CN105647865A - 同时制备抗肿瘤的联合免疫细胞dc-cik、nk的方法及制得的联合免疫细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时制备抗肿瘤的联合免疫细胞DC-CIK、NK的方法及制得的联合免疫细胞，利用Ficoll密度梯度离心法高效分离获得单个核细胞，并利用细胞培养袋和免疫细胞诱导培养系统获得足量的DC、CIK及NK细胞，最终将诱导的细胞联合培养并应用于临床治疗以达到增强肿瘤杀伤效果的目的。本方法采用美天旎公司生产的TexMACS免疫细胞培养基和自体血清、多种细胞因子及联合培养技术对DC、CIK及NK分别进行诱导培养并在一定时间点将细胞混合培养及应用，避免了胎牛血清的应用，减少外源致热源、致敏源污染几率，同时增强了最终混合细胞的肿瘤杀伤活性；利用细胞培养袋技术，减少细胞污染几率，适合临床治疗应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种同时制备抗肿瘤的联合免疫细胞的方法，尤其是一种以外周血或者脐血作为原材料，配合美天旎公司生产的TexMACS免疫细胞培养基，配合自体血清及多种细胞因子成分，获得抗肿瘤的联合免疫细胞DC-CIK、NK。
技术背景
肿瘤的免疫细胞疗法作为肿瘤的第四种治疗手段，因其安全、有效且无副作用的特点正逐渐被医学界所认同，并被作为人类最终能够彻底战胜肿瘤的利器而大力发展。目前，临床上常用的免疫细胞疗法包括DC(Dendriticcell)细胞、CIK(Cytokineinducedkiller)细胞、NK(Naturalkiller)细胞等。但是，这几种细胞都存在其确定及临床局限性，无法对各种肿瘤细胞进行高效的杀伤。
发明内容
本发明所要解决的问题是，提供一种通过少量的外周血或者脐血获得自体血清及外周血单个核细胞(PBMC)最终同时制备出满足临床治疗标准的抗肿瘤的联合免疫细胞DC-CIK、NK。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种同时制备抗肿瘤的联合免疫细胞DC-CIK、NK的方法，以外周血或者脐带血为原材料，通过Ficoll密度梯度离心法分离获得PBMC和上层血浆，上层血浆采用灭活并冻融的方法获得自体血清，自体血清配合免疫细胞培养基及多种细胞因子，将分离的PBMC分别诱导DC、CIK及NK，CIK细胞每隔2天扩大培养、NK细胞每隔3天扩大培养，最终保证能够在14-17天同时达到数量要求，在CIK细胞诱导中，在第7天加入CD28、CD3单抗提高CIK的扩增效率，在NK细胞扩增中，在第1天及第7天使用CD16单抗进行2次刺激的方法提高NK的扩增效率。
具体地说，包括以下步骤：
1)采集人体的外周血或者脐带血，通过Ficoll密度梯度离心法分离获得PBMC和上层血浆，上层血浆通过灭活、冻融、高速离心、过滤的流程从中制备出自体血清；
2)配置细胞诱导培养基备用
DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含有体积浓度5-10％的步骤1)中制备的自体血清、80-150IU/ml的IL-4和800-1500IU/ml的GM-CSF；
CIK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有有体积浓度5-10％的步骤1)中制备的自体血清和300-1000IU/ml的IL-2；
NK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有体积浓度5-10％的步骤1)中制备的自体血清、300-1000IU/ml的IL-2、20-200ng/ml的IL-12、50-200ng/ml的IL-15；
3)分离获得的PBMC取(5-10)*107个细胞接种至一个T-175细胞培养瓶中，加入40-50ml免疫细胞培养基、并加入步骤1)中制备的2-4ml的自体血清，孵育1-2h后将未贴壁的细胞吸出，贴壁的细胞中加入40-50mlDC细胞诱导培养基，诱导DC细胞；
4)将步骤3)中的未贴壁的细胞加入到未使用的PBMC中，按照细胞数量比1：1的比例将所有细胞平均加入到分别提前4-12小时预包被4-10ug的CD3McAb的T-175细胞培养瓶，以及预包被20-40ug的CD16McAb的T-175细胞培养瓶中；在预包被CD3McAb的培养瓶中加入100mlCIK细胞诱导培养基和终浓度500-1000IU/ml的IFN-r，诱导CIK细胞；在预包被CD16McAb的培养瓶中加入100mlNK细胞诱导培养基以及终浓度500-1000IU/ml的IFN-r，诱导NK细胞；
4)培养第3天，在CIK细胞诱导体系中补加5-10ml的自体血清、30000-100000IU的IL-2继续培养；
