CN107441480A - 多肽及其作为用于治疗多发性硬化、类风湿性关节炎以及其他自身免疫病症的药物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种蛋白C1ORF32以及其变体以及片段以及其融合蛋白，以及其用于免疫疗法和药物开发的方法，包括但不局限于作为免疫调节剂以及用于免疫疗法，包括用于自身免疫病症。

Description

多肽及其作为用于治疗多发性硬化、类风湿性关节炎以及其 他自身免疫病症的药物的用途
本申请是申请日为2011年6月30日申请号为201180038162.9发明名称为“多肽及其作为用于治疗多发性硬化、类风湿性关节炎以及其他自身免疫病症的药物的用途”的申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及一种新颖蛋白，以及其变体、片段以及融合蛋白，以及将其用于免疫疗法和药物开发的方法。
发明背景
诱导免疫耐受性已经长时间被认为是自身免疫疾病疗法的“圣杯”。免疫系统具有针对入侵病原体保护宿主，但同时防止对于自身抗原的不想要的反应所导致的损害的彼此相反的任务。后一部分被称为免疫耐受性并且通过调节免疫应答的一组复杂的相互作用的并且互补的通路来进行。T细胞具有与自身以及非自身的各种抗原起反应的能力。因此，现存许多天然地存在以便消除潜在自身反应性应答的机制-这被称为天然耐受性。消除潜在自身反应性T细胞的主要机制在胸腺中出现并且被称为中心耐受性。一些潜在自身反应性T细胞逃避中心耐受性，并且因此还存在多种周围耐受性机制。尽管存在这些机制，一些自身反应性T细胞可能‘逃避’并且以集合状态(repertoire)存在；据信它们的活化可以导致自身免疫疾病。
对于治疗耐受性的研究已经尝试诱导并且扩大有效的生理性耐受机制以便消除或中和自身反应性T细胞并且预防或治疗自身免疫疾病。诱导耐受性的一种方法是通过操纵共刺激配体与抗原呈递细胞(APC)以及淋巴细胞上的受体之间的相互作用。
CTLA-4是下调免疫应答的最广泛研究的共刺激分子。免疫抑制品质以及能够诱导耐受性的属性使它被公认为用于自身免疫介导的炎症病症的潜在免疫治疗剂。阿巴西普(Abatacept；商品名称：奥瑞希纳(Orencia))是由与hIgG1的Fc片段融合的CTLA-4的ECD(细胞外域)组成的融合蛋白。据信阿巴西普可通过有效地干扰炎症级联来诱导共刺激阻断，它已经被批准用于治疗患有类风湿性关节炎的患者。
用当前疗法来诱导疾病控制，随后在重新建立免疫耐受性的同时逐渐撤药，可能在未来成为用于自身免疫疗法的有吸引力的方法。此外，由于它们的免疫特异性，在不存在整体免疫抑制的情况下，这类疗法对于长期使用应是安全的。
多发性硬化(MS)是中枢神经系统(CNS)的一种慢性、炎症性、脱髓鞘性病症，它涉及对于髓磷脂抗原的自身免疫应答。它的特征在于CNS内的病变并且脱髓鞘是这些病变的关键特征。自身反应性T细胞被认为引起针对CNS髓磷脂组分的自身免疫应答。这些自身免疫反应的主要目标被认为是髓磷脂碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)以及髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，一种通过用佐剂中的髓磷脂组分进行免疫接种来诱导的MS动物模型，展示了可比较的神经元病变。不希望受单一假设限制，EAE中的研究提供了特异性针对自身抗原的T细胞介导这些疾病中的病变的令人信服的证据。
T辅助1型(Th1)细胞由IL-12诱导并且产生IFN-γ，而T辅助2型(Th2)细胞分泌IL-4、IL-5以及IL-13。Th1细胞可以介导促炎症性或细胞介导性免疫应答，而Th2细胞主要促进某些类型的体液免疫。一些免疫相关疾病，例如自身免疫反应、炎症、慢性感染以及败血症的特征在于免疫系统的促炎症性相对于抗炎症性倾向的失调，连同Th1相对于Th2细胞因子平衡的失衡。在炎症期间，诱导从Th1到Th2的平衡转变通过减少免疫系统的炎症性倾向来保护有机体免受Th1/促炎症性细胞因子的全身性‘过调节(overshooting)’。与Th1到Th2免疫转变相关的免疫调节疗法在多种Th1介导的自身免疫疾病，例如多发性硬化以及类风湿性关节炎中具有保护性作用。例如，在包括MS的若干自身免疫疾病的动物模型中已经证明了功效的拉喹莫德(Laquinimod)展示出通过Th1/Th2转变实现的免疫调节作用，并且不导致免疫抑制。乙酸格拉替雷(Glatiramer acetate；克帕松(Copaxone))也诱导Th1/Th2转变，同时减少促炎症细胞因子的分泌，而增加抗炎症细胞因子的分泌。此外，乙酸格拉替雷特异性Th2细胞能够迁移越过血脑屏障并且引起自身攻击性Th1 T细胞的原位旁观者抑制(bystander suppression)。
某些免疫细胞以及免疫细胞信号转导通路是用于治疗免疫病症的新药剂的有希望的靶点。例如Th1、Th17、Th2以及调控T细胞(Treg)在调节自身免疫性以及炎症中发挥重要作用。来自许多研究的越来越多的证据显示，这些免疫细胞在多种病症，例如类风湿性关节炎、炎症性肠病、多发性硬化、牛皮癣、红斑狼疮、1型糖尿病以及葡萄膜炎中的重要性。大多数现有疗法一次只靶向一个通路。
发明简要概述
背景技术未能提供靶向在自身免疫性以及炎症中所涉及的多个细胞以及通路的疗法，这些细胞例如Th1、Th17、Th22、Th2、Treg或者分泌或影响其他细胞分泌炎症分子的其他细胞，这些炎症分子例如细胞因子、金属蛋白酶、趋化因子以及其他分子。
本发明关于新颖蛋白，以及其变体、片段以及融合蛋白，以及将其用于免疫疗法和药物开发的方法，包括但不局限于治疗免疫相关疾病的方法。
如在此使用，术语“免疫相关疾病”包括以下疾病的如下列出类型以及亚型的任何一种：多发性硬化、类风湿性关节炎、I型糖尿病、牛皮癣、全身红斑狼疮、炎症性肠病、葡萄膜炎或舍格伦氏综合征(Sjogren′s syndrome)。
如在此使用，“多发性硬化”包括以下一种或多种：多发性硬化、良性多发性硬化、复发缓解性多发性硬化、继发性进行性多发性硬化、原发性进行性多发性硬化、进行性复发性多发性硬化、慢性进行性多发性硬化、过渡性/进行性多发性硬化、快速恶化性多发性硬化、临床确诊的多发性硬化、恶性多发性硬化(又称为马尔堡变种(Marburg′s Variant))，以及急性多发性硬化。任选地，“与多发性硬化有关的病状”包括例如德维克氏病(Devic′sdisease)，又称为视神经脊髓炎；急性散播性脑脊髓炎、急性脱髓鞘性视神经炎、脱髓鞘横贯性脊髓炎、米勒-费歇尔综合征(Miller-Fisher syndrome)、脑脊髓神经根神经病变、急性脱髓鞘多神经病、肿胀性多发性硬化以及Balo同心圆性硬化。
如在此使用，“类风湿性关节炎”包括以下一种或多种：类风湿性关节炎、痛风以及假性痛风、幼年特发性关节炎、幼年类风湿性关节炎、斯提耳氏病(Still′s disease)、强直性脊柱炎、类风湿性脉管炎。任选地，与类风湿性关节炎有关的病状包括例如骨关节炎、肉状瘤病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、脓毒性关节炎、血色病、肝炎、脉管炎、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener′sgranulomatosis)、莱姆氏病(Lyme disease)、家族性地中海热、具有回归热的高免疫球蛋白血症D、TNF受体相关周期性综合征，以及与炎症性肠病相关的肠病性关节炎。
如在此使用，“葡萄膜炎”包括以下一种或多种：葡萄膜炎、前葡萄膜炎(或虹膜睫状体炎)、中间葡萄膜炎(扁平部睫状体炎)、后葡萄膜炎(或脉络膜视网膜炎)以及全葡萄膜炎形式。
如在此使用，“炎症性肠病”包括以下一种或多种：炎症性肠病、克罗恩氏病(Crohn′s disease)、溃疡性结肠炎(UC)、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、贝切特氏病(Behcet′s disease)、未确定的结肠炎。
如在此使用，“牛皮癣”包括以下一种或多种：牛皮癣；非脓疱性牛皮癣，包括寻常性牛皮癣以及牛皮癣性红皮症(红皮性牛皮癣)；脓疱性牛皮癣，包括泛发性脓疱性牛皮癣(宗布什脓疱性牛皮癣(pustular psoriasis of von Zumbusch))、掌跖脓疱病(永久性掌跖脓疱病、理发师类型的脓疱性牛皮癣(pustular psoriasis of the Barber type)、四肢脓疱性牛皮癣)、环状脓疱性牛皮癣、持续性肢端皮炎、疱疹样脓疱病。任选地，与牛皮癣有关的病状包括例如药物诱导的牛皮癣、皮褶牛皮癣、尿布区牛皮癣、脂溢性皮炎样牛皮癣、滴状牛皮癣、指甲牛皮癣、牛皮癣性关节炎。
如在此使用，“1型糖尿病”包括以下一种或多种：1型糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病、特发性糖尿病、幼年1型糖尿病、青春晚期糖尿病、成人隐匿性自身免疫性糖尿病、妊娠糖尿病。与1型糖尿病有关的病状包括：神经病变，包括多神经病变、单神经病变、周围神经病变以及自主神经病变；眼睛并发症：青光眼、白内障、视网膜病。
如在此使用，“舍格伦氏综合征”包括以下一种或多种：舍格伦氏综合征、原发性舍格伦氏综合征以及继发性舍格伦氏综合征，以及与舍格伦氏综合征有关的病状，包括结缔组织疾病，例如类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮或硬皮病。其他并发症包括肺炎，肺纤维化，间质性肾炎，肾脏过滤器周围组织的炎症，肾小球性肾炎，肾小管性酸中毒，腕管综合征，周围神经病变，颅神经病变，原发性胆汁性肝硬变(PBC)，肝硬化，食道、胃、胰腺以及肝脏的炎症(包括肝炎)，多肌炎，雷诺氏现象(Raynaud′s phenomenon)，脉管炎，自身免疫甲状腺问题，淋巴瘤。
如在此使用，“全身性红斑狼疮”包括以下一种或多种：全身性红斑狼疮、盘状狼疮、狼疮性关节炎、狼疮性肺炎、狼疮性肾炎。与全身性红斑狼疮有关的病状包括骨关节结核、抗磷脂抗体综合征、心脏各个部分的炎症(例如心包炎、心肌炎以及心内膜炎)、肺以及胸膜炎症、胸膜炎、胸膜腔积液、慢性弥散性间质性肺病、肺动脉高压、肺栓塞、肺出血，以及肺萎缩综合征、狼疮性头痛、格-巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)、无菌性脑膜炎、脱髓鞘性综合征、单神经病变、多发性单神经炎、重症肌无力、脊髓病变、颅神经病变、多神经病变、脉管炎。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是C1ORF32多肽，任选地被提供为含有C1ORF32多肽的融合蛋白。C1ORF32融合多肽任选地具有直接或间接地经由肽连接物序列或化学连接物融合在一起的第一融合伴侣与第二融合伴侣：该第一融合伴侣包括C1ORF32可溶性多肽的全部或一部分，或包括H19011_1_P8(SEQ ID号：4)、H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)、H19011_1_P9(SEQ ID号：6)或H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)的细胞外域的全部或一部分的多肽或与它同源的序列，该第二融合伴侣由异源序列(对应地非C1ORF32)组成。
根据至少一些实施方案，分离的多肽与包括H19011_1_P8(SEQ ID号：4)、H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)、H19011_1_P9(SEQ ID号：6)或H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)的细胞外域的全部或一部分的多肽至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。根据至少一些实施方案，与包括H19011_1_P8(SEQ ID号：4)、H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)、H19011_1_P9(SEQ ID号：6)或H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)的细胞外域的全部或一部分的多肽至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的分离的多肽具有如在此描述的(例如在实例1中)至少一种SNP变化。C1ORF32多肽可为任何物种来源。在进一步的实施方案中，C1ORF32多肽为鼠科、非人灵长类动物或人类来源。
不希望受单一假设限制，根据至少一些实施方案，C1ORF32融合蛋白抑制Th1、Th17、Th22或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的炎症活性，这些炎症分子包括但不局限于IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP。再次不希望受单一假设限制，根据至少一些实施方案，C1ORF32融合蛋白还可增加Treg的抑制能力或Th2细胞的免疫调节活性。C1ORF32融合蛋白还可增加抗炎症分子，例如细胞因子IL-10的产生。
根据至少一些实施方案，C1ORF32融合蛋白可任选地包括C1ORF32的完全细胞外域(ECD)或其片段或同源物。在一个实施方案中，C1ORF32多肽为全长C1ORF32 ECD的可溶性片段。这类片段任选地包括保持结合至其天然受体的能力并且合并有C1ORF32多肽的细胞外域的部分或全部、并且缺乏细胞内和/或跨膜域的部分或全部的那些片段。在一个实施方案中，C1ORF32多肽片段包括C1ORF32多肽的整个细胞外域。在其他实施方案中，C1ORF32多肽的可溶性片段是保持C1ORF32生物活性的细胞外域的片段。
C1ORF32多肽细胞外域可包括来自跨膜域的1、2、3、4、5或更多个连续氨基酸，和/或来自信号序列的1、2、3、4、5或更多个连续氨基酸。可替代地，该细胞外域可有1、2、3、4、5、或更多个连续氨基酸被从C-末端、N-末端或这两个末端去除。还可使用C1ORF32多肽的生物活性变体和/或同源物及其片段。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是包括如在此描述的分离的C1ORF32多肽的融合蛋白用于治疗免疫相关病症的用途，该融合蛋白任选地在包括药学上可接受的稀释剂或载体的药用组合物中。
在一个实施方案中，C1ORF32多肽可任选地被融合至Ig重链恒定区的一个或多个域，该恒定区优选地具有与人免疫球蛋白Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4链的铰链，CH2以及CH3区或与鼠免疫球蛋白Cγ2a链的铰链，CH2以及CH3区对应的氨基酸序列。
这些融合蛋白可任选地二聚化或多聚化以便形成同源二聚体、异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体。二聚/多聚伴侣可在平行或反平行方向上安排。任选地，融合蛋白具有在SEQ ID号：8、22、23、38、29中的任何一个中阐明的序列。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是一种药用组合物，该药用组合物包括能够抑制T细胞活化的一种分离的可溶性C1ORF32多肽、或其片段或变体或同源物，或含有它们的融合蛋白，以及药学上可接受的稀释剂或载体。任选地，该药用组合物包括含有H19011_1_P8(SEQ ID号：4)、H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)、H19011_1_P9(SEQ ID号：6)或H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)的细胞外域的可溶性C1ORF32多肽或其片段，以及药学上可接受的稀释剂或载体。根据本发明的至少一些实施方案，提供的是一种药用组合物，该药用组合物包括一种分离的可溶性C1ORF32多肽、或片段或变体或同源物或含有它们的融合蛋白，以及药学上可接受的稀释剂或载体，该药用组合物被适配用于通过以下途径中的任何一个或多个来治疗炎症：抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的分化；抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的活性；抑制或减少Th1和/或Th17通路；抑制或减少Th1和/或Th17通路，同时促进Th2通路/活性/分化；抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的炎症分子产生和/或分泌；抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的增殖；与Treg相互作用；增强Treg活性；增强Treg的IL-10分泌；增加Treg数量；增加Treg的抑制能力；与Th2细胞相互作用；增强Th2活性，增强Th2细胞的免疫调节能力，增加Th2细胞数，增强Th2细胞的IL-4、IL-5或IL-10产生；或其组合。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是一种药用组合物，该药用组合物包括一种分离的可溶性C1ORF32多肽、片段、变体或同源物或含有它们的融合蛋白或偶联物，以及药学上可接受的稀释剂或载体，该药用组合物被适配用于治疗免疫相关病症。
在一个实施方案中但是不希望受单一假设限制，C1ORF32多肽或含有它们的融合蛋白或药用组合物增强Treg对于免疫系统的抑制活性。Treg可抑制通过Th1、Th17、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌。在一个实施方案中，C1ORF32多肽或含有它们的融合蛋白或药用组合物增强Treg对于初始T细胞的抑制活性以便抑制或减少初始T细胞分化成Th1、Th17、Th22细胞并且从而减少受试者中的Th1、Th17、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的数量，这些炎症分子包括但不局限于IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP。
在一个实施方案中，C1ORF32多肽或含有它们的融合蛋白或药用组合物增强Th2免疫应答活性或增加Th2细胞数。Th2细胞可调节Th1、Th17、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌，从而导致Th1和/或Th17应答的抑制，以及经由Th1/Th2转变的免疫调节。在一个实施方案中，C1ORF32多肽或含有它们的融合蛋白或药用组合物增强Th2对于初始T细胞的免疫调节活性以便抑制或减少初始T细胞分化成Th1、Th17、Th22细胞并且从而减少受试者的Th1、Th17、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的数量，这些炎症分子包括但不局限于IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP。在一个实施方案中，C1ORF32多肽或含有它们的融合蛋白或药用组合物促进或增强Th2细胞的IL-4、IL-5或IL-10产生。任选地，该组合物是用于治疗免疫相关病症。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是以下各项的用途：一种分离的可溶性C1ORF32多肽、或片段或变体或同源物或含有它们的融合蛋白或偶联物，或包括H19011_1_P8(SEQ ID号：4)、H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)、H19011_1_P9(SEQ ID号：6)或H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)的细胞外域的多肽、或其片段或变体或同源物或含有它们的融合蛋白或偶联物，或含有前述任一种的药用组合物，上述各项被适配用于治疗免疫相关病症。
任选地，该多肽包含与以下各项具有至少95％序列一致性的氨基酸残基的序列：与在SEQ ID号：14中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的氨基酸残基21-186、或与在SEQ ID号：35中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)的残基21-186、或与在SEQ ID号：15中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9(SEQ ID号：6)的残基21-169、或与在SEQ ID号：36中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)的残基21-169、或与在SEQ ID号：37中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的残基1-184、或与在SEQ ID号：19中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011_1_P8_V1(SEQID号：5)的残基1-184、或与在SEQ ID号：28中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9(SEQID号：6)的残基1-169、或与在SEQ ID号：30中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)的残基1-169，或其片段或变体或同源物，这些序列被适配用于治疗免疫相关病症。任选地，该多肽附接至一个可检测的或治疗的部分上。
根据至少一个实施方案，提供的是通过向受试者给予有效量的一种可溶性C1ORF32多肽、其片段、变体、同源物、融合蛋白或偶联物、或其药用组合物来抑制或减少受试者中中中的表位扩展的方法。进一步的实施方案提供给予有效量的可溶性C1ORF32多肽、其片段、变体、同源物、融合蛋白或偶联物或其药用组合物以便抑制或减少患有免疫相关病症的患者的表位扩展的方法。
C1ORF32多肽、其片段、变体、同源物、融合蛋白和/或偶联物可结合一种或多种另外治疗剂来给予，这些另外治疗剂包括但不局限于，针对其他淋巴细胞表面标记(例如CD40、α-4整联蛋白)或针对细胞因子的抗体；其他融合蛋白，例如CTLA4-Ig(贝拉西普(belatacept))、TNFR-IgTNF-α阻断剂，例如英利昔单抗(Remicade)、赛妥珠单抗(Cimzia)以及阿达木单抗(Humira)；CD73-Ig；环磷酰胺(CTX)(即 RevimmuneTM)；甲氨喋呤(MTX)(即 )；贝利木单抗(belimumab；即)；那他珠单抗(Tysabri)或其他免疫抑制药物、抗增殖药物、细胞毒性剂、或可有助于免疫抑制的其他化合物。
在一个实施方案中，该额外治疗剂靶向免疫活化中涉及到的不同通路。在一个进一步的实施方案中，该另外治疗剂是一种CTLA-4融合蛋白，例如CTLA-4Ig(阿巴西普(abatacept))。在一个进一步的实施方案中，该额外治疗剂是一种被称为贝拉西普的CTLA4-Ig融合蛋白，它含有在体内显著地增加其对于CD86的亲合力的两个氨基酸取代(L104E以及A29Y)。
在另一个实施方案中，第二治疗剂是环磷酰胺(CTX)。在一个进一步的实施方案中，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白与CTX是以治疗慢性自身免疫疾病或病症，例如全身性红斑狼疮(SLE)的有效量共同给予的。
在另一个实施方案中，第二治疗剂是甲氨喋呤(MTX)。在一个进一步的实施方案中，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白与MTX是以治疗慢性自身免疫疾病或病症，例如类风湿性关节炎(RA)的有效量共同给予的。在另一个实施方案中，第二治疗剂增加血清中的腺苷量。
在一个进一步的实施方案中，第二治疗剂为CD73-Ig、重组CD73或增加CD73表达的另一种药剂(例如细胞因子或单克隆抗体或小分子)。在另一个实施方案中，第二治疗剂是干扰素-β。
在另一个实施方案中，第二治疗剂是那他珠单抗或用于MS的另一种治疗剂。在一个进一步的实施方案中，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白与那他珠单抗轮转使用或在药物假期期间使用以便允许第二治疗剂给药的频率更低并且减少例如PML的副作用的风险并防止对于第二治疗剂的抗性。
在另一个实施方案中，第二治疗剂是抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌的一种小分子。在另一个实施方案中，第二治疗剂是与Treg相互作用、增强Treg活性、促进或增强Treg的IL-10分泌、增加Treg数量、增加Treg的抑制能力、或其组合的一种小分子。在一个实施方案中，该小分子是视黄酸或其衍生物。在另一个实施方案中，第二治疗剂是与Th2细胞相互作用、增强Th2活性、促进或增强Th2细胞的IL-10、IL-4或IL-5产生、增加Th2细胞数、增加Th2细胞的免疫调节能力、或其组合的一种小分子。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是如在此列举的一种C1ORF32可溶性多肽与有效于治疗免疫相关病症的一种已知治疗剂的组合的用途。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是一种治疗免疫相关病症的方法，该方法包括向有需要的受试者给予一种药用组合物，该药用组合物包括：一种具有C1ORF32多肽的细胞外域的可溶性分子、或其片段或变体或同源物；或其融合蛋白或偶联物；或包括以下各项的多肽：与在SEQ ID号：14中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的氨基酸残基21-186、或与在SEQ ID号：35中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)的残基21-186、或与在SEQ ID号：15中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9(SEQ ID号：6)的残基21-169、或与在SEQ ID号：36中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_V1(SEQID号：34)的残基21-169、或与在SEQ ID号：37中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的残基1-184、或与在SEQ ID号：19中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)的残基1-184、或与在SEQ ID号：28中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9(SEQ ID号：6)的残基1-169、或与在SEQ ID号：30中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)的残基1-169，或序列H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)的残基21-167，或其片段或变体或同源物。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是一种预防MS患者的中枢神经系统的神经细胞的髓磷脂外层(myelin coat)损伤的方法，该方法包括向有需要的受试者给予一种药用组合物，该药用组合物包括：一种具有C1ORF32多肽的细胞外域的可溶性分子、或其片段、变体、同源物、融合蛋白或偶联物；或包括以下各项的多肽：与在SEQ ID号：14中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的氨基酸残基21-186、或与在SEQ ID号：35中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)的残基21-186、或与在SEQ ID号：15中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9(SEQ ID号：6)的残基21-169、或与在SEQ ID号：36中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)的残基21-169、或与在SEQID号：37中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的残基1-184、或与在SEQ ID号：19中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)的残基1-184、或与在SEQ ID号：28中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9(SEQ ID号：6)的残基1-169、或与在SEQ ID号：30中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)的残基1-169，或其片段或变体或同源物；任选地以药用组合物形式提供。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是一种治疗免疫相关病症的方法，其中该治疗不引起受试者的免疫系统的整体免疫抑制，该方法包括向有需要的受试者给予一种药用组合物，该药用组合物包括：一种具有C1ORF32多肽的细胞外域的可溶性分子、其片段、变体、同源物、融合蛋白或偶联物；或包括以下各项的多肽：与在SEQ ID号：14中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的氨基酸残基21-186、或与在SEQ ID号：35中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)的残基21-186、或与在SEQ ID号：15中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9(SEQ ID号：6)的残基21-169、或与在SEQ ID号：36中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)的残基21-169、或与在SEQ ID号：37中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的残基1-184、或与在SEQ ID号：19中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)的残基1-184、或与在SEQ ID号：28中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9(SEQ ID号：6)的残基1-169、或与在SEQ ID号：30中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)的残基1-169，或其片段或变体或同源物；任选地以药用组合物形式提供。
根据本发明的至少一些实施方案，提供的是一种分离的可溶性C1ORF32多肽、其片段、变体或同源物；任选地为融合蛋白或偶联物，其中所述多肽或所述融合蛋白或偶联物是用于如在此描述的免疫相关病状的抗免疫相关病状免疫疗法，任选地提供为药用组合物。
任选地，治疗包括预防、治愈、控制、逆转、减弱、减轻、最小化、抑制、管理或阻止上述疾病的有害作用的这些项中的一个或多个。
任选地，管理包括降低疾病的严重度、减少疾病发作频率、减少这类发作的持续时间、或减少这类发作的严重度、或其组合。
在另一个实施方案中，这些C1ORF32多肽、其片段或变体或同源物、包含它们的融合蛋白或偶联物，或包含它们的药用组合物可用于治疗不对TNF阻断剂起反应的患者。
附图简要说明
图1A示出H19011_1_P8(SEQ ID号：4)蛋白与已知蛋白Q71H61_人类以及NP_955383(SEQ ID号：3)的比对。
图1B示出H19011_1_P9(SEQ ID号：6)蛋白与已知蛋白Q71H61_人类以及NP_955383(SEQ ID号：3)的比对。
图2示出C1ORF32_T8_P8_V1_ECD_mFc(在此又称为C1ORF32_ECD_mFc)DNA序列(1287bp)(SEQ ID号：7)。ECD序列以粗体标明，TEV裂解位点序列加下划线，mFc序列为非粗斜体并且信号肽序列为粗斜体。
图3示出C1ORF32_T8_P8_V1_ECD_mFc(在此又称为C1ORF32_ECD_mFc)氨基酸序列(428aa)(SEQ ID号：8)。ECD序列以粗体标明，TEV裂解位点序列加下划线并且由TEV序列的N-末端上的GS连接物以及TEV序列的C-末端上的SG包围，mFc序列为非粗斜体并且信号肽序列为粗斜体。
图4示出从疾病诱导日开始以两种剂量(30和100微克/小鼠)以及两种频率(每天一次或每周3次)在预防模式下给予的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)的六次给予对于小鼠R-EAE模型的临床症状的效果，展示为平均临床计分(图4A)、累积临床计分(图4B)以及复发频率(图4C)。在此项研究中，与给予连续6天的Ig对照(100微克/小鼠)以及NM-抗-CD3(50微克/小鼠)比较来研究C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)的效果。
图5示出疾病缓解发生时(第25天)以两种剂量(30和100微克/小鼠)以及两种频率(每天一次或每周3次)在治疗模式下给予的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)的六次给予对于SJL小鼠中的PLP139-151-诱导R-EAE模型的临床症状的效果，展示为平均临床计分(图5A)、累积临床计分(图5B)以及复发频率(图5C)。在此项研究中，与给予连续6天的Ig对照(100微克/小鼠)以及抗-CD80FaB比较来研究C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)的效果。
图6示出与对照Ig以及B7-H4-Ig比较，C1ORF32-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗对于来源于SJL或BALB/c小鼠的T细胞增殖的效果。
图7示出以可溶性或结合至板亦或珠粒形式呈现的C1ORF32-ECD-mFc(SEQ ID号：8)对于从SJL小鼠分离的初始CD4+T细胞的增殖以及细胞因子分泌的体外效果。
图8示出以可溶性或结合至板或珠粒形式呈现的C1ORF32-ECD-mFc(SEQ ID号：8)对于从BALB/c小鼠分离的初始CD4+T细胞的增殖以及细胞因子分泌的体外效果。
图9示出在以连同抗-CD3以及抗-CD28的珠粒结合形式呈现时，以及在以可溶性蛋白形式添加至经过照射的从DO.11小鼠分离的APC+OVA323-339时，C1ORF32-ECD-mFc(SEQ ID号：8)对于在Th0、Th1、Th2以及Th17促进条件下的T细胞活化以及分化的效果。
图10示出在HEK-293中产生的C1ORF32-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在小鼠R-EAE模型中的效果。C1ORF32-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在疾病诱导后第0-5天经由腹膜内(i.p.)注射在预防模式下给予。
图11示出在CHO以及HEK-293中产生的C1ORF32-ECD-mFc(SEQ ID号：8)对于在Th0、Th1、Th2以及Th17衍生条件下的CD4+T细胞增殖以及细胞因子产生的体外活性的比较。
图12示出在治疗模式下每周3次i.p.给予历时两周的C1ORF32-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在SJL小鼠的PLP139-151-诱导R-EAE中的效果。展示了对于以下各项的效果：平均临床计分、累积临床计分以及复发频率(图12A)；免疫细胞到脾、淋巴结以及CNS的募集(图12B)；免疫细胞群对CNS的浸润(图12C)；经由增殖实现的脾细胞对于起始以及扩展表位的回忆应答(图12D)；经由细胞因子分泌实现的脾细胞对于起始以及扩展表位的回忆应答(图12E)；经由增殖实现的颈部淋巴结细胞对于起始表位的回忆应答(图12F)。在此项研究中，与Ig对照(100微克/小鼠)以及抗-CD80Fab(50微克/小鼠)比较来研究C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)的效果。
图13A示出与Ig对照比较，C1ORF32-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在100、30以及10微克/小鼠下每周3次i.p.给予历时2周在SJL小鼠的PLP139-151-诱导R-EAE中的治疗性治疗的剂量应答效果。呈现了以平均临床计分来表现的临床疗效(图13A)；还估计了如以上在100和30微克/小鼠下给予的C1ORF32-ECD-mFc(SEQ ID号：8)对于以下各项的效果：在R-EAE诱导之后第35天进行的对于诱导表位(PLP139-151)或扩展表位(PLP178-191)的DTH应答(图13B)，在R-EAE诱导之后第35天的回忆应答，表现为响应诱导表位(PLP139-151)、扩展表位(PLP178-191)以及抗CD3的淋巴结细胞(图13C)或脾细胞(图13D)的增殖；在R-EAE诱导后第65天进行的对于扩展表位(PLP178-191以及MBP84-104)的DTH应答(图13E)，以及在R-EAE诱导之后第65天的回忆应答，表现为响应抗CD3、OVA323-339、诱导表位(PLP139-151)以及扩展表位(PLP178-191以及MBP84-104)的脾细胞的增殖。
图14示出在过继转移模型中在细胞转移时给予时C1ORF32-ECD-mFc(SEQ ID号：8)或对照Ig治疗对于R-EAE发展(图14A)以及将总免疫细胞(图14B)和自身反应T细胞(图14C)募集到脾、淋巴结以及CNS的效果。
图15和图16示出C1ORF32-ECD-mFc(SEQ ID号：8)对于来自不同人类供体的人T细胞活化的效果，这种活化表现为细胞增殖以及IFNγ分泌。使用以C1ORF32-ECD-mFc(SEQ ID号：8)、抗CD3以及抗CD28涂布的珠粒在一步法(图15)或两步法(图16)中进行活化。
图17示出C1ORF32-ECD-mFc(SEQ ID号：8)对于人T细胞增殖的效果的剂量依赖性。
图18示出C1ORF32-ECD-mFc(SEQ ID号：8)以及对照Ig对于来自不同供体的纯化的人T细胞的增殖的效果，这些T细胞由以抗-CD3以及抗-CD28抗体连同C1ORF32-ECD-mFc(SEQID号：8)涂布的珠粒来活化。
图19示出C1ORF32-ECD-mFc(SEQ ID号：8)以及对照Ig对于来自不同供体的纯化的人T细胞的增殖的效果，这些T细胞由经过照射的自体PBMC以及抗-CD3和抗-CD28抗体来活化。
图20示出每周3次以100或30微克/小鼠i.p.给予历时10天的C1ORF32-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在类风湿性关节炎的胶原诱导的关节炎(CIA)模型中的治疗效果。测量的是临床计分(A)、脚爪肿胀(B)以及患病脚爪数量(C)。益赛普(Enbrel)(TNF-R-Ig，100微克/小鼠)用作阳性对照，而对照Ig(100微克/小鼠)用作阴性对照。
图21示出1.5和5mg/kg下的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ IDEnbrel：8)在转移体内测定中对于DTH的效果，表现为与同种型对照(mIgG2a，5mg/kg)或媒介物(PBS)治疗的小鼠比较的脚爪厚度的变化(Δ)，如图中详述。FK506在3和30mg/kg的剂量下用作阳性对照。在注射从4个不同供体汇集的PBMC后获得的结果在图21A中示出，注射来自每个供体的PBMC时获得的单独数据呈现于图21B和图21C中。
图22示出C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)对于脾细胞的IFNγ(A和B)、IL-2(C和D)以及IL-4(E和F)产生的效果，这些脾细胞在板结合抗-CD3以及可溶性抗-CD28的存在下被刺激24小时。FK506和B7-H4-Ig用作阳性对照，mIgG2a用作阴性对照。对于每个细胞因子，提供两个研究的结果，在图上标记为研究1和2。
本发明的详细说明
本发明在至少一些实施方案中涉及以下各项中的任何一个：被称为C1ORF32的蛋白、其片段、变体以及同源物以及含有它们的融合蛋白和偶联物，以及包含它们的药用组合物，以及编码它们的核酸序列，以及其作为治疗在此描述的免疫相关病症的治疗剂的用途，包括但不局限于C1ORF32蛋白的ECD(细胞外域)、其片段和/或变体和/或同源物(单独或作为融合蛋白或偶联物的一部分)的用途。
为了使本发明可更容易理解，首先定义某些术语。额外的定义贯穿详细说明而阐明。
如在此使用，术语“分离的”是指处于与化合物天然地发生于其中的环境不同的环境中的所感兴趣的化合物(例如多核苷酸或多肽)，例如，像通过将肽浓缩至它在天然状态下不存在的浓度来从其天然环境中分离。“分离的”包括样品内基本上富含所感兴趣的化合物和/或其中所感兴趣的化合物是部分或基本上纯化的化合物。
“免疫细胞”是指来自造血来源的任何细胞，包括但不局限于T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞以及巨噬细胞。
如在此使用，术语“多肽”是指具有任何长度的氨基酸链，而无论是否修饰(例如，磷酸化或糖基化)。
如在此使用，“共刺激多肽”或“共刺激分子”是在与T细胞上的细胞表面分子相互作用时调节T细胞应答的一种多肽。
如在此使用，“共刺激信号传导”是在抗原特异性T细胞应答期间在抗原呈递细胞上的共刺激多肽与其在T细胞上的受体之间的相互作用所产生的信号传导活性。不希望受单一假设限制，据信该抗原特异性T细胞应答由两种信号介导，即：1)T细胞受体(TCR)与在MHC背景下呈递的抗原性肽的接合(信号1)，以及2)在不同的共刺激受体/配体对之间的接触所递送的第二个抗原非依赖性信号(信号2)。不希望受单一假设限制，此“第二信号”在确定T细胞应答类型(活化与抑制)以及这种应答的强度和持续时间方面是关键性的，并且受来自例如B7蛋白家族的共刺激分子的正以及负信号来调节。
如在此使用，术语“B7”多肽是指会共刺激T细胞的B7蛋白家族的成员，包括但不局限于B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H5、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-S3以及其生物活性片段和/或变体。代表性生物活性片段包括会共刺激T细胞的细胞外域或细胞外域片段。
如在此使用，“炎症分子”是指诱导炎症应答(直接或间接地)的分子，包括但不局限于细胞因子以及金属蛋白酶，例如包括但不局限于IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP。
如在此使用，“载体”是另一个DNA片段可插入其中以便引起所插入片段复制的复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒。在此描述的载体可为表达载体。如在此使用，“表达载体”是包含一个或多个表达控制序列的载体。
如在此使用，“表达控制序列”是控制并且调节另一个DNA序列的转录和/或翻译的DNA序列。
“可操作地连接”是指其中所描述的部件经过配置以便进行其常用或预期功能的元件安排。因此，可操作连接在一起的两个不同多肽在物理上连接在一起的同时保持其相应的生物功能。
如在此使用，“效价”是指每个分子可利用的结合位点的数量。
如在此使用，“变体”多肽与对应野生型多肽的氨基酸序列相比含有至少一个氨基酸序列改变。
如在此使用，“保守”氨基酸取代是其中取代的氨基酸具有类似结构或化学特性的取代。如在此使用，术语“宿主细胞”是指重组载体可引入其中的原核和真核细胞。
如在此使用，“转化的”以及“转染的”包括通过在本领域中已知的许多技术将核酸(例如载体)引入细胞中。
如在此使用，术语“免疫性(immunologic)”、“免疫学(immunological)”或“免疫(immune)”应答是在接受患者体内针对肽的有益的体液性(抗体介导)和/或细胞性(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导)应答的发展。这种应答可为通过给予免疫原来诱导的主动应答或通过给予抗体或致敏T-细胞来诱导的被动应答。不希望受单一假设限制，细胞免疫应答通过结合I类或II类MHC分子来呈递多肽表位以便活化抗原特异性CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞来引起。该应答还可涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、星形细胞、小神经胶质细胞、嗜酸性粒细胞的活化、嗜中性粒细胞或先天性免疫的其他组分的活化或募集。细胞介导的免疫应答的存在可通过增殖测定(CD4+T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)测定来确定。体液和细胞应答对于免疫原的保护或治疗效果的相对贡献可通过单独地将抗体以及T-细胞从免疫接种的同系动物中分离并且测量在第二受试者中的保护或治疗效果来区分。
“免疫剂”或“免疫原”能够在任选地结合佐剂来给予至哺乳动物时诱导针对本身的免疫应答。
