CZ305380B6 - Léčivo pro inhibici rejekce transplantovaných buněk ostrůvků slinivky břišní - Google Patents

Léčivo pro inhibici rejekce transplantovaných buněk ostrůvků slinivky břišní Download PDF

Info

Publication number
CZ305380B6
CZ305380B6 CZ2003-3188A CZ20033188A CZ305380B6 CZ 305380 B6 CZ305380 B6 CZ 305380B6 CZ 20033188 A CZ20033188 A CZ 20033188A CZ 305380 B6 CZ305380 B6 CZ 305380B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
ctla4
soluble
cells
atcc
antibodies
Prior art date
Application number
CZ2003-3188A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20033188A3 (cs
Inventor
Christian P. Larsen
Thomas C. Pearson
Andrew B. Adams
Original Assignee
Bristol-Myers Squibb Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol-Myers Squibb Company filed Critical Bristol-Myers Squibb Company
Publication of CZ20033188A3 publication Critical patent/CZ20033188A3/cs
Publication of CZ305380B6 publication Critical patent/CZ305380B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/12—Keratolytics, e.g. wart or anti-corn preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)

Abstract

Je popsáno použití rozpustné CTLA4 mutantní molekuly pro výrobu léčiva pro inhibici rejekce transplantovaných buněk ostrůvků slinivky břišní, kde mutovaná extracelulární doména CTLA4 má aminokyselinovou sekvenci začínající methioninem a končící kyselinou asparagovou nebo začínající alaninem a končící kyselinou asparagovou, jak je vysvětleno v popise a znázorněno na některých obrázcích. Popsané řešení nachází použití při léčbě diabetu, jako je diabetes typu I a II. Jedním příkladem solubilní CTLA4 mutantní molekuly je L104EA29YIg.

