CN102321581A - 腹水肿瘤细胞致敏dc-cik的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法以及DC-CIK的应用。该腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法包括的步骤有：腹水肿瘤抗原的制备；脐带血单个核细胞的制备；脐带血淋巴细胞和粘附细胞的分离；CIK细胞的诱导扩增；DC细胞的诱导扩增及DC细胞负载腹水肿瘤抗原；DC细胞与CIK细胞共培养制备DC-CIK。本发明腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法制备的DC-CIK增殖活性和杀瘤活性高，其该方法工序简单，条件易控，对设备要求低。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的涉及一种腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法与DC-CIK的应用。
背景技术
免疫治疗是即手术、放疗和化疗之外肿瘤临床治疗的重要手段，对清除肿瘤患者体内残留和转移的肿瘤细胞，防止肿瘤的转移和复发及提高患者的生存率和生存治疗具有重要的作用和价值。目前肿瘤的免疫治疗手段主要有淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、自然杀伤细胞(NK)、经修饰的自体树突状细胞刺激的T淋巴细胞治疗(DC-T)、自体树突细胞刺激的CIK免疫治疗(DC-CIK)等。
DC细胞是Steinman和Cohn于1973年首先报道的，因其成熟时有树突样或伪足样突起而得名。它是目前发现的功能最强的专职抗原呈递细胞(APC)，DC在免疫应答过程中处于调控地位：①机体的卫士：未成熟的DC主要在分布的原位摄取、加工和处理抗原，然后迁移至淋巴器官激发免疫应答。②免疫应答的始动者：成熟的DC递呈抗原并刺激静息期的初始型和记忆性T细胞，使其活化。③有刺激T细胞的强效：数量很少的DC和低水平的抗原就能诱导强烈的T细胞应答，表达协同刺激分子。有研究显示，绝大多数肿瘤患者存在DC数量减少和功能障碍，DC的浸润程度与淋巴结转移、肿瘤的浸润深度、转移复发、预后等均有密切的关系，同时也提示体外诱导足够数量的功能强大的DC用于纠正患者的免疫缺陷成为一种可能。
CIK细胞是一种非主要组织相容性复合体(MHC)限制性的细胞毒性T淋巴细胞。CIK用于杀伤肿瘤被认为是肿瘤过继免疫治疗的首选方案。树突状细胞(DC)在肿瘤细胞和T淋巴细胞的相互作用中起到桥梁和枢纽作用。二者共同培养后，不仅提高了CIK的增殖能力和杀伤活性，并且治疗范围广泛，对多个系统的肿瘤具有1+1＞2的疗效。
目前DC-CIK主要是无抗原致敏的DC-CIK、肿瘤特异性抗原致敏的DC-CIK及肿瘤细胞株致敏的DC-CIK。大量研究表明，DC与CIK细胞共同培养后，DC的抗原提呈及激发机体免疫应答的能力得到提高，CIK的增殖活性和细胞毒作用得以增强。经抗原负载的DC与未经抗原负载的DC均可使CIK细胞的杀瘤活性提高，但是经抗原负载的DC能够提成更多的肿瘤抗原，更好地协同刺激CIK细胞的活化，具有更高的杀瘤活性，两者比较有显著差异(P＜0.05)。
DC细胞体外负载的抗原主要是已知的肿瘤特异性抗原，肿瘤细胞株裂解物。由于很多肿瘤的特异性抗原尚未明确并且肿瘤发生的抗原突变能抵抗单一抗原的免疫攻击，因此用特异性抗原致敏DC细胞具有一定的局限性。另外肿瘤细胞株在体外传代过程中表面抗原可能发生改变，DC细胞不能将该肿瘤的所有抗原呈递给效应T细胞，限制了DC-CIK的体内抗肿瘤效应。
