CN113943704A - 一种肿瘤新生抗原特异性t细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,包括:步骤一,通过基因测序获得生物信息,设计合成肿瘤新生抗原多肽;步骤二,将肿瘤新生抗原多肽负载到未成熟DC细胞,利用细胞因子诱导DC细胞成熟;步骤三,将成熟的DC细胞与初始T细胞进行多轮共孵育刺激;步骤四,利用免疫磁珠技术分离收集肿瘤新生抗原特异性T细胞;步骤五,扩增得到纯度高且具有杀伤活性的肿瘤新生抗原特异性T细胞;步骤六,冻存得到肿瘤新生抗原特异性T细胞;通过本发明的方法能够大量且高效的制备出纯度高且具有高杀伤活性的肿瘤新生抗原特异性T细胞,肿瘤杀伤效率接近100%;成本低,速度快,满足市场需求。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物技术领域,特别是一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法。
背景技术
近来,由于过继性免疫细胞治疗在治疗恶性黑色素瘤和血液系统的肿瘤中取得了突破性进展;其再次成为肿瘤免疫治疗研究领域的热点。目前国际上常见的过继性免疫细胞治疗的效应细胞主要包括肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte,缩写TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(Dendritic Cell-Cytokine Induced Killer,缩写DC-CIK)、嵌合抗原受体修饰的T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell,缩写CAR-T)和T细胞受体基因工程改造的T细胞(T-Cell Receptor gene engineered T-cell,缩写TCR-T)。对于过继性免疫细胞治疗来说,高特异性的肿瘤抗原靶点的获得极为关键,其常见方法有:直接利用肿瘤组织分解物、提取肿瘤细胞的裂解物、或根据肿瘤类型筛选已知的高表达肿瘤相关抗原(Tumor Associate Antigen,缩写TAA)进行制备获得。目前TIL和DC-CIK疗法多采用前两种方法制备得到肿瘤抗原,其特异性较差,因此存在大量效应细胞未能特异性识别肿瘤细胞,疗效有限。而CAR-T和TCR-T多采用TAA作为靶点。由于TAA并非肿瘤细胞所特有,在部分正常细胞中也有一定量的表达,所以TAA的肿瘤特异性不高,靶向TAA的疗法易产生脱靶毒副作用,基于TAA的杀伤性T细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤功效并不明显。目前,CAR-T和TCR-T疗法仅在血液肿瘤的治疗中显示出有效性,其对实体瘤的治疗效果仍十分有限,因此还未大规模在临床推广应用。
最近研究显示,癌细胞由于基因变异而产生的带有肿瘤特异性的氨基酸序列被称为“肿瘤新生抗原”(neoantigen)。这些蛋白是癌细胞在发生以及发展过程中产生的,会被表达到肿瘤细胞表面。理论上可以利用这类肿瘤新生抗原训练免疫细胞特异性识别肿瘤细胞,激活免疫系统,对癌细胞进行特异性地高效杀伤。为了克服现有技术的限制,需要开发一种制备肿瘤新生抗原特异性T细胞的通用技术。
目前常用的扩增特异性T细胞的方法主要是利用单核细胞(monocyte)(包括未成熟DC细胞)贴壁生长的特性将未成熟DC细胞与T细胞分离。从患者外周血中分离单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,缩写PBMC)后,将其加入适量培养基后在培养箱中孵育2h,其中所有贴壁细胞被认为是未成熟DC细胞,悬浮细胞被认为是T细胞;将悬浮细胞通过收集洗涤后作为T细胞保存;将抗原与贴壁细胞(未成熟DC细胞)共孵育,并通过多种细胞因子诱导贴壁细胞,使未成熟DC细胞成熟;然后再将得到的细胞与之前收集的悬浮细胞共培养,利用白介素2(IL-2)联合CD3抗体刺激T细胞分裂增殖。此方法获得的未成熟DC细胞由于含有T细胞而造成纯度低;直接导致通过诱导未成熟DC细胞得到的成熟DC细胞的纯度低、数量少;最终在共培养的细胞悬液中获得的肿瘤新生抗原特异性T细胞的比例极低,对肿瘤细胞的杀伤效果十分有限。
因此,亟需发明一种能够大量且高效地制备出纯度高且具有高杀伤活性、高质量的肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法,以满足临床患者的治疗需求。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种能够大量且高效地制备出纯度高且具有高杀伤活性、高质量的肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法,以满足临床治疗的需求。
为了实现上述目标,本发明采用如下的技术方案:
一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,包括:
步骤一,合成肿瘤新生抗原多肽;
步骤二,将肿瘤新生抗原多肽负载到未成熟DC细胞,对未成熟DC细胞进行诱导,获得负载有肿瘤新生抗原的成熟DC细胞;
步骤三,将成熟DC细胞与纯化后的初始T细胞进行1~3轮的共刺激培养,从而获得含有表面被标记的肿瘤新生抗原特异性T细胞的细胞悬液;
步骤四,从细胞悬液中分离收集肿瘤新生抗原特异性T细胞;
步骤五,对肿瘤新生抗原特异性T细胞进行扩增处理,得到具有杀伤活性的肿瘤新生抗原特异性T细胞。
前述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,步骤一,合成肿瘤新生抗原多肽;
具体方法包括:
