CN116179484A - 一种来源于肿瘤组织的t淋巴细胞的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法及应用，通过对肿瘤组织进行消化分离，获得的细胞给予连续刺激并使用特定培养基进行定向诱导扩增培养，在细胞达到一定数量后使用磁珠进行分选，对获得的特异性杀伤细胞继续扩增，直到细胞数量满足多次使用后冻存，对冻存细胞进行复苏，经过10天左右时间培养即可获得满足制剂需求的细胞数量并制成细胞悬液。本发明采用连续刺激加定向培养的扩增方式，在细胞接种初始即给予刺激，相比传统培养方法先无差别扩增种子细胞再定向刺激的方式，可大大提高细胞扩增效率。使用磁珠分选，对特异性杀伤细胞进一步提纯，再大规模扩增，可使细胞维持高水平的生物活性，1次冻存的种子细胞能够满足4‑6次回输应用。

Description

一种来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及T淋巴细胞制剂领域，特别涉及一种来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法及应用。
背景技术
近几年，随着生物医药领域的迅猛发展，免疫疗法逐渐成为继手术、放疗、化疗后第四类肿瘤治疗手段，其中过继性细胞治疗、免疫检查点阻断疗法、肿瘤疫苗以及双特异性抗体等治疗方法均取得了一定的临床疗效。然而在实体瘤发展过程中，实体肿瘤的物理屏障及其复杂的肿瘤微环境限制了非特异性免疫治疗的疗效。
来自肿瘤内部或肿瘤组织附近的肿瘤组织浸润性淋巴细胞，对肿瘤细胞具有特异性识别能力，在1922年首次被提到，Mac carty推测淋巴细胞到肿瘤组织内是体内免疫系统抵抗肿瘤的一种现象，提出了肿瘤组织浸润性淋巴细胞是一种高效抗癌的免疫效应细胞。1986年Rosenberg等人在荷瘤小鼠的肿瘤组织内发现并分离出了肿瘤组织浸润性淋巴细胞，他们将分离出的细胞经过体外扩增培养后，再回输到荷瘤小鼠体内，发现肿瘤组织有明显消退，从而证明肿瘤组织浸润性淋巴细胞具有抗肿瘤的作用。
常规的肿瘤特异性杀伤T淋巴细胞培养方法，多采用两步法进行培养，先用高浓度的IL-2扩增细胞数量，再用CD3单抗、CD28单抗或辐照的人外周血PBMC等对细胞进行刺激以提高效应细胞的比例，培养周期通常在20-25天，也有研究培养到36天，此方法最后收获的细胞，往往生物活性均有所降低，杀伤性细胞比例偏低，最终制剂中含有较高比例的调节性T淋巴细胞，严重影响临床治疗效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供了一种来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法及应用，可大大提高具有特异性识别肿瘤抗原的细胞比例，免磁珠残留，确保制剂细胞品质。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1.将手术后废弃的肿瘤组织进行清洗、分割，放入消化液中震荡消化30-40min；
S2.组织消化后过滤、洗涤、离心，用T淋巴细胞完全培养基重悬沉淀后加入到预先包被的培养瓶中，补加IFN-γ至终浓度1000-1500IU/ml，进行细胞培养；
S3.每日观察细胞状态，取样计数，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在(0.3-0.8)×109/L，继续细胞培养；
S4.继续每日观察细胞状态，当培养体系达到10-15ml时，取样计数，将细胞转移至预先包被的培养瓶中；根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在(0.3-0.8)×109/L，补加IFN-γ至终浓度1000-1500IU/ml，继续细胞培养；
S5.继续每日观察细胞状态，取样计数，当培养体系达到25-45ml时，将细胞转入另一培养瓶中，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在(0.3-0.8)×109/L，继续细胞培养；
S6.继续每日观察细胞状态，取样计数，当细胞总数达到1×108时，使用CD4磁珠对细胞进行分选，所得阴选细胞重新接种至培养瓶中，调整细胞浓度在(0.3-0.8)×109/L，补加T淋巴细胞完全培养基继续培养；
S7.继续每日观察细胞状态，取样计数，当细胞总数达到(1.0-2.0)×108时，将细胞按照(2.5～4.0)×107个细胞/支，冻存4-6支，程控降温后冻存于-196℃液氮罐中；
S8.复苏1支细胞，接种到预先包被的培养瓶中，补加IFN-γ至终浓度1000-1500IU/ml，补加T淋巴细胞完全培养基继续培养；
S9.继续每日观察细胞状态，取样计数，当培养体系达到180-200ml时，将细胞转入细胞培养袋中，按照20-50ng/ml向培养袋中补加CD3和CD28单抗，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在(0.3-0.8)×109/L，继续细胞培养；
S10.继续每日观察细胞状态，取样计数，当培养体系达到1600-2000ml且细胞总数在4-6×109以上时，收获全部细胞。
所述预先包被的培养瓶的方法为：用含有CD3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基包被培养瓶置于37℃，5.0％ CO2条件下0.5-1h。
步骤S1中，每立方厘米组织块加入10-15ml消化液。
步骤S1中，消化液为含有0.075-0.15g/ml的Ⅰ型胶原酶的1640培养基。
T淋巴细胞完全培养基为含有体积浓度10％～20％胎牛血清、体积浓度2％50X氨基酸和4000～6000IU/ml IL-2的X-VIVO 15培养基。
CD3和CD28两种单抗的含量为20～50ng/cm2。
上述的制备方法制得的来源于肿瘤组织的T淋巴细胞在制备肿瘤特异性药物中的应用。
上述制备方法制备得到的来源于肿瘤组织的T淋巴细胞。
一种肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞制剂，包括上述的来源于肿瘤组织的T淋巴细胞。
