EA013122B1 - Способы лечения иммунных нарушений, связанных с пересадкой трансплантата, растворимым мутантным ctla4 - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение предусматривает применение растворимого мутантного CTLA4, который связывается с антигеном CD80 и/или CD86 с большей авидностью, чем дикого типа CTLA4 или немутантный CTLA4, при лечении иммунных нарушений, связанных с пересадкой трансплантата.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к применению растворимого мутантного СТБА4 с повышенной авидностью к ί.Ό80 (В7-1) и ί.Ό86 (В7-2) по сравнению с СТБА4 дикого типа при лечении иммунных нарушений, обусловленных пересадкой трансплантата.

Предпосылки создания изобретения

Принимая во внимание важнейшую роль Т-клеток в отторжении трансплантата, можно представить, что общей целью современных иммунодепрессивных средств является блокирование активации и функции Т-клеток (8ауедб М.Н., Тигка Ь.А. Тбе го1е ок Т-се11 сокбши1а!огу асРуаФоп раНзхгаук ίη 1гап<р1ап( гс)сс1юп. N. Епд1. ί. МеФ. 1998; 338(25): 1813-21). Для полной активации Т-клеток необходим как антиген-специфический (сигнал 1), так и костимулирующий сигнал (сигнал 2) (Ьепксботе ОФ.. ^а1ипак Т.Ь., В1иек!опе ЕЛ. СО28/В7 кук!еш ок Т се11 сокбши1абоп. Аппи Веу. 1ттипо1. 1996; 14: 233-58). Один из лучше всего охарактеризованных костимулирующих путей включает взаимодействие СО28-СО80/86 (В71/2) (Ыпк1еу Р.8., ЬеФЬейег кА. Т1е го1е ок Ле СО28 гесерЮг Фибпд Т се11 гекропкек !о апбдеп. Аппи Веу. 1ттипо1. 1993; 11: 191-212). Антиген 4 цитотоксического Т-лимфоцита (СТБА4) связывается с СО80/86 с более высокой авидностью, чем СО28, и транзиторно экспрессируется на Т-клетках после их активации в тех случаях, когда он прерывает взаимодействие между СО28 и СО80/86 (Оок1ег\уеде1 М.А., Сгееп\га1Ф ВФ., МапФе1Ьго! О.А., ЬогкЬасй В.В., 8йагре А.Н. СТЬА-4 апФ Т се11 асбуабоп. Сигг. Орш. 1ттипо1. 1999; 11(3): 294-300). При этом возникает негативный сигнал обратного связывания для активации Т-клеток.

Вмешательство в этот путь ранее осуществляли с помощью СТЬА41д. СТЬА41д успешно применяли в качестве способа лечения аутоиммунных заболеваний, опосредованных Т-клетками, таких как ревматоидный артрит (Кгетег ЕМ., \¥ек11юуепк В., Ьеоп М., е! а1. Тгеа1теп1 ок гЬеита!о1Ф айбпбк Ьу ке1есбуе шЫЫбопок Т-се11 асбуабоп \νί11ι кикюп рго!ет СТЬА41д. N. Епд1. к МеФ. 2003; 349(20): 1907-15), и псориаз (АЬгатк кВ., ЬеЬ^оЫ М.С., Сиххо С.А., е! а1. СТЬА41д-теФ1а!еФ Ь1оскаФе ок Т-се11 сокбти1абоп ш рабеп1к νίίΗ ркобакщ уи1дапк. I. С1т. 1пуек1. 1999; 103(9): 1243-52).

ЬЕА29У изучали на моделях трансплантатов у приматов, индивидуально или в комбинации с другими иммунодепрессивными агентами. Сббкбап Ьагкеп е! а1. (С. Ьагкеп, Т. Реагкоп, А. АФатк, Р. Тко, N. 8Ыгакид1, Е. 8боЬеб, Ό. АпФегкоп, 8. Со\уап, К. Рбсе, к №етига, к Етк\уИег, к Степе, Ь.А. Тигк, к Ва)ога(Н, В. То\упкепФ, Ό. Надейу, Р. Ьтк1еу апФ В. Реасб; Вабопа1 Оеге1ортеп1 ок ЬЕА29У (Ье1а1асер(), а Н|д11-АПтЦу УапаШ ок СТЬА41д νίίΗ Ро1еп1 1ттипокирргекк1уе Ргорегбек; Атебсап 1оигпа1 ок Тгапкр1ап1абоп; Уо1. 5, 1ккие 3, Магсб 2005, р.443) продемонстрировали повышенную иммунодепрессивную активность БЕА29У по сравнению с СТЬА41д на модели приматов, используемой для исследования отторжения почечного трансплантата. БЕА29У вводили интраоперационно (во время операции) (10 мг/кг внутривенно), на 4 день (15 мг/кг) и на 14, 28, 42, 56 и 70 день после операции (20 мг/кг внутривенно). СТЬА41д (16 мг/кг) вводили интраоперационно и на 4, 8, 11 и 16 день после операции. Схема лечения включала также ММЕ (15 мг/кг Ь1Ф к.с. (два раз в день подкожно) в дни 0-14, с.|Ф (ежедневно) в дни 15180), метилпреднизолон (подкожные инъекции по следующей схеме: день 0: 20 мг, день 1: 16 мг, день 3: 8 мг, день 4: 4 мг, дни 5-14: 3 мг, дни 15-180: 1 мг) и базиликсимаб (0.3 г/кг в.в. в дни 0 и 4). Жизнеспособность реципиентов с почечным трансплантатом, пролеченных с помощью БЕА29У, была четко выше жизнеспособности в группе, получавшей СТЬА41д, несмотря на сравнимые сывороточные концентрации. Контрольные реципиенты, получавшие альбумин, показывают медианную продолжительность жизни, аналогичную продолжительности жизни (выживаемости) в группе, получавшей СТЬА41д. Однако несмотря на непрерывное лечение с помощью БЕА29У, все реципиенты испытывали значительное ухудшение почечной функции (повышение уровня сывороточного креатинина).

АпФге\у АФатк е! а1. (А. АФатк, N. 8Ыгакид1, Т. 1опек, М. Оигбат, Е. 8боЬеб, 8. Со\уап, Р. Веек, В. НепФбх, К. Рбсе, N. Кепуоп, Ό. Надейу, В. То\упкепФ, Ό. Но11епЬаидб, Т. Реагкоп апФ С. Ьагкеп: Оеуе1ортеп! ок а СЫтебс Апб-СО40 Мопос1опа1 АпбЬоФу Тба! 8упегщхек νί(Η ЬЕА29 Υ !о Рго1опд 1к1е1 абодгай 8шУ1уа1; Тбе 1опгпа1 ок 1ттипо1оду; кт 2005; 174; р. 542) показали, что комбинация БЕА2^<Ю и СЫ220 (химерное таЬ (моноклональное антитело) против человеческого СО40) действует синергистически на модели трансплантации панкреатических островков у приматов с целью продлить период существования трансплантата. БЕА2^<Ю вводили внутривенно во время операции (20 мг/кг); на 4, 7 и 14 день после операции; затем каждые 2 недели до дня 100. Дополнительные дозы (20 мг/кг) вводили ежемесячно до 6 месяцев включительно. Протестировано четыре протокола: 1) БЕА2^<Ю индивидуально, 2) СО220 (антиСО40), 3) ΕΒΛ29Υ в комбинации с СЫ220 и 4) БЕА2^<Ю в комбинации с анти-СО20.

АпФге\у АФатк е! а1. (А. АФатк, N. 8Ыгакид1, М. Откат, Е. 8боЬеб, Ό. АпФегкоп, Р. Веек, 8. Со\уап, Н. Хи, Υ. В1шФег, М. Сбеипд, Ό. Но11епЬаидб, N. Кепуоп, Т. Реагкоп апФ С Ьагкеп; Са1сшеибп 1пб1Ьйог Егее СО28 В1оскаФе-ВакеФ Рго!осо1 Рго!ес!к А11одепею 1к1е1к ш №п1штап Рбта!ек; О1аЬе!ек, Уо1. 51(2), ЕеЬгиагу 2002, р. 265) показали, что комбинация ^ЕА29Υ, рапамицина и тАЬ против 1Ь-2В значительно пролонгируют выживаемость аллотрансплантата островков. ЬЕА2^<Ю вводили внутривенно во время операции (10 мг/кг) и на 4 день после операции (15 мг/кг). Дополнительные дозы по 20 мг/кг давали на 14 день после операции и каждые 2 недели до 154 дня после операции.

В течение 2003 года в США было пересажено более 25000 органов. Трансплантаты почки составляют около 60% трансплантированных плотных органов, затем идут трансплантаты печени 21%, сердца

- 1 013122

8%, легкого 4% и остальные 7% составляют трансплантаты других органов, таких как поджелудочная железа и кишечник (ΘΡΤΝ/8ΚΤΚ Аппиа1 Керой 2004 на сайте \\л\лг.ор1п.огд).

Трансплантация почки является наиболее эффективным лечением на последней стадии заболевания почек. Она обеспечивает жизнеспособность и качество жизни (ОоБ). Поддержание функционирующего почечного трансплантата требует пожизненной иммунодепрессивной терапии для предупреждения иммунного разрушения трансплантата. Современные схемы иммунодепрессивной терапии дают коэффициент выживаемости 1 год для 89% трансплантатов от умерших и 94% трансплантатов от живых доноров. Однако со временем наблюдается прогрессирующая потеря как субъектов, так и трансплантатов. Продолжительность жизни пять лет для трансплантатов, полученных от умерших и живых доноров, составляет 66% и 79%, соответственно. (Ипйей №1\гогк Гог Отдал 8йаппд Кепа1 Тгаи8р1аи1 Кедййу 2003 на сайте те^^.ипок.огд)

Наиболее часто встречающимися причинами гибели субъекта и трансплантата через продолжительное время является сердечно-сосудистое заболевание и хроническая нефропатия аллотрансплантата (ΟΑΝ), соответственно. (Ь.С. Раи1, Сйгоше а11одгай перйгораЛу - А шойе1 о£ пирайей герай гот щ)игу. №р11го1 Όίπ1 Тгап8р1ап1 2000; 15: 149-151) Парадоксально, но основные терапевтические средства при трансплантации почки, ингибиторы кальциневрина (ΟΝΙ), С§А и такролимус, непосредственно влияют на отдаленную потерю аллотрансплантата и смерть пациента, так как они по определению являются нефротоксическими, а также вызывают или увеличивают риск сердечно-сосудистых заболеваний, включая гипертензию, гиперхолистеринемию и сахарный диабет. Тем не менее, эти агенты являются краеугольным камнем всех традиционных иммунодепрессивных схем при трансплантации почки.

В настоящее время не существует одобренных агентов, которые могут заменить ΟΝΙ в качестве основы поддерживающей иммунодепрессивной терапии у различных субъектов. Один агент, сиролимус (рапамицин, Каратипе® от ХУуеЛ/Ауегй), был одобрен в ΟΝΙ-щадящей схеме. Однако ΟΝΙ должны попрежнему применяться с сироламусом в течение по меньшей мере 3 месяцев после трансплантации. Более важно то, что сироламус одобрен в качестве ΟΝΙ-сберегающего агента в этом наборе только у субъектов с риском потери трансплантата от низкого до умеренного. Таким образом, для больных с повышенным риском потери трансплантата, для которых отсутствие нефротоксического эффекта ΟΝΙ было бы наиболее благоприятно, не существует одобренной альтернативы ΟΝΙ.

Следовательно, существует необходимость в иммунодепрессивных агентах, которые могут обеспечить приемлемый контроль аллоиммунного ответа, сравнимый со стандартами применяемых на практике лекарственных средств, без токсичности, которая способствует отдаленной смерти субъекта и потере трансплантата. В идеале агент мог бы применяться не только у субъектов с пониженным риском, но также у субъектов с повышенным риском потери трансплантата.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение предусматривает способы лечения иммунных нарушений, ассоциированных с трансплантацией, путем введения мутантного СТБА4, который с более высокой авидностью связывается с антигеном СЭ80 и/или СО86, чем у дикого типа СТБА4 или немутированный СТБА4[д. СТБА4 включает первую аминокислотную последовательность, содержащую внеклеточный домен СТБА4, в котором некоторые аминокислотные остатки в области 825-К33 и в области М97-О107 являются мутированными. Мутантные соединения по изобретению могут также включать вторую аминокислотную последовательность, которая повышает растворимость мутантного соединения.

Примером мутантного СТБА4 является Ш 04ΕΑ29ΥIд (фиг. 7, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3 и 4) по данному описанию. Другим примером мутантного СТЬА4 СТБА4 является БКНЕ^ (фиг. 8, 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5 и 6) по данному описанию. ^104ΕΑ29ΥIд и БКНЕ^ связывают СЭ80 и СЭ86 с более высокой авидностью, чем СΤ^Α4Iд.

Введение мутантного СТЬА4 по изобретению можно осуществлять через различные промежутки времени. Обычно схемы применения включают раннюю фазу, в которой дозы выше и частота введения повышается в период наибольшего иммунологического риска, с последующей фазой поддерживающей терапии. Ранняя фаза может длиться от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации. Схема применения в течение ранней фазы может в значительной степени варьироваться в зависимости от состояния реципиента/трансплантата.

В одном варианте настоящее изобретение предусматривает способ лечения иммунного нарушения, ассоциированного с трансплантацией ткани, путем введения субъекту эффективной дозы мутантного СТЬА4 с внеклеточным доменом СТБА4. показанным в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8, начиная с аланина в положении 26 или метионина в положении 27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении 150, или его участком. Кроме того, во внеклеточном домене или его участке аланин в положении 55 заменен на тирозин, а лейцин в положении 130 заменен на глутаминовую кислоту. Кроме того, схема применения включает раннюю фазу от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации и предполагает введение, первоначально более частое, чем раз в месяц.

В другом варианте настоящего изобретения предусматривается способ лечения иммунного нарушения, ассоциированного с трансплантацией ткани, путем введения субъекту эффективной дозы мутантного СТЬА4 с аминокислотной последовательностью начиная с метионина в положении 27 и кончая аспа

- 2 013122 рагиновой кислотой в положении 150 8ЕО ΙΌ N0: 4, или с аминокислотной последовательностью начиная с аланина в положении 26 и кончая аспарагиновой кислотой в положении 150 8Е0 ΙΌ N0: 4. Кроме того, схема введения мутантного СТЬЛ4 включает раннюю фазу, причем схема на ранней фазе может соблюдаться от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации и предполагает первоначально более частое введение, чем раз в месяц.

На фиг. 1 показан анализ равновесного связывания Ь104ЕЛ29¥1д, Ь104Е1д и дикого типа СТЬЛ41д с СО861д.

На фиг. 2А и 2В приводятся данные анализов РАС8, показывающие связывание Е104ЕЛ29У1д. Ь104Е1д и СТЬА41д с человеческими ΕΌ80- или СО86-трансфецированными СНО-клетками, описанное в примере 2, ниже.

На фиг. ЗА и 3В показано ингибирование пролиферации СЭ80-позитивных и СЭ86-позитивных СНО клеток, описанное в пример 2, ниже.

На фиг. 4А и 4В показано, что Ы104ЕА29¥1д более эффективно, чем СТЬА41д, ингибирует пролиферацию первичных и вторичных аллостимулированных Т клеток, как описано в примере 2, ниже.

На фиг. 5 А-С показано, что Ы104ЕА29¥1д более эффективно, чем СТЬА41д, ингибирует продуцирование 1Ь-2 (фиг. 5А), ЕЬ-4 (фиг. 5В) и γ-интерферона (фиг. 5С) аллостимулированными Т клетками, как описано ниже, в примере 2.

На фиг. 6 показано, что Ь104ЕА29¥1д более эффективно, чем СТЬА41д, ингибирует пролиферацию стимулированных фитогемагглютинином (РНА) Т клеток обезьяны, как описано ниже, в примере 2.

На фиг. 7 (8Е0 ΙΌ N0: 3 и 4) изображены нуклеотидная и аминокислотная последовательность мутантного СТЬА4 (Ь104ЕА29¥1д), содержащего сигнальный пептид; мутированный внеклеточный домен СТЬА4 начиная с метионина в положении +1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124, или начиная с аланина в положении -1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124; и область 1д, как описано ниже, в примере 1. 8Е0 ΙΌ N0: 3 и 4 изображают нуклеотидную и аминокислотную последовательность, соответственно, мутантного СТЬА4 (Ь104ЕА29¥1д); мутированный внеклеточный домен СТЬА4 начиная с метионина в положении +27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +150, или начиная с аланина в положении +26 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +150; и область ^Ι§.

На фиг. 8 (8Е0 ΙΌ N0: 5 и 6) изображены нуклеотидная и аминокислотная последовательность мутантного СТЬА4 ('Ή И'ЩЕ^), содержащая сигнальный пептид; мутированный внеклеточный домен СТЬА4 начиная с метионина в положении +1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124, или начиная с аланина в положении -1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124; и область Ι§, как описано ниже, в примере 1. 8Е0 ΙΌ N0: 5 и 6 изображают нуклеотидную и аминокислотную последовательность, соответственно, мутантного СТЬА4 ('Έ1 (ЩЕ^), содержащего сигнальный пептид; мутированный внеклеточный домен СТЬА4 начиная с метионина в положении +27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +150, или начиная с аланина в положении +26 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +150; и область Ι§.

На фиг. 9 (8Е0 ΙΌ N0: 7 и 8) изображены нуклеотидная и аминокислотная последовательность мутантного СТ^Л4Iд. содержащая сигнальный пептид; мутированный внеклеточный домен СТЬА4 начиная с метионина в положении +1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124, или начиная с аланина в положении -1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124; и область Ι§. 8Е0 ΙΌ N0: 7 и 8 изображают нуклеотидную и аминокислотную последовательность, соответственно, СТ^А4Iд, содержащего сигнальный пептид; дикого типа аминокислотную последовательность внеклеточного домена СТЬА4 начиная с метионина в положении +27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +150, или начиная с аланина в положении +26 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +150; и область Ι§.

На фиг. 10А-С изображен 8Ό8 гель (фиг. 10А) для СТ^А4Iд (дорожка 1), Е104ЕЦ (дорожка 2) и ^104ЕА29ΥIд (дорожка 3А); и эксклюзионные хроматограммы СТ^А4Iд (фиг. 10В) и ^104ЕА29ΥIд (фиг. 10С).

На фиг. 11А и 11В изображена ленточная диаграмма У-образной складки внеклеточной Ι§νподобной складки СТЬА4, полученная при исследовании структуры в растворе методом ЯМРспектроскопии. На фиг. 11В дано увеличенное изображение области 825-Р33 и области ΜΥΡΡΡΥ, показывающее локализацию и ориентацию боковой цепи мутаций, повышающих авидность, Ь104 и А29.

На фиг. 12 изображена принципиальная схема вектора, ρ^^N-^104ЕА29ΥIд, имеющего ^104ЕА29ΥIд вставку.

На фиг. 13 изображены нуклеотидная и аминокислотная последовательность рецептора СТЬА4 (81+) ΙΌ N0: 9 и 10).

Подробное описание изобретения

Определения

Если не указано иначе, все научные и технические термины, употребляемые в данном патенте, имеют общепринятые в уровне техники значения. Употребляемые в данном изобретении нижеприведенные слова или выражения имеют указанные значения.

Термин лиганд по данному описанию относится к соединению (молекуле), которое (которая) спе

- 3 013122 цифически распознает и связывает другое(ую) соединение (молекулу), например лигандом для СТБА4 является В7.

Дикого типа СТЬЛ4 или немутированный (немутантный) СТЬЛ4 по данному описанию имеет аминокислотную последовательность природного полноразмерного СТЬЛ4, показанную на фиг. 13 (ЗЕЦ ГО N0: 9 и 10; также описанную в патентах США 5434131, 5844095, 5851795), или какого-либо его участка, или его производного, который распознает или связывает В7 или противодействует (сталкивается с) В7 таким образом, что блокируется связывание с СГО28 и/или СТЬЛ4. В конкретных вариантах изобретения внеклеточный домен дикого типа СТЬЛ4 начинается с метионина в положении +1 и кончается аспарагиновой кислотой в положении +124, или внеклеточный домен дикого типа СТЬЛ4 начинается с аланина в положении -1 и кончается аспарагиновой кислотой в положении +124. Дикого типа СТЬЛ4 представляет собой белок клеточной поверхности, имеющий Ν-концевой внеклеточный домен, трансмембранный домен и С-концевой цитоплазматический домен. Внеклеточный домен связывается с целевыми молекулами (молекулами-мишенями), такими как молекула В7. В клетке природный дикого типа СТЬЛ4 белок транслируется в виде незрелого полипептида, который включает сигнальный пептид на Ν-конце. Незрелый полипептид претерпевает посттрансляционный процессинг, который включает отщепление и удаление сигнального пептида с образованием продукта расщепления СТЬЛ4, имеющего новообразованного Ν-конца, который отличается от Ν-конца в незрелой форме. Специалисту в данной области техники ясно, что может происходить дополнительный посттрансляционный процессинг, в результате которого из вновь образованного Ν-конца продукта расщепления СТЬЛ4 удаляется одна или более аминокислот. Или же, сигнальный пептид может не удаляться целиком, в результате образуется молекула, которая начинается ранее обычной стартовой аминокислоты метионина. Таким образом, зрелый белок СТЬЛ4 может начинаться с метионина в положении +1 или с аланина в положении -1. Зрелая форма СТЬЛ4 включает внеклеточный домен или его любой участок, который связывается с В7.

СТЬЛ41д представляет собой растворимый слитый белок, содержащий внеклеточный домен дикого типа СТЬЛ4, связанный с 1д хвостом, или его участок, который связывает В7. Конкретный вариант изобретения содержит внеклеточный домен дикого типа СТЬЛ4 (как показано на фиг. 9, ЗЕЦ ГО Ν0: 7 и 8) начиная с метионина в положении +1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124; или начиная с аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124; соединительный аминокислотный остаток глутамин в положении +125; и иммуноглобулиновый участок, охватывающий область от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 или глицина в положении +356 включительно (ДНК, кодирующая СТЬЛ41д, депонирована 31 мая 1991 г. в Американской коллекции типовых культур (АТСС), 10801 иштегкйу Β1νά., Мапаккак, УЛ 20110-2209 согласно условиям Будапештского Соглашения и имеет присвоенный АТСС регистрационный номер АТСС 68629; Ып81еу, Р., с1 а1., 1994 1шшиш1у 1: 793-80. СТЬЛ41д-24, линия клеток яичников китайского хомячка (СНО), экспрессирующих СТЬЛ41д, депонирована 31 мая 1991 г. в АТСС под идентификационным номером СВЬ-10762). Растворимый СТЬА41д может включать или не включать последовательность сигнального пептида (лидерную последовательность).

Термин слитый белок по данному описанию определяется как одна или более аминокислотных последовательностей, соединенных вместе общеизвестными в уровне техники способами как описано в патентах США 5434131 или 5637481. Соединенные аминокислотные последовательности образуют при этом один слитый белок.

Понятие растворимый по данному описанию относится к молекуле любого соединения или к ее фрагментам и производным, не связанным или не соединенным с клеткой, т.е., например, циркулирующей. Например, СТЬА4, В7 или СГО28 можно сделать растворимыми путем присоединения иммуноглобулиновой (1д) частицы к внеклеточному домену СТЬА4, В7 или СГО28. соответственно. Или же, соединение, такое как СТЬА4, можно сделать растворимым, удалив его трансмембранный домен.

Выражение внеклеточный домен СТЬА4 представляет собой участок СТЬА4, который узнает и связывает СТЬА4 лиганды, такие как В7. Например, внеклеточный домен СТЬА4 содержит область от метионина в положении +1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 (фиг. 13, ЗЕЦ ГО Ν0: 9 и 10). Или же, внеклеточный домен СТЬА4 содержат область от аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 (фиг. 13, ЗЕЦ ГО Ν0: 9 и 10). Внеклеточный домен включает фрагменты СТЬА4, которые связывают В7. Внеклеточный домен СТЬА4, показанный на фиг. 13 (ЗЕЦ ГО Ν0: 9 и 10), может также включать мутации, которые изменяют авидность связывания СТЬА4 для В7 молекулы.

Выражение мутантный СТБА4 (мутантная молекула СТЬА4) означает дикого типа СТБА4, показанный в (8ЕС ГО Ν0: 9 и 10), или любой участок его последовательности, или производное, которые содержат мутацию или множественные мутации (предпочтительно, во внеклеточном домене дикого типа СТБА4). Мутантный СТБА4 имеет последовательность, аналогичную, но не идентичную последовательности дикого типа СТБА4, но все еще связывает В7. Мутации могут включать один или более аминокислотных остатков с аминокислотой, имеющей консервативную (например, замена глицина на изолейцин) или неконсервативную (например, замена глицина на триптофан) структуру или химические свойства, аминокислотные делеции, добавления, сдвиги рамки или усечения (укорочения). Молекулы мутантного СТБА4 могут заключать в себе или быть связаны с не-СТЬА4 молекулами. Мутантные соединения могут

- 4 013122 быть растворимыми (т.е. циркулирующими) или связанными с клеточной поверхностью. Другие мутантные СТЬЛ4 включают СТЬЛ4, описанные в патентных заявках США порядковые номера 09/865321, 60/214065 и 60/287576; в патентах США 6090914, 5844095 и 5773253; и описанные РеаеЬ, К.Д., е! а1., в 1. Ехр. Меб. 180: 2049-2058 (1994). СТЬЛ4 мутантные молекулы можно получать синтетическими методами или методами рекомбинантной ДНК. Обычно в способах и/или наборах по изобретению молекулы не включают последовательность сигнального пептида.

'Έ104ΕΑ29ΥΙβ представляет собой слитый белок, который является растворимым мутантным СТЬА4, содержащим внеклеточный домен дикого типа СТЬА4 с аминокислотными заменами Α29Υ (замена аминокислотного остатка аланина на тирозин в положении 29) и Ь104Е (аминокислотная замена лейцина на глутаминовую кислоту в положении +104), или его частью, которая связывает молекулу В7, соединенной с 1д хвостом (включенным в фиг. 7, 8Е0 ΙΌ N0: 3 и 4; ДНК, кодирующая Ε104ΕΑ29ΥΙ§, депонирована 20 июня 2000 г. под номером АТСС РТА-2104; одновременно рассматриваемые патентные заявки США 09/579927, 60/287576 и 60/214065, вводимые в данное описание ссылкой). Растворимые Ε104ΕΑ29ΥΙ§, применяемые в способах и/или наборах по изобретению, могут включать или не включать последовательность сигнального (лидерного) пептида.

Термин мутация по данному описанию означает изменение в нуклеотидной или аминокислотной последовательности соединения дикого типа, например, изменение в ДНК и/или аминокислотной последовательностях внеклеточного домена дикого типа СТ^Α4. Мутация в ДНК может менять кодон, что приводит к изменению аминокислотной последовательности. Изменение ДНК может включать замены, делеции, инсерции, добавления, укорочения или ошибки процессинга или расщепления белка. Или же мутации в нуклеотидной последовательности могут дать молчащую мутацию в аминокислотной последовательности, хорошо известную в уровне техники. При этом некоторые нуклеотидные кодоны кодируют одну и ту же аминокислоту. Примеры включают нуклеотидные кодоны СОН, СОО, СОС и СОА, кодирующие аминокислоту аргинин (К); или кодоны ΘΑϋ и ОАС, кодирующие аспарагиновую кислоту (Ό). Таким образом, белок может кодироваться одной или более аминокислотами, которые отличаются своей конкретной нуклеотидной последовательностью, хотя кодируют белки, имеющие идентичные последовательности. Ниже даны кодирующие последовательности для аминокислот._______

Аминокислота	Символ	Однобуквенный символ	Кодоны
Аланин	А1а	А	оси, осс, оса, осс
Цистеин	Суз	С	иси, иос
Аспарагиновая кислота	Азр	ϋ	ели, ОАС
Глутаминовая кислота	С1и	Е	САА, САС
Фенилаланин	РЬе	Е	иии, иис
Глицин	О1у	О	оси, ссс, оса, ссс
Гистидин	ΗΪ8	Н	ели, САС
Изолейцин	Не	I	лии, лис, лил
Лизин	Ьуз	к	ААА.ААС
Лейцин	Ьеи	ь	иил, иис, сии, сис, сил, сис
Метионин	Ме!	м	лис
Аспарагин	Азп	N	ААЬ/ААС
Пролин	Рго	Р	сси, ссс, сса, ссс
Глутамин	СЯп	Ω	САА,САС
Аргинин	Агд	в.	сои, ССС, ССА, ССС, АСА, АСС
Серин	Зег	8	иси, исс, исл, исс, леи, асс
Треонин	ТЬг	Т	Аси, АСС, АСА, АСС
Валин	Уа1	V	сии, сис, сил, сис
Триптофан	Тгр	V/	исс
Тирозин	Туг	Υ	или, иле

Молекула мутантного соединения может иметь одну или более мутаций.

Выражение последовательность не-СТ^Α4 белка или ^-ΟΓΕΑ4 белок (молекула) по данному описанию означает любую белковую молекулу, которая не связывает В7 и не препятствует связыванию СТ^Α4 с его мишенью. Пример включает, но без ограничения, константную область иммуноглобулина (1д) или ее участок. Предпочтительно константная область 1д представляет собой константную область 1д человека или обезьян, например, области человеческого С(гамма)1, включающие шарнирную область, СН2 и СН3. Константная область 1д может быть мутантной с целью снижения его эффекторной функции (Патенты США 5637481, 5844095 и 5434131).

Термин фрагмент, участок или часть по данному описанию означает любую часть или любой сегмент СТ^Α4, предпочтительно внеклеточный домен СТ^Α4 или его участок или сегмент, который распознает и связывает его цель, например молекулу В7. Внеклеточный домен СТ^Α4 может включать мутации, которые изменяют авидность связывания (молекулы) СТ^Α4 с (молекулой) В7.

- 5 013122

В7 по данному описанию относится к семейству молекул В7, включая, но без ограничения, В7-1 (ΟΌ80), В7-2 (ΟΌ86) и В7-3, которые могут распознавать и связывать СТЬЛ4 и/или СЭ28.

Выражение В7-позитивные клетки означает любые клетки с одним или более типов В7 молекул, экспрессированных на поверхности клеток.

Термин производное по данному описанию обозначает молекулу, последовательность которой гомологична последовательности, а активность аналогична активности исходной молекулы. Например, производное СТЬЛ4 включает растворимый СТЬЛ4, имеющий аминокислотную последовательность по меньшей мере на 70% аналогичную аминокислотной последовательности внеклеточного домена дикого типа СТЬЛ4 и распознающий и связывающий В7, например, СТЬА41д, или Ь104ЕЛ29У1§. являющийся мутантным растворимым СТЬЛ4.

Регулировать иммунный ответ по данному описанию означает активировать, стимулировать, позитивно регулировать, ингибировать, блокировать, негативно модулировать или модифицировать иммунный ответ. Аутоиммунные заболевания по данному описанию можно лечить регуляцией иммунного ответа, например, регуляцией функциональных взаимодействий СТЬЛ4- и/или СП28-позитивных клеток с В7-позитивными клетками. Например, способ регуляции иммунного ответа включает контактирование В-позитивных клеток с растворимым СТЬЛ4 по изобретению с образованием комплексов СТЬЛ4/В7, растворимого СТЬЛ4, мешающего реакции эндогенного СТЬЛ4 и/или СЭ28 с указанным В7.

