KR20200030337A - 종양 치료를 위한 항-cd 19 항체 및 자연살해세포를 포함하는 약학적 조합물 - Google Patents

종양 치료를 위한 항-cd 19 항체 및 자연살해세포를 포함하는 약학적 조합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CD19에 특이적인 항체와 자연살해세포가 포함된 약학적 조합물 및 이를 이용한 치료 방법을 제공한다. 이러한 약학적 조합물은 비-호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병 및/또는 급성 림프구성 백혈병 등의 B 세포 기원 악성 종양에 대하여 상승적 치료 효과를 나타낼 수 있다.

Description

종양 치료를 위한 항-CD 19 항체 및 자연살해세포를 포함하는 약학적 조합물 {PHARMACEUTICAL COMBINATIONS FOR TREATING TUMOR COMPRISING ANTI-CD19 ANTIBODY AND NATURAL KILLER CELL}
본 발명의 일 구현예는, 비-호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및/또는 급성 림프구성 백혈병(ALL) 등의 B 세포 기원 악성 종양에 대하여 상승적 치료 효과를 갖는, 항-CD 19 항체 및 자연살해세포를 포함하는 약학적 조합물에 관한 것이다.
자연살해세포(NK cell)는 T세포와 다르게 MHC 비제한적인 방식으로 타겟을 인지하는, 선천성 면역반응에 중요한 역할을 하는 림프구계 세포로 알려져 있다. 자연살해세포는 항바이러스 및 항암 효능을 발휘할 수 있으며, 구체적으로, 악성 종양을 직접적으로 죽이거나 수지상 세포 활성 또는 종양 특이적인 세포독성 T 임파구(cytotoxic t lymphocyte, CTL)를 유도하여, 종양화되거나 종양화가 진행되는 이상 세포를 제거하는 역할을 수행한다. 또한, 자연살해세포의 항암 효능과 관련하여, 암환자 치료시 살해세포 수용체(killer cell immunoglobulin-like receptor; KIR)-리간드 쌍과 불일치하는 동종 자연살해세포를 사용하는 것이 자가 자연살해세포를 사용하는 경우보다 훨씬 효능이 있고 안전하다는 것이 입증되었다.
한편, 사람의 CD19 분자는 사람 B 세포, 예를 들어 전 B 세포, 발달 초기의 미성숙 B 세포, 성숙 B 세포 및 악성 B 세포의 표면 상에 발현되는 세포 표면 수용체이다. 실제로 B 세포 계통의 악성 종양의 대부분은 비-호지킨 림프종, 만성 림프 구성 백혈병 (CLL) 및 급성 림프 구성 백혈병 (ALL)을 포함하여 CD19를 발현한다. 그러므로, 항-CD19 항체는 CD19 항원을 표적으로 결합할 수 있으므로, 상술한 B 세포 기원 악성 종양의 치료 면역 요법에서 사용될 수 있다.
최근 여러 항암제의 발견 및 개발에도 불구하고, CD19 발현 종양을 포함하는 다수의 암 형태들은 치료 예후가 좋지 않기 때문에, 이러한 형태의 암을 치료하기 위한 개선된 방법이나 치료제에 대한 요구가 여전히 존재한다. 이에, 본 발명자들은 자연살해세포와 CD19에 특이적인 항체를 병용 투여하는 것이 B 세포 기원 악성 림프종의 치료에 상승적 효과를 갖는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Nadler et al, J. Immunol., 131 :244-250 (1983)
본 발명의 목적은 CD19에 특이적인 항체와 자연살해세포를 이용한 병용 요법 또는 이의 조합물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해,
본 발명의 일 구현예는 CD19에 특이적인 항체 및 자연살해세포(NK 세포)를 포함하는 암 치료용 약학적 조합물을 제공할 수 있다.
상기 항체는 서열번호 1(SYVMH)의 HCDR1 영역, 서열번호 2(NPYNDG)의 HCDR2 영역, 서열번호 3(GTYYYGTRVFDY)의 HCDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
상기 항체는 서열번호 4(RSSKSLQNVNGNTYLY)의 LCDR1 영역, 서열번호 5(RMSNLNS)의 LCDR2 영역, 및 서열번호 6(MQHLEYPIT)의 LCDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
상기 항체는 서열번호 1(SYVMH)의 HCDR1 영역, 서열번호 2(NPYNDG)의 HCDR2 영역, 서열번호 3(GTYYYGTRVFDY)의 HCDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열번호 4(RSSKSLQNVNGNTYLY)의 LCDR1 영역, 서열번호 5(RMSNLNS)의 LCDR2 영역, 및 서열번호 6(MQHLEYPIT)의 LCDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
상기 항체는 서열번호 8 (EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWGQGTLVTVSS)의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9 (DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIK)의 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
상기 항체는 서열번호 10 (ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)의 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
상기 항체는 서열번호 11 (RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC)의 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
상기 NK 세포는 (i) 항-CD3 항체, 사이토카인 및 지지세포를 포함하는 배양액 중에서 NK 세포를 정치배양하여 세포간 접촉을 자극하는 단계, (ii) 사이토카인, 항-CD3 항체 및 지지세포를 첨가하여 재자극하고 다시 정치배양하여 세포간 접촉을 유도하는 단계 및 (iii) 사이토카인을 포함하는 배지를 세포에 추가하고, 세포 농도 및 사이토카인 농도를 일정하게 유지하면서 정치 또는 부유 배양하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
상기 NK 세포는 지지세포(feeder cell)로서 체외로 분리된 CD4(+) T 세포 또는 체외 확장 배양된 CD4(+) T 세포와 원료세포(seed cell)를 공배양하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
상기 CD4(+) T 세포는 CD4(+)/CD1(-) T 세포주일 수 있다.
상기 CD4(+)/CD1(-) T 세포주는 H9 또는 HuT78 세포주일 수 있다.
상기 원료세포는 말초혈액 유래 세포, 말초혈 백혈구 세포, PBMC(말초혈 단핵구 세포), 제대혈 백혈구 세포, 제대혈 단핵 세포, 줄기세포로부터 유래된 자연살해세포, 농축된(enriched) 자연살해세포 및 분리된 자연살해세포로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 약학적 조합물은 알부민을 더 포함할 수 있다.
상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 림프구성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있다.
상기 림프종은 B 세포 기원 악성 종양일 수 있다.
상기 B 세포 기원 악성 종양은 비-호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병 및 급성 림프구성 백혈병으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있다.
상기 CD19에 특이적인 항체 및 NK 세포는 별도로 투여될 수 있다.