本发明的有益效果是：本发明从含有大量具有特异性识别肿瘤抗原的免疫细胞的肿瘤组织及其周围组织中分离获得种子细胞，经体外定向培养，进一步分选，可大大提高具有特异性识别肿瘤抗原的细胞比例，并且此类细胞主要为杀伤性T细胞，进入到人体除自身发挥抗肿瘤作用外，还可分泌多种细胞因子，积极调动人体免疫系统协同进行肿瘤杀伤。本发明选用CD4磁珠阴选的分选方式，能够有效降低调节性T细胞出现在细胞制剂中的可能，还可以避免磁珠残留，确保制剂细胞品质。分选后对细胞继续扩增，再进行冻存，能够最大限度保持冻存细胞的活性和稳定性，切实满足多次制剂回输需求，为治疗效果提供保障。
附图说明
图1是本发明实施例1D3镜下观察细胞扩增状态图(4倍镜)；
图2是本发明实施例1培养D9天细胞分选前流式结果图；
图3是本发明实施例1复苏培养D10天流式结果图；
图4是本发明实施例1细胞扩增曲线图；
图5是本发明实施例2D3镜下观察细胞扩增状态图(4倍镜)；
图6是本发明实施例2培养D9天细胞分选前流式结果图；
图7是本发明实施例2复苏培养D12天流式结果图；
图8是本发明实施例2细胞扩增曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)种子细胞的提取：手术获得的肿瘤组织，体积不小于1cm×1cm×1cm。使用1640培养基清洗一遍后，将组织放入无菌培养皿中，用无菌手术刀和镊子将其分割成若干2-3mm3的小块，放入离心管中，补充消化液混匀，放入恒温振荡器37℃振荡消化30-40min。每立方厘米组织块补充10-15ml消化液，消化液成分：1640培养基含有0.075-0.15g/ml的Ⅰ型胶原酶。
(2)T淋巴细胞培养：提前使用1ml含有CD3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基包被T-25培养瓶置于37℃，5.0％ CO2条件下0.5-1h备用，两种单抗的含量为20-50ng/cm2。组织消化后以200um孔径滤网过滤，补加20-30ml 1640培养基300-500g条件下离心8-10min，然后弃上清，使用4-6ml T淋巴细胞完全培养基重悬沉淀后加入到已包被的T-25培养瓶中，该完全培养基为包括体积分数10-20％胎牛血清、体积分数2％50X必需氨基酸(BI/01-325-1B)、4000-6000IU/ml IL-2的X-VIVO 15培养基(LONZA/04-418Q)。向培养瓶中补加IFN-γ至终浓度1000-1500IU/ml，放入37℃、5％CO2培养箱进行培养。
(3)每日观察细胞状态，取样计数，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在0.3-0.8×109/L，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(4)继续每日观察细胞状态，当培养体系达到10-15ml时，取样计数，提前使用3ml含有CD3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基包被T-75培养瓶0.5-1h备用，两种单抗的含量为20-50ng/cm2。将细胞转移至已包被的T-75培养瓶中，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在0.3-0.8×109/L，补加IFN-γ至终浓度1000-1500IU/ml，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(5)继续每日观察细胞状态，取样计数，当培养体系达到25-45ml时，将细胞转入新的T-175培养瓶中，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在0.3-0.8×109/L，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(6)继续每日观察细胞状态，取样计数，当细胞总数达到1×108时，使用CD4磁珠对细胞进行分选，所得阴选细胞接种至新的T-175培养瓶中，调整细胞浓度在0.3-0.8×109/L，补加T淋巴细胞完全培养基继续培养。
(7)继续每日观察细胞状态，取样计数，当细胞总数达到1.0-2.0×108时，将细胞按照2.5-4.0×107/3ml/支灌装至5ml冻存管中，程序降温后放入-196℃液氮冻存，冻存管数4-6支。
(8)复苏1支细胞，接种到预先包被的T-175培养瓶中，包被方法同步骤2，补加IFN-γ至终浓度1000-1500IU/ml，调整细胞浓度在0.3-0.8×109/L，补加T淋巴细胞完全培养基继续培养。
(9)继续每日观察细胞状态，取样计数，当培养体系达到180-200ml时，将细胞转入新的细胞培养袋中，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在0.3-0.8×109/L，按照20-50ng/ml向培养袋中补加CD3和CD28单抗，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(7)继续每日观察细胞状态，取样计数，当培养体系达到1600-2000ml且细胞总数在4-6×109以上时，收获全部细胞悬液至4个500ml离心杯中，300-500g离心10-20min后弃掉离心上清，加入含0.2-0.4％人血白蛋白的氯化钠注射液重悬细胞后，300-500g离心10-20min清洗细胞2-3次，使用含1-3％人血白蛋白的氯化钠注射液重悬细胞，制成肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞制剂。
通过采用上述技术方案，通过对肿瘤组织进行消化分离，获得的细胞给予连续刺激并使用特定培养基进行定向诱导扩增培养，达到一定数量后使用磁珠对细胞进行分选，得到的特异性杀伤细胞继续扩增，满足多次使用量后冻存，冻存细胞复苏后经过10天左右时间培养即可获得满足制剂需求的细胞数量并制成细胞悬液。本发明采用连续刺激加定向培养的扩增方式，在细胞接种初始即给予刺激，相比传统培养方法先扩增种子细胞数再刺激的方式，可大大提高细胞扩增效率。使用磁珠分选，对特异性杀伤细胞进一步提纯，再大规模扩增，使细胞维持高水平的生物活性，冻存的种子细胞可满足4-6次应用回输。
实施例1
具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞制剂的制备：
