 유도된 BALb/c(H-2d), 및 문헌 [Edinger M et al., Blood. (2003) 101: 640-648] 에서 이전에 설명된 A20의 안정한 세포감염체(transfectant), A20 yfp/luc+를 모두 5% FCS, 2mM 글루타민, 불필수 아미노산, 항생제, 및 50μM 2-β머캅토에탄올로 보충된 RPMI 1640 배지에서 모두 유지시켰다.
숙주
비반응성
항-
서드파티
Tcm
의 제조
항-서드파티 Tcm을 문헌[Ophir E et al., Blood (2010) 115: 2095-2104] 에서 이전에 설명된 바와 같이 제조하였다. 간단히, 도너 마우스들의 지라세포를 사이토카인 박탈하에서 60시간 동안 방사선 조사된 서드-파티 지라세포에 대해서 배양하였다. 이어서, CD8+ 세포를 마그네틱 입자(BD Pharmingen)을 사용하여 포지티브하게 선택하고, Ag 없는 환경에서 배양하였다. rhIL-15(20 ng/mL; R&D Systems) 을 매 두 번째 날에 첨가하였다. 정제된 개체군을 배양의 말기(16일)에 얻기 위해, Tcm 세포를 마그네틱-활성화된 세포 분류[MACS, Milteny, Bergisch Gladbach, Germany]에 의해 CD62L 발현을 위해 포지티브하게 선택하였다.
유세포분석기
분석(
Flow
cytometric
analysis)
형광-활성화된 세포 분류(FACS) 분석을 변형된 Becton Dickinson FACsan을 사용하여 수행하였다. 세포를 CD8-피코에리트린(phycoerythrin) (PE)/플루오레세인이소티오시안산염(FITC)/알로피코시아닌(allophycocyanin)(APC)(BD Pharmingen), 칼세인에이엠(CalceinAM)(몰레큘러 프로브스, 인크, 유젠, OR, USA)에 대해 특이적인 라벨화된 항체로 염색하였다. 애넥신 V 및 7-아미노-액티노마이신 D(7AAD) 염색을 제조업자의 지시(BD Pharmingen)에 따라서 진행하였다.
MLR
배양 및 세포독성 분석
항-서드파티 Tcm 및 림프종 세포를 피콜(Ficoll) 밀도 구배 원심분리에 의해 얻고, 림프종 세포를 0.15㎍/ml 칼세인에이엠(몰레큘러 프로브스, 인크, 유젠, OR, USA)으로 제조업자의 지시에 따라 라벨화하고, 요구된 배지중에 1 x 106 세포/ml의 농도로 만들었다. 림프종 세포의 3 x 105을 24-웰 플레이트를 위한 지시된 비율 및 시간 간격에 따라 항-서드파티 CTL로 배양하였다. 세포를 회수하고 애넥신-V(BD)과 같은 표면 마커를 사용하고, FACS에 의해 칼세인에이엠 염색된 림프종의 수를 측정하는 것으로 살아 있는 것에 대해 분석하였다.
애넥신
V 염색에 의한
아포토시스의
검출
애넥신 V APC를 아포토시스 세포를 검출하기 위해 사용하였다. 시험관내 배양액으로부터 샘플을 다른 형광크롬으로 라벨화된 선택된 모노클로날 항체의 혼합물로 4℃에서 20분 동안 배양하였다. 애넥신 V 결합 완충액을 사용하여 결합되지 않은 자유 항체를 씻겨낸 후, 샘플을 5㎕ 애넥신 V-APC(BD)로 보충하였다. 이어서 세포를 실온에서 15분 동안 어둠 속에서 배양하고, 애넥신-V 결합 완충액으로 세척하였다. 샘플을 애넥신 A의 포지티브하게 염색된 살아 있는 세포들에 대해 FACS로 분석하였다.