Блокировать или ингибировать рецептор, сигнал или молекулу (соединение) по данному описанию означает противодействовать активации рецептора, сигнала или молекулы, обнаруживаемой с помощью общепризнанного в уровне техники теста. Блокада или ингибирование могут быть частичными или тотальными. Например, блокаду клеточного иммунного ответа можно детектировать, определяя функциональность трансплантата, такую как концентрации сывороточного креатинина после трансплантации почки.

Выражение блокирование В7 взаимодействия по данному описанию означает противодействие связыванию В7 с его лигандами, такими как ΟΌ28 и/или СТЬЛ4, т.е. препятствие взаимодействию Тклеток и В7-позитивных клеток. Примеры агентов, которые блокируют В7 взаимодействия, включают, но без ограничения, молекулы, такие как антитело (или его участок или производное), которые узнают СТЬЛ4, СЭ28 или В7 (например, В7-1, В7-2) и связываются с ними; растворимую форму (или участок или производное) молекул, такую как растворимый СТЬЛ4; пептидный фрагмент или другую малую молекулу, созданную с целью помешать клеточному сигналу с помощью СТЕЛ4/СЭ28/В7опосредованного взаимодействия. В предпочтительном варианте изобретения блокирующий агент представляет собой мутантный СТЬЛ4, такой как Б1О4ЕЛ29У1д (АТСС РТА-2104).

Выражение лечить или лечение нарушения или заболевания по данному описанию означает помочь больному бороться с болезнью или с нарушением медицинскими или другими средствами. Лечение заболевания или состояния может подавить иммунные события, ассоциированные с заболеванием, уменьшить симптомы заболевания или нарушения, понизить тяжесть заболевания или нарушения, изменить ход прогрессирования заболевания или нарушения и/или облегчить или вылечить основное заболевание или нарушение. Например, лечение иммунного нарушения, ассоциированного с трансплантацией ткани, можно осуществлять регуляцией иммунного ответа, например, регуляцией функциональных взаимодействий СТЬА4-и/или СП28-позитивных клеток с В7-позитивными клетками. Или же, лечение иммунного заболевания или нарушения можно проводить, предупреждая или ингибируя начало или прогрессирование заболевания или нарушения с помощью композиций по данному описанию. Например, лечение отторжения почечного трансплантата включает ингибирование отторжения почечного трансплантата, измеряемого скоростью (уровнем) гломерулярной фильтрации (СКФ, СРВ). Например, лечение иммунных нарушений, ассоциированных с трансплантацией ткани, включает профилактику отторжения органа с помощью введения Ь104ЕА29У1д. Кроме того, лечение иммунных нарушений, ассоциированных с трансплантацией ткани, может пролонгировать продолжительность существования хозяина и трансплантированного органа.

Заболевание иммунной системы по данному описанию включает любое заболевание, опосредованное взаимодействиями Т-клеток с В7-позитивными клетками, включая, но без ограничения, аутоиммунные заболевания, иммунопролиферативные заболевания и иммунные нарушения, ассоциированные с трансплантацией органа или ткани.

Выражение иммунные нарушения, ассоциированные с трансплантацией органа или ткани по данному описанию означает любое заболевание, опосредованное взаимодействиями Т-клеток с В7позитивными клетками, включая, но без ограничения, иммунные нарушения, ассоциированные с отторжением трансплантата, нарушения, связанные с трансплантатом, гомологичную болезнь (трансплантат против хозяина (СУНЭ)) (например, такую, которая возникает при пересадке костного мозга или при индукции толерантности), отторжение ткани или трансплантата, включая острое отторжение ткани или трансплантата и хроническое отторжение ткани или трансплантата. Трансплантаты могут быть аллотрансплантатами или ксенотрансплантатами плотного органа, тканевыми или клеточными аллотрансплантатами или ксенотрансплантатами или аллотрансплантатами или ксенотрансплантатами внешних органов, включая, но без ограничения, островковые клетки (также известные как островки), мышцы, ге

- 6 013122 патоциты, нейроны, сердце, печень, почку, легкое, придатки, конечности, нос, ухо или лицо.

Иммунопролиферативные заболевания по данному описанию включают, но без ограничения, Тклеточную лимфому; Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз; тестикулярную ангиоцентрическую Т-клеточную лимфому; и доброкачественный лимфоцитарный ангиит.

Аутоиммунные заболевания по данному описанию включают, но без ограничения, такие заболевания, как волчанка (например, красная волчанка, волчаночный нефрит), псориаз; тиреоидит Хашимото, первичная микседема, болезнь Грейвза, злокачественная анемия, аутоиммунный атрофический гастрит, болезнь Аддисона, диабет (например, инсулиннезависимый сахарный диабет, сахарный диабет типа I, сахарный диабет типа II), синдром Гудпасчера, тяжелая миастения, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника (ΙΒΌ), симпатическая офтальмия, аутоиммунный увеит, рассеянный склероз, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопения, первичный билиарный цирроз, хронический активный гепатит, язвенный колит, синдром Шегрена, ревматические заболевания (например, ревматоидный артрит, псориатический артрит), полимиозиты, склеродермия и смешанная соединительно-тканная болезнь.

Композиции и способы по изобретению

Настоящее изобретение охватывает новый класс иммунодепрессивных средств для трансплантации. Этот класс представляет собой слитый белок, который связывается с молекулами В7 на поверхности антиген-презентирующих клеток (АРС), ингибируя костимуляцию, необходимую для Т-клеточной активации. Растворимый мутантный СТЬА4 по изобретению отличается от имеющихся иммунодепрессантов ограниченной локализацией молекулярной мишени и специфичностью эффекта. Настоящее изобретение предусматривает растворимый мутантный СТЬА4, который распознает и связывает СЭ80 и/или СО86. В некоторых вариантах изобретения растворимые мутантные СТЬА4 обладают более высокой авидностью к ΟΌ80 и/или СЭ86. чем СТЬА41д. Например, Ь104ЕА29¥1д связывается с СЭ80 с авидностью примерно в 2 раза более высокой, а с ΟΌ86 примерно в 4 раза более высокой, чем дикого типа СТЬА41д (в данном описании называемый СТЬА41д). Это более сильное связывание приводит к тому, что Ь104ЕА29У1д более эффективно блокирует иммунные реакции, нежели СТЬА41д.

В одном варианте настоящее изобретение предусматривает способы лечения заболеваний иммунной системы. Способы включают введение терапевтической композиции, содержащей растворимый мутантный СТЬА4 по данному описанию, субъекту в количестве, эффективно ослабляющем по меньшей мере один из симптомов, ассоциированных с заболеванием иммунной системы. Кроме того, растворимый мутантный СТЬА4 по данному описанию может обеспечить продолжительное лечение заболеваний иммунной системы, блокируя взаимодействия Т-клеток с В-позитивными клетками, тем самым блокируется активация/костимуляция Т-клеток с помощью костимулирующих сигналов, таких как связывание В7 с СВ28, приводящее к индукции нечувствительности или толерантности Т-клеток. Болезни (заболевания) иммунной системы включают, но без ограничения, аутоиммунные заболевания, иммунопролиферативные заболевания и иммунные нарушения, ассоциированные с обсуждавшейся выше трансплантацией органов и тканей.

В другом варианте настоящее изобретение предусматривает способы индукции толерантности у субъекта с иммунными нарушениями, ассоциированными с трасплантацией органов и тканей, путем введения терапевтической композиции, содержащей растворимые мутантные СТЬА4, раскрываемые в данном описании.

Растворимые мутантные СТЬА4, раскрываемые в данном описании, проявляют ингибирующие свойства ίη νίνο. В условиях, когда взаимодействия Т-клеток/с В7-позитивными клетками, например взаимодействия Т-клеток/с В клетками, происходят в результате контакта между Т-клетками и В7позитивными клетками, связывание введенного мутантного СТЬА4 для реакции с В7-позитивными клетками, например В-клетками, может препятствовать, т.е. ингибировать взаимодействия Т-клеток/с В7позитивными клетками, что приводит в результате к регуляции иммунного ответа.

Другой вариант изобретения предусматривает способы регуляции иммунного ответа. Модулирование иммунного ответа по типу негативной регуляции (понижение) растворимыми мутантными СТЬА4, раскрываемыми в данном описании, может осуществляться путем ингибирования или блокирования уже имеющегося иммунного ответа или может включать предупреждение индукции иммунного ответа. Растворимые мутантные СТЬА4, раскрываемые в данном описании, могут ингибировать функции активированных Т клеток, например, пролиферацию Т лимфоцитов, секрецию цитокинов и/или продуцирование цитокинов, подавляя Т-клеточный ответ или индуцируя специфическую толерантность в Т-клетках, или делая и то, и другое. Кроме того, растворимые мутантные СТЬА4, раскрываемые в данном описании, вмешиваясь в путь СТЬА4/СО28/П7, могут ингибировать Т-клеточную пролиферацию и/или секрецию цитокинов и, тем самым, вызывают деструкцию тканей и индукцию нечувствительности или инертности Т-клеток.

Мутантные СТЬА4 содержат по меньшей мере один внеклеточный домен СТЬА4, или его участки, которые связывают СЭ80 и/или ΟΌ86. Внеклеточный участок мутантного СТЬА4 содержит аминокислотную последовательность начиная с метионина в положении +1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124 (фиг. 7, 8ЕО ΙΌ N0: 3 и 4; или фиг. 8, 8Е0 ΙΌ N0: 5 и 6). Или же внеклеточный участок

- 7 013122 мутантного СТЬА4 может содержать аминокислотную последовательность начиная с аланина в положении -1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124 (фиг. 7, 8ЕР ΙΌ N0: 3 и 4; или фиг. 8, 8ЕР ΙΌ N0: 5 и 6).

В одном варианте изобретения растворимый мутантный СТЬЛ4 представляет собой слитый белок, содержащий внеклеточный домен СТЬЛ4, имеющий одну или более мутаций в области аминокислотной последовательности начиная с серина в положении +25 и кончая аргинином в положении +33 (825-К.33). Например, аланин в положении +29 дикого типа СТЬЛ4 может быть заменен на тирозин (кодоны: ИЛи, ИЛС). Или же, аланин может быть заменен на лейцин (кодоны: ИИЛ, ииС. СИИ, СИС, СИЛ, СИС), фенилаланин (кодоны: иии, ииС), триптофан (кодон: ИСС) или треонин (кодоны: ЛСИ, АСС, АСА, АСС). Как легко поймут специалисты в данной области техники, урацил (И), нуклеотид последовательности РНК, соответствует тимину (Т), нуклеотиду ДНК последовательности.

В другом варианте изобретения растворимый мутантный СТЬА4 представляет собой слитый белок, содержащий внеклеточный домен СТЬА4, имеющий одну или более мутаций в или около области аминокислотной последовательности начиная с метионина в положении +97 и кончая глицином в положении +107 (М97-С107). Например, лейцин в положении +104 дикого типа СТЬА4 может быть заменен на глутаминовую кислоту (кодоны: САА, САС). Мутантный СТЬА4, имеющий такую замену, в данном описании обозначен как Ы04Е1С (фиг. 8, 8ЕР ΙΌ N0: 5 и 6).

Еще в одном варианте изобретения растворимый мутантный СТЬА4 представляет собой слитый белок, содержащий внеклеточный домен СТЬА4, имеющий одну или более мутаций в областях 825-К33 и М97-С107. Например, в одном варианте изобретения мутантный СТЬА4 имеет тирозин в положении +29 вместо аланина; и глутаминовую кислоту в положении +104 вместо лейцина. Мутантный СТЬА4, имеющий эти замены, в данном описании называется Ь104ЕА29У1д (фиг. 7, 8ЕР ΙΌ N0: 3 и 4). Нуклеотидная молекула, которая кодирует Ь104ЕА29У1д, содержится в ρΌ16 Ь104ЕА29У1д и депонирована 19 июня 2000 г. в Американской коллекции типовых клеток (АТСС), 10801 Ишуегайу Βίνά., Мапаккак, УА 201102209 (АТСС N0. РТА-2104). Вектор ρΌ16 Ь104ЕА29У1д является производным вектора реЭНЛ3 (ГЫУ!ТВ0СЕЖ

Помимо этого, данное изобретение предусматривает мутантный СТЬА4, содержащий внеклеточный домен мутантного СТЬА4, показанного на фиг. 7 (8ЕР ΙΌ N0: 3 и 4) или фиг. 8 (8ЕР ΙΌ N0: 5 и 6), или его участок (участки), и фрагмент, который изменяет растворимость, аффинность и/или валентность мутантного СТЬА4.

В соответствии с практическим применением изобретения фрагмент может представлять собой константную область или его участок, например один или более из СН1 домена, шарнира, СН2 домена или СН3 домена. Для применения ίη νΐνο предпочтительно, чтобы константная область иммуноглобулина не проявляла вредного иммунного ответа у субъекта. Например, в клинических протоколах может быть предпочтительным, что мутантные молекулы включают константные области человеческого или обезьяньего иммуноглобулина или ее часть. Примеры подходящих иммуноглобулиновых доменов включают, но без ограничения ΙβΕγ1 (ΙβΕ гамма1), ΡΕ’γΣ (Ι§0 гамма2), ΙβΕγ3 (Ι§0 гамма3), ΙβΕγ4 (Ι§0 гамма4), Ιβί,’μ ДдС мю), ΙβΕ’α 1 (ΙβΕ альфа1), ΙβΕα2 (ΙμΕ альфа2), ΙβΕδ (ΙμΕ дельта) или ΙβΕε (ΙμΕ ипсилон). Возможны другие изотипы. Кроме того, возможны константные области других иммуноглобулинов (предпочтительно константные области слабо- или неиммуногенных иммуноглобулинов или их участок).

Для клинических протоколов предпочтительно, чтобы иммуноглобулиновый фрагмент не вызывал у субъекта вредного иммунного ответа. Предпочтительным фрагментом является константная область иммуноглобулина или его участок, включая константные области человеческого или обезьяньего иммуноглобулина или их участок. Примером подходящей иммуноглобулиновой области является человеческий Су1, включающий шарнирную, СН2 и СН3 области, который может опосредовать эффекторные функции, такие как связывание с Ес рецепторами, содействующими комплемент-зависимой цитотоксичности (СЭС), или опосредовать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС). Иммуноглобулиновый фрагмент может в себе содержать одну или более мутаций (например, в домене СН2, для снижения эффекторных функций, таких как СЭС или АОСС), причем мутация модулирует способность иммуноглобулина связываться со своим лигандом за счет повышения или понижения способности связывания иммуноглобулина с Ес рецепторами. Например, мутации в иммуноглобулиновом фрагменте могут включать замены любого цистеинового остатка или всех цистеиновых остатков в шарнирной области, например цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменяются на серин (фиг. 9, 8ЕР ΙΌ N0: 8). Иммуноглобулиновый фрагмент может также включать замену пролина в положении +148 на серин, как показано на фиг. 9 (8ЕР ΙΌ N0: 8). Кроме того, мутации в иммуноглобулиновом фрагменте могут включать замену лейцина в положении +144 на фенилаланин, замену лейцина в положении +145 на глутаминовую кислоту или замену глицина в положении +147 на аланин. Примеры иммуноглобулиновых фрагментов включают фрагменты, описанные и раскрываемые в опубликованных патентных заявках США 2002/0114814 А1 и 2004/0151725 А1, патентах США 6444792 и 675033 и в Международной патентной заявке \У0 97/28267.

Другие фрагменты включают полипептидные метки (хвосты). Примеры подходящих меток вклю

- 8 013122 чают, но без ограничения, молекулу р97, молекулу епу др120, молекулу Е7 и молекулу оуа (Όαδίι. В., е! а1. (1994) 1. Сеп. У1го1. 75: 1389-97; 1кеба, Т., е! а1. (1994) Сепе 138: 193-6; Ра1к, К., е! а1. (1993) Се11. 1ттипо1. 150: 447-52; Рнрзака, К. е! а1. (1994) У1го1о§у 204: 789-93). В качестве меток могут применяться другие молекулы (Оегагб, С. е! а1. (1994) №иго8С1епсе 62: 721-739; Вугп, В. е! а1. 1. Уио1. (1989) 63: 43704375; 8тйЬ, Ό. е! а1., (1987) 8с1епсе 238: 1704-1707; Ьакку, Ь., (1996) 8с1епсе 233: 209-212).

Помимо этого, изобретение предусматривает слитые белки растворимого мутантного СТЬЛ41д, преимущественно более реактивные с СГО80 и/или СЭ86 антигеном по сравнению с дикого типа СТЬЛ4. Примером является Ь104ЕЛ29¥1д, показанный на фиг. 7 (8ЕО ГО N0: 3 и 4).

В другом варианте изобретения растворимый мутантный СТЬЛ4 включает соединительный (соединяющий) аминокислотный остаток, локализованный между участком СТЬЛ4 и иммуноглобулиновым участком. Соединяющая аминокислота может быть любой аминокислотой, включая глутамин. Соединяющую аминокислоту можно вводить молекулярными методами или методами химического синтеза, известными в уровне техники.

В другом варианте изобретения растворимый мутантный СТЬЛ4 включает иммуноглобулиновый участок (например, шарнирный СН2 и СН3 домены), в котором любой из цистеиновых остатков или все цистеиновые остатки в шарнирном домене иммуноглобулинового участка заменены на серин, например цистеиновые остатки в положениях +130, +136 или +139 (фиг. 7, 8ЕО ГО N0: 3 и 4; или фиг. 8, 8ЕО ГО N0: 5 и 6). Мутантная молекула может также включать замену пролина в положении +148 на серин, как показано на фиг. 7 (8Е0 ГО N0: 3 и 4) на фиг. 8 (8Е0 ГО N0: 5 и 6).

Растворимый мутантный СТЬЛ4 может включать последовательность сигнального пептида, связанную с ^концом внеклеточного домена СТЬЛ4 участка мутантной молекулы. Сигнальный пептид может иметь любую последовательность, которая допускает секрецию мутантной молекулы, включая сигнальный пептид онкостатина М (Майк, е! а1., (1989) Мо1ес. Се11. Вю1. 9: 2847-2853), или СГО5 (1опе8, N. Н. е! а1., (1986) №11иге 323: 346-349), или сигнальный пептид любого внеклеточного белка.

Молекула мутантного соединения может включать сигнальный пептид онкостатина М, связанный с №концом внеклеточного домена СТЬЛ4, и молекулу человеческого иммуноглобулина (например, шарнир, СН2 и СН3), связанную с С-концом внеклеточного домена СТЬЛ4. Молекула этого слитого белка включает сигнальный пептид онкостатина М, охватывающий аминокислотную последовательность от метионина в положении -26 до аланина в положении -1, участок СТЬЛ4, охватывающий аминокислотную последовательность от метионина в положении +1 до аспарагина в положении +124, включительно, соединительный аминокислотный остаток глутамин в положении +125 и иммуноглобулиновый участок, охватывающий аминокислотную последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 или глицина в положении +356 включительно.

Растворимые мутантные СТЬЛ4 по изобретению можно получать молекулярными методами или методами химического синтеза. Молекулярные методы могут включать следующие стадии: введение подходящей клетки-хозяина с нуклеотидом, который экспрессирует и кодирует растворимый мутантный СТЬЛ4; культивирование клетки-хозяина, введенной таким образом, в условиях, которые способствуют экспрессии мутантных соединений в клетке-хозяине; и выделение экспрессированных мутантных соединений (молекул). Участок сигнального пептида мутантного соединения (белка) содействует экспрессии белковых молекул на клеточной поверхности и их секреции клеткой-хозяином. Транслируемые мутантные молекулы могут претерпевать пост-трансляционную модификацию, включающую отщепление сигнального пептида с образованием зрелого белка, содержащего СТЬЛ4 и иммуноглобулиновый участки. Отщепление может быть после аланина в положении -1, в результате образуется зрелый мутантный белок, содержащий метионин в положении +1 в качестве первой аминокислоты (фиг. 7, 8Е0 ГО N0: 3 и 4; или фиг. 8, 8Е0 ГО N0: 5 и 6). Или же, отщепление может быть после метионина в положении -2, в результате образуется зрелый мутантный белок, содержащий аланин в положении -1 в качестве первой аминокислоты.

Специалисты в данной области техники понимают, что в результате экспрессии Ь104ЕЛ29У1д в клетках млекопитающих могут продуцироваться N и С-варианты, так что продуцированные белки могут иметь аминокислотную последовательность из остатков: (ί) от +1 до +357; (ίί) от -1 до +357; (ίίί) от +1 до +356; или (ίν) от -1 до +356 (фиг. 7, 8Е0 ГО N0: 3 и 4; или фиг. 8, 8Е0 ГО N0: 5 и 6).

Предпочтительный вариант изобретения представляет собой мутантный СТЬЛ4, содержащий внеклеточный домен человеческого СТЬЛ4, связанный с целой молекулой человеческого иммуноглобулина или с ее частью (например, шарниром, СН2 и СН3). Это предпочтительное соединение включает СТЬЛ4 участок растворимой молекулы, охватывающий аминокислотную последовательность от метионина в положении +1 до аспарагиновой кислоты в положении +124, соединительный аминокислотный остаток в положении +125 и иммуноглобулиновый участок, охватывающий последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 или глицина в положении +356. Участок, содержащий внеклеточный домен СТЬЛ4, мутирует таким образом, что аланин в положении +29 заменяется на тирозин, а лейцин в положении +104 заменяется на глутаминовую кислоту. Иммуноглобулиновый участок мутантной молекулы может мутировать таким образом, что цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменяются на серин. Это мутантное соединение в данном описании обозначено как

- 9 013122

Ε104ΕΑ29ΥΙ§ (фиг. 7, ЗЕр ΙΌ N0: 3 и 4).

В другом варианте изобретения Ε104ΕΑ29Υ[§ представляет собой мутантный белок (молекулу), имеющий аминокислотную последовательность от аланина в положении +1 до аспарагиновой кислоты в положении +124, соединительный аминокислотный остаток в положении +125 и иммуноглобулиновый участок, охватывающий последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 (например, от +126 до лизина в положении +357 или глицина в положении +356). Участок, содержащий внеклеточный домен СТЬА4, мутирует таким образом, что аланин в положении +29 заменяется на тирозин, а лейцин в положении +104 заменяется на глутаминовую кислоту. Иммуноглобулиновый участок мутантной молекулы мутирует таким образом, что цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменяются на серин, а пролин в положении +148 заменяется на серин. Это мутантное соединение (молекула) в данном описании обозначено как Ε104ΕΑ29ΥΙ§ (фиг. 7, ЗЕр ΙΌ N0: 3 и 4). После отщепления сигнальной последовательности Ε104ΕΑ29ΥΙ§ может начинаться либо с метионина в положении +1, либо с аланина в положении -1.

Другим мутантным белком (молекулой) по изобретению является растворимый мутантный СТЬА4, содержащий внеклеточный домен человеческого СТЬА4, связанный с молекулой человеческого иммуноглобулина (например, с шарниром, СН2 и СН3). Эта молекула включает участок аминокислотной последовательности, кодирующей СТЬА4, начиная с метионина в положении +1 до аспарагиновой кислоты в положении +124, соединительный аминокислотный остаток глутамин в положении +125 и иммуноглобулиновый участок, охватывающий последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 или глицина в положении +356. Участок, содержащий внеклеточный домен СТЬА4, мутирует таким образом, что лейцин в положении +104 заменяется на глутаминовую кислоту. Шарнирный участок мутантной молекулы мутирован таким образом, так что цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменены на серин, а пролин в положении +148 заменен на серин. Эта мутантная молекула обозначена в данном описании как Ε104ΕΙ§ (фиг. 8, ЗЕр ΙΌ N0: 5 и 6).

Или же, вариант изобретения Ε104ΕΙ§ представляет собой растворимый мутантный СТЬА4, содержащий внеклеточный домен человеческого СТЬА4, связанный с молекулой человеческого иммуноглобулина (например, с шарниром, СН2 и СН3). Эта предпочтительная молекула (предпочтительное соединение) включает участок СТЬА4, охватывающий аминокислотную последовательность, начиная с аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124, соединительный аминокислотный остаток глутамин в положении +125 и иммуноглобулиновый участок, охватывающий последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 или глицина в положении +356. Участок, содержащий внеклеточный домен СТЬА4, мутирует таким образом, что лейцин в положении +104 заменяется на глутаминовую кислоту. Шарнирный участок мутантной молекулы мутирован таким образом, что цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменены на серин, а пролин в положении +148 заменен на серин. Эта мутантная молекула обозначена в данном описании как Ε104ΕΙ§ (фиг. 8, 3ΕΡ ΙΌ N0: 5 и 6).

Помимо этого, изобретение предусматривает растворимый мутантный СТЬА4, имеющий: (а) первую аминокислотную последовательность мембранного гликопротеина, например, СЭ28. СЭ86. СЭ80. СЭ40 и др39, которая блокирует пролиферацию Т клеток, слитую со второй аминокислотной последовательностью; (б) вторую аминокислотную последовательность, являющуюся фрагментом внеклеточного домена мутантного СТЬА4, которая блокирует пролиферацию Т клеток, такую, например, как аминокислотная последовательность от метионина в положении +1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 (фиг. 7, 3Ερ ΙΌ N0: 3 и 4; или фиг. 8, 3Ερ ΙΌ N0: 5 и 6); третью аминокислотную последовательность, которая служит в качестве идентификационной метки или повышает растворимость молекулы. Например, третья аминокислотная последовательность может состоять главным образом из аминокислотных остатков шарнирной, СН2 и СН3 областей неиммуногенного иммуноглобулина. Примеры подходящих иммуноглобулинов включают, но без ограничения, человеческий или обезьяний иммуноглобулин, например, Ι§ϋγ1. Возможны также другие изотипы.

Настоящее изобретение также предусматривает способ лечения иммунного нарушения, ассоциированного с пересадкой трансплантата, путем введения субъекту эффективной дозы мутантного СТЬА4 с внеклеточным доменом СТЬА4, показанным 3Ερ ΙΌ N0: 8, начиная с аланина в положении 26 или метионина в положении 27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении 150, или его участком. Кроме того, во внеклеточном домене или его участке аланин в положении 55 заменен глутаминовой кислотой. Кроме того, схема введения содержит схему ранней фазы лечения, причем схема ранней фазы может продолжаться от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации и включает введение, первоначально более частое, чем раз в месяц.

Кроме того, настоящее изобретение предусматривает способ лечения иммунного нарушения, ассоциированного с пересадкой трансплантата, путем введения субъекту эффективной дозы мутантного СТЬА4 с аминокислотной последовательностью начиная с метионина в положении 27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении 150 по 3Ερ ΙΌ N0: 4, или с аминокислотной последовательностью начиная с аланина в положении 26 и кончая аспарагиновой кислотой в положении 150 по 3Ερ ΙΌ N0: 4. Кроме того, схема введения мутантного СТЬА4 содержит схему ранней фазы лечения, причем схема ранней

- 10 013122 фазы может продолжаться от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации и включает введение, первоначально более частое, чем раз в месяц.

Кроме того, изобретение предусматривает нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности, соответствующие растворимым мутантным СТЬЛ4 по изобретению. В одном варианте изобретения нуклеиновая кислота представляет собой ДНК (например, кДНК) или ее гибрид. Или же, нуклеиновая кислота представляет собой РНК или ее гибрид.

Кроме того, изобретение предусматривает вектор, который содержит нуклеотидные последовательности по изобретению. Также предусматривается система вектор-хозяин. Система вектор-хозяин содержит вектор по изобретению в подходящей клетке-хозяине. Примеры подходящих клеток-хозяев включают, но без ограничения, прокариотические и эукариотические клетки.

Изобретение включает фармацевтические композиции для применения при лечении иммунных нарушений, ассоциированных с пересадкой трансплантата, содержащие фармацевтически эффективные дозы растворимого мутантного СТЬЛ4. В некоторых вариантах изобретения иммунные нарушения, ассоциированные с пересадкой трансплантата, опосредуются взаимодействиями СО28 и/или СТЬЛ4позитивных клеток с СЭ80 и/или СО86-позитивными клетками. Растворимые мутантные СТЬЛ4, предпочтительно, имеют одну или более мутаций во внеклеточном домене СТЬЛ4. Фармацевтическая композиция может включать растворимый мутантный СТЬЛ4 белок и/или нуклеиновую кислоту и/или векторы, кодирующие этот белок. В предпочтительных вариантах изобретения растворимый мутантный СТЬЛ4 имеет последовательность внеклеточного домена СТЬЛ4, показанную на фиг. 7 (8ЕО ΙΌ N0: 3 и 4) или 8 (8Е0 ΙΌ N0: 5 и 6), Ε104ΕΆ29Υ или Ь104Е соответственно. Еще более предпочтительно растворимый мутантный СТЬЛ4 представляет собой Ε104ΕΆ29ΥΙ§, раскрываемый в данном описании. Кроме того, композиция может включать другие терапевтические агенты, включая, но без ограничения, лекарственные токсины, ферменты, антитела или конъюгаты.

Предпочтительно фармацевтические композиции включают также подходящие носители и адъюванты, которые включают любой материал, который, при смешении с белками (молекулами) по изобретению (например, с растворимым мутантным СТЬЛ4, таким как Ε104ΕΆ29Υ или Ь104Е), сохраняют активность молекулы и нереактивны по отношению к иммунной системе субъекта. Примеры подходящих носителей и адъювантов включают, но без ограничения, человеческий сывороточный альбумин; ионообменные вещества; оксид алюминия; лецитин; буферные вещества, такие как фосфаты; глицин; сорбиновую кислоту; сорбат калия; и соли или электролиты, такие как протаминсульфат. Другие примеры включают любые стандартные фармацевтические носители, такие как фосфатно-солевой буферный раствор; вода; эмульсии, такие как эмульсия масла в воде; и различные типы смачивающих веществ. Другие носители могут включать также стерильные растворы; таблетки, включая таблетки, покрытые оболочкой, и капсулы. Обычно такие носители содержат эксципиенты, такие как крахмал, молоко, сахар, некоторые виды глины, желатин, стеариновую кислоту или ее соли, стеарат магния или кальция, тальк, растительные жиры и масла, камеди, гликоли или другие известные эксципиенты. Такие носители могут также включать вкусовые добавки и красители или другие ингредиенты. Композиции, содержащие такие носители, готовят общеизвестными традиционными методами. Такие композиции можно также готовить в различных липидных композициях, таких как, например, липосомы, а также в различных полимерных композициях, таких как полимерные микросферы.

Фармацевтические композиции по изобретению можно вводить субъекту традиционными способами, включая, но без ограничения, внутривенное (в.в.) введение, интраперитонеальное (и.п.) введение, внутримышечное (в.м.) введение, подкожное введение, пероральное введение, введение в виде суппозитория или при топическом контакте, или имплантация устройства пролонгированного действия, такого как миниосмотический насос.

Фармацевтические композиции по изобретению могут быть в виде различных лекарственных форм, которые включают, но без ограничения, жидкие растворы или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, суппозитории, полимерные микрокапсулы или микровезикулы (микропузырьки), липосомы и инъецируемые или вливаемые (инфузия) растворы. Предпочтительная форма зависит от способа введения и терапевтического применения.

