JP7488337B2 - Ｉｌ－２タンパク質及びｃｄ８０タンパク質を含む融合タンパク質及びｎｋ細胞を含む抗癌治療用組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、ＣＤ８０タンパク質及びＩＬ－２変異体を含む融合タンパク質及びＮＫ細胞を有効成分として含む抗癌用組成物に関する。
ＩＬ－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２）は、Ｔ細胞成長因子（Ｔ－ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ，ＴＣＧＦ）とも呼ばれ、リンパ球の生成、生存及び恒常性において中心役割を担う球形の糖タンパク質である。ＩＬ－２のタンパク質サイズは、１５．５ｋＤａ～１６ｋＤａであり、１３３個のアミノ酸からなっている。ＩＬ－２は個別の３個のサブユニットで構成されたＩＬ－２受容体（ＩＬ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合することによって各種の免疫作用を媒介する。また、ＩＬ－２は、活性化されたＴ細胞の中でも特に、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ）によって主に合成される。ＩＬ－２は、Ｔ細胞の増殖及び分化を刺激し、細胞毒性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＣＴＬ）の生成及び末梢血リンパ球の細胞毒性細胞及びリンフォカイン－活性化殺害細胞（ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ，ＬＡＫ ｃｅｌｌ）への分化を誘導する。
一方、ＣＤ８０はＢ７－１として知られており、リガンドと結合して共同刺激反応（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）及び共同抑制反応（ｃｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を伝達して免疫調節に関与する膜タンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のうちＢ７ファミリーの一つである。ＣＤ８０は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞及び単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）の表面に発現する膜貫通タンパク質である。ＣＤ８０は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）及びＰＤ－Ｌ１に結合するものと知られている。ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４及びＣＤ２８は、共同刺激－共同抑制システムに関与する。例えば、Ｔ細胞の活性を調節し、増殖、分化及び生存に関与する。
また、自然殺害細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ、以下、ＮＫ細胞）は、癌細胞を除去して抗癌活性を示すものと知られている（Ｌｏｒｉｓ Ｚａｍａｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７８：４０１１－４０１６，２００７）。ＮＫ細胞の活性は、様々な活性化及び抑制受容体信号伝達バランスによって調節される。ＮＫ細胞の抗癌活性も、その表面に存在する様々な免疫受容体（ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を通じて癌細胞を区別することによって達成することが知られている。正常細胞は、ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ） Ｃｌａｓｓ Ｉが細胞に存在するので、ＮＫ細胞の抑制受容体によって認識されて攻撃されないが、癌細胞又は感染した一部の細胞は、ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉが減少する或いはＮＫ細胞活性化受容体に対するリガンド（ｌｉｇａｎｄ）を有する理由からＮＫ細胞によって除去される。ＮＫ細胞は、癌細胞の他にも癌幹細胞（ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）も除去でき、癌の発生、増殖、転移を抑制するだけでなく、完治後に癌の再発を低減させることができる治療剤の開発源として脚光を浴びている。
そこで、本発明者らは、安全で効果的なＩＬ－２を開発するために研究した結果、ＩＬ－２タンパク質及びＣＤ８０タンパク質を一つの分子内に含む新規な融合タンパク質二量体と自然殺害細胞との併用投与時に抗癌効果に優れることを発見し、本発明を完成するに至った。
上記の目的達成のために、本発明の一側面は、ＩＬ－２タンパク質及びＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質二量体及び自然殺害細胞を有効成分として含む抗癌剤を提供する。
ＩＬ－２タンパク質及びＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質は、免疫細胞を活性化させることができる他にも、自然殺害細胞と併用投与時にシナジー効果を示すことを確認した。したがって、前記併用投与療法は癌治療に有用に利用可能である。
ここで、Ｙ軸＝０は、最初播種時点の癌細胞の生存信号（Ｒｅｄ ｓｉｇｎａｌ）の範囲を０点としたものである。Ｙ軸＞０は、播種時点以後に癌細胞の生存信号が捕まえる範囲が増加した場合であって、細胞増加速度が死滅速度よりも速いこと（細胞増加速度＞死滅速度）を表す。すなわち、癌細胞の数字が増加したと見なすことができる。ただし、増加量の値が低いほど癌細胞の増殖を抑制したものと見なす。一方、負数値は、最初播種時点で確認される生存癌細胞に比べて測定される生存癌細胞面積が小さくなる場合に、負数値で示し、細胞増加速度が死滅速度よりも遅いこと（細胞増加速度＜死滅速度）を表す。すなわち、最初播種時に測定される面積よりも小さくなる場合に、負数値で示す。したがって、負数値が大きいほど、癌細胞の増殖抑制に留まらず、死滅までにもつながり得ることを暗示する。
発明を実施するための形態
本発明の一側面は、ＩＬ－２タンパク質及びＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質及びＮＫ細胞を有効成分として含む医薬組成物を提供する。
本発明の一側面は、ＩＬ－２タンパク質及びＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質及びＮＫ細胞を有効成分として含む医薬組成物を提供する。
本発明のさらに他の側面は、ＩＬ－２タンパク質及びＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質及びＮＫ細胞を有効成分として含む癌疾患治療用医薬組成物を提供する。
自然殺害細胞
本明細書で使う用語“ＮＫ細胞”は、自然殺害細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；以下、ＮＫ細胞）を意味し、先天的免疫細胞の一つであって、様々な大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、Ｔ細胞（Ｔ ｃｅｌｌ）と直接に相互作用するか或いはサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を生成することによって免疫反応調節に関与し、これによって自己免疫疾患などに重要な働きをする細胞である。本発明において、ＮＫ細胞は、脾臓又は骨髄から分離され得るが、これに限定されるものではない。具体的に、前記ＮＫ細胞は、自家又は他家から収得した細胞であってよい。
また、前記ＮＫ細胞は、哺乳動物又はヒトに由来するものでよい。好ましくは、ＮＫ細胞治療を受けようとする個体から収得したものであってよい。このとき、前記ＮＫ細胞は、個体の血液から直接分離して使用するか、個体から収得した未成熟ＮＫ細胞又は幹細胞を分化させて使用することができる。
また、前記自然殺害細胞は、ｉ）ＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）から、ＣＤ３を発現させない細胞を分離する段階；ｉｉ）前記段階で分離されたＣＤ３を発現させない細胞から、ＣＤ５６を発現させる細胞を分離する段階；及び、ｉｉｉ）ＩＬ－２又はその変異体及びＣＤ８０又はその断片を含む融合タンパク質二量体の存在下に、前記分離された細胞を培養する段階によって収得されたものであってよい。
また、前記自然殺害細胞は、ｉ）ＰＢＭＣから、ＣＤ３を発現させない細胞を分離する段階；及び、ｉｉ）ＩＬ－２又はその変異体及びＣＤ８０又はその断片を含む融合タンパク質二量体の存在下に、前記分離された細胞を培養する段階によって収得されたものであってよい。
また、前記自然殺害細胞は、ｉ）ＰＢＭＣから、ＣＤ５６を発現させる細胞を分離する段階；及び、ｉｉ）ＩＬ－２又はその変異体及びＣＤ８０又はその断片を含む融合タンパク質二量体の存在下に、前記分離された細胞を培養する段階によって収得されたものであってよい。
ＩＬ－２タンパク質及びＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質
本明細書で使われる用語“ＩＬ－２”又は“インターロイキン－２”は、別に断りのない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）を含めて任意の脊椎動物供給源から収得した任意の野生型ＩＬ－２を意味する。前記ＩＬ－２は、動物細胞から収得されたものであってもよいが、ＩＬ－２を生産できる組換え細胞から収得されたものも含む。また、前記ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２又はその変異体であってよい。
本明細書では、ＩＬ－２或いはその変異体を総称して“ＩＬ－２タンパク質”或いは“ＩＬ－２ポリペプチド”の用語と表現してもよい。ＩＬ－２、ＩＬ－２タンパク質、ＩＬ－２ポリペプチド、及びＩＬ－２変異体は、例えば、ＩＬ－２受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に特異的に結合する。この特異的な結合は、当業者に知られた方法によって確認することができる。
前記ＩＬ－２の一具体例は、配列番号３５又は配列番号３６のアミノ酸配列を有することができる。また、このとき、前記ＩＬ－２は、成熟した形態であってよい。具体的に、前記成熟したＩＬ－２は、信号配列を含まないものであってよく、配列番号１０のアミノ酸配列を有するものであってよい。このとき、前記ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２のＮ末端又はＣ末端の一部が欠失した（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）断片を含む概念で使われてよい。