步骤1.1,根据肿瘤组织的全外显子与转录组测序数据分析得到体细胞突变位点,预测肿瘤新生抗原短多肽序列;
步骤1.2,根据短多肽序列的起始和终止位置关系及组合方式设计出若干条对应的长多肽序列,长多肽序列包含15~30个氨基酸;
步骤1.3,对长多肽序列进行筛选;
步骤1.4,根据筛选得到的长多肽序列合成长度为15~30个氨基酸的长多肽。
前述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,步骤二中对未成熟DC细胞进行诱导的具体方法包括:利用细胞因子对未成熟DC细胞进行诱导;细胞因子包括如下细胞因子至少一个:α4-1BB×CD40L双特异性抗体、OX40、TLR-3、TLR-6、TLR-7/8、TLR-9。
前述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,细胞因子为:500~1000U/mlTNF-α、5~10ng/ml IL-6、5~10ng/ml IL-1β、0.5~2μg/ml PGE-2、0.5~2μg/mlα4-1BB×CD40L双特异性抗体、0.5~2μg/ml OX40、0.5~2μg/ml TLR-3、0.5~2μg/ml TLR-6、0.5~2μg/ml TLR-7/8、0.5~2μg/ml TLR-9。
前述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,步骤三中纯化后的初始T细胞是指通过免疫磁珠纯化获取的初始T细胞;免疫磁珠纯化的方法包括但不仅限于:CD45RAMicroBeads免疫磁珠纯化方法、Naive Pan T Cell Isolation Kit免疫磁珠纯化方法。
前述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,步骤三中表面被标记的肿瘤新生抗原特异性T细胞的表面标记为IFN-γ+、TNF-α+、Granzyme B+、Perforin+、CD69+、CD137+中的任意一个。
前述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,
步骤三中将成熟DC细胞与纯化后的初始T细胞进行1~3轮的共刺激培养是指按照成熟DC细胞:初始T细胞=1:20~60的细胞数量比例混合。
前述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,步骤三中将成熟DC细胞与纯化后的初始T细胞进行1~3轮的共刺激培养的具体方法为:分批复苏冻存的成熟DC细胞,将复苏的成熟DC细胞和10μg/ml~50μg/ml的肿瘤新生抗原多肽加入初始T细胞中进行1~3轮的共刺激培养,在最后1轮加入复苏的成熟DC细胞和肿瘤新生抗原多肽后继续培养24~72h。
前述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,步骤四中,从细胞悬液中分离收集肿瘤新生抗原特异性T细胞的具体内容包括:利用免疫磁珠技术从细胞悬液中分离收集肿瘤新生抗原特异性T细胞;免疫磁珠技术包括如下免疫磁珠至少一个:CD137免疫磁珠、IFN-γ免疫磁珠、CD69免疫磁珠、TNF-α免疫磁珠、Granzyme B免疫磁珠和Perforin免疫磁珠。
前述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,步骤五中对肿瘤新生抗原特异性T细胞扩增处理,得到具有杀伤活性的肿瘤新生抗原特异性T细胞的具体内容包括:
使用细胞因子组合激活扩增肿瘤新生抗原特异性T细胞,得到具有杀伤活性的肿瘤新生抗原特异性T细胞;细胞因子组合包括:CD3抗体、CD28抗体。
前述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,步骤五中的细胞因子组合为:25~100ng/ml CD3抗体、5~20ng/ml CD28抗体、0.5~3ng/ml IL-1α、10~30ng/ml IL-7、400~1000U/ml IL-2和5~20ng/ml IL-15。
本发明的有益之处在于:
本方法使用的抗原为肿瘤新生抗原多肽,满足细胞培养添加物的要求,区别于肿瘤相关抗原和肿瘤细胞裂解物;通过生物信息学手段筛选得到的肿瘤新生抗原多肽所包含的抗原信号更具特异性且集中,可更好地激发免疫系统、产生更强的特异性免疫反应;
本方法使用的肿瘤新生抗原多肽为长多肽(序列长度为15~30个氨基酸),这种长多肽包含了突变位点及其上下游基因序列翻译得到的氨基酸序列。一条长多肽包含了由同一突变位点产生的一系列部分重叠的表位短多肽(序列长度为8~11个氨基酸)。这些短多肽可以被不同的HLA分型识别,且它们刺激T细胞的能力各不相同。因此,使用新生抗原长多肽能在一条长多肽中纳入更多的新生抗原表位短多肽,使其被DC细胞吞噬后能加工出更多的表位短多肽,从而提高实验的效率与可行性。另外,由于对比短多肽,未成熟DC细胞更容易吞噬长多肽,因此采用长多肽可以提高未成熟DC细胞对抗原肽的吞噬效率;
本发明通过在诱导未成熟DC细胞成熟的过程中添加细胞因子,能够显著提升DC细胞的成熟度,提高DC细胞递呈抗原的效率;
由于只有初始T细胞能够被刺激进而分化成为特异性T细胞,本发明加入纯化初始T细胞的步骤,从而显著提高肿瘤新生抗原特异性T细胞在初始T细胞与成熟DC细胞共刺激培养后细胞悬液中的占比;
本发明将负载肿瘤新生抗原的成熟DC细胞与纯化后的初始T细胞按照成熟DC细胞:初始T细胞=1:20~60的细胞数量比例混合共刺激培养,能显著提高肿瘤新生抗原特异性T细胞在共刺激培养后获得的细胞悬液中的占比;
本发明在负载肿瘤新生抗原的成熟DC细胞与纯化后的初始T细胞共刺激培养时,采用本发明的共刺激培养方法能够显著提升肿瘤新生抗原特异性T细胞在细胞悬液中的占比;
