CN115175688A - 在数个t细胞介导的自身免疫性疾病的治疗中的数个否决细胞的用途 - Google Patents

Abstract

公开了一种在有需要的一受试者中治疗或预防一T细胞介导的自身免疫疾病的方法。所述方法包括：(a)将数个未成熟造血细胞移植到所述受试者体内；(b)向所述受试者施用一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结。

Description

在数个T细胞介导的自身免疫性疾病的治疗中的数个否决细 胞的用途

相关申请

本申请主张2019年11月5日申请的美国临时专利申请案第62/930,621号的优先权，其内容通过引用整体并入本文。

序列表声明

2020年11月4日创建的名称为84751 Sequence Listing.txt的ASCII文件(包含2,977个字节)与本申请的申请日同时申请，通过引用并入本文。

技术领域与背景技术

在其一些实施例中，本发明涉及包含中枢记忆T淋巴细胞表型的诱导耐受的抗第三方细胞的用途，作为用于治疗数个T细胞介导的自身免疫性疾病的造血干细胞移植的辅助治疗。

自身反应性T淋巴细胞是自身免疫性疾病的关键参与者，包括自身免疫性1型糖尿病(T1DM)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、多发性硬化症(multiplesclerosis，MS)及乳糜泻(celiac disease)。在这些疾病中，对关键自身抗原的免疫耐受失败是由所述患者自身的T细胞攻击各种器官引起的。尽管所述新型免疫抑制生物药物取得了成功，但这些药物都没有导致一无药物疾病缓解的永久状态，也没有恢复自我耐受的生理机制。

例如，T1DM是由对分泌胰岛素的β细胞的自身免疫攻击及随后的胰岛素缺乏引起的。所述T1DM的治愈需要通过胰岛移植或增强内源性β细胞再生来逆转自身免疫及重新供应分泌胰岛素的β细胞。

所述诱导对胰腺自身抗原的耐受性是治疗T1DM的一种有前景的方法。此一目标可以通过免疫消融及自体造血干细胞移植(hematopoietic stemcell transplant，HSCT)部分实现，如果在诊断后不久进行的话，至少可以暂时缓解导致糖尿病的免疫反应。然而，大多数接受自体HSCT移植的T1DM患者最终会复发[Snarski E.等人，骨髓移植Bone marrowTransplantation(2016)51,398–402]。因此，开发同种异体HSCT的方法，以提供持久的非自身免疫TCR库，可能是一种有前景的治疗方法，前提是此类方案可以安全地实现供体型嵌合体。因此，在与最小毒性及降低(graft versus host disease，GVHD)风险相关的温及条件下移植T细胞耗尽的同种异体HSCT(TD-HSCT)提供了一种有吸引力的治疗选择。然而，在T1DM中减少条件反射后克服移植排斥是一项重大挑战。

Reisner及其同事先前在野生型小鼠中证明，使用供体来源的数个否决细胞(vetocells)可以防止对TD-HSCT的排斥。否决活动(首先由米勒定义[Miller,R.G,自然Nature(1980)287；544-54])是基于所述特定细胞群攻击宿主CTL前体(CTLp)的能力，所述前体针对所述数个否决细胞本身所呈现的抗原。这种反应可以不伤害那些不针对否决细胞的细胞，包括那些识别病原体的细胞。在所述文献中描述的不同否决细胞群中，中枢记忆CD8T细胞在移植时表现出最强大的否决活性，但也具有显着的移植物抗宿主(graft-versus-host，GVH)活性。Reisner及其同事在有利于所述中枢记忆表型表达的培养条件下，通过扩增针对第三方MHC或病毒抗原的初始或记忆CD8T细胞克服了GVH反应性。这种抗第三方中枢记忆CD8T细胞(Tcm)具有明显的否决活性，而在完全不匹配的受体中有效地耗尽了GVH反应性[Reisner Y,Or-Geva N.Semin.(2019)56(3):173-182]。

已经考虑了各种方法来产生没有GVH反应性的耐受诱导细胞以及将其用作移植物移植的辅助治疗，其中一些总结如下。

PCT公开号WO 2001/049243公开了非同种异体反应性抗第三方细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其中非同种异体反应性抗第三方CTL通过引导所述供体的T淋巴细胞对抗3^rd-party刺激剂在没有外源性IL-2的情况下。这种方法基于观察到只有激活的细胞毒性T淋巴细胞前体(CTLp)能够在所述原代培养中的IL-2剥夺中存活(IL-2饥饿导致非细胞凋亡诱导的T细胞)。将这些抗3^rd方否决CTLs引入接受者(连同一移植物)在不诱导移植物GVHD的情况下防止了移植物排斥。

PCT公开号WO 2007/023491公开了所述在受试者中使用致耐受性细胞减少或预防一非同源移植物的移植排斥。所述公开的耐受性T调节细胞(例如CD4⁺CD25⁺细胞)可以来自与受试者及移植物(例如骨髓)可以来自与所述受试者同种异体或异种的任何移植物供体。

PCT公开号WO 2002/102971公开了所述使用包含增强的否决活性的培养的造血祖细胞(HPC)用于诱导对从供体移植到一接受者的移植物的耐受性。公开的致耐受性细胞优选表达CD33并且在所述移植物(例如细胞或器官移植)移植之前、同时或之后施用。

PCT公开号WO 2010/049935及WO 2012/032526公开了分离的细胞群，其包含具有一Tcm表型的非GVHD诱导抗第三方细胞，细胞是耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢到淋巴结。具体而言，WO 2010/049935及WO 2012/032526教导了未成熟造血干细胞与抗第三方Tcm细胞的共同移植。使用所述抗第三方Tcm细胞能够植入未成熟的造血细胞，而不会出现移植物抗宿主病(GVHD)。

PCT公开号WO 2013/035099及WO 2018/002924公开了产生包含具有一Tcm表型的抗第三方细胞的分离细胞群的方法，细胞是耐受诱导细胞及/或具有抗疾病活性，并且能够在移植后归巢至所述淋巴结。

发明内容

根据本发明的数个实施例的一方面，提供了一种治疗或预防有需要的一受试者的一T细胞介导的自身免疫疾病的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将数个未成熟造血细胞移植到所述受试者体内；及

(b)向所述受试者施用一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型(Tcm)的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结，从而治疗所述受试者的所述T细胞介导的自身免疫疾病。

根据本发明的数个实施例的一方面，提供了一种未成熟造血细胞移植及一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型(Tcm)的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结，用于治疗或预防有需要的一受试者的T细胞介导的自身免疫疾病。

根据本发明的数个实施例的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群是与所述未成熟造血细胞移植同时施用。

根据本发明的数个实施例，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群是用于所述未成熟造血细胞移植后的施用。

根据本发明的数个实施例，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群是在所述未成熟造血细胞移植后的第1至20天施用。

根据本发明的数个实施例，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群以每公斤理想体重的至少0.5x10⁶个CD8⁺细胞的一剂量施用。

根据本发明的数个实施例，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群以每公斤理想体重的0.5x10⁶个至10x10⁶个CD8⁺细胞的一剂量施用。

根据本发明的数个实施例，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群用于减少移植排斥及/或诱导供体特异性耐受。

根据本发明的数个实施例，使用所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群作为一辅助治疗，以减少移植排斥及/或诱导供体特异性耐受。

根据本发明的数个实施例，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群通过一方法产生，所述方法包括以下步骤：

(a)将数个外周血单核细胞(PBMCs)与在缺乏数个细胞因子的一培养物中的一或数个第三方抗原接触，以允许数个抗原反应性细胞的富集；及

(b)在所述数个细胞因子存在下培养由步骤(a)产生的所述数个细胞，以允许包括所述中枢记忆T淋巴细胞表型(Tcm)的数个细胞的增殖，从而产生所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞。

根据本发明的数个实施例，所述方法进一步包括在与所述一或数个第三方抗原接触之前从所述数个外周血单核细胞中消耗数个CD4⁺及/或CD56⁺表达细胞。

根据本发明的数个实施例，所述方法进一步包括选择数个CD45RA⁺表达细胞，以获得表达一CD45RA⁺CD8⁺表型的数个初始T细胞的一族群。

根据本发明的数个实施例，所述方法进一步包括消耗数个CD45RA⁺表达细胞，以获得富含数个记忆T细胞的一族群，所述数个记忆T细胞表达一CD45RA^-CD8⁺表型。

根据本发明的数个实施例，步骤(a)中与所述一或数个抗原的所述接触是在IL-21的存在下起作用。

根据本发明的数个实施例，在所述数个细胞因子存在下培养由步骤(a)产生的所述数个细胞的步骤包括在IL-15的存在下培养所述数个细胞。

根据本发明的数个实施例，在所述数个细胞因子存在下培养由步骤(a)产生的所述数个细胞的步骤包括在IL-21、IL-15及/或IL-7的存在下培养所述数个细胞。

根据本发明的数个实施例，所述一或数个抗原选自由一病毒抗原、一细菌抗原、一肿瘤抗原、一自身免疫性疾病相关抗原、一蛋白质提取物、一纯化蛋白质及一合成肽组成的群组。

根据本发明的数个实施例，所述一或数个抗原由数个自体抗原呈现细胞、数个非自体抗原呈现细胞、数个人工载体或数个人工抗原呈现细胞所呈现。

根据本发明的数个实施例，所述一或数个抗原由与所述数个外周血单核细胞同源的数个抗原呈现细胞所呈现。

根据本发明的数个实施例，所述一或数个抗原包括数个刺激细胞，所述数个刺激细胞选自从数个外周血淋巴细胞、脾脏或数个淋巴结、细胞因子动员的数个PBL、体外扩增的数个抗原呈现细胞、体外扩增的数个树突状细胞及数个人工抗原呈现细胞中纯化的数个细胞所组成的群组。

根据本发明的数个实施例，所述方法进一步包括选择CD3⁺、CD8⁺、CD62L⁺、CD45RA^-、CD45RO⁺特征。

根据本发明的数个实施例，所述数个未成熟造血细胞包括数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞。

根据本发明的数个实施例，所述数个未成熟造血细胞包括所述受试者的每公斤理想体重的至少5×10⁶个CD34⁺细胞。

根据本发明的数个实施例，所述数个未成熟造血细胞耗尽了CD3⁺及/或CD19⁺表达细胞。

根据本发明的数个实施例，所述数个未成熟造血细胞包括少于所述受试者的每公斤理想体重的5×10⁵个CD3⁺表达细胞。

根据本发明的数个实施例，所述数个未成熟造血细胞移植与所述受试者是非同源的。

根据本发明的数个实施例，所述未成熟造血细胞移植及所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群从相同的供体中获得。

根据本发明的数个实施例，所述方法还包括在非清髓性调节下调节所述受试者(例如所述移植前)。

根据本发明的数个实施例，所述方法进一步包括一非清髓性调节(移植前调节)。

根据本发明的数个实施例，所述非清髓性调节包括全身照射(TBI)、局部照射(TLI)、化疗剂、抗体免疫疗法或共刺激阻断中的至少一者。

根据本发明的数个实施例，所述全身照射包括1至6Gy的范围内的一照射剂量(例如单次或分次照射剂量)。

根据本发明的数个实施例，所述全身照射将在所述移植的第-3天至第0天中的任何一天施用。

根据本发明的数个实施例，所述全身照射将在所述移植的第-3天至第-1天中的任何一天施用。

根据本发明的数个实施例，所述全身照射将在所述移植之前的一天或两天施用。

根据本发明的数个实施例，所述化疗剂包括依维莫司(Everolimus)、氟达拉滨(Fludarabine)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、白消安(Busulfan)、三磺安(Trisulphan)、美法仑(Melphalan)或噻替帕(Melphalan)中的至少一者。

根据本发明的数个实施例，所述方法还包括向所述受试者施用一治疗有效量的雷帕霉素(Rapamycin)。

根据本发明的数个实施例，所述方法进一步包括一治疗有效量的雷帕霉素。

根据本发明的数个实施例，所述治疗有效量的雷帕霉素包括所述受试者的每公斤理想体重的每天至少0.1mg雷帕霉素。

根据本发明的数个实施例，所述雷帕霉素用于在所述移植的第-1天至第+4天向所述受试者施用。

根据本发明的数个实施例，所述非清髓性调节包括T细胞减灭。

根据本发明的数个实施例，所述T细胞减灭由数个抗胸腺细胞球蛋白(anti-thymocyte globulin，ATG)抗体、数个抗CD52抗体或数个抗CD3(OKT3)抗体中的至少一者实现。

根据本发明的数个实施例，所述非清髓性调节包括一治疗有效量的氟达拉滨。

根据本发明的数个实施例，所述方法还包括向所述受试者施用一治疗有效量的环磷酰胺。

根据本发明的数个实施例，所述方法进一步包括一治疗有效量的环磷酰胺。

根据本发明的数个实施例，所述治疗有效量的环磷酰胺包括所述受试者的每公斤理想体重的25-200mg。

根据本发明的数个实施例，所述环磷酰胺用于在所述移植的第+3天及第+4天向所述受试者施用。

根据本发明的数个实施例，所述方法包括以下步骤：

(a)在非清髓性调节下调节所述受试者，其中所述非清髓性调节包括一全身照射(TBI)及一免疫抑制剂，其中所述全身照射及所述免疫抑制剂在移植的第-4天至第+4天施用；

(b)向所述受试者移植一剂的数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞，其中所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞包括所述受试者的每公斤理想体重的至少5×10⁶个CD34+细胞；及

(c)向所述受试者施用一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型(Tcm)的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结。

根据本发明的数个实施例，所述免疫抑制剂包括雷帕霉素。

根据本发明的数个实施方案，所述雷帕霉素在移植的第-1天至第+4天施用。

根据本发明的数个实施方案，在移植的第-3天至第0天施用TBI。

根据本发明的数个实施方案，在移植前的第-1天施用TBI。

根据本发明的数个实施例，所述步骤(b)及步骤(c)同时进行。

根据本发明的数个实施例，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群在所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞移植后的第1至20天施用。

根据本发明的数个实施例，所述方法包括：

(a)在非清髓性调节下调节所述受试者，其中所述非清髓性调节包括一全身照射(TBI)及一化疗剂，其中所述全身照射及所述化疗剂在移植的第-6天到第0天施用；

(b)向所述受试者移植一剂的数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞，其中所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞包括所述受试者的每公斤理想体重的至少5×10⁶个CD34+细胞；

(c)向所述受试者施用一治疗有效量的环磷酰胺，其中所述治疗有效量的所述环磷酰胺包括所述受试者的每公斤理想体重的25-200mg环磷酰胺，并且其中在所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞移植后的第+3天及第+4天，将所述治疗有效量的环磷酰胺以两剂施用于所述受试者；及

(d)向所述受试者施用一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，数个非GVHD诱导抗第三方细胞的所述分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结，其中数个非GVHD诱导抗第三方细胞的所述分离族群在所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞移植后第+5天至第+10天施用。

根据本发明的数个实施例，所述化疗剂包括氟达拉滨。

根据本发明的数个实施例，所述氟达拉滨在所述移植前的第-6天至第-3天施用。

根据本发明的数个实施例，所述全身照射在所述移植前的第-1天施用。

根据本发明的数个实施例，所述方法进一步包括在步骤(a)之前进行T细胞减灭。

根据本发明的数个实施例，所述T细胞减灭通过在所述移植前的第-9天至第-7天施用的抗胸腺细胞球蛋白(ATG)实现。

根据本发明的数个实施例，在T细胞耗尽的未成熟造血细胞的所述移植后的第+7天后施用所述数个非GVHD诱导细胞的分离族群。

根据本发明的数个实施例，所述T细胞介导的自身免疫性疾病选自由1型糖尿病(T1DM)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、多发性硬化症(multiplesclerosis，MS)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis)、克罗恩病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)、非感染性葡萄膜炎(non-infectious uveitis)、红斑狼疮(Lupus erythematosus，SLE)、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、原发性胆道肝硬化(primary biliary cirrhosis)、自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)、免疫性血小板紫癜(Immune Thrombocytic Purpura，ITP)、慢性肾小球肾炎(Chronic Glomerulonephritis)、重症肌无力(Myastheniagravis)、系统性硬皮病(Systemic Scleroderma)、多发性肌炎(Polymyositis)及艾迪生病(Addison's disease)所组成的群组。

根据本发明的数个实施例，当所述T细胞介导的自身免疫性疾病是1型糖尿病(T1DM)时，所述移植进一步包括一胰腺细胞或组织移植。

根据本发明的数个实施例，所述胰腺细胞或组织移植来自与所述未成熟造血细胞及/或所述数个非GVHD诱导抗第三抗体的分离族群相同的供体。

根据本发明的数个实施例，当所述T细胞介导的自身免疫病是一原发性胆汁性肝硬化或一自身免疫性肝炎时，所述移植进一步包括一肝细胞或组织移植。

根据本发明的数个实施例，所述肝细胞或组织移植来自与所述未成熟造血细胞及/或所述数个非GVHD诱导抗第三抗体的分离族群相同的供体。

根据本发明的数个实施例，所述受试者是一人类受试者。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术及/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实施例的实践或测试中可以使用与本文所述的那些相似或等效的方法及材料，但是示例性方法及/或材料在下文描述。如果发生冲突，以专利说明书(包括定义)为准。此外，所述材料、方法及示例仅是说明性的，并非旨在必然地进行限制。

附图说明

本发明的一些实施例在此仅通过示例的方式参考附图进行描述。现在具体参考附图，强调所示的细节是示例性的并且是为了对本发明的实施例进行说明性讨论。在这点上，结合附图的描述使本领域技术人员清楚所述可以如何实施本发明的实施例。

在所述数个图式中：

图1是去除T细胞的骨髓移植的一降低强度调节(RIC)方案的示意图。

图2A至图2B说明了NOD小鼠中MHC不同的非清髓性骨髓移植(BMT)后的无糖尿病存活率和移植相关死亡率。在第0天将大剂量NuBM(H-2b)细胞移植到具有5x 10⁶个Tcm的NOD(H-2d)接受者小鼠中。在第-1天至第+4天，宿主接受4.5Gy TBI及雷帕霉素(12.5mg/kg)。对照组未接受任何治疗、或进行调节但未进行移植。(图2A)显示无糖尿病生存的KaplanMeyer曲线。(图2B)显示非糖尿病相关死亡率的Kaplan Meyer曲线。

图3A至图3J说明了在NOD小鼠中降低强度的骨髓移植能够实现移植并防止糖尿病的发展。将大剂量C57BL/6裸(H-2^b)BM细胞移植到NOD小鼠(H-2^d)受体小鼠后6个月的供体型嵌合体在第0天使用5x 10⁶个Tcm。宿主用4.5Gy TBI进行调节，并在第-1至+4天注射雷帕霉素(12.5μg/小鼠)。对照组没有接受调节或BM。(图3A)使用抗供体及抗宿主(H-2^d及H-2^b)抗体通过FACS散点图分析外周血中供体细胞的百分比；每个点代表一鼠，所述鼠属于适当组；(图3B至图3F)CD4T细胞(CD45⁺CD3⁺CD4⁺)、CD8T细胞(CD45⁺CD3⁺CD8⁺)及B细胞(CD45⁺CD3^-CD19⁺)的流式细胞术分析来自治疗组(4.5Gy+Rapa+BM+Tcm)及未治疗小鼠的血液；(图3G至图3J)树突细胞(DCs)(CD45⁺CD11b⁺MHC-II⁺)及巨噬细胞(CD45⁺CD11b⁺F4/80⁺)来自治疗组(4.5Gy+Rapa+BM+Tcm)及未治疗小鼠的脾脏。(N≥3)。

