CN114746544A - 用于治疗癌症的、包含含有il-2蛋白和cd80蛋白的融合蛋白与自然杀手细胞的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本文提供有一种抗癌剂，其包含作为活性成分的含有IL‑2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白与自然杀手细胞。在一实施方案中，含有CD80片段、免疫球蛋白Fc结构域及IL‑2变体的融合蛋白能活化免疫细胞如自然杀手细胞。此外，当与自然杀手细胞结合给药时，该融合蛋白能有效地抑制癌症，且含有该融合蛋白的药物组合物能激活体内的免疫活性。因此，所述药物组合物能有效地用于治疗癌症且具有高产业应用性。

Description

用于治疗癌症的、包含含有IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白 与自然杀手细胞的药物组合物
技术领域
本发明涉及一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含作为活性成分的含有CD80蛋白及IL-2变体的融合蛋白与NK细胞。
背景技术
IL-2，亦称作T细胞生长因子(TCGF)，是一种球状糖蛋白，其在淋巴细胞的生成、存活及动态平衡中发挥核心的作用。IL-2蛋白具有15.5kDa至16kDa的大小且由133个氨基酸构成。IL-2通过与具有三个不同次单元法人IL-2受体结合，介导各种免疫作用。此外，IL-2主要是由活化的T细胞合成，特别是由CD4+辅助型T细胞。IL-2会刺激T细胞的增殖与分化，及诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的产生及外周血淋巴细胞分化成细胞毒性细胞与淋巴激素活化杀手细胞(LAK细胞)。
同时，CD80，亦称作B7-1，是膜连型蛋白B7家族的成员，其通过与其配体结合，透过递送共刺激反应及共抑制反应的方式进行免疫调节。CD80是一种表达在T细胞、B细胞、树状细胞及单核球表面上的透膜蛋白。CD80已知会与CD28、CTLA4(CD152)及PD-L1结合。CD80、CD86、CTLA4及CD28涉及共刺激-共抑制系统。例如，其等会调节T细胞的活性且涉及其增殖、分化及存活。
此外，已知自然杀手细胞(然后称NK细胞)会通过移除癌细胞而表现出抗癌活性(Loris Zamai et.al.,J.Immunol.,178:4011-4016,2007)。NK细胞活性的调节是通过各种活化性及抑制性受体传讯的平衡。已知NK细胞还能透过表达在表面上的各种免疫受体来辨别癌细胞以达到抗癌活性。由于正常细胞中存在主要组织兼容性复合体(MHC)第I类，所以正常细胞不会被NK细胞的抑制性受体辨识，从而不会遭受攻击，但癌细胞或一些受感染的细胞因MHC第I类减少或具有NK细胞活化受体的配体而会被NK细胞清除。除了癌细胞外，NK细胞还可消除癌干细胞，因此成为不仅可抑制癌的发展、增殖及转移，且可降低完全康复后癌症复发的备受关注的治疗剂来源。
发明内容
因此，研究开发安全且有效的IL-2的结果，本发明人发现共给药在一分子中含有IL-2蛋白和CD80蛋白的新穎的融合蛋白二聚体与自然杀手细胞的组合，表现出优异的抗癌作用，并完成本发明。
为达成上述目的，根据本发明的一个方面，提供一种抗癌剂，其包含作为活性成分的含有IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白二聚体与自然杀手细胞。
本发明的效果
已确认含有IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白二聚体不仅可活化免疫细胞，且当与自然杀手细胞结合给药时，可表现出协同作用。因此，此组合疗法可用于治疗癌症。
附图说明
图1是本发明中所使用的融合蛋白二聚体的实施方案的示意图。
图2显示确认所获得的融合蛋白二聚体(GI-101)的SDS-PAGE影像。
图3显示所获得的融合蛋白二聚体(GI-101)的粒径筛析色谱法(SEC)的分析。
图4显示确认所获得的Fc-IL2v2融合蛋白的SDS-PAGE影像。
图5显示所获得的Fc-IL2v2融合蛋白的粒径筛析色谱法(SEC)的分析。
图6显示确认所获得的hCD80-Fc融合蛋白的SDS-PAGE影像。
图7显示所获得的hCD80-Fc融合蛋白的粒径筛析色谱法(SEC)的分析。
图8显示在无自然杀手细胞的情况下单独培养K562细胞株(E/T比＝0/1)时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2处理的癌细胞存活力结果。在此情况下，E表示作为效应细胞的NK细胞，T表示作为标靶细胞的K562癌细胞株。
图9显示在无自然杀手细胞的情况下单独培养MDA-MB-231细胞株(E/T比＝0/1)时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2处理的癌细胞存活力结果。在此情况下中，E表示作为效应细胞的NK细胞，T表示作为标靶细胞的MDA-MB-231癌细胞株。
图10显示在无自然杀手细胞的情况下单独培养HCT-116细胞株(E/T比＝0/1)时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2处理的癌细胞存活力结果。在此情况下，E表示作为效应细胞的NK细胞，T表示作为标靶细胞的HCT-116癌细胞株。
图11显示在无自然杀手细胞的情况下单独培养A549细胞株(E/T比＝0/1)时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2处理的癌细胞存活力结果。在此情况下，E表示作为效应细胞的NK细胞，T表示作为标靶细胞的A549癌细胞株。
图12显示在共培养K562细胞株(标靶细胞)与自然杀手细胞(效应细胞)，E/T比＝1/3时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力结果。
在此，Y轴＝0表示在起始接种时癌细胞的存活力讯号(红色讯号)范围设为0。Y轴>0是接种后发现癌细胞存活力讯号范围增加的情况，表示细胞增殖率快于细胞死亡率(细胞增殖率>细胞死亡率)。即，可视为癌细胞数增加。然而，一般认为增加的值越低，则越能抑制癌细胞的增殖。同时，假如测得的存活癌细胞面积小于起始接种时测得的存活癌细胞面积，则表示为负值，其表示细胞增殖率低于细胞死亡率(细胞增殖率<细胞死亡率)。即，与在起始接种时测得的面积相比，面积减少表示为负值。因此，提示负值越大可能不仅与癌细胞增殖的抑制有关，而且与癌细胞死亡有关。
图13显示在共培养K562细胞株与自然杀手细胞(E/T比＝1/1)时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力结果。
图14显示在共培养K562细胞株与自然杀手细胞(E/T比＝3/1)时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力结果。
图15显示在共培养K562细胞株与自然杀手细胞(E/T比＝10/1)时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力结果。
图16显示在共培养MDA-MB231细胞株与自然杀手细胞(E/T比＝1/3)时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力结果。
图17显示在共培养MDA-MB231细胞株与自然杀手细胞(E/T比＝1/1)时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力结果。
图18显示在共培养MDA-MB231细胞株与自然杀手细胞(E/T比＝3/1)时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力结果。
图19显示在共培养MDA-MB231细胞株与自然杀手细胞(E/T比＝10/1)时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力结果。
图20显示在共培养HCT-116细胞株(标靶细胞)与自然杀手细胞(效应细胞)，E/T比＝1/3时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力结果。
图21显示在共培养HCT-116细胞株与自然杀手细胞，E/T比＝1/1时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力结果。
图22显示在共培养HCT-116细胞株与自然杀手细胞，E/T比＝3/1时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力结果。
图23显示在共培养HCT-116细胞株与自然杀手细胞，E/T比＝10/1时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力结果。
图24显示在共培养A549细胞株(标靶细胞)与自然杀手细胞(效应细胞)，E/T比＝1/3时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力结果。
图25显示在共培养A549细胞株与自然杀手细胞，E/T比＝1/1时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力结果。
图26显示在共培养A549细胞株与自然杀手细胞，E/T比＝3/1时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力结果。
图27显示在共培养A549细胞株与自然杀手细胞，E/T比＝10/1时，以GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力结果。
图28是显示对CT26移植癌小鼠模型进行mGI-101和/或NK细胞组合疗法的给药时间表的示意图。
图29显示对CT26移植癌小鼠模型共给药自然杀手细胞与mGI-101的肿瘤生长抑制作用的结果。
图30显示对CT26移植癌小鼠模型共给药自然杀手细胞与mGI-101的肿瘤生长抑制百分比。
图31显示在CT26移植癌小鼠模型中，各治疗组(媒介物、NK细胞、mGI-101、NK细胞+mGI-101)的单个实验动物的肿瘤生长测量值。
图32显示在CT26移植癌小鼠模型中，媒介物组的单个实验动物的肿瘤生长测量值。
图33显示在CT26移植癌小鼠模型中，NK细胞治疗组的单个实验动物的肿瘤生长测量值。
图34显示在CT26移植癌小鼠模型中，mGI-101治疗组的单个实验动物的肿瘤生长测量值。
图35显示在CT26移植癌小鼠模型中，自然杀手细胞与mGI-101共给药组的单个实验动物的肿瘤生长测量值。
具体实施方式
本发明的一个方面提供一种药物组合物，其包含作为活性成分的含有CD80蛋白及IL-2蛋白的融合蛋白与NK细胞。
本发明的另一个方面提供一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含作为活性成分的含有CD80蛋白及IL-2蛋白的融合蛋白与NK细胞。
自然杀手细胞
本文中使用的术语"NK细胞"意指自然杀手细胞(然后称NK细胞)，是先天性免疫细胞的一种，其会直接与各种巨噬细胞及T细胞交互反应或产生细胞因子，调节免疫反应，从而在自体免疫疾病中起重要作用。在本发明中，NK细胞可从脾或骨髓中分离出来，但不限于此。具体地，NK细胞可从自体或异源细胞获得。
此外，NK细胞可源自哺乳动物或人。优选地，其可从预期接受NK细胞治疗的个体获得。在此情况下，可从个体的血液中直接分离出NK细胞，然后使用，或使从个体获得的不成熟NK细胞或干细胞进行分化，然后使用。
此外，该自然杀手细胞可从下列步骤获得，其包括：i)从外周血单核细胞(PBMC)中分离出不会表达CD3的细胞；ii)从以上步骤获得的不会表达CD3的细胞中分离出会表达CD56的细胞；及iii)在含有IL-2或其变体及CD80或其片段的融合蛋白二聚体的存在下培养分离的细胞。
此外，该自然杀手细胞可通过下列步骤获得：i)从PBMCs中分离出不会表达CD3的细胞；及ii)在含有IL-2或其变体及CD80或其片段的融合蛋白二聚体的存在下培养该分离的细胞。
再者，该自然杀手细胞可通过下列步骤获得：i)从PBMCs中分离出不会表达CD56的细胞；及ii)在含有IL-2或其变体及CD80或其片段的融合蛋白二聚体的存在下培养该分离的细胞。
包含IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白二聚体
本文中使用的术语"IL-2"或"白介素-2"，除非有另外说明，否则意指从任何脊椎动物来源，包括哺乳动物，例如灵长类动物(如人)及囓齿动物(如小鼠及大鼠)获得的任何野生型IL-2。IL-2可从动物细胞获得，还包括从能够产生IL-2重组细胞获得的IL-2。此外，IL-2可为野生型IL-2或其变体。
在本说明书中，IL-2或其变体可集体以术语"IL-2蛋白"或"IL-2多肽"表示。IL-2、IL-2蛋白、IL-2多肽及IL-2变体会特异性地结合至例如IL-2受体。此特异性结合可用熟悉本领域普通技术人员已知的方法鉴定。
IL-2的一个实施方案可具有SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在此，IL-2亦可为成熟形式。具体地，成熟IL-2可不含信号序列，且可具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在此，IL-2可在包含野生型IL-2的片段的概念下使用，其中野生型IL-2的N端或C端部分被截短。
此外IL-2的片段可为从具有SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列的蛋白的N端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续的氨基酸的形式。此外，所述IL-2的片段可为从具有SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列的蛋白的C端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续的氨基酸的形式。
本文中使用的术语“IL-2变体”意指全长IL-2或上述IL-2的片段中一部分的氨基酸被取代的形式。即，IL-2变体可具有与野生型IL-2或其片段不同的氨基酸序列。然而，IL-2变体可具有与野生型IL-2相当或相似的活性。在此，"IL-2活性"可意指例如与IL-2受体特异性结合，该特异性结合可用熟悉本领域普通技术人员已知的方法测量。
具体地，IL-2变体可通过取代野生型IL-2中一部分的氨基酸而获得。通过氨基酸取代而获得的IL-2变体的实施方案，可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38个、第42个、第45个、第61个及第72个氨基酸中的至少一个而获得。
具体地，所述IL-2变体可通过以另一氨基酸取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38个、第42个、第45个、第61个及第72个氨基酸中的至少一个而获得。此外，当IL-2为SEQID NO:35的氨基酸序列中N端的一部分被截短的形式时，可以另一氨基酸取代与SEQ IDNO:10的氨基酸序列中互补对应位置处的氨基酸。例如，当IL-2具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列时，其IL-2变体可通过以另一氨基酸取代SEQ ID NO:35氨基酸序列中第58个、第62个、第65个、第81个或第92个氨基酸中的至少一个而获得。此等氨基酸残基分别对应在SEQ IDNO:10的氨基酸序列中的第38个、第42个、第45个、第61个及第72个氨基酸残基。根据一个实施方案，可取代一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸，只要此IL-2变体能保持IL-2活性。根据另一个实施方案，可取代一至五个氨基酸。
在一个实施方案中，IL-2变体可为二个氨基酸被取代的形式。具体地，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个及第42个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个及第45个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个及第61个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第42个及第45个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第42个及第61个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第42个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第45个及第61个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第45个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第61个及第72个氨基酸而获得。
再者，IL-2变体可为三个氨基酸被取代的形式。具体地，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第42个及第45个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第42个及第61个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第42个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第45个及第61个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第45个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第61个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第42个、第45个及第61个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第42个、第45个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第45个、第61个及第72个氨基酸而获得。
此外，IL-2变体可为四个氨基酸被取代的形式。具体地，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第42个、第45个及第61个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第42个、第45个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第45个、第61个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第42个、第61个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第42个、第45个、第61个及第72个氨基酸而获得。
再者，IL-2变体可为五个氨基酸被取代的形式。具体地，所述IL-2变体可通过以另一氨基酸取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第42个、第45个、第61个及第72个氨基酸中的每一个而获得。
在此，通过取代而导入的"另一氨基酸"可为任一个选自于由下列所构成的群组：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、离氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸及缬氨酸。然而，在所述IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第38个氨基酸不能以精氨酸取代、第42个氨基酸不能以苯丙氨酸取代、第45个氨基酸不能以酪氨酸取代、第61个氨基酸不能以谷氨酸取代及第72个氨基酸不能以亮氨酸取代。
在IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第38个氨基酸，精氨酸，可以非精氨酸的氨基酸取代。优选地，在IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ IDNO:10的氨基酸序列中，第38个氨基酸，精氨酸，可以丙氨酸取代(R38A)。
在IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第42个氨基酸，苯丙氨酸，可以非苯丙氨酸的氨基酸取代。优选地，在
IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第42个氨基酸，苯丙氨酸，可以丙氨酸取代(F42A)。
在IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第45个氨基酸，酪氨酸，可以非酪氨酸的氨基酸取代。优选地，在IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ IDNO:10的氨基酸序列中，第45个氨基酸，酪氨酸，可以丙氨酸取代(Y45A)。
在IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第61个氨基酸，谷氨酸，可以非谷氨酸的氨基酸取代。优选地，在IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ IDNO:10的氨基酸序列中，第61个氨基酸，谷氨酸，可以精氨酸取代(E61R)。
在IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第72个氨基酸，亮氨酸，可以非亮氨酸的氨基酸取代。优选地，在IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ IDNO:10的氨基酸序列中，第72个氨基酸，亮氨酸，可以甘氨酸取代(L72G)。
具体地，IL-2变体可通过至少一个选自于由下列所构成的群组的取代而获得：SEQID NO:10的氨基酸序列中的R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G。
具体地，所述IL-2变体可通过在选自于由R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G所构成的群组的位置中的二个、三个、四个或五个位置处的氨基酸取代而获得。
此外，IL-2变体可为二个氨基酸被取代的形式。具体地，IL-2变体可通过R38A及F42A的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A及Y45A的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A及E61R的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A及L72G的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过F42A及Y45A的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过F42A及E61R的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过F42A及L72G的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过E61R及L72G的取代而获得。
此外，IL-2变体可为三个氨基酸被取代的形式。具体地，IL-2变体可通过R38A、F42A及Y45A的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A、F42A及E61R的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A、F42A及L72G的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A、Y45A及E61R的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A、Y45A及L72G的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过F42A、Y45A及E61R的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过F42A、Y45A及L72G的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过F42A、E61R及L72G的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过Y45A、E61R及L72G的取代而获得。