如在此使用，术语“C1ORF32”是指由在此报告的H19011_1_T8(SEQ ID号：1)、H19011_1_T9(SEQ ID号：2)转录物中的任何一个所编码的蛋白，尤其指如在H19011_1_P8(SEQ ID号：4)、H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)、H19011_1_P9(SEQ ID号：6)或H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)中任何一个所阐明的蛋白、其变体及片段，这些蛋白对于免疫相关病症可以具有治疗效果。如在此使用，术语C1ORF32片段和/或C1ORF32变体和/或C1ORF32同源物是指包括具有抑制T细胞活化的生物活性的氨基酸序列的C1ORF32部分。
如在此使用，术语“可溶性C1ORF32”或“可溶性胞外域(ECD)”或“胞外域”或“可溶性C1ORF32蛋白/分子”是指包括C1ORF32多肽的细胞外域的一部分或全部、并且缺乏细胞内和/或跨膜域的一部分或全部的C1ORF32片段，其中所述片段保持抑制T细胞活化的生物活性。在一个实施方案中，可溶性C1ORF32多肽片段包括C1ORF32多肽的整个细胞外域。在其他实施方案中，C1ORF32多肽的可溶性片段包括细胞外域的片段。
如在此使用，术语“可溶性C1ORF32”或“可溶性胞外域(ECD)”或“胞外域”或“可溶性C1ORF32蛋白/分子”进一步是指非细胞表面结合的(即循环的)C1ORF32分子或C1ORF32分子的任何部分，包括但不局限于：C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白；其中C1ORF32的细胞外域融合至使得融合分子可溶的免疫球蛋白(Ig)部分的融合蛋白、或其片段及衍生物；C1ORF32的细胞外域与例如乳头状瘤病毒E7基因产物、黑素瘤相关抗原p97或HIV包膜蛋白的生物活性或化学活性蛋白的一部分融合或连接的蛋白、或其片段及衍生物；例如C1ORF32多肽的杂合(嵌合)融合蛋白、其片段或融合蛋白，或其片段及衍生物。“可溶性C1ORF32蛋白/分子”还包括跨膜域被去除以便使得蛋白可溶的C1ORF32分子、或其片段及衍生物；以及可溶性C1ORF32突变分子。用于本发明方法中的可溶性C1ORF32分子可包括或可不包括信号(前导)肽序列。
术语C1ORF32的“可溶性胞外域(ECD)”或“胞外域”或“可溶性”形式还指编码C1ORF32“可溶性胞外域(ECD)”或“胞外域”或“可溶性C1ORF32蛋白/分子”的对应蛋白的核酸序列。任选地，C1ORF32 ECD是指以下多肽序列或其片段中的任何一个：
＞H19011_1_P8(SEQ ID号：4)残基21至186，与以下SEQ ID号：14中描绘的氨基酸序列对应
LQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNEGSLGLLVLGRTGLLADLLPSFAVEIMPE；
＞H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)残基21-186，与以下SEQ ID号：35中描绘的氨基酸序列对应LQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNEDSVELLVLGRTGLLADLLPSFAVEIMPE；
＞H19011_1_P9(SEQ ID号：6)残基21至169，与以下SEQ ID号：15中描绘的氨基酸序列对应
LQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNEGSLGLLVLEWV；
＞H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)残基21至169，与以下SEQ ID号：36中描绘的氨基酸序列对应
LQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNEDSVELLVLEWV；
＞H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)残基1至184，与以下SEQ ID号：19中描绘的氨基酸序列对应
MDRVLLRWISLFWLTAMVEGLQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNEDSVELLVLGRTGLLADLLPSFAVEIM；
＞H19011_1_P8(SEQ ID号：4)残基1至184，与以下SEQ ID号：37中描绘的氨基酸序列对应
MDRVLLRWISLFWLTAMVEGLQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNEGSLGLLVLGRTGLLADLLPSFAVEIM；
＞H19011_1_P9(SEQ ID号：6)残基1-169，与以下SEQ ID号：28中描绘的氨基酸序列对应
MDRVLLRWISLFWLTAMVEGLQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNEGSLGLLVLEWV；
H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)残基1-169，与以下SEQ ID号：30中描绘的氨基酸序列对应
MDRVLLRWISLFWLTAMVEGLQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNEDSVELLVLEWV，＜0}
以及其具有与其至少80％序列一致性、更优选至少90％序列一致性并且甚至更优选与其至少95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的变体。根据至少一些实施方案，与包含H19011_1_P8(SEQ ID号：4)、H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)、H19011_1_P9(SEQ ID号：6)或H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)的细胞外域的全部或一部分的多肽至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源的分离的多肽具有如在实例1中在此描述的至少一种SNP变化。
C1ORF32细胞外域可含有来自C1ORF32的信号肽或假定跨膜域的一个或多个氨基酸。在分泌期间，裂解的信号肽的氨基酸数量可取决于表达系统以及宿主而变化。另外或可替代地，失去C-末端或N-末端的一个或多个氨基酸的保持结合至C1ORF32受体的能力的C1ORF32细胞外域的片段可用作所披露融合蛋白的融合伴侣。
C1ORF32多肽的变体
这类C1ORF32多肽的有用变体包括如在此描述的任何测定所指示增加生物活性，或增加该蛋白的半衰期或稳定性的那些变体。可溶性C1ORF32多肽以及其具有C1ORF32活性的C1ORF32片段或融合物可经过工程化以便增加生物活性。在一个进一步的实施方案中，C1ORF32多肽或融合蛋白是通过增加该分子与免疫细胞，例如T细胞的结合并且将一个抑制信号传输至该T细胞中的至少一种氨基酸取代、缺失或插入来修饰的。
其他任选的变体是经过工程化以便相对于其他免疫细胞选择性地结合至一种类型T细胞的那些C1ORF32多肽。例如，C1ORF32多肽可经过工程化以便任选地结合至Treg、ThO、Th1、Th17、Th2或Th22细胞。优先结合是指对于一种类型的细胞超过另一种类型的细胞至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更大的结合。
C1ORF32的又其他变体可经过工程化以便相对于野生型C1ORF32具有降低的与免疫细胞的结合。这些变体可与具有更强的结合特性的变体组合使用以便以中度影响来调节免疫应答。
还任选地，变体C1ORF32多肽可经过工程化以便相对于野生型具有增加的半衰期。这些变体通常经过修饰以便抵抗酶性降解。示例性修饰包括抵抗酶性降解的修饰的氨基酸残基以及修饰的肽键。实现这一目的的各种修饰是本领域中已知的。
融合蛋白
根据至少一些实施方案，C1ORF32融合多肽具有包括C1ORF32蛋白的全部或一部分的第一融合伴侣，该第一融合伴侣融合至第二多肽，融合是直接的或经由适用于连接这两种蛋白的连接物肽序列或化学连接物的。C1ORF32多肽可任选地融合至第二多肽以便形成在此描述的融合蛋白。该第二多肽的存在可改变C1ORF32融合多肽的溶解性、稳定性、亲和力和/或效价。如在此使用，“效价”是指每个分子可利用的结合位点的数量。在一个实施方案中，该第二多肽是来自不同来源或不同蛋白的多肽。
根据至少一些实施方案，C1ORF32蛋白或片段针对其在此描述的治疗免疫相关病症的活性来加以选择。
在一个实施方案中，第二多肽含有一个免疫球蛋白重链恒定区的一个或多个域，该恒定区优选地具有与人免疫球蛋白Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4链的铰链、CH2以及CH3区或与鼠免疫球蛋白Cγ2a链的铰链、CH2以及CH3区对应的氨基酸序列。SEQ ID号：20提供人免疫球蛋白Cγ1的铰链、CH2以及CH3区的示例性序列。
根据至少一些实施方案，该融合蛋白是一种二聚体融合蛋白。在一个任选的二聚体融合蛋白中，二聚体由两个Ig重链的铰链区中的Cys残基的共价键结产生，这些Cys残基是二聚化的正常Ig重链中以二硫键连接的相同Cys残基。这类蛋白被称为C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白。
在一个实施方案中，免疫球蛋白恒定域可含有增强C1ORF32多肽、其融合蛋白或片段的与具体细胞类型的结合、增加其生物利用度或增加其稳定性的一个或多个氨基酸插入、缺失或取代。适合的氨基酸取代包括如上所述的保守以及非保守取代。
这些融合蛋白任选地含有起作用以便使两个或更多个融合蛋白二聚化或多聚化的一个域。肽/多肽连接物域可为一个单独的域，亦或可替代地可包含于融合蛋白的一个其他域(C1ORF32多肽或第二多肽)中。同样地，起作用以便使融合蛋白二聚化或多聚化的这个域可为一个单独的域，亦或可替代地可包含于融合蛋白的一个其他域(C1ORF32多肽、第二多肽或肽/多肽连接物域)中。在一个实施方案中，二聚化/多聚化域以及肽/多肽连接物域是相同的。二聚化/多聚化域以及连接物的进一步的具体、说明性以及非限制实例在下文给出。
根据本发明的至少一些实施方案在此披露的融合蛋白具有化学式I：N-R1-R2-R3-C，其中“N”代表融合蛋白的N-末端，“C”代表融合蛋白的C-末端。在进一步的实施方案中，“R1”是C1ORF32多肽，“R2”是任选的肽/多肽或化学连接物域，并且“R3”是第二多肽。可替代地，R3可为C1ORF32多肽并且R1可为第二多肽。
任选地，融合蛋白包含任选地通过具有一个或多个氨基酸的连接物肽(例如GS)融合至一个或多个“半衰期延长部分”的在此描述的C1ORF32多肽片段。“半衰期延长部分”是在附接至蛋白上时延长这种蛋白在受试者体内(例如受试者血浆内)的体内半衰期的任何部分，例如多肽、小分子或聚合物。例如，半衰期延长部分在本发明的一个实施方案中是聚乙二醇(PEG)、单甲氧基PEG(mPEG)或免疫球蛋白(Ig)。在本发明的一个实施方案中，PEG是5、10、12、20、30、40或50kDa部分或更大或包含约12000个乙二醇单元(PEG 12000)。
二聚化或多聚化可经由二聚化或多聚化域在两个或更多个融合蛋白之间发生。可替代地，融合蛋白的二聚化或多聚化可通过化学交联来发生。形成的二聚体或多聚体可为同源二聚体/同源多聚体或异源二聚体/异源多聚体。C1ORF32融合多肽中的第二多肽“伴侣”可包括一个或多个在此描述的其他蛋白、蛋白片段或肽，包括但不局限于任何免疫球蛋白(Ig)蛋白或其一部分，优选地Fc区，或例如乳头状瘤病毒E7基因产物、黑素瘤相关抗原p97、以及HIV包膜蛋白(gp120)的生物学或化学活性蛋白的一部分。“伴侣”可任选地选择以便提供可溶性二聚体/多聚体和/或针对在此描述的一种或多种其他生物活性加以选择。
二聚化或多聚化可经由二聚化或多聚化域在两个或更多个融合蛋白之间发生，这些二聚化或多聚化域包括如上所述的那些域。可替代地，融合蛋白的二聚化或多聚化可通过化学交联发生。融合蛋白二聚体可为同源二聚体或异源二聚体。融合蛋白多聚体可为同源多聚体或异源多聚体。如在此披露的融合蛋白二聚体具有化学式II：
N-R1-R2-R3-C
N-R4-R5-R6-C或替代地具有化学式III：
N-R1-R2-R3-C
C-R4-R5-R6-N，其中化学式II提供的二聚体的融合蛋白被定义为处于平行取向并且化学式III提供的二聚体的融合蛋白被定义为处于反平行取向。平行和反平行二聚体又分别称为顺式和反式二聚体。″N”和“C”分别代表融合蛋白的N-和C-末端。融合蛋白成分“R1”、“R2”以及“R3”如上文关于化学式I所定义。关于化学式II和化学式III而言，“R4”是C1ORF32多肽或第二多肽，“R5”是任选的肽/多肽连接物域，并且“R6”是C1ORF32多肽或第二多肽，其中当“R4”是第二多肽时，“R6”是C1ORF32多肽，并且当“R4”是C1ORF32多肽时，“R6”是第二多肽。在一个实施方案中，“R1”为C1ORF32多肽，“R4”也为C1ORF32多肽，并且“R3”和“R6”均为第二多肽。
当“R1”＝“R4”，“R2”＝“R5”并且“R3”＝“R6”时，具有化学式II的融合蛋白二聚体定义为同源二聚体。同样地，当“R1”＝“R6”、“R2”＝“R5”并且“R3”＝“R4”时，具有化学式III的融合蛋白二聚体定义为同源二聚体。当出于任何原因不满足这些条件时，融合蛋白二聚体被定义为异源二聚体。例如，异源二聚体可含有满足这些条件(即，对于根据化学式II的二聚体而言，“R1”和“R4”均为C1ORF32多肽，“R2”和“R5”均为肽/多肽连接物域并且“R3”和“R6”均为第二多肽)的域取向，然而这些域中的一个或多个域的种类并不相同。例如，虽然“R3”和“R6”可均为C1ORF32多肽，但是一种多肽可含有野生型C1ORF32氨基酸序列，而另一种多肽可为变体C1ORF32多肽。示例性变体C1ORF32多肽为经过修饰而具有增加或减少的与靶细胞的结合、增加的对于免疫细胞的活性、增加或减少的半衰期或稳定性的C1ORF32多肽。含有一种免疫球蛋白的CHI或CL区作为多肽连接物域的一部分的融合蛋白二聚体优选地形成这样的异源二聚体，其中二聚体的一个融合蛋白含有CHI区并且二聚体的另一个融合蛋白含有CL区。
融合蛋白也可用于形成多聚体。与二聚体一样，多聚体可为平行多聚体，其中多聚体的所有融合蛋白以相对于其N-和C-末端的相同取向来对齐。多聚体可为反平行多聚体，其中多聚体的融合蛋白可替代地以相对于其N-和C-末端的相反取向来对齐。多聚体(平行或反平行)可为同源多聚体或异源多聚体。融合蛋白任选地以二聚体形式产生；更优选地，融合如下所述在基因水平来进行，方法为连接与两个(或更多个)蛋白、蛋白部分和/或肽对应的多核苷酸序列，以使得由细胞根据连接的多核苷酸序列来产生连接或融合的蛋白。制备这种融合蛋白的描述参照Linsley(林斯雷)等的美国专利号5,851,795来描述，该专利只作为非限制性实例通过引用结合在此，其引用程度如同完全在此阐明一样。
融合蛋白也可任选地通过化学合成方法来制备并且在合成或合成后期间以化学方法实现“连接”。可任选地使用交联以及其他这类方法(任选地还使用以上描述的基因水平融合方法)，如例如在Wallner(瓦尔纳)等的美国专利号5,547,853中描述，该专利只作为非限制性实例通过引用结合在此，其引用程度如同完全在此阐明一样。
根据本发明，融合蛋白可用本发明的蛋白通过与包含一种免疫球蛋白的恒定区的免疫球蛋白的一部分融合来制备。更优选地，该免疫球蛋白的该部分包含任选地并且更优选地为人重链恒定区的重链恒定区。该重链恒定区最优选地为IgG重链恒定区，并且任选地以及最优选地为Fc链，最优选地为包含铰链、CH2以及CH3域的IgG Fc片段。该Fc链可任选地为已知或“野生型”Fc链，或替代地可以是突变或截短的。融合蛋白的Fc部分可任选地按照同种型或子类而不同，可以是嵌合体或杂合体，和/或可经过修饰以便例如改进效应子功能、控制半衰期、组织可接近性、增进生物物理特性例如稳定性，并且改进产生效率(并且成本更小)。适用于构建所披露融合蛋白的许多修饰以及其制造方法是本领域中已知的，参见例如Mueller(穆勒)等人，分子免疫学(MoI.Immun.)，34(6)：441-452(1997)，Swann(斯万)等人，当前免疫学观点(Cur.Opin.Immun.)，20：493-499(2008)，以及Presta(帕斯塔)，当前免疫学观点(Cur.Opin.Immun.)20：460-470(2008)。在一些实施方案中，该Fc区为原生IgG1、IgG2或IgG4 Fc区。在一些实施方案中，该Fc区是杂合体，例如由IgG2/IgG4 Fc恒定区组成的嵌合体。
该Fc区的修饰包括但不局限于IgG4被修饰以便防止与Fcγ受体以及补体的结合，IgG1被修饰以便改进与一个或多个Fcγ受体的结合，IgG1被修饰以便最小化效应子功能(氨基酸变化)，IgG1具有改变的聚糖/没有聚糖(通常通过改变表达宿主)，并且IgG1具有改变的与FcRn的pH依赖性结合。该Fc区可包括整个铰链区，或不足整个铰链区。
在另一个实施方案中，Fc域可含有一个或多个氨基酸插入、缺失或取代，这些插入、缺失或取代减少与低亲和力抑制性Fc受体CD32B(FcγRIIB)的结合并且保持野生型水平的与低亲和力活化Fc受体CD16A(FcγRIIIA)的结合或增强与之的结合。
另一个实施方案包括IgG2-4杂合体和IgG4突变体，它们具有降低的与FcR(Fc受体)的结合，从而增加其半衰期。代表性IgG2-4杂合体和IgG4突变体描述于Angal(安盖尔)，S.等人，分子免疫学(Molecular Immunology)，30(1)：105-108(1993)；Mueller(穆勒)，J.等人，分子免疫学(Molecular Immunology)，34(6)：441-452(1997)；以及Wang(王)等的美国专利号6,982,323中。在一些实施方案中，IgG1和/或IgG2域被缺失；例如，Angal(安盖尔)等描述具有丝氨酸241替换为脯氨酸的IgG1和IgG2。
在一个进一步的实施方案中，Fc域含有氨基酸插入、缺失或取代，这些插入、缺失或取代增强与CD16A的结合。增加与CD16A的结合并且减少与CD32B的结合的人IgG1的Fc域中的很多取代是本领域中已知的并且描述于Stavenhagen(斯塔文哈根)等人，癌症研究(Cancer Res.)，57(18)：8882-90(2007年)中。具有降低的与CD32B的结合和/或增加的与CD16A的结合的人IgG1 Fc域的示例性变体含有F243L、R929P、Y300L、V305I或P296L取代。这些氨基酸取代可按任何组合存在于人IgG1 Fc域中。
在一个实施方案中，该人IgG1 Fc域变体含有F243L、R929P以及Y300L取代。在另一个实施方案中，人IgG1 Fc域变体含有F243L、R929P、Y300L、V305I以及P296L取代。在另一个实施方案中，人IgG1 Fc域变体含有N297A/Q取代，因为这些突变消除FcγR结合。非限制、说明性、示例性类型的突变描述于2006年2月16日公开的美国专利申请号20060034852中，该申请通过引用结合在此，其引用程度如同完全在此阐明一样。术语“Fc链”还任选地包括任何类型的Fc片段。
已经鉴定对于IgG子类中的抗体恒定区介导的活性而言重要的几个特定氨基酸残基。因此，包含、取代或排除这些特定氨基酸允许包含或排除特定免疫球蛋白恒定区介导的活性。此外，特定变化可产生例如去糖基化和/或Fc链的其他所希望变化。可任选地产生至少一些变化以便阻断被认为不合需要的Fc功能，例如不合需要的免疫系统效应，如下文更详细描述的。
可产生以调节融合蛋白的活性的Fc突变的非限制性、说明性实例包括以下变化(根据Kabat(卡巴特)EA等：具有免疫学重要性的蛋白的序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，美国卫生和公众服务部(US Department of Health andHuman Services)，NIH，1991，参照如Kabat(卡巴特)给出的Fc序列命名法来给出)：220C-＞S；233-238ELLGGP-＞EAEGAP；265D-＞A，优选地结合434N-＞A；297N-＞A(例如用于阻断N-糖基化)；318-322 EYKCK-＞AYACA；330-331AP-＞SS；或其组合(参见例如M.Clark(克拉克)，“化学免疫学与抗体工程化(Chemical Immunol and Antibody Engineering)”，第1-31页以便获得这些突变及其效果的描述)。特征为以上变化的Fc链的构建体任选地并且优选地包括铰链区与CH2和CH3域的组合。
以上突变可任选地实施以便增强所希望的特性或替代地阻断不希望的特性。例如，已显示抗体的去糖基化可在阻断T-细胞的耗尽或触发细胞因子释放的同时维持所希望的结合功能性，此举可任选地为不希望有的功能(参见M.Clark，“化学免疫学与抗体工程化(Chemical Immunol and Antibody Engineering)”，第1-31页)。将331脯氨酸取代为丝氨酸可阻断活化补体的能力，此举可任选地被认为是不希望有的功能(参见M.Clark(克拉克)，“化学免疫学与抗体工程化(Chemical Immunol and Antibody Engineering)”，第1-31页)。结合此变化将330丙氨酸改变成丝氨酸也可增强阻断活化补体的能力的所希望的效果。
已显示残基235和237涉及到抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，使得如果ADCC被认为是不合需要的功能，如所描述改变233-238残基区块也可阻断这种活性。
残基220通常是来自IgG1的Fc的半胱氨酸，它是重链与轻链形成共价键的位点。任选地，此残基可改变为丝氨酸，以避免任何类型的共价键(参见M.Clark(克拉克)，“化学免疫学与抗体工程化(Chemical Immunol and Antibody Engineering)”，第1-31页)。
残基265和434的以上变化可任选地实施以便减少或阻断与Fc受体的结合，这可任选地阻断Fc的与其免疫系统功能相关的不希望有的功能(参见“人IgG1上的Fc受体结合位点(Binding site on Human IgG1 for Fc Receptors)”，Shields(希尔兹)等人，第276卷，第6591-6604页，2001年)。
以上变化只用来说明任选的变化并且不欲以任何方式具有限制性。此外，以上解释只出于描述目的而提供，而不希望受单一假设限制。
示例性融合蛋白在SEQ ID号：8、22、23、38、29中阐明。
前述示例性融合蛋白可合并有在此描述的变体的任何组合。在另一个实施方案中，前述示例性融合蛋白的末端赖氨酸被删除。
所披露的融合蛋白可使用标准分子生物学技术来分离。例如，将含有编码C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白的DNA序列的表达载体通过磷酸钙沉淀而转染至293细胞中并且在无血清DMEM中培养。在72h收集上清液并且通过蛋白G、或优选地蛋白A管柱(Pharmacia公司，乌普萨拉(Uppsala)，瑞典)来纯化融合蛋白。任选地，将编码C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白的DNA序列转染至逆转录病毒载体中并且在四轮逆转录病毒载体转导之后，在CHO-S细胞中表达。该蛋白通过使用蛋白A色谱法从上清液中净化。
在另一个实施方案中，第二多肽可具有一个偶联域，通过该偶联域另外的分子可结合至这些C1ORF32融合蛋白。在一个这样的实施方案中，被偶联的分子能够将融合蛋白靶向输送至特定器官或组织；这类靶向域和/或分子的进一步的具体、说明性、非限制性实例在下文给出。
在另一个这样的实施方案中，被偶联的分子是可增强或增进C1ORF32融合蛋白的效果的另一种免疫调节剂。在另一个实施方案中，被偶联的分子是聚乙二醇(PEG)。
肽或多肽连接物域
所披露的C1ORF32融合蛋白任选地含有将C1ORF32多肽与第二多肽分离开的肽或多肽连接物域。在一个实施方案中，该连接物域含有一种免疫球蛋白的铰链区。在一个进一步的实施方案中，该铰链区来源于人免疫球蛋白。该铰链可来源自的适合的人免疫球蛋白包括IgG、IgD以及IgA。在一个进一步的实施方案中，铰链区来源于人IgG。免疫球蛋白铰链区以及其他域的氨基酸序列在本领域中是熟知的。在一个实施方案中，C1ORF32融合多肽含有与以下SEQ ID号：20中阐明的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、99％或100％序列同源性的人免疫球蛋白Cγ1链的铰链、CH2以及CH3区：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
铰链可进一步缩短以便去除SEQ ID号：20的氨基酸1、2、3、4、5或其组合。在一个实施方案中，SEQ ID号：20的氨基酸1-5被缺失。
在另一个实施方案中，C1ORF32融合多肽含有与在以下SEQ ID号：21中阐明的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、99％或100％序列同源性的人免疫球蛋白Cγ1链的CH2以及CH3区：
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在另一个实施方案中，C1ORF32融合多肽含有与以下SEQ ID号：31中阐明的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、99％或100％序列同源性的鼠免疫球蛋白Cγ2a链的铰链、CH2以及CH3区：
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK.在另一个实施方案中，该连接物域含有如上所述的一种免疫球蛋白的铰链区，并且进一步包含一个或多个另外的免疫球蛋白域。
其他适合的肽/多肽连接物域包含天然发生或非天然发生的肽或多肽。肽连接物序列具有至少2个氨基酸的长度。任选地，肽或多肽域是柔性肽或多肽。“柔性连接物”在此是指含有由一个或多个肽键相连接的两个或更多个氨基酸残基的肽或多肽，这与在不存在该柔性连接物的情况下的两个连接的多肽相比，为由此连接的两个多肽提供增加的转动自由度。这种转动自由度允许由该柔性连接物连接的两个或更多个抗原结合位点各自更有效地接近一个或多个目标抗原。示例性柔性肽/多肽包括但不局限于氨基酸序列Gly-Ser(SEQID号：24)、Gly-Ser-Gly-Ser(SEQ ID号：25)、Ala-Ser(SEQ ID号：26)、Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID号：27)、Gly4-Ser(SEQ ID号：39)、(Gly4-Ser)2(SEQ ID号：40)、(Gly4-Ser)3(SEQID号：32)以及(Gly4-Ser)4(SEQ ID号：33)。额外的柔性肽/多肽序列在本领域中是熟知的。
二聚化、多聚化以及靶向域
在此披露的融合蛋白任选地含有起作用以便使两个或更多个融合蛋白二聚化或多聚化的一个二聚化或多聚化域。起作用以便使融合蛋白二聚化或多聚化的该域可为一个单独的域，或可替代地可包含于融合蛋白的一个其他域(C1ORF32多肽、第二多肽、或肽/多肽连接物域)中。
“二聚化域”通过至少两个氨基酸残基或至少两个肽或多肽(可具有相同或不同的氨基酸序列)的缔合来形成。肽或多肽可经由共价和/或非共价缔合来彼此相互作用。任选的二聚化域含有能够与伴侣融合蛋白上的半胱氨酸形成分子间二硫键的至少一个半胱氨酸。二聚化域可含有一个或多个半胱氨酸残基以使得可在伴侣融合蛋白之间形成一个或多个二硫键。在一个实施方案中，二聚化域含有一个、两个或三个至约十个半胱氨酸残基。在一个进一步的实施方案中，二聚化域是一种免疫球蛋白的铰链区。
另外的示例性二聚化域可以是本领域中已知的任何一种并且包括但是不局限于卷曲螺旋、酸补丁、锌指、钙手、CH1-CL对、如在美国专利号5,821,333中描述的具有经过工程化的“突起(knob)”和/或“隆起(protruberance)”的“界面”、亮氨酸拉链(例如来自jun和/或fos)(美国专利号5,932,448)、SH2(src同源性2)、SH3(src同源性3)(Vidal(威代尔)等人，生物化学(Biochemistry)，43，7336-44((2004))、磷酸酪氨酸结合(PTB)(Zhou(周)等人，自然(Nature)，378：584-592(1995))、WW(Sudol(萨杜尔)，生物物理学与分子生物学进展(Prog，Biochys.MoL Bio.)，65：113-132(1996))、PDZ(Kim(金姆)等人，自然(Nature)，378：85-88(1995)；Komau(考茅)等人，科学(Science)，269.1737-1740(1995))14-3-3、WD40(Hu5等人，生物化学杂志(J Biol Chem.)，273，33489-33494(1998))EH、Lim、异亮氨酸拉链、受体二聚体对(例如白介素-8受体(IL-8R)；以及整联蛋白异源二聚体例如LFA-I和GPIIIb/IIIa)，或其二聚化区、二聚体配体多肽(例如神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3(NT-3)、白介素-8(IL-8)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、PDGF成员，以及脑源性神经营养因子(BDNF)(Arakawa(荒川)等人，生物化学杂志(J Biol.Chem.)，269(45)：27833-27839(1994)以及Radziejewski(拉切耶夫斯基)等人，生物化学(Biochem.)，32(48)：1350(1993))并且还可为其中亲和力发生改变的这些域的变体。这些多肽对可通过本领域中已知的方法，包括酵母双杂交筛选来鉴定。酵母双杂交筛选描述于美国专利号5,283,173以及6,562,576中。一对相互作用域之间的亲和力可使用在本领域中已知的方法，包括如Katahira(片平)等人，生物化学杂志(J.Biol Chem)，277，9242-9246(2002年)中所描述来确定。可替代地，可针对异源二聚化，例如使用在WO 01/00814中描述的方法来筛选肽序列文库。蛋白-蛋白相互作用的有用方法还描述于美国专利号6,790,624中。
“多聚化域”是经由共价和/或非共价缔合引起三个或更多个肽或多肽彼此相互作用的域。适合的多聚化域包括但不局限于卷曲螺旋域。卷曲螺旋是具有间隔开3个和4个残基的主要疏水性残基的连续型式的肽序列，通常呈七个氨基酸(七价重复)或十一个氨基酸(十一价重复)的序列形式的，这些氨基酸组装(折叠)以形成多聚体螺旋束。还涵盖具有包含3个和4个残基间隔的某种不规则分布的序列的卷曲螺旋。疏水性残基具体来说是疏水性氨基酸Val、He、Leu、Met、Tyr、Phe以及Trp。“主要疏水性”是指至少50％的残基必须选自所提到的疏水性氨基酸。
卷曲螺旋域可来源于层粘连蛋白。在细胞外空间中，异源三聚体卷曲螺旋蛋白层粘连蛋白在基底膜的形成中发挥重要作用。显然地，多官能低聚结构是层粘连蛋白功能所要求的。卷曲螺旋域还可来源于其中连接三个(TSP-I和TSP-2)或五个(TSP-3、TSP-4以及TSP-5)链的血小板反应蛋白，或来源于折叠成平行五链卷曲螺旋的COMP(COMPcc)(Guo(郭)等人，EMBO J，1998，17：5265-5272)(Malashkevich(马拉舍科维奇)等人，科学(Science)，274：761-765(1996))。来源于其他蛋白的另外卷曲螺旋域，以及介导多肽多聚化的其他域是本领域中已知的并且适用于所披露的融合蛋白。
在另一个实施方案中，可通过结合至例如抗体的第二多价多肽来诱导C1ORF32多肽、其融合蛋白或片段以便形成多聚体。适合于用于使C1ORF32多肽、其融合蛋白或片段多聚化的抗体包括但不局限于IgM抗体以及交联的多价IgG、IgA、IgD或IgE复合物。
靶向域
C1ORF32多肽和融合蛋白可含有用于将分子靶向至体内特定位点的一个靶向域。任选的靶向域将分子靶向输送至炎症区域。示例性靶向域是对于发炎组织或促炎症细胞因子具有特异性的抗体或其抗原结合片段，所述细胞因子包括但不局限于IL17、IL-4、IL-6、IL-12、IL-21、IL-22以及IL-23。在神经学病症，例如多发性硬化的情况下，靶向域可将分子靶向至CNS或可结合至血管上皮上的VCAM-I。另外的靶向域可以是对于促炎症分子具有特异性的肽适体。在其他实施方案中，C1ORF32融合蛋白可包括对于展示于例如T细胞的免疫细胞的表面上的多肽具有特异性的结合伴侣。仍然在其他实施方案中，靶向域特异性地靶向活化的免疫细胞。被靶向的任选的免疫细胞包括Th0、Th1、Th17、Th2以及Th22T细胞、分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞，这些炎症分子包括但不局限于IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP，以及Treg。例如，Treg的靶向域可特异性地结合至CD25。
术语“个体”、“宿主”、“受试者”，以及“患者”在此可互换使用，并且是指任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、犬、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物、等。
本发明的不同方面在以下小节中进一步详细描述。
核酸
“核酸片段”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”在此可互换使用以指代核酸残基的聚合物。本发明的多核苷酸序列是指单或双链核酸序列，它以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如，以上的组合)形式分离和提供。
因此，本发明涵盖在上文中描述的核酸序列；其片段、与其杂交的序列、与其同源的序列[例如与在此阐明的核酸序列至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％或更大程度一致、编码具有不同密码子使用的类似多肽的序列、以一个或多个核苷酸的天然发生的或者随机亦或以靶向方式人工诱导的突变为特征的改变序列，所述突变例如缺失、插入或取代。本发明还涵盖包括本发明的多核苷酸独特的序列区的同源核酸序列(即，形成本发明的多核苷酸序列的一部分)。
如果本发明的多核苷酸序列编码先前未鉴定的多肽，本发明还涵盖由在上文中描述的分离的多核苷酸以及其相应核酸片段和/或其简并变体所编码的新颖多肽或其部分。
因此，本发明还涵盖由本发明的多核苷酸序列编码的多肽。本发明还涵盖这些多肽的同系物，这类同系物可与以下阐明的氨基酸序列至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％或更大程度同源，如可使用国家生物技术信息中心(National Center ofBiotechnology Information；NCBI)的BlastP软件使用缺省参数来确定的。最后，本发明还涵盖以上描述的多肽以及具有一个或多个氨基酸的天然发生的随机亦或以靶向方式人工诱导的突变的多肽的片段，所述突变例如缺失、插入或取代。
如在上文中提到的，本发明的生物分子序列可有效地用作组织或病理标志以及作为治疗或预防疾病的假定药物或药物靶标。
被设计成针对在此提供的任何序列来进行本发明方法(如上所述来设计)的寡核苷酸可根据在本领域中已知的任何寡核苷酸合成法，例如酶促合成或固相合成来产生。进行固相合成的设备和试剂例如从美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)可购得。也可使用这类合成的任何其他手段；寡核苷酸的实际合成完全在本领域技术人员的能力范围内。
根据本发明的这一方面使用的寡核苷酸是具有选自从约10至约200个碱基、优选地从约15至约150个碱基、更优选地从约20至约100个碱基、最优选地从约20至约50个碱基的范围的长度的那些寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸可包含由嘌呤和嘧啶碱基组成的杂环核苷，这些碱基以3′至5′磷酸二酯键来键结。
优选的寡核苷酸是在骨架、核苷间键或碱基中经过修饰的那些寡核苷酸，如下文中广泛描述。这类修饰可时常促进寡核苷酸吸收以及对于细胞内条件的抵抗性。
根据本发明的这一方面适用的优选寡核苷酸的具体实例包括含有经过修饰的骨架或非天然核苷间键的寡核苷酸。具有修饰的骨架的寡核苷酸包括在骨架中保持磷原子的那些寡核苷酸，如在以下美国专利号中所披露的：4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；以及5,625,050。
优选的修饰的寡核苷酸骨架包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基以及其他烷基膦酸酯(包括3′-亚烷基膦酸酯以及手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3′-氨基氨基磷酸酯以及氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基膦酸三酯，以及具有正常3′-5′键、这些键的2′-5′连接类似物的硼烷磷酸酯，以及具有其中相邻对的核苷单位以3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′来连接的反向极性的那些硼烷磷酸酯。也可使用不同盐、混合盐以及游离酸形式。
可替代地，其中不包括磷原子的修饰的寡核苷酸骨架具有通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子以及烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些骨架包括具有吗啉键(部分地由核苷的糖部分形成)的那些骨架；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜以及砜骨架；甲酰基以及硫代甲酰基骨架；亚甲基甲酰基以及硫代甲酰基骨架；含有烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基以及亚甲基肼基骨架；磺酸酯以及磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合N、O、S以及CH2组成部分的其他骨架，如在美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623，070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439中所披露。
根据本发明可使用的其他寡核苷酸是核苷酸单位的糖和核苷间键(即，骨架)替换为新颖的基团而修饰的那些寡核苷酸。保持碱基单位以便与适当的多核苷酸目标互补。这类寡核苷酸模拟物的实例包括肽核酸(PNA)。PNA寡核苷酸是指其中糖-骨架替换为含有酰胺的骨架，特别是氨乙基甘氨酸骨架的寡核苷酸。碱基得以保持并且直接或间接地结合至骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。传授PNA化合物的制备的美国专利包括但不局限于美国专利号5,539,082；5,714,331；以及5,719,262，它们各自通过引用结合在此。可用于本发明中的其他骨架修饰披露于美国专利号：6,303,374中。
本发明的寡核苷酸还可包括碱基修饰或取代。如在此使用，“未修饰的”或“天然”碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)以及尿嘧啶(U)。修饰碱基包括但不局限于其他合成以及天然碱基例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶以及2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶以及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶以及胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶以及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-氢硫基、8-硫烷基、8-羟基以及其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基尤其5-溴、5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的碱基包括在美国专利号：3,687,808中披露的那些碱基、在聚合物科学与工程简明百科全书(The ConciseEncyclopedia Of Polymer Science and Engineering)，第858-859页，Kroschwitz(克洛舍维奇)，J.I.编著，约翰威利出版公司(John Wiley&Sons)，1990年中披露的那些碱基、在Englisch等人，应用化学(Angewandte Chemie)，国际版，1991，30，613中披露的那些碱基、以及在Sanghvi(赛格维)，Y.S.，第15章，反义研究与应用(Antisense Research andApplications)，第289-302页，Crooke(克鲁克)，S.T.和Lebleu(拉布列)，B.编著，CRC出版社，1993中披露的那些碱基。这类碱基尤其适用于增加本发明的低聚化合物的结合亲和力。这些碱基包括5-取代嘧啶、6-氮嘧啶以及N-2、N-6以及O-6取代嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶取代可将核酸双链稳定性增加0.6-1.2℃[Sanghvi YS(赛格维)等人(1993)反义研究与应用(Antisense Researchand Applications)，CRC出版社，波卡拉顿(Boca Raton)276-278]并且是目前优选的碱基取代，在与2′-O-甲氧基乙基糖修饰相结合时甚至更特别如此。
本发明的寡核苷酸的另一种修饰涉及将增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞吸收的一种或多种部分或偶联物化学连接至该寡核苷酸。这类部分包括但不局限于脂质部分(例如胆固醇部分)、胆酸、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醚)、巯基胆固醇、脂肪链(例如十二烷二醇或十一基残基)、磷脂(例如二-十六基-rac-甘油或1，2-二-O-十六基-rac-甘油-3-H-膦酸三乙基铵)、多胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸、棕榈基部分，或十八烷基胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分，如美国专利号：6,303,374中所披露。
不需要给定寡核苷酸分子中的所有位置被均匀地修饰，并且事实上多于一种的上述修饰可并入单一化合物中或甚至一个寡核苷酸内的单一核苷处。
肽
术语“多肽”、“肽”及“蛋白”在此可互换使用以指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然发生氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，以及天然发生的氨基酸聚合物。多肽可例如通过添加碳水化合物残基以便形成糖蛋白来修饰。术语“多肽”、“肽”以及“蛋白”包括糖蛋白，连同非糖蛋白。
多肽产物可例如通过使用标准固相技术来生化合成。这类方法包括排阻固相合成、部分固相合成方法、片段缩合、经典溶液合成。这些方法优选地当肽相对较短(即，10kDa)和/或当它不能通过重组技术来产生(即，未由核酸序列来编码)并且因此涉及不同化学时使用。
固相多肽合成程序在本领域中是熟知的，并且进一步由John Morrow Stewart(约翰 莫罗 斯图尔特)以及Janis Dillaha Young(詹尼斯 迪拉哈 杨)，固相肽合成(SolidPhase Peptide Syntheses)(第2版，Pierce Chemical Company公司，1984)描述。
合成多肽可通过制备型高效液相色谱来纯化[Creighton(克雷顿)T.(1983年)蛋白、结构以及分子原则(Proteins，structures and molecular principles)WH Freeman(弗里曼)和Co.N.Y.]并且其组成可经由氨基酸测序来确认。
如果希望有大量多肽，它可使用例如以下文献描述的重组技术来产生：Bitter(比特尔)等人，(1987)酶学方法(Methods in Enzymol.)153：516-544，Studier(斯图迪尔)等人(1990年)酶学方法(Methods in Enzymol.)185：60-89，Brisson(布里松)等人(1984年)自然(Nature)310：511-514，Takamatsu(高松)等人(1987年)EMBO J.6：307-311，Coruzzi(科鲁兹)等人(1984年)EMBO J.3：1671-1680以及Brogli(布罗意)等人，(1984年)科学(Science)224：838-843，Gurley(葛尔莱)等人(1986年)分子细胞生物学报(Mol.Cell.Biol.)6：559-565以及Weissbach(怀斯巴赫)&Weissbach，1988，植物分子生物学方法(Methods for Plant Molecular Biology)，学术出版社(Academic Press)，纽约(NY)，第VIII部分，第421-463页。
将理解，根据本发明的传授内容鉴定的肽可以是降解产物、合成肽或重组肽以及拟肽物，通常是作为肽类似物的合成肽以及类肽以及半类肽，它们可具有例如使得肽在处于体内时更稳定或更能够渗透至细胞中的修饰。这类修饰包括但不局限于N末端修饰、C末端修饰、肽键修饰(包括但不局限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH)、骨架修饰以及残基修饰。用于制备拟肽物化合物的方法在本领域中是熟知的，并且在例如定量药物设计(Quantitative Drug Design)，C.A.Ramsden(拉姆斯登)Gd.，第17.2章，F.Choplin Pergamon Press出版社(1992)中加以规定，该文献通过引用结合在此，如同完全在此阐明一样。此方面的进一步细节提供于下文。