また、前記ＩＬ－２の断片は、配列番号３５又は配列番号３６のアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端から連続して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個のアミノ酸が欠失した形態であってよい。また、前記ＩＬ－２の断片は、配列番号３５又は配列番号３６のアミノ酸配列を有するタンパク質のＣ末端から連続して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個のアミノ酸が欠失した形態であってよい。
本明細書で使われる用語“ＩＬ－２変異体”は、全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）ＩＬ－２又は上述したＩＬ－２断片のアミノ酸の一部が置換された形態を意味する。すなわち、ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２又はその断片と異なるアミノ酸配列を有することができる。しかし、前記ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２と同等又は類似の活性を有することができる。ここで、“ＩＬ－２活性”は、例えば、ＩＬ－２受容体に特異的に結合することを意味でき、この特異的結合は、当業者に知られた方法によって測定できる。
具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２のアミノ酸の一部が置換されたものであってよい。アミノ酸置換によるＩＬ－２変異体の一具体例としては、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸のうち少なくとも一つが置換されたものであってよい。
具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目、６１番目又は７２番目のアミノ酸のうち少なくともいずれか一つが別のアミノ酸に置換されたものであってよい。その他にも、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列のＮ末端の一部分が欠失した形態の場合に、配列番号１０のアミノ酸配列において相補的に対応する位置のアミノ酸が別のアミノ酸に置換されてよい。例えば、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸を配列を有する場合に、前記ＩＬ－２の変異体は、配列番号３５のアミノ酸配列において５８番目、６２番目、６５番目、８１番目又は９２番目のアミノ酸のうち少なくともいずれか一つが別のアミノ酸に置換されたものであってよい。それらは、それぞれ、配列番号１０のアミノ酸配列の３８番目、４２番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸残基に該当する。一具体例によれば、ＩＬ－２活性が維持される限り、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、或いは１０個のアミノ酸が置換されてよい。さらに他の具体例によれば、１個から５個までのアミノ酸が置換されてよい。
一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、２箇所のアミノ酸が置換された形態であってよい。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目及び４２番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目及び４５番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目及び４５番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。
さらに、前記ＩＬ－２変異体は、３箇所のアミノ酸が置換された形態であってよい。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目及び４５番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４５番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４５番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目、４５番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目、４５番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。
また、前記ＩＬ－２変異体は、４箇所のアミノ酸が置換された形態であってよい。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであってよい。
さらに、前記ＩＬ－２変異体は、５箇所のアミノ酸が置換された形態であってよい。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸がいずれも別のアミノ酸に置換されたものであってよい。
このとき、前記置換によって導入される“別のアミノ酸”は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）、アスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、イソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）、メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌ ａｌａｎｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）及びバリン（ｖａｌｉｎｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つであってよい。ただし、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、前記配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目はアルギニンに置換されなくてよく、４２番目はフェニルアラニンに置換されなくてよく、４５番目はチロシンに置換されなくてよく、６１番目はグルタミン酸に置換されなくてよく、７２番目はロイシンに置換されなくてよい。
前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目のアミノ酸であるアルギニンは、アルギニン以外の別のアミノ酸に置換されてよい。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目のアミノ酸であるアルギニンは、アラニンに置換（Ｒ３８Ａ）されてよい。
前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目のアミノ酸であるフェニルアラニンは、フェニルアラニン以外の別のアミノ酸に置換されてよい。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目のアミノ酸であるフェニルアラニンは、アラニンに置換（Ｆ４２Ａ）されてよい。
前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目のアミノ酸であるチロシンは、チロシン以外の別のアミノ酸に置換されてよい。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目のアミノ酸であるチロシンは、アラニンに置換（Ｙ４５Ａ）されてよい。
前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において６１番目のアミノ酸であるグルタミン酸は、グルタミン酸以外の別のアミノ酸に置換されてよい。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において６１番目のアミノ酸であるグルタミン酸は、アルギニンに置換（Ｅ６１Ａ）されてよい。
前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において７２番目のアミノ酸であるロイシンは、ロイシン以外の別のアミノ酸に置換されてよい。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において７２番目のアミノ酸であるロイシンは、グリシンに置換（Ｌ７２Ｇ）されてよい。
具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列においてＲ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇからなる群から選ばれる少なくともいずれか一つの置換が起きたものであってよい。
具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇからなる群から選ばれる位置において２箇所、３箇所、４箇所又は５箇所の位置でアミノ酸置換が起きてよい。
また、前記ＩＬ－２変異体は、２箇所のアミノ酸が置換された形態であってよい。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ及びＦ４２Ａに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ及びＹ４５Ａに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ及びＥ６１Ｒに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ及びＬ７２Ｇに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ及びＹ４５Ａに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ及びＥ６１Ｒに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ及びＬ７２Ｇに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起きたものであってよい。
さらに、前記ＩＬ－２変異体は、３箇所のアミノ酸が置換された形態であってよい。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ及びＹ４５Ａに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ及びＥ６１Ｒに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ及びＬ７２Ｇに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＥ６１Ｒに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起きたものであってよい。