상기 CD19에 특이적인 항체 및 NK 세포는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는, 전술한 조합물을 포함하는 암 치료용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예는, 암 치료용 약제를 제조하기 위하여, 전술한 약학적 조합물의 용도를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 구현예는, 전술한 CD19에 특이적인 항체와 전술한 NK 세포를 개체에 병용 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른, CD19에 특이적인 항체와 자연살해세포를 포함하는 약학적 조합물은 암, 특히 비-호지킨 림프종, 만성 림프구 백혈병 및/또는 급성 림프구 백혈병과 같은 B 세포 악성 종양의 치료에 유용하다. 특히, 상기 자연살해세포는 기존 방법에 비해 임상 친화적인 방법으로 생산되어 높은 세포살상능, 세포생존율 및 장기 보관성을 갖는 것으로, 특정 CD19에 특이적인 항체와 병용 투여시 종양 치료에 상승적 효과를 나타낼 수 있다.
도 1a 내지 도 1d는 NK 세포 존재 하에서 라지(Raji) 및 라모스(Ramos) 버킷 B-세포 림프종을 여러 농도의 단일클론항체와 배양한 결과이다.
도 2는 SCID 마우스 모델에서 라모스 세포주의 적합성을 평가한 결과이다.
도 3은 라모스 세포가 정맥주사된 SCID 마우스 모델 군에서 MOR208을 농도 별로 투여한 결과이다.
도 4는 라모스 세포가 정맥주사된 SCID 마우스 모델 군에서 MG4101을 농도 별로 투여한 결과이다.
도 5는 라모스 세포가 정맥주사된 SCID 마우스 모델 군에서 대조군, MOR208, MG4101 및 "MOR208/MG4101"을 투여한 결과이다.
자연살해세포가 다양한 질환의 치료제로서 적용될 수 있는 가능성에도 불구하고, 말초혈액에서 다소 한정적인 자연살해세포 수, 의약품 품질 관리 기준(good manufacturing practice; GMP) 준수 세포용해 자연살해세포의 대규모 생산과 관련된 어려움, 자연살해세포 매개 살상을 유도하기 위해서는 자연살해세포를 활성화시켜야 하는 점 등 여러 가지 한계점 때문에 접근이 쉽지 않은 실정이었다.
최근 본원 발명자들은 GMP 조건 하에서, 건강한 공여자로부터의 자연살해세포의 대규모 증식 및 활성화를 위한 간단하고 효율적인 방법을 확립한 바 있다(KR10-1644984 B1). 또한 제대혈의 단핵세포에서 NK 세포를 대량 배양하는 방법을 통해 체외에서 증식되고 고도로 활성화된 자연살해세포는 GMP 조건 하에서 생산되어, 전임상 연구에서 in vitro 및 in vivo에서 강력한 항암 활성을 나타냈다.
한편, 암 세포에서 발현되는 에피토프 분자에 특이적인 단일클론 항체를 적용한 치료법은 현재까지 가장 성공적인 암 면역 요법으로 알려져 있다. 이들의 작용 메카니즘 중 하나는 자연살해세포 매개 항체 의존성 세포 독성(antibody dependent cellular cytotoxicity; ADCC)이다. 본 발명의 일 구현예에 따라 증식된 자연살해세포는 ADCC를 매개하는 Fc 수용체인 CD16을 높은 수준으로 발현했으므로, 본원 발명자들은 B 세포 림프종에 대한 항암 활성이 항-CD19 항체의 존재 하에서 향상될 수 있는지를 확인하고자 하였다.
놀랍게도, 본 발명자들은 CD19에 특이적인 특정 항체와 자연살해세포를 병용 투여하는 경우, 상기 항체 또는 자연살해세포 단독과 비교하여 in vitro 및 in vivo에서 ADCC를 통한 인간 B 세포 악성 종양의 직접 사멸에 상승적 효과를 나타내는 것을 발견하였다.
본 발명의 일 측면은, CD19에 특이적인 항체 및 자연살해세포를 포함하는 암 치료용 약학적 조합물을 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "CD19"는 다음 동의어를 갖는 CD19로 알려진 단백질을 말한다: B4, B-림프구 항원 CD19, B-림프구 표면 항원 B4, CVID3, 분화 항원 CD19, MGC12802, 및 T-세포 표면 항원 Leu-12. 상기 CD19는 인간 유래의 CD19일 수 있으며, 인간 CD19는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CD19는 대부분의 B 세포 악성종양을 비롯한, 다양한 질병과 병태의 세포 및 조직에 의해, 그리고 정상적인 B 세포 상에서 발현된다.
또한, 본원에서 사용된 용어 "항체"는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE와 같은 임의의 동형(isotype)을 포함하는 단클론 항체를 의미한다. IgG 항체는 이황화 결합에 의해 연결되는 2 개의 동일한 중쇄 및 2 개의 동일한 경쇄로 구성된다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 각각의 가변 영역은, 일차적으로 항원의 에피토프 결합을 담당하는 "상보성-결정 영역"("CDR") 또는 "초가변 영역"으로 불리는 3개의 분절을 포함한다. 이들은 N-말단으로부터 순차적으로 넘버링하여 CDR1, CDR2, 및 CDR3로 호칭된다. CDR의 외부에서 가변 영역의 더 고도로 보존된 부분은 "프레임워크 영역"으로 불린다.
즉, CD19에 특이적인 항체인 항-CD19 항체는, CD19 항원에 특이적으로 결합하는 항체로서, 완전한 항체 형태뿐만 아니라, 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 CD19에 특이적인 항체는 예를 들어, US 12/377,251 (Xencor); WO 2005/012493, WO 2010/053716 (lmmunomedics); WO 2007/002223 (Medarex); WO 2008/022152 (Xencor); WO 2008/031056 (Medimmune); WO 2007/076950 (Merck Patent GmbH); WO 2009/052431 (Seattle Genetics); 및 WO 2010/095031 (Glenmark Pharmaceuticals)에 기술된 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 CD19에 특이적인 항체는, 서열번호 1(SYVMH)의 HCDR1 영역, 서열번호 2(NPYNDG)의 HCDR2 영역, 서열번호 3 (GTYYYGTRVFDY)의 HCDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 아울러, 본 발명의 CD19에 특이적인 항체는 서열번호 4(RSSKSLQNVNGNTYLY)의 LCDR1 영역, 서열번호 5(RMSNLNS)의 LCDR2 영역, 및 서열번호 6(MQHLEYPIT)의 LCDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 따른 CD19에 특이적인 항체는, 전술한 본 발명의 항체와 교차-경쟁하는 항체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "교차 경쟁"은, 표준 경쟁 결합 분석에서 항체 또는 다른 결합 물질이 CD19에 대한 다른 항체 또는 결합 물질의 결합을 방해하는 능력을 의미한다. 항체 또는 다른 결합 물질이 CD19에 대한 다른 항체 또는 결합 물질의 결합을 방해할 수 있는 능력 또는 정도, 그리고, 이에 따라 본 발명에 따른 교차-경쟁으로 말할 수 있는지 여부는 표준 경쟁 결합 분석을 사용하여 결정할 수 있다.