图4A至图4B说明了NOD小鼠中错配MHC非清髓性BMT后的无糖尿病存活率及移植相关死亡率。在第0天与5x 10⁶个Tcm将大剂量C57BL/6裸(H-2^b)细胞移植到NOD(H-2^d)接受者小鼠中。宿主用4.5Gy TBI进行调节，并在第-1至+4天用雷帕霉素(12.5μg/小鼠)处理。对照组未接受任何治疗或进行了调节但未进行移植。(图4A)显示无糖尿病生存的Kaplan Meyer曲线；(图4B)显示非糖尿病相关死亡率的Kaplan Meyer曲线。

图5为一表格，说明了在NOD小鼠中错配MHC非清髓性BMT后的无糖尿病存活率、移植相关死亡率及疾病死亡率。提供了来自4个独立实验的详细数据。

图6A至图6D为数个照片，说明了供体型CD8⁺否决细胞在移植后一年在所述宿主的淋巴器官中存活。在第0天与5x 10⁶个Tcm-GPF将大剂量C57BL/6裸(H-2^b)BM细胞移植到NOD接受者小鼠(H-2^d)。宿主用4.5Gy TBI调节并在第-1至+4天注射雷帕霉素(12.5μg/小鼠)。评估了3只不同小鼠的淋巴器官。通过双光子激光扫描显微镜(Zeis)进行成像采集。(图6A)腘窝淋巴结(popliteal lymph node)；(图6B)放大腘窝淋巴结；(图6C)肠系膜淋巴结；及(图6D)脾脏。

图7A至图7B说明了T细胞库分析。(图7A)维恩图显示不同小鼠组共享的所述b链序列中CDR3氨基酸的数量。值得注意的是，处理过的小鼠在β-链序列中共享较少的氨基酸；(图7B)T细胞类型的Vβ使用-PC分析。PC1在CD4、CD8及CD25细胞之间分离。PC2在来自处理及未处理小鼠的克隆之间进行划分。

图8为一表格，说明了在移植后NOD小鼠中未发现自身免疫TCR。在糖尿病发展前后的NOD小鼠中证实了与自身免疫相关的CDR3β氨基链，但在移植后的NOD小鼠中并未发现。

具体实施方式

本发明在其一些实施例中涉及包含诱导耐受的数个抗第三方细胞的用途，诱导耐受的所述数个抗第三方细胞包括中枢记忆T淋巴细胞表型，作为用于治疗数个T细胞介导的自身免疫疾病的造血干细胞移植的一辅助治疗。

本发明的数个原理及操作可以通过参考所述数个附图及所附说明书来得到更好的理解。

在详细说明本发明的至少一实施例之前，应理解本发明的应用并不一定限于在以下描述中通过所述数个范例阐述或举例说明的细节。本发明能够具有其他实施例或以各种方式实践或执行。此外，应理解在此使用的词语及术语是为了所述描述的目的而不应被视为限制性的。

自身反应性T淋巴细胞是自身免疫性疾病的关键参与者，包括自身免疫性1型糖尿病(autoimmune type 1diabetes mellitus，T1DM)、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)、多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)、系统性红斑狼疮(systemiclupus erythematosus，SLE)及乳糜泻(celiac disease)。在这些疾病中，对关键自身抗原的免疫耐受失败是由所述患者自身的T细胞攻击各种器官引起的。异基因造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplant，HSCT)可以潜在地“重置”自身免疫中的免疫系统，并可能提供一持久的非自身免疫TCR库，如果此类方案可能是可以安全地实现具有移植排斥及GVHD的最小毒性、降低风险的供体型嵌合体的一种有前途的治疗方法。

在将本发明付诸实践的同时，本发明人发现通过第三方刺激产生的供体来源的数个否决细胞可以安全有效地用于在T细胞介导的自身免疫性疾病(包括T1DM)的治疗中预防HSCT的移植排斥及GVHD。

如下文及随后的所述数个范例部分所示，本发明人通过劳动性实验发现了一种用于治疗自身免疫性1型糖尿病的低毒性方案，包括移植T细胞耗尽的MHC不同的骨髓细胞及抗第三方否决Tcm细胞(参见图1)。根据所述治疗方案，首先对受试者进行一强度降低的调节治疗，包括在第-1天进行全身照射(TBI)及在第-1至+4天使用短期雷帕霉素，随后使用T细胞耗尽的骨髓移植(第0天)以及抗第三方否决Tcm细胞(第0天)。所述方案能够在所述移植小鼠中不具有移植排斥及GVHD的情况下实现长期无糖尿病生存(参见图2A至图2B、图3A及图4A至图4B)。尽管使用了最低限度的调节，但对移植小鼠的嵌合分析显示出多谱系嵌合，在免疫系统的各种细胞类型中，包括骨髓细胞、树突细胞及淋巴样细胞，这意味着扩展变化在所述宿主的免疫系统中(参见图3B至图3J)。值得注意的是，使用GFP同种异体Tcm对经治疗的NOD小鼠的淋巴器官进行的分析显示，Tcm在脾脏及各种淋巴结中存活长达一年后移植(参见图6A至图6D)，说明获得了持久的免疫耐受性。此外，TCR测序分析表示出，在所述治疗的小鼠中并未发现与糖尿病自身免疫相关的序列(典型的自身免疫T细胞克隆)(参见图7A至图7B)，这表明存在基于缺失的机制预防移植小鼠的疾病发作。测序分析还揭示了治疗小鼠与未治疗小鼠的不同CD8及CD4vβ使用情况(参见图8)。这些结果表示出，尽管在相同的胸腺中“培养”了BM多能细胞，但在骨髓移植时产生了不同的T细胞并防止了自身免疫。

综上所述，所述抗第三方否决Tcm细胞通过在在不具有GVHD的情况下进行短程降低强度调节后移植MHC不同的HSCT来治疗T细胞介导的自身免疫性疾病，包括T1DM及移植排斥。

因此，根据本发明的一方面，提供了治疗或预防有需要的一受试者的一T细胞介导的自身免疫疾病的方法，所述方法包括：(a)将数个未成熟造血细胞移植到所述受试者体内；(b)向所述受试者施用一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结。

根据本发明的另一方面，提供一种未成熟造血细胞移植及一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，其特征在于，包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结，用于治疗或预防有需要的一受试者的T细胞介导的自身免疫疾病。

如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转所述状况的进展，基本上改善一状况的临床或美学症状或基本上预防所述一种病症的临床或外观(aesthetical)症状的出现。

如本文所用，所述术语“预防”是指防止疾病、病症或病症在一可能处于所述疾病或病症风险但尚未被诊断为患有所述疾病或障碍，例如一T细胞介导的自身免疫疾病。

如本文所用，所述术语“受试者”或“有需要的受试者”是指一哺乳动物，优选为患有一T细胞介导的自身免疫疾病或处于发展一T细胞介导的自身免疫疾病的高风险(例如具有一T细胞介导的自身免疫疾病的遗传易感性)状况下的任何年龄的一人类(男性或女性)。通常所述受试者需要一未成熟造血细胞移植(在本文中也称为接受者(recipient))以治疗或预防所述T细胞介导的自身免疫疾病。

如本文所用，所述术语“T细胞介导的自身免疫疾病”是指其中涉及T淋巴细胞的免疫反应响应一物质(例如一蛋白质或一组织，通常存在于所述体内)而产生的疾病或病症，并且这种反应是不期望的(例如对于一或数个自身抗原)。

自身免疫性疾病还可以包括由外来抗原引起的疾病，例如乳糜泻(celiacdisease)。

自身免疫性疾病的非限制性实例包括但不限于急性播散性脑脊髓炎(Acutedisseminated encephalomyelitis，ADEM)、艾迪生病(Addison's disease)、无丙种球蛋白血症(Agammaglobulinemia)、斑秃(Alopecia areata)、肌萎缩性侧索硬化(Amyotrophiclateral sclerosis)、强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis)、抗磷脂综合征(Antiphospholipid syndrome)、抗合成酶综合征(Antisynthetase syndrome)、特应性过敏(Atopic allergy)、特应性皮炎(Atopic dermatitis)、自身免疫再生障碍性贫血(Autoimmune aplastic anemia)、自身免疫性心肌病(Autoimmune cardiomyopathy)、自身免疫性肠病(Autoimmune enteropathy)、自身免疫性溶血性贫血(Autoimmune hemolyticanemia)、自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis)、自身免疫性内耳病(Autoimmuneinner ear disease)、自身免疫性淋巴增生综合征(Autoimmune lymphoproliferativesyndrome)、自身免疫性周围神经病(Autoimmune peripheral neuropathy)、自身免疫性胰腺炎(Autoimmune pancreatitis)、自身免疫性多内分泌综合征(Autoimmunepolyendocrine syndrome)、自身免疫性孕酮皮炎(Autoimmune progesteronedermatitis)、自身免疫性血小板减少性紫癜(Autoimmune thrombocytopenic purpura)、自身免疫性葡萄膜炎(Autoimmune uveitis)(例如非传染性葡萄膜炎(non-infectiousuveitis))、白塞病(Behcet's disease)、乳糜泻(Celiac disease)、慢性肾小球肾炎(Chronic Glomerulonephritis)、冷凝集素病(Cold agglutinin disease)、克罗恩病(Crohn's disease)、皮肌炎(Dermatomyositis)、皮肌炎(Dermatomyositis)、1型糖尿病(Diabetes mellitus type 1)(1型糖尿病(Type 1diabetes mellitus，T1DM))、嗜酸性筋膜炎(Eosinophilic fasciitis)、Goodpasture综合征、格雷夫斯病(Graves'disease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)、桥本氏脑病(Hashimoto'sencephalopathy)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、特发性血小板减少性紫癜(Idiopathic thrombocytopenic purpura)、免疫性血小板减少性紫癜(ImmuneThrombocytic Purpura，ITP)、红斑狼疮(Lupus erythematosus，SLE)、Miller-Fisher综合征、混合性结缔组织病、多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)、重症肌无力(Myastheniagravis)、嗜睡症(Narcolepsy)、寻常型天疱疮(Pemphigus vulgaris)、恶性贫血(Pernicious anaemia)、多发性肌炎(Polymyositis)、原发性胆汁性肝硬化(Primarybiliary cirrhosis)、银屑病(Psoriasis)、银屑病关节炎(Psoriatic arthritis)、复发性多软骨炎(Relapsing polychondritis)、类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)、风湿热(Rheumatic fever)、系统性硬皮病(Systemic Scleroderma)、干燥综合征(Sjogren'ssyndrome)、颞动脉炎(Temporal arteritis)、横贯性脊髓炎(Transverse myelitis)、溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)、未分化结缔组织病(Undifferentiated connectivetissue disease)、血管炎(Vasculitis)及韦格纳肉芽肿(Wegener's granulomatosis)。

根据一具体实施例，所述T细胞介导的自身免疫性疾病是自身免疫性1型糖尿病(T1DM)。

1型糖尿病(T1DM)是器官特异性自身免疫性破坏朗格汉斯胰岛(pancreaticislets of Langerhans)中分泌胰岛素的β细胞的结果，最终导致身体不产生胰岛素。如果没有足够的胰岛素，葡萄糖会在血液中积聚，而不是被细胞吸收，所述身体就无法利用这种葡萄糖来获取能量。

1型糖尿病可发生在任何年龄，但通常在儿童、青少年或年轻人中被诊断出来。β细胞破坏早在疾病症状出现之前就开始了。据估计，所述总β细胞量中只有10％保持在所述临床发病时。因此，当诊断出所述疾病时，可能已经发生严重的β细胞耗竭及胰岛素依赖。

T1DM的症状包括但不限于高度口渴及饥饿、尿频、疲劳、视力模糊、脚部麻木或刺痛所述、体重意外减轻、呼吸急促、皮肤及嘴巴干燥、脸红面部、水果气味、恶心或呕吐、无法保持液体及胃痛。

T细胞介导的自身免疫疾病的治疗受未成熟造血细胞移植到受试者体内的影响。

如本文所用，所述短语“移植”是指将一体细胞(例如一单一细胞或一组细胞)施用给一受试者。

如本文所用所述短语“未成熟造血细胞”是指包含前体造血细胞(例如造血干细胞)的造血组织或细胞制剂。此类组织/细胞制剂包括或源自一生物样品，例如骨髓、动员的外周血(例如动员的CD34⁺表达细胞以提高它们的浓度)、脐带血(例如脐带)、胎肝、卵黄囊及/或胎盘。另外，纯化的CD34⁺细胞或其他造血干细胞如CD131⁺细胞可以根据本教导使用，不论在具有或不具有离体(ex-vivo)扩展。

根据一实施例，所述未成熟造血细胞包括T细胞耗尽的未成熟造血细胞。

如本文所用所述短语“T细胞耗尽的未成熟造血细胞(T cell depleted immaturehematopoietic cells)”是指一T淋巴细胞耗尽的数个前体造血细胞的一族群。所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞可能包括例如CD34⁺、CD33⁺及/或CD56⁺细胞。所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞可能耗尽CD3⁺细胞、CD2⁺细胞、CD8⁺细胞、CD4⁺细胞、α/βT细胞及/或γ/δT细胞。

根据一实施例，所述未成熟造血细胞包括T细胞耗尽的动员血细胞，其富含CD34⁺未成熟造血细胞。

根据一实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的个0.1x10⁶至20x10⁶个CD34⁺细胞(例如1x10⁶-10x10⁶个CD34⁺细胞)。

根据一实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者每公斤理想体重的至少约0.1×10⁶个CD34⁺细胞、0.5×10⁶个CD34⁺细胞、1x10⁶个CD34⁺细胞、2x10⁶个CD34⁺细胞、3x10⁶个CD34⁺细胞、4x10⁶个CD34⁺细胞、5x10⁶个CD34⁺细胞、6x10⁶个CD34⁺细胞、7x10⁶个CD34⁺细胞、8x10⁶个CD34⁺细胞、9x10⁶个CD34⁺细胞、10x10⁶个CD34⁺细胞、15x10⁶个CD34⁺细胞或20x10⁶个CD34⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者每公斤理想体重的至少约5x10⁶个CD34⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者每公斤理想体重的至少约6x10⁶个CD34⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者每公斤理想体重的至少约8x10⁶个CD34⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者每公斤理想体重的至少约10x10⁶个CD34⁺细胞。

根据一实施例，所述未成熟造血细胞耗尽了CD3⁺及/或CD19⁺细胞。

根据一实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于1x10⁴个-1x10⁶个(例如1x10⁵个-50x10⁵个)CD3⁺细胞。

根据一实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于约50x10⁵个CD3⁺细胞、40x10⁵个CD3⁺细胞、30x10⁵个CD3⁺细胞、20x10⁵个CD3⁺细胞、15x10⁵个CD3⁺细胞、10x10⁵个CD3⁺细胞、9x10⁵个CD3⁺细胞、8x10⁵个CD3⁺细胞、7x10⁵个CD3⁺细胞、6x10⁵个CD3⁺细胞、5x10⁵个CD3⁺细胞、4x10⁵个CD3⁺细胞、3x10⁵个CD3⁺细胞、2x10⁵个CD3⁺细胞、1x10⁵个CD3⁺细胞、0.5x10⁵个CD3⁺细胞或0.1x10⁵个CD3⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于5x10⁵个CD3⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于3×10⁵个CD3⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于2x10⁵个CD3⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于1x10⁵个CD3⁺细胞。

根据一实施例，所述未成熟造血细胞耗尽了CD8⁺细胞。

根据一实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于1x10⁴-1x10⁶个CD8⁺细胞(例如1x10⁴个-4x10⁵个CD8⁺细胞)。

根据一实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于约50x10⁵个CD8⁺细胞、25x10⁵个CD8⁺细胞、15x10⁵个CD8⁺细胞、10x10⁵个CD8⁺细胞、9x10⁵个CD8⁺细胞、8x10⁵个CD8⁺细胞、7x10⁵个CD8⁺细胞、6x10⁵个CD8⁺细胞、5x10⁵个CD8⁺细胞、4x10⁵个CD8⁺细胞、、3x10⁵个CD8⁺细胞、2x10⁵个CD8⁺细胞、1x10⁵个CD8⁺细胞、9x10⁴个CD8⁺细胞、8x10⁴个CD8⁺细胞、7x10⁴个CD8⁺细胞、6x10⁴个CD8⁺细胞、5x10⁴个CD8⁺细胞、4x10⁴个CD8⁺细胞、3x10⁴个CD8⁺细胞、2x10⁴个CD8⁺细胞或1x10⁴个CD8⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于4x10⁵个CD8⁺细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于1x10³个-1x10⁶个CD8⁺TCRα/β^-细胞(例如1x10⁴个-1x10⁵个CD8⁺TCRα/β^-细胞。

根据一实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于约1x10⁶个CD8⁺TCRα/β^-细胞、0.5x10⁶个CD8⁺TCRα/β-细胞、1x10⁵个CD8⁺TCRα/β-细胞、0.5x10⁵个CD8⁺TCRα/β^-细胞、1x10⁴个CD8⁺TCRα/β^-细胞、0.5x10⁴个CD8⁺TCRα/β^-细胞、1x10³个CD8⁺TCRα/β^-细胞或0.5x10³个CD8⁺TCRα/β^-细胞。

根据一具体实施例，所述T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于1x10⁶个CD8⁺TCRα/β^-细胞。

根据一实施例，所述未成熟造血细胞耗尽了B细胞。

根据一实施例，所述未成熟造血细胞耗尽了B细胞(CD19⁺及/或CD20⁺细胞)。

根据一实施例，所述未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于1x10⁴个-1x10⁶个CD19⁺及/或CD20⁺细胞(例如1x10⁵个-50x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞)。

根据一实施例，所述未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于约50×10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、40x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、30x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、20x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、10x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、9x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、8x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、7x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、6x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、5x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、4x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、3x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞、2x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞或1x10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞。

根据一具体实施例，所述未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的小于3×10⁵个CD19⁺及/或CD20⁺细胞。

T细胞(例如CD3⁺、CD2⁺、TCRα/β⁺、CD4⁺及/或CD8⁺细胞)或B细胞(例如CD19⁺及/或CD20⁺细胞)的耗尽，可以使用本领域已知的任何方法进行，例如通过用特异性抗体的根除(例如杀死)或通过基于亲及力的纯化，例如例如通过使用磁性细胞分离技术、FACS分选器及/或捕获ELISA标记。

此类方法在本文及所述THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY第1至4卷(编辑者D.N.Weir)及FLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING(编辑者A.Radbruch，SpringerVerlag，1992年)中有所描述。例如，细胞可以通过例如流式细胞术或FACS分选。因此，可以使用荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)并且可以具有不同程度的颜色通道、低角度及钝角光散射检测通道以及阻抗通道。本领域已知的任何配体依赖性分离技术可以与依赖所述细胞的物理性质而不是抗体亲及力的阳性及阴性分离技术结合使用，包括但不限于淘析及密度梯度离心。

用于细胞分选的其他方法包括，例如使用亲及力技术的淘选及分离，包括使用例如数个板、数个珠及数个柱的数个固体支持物的那些技术。因此，生物样品可以通过用连接到一固体基质(例如连接到一板)的一抗体“淘选”来分离。

或者，可以通过数个磁分离技术来分选/分离细胞，其中一些方法利用数个磁珠。可从数个来源获得不同的磁珠，包括例如Dynal(挪威)、Advanced Magnetics(美国马萨诸塞州剑桥)、Immuncon(Philadelphia，U.S.A.)，Immunotec(法国马赛)、Invitrogen、Stemcell Technologies(美国)及Cellpro(美国)。或者，抗体可以被生物素化或与地高辛(digoxigenin)结合，并与抗生物素蛋白或抗地高辛包被的亲及柱结合使用。

根据一实施例，细胞可以在

柱(可从Miltenyi Biotec获得)上进行处理。

根据一实施例，可以组合不同的耗尽/分离方法，例如，可以将磁性细胞分选与FACS结合，以提高所述分离质量或允许通过数个参数进行分选。

根据一具体实施例，T细胞耗尽的未成熟造血细胞通过一种方法获得，所述方法包括从一供体受试者(例如为产生非GVHD诱导抗第三方细胞而收集非动员PBMC的同一供体受试者，如下所述)。