5)培养第4天，在DC细胞诱导体系中加入30-40mlDC细胞诱导培养基，混合均匀后培养；同时NK细胞诱导体系中加入100mlNK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
6)培养第5天，在CIK细胞诱导体系中加入100mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
7)培养第6天，在DC细胞诱导体系中按照终浓度500-1000IU/ml加入TNF-a，混合均匀后继续培养；
8)第7天，将CIK细胞诱导体系中的全部细胞悬液加入到一个1.8升容量的细胞培养袋中并在培养体系中加入200mlCIK细胞诱导培养基并加入4-10ug的CD3McAb以及15-30ug的CD28McAb；与此同时将诱导DC细胞诱导体系中的细胞全部收获后加入到上述细胞培养袋中与CIK细胞共培养；同时，将NK细胞诱导体系中的细胞悬液加入到另一个1.8升容量细胞培养袋中，并在培养体系中并加入400ml的NK细胞诱导培养基以及20-40ug的CD16McAb，混合均匀后继续培养；
9)第9天，在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入400mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
10)第11天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入800mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；与此同时在NK细胞的培养袋中加入1000ml的NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
11)第14天取出800-1000ml的DC+CIK细胞共培养的培养袋中细胞悬液收获细胞，并加入400-600ml的CIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；与此同时取出800-1000ml的NK细胞的培养袋中细胞悬液收获细胞，加入400-600ml的NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
12)第17天，将DC+CIK细胞共培养的培养袋及NK细胞的培养袋中的所有细胞收获。
所述免疫细胞培养基为美天旎公司生产的TexMACS免疫细胞培养基。
将获得的血浆在56℃的条件下灭活30-35min后，通过-20℃完全冻结，在20-24℃融化后，通过10000-12000rpm的条件下离心5-10min，使用0.4um的滤膜过滤上清后获得自体血清。
上述的制备方法制得的联合免疫细胞。
本发明的有益效果是：本发明将分离PBMC过程中获得的自体血浆作为原料，利用简单快捷的方法制备出自体血清，配合多种细胞因子及联合培养技术对DC、CIK及NK分别进行诱导培养并在一定时间点将细胞混合培养及应用，避免了胎牛血清的应用，减少外源致热源、致敏源污染几率，同时增强了最终混合细胞的肿瘤杀伤活性；利用细胞培养袋技术、减少细胞污染几率，适合临床治疗应用。
附图说明
图1培养第7天的CIK、NK、DC细胞图。
图2培养第7天的DC细胞的流式检测结果图(成熟DC细胞的表面标志物CD1A、CD83、CD86的阳性率分别为75％、79％、89％)。
图3诱导第17天CIK及NK细胞诱导结果图(在各自的培养体系中CIK细胞的比例为27.2％；NK细胞的比例为55.3％)。
具体实施方式
本发明同时制备抗肿瘤的联合免疫细胞DC-CIK、NK的方法，以外周血或者脐带血为原材料，通过Ficoll密度梯度离心法分离获得PBMC和上层血浆，上层血浆采用灭活并冻融的方法获得自体血清，自体血清配合免疫细胞培养基及多种细胞因子，将分离的PBMC分别诱导DC、CIK及NK，CIK细胞每隔2天扩大培养、NK细胞每隔3天扩大培养，最终保证能够在14-17天同时达到数量要求，在CIK细胞诱导中，在第7天加入CD28、CD3单抗提高CIK的扩增效率，在NK细胞扩增中，在第1天及第7天使用CD16单抗进行2次刺激的方法提高NK的扩增效率。
具体地说，包括以下步骤：
1)采集人体的外周血或者脐带血，通过Ficoll密度梯度离心法分离获得PBMC和上层血浆，上层血浆通过灭活、冻融、高速离心、过滤的流程从中制备出自体血清；
2)配置细胞诱导培养基备用
DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含有体积浓度5-10％的步骤1)中制备的自体血清、80-150IU/ml的IL-4和800-1500IU/ml的GM-CSF；
CIK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有有体积浓度5-10％的步骤1)中制备的自体血清和300-1000IU/ml的IL-2；