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká použití rozpustné CTLA4 mutantní molekuly pro výrobu léčiva pro inhibici rejekce transplantovaných buněk ostrůvků slinivky břišní.
Dosavadní stav techniky
Transplantace orgánů se ukazuje jako výhodná metoda pro léčbu mnoha forem život ohrožujících onemocnění, při kterých dochází k orgánovým selháním. Lepší výsledky v klinických transplantacích jsou dosaženy primárně díky vývoji účinnějších nespecifických imunosupresivních léků pro inhalaci rejekcí (Lancet, 345, 1321 až 1325 (1995)). Ačkoliv došlo ke zlepšení krátkodobých výsledků, dlouhodobé výsledky jsou stále neuspokojivé. V současnosti je nutno pro zabránění chronické rejekci transplantovaných orgánů podávat dlouhodobě imunosupresivní přípravky a tyto přípravky dramaticky zvyšují rizika kardiovaskulárních onemocnění, infekcí a malignit.
Vývoj strategii pro navození přijetí allogenních tkání bez potřeby chronické imunosuprese může nejen redukovat rizika těchto život ohrožujících komplikací, ale také má značně rozšířit aplikaci orgánových, tkáňových nebo buněčných transplantací na onemocnění, jako jsou hemoglobinopatie, genetické imunodeficience a autoimunitní onemocnění.
Inzulin-dependentní diabetes mellitus (1DDM) je jedním z nejběžnějších metabolických onemocnění na světě. V USA postihuje IDDM přibližně jednoho z 300 až 400 obyvatel a epidemiologické studie naznačují, že incidence IDDM trvale stoupá. IDDM je způsobem autoimunitní reakcí, která vede k T-lymfocyty zprostředkované destrukci buněk ostrůvků slinivky břišní, které produkují inzulín.
Jakmile jsou klinické příznaky IDDM zjevné, tak je nejběžněji používanou terapií pro ovlivnění příznaků IDDM exogenní podávání inzulínu. Ačkoliv inzulínová substituční terapie umožňuje většině pacientů s IDDM vést téměř normální život, není u pacientů podrobujících se této léčbě zcela obnovena normální homeostasa a v důsledku toho jsou časté závažné komplikace, včetně dysfunkce očí, ledvin, srdce a jiných orgánů.
Dlouhodobou léčbou pro pacienty s IDDM je transplantace ostrůvků slinivky břišní. Nicméně, transplantované buňky ostrůvků slinivky břišní produkující inzulín jsou často rychle destruovány stejnými autoimunitními mechanismy, které předtím destruovaly vlastní buňky pankreatických ostrůvků pacienta. Z 260 allotransplantátů transplantovaných od roku 1990 vedlo pouze 12,4 % k nezávislosti na inzulínu po dobu delší než jeden týden a pouze 8,25 % pacientů bylo nezávislých na inzulínu po dobu delší než jeden rok (Linsley a kol., Diabetes 46, 1120 až 1123 (1997)). U většiny těchto procedur se základní imunosupresivní režim skládal z indukce protilátek pomocí anti-lymfocytámího globulinu v kombinaci s cyklosporinem, azathiprinem a glukokortikoidy.
Pro jakoukoliv transplantační proceduru je klíčovým faktorem pro její přijatelnost poměr mezi účinností a toxicitou. S ohledem na transplantaci ostrůvků slinivky břišní je dalším faktorem, který musí být brán v úvahu, to, že mnoho ze současných imunosupresivních činidel, například glukokortikoidy nebo inhibitor kalcineurinu, například tarcolimus, poškozují beta buňky nebo indukují periferní resistenci na inzulín (Zeng a kol., Surgery 113, 98 až 102 (1993)).
Imunosupresivní protokol bez steroidů („Edmonton protokol“), který zahrnuje sirolimus, nízké dávky tarcolimu a monoklonální protilátku (mAb) proti IL—2 receptoru byl použit v mnoha klinických studiích zkoumajících transplantace ostrůvků slinivky břišní samotné pro pacienty s diabetem typu 1 (Shapiro, A. M. J. a kol., N. Eng. J. Med. 343, 230 až 238 (2000)).
- 1 CZ 305380 B6
Nedávné úspěchy s „Edmonton protokolem“ obnovily nadšení pro použití transplantace ostrůvků slinivky břišní při léčbě diabetů. Nicméně, obavy z toxicity tarcolimu mohou limitovat použití této terapie u člověka. Biologická činidla, která blokují klíčové kostimulační signály pro Tlymfocyty, konkrétně CD28 dráhu, jsou potenciálními alternativami pro chránění allogenních ostrůvků slinivky břišní. Příklady činidel, která blokují CD28 dráhu, jsou například solubilní CTLA4 molekuly, včetně mutantních CTLA4 molekul.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je použití rozpustné CTLA4 mutantní molekuly pro výrobu léčiva pro inhibici rejekce transplantovaných buněk ostrůvků slinivky břišní, kde mutovaná extracelulámí doména CTLA4 má
a) aminokyselinovou sekvenci začínající methioninem v pozici +1 a končící kyselinou asparagovou v pozici +124, jakje znázorněno na obr. 3, nebo začínající alaninem v pozici -1 a končící kyselinou asparagovou v pozici +124, jak je znázorněno na obr. 3,
b) aminokyselinovou sekvenci začínající methioninem v pozici +1 a končící kyselinou asparagovou v pozici +124, jakje znázorněno na obr. 19, nebo začínající alaninem v pozici -1 a končící kyselinou asparagovou v pozici +124, jakje znázorněno na obr. 19,
c) aminokyselinovou sekvenci začínající methioninem v pozici 27 a končící kyselinou asparagovou v pozici 150, jakje znázorněno na obr. 20, nebo začínající alaninem v pozici 26 a končící kyselinou asparagovou v pozici 150, jakje znázorněno na obr. 20,
d) aminokyselinovou sekvenci začínající methioninem v pozici 27 a končící kyselinou asparagovou v pozici 150, jakje znázorněno na obr. 21, nebo začínající alaninem v pozici 26 a končící kyselinou asparagovou v pozici 150, jakje znázorněno na obr. 21, nebo
e) aminokyselinovou sekvenci začínající methioninem v pozici 27 a končící kyselinou asparagovou v pozici 150, jak je znázorněno na obr. 22, nebo začínající alaninem v pozici 26 a končící kyselinou asparagovou v pozici 150, jak je znázorněno na obr. 22.
Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití, při kterém transplantace ostrůvků slinivky břišní je pro léčbu diabetes.
Ještě výhodnější provedení tohoto vynálezu spočívá v použití, při kterém diabetem je diabetes typu 1 nebo diabetes typu 2.
Výhodné provedení jakéhokoliv z předcházejících použití spočívá v tom, že buňky transplantátu slinivky břišní zahrnují enkapsulované buňky slinivky břišní.
Výhodné provedení jakéhokoliv z předcházejících použití spočívá v tom, že transplantace buněk ostrůvků slinivky břišní se dosahuje před, během a/nebo poté co jsou přítomny rozpustné CTLA4 mutantní molekuly.
Výhodné provedení jakéhokoliv z předcházejících použití spočívá vtom, že rozpustná CTLA4 mutantní molekula se váže na CD80 a/nebo CD86 molekulu na CD80 a/nebo CD86-pozitivních buňkách.
Výhodné provedení jakéhokoliv z předcházejících použití spočívá v tom, že rozpustná mutantní CTLA4 mutantní molekula obsahuje mutovanou extracelulámí doménu CTLA4, které se váže na CD80 a/nebo CD86 molekulu na CD80 a/nebo CD86-pozitivních buňkách.
-2CZ 305380 B6
Jiné výhodné provedení vynálezu spočívá v použití popsaném jako první provedení pod nadpisem „podstata vynálezu“ nebo v předchozím odstavci, kde extracelulámí doména je fúzovaná k non-CTLA4 části.
Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití uvedeném v předchozím odstavci, kde non-CTLA4 skupina zahrnuje imunoglobulinovou část.
Jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití uvedeném v předchozím odstavci, kde imunoglobulinovou částí je konstantní region imunoglobulinu nebo jeho část.
Jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití uvedeném v předchozím odstavci, kde konstantní region imunoglobulinu nebo jeho část obsahuje jednu nebo více mutací pro snížení efektorové funkce.
Jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití uvedeném v některém ze dvou předchozích odstavců, kde konstantní region imunoglobulinu obsahuje pant, CH2 a CH3 region imunoglobulinové molekuly.
Jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití uvedeném v kterémkoli ze tří předchozích odstavců, kde konstantním regionem imunoglobulinu nebo jeho částí je lidský nebo opičí konstantní region imunoglobulinu.
Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v kterémkoli z použití uvedených výše, kde rozpustnou CTLA4 mutantní molekulou je:
a) L104EA29YIg, znázorněný na obr. 3, začínající Ala v pozici -1 nebo Met v pozici +1 a končící Lys v pozici +357,
b) L104EIg, znázorněný na obr. 19, začínající Ala v pozici -1 nebo Met v pozici +1 a končící Lys v pozici +357,
c) L104EA29LIg, znázorněný na obr. 20, začínající Ala v pozici 26 nebo Met v pozici 27 a končící Lys v pozici 383,
d) L104EA29TIg, znázorněný na obr. 21, začínající Ala v pozici 26 nebo Met v pozici 27 a končící Lys v pozici 383, nebo
e) L104EA29WIg, znázorněný na obr. 22, začínající Ala v pozici 26 nebo Met v pozici 27 a končící Lys v pozici 383.
Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v kterémkoli z použití uvedených výše, kde rozpustná CTLA4 mutantní molekula je v kombinaci s alespoň jednou další sloučeninou, která je vybrána ze souboru obsahujícího imunosupresivní sloučeniny, imunomodulační sloučeniny a protizánětlivé sloučeniny.
Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití, uvedeném v předchozím odstavci, kde sloučenina je zvolena ze souboru obsahujícího anakinru, adrenokortikosteroidy, azathioprin, basiliximab, inhibitory kalcineurinu, chlorochin, kortikosteroidy, cyklosporin, prednison, cyklofosfamid, cytoxan, 15-deoxyspergualin ajeho analogy, D-penicilamin, etanercept, glatiramer-acetát, FTY720 a jeho analogy, glukokortikoidy, soli zlata, koňský anti-lidský thymocytámí globulin, humanizovanou anti-TAC, hydrochlorochin, infliximab, interferon, beta-la, interferon beta-lb, leflunomid ajeho analogy, lymfocytámí imunitní globulin, činidlo pro infiltraci lymfocytů, methoxsalen, methotrexát, hydrochlorid mitoxantronu, kyselinu mykofenolovou, mykofenolátmofetil, mizoribin, NSAIDs, králičí anti-lidský thymocytámí globulin, Rho (D) imunní globulin, sirolimus nebo rapamycin ajejich deriváty, jako je 40-0-(2-hydroxy)ethyl-rapamycin), sulfasal-3CZ 305380 B6 azopyrin, sulfazalin, tarcolimus, thalidomid, TNF a blokátory a biologická činidla, která jsou namířena proti zánětlivým cytokinům, TOR inhibitory, sloučeniny, které interferují sCD40 a CD154, solubilní gp39, solubilní CD29, solubilní CD40, solubilní CD80, jako je ATCC 68627, solubilní CD86, solubilní CD28, solubilní CD56, solubilní Thy-I, solubilní CD3, solubilní TCR, solubilní VFA-4, solubilní VCAM-1, solubilní LECAM-1, solubilní ELAM-1, solubilní CD44, protilátky reaktivní s gp39, jako jsou ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 a ATCC HB-9110, protilátky reaktivní s B7, jako jsou ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341, protilátky reaktivní s CD28, jako je ATCC HB-1944 nebo mAb 9.3, protilátky reaktivní s LFA-1, jako jsou ATCC HB-9579 a ATCC TIB-213, protilátky reaktivní s LFA-2, protilátky reaktivní s IL-2, protilátky reaktivní sIL-12, protilátky reaktivní s IL-2, protilátky reaktivní s IL—12, protilátky reaktivní s IFN-gamma, protilátky reaktivní s CD2, protilátky reaktivní s CD48, protilátky reaktivní s jakoukoliv ICAM, jako jsou ICAM-1, například ATCC CRL-2252, ICAM-2 a ICAM-3, protilátky reaktivní s CTLA4, jako je ATCC HB-304, protilátky reaktivní sThy-1, protilátky reaktivní s CD56, protilátky reaktivní s CD3, protilátky reaktivní s CD29, protilátky reaktivní s TCR, protilátky reaktivní s VLAX, protilátky reaktivní s VCAM-1, protilátky reaktivní s LECAM-1, protilátky reaktivní s ELAM-1, protilátky reaktivní s CD44, monoklonální protilátky k leukocytámím receptorům, například MHC, CD2, CD3, CD4, CDIIa/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150, 0X40, 4-1BB nebo jejich ligandy, CTLA4/CD28-Ig, LFA-1 antagonisty, antagonisty selektinu a VLA-4 antagonisty a proti-lidský IL-2 R mAbs.
Jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití uvedeném v některém ze dvou předchozích odstavců, kde rozpustná CTLA4 mutantní molekula a další sloučenina účinkují společně, resp. kde rozpustná CTLA4 mutantní molekula a další sloučenina účinkují souběžně nebo postupně.
Jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití uvedeném v některém z prvních čtrnácti řešení, kde inhibice rejekce transplantovaných buněk ostrůvků slinivky břišní je dosahováno doplňkovým imunosupresivním režimem.
Jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití uvedeném v předchozím odstavci, kde doplňkový imunosupresivní režim je prostý glukokortikoidu, resp. kde doplňkový imunosupresivní režim zahrnuje kortikosteroid.
Jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití uvedeném v některém ze dvou předchozích odstavců, kde doplňkový imunosupresivní režim je prostý inhibitoru kalcineurinu.
Jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití uvedeném v některém ze dvou předchozích odstavců, kde doplňkový imunosupresivní režim obsahuje jednu nebo více sloučenin, kde sloučenina je zvolena ze souboru obsahujícího anakinru, adrenokortikosteroidy, azathioprin, basiliximab, inhibitory kalcineurinu, chlorochin, kortikosteroidy, cyklosporin, prednison, cyklofosfamid, cytoxan, 15-deoxyspergualin a jeho analogy, D-penicilamin, etanercept, glatirameracetát, FTY720 a jeho analogy, glukokortikoidy, soli zlata, koňský anti-lidský thymocytámí globulin, humanizovanou anti-TAC, hydrochlorochin, infliximab, interferon, beta-la, interferon beta-lb, leflunomid a jeho analogy, lymfocytámí imunitní globulin, činidlo pro infiltraci lymfocytů, methoxsalen, methotrexát, hydrochlorid mitoxantronu, kyselinu mykofenolovou, mykokfenolát-mofetil, mizoribin, NSAIDs, králičí anti-lidský thymocytámí globulin, Rho (D) imunní globulin, sirolimus nebo rapamycin ajejich deriváty, jako je 40-0-(2-hydroxy)ethyl-rapamycin), sulfasalazopyrin, sulfazalin, tarcolimus, thalidomid, TNF a blokátory a biologická činidla, která jsou namířena proti zánětlivým cytokinům, TOR inhibitory, sloučeniny, které interferují s CD40 a CD154, solubilní gp39, solubilní CD29, solubilní CD40, solubilní CD80, jako je ATCC 68627, solubilní CD86, solubilní CD28, solubilní CD56, solubilní Thy-I, solubilní CD3, solubilní TCR, solubilní VLA-4, solubilní VCAM-1, solubilní LECAM-1, solubilní ELAM-1, solubilní CD44, protilátky reaktivní s gp39, jako jsou ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 a ATCC HB-12056, protilátky reaktivní s CD40, jako je ATCC HB-9110, protilátky reaktivní s B7, jako je ATCC
-4CZ 305380 B6
HB-253 ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341, protilátky reaktivní s CD28, jako je ATCC HB-1944 nebo mAb 9.3, protilátky reaktivní s LFA-1, jako jsou ATCC HB-9579 a ATCC TIB-213, protilátky reaktivní sLFA-2, protilátky reaktivní s IL-2, protilátky reaktivní s IL-12, protilátky reaktivní s IFN-gamma, protilátky reaktivní s CD2, protilátky reaktivní s CD48, protilátky reaktivní s jakoukoliv ICAM, jako jsou ICAM-1, například ATCC CRL-2252, ICAM-2 a ICAM-3, protilátky reaktivní s CTLA4, jako je ATCC HB-304, protilátky reaktivní sThy-1, protilátky reaktivní s CD56, protilátky reaktivní s CD3, protilátky reaktivní s CD29, protilátky reaktivní s TCR, protilátky reaktivní s VLA-4, protilátky reaktivní s VCAM-1, protilátky reaktivní s LECAM-1, protilátky reaktivní s ELAM-1, protilátky reaktivní s CD44, monoklonální protilátky k leukocytámím receptorům, například MHC, CD2, CD3, CD4, CDIIa/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137,1COS, CD150, 0X40, 4-1BB nebo jejich ligandy, CTLA4/CD28-Ig, LFA-1 antagonisty, antagonisty selektinu a VLA4 antagonisty a proti-lidský IL-2 R mAbs.
Jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití uvedeném v některém ze čtyř předchozích odstavců, kde doplňkový imunosupresivní režim obsahuje TOR inhibitor a/nebo biologické činidlo, které je namířeno proti IL-2.
Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití uvedeném v předchozím odstavci, kde TOR inhibitorem je rapamycin neboli sirolimus nebo jeho derivát, resp. kde biologickým činidlem, které je namířeno proti IL-2, je protilátka reaktivní s IL-2 nebo anti-lidský IL-2R mAb.
Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití uvedeném posledně, kde anti-lidským IL2R mAb je basiliximab.
Jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití uvedeném v posledních devíti případech, kde doplňkový imunosupresivní režim obsahuje kyselinu mykofenolovou nebo mykofenolát-mofetil.
Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití rozpustné CTLA4 mutantní molekuly a další sloučeniny, které účinkují souběžně nebo postupně, kde doplňkový imunosupresivní režim obsahuje sloučeninu, která interferuje s vázáním CD40 na CD 154.
Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití uvedeném předchozím odstavci, kde sloučeninou, která interferuje s vázáním CD40 na CD 154, je anti-CD40 protilátky, resp. kde sloučeninou, která interferuje s vázáním CD40 na CD154, je anti-CD154 protilátka.
Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití uvedeném v kterémkoli z předchozích odstavců, kde inhibice rejekce transplantovaných buněk ostrůvků slinivky břišní se dosahuje přítomností buněk kostní dřeně zbavené T-lymfocytů.
Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití uvedeném předchozím odstavci, kde buňky kostní dřeně zbavené T-lymfocytů jsou přítomny přibližně současně s transplantátem buněk ostrůvků slinivky břišní, resp. kde buňky kostní dřeně zbavené T-lymfocytů jsou přítomny před transplantátem buněk ostrůvků slinivky břišní.
Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití uvedeném v předchozích dvou odstavcích, kde buňky kostní dřeně zbavené T-lymfocytů jsou v první dávce a v druhé dávce.
Svrchu popsanou podstatu vynálezu a její nej významnější výhodná provedení, jak jsou popsány svrchu, lze charakterizovat v krátkosti takto:
Předmětem tohoto vynálezu je použití rozpustné CTLA4 mutantní molekuly pro výrobu léčiva pro inhibici rejekce transplantovaných buněk ostrůvků slinivky břišní.
-5CZ 305380 B6
Předkládaný vynález tak umožňuje způsoby pro léčbu onemocnění imunitního systému, podáním solubilních CTLA4 mutantních molekul, které se váží na CD80 a/nebo CD86 molekuly na CD80 a/nebo CD86-pozitivních buňkách, čímž se dosahuje inhibice vazby endogenních CD80 a/nebo CD86 molekul na CTLA4 a/nebo CD28 na T-lymfocytech a tím dochází k blokádě klíčových kostimulačních signálů pro T-lymfocyty, konkrétně CD28 dráhy.
Mezi solubilní CTLA4 mutantní molekuly patří L104EA29Y, molekula obsahující mutace v extracelulámí doméně CTLA4 v alaninu v pozici +29 a/nebo v leucinu v pozici +104, kde alanin v pozici 29 je substituovaný tyrosinem, a leucin v pozici 104 je substituovaný kyselinou glutamovou. CTLA4 mutantní molekuly dále obsahují část, jako je imunoglobulinová molekula, díky které je mutantní protein solubilní.
Ve výhodném provedení je L104EA29Y molekulou molekula L104EA29YIg (Obr. 3).
Předkládaný vynález dále umožňuje způsoby pro inhibici rejekce transplantovaných buněk ostrůvků slinivky břišní, při kterých je jedinci s transplantovanými buňkami ostrůvků slinivky břišní podán L104EA29Y (např. L104EA29YIg).
Vynález umožňuje také způsoby pro léčbu diabetů u jedince, které zahrnují podání imunosupresivního režimu zahrnujícího L104EA29Y (např. LI 04EA29YIg) jedinci, u kterého byl diagnostikován diabetes a provedena transplantace buněk ostrůvků slinivky břišní.
S předkládaným vynálezem jsou také spojeny farmaceutické prostředky pro léčbu diabetů, které obsahují farmaceuticky přijatelný nosič a solubilní CTLA4 mutant, např. L104EA29Y.
Objasnění výkresů
Obr. 1 ukazuje kompletní nukleotidovou (SEQ ID NO.:1) a aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 2) pro lidský CTLA4 receptor fúzovanou na signální peptid onkostatinu M. Signální peptid onkostatinu M je ukázán v pozici v pozici -25 až -1.
Obr. 2 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO.: 3) a aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 4) CTLA4Ig obsahující signální peptid; přirozenou aminokyselinovou sekvenci extracelulámí domény CTLA4 začínající methioninem v pozici +1 a končící kyselinou asparagovou v pozici +124, nebo začínající alaninem v pozici a končící kyselinou asparagovou v pozici +124; a Ig region.
Obr. 3 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO.: 5) a aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 6) CTLA4Ig mutantní molekuly (L104EA29Ylg) obsahující signální peptid; mutovanou extracelulámí doménu CTLA4 začínající methioninem v pozici +1 a končící kyselinou asparagovou v pozici +124, nebo začínající alaninem v pozici -1 a končící kyselinou asparagovou v pozici +124, a Ig region, jak je popsán v příkladu 1, dále.
Obr. 4 je graf ukazující plazmatické koncentrace glukózy na lačno u normálních jedinců, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
Obr. 5 je graf ukazující plasmatické koncentrace glukózy na lačno u pankreatomizovaných jedinců s transplantovanými buňkami pankreatických ostrůvků, jakje popsáno v příkladu 3. Zvířatům byly transplantovány buňky pankreatických ostrůvků v den 0 a byla léčena buď imunosupresívním režimem sL104EA29Yig a základním imunosupresivním režimem (léčba), neb pouze základním imunosupresivním režimem (kontrola). Základní imunosupresivní režim obsahoval rapamycin a anti-lidský IL-2.
-6CZ 305380 B6
Obr. 6 je graf ilustrující požadavky na inzulín u jedinců s transplantovanými buňkami ostrůvků pankreatu, jak je popsáno v příkladu 3. Zvířatům byly transplantovány buňky h ostrůvků pankreatu. V den 0 byla léčena buď imunosupresivním režimem s L104EA29Yig a základním imunosupresivním režimem (léčba), nebo pouze základním imunosupresivním režimem (kontrola).
Obr. 7 je graf ilustrující koncentraci glukózy v krvi v testu intravenózní tolerance glukózy pre- a post-transplantaci ostrůvků, jak je popsáno v příkladu 3.
Obr. 8 ukazuje schématický diagram vektoru, piLN-L104EA29Y, s L104EA29YIg insertem.
Obr. 9A a 9B ilustrují data zFACS testů ukazující vazbu L104EA29YIg, L104EIg a CTLA4Ig na lidské CHO buňky transfektované CD80- nebo CD86, jak je popsáno v příkladu 2.
Obr. 10A a 10B ukazují inhibici proliferací CD80-pozitivních a CD86-pozitivních CHO buněk, jak je popsáno v příkladu 2, dále.
Obr. 11A a 11B ukazují, že L104EA29YIg je účinnější než CTLA4Ig v inhibici proliferace primárně a sekundárně alostimulovaných T lymfocytů, jak je popsáno v příkladu 2, dále.
Obr. 12A-C ilustrují, že L104EA29YIg je účinnější než CTLA4Ig v inhibici produkce IL-2 (obr. 12A), IL-4 (obr. 12B), a -interferonu (obr. 12C) v alostimulovaných lidských T-lymfocytech, jak je popsáno v příkladu 2, dále.
Obr. 13 ukazuje, že L104EA29YIg je účinnější než CTLA4Ig v inhibici proliferace íytohemaglutininem (PHA) stimulovaných opičích T-lymfocytů, jak je popsáno v příkladu 2, dále.
Obr. 14A-C jsou SDS gely (obr. 14A) pro CTLA4Ig (dráha 1), L104EIg (dráha 2) a L104EA29YIg (dráha 3A); a chromatografie s vylučováním podle velikosti pro CTLA4Ig (obr. 14B) a L104EA29YIg (obr. 14C).
Obr. 15A a 15B jsou diagramy CTLA4 extracelulámího Ig V-like složení generovaného ze struktury stanovené NMR spektroskopií. Obr. 15B ukazuje rozšířený pohled na S25-R33 region a MYPPPY region, který ukazuje umístění a lokalizaci vedlejších řetězců při mutacích zvyšujících aviditu L104 a A29.
Obr. 16 ukazuje koncentrace glukózy na lačno pro LEA29YIg léčené (A) a kontrolní (B) příjemce ostrůvků (representativní zvířata) před a po transplantaci. U všech zvířat byla provedena chirurgická pankreatektomie alespoň 2 týdny před transplantací (průměrný požadavek na inzulín před transplantací 8,76 x 0,18 jednotek/den) (C) Pro intraportální infuzi allogenních ostrůvků se příjemci rychle stali euglykemickými a po transplantaci nevyžadovaly žádný exogenní inzulín. (D) Indukce diabetů a posttransplantační funkce ostrůvků se potvrdily intravenózním glukózovým tolerančním testem před transplantací a za 1 a 3 měsíce po transplantaci, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
Obr. 17 ukazuje (A) imunohistologii funkčních transplantovaných ostrůvků potvrzenou pozitivním barvením na inzulín. (B) Ostrůvky od zvířat s kontrolním režimem byly obklopeny infiltrátem mononukleáry, což ukazuje na rejekci, jakje popsáno v příkladu 3, dále.
Obr. 18 ukazuje supresi reakce T- a B- lymfocytů namířené proti dárci pomocí L104EA29Y režimu. (A) IFN-ELISpot reakce proti dárci koresponduje s načasováním rejekce u kontrol (1 týden po transplantaci). (B) L104EA29Y režim účinně potlačuje indukci T-lymfocytámí reakce namířené proti dárci. (C) Zvířata, kterým byl podán rapamycin a anti-IL-2R mAb rychle produkovaly detekovatelné protilátky namířené proti dárci, jak byly měřeny průtokovou cytometrií v době rejekce. (D) příjemci ostrůvků, kterým byl podáván režim obsahující L104EA29Y, negenerovaly při léčbě protilátky proti dárci, jakje popsáno v příkladu 3, dále.
-7CZ 305380 B6
Obr. 19 ukazuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci L104EIg (SEQ ID NO: 7-8), jak jsou popsány v příkladu 2, dále.
Obr. 20 ukazuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci L104EA29LIg (SEQ ID NO: 910).
Obr. 21 ukazuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci L104EA29TIg (SEQ ID NO: 1112)·
Obr. 22 ukazuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci L104EA29WIg (SEQ ID NO: 1314).
Obr. 23 ukazuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci CTLA4Ig (SEQ ID NO: 15-15) obsahující signální peptid; přirozenou aminokyselinovou sekvenci extracelulámí domény CTLA4 začínající methioninem v pozici +1 a končící kyselinou asparagovou v pozici +124, nebo začínající alaninem v pozici -1 a končící kyselinou asparagovou v pozici + 124; a Ig region.
Obr. 24 ukazuje aminokyselinovou sekvenci CTLA4Ig (SEQ ID NO: 16) obsahující signální peptid; přirozenou aminokyselinovou sekvenci extracelulámí domény CTLA4 začínající methioninem v pozici +1 a končící kyselinou asparagovou v pozici +124, nebo začínající alaninem v pozici -1 a končící kyselinou asparagovou v pozici + 124; a Ig region.
Podrobný popis vynálezu
Všechny odborné a technické termíny použité v tomto vynálezu mají běžně používané významy, pokud není uvedeno jinak. V uvedeném vynálezu mají následující výrazy a fráze tyto významy.
„Přirozený CTLA4“ má aminokyselinovou sekvenci přirozeného, kompletního CTLA4 (U.S. Patenty 5,434,131, 5,844,095, 5,851,795), nebo jakékoliv jeho části nebo derivátu, a váže se na B7 (CD80 a/nebo CD86) nebo interferuje s B7 (např. CD80 a/nebo CD86) tak, že blokuje vazbu na jejich ligand nebo blokuje jejich vazbu na extracelulámí doménu CTLA4 nebo její část. V konkrétních provedeních začíná extracelulámí doména přirozeného CTLA4 methioninem v pozici +1 a končí kyselinou asparagovou v pozici +124, nebo začíná extracelulámí doména přirozeného CTLA4 alaninem v pozici -1 a končí kyselinou asparagovou v pozici +124. V jiných provedeních se přirozený CTLA4 skládá ze 187 aminokyselin CTLA4 receptoru, jak je popsán na obr. 3 US patentů 5434131, 5844095, 5851795, a jak je uveden na obr. 1 tohoto vynálezu. Přirozený CTLA4 je buněčný povrchový protein, který má N-terminální extracelulámí doménu, transmembránovou doménu a C-terminální cytoplasmatickou doménu. Extracelulámí doména se váže na cílové antigeny, jako jsou CD80 a CD86. V buňce je přirozený CTLA4 protein translatován jako nezralý polypeptid, který obsahuje signální peptid na N-konci. Nezralý polypeptid je posttranslačně zpracován, což zahrnuje štěpení a odstranění signálního peptidu za zisku CTLA4 štěpného produktu majícího nově vytvořený N-konec, který se liší od N-konce nezralé formy. Odborníkům v oboru bude jasné, že může proběhnout další posttranslační zpracování, které odstraní jednu nebo více aminokyselin z nově vytvořeného konce produktu štěpení CTLA4. Zralá forma CTLA4 molekuly obsahuje extracelulámí doménu nebo jakoukoliv její část, která se váže na CD80 a/nebo CD86.
Termín „extracelulámí doména CTLA4“ označuje část CTLA4 receptoru, která je lokalizovaná vně buněčné membrány a která rozpoznává a váže se na CTLA4 ligandy, jako jsou B7 molekuly (například C80 a/nebo CD86). Například, extracelulámí doména CTLA4 zahrnuje methionin v pozici +1 až kyselinou asparagovou v pozici +124 (obr. 2). Alternativně, extracelulámí doména CTLA4 zahrnuje alanin v pozici -1 až kyselinou asparagovou v pozici +124 (obr. 1). Extracelulámí doména zahrnuje fragmenty nebo deriváty CTLA4, které se váží na B7 molekulu (například CD80 a/nebo CD86).
-8CZ 305380 B6
Termín „non-CTLA4 proteinová sekvence“ nebo „non-CTLA4 molekula“ označuje jakoukoliv proteinovou molekulu, která se neváže na CD80 a/nebo CD86 a neinterferuje s vazbou CTLA4 na cílovou sekvenci. Příkladem je imunoglobulinový (Ig) konstantní region nebo jeho část. Výhodně je Ig konstantní region lidský nebo opičí Ig konstantní region, např., lidský C(gamma)l, včetně pantu, CH2 a CH3 regionu. Ig konstantní region může být mutovaný pro snížení jeho efektorových funkcí (U.S. Patenty 5,637,481 a 6,090,914).
Termín „rozpustná“ označuje jakoukoliv molekulu, nebo její fragmenty a deriváty, nenávazanou na buňku, tj. cirkulující. Například, CTLA4, L104EA29Yig, B7 nebo CD28 mohou být učiněny rozpustnými navázáním na imunoglobulinové (Ig) skupiny na extracelulámí doménu CTLA4, B7 nebo CD28, v příslušném pořadí. Dalšími molekulami mohou být produkt papilomavirového E7 genu (E7), antigen p97 asociovaný s melanomem (p97) nebo HIV env protein (env gpl 20). Alternativně, molekula, jako je CTLA4, může být učiněna rozpustnou odstraněním její transmembránové domény. Obvykle solubilní molekuly použité ve způsobech podle předkládaného vynálezu neobsahují signální (nebo vedoucí) sekvenci.
„CTLA4Ig“ je rozpustný fúzní protein obsahující extracelulámí doménu přirozeného CTLA4 navázanou na Ig koncovku, nebo jeho část, která se váže na CD80 a/nebo CD86. Konkrétní provedení obsahují extracelulámí doménu přirozeného CTLA4 začínající methioninem v pozici +1 a končící kyselinou asparagovou v pozici +124; nebo začínající alaninem v pozici -1 a končící kyselinou asparagovou v pozici +124; spojovací aminokyselinový zbytek glutamin v pozici +125; a imunoglobulinovou část obsahující kyselinu glutamovou v pozici +126 až lysin v pozici +357 (Obr. 2). DNA kódující CTLA4Ig byla uložena 31.5.1991 v American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, podle podmínek Budapešťské smlouvy, pod ATCC přírůstkovým č. ATCC 68629; Linsley, P., et al., 1994 Immunity 1:793-80). CTLA4Ig-24, Chinese Hamster Ovary (CHO) buněčná linie exprimující CTLA4Ig byla uložena 31. 5. 1991 pod ATCC identifikačním č. CRL-10762. Solubilní CTLA4Ig molekuly použité ve způsobech a/nebo kitech podle předkládaného vynálezu mohou a nemusí obsahovat signální (vedoucí) peptidovou sekvenci. Obvykle ve způsobech a/nebo kitech podle předkládaného vynálezu molekuly neobsahují signální peptidovou sekvenci.