Ниже приводится типичная фармацевтическая композиция по изобретению для внутривенного (в. в.) применения.

- 11 013122

Композиция лиофилизированного фармацевтического продукта, содержащего 100 мг Б104ЕА29У1§/ампула

Компонент	Количество/ампула (мг)а
Ε104ΕΑ29ΥΙ§	110а
Сахароза	220
Одноосновный фосфат натрия, моногидрат	15.18
Хлорид натрия	2.55
1Ν гидроксид натрия	Доводят до рН 7.5
1Ν соляная кислота	Доводят до рН 7.5

^а Каждая ампула (флакон) содержит 10% избыток восстановленного раствора с учетом остатка в ампуле, игле и шприце.

Лиофилизированный фармацевтический продукт может быть составлен с водным носителем. Представляющий интерес водный носитель по данному описанию представляет собой водный носитель, являющийся фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксическим для введения человеку) и применимым для приготовления жидкого препарата, после лиофилизации. Как правило, лиофилизированный фармацевтический продукт готовят из расчета 25 мг/мл с 10 мл либо стерильной воды для инъекций, ИЗР (3Α1Ί), либо 0.9% хлорида натрия для инъекций, ИЗР. Далее полученный раствор разводят 0.9% раствором хлорида натрия для инъекций, ИЗР, до концентрации фармацевтического продукта между 1 и 10 мг/мл. Разведенный фармацевтический продукт для инъекций является изотоническим и пригоден для введения с помощью внутривенной инфузии (вливания).

Поверхностно-активное вещество можно добавлять в препарат в количестве, достаточном для уменьшения или предотвращения взаимодействия созданного (составленного) фармацевтического продукта с силиконизированным шприцом.

Наиболее эффективный способ введения и наиболее эффективная схема приема композиций по данному изобретению зависит от тяжести и течения заболевания, состояния здоровья пациента и его реакции на лечение и мнения лечащего врача. Соответственно, дозировки (также известные как дозы) композиций следует титровать для отдельного пациента.

Растворимый мутантный СТЕА4 можно вводить субъекту в количестве, с частотой, достаточной, и через промежуток времени (например, продолжительность и/или многократность), достаточный для того, чтобы блокировать связывание эндогенного В7 (например, СО80 и/или СО86) с их соответствующими лигандами, в организме субъекта. Блокада связывания эндогенного В7/лиганд тем самым ингибирует взаимодействия между В7-позитивными клетками (например, С1)80- и/или СО86-позитивными клетками) и СО28- и/или СТБА 4-позитивными клетками. Доза терапевтического агента зависит от многих факторов, в том числе, но без ограничения, тип пораженных клеток, тип иммунного нарушения, ассоциированного с подвергающейся лечению пересадкой трансплантата, тяжесть заболевания, здоровье субъекта и реакцию субъекта на лечение агентами.

Дозы веществ (молекул) или фармацевтических композиций по изобретению зависят от массы тела, а схемы введения могут определяться целевыми профилями сывороточного минимума (углубления, впадины). Обычно целевой минимальной (впадина) сывороточной концентрации мутантного СТБА4 по изобретению между 3 и около 30 мкг/мл в первые 3-6 месяцев после трансплантации бывает достаточно для сохранения функции аллотрансплантата, предпочтительно, около 5-20 мкг/мл. Обычно целевая минимальная (впадина) сывороточная концентрация мутантного СТБА4 по изобретению в поддерживающей фазе составляет около 0.2-3 мкг/мл, предпочтительно около 0.25-2.5 мкг/мл.

Мутантный СТБА4 по изобретению можно вводить в количестве около 0.1-20 мг/кг веса пациента, как правило, около 1.0-15.0 мг/кг. Например, Б104ЕА29У можно вводить в количестве 10 мг/кг массы пациента в течение ранней фазы, периода высокого риска после трансплантации, и снижается до 5 мг/кг веса пациента в качестве поддерживающей дозы.

Введение белков или фармацевтических композиций по изобретению можно делать через различные промежутки времени, обычно схемы приема (введения) включают раннюю фазу, во время которой дозы выше и частота введения повышается во время наивысшего иммунологического риска, с последующей поддерживающей фазой. Схема ранней фазы может быть от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации и включает введение, первоначально более частое, чем раз в месяц, предпочтительно с частотой раз в день, раз в неделю или каждые две недели в зависимости от иммунологического риска и/или целевой минимальной (впадина) сывороточной концентрации. Поддерживающая фаза начинается, когда кончается ранняя фаза, и включает введение не чаще раза в месяц и длится столько, сколько необходимо, как правило, столько времени, сколько у пациента сохраняется трансплантат. По данному описанию день 1 определяется как день трансплантации или первый день лечения соединениями (молекулами) или фармацевтическими композициями по изобретению.

Дозировка мутантного СТБА4 по изобретению на ранней фазе составляет около 8-12 мг/кг массы тела пациента, предпочтительно около 10 мг/кг. Дозировка мутантного СТБА4 по изобретению в поддерживающей фазе составляет около 3-7 мг/кг массы тела пациента, предпочтительно около 5 мг/кг.

- 12 013122

Ранняя фаза может продолжаться от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации. Схема введения во время ранней фазы может меняться в зависимости от состояния реципиента и/или трансплантата. Например, более интенсивная схема на ранней фазе включает введение повышенной дозы соединений (белков, молекул) или фармацевтических композиций по изобретению при посещении в день 1, день 5, через 2 недели (например, день 13-17), чем каждые две недели в течение первых 3 месяцев (например, посещение на неделе 4, посещение на неделе 6, посещение на неделе 8, посещение на неделе 10 и посещение на неделе 12), с последующими ежемесячными визитами вплоть до 6 месяцев (например, посещение на 4 месяце, посещение на 5 месяце, посещение на 6 месяце). Примером типичной более интенсивной схемы на ранней фазе является введение Ь104ЕЛ29У1§ в количестве 10 мг/кг массы тела пациента в дни 1, 5, 15, 29, 43, 57, 71, 85, 113, 141 и 169. По менее интенсивной схеме, например, вводят соединения (молекулы) или фармацевтические композиции по изобретению в день 1, при посещении на неделе 2, неделе 4, затем ежемесячно до месяца 3 включительно. Примером типичной менее интенсивной схемы на ранней фазе является введение Ы04ЕА29У1д в количестве 10 мг/кг массы тела пациента в дни 1, 15,29, 57 и 85.

Как правило, после ранней фазы следует поддерживающая фаза, во время которой более низкие дозы соединений (белков, молекул) или фармацевтических композиций по изобретению вводят с интервалами один-два месяца столько времени, сколько необходимо, как правило, столько времени, сколько у пациента сохраняется трансплантат. Более интенсивная схема поддерживающей фазы в вышеприведенном примере включает ежемесячное введение Б104ЕА29У1§ в количестве 5 мг/кг массы тела пациента, начиная с посещения на 7 месяце. В то время как менее интенсивной схемы поддерживающей фазы в вышеприведенном примере включает ежемесячное введение Б104ЕА29У1§ в количестве 5 мг/кг массы тела пациента, начиная с посещения на 4 месяце.

Или же, специалист в данной области техники способен модифицировать схему введения в зависимости от степени риска пациента и/или реакции на посттрансплантационную терапию. Например, менее интенсивную схему ранней фазы, описанную выше, можно модифицировать, добавляя к схеме введение на день 5, тем самым увеличивая частоту введения в период наивысшего иммунологического риска.

Выражения четыре недели, месяц, месяцы или ежемесячно по данному описанию относятся к периоду 28±5 дней. Выражение две недели по данному описанию относится к периоду 14±3 дня.

Гибкость схемы введения требуется для того, чтобы упростить планирование введения в течение жизни реципиентов трансплантата, в то же время поддерживая целевой минимальный (впадина) профиль мутантного СТЕА4 по изобретению. Разрешенные интервалы для введения доз можно представить следующим образом: __________________________________

Посещение	Интервал (окно) между посещениями
День 1 и день 5	Через 96 часов ± 6 часов
Неделя 2	Намеченный день ± 2 ДНЯ
Неделя 4- Месяц 6	Намеченный день ± 3 дня
С месяца 7 и далее	Намеченный день ± 5 дней

Намеченный день получают прибавлением необходимого промежутка времени к фактической дате предыдущего посещения. Заданный промежуток времени до посещения на неделе 2 составляет 10 дней. Заданное время составляет 14 дней до посещения, планируемого через две недели после предыдущего посещения, например посещения на неделе 6 после посещения на неделе 4. Заданное время составляет 28 дней до посещения, планируемого через месяц или четыре недели после предыдущего посещения, например посещения в 4 месяце после посещение в 3 месяце. Заданное время составляет 56 дней до посещения, планируемого через два месяца после предыдущего посещения, например посещения в 8 месяце после посещения в 6 месяце. Например, фактическая дата посещения день 15 плюс 14 дней дают намеченный день 29 на неделе 4. На основании вышеуказанного интервала (окна) посещения введение можно осуществлять на 29 день±3 дня. Если введение осуществляют в день 26, этот день становится фактической датой посещения, используемой для расчета следующей намеченной даты.

Реципиенты с низкой степенью риска острого отторжения трансплантата обычно включают тех реципиентов, которые получают трансплантаты от живых родственных доноров и у реципиентов из удачно подобранных пар реципиент/доноры. Реципиенты с высокой степенью риска острого отторжения трансплантата обычно включают тех реципиентов, которые получают трансплантаты от маргинальных доноров или повторные трансплантаты, имеют большой набор реактивных антител или являются афроамериканцами.

Помимо непосредственного риска острого отторжения трансплантата, применение поддерживающих лекарств, таких как ингибиторы кальциневрина и стероиды, в течение длительного времени вызывает токсичность, которая негативно влияет на отдаленный результат и качество жизни пациента. Например, побочные эффекты поддерживающих лекарств включают нефротоксичность (САИ), приводящую в результате к снижению почечной функции и/или утрате трансплантата, и сердечно-сосудистые и метабо

- 13 013122 лические заболевания, такие как гипертензия, гиперлипидемия и диабет, которые вызывают сердечнососудистые заболевания и смерть. Другие побочные эффекты включают гирсутизм, алопецию, гипертрофический гингивит, тремор, нейротоксичность и остеопороз, что приводит к несоблюдению режима и ухудшению качества жизни. Соединения (молекулы) или фармацевтические композиции по изобретению могут применяться для того, чтобы избежать этих последствий, понизить заболеваемость, развитие и/или прогрессирование этих последствий при лечении иммунных нарушений, ассоциированных с пересадкой трансплантата, или для лечения иммунных нарушений, ассоциированных с пересадкой трансплантата, у пациентов, у которых риск этих последствий высок. Соединения (молекулы) или фармацевтические композиции по изобретению можно применять для улучшения почечной функции, такой, которая измеряется СКФ (СЕЯ).

Введение соединений (молекул) или фармацевтических композиций по изобретению можно осуществлять с помощью внутривенного вливания (инфузии) в течение периода от 30 мин до 1 ч. Или же, нужную дозу можно доставлять с помощью разовой подкожной инъекции или многократных подкожных инъекций. Типичным способом введения является тридцатиминутное внутривенное вливание, применяемое на ранней фазе лечения, в то время, когда пациент находится в больнице и/или наносит плановые визиты к профессиональному работнику здравоохранения с целью мониторинга. Подкожная инъекция является типичным способом введения, применяемым в поддерживающей фазе, что позволяет пациенту вернуться к их обычному графику вследствие уменьшения числа посещений профессионального работника здравоохранения для внутривенных вливаний.

Другой вариант изобретения предусматривает способ лечения иммунного нарушения, ассоциированного с пересадкой трансплантата у субъектов, которые получали альтернативную иммунодепрессивную терапию после трансплантации. Субъекты, получающие альтернативную фармацевтическую иммунодепрессивную терапию, могут сменить ее, или переключиться, или обратиться к терапии, включающей соединения (молекулы) или фармацевтические композиции по настоящему изобретению, при этом отменив альтернативное (другое) лекарство. Обычно фармацевтический препарат, который следует исключить, постепенно уменьшают в течение соответствующего периода времени на основании предписанных для конкретного лекарства инструкций, в то же время соединения (молекулы) или фармацевтические композиции по настоящему изобретению вводят чаще чем раз в месяц. Когда субъект полностью отказывается от другого (альтернативного) лекарства, он может вернуться к стандартной поддерживающей схеме с применением соединений (молекул) или фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Например, субъект, получающий лечение по схеме СкА/ММЕ±кортикостероид, может заменить СкА на Ь104ЕА29¥1д по схеме Ь104ЕА29¥1д/ММЕ±кортикостероид. Схема изменения введения может включать постепенное уменьшение дозы СкА в течение двух месяцев и введение 5 мг/кг Ь104ЕА29¥1д каждые две недели в течение этих двух месяцев. Когда СкА исключен, субъект вступает в поддерживающую фазу и продолжает получать 5 мг/кг каждые 4 или 8 недель в продолжение лечения в отсутствие СкА.

В одном варианте изобретения предусматриваются подходящие дозы растворимого мутантного СТБА4 по данному описанию, позволяющие эффективно блокировать взаимодействия В7 с его лигандом и лечить заболевание иммунной системы. Например, доза может определяться массой тела, а схему введения могут диктовать целевые сывороточные минимальные (впадина) профили. Например, эффективные целевые минимальные сывороточные концентрации растворимого мутантного СТЬА4, раскрываемого в данном описании, для лечения заболевания иммунной системы могут составлять около 0.1-30 мкг/мл. Или же, растворимый мутантный СТЬА4, раскрываемый в данном описании, можно вводить в количестве около 0.1-20.0 мг/кг массы тела пациента для лечения заболеваний иммунной системы.

Помимо этого, настоящее изобретение предусматривает способы лечения иммунных нарушений, ассоциированных с пересадкой трансплантата. В конкретных вариантах изобретения иммунные нарушения, ассоциированные с пересадкой трансплантата, опосредуются взаимодействиями СО28- и/или СТЕА4-позитивных клеток с СЭ80/СЭ8б-позитивными клетками. В другом варианте изобретения ингибируются взаимодействия Т клеток. Эти способы включают введение субъекту растворимого мутантного СТБА4 по изобретению для регуляции взаимодействий Т клеток с СЭ80- и/или СЭ8б-позитивными клетками. Примеры иммунных нарушений, ассоциированных с пересадкой трансплантата, обсуждаются выше.

Кроме того, настоящее изобретение предусматривает способ профилактики или ингибирования или предупреждения отторжения трансплантата плотных органов, ткани, клеток и/или наружных органов у субъекта, причем субъект является реципиентом трансплантата плотных органов, ткани, клеток и/или наружных органов. Обычно при трансплантации отторжение трансплантата начинается с распознавания его Т клетками как чужеродного с последующим иммунным ответом, который разрушает трансплантат. Растворимые мутантные СТБА4 по настоящему изобретению, ингибируя пролиферацию Т лимфоцитов и/или секрецию цитокинов, могут привести к пониженной деструкции ткани и к ингибированию антиген-специфической невосприимчивости Т клеток, что может обеспечить стойкое (долговременное) приживление трансплантата.

В исследовании, описанном в примере 3, сравнивают эффективность и безопасность Ь104ЕА29¥1д

- 14 013122 как поддерживающего иммунодепрессанта с циклоспорином А (СкА) в течение 12 месяцев при применении в схеме в качестве компонента в не содержащей €.'N1 (кальциневрин) комбинации по схеме, включающей индукцию базиксимабом (81ти1ес!; ΝοναΠίδ). микофенолята мофетил (ММР; Се11Сер1®; Восйе) и кортикостероиды у реципиентов трансплантата. Цели (задачи) включали оценку частоты возникновения острого отторжения трансплантата (подтвержденного биопсией или предполагаемого) через 6 месяцев или через 1 год; измерение скорости (уровней) гломерулярной (клубочковой) фильтрации (СКФ, ОРК). рассчитываемых по клиренсу йогексола через 1. 6 и 12 месяцев; параметры гипертензии. включая сывороточный холестерин и триглицериды; и общую безопасность. Другие определяемые данные включают смерть пациента или потерю трансплантата через 1 год; тяжесть острого отторжения; заболеваемость сахарным диабетом после трансплантации [который определяется требующей любого лечения гипергликемией в течение >4 недель. или содержанием гемоглобина А1С (НЬА1с)>7%. у пациентов. ранее не считавшихся диабетиками]; СКФ (ОРК). рассчитанные по формулам в исследовании Модификация Диеты при Почечном Заболевании (МЭВЭ. Ьеуеу А.8.. Воксй РР.. йе\\'15 РР.. Огеепе Т.. Водегк N.. Во!й Ό. А тоге ассита1е те!йоб 1о екйта!е д1отеги1аг ййгайоп га!е Ггот кегит сгеаИшпе: а пе\у ртеФсНоп есщаНоп. МобгВсаНоп ой Э1е1 ίη Вепа1 Э1кеаке 8!ибу Огоир. Апп 1п1етп Меб 1999; 130: 461-470). 1еШРГе (В\У. Стеабшпе с1еагапсе: Вебыбе екйта!е. Апп 1п1ег Меб. 1973; 79: 604-605). Сосксгой-6аи1! (Соскстой ЭЛУ.. Сан11 М.Н. РтебШюп оГ стеайшпе с1еагапсе Ггот кегит сгеайшпе. Церйгоп 1976; 16: 31-41). и Цапк1уе11 (Цапк1уе11 В.1.. Огиепе^а1б 8.М.. А11еп В.Э.. Сйартап 1.В. РтебШшд д1отеги1аг Й1!га!юп та!е айет к1бпеу 1тапкр1ап!айоп. Тгапкр1ап!а!юп. 1995; 59(12): 1683-1689); фармакокинетику и иммуногенность. Диагностику и лечение острого отторжения (АК) осуществляют по критериям международной классификации Вапй 97 (Васикеп Ь.С.. 8о1ех К.. СоМп В.В.. е! а1. Тйе ВапГГ 97 \тогктд с1аккй1са!юп ой гепа1 айодтай ра1йо1оду. К1бпеу 1п! 1999; 55(2): 713-23). Проводят рок! йос (вторичный) анализ частоты встречаемости хронической нефропатии аллотрансплантата (САЦ).

Это 12-месячное исследование показало. что поддерживающая терапия на основе Ы04ЕА29У1д обеспечивает эквивалентную СкА эффективность предупреждения АВ и аналогичную СкА жизнеспособность пациента и трансплантата. Кроме того. Ь104ЕА29У1д продемонстрировал значительное улучшение почечной функции и снижение САЦ по сравнению с поддерживающей иммунодепрессией (иммуносупрессией) на основе СкА. Ь104ЕА29¥1д был безопасен. хорошо переносился и не ассоциировался с типичной обусловленной СШ токсичностью.

Оказалось. что повышенная почечная функция в течение первого года после трансплантации согласуется с более благоприятными отдаленными результатами (Наййатап 8.. МсВпбе М.А.. Сйепкй У.8.. То11епк С.В.. Вгекпайап В.А.. 1ойпкоп С.Р. Рок!-!гапкр1ап! гепа1 Гипсйоп ш !йе йтк! уеаг ртебШк 1опд-!егт к1бпеу !гапкр1ап! кшУ1уа1. К1бпеу 1п! 2002; 62(1): 311-8). тогда как продолжительное применение СШ ограничивается их нефротоксичностью (Эапоуйсй О.М. 1штипокирргекк1уе тебюа!юпк Гог гепа1 !гапкр1ап!а!юп: а ти1йр1е сйоюе диекйоп. К1бпеу 1п! 2001; 59(1): 388-402). которая приводит к пониженной функции трансплантата и к почечной недостаточности со всеми вытекающими проблемами. Таким образом. возможно. наиболее значительными результатами. наблюдаемыми при лечении Ь104ЕА29У1д. являются превосходные СКФ (ОРВ) в сочетании с гистологией почки через 12 месяцев. показывающей замедление развития и/или прогрессирования САЦ по сравнению с СкА. Это был неожиданный результат. и это был первый случай. когда открытие подобного рода было проиллюстрировано в Фазе II рандомизированного испытания иммунодепрессивного лекарственного средства. Так как сохранение массы нефронов с помощью предупреждения иммунологических. сердечно-сосудистых и/или метаболических инсультов способствует благоприятному действию на выживаемость (жизнеспособность) как пациента. так и трансплантата. возможно. что Ь104ЕА29У1д может ассоциироваться с более благоприятными отдаленными результатами.

Эти результаты особенно важны при увеличивающемся использовании органов в случае доноров и реципиентов с расширенными критериями. так как они особенно чувствительны к СШ-связанной токсичности. Снижение частоты встречаемости СУ и метаболических событий у пациентов. перенесших трансплантацию почки. также является важнейшим для улучшения отдаленных (долговременных) результатов.

Соединения (молекулы) или фармацевтические композиции по изобретению можно применять для лечения иммунных нарушений. ассоциированных с пересадкой трансплантата у субъектов. которые являются реципиентами с расширенными критериями и/или которые получают трансплантаты от доноров. отвечающих расширенным критериям. Эти критерии. частично основанные на критериях Службы обеспечения донорскими органами (υΝΟ8). могут включать один или более следующих показателей: возраст моложе 10 лет или старше или равен 60 годам; донор после остановки сердца; ожидаемое холодноишемическое время (время хранения донорского органа до трансплантации) более или равно 24 ч; субъекты. которым делают трансплантацию в первый раз. с текущим РВА>50%. или. в случае ретрансплантации. с РВА>30%; субъекты. у которых произошла утрата прежнего трансплантата вследствие острого отторжения в течение первых 6 месяцев после трансплантации; субъекты с позитивной Т-клеточной лимфоцитотоксической перекрестной пробой (кросс-матч тест) при использовании лимфоцитов донора и

- 15 013122 сыворотки реципиента; субъекты с ВИЧ инфекцией; субъекты с активной формой туберкулеза, требующего лечения в течение предыдущих 3 лет; или другие критерии Службы обеспечения донорскими органами (υΝΟ8). Пример возможных расширенных критериев для донора и/или донорской почки включает по меньшей мере 1 из нижеприведенных критериев для донорских органов.

а) Возраст донора > 60 лет ОВ.

б) Возраст донора 50-59 лет и 1 из следующих обстоятельств: (ί) инсульт (СУА) + гипертензия + 8Сг (креатинин сыворотки крови) > 1.5 мг/дл ОВ; (и) СУА + гипертензия ОВ; (ίίί) СУА + 8Сг > 1.5 мг/дл ОВ; (ίν) гипертензия + 8Сг > 1.5 мг/дл ОВ.э (в) С1Т > 24 ч, возраст донора > 10 лет ОВ.

г) Донор с остановкой сердца (донор, у которого нет пульса).

Настоящее изобретение предусматривает также способы ингибирования болезни трансплантатапротив-хозяина у субъекта. Этот способ заключается во введении субъекту растворимого мутантного СТЪА4 по изобретению, самостоятельно или в комбинации, одновременно или последовательно, с другими дополнительными лигандами, реактивными в отношении 1Ъ-2, 1Ъ-2В, 1Ъ-4 или γ-интерферона. Например, растворимый мутантный СТЪА4 по изобретению можно вводить реципиенту в трансплантат костного мозга для ингибирования аллореактивности донорских Т клеток. Или же, донорские Т клетки в трансплантате костного мозга можно сделать толерантными к аллоантигенам реципиента ех νίνο перед трансплантацией.

Растворимый мутантный СТЪА4 по изобретению, например Ъ104ЕА29У, можно вводить как единичный активный ингредиент или в комбинации, одновременно или последовательно, с одним или более других лекарств в схемах иммуномодулирующей терапии, иммуносупрессорами (иммунодепрессантами) и/или другими противовоспалительными агентами, например, для лечения, предупреждения или ингибирования или профилактики острого или хронического отторжения аллотрансплантата или ксенотрансплантата или для индукции толерантности. Например, его можно использовать в комбинации с ингибитором кальциневрина (например, циклоспорином А или РК506); макролидом иммунодепрессивного действия (например, такролимусом, рапамицином, сиролимусом) или его производным (например, 40-О-(2гидрокси)этилрапамицином, сиролимусом, центиканом); агентом хоуминга лимфоцитов (например, РТУ720) или его аналогом (РК778, .Так-3), кортикостероидами; циклофосфамидом; азатиопреном; метотрексатом; лефлуномидом или его аналогом; мизорибином; микофенольной кислотой; микофенолята мофетилом; 15-дезоксиспергуалином или его аналогом; иммуносупрессорными моноклональными антителами (например, базиликсимабом, даклизумабом), лигандами, моноклональными антителами или фрагментами антител к рецепторам лейкоцитов (например, МНС, СЭ2, СЭ3, СЭ4, СЭ 11а/СЭ18, СЭ7, СЭ25, СЭ27, В7, СЭ40, СЭ45, СЭ58, СЭ 137, 1СО8, СЭ150 (8ЪАМ), ОХ40, 4-1ВВ или их лиганды); или другими иммуномодулирующими соединениями (например, СТЪА4/СП28-1д), или другими ингибиторами молекул адгезии (например, тАЬ) или низкомолекулярными ингибиторами, включая антагонисты ЪРА-1, антагонисты селектина и антагонисты УЪА-4. Соединение особенно применимо в комбинации с соединением, которое является помехой СЭ40 и его лиганду (например, антитела к СЭ40 или к СЭ40-Ь), таким как СЫ220 (патент США 6051228), например, в вышеописанных показаниях, например, при индукции толерантности.

Если растворимый мутантный СТЬА4 по изобретению вводится одновременно или последовательно в сочетании с другим иммуносупрессором (иммунодепрессантом)/иммуномодулятором, например, по данному описанию, дозы вводимого совместно иммунодепрессанта или иммуномодулятора, естественно, меняются в зависимости от типа используемого совместно лекарства (солекарства), например, от того, является ли оно стероидом или циклоспорином, от конкретного используемого лекарства, от состояния, которое нужно лечить и т. д.

В соответствии с вышеописанным, настоящее изобретение предусматривает, помимо этого, терапевтические комбинации, например, набор для применения в любом способе по определению выше, содержащий Ъ104ЕА29У1д в свободном виде или в виде фармацевтически приемлемой соли, для одновременного или последовательного применения, по меньшей мере, с одной фармацевтической композицией, содержащей иммунодепрессант, иммуномодулятор или противовоспалительное лекарство. Набор может содержать инструкции для применения.

В соответствии с вышеописанным, настоящее изобретение предусматривает, еще в одном аспекте, способы по определению выше, содержащие введение, например, одновременно или последовательно, терапевтически эффективной дозы мутантного растворимого СТЬА4 по изобретению с иммунодепрессантами (иммуносупрессорами). Иммунодепрессанты включают растворимый др39 (также известный как СЭ40 лиганд (СЭ40Ъ), СЭ 154, Т-ВАМ, ТВАР), растворимый СЭ29, растворимый СЭ40, растворимый СЭ80 (например, АТСС 68627), растворимый СЭ86, растворимый СЭ28 (например, 68628), растворимый СЭ56, растворимый Тйу-1, растворимый СЭ3, растворимый ТСВ, растворимый УЪА-4, растворимый УСАМ-1, растворимый ЪЕСАМ-1, растворимый ЕЪАМ-1, растворимый СЭ44, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с др39 (например, АТСС НВ-10916, АТСС НВ-12055 или АТСС НВ12056), лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с СЭ40 (например, АТСС НВ-9110), ли

- 16 013122 ганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с В7 (например, АТСС НВ-253, АТСС СВЬ-2223, АТСС СВЬ-2226, АТСС НВ-301, АТСС НВ-11341, и т.д.), 1 лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с ΟΌ28 (например, АТСС НВ-11944 или тАЬ 9.3, описанное Майш с1 а1. (1. Скп. 1ттип. 4(1): 18-22, 1980), лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с ЬРА-1 (например, АТСС НВ-9579 и АТСС Т1В-213), лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с ЬРА-2, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с ЕЬ-2 или 1Ь-2В, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с 1Ь-12, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с ΙΡΝ-гамма, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с 0Ό2. лиганды антител, антитела или фрагменты антитела, реактивные с СО48, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с любыми 1САМ (например, 1САМ-1 (АТСС СВЬ-2252), 1САМ-2 и 1САМ-3), лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с СТЬА4 (е.д., АТСС НВ-304), лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с ТНу-1, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с СЭ56, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с СЭ3, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с СО29, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с ТСВ, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с УЪА-4, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с УСАМ-1, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с ЬЕСАМ-1, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с ЕЬАМ-1, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с СО44. В некоторых вариантах изобретения предпочтительны моноклональные антитела. В других вариантах изобретения предпочтительными являются фрагменты антитела. Фрагменты антитела включают, но без ограничения, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂, Ρν, ясРу и доменные антитела (бАЬ, вариабельные домены тяжелых цепей), включая, но без ограничения, эти фрагменты, описанные в Международной заявке XV 0 2006/030220. Как легко поймут специалисты в данной области техники, комбинация может включать растворимый мутантный СТЬА4 по изобретению и еще один иммуносупрессор, растворимый мутантный СТЬА4 по изобретению и два других иммуносупрессора, растворимый мутантный СТЬА4 по изобретению и еще три иммуносупрессора и т.д. Можно определить оптимальные комбинации и дозы и оптимизировать их общеизвестными в уровне техники методами.

Особенно применимой комбинацией является комбинация Е104ЕА29У1§ или его фармацевтической композиции с соединением, которое мешает 1Ь-2 и его лиганду, конкретно, антагонистом, нацеленным на 1Ь-2В(альфа), который селективно экспрессируется на поверхности активированных Т-лимфоцитов. Соединение, которое связывается с 1Ь-2В(альфа), конкурентно ингибирует опосредованную 1Ь-2В активацию лимфоцитов, которая представляет собой важнейший каскад реакций в клеточном иммунном ответе, сопровождающий отторжение аллотрансплантата.

Ниже представлены некоторые конкретные комбинации: Ь104ЕА29У1д и СЭ80 моноклональные антитела (тАЬя); Ь104ЕА29У1§ и (Ό86 тАЬя; Ь104ЕА29У1§, (Ό80 тАЬя и С1)86 тАЬя; Ь104ЕА29У1§ и др39 тАЬя; Ь104ЕА29У1§ и С1)40 тАЬя; Ь104ЕА29У1§ и С1)28 тАЬя; Ь104ЕА29У1§, С1)80 и С1)86 тАЬя и др39 тАЬя; Ь104ЕА29У1д, СЭ80 и СЭ86 тАЬя и СЭ40 тАЬя; и Ь104ЕА29У1д, анти-ЬРА1 тАЬ и антидр39 тАЬ. Конкретным примером др39 тАЬ является МВ1. Специалисты в данной области техники сразу оценят и представят другие комбинации.

В соответствии с вышеизложенным еще в одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способы по определению выше, включающие совместное введение, например одновременно или последовательно, терапевтически эффективной дозы растворимого мутантного СТЬА4 по изобретению с дополнительным агентом и/или кортикостероидом. Целью является заменить токсические ингибиторы кальциневрина мутантным СТЬА4 по изобретению. Однако мутантный СТЬА4 по изобретению также может вводиться, одновременно или последовательно, совместно с ϋΝΙ, такими как циклоспорин (№ога1®, Сандиммун® от ΝονηΠίδ) и такролимус (РК506, Програф® от Риряата).

