CN104946588A - 一种抗原特异性t淋巴细胞的分离和高效扩增培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗原特异性T淋巴细胞的分离和高效扩增培养方法，利用免疫磁珠技术结合活化的T细胞表达CD137的特性将抗原特异性T淋巴细胞从复杂的细胞群中分离出来，再经过体外高效扩增培养获得高肿瘤杀伤活性的抗原特异性T淋巴细胞。培养中加入CD137L（CD137-配体）、IL-7，IL-15，IL-2避免培养中容易发生已活化诱导的细胞凋亡的现象，提高扩增倍数和抗原特异性T淋巴细胞的杀伤活性。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，涉及抗原特异性T淋巴细胞的分离和高效扩增培养方法。
背景技术
树突状细胞(dendritic cells,DC)是目前已知功能最强的专职抗原呈递细胞(antigenprocess cells,APC)，它在诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。用荷载肿瘤抗原的DC作为疫苗进行免疫治疗，能够刺激机体产生针对肿瘤抗原的特异性细胞毒T细胞免疫应答(cytotoxic T lymphocyte,CTL)。肿瘤疫苗可分为基因修饰的树突状细胞疫苗、负载肿瘤抗原多肽的树突状细胞疫苗、转染肿瘤抗原m R N A或R N A的树突状细胞疫苗、完全肿瘤细胞抗原致敏的树突状细胞疫苗等几个种类，目前，负载抗原的DC疫苗在治疗恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾细胞癌的临床试验中已取得了较好的临床疗效。
有研究显示，以DC疫苗联合过继性T细胞免疫治疗效果好，即借助于体外培养技术，将肿瘤抗原诱导活化的DC细胞与患者自体外周血T细胞共培养，然后回输患者体内以达到抗肿瘤的治疗效果。但是，肿瘤抗原诱导活化的DC细胞与外周血T细胞共培养最终得到的细胞是一种异质性的细胞群，包含活化的抗原特异性T细胞和未活化的非抗原特异性T细胞，后者占绝大多数细胞。
深圳市合一康生物科技有限公司(申请号：201410169608.7)发明的抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞的制备方法和成都百赛泰科生物技术有限公司(申请号：201410192581.3)发明的一种高效增殖、靶向杀伤肿瘤的CTL制备方法都是将DC细胞与患者自体外周血淋巴细胞共培养得到的异质性的细胞群直接回输患者体内。这些方法得到的抗原特异性T细胞数量少，达不到很好的临床效果，而且这些方法培养的T细胞容易发生已活化诱导的细胞的凋亡，限制了最终得到的T细胞的数量和活性。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术分离培养抗原特异性T细胞数量少，培养中T细胞容易发生发生已活化诱导的细胞凋亡的现象，提供了一种可提高抗原特异性T细胞数量同时减少发生已活化诱导的细胞凋亡的抗原特异性T淋巴细胞的分离和高效扩增培养方法。
由于肿瘤抗原诱导活化的DC细胞与外周血T细胞共培养最终得到的异质性细胞群中肿瘤抗原活化的细胞毒性T淋巴细胞因具有肿瘤特异性，能直接靶向杀伤肿瘤细胞，对肿瘤细胞杀伤活性高等特点，因此是该异质性细胞群中发挥主要抗肿瘤作用的细胞。
本发明从肿瘤抗原诱导活化的DC细胞与外周血T细胞共培养最终得到的异质性细胞群中将肿瘤抗原活化的细胞毒性T淋巴细胞分离出来，并进行大量扩增，大大增加了抗原特异性T细胞的数量，并提高其杀瘤活性。