Termín „rozpustné CTLA4 molekuly“ označuje na buněčný povrch nenavázané (tj. cirkulující) CTLA4 molekuly (přirozené nebo mutantní) nebo jakoukoliv funkční část CTLA4 molekuly, která se váže na B7, včetně, například: CTLA4Ig fúzních proteinů (např. ATCC 68629), kde extracelulámí doména CTLA4 je fúzovaná na imunoglobulinovou (Ig) skupinu, což způsobuje rozpustnost fúzní molekuly, nebo jejich fragmentů a derivátů; proteinů s extracelulámí doménou CTLA4 fúzovanou nebo navázanou na část biologicky nebo chemicky aktivního proteinu, jako je papillomavirový E7 genový produkt (CTLA4-E7), antigen p97 asociovaný s melanomem (CTLA4-p97) nebo HIV env protein (CTLA4-env gpl20), nebo jejich fragmenty a deriváty; hybridní (chimérické) fúzní proteiny, jako je CD28/CTLA4Ig, nebo jejich fragmenty a deriváty; CTLA4 molekuly s odstraněnou transmembránovou doménou pro dosažení rozpustnosti proteinu (Oaks, Μ. K., et al., 2000 Cellular Immunology 201:144-153), nebo jejich fragmenty a deriváty. „Rozpustné CTLA4 molekuly“ také zahrnují jejich fragmenty, části a deriváty; a rozpustné CTLA4 mutantní molekuly mající vazebné aktivity CTLA4. Solubilní CTLA4 molekuly použité ve způsobech podle předkládaného vynálezu mohou a nemusí obsahovat signální (vedoucí) peptidovou sekvenci. Obvykle ve způsobech podle předkládaného vynálezu molekuly neobsahují signální peptidovou sekvenci.
Termín „fuzní protein“ je definován jako jedna nebo více aminokyselinových navázaných na sebe za použití metod známých v oboru a jak je popsáno v U.S. Pat. 5,434,131 nebo 5,637,481. Na sebe navázané aminokyselinové sekvence tak tvoří fúzní protein.
Termín „CTLA4 mutantní molekula“ označuje molekulu, kterou může být kompletní přirozený CTLA4 nebo jakákoliv jeho část (derivát nebo fragment), který obsahuje mutaci nebo více mutací (výhodně v extracelulámí doméně přirozeného CTLA4). CTLA4 mutantní molekula má sek-9CZ 305380 B6 věnci, která je podobná, ale ne identická se sekvencí přirozené CTLA4 molekuly. CTLA4 mutantní molekuly se váží na B7 molekulu (například na CD80 nebo CD86 nebo na obě). Mutantní CTLA4 molekuly mohou mít na sebe navázané biologicky nebo chemicky aktivní non-CTLA4 molekuly. Mutantní molekula může být solubilní (tj. cirkulující) nebo vázaná na povrch. CTLA4 mutantní molekula může obsahovat celou extracelulámí doménu CTLA4 nebo její části, např. fragmenty nebo deriváty. CTLA4 mutantní molekuly může být vyrobena synteticky nebo rekombinantně.
Termín mutace označuje změnu nukleotidové nebo aminokyselinové sekvence přirozené molekulo ly, například změnu v DNA a/nebo aminokyselinové sekvenci přirozené CTLA4 extracelulámí domény. Změny v sekvenci přirozeného CTLA4 mohou být konzervativní nebo nekonzervativní.
Mezi aminokyselinové změny patří substituce, delece, inserce, adice, zkrácení. Mutantní molekula může obsahovat jednu nebo více mutací. Mutace v nukleotidové sekvenci mohou, ale nemusí vést ke vzniku mutací aminokyselinové sekvence, jak je dobře v oboru známé. V tomto ohledu některé nukleotidové kodony kódují stejné aminokyseliny. Příklady jsou nukleotidové kodony CGU, CGG, CGC, a CGA kódující aminokyselinu arginin (R); nebo kodony GAU a GAC kódující aminokyselinu kyselinu asparagovou (D). Tak může být protein kódován jednou nebo více molekulami nukleové kyseliny, které se liší ve své specifické nukleotidové sekvenci, ale které kódují proteinové molekuly mající identické sekvence. Aminokyselinové kódující sekvence jsou následující:
Aminokyselina Symbol J e dnop í směnný symbol Kodony
Alanin Ala A GCU, GCC, GCA, GCG
Cystein Cys C UGU, UGC
Kyselina asparagová Asp D GAU, GAC
Kyselina glutamová; Glu E GAA, GAG
Fenylalanin Phe F UUU,UUC
Glycin Gly G GGU, GGC, GGA, GGG
Histidin His H CAU, CAC
Isoleucini De I AUU. AUC, AUA
Lysint Lys K AAA, AAG
Leucim Leu L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG
- 10CZ 305380 B6
Methionin Met M AUG
Asparagint Asn N AAUj AAC
Prolin.' Pro P CCU, CCC, CCA, CCG
Glutamin Gin Q CAA, CAG
Arginin Arg R CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG
Serin Ser S UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC
Threonin Thr T ACU, ACC, ACA, ACG
Valin Val v GUU, GUC, GUA, GUG
Tryptofan Trp w UGG
Tyrosin Tyr Y UAU, UAC
„L104EA29YIg“ je fúzní protein, kterým je rozpustná CTLA4 mutantní molekula obsahující extracelulámí doménu přirozeného CTLA4 s aminokyselinovou změnou A29Y (tyrosin substituovaný za alanin v pozici 29) a L104E (kyselina glutamová substituovaná za leucin v pozici +104), nebo její část, která se váže na B7 molekulu, navázanou na Ig koncovku (jak je uvedeno na obr. 3; DNA kódující L104EA29YIg byla uložena 20. 6. 2000 pod ATCC č. PTA-2104). Solubilní L104EA29YIg molekuly použité ve způsobech a/nebo kitech podle předkládaného vynálezu mohou a nemusí obsahovat signální (vedoucí) peptidovou sekvenci. Obvykle ve způsobech a/nebo kitech podle předkládaného vynálezu molekuly neobsahují signální peptidovou sekvenci.
Mutantní molekula může obsahovat jednu nebo více mutací. Termín „non-CTLA4 proteinová sekvence“ nebo „non-CTLA4 molekula“ označuje jakoukoliv proteinovou molekulu, která se neváže na B7 a neinterferuje s vazbou CTLA4 na cílovou sekvenci. Příkladem je imunoglobulinový (Ig) konstantní region nebo jeho část. Výhodně je Ig konstantní region lidský nebo opičí Ig konstantní region, např., lidský C(gamma)l, včetně pantu, CH2 a CH3 region. Ig konstantní region může být mutovaný pro snížení jeho efektorových funkcí(U.S. Patenty 5,637,481, 5,844,095 a 5,434,131).
Termín „fragment“ nebo „část“ označuje jakoukoliv část nebo segment molekuly, například CTLA4 nebo CD28, výhodně extracelulámí doménu CTLA4 nebo CD28 nebo její část nebo segment, která rozpoznává a váže se na cílovou strukturu, např. B7 molekulu.
Termín „B7“ označuje B7 rodinu molekul, včetně B7-1 (CD80) (Freeman et al., 1989, J. Immunol. 143: 714-2722, zde uvedeno jako odkaz ve své úplnosti), B7-2 (CD86) (Freeman et al., 1993, Science 262:909-911, zde uvedeno jako odkaz ve své úplnosti; Azuma et al., 1993, Nátuře 366:76-79, zde uvedeno jako odkaz ve své úplnosti), které rozpoznávají a váží se na CTLA4 a/nebo CD28.
Termín CD28 označuje molekulu, která rozpoznává a váže se na B7, jak je popsáno v US přihlášce 5580756 a 5521288 (které jsou zde uvedeny jako odkaz ve své úplnosti).
Termín „B7-pozitivní buňky“ označuje buňky exprimující na povrchu jednu nebo více molekul typu B7.
Termín „derivát“ označuje molekulu mající homologii sekvence a stejnou aktivitu jako původní molekula. Například, derivát CTLA4 je rozpustní CTLA4 molekula mající aminokyselinovou sekvenci z alespoň 70 % stejnou jako je extracelulámí doména přirozeného CTLA4, a která rozpoznává a váže se na B7, např. CTLA4Ig nebo rozpustný CTLA4 mutantní molekula L104EA29YIg.
- 11 CZ 305380 B6
Termín „blokování“ nebo „inhibice“ receptorů, signálu nebo molekuly označuje interferenci s aktivací receptorů, signálu nebo molekuly, detekovanou testy známými v oboru. Například, blokáda buněčné imunitní reakce může být detekována stanovením redukce příznaků souvisejících s revmatickým onemocněním. Blokáda nebo inhibice může být úplná nebo částečná.
Termín „blokování B7 interakce“ označuje interferenci s vazbou B7 na jeho ligandy, jako je CD28 a/nebo CTLA4, což způsobuje blokádu interakce T-lymfocytů a B7-pozitivních buněk. Příklady sloučenin, které blokují B7 interakce, jsou molekuly, jako jsou protilátky (nebo jejich části či deriváty), které rozpoznávají a váží se na jakoukoliv zCTLA4, CD28 nebo B7 molekul (např. B7-1, B7-2); rozpustné formy (nebo jejich části nebo deriváty) molekul, jako je rozpustný CTLA4; peptidové fragmenty nebo jiné malé molekuly navržené tak, aby interferovaly s buněčnou signalizací přes CTLA4/CD28/B7-zprostředkované interakce. Ve výhodném provedení je blokovacím činidlem rozpustná CTLA4 molekula, jako je CTLA4Ig (ATTC 68629) nebo L104EA29YIg (ATTC PTA-2104), rozpustná CD28 molekula, jako je CD28Ig (ATCC 68628), rozpustná B7 molekula, jako je B71g (ATCC 68627), anti-B7 monoklonální protilátka (např. ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 a monoklonální protilátky popsané v Anderson et al., U.S. Patent 6,113,898 nebo Yokochi et al., 1982. J. Immun., 128(2):823-827), anti-CTLA4 monoklonální protilátka (např. ATCC HB-304, a monoklonální protilátky popsané v odkazech 82-83) a/nebo anti-CD28 monoklonální protilátka (např. ATCC HB 11944 a mAb 9.3 popsaná v Hansen (Hansen et al., 1980. Immunogenetics 10:247-260) nebo Martin (Martin et al., 1984. J. Clin. Immun., 4(1):18-22)).
Termín „onemocnění imunitního systému“ označuje onemocnění zprostředkované interakcí Tlymfocytů s B7-pozitivními buňkami, včetně, například, autoimunitních onemocnění, onemocnění souvisejících se štěpem a imunoproliferativních onemocnění. Příklady onemocnění imunitního systému jsou reakce štěpu proti hostiteli (GVHD) (například při transplantaci kostní dřeně nebo při indukci tolerance), imunitní poruchy asociované s rejekcí transplantátu, chronickou rejekcí, tkáňovými nebo orgánovými allo- nebo xenotransplantáty, včetně solidních orgánů, kůže, ostrůvků pankreatu, hepatocytů, neuronů. Příklady imunoproliferativních onemocnění jsou například psoriasa, T-lymfocytámí lymfom, T-lymfocytámí akutní lymfoblastická leukemie, testikulámí angiocentrický T-lymfocytámí lymfom, benigní lymfocytámí angitis, lupus (např. lupus erythematosus, lupus nephritis), Hashimotova thyroiditis, primární myxedem, Gravesova nemoc, pemiciosní anemie, autoimunitní atrofická gastritis, Addisonova nemoc, diabetes (např. inzulín dependentní diabetes mellitus, diabetes mellitus typu I, diabetes mellitus typu II), GoodPasteurův syndrom, myasthenia gravis, pemphigus, Crohnova nemoc, sympathetická ophthalmie, autoimunitní uveitis, roztroušená skleróza, autoimunitní hemolytická anemie, idiopatická trombocytopenie, primární biliámí cirhóza, chronická infekční hepatitida, ulcerosní colitis, Sjogrenův syndrom, revmatická onemocnění (např. revmatoidní arthritis), polymyositis, sklerodermie, smíšené onemocnění pojivové tkáně.
Termín Jedinec“, jak je zde použit, označuje například člověka, primáta (např. opici, gibona), ovci, králíka, prase, psa, kočku, myš nebo krysu.
Termín „tkáňový transplantát“ je definován jako tkáň z orgánu nebo celý orgán, která je transplantována příjemci. V některých provedeních je tkáň z jednoho nebo více solidních orgánů. Příklady tkání nebo orgánů jsou kůže, plíce, srdce, slinivka břišní, ledviny, játra, kostní dřeň, buňky ostrůvků pankreatu, pluripotentní kmenové buňky, buněčné suspenze a geneticky modifikované buňky. Tkáň může být odebrána od jedince nebo může být vykultivována in vitro. Transplantát může být autotransplantát, isotransplantát, allotransplantát nebo xenotransplantát, nebo kombinace uvedených možností.
Termín „rejekce transplantátu“ je definována jako téměř kompletní nebo kompletní ztráta životaschopné tkáně štěpu od příjemce.
- 12CZ 305380 B6
Termín „enkapsulace“, jak je zde použit, označuje proces, který imuno-izoluje buňky a/nebo seskupení buněk, které produkují a secemují terapeutické substance, např. inzulín, a lékařské použití těchto přípravků. Proces enkapsulace zahrnuje umístění buněk a/nebo seskupení buněk do semipermeabilní membrány před transplantací, aby se zabránilo jejich rejekci imunitním systémem. Hraniční molekulová hmotnost propustnosti enkapsulační membrány může být kontrolována procesem enkapsulace tak, aby se zabránilo průniku imunoglobulinů a lytických faktorů komplementu skrz membránu, ale aby se naopak umožnil průnik malých molekul, jak oje glukóza a inzulín. Enkapsulace umožňuje buňkám pankreatických ostrůvků fyziologicky reagovat na změny koncentrace glukózy v krvi, ale brání jejich kontaktu se složkami imunitního systému. Způsoby pro enkapsulaci buněk pankreatických ostrůvků jsou popsány v U.S. Patentu 6,080,412.
Termín „ligand“, jak je zde použit, označuje molekulu, která specificky rozpoznává a váže se na jinou molekulu, například ligand pro CTLA4 je CD80 a/nebo CD86 molekula.
Termín „rozpustný ligand, který rozpoznává a váže se na CD80 a/nebo CD86 antigen“ označuje ligandy, jako je CTLA4-Ig, CD28-Ig nebo jiné rozpustné formy CTLA4 a CD28; rekombinantní CTLA4 a CD28; mutantní CTLA4 molekuly, jako je L104EA29YIg; a jakoukoliv protilátkovou molekulu, její fragment nebo rekombinantní vazebný protein, která rozpoznává a váže se na CD80 a/nebo CD86 antigen. Tato činidla jsou také označována jako imunosupresivní činidla.
Termín „kostimulační dráha“ označuje biochemickou dráhu vznikající při interakci ko-stimulačních signálů na T-lymfocytech a buňkách prezentujících antigen (APC). Kostimulační signály napomáhají při určení velikosti imunologické reakce na antigen. Jeden kostimulační signál je dodáván interakcí T-lymfocytámích receptorů CD28 a CTLA4 s CD80 a/nebo CD86 molekulami na APC.
Termín „CD80 a/nebo CD86“ označuje B7-1 (též CD80), B7-2 (též označovaný jako CD86), B7-3 (též označovaný jako CD74), a B7 rodinu, např. kombinaci B7-1, B7-2, a/nebo B7-3.
Termín „blokáda kostimulace“ označuje protokol, při kterém jsou jedinci podány jedno nebo více činidel, které blokují nebo interferují s kostimulační dráhou, jak je definována výše. Příklady činidel, která interferují s kostimulační blokádou, jsou rozpustný CTLA4, mutantní CTLA4, rozpustný CD28, anti-B7 monoklonální protilátky (mAb), rozpustný CD40 a anti-gp39 mAb. V jednom provedení je L104EA29YIg výhodným činidlem, které interferuje s kostimulační blokádou.
Termín „kostní dřeň ochuzená o T-lymfocyty“ označuje kostní dřeň odebranou z kosti, která byla zpracována způsobem způsobujícím depleci T-lymfocytů. Způsob způsobující depleci Tlymfocytů označuje způsob vedoucí k odstranění T-lymfocytů z kostní dřeně. Způsoby pro selektivní odstranění T-lymfocytů jsou dobře známé v oboru. Příkladem způsobu pro odstranění Tlymfocytů je ošetření kostní dřeně protilátkou specifickou pro T-lymfocyty, jako je anti-CD3, anti-CD4, anti-CD5, anti-CD8, a anti-CD90 monoklonální protilátka, kde protilátky jsou cytotoxické pro T-lymfocyty. Alternativně, protilátky mohou být navázány na magnetické částice, aby bylo možné odstranit T-lymfocyty z kostní dřeně pomocí magnetického pole. Dalším příkladem způsobu pro odstranění T-lymfocytů je ošetření T-lymfocytů kostní dřeně anti-lymfocytámím sérem nebo anti-thymocytámím globulinem.
Termín „tolerizační dávka kostní dřeně zbavené T-lymfocytů“ je definována jako počáteční dávka kostní dřeně ochuzené o T-lymfocyty, která je podána jedinci za účelem inaktivace potenciálních T-lymfocytů reaktivních s dárcem.
Termín „transplantační dávka kostní dřeně ochuzené o T-lymfocyty“ je definován jako následující dávka kostní dřeně ochuzené o T-lymfocyty, která je podána jedinci za účelem navození smíšeného hematopoetického chimérismu. Transplantační dávka kostní dřeně ochuzené o Tlymfocyty bude proto podána po tolerizační dávce kostní dřeně ochuzené o T-lymfocyty.
- 13 CZ 305380 B6
Termín „smíšený hematopoetický chimérismus“ je definován jako přítomnost dárcovských a původních krevních progenitorových a zralých buněk (např. buněk pocházejících z krve) za nepřítomnosti (nebo nedetekovatelné přítomnosti) imunitní reakce.
Termín „párování dárce-příjemce“ označuje molekulární typizaci za použití panelu předem definovaných hlavních histokompatibilních alel (8 tříd I a 12 tříd II) (Lobashevsky A, et al., Tissue Antigens 54:254-263, (1999); Knapp LA, et al., Tissue Antigens 50:657-661, (1997); Watkins D. I., Crit. Rev. Immunol. 15:1-29, (1995)). Párování maximalizuje rozdíly mezi lokusy I a II třídy.
Termín „podávání“ nebo „podání“ označuje podání provedené jakýmkoliv způsobem, včetně intravenózního (i.v.) podání, intra-peritoneálního (i.p.) podání, intramuskulámího (i.m.) podání, subkutánního podání, orálního podání, podání ve formě čípků, nebo lokálně, nebo implantace prostředku s dlouhodobým uvolňováním, jako je miniosmotická pumpa, jedinci.
Termín „farmaceuticky přijatelný nosič“ označuje jakýkoliv materiál, který při kombinování s reaktivním činidlem zachovává biologickou aktivitu reaktivního činidla, například vazebnou specificitu, a je nereaktivní s imunitním systémem jedince. Příklady standardních farmaceutických nosičů jsou fosfátem pufrované salinické roztoky, voda, emulze, jako je emulze olej ve vodě, a různé typy smáčivých činidel. Dalšími nosiči jsou sterilní roztoky, tablety, včetně potahovaných tablet a kapslí. Obvykle takové nosiče obsahují přísady, jako je škrob, mléko, cukr, některé hlinky, želatina, kyselina stearová, nebo její soli, stearát hořečnatý nebo vápenatý, talek, rostlinné tuky nebo oleje, klovatiny, glykoly, nebo jiné známé přísady. Mezi takové nosiče také patří barviva a chuťová korigens nebo jiné složky. Prostředky obsahující takové nosiče jsou připraveny za použití běžných technik.
Termín „imunosupresivní činidla“ označuje přípravky obsahující jeden nebo více typů molekul, které brání vzniku imunitní reakce nebo oslabují imunitní systém jedince. Výhodně tato činidla inhibují proliferaci T-lymfocytů. Některé činidla mohou inhibovat proliferaci T-lymfocytů tím, že inhibují interakci T-lymfocytů sjinými buňkami prezentujícími antigen (APC). Jedním příkladem APC jsou B lymfocyty. Příklady činidel, které interferují s interakcemi T-lymfocytů s APC, a tím inhibují proliferaci T-lymfocytů, jsou ligandy pro CD80 a/nebo CD86 antigeny, ligandy pro CTLA4 antigen, a ligandy pro CD28 antigen. Příklady ligandů pro CD80 a/nebo CD86 antigeny jsou, například, solubilní CTLA4, solubilní CTLA4 mutant, solubilní CD28, nebo monoklonální protilátky, které rozpoznávají a váží se na CD80 a/nebo CD86 antigeny, nebo jejich fragmenty. Jedním výhodným činidlem je L104EA29YIg. Ligandy pro CTLA4 nebo CD28 antigeny zahrnují monoklonální protilátky, které rozpoznávají a váží se na CTLA4 a/nebo CD28, nebo jejich fragmenty. Mezi další ligandy pro CTLA4 nebo CD28 patří solubilní CD80 a/nebo CD86 molekuly, jako je CD80 a/nebo CD86Ig. Odborníkům v oboru bude jasné, že i další činidla nebo ligandy mohou být použity pro inhibici interakce CD28 s CD80 a/nebo CD86.
Mezi imunosupresivní činidla patří, například, methotrexát, cyklofosfamid, cyklosporin, cyklosporin A, chlorochin, hydroxychlorochin, sulfasalazin (sulfasalazopyrin), soli zlata, D-penicilamin, leflunomid, azathioprin, anakinra, infliximab (REMICADER), etanercept, TNF blokátory a biologická činidla, která jsou namířena proti zánětlivým cytokinům, a nesteroidní protizánětlivé léčiva (NSAID). Mezi NSAID patří, například, kyselina acetylsalicylová, cholin-magnesiumsalicylát, diflunisal, salicylát hořečnatý, salsalát, salicylát sodný, diklofenac, etodolac, fenoprofen, flurbiprofen, indomethacin, ketoprofen, ketorolac, meclofenamát, naproxen, nabumeton, fenylbutazon, piroxicam, sulindca, tolmetin, acetaminofen, ibuprofen, Cox-2 inhibitory a tramadol.
Prostředky podle předkládaného vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje prostředky pro léčbu imunitních onemocnění, jako je diabetes, které obsahují solubilní CTLA4 molekuly. Předkládaný vynález dále poskytuje prostředky pro
- 14CZ 305380 B6 inhibici rejekce transplantátu, např. transplantovaných buněk pankreatických ostrůvků, při léčbě diabetů. Dále, předkládaný vynález poskytuje prostředky obsahující biologické činidlo, které inhibuje funkci T-lymfocytů, ale nezpůsobuje depleci T-lymfocytů u člověka, které působí prostřednictvím kontaktování B7-pozitivních buněk u člověka se solubilním CTLA4. Příklady solubilních CTLA4 jsou CTLA4Ig a solubilní CTLA4 mutantní molekuly, jako je L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg a L104EA29WIg.
CTLA4 molekuly, s mutantními nebo přirozenými sekvencemi, mohou být učiněny rozpustnými deletováním CTLA4 transmembránového segmentu (Oaks, Μ. K., et al., 2000 Cellular Immunology 201:144-153).
Případně solubilní CTLA4 molekuly, s mutantní nebo přirozenou sekvencí, mohou být fúzní proteiny, ve kterých jsou CTLA4 molekuly fúzované na non-CTLA4 skupiny, jako je imunoglobulinová (Ig) molekula, která činí CTLA4 molekulu solubilní. Například může CTLA4 fúzní protein obsahovat extracelulámí doménu CTLA4 fúzovanou na konstantní doménu imunoglobulinu, což vede ke vzniku CTLA4Ig molekuly (obr. 2) (Linsley, P. S., et al., 1994 Immunity 1:793-80).
Pro klinické protokoly je výhodné, aby imunoglobulinový region nevyvolával škodlivou imunitní reakci u jedince. Výhodnou skupinou je konstantní region imunoglobulinu, včetně lidského nebo opičího imunoglobulinového konstantního regionu. Příkladem imunoglobulinového regionu je lidský Cl, včetně pantového regionu, CH2 a CH3 regiony, které mohou zprostředkovat efektorové funkce, jako je vazba na Fc receptory, zprostředkování komplement-dependentní cytotoxicity (CDC), nebo zprostředkování buněčné cytotoxicity závislé na protilátkách (ADCC). Imunoglobulinová skupina může obsahovat jednu nebo více mutací (např. v CH2 doméně, pro redukci efektorových funkcí, jako je CDC nebo ADCC), kde mutace moduluje vazebnou kapacitu imunoglobulinu kjeho ligandu tím, že zvyšuje nebo snižuje vazebnou kapacitu imunoglobulinu na Fc receptory. Například, mutace v imunoglobulinu mohou zahrnovat změny jakéhokoliv nebo všech cysteinových zbytků v pantové doméně, například, cysteinů v pozicích +130, +136, a +139, které jsou substituované serinem (Obr. 20). Imunoglobulinová molekula může také obsahovat prolin v pozici +148 substituovaný serinem, jak je uvedeno na Obr. 24. Další mutací v imunoglobulinové skupině může být substituce leucinu v pozici +144 za fenylalanin, leucinu v pozici +145 za kyselinu glutamovou nebo glycinu v pozici +147 za alanin.
Dalšími non-CTLA4 skupinami vhodnými pro použití v solubilní CTLA4 molekule nebo rozpustné CTLA4 mutantní molekule jsou, například, p97 molekula, env gpl20 molekula, E7 molekula, a ova molekula (Dash, B. et al. 1994 J. Gen. Virol. 75 (Pt 6): 1389—97; Ikeda, T., et al., 1994 Gene 138(1-2): 193-6; Falk, K., et al. 1993 Cell. Immunol. 150(2):447-52; Fujisaka, K. et al. 1994 Virology 204(2):789-93). Vhodné jsou i další molekuly (Gerard, C. et al. 1994 Neuroscience 62(3):721; Bym, R. et al. 1989 63(10):4370; Smith, D. et al. 1987 Science 238:1704; Lásky, L. 1996 Science 233: 209).
Solubilní CTLA4 molekula podle předkládaného vynálezu může obsahovat sekvenci signálního peptidu navázanou na N-terminální konec extracelulámí domény CTLA4 části molekuly. Signálním peptidem může být jakákoliv sekvence, která umožní sekreci molekuly, včetně signálního peptidu z onkostatinu M (Malin et a., (1989) Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2853), nebo CD5 (Jones, N. H. et al., (1986) Nátuře 323 :346-349), nebo signálního peptidu z jakéhokoliv extracelulámího proteinu. Solubilní CTLA4 molekula podle předkládaného vynálezu může obsahovat signální peptid onkostatinu M navázaný na N-terminální konec extracelulámí domény CTLA4, a lidskou imunoglobulinovou molekulu (např. pant, CH2 a CH3) navázanou na C-terminální konec extracelulámí domény (přirozené nebo mutované) CTLA4. Tato molekula obsahuje signální peptid onkostatinu M mající aminokyselinovou sekvenci s methioninem v pozici -26 až kalaninu v pozici -1, CTLA4 část tvořenou aminokyselinovou sekvencí od methioninu v pozici +1 do kyseliny asparagové v pozici +124, a spojovací aminokyselinový zbytek glutamin v pozici +125,
- 15 CZ 305380 B6 a imunoglobulinovou část tvořenou aminokyselinovou sekvencí mající kyselinu glutamovou v pozici +126 až lysin v pozici +357.
Vjednom provedení jsou solubilní CTLA4 mutantními molekulami podle předkládaného vynálezu, které obsahují mutované CTLA4 sekvence popsané dále, fúzní molekuly obsahující lidskou IgC(gamma)l (tj. IgCl) skupinu fúzovanou na mutované CTLA4 fragmenty. Solubilní CTLA4 mutantní molekula může obsahovat jednu nebo více mutací (např., aminokyselinových substitucí, delecí nebo insercí) v extracelulámí doméně CTLA4.
Například může solubilní CTLA4 mutantní molekula obsahovat mutaci nebo mutace v nebo v těsné blízkosti regionu ohraničeného serinem v pozici +25 a argininem v pozici +33 (např. S25-R33, při použití standardních jednopísmenných aminokyselinových symbolů). Mutantní CTLA4 molekula může obsahovat aminokyselinové substituce v jakékoliv jedné nebo více následujících pozic: S25, P26, G27, K28, A29, T30, E31 nebo R33.
V jiném provedení může solubilní CTLA4 mutantní molekula obsahovat mutace nebo mutaci v nebo v těsné blízkosti regionu ohraničeného kyselinou glutamovou v pozici +95 a glycinem v pozici +107 (např., E95-G107). Mutantní CTLA4 molekula může obsahovat aminokyselinové substituce v jakékoliv jedné nebo více následujících pozic: K.93, L96, M97, Y98, P99, P100, P101, Y102, Y103, L104, G106,1106 a G107.
Dále předkládaný vynález poskytuje solubilní CTLA4 mutantní molekuly obsahující mutaci nebo mutace v nebo v těsné blízkosti regionu ohraničeného asparaginem v pozici +108 a isoleucinem v pozici +115 (např., N108-1115). Mutantní CTLA4 molekula může obsahovat aminokyselinové substituce může obsahovat aminokyselinové substituce v jakékoliv jedné nebo více z následujících pozic: L104, G105,1106, G107, Q111, Yl 13 nebo 1115.
Vjednom provedení obsahuje solubilní CTLA4 mutantní molekula IgCl fúzovaný na CTLA4 fragment obsahující mutaci vjednom místě extracelulámí domény. Extracelulámí doména CTLA4 je tvořena methioninem v pozici +1 až kyselinou asparagovou v pozici +124 (např. obr. 1). Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat alanin v pozici -1 až kyselinu asparagovou v pozici +124 (např. obr. 1).
Příklady jednotlivých mutací jsou uvedeny v následující tabulce, ve které je leucin v pozici +104 změně na jakoukoliv jinou aminokyselinu:
-16CZ 305380 B6
Mutanti s jednou mutací Změna kodonů
L104EIg Kyselina glutamová GAG
L104SIg Serin AGT
L104TIg Threonin ACG
LKMAIg Alanin GCG
L104WIg Tryptofan TGG
L104QIg Glutamin CAG
L104KIg Lysin AAG
L104RIg Arginin CGG
L104GIg Glycin GGG
Dále předkládaný vynález poskytuje mutantní molekuly mající extracelulámí doménu CTLA4 se dvěma mutacemi fúzovanou na IgCl skupinu. Příklady jsou následující molekuly mající leucin v pozici +104 změněn na jinou aminokyselinu (např. kyselinu glutamovou) a glycin v pozici +105, serin v pozici +25, threonin v pozici +30 nebo alanin v pozici +29 změně na jakoukoliv jinou aminokyselinu:
Mutanti se dvěma mutacemi Změna kodonů
L104EG105FIg Fenylalanin TTC
Llv4EG105WIg Tryptofan TGG
L104EG105LIg Leucin CTT
L104ES25RIg Arginin CGG
L104ET30GIg Glycin GGG
LlÓ4ET30NIg Asparagin AAT
L104EA29YIg Tyrosin TAT
L104EA29LIg Leucin TTG
L104EA29TIg Threonin ACT
L104EA29WIg Tryptofan TGG
Ještě dále vynález poskytuje mutantní molekuly mající extracelulámí doménu CTLA4 obsahující tři mutace fúzovanou na IgCl skupinu. Příklady jsou následující molekuly, ve kterých je leucin v pozici +104 změněn na jinou aminokyselinu (např. kyselinu glutamovou), alanin pozici +29 je změněn na jinou aminokyselinu (např. tyrosin), a serin v pozici +25 je změněn na jinou aminoky15 selinu:
- 17CZ 305380 B6
Mutanti se třemi mutacemi Změna kodonů!
L104EA29YS25KIg Lysin AAA
L104EA29YS25KIg Lysin AAG
L104EA29YS25NIg Asparagin AAC
L104EA29YS25RIg Arginin' CGG
Rozpustné CTLA4 mutantní molekuly mohou obsahovat spojovací aminokyselinový zbytek, který je umístěn mezi CTLA4 část a Ig část molekuly. Spojovací aminokyselinou může být jakákoliv aminokyselina, včetně glutaminu. Spojovací aminokyselina může být vložena metodami molekulárními nebo chemickou syntézou, jak jsou známé v oboru.
Vynález poskytuje rozpustné CTLA4 mutantní molekuly obsahující jedinou mutaci v extracelulámí doméně CTLA4, jako je L104EIg (jak je uvedena na Obr. 194) nebo L104SIg, kde L104EIg a L104SIg jsou mutované ve své CTLA4 sekvenci tak, že leucin v pozici +104 je substituovaný kyselinou glutamovou nebo serinem, v příslušném pořadí. Mutantní molekuly s mutací v jednom místě dále obsahují CTLA4 části obsahující methionin v pozici +1 až kyselinu asparagovou v pozici +124, a spojovací aminokyselinový zbytek glutamin v pozici +125, a imunoglobulinovou část tvořenou kyselinou glutamovou v pozici +126 až lysinem v pozici +357. Imunoglobulinová část mutantní molekuly může být také mutovaná tak, že cysteiny v pozicích +130, +136 a +139 jsou substituované serinem a prolin v pozici +148 je substituovaný serinem. Alternativně, rozpustná CTLA4 mutantní molekula s jednou mutací může mít CTLA4 část tvořenou alaninem v pozici -1 až kyselinou asparagovou v pozici +124.
Vynález poskytuje rozpustné CTLA4 mutantní molekuly obsahující dvě mutace v extracelulámí doméně CTLA4, jako je L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg nebo L104EA29WIg, kde leucin v pozici +104 je substituovaný kyselinou glutamovou, a alanin v pozici +29 je substituovaný tyrosinem, leucinem, threoninem nebo tryptofanem, v příslušném pořadí. Sekvence pro L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg a L104EA29WIg, začínající methioninem v pozici +1 a končící lysinem v pozici +357, plus signální (vedoucí) peptidové sekvence, jsou obsaženy v sekvencích uvedených na obr. 3 a 20 až 22, v příslušném pořadí. Mutantní molekuly se dvěma mutacemi dále zahrnují CTLA4 části tvořené methioninem v pozici +1 až kyselinou asparagovou v pozici +124, spojovacím aminokyselinovým zbytkem glutaminem v pozici ++25, a imunoglobulinovou část tvořenou kyselinou glutamovou v pozici +126 až lysinem v pozici +357. Imunoglobulinová část mutantní molekuly může být také mutovaná tak, že cysteiny v pozicích +130, +136 a +139 jsou substituované serinem, a prolin v pozici +148 je substituovaný serinem. Alternativně, tyto mutantní molekuly mohou obsahovat CTLA4 část tvořenou alaninem v pozici -1 až kyselinou asparagovou v pozici +124.
Vynález poskytuje rozpustné CTLA4 mutantní molekuly obsahující na dvou místech mutace v extracelulámí doméně CTLA4, jako je L104EG105FIg, L104EG105WIg a L104EG105LIg, kde leucin v pozici +104 je substituovaný kyselinou glutamovou a glycin v pozici +105 je substituovaný fenylalaninem, tryptofanem nebo leucinem, v příslušném pořadí. Mutantní molekuly se dvěma mutacemi mohou dále obsahovat CTLA4 části tvořené methioninem v pozici +1 až kyselinou asparagovou v pozici +124, spojovacím aminokyselinovým zbytkem glutaminem v pozici +125, a imunoglobulinovou částí tvořenou kyselinou glutamovou v pozici +126 až lysinem v pozici +357. Imunoglobulinová část může být také mutovaná tak, že cysteiny v pozicích +130, +136 a +139 jsou substituované serinem, a prolin v pozici +148 je substituovaný serinem. Alternativně, tyto mutantní molekuly mohou obsahovat CTLA4 část tvořenou alaninem v pozici -1 až kyselinou asparagovou v pozici +124.
