CN104815323B - 一种树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗及其制备方法。用含抑肽酶和亮抑蛋白酶肽的RPMI‑1640培养基重悬胸腹水离心过滤后的单细胞悬液，将贴壁培养的DC细胞加入上述肿瘤相关全抗原细胞，加入rhTNF‑α、GM‑CSF和/或IL，继续培养，得到肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗。
Description
技术领域：
本发明属于生物制剂领域，特别涉及一种负载肿瘤抗原致敏树突状细胞而获得的树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法。
背景技术：
树突状细胞(DC)是存在于外周血、皮肤、淋巴器官和胸腺中的抗原提呈细胞(APC)，是人体内功能最强的APC，除了具有强大的抗原提呈能力外，在树突状细胞表面上表达的I类和II类分子的抗原肽，能分别激活CD4+和CD8+T细胞，并通过这种激活DC诱导针对特定抗原的体内免疫应答，所述抗原是例如肿瘤相关抗原、病原微生物抗原以及移植物抗原等。
树突状细胞肿瘤疫苗(DC肿瘤疫苗)是一类携带肿瘤抗原信息的功能性树突状细胞，能有效激活特异性T细胞产生免疫应答，产生抗肿瘤效应及免疫记忆功能。DC肿瘤疫苗的优势是能通过特异性肿瘤抗原诱导DC细胞成熟，并通过DC将肿瘤抗原信息传递给T细胞，使T细胞重新认识并杀伤肿瘤细胞。采用不同形式的肿瘤抗原体外冲击致敏DC后可以产生较强的抗肿瘤免疫，抑制肿瘤的生长和转移，并能在患者体内诱发免疫记忆，使患者体内获得长期的抗肿瘤效应从而有效防止肿瘤的复发。
现有的树突状细胞体外负载的抗原主要是已知的肿瘤特异性抗原，即肿瘤细胞株裂解物。由于许多肿瘤的特异性抗原尚未明确且易发生抗原位点变异，另外肿瘤细胞株在体外传代过程中表面抗原可能发生改变，DC细胞不能将该肿瘤的所有抗原有效呈递给效应T细胞，从而限制了效应T细胞在体内的抗肿瘤效应。
传统的胸、腹水肿瘤细胞的提取方法有多种，其中采用密度梯度离心法和贴壁培养法操作较为简单、经济，但由于腹水中含有较多红细胞、肿瘤浸润淋巴细胞等，使制备成的细胞悬液不利于肿瘤细胞的分离；而贴壁培养法是根据肿瘤细胞易贴壁而淋巴细胞不易贴壁的原理，将经淋巴细胞分离液分离得到的淋巴细胞与肿瘤细胞混合培养并根据贴壁特性进行分离获得，由于细胞需要在体外传代培养，其表面抗原可能发生变化；采用免疫磁珠法较为先进，但需要特异性肿瘤细胞抗体，价格较昂贵，成本较高，不利于规模化生产。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有高效肿瘤细胞致敏的DC肿瘤疫苗及其制备方法，特别是采用胸、腹水肿瘤细胞致敏的DC肿瘤疫苗及其制备方法。
本发明是通过下面的技术方案实现上述发明目的的。
一方面，本方法采用胸、腹水肿瘤细胞抗原，与肿瘤特异性抗原相比，该胸、腹水中了细胞抗原中抗原肽丰富，有效避免了肿瘤细胞可能对特异性单一抗原的抵抗作用；与肿瘤细胞株抗原相比，由于胸、腹水肿瘤细胞是原代细胞而避免了肿瘤细胞株在体外传代过程中可能产生表面抗原结构的变异，此外采用患者胸、腹水中特异性肿瘤细胞裂解液作为肿瘤抗原，效应T细胞的杀伤活性更强；且原料中不添加额外的化学药物，安全性更高。
另一方面，本发明在胸、腹水肿瘤抗原制备过程中，使用蛋白酶抑制剂避免了在体外裂解胸、腹水肿瘤细胞过程中胸、腹水肿瘤细胞内的蛋白酶释放到胞外降解胸、腹水肿瘤细胞抗原蛋白，最大程度上保持了胸、腹水肿瘤细胞抗原的完整性，对肿瘤细胞抗原起到很好的保护作用，进而可以通过负载DC细胞制备具有高效杀瘤活性的胸、腹水肿瘤细胞致敏的DC肿瘤疫苗。