CD137是一种T细胞活化后表达的膜蛋白，在非活化T细胞不表达，本发明将其作为分离抗原特异性T细胞的表面分子。
分离后得到的抗原特异性T细胞数量很少，本发明将其进一步高效扩增得到足够数量的细胞用于回输治疗。培养中加入CD137L(CD137-配体)、IL-7，IL-15，IL-2等，CD137-配体是CD137的非膜结合型配体，与CD137结合后，可诱导记忆型T细胞的形成，减少活化诱导的细胞凋亡，从而提高扩增倍数和细胞的杀伤活性；在培养过程中IL-7，IL-15，IL-2的组合使用比单独使用IL-2的增殖细胞要好，且可降低IL-2的使用浓度。
本发明的具体技术方案是：步骤一：DC细胞培养及肿瘤抗原的负载；步骤二：抗原特异性T细胞的活化和初始扩增培养；步骤三：免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞；步骤四：抗原特异性T淋巴细胞的高效扩增培养。
优选的，步骤一中，所述DC细胞培养及肿瘤抗原的负载具体包括如下步骤：
1.1用单采机采集外周血单个核细胞，Ficoll分离后取中间层的细胞，生理盐水洗涤，得到PBMC(外周血单个核细胞)；
1.2取PBMC，加入(不含血清的基础培养基)配成细胞悬液，接种，培养；
1.3培养2小时后晃动去除上层杂细胞，留下贴壁的单核细胞(体积比其它细胞稍大)，加入DC培养基，该DC培养基优选的为无血清培养基(含1000IΜ/ml GM-CSF，1000IΜ/ml IL-4)，如IMP无血清培养基，培养时加入2％自体血浆。
1.4第4天按照加入肿瘤抗原，肿瘤抗原可以是10μg/ml-1mg/ml自体肿瘤细胞裂解物或1μg/ml-1mg/ml全蛋白抗原；10μg/ml-1mg/ml抗原肽，其中抗原肽可以是一种或几种抗原肽的混合。
1.5第5天，加入DC成熟剂(含LPS、IFN-r，终浓度分别为10ng/ml、50IΜ/ml)。
1.6第7天，收集细胞，并将一部分DC细胞冻存。
优选的，步骤二中，所述抗原特异性T细胞的活化和初始扩增培养具体包括如下步骤：
2.1将步骤一中最终收集的负载了肿瘤抗原的DC细胞与外周血T细胞按照1:1-1:100的比例混合，用含1ng/ml-100ng/ml IL-21的T细胞完全培养基(在RPMI1640培养基中加入25mmol/L HEPES PH 7.2，100IΜ/ml盘尼西林，100μg/ml链霉素，2mmol/L谷氨酰胺，5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇，10％人AB血清)调整细胞浓度为1×105-2×106个/ml，接种，培养。
2.2第4天，去除一半培养基，并加入相应量含10-2000IΜ/ml IL-2，1-1000ng/mlIL-7和1-1000ng/ml IL-15的T细胞完全培养基。
2.3第7天，去除一半培养基，并加入相应量含1ng/ml-100ng/ml IL-21的T细胞完全培养基，再按DC细胞与T细胞的比值为1:1-1:100加入步骤一冻存的DC细胞
优选的，步骤三中，所述免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞具体包括如下步骤：
步骤2.3中加入冻存的DC细胞与T细胞共培养24小时后，采用CD137免疫磁珠(美天妮，货号130-093-476)的方法分离其中被抗原激活的T淋巴细胞(CD137阳性)。
3.1计数细胞总数，离心去除上清。
3.2按每1×108细胞，加入400μl PBS缓冲溶液。
3.3加入100μl CD137-PE，混匀，2-8摄氏度放置10分钟。