本发明在肿瘤新生抗原特异性T细胞的扩增过程中添加细胞因子,能够对肿瘤新生抗原特异性T细胞增殖效率产生协同作用,可在较短时间内使细胞数量快速扩增,满足临床治疗所需的细胞用量;
本发明利用免疫磁珠技术可从负载肿瘤新生抗原的成熟DC细胞与纯化后的初始T细胞共刺激培养后的细胞悬液中分离收集肿瘤新生抗原特异性T细胞;免疫磁珠技术包括如下免疫磁珠至少之一:CD137免疫磁珠、IFN-γ免疫磁珠、CD69免疫磁珠、TNF-α免疫磁珠、Granzyme B免疫磁珠和Perforin免疫磁珠。
附图说明
图1是本发明实验一的病毒长多肽和病毒短多肽四聚体(tetramer)染色流式分析实验结果对比图;
图2是本发明实验二中不同组合细胞因子刺激物诱导DC细胞成熟后表面标记物表达量结果对比图;
图3是本发明实验二中不同组合细胞因子刺激物诱导DC细胞成熟后IL-12的分泌量对比图;
图4是本发明实验三中成熟DC细胞与初始T细胞不同比例共培养检测特异性标记物表达量对比图;
图5是本发明实验三中共刺激培养时添加不同浓度多肽检测特异性标记物表达量对比图;
图6是本发明实验四中成熟DC细胞与初始T细胞进行共培养检测特异性标记物表达量对比图;
图7是本发明实验四中成熟DC细胞与初始T细胞经过1~3轮的共培养分别检测特异性标记物表达量对比图;
图8是本发明实验五中成熟DC细胞与初始T细胞共培养后在一定时间内检测特异性标记物表达量对比图;
图9是本发明实验六中免疫磁珠分离纯化的特异性T细胞扩增后经ELISpot实验验证对比图;
图10是本发明实验六中免疫磁珠分离纯化前与特异性T细胞扩增后分别检测四聚体表达量对比图;
图11是本发明实验七中免疫磁珠分离纯化扩增后的特异性T细胞杀伤A375细胞验证实验结果图;
图12是本发明实验八中免疫磁珠分离纯化扩增后的特异性T细胞CDX药效结果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备及其杀伤肿瘤细胞的有效性验证方法,包括:
步骤一,合成肿瘤新生抗原多肽;
具体方法参见专利202110251383.X中一种个体化肿瘤新生抗原肽的筛选方法得到多肽序列,继而合成多肽,采用固相合成技术生产合适纯度多肽;对得到的多肽进行免疫功能验证:
抽取健康志愿者血样分离PBMC后进行多肽疫苗免疫功能体外验证,检测多肽刺激后IFN-γ的分泌情况。使用ELISpot方法,以多肽疫苗作为刺激物,以本发明的长多肽作为实验组1,以长多肽中相同位点的对应短多肽作为实验组2,以CEF多肽池作为阳性对照组,以空白组作为阴性对照组,具体步骤参见人IFN-γELISpot试剂盒(达优),使用酶联荧光斑点分析仪进行斑点计数,与实验组2(短多肽)相比,结果显示实验组1(长多肽)能够刺激得到更多的斑点,证明长多肽的免疫功能更好。
步骤二,将肿瘤新生抗原多肽负载到未成熟DC细胞,对未成熟DC细胞进行诱导,获得负载有肿瘤新生抗原的成熟DC细胞;
本发明专利加入的细胞因子组合为TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE-2,α4-1BB×CD40L双特异性抗体,经以上组合刺激诱导未成熟DC细胞后,通过流式标记(CD83/CD80/CD86/MHCI/MHC II)和IL-12分泌量鉴定显示这些DC细胞的成熟度显著提升。
除了采用本发明的细胞因子组合,也可采用类似功效的其他细胞因子组合,比如:目前已有的刺激组合有500U/ml TNF-α(Peprotech);500U/ml TNF-α(Peprotech)、5ng/mlIL-1β(Peprotech);500U/ml TNF-α(Peprotech)、5ng/ml IL-6(Peprotech)、5ng/ml IL-1β(Peprotech)、0.5μg/ml PGE-2(Sigma)。然而经以上三种组合刺激诱导未成熟DC细胞后,通过流式标记(CD83/CD80/CD86/MHC I/MHC II)和IL-12分泌量鉴定显示这些DC细胞的成熟度均不高,无法满足抗原被DC递呈的要求。
步骤三,将负载有肿瘤新生抗原的成熟DC细胞与纯化后的初始T细胞进行多轮的共刺激培养,且成熟DC细胞与初始T细胞按照成熟DC细胞:初始T细胞=1:20~60的细胞数量比例混合,可获得含有表面被标记的肿瘤新生抗原特异性T细胞的细胞悬液。
纯化获得初始T细胞的方法可采用免疫磁珠纯化法。通过免疫磁珠纯化获取初始T细胞的方法包括但不仅限于:CD45RA免疫磁珠纯化方法、Naive Pan T Cell IsolationKit免疫磁珠纯化方法。
共刺激培养的具体方法为:分批复苏冻存的成熟DC细胞,将复苏的成熟DC细胞和10μg/ml~50μg/ml的肿瘤新生抗原多肽加入初始T细胞中进行1~3轮的共刺激培养,在最后1轮加入复苏的成熟DC细胞和肿瘤新生抗原多肽后继续培养24~72h。
现有技术一般为一次性收集全部成熟DC细胞,直接将收集得到的成熟DC细胞与T细胞按1:10的细胞数量比例进行共刺激培养以激活T细胞,再直接扩增共培养后的细胞悬液获得肿瘤抗原特异性T细胞。此方法难保证DC细胞递呈抗原信息到所有的能识别抗原信息的T细胞,比例太高,无足够的DC细胞用于共刺激,比例太低,无法保证所有的能识别抗原信息的T细胞接受DC所递呈的抗原信息。本发明按照成熟DC细胞:初始T细胞=1:20~60的细胞数量比例混合,分1-3轮刺激初始T细胞,既保证足够的DC细胞用于共刺激,又满足了所有能识别抗原信息的T细胞获得抗原信息。
现有根据DC细胞与T细胞全刺激共培养的方法技术中T细胞亚群未经纯化,因此丰度很低的抗原特异性T细胞接触DC细胞的概率很低,而去除大部分丰度高的T细胞后,大大增加了抗原特异性T细胞与DC细胞接触的概率。本专利选取初始T细胞特异性标记物CD45RA,通过免疫磁珠分选获得高纯度的初始T细胞,有效提升DC细胞递呈抗原信息,从而获得大量的肿瘤新生抗原特异性T细胞。