Примеры дополнительных агентов включают, но без ограничения, ингибиторы инозинмонофосфат-дегидрогеназы (МРОН), например микофенолята мофетил (ММР, Селлсепт от Воске ЬаЬога1опея) и микофенольную кислоту (Мифортик® от ΝονηΠίδ); рапамицин (сиролимус, Рапамун® от Χν\Όΐ1ι/Λ\ΌΓ5ΐ); азатиоприн (Азарсан® от 8акх, Имуран, дженерик); агент хоуминга лимфоцитов, например РТУ720 (от Nονа^ί^5); РК778 (от Риряа^а); 1ак-3 (от РПхег); и Сертикан® (эверолимус от №\^гагЦ5).

Примеры кортикостероидов включают, но без ограничения, бетаметазон, будезонид, кортизол, кортизон, дексаметазон, гидрокристин, метилперднизолон, преднизолон, преднизон и триамцинолон.

Типичные комбинации для совместного введения включают, но без ограничения, ^104ΕА29ΥIд и по меньшей мере один дополнительный агент, выбранный из перечисленной выше группы; ^104ΕА29ΥIд и по меньшей мере один кортикостероид, выбранный из перечисленной выше группы; ^104ΕА29ΥIд, ММР (Селлсепт от Воске) и кортикостероид, выбранный из перечисленной выше группы; ^104ΕА29ΥIд, рапамицин (сиролимус, Рапамун® от Vуеΐк/Ауе^5ΐ) в присутствии или в отсутствие кортикостероида, выбранного из перечисленной выше группы.

Описанные выше комбинации для совместного введения можно применять с индукционным агентом, таким как иммуносупрессивные (иммуносупрессорные) моноклональные антитела, например базиликсимаб (Симулект® от ШтагНя), мурономаб (Ортоклон ОКТ3® от 0г1ко Вю1еск), ритуксимаб (Ритук

- 17 013122 сан® от Оепеп!есЬ) и даклизумаб (Зенапакс® от КосЬе БаЬз); или антитимоцит-глобулин (Тимоглобулин от 8апд81а1). Например, подходящие комбинации включают, но без ограничения, базиликсимаб (Симулект® от ΝονηΠίδ) с Ε104ΕΑ29ΥΙ§, ММР (Селлсепт от КосЬе) и преднизолон; или даклизумаб (Зенапакс® от КосЬе), Ε104ΕΑ29ΥΙ§ и рапамицин (сиролимус, Рапамун® от ХУуеФ/ЛуегЧ).

Обычно на стандартные дозы и схему введения совместно вводимых лекарств, описанных выше, не влияет добавление к схеме лечения мутантного ΟΙΕΑ4 по изобретению. Однако специалист в данной области техники может назначать более низкие дозы совместно вводимых лекарств, например, дополнительных агентов и/или кортикостероидов, за счет включения в схему лечения менее токсичного мутантного ΟΓΕΑ4 по изобретению.

При назначении каждого совместно вводимого лекарства можно руководствоваться сведениями во вкладыше в упаковку. Кортикостероид можно вводить совместно с соединением или с композицией по изобретению. Например, пациентов можно лечить, давая кортикостероид каждый день. Один метод поддерживающей стероидной терапии и постепенного уменьшения дозы стероида может включать 500 мг в.в. метилпреднизолона в операционной (0К) перед операцией, 250 мг в.в. метилпреднизолона на 2 день, а затем преднизон (или преднизолон) 100 мг перорально на 3 день, с последующим постепенным снижением дозы преднизона (или преднизолона) до 20-30 мг/день к концу недели 2, с последующим постепенным снижением дозы преднизона (или преднизолона), доводя ее через 6 месяцев не ниже, чем до 2.5 мг/день. Пациентам можно давать дозу, по меньшей мере, 2.5 мг/день в течение их курса лечения.

Дополнительные совместно вводимые лекарства могут включать микофенолята мофетил (ММР). Обычно ММР вводят в виде 2 раздельных доз по соответствующей схеме в зависимости от времени дня и приема пищи. Пример схемы введения ММР включает 2 г ежедневно. Первую дозу можно вводить перед операцией. Последующие дозы можно вводить п.о., как только пациент сможет переносить пероральный прием лекарства. Дозу и схему можно корректировать с учетом лабораторных данных (например, пониженное число лейкоцитов (\УВС)) и переносимости пациентом. Во вкладыше в упаковку предоставлена полная информация о предписаниях (назначении).

Другое совместно вводимое лекарство может включать базиликсимаб. Восстановленный базиликсимаб (20 мг в 5 мл) можно разводить до объема 50 мл нормальным физиологическим солевым раствором или 5% декстрозой и вводить в виде в.в. инфузии в течение 20-30 мин. Первую дозу 20 мг можно вводить в 1 день (день трансплантации). Вторую дозу 20 мг можно давать на 5 день. Во вкладыше в упаковку предоставлена полная информация о назначении.

Помимо этого, предусматриваются терапевтические комбинации, например, набор для применения в любом способе по определению выше, содержащий Ε104ΕΑ29ΥΙ§, в свободном виде или в виде фармацевтически приемлемой соли, для одновременного или последовательного применения, по меньшей мере, с одной фармацевтической композицией, содержащей дополнительный агент и кортикостероиды. Набор может содержать инструкции для его применения.

На этикетке и/или в инструкциях может быть указано, что фармацевтическую композицию можно использовать самостоятельно (индивидуально) или в комбинации, одновременно или последовательно, со вторым агентом для лечения выбранного состояния, например, заболеваний иммунной системы, аутоиммунных заболеваний, иммунопролиферативных заболеваний, иммунных нарушений, ассоциированных с пересадкой трансплантата, описанных выше.

На этикетке могут быть указаны подходящие дозы для соединений, раскрываемых в данном описании. Например, на этикетке может быть указано, что эффективные дозы соединения для блокады взаимодействий В7 с его лигандами и/или для лечения заболевания иммунной системы можно определять с учетом массы тела, а схемы введения могут диктоваться целевыми минимальными сывороточными профилями. Например, на этикетке может быть указано, что эффективные целевые минимальные сывороточные концентрации мутантного ΟΓΕΑ4, раскрываемого в данном описании, для лечения заболевания иммунной системы могут составлять около 0.2-30 мкг/мл. Или же, на этикетке может быть указано, что для лечения заболеваний иммунной системы мутантный ΟΓΕΑ4, раскрываемый в данном описании, можно вводить в количестве около 0.1-20.0 мг/кг массы тела пациента.

Способы получения соединений (молекул) по изобретению

Экспрессия мутантного ΟΕΒΑ4 может быть в прокариотических клетках. Прокариоты чаще всего бывают представлены различными штаммами бактерий. Бактерии могут быть грамположительными или грамотрицательными. Как правило, предпочтительны грамотрицательные бактерии, такие как Е.сой. Можно также использоваться другие микробные штаммы.

Последовательности, кодирующие мутантный 0ΊΕΑ4. можно вводить в вектор, созданный для экспрессии чужеродных последовательностей в прокариотических клетках, таких как Е.сой. Эти векторы могут включать обычные прокариотические контрольные последовательности, которые по данному описанию включают промоторы для инициации транскрипции, необязательно с оператором, наряду с последовательностями сайта связывания рибосом, включают такие обычно применяемые промоторы, как промоторная система бета-лактамазы (пенициллиназы) и лактозы (1ас) (СЬапд, е! а1., (1977) №1иге 198: 1056), промоторная система триптофана (Ооеббе1, е! а1., (1980) ШсШс Αάάδ Кез. 8: 4057) и Р_ъ промотор фага

- 18 013122 лямбда, и сайт связывания рибосом Ν-гена (8Ыта!аке, е! а1., (1981) Иа!иге 292: 128).

Такие экспрессирующие векторы включают также ориджины репликации и селективные маркеры, такие как ген бета-лактамазы или неомицин фосфотрансферазы, придающие устойчивость к антибиотикам, так что векторы могут реплицироваться в бактериях, и можно выбирать клетки, несущие плазмиды, выращенные в присутствии антибиотиков, таких как ампициллин или канамицин.

Плазмиду экспрессии можно вводить в прокариотические клетки различными стандартными методами, включая, но без ограничения, СаС1₂-шок (СоЬеп, (1972) Ргос. Ν;·ι11. Асаб. δα. И8А 69: 2110, и ЗатЬгоок е! а1. (ебк.), Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2пб ЕбШоп, Со1б 8рпид НагЬог Ргекк, (1989)) и электропорацию.

В соответствии с практикой применения изобретения эукариотические клетки также являются подходящими клетками-хозяевами. Примеры эукариотических клеток включают любую животную клетку, первичную или иммортализованную, клетки дрожжей (например, ЗассЬаготусек сегеуЩае, 8с1ихокассЬаготусек ротЬе и РюЫа рак!опк), и растительные клетки. Миеломные, СО8 и СНО клетки являются примерами животных клеток, которые могут использоваться в качестве хозяев. Конкретные СНО клетки включают, но без ограничения, ЭС44 (СЬакш, е! а1., 1986 8от. Се11. Мо1ес. Сепе!. 12: 555-556; Ко1кекаг 1997 ВюсЬет1к1гу 36: 10901-10909), СНО-К1 (АТСС Ио. ССЬ-61), СНО-К1 Те!-Оп линию клеток (С1оп!есЬ), СНО, обозначенные ЕСАСС 85050302 (САМЕ, ЗайкЬшу, У11!кЫге, ИК), СНО клон 13 (СЕМС, Сепоуа, 1Т), СНО с1опе В (СЕМС, Сепоуа, 1Т), СНО-К1/8Е, обозначенные ЕСАСС 93061607 (САМЕ, 8а11кЬшу, У11!кЫге, ИК) и ЕЕ-СНОКЕ обозначенные ЕСАСС 92052129 (САМЕ, ЗаЪкЬигу, Уб!кЫге, ИК). Примеры растительных клеток включают клетки табака (целое растение, клеточную культуру и каллюс), маиса, сои и риса. Также применимы семена маиса, сои и риса.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие мутантный СТЬА4, можно также вводить в вектор, созданный с целью экспрессии чужеродных последовательностей в эукариотическом хозяине. Регуляторные элементы вектора могут меняться в зависимости от конкретного эукариотического хозяина.

Распространенные эукариотические контрольные последовательности для применения в экспрессирующих векторах включают промоторы и контрольные последовательности, совместимые с клетками млекопитающих, такие, например, как СМУ промотор (СЭМ8 вектор) и вирус саркомы птиц (А8У) (пЬИ вектор). Другие применяемые традиционно промоторы включают ранний и поздний промоторы вируса зеленой мартышки 40 (8У40) (Е1егк, е! а1., (1973) Иа!иге 273: 113), или можно применять также другие вирусные промоторы, такие как вирусные промоторы полиомы, Аденовируса 2 и вируса бычьей папилломы 1МТ11 (Капп, е! а1., (1982) Иа!иге 299: 797-802).

Векторы для экспрессии мутантного СТЬА4 в эукариотах могут также нести последовательности, называемые энхансерными областями. Они важны для оптимизации экспрессии гена и находятся либо в 3'-5', либо в 5'-3'направлении от промоторной области.

Примеры векторов экспрессии для эукариотических клеток-хозяев включают, но без ограничения, векторы для клеток-хозяев млекопитающих (например, ВРУ-1, рНуд, рЕ8У, р8У2, рТК2 (Машабк); р1ЕЕ8 (С1оп!есЬ); рЕс/СМУ2, рЕс/ЕЗУ, рЗЕУ1 (ЫГе ТесЬпо1од1ек); рУРакс векторы, рСМУ векторы, рЗС5 векторы (81га!адепе)), ретровирусные векторы (например, рЕВ векторы (81га1адепе)), рСЭИА-3 (1пуйгодеп) или его модифицированные формы, аденовирусные векторы; аденоассоциированные вирусные векторы, бакуловирусные векторы, дрожжевые векторы (например, рЕЗС векторы (81га1адепе)).

Нуклеотидные последовательности, кодирующие мутантный СТЬА4, можно интегрировать в геном эукариотической клетки-хозяина и реплицировать по мере репликации генома хозяина. Или же, вектор, несущий молекулы мутантного СТЬА4, может содержать ориджины репликации, способствующие внехромосомной репликации.

Для экспрессии нуклеотидных последовательностей в ЗассЬаготусек сегеу1к1ае можно использовать ориджин репликации из эндогенной дрожжевой плазмиды, кольцо 2 мк (ВгоасЬ, (1983) Ме!Ь. Епх. 101: 307). Или же можно использовать последовательности из генома дрожжей, способные промотировать автономную репликацию (например, с 8!шсйсотЬ е! а1., (1979) Иа!иге 282: 39); ТксЬетрег е! а1., (1980) Сепе 10: 157; и С1агке е! а1., (1983) Ме!Ь. Еп/. 101: 300).

Последовательности контроля транскрипции для дрожжевых векторов включают промоторы для синтеза гликолитических ферментов (Некк е! а1., (1968) 1. Абу. Епхуше Кед. 7: 149; Но11апб е! а1., (1978) Вюсйет1к1гу 17: 4900). Другие известные в уровне техники промоторы включают СМУ промотор, предусматриваемый в СЭМ8 векторе (Тоуата апб Окауата, (1990) ЕЕВЗ 268: 217-221); промотор для 3фосфоглицерат киназы (Нйхешап е! а1., (1980) 1. Вю1. СЬет. 255: 2073), и промоторы для других гликолитических ферментов.

Другие промоторы являются индуцибельными, потому что они могут регулироваться внешними стимулами или питательной средой клеток. Эти индуцибельные промоторы включают промоторы генов белков теплового шока, алкогольдегидрогеназы-2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, ферментов, ассоциированных с катаболизмом азота, и ферментов, отвечающих за утилизацию мальтозы и галактозы.

Регуляторные последовательности можно также поместить на 3' конце кодирующих последовательностей. Эти последовательности могут стабилизировать матричную РНК. Такие терминаторы находятся в 3' нетранслируемой области после кодирующих последовательностей в некоторых генах дрож

- 19 013122 жей и млекопитающих.

Типичные векторы для растений и растительных клеток включают, но без ограничения, Т₁плазмиды агробактерий, вирус мозаики цветной капусты (СаМУ) и вирус золотой мозаики томатов (ТОМУ).

Общие аспекты трансформации системы клеток-хозяев млекопитающего описаны Ахе1 (патент США 4399216, выданном 16 августа 1983 г.). Клетки млекопитающих можно трансформировать разными методами, включая, но без ограничения, трансфекцию в присутствии фосфата кальция, микроинъекцию, электропорацию или трансдукцию вирусными векторами.

Методы введения последовательностей чужеродной ДНК в геном растения или дрожжей включают (1) механические методы, такие как микроинъекция ДНК в одиночные клетки или протопласты, встряхивание клеток со стеклянными бусами (шариками) в присутствии ДНК или стрельба покрытыми ДНК свинцовыми или золотыми сферами в клетки или протопласты; (2) введение ДНК за счет того, что мембраны становятся проницаемыми для макромолекул после обработки полиэтиленкликолем, или выдерживание в высоковольтном пульсовом режиме (электропорация); или (3) применение липосом (содержащих кДНК), которые сливаются с клеточными мембранами.

Экспрессию мутантного СТЬА4 можно детектировать известными в уровне техники методами. Например, мутантные молекулы можно детектировать окрашиванием 8П8-РАОЕ гелей Кумасси голубым и иммуноблоттингом с применением антител, которые связывают СТЬА4. Извлечение белка можно осуществлять стандартными методами очистки белков, например, аффинной хроматографией или ионообменной хроматографией, получая практически чистый продукт (К. 8соре§ в Рго1ет Рипйсайоп, ΡΓίηοίр1е§ апё Ргасйсе, ТЫгё Εάίΐίοη, §рппдег-Уег1ад (1994)).

В опубликованных патентных заявках 2005/0019859, 2005/0084933 и в Международной заявке XVО 04/058944, которые вводятся в данное описание в качестве ссылки, предлагаются способы получения белков по изобретению, в частности, рекомбинантных гликопротеиновых продуктов, при использовании культур клеток животных или млекопитающих.

Кроме того, изобретение предусматривает растворимые мутантные СТЬА4, полученные по данному описанию.

Мутагенез СТБА41С с помощью мутаций в кодонах

В одном варианте изобретения сайт-направленный мутагенез и новая методика скрининга были использованы для идентификации нескольких мутаций во внеклеточном домене СТЬА4, которые повышают авидность связывания с 0Ό86. В этом варианте изобретения мутации осуществляют в областях внеклеточного домена СТЬА4 от серина 25 до аргинина 33, С' цепь (аланин 49 и треонин 51), Г цепь (лизин 93, глутаминовая кислота 95 и лейцин 96) и область от метионина 97 до тирозина 102 включительно, от тирозина 103 до глицина 107, и О цепь в положениях глутамин 111, тирозин 113 и изолейцин 115. Эти сайты выбирают на основании изучения химерных СО28/СТЬА4 белков (Реасй е1 а1., ί. Ехр. Меё., 1994, 180: 2049-2058) и рассмотрения (прогнозирования) на моделях, какие боковые цепи аминокислот будут экспонироваться с растворителем, и отсутствия идентичности или гомологии аминокислотных остатков в некоторых положениях ΟΌ28 и СТЬА4. Также любой остаток, находящийся в непосредственной пространственной близости (5-20 А) к идентифицированным остаткам, рассматривается как часть настоящего изобретения.

Для синтеза и скрининга растворимого мутантного СТЬА4 с измененной аффинностью к 0Ό80 и/или 0Ό86 был применен двухстадийный метод. Эксперименты включали, во-первых, создание библиотеки мутаций в конкретном кодоне внеклеточного участка СТЬА4, а затем их скрининг с помощью В1Асоге для идентификации мутантов с измененной реактивностью к 0Ό80 и 0Ό86. Аналитическая система В1Асоге (Рйагташа, Р18са1атау, N.1.) использует детекторную систему поверхностного плазмонного резонанса, которая в основном включает ковалентное связывание либо СЭ801д, либо 0Ό86Ι§ с покрытым декстраном сенсорным чипом, расположенным в детекторе. Тестируемое соединение (молекула) можно затем ввести (инжекция) в камеру, содержащую сенсорный чип, и количество комплементарного белка, который связывается, можно оценивать на основании изменения молекулярной массы, которая физически связана с покрытой декстраном стороной сенсорного чипа; изменение молекулярной массы можно измерять с помощью детекторной системы.

Преимущества изобретения

Так как связывание СТЬА4 с 0Ό80 и 0Ό86 характеризуется быстрыми скоростями ассоциации (оп) и быстрыми скоростями диссоциации (оЩ и так как комплексы СТЬА41д-СО86 диссоциируют примерно в 5-8 раз быстрее, чем комплексы СТЬА41д-СО80, логично предположить, что замедление скорости диссоциации СТЬА41д из комплексов с 0Ό80 и/или 0Ό86 даст соединения (молекулы) с более сильными иммуносупрессорными свойствами. Так, ожидается, что растворимый мутантный СТЬА4, обладающий более высокой авидностью к 0Ό80 и СО86-позитивным клеткам по сравнению с дикого типа СТЬА4 или немутированными формами СТЬА41д, будет блокировать примирование антигенспецифических активированных клеток с более высокой эффективностью, чем дикого типа СТЬА4 или немутированными формами СТЬА41д.

- 20 013122

Примеры

Нижеприведенные примеры представлены для иллюстрации настоящего изобретения и для помощи рядовому специалисту в их получении и применении. Примеры никоим образом не предполагают каклибо ограничить объем изобретения.

Пример 1.

Данный пример включает описание методов, используемых для создания нуклеотидных последовательностей, кодирующих растворимый мутантный СТЬА4 по изобретению. Получают мутант с мутацией в одном сайте (односайтовый мутантный) Μ04Ε^ и проверяют кинетику связывания с СЭ80 и/или СО86. Нуклеотидную последовательность Μ04Ε^ используют в качестве матрицы для создания последовательности СТЬА4 с мутацией в двух сайтах, ^104ΕΑ29ΥIд, и определяют кинетику его связывания с СЭ80 и/или СЭ86.

Мутагенез СТЬА4Ю с помощью мутаций в кодонах.

Стратегию мутагенеза и скрининга разрабатывают с целью идентификации мутантных СΤ^Α4Iд, которые имеют более медленные скорости диссоциации (ой) от СЭ80 и/или СЭ86. Односайтовые мутантные нуклеотидные последовательности получают, используя СΤ^Α4Iд (патенты США: 5844095; 5851795; и 5885796; АТСС инвентарный номер 68629) в качестве матрицы. Для случайного мутагенеза специфического кДНК кодона создают мутагенные олигонуклеотидные ПЦР праймеры, содержащие любое основание в положениях 1 и 2 кодона, но в положении 3 содержащие только гуанин или тимин (ХХС/Т; также известный как ΝΝΟ/Т). Таким образом, можно провести случайную мутацию специфического кодона, кодирующего аминокислоту, чтобы кодировать каждую из 20 аминокислот. При этом ХХС/Т мутагенез дает 32 потенциальных кодона, кодирующих каждую из 20 аминокислот.

ПЦР продукты, кодирующие мутации в непосредственной близости к -М97-С107 СΤ^Α4Iд (см. фиг. 7, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3 и 4; или фиг. 8, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 5 и 6), расщепляют с помощью ЗасЕХЬа! и субклонируют в аналогично разрезанный СΤ^Α4Iд πΕΝ (также известный как рЛ-Ν) экспрессирующий вектор. Этот метод используют для создания СТЬА4 с мутацией в одном сайте, Ε104Ε^ (фиг. 8, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 5 и 6).

Для мутагенеза близ 825-К33 СΤ^Α4Iд 5' к этой петле сначала вводят молчащий ΝΙκΙ сайт рестрикции с помощью ПЦР праймер-направленного мутагенеза. ПЦР продукты расщепляют с помощью ХйеЕХЫй и субклонируют в аналогично разрезанный СΤ^Α4Iд или Ε104Ε^ векторы экспрессии. Этот метод используют для создания СТЬА4 с мутацией в двух сайтах, ^104ΕΑ29ΥIд (фиг. 7, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3 и 4). В частности, нуклеотидную молекулу, кодирующую СТЬА4 с мутацией в одном сайте, Ε104Ε^, используют в качестве матрицы для создания СТЬА4 с мутацией в двух сайтах, ^104ΕΑ29ΥIд. Вектор рЛМ содержащий ^104ΕΑ29ΥIд, показан на фиг. 12.

Пример 2.

Далее дается описание методов скрининга, применяемых для идентификации СТЬА4 полипептидов с единичной и с двойной мутацией, экспрессированных при использовании конструкций, описанных в примере 1, которые проявляют повышенную авидность связывания с СЭ80 и СЭ86 антигенами по сравнению с немутантным СΤ^Α4Iд.

Последние т νίΙΐΌ и т νί\Ό исследования показывают, что сам по себе СΤ^Α4Iд не способен полностью блокировать примирование антиген-специфических активированных Т клеток. Λ ν 11го исследования с измерением ингибирования пролиферации Т-клеток СΤ^Α4Iд и любым моноклональным антителом, специфическим к СЭ80 или СЭ86, показывает, что моноклональное антитело против СЭ80 не повышает ингибирование СΤ^Α4Iд. Однако моноклональное антитело против СЭ86 повышает ингибирование, это показывает, что СΤ^Α4Iд не эффективно для блокирования взаимодействий СЭ86. Эти данные подтверждают результаты, полученные ранее ЬтДеу е1 а1. (Iттишίу, (1994), 1: 793-801), показывающие, что для ингибирования опосредованных СЭ80 клеточных ответов требуются примерно в 100 раз более низкие концентрации СΤ^Α4Iд, чем для ответов, опосредованных СЭ86. На основании этих данных было высказано предположение, что растворимый мутантный СТЬА4, обладающий более высокой авидностью к СЭ86, чем дикого типа СТЬА4, способен лучше блокировать примирование антигенспецифических активированных клеток, чем СΤ^Α4Iд.

С этой целью растворимый мутантный СТЬА4, описанный выше, в пример 1, подвергают скринингу, используя новый метод скрининга, для того, чтобы определить некоторые мутации во внеклеточном домене СТЬА4, которые повышают авидность связывания с СЭ80 и СЭ86. Эта стратегия скрининга включает эффективный метод непосредственной идентификации мутантов с явно более медленными ой скоростями (скоростями диссоциации), не требующий очистки или количественного определения белка, так как определение ой скорости не зависит от концентрации (Ο'8йаηле88у е1 а1., (1993) Апа1. Вюсйет., 212: 457-468).

Клетки СΟ8 трансфецируют при использовании индивидуальных очищенных плазмидных ДНК т1шртер и выращивают в течение нескольких дней. Трехдневные кондиционированные культуральные среды наносят на биосенсорные чипы ЫАсоте (Рйатташа Вю1есй АВ, Ирр8а1а, 8^ейеп), покрытые растворимым ί.Ό80Λ или ί.Ό86Λ. Специфическое связывание и диссоциацию мутантных белков определяют с помощью поверхностного плазмонного резонанса (Ο'811аηηе55У. Ό.Ε, е1 а1., (1993) Апа1. Вюсйет.

- 21 013122

212: 457-468). Все эксперименты проводят на биосенсорах В1Асоге™ или В1Асоге™ 2000 при 25°С. Лиганды иммобилизуют на сенсорных чипах NСМ5 (чистые для исследовательских работ) (Рйагтас1а) с применением связывания стандартного №этил-№-(диметиламинопропил)карбодиимид-№ гидроксисукцинимида (ΣοΗηκκοη, В., е! а1. (1991) Апа1. Вюсйет. 198: 268-277; КЫ1ко, 8.Ν., е! а1. (1993) Σ. Вю1. Сйет. 268: 5425-5434).

Способ скрининга.

Клетки С08, выращенные в 24-луночных планшетах для тканевых культур, трансфецируют при использовании ДНК, кодирующей мутантный СТЬА41д. Через 3 дня собирают культуральные среды, содержащие секретированный растворимый мутантный СТЬА41д.

Кондиционированные культуральные среды клеток С08 пропускают через биосенсорные чипы В1Асоге, дериватизированные с помощью СЭ861д или СЭ801д (как описано Сгеепе е! а1., 1996 Σ. Βίο1. Сйет. 271: 26762-26771), и определяют мутантные молекулы, имеющие более медленные скорости диссоциации (оГГ^'), чем скорости, наблюдаемые для дикого типа СТЬА41д. кДНК, соответствующие выбранным образцам сред, секвенируют и получают ДНК для осуществления более масштабной транзиторной трансфекции клеток С08, при использовании которых, после очистки культуральных сред от протеина А, получают мутантный СТЬА41д.

Применяемые условия В1Асог и анализ данных равновесного связывания представлены в Сгеепе е! а1., 1996, Σ. Вю1. Сйет. 271: 26762-26771 и в данном описании.

Данные анализа В1Асоге.

Перед началом анализа на сенсограммах нулевую линию (линия отсчета, фон) нормализуют по нулевой единице ответа (относительной единице, НИ). Образцы пропускают через псевдодериватизированные проточные кюветы (кюветы сравнения) с целью определения фоновых значений единицы ответа (НИ) вследствие большой разницы между коэффициентами преломления растворов. Равновесные константы диссоциации (К ι) рассчитывают по кривым зависимости К_еч от С, где Н_еч обозначает ответ в стационарном состоянии минус ответ на псевдодериватизированном чипе (проверочном чипе, чипе сравнения), а С обозначает молярную концентрацию аналита. Кривые связывания анализируют с помощью выпускаемой серийно программы построения нелинейной кривой (Рпкт, СгарйРЛЭ 8оП\уаге).

Экспериментальные данные сначала применяют к модели связывания одного лиганда с единственным рецептором (1-сайтовая модель, т.е. простая система Лэнгмюра, А+В^АВ), а равновесные константы ассоциации (К_Й=[А]-[В]\[АВ]) рассчитывают по уравнению Н=Н_тах-С/(К_й+С). Затем данные применяют к простейшей двухсайтовой модели связывания лиганда (т.е. к рецептору, имеющему два невзаимодействующих независимых сайта связывания, описываемому уравнением ^{Н Н}тах1 * С\(К_И+С)+Кт_ах2’С\(К₀2+С).

Согласие (критерий адекватности) этих моделей анализируют визуально, сравнивая с экспериментальными данными, и статистическими методами, с помощью Р теста по сумме квадратов. Как более подходящую выбирают односайтовую модель, если двухсайтовая модель не подходит значительно лучше (р<0.1).

Анализ ассоциации и диссоциации проводят с применением программы В1А еνа1иаΐ^οη 2.1 (Рйагтас1а). Константы скорости ассоциации к_оп рассчитывают двояко, предполагая как гомогенные односайтовые взаимодействия, так и параллельные двухсайтовые взаимодействия. Для односайтовых взаимодействий величины к_оп рассчитывают по уравнению Н_!=Н_еч(1-ехр^-кк(!-!0)), где Н обозначает ответ в данное время !; Кеч обозначает ответ в стационарном состоянии; !0 обозначает время в начале инжекции (впуска); и кк=йК/й!=коп-СкоГГ, и где С обозначает концентрацию аналита, вычисленную в единицах мономерных связывающих сайтов. Для двухсайтовых взаимодействий величины коп рассчитывают по уравнению К!=Кеч1(1-ехр^-кк1(!-!°⁾) + Кеч2(1-ехр^-кк(!-‘°⁾). Для каждой модели величину к,_>п определяют с помощью рассчитанного тангенса угла наклона (примерно, до 70% максимальной ассоциации) на кривых зависимости кк от С.

Данные по диссоциации анализируют в приложении к односайтовой (АВ=А+В) или двухсайтовой (А1В_)=А1+В_)) моделям, а константы скорости (к_оГГ) рассчитывают по кривым наибольшего соответствия. Используют модель сайта связывания за исключением тех случаев, когда разность больше фона прибора (автомата) (2-10 НИ, в зависимости от прибора), в этом случае используют модель двух сайтов связывания. Полупериод удерживания рецептора рассчитывают по соотношению 1|.₂=0/693/1<,_Γΐ.

Проточная цитометрия.

Мышиное тАЬ Ь307.4 (против СЭ80) получают от ВесЮп Эюкшкоп (8ап .Токе, СайГогша), а 1Т2.2 (анти-В7-0 [также известный как СЭ86]), от Рйагтшдеп (8ап П1едо, СайГогша). Для иммуноокрашивания СЭ80-позитивные и/или СЭ86-позитивные СНО клетки удаляют из сосудов для культивирования, инкубируя в фосфатно-солевом буферном растворе (РВ8), содержащем 10 мМ ЕЭТА. Клетки СНО (1-10х10⁵) сначала инкубируют с тАЬ или белками, слитыми с иммуноглобулином, в среде ЭМЕМ, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (РВ8), затем отмывают и инкубируют с конъюгатом изоцианата флуоресцеина с антителом козы против мышиного или человеческого иммуноглобулина (Тадо, Вигйпдате, СайГогша). Клетки окончательно отмывают и анализируют на РАС8сап (ВесЮп Эккткоп).

- 22 013122

ЗЭЗ-РА6Е и эксклюзионная хроматография.