根据一实施例，动员受G-CSF影响。

根据一实施例，动员受G-CSF及普乐沙福(plerixafor)影响。

根据一具体实施例，动员的PBMC的所述收集在一单一集合中获得。

根据一具体实施例，动员的PBMC的所述收集是在每天两次、三次、四次、五次或更多次收集中获得的，例如每天三次收集(例如，在随后的几天或相隔几天内)。

根据一实施例，CD34⁺表达细胞的富集通过将所述PBMC与一CD34结合剂一起温育来实现。

根据一具体实施例，所述CD34结合剂是抗体，例如一单克隆抗体。

根据一具体实施例，所述CD34单克隆抗体与数个磁性颗粒结合，例如数个超顺磁性颗粒。

根据一具体实施例，所述CD34⁺标记的细胞通过磁分离技术(如上文详细讨论的)来选择。

根据一具体实施例，所述CD34磁性标记细胞(即CD34⁺表达细胞)被所述分离柱(即阳性选择)保留，以及所述CD34^-细胞被去除。然后将所述CD34⁺细胞从所述柱中释放并收集。

根据一实施例，T细胞的耗尽通过将所述PBMC与一CD3、CD2、TCRα/β、CD4及/或CD8结合剂一起温育来实现。

根据一实施例，B细胞的耗尽通过将所述PBMC与一CD19及/或CD20结合剂一起温育来实现。

根据一具体实施例，所述CD3、CD2、TCRα/β、CD4、CD8、CD19及/或CD20结合剂是一抗体，例如单克隆抗体。

根据一具体实施例，所述CD3、CD2、TCRα/β、CD4、CD8、CD19及/或CD20单克隆抗体与数个磁性颗粒结合，例如数个超顺磁性颗粒。

根据一实施例，CD3、CD2、TCRα/β、CD4、CD8、CD19及/或CD20标记细胞通过数个磁分离技术来选择(如上文详细讨论的)。

根据一具体实施例，所述CD3、CD2、TCRα/β、CD4、CD8、CD19及/或CD20磁性标记细胞(即CD3、CD2、TCRα/β、CD4、CD8、CD19及/或CD20表达细胞)被所述分离柱(即阴性选择)及所述CD3-、CD2-、TCRα/β-、CD4-、CD8-、CD19-及/或CD20-细胞被收集。

根据一实施例，T细胞耗尽的未成熟造血细胞及用于产生诱导非GVHD的抗第三方细胞(即用于产生如下所述的否决细胞)的所述PBMC是从相同的供体受试者获得。

根据应用，所述方法可能会受到使用数个供体细胞的影响(例如，T细胞耗尽的未成熟造血细胞、用于生成非GVHD诱导抗第三方细胞的PBMC、及/或数个非造血细胞，如下所述)，所述数个供体细胞与所述接受者(recipient)受试者为同源的或非同源的(例如同种异体的)。

如本文所用，术语“同源(syngeneic)”细胞是指与所述受试者或所述受试者的基本上所有淋巴细胞在遗传上基本相同的数个细胞。同源细胞数个范例包括来自所述受试者的细胞(在本领域中也称为“自体(autologous)”)、来自所述受试者的一克隆或来自所述受试者的一同卵双胞胎。

如本文所用，术语“非同源(non-syngeneic)”细胞是指与所述受试者或所述受试者的基本上所有淋巴细胞在遗传上不基本相同的数个细胞，例如同种异体细胞(allogeneic cells)或异种细胞(xenogeneic cells)。

如本文所用，所述术语“同种异体(allogeneic)”是指源自一供体受试者的数个细胞，所述供体受试者与所述接受者(recipient)受试者为相同物种，但与所述接受者受试者基本上是非克隆的。通常，相同物种的远交、非合子双胞胎哺乳动物彼此是同种异体的。应当理解，对于所述接受者受试者，一同种异体细胞可以是HLA相同的、部分HLA相同的或HLA不同的(即显示一或数个不同的HLA决定簇)。

根据一实施例，所述供体是一人类。

如本文所用，所述术语“异种(xenogeneic)”是指相对于所述受试者的一大部分所述数个淋巴细胞而基本上表达一不同物种的数个抗原的数个细胞。通常，不同物种的远交哺乳动物彼此是异种的。

本发明设想异种细胞来源于多种物种。因此，根据一实施例，细胞可以来源于任何哺乳动物。细胞的合适物种来源包括主要的驯养或家畜动物及灵长类动物。这样的动物包括但不限于猪类(porcines)(例如猪)、牛类(bovines)(例如牛)、马类(equines)(例如马)、羊类(ovines)(例如山羊、绵羊)、猫类(felines)(例如Felis domestica)、犬科动物(例如Canis domestica)、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、沙鼠、仓鼠)及灵长类动物(例如，黑猩猩、恒河猴、猕猴、狨猴)。异种来源(例如猪来源)的细胞优选从已知不含人畜共患病的来源(例如猪内源性逆转录病毒)获得。类似地，人源细胞或组织优选地从基本上无病原体的来源获得。

因此，细胞的来源将根据其预期用途来确定，并且完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。

本发明的一些实施例的未成熟造血细胞(例如，T细胞耗尽的未成熟造血细胞)可以使用本领域已知的任何细胞移植方法移植到所述受试者中，例如但不限于细胞输注(例如I.V.)或通过一腹膜内途径，如下文详细讨论的。

本发明的一些实施例的未成熟造血细胞可以在一单次输注中(例如在第0天)、或在2次、3次、4次或更多次输注中(例如在随后的几天或相隔几天内，例如在第-1天及第0天；或在第0天及第1天)施用。因此，本发明的一些实施例的所述未成熟造血细胞可以在每天2次、3次、4次或更多次的收集中获得，例如每天2次、3次、4次或更多次收集，例如每天2次收集(例如，在随后的几天或相隔几天内)。

根据一实施例，在计划移植日期之前的任何时间收集所述未成熟造血细胞(例如，已耗尽的T细胞)。这样的细胞可以储存以备将来使用(例如冷冻保存)。

在根据本教导将所述数个未成熟造血细胞移植到所述受试者中之后，根据标准医学实务，建议根据各种标准技术中的任一种监测细胞的生长功能及免疫相容性。例如，可以通过标准血液及骨髓测试(例如通过FACS分析)在一受试者中监测数个未成熟造血细胞的细胞数量。

如后面的所述数个范例部分所示，抗第三方中枢记忆T细胞具有特定的否决活性(veto activity)，可在数个造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells)的非同源(例如异基因)移植具有保证的情况下用作移植促进细胞。

根据一实施例，本发明的的一些实施例的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞可用作数个未成熟造血细胞移植的辅助疗法(如上文所述)。

根据一实施例，所述数个非GVHD诱导的抗第三方细胞可用于避免移植排斥、移植物抗宿主病及/或诱导供体特异性耐受性(即所述未成熟造血细胞的供体特异性耐受性)。

因此，根据一实施例，向所述受试者施用一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴(Tcm)表型的数个细胞，所述数个细胞是耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结。

术语“分离的”是指从其自然环境(例如，所述人体)中分离出来的细胞。

根据一实施例，数个细胞的一族群是指一异质细胞混合物。

如本文所用，术语“非移植物抗宿主病”或“非GVHD”是指具有显着降低或不具有诱导移植物抗宿主(GVH)的反应性。因此，本发明的一些实施例的细胞被生成为不会显着引起移植物抗宿主病(GVHD)，如移植后30天至120天的所述移植受试者的存活率、体重及整体外观所证明。评估一受试者GVHD降低的方法是本领域技术人员众所周知的。

根据一实施例，本发明的一些实施例的所述数个细胞相对于并非根据本教导产生的细胞而具有对于一宿主的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或甚至100％降低反应性。

所述如本文所用的短语“中枢记忆T淋巴细胞(central memory T-lymphocyte，Tcm)表型”是指归巢于所述数个淋巴结的数个细胞毒性T细胞的一子集，在人类中，通常包括一CD3⁺/CD8⁺/CD62L⁺/CD45RO⁺/CD45RA^-特征(signature)。应当理解，Tcm细胞可以在一单一细胞上表达所有所述特征标记，或者可以在一单一细胞上仅表达所述特征标记的一部分。一细胞表型的确定可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行，例如通过荧光激活细胞分选(FACS)或捕获ELISA标记。

根据一实施例，至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或甚至100％的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群具有所述Tcm细胞特征。

根据一具体实施例，约10-20％、约10-30％、约10-40％、约10-50％、约20-30％、约20-40％、约30-50％、约40-60％、约50-70％、约60-80％、约70-90％、约80-100％或约90-100％的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群具有所述Tcm细胞特征。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的10-30％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的10-50％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的20-40％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的30-50％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的50-70％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的20％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的30％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的40％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的50％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的60％。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的细胞占所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的70％。

包括一本发明的一Tcm表型的所述数个非GVHD诱导细胞在本文中也称为“Tcm细胞”。

如前所述，移植后数个Tcm细胞通常归巢于所述数个淋巴结。根据一些实施例，本发明的一些实施例的数个细胞的所述分离族群可以归巢于移植后的任何淋巴结，例如所述数个外周淋巴结及所述数个肠系膜淋巴结。所述这些细胞的所述归巢特性使它们能够以一快速且有效的方式发挥其否决效果。

包括本发明的一些实施例的一Tcm表型的所述数个非GVHD诱导细胞是数个耐受诱导细胞。

如本文所用的短语“耐受诱导细胞”是指相较于不存在施用的耐受诱导细胞的情况下的所述接受者的细胞的所述反应，与所述接受者的细胞接触时引起所述接受者的细胞(例如，接受者的T细胞)的反应性降低。耐受诱导细胞包括如先前在PCT公开号WO 2001/049243及WO 2002/102971中描述的否决细胞(即，在与宿主T细胞接触时导致宿主T细胞凋亡的T细胞)。

术语“否决活性(veto activity)”涉及免疫细胞(例如，供体来源的T细胞)，其在识别并与否决细胞结合后导致抗供体接受者T细胞失活。根据一实施例，失活导致所述抗供体接受者T细胞凋亡。

包括一本发明的一Tcm表型的所述非GVHD诱导细胞在本文中也称为“否决细胞”。

如本文所用的短语“抗第三方细胞”是指(通过T细胞识别)针对一或数个第三方抗原的T淋巴细胞。

如本文所用所述短语“一或数个第三方抗原”是指一可溶性或不可溶性(例如膜相关)抗原或不存在于所述供体或接受者中的抗原，如下文详细描述。

例如，一或数个抗原可以是数个全细胞(例如数个活细胞或数个死细胞)、数个细胞部分(例如数个裂解细胞)、数个细胞抗原(例如数个细胞表面抗原/数个蛋白质)、一蛋白质提取物、一合成肽。

根据一实施例，所述一或数个第三方抗原是一非自身抗原，即所述供体的所述免疫系统不识别为一种自身抗原的一或数个抗原。

根据一实施例，所述一或数个抗原是非哺乳动物的，例如是非人类的(例如为一鸟类、爬行动物、病毒、细菌、真菌等来源的非人类动物或微生物的数个蛋白质或数个肽)。

根据一实施例，所述一或数个抗原包括数个病毒抗原。

示例性病毒抗原包括但不限于一爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、腺病毒(Adv)、巨细胞病毒(CMV)、感冒病毒、流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒及C病毒、单纯疱疹病毒、HIV、流感、日本脑炎、麻疹、脊髓灰质炎、狂犬病、呼吸道合胞体、风疹、天花、水痘带状疱疹、轮状病毒、西尼罗河病毒、多瘤病毒(Polyomavirus)(例如BK病毒)、寨卡病毒(zikavirus)、细小病毒(parvovirus)(例如细小病毒B19)、水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)及单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)。

作为病毒抗原的进一步具体实例，BK病毒抗原包括但不限于BKV LT；BKV(衣壳(capsid)VP1)、BKV(衣壳蛋白VP2)、BKV(衣壳蛋白VP2、等孔(isoporm)VP3)、BKV(小T抗原)；腺病毒抗原包括但不限于Adv-penton或Adv-hexon；CMV抗原包括但不限于包膜糖蛋白B、CMV IE-1及CMV pp65、UL28、UL32、UL36、UL40、UL48、UL55、UL84、UL94、UL99UL103、UL151、UL153、US 29、US 32；EBV抗原包括但不限于EBV LMP2、EBV BZLF1、EBV EBNA1、EBV P18及EBV P23；肝炎抗原包括但不限于乙型肝炎病毒的S、M及L蛋白、乙型肝炎病毒的前S抗原、HBCAG DELTA、HBV HBE、丙型肝炎病毒RNA、HCV NS3及HCV NS4；单纯疱疹病毒抗原包括但不限于即早蛋白(immediate early proteins)及糖蛋白D；HIV抗原包括但不限于gag、pol及env基因的基因产物，例如HIV gp32、HIV gp41、HIV gp120、HIV gp160、HIV P17/24、HIVP24、HIV P55GAG、HIV P66POL、HIV TAT、HIV GP36、Nef蛋白及逆转录酶；流感抗原包括但不限于血凝素及神经氨酸酶；日本脑炎病毒抗原包括但不限于蛋白质E、M-E、M-E-NS1、NS1、NS1-NS2A及80％E；麻疹抗原包括但不限于麻疹病毒融合蛋白(measles virus fusionprotein)；狂犬病抗原包括但不限于狂犬病糖蛋白及狂犬病核蛋白；呼吸道合胞病毒抗原包括但不限于RSV融合蛋白及所述M2蛋白；轮状病毒抗原包括但不限于VP7sc；风疹抗原包括但不限于蛋白质E1及E2；及水痘带状疱疹病毒抗原包括但不限于gpl及gpll。

根据一实施例，所述一或数个抗原包括病毒肽。

根据一实施例，所述数个小瓶肽(vial peptides)包含1-25种、1-20种、1-15种、1-10种、1-9种、1-8种、1-7种、1-6种、1-5种、1-4种、1-3种、1-2种、2-20种、2-10种、2-8种、2-6种、2-4种、3-20种、3-10种、3-9种、3-7种、3-5种、3-4种、4-20种、4-10种、4-8种、或4-6种病毒肽。

根据一具体实施例，所述小瓶肽包含4-10种病毒肽(例如在一单一制剂或几种制剂中)。

根据一具体实施例，所述小瓶肽包含4-8种病毒肽(例如在一单一制剂或几种制剂中)。

根据一具体实施例，所述小瓶肽包含4-6种病毒肽(例如在一单一制剂或几种制剂中)。

根据一实施例，所述小瓶肽包含1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种或20种病毒肽(例如一单一配方或多种配方)。

根据一具体实施例，所述小瓶肽包含4种类型的病毒肽(例如在一单一制剂或几种制剂中)。

根据一具体实施例，所述小瓶肽包含5种类型的病毒肽(例如在一单一制剂或几种制剂中)。

根据一具体实施例，所述小瓶肽包含6种类型的病毒肽(例如在一单一制剂或数个制剂中)。

根据一具体实施例，所述小瓶肽包含来自一单一生物体(即来自一种病毒类型)的肽。

根据一具体实施例，所述小瓶肽包含来自两种或更多种生物体的肽(即一来自2种、3种、4种、5种或更多种病毒类型的混合物)。

根据一实施例，所述病毒肽包含一BK病毒肽。

根据一具体实施例，所述病毒肽包括爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)肽、巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)肽、BK病毒肽及一腺病毒(Adenovirus，Adv)肽。

根据一具体实施例，所述数个病毒肽包括EBV-LMP2、EBV-BZLF1、EBV-EBNA1、EBV-BRAF1、EBV-BMLF1、EBV-GP340/350、EBNA2、EBV-EBNA3a、EBV-EBNA3b、EBV-EBNA3c、CMV-pp65、CMV-IE-1、Adv-penton、Adv-hexon、BKV LT、BKV(衣壳VP1)、BKV(衣壳蛋白VP2)、BKV(衣壳蛋白VP2，等孔VP3)及BKV(小T抗原)中的至少一者。

根据一具体实施例，所述数个病毒肽包括AdV5Hexon、hCMV pp65、EBV select(下文讨论)及BKV LT中的至少一者。

专用软件可用于分析抗原序列以识别免疫原性短肽，即在主要组织相容性复合物(MHC)I类或MHC II类的背景下呈现的肽。

根据一具体实施例，所述一或数个抗原包含一肽混合物的一混合物，其是跨越三种病毒的整个蛋白质序列的所述重迭肽文库(例如，被11个氨基酸重迭的15聚体)：CMV、EBV及Adeno(此类pepmix可以商业购买，例如从JPT Technologies，柏林，德国)。

根据一具体实施例，所述数个病毒肽包含“EBV select”，即一来自美天旎生物技术的商业产品，包含来自来自EBV的13种不同蛋白质的43种MHC 1类及2类限制肽(例如MACSGMP

EBV Select，例如目录号170-076-143)。另外或替代地，所述数个病毒肽包含“collection EBV”，即来自JPT的商业产品具有包含来自14种不同EBV抗原的数个肽的一pepmix。另外或可选地，所述数个病毒肽包括可从JPT商购的PepMix^TM BKV(衣壳蛋白VP1)、PepMix^TM BKV(衣壳蛋白VP2)、PepMix^TM BKV(衣壳蛋白VP2、异构体VP3)、PepMix^TM BKV(大T抗原)、PepMix^TM BKV(小T抗原)。

根据另一具体实施例，所述一或数个抗原包含七种pepmix的一混合物，在所述七种肽的一浓度(例如100ng/肽或700ng/7种肽)下跨越EBV-LMP2、EBV-BZLF1、EBV-EBNA1、CMV-pp65、CMV-IE-1、Adv-penton及Adv-hexon。

根据一实施例，所述一或数个抗原包括一感染性有机体(例如，细菌、真菌有机体)的一或数个抗原，所述感染性有机体通常影响免疫包括的数个受试者，例如数个移植患者。

根据一实施例，所述抗原是一细菌抗原，例如但不限于一炭疽抗原；革兰氏阴性杆菌、衣原体、白喉、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、疟疾、结核分枝杆菌、百日咳毒素、肺炎球菌、立克次体、葡萄球菌、链球菌及破伤风。

作为细菌抗原的数个进一步具体范例，炭疽抗原包括但不限于炭疽保护性抗原；革兰氏阴性杆菌抗原包括但不限于脂多糖；流感嗜血杆菌抗原包括但不限于荚膜多糖；白喉抗原包括但不限于白喉毒素；结核分枝杆菌抗原包括但不限于分枝杆菌酸、热休克蛋白65(HSP65)、所述30kDa主要分泌蛋白及抗原85A；百日咳毒素抗原包括但不限于血凝素、pertactin、FIM2、FIM3及腺苷酸环化酶；肺炎球菌抗原包括但不限于肺炎球菌溶血素及肺炎球菌荚膜多糖；立克次体抗原包括但不限于rompA；链球菌抗原包括但不限于M蛋白；破伤风抗原包括但不限于破伤风毒素。

根据一实施例，所述抗原是超级细菌抗原(例如多重耐药细菌)。超级细菌的数个范例包括但不限于粪肠球菌(Enterococcus faecium)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)及肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)及肠杆菌属(Enterobacter spp.))。

根据一实施例，所述抗原是一真菌抗原。真菌的数个范例包括但不限于念珠菌(candida)、球虫(coccidiodes)、隐球菌(cryptococcus)、组织胞浆菌(histoplasma)、利什曼原虫(leishmania)、疟原虫(plasmodium)、原生动物(protozoa)、寄生虫、血吸虫(schistosomae)、癣(tinea)、弓形虫(toxoplasma)及克氏锥虫(trypanosoma cruzi)。