생체 모델에서 최소 잔류 질환
12주령 BALB/c 암컷 수령 마우스를 감마빔 150-A 60 코 소스(아토믹 에너지 오브 캐나다, Kanata, ON, Canada)로부터 8Gy 전신방사선 조사(TBI)의 단일 투여량에 노출시켰다(-1일). 다음날(0일)에 수령 마우스들에 마우스마다 5 x 103 A20 luc 림프종 세포로 보충된 BALb/c-누드 마우스들(공통유전자)로부터 3 x 106 T 세포 고갈된 골수를 정맥으로 주입하거나 또는 B6-누드 마우스로부터의 3 x 106 T 세포 고갈된 골수를 정맥으로 주입하였다. 그 다음날(+1일)에 마우스들은 10 x 106 BALB/c 유도된 항-서드파티 Tcm(공통유전자) 또는 5 x 106 C57BL/6 유도된 항-서드파티 Tcm(동종이계)를 정맥으로 받거나 받지 않았다. A20 세포의 종양 국지화, 이동 패턴 및 항-서드파티 CTL들의 항-림프종 반응성을 생체내 이미징 시스템을 사용하여 조사하였다.
생체내
이미징
마우스들을 케타민(Ketamine)(100 mg/kg 복강내 (i.p))(Kepro Holand Netherlands) 및 실라진(Xylazine) (Kepro Holand Netherlands) (20 mg/Kg i.p)으로 마취시키고, 이어서 D 루시페린(150 mg/Kg i.p) (Cat#XR-1001, PBS중의 30 mg/ml; 이종)을 이미징하기 전 10분에 주입하였다. 동물들을 웨이쯔만 인슈티튜드의 수의관 리소스의 부서에서 픽셀플라이(Pixelfly) QE(PCO, K, Germany) 전하-연결된 장치(CCD) 카메라가 연결된 인 비보 이미징 시스템(In Vivo Imaging system: IVIS 100
, Xenogen)의 광선-고정된 챔버에 위치시켰다. 흑백으로 신체 표면 참조 이미지(디지털 사진)을 강한 조명하 10초 노출 후에 얻어졌다. 이미지 데이터 처리 및 분석을 리빙 이미지 2.5 소프트웨어(Living Imagne 2.5 softwar)을 사용하여 수행하였다. 마우스들을 주간격으로 14일로부터 종양 성장에 대해 모니터하였다.
통계적 분석
생존 데이터 분석을 카플란-메이어 커브(로그-랭크 테스트)를 사용하여 수행하였다. 평균의 비교는 스튜던트 t 테스트를 사용하여 수행하였다.
실시예
1
마우스 모델 구축
적당한 마우스 모델을 구축하기 위해, 발명자들은 (B6 x BALB/c)F1로부터 유도된 항-서드파티 Tcm 세포가 BALB/c 기원의 A20 림프종 세포를 TCR 독립적으로 죽이는 것을 보여주는 것은 초기에 확인하였다(4번 실험에서 34.8 ± 12.1%, 5:1 Tcm/림프종 세포비, Tcm 없이 배양된 A20 세포와 비교, p<0.05). 또한, Tcm 세포 배양 16시간 후에 애넥신 V 염색의 A20 세포들이 기저 염색 레벨과 비교하여 현저하게 강화되었고(3번 실험에서 14.8 ±4.5 % 및 5.2 ±2.2 % 각각, p<0.05), 이는 문헌[Lask A et al. (submitted 2010); Arditti FD et al., Blood (2005) 105:3365-3371]에서 사람 림프종 세포를 죽이는 이전에 설명된 것과 유사한 메카니즘인 아포토시스 기초된 메커니즘을 제안한다.
