CN110205293A - 一种加强型高效治疗肺癌的nk免疫细胞的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了一种加强型高效治疗肺癌的NK免疫细胞的制备方法及应用，该制备方法包括如下步骤：(a)将刺激因子包被培养瓶；(b)在人外周血液中分离单个核细胞；(c)在刺激因子包被的培养瓶中添加活化培养基，再将单个核细胞接种于刺激因子包被的培养瓶中进行培养；(d)待培养3‑4天后，将单个核细胞移入空培养瓶中，再向空培养瓶中添加活化培养基继续培养；(e)待培养7‑8天后，将单个核细胞移入培养袋中，再向培养袋中添加活化培养基继续培养，待培养14‑16天后，收集单个核细胞；上述方法将单个核细胞在体外共培养2‑3周，能使NK免疫细胞扩增500‑1000倍以上，且NK免疫细胞含量达到90％以上，并能够增强NK免疫细胞的活性，使其对K562瘤细胞的体外杀伤率达90％以上。

Description

一种加强型高效治疗肺癌的NK免疫细胞的制备方法及应用
技术领域
本发明实施例涉及免疫细胞扩增技术领域，具体涉及一种加强型高效治疗肺癌的NK免疫细胞的制备方法及应用。
背景技术
细胞治疗是继化疗、手术、放疗之后的一个新兴生物医药领域，是治疗疾病最好的方法之一。肿瘤的细胞治疗是一种全身性的免疫疗法，是把人体自身或异体的免疫细胞，进行体外培养、增殖，形成数量众多，活性超强的免疫抗癌细胞，再回输到患者体内，发挥强大的抗癌作用。与手术、放疗及化疗对免疫损伤不同，细胞治疗能大大提高患者的抗癌免疫力，清除手术治疗不能触及的血液、淋巴或转移到其他组织中的癌细胞、甚至是休眠的癌细胞，相比之下治疗更加彻底。免疫活性细胞具有促进自身愈合和再生的能力，细胞治疗有长期的效果。用细胞治疗疾病，毒副作用小，安全有效。
NK免疫细胞是机体抗肿瘤、抗病毒的主要免疫活性细胞。其他几个具有抗癌功能的细胞包括杀伤性T细胞、巨噬细胞、网状内皮细胞(DC)；由于巨噬细胞内含有很多炎症因子，目前还无法用于细胞治疗；DC是一类免疫调节细胞，主要作用是抗原加工并呈递给T细胞，再靠T细胞发挥抗癌作用；所以，DC一般是用于制备治疗性疫苗；美国FDA已经批准了一个前列腺癌的DC治疗性疫苗。T细胞的抗癌作用需要再次激发才有效，只有经DC活化后才能起作用；T细胞初次遇到抗原时并无杀伤作用，而只是形成免疫记忆；只有再次遇到抗原后，才能激发出强有力的杀伤功能。现在很多人用的CIK中主要是经细胞因子活化的T细胞。其实，未经DC抗原呈递、单独靠细胞因子活化的杀伤T细胞的疗效是非常有限的。NK免疫细胞的全名叫自然杀伤细胞，其特点之一是初次遇到就有杀伤作用。NK免疫细胞还可与抗体联合使用，通过抗体介导的杀伤效应(ADCC)，一方面赋予NK免疫细胞特异性，另一方面使抗体具有更强的治疗效果；现在临床上使用的大多数抗癌单抗的治疗机理中，NK免疫细胞往往起着重要的作用。另外，T细胞和网状内皮细胞必须用自身的，因为网状内皮细胞不能呈递抗原给异体的T细胞，而异体的杀伤性T细胞会引起移植物宿主反应；但NK免疫细胞可以用同种异体的，往往正是因为这些自身细胞的免疫功能差，才发生肿瘤等疾病。再用那些功能本来就差的细胞来治疗，疗效难以太好。NK免疫细胞则不同，可以用健康人的NK免疫细胞，有望产生更好的疗效。
目前，大量制备活化的人NK免疫细胞的方法主要有两种：一是采用抗体并通过红细胞或磁性微球的分离法，直接从PBMC中分离NK免疫细胞；可以快速获得NK免疫细胞，但由于NK免疫细胞在PBMC中的比例很少，所得NK免疫细胞的数目不多，只适用于小规模制备NK免疫细胞及分析性研究；此外，正常的NK免疫细胞一般都处于抑制状态，直接使用时，即使有足够量的NK免疫细胞也很有可能没有抗癌作用。二是体外扩增法，从PBMC中扩增培养NK免疫细胞：也就是用PBMC或者已经分离的NK免疫细胞，通过一些特殊细胞因子的刺激，使NK免疫细胞在体外扩增，但是，至今大多体外扩增技术只能使NK免疫细胞扩增几十倍，且纯度低、活性差、成本高。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种加强型高效治疗肺癌的NK免疫细胞的制备方法，以解决现有技术中NK免疫细胞扩增中存在的NK免疫细胞数量少、抗癌作用差、扩增倍数少、纯度低、活性差以及成本高的问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面提供一种加强型高效治疗肺癌的NK免疫细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(a)将刺激因子包被培养瓶；