아울러, 본 발명의 또 다른 구체예에 따른 CD19에 특이적인 항체는, 전술한 본 발명의 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
또한, 상기 항체는 서열번호 8 (EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWGQGTLVTVSS)의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9 (DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIK)의 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항체는 서열번호 10 (ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)의 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항체는 서열번호 11 (RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC)의 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 상기 항-CD19 항체는 "MOR208"이다. MOR208 항체는 US 특허 출원번호 제12/377,251호에 개시된 것일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "자연살해세포(Natural Killer Cell, 이하 'NK 세포'라 한다)"는 체내 면역 시스템에 중요한 역할을 하는 세포독성 림프구(cytotoxic lymphocyte)를 의미한다. 본 발명의 목적상 NK 세포는 개체의 내재적인 NK 세포 및/또는 외래의 NK 세포일 수 있으며, 구체적으로 개체 외부에서 투여되는 분리된 NK 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, NK 세포는 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나, 개체로부터 분리하거나, 배양하는 등의 통상적인 방법에 따라 얻을 수 있다.
한편, 본 발명의 일 구현예에 따른 약학적 조합물에 포함되는 NK 세포는, T 세포가 제거된 단핵구 세포를 사이토카인을 포함하는 배지에서 항-CD3 항체와 지지세포를 이용하여 자극한 후 수일 동안 정치배양하여 세포간 접촉을 자극하고, 세포 농도 및 사이토카인 농도를 일정하게 유지하면서 NK 세포를 반응기에서 정치 또는 부유배양하여 제조된 것일 수 있다.
증가된 함량의 NK 세포를 수득하기 위하여, 이후의 정치 또는 부유 배양 전에 자극 및 정치배양을 반복할 수 있다. 본 발명에 따른 방법으로 제조된 NK 세포는 높은 세포 생존율과 세포살상능을 나타내면서도 고효율 및 고농도로 체외배양이 가능하기 때문에, 상기 항-CD19 항체와 병용 투여되어 B 세포 기원 악성 종양을 치료할 수 있다.
상기 NK 세포는, 일 예시로서 아래 (i) 내지 (iii) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것일 수 있다.
(i) 항-CD3 항체, 사이토카인 및 지지세포를 포함하는 배양액 중에서 분리된 NK 세포를 정치 배양하여 세포간 접촉을 자극하는 단계;
(ii) 사이토카인, 항-CD3 항체 및 지지세포를 첨가하여 재자극하고 다시 정치배양하여 세포간 접촉을 유도하는 단계; 및
(iii) 사이토카인을 포함하는 배지를 세포에 추가하고, 세포 농도 및 사이토카인 농도를 일정하게 유지하면서 정치 또는 부유 배양하는 단계.
이때, 상기 분리된 NK 세포는 인간 말초혈액 또는 제대혈으로부터 백혈구 세포 및 NK 세포를 분리하여 얻은 것일 수 있다.
이때, 최초 자극 후의 정치배양은 약 2~15일, 구체적으로는 5~10일간 이루어질 수 있으며, 재자극 후의 정치배양은 약 2~7일, 구체적으로는 3~5일 이루어질 수 있다. 또한, 정치배양이 완료된 후 배양기에서는 사이토카인의 농도를 일정하게 유지하면서 정치 또는 부유 배양할 수 있다. 또한, NK 세포 제조시 이를 포함하는 조성물에 알부민을 첨가함에 따라, NK 세포의 세포살상능 및 세포생존율이 크게 제고될 수 있다. 구체적으로, 전술한 방법으로 제조된 NK 세포는 "MG4101"로 표기될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따른 상기 NK 세포의 제조방법 및 해당 NK 세포와 관련하여서는 한국 등록특허 10-1644984에 기술된 것일 수 있다.
본원에서 사용한 용어 "지지세포(feeder cell, 배양보조세포라고도 한다)"는 분열증식하는 능력은 없지만 대사활성이 있기 때문에 여러 가지 대사물질을 생산하여 목적 NK 세포의 증식을 돕는 세포를 의미한다. 사용될 수 있는 지지세포로는 유전자가 도입된 동물 세포주(cell line)나 각종 사이토카인이나 화합물이 처리된 말초혈 백혈구 세포(PBL), 자기 또는 타인의 말초혈 백혈구 세포(PBL), T-세포, B-세포(B-cell), 또는 단핵구(monocyte) 등이 있으며, 구체적으로는 자기 말초혈 단핵구 세포가 사용될 수 있지만, 이에 한정되는 것 아니다.
또한, 상기 지지세포로 이용되는 자기 말초혈 단핵구 세포는 불활성화시켜 사용함으로써 안전성을 확보할 수 있다. 불활성화시키는 방법으로는 당업계에 공지된 통상의 방법이 사용될 수 있으며, 예를 들어 감마선(gamma-ray)을 조사하는 방법이 사용될 수 있다. 이와 같이 불활성화된 지지세포는 분리된 T-세포를 포함한다. 이와 같이 지지 세포를 사용하는 증식 방법은 NK 세포를 순수 분리한 후 증식시키는 방법으로, 이후에도 계속 순수 NK 세포만 증식하게 된다는 장점이 있다.
본원에서 사용한 용어 "항-CD3 항체"란, T 세포 수용체(TCR)과 결합하여 항원인식복합체를 형성하는 분자군인 CD3 항원에 특이적으로 결합하는 항체로, CD3 분자는 TCR과 결합하여 항원인식신호를 세포 내에 전달하는 역할을 담당한다. 본 발명에서 사용가능한 항-CD3 항체는 CD3에 결합하는 특성을 가지는 항체라면 제한 없이 이용가능하며, 예를 들어 OKT3, UCHT1 및 HIT3a로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 배지에 포함될 수 있는 사이토카인은 인터루킨 류에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 예를 들어, 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-18(IL-18) 및 인터루킨-21(IL-21)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 정치배양 및 부유배양을 위해 사용되는 항-CD3 항체의 배지 내 농도는 0.1 내지 1,000 ng/ml, 1 내지 100 ng/ml, 또는 5 내지 20 ng/ml일 수 있으며, 사이토카인의 배지 내 농도는 10 내지 2,000 IU, 100 내지 1,000 IU, 또는 약 200 내지 700 IU일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "자극"이란 지지세포 등을 첨가하여 NK 세포의 증식을 유도하는 것을 의미하며, 항-CD3 항체가 함께 사용될 수도 있다. 또한, 본원에서 사용된 용어 "재자극"은 일정 배양 시간이 경과한 후, 배지에 지지세포 및/또는 항-CD3 항체를 다시 첨가하여 NK 세포 증식을 재유도하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 NK 세포의 제조를 위한 배지로는 CellGro 배지(Cellgenix), AIM-V 배지, RPMI1640 배지, X-VIVO 20과 같은 통상의 동물세포 배양용 배지가 사용될 수 있다. 이러한 동물세포 배양용 배지에 필요에 따라 인간 말초혈로부터 분리한 NK 세포, 말초혈 단핵구 세포, 항-CD3 항체 및 인터루킨에서 선택된 하나 이상의 성분이 첨가되어 사용될 수 있다.