此外，IL-2变体可为四个氨基酸被取代的形式。具体地，IL-2变体可通过R38A、F42A、Y45A及E61R的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A、F42A、Y45A及L72G的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A、F42A、E61R及L72G的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A、Y45A、E61R及L72G的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过F42A、Y45A、E61R及L72G的取代而获得。
此外，IL-2变体可通过R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G的取代而获得。
优选地，所述IL-2变体的实施方案可包含任一个选自于下列SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的取代组合(a)至(d)：
(a)R38A/F42A；
(b)R38A/F42A/Y45A；
(c)R38A/F42A/E61R；或
(d)R38A/F42A/L72G。
在此，当IL-2具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列时，氨基酸取代可出现在与SEQ IDNO:10的氨基酸序列中互补对应位置处。此外，即使IL-2是SEQ ID NO:35的氨基酸序列的片段，氨基酸取代亦可出现在与SEQ ID NO:10的氨基酸序列中互补对应位置处。
具体地，所述IL-2变体可具有SEQ ID NO:6、22、23或24的氨基酸序列。
此外，所述IL-2变体可具有低活体内毒性的特征。在此，该低活体内毒性可能是IL-2与IL-2受体α链(IL-2Rα)结合引起的副作用。已开发出各种可减少因IL-2与IL-2受体α结合所引起的副作用的IL-2变体，且此IL-2变体可为美国专利案第5,229,109号及韩国专利案第1667096号中所揭示的。特别是，本申请案中所述的IL-2变体对IL-2受体α链(IL-2Rα)具有低结合能力，因此具有比野生型IL-2低的活体内毒性。
本文中使用的术语"CD80"，亦称作"B7-1"，是一种存在树状细胞、活化B细胞及单核球中的膜蛋白。CD80提供T细胞的活化及存活必需的共刺激讯息。CD80已知为存在T细胞表面上二种不同的蛋白(即CD28及
CTLA-4)的配体。CD80由288个氨基酸构成，具体地具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列。此外，本文中所使用的术语"CD80蛋白"意指CD80全长或CD80片段。
本文中使用的术语"CD80片段"意指CD80的截短形式。此外，该CD80片段可为CD80的胞外结构域。CD80片段的实施方案可通过删除CD80的N端第1个至第34个氨基酸(其是信号序列)而获得。具体地，CD80片段的实施方案可为由SEQ ID NO:11中第35个至第288个氨基酸构成的蛋白。此外，CD80片段的实施方案可为由SEQ ID NO:11中第35个至第242个氨基酸构成的蛋白。此外，CD80片段的实施方案可为由SEQ ID NO:11中第35个至第232个氨基酸构成的蛋白。此外，CD80片段的实施方案可为由SEQ ID NO:11中第35个至第139个氨基酸构成的蛋白。此外，CD80片段的实施方案可为由SEQ ID NO:11中第142个至第242个氨基酸构成的蛋白。在一实施方案中，CD80片段可具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
此外，所述IL-2蛋白及该CD80蛋白可透过一接头或一携带体(carrier)彼此附接。具体地，所述IL-2或其变体及该CD80(B7-1)或其片段可透过一接头或一携带体彼此附接。在本说明中，该接头及该携带体可交换使用。
该接头会连接二个蛋白。该接头的实施方案可包括1至50个氨基酸、白蛋白或其片段、免疫球蛋白的Fc结构域等等。在此，免疫球蛋白的Fc结构域意指含有免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)及重链恒定区3(CH3)，而不含免疫球蛋白的重及轻链可变区及轻链恒定区1(CH1)的蛋白。该免疫球蛋白可为IgG、IgA、IgE、IgD或IgM，优选地可为IgG4。在此，野生型免疫球蛋白G4的Fc结构域可具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
此外，免疫球蛋白的Fc结构域可为Fc结构域变体及野生型Fc结构域。此外，在本文中使用的术语"Fc结构域变体"可意指在糖基化模式方面与野生型Fc结构域不同的形式，与野生型Fc结构域相比具高糖基化，或与野生型Fc结构域相比具低糖基化，或去糖基化的形式。此外，无糖基化Fc结构域包含于其中。通过宿主的培养条件或基因工程，可使该Fc结构域或其变体适应而具有调整数量的唾液酸、岩藻糖基化或糖基化。
此外，免疫球蛋白的Fc结构域的糖基化可通过常规的方法修饰，如化学方法、酵素方法及使用微生物的遗传工程方法。此外，该Fc结构域变体可为免疫球蛋白、IgG、IgA、IgE、IgD及IgM各别的Fc区的混合形式。此外，该Fc结构域变体可为Fc结构域的一些氨基酸经其它氨基酸取代的形式。Fc结构域变体的实施方案可具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
该融合蛋白可具有使用Fc结构域作为接头(或携带体)的结构，其中CD80蛋白及IL-2蛋白，或IL-2蛋白和CD80蛋白，连接至该融合蛋白的N端及C端(图1)。该Fc结构域的N端或C端与CD-80或IL-2间的连接，可任择地通过一连接肽达成。
具体地，融合蛋白可由下列结构式(I)或(II)构成：
N'-X-[接头(1)]n-Fc结构域-[接头(2)]m-Y-C'(I)
N'-Y-[接头(1)]n-Fc结构域-[接头(2)]m-X-C'(II)
在此，在结构式(I)及(II)中，
N'是该融合蛋白的N端，
C'是该融合蛋白的C端，
X是CD80蛋白，
Y是IL-2蛋白，
该接头(1)及(2)是肽接头，及
n及m各独立地为0或1。
优选地，该融合蛋白可由结构式(I)构成。所述IL-2蛋白如上所述。此外，该CD80蛋白如上所述。根据一个实施方案，所述IL-2蛋白可为与野生型IL-2相比具有一至五个氨基酸取代的IL-2变体。该CD80蛋白可为从野生型CD80的N端或C端截短高达约34个连续的氨基酸残基所获得的片段。或者，该CD80蛋白可为具有与T细胞表面受体CTLA-4及CD28结合的活性的胞外免疫球蛋白样结构域。
具体地，该融合蛋白可具有SEQ ID NO:9、26、28或30的氨基酸序列。根据另一个实施方案，该融合蛋白包括与SEQ ID NO:9、26、28或30的氨基酸序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在此，该一致性是例如同源百分比，且可透过同源性比对软件如National Centerof Biotechnology Information(NCBI)的BlastN软件测定。
该肽接头(1)可包含在该CD80蛋白与该Fc结构域之间。该肽接头(1)可由5至80个连续的氨基酸、20至60个连续的氨基酸、25至50个连续的氨基酸或30至40个连续的氨基酸构成。在一实施方案中，该肽接头(1)可由30个氨基酸构成。此外，该肽接头(1)可包含至少一个半胱氨酸。具体地，该肽接头(1)可含有一个、二个或三个半胱氨酸。此外，该肽接头(1)可源自免疫球蛋白的铰链。在一实施方案中，该肽接头(1)可为由SEQ ID NO:3的氨基酸序列构成的肽接头。
该肽接头(2)可由1至50个连续的氨基酸、3至30个连续的氨基酸或5至15个连续的氨基酸构成。在一实施方案中，该肽接头(2)可为(G4S)n(其中n是1至10的整数)。在此，于(G4S)n中，n可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一实施方案中，该肽接头(2)可为由SEQ IDNO:5的氨基酸序列构成的肽接头。
在本发明的另一方面中，提供有一种药物组合物，其包含作为活性成分的通过结合二个融合蛋白而获得的二聚体，其各含有IL-2蛋白和CD80蛋白，与NK细胞。含有IL-2或其变体及CD80或其片段的融合蛋白如上所述。
在此，构成该二聚体的融合蛋白间的结合，可通过，但不限于，存在该接头中的半胱氨酸形成的双硫键达成。构成该二聚体的融合蛋白可为彼此相同或不同的融合蛋白。优选地，该二聚体可为同型二聚体。构成该二聚体的融合蛋白的实施方案可为具有SEQ IDNO:9的氨基酸序列的蛋白。
在本发明中，该癌症可为任一个选自于由下列所构成的群组：胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰脏癌、子宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性淋巴母细胞白血病、脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾腺癌及淋巴瘤。
所述药物组合物的优选剂量随着患者的病况及体重、疾病严重度、药物形式、给药途径与期间而变，且可由熟悉本领域普通技术人员适当地选择。在用于治疗或预防癌症的本发明的药物组合物中，可依据应用、用途、剂型、掺合目的等等而包含任何数量(有效量)的活性成分，只要该活性成分表现出抗癌活性。其常规有效量以该组合物的重量为基础，判定在0.001重量％至20.0重量％的范围内。在此，术语“有效量”意指活性成分能够引起抗癌作用的数量。此一有效量可在熟悉本领域普通技术人员的常识范围内通过实验判定。
本文中使用的术语“治疗”可用于意指治疗性与预防性治疗。在此，预防性可用于指减轻或缓和个体的病理状态或疾病。在一实施方案中，术语“治疗”包括用于治疗哺乳动物(包括人)的疾病的施用或任何形式的投药。此外，该术语包括抑制或减慢疾病或疾病的进展；及包括复原或修复损伤或丧失的功能，以便部分或完全减轻疾病的意思；刺激低效的治疗；或减轻严重疾病。
本文中所使用的术语“疗效”意指可利用一或多个参数确定的能力，例如在一定时间如一年、五年或十年内的存活率或无病存活率。此外，该参数可包括缩小个体中至少一个肿瘤的大小。
药动学参数如生物可用率及基础参数如清除率亦会影响疗效。因此，“增强疗效”(例如，改善疗效)可以是由于增强药动学参数而改善疗效，其可通过比较实验室动物或人受试者中的清除率及肿瘤生长，或通过比较参数如存活率、复发或无疾病存活率来测量。
本文中所使用的术语"治疗有效量"或"药学有效量"意指有效预防或治疗提到的疾病的化合物或组合物的数量，其足够以适用于医疗的合理的效益/风险比治疗疾病而不会引起副作用。该有效量的位准可依据包括下列的因素决定：患者的健康状况、疾病的种类或严重度、药物活性、患者对药物的敏感性、投药模式、投药时间、投药途径与排泄率、治疗期间、配方或同时使用的药物及医学领域中熟知的其它因素。在一实施方案中，该治疗有效量意指有效治疗癌症的数量。
在此，所述药物组合物可进一步包括一药学上可接受的载剂。该药学上可接受的载剂可为任一载剂，只要该载剂为适合递送至患者的无毒性物质。可包含蒸馏水、酒精、脂肪、蜡及惰性固体作为该载剂。所述药物组合物中亦可包含药学上可接受的佐剂(缓冲液、分散剂)。
具体地，通过包含除活性成分外的药学上可接受的载剂，可依据投药途径，使用本领域惯用的方法，将所述药物组合物制备成肠胃外配方。在此，术语"药学上可接受的"意指该载剂的毒性不超过所施用的(处方的)受试者所能适应的毒性，同时不抑制活性成分的活性。
在将所述药物组合物配制成胃肠外配方时，可根据本领域熟知的方法用适合的载剂将其制成注射剂、穿皮贴片、鼻吸剂或栓剂的形式。在制成注射剂的情况下，可使用无菌水、乙醇、诸如甘油或丙二醇的多元醇或其等的混合物作为适合的载剂；及优选地可使用等张溶液，诸如林格氏溶液、含三乙醇胺或注射用无菌水的磷酸盐缓冲食盐水(PBS)及5％右旋糖等等。药物组合物的配方是本领域已知的，且可具体参考Remington'sPharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)等等。此文件视为本说明书的一部分。
所述药物组合物中二聚体的优选剂量范围可从每日0.01μg/kg至10g/kg或0.01mg/kg至1g/kg，取决于患者的病况、体重、性别、年龄、患者的严重程度、投药途径。该剂量的给药，可一天一次，或可分成一天数次。此一剂量在任何方面不应被解释为本发明的范畴的限制。此外，药物组合物中的NK细胞可以1×102至1×1013细胞、1×107至1.5×1011细胞的数量给药，并在显示药学作用的范围内适当地调整。
所述药物组合物可施用(处方)的受试者为哺乳动物及人，特别适合的是人。除了活性成分外，本申请案的药物组合物可进一步含有任何已经过安全认证且已知具抗癌活性的化合物或天然萃取物，以便增强或加强抗癌活性。
在本发明的又另一方面中，提供一种含有IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白二聚体与NK细胞用于治疗癌症或感染性疾病的用途。
在本发明的又另一方面中，提供一种含有IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白二聚体与NK细胞用于提高对癌症的疗效的用途。
在本发明的又另一方面中，提供一种含有IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白二聚体与NK细胞用于制造用于治疗癌症的药剂的用途。
在本发明的又另一方面中，提供一种用于治疗癌症的方法和/或用于提高对癌症的疗效的方法，其包含对一受试者给药含有IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白，或二个该融合蛋白附接的融合蛋白二聚体，与NK细胞。
在此，该融合蛋白二聚体与该NK细胞可同时或依序给药。在此情况下，给药顺序可决定为在给药该融合蛋白二聚体后接着给药该NK细胞，或在给药该NK细胞后接着给药该融合蛋白二聚体。
该受试者可为罹患癌症或感染性疾病的个体。此外，该受试者可为哺乳动物，优选地人。该含有IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白，或其中二个融合蛋白附接的融合蛋白二聚体如上所述。
给药该融合蛋白或融合蛋白二聚体与NK细胞的投药途径、剂量及频率可依患者的病况，有或无副作用而变化，因此可以各种方法及数量给药该融合蛋白或该融合蛋白二聚体至受试者。最适当的投药方法、剂量及投药频率可由熟悉本领域普通技术人员在适当的范围内选择。此外，该融合蛋白或融合蛋白二聚体可与治疗效果已知和待治疗的疾病有关的其它药物或生理活性物质结合给药，或可与其它药物配制成组合制剂的形式。
由于IL-2活性，本发明实施方案中的融合蛋白可活化免疫细胞，如自然杀手细胞。因此，该融合蛋白可有效地用于癌症与感染性疾病。特别是，经鉴定，与野生型相比，具二至五个氨基酸取代的IL-2变体，特别是在选自于由R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G所构成的群组的位置中的二个、三个、四个或五个位置处含有氨基酸取代的IL-2变体，对IL-2受体α链具低结合能力，因此在习知IL-2的药理副作用方面，展现出改善的特征。因此，此一IL-2变体当单独使用或以融合蛋白的形式使用时，可降低血管(或微血管)渗漏症候群(VLS；一种习知与IL-2相关的问题)的发生率。
实施例
于下文中，将通过下列实施例更详细的说明本发明。然而，下列实施例仅供例示说明本发明，而本发明的范畴不受其限制。
I.含有IL-2及CD80的融合蛋白二聚体的制备
制备实施例1：hCD80-Fc-IL-2变体(2M)：GI101的制备
为了产生含有人CD80片段、Fc结构域及IL-2变体的融合蛋白，通过ThermoFisherScientific Inc.的Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服务合成包含核苷酸序列(SEQID NO:8)的多核苷酸序列，其从N端依序编码含有信号肽(SEQ ID NO:1)、CD80片段(SEQ IDNO:2)、接头结合的Ig铰链(SEQ ID NO:3)、Fc结构域(SEQ ID NO:4)、接头(SEQ ID NO:5)及具有二个氨基酸(R38A，F42A)取代的IL-2变体(2M)(SEQ ID NO:6)的融合蛋白，并克隆进入pcDNA3_4载体中。此外，将该载体导入CHO细胞(EXPI-CHOTM)中，用以表达具有SEQ ID NO:9的融合蛋白。在导入该载体后，将CHO细胞置于37℃、125RPM及8％CO2的环境下培养7天，然后收集以纯化融合蛋白。将纯化的融合蛋白二聚体命名为"GI-101"。
使用含MabSelect SuRe蛋白A树脂的色谱法进行纯化。该融合蛋白在25mM Tris，25mM NaCl及pH 7.4的条件下会被结合。然后，用100mM NaCl及100mM醋酸于pH 3下进行洗提。在将20％的1M Tris-HCl，pH 9放入收集管中后，收集该融合蛋白。将收集的融合蛋白于PBS缓冲液中透析16个小时进行交换。
然后，使用具TSKgel G3000SWXL管柱(TOSOH Bioscience)的粒径筛析色谱法，测量在波长280nm下隨時間推移的吸收度，以获得高浓度的融合蛋白。此时，对该分离纯化的融合蛋白进行还原(R)或非還原(NR)条件下的SDS-PAGE处理且用考马斯蓝(Coomassieblue)染色，确定其纯度(图2)。使用NanoDrop檢測時，确认包括2.78mg/mL浓度的融合蛋白。此外，使用粒径筛析色谱法分析的结果示于图3中。
制备实施例2：Fc-IL-2变体(2M)二聚体：Fc-IL-2v2的制备
为了产生含有Fc结构域与IL-2变体的融合蛋白，通过ThermoFisher ScientificInc.的Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服务合成包含核苷酸序列(SEQ ID NO:45)的多核苷酸序列，其从N端依序编码含有信号肽(SEQ ID NO:1)、Ig铰链(SEQ ID NO:38)、Fc结构域(SEQ ID NO:4)、接头(SEQ ID NO:5)及具有二个氨基酸(R38A，F42A)取代的IL-2变体(2M)(SEQ ID NO:6)的融合蛋白，并克隆进入pcDNA3_4载体中。此外，将该载体导入CHO细胞(EXPI-CHOTM)中，用以表达具有SEQ ID NO:44的融合蛋白。在导入该载体后，将CHO细胞置于37℃、125RPM及8％CO2的环境下培养7天，然后收集以纯化融合蛋白二聚体。将纯化的融合蛋白二聚体命名为"Fc-IL2v2"。
以在制备实施例1中相同的方式進行该融合蛋白的純化及收集。对分离纯化的融合蛋白进行在还原(R)或非还原(NR)条件下的SDS-PAGE处理，且用考马斯蓝染色，确认其纯度(图4)。结果，确认该融合蛋白形成二聚体。此外，使用粒径筛析色谱法分析的结果示于图5中。
制备实施例3：hCD80-Fc二聚体：hCD80-Fc的制备
为了产生含有CD80片段与Fc结构域的融合蛋白，通过ThermoFisher ScientificInc.的Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服务合成包含核苷酸序列(SEQ ID NO:39)的多核苷酸序列，其从N端依序编码含有信号肽(SEQ ID NO:1)、CD80片段(SEQ ID NO:2)、接头结合的Ig铰链(SEQ ID NO:3)及Fc结构域(SEQ ID NO:4)的融合蛋白，并克隆进入pcDNA3_4载体中。此外，将该载体导入CHO细胞(EXPI-CHOTM)中，用以表达具有SEQ ID NO:40的融合蛋白。导入载体后，在37℃、125RPM及8％CO2的环境中进行培养7天，然后收集以纯化融合蛋白二聚体。将纯化的融合蛋白二聚体命名为“hCD80-Fc”。
使用含MabSelect SuRe蛋白A树脂的色谱法进行纯化。该融合蛋白在25mM Tris，25mM NaCl及pH 7.4的条件下会被结合。然后，用100mM NaCl及100mM醋酸于pH 3下进行洗提。在将20％的1M Tris-HCl，pH 9放入收集管中后，收集该融合蛋白。将收集的融合蛋白于PBS缓冲液中透析16个小时进行交换。
然后，使用具TSKgel G3000SWXL管柱(TOSOH Bioscience)的粒径筛析色谱法测量在波长280nm下隨時間推移的吸收度，以获得高浓度的融合蛋白。此时，对该分离纯化的融合蛋白进行还原(R)或非還原(NR)条件下的SDS-PAGE处理且用考马斯蓝染色，确定其纯度(图6)。结果，确认该融合蛋白形成二聚体。此外，使用粒径筛析色谱法分析的结果示于图7中。
制备实施例4：mCD80-Fc-IL-2变体(2M):mGI101的制备
根据制备实施例1中相同的方法，制造含有小鼠来源CD80及IL-2的小鼠型GI-101。具体地，为了产生含有小鼠CD80、Fc结构域及IL-2变体的融合蛋白，通过ThermoFisherScientific Inc.的Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服务合成多核苷酸。该多核苷酸含有核苷酸序列(SEQ ID NO:14)，其从N端依序编码含有信号肽(SEQ ID NO:1)、mCD80(SEQID NO:13)、接头结合的Ig铰链(SEQ ID NO:3)、Fc结构域(SEQ ID NO:4)、接头(SEQ ID NO:5)及具有二个氨基酸(R38A，F42A)取代的IL-2变体(2M)(SEQ ID NO:6)的融合蛋白。将该多核苷酸插入pcDNA3_4载体中。此外，将该载体导入CHO细胞(EXPI-CHOTM)中，用以表达具有SEQ ID NO:47的融合蛋白。在导入该载体后，将CHO细胞置于37℃、125RPM及8％CO2的环境下培养7天。然后收集该培养物并从其中纯化出融合蛋白。将纯化的融合蛋白命名为"mGI101"。
II.NK细胞的制备与培养
制备实施例1：外周血单核细胞(PBMC)来源CD3(-)CD56(+)自然杀手细胞的分离
为了获得CD3(-)细胞，使用ADAM-MC2自动细胞计数器(NanoEnTek，购自CosmoGenetech Co.,Ltd.)测量PBMCs(外周血单核细胞，Zen-Bio.Inc,NC 27709,USA,Cat#:SER-PBMC-200-F)的数量。将PBMCs移到新的试管中，然后在300×g，温度4℃下离心5分钟。在PBS中加入0.5％(v/v)的牛血清白蛋白(BSA)及2mM的EDTA制备MACS缓冲液(pH7.2)。离心完成后，以每1×107细胞80μl的MACs缓冲液及20μl的CD3磁珠(Miltenyi biotech,130-050-101)处理细胞沈淀物使其悬浮，然后在4℃温度下反应15分钟。加入10mL的MACs缓冲液进行清洗并在300×g，温度4℃下离心10分钟，然后将细胞沈淀物重新悬浮于0.5mL的MACs缓冲液中。
先让2mL的MACs缓冲液流进LD管柱(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany,Cat#:130-042-901)，然后接着细胞悬浮液。然后获得通过LD管柱的CD3(-)细胞。此时，使2mL的MACs缓冲液流过三次，获得CD3(-)细胞，如此可充分地分开残留在LD管柱中的细胞。使用细胞计数器计数所获得的CD3(-)细胞，然后将其置于新管中，在300×g，温度4℃下离心5分钟。然后，移除上清液，然后每1×107细胞添加80μl的MACs缓冲液及20μl的CD56磁珠(Miltenyi biotech,Cat#:130-050-401)，接着在温度4℃下反应15分钟。加入10mL的MACs缓冲液进行清洗，在300×g，温度4℃下离心10分钟，然后将细胞沈淀物重新悬浮于0.5mL的MACs缓冲液中。
使3mL的MACs缓冲液先流进LS管柱(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany,Cat#:130-042-901)中，接着细胞悬浮液。此时，使2mL的MACs流进三次，如此可充分地分开残留在LS管柱中的细胞。将LS管柱与磁力架分开后，加入5mL的MACs缓冲液，用活塞加压以获得CD3(-)CD56(+)自然杀手细胞。然后将获得的CD3(-)CD56(+)自然杀手细胞置于新管中，在300×g，温度4℃下离心5分钟。移除上清液后，将细胞悬浮于培养基中，及使用细胞计数器测量悬浮细胞的数量。
制备实施例2：CD3-CD56+自然杀手细胞的培养与获得