-18CZ 305380 B6
Vynález dále poskytuje L104ES25RIg, což je mutantní molekula se dvěma mutacemi obsahující CTLA4 část tvořenou methioninem v pozici +1 až kyselinou asparagovou v pozici +124, spojovacím aminokyselinovým zbytkem glutaminem v pozici +125, a imunoglobulinovou částí tvořenou kyselinou glutamovou v pozici +126 až lysinem v pozici +357. Část obsahující extracelulámí doménu CTLA4 je mutovaná tak, že serin v pozici +25 je substituovaný argininem a leucin v pozici +104 je substituovaný kyselinou glutamovou. Alternativně, L104ES25RIg může obsahovat CTLA4 část tvořenou alaninem v pozici -1 až kyselinou asparagovou v pozici +124.
Vynález poskytuje rozpustné CTLA4 mutantní molekuly obsahující mutace ve dvou místech extracelulámí domény CTLA4, jako je 104ET30GIg a L104ET30NIg, kde je leucin v pozici +104 substituovaný kyselinou glutamovou, a threonin v pozici +30 je substituovaný glycinem nebo asparaginem, v příslušném pořadí. Mutantní molekuly s mutacemi na dvou místech dále obsahují CTLA4 části tvořené methioninem v pozici +1 až kyselinou asparagovou v pozici +124, spojovacím aminokyselinovým zbytkem glutaminem v pozici +125, a imunoglobulinovou částí tvořenou kyselinou glutamovou v pozici +126 až lysinem v pozici +357. Imunoglobulinová část může být také mutovaná tak, že cysteiny v pozicích +130, +136 a +139 jsou substituované serinem, a prolin v pozici +148 je substituovaný serinem. Alternativně, tyto mutantní molekuly mohou obsahovat CTLA4 část tvořenou alaninem v pozici -1 až kyselinou asparagovou v pozici +124.
Vynález poskytuje rozpustné CTLA4 mutantní molekuly obsahující mutace ve třech místech extracelulámí domény CTLA4, jako je L104IEA29YS25Klg, L104EA29YS25Nlg, L104EA29YS25RIg, kde je leucin v pozici +104 substituovaný kyselinou glutamovou, alanin v pozici +29 je substituovaný tyrosinem, a serin v pozici +25 je změněn na lysin, asparagin nebo arginin, v příslušném pořadí. Mutantní molekuly s mutacemi na třech místech dále obsahují CTLA4 části tvořené methioninem v pozici +1 až kyselinou asparagovou v pozici +124, spojovacím aminokyselinovým zbytkem glutaminem v pozici +125, a imunoglobulinovou částí tvořenou kyselinou glutamovou v pozici +126 až lysinem v pozici +357. Imunoglobulinová část může být také mutovaná tak, že cysteiny v pozicích +130, +136 a +139 jsou substituované serinem, a prolin v pozici +148 je substituovaný serinem. Alternativně, tyto mutantní molekuly mohou obsahovat CTLA4 část tvořenou alaninem v pozici -1 až kyselinou asparagovou v pozici +124.
Dalšími provedeními rozpustných CTLA4 mutantních molekul jsou chimérické CTLA4/CD28 homologní mutantní molekuly, které se váží na B7 (Peach, R. I., et al., 1994 J. Exp. Med. 180:2049-2058). Příklady těchto chimérických CTLA4/CD2DS mutantních molekul jsou HS1, 13152, HS3, HS4, HS5, 13156, HS4A, HS4B, HS7, HS8, 13159, 131510, HS11, HS12, HS13 a HS14 (U.S. patent č. 5,773,253).
Výhodnými provedeními předkládaného vynálezu jsou rozpustné CTLA4 molekuly, jako je CTLA4Ig (uvedený na obr. 2, začínající methioninem v pozici +1 a končící lysinem v pozici +357) a rozpustný CTLA4 mutantní L104EA29YIg (uvedený na obr. 3, začínající methioninem v pozici +1 a končící lysinem v pozici +357).
Vynález dále poskytuje molekuly nukleové kyseliny kódující aminokyselinové sekvence odpovídající solubilním CTLA4 molekulám podle předkládaného vynálezu. Vjednom provedení je molekulou nukleové kyseliny DNA (např. cDNA) nebo její hybrid. DNA kódující CTLA4Ig (Obr. 2) byla uložena 31.5. 1999 v American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 a bylo jí přiděleno ATCC přírůstkové č. ATCC 68629. DNA kódující L104EA29YIg (sekvence uvedená na Obr. 3) byla uložena 19. 6. 2000 v ATCC pod ATCC přírůstkovým č. PTA-2104. Alternativně jsou molekulami nukleové kyseliny RNA nebo její hybridy.
- 19CZ 305380 B6
CTLA4 hybridy
Předkládaný vynález poskytuje solubilní CTLA4 mutantní molekuly obsahující alespoň extracelulámí doménu CTLA4 nebo její část, která se váže na CD80 a/nebo CD86. Extracelulámí část CTLA4 obsahuje methionin v pozici +1 až kyselinu asparagovou v pozici +124 (např. obr. 1). Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat alanin v pozici -1 až kyselinu asparagovou v pozici +124 (např. obr. 1). Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat kyselinu glutamovou v pozici +95 až cystein v pozici +120. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat methionin v pozici +1 až cystein v pozici +21 a kyselinu glutamovou v pozici +95 až kyselinu asparagovou v pozici +122. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat methionin v pozici +1 až tyrosin v pozici +23 a valin v pozici +32 až kyselinu asparagovou v pozici +122. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat alanin v pozici +24 až kyselinu glutamovou v pozici +31 a kyselinu glutamovou v pozici +95 až kyselinu asparagovou v pozici +122. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat alanin v pozici +24 až kyselinu glutamovou v pozici +31 a kyselinu glutamovou v pozici +95 až isoleucin v pozici +112. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat alanin v pozici +24 až kyselinu glutamovou v pozici +31 a tyrosin v pozici +113 až kyselinu asparagovou v pozici +122. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat alanin v pozici +50 až kyselinu glutamovou v pozici +57 a kyselinu glutamovou v pozici +95 až kyselinu asparagovou v pozici +122. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat alanin v pozici +24 až kyselinu glutamovou v pozici +31; alanin v pozici +50 až kyselinu glutamovou v pozici +57; a kyselinu glutamovou v pozici +95 až kyselinu asparagovou v pozici +122. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat alanin v pozici +50 až kyselinu glutamovou v pozici +57 a kyselinu glutamovou v pozici +95 až isoleucin v pozici +112. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat alanin v pozici +24 až kyselinu glutamovou v pozici +57; a kyselinu glutamovou v pozici +95 až kyselinu asparagovou v pozici +122. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat alanin v pozici +24 až valin v pozici +94. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat alanin v pozici -1 až cystein v pozici +21. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat methionin v pozici +1 až cystein v pozici +21. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat kyselinu glutamovou v pozici +95 až kyselinu asparagovou v pozici +122. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat alanin v pozici -1 až valin v pozici +94. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat methionin v pozici +1 až valin v pozici +94. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat alanin v pozici +24 až kyselinu glutamovou v pozici +31. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat alanin v pozici -1 až tyrosin v pozici +23. Extracelulární část CTLA4 může obsahovat methionin v pozici +1 až tyrosin v pozici +23. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat valin v pozici +32 až kyselinu asparagovou v pozici +122. Extracelulární část CTLA4 může obsahovat tyrosin v pozici +113 až kyselinu asparagovou v pozici +122. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat kyselinu glutamovou v pozici +95 až isoleucin v pozici +112. Extracelulámí část CTLA4 může obsahovat alanin v pozici +50 až kyselinu glutamovou v pozici +57.
Způsoby produkce molekul podle předkládaného vynálezu
Exprese CTLA4 mutantních molekul může být provedena v prokaryotických buňkách. Prokaryotické buňky jsou často reprezentovány různými kmeny bakterií. Bakterie mohou být grampozitivní nebo gram-negativní. Mohou být použity také jiné mikrobiální kmeny.
Nukleotidové sekvence kódující CTLA4 mutantní molekuly mohou být vloženy do vektorů navržených pro exprimování cizorodých sekvencí v prokaryotických buňkách, jako je E. coli. Tyto vektory mohou obsahovat běžně používané prokaryotické kontrolní sekvence, které jsou zde definovány jako sekvence obsahující promotory pro iniciaci transkripce, volitelně s operátorem, spolu se sekvencemi vazebného místa pro ribosomy, a zahrnují takové běžně používané promotory, jako je beta-laktamasový (penicillinasový) a laktosový (lac) promotor (Chang, et al., (1977) Nátuře 198:1056), tryptofanový (trp) promotor (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) a PL promotor a N-genové ribosomové vazebné místo od fágu lambda (Shimatake, et al.,( 1981) Nátuře 292:128).
-20CZ 305380 B6
Takové expresní vektory budou také obsahovat sekvence rozpoznávající počátek replikace a selektovatelné markéry, jako je gen pro beta-laktamasu nebo neomycin fosfotransferázu, které udílejí resistenci na antibiotika, a potom může být vektor replikován v bakteriích a buňkách nesoucích plasmid, které mohou být selektovány kultivací za přítomnosti antibiotik, jako je ampicilin nebo kanamycin.
Expresní plazmid může být vložen do prokaryotických buněk pomocí různých standardních metod, včetně například CaCl2-šoku (Cohen, (1972) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69:2110, a Sambrook et al. (eds.), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual“, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989)), a elektroporace.
Pro předkládaný vynález jsou také vhodnými buňkami eukaryotické buňky. Příklady eukaryotických buněk jsou jakékoliv živočišné buňky, primární nebo imortalizované, kvasinky (např. Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe a Pichia pastoris), a rostlinné buňky. Myelomové, COS a CHO jsou také příklady živočišných buněk, které mohou být použity jako hostitelské buňky. Mezi konkrétní CHO buňky patří, například, DG44 (Chasm, et al., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36: 10901-10909), CHO-K1 (ATCC č. CCL-61), CHO-K1 Tet-On buněčná linie (Clontech), CHO označené jako ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, 1310, CHO klon B (GETMG, Genová, IT), CHO klon B (GEIMG, Genová, IT), CHO-K1/SF označený jako ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), a RR-CHOK1 označený ECACC 92052 P9 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Příklady rostlinných buněk jsou tabákové (z celých rostlin, buněčné kultury nebo kalu), kukuřičné, sójové a rýžové buňky. Přijatelná jsou také kukuřičná, sojová a rýžová semena.
Nukleotidové sekvence kódující CTLA4 mutantní molekuly mohou být také insertovány do vektoru navrženého pro expresi cizorodých sekvencí v eukaryotických hostitelích. Regulační elementy vektoru mohou být různé pro různé eukaryotické hostitelské buňky. Molekula nukleové kyseliny kódující L104EA29YIg je obsažena vpD16 L104EA29YIg a byla uložena 19.6.2000 v American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manasas, VA 20110— 2209 (ATCC ě. PTA-2104). pD16 L104EA29YIg vektor je derivátem pcDNA3 vektoru (INVITROGEN).
Mezi běžně používané eukaryotické kontrolní sekvence pro použití v expresních vektorech patří promotory a kontrolní sekvence kompatibilní se savčími buňkami, jako je, například, CMV promotor (CDM8 vektor) a virus ptačího sarkomu(ASV) (píLN vektor). Dalšími běžně používanými promotory jsou časný a pozdní promotor ze Simian Virus 40 (SV40) (Fiers, et al., (1973) Nátuře 273:113), nebo jiné virové promotory, jako jsou promotory odvozené od polyoma, Adenoviru 2, a hovězího papilloma viru. Také může být použit indukovatelný promotor, jako je hMTII (Karin, et al., (1982) Nátuře 299:797-802).
Vektory pro exprimování CTLA4 mutantní molekuly v eukaryotech transkripce. Tyto sekvence jsou významné pro optimalizaci genové exprese a jsou umístěny před nebo za promotorovým regionem.
Příklady expresních vektorů pro použití v eukaryotických hostitelských buňkách jsou, například, vektory pro savčí hostitelské buňky (např., BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pITES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVl (Life Technologies); pVPakc Vektory, pCMV vektory, pSG5 vektory (Stratagene)), retrovirové vektory (např., pFB vektory (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) nebo jejich modifikované formy, adenovirové vektory; adeno-asociované virové vektory, bakulovirové vektory, kvasinkové vektory (např., pESC vektory (Stratagene).
Nukleotidové sekvence kódující CTLA4 mutantní molekuly mohou být integrovány do genomu eukaryotické hostitelské buňky a replikují se jako kopie genomu hostitelské buňky. Alternativně může vektor nesoucí CTLA4 mutantní molekulu obsahovat sekvence rozpoznávající počátek replikace umožňující extrachromosomální replikaci.
-21 CZ 305380 B6
Pro expresi nukleotidové sekvence v Saccharomyces cerevisiae může být použito sekvence rozpoznávající počátek replikace z endogenního kvasinkového plasmidu, 2 kruh (Broach, (1983) Meth. Enz. 101:307). Alternativně může být použita sekvence z kvasinkového genomu schopná navodit autonomní replikaci (viz například, Stinchcomb et al., (1979) Nátuře 282:39); Tschemper et al., (1980) Gene 10:157; a Clarke et al., (1983) Meth. Enz. 101:300).
Mezi transkripční kontrolní sekvence pro kvasinkové vektory patří promotory pro syntézu glykolytických enzymů (Hess et al., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; Holland et al., (1978) Biochemistry 17:4900). Mezi další promotory známé v oboru patří CMV promotor obsažený v CDM8 vektoru (Toyama a Okayama, (1990) FEBS 268:217-221); promotor pro 3-fosfoglycerát-kinasu (Hitzeman. et al., (1980) J. Biol. Chem. 255:2073), a promotory pro další glykolytické enzymy.
Jiné promotory jsou indukovatelné, protože mohou být regulovány vnějšími podněty nebo kultivačním mediem buněk. Mezi indukovatelné promotory patří promotory z genů pro proteiny teplotního šoku, alkoholdehydrogenasu 2, isochytochrom C, kyselou fosfatasu, enzymy asociované s katabolismem dusíku a enzymy odpovědné za využití maltózy a galaktózy.
Regulační sekvence mohou být také umístěny na 3' konci kódující sekvence. Tyto sekvence mohou účinkovat tak, že stabilizují messengerovou RNA. Takové terminátory se nacházejí v 3' netranslatovaném regionu po kódujících sekvencích v několika kvasinkových a savčích genech.
Příklady vektorů pro rostliny a rostlinné buňky jsou, například, Agrobacterium Tiplasmidy, virus květákové mozaiky (CaMV), a virus zlaté mozaiky rajčat (TGMV).
Obecné aspekty transformací savčích hostitelských buněk byly popsány v (U.S. Patentu 4,399,216, uděleném 16.8.1983). Savčí buňky mohou být transformovány způsoby jako je transfekce za přítomnosti fosforečnanu vápenatého, mikroinjekce, elektroporace nebo transdukcí virovými vektory. Mezi způsoby vhodné pro vnesení cizorodé DNA sekvence do rostlinných a kvasinkových genomů patří (1) mechanické metody, jako je mikroinjekce DNA do jedné buňky nebo protoplastů, víření buněk se skleněnými korálky za přítomnosti DNA, nebo vystřelování wolframových nebo zlatých sfér potažených NA do buněk nebo protoplastů; (2) vnesení DNA do buněk pomocí zpermeabilnění buněčných membrán pro makromolekuly pomocí zpracování polyethylenglykolem nebo elektrickými pulsy o vysokém napětí (elektroporace); nebo (3) použití liposomů (obsahujících cDNA), které fúzují s buněčnými membránami.
Exprese CTLA4 mutantních molekul může být detekována za použití způsobů známých v oboru. Například může být mutantní molekula detekována Coomassie barvením SDS-PAGE gelů a imunopřenosem za použití protilátek, které se váží na CTLA4. Zpětný odběr proteinu může být proveden za použití standardních způsobů pro přečištění proteinů, např., afinitní chromatografie nebo iontoměničové chromatografie, za zisku produktu s významně vyšší čistotou (R. Scopes v: „Protein Purification. Principles a Practice“, Third Edition, Springer-Verlag (1994)).
Vynález dále poskytuje solubilní CTLA4 mutantní proteinovou molekulu produkovanou způsoby podle předkládaného vynálezu.
Mutageneze CTLA4Ig na bázi kodonů
V jednom provedení byla místně cílená mutageneze a nový skríningový postup použity pro identifikaci několika mutací v extracelulámí doméně CTLA4, kde tyto mutace zlepšovaly jeho vazebnou aviditu pro CD86. V tomto provedení byly mutace provedeny na zbytcích v regionech extracelulámí domény CTLA4 od šeřinu 25 do argininu 33, C' řetězci (alanin 49 a threonin 51), F řetězci (lysin 93, kyselina glutamová 95 a leucin 96), a v regionech od methioninu 97 do tyrosinu 102, tyrosinu 103 až glycinu 107 a v G řetězci v pozicích glutamin 111, tyrosin 113 a isoleucin 115. Tato místa byla vybrána na základě studia chimérických CD28/CTLA4 fúzních proteinů
-22CZ 305380 B6 (Peach et al., J. Exp. Med., 1994, 180:2049-2058), a podle modelu předpovídajícího, které vedlejší řetězce aminokyselinových zbytků budou vystaveny rozpouštědlu, a podle chybění identity nebo homologie aminokyselinových zbytků v některých pozicích mezi CD28 a CTLA4. Jakýkoliv zbytek, který je prostorově v těsné blízkosti (5 až 20 x 10“10 m) k identifikovaným zbytkům je považován za součást předkládaného vynálezu.
Pro syntetizování a testování rozpustných CTLA4 mutantních molekul s alterovanými afinitami k CD80 a/nebo CD86 se použila dvoustupňová strategie. V pokusech se nejprve připravila knihovna mutací ve specifických kodonech extracelulámí části CTLA4 a potom se tato knihovna testovala za použití Biacore analýzy pro určení mutantů s alterovanou reaktivitou s CD80 nebo CD86. Biacore testovací systém (Pharmacia, Pistcataway, N.J.) využívá detekce pomocí povrchové plazmonové rezonance, který využívá kovalentní vazby CD80Ig nebo CD86Ig na dextranem potažený senzorový čip, který je umístěn v detektoru. Testovaná molekula se potom injikuje do komůrky obsahující senzorový čip a množství komplementárního proteinu, který se naváže, může být hodnoceno podle změny molekulové hmotnosti, která je fyzikálně asociovaná s dextranem potaženou stranou senzorového čipu; změna molekulové hmotnosti může být měřena detektorovým systémem.
Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu
Vynález zahrnuje farmaceutické prostředky pro použití při léčbě onemocnění imunitního systému, kde tyto prostředky obsahují farmaceuticky účinná množství rozpustné CTLA4 mutantní molekuly. V některých provedeních jsou onemocnění imunitního systému zprostředkována interakcemi CD28- a/nebo CTLA4- pozitivních buněk s CD80 a/nebo CD86 pozitivními buňkami. Solubilní CTLA4 molekuly jsou výhodně rozpustné CTLA4 molekuly s přirozenou sekvencí a/nebo rozpustné CTLA4 molekuly obsahující jednu nebo více mutací v extracelulámí doméně CTLA4. Farmaceutický prostředek může obsahovat rozpustnou CTLA4 proteinovou molekulu a/nebo molekulu nukleové kyseliny, a/nebo vektor kódující molekulu. Ve výhodném provedení mají solubilní CTLA4 molekuly aminokyselinové sekvence extracelulámí domény CTLA4 uvedené na Obr. 3 (L104EA29Y). Ještě výhodněji je solubilní CTLA4 mutantní molekulou L104EA29YIg, jak je uvedena na obr. 3. Prostředky mohou dále obsahovat další terapeutická činidla, včetně imunosupresivních činidel, NSAID, kortikosteroidů, glukokortikoidů, léčiv, toxinů, enzymů, protilátek nebo konjugátů.
V jednom provedení farmaceutický prostředek obsahuje účinné množství solubilní CTLA4 molekuly samotné nebo v kombinaci s účinným množstvím alespoň jednoho dalšího terapeutického činidla, včetně imunosupresivního činidla nebo NSAID.
Účinná množství CTLA4 ve farmaceutickém prostředku mohou být v rozmezí od přibližně 0,1 do 100 mg/kg hmotnosti jedince. V jiném provedení může být účinné množství od přibližně 0,5 do 5 mg/kg hmotnosti jedince, od přibližně 5 do 10 mg/kg hmotnosti jedince, přibližně od 10 do 15 mg/kg hmotnosti jedince, od přibližně 15 do 20 mg/kg hmotnosti jedince, od přibližně 20 do 25 mg/kg hmotnosti jedince, od přibližně 25 do 30 mg/kg hmotnosti jedince, od přibližně 30 do mg/kg hmotnosti jedince, od přibližně 35 do 40 mg/kg hmotnosti jedince, od přibližně 40 do mg/kg hmotnosti jedince, od přibližně 45 do 50 mg/kg hmotnosti jedince, od přibližně 50 do mg/kg hmotnosti jedince, od přibližně 55 do 60 mg/kg hmotnosti jedince, od přibližně 60 do mg/kg hmotnosti jedince, od přibližně 65 do 70 mg/kg hmotnosti jedince, od přibližně 70 do mg/kg hmotnosti jedince, od přibližně 75 do 80 mg/kg hmotnosti jedince, od přibližně 80 do mg/kg hmotnosti jedince, od přibližně 85 do 90 mg/kg hmotnosti jedince, od přibližně 90 do mg/kg hmotnosti jedince, nebo od přibližně 95 do 100 mg/kg hmotnosti jedince. V jiném provedení je účinné množství od 2 mg/kg hmotnosti jedince. V jiném provedení je účinné množství 10 mg/kg hmotnosti jedince. V jiném provedení je účinné množství solubilní CTLA4 molekuly 2 mg/kg hmotnosti jedince. V jiném provedení je účinné množství solubilní CTLA4 molekuly 10 mg/kg hmotnosti jedince.
-23 CZ 305380 B6
Dávka imunosupresivního činidla podaná jedinci závisí na několika faktorech, včetně účinnosti léku na konkrétního jedince a toxicity (tj. tolerability) léku pro konkrétního jedince.
Methotrexát je obvykle podán v dávce od přibližně 0,1 do 40 mg za týden, s obvyklou dávkou v rozmezí od přibližně 5 do 30 mg za týden. Methotrexát může být podáván jedinci v různých dávkách: přibližně 0,1 až 5 mg/týden, přibližně 5 až 10 mg/týden, přibližně 10 až 15 mg/týden, přibližně 15 až 20 mg/týden, přibližně 20 až 25 mg/týden, přibližně 25 až 30 mg/týden, přibližně 30 až 35 mg/týden, nebo přibližně 35 až 40 mg/týden. Vjednom provedení je účinným množstvím imunosupresivního činidla, včetně methotrexátu, dávka přibližně 10 až 30 mg/týden.
Účinné množství methotrexátu je v rozmezí od přibližně 0,1 do 40 mg/týden. Vjednom provedení je účinné množství v rozmezí od přibližně 0,1 do 5 mg/týden, od přibližně 5 do 10 mg/týden, od přibližně 10 do 15 mg/týden, od přibližně 15 do 20 mg/týden, od přibližně 20 do 25 mg/týden, od přibližně 25 do 30 mg/týden, od přibližně 30 do 35 mg/týden, nebo od přibližně 35 do 40 mg/týden. V jednom provedení je methotrexát podán v dávce od přibližně 10 do 30 mg/týden.
Cyklofosfamid, alkylační činidlo, může být podán v dávce přibližně 1 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti za den.
Cyklosporin (např. NEORAL), též známý jako Cyklosporin A, je obvykle podáván v dávce v rozmezí přibližně 1 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti a den. Obvykle jsou používány dávky v rozmezí přibližně 2,5 až 4 mg na tělesné hmotnosti a den.
Chlorochin nebo hydroxychlorochin (např. PLAQUENIL) je obvykle podáván v dávce v rozmezí přibližně 100 až 1000 mg na den. Výhodné jsou dávky v rozmezí přibližně 200 až 600 mg za den.
Sulfasalazin (např. AZULFIDINE EN-tabs®) je obvykle podáván v dávkách přibližně 50 až 5000 mg za den, s běžnými dávkami přibližně 2000 až 3000 mg za den, pro dospělé. Dávky pro děti jsou obvykle přibližně 5 až 100 mg/kg tělesné hmotnosti, do 2 gramů za den.
Soli zlata jsou dostupné pro dvě formy podání: injekční nebo orální, kde injekční soli zlata jsou obvykle podávány v dávkách přibližně 5 až 100 mg každé dva až čtyři týdny. Orálně podávané soli zlata jsou obvykle podávány v dávkách přibližně 1 až 10 mg za den.
D-penicillamin nebo penicillamin (CUIPRIMINE®) je obvykle podáván v dávkách přibližně 50 až 2000 mg za den, s výhodnými dávkami přibližně 125 mg za den až 1500 mg za den.
Azathioprin je obvykle podáván v dávkách přibližně 10 až 250 mg za den. Výhodné jsou dávky v rozmezí přibližně 25 až 200 mg za den.
Anakinra (např. KINERET®) je antagonista receptoru pro interleukin-1. Běžnými dávkami pro anakinru jsou dávky přibližně 10 až 250 mg za den, s doporučenou dávkou přibližně 100 mg za den.
Infliximab (REMICADE®) je chimérická monoklonální protilátka, která se váže na faktor nekrózy nádoru alfa (TNFalfa). Infliximab je obvykle podáván v dávkách přibližně 1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti každé čtyři až osm týdnů. Dávky přibližně 3 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti mohou být podávány každé čtyři až osm týdnů, podle jedince.
Etanercept (např. ENBREL®) je dimemí fůzní protein, který se váže na faktor nekrózy nádorů (TNF) a blokuje jeho interakce s TNF receptory. Běžně podávané dávky etanerceptu jsou dávky v rozmezí přibližně 10 až 100 mg za týden pro dospělé, kdy výhodnou dávkou je dávka přibližně 50 mg za týden, dávky pro mladistvé jsou v rozmezí přibližně 0,1 až 50 mg/kg tělesné hmotnosti a týden, s maximální dávkou přibližně 50 mg za týden.
-24CZ 305380 B6
Leflunomid (ARAVAR) je obvykle podáván v dávkách přibližně 1 až 100 mg za den. Běžnou denní dávkou je dávka přibližně 10 až 20 mg za den.
Farmaceutické prostředky také výhodně obsahují vhodné nosiče a adjuvans, kterými může být jakýkoliv materiál, který po smísení s molekulami podle předkládaného vynálezu (např. rozpustnou CTLA4 molekulou, jako je L104EA29YIg) zachovává aktivitu molekuly, a je nereaktivní s imunitním systémem jedince. Mezi tyto nosiče a adjuvans patří, například, lidský sérový albumin, iontoměniče, kamence; lecitin; pufrovací substance, jako jsou fosfáty; glycin; kyselina sorbová; sorbát vápenatý; a soli nebo elektrolyty, jako je protamin-sulfát. Dalšími příklady jsou standardní farmaceutické nosiče, jako je fosfátem pufrovaný salinický roztok; voda, emulze (např. emulze olej/voda); a různé typy smáčivých činidel. Jinými nosiči jsou sterilní roztoky; tablety, včetně potahovaných tablet a kapslí. Obvykle takové nosiče obsahují přísady, jako je škrob, mléko, cukr, některé typy hlinek, želatinu, kyselinu stearovou nebo její soli, hořečnatý nebo vápenatý stearát, talek, rostlinné tuky nebo oleje, klovatiny, glykoly, nebo jiné známé přísady. Takové nosiče mohou také obsahovat chuťová korigens nebo barviva nebo jiné složky. Prostředky obsahující takové nosiče jsou připraveny způsoby známými v oboru. Takové prostředky mohou být také formulovány s různými lipidovými kompozicemi, jako jsou například liposomy, stejně jako s různými polymemími prostředky, jako jsou polymerové mikrosféry.
Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být podány za použití běžných způsobů podání, jako je intravenózní (i.v.) podání, intraperitoneální (i.p.) podání, intramuskulámí (i.m.) podání, podkožní podání, orální podání, podání ve formě čípků, nebo lokální podání, nebo jako je implantace prostředku se zpomaleným uvolňováním, jako je miniosmotická pumpa.
Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být v různých dávkových formách, mezi které patří, například, kapalné roztoky nebo suspenze, tablety, pilulky, prášky, čípky, polymemí mikrokapsle nebo mikrovesikuly, liposomy a injekční nebo infuzní roztoky. Výhodná forma závisí na způsobu podání a terapeutické aplikaci.
Nejúčinnější způsob podání a dávkovači pro prostředky podle předkládaného vynálezu závisí na závažnosti a průběhu onemocnění, zdravotním stavu pacienta a odpovědi na léčbu a úsudku ošetřujícího lékaře. Proto by měly být dávky titrovány pro konkrétního pacienta.
Solubilní CTLA4 mutantní molekuly by měly být podávány jedincům v dávkách a po dobu (např. celkovou dobu a/nebo počet aplikací) dostatečnou pro blokování vazby endogenních B7 (např., CD80 a/nebo CD86) molekul na jejich příslušné ligandy u jedince. Blokáda vazby endogenní B7/ligand tak inhibuje interakce mezi B7-pozitivními buňkami (např., CD80- a/nebo CD86pozitivními buňkami) s CD28- a/nebo CTLA4-pozitivními buňkami. Dávka terapeutického činidla je závislá na mnoha faktorech, včetně například, typu léčeného autoimunitního onemocnění, závažnosti onemocnění, zdravotního stavu jedince a reakce jedince na léčbu činidlem. Proto jsou dávky různé u různých subjektů a podle způsobu podání. Solubilní CTLA4 mutantní molekuly mohou být podány v dávce mezi 0,1 a 20,0 mg/kg hmotnosti pacienta/den, výhodně mezi 0,5 a 10,0 mg/kg/den. Podání farmaceutických prostředků podle předkládaného vynálezu může být provedeno v průběhu různé doby. V jednom provedení může být farmaceutický prostředek podle předkládaného vynálezu podán během jedné nebo více hodin. Kromě toho může být podání zopakováno v závislosti na závažnosti onemocnění a na jiných faktorech známých v oboru.
Způsoby podle předkládaného vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje způsoby pro léčbu onemocnění imunitního systému a autoimunitního onemocnění u jedince, kde tyto způsoby zahrnují podání účinného množství solubilní CTLA4 nebo CTLA4 mutantní molekuly, která se váže na CD80 a/nebo CD86 molekuly na CD80 a/nebo CD86-pozitivních buňkách a tím inhibuje vazbu CD80 a/nebo CD86 na CTLA4 a/nebo CD28. Způsoby zahrnují podání terapeutického přípravku, který obsahuje solubilní CTLA4 nebo CTLA4 mutantní molekulu podle předkládaného vynálezu, jedinci v množství účin-25CZ 305380 B6 ném pro zmírnění alespoň jednoho příznaku asociovaného s onemocněním imunitního systému. Dále vynález poskytuje dlouhodobou terapii pro onemocnění imunitního systému, při které se blokují interakce B7-pozitivních buněk a T-lymfocytů, což blokuje aktivaci/stimulaci T-lymfocytů kostimulační signály, jako je vazba B7 na CD28, což vede k indukci anergie T-lymfocytů nebo tolerance.
Solubilní CTLA4 nebo CTLA4 mutantní molekuly podle předkládaného vynálezu vykazují inhibiční vlastnosti in vivo. Za podmínek, při kterých dochází k interakcím T-lymfocytů/B7pozitivních buněk, například k interakcím T lymfocytů/B-lymfocytů, v důsledku kontaktu mezi T lymfocyty a B7-pozitivními buňkami, může vazba podaných CTLA4 molekul na B7-pozitivní buňky, například B-lymfocyty, interferovat, tj. inhibovat interakce T-lymfocyty/B7-pozitivní buňky, což vede k regulaci imunitní reakce. Inhibice T-lymfocytámí reakce podáním solubilní CTLA4 molekuly může být také užitečná pro léčbu autoimunitních onemocnění. Mnoho autoimunitních onemocnění vzniká v důsledku nevhodné aktivace T-lymfocytů, kteréjsou reaktivní proti autoantigenům, a které podporují produkci cytokinů a autoprotilátek, které se podílejí na patogenesi onemocnění. Podání L104EA29YIg molekuly jedinci trpícímu nebo rizikovému z hlediska vzniku autoimunitního onemocnění může zabránit aktivaci autoreaktivních T-lymfocytů a může redukovat nebo eliminovat příznaky onemocnění. Tento způsob může také zahrnovat podání L104EA29YIg molekuly podle předkládaného vynálezu jedinci, samostatně nebo v kombinaci s dalšími ligandy, jako jsou ligandy reaktivní s IL-2, IL-4 nebo gamma-interferonem.