실시예
2
공통유전자 골수 이식편 및
Tcm
세포에 의한 치료 프로토콜
루시퍼라제 발현 A20 세포를 사용하여, 발명자들은 모델 모의 최소 잔류 질환(model simulating minimal residucal disease)에서 생체 내 악성 세포의 운명을 따르게 하고, 공통유전자 또는 동종이계 골수 이식편(이하에서, BMT이라 함)에 더해진 도너 항-서드파티 Tcm의 항-림프종 효과를 연구하였다. 공통유전자 모델에서, 3 x 106 누드 BALB/c BM 세포를 치명적으로 방사선 조사된 BALB/c 마우스들에 5000 A20 세포와 함께 이식하였다. 다음날에, 공통유전자 Tcm을 주사하였다. 도 1A 내지 1D에서 보여질 수 있는 바와 같이, 골수 이식 후 100일에 살아있는 미처리된 마우드들(0/7)은 없었다(BMT, 23일 중앙 생존 기간(median survival). 그러나, 1 x 107 또는 2 x 107 공통유전자 Tcm 세포의 투여는 현저하게 감소된 종양 부담을 이끌었으며, BMT 후 100일에 마우스들의 전체 생존률 28%(2/7, p<0.0001) 및 40%(2/5, p<0.002)로 개선되었고, 이들 각각은 49 및 80일의 중앙 생존 기간을 가졌다(도 11).
실시예
3
공통유전자 골수
이식편
및
동종이계
Tcm
세포에 의한 치료 프로토콜
우리의 실험실에서 시험한 이전 연구[Ophir E. et al., Blood (2010) 115: 2095-2104]는 부분적으로 매칭된 도너을 사용하는 경우에서조차 항-서드파티 Tcm 세포에 내성화 활성(tolerizing activity)이 제공되고, BMT로 이어지는 연장된 지속성으로 번역됨을 보여주었다. 따라서, 발명자들은 상기 설명된 공통유전자 BMT 모델에서 이전에 투여된 공통유전자 Tcm 세포 대신 2 x 107 F1 (CB6) 유도된 Tcm 세포들의 항-림프종 효과를 테스트하였다. 비록 이들 F1 유도된 Tcm 세포들은 MHC 차이(disparity)에 기인하여 거부된다고 예측되었지만, 이들은 계속 존재하였고 이식 후 2개월에서 조차 거부되지 않았다(데이터 도시하지 않음). 이들의 장기간 지속성은 아마도 상기 설명된 이들의 내성화 활성의 결과인 것 같다. 이들 F1 유도된 Tcm 세포의 현저한 임상적 효과는 미처리된 그룹에서 마우스들의 생존률 0%(0/5, 도 2A 내지 2C 및 2G)와 비교하여 개선된 전체 마우스들의 생존률 57.1%(4/7, 도 2D 내지 2G)에 의해 보여졌다. 따라서, 이들 결과는 동종이계 도너로부터 유도된 항-서드파티 Tcm 세포가 단독으로 또는 골수 세포와 조합해서 항-B 세포 악성종양 세포 치료법으로 사용될 수 있음을 결론적으로 보여준다.
실시예
4
동종이계
골수
이식편
및
동종이계
Tcm
세포에 의한 치료 프로토콜
동종이계 세팅에서 조사되는 경우, 종양 박멸 추가적인 개선점이 관찰되었다. 이 효과는 아마도 새로이 발견된 T 세포 수용체(TCR)의 독립적인 세포 사멸 이상의 추가적인 이식편대백혈병/림프종(GVL) 효과를 제공하는 잔류 알로반응성에 기인한 것이다. 중요하게, 이 추가 효과는 GVHD를 일으킴 없이 성취된다. 동종이계 모델에서, ,3 x 106 동종이계 누드 B6 BM 세포를 5000 A20과 함께 치명적으로 방사선 조사된 BALB/c 마우스들에 이식하였다. 다음날에, 마우스들을 도너 타입 Tcm으로 처리하였다. 동종이계 모델의 결과와 유사하게(상기 실시예 2 및 3에서 설명), BMT 후 100일에 생존한 미처리된 마우스들은 없었고(0/8, 23일 중앙 생존 기간, 도 3A 내지 3D 및 3I), 반면 5 x 106 도너 타입 Tcm 세포들의 투여는 BMT 후 100일에 아주 놀라운 생존률 100%(7/7)을 이끌어 냈다(도 3e 내지 3i). 비록 동종이계 Tcm 세포는 공통유전자 Tcm 세포와 비교하여 강화된 GVL 활성을 보여주었지만, 이 효과는 GVHD의 임의의 현상(manifestation)과 관련되지 않았다. 따라서, 이전에 설명된 바와 같이, 동종이계 항-서드파티 Tcm 세포를 받은 마우스들의 체중 및 전체 외관은 누드 BM 단독의 이식편으로 라디오(radio)-보호된 대조군의 마우스들과 유사하였다.