将包含在NK细胞活化/扩张试剂盒(Cat#:130-112-968)(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)中的100μl的CD335(NKp46)-生物素及100μl的CD2-生物素置于1.5mL微管中并混合。加入500μl的抗生物素MACSiBead粒子并混合。然后，加入300μl的MACs缓冲液，及使用微管旋转器在2℃至8℃下混合2小时。
然后，将每1x106细胞5μl的NK活化珠转移至新管中。加入1mL的PBS并在300×g下离心5分钟。移除上清液后，根据5μl/106NK细胞，加入添加有5％人AB血清(Cat#:H4522)(Sigma,St.Louis,Missouri,US)的RPMI1640培养基并使珠悬浮，接着接种至在制备实施例1中分离的CD3-CD56+自然杀手细胞中。
接着，将CD3-CD56+自然杀手细胞种在24孔盘中，然后于其中加入具有5％人AB血清(Cat#:H4522)(Sigma,St.Louis,Missouri,US)及rhIL-2(500IU/mL)的RPMI1640培养基，接着在37℃、5％CO2的条件下培养。然后，每2天测定细胞数量，当占培养容器的80％以上(汇合)时，依照12孔盘、6孔盘及25T培养瓶的顺序继代培养，最后在第21天收成所有的细胞。
制备实施例3：小鼠来源自然杀手细胞的培养及收集
制备实施例3.1：小鼠脾细胞及骨髓的制备
为获得小鼠来源自然杀手细胞，首先制备小鼠脾细胞及骨髓。具体地，从6周大雌性Balb/c(ORIENT BIO Inc.)中取出脾与股骨，尽可能的清除脂肪与肌肉，小心不要弄断股骨。将取出的股骨置于70％乙醇中，接着装有5mL PBS的50mL管中，立即将脾转移至装有5mLPBS的50mL试管中，然后储存在冰中。用70μm细胞滤网盖住分别为脾及骨髓制备的装有5mLFACS缓冲液的50mL管。FACS缓冲液A的组成述于以下表1中。
[表1]
Figure BDA0003664673360000201
在用针尖捣碎后，加入5mL FACS缓冲液A以收集细胞。然后，在1,300rpm、4℃下离心5分钟，除去上清液。用3mL ACK溶胞缓冲液将脾溶解，以去除红血球细胞，然后置于冰上培育3分钟。3分钟后，加入FACS缓冲液A，使总积体至20mL。涡旋产物，然后在1,300rpm、4℃下离心5分钟及去除上清液。通过重复以上过程去除红血球，直到沈淀物的颜色转成粉红色，然后用10mL FACS缓冲液A溶解，以计数细胞。
在用于骨髓的70μm细胞滤器上将股骨二侧切开，使用1ml充填10mL FACS缓冲液A的针筒，让FACS缓冲液A流进骨头的洞中。来回移动一会儿，然后在FACS缓冲液A流至切开的组织时，收集细胞。收集细胞，然后于1,300rpm、4℃下离心5分钟。然后，去除上清液，并用10mL FACS缓冲液A溶解，接着计数细胞。
制备实施例3.2：小鼠NK细胞的分离与培养
使用NK细胞分离试剂盒(#130-115-818)，从以上制备实施例3.1的6周大雌性Balb/c(ORIENT BIO Inc.)小鼠中分离出来的脾及骨髓中，分离出NK细胞。分离后，在1,300×g、4℃下进行离心，并去除上清液。
每107细胞添加40μl MACS缓冲液(脾600μl，骨髓200μl)使细胞沈淀物悬浮，及每107细胞添加40μl NK鸡尾酒细胞(脾150μl，骨髓50μl)。然而，在此情况下，超过5×107细胞显示出凝集现象，所以将其等分开并混合。然后，在300×g、4℃下离心，去除上清液。
每107细胞加入2mL清洗缓冲液(脾30mL，骨髓10mL)，清洗，在300×g，4℃下离心并去除上清液。然后，每107细胞加入80μl MACS缓冲液(脾1.2mL，骨髓400μl)，然后每107细胞加入20μl抗生物素微珠(脾300μl，骨髓100μl)，混合，并在冰箱中培养10分钟。
使500μl混合与抗生物素微珠的细胞流进MS管柱，获得通过该管柱的上清液。重复相同的过程，以获得通过该管柱的上清液，然后在300×g，4℃下离心。然后去除上清液。通过重新悬浮于GC-RPMI培养基(1×)中计数细胞(脾：6.95×105/mL存活力59％，骨髓：1.58×106/mL存活力64％)。GC-RPMI培养基的组成述于以下表2中。
[表2]
Figure BDA0003664673360000211
在将3.5×105个从脾及骨髓中分离出来的NK细胞种于60mm培养容器后，用50ng/mL的rmIL-2处理并培养14天。
III.癌细胞的制备及小鼠模型的建构
制备实施例4：人源癌细胞株及其培养基的制备
参考以下表3，使用适合各种癌细胞株的培养溶液。
[表3]
Figure BDA0003664673360000212
具体地，使2×106细胞的癌细胞株重新悬浮于8mL各培养溶液中并于25T培养瓶中培养。回收细胞时，对贴壁型细胞用1mL的胰蛋白酶-EDTA(0.25％)处理，并于5％CO2中反应2分钟。然后，加入5mL培养溶液，以便回收脱离培养瓶的细胞，然后于300×g下离心5分钟。
以下表4显示用于各癌细胞株的具体培养溶液的组成。
[表4]
Figure BDA0003664673360000221
制备实施例5：小鼠来源癌细胞株及其培养基的制备
CT26.WT，一种小鼠结肠癌细胞，购自ATCC(American Type Culture Collection,USA)(表5)。将待用于实验的癌细胞解冻，置于细胞培养瓶中，在37℃，5％CO2培育箱中(MCO-170M，Panasonic,Japan)培养。将细胞株移植那一天培养的细胞置于离心管中并收集，然后在125×g下离心5分钟，去除上清液。然后，加入PBS制备细胞悬浮液(5x107细胞/mL)，等份分配给9只小鼠，并储存在冰上直至给药。
[表5]
来源生物 疾病 制造商 最后浓度
CT26 家鼷鼠，小鼠 结肠癌 ATCC 5×10<sup>5</sup>
将胎牛血清(FBS；16000-044，Thermofisher scientific,USA)、盘尼西林-链霉素(10,000单位/mL盘尼西林及10,000μg/mL链霉素；15140122,Thermofisher scientific,USA)及RPMI1640(A1049101，Thermofisher scientific,USA)混合以获得每100mL具有以下表6中所述的组成，用作癌细胞的培养基。
[表6]
Figure BDA0003664673360000222
Figure BDA0003664673360000231
制备实施例6：癌小鼠模型的制备
制备实施例6.1：实验小鼠的隔离和驯化过程
从ORIENT BIO Inc.购入36只雌性12周大BALB/c小鼠。在用于实验室之前，先将小鼠带至动物实验室驯化5天。接到小鼠时，他们会评估外观及称体重。在5天的驯化期间，每天观察一般症状一次，且在驯化期结束时，测量体重，然后核对一般症状及体重的变化，以评估小鼠的健康状况。异常的小鼠在CO2麻醉下安乐死。
有关实验室小鼠的信息总结并示于以下表7中。
[表7]
來源品種 购自 年龄 性別
小鼠 Balb/c OrientBio 12周大 雌性
制备实施例6.2：癌细胞株的移植
在肿瘤抑制模型方面，在隔离及驯化期结束后隔天测量体重，然后将为健康动物准备的CT26细胞悬浮液(5×105细胞/0.1mL)，装在抛弃式针筒中，皮下给药至小鼠的右背(0.1mL/只)进行移植。在细胞株移植后的植入及生长期间，每天观察一般症状一次。
制备实施例6.3：肿瘤生长抑制小鼠模型的分组
在CT26细胞移植一段时间后，测量没有异常健康状态的小鼠的肿瘤体积及体重，并分成4组(9只/组)，以便各组的平均值达到50mm3。
IV.NK细胞与融合蛋白二聚体的抗癌活性的测定：试管内
实施例1：NK细胞和/或融合蛋白二聚体对各种癌的癌细胞生长抑制作用的测定
参照用于96孔盘的盘设计，分别地将50μl的0.01％聚-L-鸟氨酸溶液(Cat#.P4957)(Sigma Aldrich,US)分配于孔中并进行包被。然后，置于室温下1小时。1小时后，移除该分配的0.01％聚-L-鸟氨酸溶液，并于室温下完全干燥1小时。将2μl的CELLTRACKERTMDeep Red Dye(Cat#C34565)(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)加至以4×105细胞/mL制备的癌细胞(标靶细胞)中，并容许在37℃及5％CO2下反应60分钟。
反应后，在300×g下对反应产物离心5分钟。去除上清液，然后溶于RPMI1640+5％hABS培养溶液中至4×105细胞/mL。分别将50μl制得的癌细胞分配于包被的96孔盘的孔中。然后，将制得的盘置于
Figure BDA0003664673360000243
Live-Cell分析系统(Satorius,Germany)仪器中，然后容许稳定10分钟。参考以下表8，将含测试材料的培养溶液配制于RPMI1640+5％hABS中。
[表8]
测试基质 对照 GI-101 CD80-Fc+Fc-IL2v2
浓度 0nM 100nM CD80-Fc：100nM,Fc-IL2v2:100nM
通过悬浮于RPMI1640+5％hABS培养溶液中至4×105细胞/mL制备自然杀手细胞(效应细胞)。参考以下表9，将于制备实施例1及2中制得的自然杀手细胞加至具有分配癌细胞的各孔中，然后加入100μl用
Figure BDA0003664673360000241
CytoTox(250nM)处理的培养溶液。
[表9]
E/T比 0/1 1/3 1/1 3/1 10/1
NK细胞数目 - 6.7×10<sup>3</sup> 2×10<sup>4</sup> 6×10<sup>4</sup> 2×10<sup>5</sup>
癌细胞数目 2×10<sup>4</sup> 2×10<sup>4</sup> 2×10<sup>4</sup> 2×10<sup>4</sup> 2×10<sup>4</sup>
然后，将其放入
Figure BDA0003664673360000242
Live-Cell分析系统中以30分钟的间隔分析3天。
实施例1.1：在有标靶癌细胞无NK细胞的情况下，单独融合蛋白二聚体的效率的测定
如以上实施例1所述，当在仅有标靶癌细胞无NK细胞的存在下培养各种癌症类型的细胞株(K562、MDA-MB-231、HCT-116及A549细胞株)时，观察到各别的测试材料GI-101及CD80-Fc+Fc-IL2v2没有显着地影响癌细胞的存活力(见表9，E/T比＝0/1)(图8至11)。
实施例1.2：NK细胞及融合蛋白二聚体对K562细胞(淋巴母细胞)的癌细胞增殖抑制作用
确认自然杀手细胞在K562细胞株，一种白血症癌细胞株，上的癌细胞杀伤能力。具体地，分别地确认当共培养作为标靶细胞(T)的K562细胞株与作为效应细胞(E)的自然杀手细胞，E/T比＝1/3、1/1、3/1及10/1时，以测试材料GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2作为组合材料处理的癌细胞存活力。
结果显示，当自然杀手细胞杀伤癌细胞以对抗K562细胞株时，GI-101组合材料(其是IL2-Fc-CD80融合蛋白的形式)的处理，抑制癌细胞的存活力胜过CD80-Fc+Fc-IL2v2处理(图12至15)。
实施例1.3：NK细胞与融合蛋白二聚体对MDA-MB231细胞的癌细胞增殖抑制作用
确认自然杀手细胞在MDA-MB231细胞株，一种乳癌细胞株，中的癌细胞杀伤能力。具体地，分别地确认当共培养作为标靶细胞(T)的MDA-MB231细胞株与作为效应细胞(E)的自然杀手细胞，E/T比＝1/3、1/1、3/1及10/1时，以测试材料GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力。
结果显示当自然杀手细胞杀伤癌细胞以对抗MDA-MB231细胞株时，GI-101组合材料(其是IL2-Fc-CD80融合蛋白的形式)的处理，抑制癌细胞的存活力胜过CD80-Fc+Fc-IL2v2处理(图16至19)。
实施例1.4：NK细胞与融合蛋白二聚体对HCT-116细胞的癌细胞增殖抑制作用
确认自然杀手细胞在HCT-116细胞株(即一种结肠癌细胞株)中的癌细胞杀伤能力。具体地，分别地确认当共培养作为标靶细胞(T)的HCT-116细胞株与作为效应细胞(E)的自然杀手细胞，E/T比＝1/3、1/1、3/1及10/1时，以测试材料GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力。
结果显示当自然杀手细胞杀伤癌细胞以对抗HCT-116细胞株时，GI-101组合材料(其是IL2-Fc-CD80融合蛋白形式)的处理，抑制癌细胞的存活力胜过CD80-Fc+Fc-IL2v2处理(图20至23)。
实施例1.5：NK细胞与融合蛋白二聚体对A549细胞的癌细胞增殖抑制作用
确认自然杀手细胞在A549细胞株(即一种结肠癌细胞株)中的癌细胞杀伤能力。具体地，分别地确认当共培养作为标靶细胞(T)的A549细胞株与作为效应细胞(E)的自然杀手细胞，E/T比＝1/3、1/1、3/1及10/1时，以测试材料GI-101或CD80-Fc+Fc-IL2v2的组合材料处理的癌细胞存活力。
结果显示当自然杀手细胞杀伤癌细胞以对抗A549细胞株时，GI-101组合材料(其是IL2-Fc-CD80融合蛋白形式)的处理，抑制癌细胞的存活力胜过CD80-Fc+Fc-IL2v2处理(图24至27)。
V.NK细胞与融合蛋白二聚体在癌小鼠模型中的癌细胞杀伤能力的测定：活体内
实施例2：mGI-101及NK细胞的给药
通过腹膜内途径对癌小鼠模型给药制备实施例4中获得的mGI-101，通过静脉途径给药制备实施例3中制得的小鼠来源NK细胞。在给药当天(肿瘤移植后第6天、第10天及第13天)使用抛弃式针筒(31G，1mL)进行一次给药，共3次。针对肿瘤生长抑制模型，如以下表10所示，待给药的细胞及给药剂量四组均不同(图28)。
[表10]
Figure BDA0003664673360000261
实施例3：癌小鼠模型的肿瘤体积的测量
使用数字卡尺(mitutoyo,Japan)测量肿瘤的最大长度(L)及垂直宽度(W)一周二次，套用以下方程式1以计算肿瘤体积(TV)。
[方程式1]
TV(mm3)＝W×W×L×0.5
使用以下方程式2计算腫瘤生長抑制百分比：
[方程式2]
肿瘤生长抑制(％)＝(1-(Ti-T0)/(Vi-V0))×100
Ti＝测试组于给药前的肿瘤体积
T0＝测试组于给药后的肿瘤体积
Vi＝对照组于给药前的肿瘤体积
V0＝对照组于给药后的肿瘤体积
给药前各个体的肿瘤体积设定为分组时测量的值。
实施例4：CT26移植癌小鼠模型中肿瘤生长抑制作用的测定
实施例4.1：肿瘤体积的测量
配制准备给健康Balb/c小鼠的CT26结直肠癌细胞悬浮液(5×105细胞/0.1mL)，将制得的溶液装在抛弃式针筒中，皮下给药至小鼠的右背(0.1mL/只)进行移植。在肿瘤移植后，分别给药表10中所示的药物。然后，在第10天、第13天及第17天测量肿瘤尺寸。与对照组(媒介物)相比，单独用自然杀手(NK细胞)或mGI-101治疗的组中，细胞肿瘤生长受到抑制。与对照组(媒介物)相比，用自然杀手(NK细胞)与mGI-101组合治疗的组中，细胞肿瘤生长受到抑制。与单独用自然杀手细胞或mGI-101相比，用自然杀手与mGI-101组合治疗的组中，细胞肿瘤生长受到抑制(图29)。
实施例4.2：肿瘤生长抑制分析
在实验结束(肿瘤移植后，第17天)时，计算相较于药物治疗第1天(肿瘤移植后，第10天)的肿瘤生长抑制率。对照组(媒介物)有3只小鼠具有肿瘤生长抑制30％以上，3只具有肿瘤生长抑制率50％以上及2只具有肿瘤生长抑制率80％。自然杀手细胞治疗组有6只具有肿瘤生长抑制率30％以上，5只具有肿瘤生长抑制率50％以上及2只具有肿瘤生长抑制率80％。mGI-101治疗组有5只具有肿瘤生长抑制率30％以上，5只具有肿瘤生长抑制率50％以上及1只小鼠具有肿瘤生长抑制率80％。自然杀手细胞与mGI-101组合治疗组有7只小鼠具有肿瘤生长抑制率30％以上，6只具有肿瘤生长抑制率50％以上及3只具有肿瘤生长抑制率80％(图30)。在图30中，黑长条表示肿瘤生长抑制率30％以上，浅灰色长条表示肿瘤生长抑制率50％以上及深灰色长条表示肿瘤生长抑制率80％以上。
实施例4.3：单个实验动物的肿瘤体积的测量
测定各治疗组中单个实验动物的肿瘤生长。具体地，测定对照组(媒介物)、自然杀手细胞(NK细胞)、mGI-101及自然杀手细胞+mGI-101治疗组中单个实验动物的肿瘤生长，并示于图31中。在图31中，虚线表示肿瘤尺寸为500mm3，实线表示肿瘤尺寸为250mm3。
更具体地，测定对照组中单个实验动物的肿瘤生长程度并示于图32中，及测定自然杀手细胞治疗组中单个实验动物的肿瘤生长程度并示于图33中。此外，测定mGI-101治疗组中单个实验动物的肿瘤生长程度并示于图34中及测定自然杀手细胞与mGI-101组合治疗组中单个实验动物的肿瘤生长程度并示于图35中。
序列表
<110> 吉爱希公司
<120> 用于治疗癌症的、包含含有IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白与自然杀手细胞的药物组合物
<130> PF-B2649
<140> PCT/KR2020/016949
<141> 2020-11-26
<150> 10-2019-0154631
<151> 2019-11-27
<150> 10-2020-0015802
<151> 2020-02-10
<160> 47
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 信号肽(TPA)
<400> 1
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala
20 25
<210> 2
<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hB7-1:35-242
<400> 2
Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys
1 5 10 15
Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp
20 25 30
Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn
35 40 45
Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn
50 55 60
Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His
85 90 95
Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser
100 105 110
Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu
145 150 155 160
Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr
165 170 175
Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn
180 185 190
Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn
195 200 205
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 带有接头的铰链
<400> 3
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
<210> 4
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 免疫球蛋白fc
<400> 4
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
210 215
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 6
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hIL-2M
<400> 6
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 7
<211> 617
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 包含IL-2和CD80部分的融合蛋白
<400> 7
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Ile His Val Thr Lys Glu
20 25 30
Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu
35 40 45
Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val
50 55 60
Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn
65 70 75 80
Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala
85 90 95
Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr
100 105 110
Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser
115 120 125
Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro
130 135 140
Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile
165 170 175
Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser
180 185 190
Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu
195 200 205
Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr
210 215 220
Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly
245 250 255
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
260 265 270
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg
275 280 285
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
290 295 300
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
305 310 315 320
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
325 330 335
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
340 345 350
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
355 360 365
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
370 375 380
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
385 390 395 400
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
405 410 415
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
420 425 430
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
435 440 445
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala
450 455 460
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly
465 470 475 480
Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
485 490 495
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
500 505 510
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe
515 520 525
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
530 535 540