第三方面，使用细胞因子刺激增加成熟的树突状细胞数目，对治疗效果的提高起着关键作用，优选使用rhTNF-α，巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或白细胞介素，有效增强树突状细胞扩增倍数，成熟DC细胞的成熟度＞86％，解决了现有DC细胞制备过程中细胞数量少、增殖缓慢等问题。
相对于原有DC培养技术用血量多，扩增倍数少、扩增效率不高等情况，本发明提供的这种新的肿瘤树突状细胞治疗性疫苗的制备方法用于肿瘤的治疗及预防，具有用血量少、制备方法工序简便、细胞增殖数量多、特异性杀伤活性强、疗效好等特点。由于DC在人外周血中比例较低，因此提高扩增倍数，增加成熟的树突状细胞数目，对治疗效果的提高起着关键作用。
本发明提供了一种DC肿瘤疫苗，其特征在于所述疫苗为肿瘤治疗性疫苗。所述的DC肿瘤疫苗，其特征在于所述肿瘤包括：胃癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或食管癌等。
本发明采用的DC细胞，可通过外周血直接采取获得，可通过外周血单个核细胞分离获得，可通过骨髓或其他组织来源的间充质干细胞定向分化获得，还可通过HLA基因半相合或全相合同种异体外周血、外周血单个核细胞、骨髓造血细胞或其他组织来源的间充质干细胞分离或定向分化获得。
本发明还提供了一种肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于：用含抑肽酶和亮抑蛋白酶肽的RPMI-1640重悬胸、腹水离心过滤后的单细胞悬液；将贴壁培养的DC细胞加入上述肿瘤相关全抗原单细胞悬液，加入rhTNF-α、GM-CSF和/或IL，继续培养，得到肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗。
在本发明的实施方案中，肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗的制备方法特征在于包括以下步骤：
1.抗原的制备：包括如下步骤：
(1)取胸、腹水离心，用生理盐水洗涤，经过滤后收取单细胞悬液；
(2)用含抑肽酶(Aprotinin)和亮抑蛋白酶肽(Leupeptin)的RPMI-1640重悬步骤(1)得到的细胞；
2.DC疫苗的制备：将贴壁培养的DC细胞加入上述步骤(2)获得的肿瘤相关全抗原细胞，加入rhTNF-α、GM-CSF和/或IL，继续培养，得到肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗。在优选的实施方案中，用rhTNF-α刺激加入肿瘤相关全抗原的贴壁培养的DC细胞。在另一个优选的实施方案中，用GM-CSF，IL-2和IL-4刺激加入肿瘤相关全抗原的贴壁培养的DC细胞。
优选地，所述抑肽酶终浓度为0.05-2.0mg/ml，亮抑蛋白酶肽终浓度为0.05-2.0mg/ml。所述rhTNF-α浓度为50-2000U/ml，GM-CSF浓度为500U/ml-2000U/ml，IL是IL-2和/或IL-4，浓度为50U/ml-2000U/ml。
在优选的实施方案中，用浓度为50-2000U/ml的rhTNF-α刺激加入肿瘤相关全抗原的贴壁培养的DC细胞。在另一个优选的实施方案中，用浓度为500U/ml-2000U/ml的GM-CSF，浓度为50U/ml-2000U/ml的IL-2和浓度为500U/ml-2000U/ml的IL-4刺激加入肿瘤相关全抗原的贴壁培养的DC细胞。
在本发明的优选实施方案中，肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗的制备方法特征在于包括以下步骤：
1.抗原的制备：包括如下步骤：
(1)取胸、腹水离心，用生理盐水洗涤，经过滤后收取单细胞悬液；
(2)用含终浓度为0.05-2.0mg/ml的抑肽酶，终浓度为0.05-2.0mg/ml亮抑蛋白酶肽的RPMI-1640重悬步骤(1)得到的细胞；