また、前記ＩＬ－２変異体は、４箇所のアミノ酸が置換された形態であってよい。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＥ６１Ｒに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起きたものであってよい。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起きたものであってよい。
さらに、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起きたものであってよい。
好ましくは、前記ＩＬ－２変異体の一具体例は、配列番号１０のアミノ酸配列において下記の（ａ）～（ｄ）組合せから選ばれるいずれか一つの組合せの置換が起きたものであってよい：
（ａ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ；
（ｂ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ；
（ｃ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｅ６１Ｒ；又は
（ｄ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｌ７２Ｇ
このとき、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列を有する場合に、配列番号１０と相補的に対応する位置にアミノ酸置換を有することができる。また、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列の断片である場合にも、配列番号１０と相補的に対応する位置のアミノ酸が置換されてよい。
（ａ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ；
（ｂ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ；
（ｃ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｅ６１Ｒ；又は
（ｄ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｌ７２Ｇ
このとき、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列を有する場合に、配列番号１０と相補的に対応する位置にアミノ酸置換を有することができる。また、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列の断片である場合にも、配列番号１０と相補的に対応する位置のアミノ酸が置換されてよい。
具体的に、前記ＩＬ－２の変異体は、配列番号６、２２、２３又は２４のアミノ酸配列を有するものであってよい。
また、前記ＩＬ－２変異体は、生体内で低い毒性を有することを特徴とするものであってよい。このとき、前記‘生体内で低い毒性’とは、ＩＬ－２がＩＬ－２受容体のアルファチェーン（ＩＬ－２Ｒα）と結合して誘発される副作用であってよい。前記ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの結合による副作用を改善させるために様々なＩＬ－２変異体が開発されており、このようなＩＬ－２変異体は、米国特許第５，２２９，１０９号及び大韓民国特許第１０－１６６７０９６号に開示されたものなどを使用することができる。特に、本出願で記述されるＩＬ－２の変異体は、ＩＬ－２受容体のアルファチェーン（ＩＬ－２Ｒα）との結合力が低いので、生体内毒性が野生型ＩＬ－２に比べて低い。
本明細書で使われる用語“ＣＤ８０”は、“Ｂ７－１”とも呼ばれ、樹状細胞、活性化されたＢ細胞及び単核球に存在する膜タンパク質である。ＣＤ８０は、Ｔ細胞の活性化と生存に必須な共刺激信号を提供する。ＣＤ８０は、Ｔ細胞表面に存在する異なる２つのタンパク質であるＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４に対するリガンドとして知られている。ＣＤ８０は、２８８個のアミノ酸で構成されており、具体的に、配列番号１１のアミノ酸配列を有するものであってよい。また、本明細書において“ＣＤ８０タンパク質”は、全長ＣＤ８０又はＣＤ８０断片を意味する。
本明細書で使われる用語“ＣＤ８０断片”とは、ＣＤ８０の切断型を意味する。また、前記ＣＤ８０断片は、ＣＤ８０の細胞外ドメインであってよい。ＣＤ８０断片の一具体例には、ＣＤ８０の信号配列であるＮ末端から１番目～３４番目のアミノ酸が除外されたものであってよい。具体的に、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の３５番目～２８８番目のアミノ酸で構成されたタンパク質であってよい。また、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の３５番目～２４２番目のアミノ酸で構成されたタンパク質であってよい。また、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の３５番目～２３２番目のアミノ酸で構成されたタンパク質であってよい。また、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の３５番目～１３９番目のアミノ酸で構成されたタンパク質であってよい。また、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の１４２番目～２４２番目のアミノ酸で構成されたタンパク質であってよい。前記一実施例として、ＣＤ８０断片は、配列番号２のアミノ酸配列を有するものであってよい。
また、前記ＩＬ－２タンパク質及び前記ＣＤ８０タンパク質は、リンカー或いはキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）によって結合したものであってよい。具体的に、前記ＩＬ－２又はその変異体及び前記ＣＤ８０（Ｂ７－１）又はその断片は、リンカー或いはキャリアによって結合したものであってよい。本明細書において、リンカーとキャリアは同じ意味で使われてもよい。
前記リンカーは、２つのタンパク質を連結する。リンカーの一具体例としては、１個～５０個のアミノ酸、アルブミン又はその断片、又は免疫グロブリンのＦｃドメインなどを含むことができる。このとき、前記免疫グロブリンのＦｃドメインは、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含み、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域及び軽鎖定常領域１（ＣＨ１）を含まないタンパク質を意味する。前記免疫グロブリンはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭであってよく、好ましくは、ＩｇＧ４であってよい。このとき、野生型免疫グロブリンＧ４のＦｃドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を有するものであってよい。
また、前記免疫グロブリンのＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインの他、Ｆｃドメイン変異体であってもよい。また、本明細書で使われる用語“Ｆｃドメイン変異体”は、野生型Ｆｃドメインの糖鎖形態（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ）と異なるか、野生型Ｆｃドメインに比べて増加した糖鎖、野生型Ｆｃドメインに比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）形態であってよい。また、無糖鎖（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）Ｆｃドメインも含まれる。Ｆｃドメイン或いは変異体は、培養条件或いはホストの遺伝子操作によって含有量が調節されたシアル酸（ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ）、フコシル化（ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を有させたものであってよい。
また、化学的方法、酵素的方法及び微生物を使用した遺伝工学的エンジニアリング方法などのように通常の方法で免疫グロブリンのＦｃドメインの糖鎖を変形させることができる。また、前記Ｆｃドメイン変異体は、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭのＦｃ領域が混合された形態であってよい。また、前記Ｆｃドメイン変異体は、前記Ｆｃドメインの一部のアミノ酸が別のアミノ酸に置換された形態であってよい。前記Ｆｃドメイン変異体の一具体例としては、配列番号１２のアミノ酸配列を有するものであってよい。
融合タンパク質は、Ｆｃドメインをリンカー（或いは、キャリア）にしてそのＮ末端及びＣ末端にそれぞれＣＤ８０及びＩＬ－２タンパク質が連結されるか或いはＩＬ－２及びＣＤ８０が連結された構造を有してよい（図１）。ＦｃドメインのＮ末端或いはＣ末端とＣＤ８０或いはＩＬ－２との連結は、任意にリンカーペプチドによってなされてよい。
具体的に、前記融合タンパク質は、下記構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）からなるものでよい：
Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
このとき、前記構造式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、
前記Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
前記Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
前記Ｘは、ＣＤ８０タンパク質であり、
前記Ｙは、ＩＬ－２タンパク質であり、
前記リンカー（１）及びリンカー（２）は、ペプチドリンカーであり、
前記ｎ及びｍはそれぞれ独立に、Ｏ又は１である。
Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
このとき、前記構造式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、
前記Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
前記Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