现有技术会根据DC细胞刺激T细胞的培养体系组合,现有培养体系组合为基础培养基添加一定量的血浆和IL-7,此组合方案,可以维持细胞正常的代谢生长,但不足以提高肿瘤新生抗原特异性T细胞的产量,本专利培养方案组合为基础培养基添加2%自体血浆和20ng/ml IL-7,另加入肿瘤新生抗原多肽10ng/ml~50ng/ml,提升肿瘤新生抗原特异性T细胞的产量。
免疫磁珠技术分离前处理为成熟DC细胞与初始T细胞在最后1轮共刺激培养后24~72h内,T细胞被激活,促使T细胞表达特异性标记物(特异性标记物包括IFN-γ、TNF-α、Granzyme B、Perforin、CD69、CD137);从而利用免疫磁珠技术分离得到表面标记IFN-γ+、TNF-α+、Granzyme B+、Perforin+、CD69+、CD137+的肿瘤新生抗原特异性T细胞。
此非穷举,只要采用了本发明制备方法的框架即都在本发明的保护范围之内。
步骤四,从上一步骤共刺激培养后获得的细胞悬液中分离收集肿瘤新生抗原特异性T细胞;
特异性标记物免疫磁珠技术包括:IFN-γ免疫磁珠、TNF-α免疫磁珠、Granzyme B免疫磁珠、Perforin免疫磁珠、CD69免疫磁珠、CD137免疫磁珠。
采用以上免疫磁珠分离收集肿瘤新生抗原特异性T细胞的具体步骤为:将复苏的成熟DC细胞和10μg/ml~50μg/ml的肿瘤新生抗原多肽加入初始T细胞中进行1~3轮的共刺激培养,在最后1轮加入复苏的成熟DC细胞和肿瘤新生抗原多肽后继续培养24~72h期间,特异性标记物(包括IFN-γ、TNF-α、Granzyme B、Perforin、CD69、CD137)可以瞬时高表达,具有良好指示作用,利用此特征能分离收集得到肿瘤新生抗原特异性T细胞,对于后续激活扩增培养肿瘤新生抗原特异性T细胞提供了良好的基础。此非穷举,只要采用了本发明制备方法的框架即都在本发明的保护范围之内。
步骤五,对肿瘤新生抗原特异性T细胞扩增处理,得到具有杀伤活性的肿瘤新生抗原特异性T细胞;
使用细胞因子组合激活扩增T细胞,从而得到纯度高且具有杀伤活性的肿瘤新生抗原特异性T细胞;细胞因子组合包括:CD3抗体,CD28抗体。本方法以50ng/ml CD3抗体(Biolegend)、10ng/ml的CD28抗体(Biolegend)激活T细胞,使用特定因子组合增殖T细胞,能快速扩增2万倍左右。作为一种优选,细胞因子组合为25ng/ml CD3抗体、5ng/ml的CD28抗体、1.5ng/ml IL-1α、10ng/ml IL-7、400U/ml IL-2、5ng/ml IL-15。
选取呈指数状态生长的细胞进行收集,用冻存液(BAMBANKER)将获得的细胞按照1~5×107cells/ml的密度存储于冻存管中,再放入程序降温盒于-80℃温度下进行初步冻存8~16h,后转入液氮罐中长期保存。
步骤六,肿瘤新生抗原特异性T细胞杀伤肿瘤细胞的有效性验证:
体外有效性验证:采用配型成功的肿瘤细胞系和健康志愿者外周血PBMC来源的未成熟DC细胞及T细胞,针对肿瘤细胞系设计合成肿瘤新生抗原肽后,将此肿瘤新生抗原肽负载到未成熟DC细胞并诱导DC细胞成熟,然后将成熟的DC细胞与初始T细胞共孵育培养刺激,分离纯化获得肿瘤新生抗原特异性T细胞,将其扩增培养后进行收集,进行体外杀伤肿瘤细胞。
体内有效性验证:采用人源肿瘤细胞株移植瘤模型(Cell Derived Xenograft,缩写CDX)评估肿瘤新生抗原特异性T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
以下实验一到实验八的制备方法按照如下实施例进行。
制备方法包括如下步骤:
步骤一,采集健康人外周血,分离获得单个核细胞(PBMC)
将外周血样本离心;取上清经水浴灭活,冷却后离心,取上清标记为自体血浆备用;剩余样本与0.9%氯化钠注射液稀释,使用淋巴细胞分离液分离得到单个核细胞(PBMC);
步骤二,未成熟DC细胞获取
将PBMC离心弃去上清,每1×107个细胞加入80μl的buffer A(PBS+0.5%AB血清+2mM EDTA)和20μl CD14免疫磁珠,混匀后于2~8℃避光孵育15min;加入10ml buffer A,4℃离心,弃上清,计数重悬;每1×108个细胞加500μl buffer A重悬;将MS柱垂悬,用500μlbuffer A润洗后,细胞液经柱洗脱分离得到未成熟DC细胞和T细胞。
步骤三,刺激诱导未成熟DC细胞成熟
收集未成熟DC细胞;按5~10×106cell/瓶铺入培养瓶,加15ml DC培养基(AIM-V+1000U/ml IL-4+1000U/ml GM-CSF+1%自体血浆),48h后半量换液;再次培养48h后全换液并加入25μg/ml/条肿瘤新生抗原肽;24h后加入500U/ml TNF-α、5ng/ml IL-6、5ng/ml IL-1β、0.5μg/ml PGE-2,0.5μg/mlα4-1BB×CD40L双特异性抗体;24h后收集成熟DC细胞;对得到的成熟DC细胞表面标记物CD80/CD83/CD86/MHC I/MHC II以及成熟DC细胞的培养液中IL-12的浓度进行检测。
步骤四,初始T细胞的分离纯化
将步骤二中T细胞计数,T细胞按1~3×106cell/ml种瓶,加入T细胞维持培养基(AIM-V+2%自体血浆+20ng/ml IL-7)后进行培养,视细胞生长情况半量换液;待收集完步骤三中成熟DC细胞后,再次对T细胞进行计数。每1×107个T细胞经160μl buffer A重悬后加入40μl CD45RA免疫磁珠;避光15min后加10ml buffer A离心,弃上清;每1×108个T细胞经500μl buffer A进行重悬;将柱子经500μl buffer A润洗后,细胞液过柱,收集未挂柱的细胞流出液(包含CD45RA阴性细胞(非初始T细胞));用500μlbuffer A润洗3次柱子后,取下柱子加压注入1ml buffer A得到CD45RA阳性细胞(即为初始T细胞)。