ЗЭЗ-РА6Е проводят на акриламидных гелях с 4-20% Трис/глицина (Νονβχ, Зап Όίοβο. СА). Аналитические гели окрашивают Кумасси голубым, а изображения влажных гелей получают цифровым сканированием. СТЬА41д (25 мкг) и Ь104ЕА29У1д (25 мкг) анализируют эксклюзионной хроматографией на колонке ТЗК-6ЕЙ 6300 З\У_х1 (7.8x300 мм, ТокоЬаак, МоШдоте^Ше, РА), уравновешенной фосфатносолевым буферным раствором, содержащим 0.02% NАN3, при скорости потока 1.0 мл/мин.

СТЬА4Хс12сз и Ь104ЕА29¥Хс120з.

Одноцепочечный СТЬА4Х_С1_20З получают, как ранее описаны (Ьтк1еу е! а1., (1995) I. ΒίοΙ. СЬет., 270: 15417-15424). Коротко говоря, плазмиду экспрессии онкостатин М СТЬА4 (ОМСТЬА4) используют в качестве матрицы, прямой праймер

6А66Т6АТААА6СТТСАССААТ666Т6ТАСТ6СТСАСАСА6 выбирают, чтобы он соответствовал последовательностям в векторе;

а обратный праймер 6Т66Т6ТАТТ66ТСТА6АТСААТСА6ААТСТ666САС66ТТС соответствовал последним семи аминокислотам (т.е. аминокислотам 118-124) во внеклеточном домене СТЬА4 и содержал сайт рестрикции и стоп-кодон (Т6А). Обратный праймер определяет мутацию С120З (замена цистеина на серин в положении 120). В частности, нуклеотидная последовательность 6СА (нуклеотиды 34-36) обратного праймера, показанного выше, заменяется на одну из следующих нуклеотидных последовательностей: А6А, 66А, Т6А, С6А, АСТ или 6СТ. Как понимают специалисты в данной области техники, нуклеотидная последовательность 6СА является обратно-комплементарной последовательностью кодона Т6С для цистеина. Аналогично нуклеотидные последовательности А6А, 66А, Т6А, С6А, АСТ или 6СТ представляют собой обратно-комплементарные последовательности кодонов для серина. Продукты полимеразной цепной реакции расщепляют с помощью Ншб111/ХЬа1 и направленно клонируют в экспрессирующий вектор πΕΝ (Βήκΐοΐ-Муегк Зс.|шЬЬ Сотрапу, РйпсеФп, N1). Ь104ЕА29УХ_С1₂о₃ получают таким же способом. Каждую конструкцию проверяют секвенированием ДНК.

Идентификация и биохимические характеристики высокоавидных мутантов.

Для мутагенеза выбирают двадцать четыре аминокислоты, и полученные ~2300 мутантных белков анализируют на связывание СИ861д методом поверхностного плазмонного резонанса (ЗРЯ; описанного выше). Преобладающие результаты мутагенеза в каждом сайте суммированы в табл. II. Случайный мутагенез некоторых аминокислот в З25-Я33, очевидно, не изменяет связывания с лигандом. Мутагенез Е31 и Я33 и остатках Μ97-Υ102 явно приводит к более слабому связыванию лиганда. Мутагенез остатков З25, А29 и Т30, К93, Ь96, Υ103, Ь104 и 6105 дает белки с медленными скоростями оп (ассоциации) и/или ой (диссоциации). Эти результаты подтверждают ранее полученные данные о том, что остатки в области М97-У102 влияют на связывание с лигандом (РеасЬ е! а1., (1994) I. Ехр. Меб., 180: 2049-2058).

Мутагенез в сайтах З25, Т30, К93, Ь96, Υ103 и 6105 позволяет идентифицировать некоторые мутантные белки, имеющие более медленные скорости диссоциации (ой) от СЭ861д. Однако в этих примерах замедленная скорость ой гасится замедленной скоростью оп, в результате полученные мутантные белки с общей авидностью к СЭ861д, несомненно аналогичной авидности, наблюдаемой в случае дикого типа СТЬА41д. Кроме того, мутагенез К93 приводит к заметной агрегации, которая может быть ответственна за наблюдаемые изменения кинетики.

Случайный мутагенез Ь104 с последующей трансфекцией клеток СОЗ и скринингом методом ЗРЯ образцов культуральных сред с помощью иммобилизованного СЭ861д дают шесть образцов сред, содержащих мутантные белки со ой скоростью, примерно в 2 раза более низкой, чем у дикого типа СТЬА41д. Когда были секвенированы соответствующие кДНК этих мутантов, оказалось, что каждая из них кодирует мутацию лейцина в глутаминовую кислоту (Ь104Е). Очевидно, замена лейцина 104 на аспарагиновую кислоту (Ε104Ό) не влияет на связывание СЭ861д.

Мутагенез затем повторяют в каждом сайте, перечисленном в табл. II, на этот раз используя в качестве ПЦР матрицы Ь104Е вместо дикого типа СТ^А4Iд, как описано выше. Анализ ЗРЯ, снова с применением иммобилизованного 6086¾ идентифицирует шесть образцов культуральных сред, полученных в результате мутагенеза аланина 29, с белками, имеющими примерно в 4 раза более медленные ой скорости, чем дикого типа СТР-А4[д. Наиболее замедлены эти скорости у двух белков с заменами на тирозин (^104ЕА29Υ), у двух белков с заменами на лейцин (Ы04ЕА29Е), у одного с заменой на триптофан (Ь104ЕА29^) и у одного с заменой на треонин (Й104ЕА29Т). Никаких мутантов с медленной скоростью ой не определяют при случайной мутации одного аланина 29 дикого типа СТ^А4Iд.

Относительную молекулярную массу и состояние агрегации очищенных Ь104Е и ^104ЕА29ΥIд определяют методами ЗЭЗ-РА6Е и эксклюзионной хроматографии. ^104ЕА29ΥIд (~1 мкг; дорожка 3) и (~1 мкг; дорожка 2) явно имеют такую же электрофоретическую подвижность, что и СТ^А4Iд (~1 мкг; дорожка 1) в восстанавливающих (~50 кДа; +вМЕ; плюс 2-меркаптоэтанол) и невосстанавливающих (~100 кДа; -()МЕ) условиях (фиг. 10А). Эксклюзионная хроматография демонстрирует, что

- 23 013122 ^104ЕЛ29ΥIд (фиг. 10С) очевидно имеет такую же подвижность, что и димерный С7^Л4Iд (фиг. 10В). Основные пики относятся к димеру белка, тогда быстрее элюирующий минорный пик на фиг. 10В относятся к более высокомолекулярным агрегатам. Примерно, 5% €7^4^ представлено в виде более высокомолекулярных агрегатов, но отсутствует доказательство агрегации ^104ЕЛ29ΥIд или ^104ЕIд. Таким образом, более сильное связывание с СЧЖйц, наблюдаемое в случае ^104ЕIд и ^104ЕА29ΥIд, нельзя отнести на счет агрегации, индуцированной мутагенезом.

Анализ равновесного связывания и кинетики связывания.

Анализ равновесного связывания и кинетики связывания осуществляют с помощью очищенных на протеине А СТ^Л4Iд, ^104ЕIд и ^104ЕА29ΥIд методом поверхностного плазмонного резонанса (8ΡΚ). Результаты показаны в табл. Ι.

Таблица Ι

Наблюдаемые константы равновесия и кинетические константы

Иммобилизованный белок	Аналит	£оп(х 105)М%	^(χΙΟήί'	КлнМ
СЦ801§	СТЬА41§	3.44 ±0.29	2.21 ±0.18	6.51 ± 1.08
СЦ801§	Ь104Е1§	3.02 ± 0.05	1.35 ±0.08	4.47 ±0.36
СЦ801§	Ь104ЕА29У1§	2.96 ± 0.20	1.08 ±0.05	3.66 ±0.41
СЦ8018	СТЬА4ХС1208	12.0 ± 1.0	230 ± 10	195 ±25
СЦ801§	Ы 04ЕА29УХС1205	8.3 ± 0.26	71 ±5	85.0 ±2.5
СЦ861§	СТЬА41§	5.95 ±0.57	8.16 ±0.52	13.9 ±2.27
СЦ861§	Ы04Е1§	7.03 ± 0.22	4.26 ±0.11	6.06 ± 0.05
СЦ861§	Ы04ЕА29У1§	6.42 ± 0.40	2.06 ± 0.03	3.21 ±0.23
СЦ861§	СТЬА4Хс1208	16.5 ±0.5	840 ± 55	511 ± 17
СЭ861§	Ы04ЕА29УХС12оз	11.4 ± 1.6	300 ± 10	267 ± 29

(величины представляют собой среднее±стандартное отклонение в трех различных экспериментах)

Наблюдаемые равновесные константы диссоциации (Кд; табл. Ι) рассчитывают по кривым связывания в интервале концентраций (5.0-200 нМ). ^104ЕА29ΥIд прочнее связывается с С^86Iд, чем Ε104Η^ или С7^Л4Iд. Более низкая величина К_д ^104ЕЛ29ΥIд (3.21 нМ), чем 1.1041% (6.06 нМ) или СТ^Л4Iд (13.9 нМ), указывает на повышенную авидность связывания ^104ЕА29ΥIд с С^86Iд. Более низкая величина К_д белка ^104ЕА29ΥIд (3.66 нМ), чем К_д Ε104Η^ (4.47 нМ) или СТ^Л4Iд (6.51 нМ) указывает на повышенную авидность связывания ^104ЕА29ΥIд с С^80Iд.

Анализ кинетики связывания показывает, что сравнительные скорости оп для связывания СТ^Л4Iд, 1.1041% и ^104ЕА29ΥIд с СБ80 аналогичны, как и скорости оп для связывания с С^86Iд (табл. Ι). Однако оЕЕ скорости для этих молекул не эквивалентны (табл. Ι). По сравнению с СТ^Л4Iд скорость оЕЕ ^104ЕА29ΥIд примерно в 2 раза медленнее оЕЕ скорости от С^80Iд и примерно в 4 раза медленнее ой скорости от С^86Iд. 017' скорости Б104Е являются промежуточными между ^104ЕЛ29ΥIд и С7^Л4Iд. Так как введение этих мутаций не оказывает значительного влияния на оп скорости, очевидно, что повышение авидности к С^80Iд и С^86Iд, наблюдаемое с ^104ЕА29ΥIд, происходит главным образом вследствие понижения ой скоростей (скоростей диссоциации).

Для определения, вызвано ли повышение авидности ^104ЕЛ29ΥIд к С^86Iд и С^80Iд мутациями, влияющими на способ ассоциации каждого мономера в димер, или повышающими авидность структурными изменениями, введенными в каждый мономер, одноцепочечные конструкции внеклеточных доменов СТЕА4 и ^104ЕА29Υ получают мутагенезом цистеина 120 в серин, описанным выше, и в соответствии с Ь1П81еу е! а1., (1995) 1. Бю1. Сйеш., 270: 15417-15424. Методом гель-проникающей хроматографии показано, что очищенные белки С7^Л4X_С12ο₈ и ^1Ο4ЕЛ29ΥX_С12ο₈ являются мономерными (Ь1П81еу е! а1., (1995), см. выше), ранее их свойства связываться с лигандом анализировались методом 8ΡΚ. Результаты показывают, что аффинность связывания обоих мономерных белков с 0086^ примерно в 35-80 раз меньше, чем аффинность связывания, наблюдаемая в отношении их соответствующих димеров (табл. Ι). Это подтверждает ранее опубликованные данные, показывающие, что для высокой авидности связывания лиганда требуется димеризация СТЕА4 (Огеепе е! а1., (1996) 1. Бю1. Сйеш., 271: 26762-26771).

^104ЕЛ29ΥX_С1208 связан как с С^80Iд, так и с С^86Iд с аффинностью примерно в 2 раза более высокой, чем С7^Л4X_С12ο8. Повышенная аффинность вызвана примерно в 3 раза более медленной скоростью диссоциации от обоих лигандов. Таким образом, наиболее вероятно, что более прочное связывание ^104ЕЛ29Υ с лигандом обусловлено скорее повышающими авидность структурными изменениями, которые были введены в каждую мономерную цепь, нежели изменениями, при которых молекулы димеризуются.

Локализация и структурный анализ мутаций, повышающих авидность.

Решение структуры внеклеточного ^У-образного домена СТЕА4 недавно осуществлено методом ЯМР спектроскопии (МеЫег е! а1., (1997) \а1иге 8!гие!. Бю1., 4: 527-531). Это позволило точно установить локализацию лейцина 104 и аланина 29 в трехмерном пространстве (фиг. 11А-В). Лейцин 104 расположен около высококонсервативной ΜΥΡΡΡΥ аминокислотной последовательности. Аланин 29 расположен близ С-конца области 825-К33, который пространственно прилегает к области ΜΥΡΡΡΥ. Хотя

- 24 013122 существует значительное взаимодействие между остатками оснований этих двух областей, по-видимому, непосредственное взаимодействие между Ь104 и А29 отсутствует, хотя они оба представляют собой часть непрерывного гидрофобного ядра в белке. Структурные последовательности двух повышающих авидность мутантов изучают на моделях. Мутацию Α29Υ можно легко разместить в углублении между областью 325-К33 и областью ΜΥΡΡΡΥ, и она может служить для стабилизации конформации области ΜΥΡΡΡΥ. В дикого типа СТЬА4 возникают пространственные гидрофобные взаимодействия между Ь104 и Ь96 и У94 рядом с областью ΜΥΡΡΡΥ. Маловероятно, что мутация с заменой на глутаминовую кислоту примет конформацию, аналогичную конформации Ь104, по двум причинам. Во-первых, без значительного изменения области 325-К33 в структуре недостаточно места для расположения более протяженной боковой цепи глутаминовой кислоты. Во-вторых, энергетические затраты на то, чтобы спрятать отрицательный заряд боковой цепи глутаминовой кислоты в гидрофобной области, были бы велики. Зато изучение на моделях позволяет предсказать, что этот заряд может быть стабилизирован за счет сольватации. Такое конформационное изменение легко можно расположить рядом с 0105 с минимальными искажениями в других областях.

Связывание высокоаффинных мутантов с СНО клетками, экспрессирующими 0080 или 0086.

РАС3 анализ (фиг. 2) связывания СТ^Α4Iд и мутантных белков со стабильно трансфецированными СЭ80+ и С086+СН0 клетками осуществляют по данному описанию. СО80-позитивные и СЭ86позитивные СНО клетки инкубируют с увеличивающимися концентрациями СТ^Α4Iд, ^104ΕΑ29ΥIд или Ε104ΕΙ§, а затем отмывают. Связанный с иммуноглобулином слитый белок детектируют с помощью конъюгированного с изоцианатом флуоресцеина антитела козы против человеческого иммуноглобулина.

Как показано на фиг. 2, СЭ80-позитивные или СО86-позитивные СНО клетки (1.5х10⁵) инкубируют с указанными концентрациями СТ^Α4Iд (темные квадраты), ^104ΕΑ29ΥIд (окружности) или Ε104ΕΙ§ (треугольники) в течение 2 ч при 23°С, отмывают и инкубируют с изоцианатом флуоресцеина антитела козы против человеческого иммуноглобулина. Изучено связывание всего на 5000 жизнеспособных клетках (единичное определение) на РАС3саи, и среднюю интенсивность флуоресценции (ΜΡΙ) определяют по данным гистограмм с применением Ρί'.'-ΕΥ3Υ3. Данные корректируют по фоновой флуоресценции, измеряемой на клетках, инкубированных только с реагентом второй стадии (ΜΡΙ=7). Контрольное Ь6 тАЬ (80 нг/мл) дает величину ΜΡΙ < 30. Эти результаты являются типичными и взяты из четырех независимых экспериментов.

Связывание ^104ЕА29ΥIд, Ε104ΕΙ§ и СТ^Α4Iд с человеческими СЭ80-трансфецированными СНО клетками примерно эквивалентны (фиг. 2А). ^104ΕΑ29ΥIд и Ε104ΕΙ§ прочнее (сильнее) связываются с СНО клетками, стабильно трансфецированными человеческим СЭ86, чем СТ^Α4Iд (фиг. 2В).

Функциональные анализы.

Человеческие СО4-позитивные Т клетки выделяют с помощью иммуномагнитной негативной селекции (Ьш81еу с1 а1., (1992) 1. Εχρ. Μοά. 176: 1595-1604). Выделенные СО4-позитивные Т клетки стимулируют форбол-миристат-ацетатом (РМА) плюс СО80-позитивные или СО86-позитивные СНО клетки в присутствии титрующих концентраций ингибитора. СО4-позитивные Т клетки (8-10х10⁴/лунка) культивируют в присутствии 1 нМ РМА в присутствии или в отсутствие стимуляторов облученных СНО клеток. Пролиферативные реакции определяют, добавляя 1 мкКи/лунка [3Н]тимидина в последние 7 ч выращивания в течение 72 ч культуры. Проводят ингибирование РМА плюс СО80-позитивных СНО или СП86-позитивных СНО стимулированных Т клеток с помощью Ε104ΕΛ29ΥΙ8 и СТ^Α4Iд. Результаты показаны на фиг. 3. ^104ΕΑ29ΥIд ингибирует пролиферацию СЭ80-позитивных обработанных РМА СНО клеток сильнее, чем СТЕА4Ц (фиг. 3А). ^104ΕΑ29ΥIд также более эффективно, чем СТ^Α4Iд, ингибирует пролиферацию СЭ86-позитивных обработанных РМА СНО клеток (фиг. 3В). Таким образом, ^104ΕΑ29ΥIд является более эффективным (сильным) ингибитором опосредованной как СЭ80, так и СО86 костимуляции Т клеток.

На фиг. 4 показано ингибирование с помощью ^104ΕΑ29ΥIд и СТ^Α4Iд аллостимулированных Т клеток, полученных выше, а затем аллостимулированных человеческими клетками В лимфобластоидной линии (ЬСЬ), называемой РМ, которые экспрессируют СЭ80 и СЭ86 (Т клетки 3.0х10⁴/лунка и РМ 8.0х10³/лунка). Первичную аллостимуляцию проводят в течение 6 дней, затем клетки выдерживают в пульсовом режиме с ³Н-тимидином в течение 7 ч, после чего определяют включение радиоактивной метки.

Вторичную аллостимуляцию осуществляют следующим образом. Аллостимулированные в течение семи дней Т клетки собирают с помощью среды для разделения лимфоцитов (Ε3Μ) (ЮИ, Аигога, ОН) и оставляют на 24 ч. Затем Т клетки рестимулируют (вторичная рестимуляция) в присутствии титрующих количеств СТ^Α4Iд или ^104ΕΑ29ΥIд, добавляя РМ в том же соотношении, что и ранее. Стимуляцию проводят в течение 3 дней, затем клетки выдерживают в пульсовом режиме с радиометкой и собирают, как указано ранее. Влияние ^104ΕΑ29ΥIд на первично аллостимулированные Т клетки показано на фиг. 4А. Влияние ^104ΕΑ29ΥIд на вторично аллостимулированные Т клетки показано на фиг. 4В. ^104ΕΑ29ΥIд ингибирует пролиферативный ответ как первично-, так и вторично стимулированных Т клеток сильнее, чем СТ^Α4Iд.

- 25 013122

Для определения продуцирования цитокинов (фиг. 5) планшеты для вторичной аллостимуляции ставят в двойном повторе. Через 3 дня культуральные среды анализируют с применением наборов ЕЫ8А (Бюкоигее, Сатап11о, СА) в условиях, рекомендованных изготовителем. Найдено, что Ы04ЕА29У1§ блокирует продуцирование цитокинов 1Б-2, 1Б-4 и γ-ΙΕΝ Т клетками после вторичного аллогенного раздражителя более эффективно, чем СТ1 ,Л41ц (фиг. 5А-С).

Влияние Ы04ЕА29У1§ и СП,Л41д на реакцию смешанной культуры лимфоцитов обезьян (МБК) показано на фиг. б. Периферические мононуклеарные клетки крови (РВМС; 3.5х10⁴ клеток/лунка от каждой обезьяны) от 2 обезьян очищают с помощью среды для разделения лимфоцитов (Б8М) и смешивают с 2 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА, РНА). Клетки стимулируют 3 дня, затем выдерживают в пульсовом режиме в течение 1б ч и собирают. Ы 04ЕА29У1§ пролиферацию обезьяньих Т клеток эффективнее (лучше), чем СТБА41§.

Таблица ΙΙ

Влияние мутагенеза СТБА41§ в перечисленных сайтах на связывание СБ8б1§

Сайт мутагенеза	Эффект не наблюдается
825
Р26	+
627	+
К28	+
А29
ПТ*} л 1 эи
Е31
КЗЗ
К93
Ь96
М97
Υ98
Р99
Р100
Р101
У102 .	-
Υ103
Ь104
6105
1106	+
6107	+
<2111	+
Υ113	+
1115	+

Эффект мутагенеза
Медленная оп скорость/медленная о£Г скорость	Пониженное связывание лиганда
+
+
	+
	+
+
+
	+
	+
	+
	+
	+
	+
+
+
+

(Преобладающий эффект указан знаком +)

Пример 3.

В данном примере проводится сравнение эффективности и безопасности Ы 04ЕА29У1§, описанного выше, в качестве иммунодепрессанта (иммуносупрессора) для поддерживающего лечения с СкА в течение 12 месяцев при использовании его в качестве компонента не содержащей СМ комбинированной схемы лечения, включающий индукцию базиликсимабом (Симулект®; Νοναίΐίκ), прием микофенолята мофетила (ММЕ; Селлсепт®; Косйе) и кортикостероидов реципиентами почечного трансплантата.

Подходящими являются взрослые реципиенты не-НЬА-идентичного почечного трансплантата от живого или умершего донора. Пациентов, имевших ранее почечный трансплантат, пациентов с содержанием тест-антигеновых антител >20% в анамнезе или пациентов, по мнению исследователя, с повышен ной степенью риска острого отторжения трансплантата ограничивают до <10% от изучаемой популяции. Показатели для недопущения включают основное почечное заболевание очаговый или сегментный гломерулосклероз, типа Ι или ΙΙ мембранопролиферативный гломерулонефрит или гемолитический уремический синдром/тромботическая тромбоцитопеническая пурпура; активный гепатит В или С или ВИЧ; и возраст донора >б0 или <б, доноры с сердечной смертью или холодно-ишемическое время донорской почки (время хранения донорской почки до трансплантации) >3б ч.

Исследование представляет собой исследование с открытой меткой, рандомизированное, активно контролируемое, с многократной дозой, многоцентровое, проводимое в Соединенных Штатах, Европе и Канаде. Допущенных до исследования пациентов обоего пола в возрасте > 18 лет, подвергающихся трансплантации почки (от умершего или живого донора за исключением случаев, когда донор и реципи- 2б 013122 ент НЬЛ-идентичны), произвольно распределяют по группам (рандомизируют) в соотношении 1:1:1, в одной группе с более интенсивной (М1) схемой лечения с помощью Ы04ЕЛ29У1д, менее интенсивной (Ы) схемой лечения с помощью Ы04ЕЛ29У1д или циклоспорином А (СкА); во всех случаях в комбинации с индукционной терапией с помощью базиликсимаба (Симулект®; дополнительной поддерживающей терапией микофенолятом мофетила (ММР; Селлсепт®; Воске) и кортикостероидами. Обе схемы с Ь104ЕА29У1д включают раннюю фазу, в которой Ь104ЕА29У1д вводят в количестве 10 мг/кг, и поддерживающую фазу, в которой Ь104ЕА29У1д вводят в количестве 5 мг/кг каждые 4 (с.]4) или 8 недель (с.]8). Дозы для каждой схемы рассчитывают, исходя из массы тела. Эти дозы определяются целевыми минимальными (углубление) профилями, оказавшимися эффективными в ходе исследований на приматах. Эти профили заставляют применять дозы, которые изначально были выше, в период наивысшего иммунологического риска (день 0-90). Ранняя фаза в схеме М1 продолжительнее (6 месяцев по сравнению с 3 месяцами) и включает более частое введение доз.

Схема более интенсивного (М1) лечения с помощью Ь104ЕА29У1д включает введение 10 мг/кг в дни 1, 5, 15, 29, 43, 57, 71, 85, 113, 141 и 169, а затем 5 мг/кг каждые 4 или 8 недель. Схема менее интенсивного (Ы) лечения с помощью Ь104ЕА29У1д включает введение 10 мг/кг в дни 1, 15, 29, 57 и 85, а затем 5 мг/кг каждые 4 или 8 недель. Ь104ЕА29У1д вводят в виде 30-минутной внутривенной инфузии. Пациенты из СкА группы дважды в сутки получают дозы (7±3 мг/кг), это позволяет достичь заданный интервал целевых сывороточных концентраций 150-400 нг/мл в течение первого месяца, а 150-300 нг/мл в течение 2-12 месяцев, что согласуется с современной медицинской практикой. Все пациенты получают ММР 2 г ежедневно и базиликсимаб 20 мг каждые 4 дня. Применяется схема с постепенным уменьшением кортикостероида, включающая в.в. болюсные инъекции метилпреднизолона 500 мг в 1 день и 250 мг на 2 день, а затем перорально вводимые дозы 100 мг на 3 день, 50 мг на 4, 25 мг в дни 5-30, 22.5 мг в дни 31-44, 20 мг в дни 45-58, 17.5 мг в дни 59-72, 15 мг в дни 73-86, 12.5 мг в дни 87-100 и 10 мг в дни 101114. После дня 114 дозу преднизона можно снижать через месяц на 2.5 мг, но она не должна быть менее чем 5 мг в день.

Главной целью является продемонстрировать, что Ь104ЕА29У1д не хуже СкА предупреждает острое отторжение через 6 месяцев. Вторичными целями является оценка частоты острого отторжения (подтвержденного биопсией или предполагаемого) через 6 месяцев или 1 год; измеренный уровень клубочковой (гломерулярной) фильтрации (СРВ) по клиренсу йогексола через 1, 6 и 12 месяцев; параметры гипертензии; сывороточный холестерин и триглицериды; и общая безопасность. Другие определяемые данные включают смерть пациента или потерю трансплантата через 1 год; тяжесть острого отторжения; заболеваемость сахарным диабетом после трансплантации [который определяется требующей любого лечения гипергликемией в течение >4 недель или содержанием гемоглобина А1С (НЬА1с) >7%, у пациентов, ранее не считавшихся диабетиками]; СКФ (СРВ), рассчитанные по формулам в исследовании Модификация Диеты при Почечном Заболевании (МОВЭ, ^еνеу А.8., Вокск ГР., Ьете1к ГР., Сгеепе Т., Водегк К, ВоФ Ό. А тоге ассига!е теФой !о ек!1та!е д1отеги1аг йИгайоп га!е Ггот кегит сгеайшпе: а пе\\' ргеФскоп ес.|иа1юп. МоФПсаВоп оГ О1е1 ш Вепа1 Э^еаке 8!ийу Сгоир. Апп 1п!ет Мей 1999; 130: 461-470), ВФГГе (В.^. Сгеайшпе с1еагапсе: Вейк1йе ек!1та!е. Апп 1п!ег Мей. 1973; 79: 604-605), СосксгоГ!-Саи1! (СосксгоГ! Ό.^., Саи1! М.Н. РгеФскоп оГ сгеайшпе с1еагапсе Ггот кегит сгеайшпе. №ркгоп 1976; 16: 3141), и №пкВе11 (№пкВе11 В.Г, Сгиепе\\'а1й 8.М., А11еп ВГО., Скартап 1В. РгеФсФчд д1отеги1аг ГФгакоп га!е айег к1йпеу !гап8р1ап!акоп. Тгапкр1ап1акоп. 1995; 59(12): 1683-1689); фармакокинетика и иммуногенность. Диагностику и лечение острого отторжения (АВ) осуществляют по критериям международной классификации ВапГГ 97 (Васикеп Ь.С., 8о1ех К., Софт В.В., е! а1. Тке ВапГГ 97 \гогктд с1аккШса!юп оГ гепа1 а11одгаГ! ра!ко1оду. К1йпеу 1п! 1999; 55(2): 713-23). Проводят рок! кос (вторичный) анализ частоты встречаемости хронической нефропатии аллотрансплантата (САЦ).

Диагностику и лечение острого отторжения (АВ) осуществляют по критериям международной классификации ВапГГ 97 (Васикеп Ь.С., 8о1ех К., Софт В.В., е! а1. Тке ВапГГ 97 \гогктд с1аккШса!юп оГ гепа1 а11одгаГ! ра!ко1оду. К1йпеу 1п! 1999; 55(2): 713-23). Интраоперационную биопсию почечного трансплантата проводят для оценки начальной (базовой) гистологии. Ткань биоптата окрашивают и классифицируют в соответствии с критериями международной классификации ВапГГ 97 для патологии почечного трансплантата. Биопсию оценивает независимый патолог, незнакомый с лечением, для подтверждения, перед лечением АВ, всех эпизодов клинически подозреваемого (предполагаемого) АВ.

Дополнительные ожидаемые результаты включают клинически подозреваемое и подтвержденное с помощью биопсии острое отторжение (С8ВРАВ) в течение 12 месяцев; смерть или потеря трансплантата в течение 1 года; тяжесть АВ эпизодов (по шкале ВапГГ 97); неудачу, неблагоприятный исход лечения (определяемые как мнение исследователя; отторжение > степени ПВ; рецидивирующее или резистентное к стероиду отторжение); почечную функцию через 1, 6 и 12 месяцев (скорости гломерулярной фильтрации [СКФ, СРВ], оцениваемые по клиренсу йогексола) и доказательство хронической нефропатии аллотрансплантата (СА№) (интерстициальный фиброз и тубулярная атрофия); показатели гипертензии (диастолическое кровяное давление [ВР] > 90 мм Нд и/или систолическое ВР > 140 тт Нд); сывороточные липиды; безопасность, переносимость и нежелательные явления (НЯ, АЕ) у пациентов, пролеченных

- 27 013122 ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с пациентами, пролеченными СкА.

Для оценки безопасности и переносимости АЕ, лабораторные анализы (гематология, биохимия и анализ мочи) и жизненные показатели (признаки) регистрируют во время регулярных визитов в клинику.

Результаты.

Всего 218 пациентов подвергаются трансплантации почки и произвольно делятся на группы ΜΙ (N=74), И (N=71) или СкА (N=73). Исходные демографические и клинические характеристика в трех экспериментальных группах аналогичны. Всего 164 пациента прошли полный одногодичный курс лечения. Из пациентов, прекративших лечение ранее 1 года (N=16 νк 16 νк 20; ΜΙ схема по сравнению с Ы схемой по сравнению с СкА), наиболее общими причинами являются АЕ (N=5 νк 8 νк 9) и неблагоприятный исход лечения (N=7 νк 5 νк 3).

С8ВРАЯ нечасто встречается во всех экспериментальных группах, и в этом случае между экспериментальными группами нет статистически значимой разницы частоты встречаемости (коэффициент заболеваемости, распространенность) либо С8ВРАК, либо доказанного биопсией острого отторжения (ВРАЯ). Через 6 и 12 месяцев коэффициент заболеваемости С8ВРАЯ составляет 6.8%, 5.6% и 8.2% для групп с ΜΙ, Ы и СкА лечением соответственно.