특히, 상기 NK 세포 제조 방법에 있어, 부유배양시 세포 농도 및 사이토카인의 농도를 일정하게 유지하기 위하여, 일정 시간 간격으로 배지 내의 사이토카인 및 세포 농도를 측정하고 그 측정값에 따라 사이토카인이 포함된 배지를 세포 농도 및 사이토카인 농도에 맞추어 제공할 수 있다.
또한, 상기 배지에 혈청 또는 혈장과 림프구의 증식을 지지하는 추가의 증식인자를 첨가하여 배양할 수도 있다. 배지에 첨가하는 혈청 또는 혈장의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 시판되는 각종 동물 유래의 것을 사용할 수 있지만, 인간유래로서 본인 유래의 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 말초혈 단핵구 세포로부터 림프구를 증식시키는 사이토카인의 조합이나, 림프구 증식을 자극하는 렉틴류 등을 첨가하는 등의 방법을 사용할 수 있다.
특히, 본 발명의 방법에 의해 제조된 NK 세포를 포함하는 조성물에 알부민을 첨가함에 따라 NK 세포의 장기 보존 안정성 측면에서 세포살상능 및 세포생존율이 크게 제고될 수 있었다. 첨가되는 알부민의 양은 별다른 제한은 없으나, 구체적으로는 전체 조성물 내에서 0.1 내지 5 중량%의 범위로 포함될 수 있으며, 더욱 구체적으로는 0.5 내지 2 중량% 범위로 포함될 수 있다.
또한, NK 세포의 제조를 위해 세포 농도를 일정하게 유지시켜 주는 배양방법을 적용시킴으로써 세포의 과잉 성장(over growth)을 방지할 수 있어 세포가 최적의 상태를 유지할 수 있다. 특히, 동결 후 다시 해동할 경우에도 세포의 기능이 손상되지 않고 높은 세포생존율과 세포살상능을 유지할 수 있다. 따라서, 추가적인 처리과정 없이도 액상 또는 동결 보관된 형태로 보관 및 공급이 용이하다는 장점이 있다.
다른 한편, 본 발명에서 이용되는 NK 세포는, 일 예시로서 지지세포(feeder cell)로서 체외로 분리된 CD4(+) T 세포 또는 체외 확장 배양된 CD4(+) T 세포와 원료세포(seed cell)를 공배양하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것일 수 있다.
구체적으로는, 본 발명에서 사용되는 CD4(+) T 세포는 CD4(+)/CD1(-) T 세포주일 수 있으며, 보다 구체적으로는 H9 또는 HuT78 세포주일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "원료세포"는 목적세포를 수득하기 위한 출발물질로서의 세포를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 원료세포는 말초혈액, 말초혈 백혈구 세포, PBMC(말초혈 단핵구 세포), 제대혈 백혈구 세포, 제대혈 단핵 세포, 줄기세포로부터 유래된 자연살해세포, 농축된(enriched) 자연살해세포 및 분리된 자연살해세포로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따른 상기 NK 세포의 제조방법 및 해당 NK 세포와 관련하여서는 한국 등록특허 10-1697473 또는 10-1799986에 기술된 것일 수 있다.
이러한 NK 세포의 제조방법은 소량의 원료세포로부터 NK 세포만 선택적으로 대량 증식시킬 수 있을 뿐 아니라 높은 살해능을 유지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에 따른 약학적 조합물은, 이러한 방법으로 제조됨으로써 높은 세포생존율과 세포살상능을 갖는 NK 세포와 특정 항 CD 19 항체를 포함함으로써, 암 치료 효과가 매우 우수하다.
또한, 본원에서 사용된 용어, "조합물"은 하나 보다 많은 유효성분, 예를 들어 항체 및 자연살해세포와 같은 유효성분이 조합된 조성물을 의미한다. 본 발명의 조합물 내에 포함된 각 유효성분은 대상체에 동시에 투여될 수도 있고 시간차를 두고 개별적으로 투여될 수도 있다. 따라서, 각 유효성분은 투여시점에 반드시 하나의 조합물로 존재할 필요는 없다. 본원발명에 따른 조합물은, 조합(combination), 약제, 및 약제학적 조성물과 관련된다.
본 발명의 조합물은 함께 투여되어 두 유효성분이 대상체 내에서 동시에 활성을 가질 수 있다. 본 발명의 조합물이 상승적 작용을 보인다는 점에서 두 유효성분이 대상체 내에서 동시에 활성을 가짐을 알 수 있다.
상기 약학적 조합물은 고형암(solid cancer) 및 혈액암을 포함한 모든 종류의 종양에 적용이 가능하다. 고형암이란 혈액암과는 달리 장기(organ)에서 덩어리를 이루어 형성된 암을 의미하며, 대부분의 장기에서 발생하는 암이 이에 해당된다. 본 발명에 따른 약학적 조합물을 이용하여 치료가능한 종양은 특별한 제한은 없다. 예를 들어, 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 질환에 상승적 치료 효과를 가질 수 있다.
본원에서 사용된 용어, "상승(synergy)", "상승 효과", "상승 작용"은, 조합으로 인해 예상되는 조합물의 상가적 효과를 넘는 것을 의미한다.
또한, 상기 림프종은 구체적으로, B 세포 기원 악성 종양 일 수 있으며, 상기 B 세포 기원 악성 종양은 비-호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병 및 급성 림프구성 백혈병으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있다.
상기 비-호지킨 림프종은 여포성 림프종, 소형 림프구 림프종, 점막-관련 림프 조직, 변연부, 산재성 대형 B 세포, 버킷(Burkitt) 및 맨틀 세포로 구성되는 군으로부터 선택된 림프종일 수 있다.