前記Ｘは、ＣＤ８０タンパク質であり、
前記Ｙは、ＩＬ－２タンパク質であり、
前記リンカー（１）及びリンカー（２）は、ペプチドリンカーであり、
前記ｎ及びｍはそれぞれ独立に、Ｏ又は１である。
好ましくは、前記融合タンパク質は、構造式（Ｉ）からなるものでよい。前記ＩＬ－２タンパク質は、上述した通りである。また、前記ＣＤ８０タンパク質は、上述した通りである。一具体例によれば、ＩＬ－２タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、１個から５個までのアミノ酸が置換されたＩＬ－２変異体であってよい。ＣＤ８０タンパク質は、野生型ＣＤ８０のＮ末端或いはＣ末端から連続して約３４個までのアミノ酸残基が欠失した（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）断片であってよい。或いは、ＣＤ８０タンパク質は、Ｔ細胞表面受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）ＣＴＬＡ－４とＣＤ２８に結合する活性を有する細胞外免疫グロブリン様ドメインであってよい。
具体的に、前記融合タンパク質は、配列番号９、２６、２８又は３０のアミノ酸配列を有するものであってよい。さらに他の具体例によれば、融合タンパク質は、配列番号９、２６、２８又は３０のアミノ酸配列に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％或いは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。このとき、同一性は、例えば、パーセント相同性、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢｌａｓｔＮ ｓｏｆｔｗａｒｅのような相同性比較ソフトウェアによって決定されてよい。
前記ＣＤ８０タンパク質とＦｃドメインとの間にはペプチドリンカー（１）が含まれてよい。前記ペプチドリンカー（１）は、５個～８０個の連続したアミノ酸、２０個～６０個の連続したアミノ酸、又は２５個～５０個の連続したアミノ酸、又は３０個～４０個のアミノ酸からなってよい。一具体例として、ペプチドリンカー（１）は、３０個のアミノ酸からなってよい。また、ペプチドリンカー（１）は、少なくとも一つのシステインを含むことができる。具体的に、１個、２個又は３個のシステインを含むことができる。また、前記ペプチドリンカー（１）は、免疫グロブリンのヒンジに由来するものであってよい。一具体例では、前記ペプチドリンカー（１）が配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってよい。
前記ペプチドリンカー（２）は、１個～５０個の連続したアミノ酸、又は３個～３０個の連続したアミノ酸、又は５個～１５個のアミノ酸からなってよい。一具体例として、前記ペプチドリンカー（２）は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ここで、ｎは１～１０の整数）であってよい。このとき、（Ｇ４Ｓ）ｎにおいて、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であってよい。一実施例として、前記ペプチドリンカー（２）が配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってよい。
本発明の他の側面は、前記ＩＬ－２タンパク質及び前記ＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質が２個結合した二量体及びＮＫ細胞を有効成分として含む癌治療用医薬組成物を提供する。前記ＩＬ－２又はその変異体及びＣＤ８０又はその断片を含む融合タンパク質は、上述した通りである。
このとき、二量体を構成する融合タンパク質間の結合は、リンカー内に存在するシステインによって二硫化結合によってなされたものでよいが、これに限定されるものではない。二量体を構成する融合タンパク質は、同一又は個別の融合タンパク質であってよい。好ましくは、前記二量体は、同型二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）であってよい。前記二量体を構成する融合タンパク質の一実施例は、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
本発明において、前記癌は、胃癌、肝癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、子宮頸癌、甲状腺癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、唾液腺癌及びリンパ腫から構成された群から選ばれてよい。
前記医薬組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択されてよい。本発明の癌治療用又は予防用薬学組成物においてその有効成分は、抗癌治療効果を示し得る限り、用途、剤形、配合目的などによって任意の量（有効量）で含まれてよいが、通常の有効量は、組成物全重量を基準にするとき、０．００１重量％～２０．０重量％の範囲で決定されるであろう。ここで、“有効量”とは、抗癌治療効果を誘導できる有効成分の量を指す。このような有効量は、当業者の通常の能力範囲内で実験的に決定されてよい。
本明細書で使われる用語“治療”は、治療学的処理及び予防的処理のいずれをも含む意味で使われてよい。このとき、予防は、個体の病理学的状態又は疾患を緩和又は減少させる意味で使われてよい。一具体例において、用語“治療”は、ヒトを含む哺乳類において疾患を治療するためのいかなる適用又は形態の投薬も含む。また、該用語は、疾患又は疾患の進行を抑制又は遅延させることを含み；損傷又は欠損した機能を回復又は修復して疾患を部分的又は完全に緩和させ；非効率的なプロセスを刺激し；又は、深刻な疾患を緩和させる意味を含む。
本明細書で使われる用語“効能（ｅｆｆｉｃａｃｙ）”とは、１年、５年、又は１０年のように日程期間にわたって生存或いは疾病のない状態で生存（ｄｉｓｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ）のような一つ以上のパラメータによって決定されてよい。その他に、前記パラメータは、個体において少なくとも一つの腫瘍のサイズが抑制されるものを含んでもよい。
生体利用率のような薬動学的パラメータ（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）及びクリアランス率（ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｒａｔｅ）のような基本的なパラメータ（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）も効能に影響を与え得る。したがって、“向上した効能（例えば、効能の改善）”は、向上した薬動学的パラメータ及び向上した効能に起因してよく、試験動物又はヒト対象体においてクリアランス率及び腫瘍成長を比較するか、生存、再発率、又は疾病のない状態で生存のようなパラメータを比較して測定されてよい。
ここで、“治療学的に有効な量”又は“薬学的に有効な量”とは、対象疾患を予防又は治療するために有効な化合物又は組成物の量であって、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険割合で疾患を治療するのに十分であり且つ副作用を起こさない程度の量を意味する。前記有効量のレベルは、患者の健康状態、疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与方法、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、配合又は同時使用される薬物を含む要素及びその他医学分野によく知られた要素によって決定されてよい。一具体例において治療学的に有効な量は、癌を治療するために効果的な薬物の量を意味する。
このとき、前記医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。前記薬学的に許容可能な担体は、患者への伝達に適切な非毒性物質であれば、いかなる担体も可能である。蒸留水、アルコール、脂肪、ワックス及び非活性固体が担体として含まれてよい。薬物学的に許容されるアジュバント（緩衝剤、分散剤）も薬学組成物に含まれてよい。
具体的に、前記医薬組成物は、有効成分の他にも薬剤学的に許容される担体を含み、当業界に公知の通常の方法で投与経路に応じて非経口用剤形で製造されてよい。ここで“薬剤学的に許容される”との意味は、有効成分の活性を抑制しない上に、適用（処方）対象にとって適応可能な毒性を超えないという意味である。
前記医薬組成物を非経口用剤形とする場合に、適切な担体と共に当業界に公知の方法によって、注射剤、経皮投与剤、鼻腔吸込剤及び坐剤の形態で製剤化してよい。注射剤として製剤化する場合に、適切な担体としては、滅菌水、エタノール、グリセロール又はプロピレングリコールなどのポリオール又はそれらの混合物を使用することができ、好ましくは、リンゲル溶液、トリエタノールアミン含有のＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）又は注射用滅菌水、５％デキストロースのような等張溶液などを使用することができる。薬剤学的組成物の製剤化と関連しては当業界に公知されており、具体的に文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）］などを参照できる。前記文献は、本明細書の一部として見なされる。
前記医薬組成物のうち二量体の好ましい投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢、患者の重症度、投与経路によって１日０．０１ｕｇ／ｋｇ～１０ｇ／ｋｇの範囲、又は０．０１ｍｇ／ｋｇ～１ｇ／ｋｇの範囲であってよい。投与は、１日１回又は数回に分けてなされてよい。このような投与量は、いかなる側面においても本願発明の範囲を制限するものとして解釈されてはいけない。また、前記医薬組成物中のＮＫ細胞は、１×１０２～１×１０１３細胞、１×１０７～１．５×１０１１細胞で投与されてよいが、薬理効果を示す範囲で適切に調節されてよい。
前記医薬組成物の適用（処方）可能対象は、哺乳動物及びヒトであり、特に、ヒトである場合が好ましい。本願の薬学組成物は、有効成分の他に、抗癌活性の上昇、補強のために既に安全性が検証され、抗癌治療効果を有するものとして公知された任意の化合物又は天然抽出物もさらに含むことができる。
本発明のさらに他の側面は、癌を治療するためのＩＬ－２タンパク質及びＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質二量体及びＮＫ細胞の用途を提供する。
本発明のさらに他の側面は、癌の治療効果を向上させるためのＩＬ－２タンパク質及びＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質二量体及びＮＫ細胞の用途を提供する。
