CN110358728A - 一种预防肿瘤发生的免疫细胞培养基及其制备方法与应用 - Google Patents

一种预防肿瘤发生的免疫细胞培养基及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种预防肿瘤发生的免疫细胞培养基及其制备方法与应用。本发明首先提供一种培养基组合物，其可用于免疫细胞TPKT(Tumor Prevention Killer T Cells)的培养，其组分包括：A液和B液；其中，A液组成成分包括：基础培养基、IL‑2、IFN‑γ、GMCSF；还可进一步包括TNF‑α；B液组成成分包括：基础培养基、IL‑2、IFN‑γ；还可进一步包括IL‑12。本发明的培养基用于针对可识别、清除机体内表达变异蛋白的肿瘤前体细胞及影像学不可见得微小肿瘤的TPKT细胞的培养，可使免疫细胞的增殖速度更快、识别及免疫功能更强。

Description

一种预防肿瘤发生的免疫细胞培养基及其制备方法与应用
技术领域
本发明是关于一种预防肿瘤发生的免疫细胞培养基及其制备方法与应用，属于细胞培养技术领域。
背景技术
肿瘤的传统治疗方法有手术切除、化疗和放射线治疗。手术切除的方法治疗彻底，但术后创伤性较大，若癌细胞入侵蔓延到邻近组织或远端转移，则手术切除的效果就会受到极大限制。这种方法也不适合对微小病灶的治疗，且肿瘤患者手术后肿瘤复发或转移率很高。化疗的方式能够对原发病灶、转移病灶均有一定的治疗作用，但杀灭肿瘤细胞的同时也能杀灭人体正常细胞，毒副作用比较大。而放射线治疗虽然能够对区域敏感性肿瘤产生较好的治疗效果，但受肿瘤部位局限性较大，容易对人体正常组织造成伤害。
免疫细胞治疗技术是运用生物技术治疗肿瘤的一种方法，能有效清除手术、放疗、化疗后残存的癌细胞及微小病灶，降低肿瘤的转移和复发，并有效地补充患者因患病而导致的白细胞数量下降的缺失，恢复和激活身体免疫机制，提高病人自身机体免疫能力，从而达到真正治疗肿瘤的目的。目前，对于机体内由于易感因素等造成的表达变异蛋白的肿瘤前体细胞及不可见微小肿瘤都不能进行准确的诊断，但可以通过免疫细胞治疗技术进行预防及治疗。
预防肿瘤发生的免疫细胞培养如何实现快速扩增，增强其对表达变异蛋白的肿瘤前体细胞及不可见微小肿瘤的识别及清除功能，细胞培养是关键，然而应用现有技术培养免疫细胞时其增长速度慢，免疫功能不强。针对这个问题，目前市场上现有的培养基配制技术还有待于改进和发展。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种可实现免疫细胞快速扩增、增强其识别和清除抗原功能的培养基组合物。
本发明的另一目的在于提供所述的培养基的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述的培养基的应用。
为实现上述目的，一方面，本发明提供了一种用于免疫细胞的培养基组合物，其组分包括：A液和B液；
其中，A液组成成分包括：基础培养基、IL-2、IFN-γ、GM-CSF；还可进一步包括TNF-α；
B液组成成分包括：基础培养基、IL-2、IFN-γ；还可进一步包括IL-12。
根据本发明的具体实施方案，本发明的培养基组合物中，IL-2、IFN-γ、GM-CSF、TNF-α在A液中的用量为：
根据本发明的具体实施方案，本发明的培养基组合物中，IL-2、IFN-γ、IL-12在B液中的用量为：
根据本发明的具体实施方案，本发明的培养基组合物中，所述基础培养基为无血清细胞培养基X-VIVO150或RPMI-1640。
在本发明的一些具体实施方案中，所述A液包括基础培养基、IL-2、IFN-γ、GMCSF与TNF-α。
A液中各组分浓度范围为：
在本发明的一些具体实施方案中，所述B液包括基础培养基、IL-2、IFN-γ与IL-12。
B液中各组分浓度范围为：
在本发明的一些更具体实施方案中，所述A液包括基础培养基、IL-2、IFN-γ、GMCSF与TNF-α。A液中各组分浓度为：
在本发明的一些更具体实施方案中，所述B液包括基础培养基、IL-2、IFN-γ与IL-12。B液中各组分浓度为：
另一方面，本发明还提供了一种制备用于免疫细胞的培养基的方法，该方法包括：
以本发明所述的培养基组合物分别制备A液与B液，其中，
A液制备：无菌操作，基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、GM-CSF，加或者不加TNF-α，搅拌5-10min；