본 발명의 상승적 조합의 두 성분, 예를 들어 CD19에 특이적인 항체 및 NK 세포는 물리적으로 또는 시간 상으로 함께, 동시에, 별개로 또는 이어서 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "투여되는" 또는 "투여"는 주사가능한 형태, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피내 또는 피하 경로, 또는 예를 들어, 흡입용 비강 스프레이 또는 에어로졸로서 또는 섭취가능한 용액, 캡슐 또는 정제로서의 점막 경로에 의한 전달을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 또한, 상기 약학적 조합물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
예를 들어, NK 세포는 CD19에 특이적인 항체, 일 예시로, MOR208의 투여 전 및/또는 이와 별개로 투여될 수 있다. 상기 두 가지 성분이 함께 투여되는 경우, 약제학적 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있는 하나의 약제학적 조성물과 함께 제형화될 수 있다. 대안적으로, 2가지 성분은 또한 상이한 약제학적 조성물 중에 제형화될 수 있다. 이러한 경우에, 2가지 성분은 동시에 또는 따로 투여될 수 있다. 구체적으로는, 상기 CD19에 특이적인 항체 및 NK 세포가 투여된 경우 투여된 환자의 체내에서 동시에 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, MOR208이 매주 투여되고 NK 세포가 매일 투여된다면, 두 약물의 활성 성분은 환자에서 동시에 존재한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은, 전술한 조합물을 포함하는 암 치료용 키트를 제공한다. 상기 키트는 그 종류가 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 형태의 키트를 사용할 수 있다.
상기 키트는 전술한 CD19에 특이적인 항체 및 NK 세포가 각각 개별 용기에 담긴 형태, 또는 하나 이상의 구획으로 나누어진 한 개의 용기 내에 담긴 형태로 포장되어 있을 수 있으며, 상기 CD19에 특이적인 항체 및 NK 세포는 각각 1회 투여 용량의 단위 용량 형태로 포장되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 키트 내의 CD19에 특이적인 항체 및 NK 세포는 투여 대상 개체의 건강 상태 등에 따라 적절한 시기에 개별적으로 병용 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암 치료용 약제를 제조하기 위한 전술한 약학적 조합물의 용도를 제공한다. 또한, 암 질환 및 그러한 병태를 치료하기 위한 전술한 약학적 조합물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은, (a) NK 세포를 준비하는 단계, (b) 서열번호 1(SYVMH)의 HCDR1 영역, 서열번호 2(NPYNDG)의 HCDR2 영역, 서열번호 3 (GTYYYGTRVFDY)의 HCDR3 영역, 서열번호 4(RSSKSLQNVNGNTYLY)의 LCDR1 영역, 서열번호 5(RMSNLNS)의 LCDR2 영역, 및 서열번호 6(MQHLEYPIT)의 LCDR3 영역을 포함하는 CD19에 특이적인 항체를 준비하는 단계 및 (c) 상기 CD19에 특이적인 항체와 NK 세포의 치료적 유효량을 개체에 병용 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.
본원에서 사용하는 용어 "개체"란, 본 발명의 일 구현예에 따라 CD19에 특이적인 항체 및 NK 세포를 투여하여 암 질환이 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태이거나 질환을 앓고 있는 인간을 포함하는 포유동물을 의미한다. 또한, 상기 개체 인간이 아닌 동물일 수 있으며, "인간이 아닌 동물"이라는 용어는 모든 척추동물, 예컨대, 인간이 아닌 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등과 같은 포유동물 및 비포유동물을 포함한다.
(a) NK 세포를 준비하는 단계, (b) CD19에 특이적인 항체를 준비하는 단계 및 (c) 상기 CD19에 특이적인 항체와 NK 세포의 치료적 유효량을 개체에 병용 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공할 수 있다.
상기 (a) NK 세포를 준비하는 단계 및 상기 (b)의 CD19에 특이적인 항체에 관해서는 이미 상술하였으므로 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
상기 (c) 투여하는 단계는 CD19에 특이적인 항체와 NK 세포를 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여할 수 있다.
또한, 상기 CD19에 특이적인 항체 및 NK 세포의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다.
상기 CD19에 특이적인 항체 및 NK 세포는 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양 내(intratumoral), 복강내(intraperitoneal), 피하(sub-cutaneous), 피내(intra-dermal), 림프절내(intra-nodal) 및 정맥 내(intra-venous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 구체적으로는, 상기 CD19에 특이적인 항체 및 NK 세포는 종양 내 투여, 복강 투여 또는 정맥 투여될 수 있다. 한편, CD19에 특이적인 항체 및 NK 세포의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다.
또한, 상기 NK 세포는 2회 내지 5회 투여할 수 있으며, 1일 내지 30일, 2일 내지 15일 또는 3일 내지 10일 간격으로 개체에 투여할 수 있다.
상기 CD19에 특이적인 항체는 NK 세포 투여 후 2 내지 48시간 이내에 투여할 수 있다. 구체적으로, 상기 CD19에 특이적인 항체는 NK 세포 투여 3 내지 5일 전 사이, NK 세포 투여 후 2시간 후부터 1일 1회, 9 내지 11일 동안 연속으로 투여할 수 있다. 상기 병용 투여로 인해 상승적 치료 효과를 갖는 대상 질환인 암과 관련된 내용은 약학적 조합물에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 측면은, 본 발명 자연살해세포와 조합되어 사용되는 본 발명의 CD19에 특이적인 항체의 암 치료용 의약의 생산을 위한 용도를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 CD19에 특이적인 항체 및 자연살해세포와 이들의 투여 방법 등은 이미 상술하였으므로 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 여기에서 우리는 항-CD19 항체와 자연살해세포의 병용 투여의 상승 효과를 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
항체 서열번호 아미노산 서열
MOR208
　
　
　
　
　		 HCDR1 1 SYVMH
HCDR2 2 NPYNDG
HCDR3 3 GTYYYGTRVFDY
LCDR1 4 RSSKSLQNVNGNTYLY
LCDR2 5 RMSNLNS
LCDR3 6 MQHLEYPIT
VH 8 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWGQGTLVTVSS
VL 9 DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIK
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불변영역		 10 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
경쇄불변영역 11 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CD19 인간 CD19 7 MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKRKRMTDPTRRFFKVTPPPGSGPQNQYGNVLSLPTPTSGLGRAQRWAAGLGGTAPSYGNPSSDVQADGALGSRSPPGVGPEEEEGEGYEEPDSEEDSEFYENDSNLGQDQLSQDGSGYENPEDEPLGPEDEDSFSNAESYENEDEELTQPVARTMDFLSPHGSAWDPSREATSLGSQSYEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSYENMDNPDGPDPAWGGGGRMGTWSTR
준비예 1. 세포주, 일차 세포 및 배양 조건
라지와 라모스(인간 Burkitt 림프종 세포주) 세포주는 American Type Culture collection (ATCC, USA)에서 얻었다. 라지 및 라모스 세포주를 10% 태아 소 혈청 (FBS), 2 mmol/L 글루타민을 첨가한 RPMI 1640 배지에서 유지시켰다. NK 세포는, 무작위 건강한 공여자로부터 PBMC(말초혈단핵구세포)를 분리하고 NK 세포를 GMP 조건(Good Manufacturing Practice, 제조품질관리기준)하에 전술한 방법대로 확장 배양하였다(MG4101, 녹십자 랩셀). 간단히 말하자면, CD3+ T 세포가 거의 제거된 PBMC를 1 % 자기혈장, 5X106 cells/mL의 방사선(2,000 rad)이 조사된 자가 유래 PBMC, 10 ng/mL의 CD3 (OKT3, eBioscience)에 대한 단일 클론 항체 및 500 IU/mL의 IL2 (Proleukin)이 포함된 CellGro SCGM 무혈청 배지 (Cellgenix)에서 확장 배양하였다. 상기 NK 세포가 배양되는 동안 2 ~ 3일 마다 500 IU/mL의 IL2를 신선한 배지에 공급하였다.