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
545 550 555 560
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
565 570 575
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
580 585 590
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
595 600 605
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
610 615
<210> 8
<211> 1857
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码融合蛋白的核苷酸(GI101)
<400> 8
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120
tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180
aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240
cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300
gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360
cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420
ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480
gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540
tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600
accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660
aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720
ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780
ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840
aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900
caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960
aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020
gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080
ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag 1140
gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200
ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260
gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320
tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380
ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt 1440
ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat 1500
ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg 1560
accgccatgc tgaccgctaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc 1620
cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag 1680
aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg 1740
aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa 1800
tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac ctgatga 1857
<210> 9
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白 (GI101)
<400> 9
Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys
1 5 10 15
Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp
20 25 30
Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn
35 40 45
Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn
50 55 60
Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His
85 90 95
Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser
100 105 110
Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu
145 150 155 160
Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr
165 170 175
Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn
180 185 190
Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
325 330 335
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser
450 455 460
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
465 470 475 480
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
485 490 495
Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
500 505 510
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
515 520 525
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
545 550 555 560
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
565 570 575
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
580 585 590
<210> 10
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hIL-2
<400> 10
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 11
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD80
<400> 11
Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr
1 5 10 15
Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys
20 25 30
Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu
35 40 45
Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile
50 55 60
Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp
65 70 75 80
Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr
85 90 95
Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly
100 105 110
Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg
115 120 125
Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr
130 135 140
Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile
145 150 155 160
Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu
165 170 175
Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp
180 185 190
Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met
195 200 205
Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg
210 215 220
Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro
225 230 235 240
Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly
245 250 255
Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg
260 265 270
Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val
275 280 285
<210> 12
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 修饰的Fc
<400> 12
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
1 5 10 15
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
20 25 30
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
35 40 45
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
50 55 60
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
65 70 75 80
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
85 90 95
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
100 105 110
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
115 120 125
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
130 135 140
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
145 150 155 160
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
165 170 175
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
180 185 190
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
195 200 205
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210> 13
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> mCD80
<400> 13
Met Ala Cys Asn Cys Gln Leu Met Gln Asp Thr Pro Leu Leu Lys Phe
1 5 10 15
Pro Cys Pro Arg Leu Ile Leu Leu Phe Val Leu Leu Ile Arg Leu Ser
20 25 30
Gln Val Ser Ser Asp Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys Ser Val Lys Asp
35 40 45
Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His Glu Asp Glu Ser
50 55 60
Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val Val Leu Ser Val
65 70 75 80
Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Leu
85 90 95
Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly Leu Val Leu Ser
100 105 110
Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys Glu Arg Gly Thr
115 120 125
Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Ala Asp
130 135 140
Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro Ser Ala Asp Thr
145 150 155 160
Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro Arg Phe
165 170 175
Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile Asn Thr Thr Ile
180 185 190
Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Gln Leu Asp
195 200 205
Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu Ile Lys Tyr Gly
210 215 220
Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys Pro Pro Glu Asp
225 230 235 240
Pro Pro Asp Ser Lys Asn Thr Leu Val Leu Phe Gly Ala Gly Phe Gly
245 250 255
Ala Val Ile Thr Val Val Val Ile Val Val Ile Ile Lys Cys Phe Cys
260 265 270
Lys His Arg Ser Cys Phe Arg Arg Asn Glu Ala Ser Arg Glu Thr Asn
275 280 285
Asn Ser Leu Thr Phe Gly Pro Glu Glu Ala Leu Ala Glu Gln Thr Val
290 295 300
Phe Leu
305
<210> 14
<211> 1848
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码融合蛋白的核苷酸 (mGI101)
<400> 14
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgtgga cgagcagctc tccaagtccg tgaaggataa ggtcctgctg 120
ccttgccggt acaactctcc tcacgaggac gagtctgagg accggatcta ctggcagaaa 180
cacgacaagg tggtgctgtc cgtgatcgcc ggaaagctga aagtgtggcc tgagtacaag 240
aacaggaccc tgtacgacaa caccacctac agcctgatca tcctgggcct cgtgctgagc 300
gatagaggca cctattcttg cgtggtgcag aagaaagagc ggggcaccta cgaagtgaag 360
cacctggctc tggtcaagct gtccatcaag gccgacttca gcacccctaa catcaccgag 420
tctggcaacc cttccgccga caccaagaga atcacctgtt tcgcctctgg cggcttccct 480
aagcctcggt tctcttggct ggaaaacggc agagagctgc ccggcatcaa taccaccatt 540
tctcaggacc cagagtccga gctgtacacc atctccagcc agctcgactt taacaccacc 600
agaaaccaca ccatcaagtg cctgattaag tacggcgacg cccacgtgtc cgaggacttt 660
acttgggaga aacctcctga ggaccctcct gactctggat ctggcggcgg aggttctggc 720
ggaggtggaa gcggaggcgg aggatctgct gagtctaagt atggccctcc ttgtcctcca 780
tgtcctgctc cagaagctgc tggcggaccc tctgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag 840
gaccagctca tgatctctcg gacccctgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcaa 900
gaggaccctg aggtgcagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 960
accaagccta gagaggaaca gttcaactcc acctatagag tggtgtccgt gctgaccgtg 1020
ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg 1080
ccttccagca tcgaaaagac catcagcaag gctaagggcc agcctaggga accccaggtt 1140
tacaccctgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg 1200
gtcaagggct tctacccttc cgacattgcc gtggaatggg agtccaatgg ccagcctgag 1260
aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gactccgacg gctccttctt tctgtactct 1320
cgcctgaccg tggacaagtc taggtggcaa gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgctg 1380
cacgaggctc tgcacaacca ctacacccag aagtccctgt ctctgtctct tggaggtggt 1440
ggcggttctg cccctacctc cagctctacc aagaaaaccc agctccagtt ggagcatctg 1500
ctgctggacc tccagatgat cctgaatggc atcaacaatt acaagaaccc caagctgacc 1560
gccatgctga ccgctaagtt ctacatgccc aagaaggcca ccgagctgaa gcacttgcag 1620
tgcctggaag aggaactgaa gcccctggaa gaagtgctga atctggccca gtccaagaac 1680
ttccacctga ggcctaggga cctgatctcc aacatcaacg tgatcgtgct ggaactgaaa 1740
ggctccgaga caaccttcat gtgcgagtac gccgacgaga cagccaccat cgtggaattt 1800
ctgaaccggt ggatcacctt ctgccagagc atcatctcca cactgacc 1848
<210> 15
<211> 616
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 带有信号肽的融合蛋白 (mGI101)
<400> 15
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys
20 25 30
Ser Val Lys Asp Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His
35 40 45
Glu Asp Glu Ser Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val
50 55 60
Val Leu Ser Val Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys
65 70 75 80
Asn Arg Thr Leu Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly
85 90 95
Leu Val Leu Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys
100 105 110
Glu Arg Gly Thr Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser
115 120 125
Ile Lys Ala Asp Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro
130 135 140
Ser Ala Asp Thr Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro
145 150 155 160
Lys Pro Arg Phe Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile
165 170 175
Asn Thr Thr Ile Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser
180 185 190
Ser Gln Leu Asp Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu
195 200 205
Ile Lys Tyr Gly Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys
210 215 220
Pro Pro Glu Asp Pro Pro Asp Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