步骤五,肿瘤新生抗原特异性T细胞的激活
将初始T细胞与成熟DC细胞分别计数;取出部分成熟DC细胞,按照成熟DC细胞:初始T细胞=1:30的比例共刺激培养,记为第1轮,采用含25μg/ml/条肿瘤新生抗原肽的T细胞维持培养基;剩余成熟DC细胞平均分2份冻存;共刺激培养后的细胞悬液每隔2天进行半量更换或补充T细胞维持培养基;待成熟DC细胞与初始T细胞第1轮共刺激培养7天后,对共刺激培养细胞悬液中的T细胞进行计数,复苏1份冻存的成熟DC细胞并计数;按照成熟DC细胞:T细胞=1:30的比例共刺激培养,并添加25μg/ml/条肿瘤新生抗原肽,记为第2轮,共刺激培养后的细胞悬液每隔2天进行半量更换或补充T细胞维持培养基;待成熟DC细胞与初始T细胞第2轮共刺激培养7天后,对共刺激培养细胞悬液中的T细胞进行计数,复苏1份冻存的成熟DC细胞并计数;按照成熟DC细胞:T细胞=1:30的比例共刺激培养,并添加25μg/ml/条肿瘤新生抗原肽,记为第3轮,48h后获得共刺激培养后的细胞悬液。
步骤六,肿瘤新生抗原特异性T细胞的分离纯化。
共刺激培养后的细胞悬液进行计数离心弃上清,加入10ml Buffer A,4℃300×g离心10min,弃上清;每1×107个细胞经48μl buffer A重悬后加入2μl CD137-PEper;2-8℃避光孵育10min;每1×107个细胞补充加入500μl buffer A混匀后离心弃上清;每1×107个细胞经80μl buffer A重悬后加入20μl Anti-PE MicroBeads;2-8℃避光孵育15min;每1×107个细胞补充加入1000μl buffer A混匀后离心弃上清;每1×108细胞经500μl buffer A重悬;将柱子经500μl buffer A润洗后,细胞悬液过柱,收集未挂柱的细胞流出液(非肿瘤新生抗原特异性T细胞);500μl buffer A润洗3次,取下柱子加压注入1ml buffer A得到CD137阳性T细胞悬液(肿瘤新生抗原特异性T细胞)。
步骤七,肿瘤新生抗原特异性T细胞的增殖:
取纯化后的肿瘤新生抗原特异性T细胞加入适量T细胞激活培养基(AIM-V+10%自体血浆+50ng/ml CD3抗体+10ng/ml的CD28抗体),培养24h后加入IL-1α1.5ng/ml和10ng/mlIL-7,经过24h后再次加入IL-2 500U/ml,24h后加入适量T细胞扩增培养基(AIM-V+10%自体血浆+10ng/ml IL-7+IL-2 500U/ml+10ng/ml IL-15)。后续每间隔一天加入适量T细胞扩增培养基。直至肿瘤新生抗原特异性T细胞数量扩增约2万倍,达到所需细胞数量。
步骤八,肿瘤新生抗原特异性T细胞冻存:
选取呈指数状态生长的细胞进行收集,用冻存液(BAMBANKER)将获得的细胞按照1~5×107cells/ml的密度存储于冻存管中,再放入程序降温盒于-80℃温度下进行初步冻存8~16h,后转入液氮罐中长期保存。
步骤九,肿瘤新生抗原特异性T细胞肿瘤杀伤验证;
1、体外杀伤肿瘤细胞效果验证:
将肿瘤新生抗原特异性T细胞分为6类:CD69+T细胞、CD137+ T细胞、TNF-α+ T细胞、Granzyme B+ T细胞、Perforin+ T细胞、IFN-γ+ T细胞;采用与组名对应的免疫磁珠对各组T细胞进行纯化并扩增。再设置普通T细胞组(名为Mock T细胞组),普通T细胞组在诱导DC细胞成熟过程中和成熟DC细胞与初始T细胞共刺激培养过程中都不添加肿瘤新生抗原肽,其他条件同肿瘤新生抗原特异性T细胞培养条件一致。以上各类T细胞组均与肿瘤细胞(A375细胞)分别按照10:1和30:1的细胞数量比例设置2组实验组。另设置阴性对照组(只添加培养基)2组。统计体外杀伤肿瘤细胞情况。
2、体内杀伤肿瘤效果验证:
将人源肿瘤细胞(A375细胞)接种于免疫缺陷小鼠身上,肿瘤模型构建成功后,将小鼠分为8组,阴性对照组、普通T细胞组、CD69+ T细胞组、CD137+ T细胞组、TNF-α+ T细胞组、Granzyme B+ T细胞组、Perforin+ T细胞组、IFN-γ+ T细胞组,每组10只。建模成功后,待肿瘤瘤体生长至约100mm3大小时,连续三天每天通过尾静脉注射接种一次肿瘤新生抗原特异性T细胞。该肿瘤新生抗原特异性T细胞与上述人源肿瘤细胞A375的HLA相匹配。定义第一次接种时间为第一天,自第一次接种开始连续观察42天,计算肿瘤抑制率(TGI)。
实验一:验证本发明使用的长多肽相比短多肽能更有效的被递呈并激活T细胞。
采集健康志愿者外周血分离获得PBMC后,体外验证多肽疫苗疗效,检测PBMC经多肽刺激后分泌IFN-γ的情况。使用ELISpot法进行检测,以本发明的病毒长多肽(NLVPMVATVKKQYIKANSKFIGITEL)作为实验组1,以包含有病毒长多肽中相同突变位点的对应病毒短多肽1(NLVPMVATV)及病毒短多肽2(QYIKANSKFIGITEL)作为实验组2,以CEF多肽池作为阳性对照组,以空白组作为阴性对照组,具体流程如下:
在室温下将外周血与PBS按照1:1比例稀释混匀后,采用淋巴细胞分离液分离获得PBMC;再加入PBS或培养基重悬PBMC后进行离心收集PBMC,重复此步重悬离心收集操作2次后测定PBMC的留存细胞量与细胞存活率。分别将病毒长多肽、病毒短多肽1、病毒短多肽2、CEF多肽池对应地加入不同的PBMC培养瓶中培养48h后再进行检测验证实验。使用人IFN-γELISpot试剂盒(达优)进行检测,具体步骤参见试剂盒说明书。