준비예 2. 단일클론 항체
CD19에 특이적인 항체인 MOR208은 MorphoSys Pharmaceuticals(Germany)로부터 구입 하였다. 리툭시맵(Rituximab)은 Roche에서 구입했다. 세포 당 MOR208 및 리툭시맵 결합 부위의 수는 제조사의 지시에 따라 유동 세포 계측법(Quantibrite kit, BD Biosciences)에 의해 측정하였다. 라지 및 라모스 세포주 당 MOR208 결합 부위의 수는 각각 56702 및 27772이다. 라지 및 라모스의 세포주 당 리툭시맵 결합 부위의 수는 각각 59974와 168253이다.
준비예 3. 칼세인 방출 세포독성 분석법
표적 세포를 37℃에서 1 시간 동안 30 uM Calcein-acetoxymethyl ester (Calcein-AM; Molecular probes)로 표지하였다. 세척 후, 표지된 표적 세포를 1 웰당 1 x 104 세포로 96-웰 플레이트에 분배시켰다. 단일클론항체(rituximab, MOR208 또는 대조 무관 항체)를 표적 세포에 첨가하였다(0.001 ng/mL 내지 10 ug/mL 사이의 농도). MG4101을 수득하고, 세척하고, 표적 세포에 3 : 1 (E / T) 비율로 첨가하였다. 2 시간 후, 플레이트를 2000rpm, 3분 동안 회전시키고, 상층액 100 uL를 수득한 후, 형광 마이크로 플레이트 리더기 (Victor3, Perkin Elmer)를 사용하여 형광값(OD480/535 nm) 측정하여 칼세인 방출량을 결정하였다. 특정 칼세인 방출량은 다음 공식을 사용하여 계산되었다:
특정 용해 % = (시험 방출 - 자연 방출) Х 100/(최대 방출 - 자발 방출)
최대 용해는 1 % Triton X-100으로 이루어졌다.
준비예 4. 마우스 종양 모델
준비예 4.1. SCID 마우스에서 라모스 이종이식 모델의 수립
라모스 세포(마우스 당 1 X 105, 5 X 105 또는 10 X 105)를 PBS에 현탁시키고 SCID 마우스에 정맥주사하였다. 질병, 뒷다리 마비 또는 사망의 징후가 있는지 동물들을 매일 모니터링 하였다.
준비예 4.2. 라모스 이종이식 모델에서 MOR208 용량 테스트
라모스 세포(마우스 당 1 X 106)를 PBS에 현탁시키고 SCID 마우스에 정맥주사하였다(0일째). 3일, 6일, 10일, 13일, 17일 및 20일에 다양한 농도(20, 60 또는 200 ug/100 uL/head)로 MOR208을 정맥주사로 투여하였다. 질병, 뒷다리 마비 또는 사망의 징후가 있는지 동물들을 매일 모니터링 하였다.
준비예 4.3. 라모스 이종이식 모델에서 MG4101 용량 테스트
라모스 세포(마우스 당 1 X 106)를 PBS에 현탁시키고 SCID 마우스에 정맥주사하였다(0일째). 4일, 7일, 11일, 14일, 18일, 및 21일에 다양한 농도(1, 2, 5 x 107/400 uL/head)로 MG4101를 정맥주사로 투여하였다. 질병, 뒷다리 마비 또는 사망의 징후가 있는지 동물들을 매일 모니터링 하였다.
준비예 4.4. 라모스 이종이식 모델에서 MG4101 + MOR208 효능 테스트
라모스 세포(마우스 당 1 X 106)를 PBS에 현탁시키고 SCID 마우스에 정맥주사하였다(0일째). 마우스를 6개의 그룹으로 분류하여 다음과 같이 조정하였다:
i) 동결 배지 및 hIgG (200ug) 정맥주사
ii) MG4101 (2x107/400 uL/head) 정맥주사
iii) MOR208 (60 ug/head) 정맥주사
iv) MOR208 (200 ug/head) 정맥주사
v) MG4101 (2x107/400 uL/head) 정맥주사 및 MOR208 (60 ug/head) 정맥주사
vi) MG4101 (2x107/400 uL/head) 정맥주사 및 MOR208 (200 ug/head) 정맥주사.
이 투여는 주 2회, 3주 동안 hIgG 또는 MOR208를 다양한 농도(60, 또는 200 ug /100 uL/head)로, 3일, 6일, 10일, 13일, 17일, 및 20일에 정맥주사되었다.
MG4101 (2x107/400 uL/head의 농도)의 정맥주사는 4일, 7일, 11일, 14일, 18일 및 21일에 수행되었다. 질병, 뒷다리 마비 또는 사망의 징후가 있는지 동물들을 매일 모니터링 하였다.
실험예 1. 악성 B 세포에 대한 MOR208의 강한 in vitro ADCC 활성 확인
NK 세포 매개 ADCC가 단일클론항체의 활성에 매우 중요하기 때문에, 본 발명자들은 먼저 림프종 치료를 위한 표준 단일클론항체로서 본 발명에서 양성 대조군 및 기준값으로 사용된 리툭시맵과 비교하여 버킷 림프종 세포주인 라지 및 라모스에서 MOR208(항-CD19 항체)과 MG4101(NK 세포)의 ADCC 활성을 결정하였다.
먼저, 3 명의 건강한 기증자로부터 얻어진 활성화되고 확장된 액상형 및 동결형의 MG4101의 존재 아래, 라지 및 라모스 세포주(Burkitt 's lymphomas, CD19 + CD20 +)를 MOR208 또는 리툭시맵의 농도를 증가시키면서 2 시간 동안 배양하였다(E/T 비율: 3).
특정 ADCC (%)는 다음과 같은 공식에 의해 계산되었고, 그 결과를 도 1 에 나타내었다(그래프는 2명의 상이한 공여자의 하나의 NK 세포 공여자 대표로부터 수득한 3 실험값의 평균 ADCC (%) ± SD를 나타냄).
(샘플 방출 - 자발 방출) / (최대 방출 - 자발 방출) x100.