3.4加入10ml PBS缓冲溶液，300xg离心10分钟，去除上清。
3.5将细胞重悬于800μl PBS缓冲溶液。
3.6加入200μl抗PE磁珠，混匀，2-8摄氏度放置15分钟。
3.7加入10ml PBS缓冲溶液，300xg离心10分钟，去除上清。
3.8加入500μl PBS缓冲溶液重悬细胞。
3.9将LS柱放在MACS磁性分离器中，用3ml PBS缓冲溶液润洗一次。
3.10加入步骤3.8所得细胞悬液到LS柱中，收集通过LS柱未标记的细胞到A管中，再用PBS缓冲溶液洗3次(每次使用3ml PBS缓冲溶液)，洗液也收集到A管中，得到未标记的细胞。
3.11将LS柱从磁性分离器中取出，加入5ml PBS缓冲溶液用推杆将标记的细胞洗出来，用B管收集，得到CD137+的T细胞。
优选的，步骤四中，所述抗原特异性T淋巴细胞的高效扩增培养具体包括如下步骤：
4.1将步骤三得到的CD137阳性的T淋巴细胞，用50％CM(在RPMI1640培养基中加入25mmol/L HEPES PH 7.2，100IΜ/ml盘尼西林，100μg/mL链霉素，2mmol/L谷氨酰胺，5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇，10％人AB血清)和50％AIM-V混合培养基进行培养，细胞浓度为1.0×103-1.0×106/ml，加入下列试剂和因子：异体辐射致死(50Gy)的PBMC(PBMC与T淋巴细胞的比值为10:1-1000:1)、0.01-0.1μg/ml OKT3抗体、10-2000IΜ/ml IL-2、1-1000ng/ml IL-7、1-1000ng/ml IL-15和1-1000ng/ml CD137-配体。
4.2第5天，去除上清，再加入相应量含10-2000IΜ/ml IL-2、1-1000ng/ml IL-7、1-1000ng/ml IL-15的50％CM和50％AIM-V混合培养基。
4.3第6天根据细胞数进行扩瓶(袋)培养，细胞浓度调整为0.5×106-2×106个/ml，培养基为含10-2000IΜ/ml IL-2、1-1000ng/ml IL-7、1-1000ng/ml IL-15的50％CM和50％AIM-V混合培养基。
4.4扩增培养到第7-30天，收集细胞。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1.本发明利用免疫磁珠技术结合活化的T细胞表达CD137的特性将抗原特异性T淋巴细胞从复杂的细胞群中分离出来，增加了分离的针对性，使最终培养得到的抗原特异性T淋巴细胞的肿瘤杀伤活性更强；
2.本发明抗原特异性T细胞的分离培养方法中同时加入IL-7，IL-15，IL-2，比单独使用IL-2的细胞增殖效果要好，且可降低IL-2的使用浓度从而防止培养中容易发生已活化诱导的细胞凋亡的现象，从而提高抗原特异性T细胞数量；
3.本发明抗原特异性T细胞的分离培养方法中加入CD137-配体，CD137-配体与CD137结合后，可诱导记忆型T细胞的形成，减少活化诱导的细胞凋亡这一特性，从而提高细胞扩增倍数和细胞的杀伤活性。
附图说明
图1为实施例1与对比例4增殖实验的结果；
图2为实施例2与对比例5增殖实验的结果；
图3为实施例3与对比例6增殖实验的结果；
图4为实施例1～5与对比例1～3杀瘤实验的结果；
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。
实施例1
肿瘤抗原(肿瘤细胞裂解物)诱导的抗原特异性T淋巴细胞的分离和高效扩增培养
