CN105238753A - 一种用于制备ctl的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于制备CTL的试剂盒及其应用，该试剂盒包括：（1）DC细胞和T细胞分离体系；（2）DC的诱导分化成熟体系；（3）CIK诱导增殖体系，包括：IFN-γ、IL-2以及IL-15；（4）成熟DC-CIK混合培养体系，包括：IL-18、IL-7以及抗CD28单克隆抗体；（5）CTL诱导增殖体系，包括：IL-2以及IL-6。本发明通过提供一种优化的CTL试剂盒，提高CIK的增殖率，减少CD45RA⁺初始T细胞的数量，不需外加IL-12，也能有效促进效应T细胞增殖，靶向肿瘤杀伤活性高。

Description

一种用于制备CTL的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体地，涉及一种用于制备CTL的试剂盒及其应用。

背景技术

目前，癌症已超过心脏病，成为全球第一大死亡原因。WHO在2013年12月公布，全球每年新增癌症患者数已经超过1400万名，新增病例大幅增加。同期，癌症患者的死亡人数也不断增加，由760万人增加到820万人，到2030年，新增癌症病例将增加50%，达到每年2160万人。癌症是中国居民死亡的主要原因之一，据全国肿瘤登记中心发布的数据显示，目前每年新发肿瘤病例超过300万例，占全球总数的两成，平均每天确诊8550人，全国每分钟有6人被诊断为癌症，约有250万人死于癌症。预计，到2020年，新发病例将达到390万，因恶性肿瘤而死亡的人数将达294万。手术、放疗和化疗是治疗肿瘤的三大常规方式，能在短时间内有效减轻肿瘤负荷，但因其不能有效得清除肿瘤细胞，手术后微小残存病灶、对化疗产生耐药及对放疗不敏感的患者肿瘤易发生转移，且副作用大等弊端，使得肿瘤的临床疗效低。肿瘤细胞免疫治疗作为一种全新的肿瘤全身治疗方式，能系统杀灭肿瘤细胞，有效抑制肿瘤细胞的转移、扩散和复发，副反应小等良好的临床治疗效果，克服了肿瘤传统治疗方式的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端，是目前国际上公认的继手术、放疗和化疗之后最有希望完全消灭肿瘤细胞的第四大治疗肿瘤的新技术。

目前，肿瘤细胞免疫治疗应用于临床的细胞有DC细胞（树突状细胞）、CIK细胞（细胞因子诱导的杀伤细胞）、DC-CIK细胞和CTL细胞（细胞毒性T淋巴细胞）。树突状细胞（DC）源自骨髓中的前体细胞，是迄今发现的功能最强大的抗原提呈细胞，负责对肿瘤抗原的摄取、加工、处理与分类，将肿瘤抗原信息提呈给T细胞，启动肿瘤抗原特异性T细胞应答，在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要作用。细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）是将人外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子诱导、分化、增殖后获得的一群异质细胞，兼具有T淋巴细胞抗瘤活性和NK细胞（自然杀伤细胞）的非MHC限制性杀瘤优点。CIK细胞主要由CD3⁺CD56⁺和CD3⁺CD8⁺T细胞亚群组成，其中CD3⁺CD56⁺T细胞为自然杀伤活性T细胞（NKT细胞），在正常人外周血中含量极少，具有抗肿瘤活性，CD3⁺CD8⁺T细胞为CTL，是体内抗肿瘤的主要效应细胞。有报道表明，DC和CIK共同培养联合应用可显著提高CIK对肿瘤的杀伤能力。因此，将对肿瘤抗原的摄取、加工、处理后的成熟DC与同源的CIK混合培养，激活的CTL具有肿瘤特异性，能直接靶向作用于肿瘤细胞，对肿瘤细胞杀伤活性高，回输到肿瘤患者体内有助于解除肿瘤患者体内T细胞的免疫无能，从而提高抗肿瘤活性。

目前，CTL细胞的制备主要包括以下几个步骤：DC细胞和T细胞的分离、DC的诱导分化成熟、CIK的诱导增殖、成熟DC-CIK混合培养、以及CTL的诱导增殖。如申请号为CN201410192581.3的中国专利申请中公开了一种制备CTL细胞的方法，该方法制备的CTL细胞中的CD3⁺CD8⁺细胞所占比例较高，约为60-70%，但是该方法还存在以下问题：（1）制备的成熟DC分泌的IL-12水平较低，不能有效的共刺激CIK分化为成熟CTL，使得效应细胞的特异性杀瘤活性降低，需要在混合培养时另外加入适量的IL-12；（2）制备的CTL细胞中初始T细胞的数量较高。