作为数个真菌抗原的数个进一步具体实例，球虫抗原包括但不限于小球抗原；隐球菌抗原包括但不限于荚膜多糖；组织胞浆菌抗原包括但不限于热休克蛋白60(HSP60)；利什曼原虫抗原包括但不限于gp63及脂磷酸聚糖；恶性疟原虫抗原包括但不限于裂殖子表面抗原、子孢子表面抗原、环子孢子抗原、配子体/配子表面抗原、原生动物及其他寄生虫抗原，包括血期抗原pf 155/RESA；血吸虫抗原包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶及副肌球蛋白；癣真菌抗原包括但不限于毛癣菌素；弓形虫抗原包括但不限于SAG-1及p30；及克氏锥虫抗原包括但不限于75-77kDa抗原及所述56kDa抗原。

根据一实施例，所述一或数个抗原包括与一恶性疾病相关的抗原(例如，肿瘤抗原)。

根据一实施例，所述抗原是由肿瘤细胞表达的一抗原(或其部分，例如抗原表位)。根据一实施例，所述抗原(或其部分)衍生自在造血组织中表达的蛋白质(例如，造血恶性肿瘤如白血病抗原)或一实体瘤中表达的蛋白质(例如黑色素瘤、胰腺癌、肝癌、胃肠道癌等)。

数个肿瘤抗原的数个范例包括但不限于A33、BAGE、Bcl-2、B细胞成熟抗原(BCMA)、BCR-ABL、β-连环蛋白、癌睾丸抗原(CTA，例如MAGE-1、MAGE-A2/A3及NY-ESO-1)、CA 125、CA19-9、CA 50、CA27.29(BR 27.29)、CA 15-3、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33、CD37、CD45、CD123、CEA、c-Met、CS-1、细胞周期蛋白B1、DAGE、EBNA、EGFR、ELA2、ephrinB2、雌激素接受者、FAP、铁蛋白、叶酸结合蛋白、GAGE、G250/CA IX、GD-2、GM2、gp75、gp100(Pmel 17)、HA-1、HA-2、HER-2/neu、HM1.24、HPV E6、HPV E7、hTERT、Ki-67、LRP、间皮素(mesothelin)、粘蛋白样癌相关抗原(mucin-like cancer-associated antigen，MCA)、MUC1、p53、PR1、PRAME、PRTN3、RHAMM(CD168)、WT-1。以下文献中提供了数个进一步肿瘤抗原，包括MolldremJ.Biology of Blood and Marrow Transplantation(2006)12:13-18；Alatrash G.andMolldrem J.,Expert Rev Hematol.(2011)4(1):37–50；Renkvist et al.,Cancerlmmunol lmmunother(2001)50:3-15；van der Bruggen P,Stroobant V,Vigneron N,Vanden Eynde B.Peptide database:T cell-defined tumor antigens.Cancer Immun(2013),www(dot)cancerimmunity(dot)org/peptide/；Rittenhouse,Manderino,andHass,Laboratory Medicine(1985)16(9)556-560，所有这些都通过引用并入本文。

根据一实施例，所述一或数个抗原包含一抗原混合物(例如，所讨论的一组抗原的一抗原混合物，例如病毒抗原；或来自不同组抗原的一抗原混合物，例如病毒及细菌抗原、病毒及肿瘤抗原)。

根据一实施例，所述一或数个抗原包含数个病毒肽及数个肿瘤肽的一混合物(例如在一单一制剂或几种制剂中)。

根据一实施例，所述一或数个抗原包含数个病毒肽及数个细菌肽的一混合物(例如在一单一制剂或几种制剂中)。

根据一实施例，所述一或数个抗原包含数个病毒肽及数个真菌肽的一混合物(例如在一单一制剂或几种制剂中)。

根据一实施例，数个第三方抗原(例如数个蛋白质提取物、数个纯化的蛋白质或数个合成肽)可以由受其感染的数个细胞(例如细胞系)呈现或以其他方式被制成表达这些肽或蛋白质。

应当理解，所述数个抗原呈现细胞可以表达一单一细胞上的所有所述抗原，或者可以仅表达一单一细胞上的部分抗原。此外，不同的抗原呈现细胞(例如在相同的制剂中)可能表达不同的抗原。因此，所述数个抗原呈现细胞(例如树突细胞)包含一异质细胞混合物。

第三方抗原可以呈现在细胞、病毒或细菌表面上或从中衍生及/或纯化。此外，病毒或细菌抗原可以展示在受感染的细胞上，细胞抗原可以展示在人工载体(例如脂质体)上，一人工抗原呈现细胞(例如用所述第三方抗原或多种抗原转染的白血病或成纤维细胞系)、自体呈现细胞或非自体呈现细胞上。

根据本发明的一些实施例，所述一或数个抗原(例如数个病毒肽)可以由遗传修饰的抗原呈现细胞或人工抗原呈现细胞呈现，这些细胞呈现出由数个T细胞(例如数个细胞记忆CD8⁺T细胞，例如用一或数个抗原转染的细胞系)可识别的MHC抗原(也称为人白血球细胞抗原(HLA))。

因此，抗原呈现细胞、细胞系、人工载体(例如脂质体)或人工抗原呈现细胞(例如用一或数个抗原转染的白血病或成纤维细胞系)可用于呈现短合成肽融合或加载到其上或呈现蛋白质提取物或纯化的蛋白质。这种短肽、蛋白质提取物或纯化的蛋白质可以是病毒、细菌、真菌或肿瘤抗原衍生的肽或代表任何其他抗原的肽。

根据一实施例，所述数个第三方细胞是选自所述从外周血淋巴细胞(peripheralblood lymphocytes，PBL)、脾脏或淋巴结、细胞因子动员的PBL、体外扩增的抗原呈现细胞中纯化的细胞的刺激细胞细胞(APC)、体外扩增的树突状细胞(DC)及人工抗原呈现细胞。

根据一实施例，抗原由与用于产生所述非GVHD诱导抗-第三方单元(即用于生成如下所述的否决细胞)。

根据一实施例，所述第三方细胞包括树突细胞。

根据一实施例，所述第三方细胞包括成熟的树突细胞。

产生第三方树突细胞的方法，其可用作刺激细胞以产生非GVHD诱导抗第三方细胞，在本领域中是众所周知的。因此，作为一非限制性范例，数个外周血单核细胞(PBMC)可以获得一细胞供体。然后使用补充有细胞因子及生长因子的DC细胞培养基(例如CellgroDC培养基)选择并培养(例如在细胞培养板中)表达CD14⁺的细胞。所确定使用的细胞因子及生长因子在本领域技术人员的能力范围内。例如，细胞培养基补充有IL-4(例如200-2000IU/mL，例如1000IU/mL)及GM-CSF(例如1000-4000IU/mL，例如2000IU/mL)。然后将细胞悬液接种(例如在细胞培养板中，例如Cell Factory板中)并培育12-36小时，例如16-24小时，例如24小时，在37℃，5％CO₂中。

为了诱导所述CD14⁺表达细胞成熟为抗原呈现细胞(例如树突细胞)，在存在成熟因子的情况下培养富含CD14+的细胞制剂。所确定使用的成熟因子在本领域技术人员的能力范围内。因此，根据一实施例，所述在IL-4(例如200-2000IU/mL，例如1000IU/mL)、GM-CSF(例如1000-4000IU/mL，例如2000IU/mL)、LPS(例如10-100ng/mL，例如40ng/mL)及IFN-γ(例如50-500IU/mL，例如200IU/mL)中10-24小时，例如14-18小时，例如16小时，在37℃，5％CO₂中。

在培育期之后，抗原呈现细胞(例如成熟的树突细胞，即mDCs)从细胞培养物中获得。根据一实施例，去除非贴壁细胞(non-adherent cells)并将抗原呈现细胞(即，贴壁细胞(adherent cells))从所述培养板分离并装载一或数个抗原。

如本文所用，短语“加载”是指所述将一或数个抗原(例如，如上所述的肽或蛋白质)附着到所述抗原呈现细胞(APC，例如树突状细胞)的表面。

根据一具体实施例，所述第三方细胞包括辐照的树突细胞。

因此，根据一实施例，用约5-10Gy、约10-20Gy、约20-30Gy、约20-40Gy、约20-50Gy、约10-50Gy辐照所述树突细胞(DC)。根据一具体实施例，用约10-50Gy(例如30Gy)辐照所述树突细胞(DC)。

利用细胞、病毒感染的细胞、细菌感染的细胞、病毒肽呈现细胞或细菌肽呈现细胞作为第三方抗原是特别有利的，因为这样的第三方抗原包括多种抗原决定簇并且因此直接形成不同族群的抗第三方细胞，在需要重组的情况下，例如在致死或亚致死辐射或化疗程序之后，这可能进一步用于更快地重组T细胞。

因此，根据一实施例，非GVHD诱导抗第三方细胞可称为抗病毒Tcm细胞、抗细菌Tcm细胞、抗肿瘤Tcm细胞等(即根据所述一或数个抗原用于生成这些细胞)。

根据一些实施例，本发明的一些实施例的包含一Tcm表型的所述数个非GVHD诱导细胞可以是取决于所需的应用(例如要治疗的T细胞介导的自身免疫疾病的类型)的非遗传修饰的数个细胞或遗传修饰的数个细胞(例如，已经被遗传工程改造的数个细胞，以表达或不表达特定基因、标记或肽或分泌或不分泌特定细胞因子)。这样的确定完全在本领域普通技术人员的能力范围内。

任何产生抗第三方Tcm细胞的方法都可以根据本发明使用，如先前在PCT公开号WO2010/049935、WO 2012/032526、WO 2013/035099及WO2018/002924中所述，通过引用并入本文。

因此，例如，具有所述Tcm表型的抗第三方细胞可以通过一方法产生，所述方法包括：(a)在去除数个细胞因子的一培养物中将数个外周血单核细胞(PBMC)与一或数个第三方抗原接触，以使抗原反应细胞富集；(b)在数个细胞因子存在下培养步骤(a)产生的所述数个细胞，以允许包含所述中枢记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的数个细胞的增殖。

根据一实施例，步骤(a)中的所述PBMC在不存在IL-21的情况下与一或数个第三方抗原接触。

根据一实施例，步骤(a)中的所述PBMC在存在IL-21的情况下与一或数个第三方抗原接触。

根据一实施例，步骤(a)中的所述PBMC在去除细胞因子且仅补充IL-21的一培养物中与一或数个第三方抗原接触。

根据一实施例，由步骤(a)产生的细胞在存在IL-15的情况下在一无抗原环境(例如，不向所述细胞培养物中添加一抗原)中培养。

根据一实施例，由步骤(a)产生的细胞在存在IL-15、IL-21及/或IL-7的情况下在一无抗原环境(例如，不向所述细胞培养物中添加一抗原)中培养。

通常通过首先在一无细胞因子培养物(即，不添加所述细胞因子)中或在仅补充IL-21的一培养物中使外周血单核细胞(PBMC，例如为同源的或非同源的，例如与未成熟造血细胞为相同细胞供体的PBMC)接触一或数个第三方抗原来产生本发明的抗第三方Tcm细胞。这种培养条件使得只有那些受到一或数个第三方抗原(即抗原反应性细胞)刺激及激活的细胞才能存活及富集，因为这些细胞分泌细胞因子(例如IL-2)，这些细胞因子能够使它们的存活(所有其余所述数个细胞在这些培养条件下死亡)。所述步骤通常进行约12-24小时、约12-36小时、约12-72小时、24-48小时、24-36小时、约24-72小时、约48-72小时、1-2天、2-3天、1-3天、2-4天、1-5天、2-5天、2-6天、1-7天、5-7天、2-8天、8-10天或1-10天，并允许数个抗原反应细胞的富集。

根据一具体实施例，使PBMC与一或数个第三方抗原(如上文所述)接触1-5天(例如3天)。

根据一实施例，用一或数个抗原培养是在存在IL-21的情况下下进行的。所述步骤通常在约0.001-3000IU/ml、0.01-3000IU/ml、0.1-3000IU/ml、1-3000IU/ml、10-3000IU/ml、100-3000IU/ml,1000-3000IU/ml,0.001-1000IU/ml、0.01-1000IU/ml、0.1-1000IU/ml、1-1000IU/ml、10-1000IU/ml、100-1000IU/ml、250-1000IU/ml、500-1000IU/ml、750-1000IU/ml、10-500IU/ml、50-500IU/ml、100-500IU/ml、250-500IU/ml,100-250IU/ml,0.1-100IU/ml,1-100IU/ml,10-100IU/ml,30-100IU/ml,50-100IU/ml,1-50IU/ml,10-50IU/ml、20-50IU/ml、30-50IU/ml、1-30IU/ml、10-30IU/ml、20-30IU/ml、10-20IU/ml、0.1-10IU/ml、或1-10IU/ml IL-21。

根据一具体实施例，IL-21的浓度为50-150IU/ml(例如100IU/ml)。

一或数个第三方抗原(例如树突状细胞)与PBMC的比率通常为约1:1至约1:20，例如约1:2至约1:10，例如约1:4、约1:6、约1:8或约1:10。根据一具体实施例，一或数个第三方抗原(例如树突细胞)与PBMC的比率为约1:2至约1:8(例如1:5)。

接下来，在存在IL-15的情况下(例如在一无抗原环境中)培养所述数个抗第三方细胞，并任选补充IL-21及/或IL-7，以允许包含所述Tcm表型的数个细胞增殖。所述步骤通常进行约12-24小时、约12-36小时、约12-72小时、24-48小时、24-36小时、约24-72小时、约48-72小时、1-20天、1-15天、1-10天、1-5天、5-20天、5-15天、5-10天、1-2天、2-3天、1-3天2-4天、2-5天、2-8天、2-10天、4-10天、4-8天、6-8天、8-10天、7-9天、7-11天、7-13天、7-15天、10-12天、10-14天、12-14天、14-16天、14-18天、16-18天或18-20天。

根据一具体实施例，抗第三方细胞在存在IL-15的情况下培养，并且任选地补充IL-21及/或IL-7，并在一无抗原环境中(例如，不添加抗原)大约7-11天(例如8天)。

根据一实施例，具有IL-15的培养物通常在约0.001-3000IU/ml、0.01-3000IU/ml、0.1-3000IU/ml、1-3000IU/ml、10-3000IU/ml、100-3000IU/ml、125-3000IU/ml、1000-3000IU/ml、0.001-1000IU/ml、0.01-1000IU/ml、0.1-1000IU/ml、1-1000IU/ml、10-1000IU/ml、100-1000IU/ml、125-1000IU/ml、250-1000IU/ml、500-1000IU/ml、750-1000IU/ml、10-500IU/ml、50-500IU/ml、100-500IU/ml、125-500IU/ml、250-500IU/ml、250-500IU/ml、125-250IU/ml、100-250IU/ml、0.1-100IU/ml、1-100IU/ml、10-100IU/ml、30-100IU/ml、50-100IU/ml、1-50IU/ml、10-50IU/ml、20-50IU/ml、30-50IU/ml、1-30IU/ml、10-30IU/ml、20-30IU/ml、10-20IU/ml、0.1-10IU/ml或1-10IU/ml的IL-15的一浓度下受到影响。根据一具体实施例，IL-15的浓度为100-150IU/ml(例如125IU/ml)。

根据一实施例，用IL-21补充IL-15通常在约0.001-3000IU/ml、0.01-3000IU/ml、0.1-3000IU/ml、1-3000IU/ml、10-3000IU/ml、100-3000IU/ml、1000-3000IU/ml、0.001-1000IU/ml、0.01-1000IU/ml、0.1-1000IU/ml、1-1000IU/ml、10-1000IU/ml、100-1000IU/ml、250-1000IU/ml、500-1000IU/ml、750-1000IU/ml、10-500IU/ml、50-500IU/ml、100-500IU/ml、250-500IU/ml、100-250IU/ml、0.1-100IU/ml、1-100IU/ml、10-100IU/ml、30-100IU/ml、50-100IU/ml、1-50IU/ml、10-50IU/ml、20-50IU/ml、30-50IU/ml、1-30IU/ml、10-30IU/ml、20-30IU/ml、10-20IU/ml、0.1-10IU/ml或1-10IU/ml的IL-21的一浓度下受到影响。根据一具体实施例，IL-21的浓度为50-150IU/ml(例如100IU/ml)。

根据一实施例，用IL-7补充IL-15通常在约0.001-3000IU/ml、0.01-3000IU/ml、0.1-3000IU/ml、1-3000IU/ml、10-3000IU/ml、30-3000IU/ml、100-3000IU/ml、1000-3000IU/ml、0.001-1000IU/ml、0.01-1000IU/ml、0.1-1000IU/ml、1-1000IU/ml、10-1000IU/ml、30-1000IU/ml、100-1000IU/ml、250-1000IU/ml、500-1000IU/ml、750-1000IU/ml、10-500IU/ml、30-500IU/ml、50-500IU/ml、100-500IU/ml、250-500IU/ml、100-250IU/ml、0.1-100IU/ml、1-100IU/ml、10-100IU/ml、30-100IU/ml、50-100IU/ml、1-50IU/ml、10-50IU/ml、20-50IU/ml、30-50IU/ml、1-30IU/ml、10-30IU/ml、20-30IU/ml、10-20IU/ml、0.1-10IU/ml或1-10IU/ml的IL-7的一浓度下受到影响。根据一具体实施例，IL-7的浓度为10-50IU/ml(例如30IU/ml)。

本发明人通过劳动性实验及筛选收集了许多标准，这些标准可用于改善包含缺乏移植物抗宿主(GVH)反应性细胞及/或增强的抗疾病(例如GVL)反应性细胞的一中枢记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的增殖。

根据一实施例，PBMC在与一或数个第三方抗原接触之前耗尽了CD4⁺细胞(例如T辅助细胞)及/或CD56⁺细胞(例如NK细胞)。

CD4⁺及/或CD56⁺细胞的耗尽可以使用本领域已知的任何方法进行，例如通过基于亲及的纯化(例如通过使用数个

珠、FACS分选器及/或捕获ELISA标记)。为了增加所述培养物中CD8⁺细胞的纯度(即消除细胞培养物中的其他淋巴细胞，例如T CD4⁺细胞或NK细胞)或为了增加CD8⁺T细胞的数量，这样的步骤可能是有益的。

根据一实施例，所述PBMC包含CD8⁺T细胞。

根据一实施例，在与一或数个第三方抗原接触之前，所述PBMC被选择以用于CD45RA⁺及/或CD45RO^-细胞(即，初始T细胞)。

初始CD8⁺T细胞的选择可以通过表达CD45RA⁺的细胞及/或表达CD45RO^-的细胞的选择来实现，并且可以使用本领域已知任何方法进行，例如通过基于亲及的纯化(例如通过使用数个

珠、FACS分选器及/或捕获ELISA标记)。

根据一实施例，所述PBMC包含初始CD8⁺T细胞。

根据一实施例，所述初始T细胞包含一CD8⁺CD45RO^-表型。

根据一实施例，所述初始T细胞包含一CD8⁺CD45RA⁺表型。

根据另一实施例，所述初始T细胞包含一CD8⁺CD45RO^-CD45RA⁺表型。

根据一具体实施例，当使用初始T细胞时，用所述一或数个抗原培养的第一步骤通常作用1-5天(例如3天)，且在存在IL-15的情况下培养(在一无抗原环境中)的步骤通常作用6-12天(例如8天)。

或者，在接触一或数个第三方抗原之前，所述PBMC被选择以用于所述CD45RA^-细胞及/或CD45RO⁺(即，记忆T细胞)。

如本文所用，术语“记忆T细胞”指T淋巴细胞的一亚群，其先前已经遇到一抗原并响应所述抗原，也称为抗原经历的T细胞(antigen experienced T cells)。

记忆CD8⁺T细胞的选择可以通过表达CD45RA^-的细胞及/或表达CD45RO⁺的细胞的选择来实现，并且可以使用本领域已知的任何方法进行，例如通过基于亲及的纯化(例如通过使用数个