ELISpot检测结果显示出病毒长多肽组的斑点数明显多于病毒短多肽组,且有统计学意义(P<0.05),即长多肽组具有更强的免疫原性,长多肽能更好地激活T细胞,具体结果如表1所示;
表1
分别采用病毒长多肽(NLVPMVATVKKQYIKANSKFIGITEL)和病毒短多肽(NLVPMVATV)通过四聚体(tetramer)染色流式分析验证成熟DC细胞成功递呈肿瘤新生抗原和激活T细胞的能力。
具体实验步骤同以上制备方法的步骤一至步骤五。除了将步骤三和步骤五中添加25μg/ml/条肿瘤新生抗原肽改为按照表1的除阴性对照组外的多肽类别进行添加,其余步骤一致。成熟DC细胞与初始T细胞3轮共刺激培养,在第3轮共刺激培养后48h进行四聚体染色流式检测。具体结果如图1所示。
实验二:验证α4-1BB×CD40L双特异性抗体,OX40,TLR-3,TLR-6,TLR-7/8,TLR-9,均能上调成熟DC细胞表面标记物CD83/CD80/CD86/MHC I/MHC II的表达量及成熟DC细胞IL-12的分泌量。
将未成熟DC细胞分为九组,诱导培养未成熟DC细胞全换液并加入25μg/ml/条肿瘤新生抗原肽,培养24h后分别加入能够刺激未成熟DC细胞成熟的细胞因子组合,第一组500U/ml TNF-α;每二组500U/ml TNF-α和5ng/ml IL-1β;第三组500U/ml TNF-α、5ng/mlIL-6、5ng/ml IL-1β和0.5μg/ml PGE-2;第四组500U/ml TNF-α、5ng/ml IL-6、5ng/ml IL-1β、0.5μg/ml PGE-2和0.5μg/mlα4-1BB×CD40L双特异性抗体;第五组:500U/ml TNF-α、5ng/ml IL-6、5ng/ml IL-1β、0.5μg/ml PGE-2和0.5μg/ml OX40,第六组:500U/ml TNF-α、5ng/ml IL-6、5ng/ml IL-1β、0.5μg/ml PGE-2和0.5μg/ml TLR-3;第七组:500U/ml TNF-α、5ng/ml IL-6、5ng/ml IL-1β、0.5μg/ml PGE-2和0.5μg/ml TLR-6,第八组:500U/ml TNF-α、5ng/ml IL-6、5ng/ml IL-1β、0.5μg/ml PGE-2和0.5μg/ml TLR-7/8,第九组:500U/ml TNF-α、5ng/ml IL-6、5ng/ml IL-1β、0.5μg/ml PGE-2和0.5μg/ml TLR-9。
实验步骤同制备方法步骤一和步骤二,经过肿瘤新生抗原筛选及抗原肽合成、肿瘤新生抗原肽负载到未成熟DC细胞,然后分别加入能够刺激未成熟DC细胞成熟的因子组合。结果显示采用第四组、第五组、第六组、第七组、第八组、第九组的细胞因子组合时,不仅刺激得到的DC细胞的表面标记物。CD83/CD80/CD86/MHC I/MHC II明显上调,优于其它组,如图2所示;而且同时IL-12的分泌量也明显升高,优于其它组,结果如图3所示。实验结果表明第四组、第五组、第六组、第七组、第八组、第九组的细胞因子组合能够更有效地诱导刺激未成熟DC细胞成熟。
实验三:验证采用不同的成熟DC细胞与初始T细胞的细胞数量比例和添加不同的肿瘤新生抗原肽浓度对于共刺激培养中特异性T细胞增殖能力的影响。
将成熟DC细胞与初始T细胞的细胞数量比例分别设置为1:10、1:20、1:30、1:60、1:90五组,通过实验比较筛选出最适共刺激培养比例。在此最适比例下,添加不同浓度的肿瘤新生抗原肽(0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml,100ng/ml),筛选出在最适共刺激比例下添加的肿瘤新生抗原肽的最优浓度。实验步骤同具体实施步骤中步骤一至步骤五。
结果显示当成熟DC细胞:初始T细胞为1:20、1:30、和1:60中任一比例,所得肿瘤新生抗原特异性T细胞增殖数量高、活性好;当添加肿瘤新生抗原肽的浓度范围在10~50ng/ml内,其都能有效刺激肿瘤新生抗原肽特异性T细胞的增殖,且所得肿瘤新生抗原特异性T细胞的数量高、活性好。结果如图4、5所示。
实验四:验证成熟DC细胞与初始T细胞共刺激培养3轮,能有效激活肿瘤新生抗原特异性T细胞。
实验方法同制备方法中步骤一、步骤二和步骤三得到成熟DC细胞和T细胞。将步骤二中未挂柱的T细胞计数后取适量进行CD45RA免疫磁珠纯化获得初始T细胞,具体纯化步骤参照CD45RA MicroBeads,human(130-045-901)说明书。将磁珠分离纯化获得的初始T细胞计数后,按成熟DC细胞:初始T细胞=1:30的细胞数量比例,加入成熟DC细胞,再进行全换液(含有25μg/ml/条肿瘤新生抗原肽的T细胞维持培养基),标记为初始T细胞组。另取适量的未经CD45RA磁珠分离纯化的T细胞,标记为全T细胞组。后续实验步骤同制备方法的步骤四至步骤七,进行流式检测。
本发明的初始T细胞组与全T细胞组相比,初始T细胞组的肿瘤新生抗原特异性T细胞的表面特异性标记物IFN-γ、TNF-α、Granzyme B、Perforin、CD69、CD137的表达量均能上调,说明初始T细胞组中肿瘤新生抗原特异性T细胞能更多地被成熟DC细胞激活,具体实验结果如图6所示;
将初始T细胞组内的T细胞与成熟DC细胞共刺激培养3轮,采用流式细胞仪分别检测第1轮、第2轮、第3轮共培养后得到的细胞中肿瘤新生抗原特异性T细胞占比,结果显示3轮共刺激培养后肿瘤新生抗原特异性T细胞占比均增加,肿瘤新生抗原特异性T细胞可通过不同的表面特异性标记物标定,具体实验结果如图7所示。
实验五:验证成熟DC细胞与初始T细胞3轮共刺激培养后,免疫磁珠分离纯化肿瘤新生抗原特异性T细胞的最优时间节点。
实验步骤同制备方法的步骤一至步骤六。完成步骤五中成熟DC细胞与初始T细胞第3轮刺激后,分别在该轮共刺激培养后0h、24h、48h、72h、96h进行流式检测。
