CN117187181B - 包被组合物的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及包被组合物的方法及其应用。本发明通过对包被液和培养基成分进行优化，获得了一种新的自体或异体NK细胞的培养方法，与其他培养方法相比，本发明所述的培养方法培养获得的自体或异体NK细胞的安全性更高、增殖能力更强、纯度更高、对肿瘤细胞杀伤能力也更强，并且本发明的培养方法步骤简单，与其他方法相比，更易于推广和应用。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及包被组合物的方法及其应用。
背景技术
癌症的治疗虽然一直是医学上的难题，近几十年来随着生命科学技术的进展，对癌症的治疗研究日益深入，目前，治疗肿瘤的主要方法有化疗、手术切除、放疗和免疫细胞治疗。然而传统的化疗药物通常具有毒副作用大、肿瘤靶向性差、易产生耐药等缺陷；手术切除治疗风险性大、对患者身体伤害非常大；放疗治疗风险较大，且易复发；而免疫细胞治疗技术具有疗效好、不良反应少或无、无耐药性等显著优势，且近年来发展迅速，被誉为继外科手术、药物治疗、放射治疗后最有前景的肿瘤治疗技术之一。
自然杀伤细胞（Natural killer cells，NK cells）因其天然杀伤能力而得名。NK细胞又称为是一类具有天然免疫及自身稳定功能的淋巴细胞，处于机体抗感染、抗肿瘤的第一道防线。NK细胞相比T、B淋巴细胞，它不需要抗原呈递诱导或任何事先激活就能对各种疾病作出快速反应，其不需要通过主要组织相容性复合体（MHC）机制独立识别靶细胞，并且在不致敏的情况下直接杀死靶细胞。外周血单个核细胞（PBMC）是NK细胞的主要来源之一，具有采集相对容易、易于体外扩增、毒副作用低等优点。但是外周血中NK细胞数量相对较少，一般占外周血单个核细胞的5%~10%，目前能在短期内获得大量高纯度、高杀伤性的NK细胞仍然比较困难。
目前已经开发了多种可以获得大量高纯度、高细胞毒性的NK细胞扩增策略，包括：使用细胞因子-抗体融合、滋养层细胞、肿瘤细胞膜颗粒等来刺激NK细胞的增殖并增强其细胞毒性。多细胞因子组合虽然能产生足够数量的高细胞毒性NK细胞，但总体扩增倍数仍不理想；使用滋养层细胞系统用于PBMC中NK细胞的扩增会增加将其他类型的细胞引入产品的风险，存在较大的安全隐患；使用肿瘤细胞膜颗粒来扩增NK细胞，存在较大风险。且现有技术大多NK细胞扩增方法还存在步骤繁琐，扩增纯度低，肿瘤细胞杀伤能力弱等缺点。
因此，提供一种可以获得大量高纯度、高细胞毒性的NK细胞的培养方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了包被组合物的方法及其应用。
本发明提供了包被组合物的方法及其应用。本发明提供的包被组合物可以维持NK细胞的高倍扩增能力、高纯度；保持细胞活率，或使细胞活率增高；增强NK细胞毒功能、增强杀伤肿瘤能力。本发明通过增加包被液中的成分，制备了新型刺激NK细胞增殖的配方，改变激活细胞方式。本发明提供了一种新型的细胞培养的方法，获得源自自体或异体外周血的NK细胞，增强INF-γ分泌能力，保持细胞增殖速率，提高肿瘤细胞杀伤能力，以培养出具有更好的杀伤实体肿瘤作用的NK细胞。本发明的细胞培养方法由可以延伸至其他的相同类型的NK细胞扩增的培养，可以达到更好的增加NK细胞的比例，并发挥更好的杀伤肿瘤的作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了包被组合物，包括CD3单抗和丙球蛋白。
在本发明的一些具体实施方案中，所述CD3单抗的浓度包括1~30μg/mL；所述丙球蛋白的浓度包括1~200μg/mL。
在本发明的一些具体实施方案中，所述CD3单抗的浓度包括1~10μg/mL；所述丙球蛋白的浓度包括1~50μg/mL。
在本发明的一些具体实施方案中，所述CD3单抗的浓度包括5~10μg/mL；所述丙球蛋白的浓度包括10~30μg/mL。
在本发明的一些具体实施方案中，所述CD3单抗的浓度包括10μg/mL；所述丙球蛋白的浓度包括30μg/mL。
在本发明的一些具体实施方案中，所述CD3单抗的浓度包括5μg/mL；所述丙球蛋白的浓度包括10μg/mL。
本发明还提供了所述包被组合物在促进NK细胞增殖和/或杀伤能力中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，自体或异体人外周血单个核细胞密度与所述包被组合物中的CD3单抗的比值为（1.0×106~2.0×106个/mL）：（1~30μg/mL）；
自体或异体人外周血单个核细胞密度与所述包被组合物中的丙球蛋白的比值为（1.0×106~2.0×106个/mL）：（1~200μg/mL）。