245 250 255
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly
465 470 475 480
Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
485 490 495
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
500 505 510
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr
515 520 525
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
530 535 540
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
545 550 555 560
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
565 570 575
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
580 585 590
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
595 600 605
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
610 615
<210> 16
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码融合蛋白的核苷酸 (GI101C1)
<400> 16
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120
tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180
aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240
cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300
gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360
cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420
ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480
gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540
tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600
accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660
aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720
ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780
ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840
aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900
caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960
aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020
gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080
ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag 1140
gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200
ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260
gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320
tctcgcctga ccgtggacaa gtctaggtgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380
ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc cctgggc 1437
<210> 17
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白 (GI101C1)
<400> 17
Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys
1 5 10 15
Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp
20 25 30
Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn
35 40 45
Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn
50 55 60
Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His
85 90 95
Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser
100 105 110
Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu
145 150 155 160
Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr
165 170 175
Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn
180 185 190
Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
325 330 335
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
450
<210> 18
<211> 1176
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码融合蛋白的核苷酸 (GI101C2)
<400> 18
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccatctc acgccgctga gtctaagtac ggccctcctt gtcctccatg tcctgctcca 120
gaagctgctg gcggaccctc tgtgttcctg tttcctccaa agcctaagga ccagctcatg 180
atctctcgga cccctgaagt gacctgcgtg gtggtggatg tgtctcaaga ggaccctgag 240
gtgcagttca attggtacgt ggacggcgtg gaagtgcaca acgccaagac caagcctaga 300
gaggaacagt tcaactccac ctacagagtg gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggat 360
tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag gtgtccaaca agggcctgcc ttccagcatc 420
gaaaagacca tctccaaggc taagggccag cctagggaac cccaggttta caccctgcct 480
ccaagccaag aggaaatgac caagaaccag gtgtccctga cctgcctggt caagggcttc 540
tacccttccg acattgccgt ggaatgggag tccaatggcc agcctgagaa caactacaag 600
accacacctc ctgtgctgga ctccgacggc tccttctttc tgtactctcg cctgaccgtg 660
gacaagtcta ggtggcaaga gggcaacgtg ttctcctgct ctgtgctgca cgaggccctg 720
cacaatcact acacccagaa gtccctgtct ctgtctcttg gcggaggcgg aggatctgct 780
cctacctcca gctccaccaa gaaaacccag ctccagttgg agcatctgct gctggacctc 840
cagatgatcc tgaatggcat caacaattac aagaacccca agctgaccgc catgctgacc 900
gctaagttct acatgcccaa gaaggccacc gagctgaagc acctccagtg cctggaagag 960
gaactgaagc ccctggaaga agtgctgaat ctggcccagt ccaagaactt ccacctgagg 1020
cctagggacc tgatctccaa catcaacgtg atcgtgctgg aactgaaagg ctccgagaca 1080
accttcatgt gcgagtacgc cgacgagaca gccaccatcg tggaatttct gaaccggtgg 1140
atcaccttct gccagtccat catctccaca ctgacc 1176
<210> 19
<211> 367
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白 (GI101C2)
<400> 19
Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
20 25 30
Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
35 40 45
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
50 55 60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
100 105 110
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
115 120 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
130 135 140
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145 150 155 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser
225 230 235 240
Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln
245 250 255
Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala
260 265 270
Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys
275 280 285
His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu
290 295 300
Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
305 310 315 320
Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr
325 330 335
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu
340 345 350
Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
355 360 365
<210> 20
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码融合蛋白的核苷酸 (mGI101C1)
<400> 20
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgtgga cgagcagctc tccaagtccg tgaaggataa ggtcctgctg 120
ccttgccggt acaactctcc tcacgaggac gagtctgagg accggatcta ctggcagaaa 180
cacgacaagg tggtgctgtc cgtgatcgcc ggaaagctga aagtgtggcc tgagtacaag 240
aacaggaccc tgtacgacaa caccacctac agcctgatca tcctgggcct cgtgctgagc 300
gatagaggca cctattcttg cgtggtgcag aagaaagagc ggggcaccta cgaagtgaag 360
cacctggctc tggtcaagct gtccatcaag gccgacttca gcacccctaa catcaccgag 420
tctggcaacc cttccgccga caccaagaga atcacctgtt tcgcctctgg cggcttccct 480
aagcctcggt tctcttggct ggaaaacggc agagagctgc ccggcatcaa taccaccatt 540
tctcaggacc cagagtccga gctgtacacc atctccagcc agctcgactt taacaccacc 600
agaaaccaca ccatcaagtg cctgattaag tacggcgacg cccacgtgtc cgaggacttt 660
acttgggaga aacctcctga ggaccctcct gactctggat ctggcggcgg aggttctggc 720
ggaggtggaa gcggaggcgg aggatctgct gagtctaagt atggccctcc ttgtcctcca 780
tgtcctgctc cagaagctgc tggcggaccc tctgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag 840
gaccagctca tgatctctcg gacccctgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcaa 900
gaggaccctg aggtgcagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 960
accaagccta gagaggaaca gttcaactcc acctatagag tggtgtccgt gctgaccgtg 1020
ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg 1080
ccttccagca tcgaaaagac catcagcaag gctaagggcc agcctaggga accccaggtt 1140
tacaccctgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg 1200
gtcaagggct tctacccttc cgacattgcc gtggaatggg agtccaatgg ccagcctgag 1260
aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gactccgacg gctccttctt tctgtactct 1320
cgcctgaccg tggacaagtc taggtggcaa gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgctg 1380
cacgaggctc tgcacaacca ctacacccag aagtccctgt ctctgtccct gggc 1434
<210> 21
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白 (mGI101C1)
<400> 21
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys
20 25 30
Ser Val Lys Asp Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His
35 40 45
Glu Asp Glu Ser Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val
50 55 60
Val Leu Ser Val Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys
65 70 75 80
Asn Arg Thr Leu Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly
85 90 95
Leu Val Leu Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys
100 105 110
Glu Arg Gly Thr Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser
115 120 125
Ile Lys Ala Asp Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro
130 135 140
Ser Ala Asp Thr Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro
145 150 155 160
Lys Pro Arg Phe Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile
165 170 175
Asn Thr Thr Ile Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser
180 185 190
Ser Gln Leu Asp Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu
195 200 205
Ile Lys Tyr Gly Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys
210 215 220
Pro Pro Glu Asp Pro Pro Asp Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
245 250 255
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
465 470 475
<210> 22
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL-2变体 (3M, M45)
<400> 22
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 23
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL-2的变体 (3M, M61)
<400> 23
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 24
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL-2的变体 (3M, M72)
<400> 24
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 25
<211> 1851
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码融合蛋白的核苷酸 (GI102-M45)
<400> 25
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120
tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180
aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240
cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300
gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360
cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420
ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480
gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540
tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600
accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660
aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720
ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780
ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840
aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900
caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960
aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020
gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080
ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag 1140
gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200
ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260
gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320
tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380
ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt 1440
ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat 1500
ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg 1560
accgccatgc tgaccgctaa gttcgccatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc 1620
cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag 1680
aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg 1740
aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa 1800
tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac c 1851