(b)在人外周血液中分离单个核细胞；
(c)在刺激因子包被的培养瓶中添加活化培养基，再将单个核细胞接种于刺激因子包被的培养瓶中进行培养；
(d)待培养3-4天后，将单个核细胞移入空培养瓶中，再向空培养瓶中添加活化培养基继续培养；
(e)待培养7-8天后，将单个核细胞移入培养袋中，再向培养袋中添加活化培养基继续培养，待培养14-16天后，收集单个核细胞。
本发明上述制备方法将单个核细胞在体外共培养2-3周，能使NK免疫细胞扩增500-1000倍以上，且NK免疫细胞比例达到90％以上，并能够增强NK免疫细胞的活性，使其对K562瘤细胞的体外杀伤率达90％以上；此外，扩增自体活化的抗肿瘤效应细胞，不存在免疫排斥反应,而且可以用于异体免疫细胞治疗。
进一步地，所述步骤(a)中，刺激因子为CD16、TIL-9或4-1BBL。本发明通过刺激因子的特定选择，能够通过CD16、TIL-9与4-1BBL活化NK免疫细胞表面激活受体NKG2D、NKp30、NKp44和NKp46。
进一步地，所述步骤(b)中，在人外周血液中采用密度梯度离心法分离单个核细胞。
进一步地，所述活化培养基为含有IL-2、IL-12和IL-15的无血清培养基，其中IL-2浓度为950-1050u/ml，IL-12浓度为8-12ng/ml，IL-15浓度为8-12ng/ml。通过特定活化培养基的选择，能够为NK免疫细胞提供各种营养需求，并充分促进NK免疫细胞的活化，提高扩增速度。
进一步地，所述步骤(c)中，单个核细胞的接种浓度为(2-5)×106个/ml。通过对接种浓度的选择，能够更好地促进NK免疫细胞的活化及扩增速度。
进一步地，所述步骤(c)至步骤(e)中，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。通过对培养条件的限定，模拟体内免疫细胞的生长环境，为NK免疫细胞体外制备提供适宜的培养条件。
进一步地，所述步骤(d)或步骤(e)中，活化培养基添加至单个核细胞浓度为(1-3)×106个/ml。通过对活化培养基的添加量的限定，能够改善NK免疫细胞浓度，进而促进NK免疫细胞的生长。
进一步地，所述步骤(e)中，收集的单个核细胞中NK免疫细胞含量不小于90％。
根据本发明实施例的第二方面提供一种上述制备方法制备得到的NK免疫细胞在制备治疗肺癌药物中的应用。
本发明实施例具有如下优点：
本发明上述制备方法将单个核细胞在体外共培养2-3周，能使NK免疫细胞扩增500-1000倍以上，且NK免疫细胞比例达到90％以上，并能够增强NK免疫细胞的活性，使其对K562瘤细胞的体外杀伤率达90％以上；此外，扩增自体活化的抗肿瘤效应细胞，不存在免疫排斥反应,而且可以用于异体免疫细胞治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例1和实施例2中的细胞生长曲线；
图2为本发明实验例2中采用实施例2扩增的NK免疫细胞对肺癌A549细胞的杀伤活性。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下各实施例采用的各原料如下：
活化培养基：为含有IL-2、IL-12和IL-15的无血清培养基，其中IL-2浓度为1000u/ml，IL-12浓度为10ng/ml，IL-15浓度为10ng/ml。
实施例1
本实施例为一种加强型高效治疗肺癌的NK免疫细胞的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)将刺激因子包被培养瓶；
(b)在人外周血液中采用密度梯度离心法分离单个核细胞；
(c)在刺激因子包被的培养瓶中添加活化培养基，再将单个核细胞接种于刺激因子包被的培养瓶中在37℃、二氧化碳浓度5％条件下进行培养，其中单个核细胞的接种浓度为5×106个/ml；