총괄적으로, 본 발명자들은 최초로 생체 이미징으로, 뮤린 항-서드파티 Tc의 GVL 활성을 보여주었다. 이들 결과는 항-서드파티 Tcm 세포가 BM 인그래프트먼트 촉진과 동시에 GVHD 일으킴 없는 GVL 활성 유도에 의해 "이중 지지 효과(double supportive effect)"를 제공할 수 있다. 이런 세포 치료법은 매우 매력적이며 특히, 공격적인 컨디셔닝에서 견딜 수 없는 B-CLL 및 기타 B 세포 악성종양을 갖는 나이든 환자에게 매력적이며, 항암 세포 치료법으로 사용될 수 있는 입수용이한 제품인 '규격품(off the shelf)' 으로 잠재적으로 개발될 수 있다.
실시예
5
항-
서드파티
T 중앙 기억 세포의 발생
물질 및 실험 절차
순수
CD8
+ T 세포 세포의
풍부화
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 버피 코트(buffy coats)의 피콜 밀도 구배 원심분리에 의해 건강한 도너로부터 얻었다. 도너의 PBMC를 이어서 10% DMSO 동결 용액에 옮기고 액체 질소상에서 저온보존하였다.
-2일 : 도너의 냉동 PBMC를 37℃ 수조에서 빠르게 해동하고 따뜻한 해동 배지(죽는 세포의 결과로 세포 무더기 형성을 피하기 위해 10% 사람 혈청으로 보충된 Celllgro DC 및 벤조나제(Benzonase)®뉴클레아제(Nuclease)로 보충된 Pen/Strep 배지)로 옮겼다. 해동된 도너의 PBMC를 2번 따뜻한 해동 배지에서 세척하였다. 부착 세포를 고갈시키기 위해, 도너의 PBMC를 배양 배지(5% 사람 혈청 및 Pen/Strep 및 10ng/ml IL-7으로 보충된 Cellgro DC)중에 재현탁시시키고, 특별히 37℃에서 밤새 배양을 위해 코팅된 6-웰 플레이스상에 위치시켰다.
-1일 : 비-부착 세포를 제거하였다(이 절차는 부착된 단핵백혈구를 제거하는 것으로 및 마그네틱 풍부화 과정(magnetic enrichment process)을 진행하기 전에 해동 과정으로부터 해동 세포가 회수되게 허용함에 따라서 요구된 T 세포의 농도를 증가시켰다).
0일 : 비접촉된 CD8+ T-세포를 제조업자의 프로토콜에 따라서 밀테니(Miltenyi)로부터 CD8 단리 키트를 사용하여 단리하였다. 이어서, 순수 표현형을 갖는 CD8 T 세포를 CD45RO 자성 비드를 사용하여 활성 마커 CD45RO를 발현하는 세포를 고갈시키는 것으로 전체 CD8 개체군으로부터 얻었다.
단핵백혈구 유도된
수상돌기세포(DC)의
발생
단핵백혈구 유도된 DC들을 동종이계 저온보관된 PBMC로부터 발생시켰다. 상기 단핵백혈구를 플라스틱 부착에 의해 PBMC로부터 풍부하게 하고, GM-CSF 및 IL-4에서 3일이 지나는 동안 배양하였다. 성숙이 LPS 및 IFN-γ의 첨가로 배양의 최종 24시간 지나서 유도되었다.
항-
서드파티
Tcm
세포의 발생(순수
CD8
T 세포
타켓팅
단핵백혈구 유도된
DC
)
순수 CD8+ T 세포를 방사선 조사된(30gy) 단핵백혈구 유도된 DC를 가지고 1:0.25의 비율로 IL-21로 보충된 배양 배지(5% 사람 혈청 및 Pen/Strep으로 보충된 Cellgro DC)에서 3일 동안 활성화하였다. 이어서, CD8+ T 세포를 더이상 활성화하지 않고, IL-7 및 IL-15로 12일까지 성장시켰다.
