CN105219717A - 一种一型极化树突状细胞及其诱导方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种一型极化树突状细胞及其诱导方法和应用，利用脐带血自然杀伤细胞(Natural？Killer？cell，NK)在DC细胞激活适应性免疫过程中的辅助作用，建立了一种新的DC1细胞制备方法，制备过程减少了细胞因子的使用，降低了成本，提高了质量控制；同时本发明还提供了将制备的DC1细胞用于制备肿瘤抗原特异性CTL细胞的方法，DC1细胞负载肿瘤特异性抗原之后，一部分细胞回输至患者体内，另一部分用于体外肿瘤抗原特异性的诱导细胞毒性T细胞(CTL)，通过体内/体外，主动诱导/被动诱导相结合的方式激活肿瘤特异性的免疫反应。

Description

一种一型极化树突状细胞及其诱导方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，主要涉及一型极化树突状细胞的培养方法及其相关的应用。

背景技术

DC细胞是哺乳类动物免疫系统内唯一的专职抗原提呈细胞。其主要功能是摄取、加工处理和递呈抗原，激活或调节适应性免疫应答。成熟的DC细胞高表达MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子，MHC分子与被细胞捕获，加工的肿瘤抗原结合，形成肽-MHC分子复合物，并递呈给T细胞，进而激活MHC-I类限制性CD8阳性细胞毒性T细胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL)和MHC-Ⅱ类限制性的CD4阳性的一型T辅助细胞(type1Thelper,Th1)。成熟的DC细胞高表达CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40等共刺激分子，为T细胞提供其活化所必需的第二信号。成熟的DC细胞在激活T细胞过程中还大量白介素12(interleukin12，IL12)等因子，促进活化的T细胞迅速增殖。此外，DC细胞还分泌一系列趋化因子，如CCL7促进T细胞在肿瘤部位的浸润，从而发挥其杀伤肿瘤的作用。

利用DC细胞的特性可以激活或增强针对病原体或肿瘤细胞的适应性免疫反应。毫无疑问，体外制备具有正常免疫功能的DC细胞具有极高临床价值与商业价值。目前大多数体外制备DC细胞方案都是基于Jonuleit等人提出诱导方法(GeneTher.200310(3))，诱导试剂包括干扰素、脂多糖(PEG2)、肿瘤坏死因子等。经过这类方案诱导成熟的DC细胞的CD80，CD40，CD86等免疫激活表型显著性增强，大量实验数据证实体外诱导成熟DC细胞具有免疫激活能力,能够有效的激活特异性免疫反应。

Kalinski等人证实了成熟的DC细胞可以分为两型，DC1与DC2，并建立多种的DC1细胞的诱导方案。DC1具有激活CTL与Th1的能力，正向调节机体的获得性免疫能力；而DC2细胞促使T调节细胞(Treg)或Th2细胞生成，减低免疫激活反应，维持机体的免疫平衡。DC1的一个重要的特征是高表达IL12p70，IL12在激活NK和T细胞的过程中至关重要。XiZhao等人用慢病毒感染的DC细胞使其持续性高表达外源性IL12，发现DC.IL12细胞能够高效的诱导抗原特异性CTL细胞的产生，将DC.IL12与肿瘤抗原肽回输至小鼠体内可显著性的缩小肿瘤肿块。Kalinski实验室也发表了多篇文章，证实了回输负载肿瘤抗原肽的DC1细胞能够有效激活癌症病人的免疫反应，使肿瘤肿块消除或缩小。因此高表达IL12的DC1的细胞是激活获得性免疫反应的优良工具。目前国内DC细胞相关的专利，如中国专利CN101481677B，CN103301449A，CN102600462A等均使用正常DC细胞激活抗原特异性反应。由于现行常规方案诱导的DC细胞的IL12表达量有限，这就意味着上述方案中DC细胞体外激活特异性CTL与Th1的能力依然有限。显而易见，高表达IL12的DC细胞对于肿瘤疫苗激活特异性免疫反应，发挥抗癌临床作用是至关重要的。