Частота (распространенность) ВРАЯ в группах через 6 и 12 месяцев также аналогична, хотя ВРАЯ немного выше в Ы группе, нежели в двух других группах (18.9%, 29.6% и 17.8% для ΜΙ, Ы и СкА лечения соответственно). Подтвержденное с помощью биопсии острое отторжение встречается чаще, чем С8ВРАЯ, во всех экспериментальных группах, и наиболее распространенным оно является в Ы группе. Однако найдено, что многие из этих событий встречаются у пациентов, у которых концентрации ^104ЕА29ΥIд ниже заданных минимальных сывороточных концентраций.

Никакой статистически значимой разницы тяжести АЯ между экспериментальными группами не наблюдается; однако число АЯ было мало и не привело к потере трансплантата.

Это исследование выведено из слепого метода, чтобы исследовать лекарственный препарат с целью обеспечить стандартное наблюдение в отношении СкА, что, возможно, способствовало повышенному числу биопсий в ^104ЕА29ΥIд группах (N=345) по сравнению с СкА группой (N=144). Хотя это не является неожиданным для спланированного таким образом исследования, оно позволяет ускорить диагностику почечных гистологических аномалий в группах, получающих ^104ЕА29ΥIд.

Смерть и/или потеря трансплантата нечасто встречается во всех экспериментальных группах, зарегистрирована 1 смерть в ΜΙ группе, 4 в СкА группе и ни одной в Ы группе. Большинство случаев потери трансплантата вызвано не иммунологическими событиями, и только 3 трансплантата потеряны в ΜΙ и СкА группах АО по сравнению с 1 в Ш группе.

Заметное улучшение почечной функции наблюдается при лечении с применением Ы 04ЕА29ΥIд по сравнению с иммуносупрессией на основе СкА. Через 12 месяцев клиренс йогексола при лечении ^104ЕА29ΥIд больше во всех временных точках, при среднем улучшении 11 мл/мин/1.73 м² (~20%) по сравнению с СкА.

Через 12 месяцев хроническая нефропатия аллотрансплантата (САИ) на 30-50% менее распространена, в относительных величинах, у пациентов, получавших ^104ЕА29ΥIд, чем у пациентах, получавших СкА. Доля новых или ухудшающихся САN через 12 месяцев составляет 29%, 19% и 44% для ΜΙ, Ш и СкА групп соответственно.

Через 1 год среднее систолическое кровяное давление на 3-4 мм Нд выше у пациентов, пролеченных с применением СкА (133 мм Нд), чем в ΜΙ (130 мм Нд) и Ы (129 мм Нд) группах. Такой результат получают несмотря на то, что в группах, получающих ^104ЕА29ΥIд, меньше пациентов, использующих антигипертензивный препарат (ΜΙ: 87.5%; Ш 84.1%: СкА 92.2%). Общий сывороточный холестерин немного ниже у пациентов, пролеченных с помощью ^104ЕА29ΥIд (ΜΙ: 198 мг/дл; Ы: 201 мг/дл), по сравнению с пациентами, получающими СкА (212 мг/дл), хотя использование лекарства, понижающего содержание липидов, также ниже с ^104ЕА29ΥIд (ΜΙ: 36.1%; ЬЕ 31.9%; СкА: 53.1%).

Четыре (5.5%) пациента умерли в СкА группе по сравнению с 1 в экспериментальных группах, получающих ^104ЕА29ΥIд. Показатели нежелательных явлений (НЯ, АЕ) в экспериментальных группах сравнимы. Однако сходные АЕ значительно ниже после лечения ^104ЕА29ΥIд, чем после лечения СкА. Внутривенное введение ^104ЕА29ΥIд хорошо переносится, при этом отсутствуют реакции на инфузию. У пациентов, пролеченных с помощью ^104ЕА29ΥIд, не наблюдается типичных связанных с СкА нежелательных явлений, таких как анемия, лейкопения, гирсутизм, тремор и гипертрофический гингивит. Терапия на основе ^104ЕА29ΥIд не ассоциируется с каким-либо повышенным риском инфекций или злокачественных новообразований по сравнению с терапией на основе СкА.

Заключение.

Это 12-месячное исследование демонстрирует, что поддерживающая терапия на основе ^104ЕА29ΥIд позволяет так же эффективно предупреждать АЯ, как и СкА, и обеспечивает жизнеспособность пациента и трансплантата, аналогично СкА. Кроме того, ^104ЕА29ΥIд показывает значительное улучшение почечной функции и снижение САN по сравнению с поддерживающей иммуносупрессии на основе СкА.

^104ЕА29ΥIд безопасен и хорошо переносится и не ассоциируется с типичной связанной с СМ

- 28 013122 токсичностью.

Степени С8ВРАВ и ВРАВ сходны в трех экспериментальных группах, это показывает, что низкие показатели АВ, наблюдаемые при лечении с помощью СбА, также достигаются с помощью Ь104ЕА29У1д. Большинство ВРАВ классифицируется как субклинические, это наводит на мысль, что почечная функция поражена. Количественно более низкая степень АВ в М1 группе, по сравнению с Ь1 группой, означает вероятную зависимость ответа от дозы в случае Ь104ЕА29У1д. Более частая биопсия в Ь104ЕА29У1д группах может, теоретически, привести к сверхдиагностике как острого, так и хронического отторжения в этих группах, заставляя предположить, что преимущества Ь104ЕА29У1д терапии в данном исследовании могут быть заниженными.

Большинство ВРАВ событий происходит в первые три месяца после трансплантации, что не является неожиданным, так как другие исследователи показали, что в раннем пост-трансплантационном периоде требуются повышенные дозы иммунодепрессантов (\У1есек А., Νονίοΐύ М., Коко! Р., ΕίΙζ Е. Аси1е Гайиге оГ 1гап5р1аи1ек к1киеу-ра1йорйу51о1оду, к1адио515 аик ргемепНоп. Апп Тгаи5р1ап1 1996; 1(4): 5-9 и Вейлей \УМ. Ро5йгап5р1аи1 аси!е гепа1 Гайиге. Веп Рай 1997; 19(2): 225-6). Так как большинство этих событий происходит при значениях ниже заданных минимальных величин, следует обратить внимание на изменение схемы в первый месяц лечения до достижения гомеостаза. Большинство ВРАВ, наблюдаемых в поддерживающей фазе, происходит при очень низких или недетектируемых уровнях Ь104ЕА29У1д, это показывает, что заболеваемость АВ в эти периоды связана с недостаточной иммуносупрессией, которой можно избежать, изменяя схему введения доз (схему лечения).

Данное исследование демонстрирует, что лечение Ь104ЕА29У1д дает общие показатели АЕ, аналогичные показателям в случае лечения с помощью СбА, но при меньшем количестве АЕ, связанных с исследуемым лекарством. Никакой реальной разницы в числе связанных с вирусами АЕ в трех экспериментальных группах не идентифицировано.

При наличии низких степеней АВ новой целью поддерживающей иммуносупрессии является снижение отдаленных осложнений, включая гипертензию, гиперлипидемию, токсичность лекарства и предупреждение рубцевания. Как и в случае аутоиммунных заболеваний, появляется новое поколение иммуноселективных поддерживающих иммуносупрессоров. Ингибирование костимуляции Т-клеток путем иммуноселективной блокады костимуляции с помощью Ь104ЕА29У1д представляет собой новую схему, предлагающую перспективу более селективной поддерживающей иммуносупрессии, пониженной токсичности и лучших отдаленных результатов при почечной трансплантации.

Пример 4.

В медицине существует неудовлетворенная необходимость в новых лекарственных препаратах для почечной трансплантации, которые могут обеспечить кратковременную жизнеспособность субъекта и трансплантата, сравнимую с жизнеспособностью в случае лечения СМ, но при отсутствии отдаленных нефротоксических, сердечно-сосудистых и метаболических эффектов. Необходимость в них особенно велика у реципиентов ЕСЭ (доноров расширенными критериями) трансплантатов почек, в этом случае отдаленные степени жизнеспособности субъекта и трансплантата отчетливо ниже, чем в случае реципиентов трансплантатов от доноров, отвечающих стандартным критериям пригодности. Ь104ЕА29У1д, иммуносупрессор с новым механизмом действия, является перспективным не нефротоксическим кандидатом для применения у реципиентов почечных трансплантатов, имеющих ЕСЭ аллотрансплантаты. Так как Ь104ЕА29У1д можно вводить скорее во время приживления, нежели с задержкой, что часто необходимо при применении ί.'ΝΕ особенно в случае аллотрансплантатов с начальной недостаточной почечной функцией, он вызывает иммуносупрессию своевременно и не требует применения препаратов поликлональных антилимфоцитарных антител. Это можно перевести в сравнимые степени острого отторжения с благоприятным профилем безопасности. Так как не ожидается, что Ь104ЕА29У1д будет нефротоксическим, можно найти дополнительные преимущества, связанные со структурой (т.е. САХ) и функцией (т.е. СКФ, СРВ) трансплантата. Наконец, в отличие от ί.'ΝΕ целевой механизм действия Ь104ЕА29У1д должен обеспечить иммуносупрессию при отсутствии вредного воздействия на сердечнососудистый/метаболический профиль. Общая оценка соотношения польза-риск для Ь104ЕА29У1д в этой популяции пациентов приводится ниже.

Изучают две схемы приема лекарственного средства (описанные в примере 3, с небольшой модификацией Ы схемы и применением поддерживающей схемы инфузии каждые 4 недели).

Основные цели.

1) Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СбА, на составную жизнеспособность субъекта и жизнеспособность трансплантата через 12 месяцев.

2) Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СбА, на составную величину измеренной СКФ (СРВ)<60 мл/мин/1.73 м² через 12 месяцев или снижение измеренной величины СКФ (СРВ)> 10 мл/мин/1.73 м² с 3 по 12 месяц.

Цели второго порядка.

1) Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СбА, на измеренную величину СКФ (СРВ) через 12 месяцев.

2) Оценить влияние Ь104ЕА29У!д, по сравнению с СбА, на подтвержденный с помощью биопсии

- 29 013122

СΑN через 12 месяцев.

3) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с ΟΙΑ, на измеренную величину СКФ (ОРК) через 3 месяца и изменения по сравнению с базовой линией (3 месяца) до 12 месяцев.

4) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с С^, на относительное число субъектов с измеренной величиной СКФ (ОРК) < 30 мл/мин/1.73 м² через 12 месяцев.

5) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с С^, на расчетную величину СКФ (ОРК) через 3, 12, 24 и 36 месяцев и изменения по сравнению с базовой линией (3 месяца) до 12, 24 и 36 месяцев.

6) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с ^Α, на РТОМ через 12, 24 и 36 месяцев.

7) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с С^, на показатели гипертензии через 12, 24 и 36 месяцев, включая 8РВ, ПВР, заболеваемость и уровень распространения гипертензии и интенсивность схемы лечения.

8) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с С^, на показатели дислипидемии через 12, 24 и 36 месяцев, включая сывороточные концентрации общего холестерина, холестерина не-ННЬ (ЛПВП), липопротеинов низкой плотности ЕПЬ (ЛПНП) и НПЬ (ЛПВП) и ТО (триглицериды), заболеваемость и распространенность дислипидемии и контролируемой дислипидемии и интенсивность схемы лечения.

9) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с С^, на жизнеспособность субъекта и трансплантата через 24 и 36 месяцев.

10) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с С^, на показатели острого отторжения через 6 месяцев, включая частоту и тяжесть острого отторжения, применение препаратов поликлональных антилимфоцитарных антител для лечения недостаточной почечной функции и прогнозируемой ПОР (отсроченной функции трансплантата), начальное применение терапии, истощающей запас лимфоцитов, для лечения острого отторжения, число случаев резистентного к стероидам острого отторжения, частоту полного выздоровления (8Сг (креатинин сыворотки крови) возвращается к базовой линии) после острого отторжения, частоту субклинического отторжения и частоту всех пролеченных эпизодов острого отторжения независимо от гистологических данных.

11) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с ^Α, на ЦоБ.

12) Оценить общую безопасность Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с ΕΙΑ.

Цели третьего порядка.

1) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с С^, на тангенс угла наклона и отрезок расчетной величины СКФ (ОРК) от базовой линии (3 месяца) до 12, 24 и 36 месяцев.

2) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с С^, на относительное число субъектов с измеренной величиной СКФ (ОРК)<45 мл/мин/1.73 м² через 12 месяцев.

3) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с С^, на относительное число субъектов с расчетной величиной СКФ (ОРК)<75 мл/мин/1.73 м² через 12 месяцев и число субъектов с понижением расчетной СКФ (ОРК) с месяца 3 до месяца 12, по меньшей мере, на 15 мл/мин/1.73 м².

4) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с ^Α, на частоту ПОР.

5) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с С^, на показатели острого отторжения через 12, 24 и 36 месяцев, включая частоту и тяжесть острого отторжения, применение препаратов поликлональных антилимфоцитарных антител для лечения недостаточной почечной функции и прогнозируемой ПОР (отсроченной функции трансплантата), начальное применение терапии, истощающей запас лимфоцитов, для лечения острого отторжения, число случаев резистентного к стероидам острого отторжения, частоту полного выздоровления (8Сг (креатинин сыворотки крови) возвращается к базовой линии) после острого отторжения, частоту субклинического отторжения и частоту всех пролеченных эпизодов острого отторжения независимо от гистологических данных.

6) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с С^, на составную конечную точку (ожидаемый результат) сердечно-сосудистых заболеваний (констатированная смерть от сердечно-сосудистого заболевания, инфаркт миокарда, ишемический удар, обязательная госпитализация по причине сердечнососудистого нарушения и чрескожное коронарное вмешательство) через 12, 24 и 36 месяцев.

7) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с С^, на составную конечную (результат) в случае вазоренальных заболеваний (смерть, потеря трансплантата, несмертельный инфаркт миокарда и удар) через 12, 24 и 36 месяцев.

8) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с С^, в баллах риска по Фрамингамской шкале (в соответствии с РгаттдЬат 81ибу) через 12, 24 и 36 месяцев.

9) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с С^, на частоту прерывания исследования лекарства.

10) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с ^Α, на антитела против человеческих лейкоцитарных антигенов (ΗΕΑ) донора.

11) Оценить влияние Ε104ΕΑ29ΥΙ§, по сравнению с С^, на Сб4 позитивную реакцию в биопсийных образцах.

План (дизайн) исследования.

Продолжительность исследования составляет 3 года с последующим врачебным наблюдением в течение 8 недель для оценки безопасности. В конце 3-годичного периода лечения пациентов могут отби

- 30 013122 рать для длительного расширенного исследования.

Это исследование является рандомизированным, частично открытым, активно контролируемым параллельным исследованием. Эти критерии частично основаны на критериях Службы обеспечения донорскими органами (ϋΝΌδ); они также включают другие признаки, широко используемые для идентификации потенциально аномальных органов, таких как органы доноров с констатированной смертью от сердечного заболевания (ΌΟΩ. отсутствует пульс) или с продолжительным холодно-ишемическим временем (С1Т, время хранения донорского органа до трансплантации).

540 человек произвольно делят на группы (рандомизируют) в соотношении 1:1:1 для лечения либо Ь104ЕА29У1д (М1 схема), Ь104ЕА29У1д (Ы схема) или СкА. При лечении всех пациентов используют индукцию базиликсимабом и основную поддерживающую схему иммуносупрессии из ММЕ и кортикостероидов. Пациенты, произвольно отнесенные к М1 схеме, получают в.в. Б104ЕА29У1д (10 мг/кг) в дни 1 и 5, затем каждые 2 недели до месяца 3 включительно (недели 2, 4, б, 8, 10 и 12), а затем каждые 4 недели до б месяцев (недели 1б, 20 и 24). Через б месяцев пациенты в М1 экспериментальной группе получают поддерживающую дозу Ь104ЕА29У1д 5 мг/кг, которую вводят каждые 4 недели до окончания испытания через 3б месяцев. Пациенты, относящиеся к Ь1 схеме, получают в.в. Б104ЕА29У1д (10 мг/кг) в дни 1 и 5, затем каждые 2 недели до месяца 1 включительно (недели 2 и 4), и каждые 4 недели до 3 месяцев (недели 8 и 12). Через 3 месяца пациенты в Ы экспериментальной группе получают поддерживающую дозу Ь104ЕА29У1д 5 мг/кг, которую вводят каждые 4 недели до окончания испытания через 3б месяцев.

Слепое исследование в группах Ы и М1 сохраняют, используя инфузии плацебо в группе Ы на неделях б и 10. Пациенты, относящиеся к СкА, два раза в день получают дозы, которые спланированы таким образом, чтобы достичь определенной минимальной сывороточной концентрации, соответствующей современной медицинской практике.

Применение препаратов поликлональных антилимфоцитарных антител (Тимоглобина или АТСАМ) допустимо, но не обязательно, для субъектов, относящихся к СкА группе, с недостаточной почечной функцией аллотрансплантата и прогнозируемой ОСЕ (отсроченной функцией трансплантата). Эти агенты широко применяются для обеспечения иммуносупрессии до тех пор, пока не восстановится функция трансплантата для введения СкА. Решение о применении и дозе препарата поликлональных антилимфоцитарных антител в этой ситуации принимает исследователь по своему усмотрению, руководствуясь рекомендациями протокола.

Основные результаты.

Каждую схему с применением Б104ЕА29У1д сравнивают со схемой на основе СкА по следующим основным показателям эффективности: (1) жизнеспособность субъекта и трансплантата через 12 месяцев; (2) измеренная СКФ (СЕК) < б0 мл/мин/1.73 м² через 12 месяцев или снижение измеренной СКФ (СЕК) > 10 мл/мин/1.73 м с 3 до 12 месяца. Т Цель^ю является продемонстрировать не мень^ну^о результа тивность в том, что касается смерти и потери трансплантата, и более высокую эффективность в отношении почечной функции. Жизнеспособность субъекта и трансплантата выбирают в качестве конечной точки (конечного результата), так как эти показатели являются наиболее важными клиническими показателями для реципиентов аллотрансплантата. Хотя потерю трансплантата можно предупредить с помощью эффективной иммуносупрессивной терапии, эта же терапия может повысить риск смерти от инфекции, РТБЭ (посттрансляционного лимфопролиферативного синдрома), злокачественного новообразования, нефротоксичности или сердечно-сосудистого заболевания. Таким образом, целесообразно изучать составную конечную точку жизнеспособности субъекта и трансплантата как суммарный показатель чистой выгоды иммуносупрессивной терапии у реципиентов аллотрансплантата. Дополнительным преимуществом этой составной конечной точки (конечного результата) является то, что ее можно оценивать у всех субъектов без систематической ошибки, вызванной пропуском данных или ошибочной классификацией.

Почечную функцию в качестве конечной точки (конечного результата) выбирают потому, что связь между посттрансплантационной почечной функцией и отдаленным результатом, касающимся состояния почки, неоднократно продемонстрирована в различных сочетаниях. Связь наблюдается вне зависимости от того, определяют почечную функцию через несколько дней после трансплантации, во время выписки из больницы или через б и 12 месяцев после трансплантации. Она наблюдается у реципиентов почки живых или умерших доноров, у реципиентов почки молодых или старых умерших доноров, у реципиентов вторичного трансплантата и у взрослых реципиентов и реципиентов-детей.

Результаты многоцентровых исследований подтверждают важность БСг (сывороточного креатинина) для прогнозирования отдаленной жизнеспособности трансплантата. Зависимость между почечной функцией и отдаленным прогнозом является четкой и воспроизводимой, но не строго линейной. При проверке взрослых реципиентов почечных трансплантатов исследование зависимости между Бег через 1 год и предполагаемого среднего (медианного) периода полужизни трансплантата выявило явную точку перегиба при БСг > 1.5 мг/дл. Аналогично, изучение зависимости между изменением БСг от б месяцев до 1 года (АБСг) и предполагаемым средним (медианным) периодом полужизни трансплантата выявляет

- 31 013122 явную точку перегиба при Д8Сг>0.3 мг/дл. Таким образом, как абсолютный уровень почечной функции через 1 год, так и изменение почечной функции начиная с 6 месяцев (или начиная с аналогичной стабильной, ранней посттрансляционной временной точки) до 1 года подходят для использования в качестве показателей результатов. Наличие нелинейной зависимости между почечной функцией и отдаленным результатом наводит на мысль, что недвусмысленные показатели почечной функции имеют более высокую клиническую значимость, чем одномерную. Пороговые значения >1.5 мг/дл через 1 год для почечной функции и изменение 8Сг>0.3 мг/дл от месяца 6 до 1 года представляются подходящими.

В цитированных выше исследованиях прогностическое значение почечной функции показано с применением 8Сг в качестве маркера. В этих исследованиях, вообще говоря, очень масштабных, используются непосредственные показатели гломерулярной (клубочковой) фильтрации. Ограничения для применения 8Сг в качестве маркера почечной функции общеизвестны. Уровни 8Сг отражают, главным образом, равновесие (баланс) между экскрецией креатинина и эндогенной генерацией креатинина. На последнее может заметно влиять изменение мышечной массы, инфекция, воспаление и применение стероидов, что обычно в популяции, имеющей трансплантаты. Кроме того, почечная экскреция креатинина может осуществляться двумя способами - клубочковой (гломерулярной) фильтрацией и канальцевой секрецией. Действие утраты клубочковой фильтрации на 8Сг обычно маскируется компенсирующим повышением канальцевой секреции, и тем самым снижается полезность повышенного 8Сг как маркера почечной недостаточности. По оценкам 40% больных с пониженной СКФ (СЕК) имеют нормальный или низкий 8Сг. Созданы многочисленные формулы с целью улучшить корреляцию между 8Сг и СКФ (СЕК) с учетом эффекта демографических и биометрических факторов. Уровень согласия между величиной СКФ (СЕК), оцененной по различным формулам, и истинной СКФ, определенной по клиренсу инулина, изучен на 294 реципиентах трансплантата со стабильной почечной функцией. Процентное содержание предсказанных величин СКФ, отличающихся от величины, измеренной по клиренсу инулина, по меньшей мере на 10 мл/мин/1.73 м², находится в интервале от 34% по формуле ЛеИГГе до 53% по формуле ΝαπΚίνе11. Для расчета СКФ в данном исследовании используется формула, предложенная Ьетеу е1 а1. Показано, что эта формула позволяет более точно вычислять СКФ в популяции пациентов, имеющих трансплантата, обеспечивает лучшую корреляцию между вычисленной и измеренной величиной, чем другие формулы, такие как формула №1пкЕ'е11. Учитывая большую разницу между истинной СКФ и расчетной СКФ, для оценки основного результата (основной конечной точки) почечной функции используют клиренс маркера истинной клубочковой фильтрации (приложение 1). СКФ 60 мл/мин/1.73 м² или изменение СКФ по меньшей мере 10 мл/мин/1.73 м² используют в качестве приблизительно равные пороговым значениям 8Сг 1.5 мг/дл или изменению 8Сг по меньшей мере 0.3 мг/дл, общепризнанные в массовых эпидемиологических исследованиях. Переменная составляющая составной конечной точки (результата) оценивается от 3 до 12 месяца, так как посттрансплантационная почечная функция в основном стабильна к 3 месяцу.

Другие показатели.

Ключевые цели второго порядка представляют собой оценку влияния Ь104ЕА29У1д, по сравнению с С§А, на измеренную величину СКФ через 12 месяцев и на подтвержденную хроническую нефропатию аллотрансплантата (САЩ через 12 месяцев. Эти результаты (конечные точки) выделяют из остальных вторичных конечных точек с целью подчеркнуть их важность в оценке Ь104ЕА29У1д. Как обсуждалось выше, массу функционального нефрона и ренальный запас в ЕСЭ почках, по-видимому, следует понизить во время трансплантации в соответствии с характеристиками донора (например, престарелый возраст, одновременная заболеваемость сердечно-сосудистым заболеванием и С1Т), при этом полученные в результате коэффициенты выживаемости пациентов и трансплантатов много ниже этих показателей, наблюдаемых при использовании органов доноров со стандартными критериями. Так как во время приживления трансплантата почечная функция теоретически снижается, возможно, что значительная доля пациентов может отвечать критериям для совместного основного результата (конечной точки) почечной функции во время начала исследования или определения базового значения функции почечного аллотрансплантата. Соответственно, наиболее важной вторичной (второго порядка) целью протокола является оценка влияния Ь104ЕА29У1д, по сравнению с С§А, на разницу измеренной СКФ через 12 месяцев. Этот важнейший вторичный результат позволяет распознавать влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с С§А, вне зависимости от заданной меры изменчивости доноров в этой ЕСЭ популяции. Он также позволяет оценивать почечную функцию в целом и дополнительно подтверждает вывод, что Ь104ЕА29У1д оказывает заметную медицинскую помощь реципиентам почечных трансплантатов. Другой важнейшей вторичной целью является подтвержденная с помощью биопсии САN через 12 месяцев. САN является второй после смерти с функционирующим трансплантатом основной причиной поздней потери почечного аллотрансплантата. Парадоксально, но полагают, что СМ содействуют САN прямым (т.е. непосредственный нефротоксический эффект) и непрямым метаболическими путями (т.е. негативные сердечнососудистые и метаболические эффекты).

Вследствие специфического механизма действия маловероятно, что Ь104ЕА29У1д либо является непосредственно нефротоксическим, либо меняет, негативно изменяет сердечно-сосудистые и метаболические показатели.

- 32 013122

В вышеприведенном примере благоприятные наблюдаемые эффекты заключаются в пониженной частоте заболеваемости САN среди больных, пролеченных ^104ЕА29ΥIд. В нынешнем исследовании установление уменьшение частоты заболеваемости САN в сочетании с улучшением почечной функции подтверждает заключение, что ^104ЕА29ΥIд оказывает значительную медицинскую помощь реципиентам почечного трансплантата. Эффективность ^104ЕА29ΥIд для предупреждения острого отторжения оценивают различными показателями. Эти показатели включают частоту заболеваемости, тяжесть, восприимчивость к лечению и результат. Однако интерпретация этих результатов усложняется имманентными различиями ^104ЕА29ΥIд и СкА. ^104ЕА29ΥIд вводят во время трансплантации, в то время как СкА инициируется, когда есть доказательство возникающей почечной функции. Предполагается, что некоторые пациенты, произвольно отнесенные (рандомизированные) в данном исследовании к СкА, получают препарат поликлональных антилимфоцитарных антител для обеспечения иммуносупрессивной помощи, если начальная почечная функция является недостаточной и предполагается Ό6Ε. Это позволяет предупредить или замаскировать развитие острого отторжения у пациентов, которым дают СкА, и способствуют тому, что результирующий показатель острого отторжения не поддается оценке. Так как у пациентов в ^104ЕА29ΥIд группах, которых лечат с момента трансплантации, в этом нет необходимости, сравнительная оценка острого отторжения неадекватна. Для того чтобы более точно определить эффективность ^104ЕА29ΥIд для предупреждения острого отторжения, будет также сообщено о применении препаратов поликлональных лимфоцитарных антител по данным показаниям в сочетании с другими показателями острого отторжения.

Изучаемая популяция.

Изучаемая популяция включает реципиентов почечных аллотрансплантатов, теоретически субоптимальных по характеристикам донора, методу заготовки, ОТ или другим показателям. Специфические критерии соответствия базируются на расширенных критериях обеспечения донорскими органами υΝΟ3. Приемлемы также реципиенты донорских почек с продолжительным СГТ или от Ό6Ό. В целом иммунологические критерии не играют главной роли в выборе субъекта. Также пригодны субъекты с различными уровнями иммунологического риска. Однако из исследования исключают субъектов с наибольшим иммунологическим риском (позитивная Т-клеточная лимфоцитотоксическая перекрестная проба (кросс-матч тест), панель-реактивные антитела [РЯА]>30% или субъекты, ранее перенесшие трансплантацию). Этим пациентам может потребоваться терапия для снижения нагрузки антител, такая как плазмаферез, который не входит в объем данного протокола. Исследование охватывает пациентов примерно в 90 местах по всему миру.

Основные показатели эффективности (результаты).

1) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на составную жизнеспособность субъекта и жизнеспособность трансплантата через 12 месяцев.

2) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на составную измеренную величину СКФ (6ЕЯ) < 60 мл/мин/1.73 м² через 12 месяцев или снижение измеренной величины СКФ (6ЕЯ) > 10 мл/мин/1.73 м² с 3 по 12 месяц.

Вторичные показатели (результаты).

1) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на измеренную величину СКФ (6ЕЯ) через 12 месяцев.

2) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на подтвержденный с помощью биопсии САN через 12 месяцев.

3) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на измеренную величину СКФ (6ЕЯ) через 3 месяца и изменения по сравнению с базовой линией (3 месяца) до 12 месяцев.

4) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на относительное число субъектов с измеренной величиной СКФ (6ЕЯ) < 30 мл/мин/1.73 м² через 12 месяцев.

5) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на расчетную величину СКФ (6ЕЯ) через 3, 12, 24 и 36 месяцев и изменения по сравнению с базовой линией (3 месяца) до 12, 24 и 36 месяцев.

6) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на РТОМ через 12, 24 и 36 месяцев.

7) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на показатели гипертензии через 12, 24 и 36 месяцев, включая ЗРВ, ОВР, заболеваемость и уровень распространения гипертензии и интенсивность схемы лечения.

8) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на показатели дислипидемии через 12, 24 и 36 месяцев, включая сывороточные концентрации общего холестерина, холестерина не-НЭЬ (ЛПВП), липопротеинов низкой плотности ЬОЬ (ЛПНП) и НОЬ (ЛПВП), и Т6 (триглицериды), заболеваемость и распространенность дислипидемии и контролируемой дислипидемии и интенсивность схемы лечения.

9) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на жизнеспособность субъекта и трансплантата через 24 и 36 месяцев.

10) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на показатели острого отторжения через 6 месяцев, включая частоту и тяжесть острого отторжения, применение препаратов поликлональных антилимфоцитарных антител для лечения недостаточной почечной функции и прогнозируемой Ό6Ε (отсрочен

- 33 013122 ной функции трансплантата), начальное применение терапии, истощающей запас лимфоцитов, для лечения острого отторжения, число случаев резистентного к стероидам острого отторжения, частоту полного выздоровления (8Сг (креатинин сыворотки крови) возвращается к базовой линии) после острого отторжения, частоту субклинического отторжения и частоту всех пролеченных эпизодов острого отторжения независимо от гистологических данных.

11) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на ОоЬ.

12) Общая безопасность ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА.

Результаты третьего порядка.

1) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на тангенс угла наклона и отрезок расчетной величины СКФ (СЕЯ) от базовой линии (3 месяца) до 12, 24 и 36 месяцев

2) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на относительное число субъектов с измеренной величиной СКФ (СЕЯ) < 45 мл/мин/1.73 м² через 12 месяцев.

3) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на относительное число субъектов с расчетной величиной СКФ (СЕЯ) < 75 мл/мин/1.73 м² через 12 месяцев и число субъектов с понижением расчетной СКФ (СЕЯ) с месяца 3 до месяца 12, по меньшей мере, на 15 мл/мин/1.73 м².

4) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на частоту ЭСЕ.

5) Оценить влияние ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на показатели острого отторжения через 12, 24 и 36 месяцев, включая частоту и тяжесть острого отторжения, применение препаратов поликлональных антилимфоцитарных антител для лечения недостаточной почечной функции и прогнозируемой ЭСЕ (отсроченной функции трансплантата), начальное применение терапии, истощающей запас лимфоцитов, для лечения острого отторжения, число случаев резистентного к стероидам острого отторжения, частоту полного выздоровления (8Сг (креатинин сыворотки крови) возвращается к базовой линии) после острого отторжения, частоту субклинического отторжения и частоту всех пролеченных эпизодов острого отторжения независимо от гистологических данных.

6) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на составную конечную точку (ожидаемый результат) сердечно-сосудистых заболеваний (констатированная смерть от сердечно-сосудистого заболевания, инфаркт миокарда, ишемический удар, обязательная госпитализация по причине сердечно-сосудистого нарушения и чрескожное коронарное вмешательство) через 12, 24 и 36 месяцев.

7) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на составную конечную (результат) в случае вазоренальных заболеваний (смерть, потеря трансплантата, несмертельный инфаркт миокарда и удар) через 12, 24 и 36 месяцев.

8) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, по Фрамингамской шкале риска (Егаттдйат 8шбу) через 12, 24 и 36 месяцев.

9) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на частоту прерывания исследования лекарства.

10) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на антитела против человеческих лейкоцитарных антигенов (НЬА) донора.

11) Действие ^104ЕА29ΥIд, по сравнению с СкА, на С64 позитивную реакцию в биопсийных образцах.

Определение потери трансплантата. Потерю трансплантата определяют либо как функциональную потерю, либо как физическую потерю. Функциональную потерю определяют как стабильный уровень 8Сг > 6/0 мг/дл (530 моль/л) по определению в центральной лаборатории в течение > 4 недель или > 56 дней диализа подряд, или такую степень недостаточности почечной функции, что пациент получает второй трансплантат. Все причины потери трансплантата рассматриваются независимым ЕАС.

Определение отсроченной функции трансплантата (ЭСЕ). ЭСЕ определяется как лечение диализом на 8 день исследования (7 день после операции).

Определение хронической нефропатии аллотрансплантата (САЖ Подтвержденная биопсией САN определяется неинформированным главным гистопатологом по критериям международной классификации Вап££ 97 патологии трансплантата почки. Заболеваемость САN определяют, сравнивая все биопсии после дня 1 с базовой (начальной) биопсией, сделанной во время трансплантации. Это сравнение позволяет установить наличие и тяжесть любой доклинической гистопатологии, которую позже можно интерпретировать как САМ

Определение пост-трансплантационного сахарного диабета. РТ^Μ определяется в соответствии с определением, изложенным в последнем кИегпаНопа! Сопкепкик Сшбе1ше.20. Эти критерии суммированы как: а) симптомы диабета плюс случайная концентрация глюкозы в плазме (РС) > 200 мг/дл (11.1 ммоль/л) 0Я; б) содержание глюкозы в плазме натощак (ЕРС) > 26 мг/дл (7.0 ммоль/л) 0Я; в) РС через 2 ч после еды > 200 мг/дл (11.1 ммоль/л) во время перорального теста толерантности к глюкозе; и г) подтверждающий лабораторный тест, основанный на измерении РС венозной крови, следует сделать на другой день при отсутствии явной гипергликемии, сопровождаемой острой метаболической декомпенсацией. В исследовании используется ЕСР для оценки РТ^Μ, однако, если пациентов оценивают этими методами и находят, что они отвечают вышеприведенным критериям, их рассматривают как больных РТ1)\1.

- 34 013122

Определение показателей гипертензии. В данном исследовании гипертензию определяют в соответствии с 8еуеп!й Верой ой !йе Ло1п1 Цайопа1 СоттШее оп 1йе Ргеуепйоп. Ие!есйоп. Еуа1иайоп апб Тгеа!теп! ой Н1дй В1ооб Ргеккиге21 для больных хроническим заболеванием почек. Это определение основано на показателях 8ВР > 130 мм Нд и ОВР > 80 мм Нд. Кроме того. все пациенты с 8ВР < 130 мм Нд и ОВР < 80 мм Нд. получающие антигипертензивный(ые) препарат(ы) или имеющие в анамнезе гипертензию. подпадают под это определение. Коэффициент заболеваемости (заболеваемость) гипертензией определяется как процентное содержание (доля) пациентов. у которых развивается гипертензия после рандомизации и трансплантации. Уровень распространенности определяется как доля пациентов в любой данный момент. отвечающих вышеприведенному определению гипертензии. Контролируемая гипертензия определяется как состояние пациентов. имеющих 8ВР < 130 мм Нд и ОВР < 80 мм Нд. в то же время получающих антигипертензивное лекарственное лечение в связи с гипертензией или получающих антигипертензивное лекарственное лечение по другим показаниям. с гипертензией в анамнезе. Пациенты с 8ВР < 130 мм Нд и ИВР < 80 мм Нд. которым предписано(ы) антигипертензивное(ые) лекарственное(ые) средства по показанию(ям). отличному (отличным) от гипертензии (например. бета-блокаторы для профилактики мигрени). у которых в анамнезе отсутствует гипертензия. не рассматриваются как имеющие гипертензию или контролируемую гипертензию. Интенсивность схемы лечения определяется как общее число антигипертензивных лекарственных средств. используемых для контроля гипертензии. Учитывают все антигипертензивные лекарственные средства. показанные при гипертензии. даваемые пациентам с гипертензией или контролируемой гипертензией. так как антигипертензивный эффект присутствует независимо от показания.

Определение показателей дислипидемии. Дислипидемию определяют в соответствии с последними рекомендациями Цайопа1 К1бпеу Роипбайоп К1бпеу И1кеаке ОиЮотек Оиа1Лу Шйайуе (ΝΙ<Ρ-Ι</ΌΟΟΙ).22. Дислипидемию определяют как гипертриглицеридемию (ТО ε 500 мг/дл [5.65 ммоль/л]). гиперхолистеринемию (ЛПНП (ЬИЬ) ε 100 мг/дл [2.59 ммоль/л]) или повышенный уровень не-ЛПВП (не-НИЬ) (неЛПВП ε 130 мг/дл [3.36 ммоль/л]) при наличии высокого уровня ТО (ТО ε 200 мг/дл [2.26 ммоль/л]). Пациентов с контролируемой дислипидемией в данном исследовании определяют как пациентов. получающих фармакологическую помощь для лечения одного из вышеописанных вариантов дислипидемии. которую успешно лечат. и уровни липидов падают ниже пороговых значений. указанных в предыдущих абзацах. Применение некоторых из этих агентов требует специфических мер предосторожности и/или предупреждений. относящихся к начальной дозе или максимальной рекомендуемой дозе одновременно с применением СкА. который дают при почечной недостаточности. или они могут вызывать изменение РК СкА. Конкретные рекомендации даются в соответствующем вкладыше в упаковку. Любой другой агент (т.е. лечение нестатиновыми препаратами). применяемый в качестве антигиперлипидемического средства. рассматривается как препарат уровня I интенсивности лечения. Сопутствующее применение статина и агента другого класса (например. эзетимиба) повышает уровень интенсивности лечения статином на 1 уровень; следовательно. возможно 5 уровней интенсивности.

Острое отторжение определяется как клинико-патологическое событие. требующее клинических данных и подтверждения биопсии. Биопсия аллотрансплантатов оценивается на наличие и тяжесть острого отторжения не участвующим в эксперименте (неосведомленным. слепым) главным независимым патологом по критериям международной классификации ВапГГ 97 оценки патологии почечного трансплантата. При анализах острого отторжения интерпретация биопсии и ее классификация главным патологом отменяет интерпретацию местного патолога. Биопсии. проводимые в случае предполагаемого острого отторжения. которое не полностью отвечает критериям. но интерпретируется главным патологом как острое отторжение и лечится как острое отторжение. считается острым отторжением. Субклиническое отторжение определяется как гистологические данные главного патолога. согласующиеся с острым отторжением. но не имеющие своего клинического коррелята. Резистентное к стероидам острое отторжение определяется как отсутствие улучшения 8Сг и/или гистологических данных. которое требует применения истощающей лимфоциты терапии после лечения кортикостероидами.

Фрамингамская шкала риска. Эта шкала риска использует данные Ргаттдйат Неай 81ибу23 по оценке риска тяжелого коронарного заболевания сердца (инфаркта миокарда и коронарной смерти) в течение 10 лет. Факторами риска. включенными в этот прогноз. являются возраст. общий холестерин. холестерин ЛПВП. 8ВР. диабет. лечение гипертонии и любое количество сигарет в предыдущем месяце.

Определение объема выборки.

Основной целью является оценить действие Ь104ЕА29У1д на коэффициент выживаемости и почечную функцию через 12 месяцев по сравнению с СкА. 2 совместных основных результата (конечных точки): (1) доля пациентов с прижившимся трансплантатом через 12 месяцев после трансплантации и (2) доля пациентов. величина СКФ у которых через 12 месяцев < 60 мл/мин/1.73 м². и/или у которых измеренная СКФ (ОРВ) понижается > 10 мл/мин/1.73 м² с месяца 3 до месяца 12. Объем выборки 180 человек в экспериментальной группе сообщает величину (ро^ег) 83% данным. показывающим. что верхняя граница 97.3% 2-сторонних С1 для абсолютной разницы (между каждой Ь104ЕА29У1д схемой и СкА схемой) в первом совместном результате (в первой совместной конечной точке) (жизнеспособность (выжи

- 35 013122 ваемость) субъекта и трансплантата) не превышает 10%, если истинный коэффициент выживаемости субъекта и трансплантата через 12 месяцев равен 80% для схемы с С§А и 83% для каждой из 2 схем с ^104ΕΑ29ΥIд. Для конечной точки (показателя) почечной функции объем выборки 180 человек в группе позволяет детектировать снижение на 25% доли субъектов, отвечающих измеренному конечному показателю (в конечной точке) СКФ (СЕК) для каждой из схем с ^104ΕΑ29ΥIд по сравнению со схемой с С§А, при предположении, что 75% пациентов, получающих С§А, отвечают конечному показателю (конечной точке) почечной функции, а 25% включенных в экспериментальную группу выбывают из исследования. В целом 180 человек в экспериментальной группе сообщает, по меньшей мере, величину (ро^ег) 80% детектированию 1 схемы с ^104ΕΑ29ΥIд, которая соответствует обеим совместным основным (первичным) конечным точкам (результатам) с общей Типа Ι ошибкой, контролируемой при уровне значимости 0.05 (критерий Даннета (ЭиппеЦ)).

Критерии включения в исследование.

Целевая популяция.

1) Субъект в первый раз является реципиентом трансплантата почки умершего донора.

2) Донор и/или донорская почка отвечает по меньшей мере 1 из следующих расширенных критериев для донорских органов: а) возраст донора > 60 лет ΟΛ б) возраст донора 50-59 лет и 1 из следующих факторов: (1) инсульт (СУА) + гипертензия + 8Сг (креатинин сыворотки крови) >1.5 мг/дл ΟΛ (и) СУА + гипертензия ΟΛ (ίίί) СУА + 8Сг > 1.5 мг/дл ΟΛ (ίν) гипертензия + 8Сг > 1.5 мг/дл ΟΛ (в) ОТ > 24 ч, возраст донора > 10 лет ΟΛ г) донор после сердечной смерти.

3) Мужчины и женщины в возрасте 18 лет и старше, без исключения.

4) \νΟ СВР (женщины, потенциально способные к деторождению) должны применять эффективный метод контрацепции, чтобы избежать беременности в процессе исследования и вплоть до 8 недели после окончания исследования таким образом, чтобы риск беременности был сведен к минимуму. νΟ СВР включает любую женщину, у которой была первая менструация (менархе) и которая не перенесла успешную хирургическую стерилизацию (гистерэктомию, перевязку маточных труб или билатеральную оофорэктомию) или не находится в периоде менопаузы (определяемой как аменорея в течение > 12 месяцев подряд; или женщины, принимающие препараты заместительной гормональной терапии с документально подтвержденным уровнем фолликулостимулирующего гормона в сыворотке > 35 мМЕд./мл). Даже женщин, которые применяют пероральные, имплантированные или инъецируемые контрацептивные гормоны или механические средства, такие как внутриматочные противозачаточные средства, или барьерные методы (диафрагма, кондомы, спермициды) для предупреждения беременности, или соблюдающих воздержание, или у которых партнер стерилен (например, вазэктомия), следует рассматривать как потенциально способных к деторождению. νΟ СВР должны иметь отрицательный сывороточный тест на беременность (минимальная чувствительность 25 Ед./л или эквивалентные единицы человеческого хорионического гонадотропина [НСС]) в течение 72 ч до начала введения исследуемого лекарственного средства.

5) Мужчины должны использовать эффективный метод контрацепции во время исследования и в течение 8 недель после последней инфузии, чтобы риск беременности у их партнеров был минимален.

Критерии исключения из исследования.

1) νΟ СВР, не желающие или не могущие использовать принятый способ предотвращения беременности в течение всего периода исследования и вплоть до 8 недель после последней инфузии.

2) Беременные женщины или женщины, кормящие грудью.

3) Женщины с положительным тестом на беременность на момент внесения в список участников или перед введением исследуемого лекарства.

4) Мужчины, не желающие или не могущие использовать эффективный способ контрацепции в течение всего периода исследования и вплоть до 8 недель после последней инфузии исследуемого лекарственного средства.

5) Возраст донора < 10 лет.

6) Субъекты с основным почечным заболеванием: а) фокально-сегментарный гломерулосклероз (подтвержденный биопсией); б) типа Ι или ΙΙ мембранопролиферативный гломерулонефрит; в) гемолитический уремический синдром/тромботическая тромбоцитопеническая пурпура.

7) Пациенты с текущим РКА > 30%.

8) Пациенты с позитивной Т-клеточной лимфоцитотоксической перекрестной пробой (кросс-матч тест).

9) Пациенты с перенесенной ранее трансплантацией какого-либо плотного органа (включая почку).

10) Пациенты, одновременно получающие трансплантат плотного органа (сердца, печени, поджелудочной железы) или клеток (островковых, костного мозга, стволовых клеток).

11) Пациенты, получающие парные почки от донора с расширенными критериями (двойной почечный трансплантат).

12) Пациенты с позитивной реакцией на антитела к гепатиту С или с позитивной реакцией на гепатит С, обнаруженной методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

- 36 013122

13) Пациенты с позитивной реакцией на поверхностный антиген гепатита В или с ПЦР-позитивным результатом на гепатит В.

14) Пациенты, диагностированные как ВИЧ (вирус иммунодефицита человека) инфицированные.

15) Пациенты с активной формой туберкулеза (ТВ), которым было необходимо лечение в предыдущие 3 года, или любой пациент, которому ранее требовалась тройная (или более) комбинированная терапия для лечения ТВ. Пациенты с известной позитивной пробой на производное очищенного белка (ΡΡΌ) не подходят для исследования, если они не закончили лечение латентного ТВ и имеют отрицательный рентгеновский снимок грудной клетки во время включения в исследование. ΡΡΌ-тестирование, сделанное в течение последних 12 месяцев, приемлемо, если есть документированная информация о результатах. Пациенты, не имеющие ΡΡΌ в течение последних 12 месяцев, у которых ранее был отрицательный результат, могут быть включены, если у них также на момент включения в исследование имеется отрицательный рентгеновский снимок грудной клетки, отсутствуют симптомы, указывающие на ТВ, отсутствуют контакты с установленным ТВ, в настоящее время они не проживают в зоне, эндемичной по ТВ, не путешествовали в последнее время в зоне, эндемичной по ТВ, или ранее не иммигрировали из зоны, эндемичной по ТВ. ΡΡΌ тест с уплотнением > 10 мм или проба Гифа-Стренидла > 1 у пациентов, не иммунизированных бациллой Кальмета-Герена (не-БЦЖ, не-ВСС), следует рассматривать как положительный тест. Можно применять более консервативные критерии в соответствии с опубликованными рекомендациями и/или местными стандартами, одобренными медицинским обществом.

16) Пациенты с любой активной инфекцией или с другим противопоказанием, который обычно исключает трансплантацию.

17) Субъекты, вероятность продолжительности жизни которых жестко ограничена болезненным состоянием или другим основным медицинским состоянием.

18) Пациенты, имеющие в анамнезе рак (отличающийся от немеланомных раков кожи, которые лечатся локальной резекцией) в течение последних 5 лет.

19) Пациенты, имеющие в анамнезе злоупотребление некоторыми веществами (лекарствами или алкоголем) в последние 5 лет, или имеющие психотические расстройства, не совместимые с эффективным контролем лечения.

20) Пациенты с активной язвой желудка, хронической диареей или желудочно-кишечной мальабсорбцией (нарушение всасывания).

21) Пациенты, у которых результаты анализов в местной лаборатории соответствуют общих критериев токсичности (СТС) ΙΙ степени или выше, могут не принимать участия в исследовании. Однако, некоторые специальные лабораторные показатели, которые являются исключениями СТС ΙΙ степени, могут быть разрешены. Отмечается разрешение в следующих случаях: гематология: гемоглобин может быть ниже СТС ΙΙ степени (но не ниже 8 г/дл). Тромбоциты могут быть ниже СТС ΙΙ степени, но не ниже 80000/мм³ (80х109/л). Общее число лейкоцитов (\УВС) может быть ниже СТС ΙΙ степени (но не ниже 3000/мм³ (3х109/л). Число гранулоцитов и лимфоцитов может быть любым. Химия: величины 3Сг и азота мочевины крови (ВиХ) могут быть любыми. Анализ мочи: результаты анализа мочи могут быть любыми.

22) Все женщины 40 лет или старше и женщины любого возраста, имеющие ближайших (первой степени) родственников с раком молочной железы в анамнезе или с повышенным риском заболевания раком молочной железы, должны иметь скрининг-маммограмму или предоставить результаты маммограммы, проведенной в течение 6 месяцев после включения в исследование. Пациенты, имеющие скрининг-маммограмму с подозрением на злокачественное новообразование, или пациенты, у которых возможность злокачественного новообразования после дополнительных клинических, лабораторных или других диагностических процедур по разумным причинам нельзя исключить, отстраняются от исследования. Если скрининг-маммограмму не сделают в течение 6 месяцев после включения в исследование, но пациент считается подходящим кандидатом на трансплантацию по локальным критериям, базовую маммограмму можно сделать в течение 4 недель после трансплантации.

23) Пациенты с труднодоступными венами для в.в. доступа или имеющие другие причины, которые, возможно, помешают оценке совместной конечной точки (результата) измеренной СКФ (СРВ), или пациенты, малообещающие (например, из-за доклинических показателей свертываемости) или не желающие подвергаться определенной протоколом биопсии трансплантата через 12 месяцев.

24) Пациенты, имеющие в анамнезе истинную аллергию к йодированным рентгеновским контрастным агентам, вводимым в. в.

25) Пациенты, применявшие любое исследовательское лекарство в течение 30 дней перед посещением в день 1.

26) Субъекты, ранее лечившиеся с помощью ^104ΕΑ29ΥIд.

27) Заключенных или субъектов, которых силой (насильно удерживаемые) заставляют лечиться либо от психиатрического, либо от физического (например, инфекционная болезнь) заболевания, не включают в данное исследование.

- 37 013122

Введение ^104ΕА29ΥIд.

День 1 определяется как день трансплантации (день 0 после трансплантации). Инфузию дозы в день 1 следует начинать после того, как хирург сделал начальную интраоперационную оценку и дал заключение, что субъект остается кандидатом на трансплантацию и трансплантация состоится, и перед наложением сосудистых анастомозов. Дозы для инфузии определяют с учетом действительной массы тела субъекта в день 1 и не меняют их в течение исследования, если изменение массы тела равно ± 10%. Исследуемое лекарство следует вводить субъекту примерно с постоянной скоростью в течение 30 мин. Дозы в день 1 и день 5 (день 4 после трансплантации) следует вводить с примерным интервалом 96 ч (± 6 ч).

Интервалы (окна) до следующего посещения и инфузии приводятся ниже. Для пациентов, находящихся на диализе, инфузию ^104ΕА29ΥIд и определение массы тела субъекта следует проводить после диализного лечения.

^104ΕΛ29ΥIд МI схема: пациенты, произвольно отнесенные к МI схеме, получают в.в. ^104ΕА29ΥIд (10 мг/кг) в дни 1 и 5, затем каждые 2 недели до месяца 3 включительно (недели 2, 4, 6, 8, 10 и 12), а затем каждые 4 недели до 6 месяцев (недели 16, 20 и 24). Через 6 месяцев пациенты в МI экспериментальной группе получают поддерживающую дозу ^104ΕА29ΥIд 5 мг/кг каждые 4 недели до окончания испытания через 36 месяцев.

^104ΕА29ΥIд Ы схема: пациенты, относящиеся к Ы схеме, получают в.в. ^104ΕА29ΥIд (10 мг/кг) в дни 1 и 5, затем через неделю 2 раза (недели 2 и 4), и затем каждые 4 недели в течение 2 месяцев (недели 8 и 12). Через 3 месяца пациенты в Ы экспериментальной группе получают поддерживающую дозу ^104ΕА29ΥIд 5 мг/кг, которую вводят каждые 4 недели до окончания испытания через 36 месяцев, слепой метод в И и МI группе сохраняется при использовании 2 инфузий плацебо в Ы экспериментальной группе. Таким образом, пациентам, произвольно отнесенным к Ы схеме, вводят инфузии плацебо (декстроза 5% в воде для инъекций [Ό5ν]) на неделях 6 и 10.

Введение циклоспорина СяА.

Суточную дозу СяА следует вводить в виде 2 раздельных доз по схеме в зависимости от времени дня и приема пищи. В дни посещений в процессе исследования пациент не должен принимать утреннюю дозу СяА до тех пор, пока не будет взята проба для определения минимального (впадина) уровня СяА в крови. В дни посещений для исследования, когда надо провести стандартный мониторинг ВР и/или измерить величину СКФ, эти показатели определяют до приема дозы СяА. Начальная суточная доза должна составлять 7±3 мг/кг (т.е. 4-10 мг/кг). Следующие дозы следует корректировать так, чтобы поддерживать определенные заранее минимальные сывороточные концентрации: 1-й месяц: целевой уровень 15300 нг/мл. После 1-го месяца: целевой уровень 15-300 нг/мл. Мониторинг уровней СяА по концентрации в плазме через 2 ч после введения дозы (С2) не следует использовать в данном исследовании. Хотя в недавнем международном согласованном отчете об исследовании действия Неорала с помощью С2 отдано предпочтение С2 мониторингу, в нем также четко говорится об отсутствии данных, касающихся отдаленного действия на почечную функцию, заболеваемость САN и общий профиль безопасности, ассоциированный с С2 мониторингом. Кроме того, не все пациенты подходят для С2 мониторинга, включая пациентов с диабетом, замедленным опорожнением желудка или пациентов, принимающих сопутствующее лекарственное средство, которое изменяет клиренс СяА. Кроме того, низкие уровни С2 могут являться результатом либо истинного низкого всасывания (при котором дозу СяА следует увеличить), либо замедленного всасывания (при котором наблюдается замедленная максимальная концентрация в плазме, а повышение дозы может вызвать токсичность). Наконец, это действие не является универсальным, и проверка этого применения входит в объем настоящего протокола. Остальную информацию о предписании см. во вкладыше в упаковку. Прием СяА всем пациентам следует начинать на день 7. Если исследователь полагает, что не в интересах пациента начинать прием СяА (например, вследствие недостаточной почечной функции) и вместо этого выбирает для применения не участвующий в исследовании препарат (например, сиролимус), это следует рассматривать как прерывание исследуемого лечения.

Пациенты с немедленной функцией аллотрансплантата.

Пациентам, произвольно отнесенным к группе, пролечиваемой с помощью СяА первую дозу следует вводить как только, но не ранее чем адекватная функция трансплантата станет очевидной. Адекватная функция определяется как снижение 8Сг, по меньшей мере, на 1 мг/дл по сравнению с начальной величиной после трансплантации или в случае диуреза > 250 мл через 12 ч (или ранее) после трансплантации.

Пациенты с недостаточной (нарушенной) функцией почечного аллотрансплантата и с прогнозируемой ЭСР (отсроченной функцией трансплантата).

Пациенты с недостаточной (нарушенной) функцией трансплантата после операции и прогнозируемой ЭСР могут, но не обязательно, получать препарат поликлональных антилимфоцитарных антител. Вне зависимости от того, получает ли пациент препарат поликлональных антилимфоцитарных антител или нет, прием СяА следует начинать, когда имеется доказательство восстановления функции аллотрансплантата (определяемой выше) или на день 7.

Кортикостероиды.

Всем участникам исследования ежедневно дают кортикостероиды.

- 38 013122

Схема поддерживающей стероидной терапии с постепенно снижающейся дозой

День трансплантации (день 1): метилпреднизолон (в виде сукцината натрия) 500 мг в.в. при поступлении в операционную (ОВ).

День 2: метилпреднизолон (в виде сукцината натрия) 250 мг в.в.

День 3: преднизон (или преднизолон) 100 мг перорально (п.о.).

Со дня 4 до дня 14 (т. е. до конца недели 2): постепенное снижение дозы преднизона (или преднизолона) до 20-30 мг п.о. ежедневно.

Со дня 15 по 6 месяц: постепенное снижение дозы преднизона (или преднизолона) не ниже чем 2.5 мг п. о. ежедневно.

Пациенты могут продолжать получать ежедневно по меньшей мере 2.5 мг п.о. ежедневно до окончания 3-го года.

Первые 2 дозы (день 1 исследования, день трансплантации, и день 2 исследования, день 1 после операции) следует вводить в.в. Остальные дозы следует вводить п.о. Однако разрешено в.в. введение эквивалентной дозы метилпреднизолона в тех случаях, когда невозможно пероральное введение доз. Такими причинами для более предпочтительного в.в. способа введения доз по сравнению с п.о. является интеркуррентное заболевание, послеоперационная непроходимость кишечника или другие причины по усмотрению исследователя. При отсутствии метилпреднизолона разрешается в.в. применение другого кортикостероида в дозе, эквивалентной дозе метилпреднизолона.

Дозировка микофенолята мофетила.

Всех пациентов в данном исследовании лечат с помощью ММЕ. ММЕ следует давать ежедневно в виде 2 раздельных доз по схеме в зависимости от времени дня и приема пищи. Суточная доза составляет 2 г; однако по усмотрению исследователя афроамериканцам можно давать 3 г ежедневно. ММЕ следует вводить п.о. При необходимости допускается в.в. введение эквивалентной дозы в случае интеркуррентного заболевания, послеоперационной непроходимости кишечника или по другим причинам по усмотрению исследователя. Первую дозу следует давать перед операцией. Следующие дозы следует давать п.о., как только пациент сможет переносить прием препаратов через рот. Дозу и схему можно корректировать с учетом лабораторных данных (например, пониженные ЦИС) и толерантности пациента (см. ниже). Подробные сведения о предписании даны во вкладыше в упаковку.

В том случае, если у пациентов появляются тошнота, диарея или другие обусловленные ММЕ побочные явления в желудочно-кишечном тракте (например, симптомы подробно изучены и признано, что их причиной является непереносимость ММЕ), дозу ММЕ можно снизить до максимальной переносимой дозы. Если у пациентов развивается нейтропения (число нейтрофилов < 1.3х10³/мл), введение ММЕ следует прекратить или снизить дозу в соответствии с вкладышем в упаковку.

Дозировка базиликсимаба.

Всем пациентам в данном исследовании дают базиликсимаб по рекомендуемой схеме. Базиликсимаб следует вводить только в периферическую или центральную вену. Восстановленный базиликсимаб (20 мг в 5 мл) следует развести до объема 50 мл нормальным физиологическим раствором или 5% декстрозой и вводить в виде в.в. инфузии в течение 20-30 мин. Первую дозу 20 мг следует вводить в день 1 (день трансплантации; день 0 после операции). Пациентам, получающим Ь104ЕА2^<Ю1д, эту первую инфузию базиликсимаба следует вводить как можно быстрее по завершении инфузии Е104ЕА2^<Ю1д. Вторую дозу 20 мг следует давать на 5 день (день 4 после операции). Вторую дозу базиликсимаба пациентам не следует вводить, если они получали или ожидается, что они будут получать лечение, истощающее запас лимфоцитов. Подробные сведения о предписании даны во вкладыше в упаковку.

Препараты поликлональных антилимфоцитарных антител при недостаточной функции почечного аллотрансплантата и прогнозируемой ИСЕ.

Применение препаратов поликлональных антилимфоцитарных антител (Тимоглобин и АТСАМ) разрешено, но не обязательно, для пациентов в СкА группе с недостаточной функцией почечного трансплантата и прогнозируемой ИСЕ после трансплантации. Применение других препаратов поликлональных антилимфоцитарных антител или поликлональных антитимоцитарных глобулинов разрешено в регионах, в которых существует разрешение на продажу, и если они показаны для лечения острого отторжения при почечной трансплантации. Следует отметить, что ОКТ3 не следует использовать для этой цели, но можно использовать для лечения острого отторжения Степени II или выше по критериям международной классификации Вапкк 97 или резистентного к стероидам острого отторжения. Применение СатраЛ 1-Н® (алемтузумаб) по данному протоколу не разрешается, и он не показан для применения при трансплантации почки. Эти агенты широко используются с целью обеспечить иммуносупрессию до тех пор, пока функция трансплантата позволит ввести СкА. Таким образом, препараты поликлональных лимфоцитарных антител можно использовать в таком наборе (сочетании), по усмотрению исследователя, у пациентов, которые отвечают > 1 из следующих признаков, имеющихся при наличии артерии и вены заявляемого трансплантата и при отсутствии, по данным сонограммы, гидронефроза: а) диурез < 250 мл/12 ч, б) нет заметного улучшения (< 1 мг/дл) величины 8Сг по сравнению с базовой линией в течение первых 24-72 ч после трансплантации, в) диализное лечение. Применение этих агентов при не

- 39 013122 достаточной функции почечного аллотрансплантата и прогнозируемой ЭСЕ не разрешено у пациентов, получающих Ь104ЕА29У1д.

Дозировка сульфаметоксазола/триметоприма.

Все участники данного исследования, у которых нет противопоказаний, должны профилактически получать сульфаметоксазол/триметоприм для предупреждения инфекций мочевых путей и инфекции Рпеитосукйк саппл. Дозировку и введение следует определять по уровню почечной функции в соответствии с вкладышем в упаковку. Пациенты с противопоказаниями или не переносящие серосодержащих лекарств или триметоприма, могут получать профилактическое лечение в виде ингаляции пентамидина по усмотрению исследователя. Подробные сведения о предписании даны во вкладышах в упаковку.

Дозировка валганцикловира/ганцикловира, ацикловира/валацикловира.

Всех реципиентов, у которых нет противопоказаний против валганцикловира, ганцикловира, ацикловира и валацикловира, следует пролечить этими лекарствами для предупреждения инфекций СМУ и Негрек к1тр1ех. Ниже дается руководство для дозировки и длительности профилактического лечения:

Профилактика в течение первых 10 дней после трансплантации или в течение терапии, истощающей запас Т клеток.

Все пациенты с трансплантатом получают валганоцикловир или ганцикловир по протоколу в течение 10 дней после операции. При терапии, при которой происходит истощение запаса Т клеток, для индукционной терапии или лечения острого отторжения пациент получает валганоцикловир или ганцикловир в продолжение терапии, истощающей запас Т клеток. Если пациента выписывают раньше, чем пройдет 10 дней, он начинает получать валганоцикловир, ганцикловир, валацикловир или ацикловир перорально с учетом СМУ иммунного статуса, описанного выше.