传统的腹水肿瘤细胞的提取方法有多种，免疫磁珠法较为先进，但是需要特异性肿瘤细胞抗体，价格昂贵；密度梯度离心法操作较为简单、经济，但是由于腹水中含有较多的红细胞、肿瘤浸润淋巴细胞等，制备成的细胞悬液密度较高，不利于肿瘤细胞的分离；贴壁培养法，将淋巴细胞分离液分离得到的淋巴细胞与肿瘤细胞混合物共同培养，根据肿瘤细胞易贴壁而淋巴细胞不贴壁的原理分离肿瘤细胞，细胞需要在体外传代培养，表面抗原亦可能发生变化。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种能获得高增殖活性和杀瘤活性的腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法。
为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
一种腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法，包括如下步骤：
腹水肿瘤抗原的制备：用PBS缓冲液重悬腹水肿瘤细胞，再与终浓度为0.1～1.0mg/ml的亮抑蛋白酶抑制剂混合，形成混合液，置于液氮中5～10min后，接着置入36～38℃水浴中，待混合液完全融化后，再次放入液氮中，反复2～5次，然后依次进行离心，微孔滤膜过滤，得到腹水肿瘤抗原；
脐带血单个核细胞的制备：将获取的新鲜脐带血离心后，分别收集上层的脐带血浆和下层的脐带血细胞，将所述脐带血细胞用DPBS缓冲液稀释，再用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用DPBS缓冲液清洗，显微镜下观察计单个核细胞数，最后用淋巴细胞培养液GT-T551调节单个核细胞密度为1～2×106个/ml，得到单个核细胞悬液，其中，所述淋巴细胞培养液GT-T551含有体积浓度为1～10％所述脐带血浆；
脐带血淋巴细胞和粘附细胞的分离：将所述单个核细胞悬液培养1～1.5小时，然后冲洗细胞，获得没有粘附的细胞和粘附细胞；
CIK细胞的诱导扩增：将所述没有粘附的细胞移入含体积浓度1～10％的所述脐带血浆的淋巴细胞培养液GT-T551中，并加入终浓度为500～1000IU/ml的重组人γ-干扰素混合，再培养12～36小时后，加入终浓度为50ng/ml～250ng/ml抗胸腺细胞球蛋白、终浓度为0.5～2ng/ml的重组人白细胞介素-1、终浓度为500～1000IU/ml的重组人白细胞介素-2进行再次培养7～8天，收集CIK细胞；
DC细胞的诱导扩增及DC细胞负载腹水肿瘤抗原：将所述粘附细胞加入DC培养液中培养2～4天后加入终浓度为15～30μg/ml的所述腹水肿瘤抗原继续培养2～4天后，加入终浓度为200～1000ng/ml的肿瘤坏死因子，得到负载肿瘤抗原的DC细胞；
DC细胞与CIK细胞共培养制备DC-CIK：将所述负载肿瘤抗原的DC细胞与所述CIK细胞混合培养，得到腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK。
上述腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法制备的DC-CIK增殖活性和杀瘤活性高，其增殖倍数平均高达210.33±1.16，是传统方法获得的DC-CIK增殖倍数的2倍，具体数值参见表1；其杀瘤率高达70～80％，与传统方法获得的DC-CIK杀瘤率相比，提高了10～30％。其中，上述腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法采用腹水肿瘤细胞获取腹水肿瘤细胞抗原，与肿瘤特异性抗原相比，该腹水肿瘤细胞抗原中抗原肽丰富，有效避免了肿瘤细胞可能对特异性单一抗原的抵抗作用；与肿瘤细胞株抗原相比，由于腹水肿瘤细胞是原代细胞，可以避免肿瘤细胞株在体外传代过程中可能产生的抗原结构的改变；在腹水肿瘤抗原制备的步骤中，蛋白酶抑制剂有效保持了肿瘤抗原的完整性；在CIK细胞诱导扩增步骤中的抗胸腺细胞球蛋白提高了DC-CIK的增殖效率。另外，上述腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法工序简单，条件易控，对设备要求低。由于该方法获得的DC-CIK增殖效率高，因此，有效降低了获取DC-CIK的成本。