도 1a 내지 도 1d 에 도시된 바와 같이, MOR208은 라지 및 라모스 세포주에 대하여 현저한 in vitro ADCC 활성을 나타내었다. hIgG 공동 처리 대조군과 비교하여, MOR208 및 리툭시맵 모두 곡선이 좌측 이동되고 및 최대 용해가 증가된바, 최고 수준의 ADCC를 매개하였다. MOR208 및 리툭시맵이 CD19에 비해 CD20에 실질적으로 높은 수준일 뿐만 아니라 비교가능한 최대 살생 효능을 나타내는 것을 고려하면, 저용량에서 더 우수한 ADCC 활성을 나타내는 라모스 세포주와, 라지 세포주를 포함하는 다양한 악성 B 세포에 대하여, MOR208는 리툭시맵과 비교하여 전반적으로 낮은 EC50을 갖는 것이 증명되었다. 이는 MOR208이 리툭시맵이 효과가 좋지 않은 조건에서 흥미로운 대체 치료제일 수 있음을 교시한다.
실험예 2. 이종이식 SCID 마우스에서 MOR208의 림프종 세포 사멸 효과
실험예 2.1. SCID 마우스 모델에서 라모스 이종이식 모델의 수립
MOR208 in vivo 실험과 관련하여, 라모스 세포주의 적합성을 평가하기 위해 라모스 세포를 사용하여 이종이식(xenograft) SCID 마우스 모델을 확립했다. 6 마리의 SCID 마우스 그룹에 1 X 105, 5 X 105, 10 X 105 라모스 세포를 정맥주사하고, 매일 질병의 징후를 모니터링했다. 모든 대조군은 라모스 주사 후 26일에서 37일 사이에 사망했다.
도 2를 참조하면, 라모스 세포의 각기 다른 농도에 따른 정맥주사는 진행성 체중 감소 및 뒷다리 마비를 포함하는 증상을 특징으로 하는 마우스에서 종양 형성 활성을 나타내었고, 주사 후 26일에서 37일 사이에 거의 100 % 생쥐가 사멸되었다. 이하 추가 실험을 위해, 라모스 세포주의 최적 용량을 1 X 106 세포로 선택했다.
실험예 2.2. 라모스 이종이식 모델에서의 MOR208 용량 테스트
B 림프종 세포 사멸에 대한 MOR208의 효능은 환자에서 프라이머리(primary) 악성 B 세포를 고갈시킬 수 있는 가능성에 있어 임상적으로 중요하다. 우리는 라모스 세포를 SCID 마우스에 정맥주사하고, MOR208을 전술한 "준비예"에 기술된 대로 투여한 전파성 림프종 모델에서 MOR208의 항종양 활성을 평가했다. 이 모델에서 라모스 세포는 전파성 버킷 림프종 및 급성 림프구성 백혈병과 같은 모방 질환과 중추신경계를 포함하는 모든 마우스 기관에 침투했다. 이와 관련하여, 10 마리의 SCID 마우스 그룹에 1 X 106 라모스 세포를 정맥주사했다(0일째). 3일, 6일, 10일, 13일, 17일 및 20일에 단일클론 항체(20, 60 또는 200μg/100μL/head) 또는 음성대조군으로 hIgG (hIgG 200 μg/ 100μL/head)로 마우스를 처리하고 매일 질병의 징후를 관찰하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 200μg의 MOR208 처리는 대조군 단일클론항체를 주사한 동물에 비해 마우스의 생존을 유의하게 연장시켰다(P <.001). 200μg의 MOR208 처리 마우스의 생존 시간 중앙값(median)은 대조군 항체 처리 마우스의 28.5일에 비해 36일로 보다 긴 것이 확인되었다.
실험예 2.3. 라모스 이종이식 모델에서의 MG4101 용량 테스트
라모스 세포가 주입된 SCID 마우스는 "준비예"에 기술된 대로 건강한 공여자의 in vitro 확장 및 활성화된 MG4101 세포를 정맥주사했다. 이 MG4101 세포 보충은 환자의 기관에 존재할 조직 NK 세포의 존재를 모방하는데 그 목적이 있다. 구체적으로, 10 마리의 SCID 마우스 그룹에 1 X 106 라모스 세포를 정맥주사했다(0 일째). 4일, 7일, 11일, 14일, 18일, 21일째에 MG4101 (1, 2, 5 X 107/400μL/head) 또는 NK 세포의 동결배지 단독으로 마우스에 투여하고 매일 질병의 징후를 관찰하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 대조군(동결 배지)으로 처리한 마우스와 비교하여, MG4101을 마우스 당 5 X 107 세포의 투여량으로 투여한 마우스는 생존율이 유의하게 향상되었다(P <.05). 5 X 107 세포의 MG4101을 처리한 마우스의 생존 시간 중앙값은 33일이었고, 대조군의 냉동 배지를 처리한 마우스는 28일이었다.
실험예 2.4. 라모스 이종이식 모델에서의 MG4101 + MOR208 병용 투여 효과 확인
라모스 세포를 주사한 마우스를 여러 군으로 무작위로 나누어, "준비예"에 기술된 대로, 라모스 세포 접종 후 3일차에, 2가지 투여량의 MOR208, MG4101 단독, 2가지 투여량의 MOR208과 MG4101의 조합물 또는 대조군으로서 hIgG를 포함한 동결 배지로 처리하였다. 구체적으로, 10 마리의 SCID 마우스 그룹에 1 X 106 라모스 세포가 정맥주사되었다(0일째). 3일, 6일, 10일, 13일, 17일 및 20일에 단일클론항체(60 또는 200μg/100μL/head)로 마우스를 처리하였다. 4일, 7일, 11일, 14일, 18일 및 21일에 MG4101(2 X 107/400μL/head의 농도)를 정맥주사하고 매일 마우스를 관찰하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, MOR208로 처리한 마우스는 hIgG 동결배지가 주입된 대조군에 비해 보호 효과가 유의하게 향상되었음을 확인하였다. MG4101 주사 군도 대조군에 비해 유의한 호전을 보였다. 200μg의 MOR208로 처리한 마우스(P <.0001)와 2 X 107 세포의 MG4101로 처리한 마우스(P <.001)의 생존 시간 중앙값은 동결 배지로 처리된 대조군의 30.5일에 비해 각각 45.5와 38일로 증가했다.