(d)待培养3天后，将单个核细胞移入空培养瓶中，再向空培养瓶中添加活化培养基继续在37℃、二氧化碳浓度5％条件下进行培养，其中活化培养基添加至单个核细胞浓度为3×106个/ml；
(e)待培养7天后，将单个核细胞移入培养袋中，再向培养袋中添加活化培养基在37℃、二氧化碳浓度5％条件下进行培养，待培养14天后，收集单个核细胞，其中活化培养基添加至单个核细胞浓度为3×106个/ml。
采用全自动计数仪分别在培养3天、7天、8天、11天、12天和14天检测单个核细胞数量，并绘制生长曲线，如图1中的2号所示；
由图1可知，培养14天后的单个核细胞数量相比接种时扩增了148倍。
采用流式细胞检测方法对步骤(e)中收集的单个核细胞中NK免疫细胞(CD3-CD56+)的含量进行检测，检测结果为95.49％。
实施例2
本实施例为一种加强型高效治疗肺癌的NK免疫细胞的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)将刺激因子包被培养瓶；
(b)在人外周血液中采用密度梯度离心法分离单个核细胞；
(c)在刺激因子包被的培养瓶中添加活化培养基，再将单个核细胞接种于刺激因子包被的培养瓶中在37℃、二氧化碳浓度5％条件下进行培养，其中单个核细胞的接种浓度为2×106个/ml；
(d)待培养4天后，将单个核细胞移入空培养瓶中，再向空培养瓶中添加活化培养基继续在37℃、二氧化碳浓度5％条件下进行培养，其中活化培养基添加至单个核细胞浓度为2×106个/ml；
(e)待培养8天后，将单个核细胞移入培养袋中，再向培养袋中添加活化培养基在37℃、二氧化碳浓度5％条件下进行培养，待培养15天后，收集单个核细胞，其中活化培养基添加至单个核细胞浓度为2×106个/ml。
采用实施例1中的检测方法分别在培养5天、8天、13天和15天检测单个核细胞数量，并绘制生长曲线，如图1中的1号所示；
由图1可知，培养15天后的单个核细胞数量相比接种时扩增了154倍。
采用流式细胞检测方法对步骤(e)中收集的单个核细胞中NK免疫细胞(CD3-CD56+)的含量进行检测，检测结果为95.82％。
实验例1
将K562细胞(人慢性髓系白血病细胞，购买于上海斯信生物科技有限公司))接种于含有20％新生小牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5.0％饱和湿度培养箱中培养；在倒置显微镜下观察肿瘤细胞生长状况，每2-3天传代一次，同时用台盼蓝计数活细胞；
采用MTT显色法测定实施例2扩增后的细胞、NK92和NKL细胞系分别对K562靶细胞的杀伤活性：
调整效应细胞，靶细胞的浓度：收获3种杀伤细胞作为效应细胞，调整效应细胞浓度为2×106/ml，台盼蓝拒染率为98％以上；调整靶细胞浓度即K562细胞浓度为2×105/ml，台盼蓝拒染率98％以上；
使用96孔培养板(预先紫外线下照射20分钟)，实验组每孔加入效应细胞及靶细胞悬液各100ul混匀，即效靶比为10:1，共加三孔；同时设效应细胞及靶细胞对照，均设三孔，各取100ul，在所有对照孔中各加入RPMI-1640(含10％小牛血清)培养液100ul，37℃，5％CO2条件下共育24小时；
24小时后，吸弃上清，加入MTT储液(5mg/ml，溶于0.02M，PH7.4，含0.05％葡萄糖的PBS中)10ul，37℃，5％CO2条件下，再共育2-4小时；
仔细吸弃上清后加入二甲亚砜溶解还原的甲臜颗粒20分钟；
在酶标仪上测定OD490nm值；
杀伤细胞活性以杀伤细胞毒活性表示，按以下公式计算：
杀伤细胞毒活性％＝{1-(实验孔OD值-单独效应细胞OD值)/单独靶细胞OD值}×100％；计算结果如表1所示：
表1
由表1可知，本发明制备方法不仅能够大量扩增NK免疫细胞数目，而且能使扩增后的NK免疫细胞杀伤活性大大提高；扩增后的NK免疫细胞对K562靶细胞的杀伤活性超过NK92细胞系，远远强于NKL细胞系。
用MTT显色法测定各组培养上清的杀瘤活性