结果显示在第3轮共刺激培养后24~72h,特异性T细胞(CD137、IFN-γ、CD69、TNF-α、Granzyme B、Perforin)占比均优于其他时间节点。具体结果如图8所示。
实验六:验证不同磁珠分离纯化抗原特异性T细胞的工艺稳定性和优效性。
将病毒长多肽替代新生抗原肽被未成熟DC细胞摄取并递呈,激活相应的抗原特异性T细胞,分别验证六种免疫磁珠IFN-γ、TNF-α、Granzyme B、Perforin、CD69和CD137分离纯化抗原特异性T细胞的工艺稳定性和优效性。实验步骤同制备方法步骤一至步骤七。将步骤三和步骤五中使用的肿瘤新生抗原肽替换为病毒长多肽,步骤六中采用不同的特异性免疫磁珠分离纯化方法获得抗原特异性T细胞,分为六种不同的方法:分别采用IFN-γ、TNF-α、Granzyme B、Perforin、CD69和CD137免疫磁珠进行分离纯化,取步骤七扩增后得到的抗原特异性T细胞进行ELISpot检测和病毒长多肽四聚体染色流式检测。
本发明中采用不同的免疫磁珠(上述六种免疫磁珠)分别分离纯化获得抗原特异性T细胞,再扩增得到的抗原特异性T细胞。采用ELISpot检测得到的抗原特异性T细胞,结果显示出抗原特异性T细胞均已被病毒长多肽激活;实验组与阴性对照组的斑点数存在显著性差异(P<0.05),同时在实验中设置了阳性对照组,具体结果如图9实验结果所示。另将分离纯化前与纯化扩增后的抗原特异性T细胞分别流式检测四聚体阳性T细胞,结果显示不同免疫磁珠纯化扩增后四聚体阳性率均大于3%,具体结果如图10实验结果所示。
实验七:肿瘤新生抗原特异性T细胞体外杀伤肿瘤细胞验证
实验步骤同制备方法步骤一至步骤七。将步骤三和步骤五中的25μg/ml/条的肿瘤新生抗原肽替换为A375肿瘤细胞新生抗原肽,步骤六中分别采用六种免疫磁珠(IFN-γ、TNF-α、Granzyme B、Perforin、CD69和CD137)进行分离纯化获得肿瘤新生抗原特异性T细胞,通过步骤七的扩增培养获得大量肿瘤新生抗原特异性T细胞。利用AgilentxCELLigence RTCA SP实时无标记细胞分析仪,按照设备使用说明书,完成A375肿瘤细胞生长曲线测定及细胞药物毒性测试。分别观察阴性对照组、普通T细胞组(Mock组)、CD69+ T细胞组、CD137+ T细胞组、TNF-α+ T细胞组、Granzyme B+ T细胞组、Perforin+ T细胞组、IFN-γ+T细胞组、阴性对照组(培养基组)的Cell Index(缩写CI)值。CI值在该实验中与细胞数量成正比,细胞量越多,CI值越高。由于细胞增殖的特点,当孔中的细胞达到一定数量,即细胞增殖进入平台期,CI值不再增加。实验结果显示出CD69+ T细胞组、CD137+ T细胞组、TNF-α+ T细胞组、Granzyme B+ T细胞组、Perforin+ T细胞组、IFN-γ+ T细胞组的肿瘤新生抗原特异性T细胞肿瘤抑制率大于90%,与阴性对照组有统计学差异(P<0.05),具体结果如下图11所示。
实验八:肿瘤新生抗原特异性T细胞体内杀伤肿瘤验证实验。
1、CDX小鼠模型入组;
构建好A375 CDX小鼠,从中选取80~90只肿瘤平均直径约为0.6cm且肿瘤体积相近的小鼠,随机分为8组,每组10只,分别是阴性对照组、普通T细胞组(Mock组)、CD69+ T细胞组、CD137+ T细胞组、TNF-α+ T细胞组、Granzyme B+ T细胞组、Perforin+ T细胞组、IFN-γ+ T细胞组。
2、肿瘤模型给药;
1)普通T细胞组给药:
利用无肿瘤新生抗原肽负载的DC细胞与初始T细胞进行共孵育刺激,完成步骤二至步骤五,获得普通T细胞,给小鼠通过尾静脉注射1×106个普通T细胞/100μl,连续3天,每天注射一次。
2)肿瘤新生抗原特异性T细胞组给药:
通过制备方法的步骤一至步骤七来制备肿瘤新生抗原特异性T细胞。步骤三和步骤五为25μg/ml/条A375肿瘤细胞新生抗原肽,步骤六采用六种免疫磁珠(IFN-γ、TNF-α、Granzyme B、Perforin、CD69和CD137免疫磁珠)分别进行分离纯化获得肿瘤新生抗原特异性T细胞,对经步骤七扩增后的肿瘤新生抗原特异性T细胞进行计数后,给小鼠通过尾静脉注射1×106个肿瘤新生抗原特异性T细胞/100μl,连续3天,每天注射一次。
3)阴性对照组给药:
给小鼠通过尾静脉注射100μl 0.9%氯化钠注射液,连续3天,每天注射一次。
3、取样检测及指标评估;
记录并对比实验组和对照组中的肿瘤生长情况,如图12所示,肿瘤新生抗原特异性T细胞CD69+ T细胞组、CD137+ T细胞组、TNF-α+ T细胞组、Granzyme B+ T细胞组、Perforin+ T细胞组、IFN-γ+ T细胞组具有良好的抑瘤效果,且与阴性对照组和普通T细胞组间存在显著性差异(P<0.05)。
本发明通过对比肿瘤样本和正常组织的全外显子测序及转录组测序结果,利用生信分析平台,优选出突变频率高、HLA亲和力强、无毒、无生物学活性的肿瘤新生抗原位点;接着,通过肿瘤新生抗原多肽设计平台完成肿瘤新生抗原的长多肽序列的设计并制备出包含肿瘤新生抗原的多肽产品;将此肿瘤新生抗原多肽负载到未成熟DC细胞(未成熟DC细胞具有很强的吞噬、加工、处理抗原肽的能力),再使用多种细胞因子组合诱导未成熟DC细胞成熟(成熟的DC细胞能够将该肿瘤新生抗原递呈到细胞表面);接着将此成熟DC细胞与外周血来源的初始T细胞共刺激培养,得到包含有能识别该肿瘤新生抗原的特异性T细胞的细胞悬液;最后利用免疫磁珠分选技术,从含有肿瘤新生抗原的特异性T细胞的细胞悬液中分离纯化获得具有肿瘤新生抗原特异性的T细胞,在体外大量扩增肿瘤新生抗原特异性T细胞后,回输患者体内,实现精准杀灭肿瘤的目的。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解,上述实施例不以任何形式限制本发明,凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案,均落在本发明的保护范围内。