肽内的肽键(-CO-NH-)可例如被以下键取代：N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)(其中R是任何烷基例如甲基)、carba键(-CH2-NH-)、羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯系双键(-CH＝CH-)、逆向酰胺键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是天然地呈现于碳原子上的“正常”侧链。
这些修饰可沿着肽链在任何键处出现并且甚至同时在若干(2-3)个键处出现。
天然芳香族氨基酸Trp、Tyr以及Phe可由合成非天然酸来取代，所述合成非天然酸例如苯甘氨酸、TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤化衍生物或o-甲基-Tyr。
除了上述以外，本发明的肽还可包含一种或多种修饰氨基酸或一种或多种非氨基酸单体(例如脂肪酸，复合碳水化合物等)。
如在此说明书以及以下权利要求部分中使用，术语“氨基酸(amino acid)”或“氨基酸(amino acids)”应理解为包括20种天然发生的氨基酸；经常在体内翻译后修饰的那些氨基酸，包括例如羟基脯氨酸、磷酸丝氨酸以及磷酸苏氨酸；以及其他独特氨基酸，包括但不局限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链赖氨素、正缬氨酸、正亮氨酸以及鸟氨酸。此外，术语“氨基酸”包括D-以及L-氨基酸。
由于本发明的肽优选地用于要求肽呈可溶性形式的治疗剂中，本发明的肽优选地包含一种或多种非天然或天然极性氨基酸，这些氨基酸包括但不局限于归因于其含羟基的侧链而能够增加肽溶解性的丝氨酸和苏氨酸。
如果希望大量本发明的肽，本发明的肽可使用例如以下文献描述的重组技术来产生：Bitter(比特尔)等人，(1987年)酶学方法(Methods in Enzymol.)153：516-544，Studier(斯图迪尔)等人(1990年)酶学方法(Methods in Enzymol.)185：60-89，Brisson(布里松)等人(1984)自然(Nature)310：511-514，Takamatsu(高松)等人(1987年)EMBOJ.6：307-311，Coruzzi等人(1984年)EMBO J.3：1671-1680以及Brogli(布罗意)等人，(1984年)科学(Science)224：838-843，Gurley(葛尔莱)等人(1986年)分子细胞生物学报(Mol.Cell.Biol.)6：559-565以及Weissbach(怀斯巴赫)&Weissbach，1988年，植物分子生物学方法(Methods for Plant Molecular Biology)，学术出版社(Academic Press)，纽约(NY)，第VIII部分，第421-463页。
表达系统
为了使得本发明的多核苷酸能够进行细胞表达，可使用根据本发明的核酸构建体，它包括以上核酸序列之一的至少一个编码区，并且进一步包括至少一种顺式作用调控元件。如在此使用，短语“顺式作用调控元件”是指结合反式作用调控子并且调控位于其下游的编码序列的转录的多核苷酸序列，优选为启动子。
任何适合的启动子序列可由本发明的核酸构建体来使用。
优选地，本发明的核酸构建体使用的启动子在所转化的具体细胞群中是活性的。细胞类型特异性和/或组织特异性启动子的实例包括具有肝特异性的启动子，例如白蛋白[Pinkert(平克特)等人，(1987年)基因和发育(Genes Dev.)1：268-277]、淋巴特异性启动子[Calame(卡拉姆)等人，(1988年)免疫学进展(Adv.Immunol.)43：235-275]；尤其T-细胞受体[Winoto(温诺托)等人，(1989年)EMBO J.8：729-733]和免疫球蛋白的启动子；[Banerji(巴纳基)等人(1983年)细胞(Cell)33729-740]、神经元特异性启动子，例如神经微丝启动子[Byrne(伯恩)等人(1989年)美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA86：5473-5477]、胰腺特异性启动子[Edlunch(艾德伦齐)等人(1985)科学(Science)230：912-916]或乳腺特异性启动子，例如乳清启动子(美国专利号4,873,316以及欧洲申请公布号264，166)。本发明的核酸构建体可进一步包括增强子，该增强子可相邻于或远离启动子序列并且可起作用以便上调由其进行的转录。
本发明的核酸构建体优选地进一步包括一个适当的选择标记和/或复制起点。优选地，所使用的核酸构建体是穿梭载体，它可在大肠杆菌中繁殖(其中该构建体包含适当的选择标记和复制起点)并且适合于在细胞中繁殖、或整合于所选择的基因和组织之中。根据本发明的构建体可以是例如质粒、杆粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。
适合的构建体的实例包括但不局限于pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、PzeoSV2(+/-)、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto，它们各自可购自英杰生命技术有限公司(Invitrogen Co.)(www.invitrogen.com)。逆转录病毒载体以及包装系统的实例是由加利福尼亚州圣迭戈Clontech公司(Clontech，San Diego(圣迭戈)，Calif.(加利福尼亚州))出售的那些，包括Retro-X载体pLNCX以及pLXSN，这些载体允许克隆至多个克隆位点中并且该转基因从CMV启动子来转录。还包括来源于Mo-MuLV的载体，例如pBabe，其中该转基因将从5′LTR启动子来转录。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒或非病毒构建体来转染，所述构建体例如腺病毒、慢病毒、单纯性疱疹I病毒，或腺伴随病毒(AAV)以及基于脂质的系统。用于基因的脂质介导的转移的有用脂质是例如DOTMA、DOPE以及DC-Choi[Tonkinson(托金森)等人，癌症研究(Cancer Investigation)，14(1)：54-65(1996)]。用于基因疗法中的最优选构建体是病毒，最优选为腺病毒、AAV、慢病毒、或逆转录病毒。例如逆转录病毒构建体的病毒构建体包含至少一种转录启动子/增强子或基因座界定元件，或通过例如选择性剪接、核RNA输出或信使的翻译后修饰的其他手段来控制基因表达的其他元件。这类载体构建体还包括一个包装信号、多个长末端重复序列(LTR)或其部分，以及适合于所用病毒的正和负链引物结合位点，除非它已经存在于病毒构建体中。此外，这种构建体典型地包括用于使肽从它所安放的宿主细胞中分泌的一个信号序列。优选地，用于这一目的的信号序列是哺乳动物信号序列或本发明的多肽的信号序列。任选地，该构建体还可包括引导多聚腺苷酸化的一个信号，以及一个或多个限制位点和一个翻译终止序列。例如，这类构建体通常包括一个5′LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成的起点，以及3′LTR或其一部分。可使用非病毒性的其他载体，例如阳离子脂质、聚赖氨酸，以及树枝状化合物。
重组表达载体和宿主细胞
本发明的另一个方面涉及含有编码本发明的蛋白、或其衍生物、片段、类似物或同源物的核酸的载体，优选地是表达载体。如在此使用，术语“载体”是指能够运输它所连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒″，是指另外DNA片段可连接至其中的一个圆形双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外DNA片段可连接至病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入至其中的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入至宿主细胞中时被整合进该宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导它们可操作连接的基因的表达。这类载体在此称为“表达载体”。一般而言，可用于重组DNA技术中的表达载体经常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换地使用，因为质粒是载体的最通常使用形式。然而，本发明旨在包括充当同等功能的这类其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒以及腺伴随病毒)。
本发明的重组表达载体包括呈适合于在宿主细胞中表达核酸的形式的本发明的核酸，这意味着这些重组表达载体包括基于待用于表达的宿主细胞来选择的一种或多种调控序列，这些调控序列可操作地连接至待表达的核酸序列。在重组表达载体中，“可操作地连接”旨在表示所感兴趣的核苷酸序列以允许表达该核苷酸序列的方式连接至调控序列(例如，在体外转录/翻译系统中或在载体被引入宿主细胞中时在该宿主细胞中)。
术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子以及其他表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。这类调控序列描述于例如Goeddel(戈德尔)，基因表达技术：酶学方法(GeneExpression Technology：Methods in Enzymology)185，学术出版社(Academic Press)，圣迭戈(San Diego)，加利福尼亚州(Calif.)(1990年)中。调控序列包括引导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成性表达的那些序列以及引导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异性调控序列)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白表达水平等的因素。本发明的表达载体可引入宿主细胞中，从而产生由在此描述的核酸编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。
本发明的重组表达载体可被设计成在原核或真核细胞中产生变体蛋白。例如，本发明的蛋白可表达于例如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中。适合的宿主细胞进一步讨论于Goeddel(戈德尔)，基因表达技术：酶学方法(Gene Expression Technology：Methods in Enzymology)185，学术出版社(Academic Press)，圣迭戈(San Diego)，加利福尼亚州(Calif.)(1990年)中。可替代地，重组表达载体可在体外例如使用T7启动子调控序列以及T7聚合酶来转录和翻译。
蛋白在原核生物中的表达最经常在大肠杆菌中用含有引导融合或非融合蛋白的表达的组成性或可诱导性启动子的载体来进行。融合载体将许多氨基酸添加至其中所编码的蛋白，添加至重组蛋白的氨基或C末端。这类融合载体通常用于三个目的：(i)增加重组蛋白的表达；(ii)增加重组蛋白的溶解性；以及(iii)通过在亲和力纯化中充当配体来帮助纯化重组蛋白。经常，在融合表达载体中，将蛋白裂解位点引入至融合部分与重组蛋白的接合处以使得能够在纯化融合蛋白之后将重组蛋白与融合部分分离。这类酶、以及其同源识别序列包括因子Xa、凝血酶、PreScission、TEV以及肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；史密斯和约翰逊(Smith and Johnson)，1988.基因(Gene)67：31-40)、pMAL(纽英伦生物技术公司(New England Biolabs)，贝弗利(Beverly)，马萨诸塞州(Mass.))以及pRIT5(Pharmacia公司，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州(N.J.))，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合至目标重组蛋白。
适合的可诱导性非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amrann(阿姆兰)等人，(1988年)基因(Gene)69：301-315)以及pET 11d(Studier(斯图迪尔)等人，基因表达技术：酶学方法(Gene Expression Technology：Methods in Enzymology)185，学术出版社(Academic Press)，圣迭戈(San Diego)，加利福尼亚州(Calif.)(1990年)60-89)-不精确地，pET11a-d具有N末端T7标签。
将大肠杆菌中的重组蛋白表达最大化的一种策略是在蛋白裂解重组蛋白的能力被削弱的细菌宿主中表达该蛋白。参见例如Gottesman(高特斯曼)，基因表达技术：酶学方法(Gene Expression Technology：Methods in Enzymology)185，学术出版社(AcademicPress)，圣迭戈(San Diego)，加利福尼亚州(Calif.)(1990)119-128。另一种策略是改变待插入表达载体中的核酸的核酸序列以使得每个氨基酸的单独密码子是在大肠杆菌使用的那些优选密码子(参见例如Wada(和田)等人，1992.核酸研究(Nucl.Acids Res.)20：2111-2118)。本发明的核酸序列的这种改变可通过标准DNA合成技术来进行。解决密码子偏爱的另一种策略是使用BL21-密码子加上细菌菌株(英杰生命技术有限公司(Invitrogen))或Rosetta菌株(诺华公司(Novagen))，这些菌株含有罕见大肠杆菌tRNA基因的额外副本。
在另一个实施方案中，编码本发明的蛋白的表达载体是一种酵母表达载体。用于在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari(班得瑞)等人，1987.EMBO J.6：229-234)、pMFa(Kurjan(库尔扬)和Herskowitz(赫斯克维茨)，1982.细胞(Cell)30：933-943)、pJRY88(Schultz(舒尔茨)等人，1987.基因(Gene)54：113-123)、pYES2(英杰生命技术有限公司(Invitrogen Corporation)，圣迭戈(San Diego)，加利福尼亚州(Calif.))以及picZ(英杰生命技术有限公司，圣迭戈，加利福尼亚州)。
可替代地，本发明的多肽可在昆虫细胞中使用杆状病毒表达载体来产生。可用于蛋白在所培养的昆虫细胞(例如SF9细胞)中表达的杆状病毒载体包括pAc系列(史密斯(Smith)等人，1983.分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)3：2156-2165)以及pVL系列(Lucklow(路克劳)和Summers(萨默斯)，1989.病毒学(Virology)170：31-39)。
在又一个实施方案中，本发明的核酸在哺乳动物细胞中使用哺乳动物表达载体来表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed(希德)，1987.自然(Nature)329：840)以及pMT2PC(Kaufman等人，1987.EMBO J.6：187-195)、pIRESpuro(Clontech)、pUB6(英杰生命技术有限公司(Invitrogen))、pCEP4(英杰生命技术有限公司)、pREP4(英杰生命技术有限公司)、pcDNA3(英杰生命技术有限公司)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能经常由病毒调控元件来提供。例如，通常使用的启动子来源于多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒、劳斯肉瘤病毒以及猿病毒40。关于用于原核和真核细胞的其他适合的表达系统，参见例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual.)第2版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州(Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)，1989的第16和17章。
在另一个实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够引导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，使用组织特异性调控元件来表达核酸)。组织特异性调控元件是本领域中已知的。适合的组织特异性启动子的非限制实例包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert(平克特)等人，1987基因和发育(Genes Dev.)268-277)、淋巴特异性启动子(Calame(卡拉姆)和Eaton(伊顿)，1988免疫学进展(Adv.Immunol.)43：235-275)、尤其T细胞受体(Winoto(温诺托)和Baltimore(巴尔的摩)，1989 EMBO J.8：729-733)和免疫球蛋白的启动子(Banerji等人1983细胞(Cell)33：729-740；Queen(昆)和Baltimore(巴尔的摩)，1983.细胞(Cell)33：741-748)、神经元特异性启动子(例如神经微丝启动子；Byrne(伯恩)和Ruddle(拉德尔)1989美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 86：5473-5477)、胰腺特异性启动子(Edlunch((艾德伦齐)等人1985科学(Science)230：912-916)或乳腺特异性启动子(例如乳清启动子；美国专利号4,873,316以及欧洲申请公布号264，166)。还涵盖发育调控启动子，例如鼠hox启动子(Kessel(凯塞尔)和Gruss(格鲁斯)，1990年.科学(Science)249：374-379)以及α-胎蛋白启动子(Campes(康珀斯)和Tilghman(蒂尔曼)，1989年.基因和发育3：537-546).
本发明在至少一些实施方案中进一步提供一种重组表达载体，它包括以反义取向克隆至该表达载体中的本发明的DNA分子。也就是说，该DNA分子以允许表达(通过DNA分子的转录)与编码本发明的蛋白的mRNA呈反义的RNA分子的方式可操作地连接至调控序列。可操作地连接至以反义取向克隆的核酸的调控序列可被选择成引导反义RNA分子在各种细胞类型中的连续表达，例如病毒启动子和/或增强子，或调控序列可被选择成引导反义RNA的组成性、组织特异性或细胞类型特异性表达。反义表达载体可呈重组质粒、噬菌粒或减毒病毒形式，其中反义核酸在一个高效率调控区的控制下产生，该高效率调控区的活性可由将载体引入其中的细胞类型来确定。关于使用反义基因来调控基因表达的讨论，参见例如Weintraub(温特劳布)等人，“作为基因分析的分子工具的反义RNA(Antisense RNA as amolecular tool for genetic analysis)”遗传学趋势评论(Reviews-Trends inGenetics)，第1(1)卷1986年。
本发明的另一个方面涉及本发明的重组表达载体已引入其中的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在此可互换地使用。应理解这类术语不仅涉及具体对象细胞，而且涉及这种细胞的子代或潜在子代。因为某些变化可在后代中由于突变或环境影响而发生，这种子代可能在事实上与亲代细胞不同，但是仍然包括在如在此使用的术语范围内。
宿主细胞可为任何原核或真核细胞。例如，本发明的蛋白可在例如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞、酵母、植物或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS或293细胞)中产生。其他适合的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
载体DNA可经由常规转化或转染技术而引入原核或真核细胞中。如在此使用，术语“转化”和“转染”用来指用于将外来核酸(例如，DNA)引入宿主细胞中的各种本领域认可的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导转染、脂质转染、或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可发现于萨姆布鲁克(Sambrook)等人(分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.)第2版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.)，1989)以及其他实验手册中。
为了稳定转染哺乳动物细胞，已知取决于所使用的表达载体以及转染技术，只有小部分的细胞可将外来DNA并入其基因组中。为了鉴定并且选择这些构成组分(integrant)，通常将编码选择标记(例如，抗生素抗性)的基因与所感兴趣的基因一起引入宿主细胞中。各种选择标记包括赋予对于例如G418、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素以及甲氨喋呤的药物的抗性的那些标记。编码选择标记的核酸可在与编码本发明蛋白的核酸相同的载体上被引入至宿主细胞中或可引入独立载体中。用所引入的核酸稳定转染的细胞可通过药物选择来鉴定(例如，并入有选择标记基因的细胞将存活，而其他细胞将死亡)。
培养中的本发明的宿主细胞，例如原核或真核宿主细胞，可用于产生(即，表达)本发明的蛋白。因此，本发明在至少一些实施方案中进一步提供使用本发明的宿主细胞来产生本发明蛋白的方法。在一个实施方案中，该方法包括在适合的培养基中培养本发明的宿主细胞(编码本发明的蛋白的重组表达载体已引入其中)以使得产生本发明的蛋白。在另一个实施方案中，该方法进一步包括将本发明的蛋白从该培养基或宿主细胞中分离。
为了有效产生蛋白，最好将编码本发明的蛋白的核苷酸序列置于针对在所希望宿主中的表达予以优化的表达控制序列的控制之下。例如，这些序列可包括优化的转录和/或翻译调控序列(例如改变的Kozak序列)。
应注意，根据本发明的至少一些实施方案，如在此描述的C1ORF32多肽可任选地分离为天然发生的多肽，或从不论天然、合成、半合成或重组的任何来源而分离。因此，C1ORF32蛋白可以从任何物种，特别是哺乳动物，包括牛、羊、猪、鼠、马，并且优选是人类，被分离为天然发生的蛋白。可替代地，C1ORF32蛋白可以被分离为在原核生物或真核生物宿主细胞中表达的重组多肽，或分离为化学合成的多肽。
本领域技术人员可容易地使用标准分离方法来获得分离的C1ORF32蛋白。分离的性质和程度取决于所分离分子的来源以及期望的用途。
基因疗法
根据本发明的至少一些实施方案，编码在此描述的可溶性C1ORF32多肽的核酸序列可用于治疗在此描述的任何免疫相关病症的基因疗法中。
如在此使用，“基因疗法”是通过基因操纵以使得一个核酸序列转移至一个细胞中，该细胞然后表达由该核酸编码的任何基因产物来治疗疾病的过程。例如，如本领域技术人员熟知的，核酸转移可通过经由各种方法离体或在体外将含有所感兴趣的核酸的表达载体插入细胞中来进行，这些各种方法包括例如磷酸钙沉淀、二乙氨基乙基葡聚糖、聚乙二醇(PEG)、电穿孔、直接注射、脂质转染或病毒感染(萨拉布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)1989年)；Kriegler(克里格勒)M.基因转移和表达：实验手册(Gene Transfer ad Expression：A Laboratory Manual)(W.H.弗里曼公司，纽约市，纽约州(W.H.Freeman and Co，New York，N.Y.)，1993)以及Wu(吴)，酶学方法(Methods inEnzymology)(学术出版社，纽约市(Academic Press，New York)，1993)。可替代地，所感兴趣的核酸序列可在体内在各种载体中以及通过各种方法转移至细胞中，这些各种方法包括例如将核酸直接给予至受试者体内，或将核酸插入病毒载体中并用该病毒感染受试者。用于体内转移的其他方法包括将核酸封装至脂质体中，以及将脂质体、或与红血球凝集性仙台病毒(Sendai virus)组合的脂质体直接转移至受试者。转染或感染的细胞表达由核酸编码的蛋白产物以便改进疾病或疾病症状。
蛋白化学修饰
在本发明中，本发明的蛋白的任何部分可任选地化学修饰，即通过添加官能团来改变。例如，出现在原生序列中的侧氨基酸残基可任选地修饰，但是替代地如下所述，除了侧氨基酸残基以外或代替侧氨基酸残基，蛋白的其他部分可任选地修饰。如果遵循一个化学合成过程，可任选地在分子合成期间进行修饰，例如通过添加化学修饰的氨基酸。然而，已经存在于分子中的氨基酸的化学修饰(“原位”修饰)也是可能的。
该分子的任何序列区的氨基酸可任选地根据以下示例性类型的修饰中的任何一种(在概念地被视为“化学修饰”的肽中)来修饰。非限制性示例性类型的修饰包括羧甲基化、酰化、磷酸化、糖基化或脂肪酰化。醚键可任选地用于将丝氨酸或苏氨酸羟基连接至糖的羟基。酰胺键可任选地用于将谷氨酸或天冬氨酸羧基连接至糖上的氨基(Garg(盖尔格)和Jeanloz(扬洛兹)，碳水化合物化学与生物化学进展(Advances in CarbohydrateChemistry and Biochemistry)，第43卷，学术出版社(Academic Press)(1985)；Kunz(孔兹)，应用化学(Ang.Chem.)国际版英语26：294-308(1987年))。缩醛和缩酮键也可任选地形成于氨基酸与碳水化合物之间。可任选地例如通过游离氨基(例如赖氨酸)的酰化来制成脂肪酸酰基衍生物(Toth(托斯)等人，肽：化学、结构以及生物学(Peptides：Chemistry，Structure and Biology)，Rivier(里维尔)和Marshal(马歇尔)，编著，ESCOM Publ.，莱顿(Leiden)，1078-1079(1990年))。
如在此使用，术语“化学修饰”，在关于根据本发明的蛋白或肽时是指其中它的氨基酸残基中的至少一个残基通过天然过程，例如加工或其他翻译后修饰，亦或通过本领域中熟知的化学修饰技术来修饰的蛋白或肽。许多已知修饰的实例通常包括但不局限于：乙酰化、酰化、酰胺化、ADP-核糖基化、糖基化、GPI锚定物形成、脂质或脂质衍生物的共价连接、甲基化、十四烷基化、聚乙二醇化、异戊烯化、磷酸化、泛素化，或任何类似过程。
其他类型的修饰任选地包括添加环烷烃部分至生物分子，例如像在PCT申请号WO2006/050262中描述的蛋白，该申请通过引用结合在此，如同完全在此阐明一样。这些部分被设计成与生物分子一起使用并且可任选地用于向蛋白赋予不同特性。
此外，任选地在蛋白上的任何点可被修饰。例如，蛋白上的糖基化部分的聚乙二醇化可任选地进行，如PCT申请号WO2006/050247中所描述，该申请通过引用结合在此，如同完全在此阐明一样。一个或多个聚乙二醇(PEG)基团可任选地添加至O-连接和/或N-连接的糖基化。PEG基团可任选地为分支的或直链的。任选地，任何类型的水溶性聚合物可经由糖基连接物连接至蛋白上的糖基化位点。
改变的糖基化蛋白修饰
本发明的蛋白可被修饰以便具有改变的糖基化型式(即，从原始或原生糖基化型式改变)。如在此使用，“改变”是指具有一个或多个碳水化合物部分缺失，和/或具有至少一个糖基化位点添加至原始蛋白。
蛋白的糖基化通常是N-连接亦或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分附接至天冬酰胺残基的侧链。其中X为除脯氨酸以外的任何氨基酸的三肽序列，天冬酰胺-X-丝氨酸以及天冬酰胺-X-苏氨酸，是将碳水化合物部分酶促附接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中的这些三肽序列中的任何一个的存在产生潜在糖基化位点。O-连接糖基化是指将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一个附接至羟基氨基酸，最通常为丝氨酸或苏氨酸，但是也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
添加糖基化位点至本发明的蛋白便利地通过改变蛋白的氨基酸序列以使得它含有一个或多个上述三肽序列来完成(对于N-连接糖基化位点)。改变也可通过原始蛋白的序列中的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的添加或取代来造成(对于O-连接糖基化位点)。蛋白的氨基酸序列也可通过引入DNA水平上的变化来改变。
增加蛋白上的碳水化合物部分的数量的另一种手段是通过将糖苷以化学或酶法偶联至蛋白的氨基酸残基。取决于所使用的偶联模式，糖可连接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基，例如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些，(e)芳香族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于WO 87/05330以及Aplin(艾波林)和Wriston(里斯顿)，CRC生物化学关键评论(CRC Crit.Rev.Biochem.)，22：259-306(1981年)中。
去除存在于本发明的蛋白上的任何碳水化合物部分可以化学、酶法或通过引入DNA水平上的变化来完成。化学去糖基化要求将蛋白暴露于三氟甲磺酸，或等效化合物。这种治疗导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)以外的大多数或所有糖裂解，留下氨基酸序列为完整的。
化学去糖基化由Hakimuddin(哈吉姆丁)等人，生物化学与生物物理学档案(Arch.Biochem.Biophys.)，259：52(1987)；以及Edge(艾什)等人，分析生物化学(Anal.Biochem.)，118：131(1981年)描述。蛋白上的碳水化合物部分的酶促裂解可使用各种内切和外切糖苷酶如Thotakura(索塔库拉)等人，酶学方法(Meth.EnzymoL)，138：350(1987年)中描述来实现。＜
治疗方法
如在上文中提到，本发明的C1ORF32蛋白和多肽、或其核酸序列或片段，尤其C1ORF32蛋白的胞外域或分泌形式，可以用于治疗在此描述的任何免疫相关病症。
因此，根据本发明的一个另外方面，提供了一种治疗免疫相关病症的方法。
如在此使用，术语“治疗”是指预防、延缓发病、治愈、逆转、减弱、减轻、最小化、抑制或阻止以上描述疾病、病症或病状的有害影响。它还包括管理如上所述的疾病。“管理”是指降低疾病的严重度、降低疾病发作频率、减少这类发作的持续时间、降低这类发作的严重度等。
根据本发明，治疗可通过特异性地上调本发明的至少一种多肽在受试者体内的量和/或表达来实现。
任选地，上调可通过向受试者给予在此描述的本发明的至少一种多肽(例如，重组或合成的)或其活性部分来实现。然而，因为较大多肽的生物利用率可能由于高降解率以及低渗透率而潜在地相对较小，多肽的给予优选地被限制于小肽片段(例如，约100个氨基酸)。多肽或肽可以任选地作为药用组合物的一部分来给予，以下更详细描述。
将理解，根据本发明的至少一些实施方案的以上描述疾病的治疗可与在此描述的在本领域中已知的其他治疗方法组合(即，组合疗法)。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂来治疗多发性硬化可与例如治疗多发性硬化的任何已知治疗剂或方法组合。治疗多发性硬化的这种已知治疗剂或方法的非限制实例包括干扰素类、IFN-β-1a(以及)以及IFN-β-1b乙酸格拉替雷一种多肽；那他珠单抗以及米托蒽醌一种细胞毒性剂，氨吡啶其他药物包括皮质类固醇、甲氨喋呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤，以及静脉内免疫球蛋白(IVIG)、肌苷、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab；R1594)、米留斯(Mylinax；Caldribine)、阿来组单抗(alemtuzumab；Campath)、达利珠单抗(daclizumab；Zenapax)、Panaclar/延胡索酸二甲酯(BG-12)、特立氟胺(Teriflunomide；HMR1726)、芬戈莫德(fingolimod；FTY720)、拉喹莫德(laquinimod；ABR216062)，以及造血干细胞移植、Neurovax、利妥昔单抗(Rituximab；Rituxan)、BCG疫苗、低剂量纳曲酮(naltrexone)、驱虫疗法、血管成形术、静脉支架，以及替代疗法，例如维生素D、多不饱和脂肪、医用大麻。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂来治疗类风湿性关节炎可与例如治疗类风湿性关节炎的任何已知治疗剂或方法组合。治疗类风湿性关节炎的这类已知治疗剂或方法的非限制实例包括糖皮质激素、非类固醇抗炎症药物(NSAID)例如水杨酸酯，或环氧酶-2抑制剂、布洛芬(ibuprofen)和萘普生(naproxen)、双氯芬酸(diclofenac)、吲哚美辛(indomethacin)、依托度酸(etodolac)、疾病改进抗风湿药物(DMARD)-口服DMARD：金诺芬(Auranofin；Ridaura)、硫唑嘌呤(Azathioprine；Imuran)、环孢素(山地明(Sandimmune)、金格福(Gengraf)、内奥拉尔(Neoral)，通用名称)、D-青霉胺(Cuprimine)、羟氯喹(Plaquenil)、IM金硫代苹果酸金钠(Myochrysine)、金硫葡糖(Solganal)、来氟米特(Arava)、甲氨喋呤(Rheumatrex)、二甲胺四环素(Minocycline)(美满霉素(Minocin))、金黄色葡萄球菌蛋白A免疫吸附(Prosorba管柱)、柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine，Azulfidine)。生物DMARD：TNF-α阻断剂，包括阿达木单抗(Adalimumab；Humira)、依那西普(Etanercept；Enbrel)、英利昔单抗(Infliximab；Remicade)、戈利木单抗(golimumab；Simponi)、塞妥珠单抗(certolizumab pegol；Cimzia)，以及其他生物DMARD，例如阿那白滞素(Anakinra；Kineret)、利妥昔单抗(Rituximab；Rituxan)、托珠单抗(Tocilizumab；Actemra)，CD28抑制剂，包括阿巴西普(Abatacept；Orencia)以及贝拉西普(Belatacept)。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂来治疗IBD可以与例如治疗IBD的任何已知治疗剂或方法组合。治疗IBD的这类已知治疗剂或方法的非限制实例包括控制症状的免疫抑制，例如泼尼松(prednisone)、美沙拉嗪(Mesalazine；包括安萨科(Asacol)、颇得斯安(Pentasa)、Lialda、Aspiro)、硫唑嘌呤(Azathioprine，Imuran)、甲氨喋呤或6-巯基嘌呤、类固醇、昂丹司琼(Ondansetron)、TNF-α阻断剂(包括英利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、塞妥珠单抗)、奥瑞希纳(Orencia；阿巴西普(abatacept))、乌泰努单抗(ustekinumab；)、必克努单抗(Briakinumab；ABT-874)、塞妥珠单抗(Certolizumab pegol，)、ITF2357(吉韦斯他(givinostat))、那他珠单抗(Natalizumab；Tysabri)、非拉司特(Firategrast；SB-683699)、英利昔单抗(Remicade；infliximab)、维多珠单抗(vedolizumab；MLN0002)，其他药物包括GSK1605786 CCX282-B(Traficet-EN)、AJM300、Stelara(乌泰努单抗)、塞马莫德(Semapimod；CNI-1493)、他斯替米(tasocitinib；CP-690550)、LMW肝素MMX、布地缩松(Budesonide)MMX、Simponi(戈利木单抗)、加卫苗(Gardasil)HPV疫苗、爱巴苏(Epaxal Berna；病毒体甲型肝炎疫苗)，手术，例如肠切除、狭部成形术或临时或持久结肠造口术或回肠造口术；抗真菌药物，例如制霉菌素(一种广谱消化道抗真菌剂)以及伊曲康唑(itraconazole；斯皮仁诺(Sporanox))或氟康唑(fluconazole；大扶康(Diflucan))；替代药物、益生元以及益生菌、大麻，驱虫疗法或猪鞭虫卵子。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂来治疗牛皮癣可以与例如治疗牛皮癣的任何已知治疗剂或方法组合。治疗牛皮癣的这类已知治疗剂的非限制实例包括通常用于轻微疾病的外用剂、用于中度疾病的光线疗法，以及用于严重疾病的全身剂。外用剂的非限制实例：沐浴溶液和保湿剂、矿物油以及凡士林油；含有以下物质的药膏和乳膏：煤焦油、蒽三酚(蒽啉)、皮质类固醇如去羟米松(desoximetasone，Topicort)、倍他米松(Betamethasone)、氟轻松乙酸酯(fluocinonide)、维生素D3类似物(例如卡泊三醇(calcipotriol))，以及维甲酸。光线疗法的非限制实例：日光；311-313nm的波长、补骨脂素以及紫外线A光线疗法(PUVA)。全身剂的非限制实例：生物制剂，例如白介素拮抗剂，TNF-α阻断剂，包括抗体，例如英利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)、戈利木单抗、塞妥珠单抗，以及重组TNF诱饵受体、依那西普(Enbrel)；靶向T细胞的药物，例如伊法利单抗(efalizumab；Xannelim/Raptiva)、阿法赛特(alefacept；Ameviv)、树突状细胞诸如伊法利单抗；靶向细胞因子的单克隆抗体(MAb)，包括抗-IL-12/IL-23(乌泰努单抗(商标Stelara))以及抗-白介素-17；必克努单抗(ABT-874)；小分子，包括但不局限于ISA247；免疫抑制剂，例如甲氨喋呤、环孢素；维生素A以及维甲酸(维生素A的合成形式)；以及替代疗法，例如改变饮食和生活方式、禁食期、低能量饮食以及素食饮食、补充富含维生素A和维生素D的鱼油(例如鱼肝油)、富含两种Ω-3脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸酸(DHA)的鱼油并且含有维生素E的饮食、鱼疗(Ichthyotherapy)、催眠术疗法、大麻。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂来治疗1型糖尿病可以与例如治疗1型糖尿病的任何已知治疗剂或方法组合。治疗1型糖尿病的这类已知治疗剂的非限制实例包括胰岛素、胰岛素类似物、胰岛移植、干细胞疗法，包括非胰岛素疗法，例如IL-1β抑制剂，包括阿那白滞素阿巴西普戴艾米(Diamyd)、阿法赛特奥西珠单抗(Otelixizumab)、DiaPep277(Hsp60衍生肽)、α1-抗胰蛋白酶、泼尼松、硫唑嘌呤、环孢素、E1-INT(包含表皮生长因子类似物和胃泌素类似物的可注射胰岛再生疗法)，他汀类药物，包括西他列汀(Sitagliptin；二肽基肽酶(DPP-4)抑制剂)、抗-CD3 mAb(例如替丽珠单抗(Teplizumab))；CTLA4-Ig(阿巴西普)、抗IL-1β(康纳单抗(Canakinumab))、抗-CD20 mAb(例如，利妥昔单抗)。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂来治疗葡萄膜炎可以与例如治疗葡萄膜炎的任何已知治疗剂或方法组合。治疗葡萄膜炎的这类已知治疗剂的非限制实例包括皮质类固醇、外用睫状肌麻痹剂，例如阿托品(atropine)或后马托品(homatropine)，或PSTTA注射剂(后眼筋膜囊下乙酸去炎松(posterior subtenon triamcinoloneacetate))、抗代谢物药物，例如甲氨喋呤、TNF-α阻断剂(包括英利昔单抗、阿达木单抗、依那西普、戈利木单抗、塞妥珠单抗)。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂来治疗舍格伦氏综合征可以与例如治疗舍格伦氏综合征的任何已知治疗剂或方法组合。治疗舍格伦氏综合征的这类已知治疗剂的非限制实例包括环孢素、匹鲁卡品(pilocarpine；Salagen)以及西维美林(cevimeline；Evoxac)、羟氯喹(Plaquenil)、可的松(cortisone；泼尼松以及其他)和/或硫唑嘌呤(Imuran)或环磷酰胺(Cytoxan)、地塞米松、沙立度胺、去氢表雄酮、NGX267、瑞巴派特(Rebamipide)、FID114657、依那西普(Etanercept)、Raptiva、贝利木单抗、MabThera(利妥昔单抗)；阿那白滞素、静脉内免疫球蛋白(IVIG)、异体骨髓间充质干细胞(AlloMSC)、“Saliwell Crown”的自动神经电刺激。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂来治疗全身性红斑狼疮可以与例如治疗全身性红斑狼疮的任何已知治疗剂或方法组合。治疗全身性红斑狼疮的这类已知治疗剂的非限制实例包括皮质类固醇以及疾病改进抗风湿药物(DMARD)、通常抗患疟疾药物例如普拉奎尼(plaquenil)以及免疫抑制剂(例如甲氨喋呤和硫唑嘌呤)、羟氯喹、细胞毒性药物(例如环磷酰胺和霉酚酸酯)、羟氯喹(HCQ)、Benlysta(贝利木单抗)、非类固醇抗炎症药物、泼尼松、骁悉(Cellcept)、普乐可复(Prograf)、阿塞西普(Atacicept)、Lupuzor、静脉内免疫球蛋白(IVIG)、CellCept(霉酚酸酯)、奥瑞希纳(Orencia)、CTLA4-IgG4m(RG2077)、利妥昔单抗、奥瑞珠单抗、依帕珠单抗、CNTO136、西法木单抗(Sifalimumab；MEDI-545)、A-623(以前AMG623)、AMG557、罗利珠单抗、帕喹莫德(paquinimod；ABR-215757)、LY2127399、CEP-33457、去氢表雄酮、左旋甲状腺素、阿贝莫司钠(abetimussodium；LJP394)、美金刚、阿片类药物、雷帕霉素、肾移植、干细胞移植。
本发明在至少一些实施方案中还涵盖连同治疗免疫系统疾病的其他药剂一起使用根据至少一些实施方案的本发明的组合物。例如，MS疾病可用本发明的分子结合但是不局限于以下物质来治疗：免疫抑制剂，例如皮质类固醇、环孢菌素、泼尼松、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、TNF-α阻断剂或拮抗剂，或靶向任何炎症细胞因子的任何其他生物制剂、非类固醇抗炎症药物/Cox-2抑制剂、羟氯喹、柳氮磺吡啶(sulphasalazopryine)、金盐、依那西普、英利昔单抗、雷帕霉素、霉酚酸酯、硫唑嘌呤、他克莫司、巴利昔单抗、癌得星(Cytoxan)、干扰素β-1a、干扰素β-1b、乙酸格拉替雷、米托蒽醌盐酸盐、阿那白滞素和/或其他生物制剂。C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白也可结合一种或多种以下调控免疫应答的药剂来使用：可溶性gp39(又称为CD40配体(CD40L)、CD154、T-BAM、TRAP)、可溶性CD29、可溶性CD40、可溶性CD80(例如ATCC68627)、可溶性CD86、可溶性CD28(例如68628)、可溶性CD56、可溶性Thy-1、可溶性CD3、可溶性TCR、可溶性VLA-4、可溶性VCAM-1、可溶性LECAM-1、可溶性ELAM-1、可溶性CD44、与gp39反应的抗体(例如ATCC HB-10916、ATCC HB-12055以及ATCC HB-12056)、与CD40反应的抗体(例如ATCC HB-9110)、与B7反应的抗体(例如ATCC HB-253、ATCC CRL-2223、ATCC CRL-2226、ATCC HB-301、ATCC HB-11341等)、与CD28反应的抗体(例如ATCC HB-11944或mAb 9.3)、与LFA-1反应的抗体(例如ATCC HB-9579和ATCC TIB-213)、与LFA-2反应的抗体、与IL-2反应的抗体、与IL-12反应的抗体、与IFN-γ反应的抗体、与CD2反应的抗体、与CD48反应的抗体、与任何ICAM反应的抗体(例如ICAM-1(ATCC CRL-2252)、ICAM-2以及ICAM-3)、与CTLA4反应的抗体(例如ATCC HB-304)、与Thy-1反应的抗体、与CD56反应的抗体、与CD3反应的抗体、与CD29反应的抗体、与TCR反应的抗体、与VLA-4反应的抗体、与VCAM-1反应的抗体、与LECAM-1反应的抗体、与ELAM-1反应的抗体、与CD44反应的抗体。在某些实施方案中，单克隆抗体是优选的。在其他实施方案中，抗体片段是优选的。如本领域技术人员将容易理解，组合可包括C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白与一种其他免疫抑制剂、与两种其他免疫抑制剂、与三种其他免疫抑制剂等。确定优化组合以及剂量可使用本领域中熟知的方法来确定并优化。