步骤一：制备自体肿瘤细胞裂解物
1.1取黑色素瘤患者手术后切除的肿瘤组织，将肿瘤组织上的正常组织去除，生理盐水冲洗干净至无血无脂肪残留。
1.2用0.1％洗必泰(氯己定)浸泡30分钟，无菌生理盐水冲洗3～4遍。
1.3用无菌手术剪刀将肿瘤组织剪碎，加入适量生理盐水进行研磨，经200目网过滤后收集单细胞悬液。
1.4将单细胞悬液放入离心管中，﹣86℃条件下冷冻，室温融化，反复冻融3次，显微镜下观察至无细胞存活。
1.5将单细胞悬液以3000rpm离心30min，无菌操作将上清液用0.22μm孔径的除菌滤器过滤，取样后于4℃保存，进行质量检测，其余﹣20℃保存。
1.6过滤后的样品进行细菌、真菌，支原体，内毒素检测以及BCA法蛋白浓度测定，合格后便制得自体肿瘤细胞裂解物(抗原)。
步骤二：DC细胞培养及肿瘤组织裂解物进行负载
2.1用单采机采集外周血单个核细胞，Ficoll分离后取中间层的细胞，生理盐水洗2次，得到PBMC(外周血单个核细胞)。
2.2取PBMC，加入RPMI 1640培养基配成5×106/ml细胞悬液，按每孔3ml接种到6孔板内，放入培养箱。
2.3 2小时后，取出，晃动去除上层杂细胞，留下贴壁的单核细胞(体积比其它细胞稍大)，每孔加入3ml DC培养基(IMP无血清培养基，含2％自体血浆，1000IU/ml GM-CSF，1000IU/ml IL-4)。
2.4第4天按照100ug/ml蛋白浓度加入步骤一得到的肿瘤细胞裂解物。
2.5第5天，加入DC成熟剂(终浓度10ng/ml LPS，50IU/ml IFN-r)。
2.6第7天，收集细胞，并将一部分DC细胞冻存。
步骤三：分离PBMC中的T细胞
3.1取1x108外周血PBMC，离心去除上清。
3.2加入800ul PBS缓冲溶液(含0.5％BSA，2mmol EDTA，PH 7.2)。
3.3加入200ul CD3磁珠(美天妮，货号130-050-101)，混匀，4-8摄氏度放置15分钟。
3.4加入15ml PBS缓冲溶液，300xg离心10分钟，去除上清。
3.5加入500ul PBS缓冲溶液重悬细胞。
3.6将LS柱放在MACS磁性分离器中，用3ml PBS缓冲溶液润洗一次。
3.7加入步骤3.5所得细胞悬液到LS柱中，收集通过LS柱未标记的细胞到A管中，再用PBS缓冲溶液洗3次(每次使用3ml PBS缓冲溶液)，洗液也收集到A管中，得到未标记的细胞。
3.8将LS柱从磁性分离器中取出，加入5ml缓冲液用推杆将标记的细胞洗出来，用B管收集，得到CD3+的T细胞。
步骤四：抗原特异性T淋巴细胞的活化和初始扩增培养
4.1将步骤二中最终得到的DC细胞与步骤三中最终得到的外周血T细胞按照1:10混合，用含30ng/ml IL-21的T细胞完全培养基(在RPMI1640培养基中加入25mM/LHEPES PH 7.2，100IU/mL盘尼西林(penicillin)，100ug/mL链霉素(streptomycin)，2mmol/L谷氨酰胺(L-glutamine)，5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)，10％人AB血清)调整细胞浓度为5×105个T细胞/ml，接种到24孔板内，每孔接种2ml。
4.2第4天每孔去除1ml培养基，并加入1ml含200IU/ml IL-2,10ng/ml IL-7和10ng/ml IL-15的T细胞完全培养基。
4.3第7天，去除1ml培养基，每孔加入1×105步骤二冻存的DC细胞，1ml含30ng/mlIL-21的T细胞完全培养基。