Vynález poskytuje metody pro regulování imunitní reakce. Imunitní reakce mohou být negativně regulovány (redukovány) solubilní CTLA4 nebo CTLA4 mutantní molekulou podle předkládaného vynálezu a takto mohou být inhibovány nebo blokovány již probíhající imunitní reakce nebo může být zabráněno indukci imunitní reakce. Solubilní CTLA4 nebo CTLA4 mutantní molekuly podle předkládaného vynálezu mohou inhibovat funkce aktivovaných T-lymfocytů, jako je proliferace T-lymfocytů a sekrece cytokinů, tím, že tlumí reakci T-lymfocytů nebo tím, že indukují specifickou toleranci u T-lymfocytů, nebo oboje. Dále, solubilní CTLA4 nebo CTLA4 mutantní molekuly podle předkládaného vynálezu mohou tím, že interferují s CTLA4/CD28/B7 dráhou, inhibovat proliferací T-lymfocytů a/nebo sekreci cytokinů, což vede ke snížení destrukce tkáně a k indukci hyporeaktivity nebo anergie T-lymfocytů.
Vynález dále poskytuje metody pro inhibici rejekce orgánových nebo tkáňových transplantátů u jedinců, které zahrnují podání účinného množství alespoň jedné solubilní CTLA4 nebo CTLA4 molekuly, např. L104EA29YIg, jedinci před, během nebo po transplantaci. V jiném provedení způsob podle předkládaného vynálezu zahrnuje podání alespoň jedné solubilní CTLA4 nebo CTLA4 mutantní molekuly v kombinaci s alespoň jedním dalším terapeutickým činidlem, včetně léčiv, toxinů, enzymů, protilátek nebo konjugátů.
Orgánový nebo tkáňový transplantát může být transplantát jakéhokoliv orgánu nebo tkáně, který je vhodný pro transplantaci. V jednom provedení může být transplantovanou tkání pankreatická tkáň. Ve výhodném provedení jsou transplantovanou tkání buňky pankreatických ostrůvků. Vynález také poskytuje způsoby pro léčbu diabetů typu 1 a/nebo 2 u jedince, které zahrnují inhibování rejekce transplantovaných buněk pankreatických ostrůvků.
Předkládaný vynález dále poskytuje způsob pro inhibování rejekce transplantovaných buněk pankreatických ostrůvků u jedince, který je příjemcem transplantované tkáně. U tkáňových transplantátů je rejekce štěpu obvykle zahájena jejich rozpoznáním jako cizorodé tkáně T-lymfocyty, a potom následuje imunitní reakce, která zničí transplantát. Podání solubilní CTLA4 molekuly ve způsobu podle předkládaného vynálezu inhibuje proliferací T-lymfocytů a/nebo produkci cytokinů, což vede k redukované destrukci tkáně a k indukci antigen-specifické hyporeaktivity Tlymfocytů, která může vést ke dlouhodobému přijetí štěpu, bez potřeby generalizované imunosuprese.
-26CZ 305380 B6
Výhodné provedení předkládaného vynálezu zahrnuje použití solubilní CTLA4 mutantní molekuly L104IEA29YIg pro regulaci funkčních interakcí CTLA4- a CD28-pozitivních buněk s B7pozitivními buňkami, za účelem léčby onemocnění imunitního systému, jako je diabetes a/nebo pro zmenšení imunitní reakce. L104EA29YIg podle předkládaného vynálezu je solubilní CTLA4 mutantní molekula obsahující alespoň dvě aminokyselinové změny, leucin (L) na kyselinu glutamovou (E) v pozici +104 a alanin (A) na tyrosin (Y) v pozici +29. L104EA29YIg molekula může kromě uvedených mutací obsahovat další mutace.
Způsob může dále zahrnovat podání solubilní CTLA4 mutantní molekuly současně se základním imunosupresivním režimem. Základní imunosupresivní režim může obsahovat (například): cyklosporin, azathioprin, methotrexát, cyklofosfamid, lymfocytámí imunitní globulin, anti-CD3 protilátky, Rho(D) imunní globulin, adrenokortikosteroidy, sulfasalzin, FK-506, methoxsalen, mykofenolát-mofetil (CELLCEPT), koňská anti-lidský thymocytámí globulin (ATGAM), humanizovanou anti-TAG (HAT), basiliximab (SIMULECT), králičí anti-lidský thymocytámí globulin (THYMOGLOBULIN), sirolimus, thalidomid, methotrexát, chlorochin, hydroxychlorochin, sulfasalazin, sulfasalazopyrin, leflunomid, soli zlata, D-penicillamin, azathioprin, anakinra, infliximab, etanercept, INF-alfa blokátory nebo biologická činidla, která ovlivňují zánětlivé cytokiny. Ve výhodném provedení je základní imunosupresivní režim bez steroidů. Výhodněji obsahuje základní imunosupresivní režim rapamycin a anti-lidský IL-2R mAb.
Jedno provedení vynálezu zahrnuje použití molekuly pro blokování interakce mezi B7 a CTLA4, společně s imunosupresivním činidlem regulujícím imunitní reakci, pro léčbu onemocnění imunitního systému, jako je diabetes. Molekulou použitou pro blokování B7/CTLA4 interakce může být solubilní CTLA4, jako je CTLA4Ig, CTLA4Ig/CD28Ig nebo L104EA29YIg, solubilní CD28, jako je CD28Ig, solubilní B7 (B7-1 nebo B7-2), jako je B7Ig, anti-CTLA4 monoklonální protilátka, anti-CD28 monoklonální protilátka nebo anti-B7 monoklonální protilátka.
Mezi jedince léčené způsoby podle předkládaného vynálezu patří, například, lidé, opice, prasata, koně, ryby, psi, kočky a krávy.
Předkládaný vynález poskytuje různé metody, lokální nebo systémové, pro podání terapeutických prostředků podle předkládaného vynálezu, jako je solubilní CTLA4 molekula samotná nebo společně s imunosupresivním činidlem a/nebo jiným terapeutickým léčivem. Mezi způsoby patří intravenózní, intramuskulámí, intraperitoneální, orální, inhalační a podkožní metody, stejně jako implantovatelné pumpy, kontinuální infuze, genová terapie, liposomy, čípky, lokální prostředky, vesikule, kapsle a injekce. Terapeutické činidlo, ve směsi s nosičem, se obvykle pro skladování lyofilizuje a před použitím se rekonstituuje vodou nebo pufrováným roztokem s neutrálním pH (přibližně pH 7-8, např., pH 7,5).
Jak je v oboru obvyklé, mohou být prostředky podle předkládaného vynálezu podány jedinci v jakékoliv farmaceuticky přijatelné formě.
Způsoby podle předkládaného vynálezu zahrnují podání solubilních CTLA4 molekul podle předkládaného vynálezu za účelem regulace interakcí CD28- a/nebo CTLA4-pozitivních buněk s B7-pozitivními buňkami. B7-pozitivní buňky jsou kontaktovány s účinným množstvím solubilních CTLA4 molekul podle předkládaného vynálezu, nebo jejich fragmentů nebo derivátů, takže dojde ke vzniku komplexů solubilní CTLA4/B7. Komplexy interferují s interakcí mezi endogenními CTLA4 a CD28 molekulami s B7-rodinou molekul.
Solubilní CTLA4 molekuly mohou být podávány jedincům v dávce a po dobu (celkovou dobu a/nebo počet aplikací) dostatečnou pro blokování vazby endogenních B7 molekul na jejich příslušné ligandy u jedince. Blokáda vazby endogenní B7/ligand způsobuje inhibici interakcí mezi B7—pozitivními buňkami a CD28—a/nebo CTLA4—pozitivními buňkami.
-27CZ 305380 B6
Dávka terapeutického činidla je závislá na mnoha faktorech, včetně například, typu postižené tkáně, typu léčeného autoimunitního onemocnění, závažnosti onemocnění, zdravotního stavu jedince a reakce jedince na léčbu činidlem. Proto jsou dávky různé u různých subjektů a různých způsobu podání. Solubilní CTLA4 molekuly mohou být podány v dávce mezi 0,1 a 100 mg/kg hmotnosti pacienta/den.
Vynález také zahrnuje použití prostředků podle předkládaného vynálezu společně s jinými farmaceutickými činidly pro léčbu onemocnění imunitního systému. Například, diabetes může být léčen molekulami podle předkládaného vynálezu společně s, například imunosupresivními činidly, jako jsou kortikosteroidy, cyklosporin (Mathiesen 1989 Cancer Lett. 44(2):151-156), prednison, azathioprin (R. Handschumacher, v: „Drugs Ušed for Immunosuppression“ strany 1264— 1276), TNF-alfa blokátory nebo antagonisty (New England Journal of Medicine, vol. 340: 253259, 1999; The Lancet vol. 354: 1932-39, 1999, Annals of Intemal Medicine, vol. 130: 478486), nebo jakýmikoliv jinými biologickými činidly ovlivňujícími jakékoliv zánětlivé cytokiny, nesteroidními protizánětlivými léky/Cox-2 inhibitory, hydroxychlorochuinem, sulfasalazopryinem, solemi zlata, etanerceptem, infliximabem, rapamycinem, mycofenolát-mofetilem, azathioprinem, tacrolismem, basiliximabem, cytoxanem, interferonem beta-la, interferonem beta-lb, glatiramer-acetátem, mitoxantron-hydrochloridem, amakinrou a/nebo jinými biologickými léčivy.
Solubilní CTLA4 molekuly (výhodně, L104EA29YIg) mohou být také použity v kombinaci s jedním nebo více činidel pro regulování imunitní reakce vybraných ze skupiny zahrnující: solubilní gp39 (též označovaný jako CD40 ligand (CD40L), CD154, T-BAM, TRAP), solubilní CD29, solubilní CD40, solubilní CD80 (např. ATCC 68627), solubilní CD86, solubilní CD28 (např. 63628), solubilní CD56, solubilní Thy-1, solubilní CD3, solubilní TCR, solubilní VEA-4, solubilní VCAM-1, solubilní LECAM-1, solubilní ELAM-1, solubilní CD44, protilátky reaktivní s gp39 (např. ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 a ATCC HB-12056), protilátky reaktivní s CD40 (např. ATCC HB-9110), protilátky reaktivní s B7 (např. ATCC HB-253, ATCC CRL2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341, atd.), protilátky reaktivní s CD28 (např. ATCC HB-1944 nebo mAb 9.3, popsaná v Martin et al. (J. Clin. Immun. 4(1):18-22, 1980), protilátky reaktivní s LFA-1 (např. ATCC HB-9579 a ATCC HB-2 13), protilátky reaktivní s LFA-2, protilátky reaktivní s IL-2, protilátky reaktivní sIL-12, protilátky reaktivní s IFN-gamma, protilátky reaktivní s CD2, protilátky reaktivní s CD48, protilátky reaktivní s jakoukoliv ICAM molekulou (např., ICAM-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 a ICAM-3), protilátky reaktivní s CTLA4 (např. ATCC HB-304), protilátky reaktivní s Thy-1, protilátky reaktivní s CD56, protilátky reaktivní s CD3, protilátky reaktivní s CD29, protilátky reaktivní s TCR, protilátky reaktivní s VLA-4, protilátky reaktivní s VCAM-1, protilátky reaktivní s LECAM-1, protilátky reaktivní s ELAM-1, protilátky reaktivní s CD44. V některých provedeních jsou výhodné monoklonální protilátky. V jiných provedeních jsou výhodné fragmenty protilátek. Jak bude odborníkům v oboru jasné, mohou kombinace zahrnovat solubilní CTLA4 molekul podle předkládaného vynálezu a jedno další imunosupresivní činidlo, solubilní CTLA4 molekulu a dvě další imunosupresivní činidla, solubilní CTLA4 molekulu a tři další imunosupresivní činidla atd. Určení optimální kombinace a dávky může být provedeno za použití metod známých v oboru.
Konkrétními kombinacemi jsou například následující kombinace: L104EA29YIg a CD80 monoklonální protilátky (mAb); L104EA29YIg a CD86 mAb; L104EA29YIg, CD80 mAb a CD86 mAb; L104EA29YIg a gp39 mAb; L104EA29YIg a CD40 mAb; L104EA29YIg a CD28 mAb; L104EA29YIg, CD80 a CD86 mAb; a gp39 mAb; L104EA29YIg, CD80 a CD86 mAb a CD40 mAb; a L104EA29YIg, anti-LFAl mAb, a anti-gp39 mAb. Specifickým příkladem gp39 mAb je MR1. Další kombinace budou známé nebo jasné odborníkům v oboru.
Solubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu, například L104EA29YIg, mohou být podány jako samostatné léčivo nebo v kombinaci s dalšími léky vimunomodulačních režimech nebo spolu s dalšími protizánětlivými léčivy, například za účelem léčby nebo prevence akutní nebo chronické rejekce allo- nebo xenotransplantátu nebo léčby zánětlivých nebo autoimunitních onemocnění nebo pro indukci tolerance. Například mohou být použity v kombinaci s kalcine-28CZ 305380 B6 urinovým inhibitorem, např. cyklosporinem A nebo FK506; imunosupresivním makrolidem, např. rapamycinem nebo jeho derivátem (např. 40-O-(2-hydroxy)ethyl-rapamycinem); činidlem pro infiltraci lymfocytů, např. FTY270 nebo jeho analogem; kortikosteroidy; cyklofosfamidem; azathioprinem; methotrexátem; leflunomidem nebo jeho analogem; mizoribinem; kyselinou mykofenolovou; mykofenolát-mofetilem; 15-deoxyspergualinem nebo jeho analogem; imunosupresivními monoklonálními protilátkami, např., monoklonální protilátkou k leukocytámím receptorům, např., MHC, CD3, CD3, CD4, CD 1 la/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), 0X40, 4-1BB nebo jejich ligandy; nebo jinými imunomodulačními sloučeninami, např. CTLA4/CD28-Ig, nebo jinými inhibitory adhezních molekul, např. mAb nebo inhibitory s nízkou molekulovou hmotnostní, včetně LFA-1 antagonistů, selektinových antagonistů a VLA-4 antagonistů. Sloučenina je zejména užitečná v kombinaci se sloučeninou, která interferuje s CD40 a jeho ligandy, např. protilátkami k CD40 a protilátkami k CD40L.
Když jsou solubilní CTLA40 mutantní molekuly podle předkládaného vynálezu podány společně s další imunosupresivní/imunomodulaČní nebo protizánětlivou terapií, například jak byla popsána výše, tak je dávkování současně podávaných imunosupresivních, imunomodulačních nebo protizánětlivých sloučenin samozřejmé závislé na typu současně podávaných sloučenin, například na tom, zda se jedná o steroid nebo cyklosporin, na konkrétním použitém léku, na typu léčeného onemocnění a tak dále.
V dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje způsoby, jak byly definovány výše, dále zahrnující současné podání, například konkomitantní nebo sekvenční, terapeuticky účinného množství solubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu, např. CTLA4Ig a/nebo L104IEA29YIg, ve volné formě nebo ve formě farmaceuticky přijatelné soli, a druhé léčivé substance, kde uvedená druhá substance je imunosupresivním, imunomodulační nebo protizánětlivé léčivo, jak byla popsána výše.
Dále vynález poskytuje terapeutické kombinace, např. kit, který obsahuje rozpustnou molekulu CTLA4, ve volné formě nebo ve formě farmaceuticky přijatelné soli, která je použita konkomitantně nebo v sekvenci s alespoň jedním farmaceutickým prostředkem obsahujícím imunosupresivní činidlo, imunomodulační činidlo nebo protizánětlivé léčivo, například NSAID, glukokortikoid nebo kortikosteroid. Kit může obsahovat návod pro jeho podání. Kity podle předkládaného vynálezu mohou být použity v jakékoliv metodě podle předkládaného vynálezu.
V jiném provedení předkládaného vynálezu je rejekce tkáňového nebo orgánového transplantátu inhibována podáním solubilního CTLA4 a buněk kostní dřeně zbavené T-lymfocytů jedinci. Podání kostní dřeně zbavené T-lymfocytů může proběhnout přibližně ve stejnou dobu jako transplantace tkáně nebo orgánu, nebo jindy. Podání kostní dřeně v přibližně stejnou dobu znamená, že kostní dřeň je podána jedinci během přípravy pro transplantaci tkáně nebo orgánu. Není nutné, aby byla kostní dřeň transplantována v přesně stejnou dobu (tj. během minut) jako orgánový transplantát.
Ve výhodném provedení je kostní dřeň zbavené T-lymfocytů podána před transplantací orgánu. Konkrétní provedení zahrnují podání kostní dřeně zbarvené T-lymfocytů během dnem během dvanácti hodin nebo během šesti hodin vzhledem k transplantaci solidního orgánu. Nicméně, kostní dřeň zbavená T-lymfocytů může být podána dříve, pokud jsou efekty podání kostní dřeně zbavené T-lymfocytů stále přítomné při provedení transplantace solidního orgánu nebo tkáně.
V alternativním provedení může být žádoucí podání kostní dřeně zbavené T-lymfocytů po transplantaci orgánu.
V jednom provedení způsob zahrnuje podání dávky kostní dřeně zbavené T-lymfocytů (tolerizační dávky) jedinci a potom podání další dávky kostní dřeně zbavené T-lymfocytů (transplantační dávky) jedinci. V některých provedeních je imunosupresivním činidlem alespoň jeden nebo
-29CZ 305380 B6 více ligandů, které interferují s vazbou CD28 antigenu na CD80 a/nebo CD86 antigen. Jak bylo popsáno výše, je ligandem výhodně mutantní CTLA4 molekula, jako je L104EA29YIg.
Dále, dávka kostní dřeně zbavené T-lymfocytů může být určena běžným experimentováním a může být optimalizována empiricky. Například může být dávka kostní dřeně zbavené T-lymfocytů titrována během rutinního experimentování za účelem zjištění dávky dostatečné pro dosažení požadovaného účinku.
Způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být také prováděny podáním -kromě solubilní CTLA4 mutantní molekuly - dvou nebo více dávek kostní dřeně zbavené T-lymfocytů jedinci, samostatně nebo v kombinaci s jedním nebo více imunosupresivními činidly.
Jak bylo uvedeno výše, ve způsobech podle předkládaného vynálezu může být podání solubilní CTLA4 nebo mutantní CTLA4 molekuly provedeno různými způsoby, včetně lokálního nebo systémového podání. Například, solubilní CTLA4 mutantní molekuly mohou být podány intravenózně, intramuskulámě nebo intraperitoneálně. Alternativně mohou být mutantní CTLA4 podány orálně nebo podkožně. Jiné způsoby podání budou známé odborníkům v oboru. Obdobně, kostní dřeň zbavená T-lymfocytů může být podána jakýmkoliv z mnoha způsobů známých odborníkům v oboru. Jedním příkladem je intravenózní infuze.
Imunosupresivní činidlo může být podáno před nebo po podání solubilní CTLA4 mutantní molekuly a/nebo před nebo po orgánové/tkáňové transplantaci. Výhodně jsou kostní dřeň a imunosupresivní činidlo podány před podáním solubilní CTLA4 mutantní molekuly. V jednom provedení jsou první dávka kostní dřeně zbavené T-lymfocytů (tolerizační dávka) a imunosupresivní činidlo podány v přibližně stejnou dobu jako orgánový transplantát.
Následující příklady jsou uvedeny pro ilustrativní předkládaného vynálezu. Postupy uvedené v příkladech a výsledky mohou být velmi závislé na zamýšleném cíli léčby a použitých postupech. Tyto příklady nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Tento příklad poskytuje popis metod použitých pro přípravu nukleotidových sekvencí kódujících solubilní CTLA4 mutantní molekuly podle předkládaného vynálezu. Byl připraven mutant s mutací vjednom místě L104EIg a tento mutant byl testován na vazebnou kinetiku na C80 a/nebo CD86. Nukleotidová sekvence L104EIg byla použita jako templát pro generování mutantní sekvence s mutací ve dvou místech CTLA4, L104EA29YIg, která byla testována na vazebnou kinetiku na C80 a/nebo CD86.
Mutageneze CTLA4Ig na bázi kodonů
Byla vyvinuta mutagenní a skríningová strategie pro identifikaci mutantních CTLA4Ig molekul, které mají nižší rychlosti disociace (off rychlosti) zCD86 molekul. Mutantní nukleotidové sekvence s mutací vjednom místě se generovaly za použití CTLA4Ig (U.S. Patenty 5,844,095; 5,851,795; a 5,885,796; ATCC přírůstkové č. 68629) jako templátu. Mutagenní oligonukleotidové PCR primery se navrhly pro náhodnou mutagenezi specifických kodonů tak, že umožňovaly jakoukoliv bázi v pozici 1 a 2 kodonů, ale v pozici 3 pouze guanin nebo thymin (XXG/T nebo též NNG/T). Tímto způsobem může být náhodně mutovaný specifický kodon kódující každou z 20 aminokyselin. Z tohoto hlediska vede XXG/T mutageneze ke 32 potenciálním kodonům kódujícím každou z 20 aminokyselin. PCR produkty kódující mutace v těsné blízkosti -M97-G107 CTLA4Ig (viz obr. 1 nebo 2) se trávily Sacl/Xbal a subklonovaly se do podobně tráveného
-30CZ 305380 B6
CTLA4Ig LN expresního vektoru. Tento způsob se použil ke generování CTLA4 mutantní molekuly L104EIg.
Pro mutagenezi v blízkosti S25-R33 CTLA4Ig se nejprve 5 k této smyčce vložilo silentní Nhel restrikční místo, pomocí PCR primerem řízené mutageneze. PCR produkty se trávily Nhel/Xbal a subklonovaly se do podobně tráveného CTLA4Ig nebo L104EIg expresního vektoru. Tento způsob se použil pro přípravu CTLA4 mutantní molekuly L104EA29YIg s mutacemi na dvou místech (jak je uvedeno na obr. 3). Konkrétně, molekula nukleové kyseliny kódující CTLA4 mutantní molekulu s mutací vjednom místě, L104EIg, použila jako templát pro generování CTLA4 mutantní molekuly L104EA29Yig s mutacemi ve dvou místech.
Příklad 2
Následující příklad poskytuje popis způsobů použitých pro identifikaci mutantních CTLA polypeptidů s jednou nebo dvěma mutacemi, exprimovaných z konstruktů popsaných v příkladu 1, které vykazují vyšší vazebnou aviditu pro CD80 a CD86 antigeny, ve srovnání s nemutovanými CTLA4Ig molekulami.
Současné pokusy in vitro a in vivo ukazují, že CTLA4Ig sám není schopen zcela blokovat priming antigenem specificky aktivovaných T-lymfocytů. In vitro studie s CTLA4Ig a bud’ monoklonální protilátkou specifickou pro CD80, nebo CD86, měřící inhibování proliferace T-lymfocytů ukazují, že anti-CD80 monoklonální protilátka nezvyšuje CTLA4Ig inhibici. Nicméně, anti-CD86 monoklonální protilátka zvyšuje inhibici, což naznačuje, že CTLA4Ig není tak účinný v blokování CD86 interakcí. Tato data podporují dřívější objevy Linsley et al. (Immunity, (1994), 1:793-801), že inhibice CD80-zprostředkované buněčné reakce vyžadovala přibližně lOOkrát nižší koncentrace CTLA4Ig než reakce zprostředkovaná CD86. Podle těchto objevů se usoudilo, že rozpustné CTLA4 mutantní molekuly mající vyšší aviditu k CD86 než přirozené CTLA4 by měly být lépe schopny blokovat priming specifických antigenem aktivovaných buněk než CTLA4Ig.
Proto byly solubilní CTLA4 mutantní molekuly popsané v příkladu 1 testovány za použití nové skríningové procedury za účelem identifikace několika mutací v extracelulámí doméně CTLA4, které zlepšují vazebnou aviditu pro CD80 a CD86. Tato skríningová strategie poskytuje účinnou metodu pro přímé identifikování mutantů s jasně pomalejší disociační rychlostí bez nutnosti přečištění nebo kvantifikace proteinů, protože stanovení rychlosti disociace je nezávislé na koncentraci (O'Shannessy et al., (1993) Anal. Biochem., 212:457-468).
COS buňky se transfektovály jednotlivými miniprepy přečištěné plazmidové DNA a propagovaly se po dobu několika dnů. Třídenní kondicionované kultivační medium se aplikovalo do BIAcore biosenzorových čipů (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) potažených rozpustným CD80Ig nebo CD86Ig. Specifická vazba a disociace mutantních proteinů se měřila povrchovou plasmonovou rezonancí (O'Shannessy, D. J., et al., 1997 Anal. Biochem. 212:457-468). Všechny pokusy se provedly na BIACore nebo BIAcore™ 2000 biosenzorech při 25 °C. Ligandy se imobilizovaly na NCM5 senzorových čipech pokusné čistoty (Pharmacia) za použití standardní Nethyl-N'-(dimethylaminopropyl)karbodiimid-N-hydroxysukcinimidové vazby (Johnsson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277; Khulko, S. N., et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:54255435).
Skríningová metoda
COS buňky kultivované ve 24 jamkových kultivačních plotnách se dočasně transfektovaly DNA kódující mutantní CTLA4Ig. Kultivační medium obsahující secemovaný rozpustný mutantní CTLA4Ig se odebíralo o 3 dny později.
-31 CZ 305380 B6
Kondicionované medium COS buněk se nechalo projít přes BlAcore biosenzorové čipy derivatizované CD86Ig nebo CD80Ig (jak je popsáno v Greene et al., 1996 J. Biol. Chem. 271: 2676226771), a identifikovaly se mutantní molekuly s rychlostmi disociace nižšími než jsou rychlosti pozorované pro přirozený CTLA4Ig. cDNA odpovídající vybraným vzorkům media se sekvenovaly a připravilo se více DNA pro provedení dočasné transfekce COS buněk ve větším rozsahu a z těchto buněk se potom po přečištění kultivačního media na proteinu A připravil CTLA4Ig mutantní protein.
Podmínky BlAcore analýzy a analýzy vazby byly stejné jako v J. Greene et al. 1996 J Biol. Chem. 271:26762-26771, ajakje popsáno dále.
Analýza BlAcore dat
Základní hodnoty senosorgramů se před analýzou normalizovány na nulové reakční jednotky (RU). Vzorky se zpracovaly na falešně derivatizovaných průtokových kyvetách pro stanovení základní RU hodnot, které vznikají v důsledku značných rozdílů v indexech lomu mezi roztoky. Rovnovážné disociační konstanty (Kd) se vypočetly z grafů Rcq versus C, kde Req je rovnovážná reakce minus reakce na falešně derivatizovaném čipu, a C je molámí koncentrace analytu. Vazebné křivky se analyzovaly za použití komerčního softwaru pro nelineární křivky (Prism, GraphPAD Software).
Experimentální data se nejprve upravila pro model vazby ligandu na jediný receptor (1-místný model, tj. jednoduchý langmuir systém, A+B AB), a rovnovážné asociační konstanty (Kd=[A].[B]/[AB]) se vypočítaly z rovnice R=Rmax.C/(Kd+C). Potom se data upravila pro nejjednodušší dvoumístný model vazby ligandu (tj. na receptor mající dvě neinteragující nezávislá vazebná místa, jak je popsán rovnicí R=R.max-C\(Kdl+C)+Rmax2.C\(Kd2+C).
Správnost těchto dvou modelů se analyzovala vizuálně srovnáním s experimentálními daty a statisticky za použití F-testu součtu čtverců. Jednomístný model byl vybrán jako nejlepší, pokud nebyl dvoumístný model významně lepší (p <0,l).
Analýza asociace a disociace se provedly za použití BIA hodnotícího 2.1 Softwaru (Pharmacia). Asociační rychlostní konstanty kon se vypočetly dvěma způsoby, za hodnocení pro homogenní jednomístné interakce a paralelní dvoumístné interakce. Pro jednomístné interakce byly hodnoty kon vypočteny podle rovnice Rt=Req(l-exp”ks(t”t0), kde Rt je reakce v daném čase, t; Req je rovnovážná reakce; to je čas na začátku injekce; a ks=dR/dt=kon.Ckoff, kde C je koncentrace analytu, vypočtená ve smyslu monomemího vazebného testu. Pro dvoumístné interakce se hodnoty kon vypočetly podle rovnice Rt=Reqi(l-exp“ks’(t_t0) + Req2(l-exp“ks2(t“t0). Pro každý model se hodnoty kon určily z vypočteného sklonu (do přibližně 70% maximální asociace) grafu ks versus C.
Disociační data se analyzovala podle jednomístných (AB=A+B) nebo dvoumístných (AiBj=Ai+Bj) modelů a rychlostní konstanty (kOff) se vypočetly z nejlépe odpovídajících křivek. Použil se model vazebného místa, kromě situace, kdy byly zbytky větší než pozadí přístroje (2 až 10 RU, podle přístroje), a v takové situaci se použil model dvou vazebných míst. Poločasy obsazení receptoru se vypočetly za použití vztahu ti/2=0,693/kOff.
Průtoková cytometrie
Myší mAb L307.4 (anti-CD80) se zakoupila od Becton Dickinson (San Jose, Califomia) a IT2.2 (anti-B7-0 [též označovaná jako CD86]) od Pharmingen (San Diego, Califomia). Pro imunobarvení se CD80-pozitivní a/nebo CD86-pozitivní CHO buňky odebraly z kultivačních nádob pomocí inkubace s fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS) obsahujícím lOmM EDTA. CHO buňky (1 až 10 χ 105) se nejprve inkubovaly s mAb nebo imunoglobulinovými fúzními proteiny v DMEM obsahujícím 10% fetální hovězí sérum (FBS), potom se promyly a inkubovaly se s reakčním činidlem druhého stupně, kterým byl anti-myší nebo anti-lidský imunoglobulin
-32CZ 305380 B6 konjugovaný s fluoresceinem isothiokyanátem (Tágo, Burlingame, Califomia). Buňky se potom naposledy propláchly a analyzovaly se na FACScan (Bacton Dickinson).
SDS-PAGE a chromatografie s vylučováním podle velikosti
SDS-PAGE se provedla na Tris/glycinových 4 až 20% akrylamidových gelech (Novex, San Diego, CA). Analytické gely se barvily Coomassie Blue a obrázky vlhkých gelů se získaly pomocí digitálního skenování. CTLA4Ig (25 g) a L104EA29YIg (25 g) se analyzovaly chromatografií s vylučováním podle velikosti za použití TSK-GE G300 SWXL kolony (7,8x 300 mm, Tosohaas, Montgomeryville, PA) uvedené do rovnováhy ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku obsahujícím 0,02% NAN3 při průtoku 1,0 ml/min.
CTLA4XCi20s a L104EA29YCci20s.
Jednořetězcový CTLA4XCi2os se připravil způsobem popsaným dříve (Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424). Stručně, onkostatin M CTLA4 (OMCTLA4) expresní plasmid se použil jako templát, kódující primer, GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG (SEQ ID NO: 17) byl vybrán tak, aby odpovídal sekvenci ve vektoru; a reverzní primer, GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGOGCACGGTTC (SEQ ID NO: 18) odpovídal posledním sedmi aminokyselinám (tj. aminokyselinám 118 až 124) v extracelulámí doméně CTLA4, a obsahoval místo pro restrikění enzym a stop kodon (TGA). Reverzní primer určoval mutaci C120S (cystein na serin v pozici 120). Konkrétně, nukleotidová sekvence GCA (nukleotidy 34 až 36) reverzního primeru uvedená výše je nahrazena jednou z následujících nukleotidových sekvencí: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, nebo GCT. Jak bude odborníkům v oboru jasné, nukleotidová sekvence GCA je revertovaná komplementární sekvence kodonu TGC pro cystein. Obdobně, nukleotidové sekvence AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, nebo GCT, jsou revertované komplementární sekvence kodonů pro serin. Produkty polymerázové řetězové reakce se trávily HindlII/Xbal a přímo se subklonovaly do expresního vektoru píLN (Bristol-Myders Squibb Company, Princeton, NJ). L104EA29YXci2OS se připravil identickým způsobem. Každý konstrukt byl ověřen sekvenováním DNA.
Identifikace a biochemická charakterizace mutantů s vysokou aviditou aminokyselin bylo vybráno pro mutagenezi a získaných 2300 mutantních proteinů bylo testováno na CD86Ig vazbu pomocí povrchové plasmonové rezonance (SPR; jak byla popsána výše). Predominantní efekty mutageneze v každém místě jsou shrnuty v tabulce II, dále. Náhodná mutageneze některých aminokyselin v S25-R33 zjevně neovlivňuje vazbu ligandu. Mutageneze E31 a R33 a zbytků M97-Y102 zjevně vede k redukované vazbě na ligand. Mutageneze zbytků S25, A29 a T30, K93, L96, Y103, L104, a G105, vede k zisku proteinů s pomalými „on- a/nebo „off iychlostmi. Tyto výsledky potvrzují předchozí objevy, že zbytky v S25-R33 regionu a zbytky v nebo poblíž M97-Y102 ovlivňují vazbu ligandu (Peach et al., (1994) J. Exp. Med., 180:20492058).
Mutageneze míst S25, T30, K93, L96, Y103 a G105 vedla k identifikaci některých mutantních proteinů, které měly pomalejší „disociační rychlosti spojeny s pomalejšími asociačními rychlostmi, což vedlo k zisku mutantních proteinů se celkovou aviditou pro CD86Ig podobnou jako je avidita přirozeného CTLAIg. Dále, mutageneze K93 vedla k významné agregaci, která byla odpovědná za pozorované změny kinetiky.
Náhodná mutageneze LI04 následovaná transfekcí COS buněk a skríningem vzorků kultivačního media SPR s imobilizovaným CD86Ig vedla k zisku šesti vzorků media, které obsahovaly mutantní proteiny s přibližně 2krát pomalejší rychlostí disociace než má přirozený CTLA4Ig. Když se příslušná cDNA těchto mutantů sekvenovaly, tak bylo zjištěno, že každý kóduje mutaci měnící leucin na kyselinu glutamovou (L104IE). Je zřejmé, že substituce leucinu 104 kyselinou asparagovou (L104D) neovlivňuje vazbu CD86Ig.
-33 CZ 305380 B6
Mutageneze se potom opakovala v každém místě uvedeném v tabulce II, tentokrát za použití L104E jako PCR templátu místo přirozeného CTLA4Ig, jak bylo popsáno výše. SPR analýza, opět za použití imobilizovaného CD86Ig, identifikovala šest vzorků kultivačního media z mutageneze alaninu 29, kde tyto proteiny měly přibližně 4krát pomalejší rychlosti disociace než přirozený CTLA4Ig. Dvěma nejpomalejšími byly tyrosinové substituce (L104EA29A), dvě byly leucinové substituce (L104EA29L), jedna byla tryptofanová substituce (L104EA29W), a jedna byla threoninová substituce (L104EA29T). V přirozeném CTLA4Ig nebyly pozorovány žádné mutanty s pomalou rychlostí disociace, když byly alanin 29 mutovaný náhodně, samostatně.
