CN1541113A - 利用激活的t细胞使抗原提呈细胞成熟 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使抗原提呈细胞成熟的方法，更具体的是使抗原提呈细胞成熟的方法。公开了在体外和体内产生成熟和/或正在成熟的抗原提呈细胞的方法。本发明还涉及到细胞组合物，包括成熟的抗原提呈细胞和/或活化的T细胞和它们在体内产生免疫应答、以及抑制感染性疾病和癌症的发展和预防这些疾病的发生的用途。

Description

利用激活的T细胞使抗原提呈细胞成熟
发明背景
发明领域
本发明一般涉及使抗原提呈细胞(APC)成熟的方法，更具体而言，涉及使APC如树突细胞(DC)成熟的方法。本发明还涉及细胞组合物，包括成熟的APC和/或活化的T细胞。
背景技术
将抗原提呈给T细胞是免疫激活过程中的中心步骤。许多类型的细胞都有提呈抗原的能力，包括DC、巨噬细胞和活化的B细胞。许多器官特异性的细胞群，比如肝脏的枯否细胞(Kuppfer cell)和皮肤的朗氏细胞(Langerhans cell)都是DC的亚细胞群。并不是所有的APC都同样有效，而且一般认为DC是最有潜力的APC。(FundamentalImmunology，4th Edition.William E.Paul，Editor.，Lippincott-Raven Publishers，New York 1999)。
DC是APC，其功能是起始几种免疫应答，比如MHC-限制性T细胞的致敏、器官移植的排斥和T细胞依赖抗体的形成。虽然DC是在许多非淋巴样组织中发现的，但是能够通过输入淋巴或血流迁移到淋巴器官的T细胞依赖区域。在皮肤中也发现有DC，在此处称为朗氏细胞，而且在粘膜中也有。它们就象是周缘组织中免疫系统的哨兵，在这里能够获得抗原。由于这些细胞通常表达CD4，而且在体外能够被HIV感染，所以它们可能是体内病毒入侵的进口：如，Knight等人，pp.145在Racz等人编辑的“Accessory Cells in HIV and Other RetroviralInfections”(Karger，Basel，1991)；Ramsauer等人，pp.155在Raca等人编辑(同上)。从外周血中分离人DC细胞在最近才获得成功而且只能得到少量的细胞，比如，Freudenthal等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.87，pp.7698(1990)。在体外产生大量人DC以及更有效发挥作用的DC，为在体内产生初级和次级免疫应答以及在体外致敏(priming)人原初(naive)CD4+和CD8+细胞提供了重要的有利条件。
发明概述
本发明一般提供了使细胞成熟的方法，更具体的是提供了一种使DC细胞成熟的新方法。本发明的一个方面在于提供一种使DC细胞成熟的方法，包含提供一个细胞群，其中至少一部分包括未成熟的DC；并且将该细胞群暴露于活化的T细胞或其形成的上清中，由此来诱导成熟。
在该方法的一个实施方案中，未成熟的DC产生于前体细胞来源，包含白细胞分离法(leukaperesis)产物、外周血、淋巴结、皮肤、消化道相关的淋巴样组织(GALT)、扁桃体、胸腺、组织活检物、肿瘤、肾、骨髓、脐带血(cord blood)、CD34+细胞、单核细胞、或粘附细胞、或其任意组合。
在该方法的另一个实施方案中，未成熟的DC产生于所述前体细胞来源中任何一种或组合，方法是将所说的前体细胞暴露于一种或多种细胞因子。在另一实施方案中，细胞因子可能包含粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)、和IL-13、或其任何组合。
在该方法的另一个实施方案中，通过将前体细胞暴露于上述一种或多种细胞因子以及活化的T细胞和/或其上清来产生未成熟的DC。
在该方法的一个实施方案中，通过基因修饰或将未成熟的DC暴露于抗原来源中使未成熟的DC带有抗原，该抗原来源可能包含蛋白质、糖蛋白、多肽、抗体/抗原复合物、肿瘤溶解产物、不溶性细胞残片、凋亡小体、坏死细胞、从肿瘤或细胞系中得到的完整肿瘤细胞(其经过处理后不能继续分裂)、同种异源细胞(该细胞经过处理后不能继续分裂)、辐射的肿瘤细胞、辐射的同种异源细胞、天然或合成的复合碳水化合物、脂蛋白、脂多糖(LPS)、转化细胞或细胞系、转染细胞或细胞系、或转导细胞或细胞系、或其任何组合。
在另一个实施方案中，未成熟的DC经过了基因修饰。
在该方法的另一实施方案中，通过给予哺乳动物一种组合物来产生未成熟的DC，该组合物物包含增加血液中DC数量的化合物和药物上可接受的赋形剂。在优选的实施方案中，该化合物可以包含Flt3-配体(Flt3-L)或CD40配体(CD40L)。
本发明还提供了通过此处描述的任何方法产生的成熟DC细胞群。
在该方法的一个实施方案中，活化的T细胞包含T细胞系。
在另一个实施方案中，通过细胞表面部分的连接来产生活化的T细胞，包含提供一种细胞群，至少其一部分包括T细胞，同时将该细胞群暴露于诱导所需激活的物质(agent)中。在一个实施方案中，该物质可以包含抗CD3抗体、抗CD28抗体、肽-MHC四聚体、或超抗原、或其组合。