步骤五：免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞
步骤4.3中再一次加入的DC细胞与T细胞共培养24小时后，采用CD137免疫磁珠(美天妮，货号130-093-476)的方法分离其中被抗原激活的T淋巴细胞。
5.1计数细胞总数，离心去除上清。
5.2按每1x108细胞，加入400ul PBS缓冲溶液。
5.3加入100ul CD137-PE，混匀，2-8摄氏度放置10分钟。
5.4加入10ml PBS缓冲溶液，300xg离心10分钟，去除上清。
5.5将细胞重悬于800ul PBS缓冲溶液。
5.6加入200ul抗PE磁珠，混匀，2-8摄氏度放置15分钟。
5.7加入10ml PBS缓冲溶液，300xg离心10分钟，去除上清。
5.8加入500ul PBS缓冲溶液重悬细胞。
5.9将LS柱放在MACS磁性分离器中，用3ml PBS缓冲溶液润洗一次。
5.10加入步骤5.8所得细胞悬液到LS柱中，收集通过LS柱未标记的细胞到A管中，再用PBS缓冲溶液洗3次(每次使用3ml PBS缓冲溶液)，洗液也收集到A管中，得到未标记的细胞。
5.11将LS柱从磁性分离器中取出，加入5mlPBS缓冲溶液用推杆将标记的细胞洗出来，用B管收集，得到CD137+的T细胞。
步骤六：抗原特异性T淋巴细胞的高效扩增培养
6.1将步骤五得到的CD137阳性的T淋巴细胞，按每1×105细胞与下列试剂和因子混合培养：7.5ml CM培养基(在RPMI1640培养基中加入25mmol/L HEPES PH 7.2，100IU/mL盘尼西林(penicillin)，100ug/mL链霉素(streptomycin)，2mmol/L谷氨酰胺(L-glutamine)，5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇(β-mercaptoethanol),10％人AB血清)，2×107个异体辐射致死(50Gy)的PBMC，450ng OKT3抗体，1500IU IL-2，75ng IL-7，75ng IL-15，1.5ug CD137-配体，7.5ml AIM-V培养基。
6.2第5天，去除12ml上清，再加入12ml含100IU/ml IL-2，5ng/ml IL-7，5ng/mlIL-15的50％CM和50％AIM-V的混合培养基。
6.3第6天根据细胞数进行扩瓶(袋)培养，细胞浓度调整为1×106/ml，培养基为含100IU/ml IL-2，5ng/ml IL-7，5ng/ml IL-15的50％CM和50％AIM-V的混合培养基。
6.4扩增培养到第14天，收集细胞。
实施例2
肿瘤抗原(蛋白)诱导的抗原特异性T淋巴细胞的分离和高效扩增培养
步骤一：操作同实施例1步骤二，不同之处是2.4加入的抗原不是肿瘤细胞裂解物，而是肿瘤抗原MART-1的全长蛋白。
步骤二：同实施例1步骤三。
步骤三：同实施例1步骤四。
步骤四：同实施例1步骤五。
步骤五：同实施例1步骤六。
实施例3
肿瘤抗原(多肽)诱导的抗原特异性T淋巴细胞的分离和高效扩增培养
步骤一：DC细胞培养及抗原多肽负载
1.1用单采机采集外周血单个核细胞，Ficoll分离后取中间层的细胞，生理盐水洗2次，得到PBMC(外周血单个核细胞)。
1.2取PBMC，加入RPMI 1640培养基配成5×106/ml细胞悬液，按每孔3ml接种到6孔板内，放入培养箱。
1.32小时后，取出，晃动去除上层杂细胞，留下贴壁的单核细胞(体积比其它细胞稍大)，每孔加入3ml DC培养基(IMP无血清培养基，含2％自体血浆，1000IU/mlGM-CSF，1000IU/ml IL-4)。