在本发明的一些具体实施方案中，自体或异体人外周血单个核细胞密度与所述包被组合物中的CD3单抗的比值为（1.0×106~2.0×106个/mL）：（1~10μg/mL）；
自体或异体人外周血单个核细胞密度与所述包被组合物中的丙球蛋白的比值为（1.0×106~2.0×106个/mL）：（1~50μg/mL）。
在本发明的一些具体实施方案中，自体或异体人外周血单个核细胞密度与所述包被组合物中的CD3单抗的比值为（1.0×106~2.0×106个/mL）：（5~10μg/mL）；
自体或异体人外周血单个核细胞密度与所述包被组合物中的丙球蛋白的比值为（1.0×106~2.0×106个/mL）：（10~30μg/mL）。
在上述研究的基础上，本发明还提供了包被方法，取所述包被组合物包被细胞培养装置。
在本发明的一些具体实施方案中，所述包被的条件包括4℃避光放置12~18h或20~30℃避光放置4h。
在本发明的一些具体实施方案中，所述细胞的包被方法包括取所述包被组合物与生理盐水混合，加入到T75的细胞培养瓶中，混匀，4℃包被12~18h或20~30℃避光包被4h。
本发明还提供了试剂组合，包括培养液和所述包被组合物；
所述培养液包括50~200W IU IL-2和GT-T551-H3培养液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述培养液包括60~100W IU IL-2和GT-T551-H3培养液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述培养液包括100W IU IL-2和GT-T551-H3培养液。
本发明还提供了NK细胞的培养方法，基于所述试剂组合培养细胞。
在本发明的一些具体实施方案中，所述培养方法，包括如下步骤：
步骤1：取所述包被组合物对细胞培养装置进行包被，获得包被细胞培养装置；
步骤2：将自体或异体人外周血的单个核细胞接种于含有所述培养液的所述包被细胞培养装置中进行培养。
在本发明的一些具体实施方案中，所述自体或异体人外周血的单个核细胞接种的密度为1.0×106~2.0×106个/mL。
在本发明的一些具体实施方案中，所述培养还包括补充培养液的步骤；
以接种的时间为第0天，所述补充培养液的时间分别为第2、4、7、9、11、14天；所述补充培养液的体积为补液前体积的1~3倍。
在本发明的一些具体实施方案中，第2天补液的体积为补液前体积的1倍；第4天补液的体积为补液前体积的3倍；第7天补液的体积为补液前体积的1.5倍；第9天补液的体积为补液前体积的1.5倍；第11天补液的体积为补液前体积的1倍；第14天补液的体积为补液前体积的1倍；第16天收集培养细胞。
在本发明的一些具体实施方案中，第0天的总培养体积为15mL，第2天补液的体积为15mL，总培养体积为30mL；第4天补液的体积为90mL，总培养体积为120mL；第7天补液的体积为180mL，总培养体积为300mL；第9天补液的体积为450mL，总培养体积为750mL；第11天补液的体积为750mL，总培养体积为1.5L；第14天补液的体积1.5L，总培养体积为3L。
在本发明的一些具体实施方案中，所述自体或异体人外周血的单个核细胞的制备方法包括：
步骤1：取样本2000rpm离心10~30min，取下层血细胞沉淀与氯化钠注射液混合，获得稀释后的血细胞；
步骤2：取稀释后的血细胞与人外周血淋巴细胞分离液混合，2000rpm离心10~30min，获得PBMC层的细胞；
步骤3：取所述PBMC层的细胞加入氯化钠注射液洗涤，1500rpm离心10~20min，获得人外周血的单个核细胞。
本发明还提供了所述培养方法培养获得的自体或异体NK细胞。
本发明还提供了所述自体或异体NK细胞在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明还提供了药物，包括所述自体或异体NK细胞以及药学上可接受的辅料或助剂。
本发明还提供了药物组合，包括所述药物以及其他任意有效成分。
本发明还提供了预防和/或治疗肿瘤的方法，向受试者施用如下任意项：
（1）、所述自体或异体NK细胞；和/或
（2）、所述药物；和/或
（3）、所述药物组合。
在本发明的一些具体实施方案中，所述施用的手段包括但不限于注射。
本发明通过对包被液和培养基成分进行优化，获得了一种新型NK细胞的培养方法，与其他培养方法相比，本发明所述的培养方法培养获得的NK细胞的安全性更高、增殖能力更强、纯度更高、对肿瘤细胞杀伤能力也更强，并且本发明的培养方法的步骤简单，与其他方法相比，更易于推广和应用。
附图说明
图1示效果例1中不同包被条件下NK细胞检测结果，其中，左图为实施例3培养到16天的NK细胞检测结果；右图为对比例1培养到16天的NK细胞检测结果；
图2示效果例1中不同包被条件下细胞总数变化折线图，其中，A为实施例3培养的细胞总数变化；B为对比例1培养的细胞总数变化；