B液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，加或者不加IL-12，搅拌5-10min；
将A液、B液混合物分别调节pH值至7.2-7.4。
另一方面，本发明还提供了所述的培养基组合物在培养预防肿瘤发生的免疫细胞(Tumor Prevention Killer T Cells，本发明中简称为TPKT或TPKT细胞)中的应用。具体地，包括在培养预防HBV、HCV发生的免疫细胞中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的培养基用于针对可识别、清除机体内表达变异蛋白的肿瘤前体细胞及影像学不可见得微小肿瘤的免疫细胞，可使TPKT细胞的增殖速度更快、识别及免疫功能更强，从而预防肿瘤的发生及复发。
附图说明
图1是采用实施例1-4提供的培养基培养得到的TPKT细胞与对照的培养方法提供的培养基培养得到的TPKT细胞的增殖曲线对比图。
图2采用实施例1-4提供的培养基培养得到的TPKT细胞与对照的培养方法提供的培养基培养得到的TPKT细胞对肿瘤细胞系杀伤率曲线对比图。
图3是实施例1-4提供的培养基培养得到的TPKT细胞与对照的培养方法提供的培养基培养得到的TPKT细胞免疫裸鼠后，用自体肺癌细胞进行接种后小鼠生存曲线。
图4是实施例1-4提供的培养基培养得到的TPKT细胞与对照的培养方法提供的培养基培养得到的TPKT细胞免疫裸鼠后，用自体肺癌细胞进行接种后小鼠瘤体体积。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明技术方案的实施和所具有的有益效果，但不能认定为对本发明的可实施范围的任何限定。各实施例中未详细说明的方法和操作条件，按照所述领域的常规技术或是按照仪器制造商建议的操作进行。
本发明提供了一种用于培养可以预防肿瘤发生的免疫细胞(本发明中成为TPKT细胞)的培养基组合物。
具体而言，本发明提供的TPKT细胞培养基组合物，其组分包括：A液和B液。
其中A液组成成分为：基础培养基、IL-2、IFN-γ、GM-CSF。或者，A液组成成分为：基础培养基、IL-2、IFN-γ、GM-CSF与TNF-α。
A液中各组分浓度为：
B液组成成分为：基础培养基、IL-2、IFN-γ。或者，B液组成成分为：基础培养基、IL-2、IFN-γ与IL-12。
B液中各组分浓度为：
在本发明提供的TPKT细胞培养基中，所述基础培养基为无血清细胞培养基或RPMI-1640。
本发明提供的TPKT细胞培养基中，IL-2在A液与B液中的剂量范围分别为100-5000IU/ml、300-10000IU/ml，在一些具体实施方案中分别为2500-4000IU/ml、5000-6500IU/ml。IL-2是由多细胞来源，主要由活化T细胞产生，又具有多向性作用的细胞因子，主要促进淋巴细胞生长、增殖、分化；IL-2对机体的免疫应答和抗病毒感染等有重要作用，能刺激已被特异性抗原或致丝裂因数启动的T细胞增殖；IL-2能活化T细胞，促进细胞因子产生；刺激细胞增殖，增强杀伤活性及产生细胞因子，诱导LAK细胞产生；促进B细胞增殖和分泌抗体；激活巨噬细胞。本发明对所述IL-2的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的IL-2即可，如可以采用其市售商品。在本发明的具体实施例中，所述IL-2购买于R&D公司。
本发明提供的TPKT细胞培养基中，IFN-γ在A液与B液中的剂量范围分别为200-10000IU/ml、300-10000IU/ml，在一些具体实施方案中分别为2000-4000IU/ml、2000-6000IU/ml。IFN-γ是由一族具有多种功能的多肽分子组成，可以激活巨噬细胞、NK细胞；能与细胞表面受体结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白；能促进MHCⅠ类及Ⅱ类抗原的加工和提呈，在机体细胞免疫及体液免疫中发挥重要的作用。
本发明提供的TPKT细胞培养基中，GMCSF在A液的剂量范围为150-1500IU/ml，在一些具体实施方案中为300-1000IU/ml。GMCSF可促进DC的分化、成熟、活化；诱导单核细胞MHCⅡ类分子的表达；能促进Th、NK在肿瘤部位的浸润。