DC1细胞是成熟DC细胞的一类亚群，具有强有力的免疫激活能力。DC1细胞的重要的特征是高表达IL12p70以及免疫激活共刺激分子。因此，DC1细胞可高效的激活抗原特异性的CD8+T细胞和CD4+Th1细胞相关的免疫反应。RobbieB.Mailliard等证实了DC1体外诱导黑色素瘤抗原特异性的CTL细胞效力达到正常的成熟DC细胞的40倍以上。AdrianaTLarregina等人还发现DC1细胞诱导B16黑色素瘤抗原特异性CD4+辅助性T细胞，并且促进CD4+辅助性T细胞对肿瘤组织的浸润。DC1细胞的上述特性为增强肿瘤疫苗的治疗效果提供了一种新的策略，因此DC1细胞可以作为一种基于抗原肽癌症疫苗的佐剂，促进肿瘤抗原特异性的免疫反应激活。目前已经有大量相关文献证实了DC1能够在动物和人体内增强肿瘤抗原特异性的免疫反应，多个使用DC1细胞的肿瘤疫苗已经进入临床阶段的研究。

高效的制备DC1细胞是基于抗原肽的癌症免疫治疗的关键。现有技术中最佳的方案可获得高表达IL12的DC1细胞，但是均需要大量的细胞因子和诱导试剂，成本昂贵。此外，细胞因子批次间可能存在效价差别，对于制备的质量控制工作带来了大量的负担。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提出了一种体外诱导一型极化树突状细胞的方法，利用脐带血自然杀伤细胞(NaturalKillercell，NK)在DC细胞激活适应性免疫过程中的辅助作用，建立了一种新的DC1细胞制备方法，制备的细胞不仅显现出成熟DC细胞表型，IL12p70的表达量显著性提高，而且其体外诱导肿瘤细胞特异性CTL的能力也获得加强。

本发明为解决上述技术问题，所采取的技术方案为：

一种体外诱导一型极化树突状细胞的方法，包括以下步骤：

步骤1，制备NK细胞的培养基上清：K562细胞与NK细胞按1:2至1:10比例共培养并加入IFNalpha，24小时后收集培养基上清；

步骤2，分离外周血中的单核细胞，细胞短暂贴壁培养之后，移除悬浮细胞，加入诱导剂GM-CSF和IL-4培养两天，培养第3天，第5天更换一半量的培养基，获得成熟DC细胞；

步骤3，所述步骤2中制得的成熟DC细胞用含INFγ以及所述步骤1中的NK细胞的培养基上清进一步培养诱导两天，使所述的成熟DC细胞分化为DC1细胞。

为了进一步优化上述技术方案，本发明提供的技术措施还包括：

上述步骤1中制备NK细胞的培养基上清时，首先分离脐血/外周血单个核细胞，加入NK细胞诱导试剂，培养12-15天收集NK细胞；然后将收集的NK细胞接种至培养基中，并在培养基中加入激活因子IFNα并与K562细胞共培养24-48小时，最后收集培养基上清，于-80℃保存或直接使用。

上述NK细胞与K562细胞的共培养的接种比例1：5至1：20。

上述的K562细胞可由K562-NK细胞替换。

上述步骤2中的贴壁培养是指在含IL-2扩增培养基中加入10％血浆，置于37.0℃、饱和湿度、5％CO₂环境条件下的培养。

本发明还提供一种一型极化树突状细胞，其由上文所描述的方法制备。

本发明还提供一种治疗肿瘤的组合物，由上述方法获得的DC1细胞进行肿瘤抗原肽负载而得到。

另一方面，本发明还提供一种体外诱导肿瘤抗原特异性CTL细胞的方法，包括以下操作：分离外周血中的单核细胞，细胞在培养瓶中短暂培养之后，悬浮细胞转移新培养瓶，按细胞密度1.0～3.0×10⁶个/ml添加扩增培养基，至第五天加入诱导剂IFN-γ培养24小时，然后加入诱导试剂IL-1α及CD3并与权利要求7上述的负载了抗原肽的DC1细胞混合培养；混合培养后第二次添加扩增培养基时，进行第二次抗原肽负载；培养15-20天，收集细胞。