Relativní molekulová hmotnost a stav agregace přečištěných L104E a L104EA29YIg se hodnotil SDS-PAGE a chromatografií s vylučováním podle velikosti. L104EA29Ylg (cca 1 pg; dráha 3) a L104EIg (cca 1 pg; dráha 2) měly stejnou elektroforetickou mobilitu jako CTLA4Ig (cca 1 pg; dráha 1) za redukujících (-50 kDa; +βΜΕ; plus 2-merkaptoethanol) a neredukujících (Obr. 110 kDa; -βΜΕ) podmínek (Obr. 14A). Chromatografie s vylučováním podle velikosti prokázala, že L104EA29YIg (Obr. 14C) má stejnou mobilitu jako dimerní CTLA4Ig (Obr. 14B). Hlavní píky představují proteinový dimer, zatímco rychleji eluující vedlejší pík na Obr. 14B představuje agregáty s vyšší molekulovou hmotností. Přibližně 5,0 % CTLA4Ig bylo přítomno jako agregáty s vyšší molekulovou hmotností, ale nebyly patrny známky agregace L104EA29Ylg nebo LI 04Elg. Proto nemůže být silnější vazba na CD86Ig pozorovaná pro L104EIg a L104EA29YIg přisouzena agregaci indukované mutagenezí.
Analýza rovnováhy a kinetiky vazby
Analýza rovnováhy a kinetiky vazby se provedla na CTLA4Lg, L104EIg a L104EA29Yig přečištěných na proteinu A za použití povrchově plazmonové rezonance (SPR). Výsledky jsou uvedeny v tabulce I, dále. Pozorované rovnovážné disociační konstanty (Kd; Tabulka I) byly vypočteny z vazebných křivek generovaných v rozmezí koncentrací (5,0 až 200 nM). L104EA29YIg se váže na CD86Ig silněji než L104ELg nebo CTLA4Ig. Nižší Kd L104EA29YIg (3,21nM) než L104EIg (6,06nM) nebo CTLA4Ig (13,9nM) ukazuje na vyšší vazebnou aviditu L104EA29YIg k CD86Ig. Nižší Kd L104EA29YIg (3,66nM) než L104EIg (4,47nM) nebo CTLA4Ig (6,51nM) ukazuje na vyšší vazebnou aviditu L104EA29YIg k CD80Ig.
Analýza kinetiky vazby ukázala srovnatelná „asociační“ rychlosti pro vazbu CTLA4Ig, L104EIg a L104EA29YIg na CD80, stejně jako byly podobné „asociační“ rychlosti pro CD86Ig (Tabulka I). Nicméně, „disociační rychlosti pro tyto molekuly nebyly ekvivalentní (Tabulka I). Ve srovnání s CTLA4Ig má L104EA29YIg přibližně 2krát pomalejší rychlost disociace zCD80Ig, a přibližně 4krát pomalejší rychlost disociace zCDBóIg. L104E má rychlosti disociace mezi L104EA29YIg a CTLA4Ig. Protože vložení těchto mutací neovlivňuje významnějším způsobem rychlosti asociace, je zvýšení avidity pro CD80Ig a CD86Ig pozorované u L104EA29YIg pravděpodobně způsobeno snížením rychlostí disociace.
Pro stanovení toho, zdaje zvýšení avidity L104EA29YIg pro CD86Ig a CD80Ig způsobeno mutacemi ovlivňujícími způsob, kterým je každý monomer asociován v dimer, nebo zda jsou strukturální změny zvyšující aviditu vloženy do každého monomeru, se připravily jednořetězcové konstrukty CTLA4 a L104EA29Y extracelulámích domén, po mutagenezi cysteinu 120 na serin, jak bylo popsáno výše a v Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424. Přečištěné proteiny CTLA4Xci2os a LlO4EA29YCCi2os byly podle gelové permeační chromatografie monomemí (Linsley et al., (1995), výše) před analýzou jejich vazebných schopností pro ligand pomocí SPR. Výsledky ukazují, že vazebná afinita obou monomemích proteinů pro CD86Ig byla přibližně 35 až 80krát nižší než afinita pozorovaná pro příslušné dimery (Tabulka 1). Toto podporuje dříve publikovaná data, že dimerizace CTLA4 je nutná pro vysokou aviditu vazby ligandu (Greene et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:26762-26771)
L1O4EA29YXC|2os se vázal s přibližně 2krát vyšší afinitou než CTLA4Xcl20S na CD80Ig i CD86Ig. Vyšší afinita byla způsobena přibližně 3krát pomalejší rychlostí disociace z obou ligan-34CZ 305380 B6 dů. Proto byla silnější vazba L104EA29Y na ligand s největší pravděpodobností způsobena strukturálními změna zvyšujícího aviditu, které byly vneseny do každého monomemího řetězce, a nikoliv změnami v dimerizaci molekuly.
Umístění a strukturální analýza mutací zvyšujících aviditu
Struktura extracelulámí IgV-like domény CTLA4 byla nedávno určena NMR spektroskopií (Metzler et al., (1997) Nátuře Struct. Biol., 4:527-531). Toto umožňuje přesnou lokalizaci leucinu 104 a alaninu 29 ve trojrozměrném obrazu (obr. 15A, B). Leucin 104 je umístěn poblíž vysoce konzervované MYPPPY aminokyselinové sekvence. Alanin 29 je umístěn poblíž C-terminálního konce CDR-1 (S25-R33) regionu, který prostorově sousedí s MYPPPY regionem. Ačkoliv existuje významná interakce mezi zbytky na bázi těchto dvou regionů, neexistuje žádná přímá interakce mezi LI04 a A29, ačkoliv oba tvoří část kontinuálního hydrofobního jádra proteinu. Strukturální následky dvou mutací zvyšujících aviditu byly hodnoceny modelováním. A29Y mutace může být snadno upravena trhlinou mezi S25-R33 regionem a MYPPPY regionem a může sloužit pro stabilizaci konformace MYPPPY regionu. V přirozeném CTLA4 vytváří LI04 významné hydrofobní interakce s L96 a V94 poblíž MYPPPY regionu. Ze dvou důvodů je značně nepravděpodobné, že by mutace kyseliny glutamové způsobovala konformaci podobnou LI04. Za prvé, není dostatek prostoru pro zapojení delšího vedlejšího řetězce kyseliny glutamové do struktury bez významnějšího narušení S25-R33 regionu. Za druhé, energetické náklady spojené s negativním nábojem vedlejšího řetězce kyseliny glutamové jsou značné. Modelové studie předpokládají, že vedlejší řetězec kyseliny glutamové vyčnívá na povrch molekuly, kde může být jeho náboj stabilizován solvatací. Taková změna konformace může být snadno upravena G105, s minimálním posunem dalších zbytků v regionu.
Vazba mutantů s vysokou aviditou na CHO buňky exprimující CD80 nebo CD86.
FACS analýza (obr. 9) vazby CTLA4Ig a mutantních molekul na stabilně transfektované CD80+ a CD86+ CHO buňky se provedla způsobem, který je zde popsán. CD80-pozitivní a CD86pozitivní CHO buňky se inkubovaly se stoupajícími koncentracemi CTLA4Ig, L104EA29YIg nebo L104EIg, a potom se promyly. Navázaný imunoglobulinový fúzní protein se detekoval za použití kozího anti-lidského imunoglobulinu konjugovaného na fluorescein isothiokyanatan.
Jakje uvedeno na obr. 9, CD80-pozitivní nebo CD86-pozitivní CHO buňky (1,5x105) se inkubovaly s uvedenými koncentracemi CTLA4Ig (plné čtverečky), L104EA29YIg (kolečka), nebo L104EIg (trojúhelníčky) po dobu 2 hodin při teplotě 23 °C, promyly se a inkubovaly se s kozím anti-lidským imunoglobulinem konjugovaným na fluorescein isothiokyanatan. Analyzovala se vazba celkem 5000 živých buněk (jediné stanovení) pomocí FACScan, a průměrná intenzita fluorescence (MFL) se stanovila zdát histogramů za použití PC-LYSYS. Data se korigovala pro fluorescence pozadí měřenou na buňkách inkubovaných s reakčním činidlem druhého stupně samotným (MFI=7). Kontrolní L6 mAb (80 g/ml) měla MFI < 30. Tyto výsledky jsou získány ze čtyř nezávislých pokusů.
Vazba L104EA29YIg, L104EIg a CTLA4Ig na lidské CD80-transfektované CHO buňky je přibližně stejná (obr. 9A). L104EA29YIg a L104EIg se váží silněji na CHO buňky stabilně transfektované lidským CD86 než CTLA4Ig (Obr. 9B).
Funkční testy
Lidské CD4-pozitivní T-lymfocyty se izolovaly imunomagnetickou negativní selekcí (Linsley et al., (1992) J. Exp. Med. 176:1595-1604). Izolované CD4-pozitivní T-lymfocyty se stimulovaly forbol-myristát-acetátem (PMA) plus CD80-pozitivními nebo CD86-pozitivními CHO buňkami za přítomnosti titračních koncentrací inhibitoru. CD4-pozitivní T-lymfocyty (8ažl0x 104/jamku) se kultivovaly za přítomnosti lnM PMA s nebo bez ozářených stimulačních CHO buněk. Proliferační reakce se měřila přidáním lCijamku [3H]thymidinu během posledních 7 hodin 72
-35CZ 305380 B6 hodinové kultivace. Provedla se inhibice stimulace T-lymfocytů PMA plus CD80-pozitivními CHO, nebo CD86-pozitivními CHO pomocí L104EA29YIg a CTLA4Ig. Výsledky jsou uvedeny na obr. 10. L104EA29Ylg inhiboval proliferaci CD80-pozitivních PMA ošetřených CHO buněk více než CTLA4Ig (Obr. 10A). L104EA29YIg byl také účinnější než CTLA4Ig v inhibování proliferace CD86-pozitivních PMA ošetřených CHO buněk (Obr. 10B). Tak je L104EA29YIg účinnějším inhibitorem jak CD80-, tak CD86-zprostředkované kostimulace T-lymfocytů.
Obr. 11 ukazuje inhibici allostimulovaných lidských T-lymfocytů připravených způsobem popsaným výše pomocí L104EA29YIg a CTLA4Ig, kde tyto lymfocyty byly dále allostimulovány lidskou B-lymfoblastoidní buněčnou linií (LCL) označovanou jako PM, která exprimuje CD80 a CD86 (T lymfocyty v koncentraci 3,0x 104/jamku a PM v koncentraci 8,0x 103/jamku). Primární allostimulace probíhala po dobu 6 dnů a potom se buňky pulsovaly 3H-thymidinem po dobu 7 hodin a pak se stanovila inkorporace radioaktivního činidla.
Sekundární allostimulace se provedla následujícím způsobem. 7dnů primárně allostimulované Tlymfocyty se odebraly pomocí lymfocytámího separačního media (LSM) (ICN, Aurora, OH) a ponechaly se v klidu po dobu 24 hodin. T-lymfocyty se potom restimulovaly (sekundárně) za přítomnosti titračních množství CTLA4Ig nebo L104EA29YIg, za přidání PM ve stejném poměru jako výše. Stimulace probíhala po dobu 3 dnů a potom se buňky pulsovaly radioaktivním činidlem a odebraly se způsobem popsaným výše. Efekt L104EA29YIg na primárně allostimulované T-lymfocyty je uveden na Obr. 11 A. Efekt L104EA29YIg na sekundárně allostimulované Tlymfocyty je uveden na obr. 11B. L104EA29YIg inhiboval jak primární, tak sekundární proliferativní reakci T-lymfocytů lépe než CTLA4Ig.
Pro měření produkce cytokinů (Obr. 12) se připravily dvojité plotny pro sekundární allostimulaci. Po 3 dnech se kultivační medium testovalo za použití ELISA kitů (Biosource, Camarillo, CA) podle návodu výrobce. Bylo zjištěno, že L104EA29YIg je účinnější než CTLA4Ig v blokování produkce IL-2, IL—4, a gamma-IFN cytokinů T-lymfocyty po sekundárním allogenním stimulu (obr. 12A-C).
Efekty L104EA29YIg a CTLA4Ig na reakci opičích smíšených lymfocytů (MLR) jsou uvedeny na Obr. 13. Mononukleámí buňky periferní krve (PBMC; 3,5x 104 buněk/jamku od každé opice) od dvou ope se přečistily pomocí lymfocytámího separačního media (LSM) a smísily se s 2 g/ml íytohemaglutininu (PHA). Buňky se stimulovaly 3 dny a potom se pulsovaly radioaktivním činidlem po dobu 16 hodin a odebraly se. L104EA29YIg inhiboval proliferaci opičích T-lymfocytů lépe než CTLA4Ig.
-36CZ 305380 B6
Tabulka I:
Tabulka uvádí rovnovážné a zřetelné kinetické konstanty (hodnoty jsou průměry standardní od chylky ze tří různých pokusů:
koa (x 10s) Aoff (x 10'3) Xá [ΜΓ1^] M [nM]
Imobilizovaný Analyt Protein
CD80Ig CTLA4Ig 3,44 ± 0,29 2,21 ±0,18 6,51 ±1,08
CD80Ig L104EIg 3,02 ± 0,05 1,35 ± 0,08 1.08 ±0,05 4,47 ± 0,36
CD80Ig L104EA29YIg 2,96 ± 0,20 3,66 ± 0,41
CD80Ig CTLA4XCi2os 12,0 ± 1,0 230 ±10 195 ±25
CD80Ig L1O4EA29YXCi2os 8,3 ± 0,26 71 ±5 85,0 ± 2,5
CD86Ig CTLA4Ig 5,95 ±0,57 8,16 ±0,52 13,9 ±2,27
CD86Ig L104EIg 7,03 ± 0,22 4,26 ±0,11 6,06 ± 0,05
CDSÓIg L104EA29YIg 6,42 ± 0,40 2,06 ± 0,03 3,21 ±0,23
CD86Is CTLA4Xci2os 16,5 ± 0,5 840 ±55 511 ± 17
CD86Ig LlO4EA29YXci2os 11,4 ± 1,6 300 ±10 267 ± 29
-37CZ 305380 B6
Tabulka II
Efekt mutageneze CTLA4Ig v uvedených místech na vazbu CD86Ig, jak byl uren SPR, jak je popsáno výše. Převládající efekt je označen +
Místo mutagenese í i Efekty mutagenese
j Žádné zjevné 1 Zpomalení asociace/ Redukce vazby
i disociace ligandu
S25 -U
P26 +
G27 +
K28 +
A29
T30 +
E31 -r
R33 +
K93 +
L96
M97 +
Y98 +
P99 +
P100 +
P101 +
vím i. 1 Ui* +
Y103 +
LI04 ~r
G105 +
1106
-38CZ 305380 B6
Místo mutagenese 1 Efekty mutagenese is
Žádné zjevné Zpomalení asociace/ disociace 1 Redukce vazby ligandu
G107
Qlll +
Y113
1115 +
Příklad 3
Tento příklad popisuje pankreatektomie a izolaci ostrůvků pankreatu u dárců a postup pro transplantaci ostrůvků na zvířecím modelu
Materiály a metody:
Zvířata. V zajetí narození adolescentní samci makaků rhesus (Macaca mulatta) (4 až 20 kg) byli použiti jako příjemci i dárci. Před transplantací se potvrdila nepřítomnost předem vytvořených protilátek specifických pro dárce u příjemce. Všichni potenciální dárci byli testováni na antiCMV protilátky a pouze zvířata, která byla pozitivní na CMV, byla použita jako příjemci.
Pankreatektomie a izolace ostrůvků od dárců. Pankreatektomie u dárců byla provedena jeden den před transplantací. Operace byla provedena v celkové anestesii (kombinace parenterálního ketaminu a isolfluranu inhalačně) a použilo se střední abdominální incise. Splenorenální a splenokolické ligamenta se rozdělily, takže mohla být mobilizována slezina, společně s kaudou pankreatu. Hlava pankreatu a druhá část duodena se mobilizovaly Kocherovým manévrem. Po podání heparinu (200 U/kg) se aorta kanylovala těsně nad bifurkací a zvířata se nechala exsanguinovat. Ledová drť se ihned umístila do menšího vaku a pod tělo pankreasu. Tělo a krček pankreasu se opatrně odřízly a byla věnována značná pozornost tomu, aby se nenarušila kapsula pankreatu. Identifikovaly se společný žlučovod, hladní a akcesomí pankreatické kanálky a tyto se ligovaly a hlava pankreatu se odřízla od druhé části slinivky břišní.
Izolace ostrůvků od makaků rhesus se provedla stejně jako izolace lidských ostrůvků, s drobnými modifikacemi (Ricordi, (1988) Diabetes, 37: 413; Ranuncoli, (2000) Cell Transplant 9: 409) za použití liberasy (Roche/Boehringer Mannheim, Indpls, IN) v koncentraci 0,47 až 0,71 mg/ml. Třívrstvý, diskontinuální Euroficoll gradient (hustoty 1,108, 1,097, 1,037; Meditech, Hemdon, V A) a Cobe 2991 processor pro krevní buňky (Gambro, Lakewood, CQ) se použil pro přečištění ostrůvků z pankreatické tráveniny. Vzorky finálního přípravku ostrůvků se barvily dithizonem (Sigma, St. Louis, MO) a přípravek se hodnotil počítáním počtu ostrůvků každé z následujících velikostí: 50 až 100, 100 až 150, 150 až 200, 200 až 250, 250 až 300, 300 až 350 a 350 až 400 pm. Data se matematicky konvertovala pro stanovení počtu ostrůvků s průměrem 150 pm a vyjádřila se v ekvivalentech ostrůvků (IEQ) (Ricordi C. et al., Acta Diabetol. Lat 27:185-195, 1990).
Pankreatektomie u příjemce a intrahepatální transplantace ostrůvků. Totální pankreatektomie, bez duodenektomie nebo splenektomie, se provedla alespoň jeden týden před transplantací. Oca a tělo pankreatu se disekovaly společně se splenickou arterií a vénou, které se pečlivě zachovaly pomocí ligace a dělení pouze pankreatických větví. Dolní mesenterická a střední kolická žíla se identi-39CZ 305380 B6 fikovaly a během dissekce těla pankreatu se zachovaly. Identifikovala se portální a horní mesenterická žíla a pankreatické vény se ligovaly a rozdělily.
Mobilizovalo se duodenum a větve pankreaticko duodenálních cév vstupujících do penkreasu se ligovaly a rozdělily se, s tím, že douodenální větve se ponechaly intaktní. Identifikoval se společný žlučovod a ten se zachoval během tupé preparace mezi hlavou pankreatu a c-smyčkou duodena. Hlavní a akcesomí pankreatické dukty se ligovaly a rozdělily se a pankreas se odstranil z dutiny břišní. U všech zvířat byl proveden test intravenózní glukózové tolerance, aby se vyhodnotila účinnost pankreatektomie. Všechna zvířata byla před transplantací ostrůvků pankreatu negativní na C-peptid.
Ostrůvky kultivované přes noc se promyly v transplantačním mediu, skládajícím se z RPMI media 1640 (Mediatech) doplněného 2,5 % lidského sérového albuminu, a spočítaly se pro stanovení IEQ. Potom se ostrůvky peletovaly a resuspendovaly se ve 20 ml transplantačního media doplněného 200 jednotkami heparinu. Intrahepatální transplantace ostrůvků pankreatu se provedla pomocí gravitační drenáže ostrůvků do větve levé kolické žíly vedoucí do portální žíly, za použití intravenózního katetru 22 gauge.
Sledování koncentrace glukózy v krvi, podávání inzulínu a definice rejekce. Koncentrace glukózy v krvi na lačno a pojidle se sledovaly dvakrát denně (před snídaní a po obědě) pomocí odběru krve z ucha a stanovení koncentrace v krvi pomocí glukometru elite (Bayer, Elkhart, ΓΝ). Inzulín (NPH, Ultralente; Eli Lilly, Indianpolis, IN) se podával třikrát denně pro udržování koncentrace glukózy na lačno <300 mg/dl u pankreatektomizováných zvířat před transplantací nebo u zvířat, která odmítla allotransplantáty.
Pokusné skupiny a imunosupresivní protokoly. Testovaly se dva léčebné protokoly: (1) Edmonton protokol - Tacrolimus, Sirolimus, a anti-IL-2R mAb (Shapiro, A. M. J. et al., (2000), N. Eng. J. Med., 343: 230-238) a (2) L104EA29Y-Edmonton protokol - L104EA29YIg, Sirolimus a anti-IL-2R mAb. Kontrolní skupinou byly příjemci léčení základním imunosupresivním režimem“ s rapamycinem a anti-IL-2R samotnými. Tacrolimus byl podáván v dávce 0,05 mg/kg bíd POD 0 až 14 (cílové koncentrace 5 až 8) a 0,06 mg/kg denně (cílové koncentrace 3 až 5) POD 15 až 120. L104EA29Ylg se podával intravenózně intra-operativně (10 mg/kg) a v pooperační dny 4(15 mg/kg), 14, 28, 42, 56, 70, 84, 98, 112, 126 (20 mg/kg) pro udržování sérových koncentrací vyšších než 30 pg/ml. Chimérická anti-lidský IL-2R mAb (0,3 mg/kg iv) se podávala intraoperativně a v POD 4. Sirolimus (Rapamune®)) se podával orálně 1,25 mg/kg bíd (cílové koncentrace 10 až 15) POD 0 až 50, 1 mg/kg bíd (cílové koncentrace 7 až 10) POD 50 až 100, a potom se dávka snižovala a ukončila se při POD 130. Sirolimus (Rapamune®) a Tacrolimus (Prograf®) se zakoupily od Emory University Hospital Pharmacy. Chimérická anti-lidský IL-2R mAb (Simulect®) se získala od Novartis Pharma AG (Basel, Switzerland).
Pitva. U všech příjemců byla provedena pitva, kterou provedli zaměstnanci Yerkes Veterinary.
Detekce protilátek proti dárcům. Přítomnost detekovatelných allo-protilátek proti příjemci se stanovila za použití průtokové cytometrie. Leukocyty periferní krve sloužily jako cílové buňky pro analýzu před transplantací. Leukocyty izolované z mesenteriálních lymfatických uzlin získaných v době transplantace byly cílovými buňkami pro potransplantační testy.
Statistiky. Přežívání transplantovaných ostrůvků v pokusných skupinách bylo srovnáváno za použití Mann-Whitney-Wilcoxon testu (Armitage et al. (1987) Statistical methods in Medical Research, Blackwell Scientific Publication, Oxford).
Enzymový immunospot test proti dárci. Reakce se měřily v interferon-gamma (IFN-gamma) enzymovém immunospot (ELISpot) testu za použití leukocytů periferní krve získaných od příjemců a od dárců. Stejný počet ozářených stimulátorů (leukocytů od dárce) a respondérů (leukocytů od příjemce) se přidal do ploten s ester-celulosovým dnem (Millipore, Bedford, MA) pota-40CZ 305380 B6 žených záchytnou protilátkou, myší anti—lidský IFN-gamma (klon GZ-4; Mabtech, Sweden). Po 14 až 16 hodinové inkubaci se přidal biotinylovaný myší anti-lidský IFN-gamma (klon 7-B6-1; Mabtech, Sweden), nenavázaná protilátka se odstranila a přidala se křenová peroxidáza-Avidin D (Vektor, Burlingame, CA). Skvrny se vyvíjely se substrátem 3-amino-9-ethyl-karbazolem (Sigma). Každá skvrna představuje buňku produkující IFN-gamma; frekvence těchto buněk může být určena vydělením počtu skvrn celkovým počtem buněk od příjemce v plotně.
Výsledky:
Terapie na bázi blokády CD28 dráhy prodlužuje přežívání allotransplantátů ostrůvků u makaků rhesus. Diabetes byl u příjemců indukován chirurgickou pankreatektomií a byl potvrzen předtransplantačním testem intravenózní glukózové tolerance. Párování dárců a příjemců bylo provedeno podle molekulové typizace za použití předem definovaného panelu hlavních histokompatibilních alel (8 třídy I a 12 třídy II) (Lobashevsky A, et al., Tissue Antigens 54:254-263, 1999); Knapp LA, et al., Tissue Antigens 50:657-661, (1997); Watkins D. I., Crit Rev Immunol 15:1— 29, (1995)). Párování maximalizovalo rozdíly v lokusech třídy I a II. Rejekce byla definována jako dvě následující hodnoty koncentrace glukózy v krvi na lačno >125 mg/dl ve dvou dnech. Intra-portální infuze allogenních ostrůvků (>10,000 IEQ/kg) vedla k iniciálnímu obnovení euglykemie a nezávislosti na inzulínu u diabetických opic v obou skupinách.
Léčba pankreatizovaných makaků režimem L104EA29YIg/Rapamycin/anti-TL-2R mAb významně prodlužovala přežití allotransplantátů ostrůvků (204, 190, 216, >220 a 56 dnů, v příslušném pořadí). U zvířat s L104EA29YIg/Rapamycin/anti-IL-2R režimem bylo dosaženo adekvátní kontroly glukózy, jak je vidět z plasmatických koncentrací glukózy na lačno (Obr. 5 a 16B). Dále, tato zvířata nevyžadovala inzulínovou léčbu po významně dlouhou dobu (obr. 6). Naopak, u zvířat se základním režimem samotným (rapamycin/anti-IL-2R mAb) došlo k rejekci transplantovaných ostrůvků během jednoho týdne (Obr. 16C). Kontrolní zvířata měla značně zvýšené plasmatické koncentrace glukózy na lačno (Obr. 5). Dále, kontrolní zvířata vyžadovala terapii inzulínem během jednoho týdne po transplantaci ostrůvků (obr. 6). 4/5 zvířat sL104EA29YIg měly přežívání bez rejekce po celou dobu léčby (Tabulka III). Intravenózní glukózový toleranční test s měřením koncentrace inzulínu a glukózy potvrdil funkci ostrůvků po transplantaci (reprezentativní zvířata, obr. 7 a 16D).
Tabulka III: Přežívání ostrůvků a léčba
MHC neodpovídající páry («)
IEQ/kg přežívání léčba třída I třída.
RKf-7 22,250 204 LEA29Y/RapaÁvIL-2R 2 ND
RUf-7 17,087 190 LEA29Y/Rapa/aEL-2R ND -Ί
RRe-7 20,266 216 LEA29Y/RapaML-2R 2 6
RWt-6 16,033 56 LEA29Y/Rapa/aIL-2R 2 D
RMv-ó 8,201 >220 LEA29YZRapaZaIL-2R 1 o O
RQz-6 12,980 7 Rapa/&IL-2R 2 5
RIb-7 10,903 7 Rapa/alL-2R 1 4
* Závislost na inzulínu. ND, nedetekováno v alelách, které byly typizovány.
-41 CZ 305380 B6
V den 100 po transplantaci se dávka rapamycinu snížila a rapamycin se vysadil v den 121. Zvířata zůstávala nezávislá na inzulinu, když jim byla podávána monoterapie L104EA29Ylg. V den 15 po transplantaci bylo zbývajícím příjemcům ostrůvků podána konečná dávka L104EA29YIg a byla ukončena jakákoliv další imunosupresivní terapie.
Jak se předpokládalo, tak se za 1 až 2 měsíce po ukončení terapie příjemci staly hyperglykemickými a vyžadovaly exogenní terapii inzulinem. Histologická analýza ukázala mononukleámí infiltrát, což ukazuje na rejekci jako etiologický faktor ztráty kontroly glukózy (obr. 17). V testu intravenózní glukózové tolerance vykazovala zvířata dostávající L104EA29YIg/Rapamycin/antiIL-2R mAb normální glukózové tolerance po transplantaci ostrůvků (obr. 7 a 16D).
Frekvence buněk namířených proti dárci produkujících IFN-gamma byla detekována ELISpot testem a analyzována za použití Immunspot zobrazovacího systému. Zvířata dostávající základní imunosupresivní režim samotný vykazovala významně vyšší počty T-lymfocytů reaktivních s dárcem produkujících IFN-gamma (84±4,6 buněk), zatímco zvířata dostávající L104EA29YIg režim neměla detekovatelnou reakci (2±0,56 buněk).
L104EA29YIg terapie inhibuje priming T- a B-lymfocytů namířených proti dárci. Frekvence alloreaktivních T-lymfocytů může být detekována za použití ELISpot testu, který může odlišit produkt IFN-gamma na úrovni jednotlivých buněk. Vzorky periferní krve od příjemců ostrůvků se analyzovaly v různou dobu před a po transplantaci na schopnost generovat IFN-gamma v reakci na antigen od dárce. LJ zvířat léčených základním režimem samotným se rychle vyvinula měřitelná reakce proti dárci, která koincidovala s rejekci 1 týden po transplantaci. Naopak, frekvence buněk namířených proti dárci produkujících IFN-gamma u zvířat s aplikovaným režimem obsahujícím L104EA29YIg byla nedetekovatelná do ukončení terapie (representativní zvířata, obr. 18A a B). Proto L104EA29YIg režim účinně blokuje generování T-lymfocytámí reakce namířené proti dárci, kteráje měřena schopností produkovat IFN-gamma.
Průtoková cytometrie se použila pro stanovení vývoje protilátkové reakce namířené proti dárci. U jednoho zvířete v kontrolní skupině vznikla silná Ab reakce proti dárci, zatímco u ostatních nevznikla detekovatelná reakce, pravděpodobně proto, že byla utracena před tím, než mohla být protilátková reakce změřena (Obr. 18C). Naopak, u 4/5 zvířat nevznikla protilátková reakce, když byla zvířata léčena L104EA29YTg terapií. Toto je v souladu s dříve popisovanými výsledky popisujícími použití CTLA4-Ig v modelu transplantace ostrůvků pankreatu (Levisetti. M. G. et al., J. Immunol. 159:5187-5191, 1997), stejně jako s našimi zkušenostmi na modelu allotransplantátu ledvin, kde příjemci selhaly v generování protilátek proti dárci (Pearson T, et al., (Abstract) vPrograms and Abstracts of the 17th American Society of Transplant Physicians Annual Meeting, Chicago. 10-14 May 1997. Chicago, American Society of Transplant Physicians). U jednoho zvířete z pěti došlo k rejekci při L104EA29Ylg terapii a poté vznikla protilátková reakce proti dárci. Jak se předpokládalo, vznikla u zbývajících čtyř zvířat s L104EA29YIg režimem protilátková reakce proti dárci v době rejekce (-200 dnů po transplantaci, 50 dnů po poslední dávce L104EA29YIg).
Transplantace ostrůvků pankreatu se stává možnou terapeutickou volbou pro pacienty s diabetem I typu. Nedávné zprávy popisující nesteroidní imunosupresivní režimy, které vedly k úspěšné nezávislosti na inzulinu po transplantaci ostrůvků pankreatu, obnovily optimismus stran praktického použití transplantací ostrůvků pankreatu. Ačkoliv eliminace glukokortikoidů z imunosupresivních režimů představuje hlavní krok vpřed při léčbě diabetů 1 typu, použití kalcineurinového inhibitoru pro primární imunosupresi může omezovat použitelnost tohoto postupu. Kalcineurinové inhibitory mají mnoho nežádoucích vedlejších účinků, včetně nefrotoxicity, diabetů, hypertense, poruchy lipidového metabolismu a hirusitismu (Kahan B. D. et al., N. Engl. J. Med. 321:1725-1738, 1989; Group TUSMFLS: A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyklosporine for immunosuppression in liver transplantation: the U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Eng. J. Med. 331:1110-1115, 1994; de Mattos AM et al., Am. J. Kidney Disease 35: 333-346, 2000). I když je dávka léků nízká, mohou se nežádoucí účinky objevit. Toto platí zej-42CZ 305380 B6 ména u populace diabetických pacientů, u které mohou být funkce ledvin již narušené. V nejčerstvější práci z Edmontonu měli dva pacienti s mírně zvýšenou předtransplantační koncentrací kreatininu významné snížení renálních funkcí při terapii kalcineurinovým inhibitorem a nakonec bylo nutné tento lék vysadit (Ryan E. A., et al., Diabetes 50:710-719, 2001). Ve stejné práci došlo u dvou třetin příjemců ke vzniku určitého stupně intoleranci glukózy a u jedné třetiny se vyvinul skutečný postransplantační diabetes, o kterém se soudilo, že souvisí s užíváním tacrolimu. Toto snižuje hodnotu imunosupresivních režimů neobsahujících inhibitor kalcineurinu, zejména pro transplantaci ostrůvků pankreatu.
Blokáda kostimulačních drah pro T-lymfocyty je slibnou strategií pro vývoj netoxických imunosupresivních a potenciálně tolerogenních režimů. Tento postup cíleně ovlivňuje ty T-lymfocyty, které dostávají „signál 1“ během podávání léčiva. Léčba v peritransplantaěním období vede k nereaktivitě allo-specifických T-lymfocytů při setkání s novou tkání nebo orgánem, zatímco ostatní T-lymfocyty jsou neovlivněné (Li Y, et al., Nat Med 5:1298-1302, 1999). Blokáda CD28/B7 dráhy se jevila značně slibně v experimentálních modelech autoimunity a transplantace, díky čemuž je slibnými cílem pro imunosupresi při transplantaci ostrůvků pankreatu, kde patrně existují auto i allo-imunitní překážky. Potenciál CD28 blokády na modelech transplantace u velkých zvířat popsal Levisetti MG, et al., (J. Immunol 159:5187-5191, 1997). Bylo zjištěno, že léčba CTLA4-Ig významně, ačkoliv mírně, prodlužuje přežívání allotransplantátu ostrůvků u non-lidských primátů (Levisetti MG, et al., J Immunol 159:5187-5191, 1997). CTLA4-Ig monoterapie o něco prodlužuje přežívání allotransplantátu ledvin (Pearson T. et al., (Abstract). V Programs and Abstracts of the 17th American Society of Transplant Physicians Annual Meeting, Chicago, 10-14 May 1997. Chicago, American Society of Transplant Physicians). Nedávno se objevilo několik prací popisujících dlouhodobé přežívání allotransplantátů ostrůvků v modelech na primátech. Anti-CD40L mAb terapie měla dosud nej přesvědčivější výsledky; nicméně, podobně jako v pokusech s transplantacemi ledvin nebylo dosaženo tolerance, protože ukončení terapie vedlo krejekci (Kenyon, N. S. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 96:8132-8137 (1999); Kirk, A. D„ et al., Nat. Med. 5, 686-693 (1999). V další zajímavé práci Thomas et al. (Diabetes 50:1227-1236, (2001)) popsali použití anti-CD3 imunotoxinu a imunomodulačního činidla DSG (15-deoxyspergualinu) pro dramatické prodloužení přežívání ostrůvků u primátů s diabetem indukovaným streptozotocinem. Ačkoliv jsou slibné, využívají tyto práce terapeutická činidla, jejichž klinický potenciál je v současné době stále nejistý.
In vivo data pro L104EA29YIg, mutantní formu CTLA4-Ig, v modelu allotransplantace ostrůvků pankreatu u makaků rhesus, jsou v souladu s důkazy in vitro naznačujícími, že tato molekula druhé generace je účinnějším inhibitorem reakce T-lymfocytů než původní molekula. Protože již byla prokázána účinnost CTLA4-Ig v klinických studiích provedených na pacientech s psoriasou (Abrams, J. R. et al., J. Clin. Invest. 103:1243-1252 (1999)), existuje významné nadšení pro klinickou studii týkající se použití L104EA29YIg jako primárního imunosupresiva. Je jasně kompatibilní, pokud ne synergní, s klinicky schválenými imunosupresivními činidly (anti-IL-2R mAb a rapamycinem), což usnadňuje návrh klinických studií. Prvotní studie s použitím L104EA29YIg u člověka již probíhají u pacientů s revmatoidní artritidou a s transplantací ledvin. Ačkoliv přímé srovnání mezi protokolem na bázi tacrolismu a protokolem s L104EA29YIg nebylo provedeno z důvodu popisované intolerovatelné toxicity u primátů (Montgomery, S. P., et al., Am J Transplant 1 (Suppl. 1):438, 2001), naznačují naše výsledky, že L104EA29YIg má potenciál být alespoň stejně účinný jako tacrolimus jako primární imunosupresivum.
Závěr:
Vynález popisuje nový imunosupresivní režim na bázi kalcineurinového inhibitoru bez steroidů, který významně chrání před rejekcí a prodlužuje přežívání allotransplantovaných ostrůvků. Biologické činidlo L104EA29YIg je účinným imunosupresivem. L104EA29YIg může nahradit Tacrolimus v Edmonton protokolu, což eliminuje nežádoucí vedlejší účinky inhibitoru kalcineurinu.
-43 CZ 305380 B6
Odborníkům v oboru bude jasné, že předkládaný vynález má i jiná provedení, než jsou provedení popsaná výše, která se neodchylují od myšlenky či základních charakteristik předkládaného vynálezu. Konkrétní provedení vynálezu popsaná výše jsou proto pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu, který je vymezen pouze připojenými patentovými nároky.
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (35)