<210> 26
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白 (GI102-M45)
<400> 26
Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys
1 5 10 15
Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp
20 25 30
Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn
35 40 45
Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn
50 55 60
Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His
85 90 95
Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser
100 105 110
Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu
145 150 155 160
Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr
165 170 175
Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn
180 185 190
Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
325 330 335
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser
450 455 460
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
465 470 475 480
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
485 490 495
Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
500 505 510
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
515 520 525
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
545 550 555 560
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
565 570 575
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
580 585 590
<210> 27
<211> 1851
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码融合蛋白的核苷酸(GI102-M61)
<400> 27
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120
tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180
aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240
cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300
gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360
cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420
ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480
gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540
tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600
accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660
aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720
ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780
ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840
aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900
caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960
aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020
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gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200
ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260
gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320
tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380
ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt 1440
ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat 1500
ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg 1560
accgccatgc tgaccgctaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc 1620
cagtgcctgg aaagggaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag 1680
aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg 1740
aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa 1800
tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac c 1851
<210> 28
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白 (GI102-M61)
<400> 28
Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys
1 5 10 15
Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp
20 25 30
Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn
35 40 45
Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn
50 55 60
Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His
85 90 95
Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser
100 105 110
Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu
145 150 155 160
Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr
165 170 175
Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn
180 185 190
Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
325 330 335
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser
450 455 460
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
465 470 475 480
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
485 490 495
Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
500 505 510
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
515 520 525
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
545 550 555 560
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
565 570 575
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
580 585 590
<210> 29
<211> 1857
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码融合蛋白的核苷酸(GI102-M72)
<400> 29
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120
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gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360
cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420
ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480
gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540
tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600
accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660
aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720
ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780
ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840
aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900
caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960
aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020
gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080
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ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260
gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320
tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380
ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt 1440
ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat 1500
ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg 1560
accgccatgc tgaccgctaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc 1620
cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatggggc ccagtccaag 1680
aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg 1740
aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa 1800
tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac ctgatga 1857
<210> 30
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白 (GI102-M72)
<400> 30
Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys
1 5 10 15
Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp
20 25 30
Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn
35 40 45
Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn
50 55 60
Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His
85 90 95
Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser
100 105 110
Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu
145 150 155 160
Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr
165 170 175
Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn
180 185 190
Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
325 330 335
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser
450 455 460
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
465 470 475 480
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
485 490 495
Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
500 505 510
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
515 520 525
Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
545 550 555 560
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
565 570 575
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
580 585 590
<210> 31
<211> 1851
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码融合蛋白的核苷酸(GI101w)
<400> 31
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120
tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180
aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240
cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300
gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360
cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420
ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480
gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540
tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600
accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660
aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720
ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780
ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840
aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900
caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960
aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020
gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080
ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag 1140
gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200
ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260
gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320
tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380
ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt 1440
ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat 1500
ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg 1560
acccgcatgc tgacctttaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc 1620
cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag 1680
aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg 1740
aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa 1800
tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac c 1851
<210> 32
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白 (GI101w)
<400> 32
Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys
1 5 10 15
Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp
20 25 30
Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn
35 40 45
Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn
50 55 60
Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His
85 90 95
Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser
100 105 110
Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu
145 150 155 160
Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr
165 170 175
Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn
180 185 190
Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
325 330 335
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser
450 455 460
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
465 470 475 480
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
485 490 495
Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
500 505 510
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
515 520 525
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
545 550 555 560
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
565 570 575
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
580 585 590
<210> 33
<211> 1848
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码融合蛋白的核苷酸(mGI102-M61)
<400> 33
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgtgga cgagcagctc tccaagtccg tgaaggataa ggtcctgctg 120
ccttgccggt acaactctcc tcacgaggac gagtctgagg accggatcta ctggcagaaa 180
cacgacaagg tggtgctgtc cgtgatcgcc ggaaagctga aagtgtggcc tgagtacaag 240
aacaggaccc tgtacgacaa caccacctac agcctgatca tcctgggcct cgtgctgagc 300