附图说明
图1是本发明实施例腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法工艺流程示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种能获得高增殖活性和杀瘤活性的腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法。该腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法的工艺流程如图1所示，包括如下步骤：
步骤S1，腹水肿瘤抗原的制备：用PBS缓冲液重悬腹水肿瘤细胞，再与终浓度为0.1～1.0mg/ml的亮抑蛋白酶抑制剂混合，形成混合液，置于液氮中5～10min后，接着置入36～38℃水浴中，待混合液完全融化后，再次放入液氮中，反复2～5次，然后依次进行离心，微孔滤膜过滤，得到腹水肿瘤抗原；
步骤S2，脐带血单个核细胞的制备：将获取的新鲜脐带血离心后，分别收集上层的脐带血浆和下层的脐带血细胞，将该脐带血细胞用DPBS缓冲液稀释，再用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用DPBS缓冲液清洗，显微镜下观察计单个核细胞数，最后用淋巴细胞培养液GT-T551调节单个核细胞密度为1～2×106个/ml，得到单个核细胞悬液，其中，淋巴细胞培养液GT-T551含有体积浓度为1～10％所述脐带血浆；
步骤S3，脐带血淋巴细胞和粘附细胞的分离：将单个核细胞悬液培养1～1.5小时，然后冲洗细胞，获得没有粘附的细胞和粘附细胞；
步骤S4，CIK细胞的诱导扩增：将没有粘附的细胞移入含体积浓度1～10％的脐带血浆的淋巴细胞培养液GT-T551中，并加入终浓度为500～1000IU/ml的重组人γ-干扰素混合，再培养12～36小时后，加入终浓度为50ng/ml～250ng/ml抗胸腺细胞球蛋白、终浓度为0.5～2ng/ml的重组人白细胞介素-1、终浓度为500～1000IU/ml的重组人白细胞介素-2进行再次培养7～8天，收集CIK细胞；
步骤S5，DC细胞的诱导扩增及DC细胞负载肿瘤抗原：将粘附细胞加入DC培养液中培养2～4天后加入终浓度为15～30μg/ml的腹水肿瘤抗原继续培养2～4天后，加入终浓度为200～1000ng/ml的肿瘤坏死因子，得到负载肿瘤抗原的DC细胞；
步骤S6，DC细胞与CIK细胞共培养制备DC-CIK：将负载肿瘤抗原的DC细胞与CIK细胞混合培养，得到腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK。
这样，上述腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法制备的DC-CIK增殖活性和杀瘤活性高，其增殖倍数平均高达210.33±1.16，是传统方法获得的DC-CIK增殖倍数的2倍，具体数值参见表1；其杀瘤率高达70～80％，与传统方法获得的DC-CIK杀瘤率相比，提高了10～30％。其中，该腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法采用腹水肿瘤细胞获取腹水肿瘤细胞抗原，与肿瘤特异性抗原相比，该腹水肿瘤细胞抗原中抗原肽丰富，有效避免了肿瘤细胞可能对特异性单一抗原的抵抗作用；与肿瘤细胞株抗原相比，由于腹水肿瘤细胞是原代细胞，可以避免肿瘤细胞株在体外传代过程中可能产生的抗原结构的改变；在腹水肿瘤抗原制备的步骤中，蛋白酶抑制剂避免在裂解腹水肿瘤细胞过程中腹水肿瘤细胞内的蛋白酶释放到胞外对腹水肿瘤细胞抗原蛋白的降解作用，保持了腹水肿瘤细胞抗原的完整性，对腹水肿瘤细胞抗原的具有一定的保护作用，从而可以通过DC细胞将更多的腹水肿瘤细胞抗原提呈给CIK细胞，协同刺激CIK细胞的活化；在CIK细胞诱导扩增步骤中的抗胸腺细胞球蛋白是多克隆的兔免疫球蛋白，有效提高了DC-CIK的增殖效率。另外，上述腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法工序简单，条件易控，对设备要求低。由于该方法获得的DC-CIK增殖效率高，因此，有效降低了获取DC-CIK的成本。