发明内容

本发明提供一种能够解决上述技术问题的CTL试剂盒及CTL的制备方法。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：

一种用于制备CTL细胞的试剂盒，包括：

（1）DC细胞和T细胞分离体系；

（2）DC的诱导分化成熟体系；

（3）CIK诱导增殖体系，包括：IFN-γ、IL-2以及IL-15；

（4）成熟DC-CIK混合培养体系，包括：IL-18、IL-7以及抗CD28单克隆抗体；

（5）CTL诱导增殖体系，包括：IL-2以及IL-6。

其中，所述（1）DC细胞和T细胞分离体系可以包括：淋巴细胞培养基。

其中，所述（2）DC的诱导分化成熟体系可以包括：淋巴细胞培养基、GM-CSF、IL-4以及TNF-α。其中，所述淋巴细胞培养基优选含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基。其中，所述GM-CSF终浓度为50ng/ml；所述IL-4终浓度为25ng/ml、所述TNF-α终浓度为30ng/ml。

其中，所述（3）CIK诱导增殖体系还可以包括淋巴细胞培养基、抗CD3单克隆抗体以及重组人纤维连接蛋白。其中，所述IFN-γ终浓度为1000U/ml，所述IL-2终浓度为20ng/ml，所述IL-15终浓度为1ng/ml，所述抗CD3单克隆抗体终浓度为50ng/ml，所述重组人纤维连接蛋白终浓度为1μg/ml。其中，所述淋巴细胞培养基优选含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基，由于自体血浆中含有患者自身的肿瘤细胞信息，培养的细胞靶向性更强。

其中，所述（4）成熟DC-CIK混合培养体系还可以包括淋巴细胞培养基。其中，所述IL-18终浓度为5ng/ml，IL-7终浓度为10ng/ml，抗CD28单克隆抗体终浓度为50ng/ml。其中，所述淋巴细胞培养基优选含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基。

其中，所述（5）CTL诱导增殖体系还可以包括抗CTLA-4单克隆抗体及淋巴细胞培养基。其中，所述抗CTLA-4单克隆抗体终浓度为100ng/ml，IL-2终浓度为50ng/ml，IL-6终浓度为100ng/ml。其中，所述淋巴细胞培养基优选含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基。

本申请所述的试剂盒在（2）DC的诱导分化成熟体系中加入了自身的抗原、GM-CSF以及IL-4，其中，IL-4能够在mRNA和细胞表面蛋白水平上诱导分化THP-1细胞表达高水平的DC；在（3）CIK诱导增殖体系中采用IL-15可以促进CIK细胞的扩增及CD3⁺CD56⁺细胞比例的增加，还可以明显上调CIK细胞上NKG2D的表达；在（4）成熟DC-CIK混合培养体系中采用IL-18能促进外周血单核细胞产生INF-γ、IL-2、GM-CSF等细胞因子，增强NK细胞毒副作用，在抗CD3单克隆抗体存在时，诱导产生的INF-γ的量远远大于IL-12诱导产生的，促进T细胞增殖，在诱导细胞的分化成熟过程和TH1细胞为主的细胞免疫反应中具有促进和调节作用。在（5）CTL诱导增殖体系中，肿瘤生长局部的CIL前体不能分化成熟，加入IL-2和IL-6因子刺激其成为成熟CTL。且IL-6相对其他细胞因子具有毒性小的特点，能刺激T细胞的分化与增值、诱导IL-2及IL-2R的表达，能减少初始IL-2的使用量。

一种采用上述试剂盒制备CTL细胞的方法，包括以下步骤：

（1）分离DC细胞和T细胞；

（2）DC细胞的诱导分化及成熟；

（3）诱导增殖CIK细胞：将T淋巴细胞转移至经抗CD3单克隆抗体和重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并加入IFN-γ培养，第2天在培养基中加入IL-2和IL-15，以后根据培养液颜色半量补充IL-2和IL-15；