最后一方面，本发明提供了上述的方法制备的肿瘤抗原特异性CTL细胞在制备抗癌药物中的应用。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

首先，本发明提供了一种利用脐血/外周血NK细胞培养上清体外制备成熟DC1细胞的方法。由本发明制备的细胞产物显现出的成熟细胞DC表型，DC细胞的多个表面标志物成阳性。由本发明提供的方案制备而得的细胞产物IL12p70表达量大大高于目前常用的方案，说明本发明的方法制备的DC细胞具有DC1细胞的特征。体外诱导实验显示经过本方案制备的DC1诱导之后，活化的T细胞即IFNγ表达阳性的T细胞显著性升高。

其次，本发明提供了一种经济易用的DC1细胞制备方法。目前现有技术中效率稍高的制备方法均需要多达六到八种诱导因子；本发明利用NK细胞的培养基上清做为重要的诱导试剂，减少了制备过程细胞因子的使用。这一改进不仅降低了制备成本，而且简化了整个系统的不确定度，有利于质量控制。

最后本方案提供了一种用于肿瘤治疗的DC1临床应用方案。DC1细胞负载肿瘤特异性抗原之后，一部分细胞回输至患者体内，另一部分用于体外肿瘤抗原特异性的诱导细胞毒性T细胞(CTL)，通过体内/体外，主动诱导/被动诱导相结合的方式激活肿瘤特异性的免疫反应。

附图说明

图1为本发明方法制备的DC1细胞与常规方案制备的成熟DC细胞相比，CCR7，CD70，HLA-DR，CD83，CD86等DC细胞与免疫激活相关的标志物表达量情况；

图2为经过CD40L激活之后，本发明诱导的DC1细胞所分泌的IL-12与常规方案制备的成熟DC细胞分泌量之对比；

图3为本发明制备的DC1细胞诱导T细胞之后，IFNγ分泌水平与常见方案制备的DC细胞诱导之对比。

具体实施方式

本发明提供了一种体外制备成熟一型树突状细胞(DC1)的方案，并使用DC1细胞诱导肿瘤特异性CTL细胞和Th1细胞，激活肿瘤病人免疫反应，进行肿瘤治疗。此外，本发明还可应用于肿瘤治疗性疫苗和肿瘤预防性疫苗的大规模制备。

具体而言，本发明提供了一种体外制备DC1细胞的方案：

首先，制备NK细胞的培养基上清。分离脐血/外周血单个核细胞，加入NK细胞诱导试剂，至第十四天收集NK细胞。NK细胞加入激活因子IFNα并与K562细胞共培养，收集培养基上清，于-80度保存或直接使用。经过试验发现，NK细胞与K562细胞的接种比例2:1至10:1之间。此外，NK细胞可以是脐血来源的细胞，也可以是成人供者来源的细胞。

然后进行DC1细胞的制备：分离外周血中的单核细胞，细胞短暂贴壁培养之后，移除悬浮细胞，使用诱导剂GM-CSF和IL-4培养五天，获得成熟的DC细胞。成熟的DC细胞用含INFγ以及NK细胞上清的培养基进一步诱导两天，促使DC细胞分化为DC1细胞。本发明方法制备的DC1细胞与常规方案制备的成熟DC细胞相比，CCR7，CD70，HLA-DR，CD83，CD86等DC细胞与免疫激活相关的标志物的多个表面标志物成阳性(如图1)。

上述过程均在体外进行，由此可获得富集DC1细胞的细胞群。DC1细胞经过CD40L刺激之后，高表达IL12。IL12在T细胞特异性免疫激活过程中有至关重要的作用，本发明方案诱导的DC1激活特异性免疫反应的能力较常规方案的DC细胞要更强，如图2所示本发明制备而得的细胞产物IL12p70表达量大大高于目前常用的方案，本发明诱导的DC1细胞所分泌的IL-12几乎是常规方案制备的成熟DC细胞分泌量的10倍。