TNF-α在A液中的剂量范围分别为10-500IU/ml，在一些具体实施方案中为200-400IU/ml。TNF-α对机体免疫功能具有调节作用，可促进T细胞及其它杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤。提高中性粒细胞的吞噬能力，增加过氧化物阴离子产生，增强ADCC功能，刺激细胞脱颗粒和分泌髓过氧化物酶。TNF-α预先与内皮细胞培养可使其增加MHCⅠ类抗原、ICAM-1的表达，IL-1、GM-CSF和IL-8的分泌，并促进中性粒细胞粘附到内皮细胞上，从而刺激机体局部炎症反应，TNF-α可刺激单核细胞和巨噬细胞分泌IL-1，并调节MHCⅡ类抗原的表达。
IL-12在B液中的剂量范围分别为100-10000IU/ml，在一些具体实施方案中为4500-6500IU/ml。IL-12是Th1细胞免疫应答的决定因素，可有效地促进Th1类细胞因子如IFN-γ的产生，另一方面又可抑制Th2类因子如IL-4、IL-13的产生，从而抑制Th2型应答反应。IL-12生物学活性的发挥是通过T细胞和NK细胞上的IL-12受体介导的。IL-12能增强细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和LAK细胞的生成，同时，通过诱导编码细胞毒颗粒相关分子基因的转录和通过上调黏附分子的表达，它也能增加CTLs和NK细胞的细胞毒活性。IL-12能直接影响B细胞的增殖、分化和IFN-γ产生，对B细胞的活化作用和诱导特定免疫球蛋白同种型(IgG增加，IgE减少)生成的效应。IL-12还可以促进DC成熟，提高DC细胞刺激淋巴细胞增殖的能力集杀瘤活性。
本专利的有益效果在于以上多种细胞因子的组合，其中：
IL-2联合GM-CSF：可增强的抗原提呈功能和对病原体的细胞毒作用。
IL-2联合IFN-γ：可激活Th1免疫应答，促进CD8+T细胞增殖，促进CTL活化。
IFN-γ联合GM-CSF：可增强机体的免疫活性，激发细胞免疫和体液免疫。
TNF-α：TNF-α可促进T细胞MHCⅠ类抗原表达，增强IL-2依赖的胸腺细胞、T细胞增殖能力，促进IL-2、GMCSF和IFN-γ等淋巴因子产生生，增强有丝分裂原或外来抗原刺激B细胞的增殖和Ig分泌。
IL-12：是最为强的诱导T淋巴细胞特别是活化的T细胞和NK细胞产生IFN-γ的细胞因子，IL-12的许多体内作用就是通过诱导IFN-γ的产生来发挥的。
本发明提供一种TPKT细胞培养基，其中基础培养基为无血清细胞培养基或RPMI-1640。
本发明还提出的上述TPKT细胞培养基的制备方法，A液制备：无菌操作，基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、GM-CSF，加或者不加TNF-α，搅拌5-10min；B液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，加或者不加IL-12，搅拌5-10min；将A液、B液混合物，调节pH值至7.2-7.4。在一些具体实施方案中，采用1M PH8.0的PBS调节pH值。检测合格后分别包装A液和B液为成品，即得到所述TPKT细胞培养基。
实施例1
一种TPKT细胞培养基，各组分的含量为：
A液中各组分浓度为：
B液中各组分浓度为：
基础培养基为无血清细胞培养基X-VIVO15。
其制备方法：
(1)A液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、GM-CSF，搅拌5-10min。
(2)B液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，搅拌5-10min。
(3)将A液、B液混合物，调节pH值至7.2-7.4；然后得到所述TPKT细胞培养基。
(4)用(3)中的A、B混合培养基在37℃、5％CO2条件下培养TPKT细胞，并检测细胞增殖情况，细胞杀瘤力等。取样时间为培养第0、3、5、7天。
实施例2
一种TPKT细胞培养基，各组分的含量为：
A液中各组分浓度为：
B液中各组分浓度为：
基础培养基为无血清细胞培养基X-VIVO15。
其制备方法：
(1)A液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、GM-CSF、TNF-α，搅拌5-10min。