本発明のさらに他の側面は、癌治療用薬剤を製造するためのＩＬ－２タンパク質及びＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質二量体及びＮＫ細胞の用途を提供する。
本発明のさらに他の側面は、ＩＬ－２タンパク質及びＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質又は前記融合タンパク質が２個結合した融合タンパク質二量体及びＮＫ細胞を個体に投与する段階を含む、癌を治療する方法、及び／又は治療効果を向上させる方法を提供する。
このとき、前記融合タンパク質二量体とＮＫ細胞は同時に又は順次に投与されてよい。このとき、投与順序は、融合タンパク質二量体がまず投与された後、ＮＫ細胞が投与されてもよく、ＮＫ細胞がまず投与された後、融合タンパク質二量体が投与されてもよい。
前記個体は、癌を患っている個体であってよい。また、前記個体は哺乳動物であってよく、好ましくはヒトであってよい。前記ＩＬ－２タンパク質及びＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質又は前記融合タンパク質が２個結合した融合タンパク質二量体は、上述した通りである。
前記融合タンパク質又は融合タンパク質二量体及びＮＫ細胞の投与経路、投与量及び投与回数は、患者の状態及び副作用の有無によって様々な方法及び量で対象に投与されてよく、最適の投与方法、投与量及び投与回数は、通常の技術者が適切な範囲で選択可能である。また、前記融合タンパク質又は融合タンパク質二量体は、治療しようとする疾患に対して治療効果が公知された別の薬物又は生理学的活性物質と併用して投与されてもよく、別の薬物との組合せの製剤の形態で剤形化されてよい。
本発明の一具体例の融合タンパク質は、ＩＬ－２の活性によって自然殺害細胞のような免疫細胞を活性化させることができる。したがって、癌に効果的に活用できる。特に、野生型と比較して、２個～５個位置のアミノ酸が置換されたＩＬ－２変異体、特に、配列番号１０のアミノ酸配列においてＲ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇからなる群から選ばれる位置において２箇所、３箇所、４箇所又は５箇所の位置のアミノ酸置換を含むＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２受容体のアルファチェーンとの結合力を減少させ、従来ＩＬ－２が持っている薬理学的副作用が改善した特性を示すことが確認された。したがって、このようなＩＬ－２変異体は、単独で或いは融合タンパク質の形態で使用する場合に、従来に知られたＩＬ－２の問題点である血管（又は、毛細管）漏れ症候群（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｌｅａｋ ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＶＬＳ）の発生を減少させることができる。
以下、本願発明を下記実施例を用いてより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本願発明を例示するためのもので、本願発明の範囲を限定するものではない。
Ｉ．ＩＬ－２及びＣＤ８０を含む融合タンパク質二量体の準備
製造例１．ｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ－２変異体（２Ｍ）二量体の製造：ＧＩ－１０１
ヒトＣＤ８０断片、Ｆｃドメイン及びＩＬ－２変異体を含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、ＣＤ８０断片（配列番号２）、リンカーが結合したＩｇヒンジ（配列番号３）、Ｆｃドメイン（配列番号４）、リンカー（配列番号５）及び２個のアミノ酸が置換されたＩＬ－２変異体（２Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ）（配列番号６）をＮ末端から順次に含む融合タンパク質をコードする塩基配列（配列番号８）を含むポリヌクレオチドを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを用いてポリヌクレオチドを合成してｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯＴＭ）に導入して配列番号９の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ２ ８％濃度の環境において７日培養後に培養液を回収して融合タンパク質を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を“ＧＩ－１０１”と命名した。
精製は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａレジンが含まれたクロマトグラフィーを用いて精製した。２５ｍＭトリス、２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４の条件で融合タンパク質を結合させた。その後、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ３の１００ｍＭの酢酸で溶出した。ｐＨ ９の２０％の１Ｍトリス－ＨＣｌを回収用チューブに入れた後、融合タンパク質を回収した。回収した融合タンパク質をＰＢＳバッファーで１６時間透析して変えた。
その後、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で時間による２８０ｎｍ波長における吸光度を測定し、高濃度融合タンパク質を確保した。このとき、分離精製された融合タンパク質は、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）で染色してその純度を確認した（図２）。ＮａｎｏＤｒｏｐを用いた検出時に、２．７８ｍｇ／ｍｌの濃度で融合タンパク質が含まれたことを確認した。また、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した結果は、図３に示す通りである。
製造例２．Ｆｃ－ＩＬ－２変異体（２Ｍ）二量体の製造：Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ２
Ｆｃドメイン及びＩＬ－２変異体を含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、Ｉｇヒンジ（配列番号３８）、Ｆｃドメイン（配列番号４）、リンカー（配列番号５）及び２個のアミノ酸が置換されたＩＬ－２変異体（２Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ）（配列番号６）をＮ末端から順次に含む融合タンパク質をコードする塩基配列（配列番号４５）を含むポリヌクレオチドを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを用いてポリヌクレオチド合成してｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯTM）に導入し、配列番号４４の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ２ ８％濃度の環境で７日培養後に培養液を回収し、融合タンパク質二量体を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を“Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２”と命名した。
前記精製及び融合タンパク質の回収は、前記製造例１と同じ方法で行った。分離精製された融合タンパク質は、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルーで染色してその純度を確認した（図４）。その結果、前記融合タンパク質が二量体を形成することを確認した。また、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した結果は、図５に示す通りである。
製造例３．ｈＣＤ８０－Ｆｃ二量体の製造：ｈＣＤ８０－Ｆｃ
ヒトＣＤ８０断片及びＦｃドメインを含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、ＣＤ８０断片（配列番号２）、リンカーが結合したＩｇヒンジ（配列番号３）及びＦｃドメイン（配列番号４）をＮ末端から順次に含む融合タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号３９）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを用いてポリヌクレオチドを合成してｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯTM）に導入して配列番号４０の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後に３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ２ ８％濃度の環境で７日培養後に培養液を回収し、融合タンパク質二量体を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を“ｈＣＤ８０－Ｆｃ”と命名した。
精製は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａレジンが含まれたクロマトグラフィーを用いて精製した。２５ｍＭトリス、２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４の条件で融合タンパク質を結合させた。その後、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ３の１００ｍＭの酢酸で溶出した。ｐＨ ９の２０％の１Ｍトリス－ＨＣｌを回収用チューブに入れた後、融合タンパク質を回収した。回収した融合タンパク質をＰＢＳバッファーで１６時間透析して変えた。
その後、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で時間による２８０ｎｍ波長における吸光度を測定し、高濃度融合タンパク質を確保した。このとき、分離精製された融合タンパク質は、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）で染色してその純度を確認した（図６）。その結果、前記融合タンパク質が二量体を形成することを確認した。また、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した結果は、図７に示す通りである。
製造例４．ｍＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ－２変異体（２Ｍ）の製造：ｍＧＩ－１０１