결과
배양 11일에, 세포 조성 및 세포 표현형을 FACS 분석을 사용하여 평가하고, 세포수를 트리판 블루 배제(trypan blue exclusion)에 의해 결정하였다. 이 결과는 세포 조성(림포게이트(Lymphogate)로부터, 데이터 도시하지 않음)이 주로 CD8+ T 세포(CD3+CD8+) 94.6% 및 미량의 CD56+NK 세포(CD3-CD56+) 1.2% 및 NK T 세포(CD3+CD56+) 1.1%를 포함함을 보여주었다. 또한, CD8+ T 세포는 주로 Tcm 세포 76%, 순수 세포 9%, Teff/Tem 8.5% 및 Temra 6.5%를 포함하였다.
실시예
6
Tcm
이식편대
백혈병(
GVL
)
어세이
물질 및 실험 절차
GVL
어세이
B 세포주를 제조업자의 지시에 따라서 세포 죽음시 방출되는 바이탈 염료인 칼세인에이엠 0.15㎍/ml으로 라벨화하였다. 이어서, 0.3 x106 칼세인 라벨화된 세포주를 1.5 x106 항-서드파티 Tcm 있이 또는 없이 24 웰 플레이트에서 22시간 동안 배양하였다. 외인성 사이토카인은 MLR에 추가되지 않았다. 22시간 후, 세포를 회수하고, FACS에 의해 살아있는 칼세인 염색 세포의 수를 측정하여 생존률을 분석하였다.
세포의 절대값을 얻기 위해, 샘플을 일정한 부피로 현탁하고, 각각의 샘플에 대한 유세포 총수를 일정한 소정 시간 동안 얻고, 고정된 체적 및 고정된 수의 유입 세포로 얻어진 유세포 총수와 비교하였다.
아포토시스의
검출
애넥신 V 염색에 의한 아포토시스 검출을 위해, 샘플을 5㎕ 애넥신 V-APC(BD)로 10분 동안 실온에서 배양하였다. 이어서, 비결합된 애넥신 V를 세척해내고, 샘플을 FACS로 분석하였다.
비록 본 발명은 이들의 특정 구현예와 결합되어 설명되고 있지만, 많은 대안, 변형 및 변화가 이 분야의 기술자에게 명확해질 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위의 정신 및 광범위한 범위 내에 속하는 모든 대안, 변형 및 변화도 포괄된다고 여겨진다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 각각의 간행물, 특허 또는 특허출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로, 본 명세서에 포함하려고 하는 동일한 정도까지 본 명세서에 참고로 인용하였다. 더욱이, 본 출원서에서 인용하거나 확인한 어떤 참고문헌은 이러한 참고문헌이 본 발명의 선행기술로서 이용가능한 것으로 허가를 필요로 하는 것으로 생각되지는 않는다. 섹션의 제목이 사용되는 정도까지, 이들은 필수적으로 한정한 것으로 구속되어서는 안 된다.