图3示效果例1中不同包被条件下细胞活率变化折线图，其中，A为实施例3培养的细胞活率变化；B为对比例1培养的细胞活率变化；
图4示效果例1中不同包被条件下NK细胞比例变化折线图，其中，A为实施例3培养的NK细胞比例变化；B为对比例1培养的NK细胞比例变化；
图5示效果例1中不同包被条件下NK细胞总数变化折线图，其中，A为实施例3培养的NK细胞总数变化；B为对比例1培养的NK细胞总数变化；
图6示效果例1中不同包被条件下NK细胞增长倍数变化折线图，其中，A为实施例3培养的NK细胞增长倍数变化；B为对比例1培养的NK细胞增长倍数变化；
图7示效果例1中不同包被条件下的NK细胞在效靶比分别为10:1、15:1时对肿瘤细胞（A498）杀伤率的柱状图，其中，A为实施例3培养的混合T细胞在效靶比分别为10:1、15:1时对肿瘤细胞（A498）杀伤率；B为对比例1培养的混合T细胞在效靶比分别为10:1、15:1时对肿瘤细胞（A498）杀伤率；
图8示效果例1中不同包被条件下的NK细胞在效靶比分别为10:1、15:1时杀伤肿瘤细胞（A498）时分泌IFN-γ浓度的柱状图，其中，A为实施例3培养的NK细胞在效靶比分别为10:1、15:1时杀伤肿瘤细胞（A498）时分泌IFN-γ浓度；B为对比例1培养的NK细胞在效靶比分别为10:1、15:1时杀伤肿瘤细胞（A498）时分泌IFN-γ浓度；
图9示实施例5中细胞培养16天NK细胞比例；
图10示实施例6中细胞培养16天NK细胞比例；
图11示实施例7中细胞培养16天NK细胞比例；
图12示实施例8中细胞培养16天NK细胞比例；
图13示实施例9中细胞培养16天NK细胞比例；
图14示对比例2中采用不同完全培养基细胞培养16天NK细胞比例；
图15示对比例3中采用不同浓度包被液细胞培养16天NK细胞比例；
图16示效果例2中细胞培养16天NK细胞比例；
图17示效果例2中细胞培养16天NK细胞比例。
具体实施方式
本发明提供了包被组合物的方法及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明通过培养PBMC获得一种相对高安全性、增殖能力强、高纯度、高细胞毒性的NK细胞。本发明的新型的细胞培养方法制备了新型刺激NK细胞增殖的配方，在保证机体安全性的情况下，达到更好的杀伤实体肿瘤的作用。
本发明通过同时扩增NK、CD4+T细胞、CD8+T细胞，即获得高扩增倍数、高纯度、高细胞毒性的NK细胞。另一方面，NK高比例的混合T细胞杀伤肿瘤能力强，且杀伤效率高。
本发明采用的试剂耗材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 本发明培养方法及培养获得细胞性能
一、采集健康人自体或异体外周血的单个核细胞（PBMC），按如下步骤：
1、人外周血淋巴细胞分离液准备：准备新的50mL离心管，每管加入10~20mL的人外周血淋巴细胞分离液（天津灏洋华科生物科技有限公司LTS10770125）；
2、血细胞稀释：接收外周血样本（来源于捐赠者的外周血，外周血编号为ER002302）后将样本采血管放入离心机，2000rpm，离心10~30min，离心结束后，将下层血细胞沉淀吸至新的50mL离心管中，用氯化钠注射液稀释血细胞（氯化钠注射液与剩余血细胞沉淀的稀释比例应不低于1:1），移液管吹打混匀；
3、密度梯度离心：将稀释后的血细胞加入至装有人外周血淋巴细胞分离液的离心管中，且立即离心，2000rpm，室温下离心10~30min。
4、单个核细胞收集：将移液管直接插至PBMC层，轻轻吸出PBMC层细胞，转移至新的50mL离心管；
5、第一次洗涤：加入氯化钠注射液至50mL，移液管吹打混匀后放入离心机，1500rpm，离心10~20min；
6、重复步骤（5）2次，备用；
7、细胞计数：使用K2细胞计数仪进行细胞计数及活率检测。
实施例2 细胞完全培养基配制
细胞完全培养基成分如表1
表1. 细胞完全培养基成分
在1000mL GT-T551-H3培养基中加入100W IU IL-2，混匀，为细胞完全培养基1。
实施例3 细胞包被液的配制及包被细胞培养瓶的制备
包被瓶1：15mL生理盐水中加入15mL生理盐水中加入150μgCD3单抗，使其浓度为10μg/mL；加入450μg的丙球蛋白，使其浓度为30μg/mL，混匀，即为激活包被液1，加入到T75的细胞培养瓶中，混匀，4℃避光放置18h或25±5℃避光放置4h，即为包被瓶1。
对比例1
包被瓶2：15mL生理盐水中加入150μgCD3单抗，使其浓度为10μg/mL；加入0μg的丙球蛋白；混匀，即为激活包被液2，加入到T75的细胞培养瓶中，混匀，4℃避光放置18h或25±5℃避光放置4h，即为包被瓶2。
实施例4 NK细胞培养