(2)B液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，搅拌5-10min。
(3)将A液、B液混合物，调节pH值至7.2-7.4；然后得到所述TPKT细胞培养基。
(4)用(3)中的A、B混合培养基在37℃、5％CO2条件下培养TPKT细胞，并检测细胞增殖情况，细胞杀瘤力等。取样时间为培养第0、3、5、7天。
实施例3
一种TPKT细胞培养基，各组分的含量为：
A液中各组分浓度为：
B液中各组分浓度为：
基础培养基为无血清细胞培养基X-VIVO15。
其制备方法：
(1)A液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、GM-CSF，搅拌5-10min。
(2)B液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、IL-12，搅拌5-10min。
(3)将A液、B液混合物，调节pH值至7.2-7.4；然后得到所述TPKT细胞培养基。
(4)用(3)中的A、B混合培养基在37℃、5％CO2条件下培养TPKT细胞，并检测细胞增殖情况，细胞杀瘤力等。取样时间为培养第0、3、5、7天。
实施例4
一种TPKT细胞培养基，各组分的含量为：
A液中各组分浓度为：
B液中各组分浓度为：
基础培养基为无血清细胞培养基X-VIVO15。
其制备方法：
(1)A液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、GM-CSF、TNF-α，搅拌5-10min。
(2)B液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、IL-12，搅拌5-10min。
(3)将A液、B液混合物，调节pH值至7.2-7.4；然后得到所述TPKT细胞培养基。
(4)用(3)中的A、B混合培养基在37℃、5％CO2条件下培养TPKT细胞，并检测细胞增殖情况，细胞杀瘤力等。取样时间为培养第0、3、5、7天。
对照例
对照例内容及培养方法：
一种基础淋巴细胞培养基，各组分的含量为：
A液中各组分浓度为：
组分 使用剂量(/ml)
A液 IL-2 500IU
B液中各组分浓度为：
组分 剂量范围(/ml)
B液 IL-2 500IU
基础培养基为无血清细胞培养基X-VIVO15。
分离并纯化外周血单个核细胞(PBMC)的步骤为：
(1)一次抽血量：150ml，肝素抗凝。150ml全血正常情况下可得1.5-2×108个细胞，可种一个75cm2培养瓶。
(2)稀释血液：培养基等倍稀释血液。
(3)25ml血液小心置于12.5ml淋巴细胞分离液上，1800rpm，15min离心，升降速调至最低。
(4)取上层部分血浆留用，4℃冰箱保存。
(5)取淋巴细胞层，置于50ml离心管中，加入培养基至总体积50ml，1800rpm，5min离心。
(6)弃上清，加入一定量培养基，混悬细胞，取少量计数。
(7)1800rpm，5min离心。
(8)弃上清，加入X-VIVO15细胞培养基50ml混悬细胞。
经过上述步骤得到对照组细胞PBMC。并检测细胞增殖情况，细胞杀瘤力等。取样时间为培养第0、3、5、7天。
图1是采用实施例1-4提供的培养基培养得到的TPKT细胞与对照的培养方法提供的培养基培养得到的TPKT细胞的增殖曲线对比图。由图1可见与对照组细胞培养基及其制备方法相比，TPKT细胞在本发明配方实施例1、2均在第5-7天获得更多的TPKT细胞(实施例1P5天＜0.001，P7天＜0.001，实施例2P5天＜0.001，P7天＜0.001)，实施例3仅在第7天获得更多细胞(实施例3P7天＜0.05)，实施例4在第3、5、7日均获得更多细胞(实施例4P3天＜0.01，P5天＜0.001，P7天＜0.001)，且都具有统计学意义。
实施例5
采用实施例1-4提供的培养基培养得到的TPKT细胞与对照的培养方法提供的培养基培养得到的TPKT细胞对肿瘤细胞的杀伤率，由图2可以看出，与对照组细胞培养基及其制备方法相比，TPKT细胞在本发明配方中E:T比为40:1至20:1的情况下与传统配方获得的TPKT细胞对自体肿瘤细胞系的杀伤无显著性差异，而在低E:T比条件下，新配方获得的TPKT细胞的杀伤率有显著性优势，且有统计学意义(P<0.001)。
实施例6