NK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有体积浓度5-10％的步骤1)中制备的自体血清、300-1000IU/ml的IL-2、20-200ng/ml的IL-12、50-200ng/ml的IL-15；
3)分离获得的PBMC取(5-10)*107个细胞接种至一个T-175细胞培养瓶中，加入40-50ml免疫细胞培养基、并加入步骤1)中制备的2-4ml的自体血清，孵育1-2h后将未贴壁的细胞吸出，贴壁的细胞中加入40-50mlDC细胞诱导培养基，诱导DC细胞；
4)将步骤3)中的未贴壁的细胞加入到未使用的PBMC中，按照细胞数量比1：1的比例将所有细胞平均加入到分别提前4-12小时预包被4-10ug的CD3McAb的T-175细胞培养瓶，以及预包被20-40ug的CD16McAb的T-175细胞培养瓶中；在预包被CD3McAb的培养瓶中加入100mlCIK细胞诱导培养基和终浓度500-1000IU/ml的IFN-r，诱导CIK细胞；在预包被CD16McAb的培养瓶中加入100mlNK细胞诱导培养基以及终浓度500-1000IU/ml的IFN-r，诱导NK细胞；
4)培养第3天，在CIK细胞诱导体系中补加5-10ml的自体血清、30000-100000IU的IL-2继续培养；
5)培养第4天，在DC细胞诱导体系中加入30-40mlDC细胞诱导培养基，混合均匀后培养；同时NK细胞诱导体系中加入100mlNK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
6)培养第5天，在CIK细胞诱导体系中加入100mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
7)培养第6天，在DC细胞诱导体系中按照终浓度500-1000IU/ml加入TNF-a，混合均匀后继续培养；
8)第7天，将CIK细胞诱导体系中的全部细胞悬液加入到一个1.8升容量的细胞培养袋中并在培养体系中加入200mlCIK细胞诱导培养基并加入4-10ug的CD3McAb以及15-30ug的CD28McAb；与此同时将诱导DC细胞诱导体系中的细胞全部收获后加入到上述细胞培养袋中与CIK细胞共培养；同时，将NK细胞诱导体系中的细胞悬液加入到另一个1.8升容量细胞培养袋中，并在培养体系中并加入400ml的NK细胞诱导培养基以及20-40ug的CD16McAb，混合均匀后继续培养；
9)第9天，在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入400mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
10)第11天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入800mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；与此同时在NK细胞的培养袋中加入1000ml的NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
11)第14天取出800-1000ml的DC+CIK细胞共培养的培养袋中细胞悬液收获细胞，并加入400-600ml的CIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；与此同时取出800-1000ml的NK细胞的培养袋中细胞悬液收获细胞，加入400-600ml的NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
12)第17天，将DC+CIK细胞共培养的培养袋及NK细胞的培养袋中的所有细胞收获。
所述免疫细胞培养基为美天旎公司生产的TexMACS免疫细胞培养基。
将获得的血浆在56℃的条件下灭活30-35min后，通过-20℃完全冻结，在20-24℃融化后，通过10000-12000rpm的条件下离心5-10min，使用0.4um的滤膜过滤上清后获得自体血清。
上述的制备方法制得的联合免疫细胞。
本发明通过一整套配合免疫细胞培养基及多种细胞因子，使用自体血清的情况下对DC细胞、CIK细胞及NK细胞进行分别诱导。并在适当的时间点将细胞进行混合培养及混合应用，从而达到增加各种免疫细胞的肿瘤杀伤活性的目的。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：免疫细胞培养基为美天旎公司生产的TexMACS免疫细胞培养基。
实施例1
1.采集120ml外周血，以240ml生理盐水稀释后利用Ficoll密度梯度离心法高效分离单个核细胞。