1、将分离得到的细胞用细胞完全培养基1，按照约1.0×106~2.0×106个/mL浓度接种于提前包被好的培养瓶中（包被瓶1或包被瓶2），总培养体积为15mL，混匀，并置于37℃、5% CO2的细胞培养箱内培养。
2、培养至48±12（2天）小时，补加细胞完全培养基1 15mL至总培养体积为30mL，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱内培养。
3、培养至96±12小时（4天），将细胞转入T175细胞培养瓶中，随后加入细胞完全培养基1 90mL至总培养体积为120mL，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱内培养。
4、培养至168±12小时（7天），将培养瓶中的细胞吹打混匀后，平均分装到5个1.8L的细胞培养袋，向每个培养袋中加入细胞完全培养基1 180mL至总体积为300mL，混匀，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱内培养。
5、培养至216±12小时（9天），向每个培养袋中加入细胞完全培养基1 450mL至总体积为750mL，混匀，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱内培养。
6、培养至264±12小时（11天），向每个培养袋中加入细胞完全培养基1 750mL至总体积为1.5L，混匀，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱内培养。
7、培养至336±12小时（14天），向每个培养袋中加入细胞完全培养基1 1.5L至总体积为3L，混匀，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱内培养。
8、培养至384±12小时（16天），收获细胞悬夜，即获得所述NK细胞。
效果例1
对上述利用实施例3和对比例1培养的细胞做肿瘤细胞杀伤检测（A498细胞）、流式表型检测、INF-γ分泌量检测，检测结果如表2。
表2.实施例3和对比例1培养细胞性能差异检测
对实施例3和对比例1培养的细胞进行流式表型检测。
实施例3和对比例1培养到16天的NK细胞检测结果如图1所示；
实施例3和对比例1培养的总细胞数变化结果如图2所示；
实施例3和对比例1培养的总细胞活率变化结果如图3所示；
实施例3和对比例1培养的NK细胞所占比例变化结果如图4所示；
实施例3和对比例1培养的NK细胞总数变化结果如图5所示；
实施例3和对比例1培养的NK细胞增长倍数变化结果如图6所示；
实施例3和对比例1培养的NK细胞在效靶比分别为10:1、15:1时对肿瘤细胞（A498）的杀伤结果如图7所示；
实施例3和对比例1培养的NK细胞在效靶比分别为10:1、15:1时杀伤肿瘤细胞（A498）时分泌IFN-γ浓度的结果如图8所示。
结果表明，按照实施例3记载的方法培养的混合T细胞总数、NK细胞总数、NK细胞纯度、NK细胞增长倍数、NK细胞杀伤肿瘤的能力、分泌的IFN-γ的浓度较高，显著高于对比例1记载的方法培养的混合T细胞总数、NK细胞总数、NK细胞纯度、NK细胞增长倍数、NK细胞杀伤肿瘤的能力、分泌的IFN-γ的浓度。
本发明的培养方法不仅能获得高比例的NK细胞，也能获得高数量的NK细胞，而且对于肿瘤细胞株的杀伤效果也显著提高。
实施例5
1、采集健康人自体或异体外周血的单个核细胞的实验步骤按照实施例1所记载的方法进行。
2、细胞完全培养基配制：
细胞完全培养基成分如表3：
表3.细胞完全培养基成分
在1000mL GT-T551-H3培养基中加入100W IU IL-2，混匀，为细胞完全培养基1。
3、细胞包被液的配制及包被细胞培养瓶的制备
15mL生理盐水中加入75μg CD3单抗，使其浓度为5μg/mL；加入150μg的丙球蛋白，使其浓度为10μg/mL，混匀，即为激活包被液，加入到T75细胞培养瓶中，混匀，4℃避光放置18h或20~30℃避光放置4h。
4、NK细胞培养
（1）将分离得到的细胞用细胞完全培养基1，按照约1.0×106~2.0×106个/mL浓度接种于提前包被好的T75细胞培养瓶中，总培养体积为15mL，混匀，并置于37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养。
后续实验步骤按照实施例4记载的方法中的步骤2-8进行。
5、实验结果：
细胞相关检测指标如表4，图9所示。
表4. 实施例5中细胞相关检测指标
使用细胞完全培养基1，培养的NK细胞到第16天，NK细胞比例为22.3%，在NK细胞与肿瘤细胞效靶比为15:1时，杀伤肿瘤的能力为82.5%，分泌IFN-γ的浓度为15.0pg/mL，NK细胞的扩增倍数较高。