(3)将步骤(2)的细胞速冻后置于水浴中，待混合液完全溶化后，再次抗原制备，反复3-5次；
(4)将步骤(3)的细胞经60-Gy辐照后，将肿瘤细胞裂解物离心，收取上清；
(5)将步骤(4)获得的肿瘤细胞冻溶上清液过滤除菌；
2.DC疫苗的制备：将贴壁培养的DC细胞加入肿瘤相关全抗原，加入rhTNF-α、GM-CSF和/或IL，其中所述rhTNF-α浓度优选为50-2000U/ml，GM-CSF浓度优选为500U/ml-2000U/ml，IL优选是IL-2和/或IL-4，浓度优选为50U/ml-2000U/ml，继续培养，得到肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗。在优选的实施方案中，用浓度为50-2000U/ml的rhTNF-α刺激加入肿瘤相关全抗原的贴壁培养的DC细胞。在另一个优选的实施方案中，用浓度为500U/ml-2000U/ml的GM-CSF，浓度为50U/ml-2000U/ml的IL-2和浓度为500U/ml-2000U/ml的IL-4刺激加入肿瘤相关全抗原的贴壁培养的DC细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，在上述步骤2制备的DC细胞中加入无血清培养基，所述无血清培养基按照如下含量添加各种组分：含有2-10％血浆；500U/ml-2000U/ml的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；500U/ml-2000U/ml的白细胞介素-4(IL-4)；50U/ml-2000U/ml的白细胞介素-2(IL-2)；进一步可以向上述培养液中添加2-10％血浆；作为血清，可以使用例如胎牛血清(FCS)、AB血清或者自体血清，优选为自体血清。本发明同现有技术相比，有效增强了树突状细胞扩增倍数，成熟的树突状细胞数量至少达到1.5X107，成熟DC细胞的成熟度＞86％，解决了现有DC细胞制备过程中细胞数量少、增殖缓慢等问题。
在本发明的实施方案中，DC细胞可通过外周血直接采取获得，可通过外周血单个核细胞分离获得，可通过骨髓或其他组织来源的间充质干细胞定向分化获得，还可通过HLA基因半相合或全相合同种异体外周血、外周血单个核细胞、骨髓造血细胞或其他组织来源的间充质干细胞分离或定向分化获得。优选地，根据下面的具体步骤获得DC细胞：
(1)将外周全血经密度梯度离心分离出外周血单个核细胞(PBMC)，贴壁培养；
(2)移除孔内上层悬浮细胞和培养液，孔的下层贴壁细胞即为非成熟DC细胞。
更具体地，在本发明更优选的实施方案中，根据如下步骤制备肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗：
1.抗原的制备：胸腹水离心制备细胞抗原，其中使用抑肽酶和亮抑蛋白酶肽，具体地，
(1)取胸、腹水1500-2000ml，在转速800-1500转/分条件下离心3-10分钟，用生理盐水洗涤2-5次，经200-500目网过滤后收取单细胞悬液；
(2)用含终浓度为0.05-2.0mg/ml的抑肽酶(Aprotinin)，含终浓度为0.05-2.0mg/ml亮抑蛋白酶肽(Leupeptin)的RPMI-1640重悬细胞(1X107/ml)后装入无菌冻存管，经水浴加热0.5-2小时后，40-80℃水浴继续加热；
(3)将冻存管迅速浸入液氮速冻，5-10min后取出，迅速置于36-39℃水浴中，待混合液完全溶化后，再次放入液氮中，反复3-5次；
(4)细胞经60-Gy辐照后，将肿瘤细胞裂解物加入离心管，5000-6000转/分离心10-30分钟，收取上清；
(5)肿瘤细胞冻溶上清液经无菌滤器；蛋白定量后储存于液氮保存；
2.DC细胞的分离和获取：具体步骤如下：