gatagaggca cctattcttg cgtggtgcag aagaaagagc ggggcaccta cgaagtgaag 360
cacctggctc tggtcaagct gtccatcaag gccgacttca gcacccctaa catcaccgag 420
tctggcaacc cttccgccga caccaagaga atcacctgtt tcgcctctgg cggcttccct 480
aagcctcggt tctcttggct ggaaaacggc agagagctgc ccggcatcaa taccaccatt 540
tctcaggacc cagagtccga gctgtacacc atctccagcc agctcgactt taacaccacc 600
agaaaccaca ccatcaagtg cctgattaag tacggcgacg cccacgtgtc cgaggacttt 660
acttgggaga aacctcctga ggaccctcct gactctggat ctggcggcgg aggttctggc 720
ggaggtggaa gcggaggcgg aggatctgct gagtctaagt atggccctcc ttgtcctcca 780
tgtcctgctc cagaagctgc tggcggaccc tctgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag 840
gaccagctca tgatctctcg gacccctgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcaa 900
gaggaccctg aggtgcagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 960
accaagccta gagaggaaca gttcaactcc acctatagag tggtgtccgt gctgaccgtg 1020
ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg 1080
ccttccagca tcgaaaagac catcagcaag gctaagggcc agcctaggga accccaggtt 1140
tacaccctgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg 1200
gtcaagggct tctacccttc cgacattgcc gtggaatggg agtccaatgg ccagcctgag 1260
aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gactccgacg gctccttctt tctgtactct 1320
cgcctgaccg tggacaagtc taggtggcaa gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgctg 1380
cacgaggctc tgcacaacca ctacacccag aagtccctgt ctctgtctct tggaggtggt 1440
ggcggttctg cccctacctc cagctctacc aagaaaaccc agctccagtt ggagcatctg 1500
ctgctggacc tccagatgat cctgaatggc atcaacaatt acaagaaccc caagctgacc 1560
gccatgctga ccgctaagtt ctacatgccc aagaaggcca ccgagctgaa gcacttgcag 1620
tgcctggaaa gggaactgaa gcccctggaa gaagtgctga atctggccca gtccaagaac 1680
ttccacctga ggcctaggga cctgatctcc aacatcaacg tgatcgtgct ggaactgaaa 1740
ggctccgaga caaccttcat gtgcgagtac gccgacgaga cagccaccat cgtggaattt 1800
ctgaaccggt ggatcacctt ctgccagagc atcatctcca cactgacc 1848
<210> 34
<211> 616
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白 (mGI102-M61)
<400> 34
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys
20 25 30
Ser Val Lys Asp Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His
35 40 45
Glu Asp Glu Ser Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val
50 55 60
Val Leu Ser Val Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys
65 70 75 80
Asn Arg Thr Leu Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly
85 90 95
Leu Val Leu Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys
100 105 110
Glu Arg Gly Thr Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser
115 120 125
Ile Lys Ala Asp Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro
130 135 140
Ser Ala Asp Thr Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro
145 150 155 160
Lys Pro Arg Phe Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile
165 170 175
Asn Thr Thr Ile Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser
180 185 190
Ser Gln Leu Asp Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu
195 200 205
Ile Lys Tyr Gly Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys
210 215 220
Pro Pro Glu Asp Pro Pro Asp Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
245 250 255
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly
465 470 475 480
Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
485 490 495
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
500 505 510
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr
515 520 525
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg
530 535 540
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
545 550 555 560
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
565 570 575
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
580 585 590
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
595 600 605
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
610 615
<210> 35
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 野生型hIL-2
<400> 35
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 36
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 带有信号序列的IL-2
<400> 36
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr
20 25 30
Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met
35 40 45
Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met
50 55 60
Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His
65 70 75 80
Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn
85 90 95
Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser
100 105 110
Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe
115 120 125
Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn
130 135 140
Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150 155
<210> 37
<211> 474
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码带有信号序列的IL-2的核苷酸序列
<400> 37
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgcccc taccagctcc tctaccaaga aaacccagct ccagttggag 120
catctgctgc tggacctcca gatgattctg aacgggatca acaactataa gaaccccaag 180
ctgacccgca tgctgacctt taagttctac atgcccaaga aggccaccga gctgaagcac 240
ctccagtgcc tggaagaaga actgaagccc ctggaagagg tgctgaatct ggcccagtcc 300
aagaacttcc acctgaggcc acgggacctg atcagcaaca tcaacgtgat cgtgctggaa 360
ctgaagggct ccgagacaac ctttatgtgc gagtacgccg acgagacagc caccatcgtg 420
gaatttctga accggtggat caccttctgc cagagcatca tctccacact gacc 474
<210> 38
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 铰链
<400> 38
Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 39
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码CD80-Fc蛋白的核苷酸
<400> 39
ggatccgcca ccatggatgc tatgctgaga ggcctgtgtt gcgtgctgct gctgtgtggc 60
gctgtgttcg tgtctccttc tcacgctgtg atccacgtga ccaaagaagt gaaagaggtc 120
gccacactgt cctgcggcca caacgtttca gtggaagaac tggcccagac caggatctac 180
tggcagaaag aaaagaaaat ggtgctgacc atgatgtccg gcgacatgaa catctggcct 240
gagtacaaga accggaccat cttcgacatc accaacaacc tgtccatcgt gattctggcc 300
ctgaggcctt ctgatgaggg cacctatgag tgcgtggtgc tgaagtacga gaaggacgcc 360
ttcaagcgcg agcacctggc tgaagtgaca ctgtccgtga aggccgactt tcccacacct 420
tccatctccg acttcgagat ccctacctcc aacatccggc ggatcatctg ttctacctct 480
ggcggctttc ctgagcctca cctgtcttgg ctggaaaacg gcgaggaact gaacgccatc 540
aacaccaccg tgtctcagga ccccgaaacc gagctgtacg ctgtgtcctc caagctggac 600
ttcaacatga ccaccaacca cagcttcatg tgcctgatta agtacggcca cctgagagtg 660
aaccagacct tcaactggaa caccaccaag caagagcact tccctgacaa tggatctggc 720
ggcggaggtt ctggcggagg tggaagcgga ggcggaggat ctgctgagtc taagtatggc 780
cctccttgtc ctccatgtcc tgctccagaa gctgctggcg gaccctctgt gttcctgttt 840
cctccaaagc ctaaggacca gctcatgatc tctcggacac ccgaagtgac ctgcgtggtg 900
gtggatgtgt ctcaagagga ccctgaggtg cagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa 960
gtgcacaacg ccaagaccaa gcctagagag gaacagttca actccaccta cagagtggtg 1020
tccgtgctga ccgtgctgca ccaggattgg ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg 1080
tccaacaagg gcctgccttc cagcatcgaa aagaccatct ccaaggctaa gggccagcct 1140
agggaacccc aggtttacac cctgcctcca agccaagagg aaatgaccaa gaaccaggtg 1200
tccctgacct gcctggtcaa gggcttctac ccttccgaca ttgccgtgga atgggagtcc 1260
aatggccagc ctgagaacaa ctacaagacc acacctcctg tgctggactc cgacggctcc 1320
ttctttctgt actctcgcct gaccgtggac aagtctaggt ggcaagaggg caacgtgttc 1380
tcctgctctg tgctgcacga ggccctgcac aatcactaca cccagaagtc cctgtctctg 1440
tccctgggct gatgactcga g 1461
<210> 40
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD80-Fc蛋白
<400> 40
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Ile His Val Thr Lys Glu
20 25 30
Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu
35 40 45
Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val
50 55 60
Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn
65 70 75 80
Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala
85 90 95
Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr
100 105 110
Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser
115 120 125
Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro
130 135 140
Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile
165 170 175
Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser
180 185 190
Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu
195 200 205
Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr
210 215 220
Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly
245 250 255
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
260 265 270
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg
275 280 285
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
290 295 300
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
305 310 315 320
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
325 330 335
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
340 345 350
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
355 360 365
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
370 375 380
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
385 390 395 400
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
405 410 415
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
420 425 430
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
435 440 445
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala
450 455 460
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
465 470 475
<210> 41
<211> 1851
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码融合蛋白的核苷酸(hCD80-Fc-IL2wt)
<400> 41
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120
tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180
aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240
cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300
gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360
cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420
ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480
gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540
tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600
accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660
aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720
ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780
ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840
aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900
caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960
aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020
gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080
ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag 1140
gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200
ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260
gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320
tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380
ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt 1440
ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat 1500
ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg 1560
acccgcatgc tgacctttaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc 1620
cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag 1680
aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg 1740
aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa 1800
tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac c 1851
<210> 42
<211> 367