(1)细胞提取：手术获得的肿瘤组织，1.2cm×0.9cm×1cm。使用10ml 1640培养基清洗一遍后，将组织放在一个无菌培养皿上，用手术刀和镊子将其分割成2-3mm3的组织块，放入1个50ml离心管中，补充15ml消化液(消化液成分：13.5ml 1640培养基和1.5mlⅠ型胶原酶原液(1640培养基含有1g/mlⅠ型胶原酶))，混匀后放入恒温振荡器37℃振荡消化30min。
(2)T淋巴细胞培养：使用1ml CD3和CD28单抗包被液包被1个T-25培养瓶0.5h备用(包被液成分：含浓度为1ug/ml的CD3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基)，两种单抗的含量为40ng/cm2。组织消化后经200um孔径滤网过滤至1个新的50ml离心管中，补加20ml 1640培养基，500g离心10min后弃上清，使用4ml T淋巴细胞完全培养基重悬沉淀后加入到已包被的T-25培养瓶中，补加IFN-γ至终浓度1000IU/ml，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱进行培养。T淋巴细胞完全培养基为包括体积分数10％胎牛血清、体积分数2％50X必需氨基酸(BI/01-325-1B)、4000IU/ml IL-2的X-VIVO 15培养基(LONZA/04-418Q)。
(3)每日观察细胞状态，培养D3天镜下可见少量细胞团块(参见图1)，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:0.3×109/L。放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(4)培养D4天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:1.0×109/L，补加5ml T淋巴细胞完全培养基，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(5)培养D5天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:1.0×109/L，使用3ml CD3和CD28单抗包被液包被1个T-75培养瓶0.5h备用，两种单抗的含量为40ng/cm2。将细胞转移至已包被的T-75培养瓶中，根据计数结果补加7ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，补加IFN-γ至终浓度1000IU/ml。混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(6)培养D6天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:0.8×109/L，根据计数结果补加12ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(7)培养D7天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:1.0×109/L，将细胞转入新的T-175培养瓶中，根据计数结果补加32ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(8)培养D8天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:1.0×109/L，根据计数结果补加64ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(9)培养D9天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:1.1×109/L，将全部细胞回收，取样送检表面标志物(结果见图2)，根据CD4磁珠使用说明书向剩余细胞中添加200ul磁珠，孵育后一并通过分选柱进行分选，所得阴选细胞总数3×107，将其接种于1个T-175培养瓶中，补加T淋巴细胞完全培养基至总体积60ml，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(10)培养D10天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:0.5×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(11)培养D11天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:1.1×109/L，根据计数结果补加13ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(12)培养D12天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:2.2×109/L，细胞总数1.60×108，回收全部细胞悬液500g、10min配平离心，离心后使用8.4ml 1640培养基重悬细胞，补加3.6ml冻存保护液(冻存保护液成分为体积分数10％DMSO(ORIGEN/CP-70)、体积分数20％胎牛血清)混匀后按照3ml/支灌装至4个5ml冻存管中，放入程控降温盒后转入-80℃冰箱，24h后转入-196℃液氮保存。
(13)复苏培养D0天，使用5ml CD3和CD28单抗包被液包被1个T-175培养瓶0.5h备用(包被液成分：含浓度为1ug/ml的CD3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基)，两种单抗的含量为40ng/cm2。金属浴复苏1支冻存细胞，接种至已包被的T-175培养瓶中，补加IFN-γ至终浓度1000IU/ml，补加T淋巴细胞完全培养基至总体积80ml，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱培养。