Claims (46)
- 중앙 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 갖는 항-서드파티 세포 유도성 비-이식편대숙주(GVHD)를 포함하는 단리된 세포 집단을 생성하는 인비트로 방법으로서,
상기 중앙 기억 T-림프구(Tcm) 표현형은 CD8+/CD62L+/CD45RO+의 시그네이쳐를 포함하고, 상기 세포의 단리된 집단의 적어도 50%가 상기 시그네이쳐를 가지며, 상기 세포는 내성-유도 세포이고 이식 후 림프절에 귀소할 수 있으며,
(a) GVH 반응성 세포의 제거를 허용하는 조건하, IL-21의 존재시 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 한 개 또는 여러 개의 서드파티 항원과 접촉하는 단계; 및
(b) 상기 중앙 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 포함하는 세포의 증식을 허용하는 조건하, 항원이 없는 환경에서 IL-15의 존재시 단계(a)에서 얻어지는 상기 세포를 배양함으로써, 세포의 단리된 집단을 생성하는 단계를 포함하는 방법. - 비-공통유전자 세포 또는 조직 이식편이 이식된 사람 대상체의 질병의 근절을 위해 보조적인 치료법으로서 사용되기 위한, 중앙 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 갖는 항-서드파티 세포 유도성 비-이식편대숙주(GVHD)를 포함하는 단리된 세포 집단으로서,
상기 중앙 기억 T-림프구(Tcm) 표현형은 CD8+/CD62L+/CD45RO+의 시그네이쳐를 포함하고, 상기 세포의 단리된 집단의 적어도 50%가 상기 시그네이쳐를 가지며, 상기 세포는 내성-유도 세포이고 이식 후 림프절에 귀소할 수 있으며,
상기 세포는:
(i) 상기 대상체 및 상기 이식편 모두에 대해 비-공통유전자이거나; 또는
(ii) 상기 이식편에 대해 비-공통유전자이고, 대상체에 대해 공통유전자인 세포의 단리된 집단. - 제 2 항에 따른 용도의 세포의 단리된 집단에 있어서, 상기 세포 또는 조직 이식편은 비-자기조직이고, 상기 세포의 단리된 집단은 자기조직인 세포의 단리된 집단.
- 제 2 항에 따른 용도의 세포의 단리된 집단에 있어서, 상기 세포 또는 조직 이식편 및 상기 세포의 단리된 집단은 다른 도너 유래인 세포의 단리된 집단.
- 제 2 항에 따른 용도의 세포의 단리된 집단에 있어서, 상기 질병은 악성 종양과 선택적으로 B 세포 악성 종양을 포함하는 세포의 단리된 집단.
- 제 2 항에 따른 용도의 세포의 단리된 집단에 있어서, 상기 이식편은 골수세포와 선택적으로 미성숙 조혈 세포를 포함하는 세포의 단리된 집단.
- 제 6 항에 따른 용도의 세포의 단리된 집단에 있어서, 상기 미성숙 조혈 세포는 대상체에 대해 비-공통유전자이고, 상기 세포의 단리된 집단은 대상체에 대해 공통유전자인 세포의 단리된 집단.
- 제 7 항에 따른 용도의 세포의 단리된 집단에 있어서, 상기 미성숙 조혈 세포는 비-자기조직이고, 상기 세포의 단리된 집단은 자기조직인 세포의 단리된 집단.
- 제 6 항에 따른 용도의 세포의 단리된 집단에 있어서, 상기 미성숙 조혈세포는 대상체에 대해 비-공통유전자이고, 상기 세포의 단리된 집단은 대상체 및 상기 이식편 모두에 대해 비-공통유전자인 세포의 단리된 집단.
- 제 9 항에 따른 용도의 세포의 단리된 집단에 있어서, 상기 미성숙 조혈 세포 및 세포의 단리된 집단은 다른 도너 유래인 세포의 단리된 집단.
- 제 2 항에 따른 용도의 세포의 단리된 집단에 있어서, 상기 림프절은 말초 림프절 또는 장간막 림프절을 포함하는 세포의 단리된 집단.
- 제 2 항에 따른 용도의 세포의 단리된 집단에 있어서, 상기 이식편에 대해 비-공통유전자이고 대상체에 대해 공통유전자인 세포는 자기조직 세포를 포함하는 세포의 단리된 집단.
- 중앙 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 갖는 항-서드파티 세포 유도성 비-이식편대숙주(GVHD)를 포함하는 치료적 유효량의 단리된 세포 집단으로서,
상기 중앙 기억 T-림프구(Tcm) 표현형은 CD8+/CD62L+/CD45RO+의 시그네이쳐를 포함하고, 상기 세포의 단리된 집단의 적어도 50%는 상기 시그네이쳐를 가지고, 상기 세포는 미성숙 조혈 세포가 이식된 사람 대상체의 질병의 근절을 위해 보조적인 치료법으로서 사용되기 위한 내성-유도세포이며 이식 후 림프절에 귀소할 수 있고, 또한 상기 미성숙 조혈 세포가 사람 대상체에 대해 공통유전자인 경우 상기 세포의 단리된 집단은 사람 대상체에 대해 공통유전자 또는 사람 대상체에 대해 비-공통유전자로 선택되는 세포의 단리된 집단. - 제 13 항에 따른 용도의 세포의 단리된 집단에 있어서, 상기 미성숙 조혈 세포 및 상기 세포의 단리된 집단은 자기조직이거나, 상기 미성숙 조혈 세포는 자기조직이고 상기 세포의 단리된 집단은 비자기조직인 세포의 단리된 집단.