C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白也可结合一种或多种以下药剂来使用：L104EA29YIg、CD80单克隆抗体(mAb)、CD86 mAb、gp39 mAb、CD40 mAb、CD28 mAb；抗-LFA1mAb、靶向免疫系统机制例如CD52(阿来组单抗)、CD25(达利珠单抗)、VLA-4(那他珠单抗)、CD20(利妥昔单抗)、IL2R(达利珠单抗)以及MS4A1(奥瑞珠单抗)的抗体或其他药剂；新的口服免疫调节剂已表明可防止淋巴细胞从淋巴器官再循环，例如芬戈莫德(fingolimod；FTY720)或导致淋巴细胞耗尽，例如米留斯(口服克拉屈滨(cladribine))或特立氟胺(teriflunomide)；以及防止免疫活化的药剂，例如panaclar(延胡索酸二甲酯BG-12)或拉喹莫德(ABR216062)。其他组合将容易由本领域技术人员认识到并且理解。
可溶性C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白可作为单独活性成分或连同免疫调节方案中的其他药物或其他抗炎症剂一起给予例如用于治疗或预防同种异体或异种移植急性或慢性排斥反应或炎症性或自身免疫病症，或诱导耐受性。例如，它可与以下物质组合使用：钙调磷酸酶抑制剂，例如环孢菌素A或FK506；免疫抑制大环内酯类，例如雷帕霉素或其衍生物；例如40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素、淋巴细胞归巢剂，例如FTY720或其类似物、皮质类固醇；环磷酰胺；咪唑硫嘌呤；甲氨喋呤；来氟米特或其类似物；咪唑立宾；麦可酚酸；霉酚酸酯；15-脱氧精胍菌素或其类似物；免疫抑制单克隆抗体，例如白细胞受体的单克隆抗体，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD11a/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40、4-1BB或其配体；或其他免疫调节化合物，例如CTLA4/CD28-Ig，或其他粘附分子抑制剂，例如mAb或低分子量抑制剂，包括LFA-1拮抗剂、选择蛋白拮抗剂以及VLA-4拮抗剂。
当C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白结合例如在上文中指定的其他免疫抑制/免疫调节或抗炎症疗法来给予时，共同给予的免疫抑制剂、免疫调节或抗炎症化合物的剂量当然取决于所使用的共用药物的类型(例如它是类固醇或是环孢菌素)、所使用的具体药物、所治疗的病状等等而变化。
治疗使用的方法
在此披露的C1ORF32多肽，或其片段或融合作为治疗剂是有用的。根据至少一些实施方案，免疫细胞，优选地T细胞，可在体内或离体与C1ORF32融合多肽接触以便降低或抑制免疫应答，包括但不局限于炎症。与C1ORF32融合多肽接触的T细胞可以是表达T细胞受体，包括α/β以及γ/6T细胞受体的任何细胞。T-细胞包括表达CD3的所有细胞，包括还表达CD4和CDS的T-细胞子集。T-细胞包括初始和记忆细胞以及效应细胞，例如CTL。T-细胞还包括例如Th1、Tc1、Th2、Tc2、Th3、Th17、Th22、Treg以及Tr1细胞的细胞。T-细胞还包括NKT-细胞以及T-细胞谱系的相似独特类别。例如，这些组合物可用于调节Th1、Th17、Th22或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞，这些炎症分子包括但不局限于IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP。这些组合物也可用于增加或促进Treg的活性、增加Treg的例如IL-10细胞因子的产生、增加Treg的分化、增加Treg的数量或增加Treg的存活。这些组合物也可用于增加或促进Th2细胞的活性、增加Th2细胞的例如IL-10或IL-4细胞因子的产生、增加Th2细胞的分化、增加Th2细胞的数量或增加Th2细胞的存活。
在一些实施方案中，所披露的C1ORF32多肽，其片段或融合物结合第二治疗剂来给予。组合疗法可以适用于免疫调节。在一些实施方案中，C1ORF32多肽，或片段，或融合物可用于减弱或逆转促炎症性药物的活性，和/或限制这类药物的不良影响。可以用所披露的C1ORF32多肽、其片段或融合物来治疗的其他免疫细胞包括T细胞前体、抗原呈递细胞(例如树突状细胞和单核细胞或其前体)、B细胞或其组合。C1ORF32组合物可用于调节B细胞的抗体产生，方法是通过使B细胞与有效量的C1ORF32组合物接触以便相对于对照来抑制或减少B细胞的抗体产生。C1ORF32组合物也可调节B细胞的细胞因子产生。
治疗炎症应答的方法
C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白抑制T细胞活化，如T细胞增殖以及细胞因子分泌所表明的。确切地，这些蛋白抑制Th1和Th17应答，同时促进Th2应答。
C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白潜在地用于治疗要求下调共刺激通路和/或因此要求下调Th1和/或Th17应答的疾病。
另一个实施方案提供治疗或减轻炎症的一个或多个症状的方法。在一个进一步的实施方案中，所披露的这些组合物以及方法可以用于治疗慢性并且持续的炎症。炎症一般可以使用所披露的C1ORF32多肽或其片段或融合物来治疗。
可抑制或降低受试者(优选为人类)的免疫应答(包括炎症)，方法是给予有效量的C1ORF32多肽或其片段或融合物以便抑制或减少免疫细胞的生物活性或减少炎症部位的促炎症分子的量。示例性促炎症分子包括但不局限于IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP。Th1和Th17是可以被C1ORF32多肽、其融合蛋白或片段靶向而抑制以便抑制或减少炎症的示例性T细胞。
不希望受关于此生物机制或在此描述的任何其他生物机制的单一假设限制，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白可以用于通过任何或所有以下机制来治疗炎症：抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的分化，这些炎症分子包括但不局限于IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP；抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的活性，这些炎症分子包括但不局限于IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP；抑制或减少Th1和/或Th17通路；抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的细胞因子产生和/或分泌，这些炎症分子包括但不局限于IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6IL-23、IL-22、IL-21以及MMP；抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的增殖，这些炎症分子包括但不局限于IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP。
额外地，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白还可以增强Th2免疫应答。C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白还可以直接作用于Th2细胞以便促进或增强IL-4、IL-5或IL-10的产生，或增加Th2细胞的数量，从而导致Th1和/或Th17的抑制，以及经由Th1/Th2转变的免疫调节。
额外地，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白可导致Treg对于免疫应答具有增强的抑制作用。Treg可抑制Th1、Th17、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌，这些炎症分子包括但不局限于IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP。例如，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白可引起Treg对于Th1和/或Th17细胞具有增强的抑制作用以便相应地减少所产生的IFN-γ和IL-17水平。C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白还可直接作用于Treg以便促进或增强IL-10的产生，从而抑制Th1和/或Th17通路，和/或增加Treg的数量。
额外地，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白可以引起Th2对于免疫应答具有增强的调节作用。Th2细胞可调节Th1、Th17、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌，这些炎症分子包括但不局限于IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP。例如，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白可引起Th2细胞对于Th1和/或Th17细胞具有增强的调节作用，以便相应地减少所产生的IFN-γ和IL-17的水平。C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白还可直接作用于Th2细胞以便促进或增强IL-10的产生，从而抑制Th1和/或Th17通路，和/或增加Th2细胞的数量。
不希望受单一假设限制，据信C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白作用于多个T细胞通路中的多个点。例如，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白可抑制初始T细胞分化成Th1或Th17细胞。可替代地，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白可与Th1细胞或Th17细胞或这两种细胞相互作用以便抑制或减少促炎症分子的产生。
额外地，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白可增加Th2分化和/或促进Th2应答，导致对于Th1和/或Th17通路的免疫调节作用，从而减少所产生的INF-γ和/或IL-17的水平。C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白增强IL-10从细胞(例如Th2和/或Treg)产生，这进而抑制Th1和/或Th17细胞的活性。
额外地，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白可以影响Treg，以便对于Th1和/或Th17通路具有增强的抑制作用，从而减少所产生的INF-γ和/或IL-17的水平。额外地，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白可以增强对Th1和/或Th17细胞活性进行抑制的IL-10的产生。
抑制Th1应答
a.抑制Th1发育
抑制或减少炎症的一种方法包括给予有效量的C1ORF32多肽、其融合蛋白、变体或其片段，以便抑制对其有需要的受试者的Th1发育。可通过给予C1ORF32多肽、其融合蛋白、片段或其变体来阻断初始T细胞分化成Th1细胞，从而抑制或降低炎症。在一个实施方案中，C1ORF32多肽或其融合蛋白可抑制或减少Th1细胞的增殖。C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白也可通过阻断抗原呈递细胞成熟来减少初始T细胞分化成Th1细胞。可替代地，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白增加Th2细胞分化并且由此减少受试者的Th1细胞数。通过限制可以在受试者体内发育的Th1细胞的数量，可以降低或遏制促炎症分子，例如INF-γ的量。INF-γ刺激包括IL-1β、TNF-a以及MMP的其他促炎症分子的产生或释放。因此，通过控制受试者中的Th1细胞数，可以控制这些其他促炎症分子的水平，由此减少炎症应答。
b.抑制促炎症分子
另一个实施方案提供一种通过向受试者给予有效量的C1ORF32多肽、其融合蛋白或其片段，以便抑制或减少Th1细胞的促炎症分子产生，来抑制或减少受试者中的炎症的方法。
Th1细胞产生的示例性促炎症分子包括IFN-γ。在此实施方案中，C1ORF32多肽、其融合蛋白或其片段可以直接与Th1细胞相互作用并且抑制或减少Th1细胞的IFN-γ产生。在此实施方案中，调控促炎症分子的量而非Th1细胞的群体。
抑制Th17应答
a.抑制Th17发育
还可通过给予有效量的C1ORF32多肽、其片段或融合物以便抑制或阻断初始T细胞发育成Th17细胞来抑制或减少受试者中的炎症。在一个实施方案中，C1ORF32多肽或融合蛋白将Treg对于初始T细胞分化成Th17细胞的抑制活性增加了足以减少受试者的Th17细胞数的量。可替代地，C1ORF32多肽或其融合蛋白抑制或减少Th17细胞的增殖。C1ORF32多肽或其融合蛋白也可以通过阻断抗原呈递细胞成熟来减少初始T细胞分化成Th17细胞。通过减少受试者的Th17细胞群，可以减少IL-17，以及IL-22和IL-21的量。IL-17是引起其他促炎症分子，例如IL-1β、TNF-α以及MMP增加的促炎症细胞因子。因此，通过减少IL-17的量，可减少这些其他促炎症分子，从而减少或抑制炎症。
b.抑制IL-17产生
仍另一个实施方案提供一种通过给予有效量的C1ORF32多肽、其融合蛋白或其片段以便抑制Th17细胞的IL-17以及IL-22和IL-21产生来治疗受试者中炎症的方法。在此实施方案中，C1ORF32多肽或融合蛋白可以直接作用于Th17细胞，例如通过结合至Th17细胞，导致抑制那些Th17细胞的IL-17(或IL-22和IL-21)产生。如以上提及，抑制或减少IL-17(以及IL-22或IL-21)导致减少其他促炎症分子，由此减少或抑制炎症。
抑制Th1和Th17应答
所披露的C1ORF32多肽、其融合蛋白以及片段可以用于同时抑制Th1和Th17通路。使用一种抗炎症剂来抑制两种单独通路提供了免疫应答的更鲁棒抑制或减少。
促进Th2应答和IL-10产生。
还可通过将C1ORF32多肽、其融合蛋白或其片段以有效增强Th2应答以及IL-10产生细胞的抑制活性、并且增强对于Th1和/或Th17通路的抑制或调节活性的量给予至受试者来治疗炎症。在此实施方案中，所披露的C1ORF32多肽以及融合蛋白引起对于IFN-γ和/或IL-17产生的增加的抑制作用。另一个实施方案提供一种通过给予有效量的C1ORF32多肽、其融合蛋白或其片段以便增加Th2、Treg或其他免疫细胞的IL-10产生来治疗炎症的方法。
增加的IL-10产生导致Th17细胞的IL-17产生降低以及Th1细胞的IFN-γ产生降低。在此实施方案中，C1ORF32多肽、其融合蛋白以及片段可以直接与免疫细胞相互作用以便增加IL-10产生。
仍另一个实施方案提供一种通过给予有效量的C1ORF32多肽、其融合蛋白及其片段以便抑制或干扰Th1通路和Th17通路、并且增强Th2细胞对于Th1和/或Th17通路的抑制作用来治疗炎症的方法。
C1ORF32多肽、其融合蛋白及其片段还可按有效增加Th2细胞群或数量的量给予至受试者。
可以通过使Th2细胞、Treg或其他免疫细胞与有效量的C1ORF32多肽、C1ORF32融合蛋白或其具有C1ORF32活性的片段接触以便相对于对照来增加IL-10产生。该增加可以在体外或在体内发生。
待治疗的炎症性疾病
在此描述了可使用C1ORF32融合多肽来治疗的免疫相关疾病和病症。
C1ORF32作为主要调控因子而作用于炎症通路中的多个点以便控制效应细胞因子，例如IFN-γ和TNF-α的表达和/或活性。因此，在此描述的C1ORF32组合物在治疗对于TNF-α阻断剂，例如Enbrel、英利昔单抗、赛妥珠单抗以及阿达木单抗不起反应的患者，或在TNF-α阻断剂不安全或无效时特别有用。另外，由于其在炎症通路中作为主要调控因子的活性，所披露的C1ORF32组合物特别适用于治疗慢性并且持续的炎症。在一个进一步的实施方案中，在此描述的C1ORF32组合物用于治疗复发性和/或缓解性多发性硬化。
抑制表位扩展
表位扩展是指B和T细胞免疫应答在从自身抗原上的单一决定子到许多位点的特异性水平上，并且在V基因使用水平上发生多样化的能力(Monneaux(曼努斯)，F.等人，关节炎和风湿症(Arthritis&amp；Rheumatism)，46(6)：1430-1438(2002年))。表位扩展不局限于全身性自身免疫疾病。它已经在人类，以及具有各种髓磷脂蛋白的EAE诱导实验动物中的的T细胞依赖性器官特异性疾病，例如1型糖尿病和多发性硬化中得到描述。
表位扩展涉及相同自身分子中的新的表位连同存在于相同大分子复合物中有关的蛋白中的表位的获得性识别。表位扩展可通过测量延迟型过敏(DTH)应答来评估，其方法是本领域中已知的。
一个实施方案提供一种通过向受试者给予有效量的C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白来抑制或减少受试者的表位扩展的方法。在一个进一步的实施方案中，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白抑制患有多发性硬化的个体的表位扩展。优选地，C1ORF32多肽或其融合物抑制或阻断炎症通路的多个点。
仍另一个实施方案提供一种通过向受试者给予有效量的C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白以便抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌来抑制或减少患有多发性硬化的受试者的表位扩展的方法，这些炎症分子包括但不局限于IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP。另一个实施方案提供一种通过向受试者给予有效量的C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白以便与Treg相互作用、增强Treg活性、促进或增强Treg的IL-10分泌、增加Treg数量、增加Treg的抑制能力或其组合来治疗多发性硬化的方法。另一个实施方案提供一种通过向受试者给予有效量的C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白以便与Th2细胞相互作用、增强Th2活性、促进或增强Th2细胞的IL-10分泌、增加Th2细胞数、增加Th2细胞的免疫调节能力或其组合来治疗多发性硬化的方法。
诱导免疫耐受性
在一个实施方案中，本发明提供一种通过向受试者给予有效量的C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白来诱导或重建受试者的免疫耐受性的方法。在一个进一步的实施方案中，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白诱导患有免疫相关疾病的个体的耐受性。在一个具体实施方案中，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白诱导患有多发性硬化的个体的耐受性。优选地，C1ORF32多肽或其融合物抑制或阻断炎症通路的多个点。在另一个具体实施方案中，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白诱导患有类风湿性关节炎的个体的耐受性。另一个实施方案提供一种通过向受试者给予有效量的C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白以便与Treg相互作用、增强Treg活性、增加Treg数量、增加Treg的抑制能力或其组合来诱导免疫耐受性而治疗免疫相关疾病的方法。另一个实施方案提供一种通过向受试者给予有效量的C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白以便促进或增强免疫细胞的IL-10分泌来治疗免疫相关疾病的方法。
组合疗法
C1ORF32融合多肽可单独或与另外治疗剂组合来使用。该另外治疗剂包括但不局限于免疫抑制剂(例如针对其他淋巴细胞表面标记(例如CD40、α-4整联蛋白)或针对细胞因子的抗体)，其他融合蛋白(例如CTLA-4-IgTNFR-Ig)，TNF-α阻断剂，例如Enbrel、英利昔单抗、赛妥珠单抗以及阿达木单抗，环磷酰胺(CTX)(即RevimmuneTM)，甲氨喋呤(MTX)(即)，贝利木单抗(即)，或其他免疫抑制药物(例如环孢菌素A、FK506样化合物、雷帕霉素化合物或类固醇)，抗增殖剂，细胞毒性剂，或可以有助于免疫抑制的其他化合物。
在一个进一步的实施方案中，该额外治疗剂起作用以便通过单独通路来抑制或减少T细胞活化。在一种这样的实施方案中，该额外治疗剂为CTLA-4融合蛋白，例如CTLA-4-Ig(阿巴西普)。CTLA-4-Ig融合蛋白与T细胞上的共刺激受体CD28竞争以便结合至抗原呈递细胞上的CD80/CD86(B7-1/B7-2)，并且因此起作用来抑制T细胞活化。在另一个实施方案中，该另外治疗剂是被称为贝拉西普的CTLA-4-Ig融合蛋白。贝拉西普含有在体内显著地增加其对于CD86的亲合力的两个氨基酸取代(L104E和A29Y)。在另一个实施方案中，该额外治疗剂是Maxy-4(马克西-4)。
在另一个实施方案中，第二治疗剂为环磷酰胺(CTX)。环磷酰胺(Cyclophosphamide)(RevimmuneTM的通用名称)，又称为环磷酰胺(cytophosphane)，是来自噁唑弗林(oxazophorine)组的氮芥烷基化剂。它用于治疗不同类型的癌症以及一些自身免疫病症。在一个进一步的实施方案中，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白与CTX以预防或治疗慢性自身免疫疾病或病症，例如全身性红斑狼疮(SLE)的有效量共同给予。环磷酰胺(CTX)是用于患有肾狼疮的患者的弥漫增生性肾小球肾炎的主要药物。在一些实施方案中，组合疗法以减少抗-双链DNA(抗-ds DNA)自身抗体的血液或血清水平和/或减少对其有需要的患者的蛋白尿的有效量来给予。
在另一个实施方案中，第二治疗剂增加血清中的腺苷量，参见例如WO 08/147482。在一个进一步的实施方案中，第二治疗剂为增加CD73表达的CD73-Ig、重组CD73或另一种药剂(例如细胞因子或单克隆抗体或小分子)，参见例如WO 04/084933。在另一个实施方案中，第二治疗剂为干扰素-β。在另一个实施方案中，第二治疗剂为那他珠单抗或用于MS的另一种治疗剂。在一个进一步的实施方案中，C1ORF32多肽、其片段或融合蛋白与那他珠单抗循环使用或在药物假期期间使用，以便允许第二治疗剂给药的频率更低并且减少副作用，例如PML的风险并防止对于第二治疗剂的抗性。
在另一个实施方案中，第二治疗剂优先治疗慢性炎症，由此治疗方案靶向急性和慢性炎症。在一个进一步的实施方案中，第二治疗剂是TNF-α阻断剂。
在另一个实施方案中，第二治疗剂是抑制或减少Th1、Th17、Th22和/或分泌或引起其他细胞分泌炎症分子的其他细胞的分化、增殖、活性和/或细胞因子产生和/或分泌的小分子，这些炎症分子包括但不局限于IL-1β、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP。在另一个实施方案中，第二治疗剂是与Treg相互作用、增强Treg活性、促进或增强Treg的IL-10分泌、增加Treg数量、增加Treg的抑制能力或其组合的小分子。
典型地有用的小分子是有机分子，优选地是具有大于100并且小于约2,500道尔顿，更优选地在100与2000之间，更优选地在约100与约1250之间，更优选地在约100与约1000之间，更优选地在约100并约750之间，更优选地在约200与约500道尔顿之间的分子量的小有机化合物。小分子包括与蛋白结构性相互作用所必需的官能团，特别是氢键合，并且典型地至少一个胺、羰基、羟基或羧基，优选地包括这些官能化学基团的至少两种。小分子经常包括用一个或多个以上官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳族或多芳环结构。小分子还包括生物分子，包括肽类、糖类、脂肪酸类、类固醇类、嘌呤类、嘧啶类、衍生物类、结构类似物或其组合。在一个实施方案中，小分子是视黄酸或其衍生物。以下实例证明视黄酸抑制或减少ThI 7细胞的分化和/或活性。在一个进一步的实施方案中，这些组合物与增加Treg活性或产生的化合物组合或顺次使用。示例性Treg增强剂包括但不局限于糖皮质激素氟替卡松(glucocorticoid fluticasone)、沙美特罗(salmeterol)、IL-12、IFN-γ以及IL-4的抗体；维生素D3，以及地塞米松及其组合。其他促炎症分子的抗体也可与所披露的C1ORF32多肽、其融合蛋白或片段组合或交替使用。优选的抗体结合至IL-6、IL-23、IL-22或IL-21。
如在此使用，术语“雷帕霉素化合物”包括中性三环化合物雷帕霉素、雷帕霉素衍生物、雷帕霉素类似物，以及被认为具有与雷帕霉素相同的作用机制(例如，抑制细胞因子功能)的其他大环内酯类化合物。措辞“雷帕霉素化合物”包括具有与雷帕霉素结构相似性的化合物，例如具有被修饰以便增强其疗效的相似大环结构的化合物。示例性雷帕霉素化合物是本领域中已知的。措辞“FK506样化合物”包括FK506，以及FK506衍生物和类似物，例如具有与FK506结构相似性的化合物，例如具有被修饰以便增强其疗效的相似大环结构的化合物。FK506样化合物的实例包括例如WO 00101385中描述的那些化合物。优选地，如在此使用的措辞“雷帕霉素化合物”不包括FK506样化合物。
其他适合的治疗剂包括但不局限于抗炎症剂。抗炎症剂可为非类固醇、类固醇或其组合。一个实施方案提供含有约1％(w/w)至约5％(w/w)、通常约2.5％(w/w)抗炎症剂的口服组合物。非类固醇抗炎症剂的代表性实例包括但不局限于昔康类药物(oxicams)，例如吡罗昔康(piroxicam)、伊索昔康(isoxicam)、替诺昔康(tenoxicam)、舒多昔康(sudoxicam)；水杨酸酯类，例如阿斯匹林、双水杨酸酯制剂(disalcid)、贝诺酯(benorylate)、三水杨酸胆碱镁(trilisate)、沙发朴林(safapryn)、索朴林(solprin)、双氟尼酸(diflunisal)以及芬多沙(fendosal)；乙酸衍生物，例如双氯芬酸(diclofenac)、芬氯酸(fenclofenac)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美汀(tolmetin)、伊索克酸(isoxepac)、呋罗芬酸(furofenac)、硫平酸(tiopinac)、齐多美辛(zidometacin)、阿西美辛(acemetacin)、芬替酸(fentiazac)、佐美酸(zomepirac)、克仑达那(clmdanac)、奥昔平酸(oxepinac)、吩布默克(felbmac)以及酮咯酸(ketorolac)；芬那酯衍生物类(fenamates)，例如甲灭酸(mefenamic)、甲氯芬那酸(meclofenamic)、氟灭酸(flufenamic)、尼氟灭(niflumic)以及托芬那酸酸(tolfenamic acid)；丙酸衍生物，例如布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、苯恶洛芬(benoxaprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、非诺洛芬(fenoprofen)、芬布芬(fenbufen)、吲哚洛芬(indoprofen)、吡洛芬(pirprofen)、卡洛芬(carprofen)、奥沙普秦(oxaprozin)、普拉洛芬(pranoprofen)、咪洛芬(miroprofen)、硫恶洛芬(tioxaprofen)、舒洛芬(suprofen)、阿明洛芬(alminoprofen)以及噻洛芬酸(tiaprofenic)；吡唑，例如苯基丁氮酮(phenylbutazone)、羟保松(oxyphenbutazone)、非泼拉酮(feprazone)、阿扎丙酮(azapropazone)，以及三甲保泰松(trimethazone)。也可以采用这些非类固醇抗炎症剂的混合物。
类固醇抗炎症药物的代表性实例包括但不局限于皮质类固醇类，例如氢可的松(hydrocortisone)、羟基-曲安西龙(hydroxyl-triamcinolone)、α-甲基地塞米松(alpha-methyl dexamethasone)、地塞米松磷酸酯(dexamethasone-phosphate)、二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、氯倍他索戊酸酯(clobetasol valerate)、羟泼尼缩松(desonide)、去氧米松(desoxymethasone)、乙酸去氧皮质酮(desoxycorticosteroneacetate)、地塞米松、双氯松(dichlorisone)、双氟拉松双乙酸酯(diflorasonediacetate)、双氟米松戊酸酯(diflucortolone valerate)、氟氢缩松(fluadrenolone)、氟氯缩松(fluclorolone acetonide)、氟氢可的松(fludrocortisone)、氟米松特戊酸酯(flumethasone pivalate)、游离氟轻松(fluosinolone acetonide)、氟轻松乙酸酯(fluocinonide)、氟氯可汀丁基酯(flucortine butylesters)、氟可龙(fluocortolone)、氟泼尼定(fluprednidene；fluprednylidene)乙酸酯、氟雄诺龙(flurandrenolone)、哈西缩松(halcinonide)、乙酸氢化可的松(hydrocortisone acetate)、氢可的松丁酸酯(hydrocortisone butyrate)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、可的松(cortisone)、可托多松(cortodoxone)、肤轻松(flucetonide)、氟氢可的松(fludrocortisone)、二氟若松双乙酸酯(difluorosonediacetate)、氟若卓龙(fluradrenolone)、氟氢可的松(fludrocortisone)、二氟乐松双乙酸酯(diflurosone diacetate)、氟若卓龙安奈德(fluradrenolone acetonide)、甲羟松(medrysone)、安西那飞(amcinafel)、安西非特(amcinafide)、倍他米松(betamethasone)以及其平衡酯、氯泼尼松(chloroprednisone)、克洛泼尼龙乙酸酯(chlorprednisoneacetate)、可洛替龙(clocortelone)、可洛西龙(clescinolone)、双氯松(dichlorisone)、二氟泼耐酯(diflurprednate)、氟氯奈德(flucloronide)、氟尼缩松(flunisolide)、氟米龙(fluoromethalone)、氟培龙(fluperolone)、氟泼尼龙(fluprednisolone)、氢可的松戊酸酯(hydrocortisone valerate)、氢可的松环戊丙酸酯(hydrocortisonecyclopentylpropionate)、氢可松氨酯(hydrocortamate)、甲泼尼松(meprednisone)、帕拉米松(paramethasone)、波尼松龙(prednisolones)、泼尼松(prednisone)、二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、曲安西龙(triamcinolone)及其混合物。
药用组合物
本发明在一些实施方案中的特征在于一种包含治疗有效量的根据本发明的治疗剂的药用组合物。根据本发明，该治疗剂可为可溶性C1ORF32蛋白、C1ORF32胞外域、或其片段或变体、或融合蛋白或对应核酸编码序列中的任何一个。根据本发明的药用组合物进一步用于治疗自身免疫性并且优选地用于治疗在此描述的免疫相关病症。本发明的治疗剂可以单独，或作为它们与药学上可接受的载体混合于其中的药用组合物的一部分来提供给受试者。
如在此使用，“药学上可接受的载体”包括生理相容的任何以及所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。优选地，载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮给予(例如通过注射或输注)。取决于给予途径，根据本发明的至少一些实施方案的活性化合物，即可溶性C1ORF32蛋白、C1ORF32胞外域、或其片段或变体、或融合蛋白、或对应的编码药用化合物的核酸序列，可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所希望生物活性并且不赋予任何不希望有的毒性效应的盐(参见例如Berge(贝尔热)，S.M.等人(1977年)药理学杂志(J.Pharm.Sci.)66：1-19)。这类盐的实例包括酸加成盐以及碱加成盐。酸加成盐包括来源于无毒无机酸的那些盐，这些无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等等，以及来源于无毒有机酸的盐，这些有机酸例如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸类、脂族以及芳族磺酸等等。碱加成盐包括来源于碱土金属的那些盐，这些碱土金属例如钠、钾、镁、钙等等，以及来源于无毒有机胺的盐，这些有机胺例如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因(procaine)等等。
根据本发明的至少一些实施方案的药用组合物还可以包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱胺酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等等；以及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸、以及类似物。根据本发明的至少一些实施方案的药用组合物还可包含添加剂，例如清洁剂和增溶剂(例如，TWEEN 20(聚山梨醇酯-20)，TWEEN 80(聚山梨醇酯-80))以及防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)以及增量物质(例如乳糖、甘露糖醇)。
可用于根据本发明的至少一些实施方案的药用组合物中的适合的水性和非水性载体的实例包括水、不同缓冲内容物(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH以及离子强度的缓冲盐水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)、以及其适合的混合物、植物油，例如橄榄油，以及可注射有机酯，例如油酸乙酯。
适当流动性可例如通过使用涂层材料，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所要求粒径，以及通过使用表面活性剂来维持。
这些组合物还可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂以及分散剂。预防存在微生物可通过上述灭菌程序，以及通过包含不同抗细菌和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯(paraben)、氯代丁醇、苯酚山梨酸、以及类似物来确保。可能还希望将等渗剂，例如糖、氯化钠、以及类似物包括于组合物中。另外，可通过包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝以及明胶来实现可注射药物形式的延长的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。这些介质和试剂对于药学活性物质的使用在本领域中是已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其在根据本发明的至少一些实施方案的药用组合物中的用途。辅助活性化合物也可以并入组合物中。
治疗组合物典型地必须在制造以及储存条件下是无菌并且稳定的。组合物可配制为溶液、微乳液、脂质体，或适合于高药物浓度的其他有序结构。载体可以为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇，以及液体聚乙二醇等等)以及其合适混合物的溶剂或分散介质。适当流动性可例如通过使用涂层，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所希望粒径，以及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，可取的是将等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠包括在组合物中。可通过在组合物中包括例如单硬脂酸盐以及明胶的延迟吸收的试剂来实现可注射组合物的延长的吸收。无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一个或其组合一起并入适当溶剂中，随后灭菌微滤来制备。总体上，分散液通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物含有一种基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其他成分。在制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥以及冷冻干燥(冻干)，这从先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外所需成分的粉末。
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一个或其组合一起并入适当溶剂中，随后灭菌微滤来制备。总体上，分散液通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物含有一种基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其他成分。在制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥以及冷冻干燥(冻干)，这从先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外所需成分的粉末。
可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量取决于所治疗的受试者以及具体给予模式而变化。可与载体材料组合以便产生单一剂型的活性成分的量总体上是产生治疗效果的组合物的量。总体上，在一百个百分数中，此量在从约0.01百分数至约九十九百分数的活性成分的范围内，优选地从约0.1百分数至约70百分数，最优选地从约1百分数至约30百分数的活性成分以及药学上可接受的载体。
将剂量方案加以调整以便提供最佳所希望应答(例如治疗应答)。例如，可以给予单次丸剂，可随着时间的推移来给予多个分次剂量或剂量可按治疗情况的紧急状态指示来按比例减少或增加。尤其有利的是将肠胃外组合物配制成剂量单位形式以实现方便给予以及剂量均匀性。如在此使用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上离散单位；每个单位含有预定数量的经过计算结合所需药用载体可产生所希望治疗效果的活性化合物。根据本发明的至少一些实施方案的剂量单位形式的规格由以下因素支配以及直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特特征以及待达到的特定治疗效果，以及(b)调配这种活性化合物以便治疗个体的感受性的领域中固有的限制。
本发明的组合物可经由一种或多种给予途径、使用在本领域中已知的各种方法中的一种或多种来给予。如本领域技术人员将认识到，给予途径和/或模式取决于所希望结果而变化。根据本发明的至少一些实施方案的治疗剂的优选给予途径包括血管内递送(例如注射或输注)、静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、脊柱、口服、肠内、直肠、肺部(例如吸入)、鼻腔、外用(包括经皮肤、口腔以及舌下)、膀胱内、玻璃体内、腹膜内、阴道、大脑递送(例如脑室内、大脑内以及对流增强扩散)、CNS递送(例如鞘内、髓周以及脊柱内)或肠胃外(包括皮下、肌肉内、腹膜内、静脉内(IV)以及真皮内)、经皮肤(被动地或使用离子电渗或电穿孔)、经粘膜(例如舌下给予、鼻腔、阴道、直肠或舌下)给予或经由植入物给予，或其他肠胃外给予途径，例如通过注射或输注，或在本领域中已知的其他递送途径和/或给予形式。如在此使用的短语“肠胃外给予”是指除肠内以及局部给予以外的通常通过注射实现的给予模式，并且包括(不局限于)静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜上以及胸骨内注射和输注或使用可生物蚀解的插入物，并且可配制成适合于每一种给予途径的剂型。在一个具体实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的蛋白、治疗剂或药用组合物可腹膜内或静脉内给予。
本发明的组合物在以具有小于约5微米的气体动力学直径的气溶胶亦或喷雾干燥颗粒形式递送时，可以在吸入时被递送至肺并且横穿肺上皮衬里到达血流。可使用被设计成经肺部递送治疗产品的广泛范围的机械装置，包括但不局限于雾化器、计量剂量吸入器以及粉末吸入器，这些全部是本领域技术人员所熟悉的。可购得装置的一些具体实例是Ultravent雾化器(马林克罗制药公司(Mallinckrodt Inc.)，密苏里州圣路易斯(St.Louis，Mo.))；Acorn II雾化器(Marquest Medical Products，科罗拉多州恩格尔伍德(Englewood，Colo.))；Ventolin计量剂量吸入器(Glaxo Inc.，北卡罗来纳州研究三角园(Research Triangle Park，N.C.))；以及Spinhaler粉末吸入器(Fisons Corp.公司，马萨诸塞州贝德福德(Bedford，Mass.))。Nektar、Alkermes以及Mannkind都具有经过批准或处于临床试验中的可吸入胰岛素粉末制剂，其中这种技术可应用于在此描述的配制品。
在一些体内方法中，在此披露的组合物以治疗有效量给予至受试者。如在此使用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或减轻所治疗的病症的一个或多个症状或以其他方式提供所希望药理和/或生理效应的剂量。确切剂量将根据各种因素，例如受试者依赖变量(例如年龄、免疫系统健康状况、等)、疾病以及所实现的治疗而变化。对于在此披露的多肽组合物以及编码它们的核酸，在进行进一步研究时，关于治疗不同患者的不同病状的适当剂量水平的信息将出现，并且本领域普通技术人员，考虑到接受者的治疗情况、年龄以及一般健康状况，将能够确定适当剂量。选择的剂量取决于所希望的治疗效果、给予途径以及所希望治疗的持续时间。对于多肽组合物，通常将每天0.0001至100mg/kg体重的剂量水平给予至哺乳动物并且更通常为0.001至20mg/kg。例如，剂量可为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。示例性治疗方案必须每周给予一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3至6个月一次。通常，对于静脉内注射或输注，剂量可以更低。剂量方案经过调整以便提供最佳所希望应答(例如治疗应答)。例如，可给予单次丸剂，可随着时间的推移来给予若干分次剂量或剂量可按治疗情况的紧急状态指示来按比例减少或增加。尤其有利的是将肠胃外组合物配制成剂量单位形式，以实现方便给予以及剂量均匀性。如在此使用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上离散单位；每个单位含有预定数量的经过计算结合所需药用载体以产生所希望治疗效果的活性化合物。根据本发明的至少一些实施方案的剂量单位形式的规格由以下因素支配以及直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特特征以及待达到的特定治疗效果，以及(b)调配这种活性化合物以便治疗个体的感受性的领域中固有的限制。
任选地，根据任何适合的定时方案，多肽制剂可以0.0001至100mg/kg患者体重/天之间的量给予，优选为0.001至20.0mg/kg/天之间。根据本发明的至少一些实施方案的治疗组合物可例如每天三次、每天两次、每天一次、每周三次、每周两次或每周一次、每两周或3、4、5、6、7或8周一次来给予。此外，组合物可给予短或长时期(例如1周、1月、1年、5年)。