珠、FACS分选器及/或捕获ELISA标记)。

根据一实施例，所述PBMC包含记忆CD8⁺T细胞。

根据一实施例，进行所述选择以获得包含CD8⁺T细胞的一细胞级分(cellfraction)，其中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多是记忆T细胞。

根据一实施例，所述记忆T细胞包含一CD8⁺CD45RO⁺表型。

根据另一实施例，所述记忆T细胞包含一CD8⁺CD45RA^-表型。

根据另一实施例，所述记忆T细胞包含一CD8⁺CD45RO⁺CD45RA^-表型。

根据一具体实施例，当使用记忆T细胞时，用所述一或数个抗原培养的第一步骤通常作用1-5天(例如3天)，且在存在IL-15的情况下培养(在一无抗原环境中)的步骤通常作用3-10天(例如6天)。

可根据本教导进行的一附加步骤包括在存在IL-15下用一或数个第三方抗原培养所述PBMC细胞，及在从所述细胞培养物中除去所述一或数个第三方抗原之前(即在产生一无抗原环境之前)任选地补充IL-21及/或IL-7。所述步骤通常进行约12-24小时、约12-36小时、约12-72小时、24-48小时、24-36小时、约24-72小时、约48-72小时、1-2天、2-3天、1-3天、2-4天、1-5天或2-5天，并且作用于相同剂量的如上文所指出的IL-21、IL-15及IL-7的情况下。根据一具体实施例，在存在IL-21、IL-15及IL-7的情况下用一或数个第三方抗原培养所述PBMC细胞12小时至4天(例如1-2天)。

附加地或替代地，可以进行允许激活细胞的选择及分离的一附加两步骤过程。此一选择步骤有助于在所述PBMC相对于所述受试者非同源的情况下去除潜在的宿主反应性T细胞(例如同种异体反应性细胞)。

因此，可以在一两阶段方法中进行分离数个激活细胞。在IL-15存在下培养所述数个细胞之前选择第一阶段激活的细胞。所述第一阶段通常在所述PBMC与一或数个第三方抗原的所述初始接触之后进行。此选择过程仅挑选那些被所述第三方抗原(例如，如下所述的表达激活标记)激活的数个细胞，并且通常作用在所述PBMC与一或数个第三方抗原的所述初始接触后约12-24小时、约24-36小时、约12-36小时、约36-48小时、约12-48小时、约48-60小时、约12-60小时、约60-72小时、约12-72小时、约72-84小时、约12-84小时、约84-96小时、约12-96小时。根据一具体实施例，所述选择过程作用在所述PBMC与一或数个第三方抗原的所述初始接触后约12-24小时(例如14小时)。

分离数个激活细胞可以通过基于亲及的纯化(例如通过使用数个

珠、FACS分选器及/或捕获ELISA标记)来实现并且可以针对包括数个细胞表面标志物或数个非细胞表面标志物在内的任何激活标志物来实现，所述数个细胞表面标志物例如但不限于CD69、CD44、CD25、CFSE、CD137，所述数个非细胞表面标志物例如但不限于IFN-γ及IL-2。分离数个激活细胞也可以通过使用本领域已知的任何方法(例如通过FACS)通过基于形态学的纯化(例如分离大细胞)来实现。通常，所述数个激活细胞也被选择用于表达CD8⁺细胞。此外，上述数个方法的任意组合可用于有效分离数个激活细胞。

根据本发明的一实施例，选择激活细胞是通过选择CD137⁺及/或CD25⁺细胞来实现的。

分离数个激活细胞的第二阶段通常在培养结束时进行(即在不具有添加一抗原的情况下用IL-15培养之后)。所述阶段通过耗尽那些在所述中枢记忆T淋巴细胞(Tcm)与受辐照的宿主抗原呈现细胞(APC，例如树突细胞)接触后被激活的细胞来耗尽数个同种异体反应性细胞。如上所述，分离数个激活细胞可以通过基于亲及的纯化(例如通过使用数个

珠、FACS分选器及/或捕获ELISA标记)来实现，并且可以针对包括数个细胞表面标志物或数个非细胞表面标志物的任何激活标志物，所述数个细胞表面标志物例如但不限于CD69、CD44、CD25、CFSE、CD137，所述数个非细胞表面标志物例如但不限于IFN-γ及IL-2。

根据本发明的一实施例，耗尽所述数个同种异体反应性细胞通过消耗CD137⁺及/或CD25⁺细胞及/或IFNγ捕获。

根据一实施例，由数个本方法产生的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群通常包含20-100％的Tcm细胞。

根据一实施例，由数个本发明方法产生的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包含至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多的Tcm细胞。

根据一具体实施例，由数个本发明方法产生的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包含至少约30％的Tcm细胞。

根据一具体实施例，由数个本方法产生的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包含至少约40％的Tcm细胞。

根据一具体实施例，由数个本方法产生的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包含至少约50％的Tcm细胞。

根据一具体实施例，由数个本发明方法产生的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包含至少约60％的Tcm细胞。

根据一具体实施例，由数个本发明方法产生的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包含至少约70％的Tcm细胞。

因此，具有本发明的一中枢记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的所述抗第三方细胞不是天然存在的，也不是自然产物。这些细胞通常是通过离体操作(即，在不存在或存在数个特定细胞因子的情况下暴露于一或数个第三方抗原)产生的。

根据一实施例，所述数个未成熟造血细胞及具有所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞获自相同供体(例如人类的供体)。

根据一实施例，所述数个未成熟造血细胞及具有所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞获自不同供体(例如人类的供体)。

根据一实施例，所述数个未成熟造血细胞及具有所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞(即，数个否决细胞)同时施用，即共同施用(例如在同一天，例如12-24小时内)。

或者，可以在移植所述数个未成熟造血细胞后施用具有所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞(即，数个否决细胞)。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的所述数个抗第三方细胞可以在移植数个未成熟造血细胞后1-30天(例如1-25天，例如1-20天，例如1-10天，例如4-10天，例如1-5天)施用。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的所述数个抗第三方细胞可以在移植未成熟造血细胞后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、25天或30天(例如3天、5天、7天、10天)施用。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的所述数个抗第三方细胞可以在移植未成熟造血细胞后8天施用。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的所述数个抗第三方细胞可以在移植未成熟造血细胞后7天施用。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的所述数个抗第三方细胞可以在移植未成熟造血细胞后6天施用。

根据一具体实施例，具有所述Tcm表型的所述数个抗第三方细胞可以在移植未成熟造血细胞后5天施用。

根据一实施例，所述数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞可以一单一剂量施用于所述受试者。或者，所述数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞可以两剂或多剂(例如三次、四次、五次或更多次)施用于所述受试者。

此一确定完全在本领域技术人员的能力范围内。

由于T细胞介导的自身免疫疾病通常引起组织或器官损伤，本发明的数个实施例考虑将能够再生所述受损组织或器官的非造血细胞移植到一对象。

如本文所用，所述术语“非造血细胞”是指不属于所述造血谱系的体细胞。这样的细胞包括分化细胞以及祖细胞及干细胞。

如本文所用，所述短语“分化细胞”是指终末分化细胞。可根据所述本教导移植的示例性细胞包括但不限于肝、胰、脾、肾、心、肺、皮肤、肠、输卵管、卵巢、神经或脑细胞。

根据一实施例，所述分化细胞从一成体组织(即，出生后任何时间的有机体的一组织)获得。

根据一实施例，所述分化细胞获自一胎儿组织(如下所述)。

根据本发明的一实施例，所述非造血细胞包括祖细胞或干细胞。

如本文所用，短语“干细胞”是指可以分化成具有一特定、特化功能的其他细胞类型的细胞(例如完全分化的细胞)。数个范例包括但不限于全能(totipotent)、多能(pluripotent)或多潜能(multipotent)细胞。

所述全能干细胞产生的“祖细胞”比所述全能细胞分化程度更高。这些细胞能够分化成特定的细胞谱系，例如内皮谱系、上皮谱系或间充质谱系。

根据一实施例，所述祖细胞包括肝祖细胞、胰腺祖细胞、心脏祖细胞、脑祖细胞、神经祖细胞、肾祖细胞、卵巢祖细胞、脾祖细胞或肺祖细胞。

根据应用及可用来源，本发明的所述非造血细胞可以从一产前生物体、产后生物体、一成人或一尸体捐赠者获得。这样的确定完全在本领域普通技术人员的能力范围内。

根据一实施例，数个细胞可以从一器官或组织获得。

根据一实施例，所述器官或组织来自一胎儿有机体。所述胎儿有机体可以是任何一人类或异种来源(例如猪)，并且处于妊娠的任何阶段。这样的确定是本领域普通技术人员的能力。

根据一实施例，所述胎儿器官或组织包括一胎儿肺组织、一胎儿胰腺组织、一胎儿肾组织、一胎儿肝组织、一胎儿心脏组织、一胎儿神经组织、一胎儿脑组织、一胎儿脾组织、一胎儿肠组织、一胎儿皮肤组织、一胎儿输卵管管组织及一胎儿卵巢组织。

可以采用各种方法从一胎儿有机体获得一器官或组织。因此，例如获得一组织(例如肝脏或胰腺组织)可以通过例如一外科手术从一发育中的胎儿(处于与人类妊娠14-24周相对应的妊娠阶段)身上采集组织来实现。所述本领域技术人员将理解一生物体的妊娠阶段是在产生所述生物体的卵母细胞受精后经过的时间段。

同样，可以采用各种方法从一成年有机体(例如活体或尸体)获得一器官或组织。因此，例如，获得一组织(例如肝脏或胰腺组织)可以通过一外科手术从一器官供体收获所述组织来实现，例如：剖腹手术或腹腔镜检查。

或者，一组织可以通过体外或离体细胞、器官或组织的培养获得。细胞、组织或器官的这种受控的体外分化是常规进行的，例如，使用胚胎干细胞系的培养以产生含有所需谱系的细胞/组织/器官的培养物。可理解的是本发明的非造血细胞可以是新鲜的或冷冻的(例如冷冻保存的)制剂。

根据一实施例，所述数个非造血细胞处于悬浮状态。因此，所述数个非造血细胞从它们的自然环境(例如，人体)中分离出来，并从组织/器官中提取，同时保持活力但不保持一组织结构(即，不具有血管化的组织结构)，使得它们可以是可注射的(例如通过静脉内施用)。根据一实施例，悬浮的所述数个细胞不附着于一固体支持物。

根据一实施例，具有本发明的所述Tcm表型的所述数个未成熟造血细胞及/或所述数个非GVHD诱导的抗第三方细胞可用于支持整个或部分器官或组织。可根据本教导的移植的示例性器官或组织包括但不限于肺器官或组织、胰腺器官或组织、肾器官或组织、肝器官或组织、心脏器官或组织、脑器官或组织、脾脏器官或组织、肠器官或组织、皮肤组织、输卵管器官或组织、卵巢器官或组织。可理解的是，所述器官或组织可以从一胎儿或成人有机体获得(如上所述)。

根据一实施例，所述器官或组织与所述接受者受试者是同源的或非同源的(例如同种异体的)。

根据一实施例，所述器官或组织相对于所述数个未成熟造血细胞及/或具有所述Tcm的非GVHD诱导抗第三方细胞是同源的表型(即，数个否决细胞)。

根据一实施例，所述器官或组织、所述数个未成熟造血细胞及具有所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞(即，数个否决细胞)来自相同的供体(例如人类)。根据一实施例，当所述T细胞介导的自身免疫性疾病涉及所述胰腺时(例如自身免疫性1型糖尿病(T1DM))，所述移植物进一步包括一胰腺细胞、组织或器官移植物。

根据一实施例，当所述T细胞介导的自身免疫性疾病涉及所述肝脏(例如自身免疫性肝炎)时，所述移植物进一步包括一肝细胞、组织或器官移植物。

根据一实施例，当所述T细胞介导的自身免疫性疾病涉及所述肾脏(例如肾小球肾炎)时，所述移植物进一步包括一肾细胞、组织或器官移植物。

根据一实施例，当所述T细胞介导的自身免疫性疾病涉及所述数个肠(例如克罗恩病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC))时，所述移植物进一步包含一肠细胞、组织或器官移植物。

根据一实施例，当所述T细胞介导的自身免疫性疾病涉及所述中枢神经系统(例如多发性硬化症)时，所述移植物进一步包括一神经细胞或组织移植物。

所述数个未成熟造血细胞及/或具有所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞及/或一些实施例的所述数个非造血细胞、数个组织或数个器官可以施用于一有机体本身、或在与合适的载体或赋形剂混合的一药物组合物中。

如本文所用，一“药物组合物”是指本文所述的一或数个活性成分与其他化学成分如生理上合适的载体及赋形剂的一制剂。所述药物组合物的目的是促进一化合物对一生物体的施用。

在此术语“活性成分”是指所述数个未成熟造血细胞及/或具有对所述生物学效应负责的所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞及/或所述数个非造血细胞。

在下文中，所述短语“生理学上可接受的载体”及“药学上可接受的载体”可以互换使用，是指一载体或一稀释剂，所述载体或所述稀释剂对生物体不会造成显着刺激且不会引起显着刺激，并且不消除所施用的化合物的生物活性及特性。这些短语下包含一佐剂(adjuvant)。

在此所述术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进一活性成分的施用的一惰性物质。赋形剂的数个实例包括但不限于包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖及淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油及聚乙二醇。

可在“Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版本”中找到用于药物的配制及施用的技术，其通过引用并入本文。

将所述数个未成熟造血细胞及/或具有所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞及/或所述数个非造血细胞施用于所述受试者中可以通过多种方式实现，这取决于各种参数，例如举例为细胞类型；所述接受者的疾病的类型、阶段或严重程度(例如T细胞介导的自身免疫疾病)；特定于所述受试者的物理或生理参数；及/或期望的治疗结果。

例如，根据应用及目的，所述数个未成熟造血细胞及/或具有所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞及/或所述数个非造血细胞的施用可以通过选自所述气管内、支气管内、肺泡内、静脉内、腹膜内、鼻内、皮下、髓内、鞘内、心室内、心内、肌内、浆膜内、粘膜内、经粘膜、经鼻、直肠及肠内的一途径来实现。

根据一实施例，通过静脉内途径进行施用。

或者，向所述受试者施用所述数个未成熟造血细胞及/或具有所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞及/或所述数个非造血细胞可以通过将其施用于各种合适的解剖位置中来实现，以达到治疗效果。因此，根据应用及目的，所述数个细胞可以被施用于一同位解剖位置(homotopic anatomical location)(所述数个细胞的所述器官或组织类型的一正常解剖位置)、或施用于一异位解剖位置(所述数个细胞的所述器官或组织类型的一异常解剖位置)。

因此，根据应用及目的，所述数个细胞、数个组织或数个器官植入于(例如移植于)肾包膜下，或进入肾脏、睾丸脂肪、皮下组织、网膜、门静脉、肝脏、脾脏、心腔、心脏、胸腔、胰腺、皮肤及/或腹腔。

例如，为了治疗涉及肝脏的T细胞介导的自身免疫性疾病(例如自身免疫性肝炎)，可以将数个非造血细胞移植到肝脏、门静脉、肾包膜、皮下组织、网膜、脾脏和腹腔。类似地，为了治疗涉及胰腺的T细胞介导的自身免疫疾病(例如自身免疫1型糖尿病(T1DM))，根据本发明，移植数个非造血细胞可以通过将所述数个细胞移植到门静脉、肝脏、胰腺、睾丸脂肪、皮下组织、网膜、肠袢(小肠U袢的浆膜下层)及/或腹腔内空间中来实现。同样，可以进行非造血细胞移植以治疗患有例如涉及肠、结肠、胃、脑和脊髓(中枢神经系统)的T细胞介导的自身免疫疾病的接受者。

任选地，当将本发明的所述数个非造血细胞、数个组织或数个器官移植到具有缺陷或受损器官的一受试者中时，首先从所述受试者中至少部分去除根据一实施例的衰竭器官，以便能够优化发育移植，以及其结构/功能与受试者的解剖学/生理学的整合。

数个非造血细胞、数个组织或数个器官的移植可以伴随或在用造血细胞及/或具有Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞治疗的同时进行。例如，可以施用所述数个非造血细胞、数个组织或数个器官，例如1-30天、30-60天、60-90天、90-120天、120-180天，例如6-12个月，例如在用所述数个造血细胞及/或具有Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞治疗后12-24个月或更长时间。这样的确定完全在本领域普通技术人员的能力范围内并且取决于待治疗的疾病、疾病严重程度、受试者的年龄等。

本发明的一些实施例的药物组合物可以通过本领域众所周知的方法制造，例如，通过常规的混合、溶解、制粒、糖衣丸制造、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。

用于根据本发明的一些实施例使用的数个药物组合物因此可以使用一或数个生理学上可接受的载体以常规方式配制，所述一或数个生理学上可接受的载体包括数个赋形剂及数个助剂，其有助于将活性成分加工成制剂，所述制剂可以是用于制药。适当的配方取决于所选择的施用途径。

对于注射剂，所述药物组合物的所述数个活性成分可以配制在水溶液中，优选在生理相容的缓冲液中，例如汉克溶液(Hank’s solution)、林格溶液(Ringer’s solution)或生理盐缓冲液。对于经粘膜施用，适合待渗透屏障的渗透剂用于制剂中。此类渗透剂在本领域中通常是已知的。

对于口服施用，通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体组合，可以容易地配制所述药物组合物。此类载体使药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、悬浮液等，供一患者口服摄取。可使用一固体赋形剂制备用于口服的数个药用制剂，任选研磨所产生的混合物，并加工所述颗粒混合物，如果需要，在添加合适的助剂后，获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂尤其是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、碳甲基纤维素钠；及/或生理上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)。如果需要，可以添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮(cross-linked polyvinyl pyrrolidone)、琼脂或海藻酸或其一盐(例如海藻酸钠)。

数个糖衣丸芯配(Dragee cores)有合适的包覆。为此目的，可使用浓缩糖溶液，其可任选含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、卡波姆凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液(lacquer solutions)及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣中以识别或表征活性化合物剂量的不同组合。

可口服使用的数个药物组合物包括由明胶制成的推入配合胶囊以及由明胶及一增塑剂(如甘油或山梨糖醇)制成的数个软密封胶囊。数个推入式胶囊可包含活性成分与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)、润滑剂(如滑石)或硬脂酸镁及任选的稳定剂。在软胶囊中，活性成分可以溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以添加稳定剂。所有口服制剂的剂量都应适合于所选的施用途径。

对于口腔施用，所述数个组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

对于通过鼻吸入施用，根据本发明的一些实施例使用的所述数个活性成分以一气溶胶喷雾剂形式方便地递送，所述气溶胶喷雾剂形式来自使用一合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳)的一加压包装或一喷雾器。在一加压气雾剂的情况下，所述剂量单位可以通过提供一阀以输送一计量的量来确定。可配制用于分配器的例如明胶的胶囊及药筒，其含有化合物及一合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。

本文所述的药物组合物可配制用于肠胃外施用，例如，通过快速推注或连续输注。注射用制剂可以单位剂型存在，例如在数个安瓿(ampoules)或具有任选的一添加防腐剂的多剂量容器中。所述数个组合物可以是在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以包含配方剂，例如悬浮剂、稳定剂及/或分散剂。

用于肠胃外施用的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水溶液。此外，活性成分的悬浮液可以制备成合适的油性或水基注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油、或合成脂肪酸酯(如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体)。水性注射混悬剂可包含增加混悬剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以包含合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度，以允许高浓度溶液的试剂的所述制备。