将5×105个细胞/ml浓度的K562细胞作为靶细胞与上述收集的效应细胞即杀伤细胞培养上清各100ml，置于96孔平底培养板中，并设靶细胞，上清液对照孔，混匀后置37℃，5％CO2培养箱中共育24小时；按下列公式计算上清液杀伤靶细胞活性百分率：
上清液杀伤％＝{1-[OD(上清液+靶细胞)-OD(相应上清孔)]/OD(相应靶细胞孔)}×100％；
计算结果如表2所示：
表2
由表2可知：采用本申请的NK免疫细胞体外扩增体系，不仅能够大量扩增NK免疫细胞数目，而且能使扩增后的NK免疫细胞旁分泌的免疫细胞因子的杀伤能力大大提高；本申请扩增的NK免疫细胞旁分泌的上清液对K562靶细胞的杀伤活性超过NK92细胞系，远远强于NKL细胞系。
实验例2
收集对数生长期肺癌A549细胞及培养的实施例2扩增的NK免疫细胞；
以A549细胞为靶细胞，以NK免疫细胞为效应细胞，将处于对数期生长的A549细胞用0.25％的胰酶消化，台盼蓝或者锥虫蓝染色法技术(活细胞数大于95％)，调整细胞的密度；
加入96孔板中，每孔50ul，按照不同效/靶比(5:1、10:1、20:1)加入效应细胞，每孔同样为50ul；
同时设立效应细胞及靶细胞自然释放孔、靶细胞最大释放孔及培养基自然释放孔，体积校正对照孔，每孔体积100ul，且均设立3个复孔；
置于37℃、5％CO2培养箱孵育4h，待反应结束前45分钟靶细胞最大释放孔每孔中加入10ul裂解液；
待反应结束，每孔吸取50ulLDH酶反应液和50ul上清液安放于另一新的96孔板，在室温条件下避光反应30min，加入反应终止液50ul，使用酶标仪检测其D值；
按照如下公式计算杀伤活性：杀伤活性(％)＝(测定管D值-靶细胞自然释放管D值-效应细胞自然释放管D值)/(靶细胞最大释放管D值-靶细胞自然释放管D值)*100％；计算结果如图2所示：
由图2可知：本发明实施例2扩增后的NK免疫细胞具有较高的对A549肿瘤细胞的杀伤活性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种加强型高效治疗肺癌的NK免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将刺激因子包被培养瓶；
(b)在人外周血液中分离单个核细胞；
(c)在刺激因子包被的培养瓶中添加活化培养基，再将单个核细胞接种于刺激因子包被的培养瓶中进行培养；
(d)待培养3-4天后，将单个核细胞移入空培养瓶中，再向空培养瓶中添加活化培养基继续培养；
(e)待培养7-8天后，将单个核细胞移入培养袋中，再向培养袋中添加活化培养基继续培养，待培养14-16天后，收集单个核细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，刺激因子为CD16、TIL-9或4-1BBL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，在人外周血液中采用密度梯度离心法分离单个核细胞。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述活化培养基为含有IL-2、IL-12和IL-15的无血清培养基，其中IL-2浓度为950-1050u/ml，IL-12浓度为8-12ng/ml，IL-15浓度为8-12ng/ml。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)中，单个核细胞的接种浓度为(2-5)×106个/ml。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)至步骤(e)中，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)或步骤(e)中，活化培养基添加至单个核细胞浓度为(1-3)×106个/ml。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(e)中，收集的单个核细胞中NK免疫细胞含量不小于90％。
9.权利要求1-8任一所述的制备方法制备得到的NK免疫细胞在制备治疗肺癌药物中的应用。
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