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc-IL2wt
<400> 42
Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
20 25 30
Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
35 40 45
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
50 55 60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
100 105 110
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
115 120 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
130 135 140
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145 150 155 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser
225 230 235 240
Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln
245 250 255
Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg
260 265 270
Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys
275 280 285
His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu
290 295 300
Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
305 310 315 320
Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr
325 330 335
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu
340 345 350
Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
355 360 365
<210> 43
<211> 1176
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc-IL2wt
<400> 43
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgctga gtctaagtat ggccctcctt gtcctccatg tcctgctcca 120
gaagctgctg gcggaccctc tgtgttcctg tttcctccaa agcctaagga ccagctcatg 180
atctctcgga cacccgaagt gacctgcgtg gtggtggatg tgtctcaaga ggaccctgag 240
gtgcagttca attggtacgt ggacggcgtg gaagtgcaca acgccaagac caagcctaga 300
gaggaacagt tcaactccac ctacagagtg gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggat 360
tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag gtgtccaaca agggcctgcc ttccagcatc 420
gaaaagacca tctccaaggc taagggccag cctagggaac cccaggttta caccctgcct 480
ccaagccaag aggaaatgac caagaaccag gtgtccctga cctgcctggt caagggcttc 540
tacccttccg acattgccgt ggaatgggag tccaatggcc agcctgagaa caactacaag 600
accacacctc ctgtgctgga ctccgacggc tccttctttc tgtactctcg cctgaccgtg 660
gacaagtcta gatggcaaga gggcaacgtg ttctcctgct ctgtgctgca cgaggccctg 720
cacaatcact acacccagaa gtccctgtct ctgtctcttg gaggtggtgg cggttctgcc 780
cctaccagct cctctaccaa gaaaacccag ctccagttgg agcatctgct gctggacctc 840
cagatgattc tgaacgggat caacaactat aagaacccca agctgacccg catgctgacc 900
tttaagttct acatgcccaa gaaggccacc gagctgaagc acctccagtg cctggaagaa 960
gaactgaagc ccctggaaga ggtgctgaat ctggcccagt ccaagaactt ccacctgagg 1020
ccacgggacc tgatcagcaa catcaacgtg atcgtgctgg aactgaaggg ctccgagaca 1080
acctttatgt gcgagtacgc cgacgagaca gccaccatcg tggaatttct gaaccggtgg 1140
atcaccttct gccagagcat catctccaca ctgacc 1176
<210> 44
<211> 392
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc-IL2v2
<400> 44
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
20 25 30
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
35 40 45
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr
50 55 60
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
65 70 75 80
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
85 90 95
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
100 105 110
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
115 120 125
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
130 135 140
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
145 150 155 160
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
165 170 175
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
180 185 190
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
195 200 205
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
210 215 220
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu
225 230 235 240
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
260 265 270
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
275 280 285
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr
290 295 300
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
305 310 315 320
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
325 330 335
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
340 345 350
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
355 360 365
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
370 375 380
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
385 390
<210> 45
<211> 1200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码Fc-IL2v2的核苷酸
<400> 45
ggatccgcca ccatggatgc tatgctgaga ggcctgtgtt gcgtgctgct gctgtgtggc 60
gctgtgttcg tgtctccatc tcacgccgct gagtctaagt acggccctcc ttgtcctcca 120
tgtcctgctc cagaagctgc tggcggaccc tctgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag 180
gaccagctca tgatctctcg gacccctgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcaa 240
gaggaccctg aggtgcagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 300
accaagccta gagaggaaca gttcaactcc acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg 360
ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg 420
ccttccagca tcgaaaagac catctccaag gctaagggcc agcctaggga accccaggtt 480
tacaccctgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg 540
gtcaagggct tctacccttc cgacattgcc gtggaatggg agtccaatgg ccagcctgag 600
aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gactccgacg gctccttctt tctgtactct 660
cgcctgaccg tggacaagtc taggtggcaa gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgctg 720
cacgaggccc tgcacaatca ctacacccag aagtccctgt ctctgtctct tggcggaggc 780
ggaggatctg ctcctacctc cagctccacc aagaaaaccc agctccagtt ggagcatctg 840
ctgctggacc tccagatgat cctgaatggc atcaacaatt acaagaaccc caagctgacc 900
gccatgctga ccgctaagtt ctacatgccc aagaaggcca ccgagctgaa gcacctccag 960
tgcctggaag aggaactgaa gcccctggaa gaagtgctga atctggccca gtccaagaac 1020
ttccacctga ggcctaggga cctgatctcc aacatcaacg tgatcgtgct ggaactgaaa 1080
ggctccgaga caaccttcat gtgcgagtac gccgacgaga cagccaccat cgtggaattt 1140
ctgaaccggt ggatcacctt ctgccagtcc atcatctcca cactgacctg atgactcgag 1200
<210> 46
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD80-Fc-IL2wt
<400> 46
Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys
1 5 10 15
Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp
20 25 30
Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn
35 40 45
Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn
50 55 60
Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His
85 90 95
Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser
100 105 110
Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu
145 150 155 160
Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr
165 170 175
Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn
180 185 190
Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
325 330 335
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser
450 455 460
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
465 470 475 480
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
485 490 495
Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
500 505 510
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
515 520 525
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
545 550 555 560
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
565 570 575
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
580 585 590
<210> 47
<211> 591
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> mGI-101
<400> 47
Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys Ser Val Lys Asp Lys Val Leu Leu Pro
1 5 10 15
Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His Glu Asp Glu Ser Glu Asp Arg Ile Tyr
20 25 30
Trp Gln Lys His Asp Lys Val Val Leu Ser Val Ile Ala Gly Lys Leu
35 40 45
Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Leu Tyr Asp Asn Thr Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly Leu Val Leu Ser Asp Arg Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Ser Cys Val Val Gln Lys Lys Glu Arg Gly Thr Tyr Glu Val Lys His
85 90 95
Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Ala Asp Phe Ser Thr Pro Asn
100 105 110
Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro Ser Ala Asp Thr Lys Arg Ile Thr Cys
115 120 125
Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro Arg Phe Ser Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile Asn Thr Thr Ile Ser Gln Asp Pro Glu
145 150 155 160
Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Gln Leu Asp Phe Asn Thr Thr Arg
165 170 175
Asn His Thr Ile Lys Cys Leu Ile Lys Tyr Gly Asp Ala His Val Ser
180 185 190
Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys Pro Pro Glu Asp Pro Pro Asp Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
325 330 335
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser
450 455 460
Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln
465 470 475 480
Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala
485 490 495
Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys
500 505 510
His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu
515 520 525
Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
530 535 540
Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr
545 550 555 560
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu
565 570 575
Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
580 585 590

Claims (22)

1.一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含作为活性成分的含有IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白及自然杀手(NK)细胞。
2.如权利要求1的用于治疗癌症的组合物，其中所述IL-2蛋白及该CD80蛋白透过一接头附接。
3.如权利要求1的用于治疗癌症的组合物，其中所述IL-2蛋白具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
4.如权利要求1的用于治疗癌症的组合物，其中所述IL-2蛋白是IL-2变体。
5.如权利要求4的用于治疗癌症的组合物，其中所述IL-2变体是通过SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第42个、第45个、第61个及第72个氨基酸中的至少一个取代而获得。
6.如权利要求4的用于治疗癌症的组合物，其中所述IL-2变体是通过至少一个选自于由下列所构成的群组的取代而获得：SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G。
7.如权利要求4的用于治疗癌症的组合物，其中所述IL-2变体含有任一个选自于下列SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的取代组合(a)至(d)：
(a)R38A/F42A
(b)R38A/F42A/Y45A
(c)R38A/F42A/E61R
(d)R38A/F42A/L72G。
8.如权利要求4的用于治疗癌症的组合物，其中所述IL-2变体具有SEQ ID NO:6、22、23或24的氨基酸序列。
9.如权利要求1的用于治疗癌症的组合物，其中该CD80蛋白具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
10.如权利要求1的用于治疗癌症的组合物，其中该CD80蛋白是CD80片段。
11.如权利要求10的用于治疗癌症的组合物，其中该CD80片段由SEQ ID NO:11中第35个至第242个氨基酸构成。
12.如权利要求2的用于治疗癌症的组合物，其中该接头是白蛋白或免疫球蛋白的Fc结构域。
13.如权利要求12的用于治疗癌症的组合物，其中该Fc结构域是野生型Fc结构域或Fc结构域变体。
14.如权利要求12的用于治疗癌症的组合物，其中该Fc结构域具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
15.如权利要求13的用于治疗癌症的组合物，其中该Fc结构域变体具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
16.如权利要求1的用于治疗癌症的组合物，其中该融合蛋白由下列结构式(I)或(II)构成：
N'-X-[接头(1)]n-Fc结构域-[接头(2)]m-Y-C' (I)
N'-Y-[接头(1)]n-Fc结构域-[接头(2)]m-X-C' (II)
其中，在该结构式(I)及(II)中，
N'是该融合蛋白的N端，
C'是该融合蛋白的C端，
X是CD80蛋白，
Y是IL-2蛋白，
该接头(1)及(2)是肽接头，及
n及m各独立地为0或1。
17.如权利要求16的用于治疗癌症的组合物，其中该接头(1)是由SEQ ID NO:3的氨基酸序列构成的肽接头。
18.如权利要求16的用于治疗癌症的组合物，其中该接头(2)是由SEQ ID NO:5的氨基酸序列构成的肽接头。
19.如权利要求16的用于治疗癌症的组合物，其中该融合蛋白由该结构式(I)构成。
20.如权利要求1的用于治疗癌症的组合物，其中该融合蛋白与SEQ ID NO:9、26、28或30的氨基酸序列具有85％以上的序列同一性。
21.如权利要求1的用于治疗癌症的组合物，其中该融合蛋白是二聚体。
22.如权利要求1的用于治疗癌症的组合物，其中该癌症是选自于由下列所构成的群组中的任一者：胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰脏癌、子宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性淋巴母细胞白血病、脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾液腺癌及淋巴瘤。
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