（4）成熟DC-CIK混合培养：将上述步骤（2）得到的DC细胞及步骤（3）得到的CIK细胞混合，加入IL-18、IL-7以及抗CD28单克隆抗体继续培养；

（5）诱导增殖CTL细胞：加入抗CTLA-4单克隆抗体、IL-2以及IL-6，继续培养3天，即可得到CTL细胞。

其中，上述步骤（1）分离DC细胞和T细胞可以为：采集并分离PBMC（外周血单个核细胞），置于含有自体血浆的淋巴细胞培养基中培养以获得悬浮细胞（即T淋巴细胞）和贴壁细胞（即DC细胞）并将所述悬浮细胞和所述贴壁细胞分离。进一步地，该步骤（1）分离DC细胞和T细胞具体为：采集并分离PBMC，置于20ml的含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基AIM-Ⅴ中，在37℃、5%CO₂培养箱中静置孵育2小时后，获得悬浮细胞（即T淋巴细胞）和贴壁细胞（即DC细胞）并将所述悬浮细胞和所述贴壁细胞分离（如，可将悬浮细胞转移至新的培养瓶中）。

其中，上述步骤（2）DC细胞的诱导分化及成熟可以为：贴壁的DC细胞中加入淋巴细胞培养基，同时加入GM-CSF及IL-4，扩增培养5天，第6天，加入肿瘤患者自体肿瘤全抗原，第7天得到负载肿瘤全抗原的DC细胞，并加入TNF-α，继续培养得到成熟的DC细胞。进一步地，所述步骤（2）DC细胞的诱导分化及成熟具体为：贴壁的DC细胞中加入含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基，加入终浓度为50ng/ml的GM-CSF及终浓度为25ng/ml的IL-4，置于37℃、5%CO₂培养箱中扩增培养5天，第6天，加入肿瘤患者自体肿瘤全抗原50μg/ml，第7天得到负载肿瘤全抗原的DC细胞，并在含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基中加入终浓度为30ng/ml的TNF-α，第8天获得到成熟的DC细胞。

其中，所述步骤（3）诱导增殖CIK细胞具体为：将T淋巴细胞转移至经终浓度为50ng/ml的抗CD3单克隆抗体和终浓度为1μg/ml的重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并在含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基中加入终浓度为1000U/mlIFN-γ以增强CIK细胞毒活性，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，第2天在培养基中加入终浓度为20ng/ml的IL-2和终浓度为1ng/ml的IL-15，以后根据培养液颜色半量补充IL-2和IL-15。

其中，所述步骤（4）成熟DC-CIK混合培养具体为：第8天，将上述步骤（2）得到的DC细胞及步骤（3）得到的CIK细胞以10:1的比例混合，在含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基中加入终浓度为5ng/ml的IL-18、终浓度为10ng/ml的IL-7、终浓度为50ng/ml的抗CD28单克隆抗体培养。

其中，所述步骤（5）诱导增殖CTL细胞具体为：第11天，在含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基中加入终浓度为100ng/ml的抗CTLA-4单克隆抗体，并用终浓度为50ng/ml的IL-2和终浓度为100ng/ml的IL-6继续培养3天即可得到成熟CTL细胞。

在步骤（3）诱导增殖CIK细胞中，由于IL-15可促进T细胞增殖，同时可抑制活化的T细胞凋亡。因此，本发明试剂盒利用IL-2以及IL-15，一方面提高CIK的增殖率，另一方面减少CD45RA⁺初始T细胞的数量。

此外，在所述步骤（4）成熟DC-CIK混合培养中，本发明试剂盒还利用IL-7、IL-18以及抗CD28单克隆抗体来诱导CTL的分化、增殖。因为IL-7可促进CTL的增殖、分化及杀伤活性；IL-18可诱导T细胞产生IFN-γ，参与抗瘤过程；诱导T淋巴细胞活化、增殖为效应细胞有赖于双信号，TCR/CD3识别抗原肽提供第一信号，第二信号是由抗原提呈细胞（APC）上的协同刺激分子与T细胞表面的相应受体结合产生。CD28是T淋巴细胞表面重要的协同刺激分子受体，与APC细胞表面的B7分子结合，为T细胞的活化提供第二信号，促进效应T细胞大量增殖，同时可以诱导IL-2、IFN-γ的生成及CTL的分化。T细胞活化同时也会诱导其细胞表面的CTLA-4高表达，同CD28竞争性地与B7分子结合，对T细胞活化发挥负调节作用，进而引起IL-2合成和分泌的减少，使得效应T细胞增殖减少；IL-6在IL-2存在下，可促进T细胞分化为CTL，并增强CTL的杀瘤活性。因此，本发明试剂盒采用抗CTLA-4单克隆抗体在CTL增殖过程中进行免疫调节，利用其与活化的T淋巴细胞表面的CTLA-4分子结合，从而阻断CTLA-4抑制作用，提高CTL增殖效率，增强其靶向杀伤肿瘤细胞的活性；同时，利用IL-2和IL-6提高CTL的增殖活性，减少初始T细胞的数量，增强CTL中CD3⁺CD8⁺效应细胞的数量和活性。