实施例6
1、采集健康人自体或异体外周血的单个核细胞的实验步骤按照实施例1所记载的方法进行。
2、细胞完全培养基配制：
细胞完全培养基成分如表5：
表5.细胞完全培养基成分
在1000mL GT-T551-H3培养基中加入100W IU IL-2，混匀，为细胞完全培养基1。
3、细胞包被液的配制及包被细胞培养瓶的制备
15mL生理盐水中加入15μg CD3单抗，使其浓度为1μg/mL；加入15μg的丙球蛋白，使其浓度为1μg/mL，混匀，即为激活包被液，加入到T75细胞培养瓶中，混匀，4℃包被18h或20~30℃避光放置4h，即为包被瓶。
4、NK细胞培养
（1）将分离得到的细胞用细胞完全培养基1，按照约1.0×106~2.0×106个/mL浓度接种于提前包被好的培养瓶中，总培养体积为15mL，混匀，并置于37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养。
后续实验步骤按照实施例4记载的方法中的步骤2-8进行。
5、实验结果：
细胞相关检测指标如表6，图10所示。
表6. 实施例6中细胞相关检测指标
使用细胞完全培养基1，培养的NK细胞到第16天，NK细胞比例为17.9%，在NK细胞与肿瘤细胞效靶比为15:1时，杀伤肿瘤的能力为78.6%，分泌IFN-γ的浓度为14.7pg/mL，NK细胞的扩增倍数为2800。
实施例7
1、采集健康人自体或异体外周血的单个核细胞的实验步骤按照实施例1所记载的方法进行。
2、细胞完全培养基配制：
细胞完全培养基成分如表7：
表7.细胞完全培养基成分
在1000mL GT-T551-H3培养基中加入100W IU IL-2，混匀，为细胞完全培养基1。
3、细胞包被液的配制及包被细胞培养瓶的制备
15mL生理盐水中加入75μg CD3单抗，使其浓度为5μg/mL；加入750μg的丙球蛋白，使其浓度为50μg/mL，混匀，即为激活包被液，加入到T75细胞培养瓶中，混匀，4℃包被18h或20~30℃避光放置4h，即为包被瓶。
4、NK细胞培养
（1）将分离得到的细胞用细胞完全培养基1，按照约1.0×106~2.0×106个/mL浓度接种于提前包被好的培养瓶中，总培养体积为15mL，混匀，并置于37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养。
后续实验步骤按照实施例4记载的方法中的步骤2-8进行。
5、实验结果：
细胞相关检测指标如表8，图11所示。
表8. 实施例7中细胞相关检测指标
使用细胞完全培养基1，培养的NK细胞到第16天，NK细胞比例为26.7%，在NK细胞与肿瘤细胞效靶比为15:1时，杀伤肿瘤的能力为80.9%，分泌IFN-γ的浓度为13.7pg/mL，NK细胞的扩增倍数为5500。
实施例8
1、采集健康人自体或异体外周血的单个核细胞的实验步骤按照实施例1所记载的方法进行。
2、细胞完全培养基配制：
细胞完全培养基成分如表9：
表9.细胞完全培养基成分
在1000mL GT-T551-H3培养基中加入100W IU IL-2，混匀，为细胞完全培养基1。
3、细胞包被液的配制及包被细胞培养瓶的制备
15mL生理盐水中加入150μg CD3单抗，使其浓度为10μg/mL；加入150μg的丙球蛋白，使其浓度为10μg/mL，混匀，即为激活包被液，加入到T75细胞培养瓶中，混匀，4℃包被18h或20~30℃避光放置4h，即为包被瓶。
4、NK细胞培养
（1）将分离得到的细胞用细胞完全培养基1，按照约1.0×106~2.0×106个/mL浓度接种于提前包被好的培养瓶中，总培养体积为15mL，混匀，并置于37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养。
后续实验步骤按照实施例4记载的方法中的步骤2-8进行。
5、实验结果：
细胞相关检测指标如表10，图12所示。
表10. 实施例8中细胞相关检测指标
使用细胞完全培养基1，培养的NK细胞到第16天，NK细胞比例为27.1%，在NK细胞与肿瘤细胞效靶比为15:1时，杀伤肿瘤的能力为90.0%，分泌IFN-γ的浓度为15.0pg/mL，NK细胞的扩增倍数为6000。
实施例9
1、采集健康人自体或异体外周血的单个核细胞的实验步骤按照实施例1所记载的方法进行。
2、细胞完全培养基配制：
细胞完全培养基成分如表11：
表11.细胞完全培养基成分
在1000mL GT-T551-H3培养基中加入100W IU IL-2，混匀，为细胞完全培养基1。
3、细胞包被液的配制及包被细胞培养瓶的制备
15mL生理盐水中加入150μg CD3单抗，使其浓度为10μg/mL；加入750μg的丙球蛋白，使其浓度为50μg/mL，混匀，即为激活包被液，加入到T75的细胞培养瓶中，混匀，4℃包被18h或20~30℃避光放置4h，即为包被瓶。