(14)复苏培养D1天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:0.5×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(15)复苏培养D2天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:0.5×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(16)复苏培养D3天，吹打混匀细胞取样计数计活率，计数结果WBC:0.7×109/L，补加32ml T细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(17)复苏培养D4天，吹打混匀细胞取样计数计活率，计数结果WBC:0.5×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(18)复苏培养D5天，吹打混匀细胞取样计数计活率，计数结果WBC:1.1×109/L，将细胞转入新的细胞培养袋中，根据计数结果补加134ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，按照40ng/ml向培养袋中补加CD3和CD28单抗，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(19)复苏培养D6天，吹打混匀细胞取样计数计活率，计数结果WBC:0.7×109/L，根据计数结果补加98ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(20)复苏培养D7天，吹打混匀细胞取样计数计活率，计数结果WBC:1.2×109/L，根据计数结果补加619ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(21)复苏培养D8天，吹打混匀细胞取样计数计活率，计数结果WBC:1.3×109/L，补加939ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.7×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(22)复苏培养D9天，吹打混匀细胞取样计数计活率，计数结果WBC:2.0×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(23)复苏培养D10天，吹打混匀细胞取样计数计活率，计数结果WBC:3.2×109/L，细胞总数：6.4×109。取1ml细胞悬液进行表面标志物检测(结果见图3)。其余细胞悬液全部收获至4个500ml离心杯中，配平500g离心10min后弃掉离心上清，使用两瓶洗液将细胞重悬至2个500ml离心杯中(每瓶洗液为500ml氯化钠注射液加1ml人血白蛋白，人血白蛋白浓度为0.2％)。重悬细胞后配平，500g离心10min清洗细胞3次，使用200ml保存液重悬细胞(保存液为194ml氯化钠注射液加6ml人血白蛋白，人血白蛋白浓度为3％)，制成肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞制剂。扩增曲线见图4(4a：细胞扩增浓度曲线；4b：细胞扩增数量曲线)，细胞活率见表1。
表1：复苏培养D10天细胞活率
Figure BDA0004017024920000081
实施例2
具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞制剂的制备：
(1)种子细胞的提取：手术获得的肿瘤组织，1.1cm×0.7cm×1.0cm。使用10ml1640培养基清洗一遍后，将组织放在一个无菌培养皿上，用手术刀和镊子将其分割成2-3mm3的组织块，放入1个50ml离心管中，补充15ml消化液(消化液成分：13.5ml 1640培养基和1.5mlⅠ型胶原酶原液(1640培养基含有1g/mlⅠ型胶原酶))，混匀后放入恒温振荡器37℃振荡消化30min。
(2)T淋巴细胞培养：使用1ml CD3和CD28单抗包被液包被1个T-25培养瓶0.5h备用(包被液成分：含浓度为1ug/ml的CD3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基)，两种单抗的含量为40ng/cm2。组织消化后经200um孔径滤网过滤至1个新的50ml离心管中，补加30ml 1640培养基离心10min后弃上清，使用4ml T淋巴细胞完全培养基重悬沉淀后加入到已包被的T-25培养瓶中，补加IFN-γ至终浓度1500IU/ml，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱进行培养。T淋巴细胞完全培养基为包括体积分数10％胎牛血清、体积分数2％ MEM-Eagle AminoAcids Solution(BI/01-325-1B)、4000IU/ml IL-2的X-VIVO 15培养基(LONZA/04-418Q)。
(3)每日观察细胞状态，培养D3天镜下可见少量细胞团块(参见图5)，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:0.3×109/L。放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(4)培养D4天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:0.4×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(5)培养D5天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:1.1×109/L，根据计数结果补加6ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(6)培养D6天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:1.2×109/L，使用3ml CD3和CD28单抗包被液包被1个T-75培养瓶0.5h备用，两种单抗的含量为40ng/cm2。将细胞转移至已包被的T-75培养瓶中，根据计数结果补加12ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，补加IFN-γ至终浓度1500IU/ml。