可替代地，治疗剂可以持续释放配制品形式给予，在此情况下所要求的给予频率更小。剂量和频率取决于治疗剂在患者体内的半衰期而变化。总体上，人类抗体展示最长半衰期，随后为人源化抗体、嵌合抗体以及非人类抗体。融合蛋白的半衰期可广泛地变化。给予剂量和频率可取决于治疗是预防性或是治疗性而变化。在预防性应用中，相对较低剂量以相对稀少的间隔在长时期内给予。一些患者在其余生继续接受治疗。在治疗性应用中，有时要求相对较短间隔下的相对较高剂量直到疾病进展减少或终止为止，并且优选地直到患者展示疾病症状的部分或完全改进为止。此后，可向患者给予预防方案。
本发明的药用组合物中的活性成分的实际剂量水平可改变以便获得对于具体患者、组合物以及给予模式可有效实现所希望治疗应答，而对患者无毒的活性成分的量。选择的剂量水平取决于各种药代动力学因素，包括所使用的本发明的具体组合物的活性、给予途径、给予时间、所使用的具体化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所使用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况以及以前病史，以及医学领域熟知的类似因素。
“治疗有效剂量”的C1ORF32可溶性蛋白或C1ORF32胞外域或含有它们的C1ORF32融合蛋白优选地引起疾病症状的严重度降低、无病症期的频率以及持续时间增加、寿命增加、疾病缓解，或预防或减少归因于疾病折磨的损害或伤残。
本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者体型、受试者症状的严重度以及所选择的具体组合物或给予途径的因素来确定治疗有效量。
在某些实施方案中，多肽组合物例如通过直接注射至待治疗的部位来局部给予。典型地，该注射引起多肽组合物的局部浓度增加，它大于可通过全身给予而获得的浓度。例如，在如多发性硬化的神经病症的情况下，蛋白可局部给予至CNS附近的部位。在另一个实例中，如在如类风湿性关节炎的关节病症的情况下，蛋白可局部给予至患病关节中的滑膜。多肽组合物可与如上所述的基质组合以便通过减少多肽从待治疗的部位中被动扩散出来而帮助建立多肽组合物的增加的局部浓度。
本发明的药用组合物可用在本领域中已知的医学装置来给予。例如，在一个任选的实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的药用组合物可用针皮下注射装置来给予，例如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中披露的装置。适用于本发明的熟知植入物以及模块的实例包括：美国专利号4,487,603，它披露用于以受控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利号4,486,194，它披露经由皮肤给予药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，它披露以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，它披露用于连续药物递送的变速流可植入输注设备；美国专利号4,439,196，它披露具有多腔室隔室的渗透药物递送系统；以及美国专利号4,475,196，它披露渗透药物递送系统。这些专利通过引用结合在此。许多其他这类植入物、递送系统以及模块是本领域技术人员已知的。
活性化合物可用保护化合物以便避免快速释放的载体来制备，例如受控释放制剂，包括植入物、经皮贴片以及微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。制备这类制剂的许多方法是授予专利的或通常是本领域技术人员已知的。参见例如持续以及受控释放药物递送系统(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems)，J.R.Robinson(罗宾逊)编著，Marcel Dekker，Inc.公司，纽约市(New York)，1978。
治疗组合物可用在本领域中已知的医学装置来给予。例如，在一个任选的实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的治疗组合物可用针皮下注射装置来给予，例如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中披露的装置。适用于本发明的熟知植入物以及模块的实例包括：美国专利号4,487,603，它披露用于以受控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利号4,486,194，它披露经由皮肤给予药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，它披露以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，它披露用于连续药物递送的变速流可植入输注设备；美国专利号4,439,196，它披露具有多腔室隔室的渗透药物递送系统；以及美国专利号4,475,196，它披露渗透药物递送系统。这些专利通过引用结合在此。许多其他这类植入物、递送系统以及模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的C1ORF32可溶性蛋白、C1ORF32胞外区、C1ORF32融合蛋白、其他蛋白或其他治疗剂可经过配制以便确保在体内的适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水性化合物。为了确保根据本发明的至少一些实施方案的治疗化合物穿过BBB(如果希望)，它们可例如在脂质体中进行配制。制造脂质体的方法参见例如美国专利号4,522,811；5,374,548；以及5,399,331。脂质体可以包括被选择性运输至特定细胞或器官中，由此增强靶向药物递送的一个或多个部分(参见例如V.V.Ranade(兰纳德)(1989)临床药理学杂志(J.Clin.Pharmacol.)29：685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如Low(劳)等的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa(梅泽)等人，(1988)生物化学和生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)153：1038)；抗体(P.G.Bloeman(布罗曼)等人(1995)欧洲生物化学学会联盟快讯(FEBS Lett.)357：140；M.Owais(欧维斯)等人(1995)抗微生物制剂和化疗(Antimicrob.AgentsChemother.)39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe(布里斯科)等人(1995)美国生理学杂志(Am.J Physiol.)1233：134)；p120(Schreier(施雷尔)等人(1994)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269：9090)；也参见K.Keinanen(凯纳门)；M.L.Laukkanen(劳卡南)(1994)欧洲生物化学学会联盟快讯(FEBS Lett.)123；J.J.Killion(基莱恩)；I.J.Fidler(菲德勒)(1994)免疫方法(Immunomethods)4：273。
肠胃外给予的配制品
在一个进一步的实施方案中，在此披露的组合物，包括含有肽和多肽的那些，以水溶液形式通过肠胃外注射来给予。这种制剂也可呈悬浮液或乳液形式。通常，所提供的药用组合物包含有效量的肽或多肽，并且任选地包括药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。这类组合物任选地包括以下物质中的一种或多种：稀释剂、无菌水、不同缓冲内容物(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH以及离子强度的缓冲盐水；以及添加剂，例如清洁剂和增溶剂(例如，TWEEN 20(聚山梨醇酯-20)，TWEEN 80(聚山梨醇酯-80))、抗氧化剂(例如水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠、半胱胺酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠；油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚；以及金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸，以及防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)以及增量物质(例如乳糖、甘露糖醇)。非水性溶剂或媒介物的实例是乙醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油和玉米油)、明胶，以及可注射有机酯，例如油酸乙酯。这些制剂可冷冻干燥(冻干)或真空干燥并且在即将使用之前再溶解/再悬浮。这种制剂可通过例如经由细菌保留过滤器来过滤，将灭菌剂并入组合物中，照射组合物，或加热组合物来灭菌。
局部给予的配制品
在此披露的C1ORF32多肽、片段、融合多肽、核酸以及载体可以局部应用。局部给予对于大多数肽配制品并不能良好地起作用，但是如果应用至肺、鼻腔、口腔(舌下、颊腔)、阴道或直肠粘膜，它可以是尤其有效的。
组合物在以具有小于约5微米的气体动力学直径的气溶胶或喷雾干燥颗粒形式递送时可在吸入时被递送至肺并且横穿肺上皮衬里到达血流。
可使用被设计成经肺部递送治疗产品的广泛范围的机械装置，包括但不局限于雾化器、计量剂量吸入器以及粉末吸入器，这些全部是本领域技术人员所熟悉的。可购得装置的一些具体实例是Ultravent雾化器(马林克罗制药公司(Mallinckrodt Inc.)，密苏里州圣路易斯(St.Louis，Mo.))；Acorn II雾化器(Marquest Medical Products，科罗拉多州恩格尔伍德(Englewood，Colo.))；Ventolin计量剂量吸入器(Glaxo Inc.公司，北卡罗来纳州研究三角园(Research Triangle Park，N.C.))；以及Spinhaler粉末吸入器(Fisons Corp.公司，马萨诸塞州贝德福德(Bedford，Mass.))。Nektar、Alkermes以及Mannkind都具有经过批准或处于临床试验中的可吸入胰岛素粉末制剂，其中这种技术可应用于在此描述的配制品。
给予至粘膜的配制品典型地将是喷雾干燥的药物颗粒，它们可并入片剂、凝胶剂、胶囊剂、悬浮液或乳液中。标准药用赋形剂从任何配方设计师处可获得。口服制剂可呈口香糖、凝胶条、片剂或锭剂形式。
还可制备经皮配制品。这些通常是软膏、洗剂、喷雾剂或贴片，全部可使用标准技术来制备。经皮配制品需要包括渗透促进剂。
控制递送聚合物基质
在此披露的C1ORF32多肽、片段、融合多肽、核酸以及载体也可以在受控释放配制品中给予。可制造受控释放聚合物装置以便在植入聚合物装置(杆、圆柱体、膜、盘)或注射(微粒)之后全身性长期释放。基质可呈例如微球的微粒形式，其中肽分散于固体聚合物基质或微胶囊中，其中核心具有与聚合物外壳不同的材料，并且肽是分散或悬浮于在性质上可为液体或固体的核心中。除非在此明确定义，否则微粒、微球以及微胶囊可互换使用。可替代地，聚合物可铸造成从数纳米至四厘米范围内的薄板或膜、通过研磨或其他标准技术产生的粉末，或甚至例如水凝胶的凝胶。
可使用不可生物降解亦或可生物降解的基质递送多肽或编码多肽的核酸，但是可生物降解基质是优选的。这些基质可以为天然或合成聚合物，但是合成聚合物由于降解以及释放概况的更好表征而为优选的。该聚合物是基于所希望的释放时段来选择的。在一些情况下，线性释放可为最有用的，但是在其他情况下脉冲释放或“整体释放”可提供更有效的结果。聚合物可以呈水凝胶(通常吸收多达按重量计约90％的水)形式，并且可任选地与多价离子或聚合物交联。
基质可通过溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂萃取以及本领域技术人员已知的其他方法来形成。可生物蚀解的微球可使用开发用于制造微球以便进行药物递送的任何方法来制备，这些方法例如由Mathiowitz(马西威兹)和Langer(朗格尔)，受控释放杂志(受控释放杂志)(J.Controlled Release)，5：13-22(1987)；Mathiowitz(马西威兹)等人，反应性聚合物(Reactive Polymers)，6：275-283(1987)；以及Mathiowitz(马西威兹)等人，应用高分子科学杂志(J.Appl Polymer ScL)，35：755-774(1988)来描述。
这些装置可经过配制用于局部释放来治疗植入或注射区域-通常递送比用于治疗整个身体或全身递送的剂量少得多的剂量。这些装置可被植入或注射至皮下、肌内、脂肪或被吞咽。
C1ORF32的诊断用途
根据本发明的至少一些实施方案的可溶性多肽也可用能够直接或间接地提供可检测信号的标记来修饰，该标记包括但不局限于放射性同位素以及荧光化合物。这类经过标记的多肽可用于不同用途，包括但不局限于疾病和/或指示病状的预后、预测、筛选、早期诊断、确定进展、疗法选择以及治疗监测，如以上详述。
根据至少一些实施方案，本发明提供一种对器官或组织成像的方法，该方法包括：(a)向需要这种成像的受试者给予一种经过标记的多肽；以及(b)检测该经过标记的多肽以便确定经过标记的多肽集中于受试者体内的位置。当用于成像应用中时，根据本发明的至少一些实施方案的经过标记的多肽通常具有与其共价或非共价附接的成像剂。适合的成像剂包括但不局限于放射性核素、可检测标签、荧光团、荧光蛋白、酶蛋白、以及类似物。本领域技术人员熟悉将成像剂连接至多肽的其他方法。例如，成像剂可经由部位特异性偶联来附接，例如，将成像剂共价附接至肽连接物，例如存在于Fc融合分子的羧基末端的具有五个至七个精氨酸的聚精氨酸部分。成像剂还可直接经由非位点特异性偶联来连接，例如，将成像剂共价附接至存在于多肽中的伯胺基团。本领域技术人员认识到成像剂还可经由非共价相互作用(例如离子键、疏水性相互作用、氢键、范德华力、双极子-双极子键等)来结合至蛋白。
在某些情况下，通过将放射性核素直接附接至多肽来将多肽用放射性核素进行放射性标记。在某些其他实例中，放射性核素结合至螯合剂或附接至多肽的螯合剂-连接物。用于直接偶联的合适放射性核素包括但不局限于18F、124I、125I、131I及其混合物。与螯合剂一起使用的合适放射性核素包括但不局限于、47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117m Sn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、212Bi及其混合物。优选地，结合至螯合剂的放射性核素是64Cu、90Y、111In或其混合物。适合的螯合剂包括但不局限于DOTA、BAD、TETA、DTPA、EDTA、NTA、HDTA、其膦酸酯类似物及其混合物。本领域技术人员熟悉将放射性核素、螯合剂以及螯合剂-连接物附接至本发明的多肽的方法。具体地说，附接可便利地使用例如可购得的双官能连接基团(通常为异双官能连接基团)来完成，这些连接基团可附接至存在于多肽的无干扰位置中的官能团，并且然后进一步连接至放射性核素、螯合剂或螯合剂-连接物。
适合于用作成像剂的荧光团或荧光染料的非限制实例包括Alexa染料(英杰生命技术有限公司(Invitrogen Corp.)；加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，Calif.))、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、Oregon GreenTM；若丹明、得克萨斯红、异硫氰酸四若丹明(TRITC)、CyDyeTM荧光剂(例如Cγ2、Cγ3、Cγ5)等等。
适合于用作成像剂的荧光蛋白的实例包括但不局限于绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白(例如DsRed)、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白以及其变体(参见例如美国专利号6,403,374、6,800,733以及7,157,566)。GFP变体的具体实例包括但不局限于增强型GFP(EGFP)、去稳定EGFP、描述于Doan(道安)等人，分子微生物学(Mol.Microbiol.)，55：1767-1781(2005)中的GFP变体、描述于Crameri(克莱默里)等人，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)，14：315-319(1996)中的GFP变体、描述于Rizzo(里佐)，自然生物技术(Nat.Biotechnol)，22：445(2004)以及Tsien(钱)，生物化学综合年刊(Annu.Rev.Biochem.)，67：509(1998)中的蔚蓝色荧光蛋白，以及描述于Nagal(内格尔)等人，自然·生物技术(Nat.Biotechnol.)，20：87-90(2002)中的黄色荧光蛋白。DsRed变体描述于例如Shaner(谢恩)等人，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)，22：1567-1572(2004)中并且包括mStrawberry、mCherry、morange、mBanana、mHoneydew以及mTangefine。另外的DsRed变体描述于例如Wang(王)等人，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.)U.S.A.，101：16745-16749(2004)中并且包括mRaspberry和mPlum。DsRed变体的另外实例包括描述于Fischer(菲舍尔)等人，欧洲生物化学学会联盟快讯(FEBS Lett.)，577：227-232(2004)中的mRFPmars以及描述于Fischer(菲舍尔)等人，欧洲生物化学学会联盟快讯(FEBS Lett.)，580：2495-2502(2006)中的mRFPruby。
在其他实施方案中，结合至根据本发明的至少一些实施方案的多肽的成像剂包括可检测标签，例如像生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性链亲和素。在其他实施方案中，成像剂包括酶蛋白，包括但不局限于荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、辣根过氧物酶、木聚糖酶、碱性磷酸酶、以及类似物。
在本领域中已知用于检测受试者体内的放射性核素的放射性发射的任何装置或方法是适用于本发明的。例如，像使用旋转γ射线摄像机来检测单光子γ-发射放射性核素的辐射的单光子发射计算机控制断层摄影术(SPECT)，以及使用闪烁γ射线摄像机来获得放射性核素在组织、器官或身体系统中的分布的一个图像或一系列连续图像的放射性核素闪烁照相法的方法，可以用于检测从本发明的放射性标记多肽发出的辐射。正电子发射断层术(PET)是用于检测受试者体内的辐射的另一种合适技术。旨在用于医学用途的微型并且灵活的辐射检测器由Intra-Medical LLC(加利福尼亚州圣塔莫尼卡(Santa Monica，Calif.))生产。磁共振成像(MRI)或本领域技术人员已知的任何其他成像技术也适合于检测放射性核素的放射性发射。不管所使用的方法或装置为何，这种检测旨在确定经过标记的多肽集中于受试者体内的位置，并且这种浓度是疾病活性的指标。
动物和人类的非侵入性荧光成像还可提供体内诊断信息并且用于多种临床专科中。例如，多年以来已开发出用于在UV激发之后进行简单眼部观察直至使用先进设备进行复杂光谱成像的技术(参见例如Andersson(安德森)-Engels(恩格斯)等人，医学和生物学中的物理学(Phys.Med.Biol.)，42：815-824(1997))。在本领域中已知的用于体内检测例如来自荧光团或荧光蛋白的荧光的特定装置或方法包括但不局限于体内近红外荧光(参见例如Frangioni(弗兰基尼)，化学生物学目前观点(Curr.Opin.Chem.Biol.)，7：626-634(2003))、MaestroTM体内荧光成像系统(美国剑桥科研仪器公司(Cambridge Research&Instrumentation，Inc.)；马萨诸塞州沃本市(Woburn，Mass.))、使用飞点扫描器的体内荧光成像(参见例如Ramanujam(拉马努詹)等人，电气和电子工程师学会生物医学工程学会报(IEEE Transactions on Biomedical Engineering)，48：1034-1041(2001)、等。
用于检测光学应答的其他方法或装置包括但不局限于目视检查、CCD摄像机、视频摄像机、摄影胶片、激光扫描装置、荧光计、光电二极管、量子计数器、落射荧光显微镜、扫描显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪或使用光电倍增器管的信号放大。
本发明进一步由以下与C1ORF32抗原、其域以及表达数据相关的实例连同描述其完全人类抗体的制造的预测实例来说明。此信息以及实例是说明性的并且不应被视为进一步限制。贯穿本申请引用的所有图以及所有参考文献、专利以及公开专利申请的内容明确地通过引用结合在此。
实例
实例1
H19011_1簇(H19011)的描述
本发明涉及C1ORF32多肽、以及基于其的诊断剂和治疗剂。
应当指出的是这些变体最初披露于与本申请共同拥有的PCT申请号WO2009/032845中，该申请通过引用结合在此，如同完全在此阐明一样。
H19011_1簇(内部ID76432827)特征为所感兴趣的2个转录物和5个片段，其名称分别在表1和2中给出。选择的蛋白变体在表3中给出。
表1-所感兴趣的转录物
转录物名称
H19011_1_T8(SEQ ID号：1)
H19011_1_T9(SEQ ID号：2)
表2-所感兴趣的片段
表3-所感兴趣的蛋白
蛋白名称 对应的转录物
H19011_1_P8(SEQ ID号：4) H19011_1_T8(SEQ ID号：1)
H19011_1_P9(SEQ ID号：6) H19011_1_T9(SEQ ID号：2)
这些序列是已知蛋白预测蛋白LOC387597(RefSeq登录识别符NP_955383(SEQ ID号：3)，同义名：C1ORF32、NP_955383；LISCH-样；RP4-782G3.2；dJ782G3.1；ILDR2)的变体，它们在此称为先前已知的蛋白。
C1ORF32是在染色体1注释期间计算发现的预测蛋白(Gregory(格里高里)SG等，2006，自然(Nature)441(7091)315-321)。其最接近的注释同源物属于LISCH7家族，这是为免疫球蛋白超级家族的亚家族。此家族的一个注释成员是脂分解刺激的脂蛋白受体，该受体在富含甘油三酸酯的脂蛋白从血液的清除中具有可能的作用(登录Q86X29的Swissprot注释)。C1ORF32的另一种同源物是含有免疫球蛋白样域的受体1(ILDR1)，该受体可充当细胞表面处的多聚受体(NCBI基因标识号286676的注释)。
根据本发明，C1ORF32基于在其细胞外域(ECD)中存在IgV域，另外如同其他已知B7成员一样，其为I型膜蛋白而被预测为共刺激蛋白的B7家族的新成员。另外，还存在本发明的两种替代剪接的变体(H19011_1_P8(SEQ ID号：4)以及H19011_1_P9(SEQ ID号：6))，它们与已知C1ORF32(NP_955383)只共有前5个外显子，并且还具有IgV域以及跨膜域。
如以上提及，H19011簇具有2个转录物，它们在以上表1中列出。这些转录物编码作为蛋白预测蛋白LOC387597(SEQ ID号：3)的变体的蛋白。现在提供根据本发明的每一种变体蛋白的描述。
根据本发明的变体蛋白H19011_1_P8(SEQ ID号：4)具有如转录物H19011_1_T8(SEQ ID号：1)编码的氨基酸序列。与一种或多种先前公开的蛋白序列的比对在图1A中示出。根据本发明的变体蛋白与每一种这类比对蛋白的关系的简述如下：
H19011_1_P8(SEQ ID号：4)与已知蛋白Q71H61_人类以及NP_955383(SEQ ID号：3)之间的比较报告(图1A)：
A.编码H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的分离嵌合多肽，包括：与对应于已知蛋白Q71H61_人类以及NP_955383(SEQ ID号：3)的氨基酸1-158的MDRVLLRWISLFWLTAMVEGLQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNE至少90％同源的第一氨基酸序列，它也对应于H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的氨基酸1-158；对应于H19011_1_P8(SEQID号：4)的氨基酸159的桥连氨基酸G；与对应于已知蛋白Q71H61_人类以及NP_955383(SEQID号：3)的氨基酸160-160的S至少90％同源的第二氨基酸序列，它也对应于H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的氨基酸160-160；对应于H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的氨基酸161-162的桥连氨基酸LG；与对应于已知蛋白Q71H61_人类以及NP_955383(SEQ ID号：3)的氨基酸163-229的LLVLGRTGLLADLLPSFAVEIMPEWVFVGLVLLGVFLFFVLVGICWCQCCPHSCCCYVRCPCCPDSC至少90％同源的第三氨基酸序列，它也对应于H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的氨基酸163-229；对应于H19011_1_P8(SEQ ID号：4)氨基酸230的桥连氨基酸W；与对应于已知蛋白Q71H61_人类以及NP_955383(SEQ ID号：3)的氨基酸231-234的CPQA至少90％同源的第四氨基酸序列，它也对应于H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的氨基酸231-234；以及与具有对应于H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的氨基酸235-254的序列CEYSDRWGDRAIERNVYLST(SEQ ID号：18)的多肽至少70％、任选地至少80％、优选地至少85％、更优选地至少90％并且最优选地至少95％、96％、97％、98％或99％同源的第五氨基酸序列，其中所述第一氨基酸序列、桥连氨基酸、第二氨基酸序列、桥连氨基酸、第三氨基酸序列、桥连氨基酸、第四氨基酸序列以及第五氨基酸序列是邻接的并且呈连续的顺序。
B.编码H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的边缘部分的分离多肽，包含与H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的序列CEYSDRWGDRAIERNVYLST(SEQ ID号：18)至少70％、任选地至少约80％、优选地至少约85％、更优选地至少约90％以及最优选地至少约95％、96％、97％、98％或99％同源的氨基酸序列。
变体蛋白的定位根据来自许多不同软件程序以及分析的结果(包括来自SignalP以及其他专用程序的分析)来确定。据信变体蛋白如下关于细胞：膜来定位。
变体蛋白H19011_1_P8(SEQ ID号：4)还具有以下如表4中列出的非沉默SNP(单个核苷酸多态性)(根据其在氨基酸序列上的位置来给出，其中列出替代氨基酸)。(使用以下SNP的一部分)产生的这种具有替代氨基酸的推导序列的实例在名称H19011_1_P8_V1(SEQID号：5)下给出。
表4-氨基酸突变
变体蛋白H19011_1_P8(SEQ ID号：4)由转录物H19011_1_T8(SEQ ID号：1)来编码，该转录物的编码部分开始于位置181并且结束于位置942。转录物还具有以下如在表5中列出的SNP(根据其在核苷酸序列上的位置来给出，其中列出替代核酸)。
表5-核酸SNP
多态性 核苷酸序列上的SNP位置
G-＞A 656
C-＞G 661
G-＞A 665
T-＞A 785
T-＞G 785
G-＞C 870
蛋白H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的基因组结构(与蛋白的细胞外区相关的外显子的数量、这些外显子的长度、其中插入内含子的密码子框架、以及基因结构的蛋白特征和域的位置)是B7/共刺激蛋白家族的配体的特征。
根据本发明的变体蛋白H19011_1_P9(SEQ ID号：6)具有如由转录物H19011_1_T9(SEQ ID号：2)编码的氨基酸序列。与一种或多种先前公开的蛋白序列的比对在图IB中示出。根据本发明的变体蛋白与每一种这类比对蛋白的关系的简述如下：
H19011_1_P9(SEQ ID号：6)与已知蛋白Q71H61_人类以及NP_955383(SEQ ID号：3)之间的比较报告(图1B)：
A.编码H19011_9_P9(SEQ ID号：6)的分离嵌合多肽，包含：与对应于已知蛋白Q71H61_人类以及NP_955383(SEQ ID号：3)的氨基酸1-158的MDRVLLRWISLFWLTAMVEGLQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNE至少90％同源的第一氨基酸序列，它也对应于H19011_0_P9(SEQ ID号：6)的氨基酸1-158；对应于H19011_0_P9(SEQID号：6)的氨基酸159的桥连氨基酸G；与对应于已知蛋白Q71H61_人类以及NP_955383(SEQID号：3)的氨基酸160-160的S至少90％同源的第二氨基酸序列，它也对应于H19011_0_P9(SEQ ID号：6)的氨基酸160-160；对应于H19011_0_P9(SEQ ID号：6)的氨基酸161-162的桥连氨基酸LG；与对应于已知蛋白Q71H61_人类以及NP_955383(SEQ ID号：3)的氨基酸163-166的LLVL至少90％同源的第三氨基酸序列，它也对应于H19011_0_P9(SEQ ID号：6)的氨基酸163-166；与对应于已知蛋白Q71H61_人类以及NP_955383(SEQ ID号：3)的氨基酸186-229的EWVFVGLVLLGVFLFFVLVGICWCCCPHSCCCYVRCPCCPDSC至少90％同源的第四氨基酸序列，它也对应于H19011_1_P9(SEQ ID号：6)的氨基酸167-210；对应于H19011_1_P9(SEQ ID号：6)的氨基酸211的桥连氨基酸W；与对应于已知蛋白Q71H61_人类以及NP_955383(SEQ ID号：3)的氨基酸231-234的CPQA至少90％同源的第五氨基酸序列，它也对应于H19011_1_P9(SEQID号：6)的氨基酸212-215；以及与具有对应于H19011_1_P9(SEQ ID号：6)的氨基酸216-235的CEYSDRWGDRAIERNVYLST(SEQ ID号：18)的多肽的序列至少70％、任选地至少80％、优选地至少85％、更优选地至少90％以及最优选地至少95％、96％、97％、98％或99％同源的第六氨基酸序列，其中所述第一氨基酸序列、桥连氨基酸、第二氨基酸序列、桥连氨基酸、第三氨基酸序列、第四氨基酸序列、桥连氨基酸、第五氨基酸序列以及第六氨基酸序列是邻接的并且呈连续的顺序。
B.编码H19011_1_P9(SEQ ID号：6)的边缘部分的分离嵌合多肽，包含具有长度“n”的多肽，其中n为至少约10个氨基酸长度，任选地至少约20个氨基酸长度，优选地至少约30个氨基酸长度，更优选地至少约40个氨基酸长度并且最优选地至少约50个氨基酸长度，其中至少两个氨基酸包含LE，该LE具有如下结构：序列从氨基酸编号166-x至166中的任何一个开始；并且终止于氨基酸编号167+((n-2)-x)的任何一个，其中x在从0至n-2之间变化。
C.编码H19011_1_P9(SEQ ID号：6)的边缘部分的分离多肽，包含与H19011_1_P9(SEQ ID号：6)的序列CEYSDRWGDRAIERNVYLST(SEQ ID号：18)至少70％、任选地至少约80％、优选地至少约85％、更优选地至少约90％以及最优选地至少约95％、96％、97％、98％或99％同源的氨基酸序列。
变体蛋白的定位根据来自许多不同软件程序和分析的结果(包括来自SignalP和其他专用程序的分析)来确定。据信变体蛋白如下关于细胞：膜来定位。
变体蛋白H19011_1_P9(SEQ ID号：6)还具有以下如表6中列出的非沉默SNP(单个核苷酸多态性)(根据其在氨基酸序列上的位置来给出，其中列出替代氨基酸)。(使用以下SNP的一部分)产生的这种具有替代氨基酸的推导序列的实例在名称H19011_1_P9_V1(SEQID号：34)下给出。
表6-氨基酸突变
变体蛋白H19011_1_P9(SEQ ID号：6)由转录物H19011_1_T9(SEQ ID号：2)来编码，该转录物的编码部分开始于位置181并且结束于位置885。转录物还具有以下如在表7中列出的SNP(根据其在核苷酸序列上的位置来给出，其中列出替代核酸)。
表7-核酸SNP
多态性 核苷酸序列上的SNP位置
G-＞A 656
C-＞G 661
G-＞A 665
T-＞A 728
T-＞G 728
G-＞C 813
实例2
与小鼠FC融合的C1ORF32细胞外域(ECD)的克隆和表达
此分析的目的是克隆经由其对应C末端融合至小鼠Fc(mFc)的C1ORF32 ECD，并且在HEK293T细胞(ATCC-CRL-11268)中表达融合的ECD，以便进一步用于C1ORF32 ECD的功能评估。
克隆的ECD的坐标描述于表8中。
表8：
融合蛋白(ECD_mFc)的克隆分两个步骤来完成：
1.将ECD克隆至pIRESpuro3(双顺反子哺乳动物表达载体，Clontech目录编号：631619)。
2.在框内将包含鼠免疫球蛋白Cγ2a链的铰链、CH2以及CH3区的小鼠Fc IgG2a亚克隆至来自步骤1的先前克隆至pIRESpuro3中的ECD的C′末端。
将ECD克隆至pIRESpuro3
将ECD(对应于氨基酸1-184)克隆至pIRESpuro3是通过PCR使用其全长序列作为模板，以及上游具有NheI序列位点的对应于氨基酸1-6的正向引物，以及下游具有BamHI序列位点的对应于178-184aa的反向引物来进行，如表9中列出。
表9：ECD克隆详情
在表9中示出的引物序列中，粗体字母代表基因特异性序列，而用于克隆目的的限制位点延长是斜体并且Kozak序列加下划线。
PCR产物经过纯化并且如表9中描述以适当限制性内切酶消化。将PCR产物C1ORF32连接至pIRESpuro3中。将连接混合物转化至DH5a感受态细胞中。筛选阳性转化株并且通过DNA测序验证。
克隆ECD-mFc pIRESpuro3
将后接TEV裂解位点序列的小鼠Fc(IgG2a)(登录-CAA49868 aa 237-469)蛋白序列进行密码子优化以便增强哺乳动物系统中的蛋白表达。优化的序列由GeneArt(德国)来合成，其中在N′末端具有侧接BamHI限制位点并且在C′末端具有NotI限制位点。DNA片段用BamHI/NotI消化并且在框内连接至先前用相同酶消化的ECD_pIRESpuro3构建体中以便给出ECD_mFc_pIRESpuro3。将连接混合物转化至DH5a感受态细胞中。筛选阳性转化株并且通过DNA测序验证。
所得ECD_mFc ORF的核苷酸序列在图2中示出：对应于ECD序列的基因特异性序列以粗体标明，TEV裂解位点序列加下划线，mFc序列为非粗斜体并且信号肽序列为粗斜体。图2示出C1ORF32_P8_V1_ECD_mFcDNA序列(1287bp)(SEQ ID号：7)。
生成的ECD_mFc融合蛋白的序列在图3中示出：对应于ECD序列的基因特异性序列以粗体标明，TEV裂解位点序列加下划线，mFc序列为非粗斜体并且信号肽序列为粗斜体。图3示出C1ORF32_P8_V1_ECD_mFc氨基酸序列(428aa)(SEQ ID号：8)。
为了产生C1ORF32_P8-V1_ECD_mFc表达细胞，将HEK-293T细胞用以上描述的对应于融合至小鼠Fc的C1ORF32细胞外域的构建体来转染。稳定池如下产生：转染后48小时，细胞经过胰酶消化并且转移至含有选择培养基(DMEM 10％FCS以及5μg/ml嘌呤霉素)的T75烧瓶以便获得稳定池。培养基每3至4天更换直到形成菌落为止。
为了验证细胞的特性，进行基因组PCR，表明正确的序列被整合至细胞基因组中(数据未示出)。
实例3
融合至小鼠FC的C1ORF32细胞外域(ECD)的蛋白产生(C1ORF32_P8-V1_ECD_mFc)
在HEK293T细胞中的产生：
为了产生融合至小鼠Fc的C1ORF32 ECD(C1ORF32_P8-V1_ECD_mFc)，使用以在此以上描述的对应构建体稳定转染的转染HEK293T细胞池。将通常保持在10％血清补充培养基中的转染细胞转移至补充有4mM谷氨酰胺以及选择抗生素(5ug/ml嘌呤霉素)的无血清培养基(EX-CELL293，SAFC)中，并且伴以搅拌在37℃下在摇瓶中悬浮生长。培养体积通过连续稀释来增加直到在2L旋转瓶中进行3-4天生产期为止。将来自旋转瓶的培养基收获，通过离心来清除细胞，经由0.22μm过滤器过滤并且保持在-20℃下。
如下所述，使用nProteinA-亲和色谱来纯化C1ORF32_P8_V1_ECD_mFc蛋白。
使用PALL超滤系统在两个10kD匣(cassette)上将收获物浓缩约10倍。然后通过添加5M NaOH来将浓缩物调整至pH 7.5，并且经由0.2μm Stericup过滤器过滤。
纯化过程使用AKTA Explorer(通用电气医疗集团(GE Healthcare))来进行。将2ml nProtein A Sepharose TM，快速流动树脂(目录#17-5280-02)在Poly-prep色谱管柱上在真空下用10管柱体积(CV)的70％乙醇、10CV WFI(灭菌冲洗用水(TEVA))、随后用10CV缓冲液A来清洗。将2ml树脂转移至两个500ml管(各自1ml)中并且添加浓缩的收获物。将管在4℃下在转瓶上孵育过夜以允许蛋白结合。结合的树脂然后转移并且在恒定流量下填充至XK16管柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，目录#18-8773-01)中。管柱用20CV缓冲液A(100Mm Tris pH 7.4)清洗并且在一个步骤中使用100％缓冲液B(柠檬酸/磷酸pH 3.0)进行洗脱。这些部分用12.5％(v/v)缓冲液C(2M Tris pH 8.5)滴定以便将pH调整至～7.5并且汇集。
使用53ml HiPrep TM(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，目录#17-5087-01)脱盐管柱将最终缓冲液交换至DPBS(杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液盐水pH 7.4，没有Ca，没有Mg)中，其pH为7.4，没有Ca，并且没有Mg。蛋白经由0.22μm过滤器过滤，在无菌条件下等分，并且在-80℃下储存。
最终蛋白浓度通过BCA总蛋白测定来确定并且蛋白通过考马斯染色还原SDS/PAGE来分析(数据未示出)。内毒素水平通过比色LAL测定(鲎阿米巴样细胞裂解物(LimulusAmebocyte Lysate)，QCL-1000，Cambrex)来确定。具体蛋白的特性通过MS来验证(在SmolerProteomics Center(Smoler蛋白组学中心)，海法市以色列科技学院(Technion，Haifa)，数据未示出)。
所得蛋白分析总结于表10中。
表10
除了HEK293T产生的蛋白以外，还在Catalent(威斯康星州米德尔顿(Middleton，Wisconsin))在CHO细胞中产生了C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)。
在载体pIRESpuro3中的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)的先前描述的cDNA序列的插入物的cDNA序列通过Catalent来验证并且使用其构建逆转录病毒载体，随后经过四轮逆转录病毒载体转导至Catalent的CHO-S细胞系中。产生并且扩增汇集的群体，并且基因拷贝指数为2.7。细胞培养物上清液通过Catalent的Fc ELISA测定来分析并且4x转导池的相对产能是28μg/ml。
蛋白在5L波生物反应器中产生，并且根据其内部过程来纯化。测试内毒素水平，并且估计为0.25-0.5EU/ml。从～10L细胞池中获得总共～400mg。
实例4-使用C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)来治疗PLP139-151诱导的EAE(R-EAE)，一种多发性硬化模型-调节疾病诱导和进展
如前所述，将在CHO细胞中产生的融合蛋白C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在多发性硬化动物模型R-EAE，以及相关体外测试模型中加以测试，并且发现是高度有效的。如上所述的此融合蛋白包括融合至IgG2a的小鼠Fc的C1ORF32-P8_V1(在此又称为H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5))的细胞外域(ECD)。进行两组研究：在此描述的第一组(图5)示出融合蛋白可以有效治疗R-EAE中的正在进行的疾病。在此实例中描述的第二组(图4)示出用在致敏时(即在疾病发作之前的疾病诱导时)给予的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)的预防性治疗减少了疾病严重度水平以及疾病复发频率。如在实例5研究D中描述，使用在HEK-293细胞中产生的蛋白观察到类似结果(图10)。
在以预防或治疗模式给予不同剂量以及频率后，此实例示出CHO产生的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在R-EAE模型中的疗效[Theien(塞恩)等人，(2003)血液(Blood)102(13)：4464-71]。此模型是基于实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型的多发性硬化复发模型，该EAE模型是中枢神经系统(CNS)的炎症性脱髓鞘性疾病。其中被诱导R-EAE的出现复发-缓解疾病的动物可用于复发-缓解多发性硬化以及其他亚型的多发性硬化的测试治疗。
在此实例中，通过给予PLP139-151肽至SJL小鼠来诱导R-EAE。在所研究的治疗方面之中，包括在疾病诱导(即预防性给予)时以及发生疾病缓解(即治疗性给予)时的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗的示例性、说明性最佳计划。此外，研究30μg/小鼠以及100μg/小鼠，以及两种给药频率，即每周3次历时两周或每天一次给予历时6天的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗的疗效。
动物方法：6周龄的雌性SJL小鼠购自Harlan并且在开始实验之前保持在CCM中心动物护理机构(在此被称为CCM)1周。小鼠随机地分配成每组10只动物的组并且在第0天用50微克PLP139-151/CFA(完全弗氏佐剂(Complete Freund′s Adjuvant))致敏。小鼠接收6次i.p.(腹膜内)注射的对照Ig(mIgG2a)、C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)、抗-CD80Fab，或非有丝分裂抗-CD3(经由i.v.(静脉内)注射)，如以下列出。在55或100天期间(分别针对预防性和治疗性给予)跟踪小鼠以便获得疾病计分并且按照如下0-5量表进行记分：0，没有异常；1，尾部瘫软；2，尾部瘫软和后肢虚弱；3，后肢麻痹；4，后肢麻痹和前肢虚弱；以及5，濒死。
组：(每组n＝10)
在前几组(1-6)中，治疗开始于疾病诱导(即致敏)(第0天)时：
组1：对照Ig(mIgG2a)(100微克/剂量；6个每天一次连续剂量)
组2：C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(30微克/剂量；6个每天一次连续剂量)
组3：C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(100微克/剂量；6个每天一次连续剂量)
组4：C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(30微克/剂量；每周3次剂量历时2周)
组5：C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(100微克/剂量；每周3次剂量历时2周)
组6：非有丝分裂抗-CD3(50微克/剂量；6个每天一次连续剂量)
在后几组(7-12)中，治疗开始于疾病缓解发生时(疾病诱导后第20天)：
组7：对照Ig(mIgG2a)(100微克/剂量；6个每天一次连续剂量)
组8：C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(30微克/剂量；6个每天一次连续剂量)
组9：C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(100微克/剂量；6个每天一次连续剂量)
组10：C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(30微克/剂量；每周3次剂量历时2周)
组11：C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(100微克/剂量；每周3次剂量历时2周)
组12：抗-CD80Fab(50微克/剂量；6个每天一次连续剂量)
结果：