具体地，上述步骤S1中，腹水肿瘤细胞的获取方法优选为：取癌性腹水，用终含量为5～15IU/ml的肝素钠抗凝，将抗凝后的腹水与羟乙基淀粉按体积比为5～6∶1的比例混合，2～8℃下静置，沉降红细胞，取上层液，进行第一次离心，收集下层细胞，用PBS重悬所述细胞，洗涤、第二次离心，用PBS二次重悬所述细胞，得到细胞悬液，将所述细胞悬液加到人肿瘤细胞分离液的液面上，第三次离心，收集腹水肿瘤细胞。该优选的腹水肿瘤细胞获取方法只需经分离、纯化处理，不需要在体外培养，工序简单，采用羟乙基淀粉与抗凝后的腹水混合，有效的除去了腹水中的红细胞，使得分离获取的腹水肿瘤细胞纯度高，从而有效克服了现有的如免疫磁珠法、密度梯度离心法、贴壁培养法等提取方法的不足。其中，肝素钠的终含量优选为10IU/ml，静置的温度优选为4℃。第一次离心和第二次离心的转速优选为600g，离心时间优选为5～10min；第三次离心的转速优选为700～900g，更优选为800g，离心时间优选为10～25min，更优选为15min，经第三次离心分离后，整个混合液会分成不同液层，从含有腹水肿瘤细胞的液层中收集腹水肿瘤细胞。另外，收集的腹水肿瘤细胞还可进一步的纯化处理，如再次用PBS洗涤，在转速为600g的条件下离心5～10min。该腹水肿瘤细胞获取进一步具体的方法请参见下文中实施例1的步骤S11。其中，该癌性腹水来源于医院手术后废弃的病人腹水。
在该步骤S1中，混合液中的亮抑蛋白酶抑制剂浓度优选为0.5mg/ml。该优选含量的亮抑蛋白酶抑制剂浓度能进一步避免在裂解腹水肿瘤细胞过程中，胞内蛋白酶释放到胞外对腹水肿瘤抗原蛋白的降解作用，保持了腹水肿瘤抗原的完整性，对腹水肿瘤抗原的具有一定的保护作用，从而可以通过DC细胞将更多的腹水肿瘤抗原提呈给CIK细胞，协同刺激CIK细胞的活化。
在该步骤S1中，混合液置于液氮中时，腹水肿瘤细胞发生裂解，为了使腹水肿瘤细胞尽可能的全部发生裂解，释放全部的抗原，重复裂解的次数优选为3次。微孔滤膜过滤的孔径优选为0.15～0.22μm，进一步优选为0.22μm。
上述步骤S2中，新鲜脐带血分离的优选在转速700g的条件下离心20分钟，经离心获得的上层脐带血浆优选置于2～8℃的温度下保存备用。淋巴细胞分离液的比重优选为1.077。淋巴细胞培养液GT-T551中含有的经离心获得的上层脐带血浆的体积浓度优选5％，该优选的淋巴细胞培养液GT-T551更有利于下述步骤S3中脐带血淋巴细胞和粘附细胞的培养。其中，该脐带血从血库获取。
上述步骤S3中，单个核细胞悬液培养优选在37℃、5％CO2饱和湿度的条件下培养。冲洗细胞的方式可以采用移液管冲洗，冲洗的强度应该保证粘附细胞不脱落。
上述步骤S4中，没有粘附的细胞在淋巴细胞培养液GT-T551中培养的条件优选为培养温度37℃、5％CO2饱和湿度。抗胸腺细胞球蛋白(thymoglobulin)是一种多克隆的兔免疫球蛋白，是一种用于治疗肾移植排斥反应的免疫抑制剂，发明人在研究中发现，它能明显提高DC-CIK的增殖效率，其在整个淋巴细胞培养液GT-T551中的终浓度优选为100ng/ml～200ng/ml，且该抗胸腺细胞球蛋白优选为粘附的细胞培养24小时后添加。
在该步骤S4中，淋巴细胞培养液GT-T551中含有的经离心获得的上层脐带血浆的浓度优选5v/v％，重组人白细胞介素-1(IL-1)的终浓度优选为1ng/ml，所述重组人白细胞介素-2(IL-2)的终浓度优选为1000IU/ml。
另外，在该步骤S4中，为了提供足量的所需营养和保持营养的平衡，没有粘附的细胞在淋巴细胞培养液GT-T551培养过程中，优选每隔2～3天补充该培养液GT-T551、脐带血浆和IL-2。