4、NK细胞培养
（1）将分离得到的细胞用细胞完全培养基1，按照约1.0×106~2.0×106个/mL浓度接种于提前包被好的培养瓶中，总培养体积为15mL，混匀，并置于37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养。
后续实验步骤按照实施例4记载的方法中的步骤2-8进行。
5、实验结果：
细胞相关检测指标如表12，图13所示。
表12. 实施例9中细胞相关检测指标
使用细胞完全培养基1，培养的NK细胞到第16天，NK细胞比例为17.5%，在NK细胞与肿瘤细胞效靶比为15:1时，杀伤肿瘤的能力为60.2%，分泌IFN-γ的浓度为12.2pg/mL，NK细胞的扩增倍数为2554。
对比例2 细胞培养条件优化中的其他尝试（不同培养基）
1、采集健康人自体或异体外周血的单个核细胞的实验步骤按照实施例1记载的方法进行。
2、细胞完全培养基配制如表13：
表13. 细胞完全培养基
在1000mL OptiVitro® NK细胞培养基液中加入8mLNE000-N02、310μL细胞因子III，混匀，为细胞完全培养基2。
3、细胞包被液的配制及包被细胞培养瓶的制备：
按照实施例3记载的方法完成细胞包被液的配制及包被细胞培养瓶的制备。
4、NK细胞培养
（1）将分离得到的细胞用细胞完全培养基2，按照约1.0×106~2.0×106个/mL浓度接种于提前包被好的包配瓶1中，总培养体积为15mL，添加10%的热灭活自体血浆混匀，并置于37℃、5% CO2的细胞培养箱内培养。
（2）第3天，沿培养瓶侧壁缓慢补加15mL 的新鲜OptiVitro® NK细胞培养基液，添加10%的热灭活自体血浆。
（3）第5天，取样计数，补加新鲜OptiVitro® NK细胞培养基液（添加5%的热灭活自体血浆），调整细胞密度1.0×106~1.5×106cells/mL，根据细胞悬液体积进行扩瓶或转入细胞培养袋培养。
（4）第7天后，每隔一天或两天取样计数补液，调整细胞密度0.5×106~1.0×106cells/mL，根据细胞悬液体积进行扩瓶或转入细胞培养袋培养，从第7天开始，可将补加的新鲜OptiVitro® NK细胞培养基液中的热灭活自体血浆含量降至1%。
（5）培养至第16天收获细胞。
5、实验结果
细胞相关检测指标如表14，图14所示。
表14.对比例2中细胞培养获得细胞情况
使用细胞完全培养基2，培养的NK细胞到第16天，NK细胞比例为6.8%，在NK细胞与肿瘤细胞效靶比为15:1时，杀伤肿瘤的能力为10.2%，且分泌IFN-γ的浓度几乎检测不到，NK细胞的扩增倍数也较低。
对比例3 不同浓度包被液
1、采集健康人自体或异体外周血的单个核细胞的实验步骤按照实施例1所记载的方法进行。
2、细胞完全培养基配制：
细胞完全培养基成分如表15：
表15.细胞完全培养基成分
在1000mL GT-T551-H3培养基中加入100W IU IL-2，混匀，为细胞完全培养基1。
3、细胞包被液的配制及包被细胞培养瓶的制备
15mL生理盐水中加入12μg CD3单抗，使其浓度为0.8μg/mL；加入1.5μg的丙球蛋白，使其浓度为0.1μg/mL，混匀，即为激活包被液，加入到T75的细胞培养瓶中，混匀，4℃避光放置18h或25±5℃避光放置4h，即为包被瓶。
4、NK细胞培养
（1）将分离得到的细胞用细胞完全培养基1，按照约1.0×106~2.0×106个/mL浓度接种于提前包被好的培养瓶中，总培养体积为15mL，混匀，并置于37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养。
后续实验步骤按照实施例4记载的方法中的步骤2-8进行。
5、实验结果：
细胞相关检测指标如表16，图15所示。
表16. 对比例3中细胞相关检测指标
使用细胞完全培养基1，培养的NK细胞到第16天，NK细胞比例为2.4%，在NK细胞与肿瘤细胞效靶比为15:1时，杀伤肿瘤的能力为17.8%，分泌IFN-γ的浓度为2.0 pg/mL，NK细胞的扩增为40倍。
对比例4
1、细胞培养基配置如表17：
表17. 培养基
在1000mL的X-VIVO15培养基中加入30W IU IL-2，20μg的IL-12，20μg的IL-15，自体血浆，混匀，为细胞完全培养基3。
2、包被液的配置及培养瓶的制备
取抗CD3单克隆抗体（50ng/mL）750ng、抗CD16单克隆抗体（50ng/mL）750ng溶解于15mL的PBS中，混匀，即为包被激活液，取15mL的混合液加入到T75细胞培养瓶中，4°C过夜。
3、外周血的制备
取50mL外周血，离心，离心所得细胞为后续细胞培养使用，取血清，将所得血清于56°C灭活30min，冷析1h，再离心，取血清4°C保存备用。
4、细胞培养步骤