(1)将外周全血经密度梯度离心分离出外周血单个核细胞(PBMC)，贴壁培养；
(2)移除孔内上层悬浮细胞和培养液，孔的下层贴壁细胞即为非成熟DC细胞；
3.DC疫苗的制备：通过步骤1得到的肿瘤相关抗原冲击步骤2得到的非成熟DC细胞，然后加入rhTNF-α、GM-CSF和/或IL，其中所述rhTNF-α浓度优选为50-2000U/ml，GM-CSF浓度优选为500U/ml-2000U/ml，IL优选是IL-2和/或IL-4，浓度优选为500U/ml-2000U/ml，将负载肿瘤全抗原的非成熟DC细胞培养成熟，而后制备成肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗。在优选的实施方案中，用浓度为50-2000U/ml的rhTNF-α刺激加入肿瘤相关全抗原的贴壁培养的DC细胞。在另一个优选的实施方案中，用浓度为500U/ml-2000U/ml的GM-CSF，浓度为50U/ml-2000U/ml的IL-2和浓度为500U/ml-2000U/ml的IL-4刺激加入肿瘤相关全抗原的贴壁培养的DC细胞。
另一方面，本发明还提供了一种DC细胞培养基，其特征在于在无血清培养基中含有含量如下的组分：2-10％血浆；500U/ml-2000U/ml的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；500U/ml-2000U/ml的白细胞介素-4；50U/ml-2000U/ml的白细胞介素-2。其中所述无血清培养基包括以下含量的成分：RPMI-1640培养基，其中添加浓度为1-10mM的L-谷氨酰胺，浓度为5-20mg/L的重组人转铁蛋白，浓度为1-10g/L的重组人白蛋白，浓度为1-10mg/L的重组人胰岛素，浓度为10-100mg/L的维生素PP，浓度为10-50mg/L的维生素C，浓度为1-50ng/mL的氢化可的松，浓度为1-10mg/L微量元素，优选硒。本发明DC细胞培养基还可以进一步含有胎牛血清、AB血清或者自体血清。同现有技术相比，本发明培养基有效增强了树突状细胞扩增倍数，成熟的树突状细胞数量至少达到1.5X107，成熟DC细胞的成熟度＞86％，解决了现有DC细胞制备过程中细胞数量少、增殖缓慢等问题。
通过本发明方法制备的肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗是本发明的一部分。包含本发明DC细胞培养基的生物制剂也是本发明的一部分。
附图简要说明：
图1是成熟DC细胞的数量和成熟度的检测结果。
图2是T细胞活化功能的鉴定结果。
图3是DC诱导肿瘤特异性CTL的实验结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
实施例1高效肿瘤细胞致敏的DC肿瘤疫苗的制备
1.胸腹水离心获得细胞抗原：
(1)取胸、腹水1000ml，在转速1200转/分条件下离心5分钟，用生理盐水洗涤3次，经300目网过滤后收取单细胞悬液。
(2)用含终浓度为1.0mg/ml的抑肽酶(Aprotinin)(购自大连美仑生物技术有限公司，产品编号：MB3095)，终浓度为1.0mg/ml亮抑蛋白酶肽(Leupeptin)(购自大连美仑生物技术有限公司，产品编号：MB3063)的RPMI-1640重悬细胞(1X107/ml)后装入5ml无菌冻存管，经水浴加热1小时后，60C水浴继续加热1小时。
(3)将冻存管迅速浸入液氮速冻，5-10min后取出，迅速置于36-39℃水浴中，待混合液完全溶化后，再次放入液氮中，反复3-5次。
(4)细胞经60-Gy辐照后，将肿瘤细胞裂解物加入Falcon离心管，5000-6000转/分离心20分钟，收取上清。
(5)肿瘤细胞冻溶上清液经0.22um的一次性无菌滤器(Pall，4612)过滤除菌。