在第0天开始的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)预防性给予导致在所使用的所有方案下急性期疾病状况有力改进，如降低的临床计分以及延迟的疾病发作所证明(图4)。另外，观察到复发率急剧降低，表现为疾病症状在复发中改进，其中通过每周3次给予30ug/小鼠亦或100ug/小鼠C1ORF32-P8-ECD-mFc(SEQ ID号：8)达到从第43天起的最明显的疾病消除。此有利效果是持久的并且持续贯穿研究的观察期。用C1ORF32-P8-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗的所有组示出比用非有丝分裂抗CD3治疗的阳性对照组更好的疗效。
图4A示出在疾病致敏时，以预防模式给予的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在R-EAE模型中提供表现为在所使用的所有方案中的疾病状态改进的有效的疗效，如降低的临床得分以及延迟的疾病发作所证明。示出平均临床计分(图4A)、累积平均临床计分(图4B)以及复发频率(图4C)。
此外，在第20天，疾病缓解发生时以治疗模式给予C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQID号：8)展示C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在所有方案中使疾病症状得到急剧改进(图5)。此治疗导致复发完全消除以及疾病体征去除多达100天，即在最后一次给予C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)之后66天。C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)的治疗功效也优于阳性对照，抗-CD80Fab。
图5示出在R-EAE模型中，在疾病缓解发生时(第20天)，以治疗模式给予C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)展示在整个研究持续时间(多达100天)在所有方案下疾病症状得到急剧并且持久的改进，如平均临床计分(图5A)、累积平均临床计分(图5B)以及复发频率(图5C)减少所表明。
整体上，C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)的持久有益效果指示C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)可诱导对于驱动疾病进展的髓磷脂表位的耐受性。耐受性诱导的另外支持提供于实例6研究A和B中。
实例5-通过C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)来调节T细胞活性以及使用HEK-293或CHO-衍生蛋白来预防多发性硬化的用途
此实例示出C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc在体外对于T细胞活性的调节作用以及用C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)预防性治疗(即在疾病诱导时以及在疾病发作之前)减少疾病严重度水平以及疾病复发频率。在体外，在HEK-293细胞中产生的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)展示抑制表现为细胞增殖以及细胞因子分泌的T细胞活化的独特能力(图6-8)。另外，HEK-293和CHO产生的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)都展示抑制促炎症性Th1以及Th17应答分化、同时使免疫应答朝向调控性Th2-应答偏移的独特能力(图9和图11)。CHO产生的蛋白还抑制小鼠脾细胞的活化，由抑制细胞因子分泌所展示(图22)。在小鼠PLP-139-151诱导的R-EAE中预防性给予来源于HEK-293的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)展示表现为疾病计分以及复发频率得到降低的疗效(图10)。这些研究提供于以下六个小节(研究A-F)中。提供于研究A、B、E以及F中的体外数据指示在HEK-293亦或CHO细胞中产生的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)抑制在抗-CD3/抗-CD28存在或在同源抗原性肽存在下活化的小鼠T细胞或脾细胞的活化。此外，提供于研究C和研究E中的数据指示在Th0细胞、Th1细胞、Th2细胞或Th17细胞促进条件下将C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)添加至在同源抗原性肽存在下活化的初始CD4+T细胞抑制了Th1和Th17应答，并且促进Th2应答，将细胞因子概况朝向Th2细胞表型偏移。研究D指示在PLP139-151 R-EAE疾病诱导时用C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗小鼠减少了疾病严重度水平，如通过平均临床计分、累积平均临床计分以及疾病复发频率所确定。
研究A：如通过CD4+T细胞活化后的细胞增殖所确定，确定C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc (SEQ ID号：8)在体外的疗效和剂量应答
目的：本实验计划的目标是调查在HEK-293细胞中产生的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)抑制CD4+T细胞活化的能力以及C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)用于未来体外实验中的理想浓度。
方法：为此目的，测试不同剂量的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)抑制CD4+T细胞增殖的能力。将初始CD4+T细胞从野生型小鼠(来自Harlan的SJL以及来自Jackson的BALB/c)分离并且在体外在抗-CD3/抗-CD28存在下活化。测试两种品系的小鼠的原理是确保没有小鼠品系与品系之间的差异。将初始CD4+T细胞从总淋巴结以及脾细胞群中分离，并且在体外在抗-CD3/抗-CD28存在下，在C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)、对照Ig(mIgG2a，作为阴性对照)或B7-H4Ig(作为阳性对照)存在下活化。细胞增殖经由氚化胸苷并入来确定。
组：
BALB/c或SJL T细胞+珠粒结合对照Ig(mIgG2a)(1、2.5、5以及10μg/ml)
BALB/c或SJL T细胞+珠粒结合C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(1、2.5、5以及10μg/ml)
BALB/c或SJL T细胞+珠粒结合B7-H4Ig(1、2.5、5以及10μg/ml)
结果：图6中示出的结果指示C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗在来源于SJL或BALB/c小鼠的T细胞中降低细胞增殖水平。效果与阳性对照B7-H4类似，并且2.5-5μg/ml的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在此测定中似乎是C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)的最佳浓度。
研究B：确定在体外C1ORF32-P8-V1-ECD-MFC(SEQ ID号：8)对于CD4+T细胞活化、增 殖以及细胞因子产生的作用。
目的：本实验的目标是确定在HEK-293细胞中产生的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQID号：8)，在结合至珠粒、板结合或以可溶性形式添加至培养物时抑制T细胞活化的能力，如通过细胞增殖以及细胞因子产生所确定。
方法：测试在不存在特异性CD4+效应T细胞驱动条件下，C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)抑制CD4+T细胞增殖以及细胞因子产生的能力。为此，将初始CD4+T细胞从野生型小鼠(SJL以及BALB/c)分离并且在体外在抗-CD3/抗-CD28存在下活化。在本研究中使用来自研究A的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(5ug/ml)最佳浓度。将初始CD4+T细胞从总淋巴结以及脾细胞群中分离，并且在体外在抗-CD3/抗-CD28存在下，在C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)、对照Ig(阴性对照)或B4-H4Ig(阳性对照)存在下活化。建立两组相同的培养物，以便进行增殖以及细胞因子产生。细胞增殖经由氚化胸苷并入来确定，并且将培养物上清液收集并且经由LiquiChip来分析。示出所产生的IL-2、IFN-γ、IL-17、IL-10以及TFN-α的水平。还分析IL-4、IL-5以及IL-12的水平，但是这三个细胞因子低于检测水平。
组：
T细胞+可溶性对照Ig(mIgG2a)
T细胞+板结合对照Ig(mIgG2a)
T细胞+珠粒结合对照Ig(mIgG2a)
T细胞+可溶性C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)
T细胞+板结合C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)
T细胞+珠粒结合C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)
T细胞+可溶性B7-H4 Ig
T细胞+板结合B7-H4 Ig
T细胞+珠粒结合B7-H4 Ig
结果与结论：所获得的对于T细胞增殖以及细胞因子分泌的结果呈现于图7(SJL初始CD4+T细胞)以及图8(BALB/c初始CD4+T细胞)中，示出用C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗时的T细胞活化的抑制，如通过细胞增殖以及细胞因子分泌所表现。对于来自两种品系的小鼠的T细胞获得类似结果。C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在以可溶性形式或以板结合或珠粒结合形式添加至培养物时以浓度依赖性方式减少CD4+T细胞增殖水平。然而，珠粒结合形式的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在抑制细胞增殖以及细胞因子产生方面有效得多，并且可溶性形式的蛋白的有效性最小。从当前数据，5ug/ml的涂布于珠粒上的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)是最佳浓度。
研究C：确定在体外C1ORF32-P8-V1-ECD-MFC(SEQ ID号：8)对于CD4+T细胞分化以 及细胞因子产生的作用
目的：本实验计划的目标是调查在HEK-293细胞中产生的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)抑制CD4+T细胞活化以及分化的能力。
方法：测试C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)抑制CD4+T细胞分化、细胞因子产生以及增殖的能力。为此，将初始CD4+T细胞从DO11.10小鼠(其中所有CD4+T细胞表达对于OVA323-339肽具有特异性的T细胞受体(TCR)的转基因小鼠)分离。使用DO11.10 CD4+T细胞的原理是多克隆(抗-CD3/抗-CD28mAbs)以及肽特异性CD4+T细胞活化可对于相同群体的CD4+T细胞进行研究。实验上，初始CD4+细胞在存在Th0细胞(IL-2)、Th1细胞(IL-2+IL-12)、Th2细胞(IL-2+IL-4)、或Th17细胞(TGF-β+IL-6+IL-23+抗-IL-2)促进条件下被活化。为了活化CD4+T细胞，将细胞在存在抗-CD3/抗-CD28涂布珠粒或OVA323-339肽加上照射的BALB/c脾细胞下，在存在C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)、对照Ig或B7-H4Ig的情况下进行培养。建立两个并列培养物组；一种培养物用氚化胸苷在24小时脉冲处理并且在72小时时收获，同时第二板在96小时时收获，用于细胞因子产生。IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-17、IFN-γ以及TNF-α的水平经由LiquiChip来测试。还分析IL-12和TNF-α的水平，但是这两种细胞因子低于检测水平。
组：
组1：对照Ig(mIgG2a)
ThO与抗-CD3/28加上珠粒结合
Th1与抗-CD3/28加上珠粒结合
Th2与抗-CD3/28加上珠粒结合
Th17与抗-CD3/28加上珠粒结合
Th0与OVA+APC加上可溶性
Th1与OVA+APC加上可溶性
Th2与OVA+APC加上可溶性
Th17与OVA+APC加上可溶性
组2：C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)-与对照Ig相同
组3：B7-H4Ig-与对照Ig相同
结果：图9中示出的结果指示C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在结合至具有抗-CD3/抗-CD28的珠粒时，连同在将可溶性蛋白添加至经过照射的APC+OVA323-339活化条件时，减少CD4+T细胞增殖水平。C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)减少分别在存在Th1细胞-以及Th17细胞促进条件下活化的CD4+T细胞产生的IFN-γ和IL-17的水平。此外，C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)似乎促进在存在Th2细胞促进条件下活化的CD4+T细胞产生的IL-4和IL-5的水平。有趣地，C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)似乎还促进在存在Th2或Th17细胞促进条件下活化的CD4+T细胞产生的抗炎症细胞因子IL-10水平。
研究D：确定在SJL小鼠中的PLP139-151诱导的R-EAE中C1ORF32-P8-V1-ECD-MFC(SEQ ID号：8)治疗在疾病诱导时的疗效
目的：为了确定在具有PLP139-151的SJL小鼠中R-EAE诱导时C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗的疗效。
方法：6周龄的雌性SJL小鼠购自Harlan并且如前所述在开始实验之前保持在CCM机构1周。小鼠随机地分配成每组10只动物的组并且在第0天用50μg PLP139-151/CFA致敏。在第0天(致敏日)开始，小鼠接收6次i.p.注射的对照Ig或C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)、或6次i.v.注射的非有丝分裂抗-CD3(作为降低疾病诱导的阳性对照)。在45天期间跟踪小鼠疾病。
组：
对照Ig(mIgG2a)
在HEK-293细胞中产生的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)
非有丝分裂抗-CD3
结果：呈现于图10中的结果表明在疾病诱导后第0-5天用C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)经由i.p.每日注射来治疗小鼠降低了临床疾病水平，如通过平均临床计分以及累积平均临床计分所确定，并且此保护效果比阳性对照的效果更显著。截止或接近疾病诱导后第+30天，治疗效果似乎丧失，并且此现象在复发频率数据中示出。截止疾病诱导后第+30天的疾病保护丧失在积极诱导的疾病模型中是被预期的，因为在小鼠背部仍然存在丸剂的PLP139-151/CFA，允许在此研究时程内新的PLP139-151-特异性CD4+T细胞活化。
研究E：在体外将两种来源的C1ORF32-P8-V1-ECD-MFC(SEQ ID号：8)对于CD4+T细 胞增殖以及细胞因子产生的效果进行比较。
目的：为了调查在CHO细胞中产生的新的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)蛋白抑制CD4+T细胞活化的能力，并且将其与在HEK-293细胞中产生旧的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)蛋白比较。
方法：初始CD4+T细胞在存在以1∶2的比率(珠粒与T细胞)用抗-CD3(0.5ug/m1)、抗-CD28(2μg/ml)以及5ug/ml对照Ig，在CHO细胞中产生的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)，或在HEK-293细胞中产生的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)涂布的珠粒下活化。细胞在存在Th0细胞、Th1细胞、Th2细胞以及Th17细胞促进条件下被活化。
组：
SJL T细胞+对照Ig(mIgG2a)(1ug/ml)
SJL T细胞+对照Ig(mIgG2a)(5ug/ml)
SJL T细胞+对照Ig(mIgG2a)(10ug/ml)
SJL T细胞+新的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(1ug/ml)+对照Ig(9ug/ml)
SJL T细胞+新的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(5ug/ml)+对照Ig(5ug/ml)
SJL T细胞+新的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(10ug/ml)+对照Ig(0ug/ml)
SJL T细胞+老的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(1ug/ml)+对照Ig(9ug/ml)
SJL T细胞+老的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(5ug/ml)+对照Ig(5ug/ml)
SJL T细胞+老的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(10ug/ml)+对照Ig(0ug/ml)
结果：呈现于图11中的结果表明在CHO中产生的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)具有与HEK-293中产生的类似效果，并且能够在存在Th1细胞和Th17细胞促进条件下抑制CD4+T细胞分化，同时增强Th2细胞分化。
研究F：C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在体外对于小鼠脾细胞活化的作用
方法
将脾脏从麻醉小鼠体中收获。脾细胞通过在Histopaque-(Sigma 1119)中将捣碎的脾离心来分离并且以1.0x106细胞/毫升悬浮。将C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)作为可溶性蛋白在1、5以及10μg/ml的最终浓度下添加至脾细胞。在与C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)类似浓度下，将FK506和B7-H4 Ig用作阳性对照并且mIgG2a用作阴性对照。将抗-CD28加入脾细胞以便在96孔透明底板中的抗-CD3预涂布孔中获得在100微克/孔样品中的1μg/ml的最终浓度(PBS中的1μg/ml，在4℃下过夜)。将板在37℃以及5.0％湿度下孵育24小时，并且通过标准ELISA(酶联免疫吸附测定)分析细胞因子分泌。
结果：
进行的两个研究的结果在图22中示出并且指示C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗以剂量依赖性方式降低活化的脾细胞的IFNγ(图22A和图22B)、IL-2(图22C和图22D)以及IL-4(图22E和图22F)产生水平。每个研究的结果分别标记为“研究1”以及“研究2”。C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)的效果大约类似于阳性对照B7-H4，但是低于免疫抑制性FK506。阴性对照IgG2a基本上没有效果。如所示出，研究重复两次，具有类似结果。
实例6-在SJL小鼠中的PLP139-151诱导R-EAE中C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号： 8)的治疗效果的作用模式
多发性硬化的复发性质由致脑炎性自身反应T细胞浸润至CNS中，从而攻击内源性髓磷脂表位而产生。对于新暴露的复发相关的髓磷脂表位的这种应答被称为“表位扩展”。C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在R-EAE模型中的有益效果下的作用模式通过以下方法来研究：分析其对于次要淋巴器官以及CNS中的免疫细胞群的影响，并且测试在疾病期间脾细胞和淋巴结细胞对于扩展表位的回忆应答。
研究A-C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)对于针对离体脾细胞的扩展表位的回忆应答，以及对于CNS、脾以及淋巴结内的细胞迁移的效果
目的：进一步证实C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗在SJL小鼠的PLP139-151诱导的R-EAES中在疾病缓解期间的疗效，并且研究C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQID号：8)治疗对于CNS和次要淋巴器官内的免疫细胞群的效果。
方法
6周龄的雌性SJL小鼠购自Harlan并且在开始实验之前保持在CCM机构1周。小鼠随机地分配成4组(每组10只小鼠)，并且在第0天用50ug PLP139-151/CFA致敏。在疾病缓解期间(疾病诱导后第18天)开始，小鼠接收i.p.注射的对照Ig、C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)，或抗-CD80Fab，如以下列出的实验组列表所指示。在50天时程内跟踪小鼠的临床疾病。在此时程(疾病诱导后第35天)期间，来自每个治疗组的5只代表性小鼠针对经由对于扩展表位的离体回忆应答、经由增殖和细胞因子分泌的表位扩展来进行评估。此外，评估CNS、脾以及淋巴结中的细胞数以及表型。对于体外回忆应答，来自单独小鼠的总脾细胞在存在单独培养基、疾病诱导肽(PLP139-151)、扩展表位肽(PLP178-191和MBP84-104)以及抗-CD3下被活化。
组：(每组n＝10只小鼠)
组1：对照Ig(100ug/剂量；每周3次剂量历时2周)(小鼠IgG2a；BioXCell目录BE0085)
组2：C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(30微克/剂量；每周3次剂量历时2周)
组3：C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(100微克/剂量；每周3次剂量历时2周)
组4：抗-CD80Fab(50毫克/剂量；5个连续剂量)(克隆16-10A1的Fab；BioXCell目录BE0024)
结果
如先前(实例4)所述，对于更低剂量和更高剂量(分别为30和100ug/剂量)，本实例示出C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗在R-EAE模型中的类似疾病调节作用。如图12A示出，在疾病缓解开始发生时，使用30ug/剂量或100ug/剂量的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)来治疗患有PLP139-151-诱导R-EAE的SJL小鼠在显著水平上减少了疾病严重度。
C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗影响CNS以及次要淋巴器官中的免疫细胞群的总细胞数和构成。最突出的是CNS内的浸润CD4+T细胞数稳健降低，这与疾病严重度水平减少强烈相关(图12B和12C)。
只在用100微克/小鼠C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗时观察到免疫细胞募集至脾以及淋巴结的轻微增加。
R-EAE小鼠的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗还极大地抑制脾细胞对于PLP139-151(疾病诱导表位)或PLP178-191(扩展表位)的回忆应答，这指示C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)抑制髓磷脂特异性T细胞应答(图12D)。确切地，这些调查结果指示表位扩展的抑制并且因此支持C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗导致诱导耐受性的观念。
此外，C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗抑制对于PLP178-191的Th1/Th17应答，并伴随有促进Th2应答以及上调抗炎症IL-10细胞因子(图12E)。这些结果与在先前研究(参见实例5)中用C1ORF32-P8-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗T-细胞时观察到的对于Th1/Th17和Th2应答的体外效果高度地相关。
C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗还抑制淋巴结细胞回忆应答，如响应诱导表位(PLP139-151)的细胞增殖所表明(图12F)。预期与脾细胞形成对照，不存在淋巴结细胞对于扩展表位的回忆应答，因为与颈部淋巴结细胞相比，脾细胞更好地反映CNS内的应答。
整体上但是不希望受单一假设限制，这些结果指示C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQID号：8)通过干扰致脑炎性T细胞至CNS中的迁移，以及经由免疫调节来发挥其有益效果，其中对于髓磷脂相关表位具有特异性的Th1/Th17细胞的活化和分化受到抑制，同时Th2应答得到促进，从而限制自身反应性Th1细胞的扩展和CNS浸润。耐受性诱导由表位扩展的抑制来暗示，并且在短期给予C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)之后的长期改进疾病症状以及消除复发中也是明显的，这在这一研究和先前研究中都观察到了。
研究B-C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在R-EAE中的剂量应答分析以及其在体内和离体对于扩展表位的回忆应答的效果
目的：
为了进一步研究C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在较宽剂量范围(10-100微克/小鼠)下的治疗效果并且进一步建立C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID：8)对于耐受性诱导的观察效果。
在此项研究中，在体内使用对于诱导肽(PLP139-151)，以及对于扩展表位肽(PLP178-191和MBP84-104)的DTH(延迟型过敏)应答，在第一次复发峰值时(第35天)以及最后一次治疗之后3周，即预期C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)得以清除并且不再存在于小鼠循环中的时间点(第65天)研究耐受性诱导。还离体使用总脾细胞和淋巴结细胞对于扩展表位的回忆应答来研究耐受性。
方法：
6周龄的雌性SJL小鼠购自Harlan并且在开始实验之前保持在CCM机构1周。小鼠如下所述随机地分配成组并且在第0天用50μg PLP139-151/CFA致敏。小鼠接收每周3次历时2周共6次i.p.注射的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)或mIgG2a同种型对照。在疾病缓解发生时，每隔一天治疗小鼠并且在65天期间跟踪疾病。在第35天(复发峰值期间，此时组织学损伤较高)，在一只耳朵中注射10ug PLP139-151并且在相对耳朵中注射PLP178-191而针对诱导肽PLP139-151以及扩展表位肽PLP178-191的DTH应答来测定用C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(30或100μg)亦或同种型对照治疗的组中的5只小鼠。激发后24小时测定耳朵膨胀水平。测定DTH之后，将小鼠处死并且收集脾和颈部淋巴结，用于对PLP139-151以及PLP178-191的离体回忆应答，测定总细胞增殖。
最后一次治疗日之后三周，在一只耳朵注射10ug PLP178-191并且在相对耳朵中注射MBP84-104，针对扩展表位肽PLP178-191以及较晚扩展表位MBP84-104的DTH应答来从每个组中选择5只代表性小鼠。激发后24小时测定耳朵膨胀水平。
组：
组1：对照Ig(mIgG2a)100μg/剂量n＝15
组2：C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)10μg/剂量n＝10
组3：C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)30μg/剂量n＝15
组4：C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)100μg/剂量n＝15
结果：
本实例示出R-EAE-诱导的小鼠的疾病严重度在用C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQID号：8)每周3次以30以及100ug/剂量在治疗模式下进行治疗时的显著降低，同时对于10μg/剂量观察到更低疗效，如图13A示出。
R-EAE小鼠的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗在第35天以及第65天(分别为图13B以及13F)极大地抑制对疾病诱导(PLP139-151)以及复发相关表位PLP178-191以及MBP84-104的DTH应答。
此外，C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗导致在第35天以及第65天体外回忆应答减少。第35天淋巴结细胞响应PLP139-151的增殖受到抑制并且响应抗-CD3(总体活化)和PLP178-191的增殖也在较小程度上受到抑制(图13C)。在第35天脾细胞中观察到响应抗-CD3、PLP139-151以及PLP178-191的增殖的更显著抑制(图13D)。在第65天脾细胞中也观察到响应PLP139-151、PLP178-191以及MBP84-104的增殖的剂量依赖性抑制(图13F)。总之，示出表位扩展抑制的这些结果与如上在研究F中所述的结果相关，并且提供C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)经由抑制髓磷脂特异性T细胞应答来诱导耐受性的另外支持。
额外地，在抗-CD25治疗之后Treg细胞在功能上无活性的PLP139-151-诱导R-EAE的一项研究中，CGEN-15001治疗导致与未用抗-CD25治疗的小鼠类似的疾病严重度降低(数据未示出)。在一个单独EAE研究中，用PLP139-151疾病诱导后10天开始的CGEN-15001治疗未改变Treg细胞数或其功能，如这些细胞在与效应细胞共孵育后增殖的能力所证明(数据未示出)。进行另外的研究以便完全阐明CGEN-15001对于不同亚型Treg，以及在不同动物模型中的效果。
实例7-C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在过继转移R-EAE模型中的疗效
目的：
为了确定在细胞转移时给予时C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗对于从R-EAE小鼠体内收获的高度活化细胞转移至健康接受小鼠时的R-EAE发作以及严重度的效果。
方法：
供体以及受体雌性6周龄的SJL小鼠购自Harlan(以色列)并且在开始实验之前保持在CCM机构1周。在第0天，供体小鼠用PLP139-151/CFA致敏。从供体小鼠排出的淋巴结在致敏后第8天收获，并且总淋巴结细胞离体在存在PLP139-151下被活化3天。在培养之后，细胞用PBSE染色并且每组10只接受小鼠经由i.v.注射接受5x106个胚细胞。在细胞转移时，向小鼠i.p.给予对照Ig或C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(分别为100ug/剂量，每周3次历时两周)。在第14天，将来自每个治疗组的五个小鼠处死并且跟踪其余小鼠的临床计分直到第30天为止。脾脏、LN(淋巴结)以及CNS针对总细胞计数以及转移细胞迁移的差异来进行分析(PBSE+)。
结果：
在细胞转移时给予C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)导致消除疾病发展。如图14A示出，用对照Ig治疗的小鼠出现严重、复发缓解疾病，表现为在第10天发作并且在第14天达到显著疾病计分。C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号8)治疗的小鼠在观察时间(30天)期间没有疾病症状。疾病发展的这一消除伴随着CNS中的免疫细胞浸润降低(图14B)，尤其是转移的自身反应性T细胞向CNS中的迁移减少(图14C)。
这些数据与实例4中描述的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)所给予的治疗效果并且与如实例6中描述的CNS中的复发相关致脑炎性自身反应性T细胞的浸润得到抑制高度相关，并且因此提供C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)经由耐受性诱导的治疗能力的另外支持。
实例8-C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)对于人T-细胞活化的作用
研究I-人T细胞通过抗-CD3以及抗-CD28-涂布珠粒的活化被C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc抑制
C1ORF32-P8-VI-ECD-mFc(SEQ ID号：8)对于人T细胞应答的效果通过两个不同体外测定使用纯化的人T细胞来测试。在第一个测试中，人T细胞由抗-CD3以及抗-CD28涂布的珠粒来活化，并且在另一个测试中，活化使用抗-CD3以及抗-CD28抗体在存在自体、经过照射的PBMC下来进行。C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)对于人T细胞活化的调控活性通过测量细胞增殖以及细胞因子释放来评估。
材料和方法
将T细胞从健康人类供体的血液分离，并且在存在用抗-CD3以及抗-CD28抗体涂布的珠粒的情况下在体外活化。C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)对于T细胞活化的效果通过在存在C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)或对照Ig(作为阴性对照)的情况下涂布珠粒来评估。在72小时之后测量细胞增殖以及IFNγ释放。
详细方法
人T细胞从全血通过阳性选择使用偶联至单克隆抗-人CD3抗体(MACS全血CD3微珠粒#130-090-874)的微珠粒来纯化。
在一步式涂布方法中，Dynabeads(M-450 Epoxy Dynabeads，Invitrogen，Invitrogen目录编号140.11)用抗-CD3&抗CD28(0.5&2ug/ml)在存在或不存在对照Ig或C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)的情况下(以图中描述的浓度)来涂布。在‘两步’涂布方法中，Dynalbeads首先用抗-CD3&抗-CD28(0.5&2ug/ml)涂布，并且然后添加Fc融合蛋白或对照。
纯化的CD3T细胞用抗-CD3+抗-CD28涂布的珠粒来活化。在存在或不存在CD3+CD28-涂布珠粒的情况下，将细胞在2∶1的细胞与珠粒比率下以每孔2x10e5来接种。
72小时之后，通过H3-胸苷并入来测量细胞增殖并且将上清液收集并且通过ELISA来测试IFNγ水平。
结果
C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)显示对于T细胞活化的强抑制作用，表现为在一步方法(图15)或两步方法(图16)中涂布珠粒时来自不同人类供体的T细胞的细胞增殖以及IFNγ分泌的减少。图15A和15B示出来自供体091608A和091608B的T细胞增殖以及IFNγ产生(分别)，而图15C示出来自供体092308A和092308B的T细胞增殖。
图16示出使用两步方法的结果。这些细胞使用在‘两步’涂布方法中用抗-CD3以及抗-CD28(分别为0.5和2ug/ml)，随后用对照IgG亦或C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(10微克/毫升)涂布的Dynabeads来活化。作为阳性对照，使用已知负性共刺激分子B7H4。图15A和15B示出来自供体091608A和091608B的T细胞增殖和IFNγ释放(分别)。此效果的程度在不同实验中可略微不同，这可以归因于供体可变性。
对于人T细胞增殖的抑制作用是剂量依赖性的，如图17示出。这些细胞使用在‘两步’涂布方法中用抗-CD3以及抗-CD28(分别为0.5以及2ug/ml)，随后用对照IgG或C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)(在1、2.5或5微克/毫升下)涂布的Dynabeads来活化。作为阳性对照，使用已知负性共刺激分子(B7-H4-Ig)。小鼠IgG用作Fc部分的对照。图表示出来自供体100708A以及100708B的T细胞增殖。似乎在10μg/ml下最佳的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)的效果与B7共刺激分子家族的已知抑制蛋白B7-H4是可比较的。C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)对于T细胞增殖的剂量依赖性抑制使用类似方法在单独实验室中重现(图18)。
不希望受单一假设限制，总体上，在获自多种供体的细胞中可重现的这些结果支持C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)是负性共刺激蛋白的观念，并且确认C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)展示的抑制作用经由ECD部分并且不经由Fc部分来转导。
研究II-人T细胞通过经过照射的自体PBMC的活化被C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc抑制
C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)对于人T细胞活化的效果还使用具有抗-CD3以及抗-CD28抗体的自体照射PBMC所活化的经过纯化的人T细胞来测试。在此设置中，经过照射的PBMC将抗-CD3、抗-CD28以及C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc或对照Ig呈递给T细胞。对于活化的效果通过经由H3-胸苷并入来测量T细胞增殖而评估。
方法
总PBMC使用菲柯尔(ficoll)梯度从健康人供体的新鲜血液中分离。10x106总PBMC再悬浮于Ex-Vivo 20培养基中，并且在3000拉德(rad)下照射。这些细胞待用作总经过照射的APC以便在体外活化分离的T细胞。PBMC的余量经由使用来自Miltenyi的CD4+T细胞分离试剂盒II而用于T细胞分离。
对于活化，5x105分离的T细胞在存在5x105自体照射PBMC下加以培养，添加可溶性形式的抗-CD3(0.5μg/ml)以及抗-CD28(2μg/ml)。培养物用1uCi的氚化胸苷在24小时脉冲处理，并且在72小时处测量增殖。
结果
在存在从不同人类供体分离的自体照射PBMC(图19)下，C1ORF32-P8-ECD-mFc(SEQID号：8)抑制用抗-CD3和抗-CD28活化的人T细胞的增殖。
C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)对于T细胞活化的表现为T细胞增殖以及促炎症细胞因子IFNγ释放的减少的抑制作用与其他负性共刺激B7蛋白的效果类似。不希望受单一假设限制，这些观察结果支持C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)属于B7家族的可能性。此外，C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)的抑制活性支持其作为抗炎症剂的潜力。
实例9-C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在类风湿性关节炎的胶原诱导性关节炎(CIA)模型中的治疗效果
使用小鼠CIA模型来研究C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)对于类风湿性关节炎的治疗潜力。
方法
通过用在完全弗氏佐剂中乳化的II型胶原进行免疫接种来在雄性DBA/1小鼠中诱导关节炎。每天监测小鼠的关节炎体征并且用C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)的治疗开始于关节炎第1天并且持续10天。每个治疗组包含8-10只小鼠，如下表11所述：
表11-治疗组
常规地测量后足垫肿胀(使用千分卡尺)，连同所有四肢中的关节涉及的数量和程度。关节记分如下：0-正常关节；1-轻微肿胀和/或红斑；2-显著肿胀；3-关节僵硬。
结果：
在100以及30微克/剂量下用C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)3次/周治疗确立了CIA的小鼠历时10天导致临床计分(图20A)以及脚爪膨胀(图20B)的有效减少。此外，C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗抑制表现为患上关节炎的脚爪的数量的疾病扩展(图20C)。C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)的疗效类似于用在此项研究中充当阳性对照的Enbrel(TNFαR-Ig，依那西普)所获得的疗效(图20)。
实例10-确定C1ORF32-P8-V1-ECD-MFC(SEQ ID号：8)对于B细胞类别转换以及抗体分泌的作用
静止B细胞从未致敏C57BL/6小鼠中分离并且在体外在存在抗-CD40加上非外源性细胞因子、IL-4亦或IFN-γ下加以活化。在培养物建立时，细胞培养物接受对照Ig(mIgG2a)、抗-CD86mAb(作为增加Ig产生的阳性对照)，或C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)，并且培养5天。测试在三种浓度下的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)。在培养结束时，经由ELISA测试上清液中IgM、IgG1以及IgG2a的存在。如果B细胞对于一种同种型抗体相对于另一种抗体进行类别转换的能力似乎发生改变，则经由ELISPOT来确定发生类别转换的B细胞的数量。如果抗体产生细胞的数量发生改变，则还可确定是否IgG1和IgG2a的γ1-以及γ2a-无菌转录物相对于成熟转录物的水平发生改变。C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)预期对于B细胞活化显示出抑制作用，这可例如通过类别转换和/或抗体分泌的减少来证明。
实例11-
A-使用FC-融合C1ORF32-P8-ECD-mFc(SEQ ID号：8)来确定C1ORF32-P8-V1-ECD-MFC(SEQ ID号8)对于人CD4+T细胞分化的效果
从5个人类供体中分离初始CD4+T细胞。初始CD4+细胞在存在ThO细胞(IL-2)、Th1细胞(IL-2+IL-12)、Th2细胞(IL-2+IL-4)或Th17细胞(TGF-β+IL-1β+IL-6+IL-23+IL-1β+抗-IL-2)促进条件下被活化。为了活化CD4+T细胞，在不存在或存在C1ORF32-P8-VI-ECD-mFc(SEQ ID号：8)、B7-H4-Ig或mIgG2a同种型对照下，将细胞在存在抗-CD3 mAb/抗-CD28mAb涂布的珠粒的情况下加以培养。建立两个并列培养物组；一种培养物用氚化胸苷在24小时脉冲处理并且在72小时时收获，同时第二板在96小时时收获，用于细胞因子产生。IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-17、IFN-γ以及TNF-α经由LiquiChip来测试。C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)mFc减少了Th1和Th17谱系的应答并且促进Th2谱系应答，如使用鼠T细胞所观察到的。
B-使用在其表面上表达C1ORF32的T细胞刺激细胞来确定C1ORF32对于人CD4+T细胞活化和分化的效果