在该方法的一个实施方案中，通过将细胞群暴露于促分裂原中来产生活化的T细胞，该细胞群至少一部分包含T细胞。在一个优选的实施方案中，该促分裂原可能包含植物凝集素(PHA)、乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)和离子霉素(ionomycin)、脂多糖(LPS)或其组合。
在该方法的一个实施方案中，通过同时进行T细胞浓集和细胞表面部分连接来产生活化的T细胞，包含：提供细胞群，其至少一部分包含T细胞；将该细胞群暴露于一表面，该表面附着有一种或多种能够连接至少一部分T细胞的细胞表面部分并且至少刺激该部分的T细胞的物质；可以选择但不是必须选择应用能明显地驱使T细胞浓集和T细胞表面部分连接的力，从而诱导T细胞刺激。
本发明还提供了一种组合物，其包含按照上述方法产生的DC和药物上可接受的赋形剂。在一个实施方案中，该组合物可能包含经过基因修饰的DC。
在一个实施方案中，提供了刺激哺乳动物的免疫应答的方法，其包含给予哺乳动物本发明的DC组合物。在优选的实施方案中，免疫应答包含哺乳动物T细胞的活化。
在另一个实施方案中，提供了改善哺乳动物的免疫应答机能障碍的方法，其包含给予哺乳动物本发明的成熟DC组合物。而在另一个实施方案中，提供了减少哺乳动物癌细胞存在的方法，包括将肿瘤细胞暴露于所述DC组合物。在一个实施方案中，该肿瘤细胞可以包含来自黑色素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病、白血病、浆细胞瘤、肉瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肾细胞癌、胰腺癌、食管癌、脑癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌(cervicalcancer)、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、鼻咽癌、ALL、AML、CML、或CLL、或其组合的细胞。
另一实施方案提供了减少哺乳动物中感染性生物体存在的方法，包含给予哺乳动物本发明的组合物。在一个优选的实施方案中，感染性生物体可能包含病毒(比如单链RNA病毒或单链DNA病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、甲、乙或丙型肝炎病毒、单纯性疱疹病毒(HSV)、人乳头状瘤病毒(HPV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV))、寄生虫、细菌、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、Pneumocystis carinii、假丝酵母属(Candida)、或曲霉属(Aspergillus)或其组合。
在另一个实施方案中，提供了抑制哺乳动物癌症发展的方法，包含给予哺乳动物本发明的DC组合物。在另一实施方案中，癌症可以包含黑色素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病、白血病、浆细胞瘤、肉瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肾细胞癌、胰腺癌、食管癌、脑癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、鼻咽癌、ALL、AML、CML、或CLL或其组合。
在另一个实施方案中，提供了抑制哺乳动物感染性疾病发展的方法，包含给予哺乳动物本发明的DC组合物。在另一实施方案中，该感染性疾病可能包含由病毒(比如单链RNA病毒、单链DNA病毒、双链DNA病毒、HIV、甲、乙或丙型肝炎病毒、HSV、CMV、EBV)、寄生虫、细菌、结核分枝杆菌、Pneumocystis carinii、假丝酵母属、或曲霉或其组合所引起的疾病。
本发明的一个方面提供了包含DC和活化的T细胞的组合物，其中的DC已经通过体外暴露于活化的T细胞和/或其上清而成熟。在一个实施方案中，该组合物还包含药物上可接受的赋形剂。
在一个实施方案中，提供了刺激哺乳动物的免疫应答的方法，包含给予哺乳动物按照本发明的方法产生的DC和活化的T细胞的组合物。
在另一个实施方案中，提供了减少哺乳动物中如上所列感染性生物体存在的方法，包含给予哺乳动物DC和活化的T细胞的组合物。
在另一的实施方案中，提供了抑制哺乳动物中上述任何癌症发展的方法，包含给予哺乳动物本发明的DC和活化的T细胞的组合物。
另一个实施方案提供了抑制哺乳动物中上述任何感染性疾病的发展的方法，包含给予哺乳动物本发明的DC和活化的T细胞的组合物。
本发明的另一个方面提供了减少哺乳动物中癌细胞存在的方法，包含给予哺乳动物一种组合物，该组合物包含由活化的T细胞和/或其上清而体外成熟的DC、活化的T细胞、和药物上可接受的赋形剂，其中的癌细胞可以包含来自上述所列任何癌症中的细胞。