或者，所述活性成分可以是粉末形式，用于在使用前与一合适的载体，例如无菌、无热原的水基溶液构成。

本发明的一些实施例的所述药物组合物也可以使用例如常规栓剂基质(例如可可脂或其他甘油酯)配制在直肠组合物(例如栓剂或保留灌肠剂)中。

适用于本发明的一些实施例的上下文中的数个药物组合物包括数个组合物，所述数个活性成分以一有效量包含在所述数个组合物中以实现所述预期目的。更具体地，一治疗有效量是指活性成分的一量(所述数个未成熟造血细胞及/或具有所述Tcm表型的所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞及/或所述数个非造血细胞)有效地预防、减轻或改善一疾病(例如T细胞介导的自身免疫疾病)的症状或延长被治疗的所述受试者的生存期。

一治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是鉴于所述本文提供的详细公开。

对于本发明的方法中使用的任何制剂，所述治疗有效量或剂量可以最初从体外及细胞培养测定中估计。例如，可以在数个动物模型中制定剂量以达到所需的浓度或效价。此类信息可用于更准确地确定人体的有用剂量。

例如，输注到一接受者的所述数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞(即，数个否决细胞)的数量应大于1x10⁴个/每公斤理想体重。输注到一接受者的所述数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞的数量通常应在1x10³个/每公斤理想体重至1x10⁴个/每公斤理想体重的范围、1x10⁴个/每公斤理想体重至1x10⁵个/每公斤理想体重的范围、1x10⁴个/每公斤理想体重至1x10⁶个/每公斤理想体重的范围、1x10⁴个/每公斤理想体重至1x10⁷个/每公斤理想体重的范围、1x10⁴个/每公斤理想体重至1x10⁸个/每公斤理想体重的范围、1x10³个/每公斤理想体重至1x10⁵个/每公斤理想体重的范围、1x10⁴个/每公斤理想体重至1x10⁶个/每公斤理想体重的范围、1x10⁶个/每公斤理想体重至1x10⁷个/每公斤理想体重的范围、1x10⁵个/每公斤理想体重至1x107个/每公斤理想体重的范围、1x10⁶个/每公斤理想体重至1x10⁸个/每公斤理想体重的范围、或1x10⁶个/每公斤理想体重至1x10⁹个/每公斤理想体重的范围。

根据一具体实施例，输注到一接受者的所述数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞的数量应在所述0.5×10⁶个/每公斤理想体重至1x10⁸个/每公斤理想体重的范围。

根据一具体实施例，输注到一接受者的所述数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞的数量应在1×10⁵个CD8⁺细胞/每公斤理想体重至1x10⁸个CD8⁺细胞/每公斤理想体重的范围。

根据一具体实施例，输注到一接受者的所述数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞的数量应包括至少0.5x10⁶个CD8⁺细胞/每公斤理想体重。

根据一具体实施例，所述输注到一接受者的非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞的数量应包括至少1x10⁶个CD8⁺细胞/每公斤理想体重。

根据一具体实施例，所述输注到一接受者的非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞的数量应包括至少2.5x10⁶个CD8⁺细胞/每公斤理想体重。

根据一具体实施例，所述输注到一接受者的非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞的数量应包括至少5x10⁶个CD8⁺细胞/每公斤理想体重。

根据一具体实施例，所述输注到一接受者的非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞的数量应包括至少7.5x10⁶个CD8⁺细胞/每公斤理想体重。

根据一具体实施例，所述输注到一接受者的非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞的数量应包括至少10x10⁶个CD8⁺细胞/每公斤理想体重。

数个治疗有效量的数个未成熟造血细胞，例如T细胞耗尽的未成熟造血细胞，在上文中详细讨论。

如本文所用，术语“理想体重”是指临床上用于调整药物剂量、帮助估计肾功能及所述药代动力学(例如肥胖患者)的测量值。

所述以公斤(kg)为单位估算理想体重的公式如下：

男性：IBW＝50公斤+5英尺以上每英寸2.3公斤。

女性：IBW＝45.5公斤+5英尺以上每英寸2.3公斤。

Peterson等人[Am J Clin Nutr 2016；103:1197-203]详细讨论了理想体重，通过引用并入本文。

此处描述的活性成分的毒性及治疗功效可以通过标准药学程序在体外、在细胞培养物或实验动物中确定。从这些体外及细胞培养试验及动物研究中获得的数据可用于制定用于人体的一剂量范围。所述剂量可以根据使用的剂型及使用的施用途径而变化。具体的配方、施用途径及剂量可以由个别医生根据患者的情况来选择。(参见例如，Fingl等人，1975年，"The Pharmacological Basis of Therapeutics"，第一章第一页)。

可以单独调整剂量及间隔以提供活性成分的水平足以诱导或抑制生物效应(最小有效浓度，MEC)。每种制剂的MEC会有所不同，但可以根据体外数据进行估算。达到所述MEC所需的剂量将取决于个体特征及施用途径。检测分析可用于确定血浆浓度。

要施用的一组合物的所述量当然取决于被治疗的所述受试者、病痛的严重程度、施用的方式、所述处方医师的判断等。

由于非同源(例如同种异体)细胞在施用于所述受试者时可能诱导一免疫反应，已经开发了几种方法来降低排斥非同源细胞的可能性。这些包括抑制所述接受者免疫系统或在移植前将非自体细胞包裹在免疫隔离的半透膜中。或者，可以使用不表达异种表面抗原的细胞，例如在转基因动物(例如猪)中开发的那些。

在根据本教导将所述数个未成熟造血细胞及/或所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞及/或所述数个非造血细胞、组织或器官移植到所述受试者中之后，根据标准医学实务，建议监测所述细胞的存活及功能以及移植排斥及/或移植物抗宿主病的发展。这些方法是本领域技术人员众所周知的。例如，所述可以通过标准血液及骨髓测试(例如通过FACS分析)在一受试者中监测未成熟造血细胞的细胞数量。移植排斥或GVHD可通过血液检查、体格检查(例如监测皮疹、黄色变色、腹部肿胀、呕吐、腹泻、腹部绞痛、恶心、眼睛干燥/刺激增加)及活组织检查(例如肝、肺的活组织检查)。例如，胰腺细胞的功能可以在移植后通过标准胰腺功能测试(例如血清胰岛素水平的分析)进行监测。同样，肝细胞移植可在移植后通过标准肝功能测试(例如白蛋白、总蛋白、ALT、AST及胆红素的血清水平分析，以及凝血时间分析)进行监测。可以通过计算机断层扫描或超声成像来监测所述数个非造血细胞的结构发育。

此外，在根据本教导将所述数个未成熟造血细胞及/或数个非GVHD诱导抗第三方细胞移植到所述受试者中后，建议监测数个T细胞介导的自身免疫疾病病症。例如，1型糖尿病的症状包括例如非常口渴、感觉饥饿、疲劳、视力模糊、感觉脚部麻木或感觉刺痛、体重减轻等。桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)的症状包括例如颈部增大或甲状腺肿大、疲劳、脱发、不耐寒、甲状腺变小或萎缩、关节僵硬、体重意外增加和面部肿胀。多发性硬化症(MS)的症状包括例如疲劳、失去平衡、肌肉痉挛、麻木或任何部位的感觉异常、手臂或腿移动问题、行走问题、协调和小动作问题、一或多个手臂或腿颤抖、一或多个手臂或腿无力、视力丧失、面部疼痛、听力丧失、口齿不清或难以理解、咀嚼及吞咽困难。这些症状可以通过身体检查、超声、MRI、验血等来监测。这样的确定完全在本领域普通技术人员的能力范围内。

为了治疗T细胞介导的自身免疫疾病及促进所述数个未成熟造血细胞的植入，所述方法可以进一步包括在亚致死、致死或超致死条件下调节所述受试者。

如本文所用，术语“亚致死”、“致死”及“超致死”，当涉及本发明受试者的调节时，指骨髓毒性及/或淋巴细胞毒性治疗，当应用于所述数个受试者的一族群，通常分别是：对族群的基本上所有成员都是非致命的对人口中的一些但不是所有成员是致命的；或在正常不育条件下对基本上所述族群的所有成员都是致命的。

根据本发明的一些实施例，所述亚致死、致死或超致死调节包括一全身照射(total body irradiation，TBI)、全淋巴照射(total lymphoid irradiation，TLI，即所有淋巴结、胸腺及脾脏的暴露)、部分身体照射(例如肺、肾、脑等的特定暴露)、清髓性调节及/或非清髓性调节，例如具有不同的组合，包括但不限于共刺激阻断、化疗剂及/或抗体免疫疗法。根据本发明的一些实施例，所述调节包括上述任何所述调节方案的一组合(例如化疗剂及TBI、共刺激阻断剂及化疗剂、抗体免疫疗法及化疗剂等)。

根据一实施例，所述调节是通过在超致死条件下调节所述受试者来实现的，例如在数个清髓条件下(即其中所述骨髓细胞被破坏的强化调节方案)。

或者，所述调理可以通过在致死或亚致死条件下调理受试者来实现，例如通过分别在清髓性条件或非清髓性条件下调理所述受试者(即降低强度的调理，这是一种较不积极的调理方案)。

根据一具体实施例，所述调节包括非清髓性调节(例如一降低强度调节方案)。

根据一实施例，所述降低强度调节作用长达2周(例如1-10天或1-7天)。

根据一具体实施例，所述非清髓性调节包括一化疗剂及TBI/TLI。

根据一实施例，所述TBI包含一照射剂量(例如单次或分次照射剂量)，所述照射剂量的范围是0.5-1Gy、0.5-1.5Gy、0.5-2Gy、0.5-2.5Gy,0.5-5Gy、0.5-7.5Gy、0.5-10Gy、0.5-15Gy、1-1.5Gy、1-2Gy、1-2.5Gy、1-3Gy、1-3.5Gy、1-4Gy、1-4.5Gy、1-5Gy、1-5.5Gy、1-6Gy、1-7Gy、1-7.5Gy、1-10Gy、2-3Gy、2-4Gy、2-5Gy、2-6Gy、2-7Gy、2-8Gy、2-9Gy、2-10Gy、3-4Gy、3-5Gy、3-6Gy、3-7Gy、3-8Gy、3-9Gy、3-10Gy、4-5Gy、4-6Gy、4-7Gy、4-8Gy、4-9Gy、4-10Gy、5-6Gy、5-7Gy、5-8Gy、5-9Gy、5-10Gy、6-7Gy、6-8Gy、6-9Gy、6-10Gy、7-8Gy、7-9Gy、7-10Gy、8-9Gy、8-10Gy、10-12Gy或10-15Gy。

根据一具体实施例，所述TBI包括在1-7.5Gy范围内的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TBI包括在1-6Gy范围内的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TBI包括在1-5Gy范围内的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TBI包括6Gy的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TBI包括5Gy的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TBI包括4Gy的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TBI包括3Gy的一单次或分次照射剂量。

根据一实施例，在移植前1-10天(例如1-3天，例如1天)向所述受试者施用TBI治疗。根据一实施例，所述受试者在移植前1天、2天、3天或4天(例如1天)用TBI调节一次。根据一实施例，TBI在移植当天(即第0天)施用。

根据一具体实施例，所述TBI包含在第-3天至第-1天(即移植前)的一单一或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TBI包含在第-2天至第-1天(即移植前)的一单一或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TBI包含在第-1天(即移植前一天)的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包含一照射剂量，所述照射剂量的范围是0.5-1Gy、0.5-1.5Gy、0.5-2.5Gy、0.5-5Gy、0.5-7.5Gy、0.5-10Gy、0.5-15Gy、1-1.5Gy、1-2Gy、1-2.5Gy、1-3Gy、1-3.5Gy、1-4Gy、1-4.5Gy、1-5Gy、1-5.5Gy、1-6Gy、1-7Gy、1-1.5Gy、1-7.5Gy、1-10Gy、2-3Gy、2-4Gy、2-5Gy、2-6Gy、2-7Gy、2-8Gy、2-9Gy、2-10Gy、3-4Gy、3-5Gy、3-6Gy、3-7Gy、3-8Gy、3-9Gy、3-10Gy、4-5Gy、4-6Gy、4-7Gy、4-8Gy、4-9Gy、4-10Gy、5-6Gy、5-7Gy、5-8Gy、5-9Gy、5-10Gy、6-7Gy、6-8Gy、6-9Gy、6-10Gy、7-8Gy、7-9Gy、7-10Gy、8-9Gy、8-10Gy、10-12Gy、10-15Gy、10-20Gy、10-30Gy、10-40Gy、10-50Gy、0.5-20Gy、0.5-30Gy、0.5-40Gy或0.5-50Gy。

根据一具体实施例，所述TLI包括在1-12Gy范围内的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包括在1-7.5Gy范围内的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包括在1-6Gy范围内的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包括在1-5Gy范围内的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包括6Gy的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包括5Gy的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包括4Gy的一单次或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包括3Gy的一单次或分次照射剂量。

根据一实施例，在移植前1-10天(例如1-3天，例如1天)向所述受试者施用TLI治疗。根据一实施例，所述受试者在移植前1天、2天、3天或4天(例如1天)用TLI调节一次。

根据一具体实施例，所述TLI包含在第-3天至第-1天(即移植前)的一单一或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包含在第-2天至第-1天(即移植前)的一单一或分次照射剂量。

根据一具体实施例，所述TLI包含在第-1天(即移植前一天)的一单次或分次照射剂量。

根据一实施例，所述调节包括一化疗剂。数个示例性化疗剂包括但不限于白消安、白消安、环磷酰胺、依维莫司、氟达拉滨、美法仑、Myleran、三磺胺及噻替帕。

根据一实施例，所述调节包括一免疫抑制剂，例如但不限于雷帕霉素。

所述(数个)化学治疗剂及/或(数个)免疫抑制剂可以一单次剂量或数次剂量(例如1次)施用于所述受试者。移植前或移植后2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多剂量(例如每日剂量)。

根据一具体实施例，所述受试者被施用雷帕霉素。

雷帕霉素(Rapamycin)(也称为西罗莫司(Sirolimus)及雷帕明(Rapamune))可购买自例如辉瑞。雷帕霉素类似物包括，例如CCI-779、RAD001、AP23573。

根据一实施例，雷帕霉素的一治疗有效量包含0.01mg/天/公斤至3mg/天/公斤理想体重、0.02mg/天/公斤至1.5mg/天/公斤理想体重，例如0.02mg/天公斤至1.5mg/天/公斤理想体重，例如0.05mg/天/公斤至1.0mg/天/公斤，例如0.1mg/天/公斤至0.3mg/天/公斤理想体重。

根据一实施例，一治疗有效量的雷帕霉素包括约0.1mg/天/公斤理想体重。

根据一实施例，一治疗有效量的雷帕霉素包括约0.3mg/天/公斤理想体重。

根据一实施例，一治疗有效量的雷帕霉素包括约0.5mg/天/公斤理想体重。

根据一实施例，一治疗有效量的雷帕霉素包括约0.7mg/天/公斤理想体重。

根据一实施例，一治疗有效量的雷帕霉素包括约1mg/天/公斤理想体重。

根据一实施例，一治疗有效量的雷帕霉素包括约2mg/天/公斤理想体重。

根据一实施例，一治疗有效量的雷帕霉素包括约2.5mg/天/公斤理想体重。

根据一实施例，一治疗有效量的雷帕霉素包括约3mg/天/公斤理想体重。

根据一实施例，雷帕霉素作用3-10天(例如3天、4天、5天或6天)。例如，雷帕霉素可以从第-4天到第+10天施用，例如从第-1天到第+4天(例如在未成熟造血细胞移植的第-1天、第0天、第+1天、第+2天、第+3天及第+4天)。

根据一实施例，雷帕霉素施用不超过4天、5天、6天或7天。

根据一具体实施例，雷帕霉素可以在诱导所述数个非GVHD抗第三方Tcm细胞(即否决细胞，例如在所述前一天、同一天，或在施用否决细胞后的第二天)。因此，根据一具体实施例，数个非GVHD诱导第三方Tcm细胞(即，否决细胞)在第0天施用，即与所述未成熟造血细胞一起施用，并且雷帕霉素在第-4天至第+4天施用，例如从第-1天到第+4天(例如在未成熟造血细胞移植的第-1天、第0天、第+1天、第+2天、第+3天及第+4天)。根据另一具体实施例，在第0天施用未成熟造血细胞，在第+7天施用所述数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞(即否决细胞)，并且在第-4天到第+4天施用雷帕霉素，例如从第-1天到第+4天(例如在未成熟造血细胞移植的第-1天、第0天、第+1天、第+2天、第+3天及第+4天)。

根据一具体实施例，雷帕霉素在第-1天以0.3mg/天/公斤理想体重的剂量作用，然后以0.1mg/天/公斤理想体重的一剂量施用体重直至第+4天(例如在未成熟造血细胞移植的第0天、第+1天、第+2天、第+3天及第+4天)。

根据一具体实施例，雷帕霉素及数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞(即否决细胞)的所述组合用于在不存在移植排斥及GVHD的情况下进行造血细胞移植。

根据一具体实施方案，雷帕霉素、数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞(即否决细胞)及辐射(例如TBI或TLI)的所述组合用于在不存在移植排斥及GVHD的情况下进行造血细胞移植。

根据一具体实施例，所述移植方案包括在第-3天至第-1天(例如第-1天)的1-7.5Gy(例如4.5-5Gy TBI)的一单次或分次照射剂量。在第0天施用未成熟造血细胞(例如大剂量T细胞耗尽，例如包含所述受试者的每公斤理想体重的至少约5x10⁶个CD34⁺细胞)。在第0天到第20天施用数个非GVHD诱导抗第三方Tcm细胞(即数个否决细胞)，例如在第0-10天，例如在第+7天(例如，在一剂量至少约为0.5x10⁶个/公斤理想体重，例如在一剂量为2.5-10x10⁶个CD8+细胞/公斤理想体重，例如5x10⁶个CD8+细胞/公斤理想体重)。并且，雷帕霉素在第-4天到第+4天施用约0.1-3mg/天/公斤理想体重的一剂量，例如从第-1天到第+4天(例如在未成熟造血细胞移植的第-1天、第0天、第+1天、第+2天、第+3天及第+4天)。

根据一实施例，所述调节包括体内T细胞减灭。

根据一些实施例，所述体内T细胞减灭受数个抗体影响。

根据一些实施例，在TBI或TLI之前实现所述体内T细胞减灭。

根据本发明的一些实施例，所述数个抗体包括一抗CD8抗体、一抗CD4抗体或两者。

根据本发明的一些实施例，所述数个抗体包括抗胸腺细胞球蛋白(ATG)抗体、抗CD52抗体或抗CD3(OKT3)抗体。

抗胸腺细胞球蛋白(ATG)抗体可购买自例如健赞(Genzyme)及辉瑞(Pfizer)或购自例如在品牌名称Thymoglobulin及Atgam下。

根据一具体实施例，所述受试者在移植前未用ATG治疗。

应当理解，当不使用ATG或使用较低剂量的ATG时，例如单剂或两剂(例如，每剂每公斤理想体重约2毫克)，更高的辐射剂量可用作所述非清髓性调节方案的一部分(例如，TBI的3-5Gy(例如3Gy、4Gy或5Gy)的一单次或分次照射剂量)。

根据一具体实施例，所述受试者被施用环磷酰胺(Cyclophosphamide)。

根据一实施例，所述所述方法包括移植后施用环磷酰胺。

根据一实施例，在移植后1天、2天、3天、4天、5天(即，D+1、+2、+3、+4、+5)向所述受试者施用环磷酰胺。

根据一具体实施例，环磷酰胺在移植后3天及4天以两剂施用于所述受试者。根据一实施例，除了移植后的所述施用之外，本发明还考虑在移植前施用环磷酰胺(例如在移植前的第6天、第5天、第4天或第3天，即D-6至D-3)。