本发明中的“成熟”，如无特别指出，指的是DC细胞经肿瘤细胞抗原刺激后经过分化，从而获得启动对肿瘤细胞产生适应性免疫应答的能力。

其中，上述CTL细胞的制备方法中，所述外周血单个核细胞的采集及分离包括以下步骤：采集肿瘤患者外周血50ml，2500rpm，离心10min，将上层血浆吸出备用；加入0.9%注射用生理盐水至血细胞中，混匀，稀释血细胞；将稀释的外周血缓慢加入比重为1.077的人淋巴细胞分离液层上，二者比例为1:1；离心30min，将呈白雾状的单个核细胞层轻轻吸出，移入另一离心管中；用0.9%注射用生理盐水稀释，离心5min，洗涤3次低速离心后得到PBMC，并用淋巴细胞培养基AIM-Ⅴ调整PBMC密度为1x10⁶个/ml。

综上，本发明通过提供一种优化的CTL试剂盒，提高CIK的增殖率，减少CD45RA⁺初始T细胞的数量，不需外加IL-12，也能有效促进效应T细胞增殖，靶向肿瘤杀伤活性高。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

本发明中提到的各英文缩写分别为：

CTL：细胞毒性T淋巴细胞；

DC：树突状细胞；

CIK：细胞因子诱导的杀伤细胞；

GM-CSF：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；

PBMC：外周血单个核细胞；

IL-4：白细胞介素-4；

TNF-α：肿瘤坏死因子-α；

IL-15：白细胞介素-15；

IFN-γ：干扰素-γ；

IL-2：白细胞介素-2；

IL-18：白细胞介素-18；

IL-6：白细胞介素-6；

IL-7：白细胞介素-7；

CTLA-4：细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4；

TCR：T细胞抗原受体；

MTT：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐；

NKG2D：C型凝集素样受体。

实施例1

1、PBMC的制备：

采集肿瘤患者外周血50ml，2500rpm，离心10min，将上层血浆吸出备用。加入0.9%注射用生理盐水至血细胞中，混匀，稀释血细胞。将稀释的外周血缓慢加入比重为1.077的人淋巴细胞分离液层上，二者比例为1:1。600g，离心30min，将呈白雾状的单个核细胞层轻轻吸出，移入另一离心管中。用0.9%注射用生理盐水稀释，400g，离心5min，洗涤3次低速离心后得到PBMC，并用无血清淋巴细胞培养基AIM-Ⅴ调整PBMC密度为1×10⁶个/ml。

2、分离DC和T淋巴细胞：

将所得到的PBMC，分装到有20ml的无血清淋巴细胞培养基AIM-Ⅴ培养瓶中，37℃、5%CO₂培养箱中静置孵育2小时后，获得悬浮细胞（即T淋巴细胞）和贴壁细胞（即DC细胞），将悬浮细胞转移至新的培养瓶中。

3、成熟DC细胞的制备：

贴壁的DC细胞中加入含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基AIM-Ⅴ20ml，同时加入终浓度为50ng/mlGM-CSF、终浓度为25ng/mlIL-4，置于37℃、5%CO₂培养箱中扩增培养5天。第6天，加入肿瘤患者自体肿瘤全抗原50μg/ml，第7天得到负载肿瘤全抗原的DC疫苗，并在含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基AIM-Ⅴ中加入终浓度为30ng/mlTNF-α，第8天获得到成熟的DC疫苗。

其中，自体肿瘤全抗原的制备方法如下：取新鲜肿瘤组织1cm³，剪除周边组织后，用生理盐水洗涤5遍，剪碎，研磨后经75μm细胞滤网过滤制备成单细胞，反复冻融后获得肿瘤细胞裂解物。