2.分离后将上层的血浆层转移到一个500ml离心杯中，共获得300ml稀释血浆，在56℃水浴条件下灭活30min。灭活后在12000rpm的条件下离心10min，使用0.4um滤膜过滤上清后获得近290ml自体血清，按照40ml/管分装后备用。
3.配置细胞诱导培养基备用：
DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含有体积浓度8％的步骤2中制备的自体血清、150IU/ml的IL-4和1000IU/ml的GM-CSF；
CIK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有有体积浓度6％的步骤2中制备的自体血清和1000IU/ml的IL-2；
NK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有体积浓度6％的步骤2中制备的自体血清、1000IU/ml的IL-2、200ng/ml的IL-12、100ng/ml的IL-15；
4.分离获得的PBMC以40ml生理盐水清洗一次后计数共获得12.5*107个细胞，将细胞浓度调整至1*107/ml的浓度。按照8*107个细胞的数量、40ml美天旎免疫细胞培养基、4ml自体血清的体系在T-175细胞培养瓶中进行静置培养。
5.1小时候后轻柔的取出培养体系中的上清液及未贴壁的细胞，加入40mlDC细胞诱导培养。
6.上清液及未贴壁的细胞300-320g条件下离心5-8min离心后的沉淀细胞与未使用的分离细胞混合均匀后按照数量比1：1的比例平均加入到预包被10ugCD3McAb的T-175细胞培养瓶和预包被30ugCD16McAb的T-175细胞培养瓶中，在预包被10ugCD3McAb的T-175细胞培养瓶中加入100mlCIK细胞诱导培养基，并按照终浓度1000IU/ml加入IFN-r诱导CIK细胞。在预包被30ugCD16McAb的T-175细胞培养瓶中加入100mlNK细胞诱导培养基并按照终浓度1000IU/ml加入IFN-r诱导NK细胞。
7.培养第3天在CIK细胞培养体系中补加5ml自体血清、50000IU的IL-2继续培养。
8.培养第4天在DC细胞培养体系中加入40mlDC细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养。同时在NK细胞培养体系中加入100mlNK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养。
9.第5天在CIK细胞培养体系中加入100mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
10.培养第6天在DC细胞培养体系中按照终浓度800IU/ml加入TNF-a混合均匀后继续培养。
11.第7天(见图1)将CIK细胞培养体系中的细胞悬液加入到1.8升容量的美天旎公司的细胞培养袋中并在培养体系中加入200mlCIK细胞诱导培养基、10ug的CD3McAb和25ug的CD28McAb。与此同时将DC细胞培养体系中细胞全部(见图2)收获后加入到此体系中与CIK细胞共培养(DC-CIK共培养体系)；同时，将NK细胞培养体系中细胞悬液加入到另一个1.8升容量美天旎公司的细胞培养袋中并在培养体系中并加入300mlNK细胞诱导培养基及30ug的CD16McAb(NK细胞培养体系)。
12.第9天在DC-CIK共培养体系中加入400mlCIK细胞诱导培养基。混合均匀后继续培养。
13.第11天在DC-CIK共培养体系中加入800mlCIK细胞诱导培养基；与此同时在NK细胞培养体系中加入1000mlNK细胞诱导培养基。
14.第14天取出1000mlDC-CIK共培养体系中的细胞悬液，加入600mlCIK细胞诱导培养基；与此同时取出1000mlNK细胞培养体系中的细胞悬液，加入600mlNK细胞诱导培养基。1000mlCIK细胞悬液中共含有2.5*109个细胞，其中CIK细胞的比例为26.8％；1000mlNK细胞悬液中共含有2.3*109个细胞，其中NK细胞的比例为48.5％。
15.第17天将所有的两个细胞培养袋中的细胞收获。1200mlCIK细胞悬液中共含有2.9*109个细胞，其中CIK细胞的比例为27.2％；1200mlNK细胞悬液中共含有2.4*109个细胞，其中NK细胞的比例为55.3％(见图3)。
实施例2
1.采集120ml脐带血，以240ml生理盐水稀释后利用Ficoll密度梯度离心法高效分离单个核细胞。
2.分离后将上层的血浆层转移到一个500ml离心杯中，共获得310ml稀释血浆，在56℃水浴条件下灭活30min。灭活后在12000rpm的条件下离心10min，使用0.4um滤膜过滤上清后获得近298ml自体血清，按照40ml/管分装后备用。
3.配置细胞诱导培养基备用：
DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含有体积浓度8％的步骤2中制备的自体血清、150IU/ml的IL-4和1000IU/ml的GM-CSF；