製造例１と同じ方法でマウス由来のＣＤ８０及びＩＬ－２を有するマウス型のＧＩ－１０１を製造した。具体的に、マウスＣＤ８０、Ｆｃドメイン及びＩＬ－２変異体を含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、ｍＣＤ８０断片（配列番号１３）、リンカーが結合したＩｇヒンジ（配列番号３）、Ｆｃドメイン（配列番号４）、リンカー（配列番号５）及び２個のアミノ酸が置換されたＩＬ－２変異体（２Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ）（配列番号６）をＮ末端から順次に含む融合タンパク質をコードする塩基配列（配列番号１４）を含むポリヌクレオチドを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを用いてポリヌクレオチドを合成してｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯTM）に導入して配列番号４７の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後に３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ２ ８％濃度の環境で７日培養後に培養液を回収し、融合タンパク質二量体を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を“ｍＧＩ１０１”と命名した。
ＩＩ．ＮＫ細胞の準備及び培養
準備例１．末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）由来ＣＤ３（－）ＣＤ５６（＋）自然殺害細胞の分離
ＣＤ３（－）細胞を収得するために、ＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，Ｚｅｎ－Ｂｉｏ．Ｉｎｃ，ＮＣ２７７０９，ＵＳＡ，Ｃａｔ＃：ＳＥＲ－ＰＢＭＣ－２００－Ｆ）を、ＡＤＡＭ－ＭＣ２自動細胞計数器（ＮａｎｏＥｎＴｅｋ、（株）コスモジンテック社製）を用いて細胞数を測定した。前記ＰＢＭＣを新しいチューブに移した後、３００×ｇ、４℃温度で５分間遠心分離した。ＰＢＳに０．５％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）と２ｍＭ濃度のＥＤＴＡが含まれたＭＡＣＳバッファー（ｐＨ ７．２）を製造した。遠心分離が終わった後、１×１０７細胞数当たり８０μｌのＭＡＣｓバッファーと２０μｌのＣＤ３磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃｈ，１３０－０５０－１０１）を処理して細胞ペレットを懸濁した後、４℃温度で１５分間反応させた。洗浄のために、１０ｍｌのＭＡＣｓバッファーを入れ、３００×ｇ、４℃温度で１０分間遠心分離した後、０．５ｍｌのＭＡＣｓバッファーに細胞ペレットを再懸濁した。
ＬＤカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｃａｔ＃：１３０－０４２－９０１）にまず２ｍｌのＭＡＣｓバッファーを流した後、前記細胞懸濁液を流した。その後、ＬＤカラムを通過して出るＣＤ３（－）細胞を収得した。このとき、ＬＤカラム内に残っている細胞が十分に分離され得るように、２ｍｌのＭＡＣｓバッファーを３回流してＣＤ３（－）細胞を収得した。収得したＣＤ３（－）細胞を細胞計数器を用いて細胞数を測定した後、新しいチューブに入れ、３００×ｇ、４℃温度で５分間遠心分離した。その後、上澄液を除去した後、１×１０７個の細胞数当たりに８０μｌのＭＡＣｓバッファーと２０μｌのＣＤ５６磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ＃：１３０－０５０－４０１）を入れて４℃温度で１５分間反応させた。洗浄のために、１０ｍｌのＭＡＣｓバッファーを入れ、３００×ｇ、４℃温度で１０分間遠心分離した後、０．５ｍｌのＭＡＣｓバッファーに細胞ペレットを再懸濁した。
ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｃａｔ＃：１３０－０４２－９０１）にまず３ｍｌのＭＡＣｓバッファーを流した後、前記細胞懸濁液を流した。このとき、ＬＳカラム内に残っている細胞が十分に分離され得るように２ｍｌのＭＡＣｓバッファーを３回流した。その後、ＬＳカラムを磁性スタンド（Ｍａｇｎｅｔ ｓｔａｎｄ）から分離した後、５ｍｌのＭＡＣｓバッファーを入れ、ピストンで圧力を与えてＣＤ３（－）ＣＤ５６（＋）自然殺害細胞を収得した。前記収得したＣＤ３（－）ＣＤ５６（＋）自然殺害細胞を新しいチューブに入れ、３００×ｇ、４℃温度で５分間遠心分離した。上澄液を除去して培養培地に懸濁し、細胞計数器を用いて細胞数を測定した。
準備例２．ＣＤ３－ＣＤ５６＋自然殺害細胞の培養及び収得
ＮＫ細胞活性化／増殖キット（ＮＫ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｋｉｔ）（Ｃａｔ＃：１３０－１１２－９６８）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内に含まれている１００μｌのＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）－Ｂｉｏｔｉｎ及び１００μｌのＣＤ２－ビオチンを１．５ｍＬマイクロチューブに入れて混ぜた。その後、５００μｌの抗ビオチンＭＡＣＳｉＢｅａｄ粒子を入れて混ぜた。その後、３００μｌのＭＡＣｓバッファーを入れ、マイクロチューブローテーター（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ Ｒｏｔａｔｏｒ）を用いて２時間２℃～８℃で混ぜた。
その後、１×１０６細胞数当たりに５μｌのＮＫ活性化ビーズを新しいチューブに移した。その後、ＰＢＳ １ｍＬを入れて３００×ｇで５分間遠心分離した。遠心分離後に、上澄液を除去し、使用するＲＰＭＩ１６４０培地に、５％ヒトＡＢ血清（Ｃａｔ＃：Ｈ４５２２）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳ）が添加された培養培地を１×１０６細胞数当たり５μｌ基準で追加してビーズ（ｂｅａｄ）を懸濁した。前記準備例１で分離されたＣＤ３－ＣＤ５６＋自然殺害細胞に接種した。
その後、２４ウェルプレートに前記ＣＤ３－ＣＤ５６＋自然殺害細胞を播種し、ＲＰＭＩ１６４０培地に５％ヒトＡＢ血清（Ｃａｔ＃：Ｈ４５２２）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳ）及びｒｈＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍＬ）が添加された培養培地を追加し、３７℃、５％ ＣＯ２条件下に培養した。その後、２日間隔で細胞数を確認し、細胞が培養容器の８０％以上を占める（Ｃｏｎｆｕｅｎｃｙ）と、１２ウェルプレート、６ウェルプレート、２５Ｔフラスコの順に継代培養し、最終的に２１日目に全ての細胞を収得した。
準備例３．マウス由来自然殺害細胞の培養及び収得
準備例３．１．マウス脾臓細胞及び骨髄準備
マウス由来自然殺害細胞を収得するために、まず、マウス脾臓細胞及び骨髄を準備した。具体的に、６週齢雌Ｂａｌｂ／ｃ（オリエントバイオ）から脾臓及び大腿骨を摘出し、脂肪と筋肉を極力除去したが、大腿骨は折れないように注意した。摘出した大腿骨は７０％エタノールに入れてから、５ｍｌのＰＢＳが入っている５０ｍｌのチューブに入れた。脾臓は、５ｍｌのＰＢＳが入っている５０ｍｌのチューブに直ちに移した後、氷に保管した。５ｍｌのＦＡＣＳバッファーＡが入っている５０ｍｌのチューブに７０μｍのストレーナーを重ねて、脾臓用と骨髄用をそれぞれ準備した。ＦＡＣＳバッファーＡは、下記の表１に記載のように組成されている。
シリンジ（ｓｙｒｉｎｇｅ）棒を用いて組織を潰した後、その上に５ｍｌのＦＡＣＳバッファーＡを添加して細胞を収集した。その後、４℃、１，３００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄液を除去した。脾臓は、赤血球を除去するために３ｍｌのＡＣＫ溶解バッファー（ＡＣＫ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）で溶解した後、３分間氷で培養した。３分後に、総体積が２０μｌとなるようにＦＡＣＳバッファーＡを添加した。これをボルテックし、４℃、１，３００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄液を除去した。ペレット（Ｐｅｌｌｅｔ）の色が桃色を帯びるまで上のような過程を反復して赤血球を除去し、１０ｍｌのＦＡＣＳバッファーＡで溶解して細胞を計数した。
骨髄用７０μｍストレーナー上に大腿骨骨両側部分を切り、１０ｍｌのＦＡＣＳバッファーＡで満たされた注射器に１ｍｌ針を用いて骨穴に入れて往復しながらＦＡＣＳバッファーＡを流した後、切った組織部分にもＦＡＣＳバッファーＡを流しながら細胞を収集した。細胞収集後に、４℃、１，３００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄液を除去し、１０ｍｌのＦＡＣＳバッファーＡで溶解した後に細胞を計数した。
準備例３．２．マウスＮＫ細胞分離及び培養
前記準備例３．１で６週齢雌Ｂａｌｂ／ｃ（オリエントバイオ）マウスから分離した脾臓と骨髄から、ＮＫセル分離キット（ＮＫ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）、マウス（＃１３０－１１５－８１８）を用いてＮＫ細胞を分離した。分離後、４℃で３００×ｇで遠心分離し、上澄液を除去した。
１０７個の細胞当たり４０μｌのＭＡＣＳバッファーを添加（脾臓では６００μｌ、骨髄では２００μｌ）して細胞ペレットを懸濁し、１０７個の細胞当たり４０μｌのＮＫ細胞カクテルを添加（脾臓では１５０μｌ、骨髄では５０μｌ）した。ただし、この場合、５×１０７個以上の細胞は凝集現象を示すので、分割して混合した。その後、４℃、３００×ｇで遠心分離し、上澄液を除去した。
１０７個の細胞当たり２ｍｌの洗浄バッファーを添加（脾臓では３０ｍｌ、骨髄では１０ｍｌ）して洗浄し、４℃で３００×ｇで遠心分離し、上澄液を除去した。その後、１０７個の細胞当たり８０μｌのＭＡＣＳバッファーを追加（脾臓では１．２ｍｌ、骨髄では４００μｌ）した後に、１０７個の細胞当たり２０μｌの抗ビオチンマイクロビーズを追加（脾臓では３００μｌ、骨髄では１００μｌ）して混ぜ、冷蔵庫で１０分間培養した。
抗ビオチンマイクロビーズと混ぜた細胞５００μｌをＭＳカラムに流し、カラムを通過した上澄液を収得した。同過程を繰り返し、カラムを通過した上澄液を収得し、これを４℃、３００×ｇで遠心分離し、上澄液を除去した。ＧＣ－ＲＰＭＩ培地（１×）に懸濁して細胞を計数した（脾臓：６．９５×１０５／ｍｌ生存率５９％、骨髄：１．５８×１０６／ｍｌ生存率６４％）。ＧＣ－ＲＰＭＩ培地の組成は、下記の表２に記載の通りである。