1. Použití rozpustné CTLA4 mutantní molekuly pro výrobu léčiva pro inhibici rejekce transplantovaných buněk ostrůvků slinivky břišní, kde mutovaná extracelulámí doména CTLA4 má
a) aminokyselinovou sekvenci začínající methioninem v pozici +1 a končící kyselinou asparagovou v pozici +124, jak je znázorněno na obr. 3, nebo začínající alaninem v pozici -1 a končící kyselinou asparagovou v pozici +124, jak je znázorněno na obr. 3,
b) aminokyselinovou sekvenci začínající methioninem v pozici +1 a končící kyselinou asparagovou v pozici +124, jak je znázorněno na obr. 19, nebo začínající alaninem v pozici -1 a končící kyselinou asparagovou v pozici +124, jak je znázorněno na obr. 19,
c) aminokyselinovou sekvenci začínající methioninem v pozici 27 a končící kyselinou asparagovou v pozici 150, jak je znázorněno na obr. 20, nebo začínající alaninem v pozici 26 a končící kyselinou asparagovou v pozici 150, jakje znázorněno na obr. 20,
d) aminokyselinovou sekvenci začínající methioninem v pozici 27 a končící kyselinou asparagovou v pozici 150, jakje znázorněno na obr. 21, nebo začínající alaninem v pozici 26 a končící kyselinou asparagovou v pozici 150, jakje znázorněno na obr. 21, nebo
e) aminokyselinovou sekvenci začínající methioninem v pozici 27 a končící kyselinou asparagovou v pozici 150, jakje znázorněno na obr. 22, nebo začínající alaninem v pozici 26 a končící kyselinou asparagovou v pozici 150, jakje znázorněno na obr. 22.
2. Použití podle nároku 1, kde transplantace ostrůvků slinivky břišní je pro léčbu diabetes.
3. Použití podle nároku 2, kde diabetem je diabetes typu 1 nebo diabetes typu 2.
4. Použití podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, kde buňky transplantátu slinivky břišní zahrnují enkapsulované buňky slinivky břišní.
5. Použití podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, kde transplantace buněk ostrůvků slinivky břišní se dosahuje před, během a/nebo poté co jsou přítomny rozpustné CTLA4 mutantní molekuly.
6. Použití podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, kde rozpustná CTLA4 mutantní molekula se váže na CD80 a/nebo CD86 molekulu na CD80 a/nebo CD86-pozitivních buňkách.
7. Použití podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, kde rozpustná mutantní CTLA4 mutantní molekula obsahuje mutovanou extracelulámí doménu CTLA4, které se váže na CD80 a/nebo CD86 molekulu na CD80 a/nebo CD86-pozitivních buňkách.
8. Použití podle nároku 1 nebo 7, kde extracelulámí doména je fúzovaná k non-CTLA4 části.
9. Použití podle nároku 8, kde non-CTLA4 skupina zahrnuje imunoglobulinovou část.
-44CZ 305380 B6
10. Použití podle nároku 9, kde imunoglobulinovou částí je konstantní region imunoglobulinu nebo jeho část.
11. Použití podle nároku 10, kde konstantní region imunoglobulinu nebo jeho část obsahuje
5 jednu nebo více mutací pro snížení efektorové funkce.
12. Použití podle nároku 10 nebo 11, kde konstantní region imunoglobulinu obsahuje pant, CH2 a CH3 region imunoglobulinové molekuly.
io
13. Použití podle jakéhokoliv z nároků 10 až 12, kde konstantním regionem imunoglobulinu nebo jeho částí je lidský nebo opičí konstantní region imunoglobulinu.
14. Použití podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, kde rozpustnou CTLA4 mutantní molekulou je:
15 a) L104EA29YIg, znázorněný na obr. 3, začínající Ala v pozici -1 nebo Met v pozici +1 a končící Lys v pozici +357,
b) L104EIg, znázorněný na obr. 19, začínající Ala v pozici -1 nebo Met v pozici +1 a končící Lys v pozici +357,
c) L104EA29LIg, znázorněný na obr. 20, začínající Ala v pozici 26 nebo Met v pozici 27 a
20 končící Lys v pozici 383,
d) L104EA29TIg, znázorněný na obr. 21, začínající Ala v pozici 26 nebo Met v pozici 27 a končící Lys v pozici 383, nebo
e) L104EA29WIg, znázorněný na obr. 22, začínající Ala v pozici 26 nebo Met v pozici 27 a končící Lys v pozici 383.
15. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1 až 14, kde rozpustná CTLA4 mutantní molekula je v kombinaci s alespoň jednou další sloučeninou, která je vybrána ze souboru obsahujícího imunosupresivní sloučeniny, imunomodulační sloučeniny a protizánětlivé sloučeniny.
30
16. Použití podle nároku 15, kde sloučenina je zvolena ze souboru obsahujícího anakinru, adrenokortikosteroidy, azathioprin, basiliximab, inhibitory kalcineurinu, chlorochin, kortikosteroidy, cyklosporin, prednison, cyklofosfamid, cytoxan, 15-deoxyspergualin a jeho analogy, D-penicilamin, etanercept, glatiramer-acetát, FTY720 a jeho analogy, glukokortikoidy, soli zlata, koňský anti-lidský thymocytámí globulin, humanizovanou anti-TAC, hydrochlorochin, infliximab, in35 terferon, beta-la, interferon beta-lb, leflunomid a jeho analogy, lymfocytámí imunitní globulin, činidlo pro infiltraci lymfocytů, methoxsalen, methotrexát, hydrochlorid mitoxantronu, kyselinu mykofenolovou, mykofenolát-mofetil, mizoribin, NSAIDs, králičí anti-lidský thymocytámí globulin, Rho (D) imunní globulin, sirolimus nebo rapamycin a jejich deriváty, jako je 40-0-(2hydroxyjethyl-rapamycin), sulfasalazopyrin, sulfazalin, tarcolimus, thalidomid, TNF α blokátory
40 a biologická činidla, která jsou namířena proti zánětlivým cytokinům, TOR inhibitory, sloučeniny, které interferují s CD40 a CD 154, solubilní gp39, solubilní CD29, solubilní CD40, solubilní CD80, jako je ATCC 68627, solubilní CD86, solubilní CD28, solubilní CD56, solubilní Thy-I, solubilní CD3, solubilní TCR, solubilní VLA-4, solubilní VCAM-1, solubilní LECAM-1, solubilní ELAM-1, solubilní CD44, protilátky reaktivní sgp39, jako jsou ATCC HB-10916, ATCC
45 HB-12055 a ATCC HB-12056, protilátky reaktivní s CD40, jako je ATCC HB-9110, protilátky reaktivní s B7, jako jsou ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341, protilátky reaktivní s CD28, jako je ATCC HB-1944 nebo mAb 9.3, protilátky reaktivní s LFA-1, jako jsou ATCC HB-9579 a ATCC TIB-213, protilátky reaktivní s LFA2, protilátky reaktivní sIL-2, protilátky reaktivní sIL-12, protilátky reaktivní s IFN-gamma,
50 protilátky reaktivní s CD2, protilátky reaktivní s CD48, protilátky reaktivní s jakoukoliv ICAM, jako jsou ICAM-1, například ATCC CRL-2252, ICAM-2 a ICAM-3, protilátky reaktivní s CTLA4, jako je ATCC HB-304, protilátky reaktivní s Thy-1, protilátky reaktivní s CD56, pro-45CZ 305380 B6 tilátky reaktivní s CD3, protilátky reaktivní s CD29, protilátky reaktivní s TCR, protilátky reaktivní s VFA-4, protilátky reaktivní s VCAM-1, protilátky reaktivní s LECAM-1, protilátky reaktivní s ELAM-1, protilátky reaktivní s CD44, monoklonální protilátky k leukocytámím receptorům, například MHC, CD2, CD3, CD4, CDIIa/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150, 0X40, 4-1BB nebo jejich ligandy, CTLA4/CD28-Ig, LFA-1 antagonisty, antagonisty selektinu a VFA-4 antagonisty a proti-lidský IL-2 R mAbs.
17. Použití podle nároku 15 nebo 16, kde rozpustná CTLA4 mutantní molekula a další sloučenina účinkuj i společně.
18. Použití podle nároku 15 nebo 16, kde rozpustná CTLA4 mutantní molekula a další sloučenina účinkují souběžně nebo postupně.
19. Použití podle jakéhokoliv z nároků 1 až 14, kde inhibice rejekce transplantovaných buněk ostrůvků slinivky břišní je dosahováno doplňkovým imunosupresivním režimem.
20. Použití podle nároku 19, kde doplňkový imunosupresivní režim je prostý glukokortikoidu.
21. Použití podle nároku 19, kde doplňkový imunosupresivní režim zahrnuje kortikosteroid.
22. Použití podle jakéhokoliv z nároků 19 až 21, kde doplňkový imunosupresivní režim je prostý inhibitoru kalcineurinu.
23. Použití podle jakéhokoliv z nároků 19 nebo 22, kde doplňkový imunosupresivní režim obsahuje jednu nebo více sloučenin podle nároku 16.
24. Použití podle jakéhokoliv z nároků 19 až 23, kde doplňkový imunosupresivní režim obsahuje TOR inhibitor a/nebo biologické činidlo, které je namířeno proti IL-2.
25. Použití podle nároku 24, kde TOR inhibitorem je rapamycin neboli sirolimus nebo jeho derivát.
26. Použití podle nároku 24, kde biologickým činidlem, které je namířeno proti IL-2, je protilátka reaktivní s IL-2 nebo anti-lidský IL-2R mAb.
27. Použití podle nároku 26, kde anti-lidským IL-2R mAb je basiliximab.
28. Použití podle jakéhokoliv z nároků 19 až 27, kde doplňkový imunosupresivní režim obsahuje kyselinu mykofenolovou nebo mykofenolát-mofetil.
29. Použití podle nároku 18, kde doplňkový imunosupresivní režim obsahuje sloučeninu, která interferuje s vázáním CD40 na CD 154.
30. Použití podle nároku 29, kde sloučeninou, která interferuje s vázáním CD40 na CD154, je anti-CD40 protilátka.
31. Použití podle nároku 29, kde sloučeninou, která interferuje s vázáním CD40 na CD154, je anti-CD154 protilátka.
32. Použití podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, kde inhibice rejekce transplantovaných buněk ostrůvků slinivky břišní se dosahuje přítomností buněk kostní dřeně zbavené T-lymfocytů.
33. Použití podle nároku 32, kde buňky kostní dřeně zbavené T-lymfocytů jsou přítomny přibližně současné s transplantátem buněk ostrůvků slinivky břišní.
-46CZ 305380 B6
34. Použití podle nároku 32, kde buňky kostní dřeně zbavené T-lymfocytů jsou přítomny před transplantátem buněk ostrůvků slinivky břišní.
35. Použití podle jakéhokoliv z nároků 32 až 34, kde buňky kostní dřeně zbavené T-lymfocytů 5 jsou v první dávce a v druhé dávce.
CZ2003-3188A 2001-05-23 2002-05-23 Léčivo pro inhibici rejekce transplantovaných buněk ostrůvků slinivky břišní CZ305380B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29340201P 2001-05-23 2001-05-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20033188A3 CZ20033188A3 (cs) 2005-04-13
CZ305380B6 true CZ305380B6 (cs) 2015-08-26