（1）取两支离心管，每支离心管中加20mL淋巴细胞分离液，将上述所得细胞用D-PBS重悬并调整至50mL，分别向每支装有20mL淋巴细胞分离液的离心管中缓缓添加25mL重悬细胞液，利用密度梯度离心法收集PBMC；
（2）将收集的PBMC用D-PBS清洗2遍，将清洗后的PBMC按照1.5×106cells/mL重悬于100mL的X-VIVO15培养基中，然后加入300 IU/mL的IL-2、20ng/mL的IL-12和20ng/mL的IL-15，同时添加自体血清5mL，置于二氧化碳培养箱孵育；
（3）第3天补加X-VIVO15培养基150mL，补加300 IU/mL的IL-2、20ng/mL的IL-12和20ng/mL的IL-15各150μL，补加自体血清5 mL；
（4）第6天补加X-VIVO15培养基250mL，补加300 IU/mL的IL-2、20ng/mL的IL-12和20ng/mL的IL-15各250μL，然后分别转移至2个培养袋中，每个培养袋加自体血清5 mL；
(5)第9天分别在两个培养袋补加X-VIVO15培养基350mL，补加300IU/mL的IL-2、20ng/mL的IL-12和20ng/mL的IL-15各350μL，每个培养袋加自体血清5mL；
(6)第12天分别在两个培养袋补加X-VIVO15培养基400mL，补加300IU/mL的IL-2、20ng/mL的IL-12和20ng/mL的IL-15各400μL，每个培养袋添加自体血清5mL；
(7)第16天收集细胞，取样做流式和杀伤。
对比例5 无血清培养液 ALyS505N-0
1、包被液的配置及培养瓶的制备
用PBS稀释Herceptin（21mg/mL）和丙球蛋白（5%）至浓度分别为 0.95mg/mL和1mg/mL，混匀后，用稀释好的Herceptin和人丙球蛋白进行包被板子，均匀的铺满瓶底，置于4°C冰箱中过夜，次日取出，将液体倒出，用PBS洗2遍，即为包被瓶。
2、外周血的制备
取外周血 4-10mL，用 Ficoll 法进行密度梯度离心，离心速度为 350×g，15~20min，吸取中界面层的单个核细胞用PBS洗涤3次。
3、细胞培养步骤
加入无血清培养基，调整细胞浓度为2.0×106/mL，然后加入细胞因子IL-2至终浓度10ng/mL，IL-15至终浓度50ng/mL，加入提前包被的培养瓶中。37°C，5% CO2孵箱中连续培养15天，每3天补加含细胞因子IL-2（20ng/mL）+IL-15（100ng/mL）的无血清培养基一次，补液量为目前液体量的2倍，补充所需的刺激因子以保持细胞因子的浓度不变。
效果例2
对比例4、对比例5培养获得细胞的性能如表18、图16和图17所示。
表18.对比例4和对比例5细胞相关检测指标
对比例4中，培养的NK细胞到第16天，NK细胞比例为7.58%，在NK细胞与肿瘤细胞效靶比为15:1时，杀伤肿瘤的能力为31.2%，且分泌IFN-γ的浓度为6.3pg/mL，NK细胞的扩增倍数为500倍。
对比例5中，培养的NK细胞到第16天，NK细胞比例为13.6%，在NK细胞与肿瘤细胞效靶比为15:1时，杀伤肿瘤的能力为51.5%，且分泌IFN-γ的浓度为7.4pg/mL，NK细胞的扩增倍数为1500倍。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (11)
1.包被组合物，其特征在于，为CD3单抗和丙球蛋白；
所述CD3单抗的浓度为1~10μg/mL；所述丙球蛋白的浓度为1~50μg/mL。
2.如权利要求1所述的包被组合物在促进体外NK细胞增殖和/或杀伤能力中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，自体或异体人外周血单个核细胞密度与所述包被组合物中的CD3单抗的比值为（1.0×106~2.0×106个/mL）：（1~30μg/mL）；
自体或异体人外周血单个核细胞密度与所述包被组合物中的丙球蛋白的比值为（1.0×106~2.0×106个/mL）：（1~200μg/mL）。
4.包被方法，其特征在于，取如权利要求1所述的包被组合物包被细胞培养装置。
5.如权利要求4所述的包被方法，其特征在于，所述包被的条件包括4℃避光放置12~18h或20~30℃避光放置4h。
6.试剂组合，其特征在于，包括培养液和如权利要求1所述的包被组合物；
所述培养液包括50~200W IU IL-2和GT-T551-H3培养液。
7.如权利要求6所述的试剂组合，其特征在于，所述培养液包括60~100W IU IL-2和GT-T551-H3培养液。
8.自体或异体NK细胞的培养方法，其特征在于，基于如权利要求6或7所述的试剂组合培养细胞。
9.如权利要求8所述的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：取如权利要求1所述包被组合物对细胞培养装置进行包被，获得包被细胞培养装置；