한편, MOR208와 MG4101의 조합이 처리된 동물은 실험 기간 동안 생존에서 시너지적인 상승을 보였다. 구체적으로, 2 X 107 세포의 MG4101이 동시 주입이 되는 상황에서, 60μg과 200μg의 MOR208 처리 마우스에 대해 생존 시간 중앙값은 각각 52 일과 62 일로 증가했다(P <.0001). MOR208과 MG4101의 병용 투여의 상당한 시너지 효과가 생존율 증가 분석에서도 나타났다. 특히 MOR208 또는 MG4101 치료의 평균 생존율 증가율은 각각 11.5 % (MOR208 60μg), 49.2 % (MOR208 200μg) 또는 24.6 % (2 X 107 세포 MG4101)였다. 반면, MOR208과 MG4101의 동시 처리는 MG4101 동시 주입 상황에서, 각각 70.5 % (MOR208 60μg) 및 103.3 % (MOR208 200μg)의 생존율 상승 효과를 보였다. 이러한 결과는 MOR208 또는 MG4101을 개별적으로 주사한 동물에 비해, MG4101과 MOR208을 동시 처리(조합물)하는 것이 특히 60μg의 MOR208 동시 주사의 경우 생쥐 생존이 2 배로 유의하게 연장된 것을 확인하였다.
즉, 본원에서 확인한 in vitro 및 in vivo 데이터는 모두 항-CD19 항체 및 자연살해세포 조합물 즉, 두 성분의 병용 요법이 인간 B 림프종 및 백혈병 등의 효과적인 치료제가 될 수 있으며, 다양한 B 세포 악성종양에 대해서도 현저한 치료효과를 보일 가능성을 제시한다.
<110> Green Cross Lab Cell Corporation MORPHOSYS AG <120> PHARMACEUTICAL COMBINATIONS FOR TREATING TUMOR COMPRISING ANTI-CD19 ANTIBODY AND NATURAL KILLER CELL <130> 201808-0077 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 Ser Tyr Val Met His 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 Asn Pro Tyr Asn Asp Gly 1 5 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Arg Val Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gln Asn Val Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 5 Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 6 Met Gln His Leu Glu Tyr 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390 395 400 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu 405 410 415 Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu 420 425 430 Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly 435 440 445 Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu 450 455 460 Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser 465 470 475 480 Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Gly 485 490 495 Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln 500 505 510 Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala 515 520 525 Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp 530 535 540 Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg 545 550 555 <210> 8 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 9 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gln Asn Val 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 10 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Trp Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 11 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 11 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (27)

  1. CD19에 특이적인 항체 및 자연살해세포(NK 세포)를 포함하는, 암 치료용 약학적 조합물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 1(SYVMH)의 HCDR1 영역, 서열번호 2(NPYNDG)의 HCDR2 영역, 서열번호 3(GTYYYGTRVFDY)의 HCDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 약학적 조합물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 4(RSSKSLQNVNGNTYLY)의 LCDR1 영역, 서열번호 5 (RMSNLNS)의 LCDR2 영역, 및 서열번호 6(MQHLEYPIT)의 LCDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약학적 조합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 8 (EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWGQGTLVTVSS)의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9 (DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIK)의 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약학적 조합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 10 (ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)의 중쇄 불변 영역을 포함하는, 약학적 조합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 11 (RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC)의 경쇄 불변 영역을 포함하는, 약학적 조합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NK 세포는 아래 (i) 내지 (iii) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것인, 약학적 조합물:
    (i) 항-CD3 항체, 사이토카인 및 지지세포를 포함하는 배양액 중에서 분리된 NK 세포를 정치배양하여 세포간 접촉을 자극하는 단계;
    (ii) 사이토카인, 항-CD3 항체 및 지지세포를 첨가하여 재자극하고 다시 정치배양하여 세포간 접촉을 유도하는 단계; 및
    (iii) 사이토카인을 포함하는 배지를 세포에 추가하고, 세포 농도 및 사이토카인 농도를 일정하게 유지하면서 정치 또는 부유 배양하는 단계.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NK 세포는 지지세포(feeder cell)로서 체외로 분리된 CD4(+) T 세포 또는 체외 확장 배양된 CD4(+) T 세포와 원료세포(seed cell)를 공배양하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것인, 약학적 조합물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 CD4(+) T 세포는 CD4(+)/CD1(-) T 세포주인, 약학적 조합물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 CD4(+)/CD1(-) T 세포주는 H9 또는 HuT78 세포주인, 약학적 조합물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 원료세포는 말초혈액, 말초혈 백혈구 세포, PBMC(말초혈 단핵구 세포), 제대혈 백혈구 세포, 제대혈 단핵 세포, 줄기세포로부터 유래된 자연살해세포, 농축된(enriched) 자연살해세포 및 분리된 자연살해세포로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인, 약학적 조합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암, 림프종 및 B 세포 기원 악성 종양으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나인, 약학적 조합물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD19에 특이적인 항체 및 NK 세포는 별도로 투여되는, 약학적 조합물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD19에 특이적인 항체 및 NK 세포는 동시에 투여되는, 약학적 조합물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 조합물을 포함하는, 암 치료용 키트.
  16. 암 치료용 약제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조합물의 용도.
  17. 암을 치료하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조합물의 용도.
  18. CD19에 특이적인 항체와 NK 세포를 개체에 병용 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 1(SYVMH)의 HCDR1 영역, 서열번호 2(NPYNDG)의 HCDR2 영역, 서열번호 3(GTYYYGTRVFDY)의 HCDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 4(RSSKSLQNVNGNTYLY)의 LCDR1 영역, 서열번호 5 (RMSNLNS)의 LCDR2 영역, 및 서열번호 6(MQHLEYPIT)의 LCDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 방법.
  21. 제18항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NK 세포는 아래 (i) 내지 (iii) 단계에 의해 제조되는, 방법:
    (i) 항-CD3 항체, 사이토카인 및 지지세포를 포함하는 배양액 중에서 분리된 NK 세포를 정치배양하여 세포간 접촉을 자극하는 단계;
    (ii) 사이토카인, 항-CD3 항체 및 지지세포를 첨가하여 재자극하고 다시 정치배양하여 세포간 접촉을 유도하는 단계; 및
    (iii) 사이토카인을 포함하는 배지를 세포에 추가하고, 세포 농도 및 사이토카인 농도를 일정하게 유지하면서 정치 또는 부유 배양하는 단계.
  22. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NK 세포는 지지세포(feeder cell)로서 체외로 분리된 CD4(+) T 세포 또는 체외 확장 배양된 CD4(+) T 세포와 원료세포(seed cell)를 공배양하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 CD4(+) T 세포는 CD4(+)/CD1(-) T 세포주인, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 CD4(+)/CD1(-) T 세포주는 H9 또는 HuT78 세포주인, 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 원료세포는 말초혈액, 말초혈 백혈구 세포, PBMC(말초혈 단핵구 세포), 제대혈 백혈구 세포, 제대혈 단핵 세포, 줄기세포로부터 유래된 자연살해세포, 농축된(enriched) 자연살해세포 및 분리된 자연살해세포로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인, 방법.
  26. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암, 림프종 및 B 세포 기원 악성 종양으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나인, 방법.
  27. 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (c) 투여하는 단계는 CD19에 특이적인 항체와 NK 세포를 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여하는, 방법.
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