Family

ID=23128937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2003-3188A CZ305380B6 (cs) 2001-05-23 2002-05-23 Léčivo pro inhibici rejekce transplantovaných buněk ostrůvků slinivky břišní

Country Status (17)

Country Link
US (2) US7304033B2 (cs)
EP (1) EP1397153B1 (cs)
JP (1) JP4837880B2 (cs)
AT (1) ATE390931T1 (cs)
AU (1) AU2002305716B2 (cs)
CA (1) CA2447921C (cs)
CY (1) CY1108127T1 (cs)
CZ (1) CZ305380B6 (cs)
DE (1) DE60225914T2 (cs)
DK (1) DK1397153T3 (cs)
ES (1) ES2302811T3 (cs)
HU (1) HU229680B1 (cs)
MX (1) MXPA03010568A (cs)
NO (1) NO332465B1 (cs)
PL (1) PL204899B1 (cs)
PT (1) PT1397153E (cs)
WO (1) WO2002094202A2 (cs)

Families Citing this family (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6887471B1 (en) * 1991-06-27 2005-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Method to inhibit T cell interactions with soluble B7
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
AU710998B2 (en) * 1996-03-20 1999-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Methods for inhibiting an immune response by blocking the GP39/CD40 and CTLA4 /CD28/B7 pathways and compositions for use therewith
US20030219863A1 (en) * 1997-01-31 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
ZA98533B (en) * 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
IL152316A0 (en) * 2000-06-09 2003-05-29 Bristol Myers Squibb Co Pharmaceutical compositions and kits for treating transplant rejection
IL153593A0 (en) * 2000-07-03 2003-07-06 Bristol Myers Squibb Co A pharmaceutical composition containing a soluble ctla4 mutant molecule
US20040022787A1 (en) 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
HUP0303930A3 (en) * 2001-01-26 2012-09-28 Univ Emory Methods of inducing organ transplant tolerance and correcting hemoglobinopathies
CZ305380B6 (cs) * 2001-05-23 2015-08-26 Bristol-Myers Squibb Company Léčivo pro inhibici rejekce transplantovaných buněk ostrůvků slinivky břišní
JP4541157B2 (ja) * 2002-12-23 2010-09-08 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー タンパク質を製造するための哺乳類細胞培養法
AU2003303394B2 (en) * 2002-12-23 2009-02-19 Bristol-Myers Squibb Company Product quality enhancement in mammalian cell culture processes for protein production
KR20060132541A (ko) * 2003-08-04 2006-12-21 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 가용성 ｃｔｌａ4 분자를 사용한 심혈관 질환의 치료 방법
US20070009517A1 (en) * 2003-08-25 2007-01-11 Mark De Boer Method of inducing immune tolerance
EA013122B1 (ru) 2005-04-06 2010-02-26 Бристол-Маерс Сквибб Компани Способы лечения иммунных нарушений, связанных с пересадкой трансплантата, растворимым мутантным ctla4
US8715649B2 (en) * 2005-06-07 2014-05-06 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods of use for alpha-1 antitrypsin having no significant serine protease inhibitor activity
ES2516690T5 (es) * 2005-06-07 2017-11-21 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Inhibidores de la actividad de serina proteasa y su uso en métodos y composiciones para el tratamiento de rechazo de injertos y promoción de supervivencia de injertos
US9457070B2 (en) 2005-06-07 2016-10-04 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions, methods and uses of alpha 1-antitrypsin for early intervention in bone marrow transplantation and treatment of graft versus host disease
US20090186097A1 (en) * 2005-08-09 2009-07-23 David Lee Ayares Transgenic Ungulates Expressing CTLA4-IG and Uses Thereof
WO2007047539A2 (en) * 2005-10-14 2007-04-26 Medtronic, Inc. Localized delivery to the lymphatic system
AR058568A1 (es) * 2005-12-20 2008-02-13 Bristol Myers Squibb Co Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo
DK2253644T3 (da) 2005-12-20 2014-01-13 Bristol Myers Squibb Co Sammensætninger og fremgangsmåder til fremstilling af en sammensætning
US7510844B2 (en) 2006-01-24 2009-03-31 Bristol-Myers Squibb Company CD86 and CD80 receptor competition assays
US20090029904A1 (en) * 2006-07-21 2009-01-29 Sean Oldham Compositions and methods for treatment of insulin-resistance diseases
WO2008014035A2 (en) * 2006-07-25 2008-01-31 The Regents Of The University Of California Modulation of nkg2d and method for treating or preventing solid organ allograft rejection
EP2051987B1 (en) * 2006-08-18 2014-11-19 Argos Therapeutics, Inc. Use of cd83 in combination therapies
GB0620934D0 (en) * 2006-10-20 2006-11-29 Cambridge Antibody Tech Protein variants
PT2612868T (pt) * 2007-11-01 2018-10-24 Astellas Pharma Inc Ácidos nucleicos e polipéptidos imunosupressores
US20090191608A1 (en) * 2008-01-22 2009-07-30 Baylor Research Institute Pancreatic Islet Cell Preparation and Transplantation
US8986253B2 (en) 2008-01-25 2015-03-24 Tandem Diabetes Care, Inc. Two chamber pumps and related methods
US7915222B2 (en) * 2008-05-05 2011-03-29 Bristol-Myers Squibb Company Method of preventing the development of rheumatoid arthritis in subjects with undifferentiated arthritis
US8408421B2 (en) 2008-09-16 2013-04-02 Tandem Diabetes Care, Inc. Flow regulating stopcocks and related methods
AU2009293019A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Tandem Diabetes Care Inc. Solute concentration measurement device and related methods
HRP20180045T1 (hr) 2008-10-02 2018-03-23 Aptevo Research And Development Llc Proteini antagonisti cd86 koji se vežu na više meta
CN102271702B (zh) * 2008-10-30 2015-11-25 耶达研究及发展有限公司 抗第三方中枢记忆性t细胞、产生其的方法及其在移植和疾病治疗中的用途
DK2365802T3 (da) 2008-11-11 2017-11-13 Univ Texas Mikrokapsler af rapamycin og anvendelse til behandling af cancer
AU2010278894B2 (en) 2009-07-30 2014-01-30 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
CA3104704A1 (en) * 2009-08-14 2011-02-17 Revivicor, Inc. Multi-transgenic pigs for diabetes treatment
US9283211B1 (en) 2009-11-11 2016-03-15 Rapamycin Holdings, Llc Oral rapamycin preparation and use for stomatitis
WO2011113019A2 (en) 2010-03-12 2011-09-15 Abbott Biotherapeutics Corp. Ctla4 proteins and their uses
US9527912B2 (en) 2010-05-17 2016-12-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Prevention of immunological rejection of transplanted stem cells by leukocyte costimulatory molecule blockade
HUE031063T2 (en) 2010-09-08 2017-06-28 Yeda Res & Dev Anti-third party use of central memory T cells for leukemia / anti-lymphoma treatment
EP2614083A2 (en) 2010-09-08 2013-07-17 Yeda Research and Development Co. Ltd An immunosuppressive drug combination for a stable and long term engraftment
NZ759163A (en) 2011-02-14 2023-03-31 Revivicor Inc Genetically modified pigs for xenotransplantation of vascularized xenografts and derivatives thereof
AU2012272636A1 (en) 2011-06-24 2013-05-02 Advent Bio Holdings Llc Compositions, methods and uses for alpha-1 antitrypsin fusion molecules
RU2636503C2 (ru) 2011-09-08 2017-11-23 Иеда Рисеч Энд Девелопмент Ко. Лтд. Т-клетки центральной памяти против третьей стороны, способы их получения и их применение в трансплантации и лечении заболеваний
US9180242B2 (en) 2012-05-17 2015-11-10 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods and devices for multiple fluid transfer
US8735359B2 (en) 2012-05-24 2014-05-27 Orban Biotech Llc Combinations of modalities for the treatment of diabetes
US9555186B2 (en) 2012-06-05 2017-01-31 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
CA2877986A1 (en) * 2012-06-27 2014-01-03 Orban Biotech Llc Ctla4 fusion proteins for the treatment of diabetes
US20140112958A1 (en) 2012-10-24 2014-04-24 Mwm Biomodels Gmbh Pancreatic islets of transgenic LEA29Y animals for treating diabetes
EP2968281B1 (en) 2013-03-13 2020-08-05 The Board of Regents of The University of Texas System Mtor inhibitors for prevention of intestinal polyp growth
US9173998B2 (en) 2013-03-14 2015-11-03 Tandem Diabetes Care, Inc. System and method for detecting occlusions in an infusion pump
US20160153990A1 (en) 2013-03-28 2016-06-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods for identifying patients at risk for costimulation blockade resistant rejection
US10071167B2 (en) * 2013-05-08 2018-09-11 Children's Medical Center Corporation Method of preventing and treating type 1 diabetes, allograft rejection and lung fibrosis (by targeting the ATP/P2X7R axis)
US10751370B2 (en) * 2013-12-13 2020-08-25 Swedish Stromabio Ab Immunomodulatory compositions
AU2014373683B2 (en) 2013-12-31 2020-05-07 Rapamycin Holdings, Llc Oral rapamycin nanoparticle preparations and use
US9700544B2 (en) 2013-12-31 2017-07-11 Neal K Vail Oral rapamycin nanoparticle preparations
GB2523399B (en) 2014-02-25 2019-03-13 Orban Tihamer A composition comprising ten overlapping peptide fragments of the entire preproinsulin sequence
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US9512229B2 (en) * 2015-03-03 2016-12-06 Kymab Limited Synergistic combinations of OX40L antibodies for the treatment of GVHD
PL3283508T3 (pl) 2015-04-17 2021-10-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Białka immunomodulacyjne o dostrajalnym powinowactwie
PL3322424T3 (pl) 2015-07-16 2024-03-04 Yeda Research And Development Co., Ltd. Zastosowanie centralnych limfocytów t pamięci przeciwko stronie trzeciej
US11260027B2 (en) 2015-07-29 2022-03-01 Musc Foundation For Research Development Donor organ pre-treatment formulation
KR102531889B1 (ko) 2016-06-20 2023-05-17 키맵 리미티드 항-pd-l1 및 il-2 사이토카인
GB201611123D0 (en) 2016-06-27 2016-08-10 Euremab Srl Anti met antibodiesand uses thereof
IT201800000534A1 (it) * 2018-01-03 2019-07-03 Procedimenti per la promozione della crescita cellulare degli isolotti pancreatici.
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
CN110392736A (zh) 2017-01-18 2019-10-29 耶达研究及发展有限公司 遗传修饰的反抑细胞及其在免疫治疗中的用途
US10751368B2 (en) 2017-01-18 2020-08-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of transplantation and disease treatment
CN111801347A (zh) 2017-10-10 2020-10-20 高山免疫科学股份有限公司 Ctla-4变体免疫调节蛋白和其用途
US12297253B2 (en) 2018-01-03 2025-05-13 Alpine Immune Sciences, Inc. Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof
FR3090320B1 (fr) * 2018-12-19 2023-03-03 Karim Bouzakri Utilisation de la decorine dans le traitement du diabete
EP3934677A4 (en) 2019-03-13 2022-11-16 University of Virginia Patent Foundation COMPOSITIONS AND METHODS TO PROMOTE ISLAND VIABILITY AND INCREASE INSULINE SECRETION
KR20230031981A (ko) 2019-05-14 2023-03-07 프로벤션 바이오, 인코포레이티드 제1형 당뇨병을 예방하기 위한 방법 및 조성물
AU2021287998A1 (en) 2020-06-11 2023-02-02 Benaroya Research Institute At Virginia Mason Methods and compositions for preventing type 1 diabetes
CN115089718B (zh) * 2021-11-30 2024-05-28 杭州瑞普晨创科技有限公司 用于异种移植的免疫抑制剂组合和免疫抑制方法
WO2025235670A1 (en) * 2024-05-07 2025-11-13 Eledon Pharmaceuticals, Inc. Use of anti-cd40 ligand antibodies for immunosuppression in islet cell transplantation

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5958403A (en) * 1992-02-28 1999-09-28 Beth Israel Hospital Association Methods and compounds for prevention of graft rejection

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) * 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
IL92382A (en) * 1988-11-23 1994-12-29 Univ Michigan Use of a ligand specific for CD28 in the manufacture of medicament
US6685941B1 (en) * 1988-11-23 2004-02-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods of treating autoimmune disease via CTLA-4Ig
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) * 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US5858358A (en) * 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) * 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US7070776B1 (en) 1990-03-26 2006-07-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods for blocking binding of CD28 receptor to B7
US5521288A (en) * 1990-03-26 1996-05-28 Bristol-Myers Squibb Company CD28IG fusion protein
US5851795A (en) * 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US5844095A (en) * 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
US5637481A (en) * 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5770197A (en) * 1991-06-27 1998-06-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for regulating the immune response using B7 binding molecules and IL4-binding molecules
US6090914A (en) * 1991-06-27 2000-07-18 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4/CD28Ig hybrid fusion proteins and uses thereof
KR100238712B1 (ko) 1991-06-27 2000-01-15 스티븐 비. 데이비스 씨티엘에이4 수용체,그를 함유한 연합단백질 및 그의 용도
DE69333580D1 (de) 1992-04-07 2004-09-09 Univ Michigan Immunregulation über die cd28-route
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5773253A (en) * 1993-01-22 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company MYPPPY variants of CTL A4 and uses thereof
DK0700430T3 (da) 1993-06-04 2005-08-15 Us Navy Fremgangsmåder til selektivt af stimulere proliferation af T-celler
WO1994028912A1 (en) 1993-06-10 1994-12-22 The Regents Of The University Of Michigan Cd28 pathway immunosuppression
IL110855A (en) 1993-09-02 1999-04-11 Dartmouth College Methods for inducing antigen-specific t cell tolerance
US5683693A (en) 1994-04-25 1997-11-04 Trustees Of Dartmouth College Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40
EP0764203A1 (en) 1994-06-03 1997-03-26 THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY OF THE NAVY Methods for selectively stimulating proliferation of t cells
US6719972B1 (en) * 1994-06-03 2004-04-13 Repligen Corporation Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies
AU2701895A (en) 1994-06-07 1996-01-05 Regents Of The University Of Minnesota Methods for inhibiting antigen specific t cell responses
AU4158396A (en) 1994-11-10 1996-06-06 Dana-Farber Cancer Institute Methods for inhibiting graft versus host disease in bone marrow transplantation
US5876950A (en) 1995-01-26 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy
GB9506844D0 (en) * 1995-04-03 1995-05-24 Armitage Ian M Pharmaceutical microencapsulation
US5993800A (en) * 1995-06-05 1999-11-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods for prolonging the expression of a heterologous gene of interest using soluble CTLA4 molecules and an antiCD40 ligand
US6113898A (en) * 1995-06-07 2000-09-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies
US7041634B2 (en) * 1995-09-27 2006-05-09 Emory University Method of inhibiting immune system destruction of transplanted viable cells
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
AU710998B2 (en) * 1996-03-20 1999-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Methods for inhibiting an immune response by blocking the GP39/CD40 and CTLA4 /CD28/B7 pathways and compositions for use therewith
KR19980066046A (ko) 1997-01-18 1998-10-15 정용훈 고역가의 CTLA4-Ig 융합단백질
US20030219863A1 (en) * 1997-01-31 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
ZA98533B (en) * 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
CA2291338A1 (en) 1997-06-11 1998-12-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Composition and method to prevent graft rejection and other counter-adaptive t lymphocyte mediated immune responses
EP1053006A4 (en) 1998-02-04 2002-09-25 Gen Hospital Corp INHIBITION OF AN ASSOCIATED STIMULATION PATHWAY AND MIXED CHIMERISM IN TRANSPLANTATION
IL126681A0 (en) 1998-10-21 1999-08-17 Opperbas Holding Bv Treatment of trauma-related conditions
WO2001054732A1 (en) 2000-01-27 2001-08-02 Genetics Institute, Llc. Antibodies against ctla4 (cd152), conjugates comprising same, and uses thereof
WO2001090122A2 (en) 2000-05-23 2001-11-29 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Haplotypes of the ctla4 gene
AU2006203199B2 (en) * 2000-05-26 2009-02-12 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
US7094874B2 (en) * 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
DK1248802T3 (da) 2000-05-26 2004-11-15 Bristol Myers Squibb Co Oplöselige CTLA4-mutantmolekyler og anvendelser deraf
IL152316A0 (en) * 2000-06-09 2003-05-29 Bristol Myers Squibb Co Pharmaceutical compositions and kits for treating transplant rejection
US20040022787A1 (en) * 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
IL153593A0 (en) * 2000-07-03 2003-07-06 Bristol Myers Squibb Co A pharmaceutical composition containing a soluble ctla4 mutant molecule
HUP0303930A3 (en) * 2001-01-26 2012-09-28 Univ Emory Methods of inducing organ transplant tolerance and correcting hemoglobinopathies
US20030031652A1 (en) 2001-04-16 2003-02-13 Bernhard Hering Systems and methods for inducing mixed chimerism
CZ305380B6 (cs) * 2001-05-23 2015-08-26 Bristol-Myers Squibb Company Léčivo pro inhibici rejekce transplantovaných buněk ostrůvků slinivky břišní
JP4541157B2 (ja) 2002-12-23 2010-09-08 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー タンパク質を製造するための哺乳類細胞培養法
AU2003303394B2 (en) 2002-12-23 2009-02-19 Bristol-Myers Squibb Company Product quality enhancement in mammalian cell culture processes for protein production
KR20060132541A (ko) 2003-08-04 2006-12-21 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 가용성 ｃｔｌａ4 분자를 사용한 심혈관 질환의 치료 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5958403A (en) * 1992-02-28 1999-09-28 Beth Israel Hospital Association Methods and compounds for prevention of graft rejection

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lenschow, D.J. et al.: "Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4Ig", Science, Vol. 257(5071), 789-792, 1992 *
Najafian N. et al.: "CTLA4-Ig: a novel immunosuppressive agent", EXP. OPIN. INVEST. DRUGS, Vol. 9(9), 2147 - 2157, 2000 *
Weber C.J. et al.: "CTLA4 -Ig prolongs survival of microencapsulated rabbit islet xenografts in spontaneously diabetic Nod mice", Cell Transplantation , Vol. 6(5), 505-508, 1997 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002094202B1 (en) 2003-07-31
EP1397153B1 (en) 2008-04-02
MXPA03010568A (es) 2005-03-07
EP1397153A4 (en) 2006-01-04
HU229680B1 (hu) 2014-04-28
AU2002305716B8 (en) 2002-12-03
DE60225914T2 (de) 2009-07-23
US20030022836A1 (en) 2003-01-30
US7304033B2 (en) 2007-12-04
WO2002094202A2 (en) 2002-11-28
CA2447921C (en) 2011-08-09
HUP0401590A3 (en) 2012-09-28
NO20035176L (no) 2004-01-05
EP1397153A2 (en) 2004-03-17
ES2302811T3 (es) 2008-08-01
DE60225914D1 (de) 2008-05-15
JP2004535402A (ja) 2004-11-25
DK1397153T3 (da) 2008-05-26
JP4837880B2 (ja) 2011-12-14
ATE390931T1 (de) 2008-04-15
PL204899B1 (pl) 2010-02-26
PT1397153E (pt) 2008-06-12
CZ20033188A3 (cs) 2005-04-13
CY1108127T1 (el) 2014-02-12
AU2002305716B2 (en) 2007-10-25
US7829534B2 (en) 2010-11-09
NO332465B1 (no) 2012-09-24
US20080160022A1 (en) 2008-07-03
CA2447921A1 (en) 2002-11-28
PL364578A1 (en) 2004-12-13
WO2002094202A3 (en) 2003-06-26
NO20035176D0 (no) 2003-11-21
HUP0401590A2 (hu) 2004-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ305380B6 (cs) Léčivo pro inhibici rejekce transplantovaných buněk ostrůvků slinivky břišní
US20210115107A1 (en) Methods of treatment using ctla4 molecules
EP1536234B1 (en) Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
AU2002305716A1 (en) Methods for protecting allogeneic islet transplant using soluble CTLA4 mutant molecules
CA2630062C (en) Methods for treating graft versus host disease and immune disorders associated with rejection using a soluble ctla4 molecule
DK1868635T3 (en) METHODS OF TREATING IMMUNE DISEASES IN CONNECTION WITH ORGAN TRANSPLANTATION WITH SOLUBLE, Mutating CTLA4 MOLECULES
HK1225393A1 (en) Soluble ctla4 mutant molecules and uses thereof
WO2006107298A1 (en) Methods for treating immune disorders associated with graft transplantation with soluble ctla4 mutant molecules
HK1071931B (en) Soluble ctla4 mutant molecules and uses thereof
CZ20031997A3 (cs) Léčivo pro navození smíšeného hematopoetického chimérismu, pro léčení hemoglobinopatie a pro inhibici nebo snížení rejekcí transplantátu
BG107210A (bg) Разтворими ctla4 мутантни молекули и тяхното използване

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20200523