(6)滤过的肿瘤细胞冻溶上清液经Bradford assay蛋白定量后储存于液氮保存，并做标记。
2.DC细胞的分离和获取：具体步骤是：
(1)将外周全血50ml，经Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离出外周血单个核细胞(PBMC)，采用无血清培养基调整单核细胞浓度为2X106个/ml；
(2)将调整好浓度的单核细胞以3ml/孔加入六孔板中，贴壁12小时；
(3)移除六孔板每个孔内上层悬浮细胞和培养液，在每个孔的下层贴壁细胞即为非成熟DC细胞；
(4)分别加入DC专用培养基3ml/孔，置于37℃、5％CO2培养箱内培养2-3天进行半量换液后继续培养；所述培养DC细胞专用无血清培养基包括以下含量的成分：RPMI-1640培养基(购自美国Gibco公司，货号：31800-105)，其中添加浓度为5mM的L-谷氨酰胺，浓度为10mg/L的重组人转铁蛋白，浓度为8g/L的重组人白蛋白，浓度为5mg/L的重组人胰岛素，浓度为50mg/L的维生素PP，浓度为30mg/L的维生素C，浓度为30ng/mL的氢化可的松，浓度为5mg/L微量元素硒。
3.肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗的制备：具体步骤是：
步骤2获得的上述贴壁培养的DC细胞于第6天加入步骤1获得的肿瘤相关全抗原50ug/ml，次日加入浓度为1000U/ml的rhTNF-α，继续培养24h后检测成熟DC细胞的数量和成熟度。
结果显示：成熟的DC数量至少达到1.5X107，成熟树突状细胞的成熟度＞86％(如图1所示)。
HLA-DR+CD11c+：93.56％
CD40+CD11c+：85.41％
CD80+CD11c+：87.34％
CD83+CD11c+：82.82％
CD86+CD11c+：93.40％
实施例2活性肿瘤细胞致敏的DC肿瘤疫苗的制备
根据实施例1步骤1通过胸腹水离心获得细胞抗原。根据实施例1步骤2分离和获取DC细胞。肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗的制备具体步骤如下：
在步骤2制备获得的DC细胞中加入无血清培养基，所述无血清培养基包括以下含量的成分：RPMI-1640培养基(购自美国Gibco公司，货号：31800-105)，其中添加浓度为5mM的L-谷氨酰胺，浓度为10mg/L的重组人转铁蛋白，浓度为8g/L的重组人白蛋白，浓度为5mg/L的重组人胰岛素，浓度为50mg/L的维生素PP，浓度为30mg/L的维生素C，浓度为30ng/mL的氢化可的松，浓度为5mg/L微量元素硒。所述无血清培养基按照如下含量添加如下组分：含有3％的血浆，1000U/ml的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，1000U/ml的白细胞介素-4(IL-4)，1000U/ml的白细胞介素-2(IL-2)；进一步向上述培养液中添加3％血浆；作为血清，使用胎牛血清(FCS)。
同现有技术相比，上述制备的DC肿瘤疫苗有效增强了树突状细胞扩增倍数，成熟的树突状细胞数量至少达到1.5X107，成熟DC细胞的成熟度＞86％。
实施例3 T细胞活化功能鉴定
取实施例1获得的非成熟imDC、成熟mDC以及自体和异体T淋巴细胞，分别按效靶比(E∶T)＝20∶1的比例加入96孔板中，于37℃、5％CO2培养箱中共同孵育24h后加入CCK-8试剂(Cell Counting Kit，CCK-8，购自日本同仁CCK8试剂盒，产品型号：CK04)20ul/孔，培养3h后，于酶标仪450波长测定OD值。
结果显示：成熟DC细胞(mDC)能有效激活自体或异体T淋巴细胞(如图2所示)。
实施例4 DC疫苗的抗肿瘤效应的实验研究