混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(7)培养D7天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:0.8×109/L，将细胞转入新的T-175培养瓶中，根据计数结果补加16ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(8)培养D8天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:1.0×109/L，根据计数结果补加42ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(9)培养D9天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:1.3×109/L，将全部细胞回收，取样送检表面标志物(结果见图6)，根据CD4磁珠使用说明书向剩余细胞中添加200ul磁珠，孵育后一并通过分选柱进行分选，所得阴选细胞总数2×107，将其接种于1个T-175培养瓶中，补加T淋巴细胞完全培养基至总体积40ml，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(10)培养D10天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:0.5×109/L，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(11)培养D11天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:0.5×109/L，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(12)培养D12天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:0.6×109/L，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(13)培养D13天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:1.1×109/L，根据计数结果补加48ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(14)培养D14天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:1.3×109/L，细胞总数1.14×108，回收全部细胞悬液500g、10min配平离心，离心后使用8.4ml 1640培养基重悬细胞，补加3.6ml冻存保护液(冻存保护液成分为体积分数10％DMSO(ORIGEN/CP-70)、体积分数20％胎牛血清)混匀后按照3ml/支灌装至4个5ml冻存管中，放入程控降温盒后转入-80℃冰箱，24h后转入-196℃液氮保存。
(15)复苏培养D0天，使用5ml CD3和CD28单抗包被液包被1个T-175培养瓶0.5h备用(包被液成分：含浓度为1ug/ml的CD3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基)，两种单抗的含量为40ng/cm2。金属浴复苏1支冻存细胞，接种至已包被的T-175培养瓶中，补加IFN-γ至终浓度1000IU/ml，补加T淋巴细胞完全培养基至总体积80ml，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱培养。
(16)复苏培养D1天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:0.4×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(17)复苏培养D2天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:0.5×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(18)复苏培养D3天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:0.7×109/L，根据计数结果补加32ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(19)复苏培养D4天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:0.7×109/L，根据计数结果补加45ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(20)复苏培养D5天，吹打混匀细胞取样计数，计数结WBC:0.8×109/L，将细胞转入新的细胞培养袋中，根据计数结果补加94ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，按照40ng/ml向培养袋中补加CD3和CD28单抗，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(21)复苏培养D6天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:0.9×109/L，根据计数结果补加201ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(22)复苏培养D7天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:0.7×109/L，根据计数结果补加181ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(23)复苏培养D8天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:0.9×109/L，根据计数结果补加507ml T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(24)复苏培养D9天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:1.0×109/L，补加860ml T淋巴细胞完全培养基，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(25)复苏培养D10天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:1.7×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(26)复苏培养D11天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:2.4×109/L，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。