CIK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有有体积浓度6％的步骤2中制备的自体血清和1000IU/ml的IL-2；
NK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有体积浓度6％的步骤2中制备的自体血清、1000IU/ml的IL-2、200ng/ml的IL-12、100ng/ml的IL-15；
4.分离获得的PBMC以40ml生理盐水清洗一次后计数共获得11.2*107个细胞，将细胞浓度调整至1*107/ml的浓度。按照8*107个细胞的数量、40ml美天旎免疫细胞培养基、3ml自体血清的体系在T-175细胞培养瓶中进行静置培养。
5.1小时候后轻柔的取出培养体系中的上清液及未贴壁的细胞，加入40mlDC细胞诱导培养。
6.上清液及未贴壁的细胞300-320g条件下离心5-8min离心后的沉淀细胞与未使用的分离细胞混合均匀后按照数量比1：1的比例平均加入到预包被10ugCD3McAb的T-175细胞培养瓶和预包被30ugCD16McAb的T-175细胞培养瓶中，在预包被10ugCD3McAb的T-175细胞培养瓶中加入100mlCIK细胞诱导培养基，并按照终浓度1000IU/ml加入IFN-r诱导CIK细胞。在预包被30ugCD16McAb的T-175细胞培养瓶中加入100mlNK细胞诱导培养基并按照终浓度1000IU/ml加入IFN-r诱导NK细胞。
7.培养第3天在CIK细胞培养体系中补加5ml自体血清、50000IU的IL-2继续培养。
8.培养第4天在DC细胞培养体系中加入40mlDC细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养。同时在NK细胞培养体系中加入100mlNK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养。
9.第5天在CIK细胞培养体系中加入100mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
10.培养第6天在DC细胞培养体系中按照终浓度800IU/ml加入TNF-a混合均匀后继续培养。
11.第7天将CIK细胞培养体系中的细胞悬液加入到1.8升容量的美天旎公司的细胞培养袋中并在培养体系中加入200mlCIK细胞诱导培养基、10ug的CD3McAb和25ug的CD28McAb。与此同时将DC细胞培养体系中细胞全部收获后加入到此体系中与CIK细胞共培养(DC-CIK共培养体系)；同时，将NK细胞培养体系中细胞悬液加入到另一个1.8升容量美天旎公司的细胞培养袋中并在培养体系中并加入400mlNK细胞诱导培养基及30ug的CD16McAb(NK细胞培养体系)。
12.第9天在DC-CIK共培养体系中加入400mlCIK细胞诱导培养基。混合均匀后继续培养。
13.第11天在DC-CIK共培养体系中加入800mlCIK细胞诱导培养基；与此同时在NK细胞培养体系中加入1000mlNK细胞诱导培养基。
14.第14天取出1000mlDC-CIK共培养体系中的细胞悬液，加入600mlCIK细胞诱导培养基；与此同时取出1000mlNK细胞培养体系中的细胞悬液，加入600mlNK细胞诱导培养基。1000mlCIK细胞悬液中共含有2.2*109个细胞，其中CIK细胞的比例为23.5％；1000mlNK细胞悬液中共含有2.0*109个细胞，其中NK细胞的比例为45.5％。
15.第17天将所有的两个细胞培养袋中的细胞收获。1200mlCIK细胞悬液中共含有2.4*109个细胞，其中CIK细胞的比例为25.2％；1200mlNK细胞悬液中共含有2.2*109个细胞，其中NK细胞的比例为48.8％。
实施例3
1.采集80ml外周血，以160ml生理盐水稀释后利用Ficoll密度梯度离心法高效分离单个核细胞。
2.分离后将上层的血浆层转移到一个500ml离心杯中，共获得220ml稀释血浆，在56℃水浴条件下灭活30min。灭活后在12000rpm的条件下离心10min，使用0.4um滤膜过滤上清后获得近210ml自体血清，按照40ml/管分装后备用。
3.配置细胞诱导培养基备用：
DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含有体积浓度5％的步骤2中制备的自体血清、80IU/ml的IL-4和800IU/ml的GM-CSF；
CIK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有有体积浓度5％的步骤2中制备的自体血清和300IU/ml的IL-2；