Валганоцикловир для профилактики.

Клиренс креатинина > 60 мл/мин, доза 900 мг ежедневно; клиренс креатинина 40-59 мл/мин, доза 450 мг ежедневно; клиренс креатинина < 40 мл/мин, доза 450 мг через день.

Ганоцикловир для профилактики.

Если пациент не может переносить пероральный прием лекарств, или валганцикловир не пригоден для применения, можно его заменит на суспензию или капсулы ганцикловира. Клиренс креатинина > 70 мл/мин, доза 1 г 3 раза в день ежедневно; клиренс креатинина 50-69 мл/мин, доза 500 мг 3 раза в день ежедневно; клиренс креатинина 25-49 мл/мин, доза 500 мг 2 раза в день ежедневно; клиренс креатинина 10-24 мл/мин, доза 500 мг ежедневно; клиренс креатинина < 10 мл/мин, доза 500 мг после гемодиализа 3 раза в неделю. Если требуется ганцикловир в.в. (внутривенно) см. дозировку во вкладыше в упаковку.

Профилактика после 10 после трансплантации по меньшей мере до 3 месяцев. СМУсеропозитивный донор для СМУ-серонегативного реципиента. Продолжают лечение валганоцикловиром или ганцикловиром по указанному выше протоколу в течение > 3 месяцев.

СМУ-серопозитивный или серонегативный донор для СМУ-серопозитивного реципиента. Пероральный прием ацикловира в течение > 3 месяцев после трансплантации. Сывороточный креатинин > 50 мл/мин, доза 800 мг перорально 4 раза в день ежедневно; сывороточный креатинин 25-49 мл/мин, доза 800 мг перорально 3 раза в день ежедневно; сывороточный креатинин 11-24 мл/мин, доза 800 мг перорально дважды в день ежедневно; сывороточный креатинин < 10 мл/мин, доза 800 мг перорально ежедневно; на гемодиализе, доза 800 мг ежедневно после гемодиализа.

Для удобства пациента ацикловир во время выписки можно заменить на валацикловир. Сывороточный креатинин > 50 мл/мин, доза 500 мг перорально 2 раза в день ежедневно; сывороточный креатинин 25-49 мл/мин, доза 500 мг перорально ежедневно; сывороточный креатинин 11-24 мл/мин, доза 500 мг перорально ежедневно; сывороточный креатинин < 10 мл/мин, доза 250 мг перорально ежедневно; на гемодиализе, доза 250 мг ежедневно после гемодиализа.

СМУ-серонегативный донор для СМУ-серонегативного реципиента. Протокол с пероральным приемом ацикловира, необходимого только для профилактики герпеса: продолжают в течение > 3 месяцев после трансплантации. Ацикловир 400 мг п. о. дважды в день ежедневно или, для удобства, в момент выписки вместо ацикловира можно назначать валацикловир. Подробные сведения о предписании даны во вкладышах в упаковку.

Посещения только для инфузии.

а) Лечение пациентов, произвольно отнесенных к Ь104ЕА29У1д группам: перед введением Ь104ЕА29У1д требуется отрицательный тест на беременность. При определении дозы следует учитывать массу тела в момент самого последнего предыдущего визита. Следует проводить мониторинг основных показателей жизнедеятельности пациента (до и после инфузии) и оценивать АЕ (НЯ, нежелательные явления). Во время некоторых посещений могут потребоваться образцы РК.

б) Для пациентов, отнесенных к группе СкА: с пациентами контактируют только для оценки АЕ. Этот визит может быть контактом по телефону и может осуществляться в промежуток времени, установленный для определенного посещения.

Интервалы (окна) между посещениями.

а) Для пациентов, отнесенных к группам Ь104ЕА29У1д: дозы в дни 1 и 5 следует вводить с разни

- 40 013122 цей в 96 ч (±6 ч). Для упрощения схемы визитов только для инфузии с целью введения последующих доз разрешены следующие интервалы: посещение на неделе 2, день, намеченный через интервал между посещениями, ±2 дня; посещение на неделе 4 - месяц 6, день, намеченный через интервал между посещениями, ±3 дня; посещение в месяце 7 - месяце 36, день, намеченный через интервал между посещениями, ±5 дней; посещение в последующие 8 недель, день, намеченный через интервал между посещениями ±5 дней.

б) Для пациентов, отнесенных к группе СкА: после дня 5 от пациентов требуется посещать клинику на неделях 2, 4, 8 и 12; затем каждое посещение с 3-месячным интервалом. В промежутки между 3месячными посещениями (т.е. на неделях 6, 10, 16, 20, 28, 32 и т.д.) для сбора сведений об АЕ контакты осуществляют по телефону. Посещения клиники и контакты по телефону происходят в тот же самый промежуток времени, который определен для пациентов, относящихся к группам Ь104ЕА29У1д. Запланированные (намеченные) дни для оценки СФК (СЕЕ) через 3 и 12 месяцев неделя 12±14 дней и неделя 52±14 дней. В некоторых обстоятельствах и в случае предварительного одобрения медицинского контроля вместо измерения величины СФК через 3 месяца и через 12 месяцев его можно проводить через 6 месяцев и через 15 месяцев соответственно. Такие причины, которые могут служить основанием для отсрочки определения измеренной величины СКФ, включают наличие параллельного (одновременного) эпизода острого отторжения или необходимость повторить определение по техническим причинам.

Намеченный день для биопсии трансплантата через 12 месяцев неделя 52±14 дней. Аналогично, в некоторых обстоятельствах и в случае предварительного одобрения медицинского контроля биопсию аллотрансплантата можно проводить через 15 месяцев. Такие причины, которые могут служить основанием для отсрочки биопсии трансплантата, включают необходимость во временной антикоагуляционной терапии.

Пример 5.

Специалист в данной области техники может применять схему введения, описанную в примере 4, для проведения исследования на другой популяции, с другими критериями и/или целями. Например, в этом исследовании трансплантата можно оценивать пациентов, получающих трансплантат почки живого донора или умершего донора с ожидаемым холодно-ишемическим временем < 24 ч. Подходят пациенты с различными уровнями иммунологического риска. Однако из исследования исключаются субъекты с наивысшим иммунологическим риском. Пациентов произвольно делят на М1, Ь1 и СкА группы, как описано в примере 4.

Основные цели.

Оценить действие Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на составной показатель выживаемости (жизнеспособности) пациента и трансплантата через 12 месяцев. Оценить действие Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на составную (результирующую) измеренную величину СКФ (СЕЕ) < 60 мл/мин/1.73 м² через 12 месяцев или снижение измеренной величины СКФ (СЕЕ) > 10 мл/мин/1.73 м² с 3 по 12 месяц. Оценить действие Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на частоту острого отторжения трансплантата через 12 месяцев.

Цели второго порядка.

1) Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на измеренную величину СКФ (СЕЕ) через 12 месяцев. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на подтвержденный с помощью биопсии САИ через 12 месяцев. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на отдельные компоненты основной составной конечной точки измеренной величины СКФ (СЕЕ) < 60 мл/мин/1.73 м² через 12 месяцев или снижения измеренной величины СКФ (СЕЕ) > 10 мл/мин/1.73 м² с 3 по 12 месяц. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на тройную составную конечную точку: смерть, потеря трансплантата и острое отторжение через 12, 24 и 36 месяцев. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на долю (относительное число) пациентов с измеренной величиной СКФ (СЕЕ) < 60 мл/мин/1.73 м² через 24 месяца. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на измеренную величину СКФ (СЕЕ) через 3 и 24 месяца и изменения по сравнению с базовой линией (3 месяца) до 12 месяцев и до 24 месяцев. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на относительное число пациентов с измеренной величиной СКФ (СЕЕ) < 30 мл/мин/1.73 м² через 12 месяцев и через 24 месяца. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на расчетную величину СКФ (СЕЕ) через 6, 12, 24 и 36 месяцев и изменения с 6 месяцев до 12, 24 и 36 месяцев. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на РТОМ через 12, 24 и 36 месяцев. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на показатели гипертензии через 12, 24 и 36 месяцев, включая ЗРВ, ОВР, заболеваемость и уровень распространения гипертензии контролируемой гипертензии и интенсивность схемы лечения. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на показатели дислипидемии через 12, 24 и 36 месяцев, включая сывороточные концентрации общего холестерина, холестерина не-НОЬ (ЛПВП), липопротеинов низкой плотности (ЬВЬ, ЛПНП) и НОЬ (ЛПВП), и ТС (триглицериды), заболеваемость и распространенность дислипидемии и контролируемой дислипидемии и интенсивность схемы лечения. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на жизнеспособность субъекта и трансплантата через 24 и 36 месяцев. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на долю (относительное число) паци

- 41 013122 ентов с расчетной величиной СКФ (СЕК) < б0 мл/мин/1.73 м² через 24 месяца и через 3б месяцев. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на показатели острого отторжения через б, 12, 24 и 3б месяцев, включая частоту и тяжесть острого отторжения, применение препаратов поликлональных антилимфоцитарных антител для лечения недостаточной почечной функции и прогнозируемой ОСЕ (отсроченной функции трансплантата), начальное применение терапии, истощающей запас лимфоцитов, для лечения острого отторжения, число случаев резистентного к стероидам острого отторжения, частоту полного выздоровления (БСг (креатинин сыворотки крови) возвращается к базовой линии) после острого отторжения, частоту субклинического отторжения и частоту всех пролеченных эпизодов острого отторжения, независимо от гистологических данных, и время до начала острого отторжения. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на ОоБ. Оценить общую безопасность Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на тангенс угла наклона и отрезок расчетной величины СКФ (СЕК) с 3 месяцев до 12, 24 и 3б месяцев. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на долю (относительное число) пациентов с измеренной величиной СКФ (СЕК) < б0 мл/мин/1.73 м² через 12 месяцев или относительное число пациентов с понижением расчетной СКФ (СЕК) с месяца 3 до месяца 12, по меньшей мере, на 10 мл/мин/1.73 м². Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на частоту ОСЕ. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на относительное число (долю) пациентов в стадии 1-стадии 5 хронического почечного заболевания через 12 и 24 месяцев по величине измеренной СКФ (СЕК). Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на относительное число (долю) пациентов в стадии 1-стадии 5 хронического почечного заболевания через 3б месяцев по величине расчетной СКФ (СЕК). Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на составную конечную точку (ожидаемый результат) сердечно-сосудистых заболеваний (констатированная смерть от сердечно-сосудистого заболевания, инфаркт миокарда, ишемический удар и методы реваскуляризации [хирургические или чрескожные]) до 12, 24 и 3б месяцев. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на составную конечную (результат) точку в случае вазоренальных заболеваний (смерть, потеря трансплантата, несмертельный инфаркт миокарда и удар) до 12, 24 и 3б месяцев. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, по Фрамингамской шкале риска (в соответствии с Егатшдйат Бшбу) через 12, 24 и 3б месяцев. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на частоту прерывания исследования лекарства. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на антитела против человеческих лейкоцитарных антигенов (НЬА) донора. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на ангиотензин ΙΙ типа 1 (АТ1)-рецепторные антитела. Оценить влияние Ь104ЕА29У1д, по сравнению с СкА, на С64 позитивную реакцию в биопсийных образцах.

План (дизайн) исследования.

Продолжительность исследования составляет 3 года с последующим врачебным наблюдением в течение 8 недель для оценки безопасности. Это исследование является рандомизированным, частично открытым (частично слепым), активно контролируемым параллельным исследованием. Все пациенты получают почечный трансплантат от живого донора или умершего донора с ожидаемым С1Т (время хранения донорского органа до трансплантации) < 24 ч.

Около бб0 человек произвольно делят на группы (рандомизируют) в соотношении 1: 1: 1 для лечения либо Ь104ЕА29У1д (М1 схема), Ь104ЕА29У1д (Ы схема) или СкА. При лечении всех пациентов используют индукцию базиликсимабом и основную поддерживающую схему иммуносупрессии из ММЕ и кортикостероидов. Пациенты, произвольно отнесенные к М1 схеме, получают в.в. Ь104ЕА29У1д (10 мг/кг) в дни 1 и 5, затем каждые 2 недели до месяца 3 включительно (недели 2, 4, б, 8, 10 и 12), а затем каждые 4 недели до б месяцев (недели 1б, 20 и 24). Через б месяцев пациенты в М1 экспериментальной группе получают поддерживающую дозу Ь104ЕА29У1д 5 мг/кг, которую вводят каждые 4 недели до окончания испытания через 3б месяцев. Пациенты, относящиеся к Ы схеме, получают в.в. Ь104ЕА29У1д (10 мг/кг) в дни 1 и 5, затем каждые 2 недели до месяца 1 включительно (недели 2 и 4), и каждые 4 недели до 3 месяцев (недели 8 и 12). Через 3 месяца пациенты в Ь1 экспериментальной группе получают поддерживающую дозу Ь104ЕА29У1д 5 мг/кг, которую вводят каждые 4 недели до окончания испытания через 3б месяцев. Слепое исследование в группах Ы и М1 сохраняют, используя инфузии плацебо в группе Ь1 на неделях б и 10. Пациенты, относящиеся к СкА группе, два раза в день получают дозы, которые спланированы таким образом, чтобы достичь определенного интервала минимальной сывороточной концентрации, соответствующей современной медицинской практике. Безопасность и эффективность Ь104ЕА29У1д оценивают в 1, 2 и 3 год. Независимые ЭБМВ (Комитет по мониторингу данных безопасности) постоянно рассматривают данные исследований и, при необходимости, дают рекомендации для изменения проведения испытания.

Изучаемая популяция.

Изучаемая в исследовании популяция включает реципиентов почечных аллотрансплантатов от живых или умерших доноров с предполагаемым С1Т < 24 ч. В целом иммунологические критерии не играют главной роли в выборе субъекта. Подходят субъекты с различными уровнями иммунологического риска. Однако из исследования исключают субъектов с наибольшим иммунологическим риском (позитивная Т-клеточная лимфоцитотоксическая перекрестная проба (кросс-матч тест), панель-реактивные антитела [РКА] > 50%, или субъекты, ранее перенесшие трансплантацию). Этим пациентам может по

- 42 013122 требоваться терапия для снижения нагрузки антител, такая как плазмаферез, который не входит в объем данного протокола. Исследование охватывает пациентов примерно в 100 местах по всему миру.

Критерии включения в исследование.

Целевая популяция: 1) субъект является реципиентом трансплантата почки живого донора или умершего донора с прогнозируемым С1Т < 24 ч; 2) мужчины и женщины в возрасте 18 лет и старше, без исключения. 3) \УО СВР (женщины, потенциально способные к деторождению) должны применять эффективный метод контрацепции, чтобы избежать беременности в процессе исследования и вплоть до 8 недели после окончания исследования таким образом, чтобы риск беременности был сведен к минимуму. \УО СВР включает любую женщину, у которой была первая менструация (менархе) и которая не перенесла успешную хирургическую стерилизацию (гистерэктомию, перевязку маточных труб или билатеральную оофорэктомию) или не находится в периоде менопаузы (определяемой как аменорея в течение 12 месяцев подряд; или женщины, принимающие препараты заместительной гормональной терапии [НВТ] с документально подтвержденным уровнем фолликулостимулирующего гормона [Р8Н] в сыворотке > 35 мМЕд./мл). Даже женщин, которые применяют пероральные, имплантированные или инъецируемые контрацептивные гормоны или механические средства, такие как внутриматочные противозачаточные средства, или барьерные методы (диафрагма, кондомы, спермициды) для предупреждения беременности, или соблюдающих воздержание, или у которых партнер стерилен (например, вазэктомия), следует рассматривать как потенциально способных к деторождению. \УО СВР должны иметь отрицательный сывороточный тест на беременность (минимальная чувствительность 25 Ед./л или эквивалентные единицы человеческого хорионического гонадотропина [НСС]) в течение 72 ч до начала введения исследуемого лекарственного средства.

Критерии исключения из исследования.

1) \УО СВР, не желающие или не могущие использовать принятый способ предотвращения беременности в течение всего периода исследования и вплоть до 8 недель после последней инфузии. 2) Беременные женщины или женщины, кормящие грудью. 3) Женщины с положительным тестом на беременность на момент внесения в список участников или перед введением исследуемого лекарства. 4) Генетически идентичные пары донор-реципиента (т.е. идентичные близнецы). 5) Возраст донора < 10 лет. 6) Субъекты, получающие донорский орган с расширенными критериями, определяемый показателями: а) возраст донора > 60 лет ОВ; б) возраст донора 50-59 лет и 1 из следующих обстоятельств: (ί) инсульт (СУА) + гипертензия + 8Сг (креатинин сыворотки крови) > 1.5 мг/дл ОВ; (и) СУА + гипертензия ОВ; (ίίί) СУА + 8Сг > 1.5 мг/дл ОВ; (ίν) гипертензия + 8Сг > 1.5 мг/дл ОВ; (в) прогнозируемое С1Т > 24 ч, ОВ; г) донор с остановкой сердца (сердечная смерть, донор, у которого нет пульса). 7) Субъекты с основным почечным заболеванием: а) первичный фокально-сегментарный гломерулосклероз; б) типа I или II мембранопролиферативный гломерулонефрит; в) гемолитический уремический синдром (Ни8)/синдром тромботической тромбоцитопенической пурпуры. Если у больного Е8ВЭ неизвестной этиологии и/или отсутствует гистологически подтвержденный диагноз, его можно включить в исследование, если только отсутствуют клинические признаки или симптомы, согласующиеся с диагнозом первичный фокальносегментарный гломерулосклероз, типа I или II мембранопролиферативный гломерулонефрит или Ни8, на усмотрение исследователя. 8) Пациенты, подвергающиеся первичной (в первый раз) трансплантации с текущим значением РВА > 50%, или пациенты, подвергающиеся ретрансплантации с РВА > 30%. 9) Пациенты с произошедшей ранее потерей трансплантата вследствие острого отторжения. 10) Пациенты с позитивной Т-клеточной лимфоцитотоксической перекрестной пробой (кросс-матч тест). 11) Пациенты с перенесенной ранее трансплантацией какого-либо плотного органа, отличного от почки (пациенты, подвергающиеся ретрансплантации почки, рассматриваются на пригодность к участию в исследовании по соответствию другим критериям), или пациенты, подвергающиеся трансплантации нескольких органов (например, почка-поджелудочная железа), или пациенты, которым исследователь предполагает сделать трансплантацию второго плотного органа или клеток (например, трансплантацию поджелудочной железы или островковых клеток) в последующие 3 года. 12) Пациенты, одновременно получающие трансплантат плотного органа (сердца, печени, поджелудочной железы) или клеток (островковых, костного мозга, стволовых клеток). 13) Пациенты, получающие парные почки от донора с расширенными критериями (двойной или еп Ь1оск почечный трансплантат). 14) Пациенты с позитивной реакцией на антитела к гепатиту С или с позитивной реакцией на гепатит С, обнаруженной методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). 15) Пациенты с позитивной реакцией на поверхностный антиген гепатита В или с ПЦРпозитивным результатом на гепатит В. 16) Пациенты, диагностированные как ВИЧ (вирус иммунодефицита человека)-инфицированные. 17) Пациенты с активной формой туберкулеза (ТВ), которым было необходимо лечение в предыдущие 3 года, или любой пациент, которому ранее требовалась тройная (или более) комбинированная терапия для лечения ТВ. Пациенты с известной позитивной пробой на производное очищенного белка (РРЭ) не подходят для исследования, если они не закончили лечение латентно го ТВ и не имеют отрицательного рентгеновского снимка грудной клетки ко времени включения в исследование. РРО-тестирование, сделанное в течение последних 12 месяцев, приемлемо, если есть документированная информация о результатах. Пациенты, не имеющие РРЭ в течение последних 12 месяцев,

- 43 013122 у которых ранее был отрицательный результат, могут быть включены, если у них также на момент включения в исследование имеется отрицательный рентгеновский снимок грудной клетки, отсутствуют симптомы, указывающие на ТВ, отсутствуют контакты с установленным ТВ, в настоящее время они не проживают в зоне, эндемичной по ТВ, не путешествовали в последнее время в зоне, эндемичной по ТВ, или ранее не иммигрировали из зоны, эндемичной по ТВ. РРЭ тест с уплотнением > 10 мм или проба ГифаСтренидла > 1 у пациентов, не иммунизированных бациллой Кальмета-Герена (не-БЦЖ, не-ВСО), следует рассматривать как положительный тест. Можно применять более консервативные критерии в соответствии с опубликованными рекомендациями и/или местными стандартами, одобренными медицинским обществом. 18) Пациенты с любой активной инфекцией или с другим противопоказанием, который обычно исключает трансплантацию. 19) Субъекты, вероятность продолжительности жизни которых жестко ограничена болезненным состоянием или другим основным медицинским состоянием. 20) Пациенты, имеющие в анамнезе рак (отличающийся от немеланомных раков кожи, которые лечатся локальной резекцией) в течение последних 5 лет. 21) Пациенты, имеющие в анамнезе злоупотребление некоторыми веществами (лекарствами или алкоголем) в последние 5 лет, или имеющие психотические расстройства, не совместимые с эффективным контролем лечения. 22) Пациенты с активной язвой желудка, хронической диареей или желудочно-кишечной мальабсорбцией (нарушение всасывания).

Введение и интервалы (окна) между посещениями для схем Ε104ΕΑ29ΥΙ§ МI и ΕΙ и С^, включая требуемый перечень, описаны выше и в примере 4.

Как очевидно для специалистов в данной области техники, к которой относится изобретение, настоящее изобретение может быть воплощено в формах, отличных от тех, которые раскрываются выше, не отходя от сущности и основных признаков изобретения. Таким образом, конкретные варианты изобретения, описанные выше, следует рассматривать как иллюстративные, но не ограничивающие. Объем настоящего изобретения скорее представлен в прилагаемой формуле изобретения, нежели ограничивается примерами, содержащимися в вышеприведенном описании.

Claims (28)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ лечения иммунного нарушения, связанного с пересадкой трансплантата, заключающийся во введении субъекту на ранней фазе от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации, первоначально более частом, чем раз в месяц, эффективной дозы мутантного СТ^Α4, содержащего внеклеточный домен СТ^Α4, показанный в 8ЕЦ ΙΌ N0: 8, начиная с аланина в положении 26 или метионина в положении 27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении 150, или его функциональный участок, причем во внеклеточном домене или его участке аланин в положении 55 заменен на тирозин, а лейцин в положении 130 заменен на глутаминовую кислоту, причем схема введения на ранней фазе включает введение мутантного СТ^Α4 в день 1, при посещении на неделе 2, при посещении на неделе 4, при посещении на неделе 8 и при посещении на неделе 12 в дозе от 5 до 20 мг/мл, и способ дополнительно включает схему поддерживающей фазы, которая начинается после окончания схемы ранней фазы и на которой мутантный СТ^Α4 вводят не чаще чем раз в месяц в дозе от 0,2 до 3 мг/мл.
2. 2. Способ лечения иммунного нарушения, связанного с пересадкой трансплантата, заключающийся во введении субъекту на ранней фазе от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации, первоначально более частом, чем раз в месяц, эффективной дозы мутантного СТ^Α4, содержащего:

   (а) аминокислотную последовательность начиная с метионина в положении 27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении 150 8ЕЦ ΙΌ N0: 4, или (б) аминокислотную последовательность начиная с аланина в положении 26 и кончая аспарагиновой кислотой в положении 150 8ЕЦ ΙΌ N0: 4;

   причем схема введения на ранней фазе включает введение мутантного СТ^Α4 в день 1, при посещении на неделе 2, при посещении на неделе 4, при посещении на неделе 8 и при посещении на неделе 12 в дозе от 5 до 20 мг/мл, и способ дополнительно включает схему поддерживающей фазы, которая начинается после окончания схемы ранней фазы и на которой мутантный СТ^Α4 вводят не чаще чем раз в месяц в дозе от 0,2 до 3 мг/мл.
3. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что схема введения на ранней фазе включает введение мутантного СТ^Α4 в день 5.
4. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что схема введения на ранней фазе включает введение мутантного СТ^Α4 при посещении на неделе 6, при посещении на неделе 10, при посещении в месяце 4, при посещении в месяце 5 и при посещении в месяце 6.
5. 5. Способ по п.3 или 4, отличающийся тем, что эффективная доза мутантного СТ^Α4 в период ранней фазы составляет около 10 мг/кг массы пациента.
6. 6. Способ по п.3 или 4, отличающийся тем, что эффективная доза мутантного СТ^Α4 в период поддерживающей фазы составляет около 5 мг/кг массы пациента.
7. 7. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что эффективная доза мутантного СТ^Α4 составляет около 10 мг/кг массы пациента со схемой введения, включающей введение в дни 1, 15, 29, 57, 85, а затем 5 мг/кг ежемесячно.

   - 44 013122
8. 8. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что эффективная доза мутантного СТЬА4 составляет около 10 мг/кг массы пациента со схемой введения, включающей введение в дни 1, 5, 15, 29, 57, 85, а затем 5 мг/кг ежемесячно.
9. 9. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что эффективная доза мутантного СТЬА4 составляет около 10 мг/кг массы пациента со схемой введения, включающей введение в дни 1, 5, 15, 29, 43, 57, 71, 85, 113, 141, 169, а затем 5 мг/кг ежемесячно.
10. 10. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что иммунные нарушения, связанные с пересадкой трансплантата, включают отторжение трансплантата плотного органа, ткани и/или клеток.
11. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что иммунные нарушения, связанные с пересадкой трансплантата, включают отторжение почечного трансплантата.
12. 12. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что мутантный СТЬА4 дополнительно содержит аминокислотную последовательность, которая изменяет растворимость, аффинность и/или валентность растворимого мутантного СТЬА4.
13. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность, которая изменяет растворимость, аффинность и/или валентность, содержит иммуноглобулиновый фрагмент.
14. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что иммуноглобулиновый фрагмент представляет собой константную область иммуноглобулина или ее участок.
15. 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что константная область иммуноглобулина или ее участок мутирует с целью снижения эффекторной функции.
16. 16. Способ по п.14, отличающийся тем, что константная область иммуноглобулина или ее участок содержит шарнирную область, СН2 и СН3 области человеческого иммуноглобулина или иммуноглобулинов обезьян.
17. 17. Способ по п.15, отличающийся тем, что константная область иммуноглобулина или ее участок содержит шарнирную, СН2 и СН3 области человеческого иммуноглобулина или иммуноглобулинов обезьян.
18. 18. Способ по п.13, отличающийся тем, что иммуноглобулин содержит аминокислотную последовательность, которая начинается с глутаминовой кислоты в положении +152 и кончается лизином в положении +383, как показано в 3Εφ ΙΌ N0: 4.
19. 19. Способ по п.1 или 2, при котором мутантный СТЬА4 дополнительно включает соединительный аминокислотный остаток и иммуноглобулин, причем соединительный аминокислотный остаток локализован между аминокислотной последовательностью, которая заканчивается аспарагиновой кислотой в положении +150, и иммуноглобулином.
20. 20. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что мутантный СТЬА4 вводят совместно по меньшей мере с одним из агентов, выбранных из группы, состоящей из базиликсимаба, даклизумаба, антитимоцитарного глобулина, ингибиторов кальциневрина, циклоспорина, такролимуса, микофенолята мофетила, микофенольной кислоты, рапамицина, азатиоприна, муромонаба, ритуксимаба, сиролимуса, эверолимуса, ΡΊΎ720, РК778, .Так-3, сентикана, кортикостероидов, бета-метазона, будезонида, кортизола, кортизона, дексаметазона, гидрокортизона, метилпреднизолона, преднизолона, преднизона и триамцинолона.
21. 21. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что развитие и/или прогрессирование последствия, выбранного из группы, состоящей из СА^ гиперлипидемии, гипертензии, диабета, гирсутизма, алопеции, гипертрофического гингивита, тремора, нейротоксичности и остеопороза, замедляется.
22. 22. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что минимальная сывороточная концентрация мутантного СТЬА4 составляет примерно 3-30 мкг/мл.
23. 23. Способ лечения иммунного нарушения, связанного с пересадкой трансплантата, заключающийся во введении субъекту на ранней фазе от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации, первоначально более частом, чем раз в месяц, эффективной дозы мутантного СТЬА4, содержащего:

    (а) аминокислотную последовательность начиная с метионина в положении 27 и кончая лизином в положении +357 или глицином в положении +356 на фиг. 7, или (б) аминокислотную последовательность начиная с аланина в положении 26 и кончая лизином в положении +357 или глицином в положении +356 на фиг. 7, причем схема введения на ранней фазе включает введение мутантного СТЬА4 в день 1, при посещении на неделе 2, при посещении на неделе 4, при посещении на неделе 8 и при посещении на неделе 12 в дозе от 5 до 20 мг/мл, и способ дополнительно включает схему поддерживающей фазы, которая начинается после окончания схемы ранней фазы и на которой мутантный СТЬА4 вводят не чаще чем раз в месяц в дозе от 0,2 до 3 мг/мл.
24. 24. Способ по пп.1, 2 или 23, отличающийся тем, что мутантный СТЬА4 вводят совместно, одновременно или последовательно, с агентами, представляющими собой базиликсимаб или ΜΜΡ.
25. 25. Способ по пп.1, 2 или 23, отличающийся тем, что мутантный СТЬА4 вводят совместно, одновременно или последовательно, с агентами, представляющими собой даклизумаб или сиролимус.
26. 26. Мутантный СТЬА4, содержащий внеклеточный домен СТЬА4, показанный в 3Εφ ΙΌ N0: 8, начиная с аланина в положении 26 или метионина в положении 27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении 150, или его функциональный участок, причем во внеклеточном домене или его участке аланин

    - 45 013122 в положении 55 заменен на тирозин, а лейцин в положении 130 заменен на глутаминовую кислоту, для лечения иммунного нарушения, связанного с пересадкой трансплантата у субъекта, который является реципиентом с расширенными критериями и/или который получает трансплантат от доноров, отвечающих расширенным критериям.
27. 27. Мутантный СТЬА4 по п.26, где расширенные критерии включают один или более из следующих: возраст 10 лет и моложе или 60 лет и более; донор после остановки сердца; ожидаемое время хранения донорского органа до трансплантации более или равно 24 ч; субъекты, которым делают трансплантацию в первый раз, с текущим ΡΚЛ > 50%, или, в случае ретрансплантации, с ΡΚЛ > 30%; субъекты, у которых произошла утрата прежнего трансплантата вследствие острого отторжения в течение первых 6 месяцев после трансплантации; субъекты с позитивной Т-клеточной лимфоцитотоксической перекрестной пробой при использовании лимфоцитов донора и сыворотки реципиента; субъекты с ВИЧинфекцией; субъекты с активной формой туберкулеза, требующего лечения в течение предыдущих 3 лет.
28. 28. Мутантный СТЬА4 по п.26, где расширенные критерии для донорских органов включают по меньшей мере один из следующих критериев: а) возраст донора 60 лет и более, б) возраст донора 50-59 лет и одно из следующих обстоятельств: (1) инсульт (СУА) + гипертензия + 8Сг (креатинин сыворотки крови) > 1.5 мг/дл, (ϋ) СУА + гипертензия, или (ш) СУА + 8Сг > 1.5 мг/дл, или (ιν) гипертензия + 8Сг > 1.5 мг/дл, в) СГГ > 24 ч, возраст донора более 10 лет, г) донор с остановкой сердца.