步骤2：将自体或异体人外周血的单个核细胞接种于含有所述培养液的所述包被细胞培养装置中进行培养。
10.如权利要求9所述培养方法，其特征在于，所述自体或异体人外周血的单个核细胞接种的密度为1.0×106~2.0×106个/mL。
11.如权利要求9或10所述的培养方法，其特征在于，所述培养还包括补充培养液的步骤；
以接种的时间为第0天，所述补充培养液的时间分别为第2、4、7、9、11、14天；所述补充培养液的体积为补液前体积的1~3倍。
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Citations (8)
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|---|---|---|---|---|
| CN103990127A (zh) * | 2013-02-17 | 2014-08-20 | 复旦大学 | 一种治疗肿瘤的药物组合物 |
| CN104371974A (zh) * | 2014-10-24 | 2015-02-25 | 杭州阿德莱诺泰制药技术有限公司 | 一种自体外周血淋巴细胞cik的培养方法 |
| CN108690830A (zh) * | 2017-04-11 | 2018-10-23 | 上海尚泰生物技术有限公司 | 一种高效扩增nkt细胞的方法 |
| CN112029720A (zh) * | 2020-08-24 | 2020-12-04 | 海南优尼科尔生物科技有限公司 | 一种人外周血nk细胞库的构建方法 |
| CN113474004A (zh) * | 2018-09-12 | 2021-10-01 | Gc细胞治疗 | 用于治疗肿瘤的包含抗cd19抗体和自然杀伤细胞的药物组合 |
| CN113710691A (zh) * | 2019-02-20 | 2021-11-26 | 罗格斯新泽西州立大学 | 自然杀伤和嵌合抗原受体修饰的细胞的扩增 |
| WO2022226130A1 (en) * | 2021-04-21 | 2022-10-27 | Indapta Therapeutics, Inc. | Methods of treatment and dosing of natural killer cell compositions |
| CN115896016A (zh) * | 2022-09-07 | 2023-04-04 | 普华赛尔生物医疗科技有限公司 | 培养组合物及其在培养免疫细胞中的应用 |
-
2023
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Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103990127A (zh) * | 2013-02-17 | 2014-08-20 | 复旦大学 | 一种治疗肿瘤的药物组合物 |
| CN104371974A (zh) * | 2014-10-24 | 2015-02-25 | 杭州阿德莱诺泰制药技术有限公司 | 一种自体外周血淋巴细胞cik的培养方法 |
| CN108690830A (zh) * | 2017-04-11 | 2018-10-23 | 上海尚泰生物技术有限公司 | 一种高效扩增nkt细胞的方法 |
| CN113474004A (zh) * | 2018-09-12 | 2021-10-01 | Gc细胞治疗 | 用于治疗肿瘤的包含抗cd19抗体和自然杀伤细胞的药物组合 |
| CN113710691A (zh) * | 2019-02-20 | 2021-11-26 | 罗格斯新泽西州立大学 | 自然杀伤和嵌合抗原受体修饰的细胞的扩增 |
| CN112029720A (zh) * | 2020-08-24 | 2020-12-04 | 海南优尼科尔生物科技有限公司 | 一种人外周血nk细胞库的构建方法 |
| WO2022226130A1 (en) * | 2021-04-21 | 2022-10-27 | Indapta Therapeutics, Inc. | Methods of treatment and dosing of natural killer cell compositions |
| CN115896016A (zh) * | 2022-09-07 | 2023-04-04 | 普华赛尔生物医疗科技有限公司 | 培养组合物及其在培养免疫细胞中的应用 |
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