NK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有体积浓度5％的步骤2中制备的自体血清、300IU/ml的IL-2、20ng/ml的IL-12、50ng/ml的IL-15；
4.分离获得的PBMC以40ml生理盐水清洗一次后计数共获得8.5*107个细胞，将细胞浓度调整至1*107/ml的浓度。按照5*107个细胞的数量、40ml美天旎免疫细胞培养基、2ml自体血清的体系在T-175细胞培养瓶中进行静置培养。
5.1小时候后轻柔的取出培养体系中的上清液及未贴壁的细胞，加入40mlDC细胞诱导培养。
6.上清液及未贴壁的细胞300-320g条件下离心5-8min离心后的沉淀细胞与未使用的分离细胞混合均匀后按照数量比1：1的比例平均加入到预包被4ugCD3McAb的T-175细胞培养瓶和预包被20ugCD16McAb的T-175细胞培养瓶中，在预包被4ugCD3McAb的T-175细胞培养瓶中加入100mlCIK细胞诱导培养基，并按照终浓度500IU/ml加入IFN-r诱导CIK细胞。在预包被20ugCD16McAb的T-175细胞培养瓶中加入100mlNK细胞诱导培养基并按照终浓度500IU/ml加入IFN-r诱导NK细胞。
7.培养第3天在CIK细胞培养体系中补加5ml自体血清、30000IU的IL-2继续培养。
8.培养第4天在DC细胞培养体系中加入30mlDC细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养。同时在NK细胞培养体系中加入100mlNK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养。
9.第5天在CIK细胞培养体系中加入100mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
10.培养第6天在DC细胞培养体系中按照终浓度500IU/ml加入TNF-a混合均匀后继续培养。
11.第7天将CIK细胞培养体系中的细胞悬液加入到1.8升容量的美天旎公司的细胞培养袋中并在培养体系中加入200mlCIK细胞诱导培养基、4ug的CD3McAb和15ug的CD28McAb。与此同时将DC细胞培养体系中细胞全部收获后加入到此体系中与CIK细胞共培养(DC-CIK共培养体系)；同时，将NK细胞培养体系中细胞悬液加入到另一个1.8升容量美天旎公司的细胞培养袋中并在培养体系中并加入400mlNK细胞诱导培养基及20ug的CD16McAb(NK细胞培养体系)。
12.第9天在DC-CIK共培养体系中加入400mlCIK细胞诱导培养基。混合均匀后继续培养。
13.第11天在DC-CIK共培养体系中加入800mlCIK细胞诱导培养基；与此同时在NK细胞培养体系中加入1000mlNK细胞诱导培养基。
14.第14天取出800mlDC-CIK共培养体系中的细胞悬液，加入400mlCIK细胞诱导培养基；与此同时取出800mlNK细胞培养体系中的细胞悬液，加入400mlNK细胞诱导培养基。800mlCIK细胞悬液中共含有1.7*109个细胞，其中CIK细胞的比例为25.4％；800mlNK细胞悬液中共含有1.6*109个细胞，其中NK细胞的比例为48.2％。
15.第17天将所有的两个细胞培养袋中的细胞收获。1200mlCIK细胞悬液中共含有2.8*109个细胞，其中CIK细胞的比例为26.8％；1200mlNK细胞悬液中共含有2.5*109个细胞，其中NK细胞的比例为51.2％。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
Claims (5)
1.一种同时制备抗肿瘤的联合免疫细胞DC-CIK、NK的方法，其特征在于，以外周血或者脐带血为原材料，通过Ficoll密度梯度离心法分离获得PBMC和上层血浆，上层血浆采用灭活并冻融的方法获得自体血清，自体血清配合免疫细胞培养基及多种细胞因子，将分离的PBMC分别诱导DC、CIK及NK，CIK细胞每隔2天扩大培养、NK细胞每隔3天扩大培养，最终保证能够在14-17天同时达到数量要求，在CIK细胞诱导中，在第7天加入CD28、CD3单抗提高CIK的扩增效率，在NK细胞扩增中，在第1天及第7天使用CD16单抗进行2次刺激的方法提高NK的扩增效率。
2.根据权利要求1所述的同时制备抗肿瘤的联合免疫细胞DC-CIK、NK的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采集人体的外周血或者脐带血，通过Ficoll密度梯度离心法分离获得PBMC和上层血浆，上层血浆通过灭活、冻融、高速离心、过滤的流程从中制备出自体血清；
2)配置细胞诱导培养基备用
DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含有体积浓度5-10％的步骤1)中制备的自体血清、80-150IU/ml的IL-4和800-1500IU/ml的GM-CSF；