如下进行DC诱导肿瘤特异性CTL(cytotoxic lymphocyte，CTL)实验：
将实施例1得到的负载肿瘤相关全抗原的DC细胞分别与自体或异体T淋巴细胞按照1∶5、1∶10、1∶20、1∶40分组混合，在RPMI-1640培养基中加入GM-CSF、IL-4、IL-2培养1周，每3天半量换液，维持细胞浓度为1X106/ml；培养1周后按以上比例加入DC细胞再培养48h后获得肿瘤特异性CTL细胞(结果见图3)。
取培养48h后的CTL上清液，按照ELISA试剂盒说明，应用酶标仪在450nm波长处测定A值，计算各组细胞培养上清中IFN-γ的平均浓度，并根据标准曲线计算IFN-γ的分泌量。
实施例5 DC诱导肿瘤特异性CTL致敏DC肿瘤疫苗的体外抗肿瘤作用试验
取96孔板加入原代培养的肿瘤细胞1X104/100ul/孔，培养3-4天后按E∶T＝20∶1的比例加入CTL，同时设单一靶细胞、单一效应细胞及空白对照，每组设3个复孔，培养24h后加入CCK-8试剂20ul/孔，共同培养3h后用酶标仪于450nm波长处测定A值，按照如下公式计算CTL对肿瘤细胞的特异性杀伤效率(％)。
杀伤效率(％)＝[1-(实验孔OD值-效应孔OD值/靶细胞孔OD值)]X100％
结果显示：
由负载自体肿瘤相关抗原的DC诱导产生的效应CTL细胞对原代培养的自体肿瘤细胞的杀伤效率为85.67％±0.56％，显著高于对异体原代肿瘤细胞的杀伤效率(20.05％±0.67％；P＜0.01)。
Claims (5)
1.一种肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于：用含抑肽酶和亮抑蛋白酶肽的RPMI-1640重悬胸腹水离心过滤后的单细胞悬液；将贴壁培养的DC细胞加入上述肿瘤相关全抗原单细胞悬液，加入rhTNF-α、GM-CSF和/或IL进行刺激，继续培养，得到肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗；
所述抑肽酶终浓度为0.05-2.0mg/ml；亮抑蛋白酶肽终浓度为0.05-2.0mg/ml。
2.根据权利要求1所述的肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于：所述rhTNF-α的浓度为50-2000U/ml，所述GM-CSF的浓度为500U/ml-2000U/ml，所述IL是IL-2和/或IL-4，浓度为50U/ml-2000U/ml。
3.根据权利要求2所述的肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于：用浓度为50-2000U/ml的rhTNF-α刺激加入肿瘤相关全抗原的贴壁培养的DC细胞。
4.根据权利要求2所述的肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于：用浓度为500U/ml-2000U/ml的GM-CSF，浓度为50U/ml-2000U/ml的IL-2和浓度为500U/ml-2000U/ml的IL-4刺激加入肿瘤相关全抗原的贴壁培养的DC细胞。
5.根据权利要求1所述的肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
－抗原的制备：包括
(1)取胸、腹水离心，用生理盐水洗涤，经过滤后收取单细胞悬液；
(2)用含抑肽酶和亮抑蛋白酶肽的RPMI-1640重悬步骤(1)得到的细胞；
－DC疫苗的制备：将贴壁培养的DC细胞加入步骤(2)得到的肿瘤相关全抗原细胞，加入rhTNF-α、GM-CSF和/或IL，继续培养，得到肿瘤细胞致敏DC肿瘤疫苗。
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