另一方面，由于DC1细胞的表型显示了其强有力的诱导CTL细胞的能力(如图3所示，体外诱导实验显示经本发明制备的DC1诱导之后，活化的T细胞即IFNγ表达阳性的T细胞显著性升高)，DC1细胞负载特异性肿瘤抗原的短肽之后，可以用多种肿瘤治疗(肝癌，肺癌，乳腺癌等等)。负载肿瘤抗原的DC1细胞单独给药进行治疗，也可以与其他肿瘤治疗方法组合使用来治疗肿瘤，如，肿瘤外科手术、化疗(细胞毒性药物，凋亡试剂，抗体药物等等)、放射疗法、冷冻疗法、近距疗法和其他免疫疗法之一种或多种来组合使用。本发明的DC1细胞可以采用任何适于给药的剂型和方式进行给药，配制成注射剂进行给药。例如，可与药学上可接受的载体结合，通过注射器、导管、插管、皮下、静脉或淋巴结等给药。

另一方面，本发明还提供了一种体外诱导肿瘤特异性的CTL的制备方法。：分离外周血中的单核细胞，细胞在培养瓶中短暂培养之后，悬浮细胞转移新培养瓶，按细胞密度1.0～3.0×10⁶个/ml添加扩增培养基，至第五天加入诱导剂IFN-γ之后24小时，加入诱导试剂IL-1α及CD3并与DC1细胞混合培养。DC和T细胞混合培养后第二次添加扩增培养基时(混合培养后第3-4天)约在第10天-11天，进行第二次抗原肽负载。培养至在第十五天，收集细胞。CTL细胞的培养时间可以根据临床治疗的要求进行延长，一般不超过20天。

本发明方案获得的CTL细胞可以做为药物，通过注射的方式，患者肿瘤内、肿瘤近旁或邻近肿瘤的血管或淋巴管内或皮下。CTL细胞也可与肿瘤外科手术、化疗、放射疗法、冷冻疗法、近距疗法和其他免疫疗法来组合使用。组合使用时，不同的疗法可以同时或依次进行。

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例1

自然杀伤细胞培养基上清(NaturalKillercell，NK)的制备

外周血单个核细胞分离参照根据Jonuleit等(GeneTher.200310(3))所述的方法。首先用通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离外周血单个核细胞。

按密度3×10⁶/ml转移至新培养瓶中，加入IL-2(2000U/ml)以及IL15(2ng/ml)。每两至三天倍比加入培养基，并等量补加因子。至第十二天收集。诱导完成之后，NK细胞按1-3×10⁶/ml接种至培养基RPMI1640中，加入IFNa(1000UI/ml)并以0.5-1.5×10⁵/ml密度接种K562细胞(可替换为K562-NK细胞)混合培养，收集激活24-48小时过程中的培养基上清，过滤之后-80度冻存或直接用于DC1细胞的制备。

实施例2

成人外周血来源的一型极化树突状细胞的制备

外周血单个核细胞分离参照根据Jonuleit等(GeneTher.200310(3))所述的方法。首先用通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离外周血单个核细胞，并收集血浆用于后续的培养。

按密度3.0×10⁶/ml，将细胞接种至T75培养瓶中，并在含1000U/mlIL-2扩增培养基中加入10％血浆，置于37.0℃、饱和湿度、5％CO₂环境中培养。培养3h后，洗去悬浮的淋巴细胞，加入含GM-CSF和IL-41000U/ml以及10％血浆的培养基。贴壁细胞培养第3天，第5天更换一半量的培养基。

培养第六天，更换含5％血浆培养基并加入NK细胞上清10％，并按照终浓度1000UI/ml加入IFNγ，培养二十小时之后再加入20ug/ml的poly-I:C。培养至第七天收集细胞即为DC1细胞。DC1s细胞培养至第六天，将CTL-TP试剂盒中的肿瘤抗原肽段粉剂离心后(300g，10min)，每支分别溶于200ul培养基中(每个肽2ug/ml)，充分混匀后加入到DC1中，孵育2h。收集的DC1细胞分为两份，每份至少10⁶个细胞，可以用于直接与肽混合回输病人体内，或用于体外诱导CTL细胞。