1.4第5天，加入DC成熟剂(终浓度10ng/ml LPS，50IU/ml IFN-r)。
1.5第7天，按照100ug/ml加入MART-1短肽(M27:AAGIGILTV)，4小时后收集DC细胞，并将一部分DC细胞冻存。
步骤二～步骤五同实施例2的。
实施例4、5
抗原特异性T淋巴细胞的分离和高效扩增培养过程如下：
步骤一～步骤六的操作过程同实施例1的，不同之处在于：
(1)步骤2.4中加入肿瘤细胞裂解物的浓度不同；
实施例4：肿瘤细胞裂解物的浓度为10μg/ml
实施例5：肿瘤细胞裂解物的浓度为1mg/ml
(2)步骤四中IL-21、IL-2、IL-7和IL-15的浓度不同；步骤4.1和4.2中DC细胞与T细胞混合的比例不同；步骤4.1中细胞调整的浓度不同；
实施例4：步骤四中IL-21、IL-2、IL-7和IL-15的浓度分别为1ng/ml、10IU/ml、1ng/ml、1ng/ml；步骤4.1和4.2DC细胞与T细胞混合的比例为1:100；步骤4.1中细胞调整的浓度1×105个/ml。
实施例5：步骤四中IL-21、IL-2、IL-7和IL-15的浓度分别为100ng/ml、2000IU/ml、1000ng/ml、1000ng/ml；步骤4.1和4.2DC细胞与T细胞混合的比例为1:1；步骤4.1中细胞调整的浓度2×106个/ml。
(3)步骤六中调整细胞初始浓度不同；加入异体辐射致死(50Gy)的PBMC的数量不同；OKT3抗体、IL-2、IL-7、IL-15、CD137-配体的浓度不一样；步骤6.3中调整细胞浓度不同；步骤6.4扩增培养的天数不同。
实施例4：步骤六中调整细胞初始浓度为1×103个/ml；加入1×106个异体辐射致死(50Gy)的PBMC；OKT3抗体的浓度为0.01ug/ml；IL-2的浓度为10IU/ml；IL-7的浓度为1ng/ml；IL-15的浓度为1ng/ml；CD137-配体的浓度为1ng/ml；步骤6.3中调整细胞浓度为0.5×106个/ml；步骤6.4扩增培养到第7天收集细胞。
实施例5：步骤六中调整细胞初始浓度为1×106个/ml；加入1×108个异体辐射致死(50Gy)的PBMC；OKT3抗体的浓度为0.1ug/ml；IL-2的浓度为2000IU/ml；IL-7的浓度为1000ng/ml；IL-15的浓度为1000ng/ml；CD137-配体的浓度为1000ng/ml；步骤6.3中调整细胞浓度为2×106个/ml；步骤6.4扩增培养到第30天收集细胞。
对比例1
相比于实施例1，不进行抗原特异性T淋巴细胞的分离和高效扩增培养。
步骤一：同实施例1步骤一。
步骤二：同实施例1步骤二。
步骤三：同实施例1步骤三。
步骤四：同实施例1步骤四。
步骤五：无论孔内淋巴细胞生长如何，不超过一周要进行一次半量换液。当任何一个孔内的淋巴细胞长满时，将所有孔内的细胞混匀，均分为2份，补加含100IU/ml IL-2，5ng/ml IL-7和5ng/ml IL-15的T细胞完全培养基，或者将细胞浓度调整为0.8～1.6×106个/ml。培养至第21天，收集细胞。
对比例2
相比于实施例2，不进行抗原特异性T淋巴细胞的分离和高效扩增培养。
步骤一：同实施例2步骤一。
步骤二：同实施例2步骤二。
步骤三：同实施例2步骤三。
步骤四：同对比例1步骤五
对比例3
相比于实施例3，不进行抗原特异性T淋巴细胞的分离和高效扩增培养。
步骤一：同实施例3步骤一。
步骤二：同实施例3步骤二。
步骤三：同实施例3步骤三。
步骤四：同对比例1步骤五
对比例4
相比于实施例1，不进行高效扩增培养。
步骤一～步骤五同实施例1.