4、CIK细胞的制备：

首先，将悬浮的T细胞转移至经抗CD3单克隆抗体（终浓度50ng/ml）和重组人纤维连接蛋白（终浓度1μg/ml）包被的培养瓶中，并在20ml含有5%自体血浆淋巴细胞培养基AIM-Ⅴ中加入终浓度为1000U/mlIFN-γ以增强CIK细胞毒活性，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。第2天在培养基中加入终浓度为20ng/mlIL-2和终浓度为1ng/mlIL-15。以后根据培养液颜色半量补充IL-2和IL-15的5%自体血浆淋巴细胞培养基AIM-Ⅴ。

5、靶向杀伤肿瘤的高活性CTL的制备：

第8天，将CIK细胞与获得的成熟DC疫苗以10:1比例，在含有5%自体血浆淋巴细胞培养基AIM-Ⅴ中混合培养，同时加入终浓度为5ng/mlIL-18、终浓度为10ng/mlIL-7、终浓度为50ng/ml的抗CD28单克隆抗体；第11天，在5%自体血浆淋巴细胞培养基AIM-Ⅴ中加入终浓度为100ng/ml抗CTLA-4单克隆抗体，并用终浓度为50ng/mlIL-2和终浓度为100ng/mlIL-6继续培养3天即可得到高效增殖力，靶向杀伤肿瘤的高活性CTL细胞。

实施例1制得的CTL细胞的生物学特性检测

1、CTL细胞活力、细胞纯度、增殖力及免疫表型的检测

取培养14天100μl浓度为10⁶/ml的细胞，加入100μl0.4%台盼蓝染色液，显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，本发明试剂盒制备的细胞活力可高达98%以上。此外，用细胞计数板进行计数，培养第14天时，CTL扩增数量达到（4.5±0.6）×10⁹，细胞增殖倍数较外周血分离得到的PBMC达到（91.34±6.48）倍。

另取培养14天100μl浓度为10⁶/ml的细胞，加入检测用的鼠抗人CD3-FITC、CD4-PerCP、CD8-PE、CD45RA-PE、CD56-APC抗体10μl，室温避光孵育30min，用生理盐水洗涤2次，流式细胞仪检测。本发明试剂盒制备的CTL细胞，CD3⁺CD8⁺细胞可达到（88.31±7.38）%，CD3⁺CD56⁺细胞比例为（25.72±3.46）%，CD45RA⁺细胞比例为（4.1±1.4）%。

2、CTL对肝癌细胞特异性杀伤作用的检测

CTL细胞按效靶比例1:10、1:20、1:30加入来自于肝癌患者的肝癌细胞或HepG2肝癌细胞株接种培养了24小时的96孔板内，共同培养24小时后加入新鲜配制的0.5mg/ml的MTT20μl，置于37℃、5%CO₂培养箱中，共同孵育3-4小时，250g，离心4min，吸弃上清液，每孔加DMSO150μl振荡溶解10min，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值，以杀伤率计算CTL对肿瘤细胞杀伤活性，杀伤活性（%）＝[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值×100％。

结果显示本发明制备的CTL细胞与来自于肝癌患者的肝癌细胞效靶比30:1时，CTL的特异性杀伤活性最高，为（73.8±5.2）%；CTL细胞对HepG2肝癌细胞株（效靶比30:1）杀伤活性为（66.2±4.9）%。

综上，本发明通过提供一种优化的CTL试剂盒，提高CIK的增殖率，减少CD45RA⁺初始T细胞的数量，不需外加IL-12，也能有效促进效应T细胞增殖，靶向肿瘤杀伤活性高。

如上所述，可较好的实现本发明。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质，在本发明的精神和原则之内，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于制备CTL的试剂盒，其特征在于，包括：

（1）DC细胞和T细胞分离体系；

（2）DC的诱导分化成熟体系；

（3）CIK诱导增殖体系，包括：IFN-γ、IL-2以及IL-15；

（4）成熟DC-CIK混合培养体系，包括：IL-18、IL-7以及抗CD28单克隆抗体；

（5）CTL诱导增殖体系，包括：IL-2以及IL-6。

2.根据权利要求1所述的用于制备CTL的试剂盒，其特征在于，所述（2）DC的诱导分化成熟体系包括：GM-CSF、IL-4以及TNF-α，其中，所述GM-CSF终浓度为50ng/ml；所述IL-4终浓度为25ng/ml、所述TNF-α终浓度为30ng/ml。