实施例3

DC1细胞体外诱导肿瘤抗原特异性CTL细胞

如上述方法分离外周血单核细胞，在贴壁培养皿中短暂培养，分离能够贴壁的细胞。悬浮细胞按密度3.0×10⁶/ml接种培养。每隔两天倍比添加含1000U/mlIL-2的扩增培养基。至培养第五天添加IFN-γ，第六天加入IL-1α与CD3。

将由实施例2获得的抗原肽负载DC1与T细胞混合培养。每隔两天倍比添加含1000U/ml的扩增培养基。混合培养开始后第四天，再次负载肿瘤特异性抗原肽。将CTL-TP试剂盒中的肿瘤抗原肽粉剂离心后(300g，10min)，每管分别加入1ml的培养基，充分溶解混匀后，添加到培养体系中。之后，继续培养至回输，T细胞体外培养时间不应超过20天。

实施例4

本发明诱导的DC1细胞的临床应用

应用上述描述的方法，本发明针对肝癌病人采用了DC1介导免疫疗法进行治疗方法简述如下：符合入选标准的患者(III或IV级)在进行化疗之前，取外周血150ml，按实施例二以及实施例三进行制备DC1以及肿瘤抗原特异性的CTL细胞。

第七天在病人的淋巴结注射抗原负载的10⁶个DC1细胞(重悬于1ml生理盐水)，第十六，十七，十八天每天回输10⁹个诱导T细胞，静脉回输。目前已完成5例，治疗效果良好，尚未发现明显的并发症，证实本方法安全可靠。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.一种体外诱导一型极化树突状细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，制备NK细胞的培养基上清：K562细胞与NK细胞按1:2至1:10比例共培养并加入IFNalpha，24-48小时后收集培养基上清；

步骤2，分离外周血中的单核细胞，细胞短暂贴壁培养之后，移除悬浮细胞，加入诱导剂GM-CSF和IL-4进行培养，培养第3天，第5天更换一半量的培养基，获得成熟DC细胞；

步骤3，所述步骤2中制得的成熟DC细胞用含INFγ以及所述步骤1中的NK细胞的培养基上清进一步培养诱导两天，使所述的成熟DC细胞分化为DC1细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中制备NK细胞的培养基上清时，首先分离脐血/外周血单个核细胞，加入NK细胞诱导试剂，培养12-15天收集NK细胞；然后将收集的NK细胞接种至培养基中，并在培养基中加入激活因子IFNα并与K562细胞共培养24-48小时，最后收集培养基上清，于-80℃保存或直接使用。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，NK细胞与K562细胞的共培养的接种比例1：5至1：20。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的K562细胞可由K562-NK细胞替换。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述的贴壁培养是指在含IL-2扩增培养基中加入10％血浆，置于37.0℃、饱和湿度、5％CO₂环境条件下的培养。

6.一种如权利要求1-5任意一项所述方法制备的一型极化树突状细胞。

7.一种治疗肿瘤的组合物，其特征在于，由如权利要求1-5任意一项所述方法获得的DC1细胞进行肿瘤抗原肽负载而得到。

8.一种制备肿瘤抗原特异性CTL细胞的方法，其特征在于，包括以下操作：分离外周血中的单核细胞，细胞在培养瓶中短暂培养之后，悬浮细胞转移新培养瓶，按细胞密度1.0～3.0×10⁶个/ml添加扩增培养基，至第五天加入诱导剂IFN-γ培养24小时，然后加入诱导试剂IL-1α及CD3并与权利要求7所述的负载了抗原肽的DC1细胞混合培养；混合培养后第二次添加扩增培养基时，进行第二次抗原肽负载；培养15-20天，收集细胞。

9.如权利要求8所述的方法制备的肿瘤抗原特异性CTL细胞在制备抗癌药物中的应用。