(27)复苏培养D12天，吹打混匀细胞取样计数，计数结果WBC:3.1×109/L，细胞总数：6.2×109。取1ml细胞悬液进行表面标志物检测(结果见图7)，其余细胞悬液全部收获至4个500ml离心杯中，配平500g离心10min后弃掉离心上清，使用两瓶洗液将细胞重悬至2个500ml离心杯中(每瓶洗液为500ml氯化钠注射液加1ml人血白蛋白，人血白蛋白含量为0.2％)。重悬细胞后配平，500g离心10min清洗细胞3次，使用200ml保存液重悬细胞(保存液为194ml氯化钠注射液加6ml人血白蛋白，人血白蛋白含量为3％)，制成肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞制剂。扩增曲线见图8(8a：细胞扩增浓度曲线；8b：细胞扩增数量曲线)，细胞活率见表2。
表2：复苏培养D12天细胞活率
Figure BDA0004017024920000121
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

Claims (9)

1.一种来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将手术后废弃的肿瘤组织进行清洗、分割，放入消化液中震荡消化30-40min；
S2.组织消化后过滤、洗涤、离心，用T淋巴细胞完全培养基重悬沉淀后加入到预先包被的培养瓶中，补加IFN-γ至终浓度1000-1500IU/ml，进行细胞培养；
S3.每日观察细胞状态，取样计数，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在(0.3-0.8)×109/L，继续细胞培养；
S4.继续每日观察细胞状态，当培养体系达到10-15ml时，取样计数，将细胞转移至预先包被的培养瓶中；根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在(0.3-0.8)×109/L，补加IFN-γ至终浓度1000-1500IU/ml，继续细胞培养；
S5.继续每日观察细胞状态，取样计数，当培养体系达到25-45ml时，将细胞转入另一培养瓶中，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在(0.3-0.8)×109/L，继续细胞培养；
S6.继续每日观察细胞状态，取样计数，当细胞总数达到1×108时，使用CD4磁珠对细胞进行分选，所得阴选细胞重新接种至培养瓶中，调整细胞浓度在(0.3-0.8)×109/L，补加T淋巴细胞完全培养基继续培养；
S7.继续每日观察细胞状态，取样计数，当细胞总数达到(1.0-2.0)×108时，将细胞按照(2.5～4.0)×107个细胞/支，冻存4-6支，程控降温后冻存于-196℃液氮罐中；
S8.复苏1支细胞，接种到预先包被的培养瓶中，补加IFN-γ至终浓度1000-1500IU/ml，补加T淋巴细胞完全培养基继续培养；
S9.继续每日观察细胞状态，取样计数，当培养体系达到180-200ml时，将细胞转入细胞培养袋中，按照20-50ng/ml向培养袋中补加CD3和CD28单抗，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在(0.3-0.8)×109/L，继续细胞培养；
S10.继续每日观察细胞状态，取样计数，当培养体系达到1600-2000ml且细胞总数在4-6×109以上时，收获全部细胞。
2.根据权利要求1所述来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述预先包被的培养瓶的方法为：用含有CD3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基包被培养瓶置于37℃，5.0％CO2条件下0.5-1h。
3.根据权利要求1所述来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤S1中，每立方厘米组织块加入10-15ml消化液。
4.根据权利要求1所述来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，步骤S1中，消化液为含有0.075-0.15g/ml的Ⅰ型胶原酶的1640培养基。
5.根据权利要求1所述来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，T淋巴细胞完全培养基为含有体积浓度10％～20％胎牛血清、体积浓度2％50X氨基酸和4000～6000IU/ml IL-2的X-VIVO 15培养基。
6.根据权利要求2所述来源于肿瘤组织的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，CD3和CD28两种单抗的含量为20～50ng/cm2。
7.如权利要求1-6任一项所述的的制备方法制得的来源于肿瘤组织的T淋巴细胞在制备肿瘤特异性药物中的应用。
8.如权利要求1-6任一项所述制备方法制备得到的来源于肿瘤组织的T淋巴细胞。
9.一种肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞制剂，其特征在于，包括权利要求8所述的来源于肿瘤组织的T淋巴细胞。
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