６０ｍｍ培養容器に脾臓及び骨髄から分離したＮＫ細胞３．５×１０５個ずつ播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、ｒｍＩＬ－２を５０ｎｇ／ｍｌずつ処理して１４日間培養を行った。
ＩＩＩ．癌細胞準備及び発癌腫マウスモデル構築
準備例４．ヒト由来癌腫細胞株及びその培養培地の準備
下記表３を参照して各癌細胞株に適合する培養液を使用した。
具体的に、癌細胞株２×１０６個の細胞を各培養液８ｍＬに懸濁し、２５Ｔフラスコに培養した。細胞回収時に、付着型（ａｄｈｅｒｅｎｔ）タイプの細胞の場合、トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ，０．２５％）を１ｍＬ処理後に２分間５％ ＣＯ２で反応させた。その後、培養液５ｍＬを追加してフラスコから離れた細胞を回収し、３００×ｇに５分間遠心分離した。
下記表４に、癌細胞株に対する具体的な培養液組成物を示す。
準備例５．マウス由来癌腫細胞株及びその培養培地の準備
ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）結腸癌腫（ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞であるＣＴ２６．ＷＴを、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＵＳＡ）から購入した（表５）。実験に使用する癌腫細胞は解凍して細胞培養用フラスコに入れ、３７℃、５％ ＣＯ２培養器（ＭＣＯ－１７０Ｍ，Ｐａｎａｓｏｎｉｃ，Ｊａｐａｎ）で培養した。細胞株移植日に、培養された細胞を遠心分離チューブに入れて収集した後、１２５×ｇで５分間遠心分離し、上澄液を除去した。その後、ＰＢＳを添加して細胞浮遊液（５×１０７細胞／ｍｌ）を製造し、９匹分量で分注し後に、投与前まで氷で保管した。
癌腫細胞を培養する培地は、１００ｍｌ当たりウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ；１６０００－０４４，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１０，０００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１０，０００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン；１５１４０１２２，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）及びＲＰＭＩ １６４０（Ａ１０４９１０１，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を、下記表６のような組成で混合して使用した。
準備例６．発癌腫マウスモデルの準備
準備例６．１．実験対象マウス検疫及び順化過程
雌の１２週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス３６匹をオリエントバイオから購入した。マウスを動物実に搬入して５日間順化させた後、実験に使用した。マウス搬入時に動物の外観検査を実施し、体重を測定した。５日間の順化期間中に毎日１回一般症状を観察し、順化期間終了日には体重を測定した後に、一般症状及び体重変化を確認してマウスの健康状態を評価し、異常のあるマウスはＣＯ２ガス麻酔下で安楽死させた。
実験対象マウスの情報は、下記の表７に整理して示す。
準備例６．２．癌腫細胞株の移植
腫瘍成長抑制モデルに対しては、検疫及び順化期間終了翌日に体重を測定した後、健康な動物に対して準備したＣＴ２６細胞浮遊液（５×１０５細胞／０．１ｍｌ）を分注して、使い捨て注射器に充填してマウスの右側背部の皮下に０．１ｍｌ／ヘッドずつ投与して移植した。細胞株の移植後、生着及び成長期間において毎日１回一般症状を観察した。
準備例６．３．腫瘍成長抑制マウスモデルの群分離
ＣＴ２６細胞を移植して一定期間経過後に、健康状態に異常がないマウスに対して腫瘍の体積及び体重を測定し、各群の平均が５０ｍｍ３に到達するように群当たり９匹ずつ、総４群に群分離した。
ＩＶ．ＮＫ細胞及び融合タンパク質二量体の抗癌活性確認：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ
実施例１．様々な癌腫に対するＮＫ細胞及び／又は融合タンパク質二量体の癌細胞成長抑制効果確認
９６ウェルプレートに使用するプレートデザインを参考して０．０１％ポリ－Ｌ－オルニチン溶液（Ｃａｔ＃．Ｐ４９５７）（Ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳ）を各ウェルに５０μｌずつ分注してコーティングした。その後、常温で１時間放置した。１時間後、分注された０．０１％ポリ－Ｌ－オルニチン溶液を除去し、常温で１時間完全に乾燥させた。４×１０５細胞／ｍＬで準備された癌細胞（Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ）に２μｌのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒTM深紅色素（Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ Ｄｙｅ）（Ｃａｔ＃ Ｃ３４５６５）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を入れ、３７℃、５％ ＣＯ２条件で６０分間反応させた。
反応後、３００×ｇで５分間遠心分離した。上澄液の除去後に、４×１０５細胞／ｍＬになるようにＲＰＭＩ１６４０＋５％ｈＡＢＳ培養液に溶解した。コーティングの完了した９６ウェルプレートに、準備された癌細胞を各ウェルに５０μｌずつ分注した。その後、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ(R)ライブセル解析システム(Ｉｎｃｕｃｙｔｅ(R) Ｌｉｖｅ－Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ)（Ｓａｔｏｒｉｕｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）機器に準備されたプレートを入れた後、１０分間安定させた。ＲＰＭＩ１６４０＋５％ｈＡＢＳに、下記表８を参考して試験物質が含まれた培養液を準備した。
自然殺害細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）を４×１０５細胞／ｍＬになるようにＲＰＭＩ１６４０＋５％ｈＡＢＳ培養液に懸濁して準備した。癌細胞が分注されたプレートに準備例１～準備例２で製造された自然殺害細胞を、下記表９を参考して各ウェルに入れた後、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ(R)ＣｙｔｏＴｏｘ（２５０ｎＭ）が処理された培養液１００μｌを入れた。
その後、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ(R)ライブセル解析システムに入れて３０分間隔で３日間分析を行った。
実施例１．１．ターゲット癌細胞単独存在環境で融合タンパク質二量体の単独効能確認
前記実施例１に記載されたように、ＮＫ細胞無しでターゲット癌細胞単独存在環境（表９参照、Ｅ／Ｔ比＝０／１）で様々な癌腫別細胞株（Ｋ５６２、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨＣＴ－１１６及びＡ５４９細胞株）の単独培養時に、各試験物質ＧＩ－１０１とＣＤ８０－Ｆｃ＋Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２は癌細胞の生存能力に大きい影響を与えないことが観察された（図８～図１１）。
実施例１．２．Ｋ５６２（Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ）細胞に対するＮＫ細胞及び融合タンパク質二量体の癌細胞増殖抑制効果
白血病（Ｌｅｕｋｅｍｉａ）癌細胞株であるＫ５６２細胞株で自然殺害細胞の癌細胞殺傷能力を確認した。具体的に、ターゲット細胞（Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ，Ｔ）としてＫ５６２細胞株と、エフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ，Ｅ）として自然殺害細胞（エフェクター細胞）をそれぞれ、Ｅ／Ｔ比＝１／３、１／１、３／１及び１０／１にして共培養する時に、併用物質として試験物質であるＧＩ－１０１又はＣＤ８０－Ｆｃ＋Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２処理による癌細胞生存能力を確認した。
その結果、Ｋ５６２細胞株に対する自然殺害細胞の癌細胞殺傷の際、併用物質としてＩＬ２－Ｆｃ－ＣＤ８０融合タンパク質形態であるＧＩ－１０１の処理が、ＣＤ８０－Ｆｃ＋Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２処理に比べて癌細胞生存能力を阻害させることが観察された（図１２～図１５）。
実施例１．３．ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞に対するＮＫ細胞及び融合タンパク質二量体の癌細胞増殖抑制効果
乳癌細胞株（Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株において自然殺害細胞の癌細胞殺傷能力を確認した。具体的に、ターゲット細胞（Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ，Ｔ）としてＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株とエフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ，Ｅ）として自然殺害細胞（エフェクター細胞）をそれぞれ、Ｅ／Ｔ比＝１／３、１／１、３／１及び１０／１にして共培養する時に、併用物質として試験物質であるＧＩ－１０１又はＣＤ８０－Ｆｃ＋Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２処理による癌細胞生存能力を確認した。
その結果、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株に対する自然殺害細胞の癌細胞殺傷の際、併用物質としてＩＬ２－Ｆｃ－ＣＤ８０融合タンパク質形態であるＧＩ－１０１の処理が、ＣＤ８０－Ｆｃ＋Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２処理に比べて、癌細胞生存能力を阻害させることが観察された（図１６～図１９）。
実施例１．４．ＨＣＴ－１１６細胞に対するＮＫ細胞及び融合タンパク質二量体の癌細胞増殖抑制効果