上述步骤S5中，DC培养液优选包含1～10％的上述脐带血浆、80～120ng/ml的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、25～30ng/ml的白细胞介素-4(IL-4)。其中，脐带血浆更优选为5％。该优选配方的DC培养液能有利于DC细胞的诱导扩增DC细胞负载腹水肿瘤抗原。优选将粘附细胞在该DC培养液中培养第3天，再补加GM-CSF和IL-4，使得两者浓度恢复原配方含量，保持各组分含量在DC细胞的诱导扩增过程中保持平衡。
在该步骤S5中，加入腹水肿瘤抗原在该DC培养液的中浓度优选为20μg/ml，加入的肿瘤坏死因子的终浓度优选为500ng/ml。该优选的腹水肿瘤抗原的浓度能使得其更高效的负载在DC细胞上，该浓度的肿瘤坏死因子能有效的诱导DC成熟。
在该步骤S5中，粘附细胞在DC培养液中的培养优选在37℃、5％CO2和饱和湿度的条件下培养。
上述步骤S6中，DC细胞与CIK细胞优选按1∶10～3的比例进行混合培养，更优选的DC细胞与CIK细胞个数混合培养的比例为1∶5。该DC细胞与CIK细胞按混合培养优选是在含有5v/v％的上述脐带血浆、1000IU/ml重组人白细胞介素-2的淋巴细胞培养液GT-T551中培养。该优选的培养液更有利于提高DC-CIK的产率。该培养的条件与上述步骤S5中培养条件相同。另外，为了提供足量的所需营养和保持营养的平衡，在DC细胞与CIK细胞按混合培养过程中，优选每隔2～3天补充该培养液。
本发明中，上述“v/v％”均表示体积百分含量。另外，上述步骤S1也可以与步骤S2至步骤S4同时进行，或者掺插在步骤S2至步骤S4之间的任相邻的两步骤之间进行。
现以具体的腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法，参见图1所示，包括如下步骤：
S11.腹水肿瘤抗原的制备方法：
(1)从腹水中分离获得肿瘤细胞：取癌性腹水400ml，用10IU/ml肝素钠抗凝，将抗凝腹水与6％的羟乙基淀粉以5∶1的比例混合均匀，4℃静置1h，沉降红细胞，取上层液，600g，离心5-10min，弃上清，用PBS重悬细胞，洗涤1次，600g，离心5-10min，再用50ml PBS重悬细胞；取15ml离心管，分别加入5ml人肿瘤细胞分离液，密度1.055，小心沿管壁将细胞悬液5ml加到人肿瘤细胞分离液的上方，注意不要摇晃离心管，800g，离心15min，从人肿瘤细胞液界面上的液层中收集肿瘤细胞，用PBS洗涤1次，600g，离心5-10min。
(2)肿瘤抗原的制备：收集上述步骤(2)中获得的107个细胞，用1ml PBS重悬细胞，加入终浓度0.5mg/ml的亮抑蛋白酶抑制剂，混匀，置液氮中进行裂解，8min后迅速置入属37℃水浴中，待其完全融化后，再次放入液氮中，反复3次，900g，离心20min，0.22μm微孔滤膜过滤，测定蛋白质浓度，于-20℃保存，备用。
S12.脐带血单个核细胞的制备：获取新鲜脐带血80ml，离心(700g，20min)，离心后分为两层，上层为脐带血浆，下层为脐带血细胞，将上层脐带血浆经处理后，放置于2-8℃保存备用；将下层脐带血细胞用DPBS稀释至80ml，用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用DPBS清洗两次，显微镜下观察计数，最后用含体积含量5％的上述制备好的血浆的淋巴细胞培养液GT-T551，调节细胞密度1-2×106个/ml。
S13.脐带血淋巴细胞和粘附细胞的分离：将上述细胞悬液移入75cm2培养瓶，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中1-1.5h，然后用移液管轻轻冲洗细胞，将没有粘附的细胞收集备用，粘附细胞用做DC细胞的制备；