- 제 2 항 또는 제 13 항에 따른 용도의 세포의 단리된 집단에 있어서, 상기 항-서드파티 세포는 중앙 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 갖고, 상기 세포는 내성-유도 세포이며 이식 후 림프절에 귀소할 수 있고,
(a) GVH 반응성 세포의 제거를 허용하는 조건하에서, IL-21 존재시 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 한 개 또는 여러 개의 서드파티 항원과 접촉하는 단계; 및
(b) 상기 중앙 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 포함하는 세포의 증식을 허용하는 조건하, 항원이 없는 환경에서 IL-15의 존재시 단계(a)에서 얻어지는 상기 세포를 배양함으로써, 세포의 단리된 집단을 생성하는 단계에 의해 생성되는 세포의 단리된 집단. - 제 1 항에 따른 방법에 있어서, 상기 GVH 반응성 세포의 제거를 허용하는 조건은, 1 내지 5일 동안 배양하는 단계를 포함하는 방법.
- 제 1 항에 따른 방법에 있어서, 상기 IL-15의 존재시의 배양은 3일 내지 30일 동안 수행되는 방법.
- 제 1 항에 따른 방법에 있어서, 상기 중앙 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 포함하는 세포의 증식을 허용하는 조건은, IL-7 및/또는 IL-21을 더 포함하는 방법.
- 제 2 항 또는 제 13 항에 따른 세포의 용도의 단리된 집단에 있어서, 상기 질병은 백혈병 또는 림프종을 포함하는 세포의 단리된 집단.
- 중앙 기억 T-림프구(Tcm) 표현형을 갖는 항-서드파티 세포 유도성 비-이식편대숙주(GVHD)를 포함하는 단리된 세포 집단으로서,
상기 Tcm 표현형은 CD8+/CD62L+/CD45RO+의 시그네이쳐를 포함하고, 상기 세포의 단리된 집단의 적어도 50%가 상기 시그네이쳐를 가지며, 상기 세포는 내성-유도 세포이고 이식 후 림프절에 귀소할 수 있으며, 제 1 항에 따른 방법으로 생성된 세포의 단리된 집단. - 제 20 항에 따른 세포의 단리된 집단에 있어서, 세포 또는 조직 이식편 이 이식된 사람 대상체의 질병의 근절을 위해 보조적인 치료법으로서 사용되기 위한 세포의 단리된 집단.
- 제 21 항에 따른 세포의 단리된 집단에 있어서, 상기 질병은 악성 질환 및 이식편의 이식과 관련된 질병으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포의 단리된 집단.
- 제 22 항에 따른 세포의 단리된 집단에 있어서, 상기 악성 질환은 조혈 또는 림프성 조직의 악성 종양을 포함하는 세포의 단리된 집단.
- 제 22 항에 따른 세포의 단리된 집단에 있어서, 상기 악성 질환은 림프종 또는 백혈병을 포함하는 세포의 단리된 집단.
- 제 21 항에 따른 세포의 단리된 집단에 있어서, 상기 이식편은 미성숙 조혈 세포를 포함하는 세포의 단리된 집단.
- 제 21 항에 따른 세포의 단리된 집단에 있어서, 적어도 하나의 면역억제 약물을 사용하는 것을 추가로 포함하는 세포의 단리된 집단.
- 제 21 항에 따른 세포의 단리된 집단에 있어서, 반 치사, 치사 또는 전 치사 컨디셔닝 프로토콜을 추가로 포함하는 세포의 단리된 집단.
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