Claims (11)
1.一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,其特征在于,包括:
步骤一,合成肿瘤新生抗原多肽;
步骤二,将肿瘤新生抗原多肽负载到未成熟DC细胞,对未成熟DC细胞进行诱导,获得负载有肿瘤新生抗原的成熟DC细胞;
步骤三,将成熟DC细胞与纯化后的初始T细胞进行1~3轮的共刺激培养,从而获得含有表面被标记的肿瘤新生抗原特异性T细胞的细胞悬液;
步骤四,从细胞悬液中分离收集肿瘤新生抗原特异性T细胞;
步骤五,对肿瘤新生抗原特异性T细胞进行扩增处理,得到具有杀伤活性的肿瘤新生抗原特异性T细胞。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,其特征在于,步骤一,合成肿瘤新生抗原多肽;
具体方法包括:
步骤1.1,根据肿瘤组织的全外显子与转录组测序数据分析得到体细胞突变位点,预测肿瘤新生抗原短多肽序列;
步骤1.2,根据短多肽序列的起始和终止位置关系及组合方式设计出若干条对应的长多肽序列,所述长多肽序列包含15~30个氨基酸;
步骤1.3,对长多肽序列进行筛选;
步骤1.4,根据筛选得到的长多肽序列合成长度为15~30个氨基酸的长多肽。
3.根据权利要求1所述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,其特征在于,步骤二中所述对未成熟DC细胞进行诱导的具体方法包括:利用细胞因子对未成熟DC细胞进行诱导;所述细胞因子包括如下细胞因子至少一个:α4-1BB×CD40L双特异性抗体、OX40、TLR-3、TLR-6、TLR-7/8、TLR-9。
4.根据权利要求3所述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,其特征在于,所述细胞因子为:500~1000U/ml TNF-α、5~10ng/ml IL-6、5~10ng/ml IL-1β、0.5~2μg/mlPGE-2、0.5~2μg/mlα4-1BB×CD40L双特异性抗体、0.5~2μg/ml OX40、0.5~2μg/ml TLR-3、0.5~2μg/ml TLR-6、0.5~2μg/ml TLR-7/8、0.5~2μg/ml TLR-9。
5.根据权利要求1所述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,其特征在于,所述步骤三中纯化后的初始T细胞是指通过免疫磁珠纯化获取的初始T细胞;所述免疫磁珠纯化的方法包括但不仅限于:CD45RA MicroBeads免疫磁珠纯化方法、Naive Pan T CellIsolation Kit免疫磁珠纯化方法。
6.根据权利要求1所述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,其特征在于,
所述步骤三中表面被标记的肿瘤新生抗原特异性T细胞的表面标记为IFN-γ+、TNF-α+、Granzyme B+、Perforin+、CD69+、CD137+中的任意一个。
7.根据权利要求1所述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,其特征在于,
所述步骤三中将成熟DC细胞与纯化后的初始T细胞进行1~3轮的共刺激培养是指按照成熟DC细胞:初始T细胞=1:20~60的细胞数量比例混合。
8.根据权利要求1所述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,其特征在于,
所述步骤三中将成熟DC细胞与纯化后的初始T细胞进行1~3轮的共刺激培养的具体方法为:分批复苏冻存的成熟DC细胞,将复苏的成熟DC细胞和10μg/ml~50μg/ml的肿瘤新生抗原多肽加入初始T细胞中进行1~3轮的共刺激培养,在最后1轮加入复苏的成熟DC细胞和肿瘤新生抗原多肽后继续培养24~72h。
9.根据权利要求1所述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,其特征在于,所述步骤四中,从细胞悬液中分离收集肿瘤新生抗原特异性T细胞的具体内容包括:利用免疫磁珠技术从细胞悬液中分离收集肿瘤新生抗原特异性T细胞;所述免疫磁珠技术包括如下免疫磁珠至少一个:CD137免疫磁珠、IFN-γ免疫磁珠、CD69免疫磁珠、TNF-α免疫磁珠、Granzyme B免疫磁珠和Perforin免疫磁珠。
10.根据权利要求1所述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,其特征在于,所述步骤五中对肿瘤新生抗原特异性T细胞扩增处理,得到具有杀伤活性的肿瘤新生抗原特异性T细胞的具体内容包括:
使用细胞因子组合激活扩增肿瘤新生抗原特异性T细胞,得到具有杀伤活性的肿瘤新生抗原特异性T细胞;所述细胞因子组合包括:CD3抗体、CD28抗体。
11.根据权利要求10所述的一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法,其特征在于,所述步骤五中的细胞因子组合为:25~100ng/ml CD3抗体、5~20ng/ml CD28抗体、0.5~3ng/ml IL-1α、10~30ng/ml IL-7、400~1000U/ml IL-2和5~20ng/ml IL-15。
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