S14.CIK细胞的诱导扩增：将上述收集的没有粘附的细胞转移到另一75cm2培养瓶中，该培养瓶盛装含有体积浓度为5％的脐带血浆的GT-T551培养基，再加入终浓度为1000IU/ml的重组人γ-干扰素(INF-γ)，置于37℃、5v/v％CO2饱和湿度培养箱中培养24h后，加入终浓度为100ng/ml的抗胸腺细胞球蛋白(thymoglobulin)、终浓度为1ng/ml的重组人白细胞介素-1(IL-1)和终浓度为1000IU/ml的重组人白细胞介素-2(IL-2)，并每2天给细胞补加培养液，含有GT-T551培养基、5％血浆、1000IU/ml重组人白细胞介素-2(IL-2)。培养至8天时，收集CIK细胞待用；
S15.DC细胞的诱导扩增及DC细胞负载腹水肿瘤抗原：将上述粘附细胞加入50ml的DC培养液，该DC培养液含有血浆、重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)，终浓度分别为5％、80-120ng/ml和25-30ng/ml，置于37℃、5v/v％CO2饱和湿度培养箱中培养，第3天时，补加重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)，终浓度分别为80-120ng/ml和25-30ng/ml，并加入上述在步骤S11中制备的腹水肿瘤抗原，使终浓度为20μg/ml，继续于饱和湿度、37℃、5.0v/v％CO2培养。第6天，加入肿瘤坏死因子(TNF-α)，使终浓度为500ng/ml；
S16.负载肿瘤抗原的DC与CIK共培养制备DC-CIK细胞：步骤S15中的粘附细胞培养第8天，将负载肿瘤抗原的DC细胞吹打下来，与CIK混合培养，该DC与CIK共培养的培养液为含有体积浓度为5％的所述脐带血浆、1000IU/ml的重组人白细胞介素-2的淋巴细胞培养液GT-T551，在之后的培养过程中每3天给DC-CIK细胞补加培养液，含有GT-T551培养基、5％血浆、1000IU/ml重组人白细胞介素-2(IL-2)。
按照本实施例1制备的DC-CIK细胞的方法，共进行10组实验，并将该10组实验制备的DC-CIK细胞的相关性能进行了检测分析，检测的关于该10组实验制备的DC-CIK细胞的相关性能指标具体参见下文“实施例1和对比实例1制备DC-CIK细胞相关性能指标检测”。
对比实例1
现有的肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法，包括如下步骤：
S21.传统肿瘤抗原的制备：
(1)传统方法获得肿瘤细胞：复苏冻存的肿瘤细胞，常规方法培养，胰酶消化收集肿瘤细胞；
(2)肿瘤抗原的制备：收集107个肿瘤细胞，用1ml PBS重悬细胞，置液氮中，10min后迅速置入属37℃水浴中，待其完全融化后，再次放入液氮中，反复3次，900g，离心20min，0.22μm微孔滤膜过滤，测定蛋白质浓度，于-20℃保存，备用；
S22.单个核细胞的制备：用生理盐水稀释50ml人脐带血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，离心2000rpm，20-25min，用Hanks液洗涤细胞2次，细胞计数，用AIM-V调成细胞密度3～5×106/ml悬液。
S23.淋巴细胞和粘附细胞的分离：将上述细胞悬液移入6孔板瓶，置于37℃、5v/v％CO2饱和湿度培养箱中2h，然后用移液管轻轻冲洗细胞，将没有粘附的细胞收集备用，粘附细胞用做DC细胞的制备；
S24.CIK细胞的诱导扩增：将上述收集的没有粘附的细胞转移到新培养瓶中，加入重组人γ-干扰素(INF-γ)，终浓度为1000IU/ml，置于37℃、5v/v％CO2饱和湿度培养箱中培养24h，24h后加入鼠抗人CD3单克隆，终浓度为100ng/ml；重组人白细胞介素-1(IL-1)，终浓度为1u/ml；重组人白细胞介素-2(IL-2)，终浓度为500U/ml。之后每2-3天给细胞补加培养液，含有AIM-V培养基、500IU/ml重组人白细胞介素-2(IL-2)，培养至第8天时，收集CIK细胞待用；