分别取培养0、4、7、10天100μl，浓度约106/ml的细胞，分别加入检测用鼠抗人CD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE,CD3-PerCP/CD19-FITC/CD14-PE，CD3-PerCP/CD16-FITC/CD56-PE，CD4-PerCP/CD25-FITC/FOX-P3-PE抗体组合，每种抗体10μl，室温环境下，避光孵育30min。之后用PBS洗涤两次，进行流式细胞检测，表1是分别采用4个实施例提供的培养基培养得到的TPKT细胞与对照的培养方法提供的培养基培养得到的TPKT细胞表型对照表。
表1
通过表1可看出，实施例1-4与对照相比(*，**，***项P<0.05)，表明新配方能获得较多CD8+T杀伤细胞，较少CD4T辅助细胞，抗肿瘤能力更强。
实施例7
给予裸鼠实施例1-4所培养的TPKT细胞后，给予裸鼠背部皮下接种自体肿瘤细胞系(1×105细胞/只)，记录其生存时间，结果如图3。以上实验中在裸鼠死亡或21天实验结束时测量肿瘤体积，结果见图4。
通过图3可见，在裸鼠的平均生存时间要优于预先接种对照细胞，说明按照实施例1-4的培养方法得出的TPKT细胞对肿瘤有预防效果，且实施例4的生存时间优于其他实施例。
通过图4可见，在接种肿瘤前预先尾静脉注射按照实施例1-4培养的TPKT细胞，可明显降低自体肿瘤细胞系成瘤体积，且实施例4的效果最好(P＜0.05)。

Claims (10)

1.一种用于免疫细胞的培养基组合物，其组分包括：A液和B液；
其中，A液组成成分包括：基础培养基、IL-2、IFN-γ、GM-CSF；还可进一步包括TNF-α；
B液组成成分包括：基础培养基、IL-2、IFN-γ；还可进一步包括IL-12。
2.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中，IL-2、IFN-γ、GM-CSF、TNF-α在A液中的用量为：
IL-2，100-5000IU/ml；
IFN-γ，200-10000IU/ml；
GM-CSF，150-1500IU/ml；
TNF-α，0-500IU/ml或者10-500IU/ml。
3.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中，IL-2、IFN-γ、IL-12在B液中的用量为：
IL-2，300-10000IU/ml；
IFN-γ，300-10000IU/ml；
IL-12，0-10000IU/ml或者100-10000IU/ml。
4.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中，所述基础培养基为无血清细胞培养基X-VIVO150或RPMI-1640。
5.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中，IL-2在A液与B液中的剂量范围分别为2500-4000IU/ml、5000-6500IU/ml。
6.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中，IFN-γ在A液与B液中的剂量范围分别为2000-4000IU/ml、2000-4000IU/ml。
7.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中，GM-CSF在A液的剂量范围为300-1000IU/ml。
8.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中，IL-12在B液中的剂量范围为4500-6500IU/ml。
9.一种制备用于免疫细胞的培养基的方法，该方法包括：
以权利要求1～8任一项所述的培养基组合物分别制备A液与B液，其中，
A液制备：无菌操作，基础培养基中加入IL-2、IFN-γ、GM-CSF，加或者不加TNF-α，搅拌5-10min；
B液制备：无菌操作，向基础培养基中加入IL-2、IFN-γ，加或者不加IL-12，搅拌5-10min；
将A液、B液分别调节pH值至7.2-7.4。
10.权利要求1～8任一项所述的培养基组合物在培养预防肿瘤发生的免疫细胞中的应用。
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