3.根据权利要求1所述的用于制备CTL的试剂盒，其特征在于，所述（3）CIK诱导增殖体系中，所述IFN-γ终浓度为1000U/ml，所述IL-2终浓度为20ng/ml，所述IL-15终浓度为1ng/ml。

4.根据权利要求1所述的用于制备CTL的试剂盒，其特征在于，所述（3）CIK诱导增殖体系还包括抗CD3单克隆抗体以及重组人纤维连接蛋白，所述抗CD3单克隆抗体终浓度为50ng/ml，所述重组人纤维连接蛋白终浓度为1μg/ml。

5.根据权利要求1所述的用于制备CTL的试剂盒，其特征在于，所述（4）成熟DC-CIK混合培养体系中，所述IL-18终浓度为5ng/ml，所述IL-7终浓度为10ng/ml，所述抗CD28单克隆抗体终浓度为50ng/ml。

6.根据权利要求1所述的用于制备CTL的试剂盒，其特征在于，所述（5）CTL诱导增殖体系中，所述IL-2终浓度为50ng/ml，所述IL-6终浓度为100ng/ml。

7.根据权利要求1所述的用于制备CTL的试剂盒，其特征在于，所述（5）CTL诱导增殖体系还包括抗CTLA-4单克隆抗体，所述抗CTLA-4单克隆抗体终浓度为100ng/ml。

8.根据权利要求1所述的用于制备CTL的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括淋巴细胞培养基。

9.应用如权利要求1至8中任一项所述的试剂盒制备CTL的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）分离DC细胞和T细胞；

（2）DC细胞的诱导分化及成熟；

（3）诱导增殖CIK细胞：将T淋巴细胞转移至经抗CD3单克隆抗体和重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并加入IFN-γ培养，第2天在培养基中加入IL-2和IL-15，以后根据培养液颜色半量补充IL-2和IL-15；

（4）成熟DC-CIK混合培养：将上述步骤（2）得到的DC细胞及步骤（3）得到的CIK细胞混合，加入IL-18、IL-7以及抗CD28单克隆抗体继续培养；

（5）诱导增殖CTL细胞：加入抗CTLA-4单克隆抗体、IL-2以及IL-6，继续培养3天，即可得到CTL细胞。

10.根据权利要求9所述的制备CTL的方法，其特征在于，所述制备方法具体如下：

（1）分离DC细胞和T细胞：采集并分离PBMC，置于含有自体血浆的淋巴细胞培养基中培养以获得悬浮细胞和贴壁细胞并将所述悬浮细胞和所述贴壁细胞分离；

（2）DC细胞的诱导分化及成熟：贴壁的DC细胞中加入含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基，加入终浓度为50ng/ml的GM-CSF及终浓度为25ng/ml的IL-4，置于37℃、5%CO₂培养箱中扩增培养5天，第6天，加入肿瘤患者自体肿瘤全抗原50μg/ml，第7天得到负载肿瘤全抗原的DC细胞，并在含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基中加入终浓度为30ng/ml的TNF-α，第8天获得到成熟的DC细胞；

（3）诱导增殖CIK细胞：将T淋巴细胞转移至经终浓度为50ng/ml的抗CD3单克隆抗体和终浓度为1μg/ml的重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并在含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基中加入终浓度为1000U/ml的IFN-γ，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，第2天在培养基中加入终浓度为20ng/ml的IL-2和终浓度为1ng/ml的IL-15，以后根据培养液颜色半量补充IL-2和IL-15；

（4）成熟DC-CIK混合培养：第8天，将上述步骤（2）得到的DC细胞及步骤（3）得到的CIK细胞以10:1的比例混合，在含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基中加入终浓度为5ng/ml的IL-18、终浓度为10ng/ml的IL-7、终浓度为50ng/ml的抗CD28单克隆抗体培养；

（5）诱导增殖CTL细胞：第11天，在含有5%自体血浆的淋巴细胞培养基中加入终浓度为100ng/ml的抗CTLA-4单克隆抗体，并用终浓度为50ng/ml的IL-2和终浓度为100ng/ml的IL-6继续培养3天即可得到CTL细胞。