S25.DC细胞的诱导扩增及DC细胞负载肿瘤抗原：将上述粘附的细胞每孔加入DC培养液3ml，DC培养液含有重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)，终浓度分别为800u/ml和500u/ml，置于37℃、5v/v％CO2饱和湿度培养箱中培养，第5天，加入肿瘤抗原使终浓度为10-50μg/ml；
S26.负载肿瘤抗原的DC与CIK共培养制备DC-CIK细胞：培养第8天，将负载肿瘤抗原的DC细胞吹打下来，与CIK混合培养，之后每2-3天给DC-CIK细胞补加培养液。
按照本对比实例1制备的DC-CIK细胞的方法，共进行10组实验，并将该10组实验制备的DC-CIK细胞的相关性能进行了检测分析，检测的关于该10组实验制备的DC-CIK细胞的相关性能指标具体参见下文“实施例1和对比实例1制备DC-CIK细胞相关性能指标检测”。
实施例1和对比实例1制备DC-CIK细胞相关性能指标检测
1.无菌和热源检测：
经测得，实施例1对比实例1所制备的DC-CIK细胞无菌试验和热源试验均为阴性。
2.表型检测：
用流式细胞仪检测细胞表型，实施例1制备的DC-CIK细胞表型结果为：T淋巴细胞(CD3+细胞)占细胞总数的98％以上，以及少量DC。其中，T淋巴细胞亚群比例因个体差异有一定的变化范围：CD3+CD56+细胞比例为40～60％，CD3+CD8+细胞比例为60～80％。对比实例1制备的DC-CIK中CD3+CD56+细胞比例为20～50％，CD3+CD8+细胞比例为40～65％。
3.细胞增殖活性检测：
第21天对实施例1和对比实例1所诱导培养的DC-CIK细胞进行活细胞计数检测，因为个体差异细胞增殖倍数有一定变化范围。实施例1制备的DC-CIK增殖倍数范围为166.82～239.76，平均增殖倍数是210.33±1.16；对比实例1制备的DC-CIK增殖倍数范围为92.36～131.47，平均增殖倍数是108.38±1.02。由此可知，本发明制备的DC-CIK细胞增殖活力明显高于传统方法，约为传统方法的2倍。
4.DC-CIK细胞杀瘤活性检测：
用MTT法分别检测实施例1和对比实例1诱导的DC-CIK杀瘤活性，将肿瘤抗原诱导的DC-CIK细胞与相应的肿瘤细胞(实验用肿瘤细胞有4种：肝癌细胞SK-HEP-1、胃癌细胞AGS、卵巢癌细胞SK-OV-3、结肠癌细胞COLO205)共同培养，置于37℃、5v/v％CO2饱和湿度培养箱中孵育24h。然后用MTT法检测肿瘤细胞死亡的比例来计算杀瘤活性。经测得，实施例1制备的DC-CIK细胞杀瘤率为70～80％，对比实例1制备的DC-CIK细胞杀瘤率为50～60％，杀瘤活性提高了10～30％。由此可知，本发明制备的DC-CIK细胞杀瘤活性高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法，包括如下步骤：
腹水肿瘤抗原的制备：用PBS缓冲液重悬腹水肿瘤细胞，再与终浓度为0.1～1.0mg/ml的亮抑蛋白酶抑制剂混合，形成混合液，置于液氮中5～10min后，接着置入36～38℃水浴中，待混合液完全融化后，再次放入液氮中，反复2～5次，然后依次进行离心，微孔滤膜过滤，得到腹水肿瘤抗原；
脐带血单个核细胞的制备：将获取的新鲜脐带血离心后，分别收集上层的脐带血浆和下层的脐带血细胞，将所述脐带血细胞用DPBS缓冲液稀释，再用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用DPBS缓冲液清洗，显微镜下观察计单个核细胞数，最后用淋巴细胞培养液GT-T551调节单个核细胞密度为1～2×106个/ml，得到单个核细胞悬液，其中，所述淋巴细胞培养液GT-T551含有体积浓度为1～10％所述脐带血浆；
脐带血淋巴细胞和粘附细胞的分离：将所述单个核细胞悬液培养1～1.5小时，然后冲洗细胞，获得没有粘附的细胞和粘附细胞；