大腸癌細胞株（Ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）であるＨＣＴ－１１６細胞株において自然殺害細胞の癌細胞殺傷能力を確認した。具体的に、ターゲット細胞（Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ，Ｔ）としてＨＣＴ－１１６細胞株とエフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ，Ｅ）として自然殺害細胞（エフェクター細胞）をそれぞれ、Ｅ／Ｔ比＝１／３、１／１、３／１及び１０／１にして共培養する時に、併用物質として試験物質であるＧＩ－１０１又はＣＤ８０－Ｆｃ＋Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２処理による癌細胞生存能力を確認した。
その結果、ＨＣＴ－１１６細胞株に対する自然殺害細胞の癌細胞殺傷の際、併用物質としてＩＬ２－Ｆｃ－ＣＤ８０融合タンパク質形態であるＧＩ－１０１の処理が、ＣＤ８０－Ｆｃ＋Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２処理に比べて癌細胞生存能力を阻害させることが観察された（図２０～図２３）。
実施例１．５．Ａ５４９細胞に対するＮＫ細胞及び融合タンパク質二量体の癌細胞増殖抑制効果
肺癌細胞株（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）であるＡ５４９細胞株において自然殺害細胞の癌細胞殺傷能力を確認した。具体的に、ターゲット細胞（Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ，Ｔ）としてＡ５４９細胞株とエフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ，Ｅ）として自然殺害細胞（エフェクター細胞）をそれぞれ、Ｅ／Ｔ比＝１／３、１／１、３／１及び１０／１にして共培養する時に、併用物質として試験物質であるＧＩ－１０１又はＣＤ８０－Ｆｃ＋Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２処理による癌細胞生存能力を確認した。
その結果、Ａ５４９細胞株に対する自然殺害細胞の癌細胞殺傷の際、併用物質としてＩＬ２－Ｆｃ－ＣＤ８０融合タンパク質形態であるＧＩ－１０１の処理が、ＣＤ８０－Ｆｃ＋Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２処理に比べて、癌細胞生存能力を阻害させることが観察された（図２４～図２７）。
Ｖ．発癌腫マウスモデルにおいてＮＫ細胞及び融合タンパク質二量体の癌細胞殺害能確認：Ｉｎ ｖｉｖｏ
実施例２．ｍＧＩ－１０１とＮＫ細胞投与
製造例４で収得したｍＧＩ－１０１は腹腔経路で、準備例３で製造したマウス由来ＮＫ細胞は静脈経路で発癌腫マウスモデルに投与したが、投与は、使い捨て注射器（３１Ｇ、１ｍＬ）を用いて投与日（腫瘍移植後６日、１０日、１３日）に１回ずつ総３回投与を行った。腫瘍成長抑制モデルに対しては、下記表１０に記載のように、４個群の投与細胞及び投与容量をそれぞれ異ならせた（図２８）。
実施例３．発癌腫マウスモデルの腫瘍体積測定
１週に２回ずつ、カリパス（Ｄｉｇｉｔａｌ ｃａｌｉｐｅｒ，ｍｉｔｕｔｏｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて腫瘍の長軸（ｍａｘｉｍｕｍ ｌｅｎｇｔｈ，Ｌ）と短軸（ｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ ｗｉｄｔｈ，Ｗ）を測定し、下記［数学式１］に代入して腫瘍の体積（ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ，ＴＶ）を計算した。
［数学式１］
ＴＶ（ｍｍ３）＝Ｗ×Ｗ×Ｌ×０．５
ＴＶ（ｍｍ３）＝Ｗ×Ｗ×Ｌ×０．５
腫瘍成長抑制率は、下記［数学式２］に代入して計算した。
［数学式２］
腫瘍成長抑制率（Ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，％）＝（１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０））×１００
腫瘍成長抑制率（Ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，％）＝（１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０））×１００
Ｔｉ＝実験群の投与前腫瘍の体積
Ｔ０＝実験群の投与後腫瘍の体積
Ｖｉ＝対照群の投与前腫瘍の体積
Ｖ０＝対照群の投与後腫瘍の体積
各個体の投与前の腫瘍の体積は、群分離時に測定された値に設定した。
Ｔ０＝実験群の投与後腫瘍の体積
Ｖｉ＝対照群の投与前腫瘍の体積
Ｖ０＝対照群の投与後腫瘍の体積
各個体の投与前の腫瘍の体積は、群分離時に測定された値に設定した。
実施例４．ＣＴ２６移植発癌腫マウスモデルにおいて腫瘍成長抑制効果確認
実施例４．１．腫瘍体積測定
健康なＢａｌｂ／ｃマウスに対して準備されたＣＴ２６大腸癌細胞浮遊液（５×１０５細胞／０．１ｍＬ）に分注し調製した溶液を使い捨て注射器に充填し、動物の右側背部の皮下に０．１ｍＬ／ヘッドずつ投与して移植した。腫瘍移植後、表１０に記載の薬物をそれぞれ投与した。その後、１０日目、１３日目及び１７日目に腫瘍のサイズを測定した。対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）に比べて、自然殺害細胞（ＮＫ ｃｅｌｌ）又はｍＧＩ－１０１単独処理群の腫瘍成長が阻害された。対照群に比べて、自然殺害細胞とｍＧＩ－１０１併用処理群の腫瘍成長が阻害された。自然殺害細胞又はｍＧＩ－１０１単独処理群に比べて、自然殺害細胞とｍＧＩ－１０１併用処理群の腫瘍成長が阻害された（図２９）。
実施例４．２．腫瘍成長抑制率分析
薬物処理１日目（腫瘍移植後、１０日目）に比べて実験終了時点（腫瘍移植後、１７日目）に腫瘍成長抑制率を計算した。対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）は、腫瘍成長抑制率３０％以上３匹、５０％以上３匹、８０％以上２匹であった。自然殺害細胞処理群は、腫瘍成長抑制率３０％以上６匹、５０％以上５匹、８０％以上２匹であった。ｍＧＩ－１０１処理群は、腫瘍成長抑制率３０％以上５匹、５０％以上５匹、８０％以上１匹であった。自然殺害細胞とｍＧＩ－１０１併用処理群は、腫瘍成長抑制率３０％以上７匹、５０％以上６匹、８０％以上３匹であった（図３０）。図３０で、黒色棒は、腫瘍成長抑制率３０％以上を示し、低い灰色棒は、腫瘍成長抑制率５０％以上を示し、濃い灰色の棒は、腫瘍成長抑制率８０％以上を示すものである。
実施例４．３．個別実験動物の腫瘍体積測定
各処理群の個別実験動物の腫瘍成長を確認した。具体的に、対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、自然殺害細胞（ＮＫ ｃｅｌｌ）、ｍＧＩ－１０１、及び自然殺害細胞＋ｍＧＩ－１０１処理群において個別実験動物の腫瘍成長を確認し、図３１に示した。図３１で、点線は腫瘍サイズ５００ｍｍ３を示し、実線は腫瘍サイズ２５０ｍｍ３を示す。
より具体的に、対照群の個別実験動物の腫瘍成長程度を確認して図３２に示し、自然殺害細胞処理群の個別実験動物の腫瘍成長程度を確認して図３３に示した。また、ｍＧＩ－１０１処理群の個別実験動物の腫瘍成長程度を確認して図３４に示し、自然殺害細胞とｍＧＩ－１０１併用処理群の個別実験動物の腫瘍成長程度を確認して図３５に示した。
Claims (12)
- 融合タンパク質を有効成分として含む、ナチュラルキラー細胞と組み合わせて癌の治療に使用するための医薬組成物であって、
前記融合タンパク質は、下記構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）からなるものであり：
Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
ここで、前記構造式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、
前記Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
前記Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
前記Ｘは、ＣＤ８０タンパク質またはその断片であり、
前記Ｙは、ＩＬ－２タンパク質の変異体であり、
前記リンカー（１）及びリンカー（２）は、ペプチドリンカーであり、
前記ｎ及びｍはそれぞれ独立に、Ｏ又は１である、
前記ＣＤ８０断片は、ＣＤ８０の細胞外ドメインを含み、そして
前記ＩＬ－２の変異体は、配列番号６、２２、２３又は２４のアミノ酸配列を含む、前記医薬組成物。 - 前記ＣＤ８０は、配列番号１１のアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記ＣＤ８０の断片は、配列番号１１のアミノ酸配列の３５番目～２４２番目のアミノ酸からなるものである、請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記リンカーは、アルブミン又は免疫グロブリンのＦｃドメインである、請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記Ｆｃドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記Ｆｃドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記リンカー（１）が配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記リンカー（２）が配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記融合タンパク質は、構造式（Ｉ）からなるものである、請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記融合タンパク質は、配列番号９、２６、２８又は３０のアミノ酸配列に対して９０％或いはそれ以上の配列同一性を有するものである、請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記融合タンパク質は、二量体であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
- 前記癌は、胃癌、肝癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、子宮頸癌、甲状腺癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、唾液腺癌及びリンパ腫からなる群から選ばれるいずれか一つである、請求項１に記載の医薬組成物。
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