步骤六：将步骤五筛选出的CD137阳性的T淋巴细胞，按每1×105细胞与下列试剂和因子混合培养：CM培养基7.5ml，2×107异体辐射致死(50Gy)的PBMC，450ng OKT3抗体，7.5ml AIM-V培养基。
4.2第2天加入IL-2至6000IU/ml。
4.3第5天，去除120ml上清，再加入12ml含6000IU/ml IL-2的50％CM和50％AIM-V的混合培养基。
4.4第6天根据细胞数进行扩瓶培养，细胞浓度调整为1×106/ml，培养基为6000IU/ml IL-2的50％CM和50％AIM-V的混合培养基。
4.5扩增培养至第14天，收集细胞。
对比例5
相比于实施例2，不进行高效扩增培养。
步骤一～步骤四同实施例2。
步骤五同对比例4步骤六。
对比例6
相比于实施例3，不进行高效扩增培养。
步骤一～步骤四同实施例3。
步骤五同对比例4步骤六。
增殖实验
对实施例1和对比例4最终得到的细胞进行计数，计算增殖倍数；
对实施例2和对比例5最终得到的细胞进行计数，计算增殖倍数；
对实施例3和对比例6最终得到的细胞进行计数，计算增殖倍数。
结果：见图1、图2、图3。
结论：实施例1～3采用本发明高效扩增培养技术，培养中加入CD137L(CD137-配体)、IL-7，IL-15，IL-2相比于对比例4～6采用现有技术大大提高培养效率，提高细胞扩增倍数。
杀瘤实验
步骤一：肿瘤组织单细胞悬液的制备。
取肿瘤组织块，去除正常组织和坏死组织，用剪刀剪成直径2mm的小块组织，将这些小的组织块浸入含2.0mg/ml胶原酶(SIGMA，货号：C9722)、0.5mg/ml透明质酸酶(SIGMA，货号：H3506)、(10-0.01)0.1mg/ml DNA酶(SIGMA，货号：D5319)的无血清RPMI 1640培养基中，缓慢摇晃孵育过夜。用100um尼龙滤网过滤除去细胞团块，得到单个细胞悬液。
步骤二：制备自体肿瘤细胞株
将单个细胞悬液用CM培养基重悬，加入到2级密度梯度分离液上(下层是100％Ficoll，中间层是75％Ficoll和25％CM培养液的混合液)，2000转离心20分钟，收集上层和中间层之间的细胞得到富集了的肿瘤细胞。用含10％FBS的RPMI 1640培养基调整细胞浓度为2×105个/ml，接种到培养瓶中培养。
步骤三：
分别将上述实施例1～5、对比例1～3中最终得到的抗原特异性T细胞作为效应细胞，以步骤一和步骤二制备的自体肿瘤细胞株为靶细胞。
1.取效应细胞，用RPMI 1640培养基洗2次，用含10％FBS的RPMI 1640培养基配成1×106/ml细胞悬液。
2.取靶细胞，用RPMI 1640培养基洗一次，配成1×105/ml细胞悬液。
3.按效靶比10:1接种到96孔板内，同时设置效应细胞孔和靶细胞孔，按每种培养基3个复孔，37度5％CO2培养4小时。
4.用MTT法测吸光度值，计算杀瘤率。
杀瘤率％＝1-(试验孔-效应细胞孔)/靶细胞孔。
结果：见图4。
结论：分别比较实施例1～3与对比例1～3的结果，可以看出实施例1～3培养得到的抗原特异性T淋巴细胞的杀瘤活性优于对比例1～3的，因此，这说明采用本发明的方法分离培养的抗原特异性T淋巴细胞的杀瘤活性得到提高。实施例4、5的结果表明，本发明的培养方法中的细胞因子浓度、细胞密度等参数可以在一定范围内调整，依然可以得到所需要的抗原特异性T细胞。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗原特异性T淋巴细胞的分离培养方法，其特征在于，包括下述步骤：步骤一：DC细胞培养及肿瘤抗原的负载；步骤二：抗原特异性T细胞的活化和初始扩增培养；步骤三：免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞；步骤四：抗原特异性T淋巴细胞的高效扩增培养。
2.如权利要求1所述的一种抗原特异性T淋巴细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤一中，所述DC细胞培养及肿瘤抗原的负载具体包括如下步骤：
(1.1)用单采机采集外周血单个核细胞，Ficoll分离后取中间层的细胞，生理盐水洗涤，得到PBMC(外周血单个核细胞)；
(1.2)取PBMC，加入(不含血清的基础培养基)配成细胞悬液，接种，培养；
(1.3)培养2小时后晃动去除上层杂细胞，留下贴壁的单核细胞(体积比其它细胞稍大)，加入DC培养基。
(1.4)第4天按照加入肿瘤抗原。
(1.5)第5天，加入DC成熟剂。
(1.6)第7天，收集细胞，并将一部分DC细胞冻存。