例如，在未成熟造血细胞移植的情况下，环磷酰胺的所述治疗有效量包括所述受试者的每公斤理想体重的约1-25mg、1-50mg、1-75mg、1-100mg、1-250mg、1-500mg、1-750mg、1-1000mg、5-50mg、5-75mg、5-100mg、5-250mg、5-500mg、5-750mg、5-1000mg、10-50mg、10-75mg、10-100mg、10-250mg、10-500mg、10-750mg、10-1000mg、25-50mg、25-75mg、25-100mg、25-125mg、25-200mg、25-300mg、25-400mg、25-500mg、25-750mg、25-1000mg、50-75mg、50-100mg、50-125mg、50-150mg、50-175mg、50-200mg、50-250mg、50-500mg、50-1000mg、75-100mg、75-125mg、75-150mg、75-250mg、75-500mg、75-1000mg、100-125mg、100-150mg、100-200mg、100-300mg、100-400mg、100-500mg、100-1000mg、125-150mg、125-250mg、125-500mg、125-1000mg、150-200mg、150-300mg、150-500mg、150-1000mg、200-300mg、200-400mg、200-500mg、200-750mg、200-1000mg、250-500mg、250-750mg、250-1000mg。

根据一具体实施例，环磷酰胺的治疗有效量为所述受试者的每公斤理想体重的约25-200mg。

根据一实施例，环磷酰胺以单剂量施用。

根据一实施例，环磷酰胺以多剂量施用，例如以多剂量以2剂、3剂、4剂、5剂或更多剂施用。

根据一具体实施例，环磷酰胺以两剂施用。

根据一具体实施例，环磷酰胺不以超过1剂、2剂、3剂、4剂或5剂施用(例如超过1天、2天、3天、4天或5天)。

每次环磷酰胺施用的剂量可以包括所述受试者的每公斤理想体重的约5mg、7.5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg、250mg、260mg、270mg、280mg、290mg、300mg、350mg、400mg、450m或500mg。

根据一具体实施例，环磷酰胺的每个剂量是所述受试者的每公斤理想体重的50mg。

环磷酰胺可购自例如Zydus(德国Remedies)、Roxane Laboratories Inc-Boehringer Ingelheim、Bristol-Myers Squibb Co-Mead Johnson及Co、及Pfizer-Pharmacia&Upjohn，购自例如品牌名称Endoxan、Cytoxan、Neosar、Procytox及Revimmune下。

根据一具体实施例，数个否决细胞在环磷酰胺之后施用(例如，在环磷酰胺之后2-5天)。因此，根据一具体实施例，在第0天施用未成熟造血细胞，在第+3天及+4天施用环磷酰胺，并且在第+7天施用否决细胞。

根据一具体实施例，向所述受试者施用氟达拉滨(Fludarabine)。

根据一实施例，氟达拉滨作用3-10天(例如3天、4天、5天或6天，例如4天)。例如，氟达拉滨可以从第-10天到第-7天施用，例如从第-8天到第-5天，例如从第-6天到第-3天(例如在未成熟造血细胞移植前的第-6天、第-5天、第-4天、第-3天)。

根据一实施例，氟达拉滨施用不超过3天、4天、5天、6天或7天。

根据一具体实施例，移植前(例如在第-6至-3天)连续3天、4天、5天或6天(例如连续4天)，氟达拉滨以约5-100mg/m²/天的一剂量施用，例如30mg/m²/天。

氟达拉滨可购自例如氟达拉例如Sanofi Genzyme、Bayer及Teva，购自例如品牌名称Fludara下。

根据一具体实施例，可以在移植前的第-6天至第-3天每天用氟达拉滨治疗所述受试者(例如以约30mg/m²的剂量)，然后在第-3天到第0天(例如在移植前的第-1天)进行低剂量TBI(例如单次或分次照射剂量为例如1-5Gy，例如3Gy)作为准备方案。在第0天施用(例如通过IV输注)未成熟造血细胞(例如耗尽的大剂量T细胞，例如包含所述受试者的每公斤理想体重的至少约5x10⁶个CD34⁺细胞)。在未成熟造血细胞移植后(例如在第+3天及第+4天，以例如所述受试者的每公斤理想体重的25-100mg的剂量)施用环磷酰胺(Cy)两剂，然后在第+5至第+10天(例如在未成熟造血细胞移植后的第+7天)输注抗第三方Tcm细胞(即否决细胞)，例如剂量为每公斤理想体重的2.5-10x10⁶个CD8⁺细胞(例如，每公斤理想体重的5x10⁶个CD8⁺细胞)。任选地，可以在移植前的第-9天至第-7天每天施用ATG以诱导所述受试者中的T细胞减灭(例如以每公斤理想体重约2mg的剂量)。根据一具体实施例，TBI在T细胞耗尽的未成熟造血细胞移植当天施用，例如在第-1天或第0天的早上，移植在同一天进行，例如在第-1天的晚上。根据一具体实施例，在后续当天(例如在第0天)进行一第二剂T细胞耗尽未成熟造血细胞。

根据一具体实施例，T细胞耗尽未成熟造血细胞包括新鲜细胞。

根据一具体实施例，T细胞耗尽未成熟造血细胞包括先前获得的、在移植当天冷冻保存及解冻的细胞。

根据一实施例，所述受试者用另外的支持性药物治疗，例如化疗辅助剂。

根据一实施例，在第一剂环磷酰胺之前(例如，在施用第一剂环磷酰胺前2小时、前1小时、前30分钟、前15分钟)用一剂的美司钠(Mesna)(例如10mg/公斤静脉内捎带(intravenous piggy back，IVPB))治疗所述受试者。根据一实施例，每4小时重复施用美司钠，共10剂。

美司钠(Mesna)可购自例如品牌名称Uromitexan及Mesnex下的Baxter。

根据一实施例，在每个剂量的环磷酰胺(Cy)之前用昂丹司琼(ondansetron)(或另一种止吐剂)治疗所述受试者。

根据一实施例，不使用一免疫抑制剂(例如，除了雷帕霉素及否决细胞，或环磷酰胺及否决细胞，如本文所讨论的)治疗所述受试者。

根据一具体实施例，所述受试者不接受长期GVHD预防(例如免疫抑制剂)，例如移植后超过7-14天，例如移植后7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。

根据一实施例，用一免疫抑制剂治疗所述受试者。

免疫抑制剂的数个实例包括但不限于Tacrolimus(也称为FK-506或藤霉素，商品名：Prograf、Advagraf、Protopic)、霉酚酸酯(Mycophenolate Mofetil)、霉酚酸钠(Mycophenolate Sodium)、泼尼松(Prednisone)、甲氨蝶呤(methotrexate)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环孢菌素(cyclosporine)、环孢菌素A(cyclosporin A)、氯喹(chloroquine)、羟氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)(柳氮磺吡啶(sulphasalazpyrine))、金盐(gold salts)、D-青霉胺(D-penicillamine)、来氟米特(leflunomide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、阿那白滞素(anakinra)、英夫利昔单抗(infliximab)(REMICADE)、依那西普(etanercept)、TNF.alpha阻滞剂、靶向一炎性细胞因子的一生物制剂、及非甾体抗炎药(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug，NSAIDs)。NSAID的数个实例包括但不限于乙酰水杨酸(acetyl salicylic acid)、胆碱水杨酸镁(choline magnesium salicylate)、二氟尼柳(diflunisal)、水杨酸镁(magnesiumsalicylate)、水杨酸钠(salsalate)、水杨酸钠(sodium salicylate)、双氯芬酸(diclofenac)、依托度酸(etodolac)、非诺洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、消炎痛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、酮咯酸(ketorolac)、甲氯芬酸(meclofenamate)、萘普生(naproxen)、萘丁美酮(nabumetone)、保泰松(phenylbutazone)、吡罗昔康(piroxicam)、舒林酸(sulindac)、托美汀(tolmetin)、对乙酰氨基酚(acetaminophen)、布洛芬(ibuprofen)、Cox-2抑制剂、曲马多(tramadol)。这些药剂可以单独或组合施用。

根据一实施例，皮质类固醇不作为对所述数个否决细胞的预处理的一施用。

预计在专利的有效期内，将开发出许多相关的非清髓性调节剂，并且所述术语非清髓性调节剂的范围旨在包括先验(a priori)的所有这些新技术。

如本文所用所述，术语“约”是指±10％。

所述术语“包括”、“包含”("comprises"、"comprising"、"includes"、"including")、“具有”及其变体意思是“包括但不限于”。

所述术语“由……组成”是指“包括并限于”。

术语“基本上由……组成”是指组合物、方法或结构可以包括额外的成分、步骤及/或部分，但前提是额外的成分、步骤及/或部分不实质上改变所述要求保护的组合物、方法或结构的基本及新颖特征。

如本文所用，所述单数形式“一”及“所述”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，所述术语“一化合物”或“至少一种化合物”可以包括数个化合物，包括它们的混合物。

在整个本申请中，本发明的各种实施例可以一范围格式呈现。应当理解，所述范围格式的描述仅是为了方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制。因此，对一范围的描述应被视为具体公开了所有所述可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，范围如1到6的描述应所述被认为具有具体公开的子范围，如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6。无论所述范围的宽度如何，这都适用。

每当一在本文中指出数值范围时，其意在包括在所指出的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。所述短语“范围/范围之间”第一个表示数字，第二个表示数字，“范围/范围从”第一个表示数字“到”第二个表示数字在本文中可互换使用，旨在包括第一个及第二个指示的数字以及所有所述它们之间的小数及整数。

如本文所用，所述术语“方法”是指用于完成一给定任务的方式、手段、技术及程序，包括但不限于已知或易于开发的那些方式、手段、技术及程序所述化学、药理学、生物、生化及医学领域的从业人员已知的方式、手段、技术及程序。

如本文所用，术语“治疗”包括消除、实质上抑制、减缓或逆转病状的进展，实质上改善病状的临床或美学症状或实质上防止病状的临床或美学症状的出现。

应当理解，本发明的某些特征，为了清楚起见，在所述单独实施例的上下文中描述，也可以在一单一实施例中组合提供。相反地，为了简洁起见，在单一实施例的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合或在任何其他描述的实施例中提供本发明。在各个实施例的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施例的基本特征，除非所述实施例在不具有这些元素的情况下是无效的。

如上文所述及如以下权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施例及方面在以下数个范例中找到实验支持。

数个范例

现在参照以下数个范例，其与所述以上描述一起以一非限制方式叙述本发明。

通常，在此使用的命名法及在本发明中使用的实验室程序包括分子、生化、微生物及重组DNA技术。这些技术在所述文献中得到了详尽的解释。例如，参见“分子克隆：实验室手册Molecular Cloning:a laboratory Manual”Sambrook等人，1989年；“分子生物学中的当前方案Current Protocols in Molecular Biology”第I-III卷，Ausubel,R.M.编辑，1994年；Ausubel等人，“分子生物学中的当前方案Current Protocols in MolecularBiology”，John Wiley及Sons，马里兰州(Maryland)巴尔的摩(Baltimore)，1989年；Perbal，“A分子克隆实用指南Practical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley&Sons，纽约，1988年；Watson等人，“重组DNA Recombinant DNA”，Scientific AmericanBooks，纽约；Birren等人(编辑)“基因组分析：实验室手册系列Genome Analysis:aLaboratory Manual Series”，第1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约，1998年；美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659及5,272,057中规定的方法；“细胞生物学：实验室手册Cell Biology:a Laboratory Handbook”，第I-III卷，Cellis,J.E.编辑，1994年；“目前的免疫学方案Current Protocols in Immunology”卷I-III，Coligan J.E.编辑，1994年；Stites等人编辑，“基础及临床免疫学Basic andClinical Immunology”(第8版)，Appleton&Lange,Norwalk,CT，1994年；Mishell及Shiigi编辑，“细胞免疫学中的选定方法Selected Methods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman及Co.，纽约，1980年；所述专利及科学文献中广泛描述了可用的免疫测定法，参见例如美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771及5,281,521；“寡核苷酸合成Oligonucleotide Synthesis”Gait,M.J.编辑，1984年；“核酸杂交Nucleic Acid Hybridization”Hames,B.D.及Higgins S.J.编辑，1985年；“转录及转译Transcription and Translation”Hames,B.D.及Higgins S.J.编辑，1984年；“动物细胞培养Animal Cell Culture”Freshney,R.I.编辑，1986年；“固定化细胞及酶Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press，1986年；“分子克隆实用指南APractical Guide to Molecular Cloning”Perbal,B.，1984年；及“"酶学方法Methods inEnzymology”第1-317卷，学术出版社；“PCR方案：方法及应用指南PCR Protocols:a GuideTo Methods And Applications”，学术出版社，圣地亚哥，加利福尼亚州，1990年；Marshak等人，“蛋白质纯化及表征策略-实验室课程手册Strategies for Protein Purificationand Characterization-a Laboratory Course Manual”CSHL出版社1996年；所有这些都通过引用并入本文，如同在本文中完全阐述一样。在整个文件中提供了其他一般参考。其中的程序被认为是本领域中众所周知的并提供给读者的方便所有其中包含的信息通过引用并入本文。

一般材料及实验程序

动物

使用的小鼠是以下品系的6至12周龄小鼠：C57BL/6(H-2^b)、FVB(H-2^q)，购自HarlanIsrael(以色列雷霍沃特(Rehovot))。B6裸(Foxn1nu/J,H-2^b)及β-肌动蛋白-GFP(在C57BL/6J背景上)小鼠购自Jackson实验室并在Weizmann研究所动物设施中饲养。NOD/LtJ(H-2K^d/H-2D^b)小鼠在Weizmann研究所动物设施中饲养。所有小鼠都被关在小笼子里，并在Weizmann研究所的机构动物护理及使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee)批准的条件下，在一SPF环境中喂食无菌食物及酸性水。

数个宿主非反应性供体抗第三方否决细胞的制备

如前所述[Ophir E等人，血Blood(2010)115(10):2095-104]。简而言之，将供体小鼠的数个脾细胞在细胞因子剥夺下针对照射过的数个第三方脾细胞培养60小时。随后，使用数个磁性颗粒(BD Pharmingen)阳性选择CD8细胞并在一无Ag环境中培养。rhIL-15(20ng/mL；R&D Systems)每隔一天添加一次。为了获得一纯化的群体，在所述培养结束时(第16天)，数个细胞被阳性选择用于CD62L表达(磁激活细胞分选-

细胞分离，Miltenyi Biotec)及细胞进行FACS分析。

骨髓制备

从B6裸(Foxn1nu/J,H-2^b)小鼠(7-12周龄)收获长骨。通过研磨所述骨头以达到一单细胞悬液来提取骨髓。对骨髓进行计数并使其达到正确浓度，然后通过尾静脉来静脉注射给小鼠。

BM同种异体移植(BM allografting)的简化条件模型

NOD/LtJ(H-2K^d/H-2D^b)雌性小鼠(8周龄)在所述指定剂量(例如4.5Gy)接受亚致死TBI第-1天。在所述次日(例如第0天)，在(25x 10⁶)具有或不具有5x 10⁶个抗第三方否决细胞(C57BL/6(H-2^b)Tcm)。数个宿主还接受皮下注射(第-1至+4天)12.5μ/小鼠/天的雷帕霉素(rapamycin，Rapamune)。移植后，每周评估小鼠的整体外观、体重并取血以测试血糖水平以检测高血糖症。当在两次连续测量中测得的血糖水平高于200mg/dl时定义为疾病。定期(每30天)进行嵌合分析。

嵌合分析

定期进行嵌合分析并通过流式细胞术确定。通过眶后出血收集外周血。在Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia Biotech,AB)上对数个细胞进行分级分离，并通过直接免疫荧光标记的针对供体及宿主表面标志物的抗体对每只小鼠的分离的单核细胞进行双重染色。使用一改良的Becton Dickinson FACSCanto I进行荧光激活细胞分选(FACS)分析。用以下标记的抗体对细胞进行染色：CD8a、CD4、CD3、CD44、CD62L、H2Dd、H2Kb(Biolegend；BD；Miltenyi)。使用FACSDiva 8.0软件及FlowJo v10.2软件分析数据。

流式细胞仪分析

使用一改良的Becton Dickinson FACSCanto I进行荧光激活细胞分选(FACS)分析。用标记的抗体对细胞进行染色：CD3-PE/FITC/APC、CD4-APC/PB、CD8α-PE/FITC/APC/APC-Cy7、CD19-PE/FITC/APC/PE-Cy7、CD62L-PE/FITC/APC、CD44-PE/FITC/APC、CD45-APC-Cy7、CD11b-PeCy7、Ly6G-PB、Ly6C-PerCP、H2K^b-PE/FITC、H2D^d-PE/FITC(BD Pharmigen；Biolegend；Miltenyi)。使用FACSDiva 8.0软件及FlowJo v10.2软件分析数据。

TCR文库制备

从所有实验组的小鼠中采集的数个脾脏经过处理，并使用Ficoll-

Paque PLUS(GE Healthcare Lifescience)通过密度梯度离心分离细胞。此后，根据制造商的说明，使用数个Miltenyi珠(磁激活细胞分选-

Cell Separation,Miltenyi Biotec)进行阳性选择。首先进行CD8

阳性选择，然后从CD8阴性部分进行CD4阳性选择，然后从CD4阴性部分进行CD25阳性选择。按照制造商的说明，分别地裂解分选的细胞群，并将RNA稳定在RLT缓冲液(Qiagen)中。根据所述制造商(Qiagen)的说明，使用一RNeasy提取试剂盒分离RNA，并在-80℃下储存。所述文库制备基于一定量TCR测序协议。所述方法的全部细节先前已发表[Oakes T等人，前免疫Front Immunol.(2017),8:1267]。简而言之，定量来自一T细胞群的高质量总RNA。然后，每个样品用DNase处理，并进行逆转录以产生cDNA。将引物及唯一分子标识符(UMI)连接到所述V恒定区，然后进行PCR扩增。最后，纯化样品并进行测序。

使用管道分析评估数据。

双光子激光扫描显微镜图像采集

NOD小鼠根据上述方案移植B6裸(Foxn1nu/J,H-2^b)BM细胞(25x 10⁶)及5x 10⁶个抗第三方GFP在C57BL/6背景上呈阳性(H-2^b)Tcm。移植后一年处死宿主，收获器官并通过显微镜观察。

使用配有一Coherent Chameleon Vision激光器的一Zeiss LSM 880正置显微镜进行活体成像实验。数个图像是用调到940nm的一飞秒脉冲双光子激光器(femtosecond-pulsed two-photon laser)采集的。所述显微镜配备一个包含565LPXR的滤光片立方体，以将所述发射分离到一PMT检测器(具有一用于tdTomato荧光的579–631-nm滤光片)及所述发射分离到2个GaAsp检测器(具有一用于GFP荧光的500–550-nm滤光片)。所述腘窝LN(popliteal LN)中的GC LZ(由NP-tdTomato标记)或DZ(面对所述副皮质并含有自发荧光巨噬细胞)在820nm处被光激活。数个平铺图像(tile images)以100–200-μmZ-stacks的形式获取，每个Z-平面之间有5-μm的步长。所述变焦设置为1.5，并以512×512x-y分辨率获取图片。

统计分析

使用Kaplan-Meier曲线(对数秩检验)进行生存数据分析。使用所述Student t测试进行均值比较。P值<0.05被认为具有统计学意义。

范例1

在一降低强度调节后使用数个否决Tcm细胞及T细胞耗尽的骨髓移植来治疗T细胞介导的糖尿病

在这项研究中，数个Tcm否决细胞是从C57BL/6供体(H-2^b)获得的脾细胞中产生的，在细胞因子剥夺下，这些脾细胞针对辐照的第三方脾细胞(FVB；H-2^q)培养。在这些条件下，CD8小鼠T细胞针对第三方刺激物的选择性扩增导致旁观者抗宿主T细胞克隆的选择性“忽视死亡”，这些克隆可能介导移植物抗宿主病(GVHD)；在IL-15存在下的进一步培养期间，通过随后扩增抗第三方T克隆来进一步稀释这些细胞。除了导致GVH反应性T细胞的选择性损失之外，这些培养条件还诱导了一种中枢记忆表型，所述表型被证明对体内强大的否决权活性至关重要。