为了评估C1ORF32分子的功能作用，使用‘T细胞刺激细胞’，这些细胞表达高水平的两种变体C1ORF32((SEQ ID号：3)和(SEQ ID号：5))分子或适当的对照分子。
T细胞刺激细胞是基于鼠胸腺瘤细胞系，Bw5147，这些细胞经过工程化以便表达膜结合的抗人CD3抗体片段。它们可触发人T细胞上的TCR-复合物，从而产生信号1。在这些细胞上表达假定的共刺激或共抑制配体时，可容易地评估其在人T细胞活化过程中的作用。
方法
1.C1ORF32对于人T细胞活化的效果
表达高水平C1ORF32分子的T细胞刺激细胞通过将C1ORF32的cDNA克隆至逆转录病毒载体中来产生。C1ORF32的表达使用特异性抗体或使用在这些分子的下游编码绿色荧光蛋白(GFP)的双顺反子载体来验证。表达活化性共刺激配体(例如CD80、CD58或4-1BBL)或抑制性共刺激分子(例如B7-H3或PD-L2)的控制刺激细胞与不表达活化性以及抑制性人共刺激分子的细胞(空载体和/或GFP T细胞刺激细胞)并行产生。
通过分选(MACS)从获自健康自愿者供体的新鲜血液中纯化原代人T细胞以及T细胞子集(例如CD4或CD8细胞或初始或记忆(抗原经历)T细胞、调控T细胞)以及MNC。
将T细胞活化不同的时间并且分析T细胞增殖(3H-胸苷并入以及CFSE标记，结合FACS分析)以及细胞因子产生。MNC是通过聚焦于IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-13以及IL-17的分泌的基于LUMINEX的多重测定来分析。C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)示出IFN-γ、IL-2以及IL-17分泌的减少。C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)示出IL-4、IL-13以及IL-10的增加，与促进IL-10和Th-2应答一致。
另外，正在研究C1ORF32对于接受外源性细胞因子(例如rhIL-2或IL-15)提供的更强的刺激或共刺激信号(例如在添加不同浓度的刺激性抗-CD28抗体时)的T细胞活化的效果。
2.C1ORF32对于人T细胞分化的效果
在促进朝向Th1、Th2或Th17表型分化的条件下刺激初始人CD4T细胞。使用表达C1ORF32分子的T细胞刺激细胞或控制刺激细胞以便提供信号1来评估C1ORF32分子的效果。所得T辅助细胞的表型通过培养上清液中的细胞因子测量并且通过渗透性T细胞的FACS分析，并且通过经由qPCR来测量谱系特异性转录因子(T-bet、GATA-3以及RORyt-)的表达来评估。表达C1ORF32分子的T细胞刺激细胞诱导Th2相关细胞因子和转录因子并且减少Th1和/或Th17-相关细胞因子和转录因子。
实例12-确定C1ORF32-P8-V1-ECD-MFC(SEQ ID号：8)在CIA中的剂量依赖性方式的疗效下的作用机制
先前已经显示在用100或30μg/小鼠剂量治疗时，C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)减少CIA模型中的疾病症状。在此实例中，所给予的治疗剂量范围得以扩大(10-100微克/小鼠)，并且研究了特别关注关节事件的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)的作用机制。
治疗组(n＝8-10)
1.C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)，100微克/小鼠
2.C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)，30微克/小鼠
3.C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)，10微克/小鼠
4.对照IgG2a，100微克/小鼠
发病后第10天，将一定比例的C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗小鼠放血，并且将腹股沟淋巴结以及患病关节去除。
将来自血液、淋巴结以及关节的细胞在体外刺激以便通过流式细胞术来分析T细胞的细胞内细胞因子表达。
还检查血液、关节以及淋巴结以便确定CD4+以及CD8+调控T细胞的数量(FOXP3表达)。抗胶原抗体水平通过ELISA来测量。
为了理解用C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗期间基因表达的变化，将未用于细胞群分析的关节均质化并且通过qPCR来测量基因表达变化。
淋巴结细胞还在存在或不存在II型胶原的情况下来培养，以便在治疗之后通过ELISA来量化抗原刺激的细胞因子表达的变化。
最近的研究已经显示调控性T细胞在RA中有缺陷并且抗TNF疗法恢复其功能。在进一步评估治疗之后调控细胞的数量(参见以上)后，测定这些调控T细胞的抑制作用。简言之，将分级数量的来自C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗或未治疗的小鼠的FoxP3+细胞与来自免疫小鼠的FoxP3-效应T细胞加上APC一起共培养。然后，将培养物用抗-CD3或胶原刺激并且测量效应细胞的增殖应答。
在用以上描述剂量的至少一种来进行C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗后，疾病症状下降。不局限于单一假设，此效果伴随有骨骼和/或软骨的组织学损伤的减少、以及Th1相关IgG2a抗胶原II抗体的降低中的一个或多个。
实例13-确定C1ORF32-P8-V1-ECD-MFC(SEQ ID号：8)在慢性CIA模型中的长期疗效
在每组8-10只小鼠的组中，从疾病发作时起，用C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)、对照IgG2a或Enbrel在如以前研究中的3种剂量下来治疗C57BL/6小鼠。在第10天，不给予进一步的治疗并且连续监测小鼠20-30天以便确立疾病再次爆发所用的实际时间。这评定C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在慢性CIA模型中的疗效以及其在类风湿性关节炎中的生物效应的持续时间。在此模型中观察到长期疗效。不受单一假设约束，例如通过ELISA所测量，疾病严重度的降低伴随有抗胶原抗体水平的降低。
实例14-C1ORF32-P8-V1-ECD-MFC(SEQ ID号：8)在CIA转移模型中对于耐受性诱导的效果
为了进一步理解C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)对于免疫调控的效果，分析C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在关节炎转移模型中诱导耐受性的能力。
简言之，将来自用C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)或对照Ig2a治疗10天的DBA/1小鼠的关节炎的脾脏和LN细胞去除并且腹膜内(i.p)注射至T-细胞缺陷的C.B-17SCID接受者体内。然后，小鼠接受注射100μgII型胶原(没有CFA)，这是关节炎成功转移所需要的。然后，监测SCID小鼠的关节炎；确定C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗赋予长期疾病保护。进行组织学并且测量抗胶原抗体水平以支持此确定。
实例15-C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在调节NOD小鼠、CD28-KONOD以及B7-2-KONOD中的1型糖尿病中的效果
研究C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在使用NOD小鼠连同两种KO小鼠的1型糖尿病小鼠模型中的效果，这两种KO小鼠是提供自身免疫疾病以及免疫性的CD28非依赖性模型的发展加速糖尿病的CD-28-KO NOD小鼠，以及发展周围神经病变的B7-2KO NOD小鼠。
在疾病发作之前或之后，这些小鼠用C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗以便检查这些化合物对于疾病发病机理的效果，并且证明这种治疗减少疾病发作并且改进发病机理。关于测试化合物的效果，通过检查单独免疫细胞类型(包括Treg、Th细胞以及CD8T细胞、DC以及B细胞)；细胞因子(Th1和Th2、IL-10和TGFb)以及组织学来研究疾病改进机制。为了研究C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗对于胰岛炎的效果，测量血糖水平3次/周，多达25周(Fife(法夫)等人，实验医学杂志(J Exp Med.)200627；203(12)：2737-47)。
作用模式通过单独免疫细胞类型的实验评估来研究：收获胰腺、胰腺LN以及脾脏以便获得Treg、Th细胞以及CD8 T细胞、DC以及B细胞。对于从胰腺、胰腺LN以及脾脏分离的细胞的细胞因子分泌的效果加以分析。对于来自胰脏的多个5-μm切片进行组织学分析，用H&E染色。切片如下对于胰岛炎严重度进行记分：
·近胰岛炎-淋巴细胞包围，但是不浸润胰岛结构；
·中度胰岛炎-如果小于一半的胰岛结构被淋巴细胞浸润；
·严重胰岛炎-如果超过一半的胰岛结构被淋巴细胞浸润。
实例16-C1ORF32-P8-V1-ECD-MFC(SEQ ID号：8)在调节过继转移模型的1型糖尿病中的效果
通过将活化的CD4+CD62L+CD25-BDC2.5T细胞(TCR识别通过与1040-p31一起孵育来活化的胰岛特异性肽1040-p31的转基因细胞)转移至NOD接受者来诱导糖尿病。小鼠用C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)、对照IgG2a或阳性对照来治疗。在转移之后1天治疗开始。转移后10-28天跟踪小鼠的葡萄糖水平(Bour(伯乌尔)-Jordan(乔丹)等人，临床调查杂志(J Clin Invest.)2004；114(7)：979-87以及Fife(法夫)等人，实验医学杂志(J ExpMed.)2006年11月27；203(12)：2737-47)。
研究1：
在转移之前，将BDC2.5T细胞用CFSE标记以便评定这些细胞在脾脏、LN以及胰腺LN中的体内增殖。
研究2：
治疗后七天，提取并且检查不同免疫细胞群的胰腺、脾脏、胰腺LN以及周围淋巴结细胞。此外，通过测试响应p31肽的离体增殖以及细胞因子分泌来测量回忆应答。
两个研究示出明C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc防止或减少疾病发作或其严重度。
实例17-C1ORF32-P8-V1-ECD-MFC(SEQ ID号：8)在MRL/LPR狼疮小鼠模型中的效果
材料和方法
将4周龄的MRL/lpr小鼠用于此实验。环磷酰胺(CTX)是用于患有肾狼疮的患者的弥漫增生性肾小球肾炎的主要药物，Daikh(戴克)和Wofsy(沃夫席)报告在减少肾病以及延长患有晚期肾炎的NZB/NZW Fl狼疮小鼠的存活方面，CTX与CTLA4-Ig的组合治疗比单独任一种药剂更有效(Daikh(戴克)和Wofsy(沃夫席)，免疫学杂志(J.Immunol)，166(5)：2913-6(2001))。在概念验证研究中，测试C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)与CTX在单独亦或组合的情况下进行的治疗。
在蛋白治疗之前3天，从颌下静脉收集血液样品，并且然后在治疗期间以及之后每隔一周通过ELISA进行血浆抗-dsDNA自身抗体分析。肾小球性肾炎通过组织学分析来评估。为此，将小鼠肾脏收获并且固定于10％福尔马林中。将切片经由标准H&E染色来染色。蛋白尿通过使用尿分析试纸测试新鲜的尿样来测量。
C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc在至少改进肾狼疮方面具有有益效果。
实例18-C1ORF32-P8-V1-ECD-MFC(SEQ ID号：8)在炎症性肠病的过继转移小鼠模型中的效果
SCID小鼠通过i.p.注射同系CD45RB高-CD4+T细胞来重构，这些T细胞是单独的或与同系CD45RB低-CD4+亦或CD25+CD4+细胞(每个细胞群为4x105/小鼠)共转移。将用来自正常小鼠的脾脏的同系CD45RB高CD4+T细胞重构的结肠炎SCID小鼠在T细胞转移开始时开始每周两次用C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)或Ig同种型对照或阳性对照i.p.治疗多达8周。每周监测所有小鼠的重量、软便或腹泻，以及直肠脱垂。所有小鼠在T细胞转移之后8周或在其展现.20％原始体重损失时被处死。收集结肠组织以便进行组织学以及细胞学检查(Liu(刘)等人，免疫学杂志(J Immunol.)2001；167(3)：1830-8)。C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc在至少改进炎症性肠病方面具有有益效果。
实例19-C1ORF32-P8-V1-ECD-MFC(SEQ ID号：8)在牛皮癣的小鼠模型中的效果
研究I：建立牛皮癣SCID异种移植模型。
将人牛皮癣斑移植至SCID小鼠上。刮取活检(2.5_2.5cm)获自患有涉及5-10％总皮肤的普通斑块状牛皮癣的患者，这些患者未接受牛皮癣的任何全身治疗或光线疗法历时6个月，并且未接受除润肤剂以外的任何局部用制剂历时6周。活检获自位于大腿或手臂上的活性斑块。将每一片活检划分成约1cm2大小的四个相等部分。每一片移植至单独小鼠。
在全身麻醉下，通过去除完全厚度的皮肤样品，保持覆盖下面的背部肌肉的筋膜上的血管丛完整，而在7至8周龄CB 17 SCID小鼠的背部的剃毛区域上产生约1cm2的移植物床。然后将通过刮取活检获得的部分厚度人类皮肤原位转移至移植物床上。将液体兽医绷带Nexaband(兽医产品实验室(Veterinary Products Laboratories)，亚利桑那州凤凰城(Phoenix，AZ))用于附接人类皮肤至小鼠皮肤并且施加抗生素药膏(枯草杆菌肽)。每周三次用C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)、同种型对照或CTLA4-Ig(阳性对照)腹膜内治疗小鼠4周。
钻取活检(2mm)在研究期的第0天(治疗之前)以及第28天(治疗之后)获得。将活检快速冷冻并且冰冻切片用于组织病理学以及免疫组织化学研究。通过将治疗前和治疗后数据比较来确定治疗功效：(i)表皮突长度用于确定对于表皮厚度的效果并且(ii)淋巴单核细胞浸润水平用于确定对于炎症细胞浸润的效果。(Raychaudhuri(雷查哈里)等人2008，皮肤病学研究杂志(J Invest Dermatol.)；128(8)：1969-76；Boehncke(伯恩克)等人，1999皮肤病学研究档案(Arch Dermatol Res)291：104-6)。
C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc在至少改进牛皮癣方面具有有益效果。
研究II：通过将CD45RBHICD4+T细胞过继转移至SCID小鼠所产生的牛皮癣和结肠炎模型
向免疫功能低下小鼠静脉内(i.v.)注射0.3_106 CD4+CD45RBhi细胞。细胞过继转移后之日，向小鼠腹膜内(i.p.)注射10微克葡萄球菌肠毒素B。将接受小鼠用C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)、同种型对照或CTLA4-Ig(阳性对照)来治疗。每周一次评估小鼠的重量损失以及皮肤病变的存在，历时8周。
获得的结果类似于如上所述的那些结果。
实例20-C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在转移体内延迟型过敏(DTH)测定中的效果
进行此实验以便确定C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗对于T细胞应答以及移植排斥反应的效果。人同种异体移植物接受性与免疫调控相关，其特征为延迟型过敏(DTH)的供体抗原相关联的抑制。‘转移体内’DTH是用于测试可影响使用人类细胞的同种异体移植物接受性的化合物的小鼠模型。此模型可评定供体反应性细胞介导的免疫应答。该应答要求人抗原呈递细胞将破伤风类毒素抗原呈递至被注射至小鼠足垫中的人T细胞。利用延迟型过敏方案的相关性是此反应被视为Th1介导的自身免疫疾病和移植排斥反应的标志。
方法：
动物
6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠购自Harlan Sprague Dawley公司(印第安纳波利斯，印第安纳州(Indianapolis，Indiana))并且在到达四周内使用。
分离人外周血单核细胞(PBMC)
通过静脉穿刺从已知为良好破伤风应答者的正常人类供体来收集血液。将一百毫升全血抽取至CPT Vacutainer管中并且在1800RCF下离心30min。将含有单核细胞以及血小板的棕黄色层分离、清洗三次，并且再悬浮于磷酸盐-缓冲盐水(PBS)并且计数。血小板污染通过在PBS中多次清洗来最小化。允许不超过1∶1比率的血小板与PBMC。将细胞直接注射至小鼠足垫之中。
破伤风类毒素
磷酸铝吸附的破伤风类毒素(TT-Tetguard，BI-Vetmedica公司 密苏里州圣约瑟夫(St.Joseph，MO))在每个注射部位以0.25Lf的浓度来使用(Lf单位是絮凝值，即在与一个国际单位的抗毒素混合时产生最佳絮凝混合物的类毒素的量)。
DTH
将在50微升的总体积下与0.25Lf单位的TT混合的7-10X106个PBMC注射至小鼠的后足垫之中。足垫厚度在注射之前以及注射后24小时，使用刻度盘式测厚仪(Mitutoyo，伊利诺伊州奥罗拉(Aurora，IL))来测量。将注射前厚度从注射后厚度之中减去以便获得脚爪厚度的变化。所有测量结果造成用英寸来表示。
测试C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)化合物
在存在或不存在TT的情况下，向足垫注射PBMC之前2-3小时，将C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)以1.5以及5mg每kg的剂量通过腹膜内给药来给予至小鼠。对于来自四种不同供体的PBMC测试每一种剂量化合物，并且每一种供体在每一次治疗时使用两个小鼠。FK506用作阳性对照并且mIgG2a用作阴性对照。
结果：
治疗导致DTH应答的显著降低，其表现为在将人类PBMC注射至后足垫中之前，在用C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗小鼠时，脚爪肿胀(以Δ脚爪厚度来表示)减少。与用5mg/kg的mIgG2a同种型对照治疗的小鼠比较，在分别用1.5以及5mg/kg C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗时，响应来自4个不同人类供体的PBMC的脚爪肿胀减少平均49％和65％(图21A，单独供体数据示出于图21B和21C中)。用阳性对照FK506治疗时，也观察到显著抑制。如示出，在与PBS给予进行比较的情况下测试时，mIgG2a对于脚爪肿胀不具有任何效果(图21C)。这些结果进一步支持C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在T细胞应答之中的作用以及其治疗自身免疫疾病和移植的临床相关性。
在这些实例中呈现的结果，包括C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)在R-EAE和CIA动物模型中的疗效、抑制T细胞活化、通过将免疫应答从Th1/Th17朝向Th2偏移所提供的免疫调节，以及诱导耐受性扩展的指示，都支持C1ORF32-P8-V1-ECD-mFc(SEQ ID号：8)治疗具有强Th1和Th17组分的自身免疫疾病的潜在治疗优势，这些自身免疫疾病例如多发性硬化、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、牛皮癣以及1型糖尿病或在此描述的任何其他免疫相关病症。
应认识到，出于清晰起见，在单独实施方案的情形之中描述的本发明的不同特征也可在单一实施方案之中以组合形式提供。相反地，为了简便起见，单一实施方案的情形之中描述的本发明的各种特征也可单独地或以任何合适的子组合来提供。本领域技术人员还应认识到本发明不受在上文中具体示出以及描述的限制。实际上，本发明的范围只由以下权利要求书来限定。
序列表
<110> Compugen 公司
<120> 多肽及其作为用于治疗多发性硬化、类风湿性关节炎以及其他自身免疫病症的药物的用途
<130>
<160> 40
<210> 1
<211> 1407
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
ccggcggcgc gatccagccc ccggccccgc ctgcgcggcc ggcccggcgg gcgctgcgcc 60
cagggacgcc cggtgcccgc cgctccgccg ccgcccgctg ccgcggggtg acagcgatcc 120
ttctgttcca gccatttccc actttcctca ctccgtaatt cggctgggaa gttggggaag 180
atggataggg tcttgctgag gtggatttct ctcttctggc taacagccat ggtcgaaggc 240
cttcaggtca cagtgcccga caagaagaag gtggccatgc tcttccagcc cactgtgctt 300
cgctgccact tctcaacatc ctcccatcag cctgcagttg tgcagtggaa gttcaagtcc 360
tactgccagg atcgcatggg agaatccttg ggcatgtcct ctacccgggc ccaatctctc 420
agcaagagaa acctggaatg ggacccctac ttggattgtt tggacagcag gaggactgtt 480
cgagtagtag cttcaaaaca gggctcgact gtcaccctgg gagatttcta caggggcaga 540
gagatcacga ttgttcatga tgcagatctt caaattggaa agcttatgtg gggagacagc 600
ggactctatt actgtattat caccacccca gatgacctgg aggggaaaaa tgagggctca 660
ctgggactgc tggtgttggg caggacaggg ctgcttgctg atctcttgcc cagttttgct 720
gtggagatta tgccagagtg ggtgtttgtt ggcctggtgc tcctgggcgt cttcctcttc 780
ttcgtcctgg tggggatctg ctggtgccag tgctgccctc acagctgctg ctgctatgtc 840
cgctgcccat gctgcccaga ttcctgctgg tgccctcaag cctgtgagta cagtgaccgc 900
tggggagaca gagcgatcga gagaaatgtc tacctctcta cctgacagct gtgtgcgctg 960
ggttcctcct ccacctcctg tcctgccacc cccaagattg gtcattccag actcttctcc 1020
gctgggtgcc cctggcctca gggatgacca ttctcatttg ccttttcacc tacatacacc 1080
tctccacact tcttatccat atctatcact ccatgcattt ggaattctca tggacactat 1140
tgataaaatg gaagggcagg tttggcgtgg tgaggttgtg gtgtaagact gttccctctc 1200
cctggggcat tcaaactaga ggaaaccttc tctggtcgtt cccttcccat gcagagaagt 1260
tcctttttat atgagaagag tgtgcaaact gtggcctttg ggcacccacc cagccacaga 1320
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<210> 2
<211> 1350
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
ccggcggcgc gatccagccc ccggccccgc ctgcgcggcc ggcccggcgg gcgctgcgcc 60
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<210> 3
<211> 639
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Met Asp Arg Val Leu Leu Arg Trp Ile Ser Leu Phe Trp Leu Thr Ala
1 5 10 15
Met Val Glu Gly Leu Gln Val Thr Val Pro Asp Lys Lys Lys Val Ala
20 25 30
Met Leu Phe Gln Pro Thr Val Leu Arg Cys His Phe Ser Thr Ser Ser
35 40 45
His Gln Pro Ala Val Val Gln Trp Lys Phe Lys Ser Tyr Cys Gln Asp
50 55 60
Arg Met Gly Glu Ser Leu Gly Met Ser Ser Thr Arg Ala Gln Ser Leu
65 70 75 80
Ser Lys Arg Asn Leu Glu Trp Asp Pro Tyr Leu Asp Cys Leu Asp Ser
85 90 95
Arg Arg Thr Val Arg Val Val Ala Ser Lys Gln Gly Ser Thr Val Thr
100 105 110
Leu Gly Asp Phe Tyr Arg Gly Arg Glu Ile Thr Ile Val His Asp Ala
115 120 125
Asp Leu Gln Ile Gly Lys Leu Met Trp Gly Asp Ser Gly Leu Tyr Tyr
130 135 140
Cys Ile Ile Thr Thr Pro Asp Asp Leu Glu Gly Lys Asn Glu Asp Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Leu Val Leu Gly Arg Thr Gly Leu Leu Ala Asp Leu Leu
165 170 175
Pro Ser Phe Ala Val Glu Ile Met Pro Glu Trp Val Phe Val Gly Leu
180 185 190
Val Leu Leu Gly Val Phe Leu Phe Phe Val Leu Val Gly Ile Cys Trp
195 200 205
Cys Gln Cys Cys Pro His Ser Cys Cys Cys Tyr Val Arg Cys Pro Cys
210 215 220
Cys Pro Asp Ser Cys Cys Cys Pro Gln Ala Leu Tyr Glu Ala Gly Lys
225 230 235 240
Ala Ala Lys Ala Gly Tyr Pro Pro Ser Val Ser Gly Val Pro Gly Pro
245 250 255
Tyr Ser Ile Pro Ser Val Pro Leu Gly Gly Ala Pro Ser Ser Gly Met
260 265 270
Leu Met Asp Lys Pro His Pro Pro Pro Leu Ala Pro Ser Asp Ser Thr
275 280 285
Gly Gly Ser His Ser Val Arg Lys Gly Tyr Arg Ile Gln Ala Asp Lys
290 295 300
Glu Arg Asp Ser Met Lys Val Leu Tyr Tyr Val Glu Lys Glu Leu Ala
305 310 315 320
Gln Phe Asp Pro Ala Arg Arg Met Arg Gly Arg Tyr Asn Asn Thr Ile
325 330 335
Ser Glu Leu Ser Ser Leu His Glu Glu Asp Ser Asn Phe Arg Gln Ser
340 345 350
Phe His Gln Met Arg Ser Lys Gln Phe Pro Val Ser Gly Asp Leu Glu
355 360 365
Ser Asn Pro Asp Tyr Trp Ser Gly Val Met Gly Gly Ser Ser Gly Ala
370 375 380
Ser Arg Gly Pro Ser Ala Met Glu Tyr Asn Lys Glu Asp Arg Glu Ser
385 390 395 400
Phe Arg His Ser Gln Pro Arg Ser Lys Ser Glu Met Leu Ser Arg Lys
405 410 415
Asn Phe Ala Thr Gly Val Pro Ala Val Ser Met Asp Glu Leu Ala Ala
420 425 430
Phe Ala Asp Ser Tyr Gly Gln Arg Pro Arg Arg Ala Asp Gly Asn Ser
435 440 445
His Glu Ala Arg Gly Gly Ser Arg Phe Glu Arg Ser Glu Ser Arg Ala
450 455 460
His Ser Gly Phe Tyr Gln Asp Asp Ser Leu Glu Glu Tyr Tyr Gly Gln
465 470 475 480
Arg Ser Arg Ser Arg Glu Pro Leu Thr Asp Ala Asp Arg Gly Trp Ala
485 490 495
Phe Ser Pro Ala Arg Arg Arg Pro Ala Glu Asp Ala His Leu Pro Arg
500 505 510
Leu Val Ser Arg Thr Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Asp His Ser Tyr
515 520 525
Leu Gly Ser Ala Arg Glu Arg Gln Ala Arg Pro Glu Gly Ala Ser Arg
530 535 540
Gly Gly Ser Leu Glu Thr Pro Ser Lys Arg Ser Ala Gln Leu Gly Pro
545 550 555 560
Arg Ser Ala Ser Tyr Tyr Ala Trp Ser Pro Pro Gly Thr Tyr Lys Ala
565 570 575
Gly Ser Ser Gln Asp Asp Gln Glu Asp Ala Ser Asp Asp Ala Leu Pro
580 585 590
Pro Tyr Ser Glu Leu Glu Leu Thr Arg Gly Pro Ser Tyr Arg Gly Arg
595 600 605
Asp Leu Pro Tyr His Ser Asn Ser Glu Lys Lys Arg Lys Lys Glu Pro
610 615 620
Ala Lys Lys Thr Asn Asp Phe Pro Thr Arg Met Ser Leu Val Val
625 630 635
<210> 4
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Met Asp Arg Val Leu Leu Arg Trp Ile Ser Leu Phe Trp Leu Thr Ala
1 5 10 15
Met Val Glu Gly Leu Gln Val Thr Val Pro Asp Lys Lys Lys Val Ala
20 25 30
Met Leu Phe Gln Pro Thr Val Leu Arg Cys His Phe Ser Thr Ser Ser
35 40 45
His Gln Pro Ala Val Val Gln Trp Lys Phe Lys Ser Tyr Cys Gln Asp
50 55 60
Arg Met Gly Glu Ser Leu Gly Met Ser Ser Thr Arg Ala Gln Ser Leu
65 70 75 80
Ser Lys Arg Asn Leu Glu Trp Asp Pro Tyr Leu Asp Cys Leu Asp Ser
85 90 95
Arg Arg Thr Val Arg Val Val Ala Ser Lys Gln Gly Ser Thr Val Thr
100 105 110
Leu Gly Asp Phe Tyr Arg Gly Arg Glu Ile Thr Ile Val His Asp Ala
115 120 125
Asp Leu Gln Ile Gly Lys Leu Met Trp Gly Asp Ser Gly Leu Tyr Tyr
130 135 140
Cys Ile Ile Thr Thr Pro Asp Asp Leu Glu Gly Lys Asn Glu Gly Ser
145 150 155 160
Leu Gly Leu Leu Val Leu Gly Arg Thr Gly Leu Leu Ala Asp Leu Leu
165 170 175
Pro Ser Phe Ala Val Glu Ile Met Pro Glu Trp Val Phe Val Gly Leu
180 185 190
Val Leu Leu Gly Val Phe Leu Phe Phe Val Leu Val Gly Ile Cys Trp
195 200 205
Cys Gln Cys Cys Pro His Ser Cys Cys Cys Tyr Val Arg Cys Pro Cys
210 215 220
Cys Pro Asp Ser Cys Trp Cys Pro Gln Ala Cys Glu Tyr Ser Asp Arg
225 230 235 240
Trp Gly Asp Arg Ala Ile Glu Arg Asn Val Tyr Leu Ser Thr
245 250
<210> 5
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Met Asp Arg Val Leu Leu Arg Trp Ile Ser Leu Phe Trp Leu Thr Ala
1 5 10 15
Met Val Glu Gly Leu Gln Val Thr Val Pro Asp Lys Lys Lys Val Ala
20 25 30
Met Leu Phe Gln Pro Thr Val Leu Arg Cys His Phe Ser Thr Ser Ser
35 40 45
His Gln Pro Ala Val Val Gln Trp Lys Phe Lys Ser Tyr Cys Gln Asp
50 55 60
Arg Met Gly Glu Ser Leu Gly Met Ser Ser Thr Arg Ala Gln Ser Leu
65 70 75 80
Ser Lys Arg Asn Leu Glu Trp Asp Pro Tyr Leu Asp Cys Leu Asp Ser
85 90 95
Arg Arg Thr Val Arg Val Val Ala Ser Lys Gln Gly Ser Thr Val Thr
100 105 110
Leu Gly Asp Phe Tyr Arg Gly Arg Glu Ile Thr Ile Val His Asp Ala
115 120 125
Asp Leu Gln Ile Gly Lys Leu Met Trp Gly Asp Ser Gly Leu Tyr Tyr
130 135 140
Cys Ile Ile Thr Thr Pro Asp Asp Leu Glu Gly Lys Asn Glu Asp Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Leu Val Leu Gly Arg Thr Gly Leu Leu Ala Asp Leu Leu
165 170 175
Pro Ser Phe Ala Val Glu Ile Met Pro Glu Trp Val Phe Val Gly Leu
180 185 190
Val Leu Leu Gly Val Phe Leu Phe Phe Val Leu Val Gly Ile Cys Trp
195 200 205
Cys Gln Cys Cys Pro His Ser Cys Cys Cys Tyr Val Arg Cys Pro Cys
210 215 220
Cys Pro Asp Ser Cys Cys Cys Pro Gln Ala Cys Glu Tyr Ser Asp Arg
225 230 235 240
Trp Gly Asp Arg Ala Ile Glu Arg Asn Val Tyr Leu Ser Thr
245 250
<210> 6
<211> 235
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Asp Arg Val Leu Leu Arg Trp Ile Ser Leu Phe Trp Leu Thr Ala
1 5 10 15
Met Val Glu Gly Leu Gln Val Thr Val Pro Asp Lys Lys Lys Val Ala
20 25 30
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35 40 45
His Gln Pro Ala Val Val Gln Trp Lys Phe Lys Ser Tyr Cys Gln Asp
50 55 60
Arg Met Gly Glu Ser Leu Gly Met Ser Ser Thr Arg Ala Gln Ser Leu
65 70 75 80
Ser Lys Arg Asn Leu Glu Trp Asp Pro Tyr Leu Asp Cys Leu Asp Ser
85 90 95
Arg Arg Thr Val Arg Val Val Ala Ser Lys Gln Gly Ser Thr Val Thr
100 105 110
Leu Gly Asp Phe Tyr Arg Gly Arg Glu Ile Thr Ile Val His Asp Ala
115 120 125
Asp Leu Gln Ile Gly Lys Leu Met Trp Gly Asp Ser Gly Leu Tyr Tyr
130 135 140
Cys Ile Ile Thr Thr Pro Asp Asp Leu Glu Gly Lys Asn Glu Gly Ser
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Leu Gly Leu Leu Val Leu Glu Trp Val Phe Val Gly Leu Val Leu Leu
165 170 175
Gly Val Phe Leu Phe Phe Val Leu Val Gly Ile Cys Trp Cys Gln Cys
180 185 190
Cys Pro His Ser Cys Cys Cys Tyr Val Arg Cys Pro Cys Cys Pro Asp
195 200 205
Ser Cys Trp Cys Pro Gln Ala Cys Glu Tyr Ser Asp Arg Trp Gly Asp
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Arg Ala Ile Glu Arg Asn Val Tyr Leu Ser Thr
225 230 235
<210> 7
<211> 1287
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 7
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ggactctatt actgtattat caccacccca gatgacctgg aggggaaaaa tgaggactca 480
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gtggagatta tgggatccga gaacctgtac tttcagggca gcggcgagcc cagaggcccc 600
accatcaagc cctgcccccc ctgcaagtgc ccagccccta acctgctggg cggacccagc 660
gtgttcatct tcccccccaa gatcaaggac gtgctgatga tcagcctgag ccccatcgtg 720
acctgcgtgg tggtggacgt gagcgaggac gaccccgacg tgcagatcag ctggttcgtg 780
aacaacgtgg aggtgcacac cgcccagacc cagacccacc gggaggacta caacagcacc 840
ctgcgggtgg tgtccgccct gcccatccag caccaggact ggatgagcgg caaagaattc 900
aagtgcaagg tgaacaacaa ggacctgcct gcccccatcg agcggaccat cagcaagccc 960
aagggcagcg tgagagcccc ccaggtgtac gtgctgcccc ctcccgagga agagatgacc 1020
aagaaacagg tgaccctgac ctgcatggtg accgacttca tgcccgagga catctacgtg 1080
gagtggacca acaacggcaa gaccgagctg aactacaaga acaccgagcc cgtgctggac 1140
agcgacggca gctacttcat gtatagcaag ctgagagtcg agaagaaaaa ctgggtggag 1200
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agcttcagcc ggacccccgg caagtga 1287
<210> 8
<211> 428
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 8
Met Asp Arg Val Leu Leu Arg Trp Ile Ser Leu Phe Trp Leu Thr Ala
1 5 10 15
Met Val Glu Gly Leu Gln Val Thr Val Pro Asp Lys Lys Lys Val Ala
20 25 30
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35 40 45
His Gln Pro Ala Val Val Gln Trp Lys Phe Lys Ser Tyr Cys Gln Asp
50 55 60
Arg Met Gly Glu Ser Leu Gly Met Ser Ser Thr Arg Ala Gln Ser Leu
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Asp Leu Gln Ile Gly Lys Leu Met Trp Gly Asp Ser Gly Leu Tyr Tyr
130 135 140
Cys Ile Ile Thr Thr Pro Asp Asp Leu Glu Gly Lys Asn Glu Asp Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Leu Val Leu Gly Arg Thr Gly Leu Leu Ala Asp Leu Leu
165 170 175
Pro Ser Phe Ala Val Glu Ile Met Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
180 185 190
Gly Ser Gly Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys
195 200 205
Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe
210 215 220
Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro
275 280 285
Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val
290 295 300
Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro
305 310 315 320
Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu
325 330 335
Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp
340 345 350
Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr
355 360 365
Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
370 375 380
Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu
385 390 395 400
Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His
405 410 415
His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
420 425
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<211> 524
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 9
gtgagtacag tgaccgctgg ggagacagag cgatcgagag aaatgtctac ctctctacct 60
gacagctgtg tgcgctgggt tcctcctcca cctcctgtcc tgccaccccc aagattggtc 120
attccagact cttctccgct gggtgcccct ggcctcaggg atgaccattc tcatttgcct 180
tttcacctac atacacctct ccacacttct tatccatatc tatcactcca tgcatttgga 240
attctcatgg acactattga taaaatggaa gggcaggttt ggcgtggtga ggttgtggtg 300
taagactgtt ccctctccct ggggcattca aactagagga aaccttctct ggtcgttccc 360
ttcccatgca gagaagttcc tttttatatg agaagagtgt gcaaactgtg gcctttgggc 420
acccacccag ccacagattt gttttattta ctcccatgat gacatgggcc acaatagggc 480
ctagttctta tttgaggatt cacaattttt accttactgg ccaa 524
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 10
gcaggacagg gctgcttgct gatctcttgc ccagttttgc tgtggagatt atgccag 57
<210> 11
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 11
agtgggtgtt tgttggcctg gtgctcctgg gcgtcttcct cttcttcgtc ctggtgggga 60
t 61
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 12
ctgctggtgc cagtgctgcc ctcacagctg ctgctgctat gtccgctgcc catgctgccc 60
agattc 66
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 13
ctgctggtgc cctcaagcct 20
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 14
Leu Gln Val Thr Val Pro Asp Lys Lys Lys Val Ala Met Leu Phe Gln
1 5 10 15
Pro Thr Val Leu Arg Cys His Phe Ser Thr Ser Ser His Gln Pro Ala
20 25 30
Val Val Gln Trp Lys Phe Lys Ser Tyr Cys Gln Asp Arg Met Gly Glu
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Ser Leu Gly Met Ser Ser Thr Arg Ala Gln Ser Leu Ser Lys Arg Asn
50 55 60
Leu Glu Trp Asp Pro Tyr Leu Asp Cys Leu Asp Ser Arg Arg Thr Val
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Ser Lys Gln Gly Ser Thr Val Thr Leu Gly Asp Phe
85 90 95
Tyr Arg Gly Arg Glu Ile Thr Ile Val His Asp Ala Asp Leu Gln Ile
100 105 110
Gly Lys Leu Met Trp Gly Asp Ser Gly Leu Tyr Tyr Cys Ile Ile Thr
115 120 125
Thr Pro Asp Asp Leu Glu Gly Lys Asn Glu Gly Ser Leu Gly Leu Leu
130 135 140
Val Leu Gly Arg Thr Gly Leu Leu Ala Asp Leu Leu Pro Ser Phe Ala
145 150 155 160
Val Glu Ile Met Pro Glu
165
<210> 15
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 15
Leu Gln Val Thr Val Pro Asp Lys Lys Lys Val Ala Met Leu Phe Gln
1 5 10 15
Pro Thr Val Leu Arg Cys His Phe Ser Thr Ser Ser His Gln Pro Ala
20 25 30
Val Val Gln Trp Lys Phe Lys Ser Tyr Cys Gln Asp Arg Met Gly Glu
35 40 45
Ser Leu Gly Met Ser Ser Thr Arg Ala Gln Ser Leu Ser Lys Arg Asn
50 55 60
Leu Glu Trp Asp Pro Tyr Leu Asp Cys Leu Asp Ser Arg Arg Thr Val
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Ser Lys Gln Gly Ser Thr Val Thr Leu Gly Asp Phe
85 90 95
Tyr Arg Gly Arg Glu Ile Thr Ile Val His Asp Ala Asp Leu Gln Ile
100 105 110
Gly Lys Leu Met Trp Gly Asp Ser Gly Leu Tyr Tyr Cys Ile Ile Thr
115 120 125
Thr Pro Asp Asp Leu Glu Gly Lys Asn Glu Gly Ser Leu Gly Leu Leu
130 135 140
Val Leu Glu Trp Val
145
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 16
ctagctagcc accatggata gggtcttgct gag 33
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 17
cgcggatccc ataatctcca cagcaaaac 29
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 18
Cys Glu Tyr Ser Asp Arg Trp Gly Asp Arg Ala Ile Glu Arg Asn Val
1 5 10 15
Tyr Leu Ser Thr
20
<210> 19
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 19
Met Asp Arg Val Leu Leu Arg Trp Ile Ser Leu Phe Trp Leu Thr Ala
1 5 10 15
Met Val Glu Gly Leu Gln Val Thr Val Pro Asp Lys Lys Lys Val Ala
20 25 30
Met Leu Phe Gln Pro Thr Val Leu Arg Cys His Phe Ser Thr Ser Ser
35 40 45
His Gln Pro Ala Val Val Gln Trp Lys Phe Lys Ser Tyr Cys Gln Asp
50 55 60
Arg Met Gly Glu Ser Leu Gly Met Ser Ser Thr Arg Ala Gln Ser Leu
65 70 75 80
Ser Lys Arg Asn Leu Glu Trp Asp Pro Tyr Leu Asp Cys Leu Asp Ser
85 90 95
Arg Arg Thr Val Arg Val Val Ala Ser Lys Gln Gly Ser Thr Val Thr
100 105 110
Leu Gly Asp Phe Tyr Arg Gly Arg Glu Ile Thr Ile Val His Asp Ala
115 120 125
Asp Leu Gln Ile Gly Lys Leu Met Trp Gly Asp Ser Gly Leu Tyr Tyr
130 135 140
Cys Ile Ile Thr Thr Pro Asp Asp Leu Glu Gly Lys Asn Glu Asp Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Leu Val Leu Gly Arg Thr Gly Leu Leu Ala Asp Leu Leu
165 170 175
Pro Ser Phe Ala Val Glu Ile Met
180
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 20
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
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Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
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Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
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Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 21
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 22
Met Asp Arg Val Leu Leu Arg Trp Ile Ser Leu Phe Trp Leu Thr Ala
1 5 10 15
Met Val Glu Gly Leu Gln Val Thr Val Pro Asp Lys Lys Lys Val Ala
20 25 30
Met Leu Phe Gln Pro Thr Val Leu Arg Cys His Phe Ser Thr Ser Ser
35 40 45
His Gln Pro Ala Val Val Gln Trp Lys Phe Lys Ser Tyr Cys Gln Asp
50 55 60
Arg Met Gly Glu Ser Leu Gly Met Ser Ser Thr Arg Ala Gln Ser Leu
65 70 75 80
Ser Lys Arg Asn Leu Glu Trp Asp Pro Tyr Leu Asp Cys Leu Asp Ser
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Arg Arg Thr Val Arg Val Val Ala Ser Lys Gln Gly Ser Thr Val Thr
100 105 110
Leu Gly Asp Phe Tyr Arg Gly Arg Glu Ile Thr Ile Val His Asp Ala
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Asp Leu Gln Ile Gly Lys Leu Met Trp Gly Asp Ser Gly Leu Tyr Tyr
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Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
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Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
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Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
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Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
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Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
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Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
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<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 23
Met Asp Arg Val Leu Leu Arg Trp Ile Ser Leu Phe Trp Leu Thr Ala
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Met Val Glu Gly Leu Gln Val Thr Val Pro Asp Lys Lys Lys Val Ala
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Met Leu Phe Gln Pro Thr Val Leu Arg Cys His Phe Ser Thr Ser Ser
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His Gln Pro Ala Val Val Gln Trp Lys Phe Lys Ser Tyr Cys Gln Asp
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Ser Lys Arg Asn Leu Glu Trp Asp Pro Tyr Leu Asp Cys Leu Asp Ser
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Arg Arg Thr Val Arg Val Val Ala Ser Lys Gln Gly Ser Thr Val Thr
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Leu Gly Asp Phe Tyr Arg Gly Arg Glu Ile Thr Ile Val His Asp Ala
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Asp Leu Gln Ile Gly Lys Leu Met Trp Gly Asp Ser Gly Leu Tyr Tyr
130 135 140
Cys Ile Ile Thr Thr Pro Asp Asp Leu Glu Gly Lys Asn Glu Asp Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Leu Val Leu Gly Arg Thr Gly Leu Leu Ala Asp Leu Leu
165 170 175
Pro Ser Phe Ala Val Glu Ile Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
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Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
195 200 205
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
210 215 220
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
225 230 235 240
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
245 250 255
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
260 265 270
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
275 280 285
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
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Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
305 310 315 320
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
325 330 335
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
340 345 350
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
355 360 365
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
370 375 380
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
385 390 395 400
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 24
Gly Ser
1
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 25
Gly Ser Gly Ser
1
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<211> 2
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 26
Ala Ser
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 27
Gly Gly Gly Ser
1
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 28
Met Asp Arg Val Leu Leu Arg Trp Ile Ser Leu Phe Trp Leu Thr Ala
1 5 10 15
Met Val Glu Gly Leu Gln Val Thr Val Pro Asp Lys Lys Lys Val Ala
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Met Leu Phe Gln Pro Thr Val Leu Arg Cys His Phe Ser Thr Ser Ser
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His Gln Pro Ala Val Val Gln Trp Lys Phe Lys Ser Tyr Cys Gln Asp
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Arg Met Gly Glu Ser Leu Gly Met Ser Ser Thr Arg Ala Gln Ser Leu
65 70 75 80
Ser Lys Arg Asn Leu Glu Trp Asp Pro Tyr Leu Asp Cys Leu Asp Ser
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Arg Arg Thr Val Arg Val Val Ala Ser Lys Gln Gly Ser Thr Val Thr
100 105 110
Leu Gly Asp Phe Tyr Arg Gly Arg Glu Ile Thr Ile Val His Asp Ala
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Asp Leu Gln Ile Gly Lys Leu Met Trp Gly Asp Ser Gly Leu Tyr Tyr
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Cys Ile Ile Thr Thr Pro Asp Asp Leu Glu Gly Lys Asn Glu Gly Ser
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Leu Gly Leu Leu Val Leu Glu Trp Val
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<211> 411
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 29
Met Asp Arg Val Leu Leu Arg Trp Ile Ser Leu Phe Trp Leu Thr Ala
1 5 10 15
Met Val Glu Gly Leu Gln Val Thr Val Pro Asp Lys Lys Lys Val Ala
20 25 30
Met Leu Phe Gln Pro Thr Val Leu Arg Cys His Phe Ser Thr Ser Ser
35 40 45
His Gln Pro Ala Val Val Gln Trp Lys Phe Lys Ser Tyr Cys Gln Asp
50 55 60
Arg Met Gly Glu Ser Leu Gly Met Ser Ser Thr Arg Ala Gln Ser Leu
65 70 75 80
Ser Lys Arg Asn Leu Glu Trp Asp Pro Tyr Leu Asp Cys Leu Asp Ser
85 90 95
Arg Arg Thr Val Arg Val Val Ala Ser Lys Gln Gly Ser Thr Val Thr
100 105 110
Leu Gly Asp Phe Tyr Arg Gly Arg Glu Ile Thr Ile Val His Asp Ala
115 120 125
Asp Leu Gln Ile Gly Lys Leu Met Trp Gly Asp Ser Gly Leu Tyr Tyr
130 135 140
Cys Ile Ile Thr Thr Pro Asp Asp Leu Glu Gly Lys Asn Glu Gly Ser
145 150 155 160
Leu Gly Leu Leu Val Leu Gly Arg Thr Gly Leu Leu Ala Asp Leu Leu
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Pro Ser Phe Ala Val Glu Ile Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
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Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
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Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
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Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
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Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
245 250 255
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
260 265 270
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
275 280 285
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
290 295 300
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
305 310 315 320
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
325 330 335
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
340 345 350
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
355 360 365
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
370 375 380
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
385 390 395 400
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
Met Asp Arg Val Leu Leu Arg Trp Ile Ser Leu Phe Trp Leu Thr Ala
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Met Val Glu Gly Leu Gln Val Thr Val Pro Asp Lys Lys Lys Val Ala
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Met Leu Phe Gln Pro Thr Val Leu Arg Cys His Phe Ser Thr Ser Ser
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Asp Leu Gln Ile Gly Lys Leu Met Trp Gly Asp Ser Gly Leu Tyr Tyr
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Cys Ile Ile Thr Thr Pro Asp Asp Leu Glu Gly Lys Asn Glu Asp Ser
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Val Glu Leu Leu Val Leu Glu Trp Val
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<220>
<223> 合成多肽
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Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
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195 200 205
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<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 32
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<220>
<223> 合成多肽
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20 25 30
Met Leu Phe Gln Pro Thr Val Leu Arg Cys His Phe Ser Thr Ser Ser
35 40 45
His Gln Pro Ala Val Val Gln Trp Lys Phe Lys Ser Tyr Cys Gln Asp
50 55 60
Arg Met Gly Glu Ser Leu Gly Met Ser Ser Thr Arg Ala Gln Ser Leu
65 70 75 80
Ser Lys Arg Asn Leu Glu Trp Asp Pro Tyr Leu Asp Cys Leu Asp Ser
85 90 95
Arg Arg Thr Val Arg Val Val Ala Ser Lys Gln Gly Ser Thr Val Thr
100 105 110
Leu Gly Asp Phe Tyr Arg Gly Arg Glu Ile Thr Ile Val His Asp Ala
115 120 125
Asp Leu Gln Ile Gly Lys Leu Met Trp Gly Asp Ser Gly Leu Tyr Tyr
130 135 140
Cys Ile Ile Thr Thr Pro Asp Asp Leu Glu Gly Lys Asn Glu Asp Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Leu Val Leu Glu Trp Val Phe Val Gly Leu Val Leu Leu
165 170 175
Gly Val Phe Leu Phe Phe Val Leu Val Gly Ile Cys Trp Cys Gln Cys
180 185 190
Cys Pro His Ser Cys Cys Cys Tyr Val Arg Cys Pro Cys Cys Pro Asp
195 200 205
Ser Cys Cys Cys Pro Gln Ala Cys Glu Tyr Ser Asp Arg Trp Gly Asp
210 215 220
Arg Ala Ile Glu Arg Asn Val Tyr Leu Ser Thr
225 230 235
<210> 35
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 35
Leu Gln Val Thr Val Pro Asp Lys Lys Lys Val Ala Met Leu Phe Gln
1 5 10 15
Pro Thr Val Leu Arg Cys His Phe Ser Thr Ser Ser His Gln Pro Ala
20 25 30
Val Val Gln Trp Lys Phe Lys Ser Tyr Cys Gln Asp Arg Met Gly Glu
35 40 45
Ser Leu Gly Met Ser Ser Thr Arg Ala Gln Ser Leu Ser Lys Arg Asn
50 55 60
Leu Glu Trp Asp Pro Tyr Leu Asp Cys Leu Asp Ser Arg Arg Thr Val
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Ser Lys Gln Gly Ser Thr Val Thr Leu Gly Asp Phe
85 90 95
Tyr Arg Gly Arg Glu Ile Thr Ile Val His Asp Ala Asp Leu Gln Ile
100 105 110
Gly Lys Leu Met Trp Gly Asp Ser Gly Leu Tyr Tyr Cys Ile Ile Thr
115 120 125
Thr Pro Asp Asp Leu Glu Gly Lys Asn Glu Asp Ser Val Glu Leu Leu
130 135 140
Val Leu Gly Arg Thr Gly Leu Leu Ala Asp Leu Leu Pro Ser Phe Ala
145 150 155 160
Val Glu Ile Met Pro Glu
165
<210> 36
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 36
Leu Gln Val Thr Val Pro Asp Lys Lys Lys Val Ala Met Leu Phe Gln
1 5 10 15
Pro Thr Val Leu Arg Cys His Phe Ser Thr Ser Ser His Gln Pro Ala
20 25 30
Val Val Gln Trp Lys Phe Lys Ser Tyr Cys Gln Asp Arg Met Gly Glu
35 40 45
Ser Leu Gly Met Ser Ser Thr Arg Ala Gln Ser Leu Ser Lys Arg Asn
50 55 60
Leu Glu Trp Asp Pro Tyr Leu Asp Cys Leu Asp Ser Arg Arg Thr Val
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Ser Lys Gln Gly Ser Thr Val Thr Leu Gly Asp Phe
85 90 95
Tyr Arg Gly Arg Glu Ile Thr Ile Val His Asp Ala Asp Leu Gln Ile
100 105 110
Gly Lys Leu Met Trp Gly Asp Ser Gly Leu Tyr Tyr Cys Ile Ile Thr
115 120 125
Thr Pro Asp Asp Leu Glu Gly Lys Asn Glu Asp Ser Val Glu Leu Leu
130 135 140
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 37
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1 5 10 15
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35 40 45
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180
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<212> PRT
<213> 人工
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<223> 合成多肽
<400> 38
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<210> 39
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
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1 5
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成多肽
<400> 40
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10

Claims (10)

1.一种包括能够抑制T细胞活化的可溶性C1ORF32多肽或其片段或变体的分离的多肽用于治疗以下疾病中的一种或多种的用途：良性多发性硬化、复发缓解性多发性硬化、继发性进行性多发性硬化、原发性进行性多发性硬化、进行性复发多发性硬化、慢性进行性多发性硬化、过渡性/进行性多发性硬化、快速恶化性多发性硬化、临床确诊的多发性硬化、又称为马尔堡变种(Marburg′s Variant)的恶性多发性硬化，以及急性多发性硬化，或选自下组的与多发性硬化有关的病状，该组由以下各项组成：德维克氏病(Devic′s disease)，又称为视神经脊髓炎；急性散播性脑脊髓炎、急性脱髓鞘性视神经炎、脱髓鞘横贯性脊髓炎、米勒-费歇尔综合征(Miller-Fisher syndrome)、脑脊髓神经根神经病、急性脱髓鞘多神经病、肿胀性多发性硬化以及Balo同心圆性硬化；或以下疾病中的一种或多种：痛风以及假性痛风、幼年特发性关节炎、幼年类风湿性关节炎、斯提耳氏病(Still′s disease)、强直性脊柱炎、类风湿性脉管炎，或选自下组的与类风湿性关节炎有关的病状，该组由以下各项组成：骨关节炎、肉状瘤病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、脓毒性关节炎、血色病、肝炎、脉管炎、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis)、莱姆氏病(Lyme disease)、家族性地中海热、具有回归热的高免疫球蛋白血症D、TNF受体相关周期性综合征，以及与炎症性肠病相关的肠病性关节炎；或以下疾病中的一种或多种：前葡萄膜炎(或虹膜睫状体炎)、中间葡萄膜炎(扁平部睫状体炎)、后葡萄膜炎(或脉络膜视网膜炎)以及全葡萄膜炎形式；或以下疾病中的一种或多种：克罗恩氏病(Crohn′s disease)、溃疡性结肠炎(UC)、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、贝切特氏病(Behcet′s disease)、未确定的结肠炎；或以下疾病中的一种或多种：非脓疱性牛皮癣，包括寻常性牛皮癣以及牛皮癣性红皮症(红皮性牛皮癣)；脓疱性牛皮癣，包括泛发性脓疱性牛皮癣(宗布什脓疱性牛皮癣(pustular psoriasisof von Zumbusch))、掌跖脓疱病(永久性掌跖脓疱病、理发师类型的脓疱性牛皮癣(pustular psoriasis of the Barber type)、四肢脓疱性牛皮癣)、环状脓疱性牛皮癣、持续性肢端皮炎、疱疹样脓疱病；药物诱导的牛皮癣、皮褶牛皮癣、尿布区牛皮癣、脂溢性皮炎样牛皮癣、滴状牛皮癣、指甲牛皮癣、牛皮癣性关节炎；或以下疾病中的一种或多种：胰岛素依赖性糖尿病、特发性糖尿病、幼年1型糖尿病、青春晚期糖尿病、成人隐匿性自身免疫性糖尿病、妊娠糖尿病；神经病变，包括多神经病变、单神经病变、周围神经病变以及自主神经病变；青光眼、白内障或视网膜病变；或以下疾病中的一种或多种：原发性舍格伦氏综合征(Primary Sjogren′s syndrome)，继发性舍格伦氏综合征(Secondary Sjogren′ssyndrome)，结缔组织疾病，例如类风湿性关节炎，全身性红斑狼疮，硬皮病，肺炎，肺纤维化，间质性肾炎，肾脏过滤器周围组织的炎症，肾小球性肾炎，肾小管性酸中毒，腕管综合征，周围神经病变，颅神经病变，原发性胆汁性肝硬变(PBC)，肝硬化，食道、胃、胰腺以及肝脏(包括肝炎)的炎症，多肌炎，雷诺氏现象(Raynaud′s phenomenon)，脉管炎，自身免疫甲状腺问题，淋巴瘤；以下疾病中的一种或多种：盘状狼疮、狼疮性关节炎、狼疮性肺炎、狼疮性肾炎，或选自下组的与全身性红斑狼疮有关的病状，该组由以下各项组成：骨关节结核、抗磷脂抗体综合征、心脏各个部分的炎症(例如心包炎、心肌炎以及心内膜炎)、肺和胸膜炎症、胸膜炎、胸膜腔积液、慢性弥散性间质性肺病、肺动脉高压、肺栓塞、肺出血，以及肺萎缩综合征、狼疮性头痛、格-巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)、无菌性脑膜炎、脱髓鞘性综合征、单神经病变、多发性单神经炎、重症肌无力、脊髓病变、颅神经病变、多神经病变、脉管炎。
2.根据权利要求1所述的蛋白的用途，其中该C1ORF32多肽直接或间接地经由一个连接物肽、多肽序列或化学连接物融合至一个异源序列。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中该C1ORF32多肽包括C1ORF32的细胞外域、或其片段或变体，或包括H19011_1_P8(SEQ ID 号：4)、H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)、H19011_1_P9(SEQ ID号：6)或H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)的细胞外域的多肽、或其片段或变体或同源物。
4.如权利要求3所述的用途，其中该C1ORF32多肽选自下组，该组由包含与以下氨基酸残基具有至少95％序列一致性的氨基酸残基序列的多肽组成：与在SEQ ID号：14中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的氨基酸残基21-186，或与在SEQ ID号：35中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)的残基21-186，或与在SEQ ID号：15中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9(SEQ ID号：6)的残基21-169，或与在SEQ ID号：36中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)的残基21-169，或与在SEQID号：37中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011_1_P8(SEQ ID号：4)的残基1-184，或与在SEQ ID号：19中描绘的氨基酸序列对应的序列H19011_1_P8_V1(SEQ ID号：5)的残基1-184，或与在SEQ ID号：28中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9(SEQ ID号：6)的残基1-169，或与在SEQ ID号：30中描绘的氨基酸序列对应的H19011_1_P9_V1(SEQ ID号：34)的残基1-169。
5.如权利要求2所述的用途，其中该异源序列包括一个免疫球蛋白恒定域的至少一部分。
6.如权利要求5所述的用途，其中该融合蛋白包括对应于选自下组的抗体同种型的一个免疫球蛋白重链恒定区，该组由以下各项组成：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA以及IgD。
7.如权利要求6所述的用途，其中该免疫球蛋白恒定域包括选自下组的一个人IgG免疫球蛋白的铰链、CH2以及CH3区，该组由以下各项组成：Cγ1、Cγ2、Cγ3以及Cγ4链。
8.如权利要求1至7中任一项所述的用途，其中该融合蛋白进一步包括介导该融合蛋白的二聚化或多聚化以便形成同源二聚体、异源二聚体、同源多聚体或异源多聚体的一个域。
9.如权利要求8所述的用途，其中该介导二聚化或多聚化的域选自下组，该组由以下各项组成：能够与伴侣融合蛋白上的半胱氨酸形成分子间二硫键的一个或多个半胱氨酸、一个卷曲螺旋域、一个酸补片、一个锌指域、一个钙手性域、一个CHI区、一个CL区、一个亮氨酸拉链域、一个SH2(src同源性2)域、一个SH3(src同源性3)域、一个PTB(磷酸酪氨酸结合)域、一个WW域、一个PDZ域、一个14-3-3域、一个WD40域、一个EH域、一个Lim域、一个异亮氨酸拉链域，以及一个受体二聚体对的二聚化域。
10.如权利要求2至9中任一项所述的用途，其中该融合蛋白包括SEQ ID号：8、22、23、38、29中任何一种的多肽。
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