3.如权利要求1所述的一种抗原特异性T淋巴细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤二中，所述抗原特异性T细胞的活化和初始扩增培养具体包括如下步骤：
(2.1)将步骤一中最终收集的负载了肿瘤抗原的DC细胞与外周血T细胞混合，用含IL-21的T细胞完全培养基调整细胞浓度为1×105-2×106个/ml，接种，培养。
(2.2)第4天，去除一半培养基，并加入相应量含10-2000IU/ml IL-2，1-1000ng/ml IL-7和1-1000ng/ml IL-15的T细胞完全培养基。
(2.3)第7天，去除一半培养基，并加入相应量含1ng/ml-100ng/ml IL-21的T细胞完全培养基，再加入步骤一冻存的DC细胞 。
4.如权利要求1所述的一种抗原特异性T淋巴细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤三中，所述免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞具体包括如下步骤：
步骤(2.3)中加入冻存的DC细胞与T细胞共培养24小时后，采用免疫磁珠技术分离其中被抗原激活的T淋巴细胞。
5.如权利要求1所述的一种抗原特异性T淋巴细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤四中，所述抗原特异性T淋巴细胞的高效扩增培养具体包括如下步骤：
(4.1)将步骤三得到的CD137阳性的T淋巴细胞，用CM和AIM-V混合培养基进行培养，调整细胞浓度，加入下列试剂和因子：异体辐射致死(50Gy)的PBMC、OKT3抗体、IL-2、IL-7、IL-15和CD137-配体。
(4.2)第5天，去除上清，再加入相应量含IL-2、IL-7、IL-15的CM和AIM-V混合培养基。
(4.3)第6天根据细胞数进行扩瓶(袋)培养，调整细胞浓度，培养基为含IL-2、IL-7、IL-15的CM和AIM-V混合培养基。
(4.4)扩增培养到第7-30天，收集细胞。
6.如权利要求2所述的一种抗原特异性T淋巴细胞的分离培养方法，其特征在于，所述DC培养基为含1000IU/ml GM-CSF，1000IU/ml IL-4的无血清培养基；所述肿瘤抗原为10μg/ml-1mg/ml自体肿瘤细胞裂解物或1μg/ml-1mg/ml全蛋白抗原或10μg/ml-1mg/ml抗原肽，其中抗原肽可以是一种或几种抗原肽的混合；所述DC成熟剂含有10ng/ml LPS、50IU/ml IFN-r。
7.如权利要求3所述的一种抗原特异性T淋巴细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤(2.1)和步骤(2.3)将负载了肿瘤抗原的DC细胞与 外周血T细胞混合的比例为1:1-1:100；所述IL-21的浓度为1ng/ml-100ng/ml；所述T细胞完全培养基为在RPMI1640培养基中加入25mmol/L HEPES PH 7.2，100IU/ml盘尼西林，100ug/ml链霉素，2mmol/L谷氨酰胺，5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇，10％人AB血清配制而成。
8.如权利要求4所述的一种抗原特异性T淋巴细胞的分离培养方法，其特征在于，所述免疫磁珠技术选用的抗体为CD137抗体。
9.如权利要求5所述的一种抗原特异性T淋巴细胞的分离培养方法，其特征在于，所述CM培养基为在RPMI1640培养基中加入25mmol/L HEPES PH 7.2，100IU/mL盘尼西林，100ug/mL链霉素，2mmol/L谷氨酰胺，5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇，10％人AB血清制成；所述CM和AIM-V混合培养基为CM培养基、AIM-V培养基按照1:1的比例混合而成；调整细胞浓度为1.0×103-1.0×106/ml；所述异体辐射致死(50Gy)的PBMC与T淋巴细胞的比值为10:1-1000:1；所述OKT3抗体的浓度为0.01-0.1ug/ml；IL-2的浓度为10-2000IU/ml；IL-7的浓度为1-1000ng/ml；IL-15的浓度为1-1000ng/ml；CD137-配体的浓度为1-1000ng/ml；所述步骤(4.3)中调整细胞浓度为0.5×106-2×106/ml。
10.如权利要求1～9中任意一项所述的分离培养方法分离培养的抗原特异性T淋巴细胞用于肿瘤的治疗或预防。
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