为了评估此一移植用于糖尿病治疗的安全性及有效性，8周龄的NOD(H-2^d)小鼠(在糖尿病发作之前，即在出现糖尿病症状之前)被在第-1天接受4.5Gy TBI调节，然后在第0天接受抗第三方否决Tcm及大剂量裸骨髓(NuBM)(图1)。为了降低所述调节毒性，使用雷帕霉素短期治疗，之前发现在4.5TBI后与否决细胞结合可以诱导嵌合体[Ophir E等人，血Blood(2013)121(7)：1220-1228]。因此，雷帕霉素治疗从第-1天到第+4天受到影响(图1)。对照组未经治疗或接受没有移植的调节。在4个独立的实验中(移植组中的n＝35只NOD小鼠)，在移植后6个月时，在所有移植小鼠中发现了从83.5％到99.6％的高度嵌合体。这些结果在4个独立实验中是一致的。值得注意的是，未实现嵌合体的小鼠由于糖尿病发展而在所述时间点之前死亡(图3A)。

随后，通过FACS分析对所述嵌合的性质进行了更深入的评估，证明了在包括淋巴细胞、骨髓细胞、树突细胞等在内的各种细胞类型中的多谱系嵌合(图3B至图3J)。

在250天的一追踪，所述对照组中72.4％的小鼠未进行任何治疗，而所述调节组(仅接受TBI及雷帕霉素)中有95％的小鼠死于糖尿病，而在完全调节及中药施用移植的小鼠中仅观察到8.5％或11.4％的糖尿病相关死亡率(分别为图2A及图4A)。相比之下，治疗组中的88.5％幸存下来并且没有患上糖尿病(图5)。此外，在所述移植小鼠(图2B及图4B)中未观察到GVHD或其他移植相关死亡率，这有力地证实了这种治疗方式的安全性。

这些结果证明所述非清髓性异基因TD-HSCT在1型糖尿病中的安全性及有效性地一概念证明。

范例2

在移植的NOD小鼠中的否决Tcm持久性

Tcm在接受者NOD小鼠中的存活问题对于评估耐受持久性以及这些否决细胞的未来应用具有重要意义。为此，从GFP小鼠(C57BL背景)产生Tcm否决细胞。根据与图1中描述的相同方案移植细胞(例如，4.5Gy照射，雷帕霉素治疗从第-1天到第+4天，大剂量B6裸骨髓连同第0天的否决细胞。一年后移植，处死小鼠，用双光子激光扫描显微镜评估淋巴器官如图6所示，在三只评估的小鼠中，GFP+Tcm细胞存在于所述脾脏及几种类型的淋巴结中。

范例3

嵌合NOD小鼠预防糖尿病的T细胞库分析支持一基于缺失的机制

因此，进行了T细胞库分析以寻找所述预防糖尿病发展的机制。如图7A所示，比较所述小鼠T细胞受体中的所述可变互补决定区(CDR3)表明所述未处理的年轻小鼠中氨基酸之间的共享水平更高。相比之下，所述处理过的小鼠具有数个序列的一较低共享水平。

所述Vβ使用的评估揭示了CD4及CD8之间的不同使用，正如预期的那样。值得注意的是，治疗小鼠的CD8Vβ使用与所述未治疗小鼠的CD8Vβ使用不同(图7B)。与未处理的小鼠相比，CD4及CD25的Vβ使用量也不同。

接下来，与I型糖尿病相关的已知CDR3序列[Gioia L.等人，科学免疫Sci Immunol(2019)4(38):10；Baker RL等人，糖尿病Diabetes(2018)67(9):1836-1846]在所述当前数据中进行了搜索及评估。如图8所示，在糖尿病发展前后的NOD小鼠中发现了与胰岛素或GAD65相关的序列，代表针对这些成分的T细胞受体。值得注意的是，在所述处理的小鼠中没有发现这些序列，这强烈表明通过所述同种异体骨髓移植方案删除了这些克隆。

范例4

人类治疗方案

为了评估人类矫正T细胞介导的自身免疫疾病的治疗方案，考虑了包括抗胸腺细胞球蛋白(Anti-thymocyte globulin，ATG)、氟达拉滨(Fludarabine，Fu)及低剂量全身照射(TBI)的降低强度调节方案。所述方案还包括大剂量T细胞耗尽的骨髓、移植后的环磷酰胺及否决细胞。

所述治疗方案如下：

第-9天，ATG(胸腺球蛋白)每公斤理想体重的2mg

第-8天，ATG(胸腺球蛋白)每公斤理想体重的2mg

第-7天，ATG(胸腺球蛋白)每公斤理想体重的2mg

第-6天，氟达拉滨30mg/m²

第-5天，氟达拉滨30mg/m²

第-4天，氟达拉滨30mg/m²

第-3天，氟达拉滨30mg/m²

第-2天，休息(不治疗)

第-1天，TBI 3Gy，一单次。

(第-1天，任选在TBI后6-16小时首次输注大剂量T细胞耗尽的未成熟造血细胞)

第0天，大剂量T细胞输注耗尽未成熟造血细胞

(即所述受试者的每公斤理想体重至少注射5x10⁶个CD34⁺细胞，一次或两次输注)

第+3天，环磷酰胺(CY)50mg/公斤理想体重/天，IV

第+4天，环磷酰胺(CY)50mg/公斤理想体重/天，IV

第+7天，以每公斤理想体重的5x10⁶个至10x10⁶个CD8⁺细胞的剂量输注抗第三方Tcm细胞(即否决细胞)。

尽管本发明已经结合其特定实施例进行了描述，但很明显许多替代、修改及变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，旨在涵盖所有落入所述所附权利要求的精神及广泛范围内的替代、修改及变化。

本说明书中提及的所有出版物、专利案及专利申请案在此通过说明书整体并入，如同每个单独的出版物、专利案或专利申请案被具体地及单独地表示出被并入的程度相同在此通过参考。此外，本申请中任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认此类参考文献可用作本发明的现有技术。对于章节标题的延伸，它们不应被解释为必然限制。此外，本申请的任何优先权文件在此通过引用的方式整体并入本文。

序列表

<110> 耶达研究及发展有限公司(Yeda Research and Development Co. Ltd.)

亚尔·赖斯纳(REISNER, Yair)

拉克菲特·西德利克·莫斯卡特(SIDLIK MUSKATEL, Rakefet)

巴尔·纳桑松-利维(NATHANSOHN-LEVI, Bar)

<120> 在数个T细胞介导的自身免疫性疾病的治疗中的数个否决细胞的用途

<130> 84571

<150> US 62/930,621

<151> 2019-11-05

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 β氨基酸序列

<400> 1

Cys Ala Ser Ser Gln Gly Gly Thr Thr Asn Ser Asp Tyr Thr Phe

1 5 10 15

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 β氨基酸序列

<400> 2

Cys Ala Ser Ser Arg Asp Thr Asn Ser Asp Tyr Thr Phe

1 5 10

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 β氨基酸序列

<400> 3

Cys Ala Ser Ser Gln Arg Gly Ala Asn Thr Glu Val Phe Phe

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 β氨基酸序列

<400> 4

Cys Ala Ser Ser Ile Arg Gly Thr Glu Val Phe Phe

1 5 10

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 β氨基酸序列

<400> 5

Cys Ala Ser Ser Gln Asp Thr Asn Thr Gly Gln Leu Tyr Phe

1 5 10

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 β氨基酸序列

<400> 6

Cys Ala Ser Ser Thr Gly Gly Asp Thr Gln Tyr Phe

1 5 10

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 β氨基酸序列

<400> 7

Cys Ala Ser Ser Leu Leu Gly Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe

1 5 10

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 β氨基酸序列

<400> 8

Cys Ala Ser Ser Ile Arg Gly Thr Glu Val Phe Phe

1 5 10

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 β氨基酸序列

<400> 9

Cys Ala Ser Ser Thr Gly Gly Asp Thr Gln Tyr Phe

1 5 10

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 β氨基酸序列

<400> 10

Cys Ala Ser Ser Gln Gly Gly Thr Thr Asn Ser Asp Tyr Thr Phe

1 5 10 15

<210> 11

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR3 β氨基酸序列

<400> 11

Cys Ala Ser Ser Gln Asp Thr Asn Thr Gly Gln Leu Tyr Phe

1 5 10

Claims (60)

1.一种在有需要的一受试者中治疗或预防一T细胞介导的自身免疫疾病的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)将数个未成熟造血细胞移植到所述受试者体内；及

(b)向所述受试者施用一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结，从而治疗所述受试者的所述T细胞介导的自身免疫疾病。

2.一种未成熟造血细胞移植及一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结，用于治疗或预防有需要的一受试者的一T细胞介导的自身免疫疾病。

3.如权利要求1所述的方法、或如权利要求2所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群与所述未成熟造血细胞移植共同施用。

4.如权利要求1所述的方法、或如权利要求2所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群是用于所述未成熟造血细胞移植后的施用。

5.如权利要求1或4中任一项所述的方法、或如权利要求2或4中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群在所述未成熟造血细胞移植后的第1至20天施用。

6.如权利要求1或3至5中任一项所述的方法、或如权利要求2至5中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群以每公斤理想体重的至少0.5x10⁶个CD8⁺细胞的一剂量施用。

7.如权利要求1或3至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群用于减少移植排斥及/或诱导供体特异性耐受。

8.如权利要求2至6中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群用作减少移植排斥及/或诱导供体特异性耐受的一辅助治疗。

9.如权利要求1或3至7中任一项所述的方法、或如权利要求2至6或8中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群通过一方法产生，所述方法包括：

(a)将数个外周血单核细胞与在缺乏数个细胞因子的一培养物中的一或数个第三方抗原接触，以允许数个抗原反应性细胞的富集；及

(b)在所述数个细胞因子存在下培养由步骤(a)产生的所述数个细胞，以允许包含所述中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞的增殖，从而产生所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞。

10.如权利要求9所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，进一步包括在与一或数个第三方抗原接触之前从所述数个外周血单核细胞中耗尽了CD4+及/或CD56+表达细胞。

11.如权利要求9至10中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，进一步包括选择数个CD45RA⁺表达细胞，以获得表达一CD45RA⁺CD8⁺表型的数个初始T细胞的一族群。

12.如权利要求9至10中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，进一步包括耗尽数个CD45RA⁺表达细胞，以获得富含表达一CD45RA^-CD8⁺表型的数个记忆T细胞的一族群。

13.如权利要求9至12中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，步骤(a)中与所述一或数个抗原接触的所述步骤是在IL-21的存在下实现。

14.如权利要求9至13中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，在数个细胞因子存在下培养由步骤(a)产生的所述数个细胞的所述步骤包括在IL-15存在下培养所述数个细胞。

15.如权利要求9至14中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，在数个细胞因子存在下培养由步骤(a)产生的所述数个细胞的所述步骤包括在IL-21、IL-15及/或IL-7存在下培养所述数个细胞。

16.如权利要求9至15中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述一或数个抗原选自由一病毒抗原、一细菌抗原、一肿瘤抗原、一自身免疫性疾病相关抗原、一蛋白质提取物、一纯化蛋白质及一合成肽所组成的群组。

17.如权利要求9至16中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述一或数个抗原由数个自体抗原呈现细胞、数个非自体抗原呈现细胞、数个人工载体或数个人工抗原呈现细胞所呈现。

18.如权利要求9至17中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述一或数个抗原由与所述数个外周血单核细胞相同来源的数个抗原呈现细胞所呈现。

19.如权利要求9至18中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述一或数个抗原包括数个刺激细胞，所述数个刺激细胞选自由从数个外周血淋巴细胞、脾脏或数个淋巴结中纯化的数个细胞、细胞因子动员的数个PBL、体外扩增的数个抗原呈现细胞、体外扩增的数个树突状细胞及数个人工抗原呈递细胞所组成的群组。

20.如权利要求9至19中任一项所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，进一步包括选择CD3⁺、CD8⁺、CD62L⁺、CD45RA^-、CD45RO⁺特征。

21.如权利要求1、3至7或9至20中任一项所述的方法、或如权利要求2至6或8至20中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个未成熟造血细胞包括数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞。

22.如权利要求1、3至7或9至21中任一项所述的方法、或如权利要求2至6或8至21中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的至少5×10⁶个CD34⁺细胞。

23.如权利要求1、3至7或9至22中任一项所述的方法、或如权利要求2至6或8至22中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个未成熟造血细胞耗尽了数个CD3⁺及/或CD19⁺表达细胞。

24.如权利要求1、3至7或9至23中任一项所述的方法、或如权利要求2至6或8至23中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个未成熟造血细胞包含小于所述受试者的每公斤理想体重的5×10⁵个CD3⁺表达细胞。

25.如权利要求1、3至7或9至24中任一项所述的方法、或如权利要求2至6或8至24中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个未成熟造血细胞移植与所述受试者是非同源的。

26.如权利要求1、3至7或9至25中任一项所述的方法、或如权利要求2至6或8至25中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述数个未成熟造血细胞移植及所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群从相同供体获得。

27.如权利要求1、3至7或9至26中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在非清髓性调节下调节所述受试者。

28.如权利要求2至6或8至26中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，进一步包括一非清髓性调节。

29.如权利要求27所述的方法、或如权利要求28所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述非清髓性调节包括全身照射、一局部身体照射、一化疗剂、一抗体免疫疗法或一共刺激阻断中的至少一者。

30.如权利要求29所述的方法、或如权利要求所述29的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述全身照射包括在1-6Gy的范围内的一照射剂量。

31.如权利要求29至30中任一项所述的方法、或如权利要求29至30中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述全身照射用于在所述移植的第-3天至第0天中的任何一天施用。

32.如权利要求29至31中任一项所述的方法、或如权利要求29至31中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述全身照射用于在所述移植前的一天或两天施用。

33.如权利要求29至32任一项所述的方法、或如权利要求29至32任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述化疗剂包括依维莫司、氟达拉滨、环磷酰胺、白消安、三磺胺、美法仑或噻替帕中的至少一者。

34.如权利要求1、3至7、9至27或29至33中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括向所述受试者施用一治疗有效量的雷帕霉素。

35.如权利要求2至6、8至26或28至33中任一项所述的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，进一步包含一治疗有效量的雷帕霉素。

36.如权利要求34所述的方法、或如权利要求35所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述治疗有效量的雷帕霉素包括所述受试者的每公斤理想体重的每天至少0.1mg雷帕霉素。

37.如权利要求34或36中任一项所述的方法、或如权利要求35至36中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述雷帕霉素用于在所述移植的第-1至+4天向所述受试者施用。

38.如权利要求27或29至33中任一项所述的方法、或如权利要求28至33中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述非清髓性调节包括T细胞减灭。

39.如权利要求38所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述T细胞减灭由数个抗胸腺细胞球蛋白抗体、数个抗CD52抗体或数个抗CD3抗体中的至少一者实现。

40.如权利要求27、29至33或38至39中任一项所述的方法、或如权利要求28至33或38至39中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述非清髓性调节包括一治疗有效量的氟达拉滨。

41.如权利要求1、3至7、9至27、29至33或38至40中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括向所述受试者施用一治疗有效量的环磷酰胺。

42.如权利要求2至6、8至26、28至33或38至40中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，进一步包括一治疗有效量的环磷酰胺。

43.如权利要求41所述的方法、或如权利要求42所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述治疗有效量的环磷酰胺包括所述受试者的每公斤理想体重的25-200mg。

44.如权利要求41或43所述的方法、或如权利要求42至43中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群的用途，其特征在于，所述环磷酰胺用于在所述移植的第+3天及第+4天向所述受试者施用。

45.如权利要求1、3至7或9至27中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)在非清髓性调节下调节所述受试者，其中所述非清髓性调节包括一全身照射及一免疫抑制剂，其中所述全身照射及所述免疫抑制剂在移植的第-4至+4天施用；

(b)将一剂的数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞移植到所述受试者，其中所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的至少5×10⁶个CD34⁺细胞；及

(c)向所述受试者施用一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结。

46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)及步骤(c)同时进行。

47.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群在所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞移植后的第1-20天施用。

48.如权利要求45至47中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫抑制剂包括雷帕霉素，并且其中所述雷帕霉素在所述移植的第-1至+4天施用。

49.如权利要求45至48中任一项所述的方法，其特征在于，所述全身照射在所述移植的第-1天施用。

50.如权利要求1、3至7或9至27中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)在非清髓性调节下调节所述受试者，其中所述非清髓性调理包括一全身照射及一化疗剂，其中所述全身照射及所述化疗剂在移植的第-6天到第0天施用；

(b)将一剂的数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞移植到所述受试者，其中所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞包含所述受试者的每公斤理想体重的至少5×10⁶个CD34⁺细胞；

(c)向所述受试者施用一治疗有效量的环磷酰胺，其中所述治疗有效量的所述环磷酰胺包括所述受试者的每公斤理想体重的25-200mg环磷酰胺，并且其中所述治疗有效量的环磷酰胺用于在所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞移植后的第+3天及+4天以两剂施用于所述受试者；及

(d)向所述受试者施用一治疗有效量的数个非GVHD诱导抗第三方细胞的一分离族群，所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群包括具有一中枢记忆T淋巴细胞表型的数个细胞，所述数个细胞是数个耐受诱导细胞并且能够在移植后归巢至所述数个淋巴结，其中所述数个非GVHD诱导抗第三方细胞的分离族群在所述数个T细胞耗尽的未成熟造血细胞的所述移植后的第+5至+10天施用。

51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述化疗剂包括氟达拉滨，并且其中所述氟达拉滨在所述移植前的第-6天至第-3天施用。

52.如权利要求50至51中任一项所述的方法，其特征在于，所述全身照射在所述移植前的第-1天施用。

53.如权利要求50至52中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括在步骤(a)之前的T细胞减灭。

54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述T细胞减灭通过在所述移植前的第-9至-7天施用的抗胸腺细胞球蛋白来实现。

55.如权利要求1、3至7、9至27、29至34、36至41或43至54中任一项所述的方法、或如权利要求2至6、8至26、28至33、35至40或42至44中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三抗体的分离族群的用途，其特征在于，所述T细胞介导的自身免疫性疾病选自由1型糖尿病、桥本氏甲状腺炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、非感染性葡萄膜炎、红斑狼疮、干燥综合征、原发性胆道肝硬化、自身免疫性肝炎、免疫性血小板紫癜、慢性肾小球肾炎、重症肌无力、系统性硬皮病、多发性肌炎及艾迪生病所组成的群组。

56.如权利要求55所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三抗体的分离族群的用途，其特征在于，当所述T细胞介导的自身免疫性疾病是1型糖尿病时，所述移植进一步包括一胰腺细胞或组织移植。

57.如权利要求56所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三抗体的分离族群的用途，其特征在于，所述胰腺细胞或组织移植来自与所述未成熟造血细胞及/或所述数个非GVHD诱导抗第三抗体的分离族群相同的供体。

58.如权利要求55所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三抗体的分离族群的用途，其特征在于，当所述T细胞介导的自身免疫病是一原发性胆汁性肝硬化或一自身免疫性肝炎时，所述移植进一步包括一肝细胞或组织移植。

59.如权利要求58所述的方法或未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三抗体的分离族群的用途，其特征在于，所述肝细胞或组织移植来自与所述未成熟造血细胞及/或所述数个非GVHD诱导抗第三抗体的分离族群相同的供体。

60.如权利要求1、3至7、9至27、29至34、36至41或43至59中任一项所述的方法、或如权利要求2至6、8至26、28至33、35至40、42至44或55至59中任一项所述的未成熟造血细胞移植及数个非GVHD诱导抗第三抗体的分离族群的用途，其特征在于，所述受试者是一人类受试者。

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