CIK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有有体积浓度5-10％的步骤1)中制备的自体血清和300-1000IU/ml的IL-2；
NK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有体积浓度5-10％的步骤1)中制备的自体血清、300-1000IU/ml的IL-2、20-200ng/ml的IL-12、50-200ng/ml的IL-15；
3)分离获得的PBMC取(5-10)*107个细胞接种至一个T-175细胞培养瓶中，加入40-50ml免疫细胞培养基、并加入步骤1)中制备的2-4ml的自体血清，孵育1-2h后将未贴壁的细胞吸出，贴壁的细胞中加入40-50mlDC细胞诱导培养基，诱导DC细胞；
4)将步骤3)中的未贴壁的细胞加入到未使用的PBMC中，按照细胞数量比1：1的比例将所有细胞平均加入到分别提前4-12小时预包被4-10ug的CD3McAb的T-175细胞培养瓶，以及预包被20-40ug的CD16McAb的T-175细胞培养瓶中；在预包被CD3McAb的培养瓶中加入100mlCIK细胞诱导培养基和终浓度500-1000IU/ml的IFN-r，诱导CIK细胞；在预包被CD16McAb的培养瓶中加入100mlNK细胞诱导培养基以及终浓度500-1000IU/ml的IFN-r，诱导NK细胞；
4)培养第3天，在CIK细胞诱导体系中补加5-10ml的自体血清、30000-100000IU的IL-2继续培养；
5)培养第4天，在DC细胞诱导体系中加入30-40mlDC细胞诱导培养基，混合均匀后培养；同时NK细胞诱导体系中加入100mlNK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
6)培养第5天，在CIK细胞诱导体系中加入100mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
7)培养第6天，在DC细胞诱导体系中按照终浓度500-1000IU/ml加入TNF-a，混合均匀后继续培养；
8)第7天，将CIK细胞诱导体系中的全部细胞悬液加入到一个1.8升容量的细胞培养袋中并在培养体系中加入200mlCIK细胞诱导培养基并加入4-10ug的CD3McAb以及15-30ug的CD28McAb；与此同时将诱导DC细胞诱导体系中的细胞全部收获后加入到上述细胞培养袋中与CIK细胞共培养；同时，将NK细胞诱导体系中的细胞悬液加入到另一个1.8升容量细胞培养袋中，并在培养体系中并加入400ml的NK细胞诱导培养基以及20-40ug的CD16McAb，混合均匀后继续培养；
9)第9天，在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入400mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
10)第11天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入800mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；与此同时在NK细胞的培养袋中加入1000ml的NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
11)第14天取出800-1000ml的DC+CIK细胞共培养的培养袋中细胞悬液收获细胞，并加入400-600ml的CIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；与此同时取出800-1000ml的NK细胞的培养袋中细胞悬液收获细胞，加入400-600ml的NK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
12)第17天，将DC+CIK细胞共培养的培养袋及NK细胞的培养袋中的所有细胞收获。
3.根据权利要求1或2所述的同时制备抗肿瘤的联合免疫细胞DC-CIK、NK的方法，其特征在于，所述免疫细胞培养基为美天旎公司生产的TexMACS免疫细胞培养基。
4.根据权利要求1或2所述的同时制备抗肿瘤的联合免疫细胞DC-CIK、NK的方法，其特征在于，将获得的血浆在56℃的条件下灭活30-35min后，通过-20℃完全冻结，在20-24℃融化后，通过10000-12000rpm的条件下离心5-10min，使用0.4um的滤膜过滤上清后获得自体血清。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的同时制备方法制得的联合免疫细胞。
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