CIK细胞的诱导扩增：将所述没有粘附的细胞移入含体积浓度1～10％的所述脐带血浆的淋巴细胞培养液GT-T551中，并加入终浓度为500～1000IU/ml的重组人γ-干扰素混合，再培养12～36小时后，加入终浓度为50ng/ml～250ng/ml抗胸腺细胞球蛋白、终浓度为0.5～2ng/ml的重组人白细胞介素-1、终浓度为500～1000IU/ml的重组人白细胞介素-2进行再次培养7～8天，收集CIK细胞；
DC细胞的诱导扩增及DC细胞负载腹水肿瘤抗原：将所述粘附细胞加入DC培养液中培养2～4天后加入终浓度为15～30μg/ml的所述腹水肿瘤抗原继续培养2～4天后，加入终浓度为200～1000ng/ml的肿瘤坏死因子，得到负载肿瘤抗原的DC细胞；
DC细胞与CIK细胞共培养制备DC-CIK：将所述负载肿瘤抗原的DC细胞与所述CIK细胞混合培养，得到腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK。
2.根据权利要求1所述的腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法，其特征在于，所述腹水肿瘤抗原的制备的步骤中，所述腹水肿瘤细胞的获取方法为：取癌性腹水，用终含量为5～15IU/ml的肝素钠抗凝，将抗凝后的腹水与羟乙基淀粉按体积比为5～6∶1的比例混合，2～8℃下静置，沉降红细胞，取上层液，进行第一次离心，收集下层细胞，用PBS重悬所述细胞，洗涤、第二次离心，用PBS二次重悬所述细胞，得到细胞悬液，将所述细胞悬液加到人肿瘤细胞分离液的液面上，第三次离心，收集腹水肿瘤细胞。
3.根据权利要求1或2所述的腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法，其特征在于，所述腹水肿瘤抗原的制备的步骤中，所述混合液中的亮抑蛋白酶抑制剂浓度为0.5mg/ml。
4.根据权利要求1或2所述的腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法，其特征在于，所述腹水肿瘤抗原的制备的步骤中，所述微孔滤膜过滤的孔径为0.15～0.22μm。
5.根据权利要求1或2所述的腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法，其特征在于，所述CIK细胞的诱导扩增的步骤中，所述抗胸腺细胞球蛋白的终浓度为100ng/ml～200ng/ml。
6.根据权利要求1或2所述的腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法，其特征在于，所述CIK细胞的诱导扩增的步骤中，所述重组人白细胞介素-1的终浓度为1ng/ml，所述重组人白细胞介素-2的终浓度为1000IU/ml。
7.根据权利要求1或2所述的腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法，其特征在于，所述DC细胞的诱导扩增及DC细胞负载腹水肿瘤抗原的步骤中，所述DC培养液包含体积浓度为1～10％的所述脐带血浆、80～120ng/ml的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、25～30ng/ml的白细胞介素-4。
8.根据权利要求1或2所述的腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法，其特征在于，所述DC细胞与CIK细胞共培养制备DC-CIK的步骤中，所述DC细胞与CIK细胞按1∶10～3的比例进行混合培养。
9.根据权利要求1或2所述的腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法，其特征在于，所述DC细胞与CIK细胞共培养制备DC-CIK的步骤中，所述DC细胞与CIK细胞混合培养是在含有体积浓度为5％的所述脐带血浆、1000IU/ml的重组人白细胞介素-2的淋巴细胞培养液GT-T551中进行。
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