本发明的一个方面提供了诱导DC体内成熟的方法，包含：给予哺乳动物一种细胞群，其中该细胞群的至少一部分包括体外产生的未成熟的DC；给予哺乳动物颗粒物质，其中该颗粒的至少一部分已经粘附了诱导T细胞活化的T细胞表面分部分的特异性配体，其中该颗粒的另一部分已经粘附了DC表面部分的特异性配体；诱导T细胞和DC的共同定位，达到T细胞的活化和所需的DC的成熟。在该方法的一个实施方案中，该颗粒是顺磁的。而在另一个实施方案中，共定位是通过在哺乳动物的离散区域(discrete region)应用磁场来完成的。而在另一个实施方案中，该颗粒进一步地包括哺乳动物的离散组织的特异性配体。在另一实施方案中，该离散组织可能包括肿瘤、淋巴结组织、粘膜淋巴组织、消化道相关的淋巴组织(GALT)、或皮肤、或其任何组合。
本发明的一方面提供了体内产生成熟DC的方法，包含给予哺乳动物包含活化的T细胞的组合物。
本发明的另一个方面提供了在体内产生DC的方法，该方法包含给予哺乳动物一种组合物，该组合物包含增加血液中DC数量的化合物和药物上可接受的赋形剂。在一个实施方案中，该化合物可能包含Flt3-L、可溶性CD40L、GM-CSF和IL-4或IL-13、或其任何组合。在另一个实施方案中，该方法进一步包含给予活化的T细胞。
本发明的另一个方面提供了产生成熟DC的方法，该方法包含：通过一种方法在体外从前体细胞来源中产生未成熟的DC，这种方法可以包含i)将前体细胞暴露于GM-CSF和IL-4中；ii)将前体细胞暴露于GM-CSF和IL-13中；iii)将前体细胞暴露于活化的T细胞中；iv)将前体细胞暴露于活化的T细胞上清中；v)将前体细胞暴露于GM-CSF和IL-4和活化的T细胞中；vi)将前体细胞暴露于GM-CSF、IL-4和活化的T细胞上清中；vii)将前体细胞暴露于GM-CSF、IL-13和活化的T细胞中；或viii)将前体细胞暴露于GM-CSF、IL-13和活化的T细胞上清中；给予哺乳动物未成熟的DC细胞，以及给予哺乳动物活化的T细胞，从而诱导未成熟的DC细胞的体内成熟。在该方法的一个实施方案中，该前体细胞来源可能包含白细胞分离法产物、外周血、淋巴结、皮肤、GALT、扁桃体、胸腺、组织活检物、肿瘤、肾、骨髓、脐带血、CD34+选择细胞、单核细胞、或粘附细胞、或其组合。
本发明的另一个方面提供了产生成熟DC的方法，该方法包含：从哺乳动物中获取细胞群，其至少一部分包含前体DC；将该部分细胞在体外暴露于GM-CSF和IL-4或IL-13中以产生未成熟的DC；将该未成熟的DC在体外暴露于活化的T细胞群中，经过足够的时间达到所期望的成熟。在一个实施方案中，该前体细胞可从外周血中分离得到。在另一实施方案中，该前体细胞可从白细胞分离物中分离得到。在另一实施方案中，通过一种方法可以产生活化的T细胞，该方法包含在适合T细胞活化的条件下，将T细胞群暴露于抗-CD3抗体和能够结合T细胞表面辅助分子(accessory)的配体。在另一实施方案中，通过一种方法能够产生活化的T细胞，该方法包含将T细胞群暴露于固定在固相表面上的抗-CD3抗体中；以及，用抗-CD28抗体刺激T细胞表面上的辅助分子，其中所说的抗-CD28抗体同抗-CD3抗体固定在同一个固相表面上，由此诱导T细胞的活化和增殖。在一个实施方案中，用该方法产生的活化的T细胞包含已经增殖的T细胞。在另一个实施方案中，用该方法产生的活化的T细胞包含分泌细胞因子的T细胞。
本发明不仅用于使DC成熟，也能被用于使其它APC成熟的所有方面和实施方案中。
本发明提供的方法和其实施方案，包含活化的T细胞或其上清使DC和其它APC成熟。在这些方法和其实施方案中都可以使用活化的T细胞或其上清。
附图简述
图1描述了在XCELLERATETM过程中在培养上清中IL-2浓度的时间过程分析。
图2描述了在XCELLERATETM过程中在培养上清中IL-4浓度的时间过程分析。
图3描述了在XCELLERATETM过程中在培养上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度的时间过程分析。
图4描述了在XCELLERATETM过程中在培养上清中γ-干扰素(IFN-γ)浓度的时间过程分析。
图5描述了XCELLERATETM活化的T细胞中CDw137(4-1BB)表达水平的时间过程分析。
图6描述了XCELLERATETM活化的T细胞中CD154(CD40L)表达水平的时间过程分析。
图7描述了XCELLERATETM活化的T细胞中CD25表达水平的时间过程分析。
图8包括4个图，描述了与单纯使用培养基培养的前体细胞相比，在XCELLERATETMT细胞上清存在下培养的前体细胞中DR、CD86、谱系(lineage)(CD3、CD14、CD16、CD19、CD20和CD56)和CD14的表达水平。
图9包括了4个柱状图，测定在有第2天或第3天的XCELLERATETM活化的T细胞存在下成熟的DC上CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达水平。
图10是多核细胞的照片，该细胞是通过第1天到第2天的单核细胞与第2天或第3天的XCELLERATETM活化的T细胞共同培养3到4天后得到的。
图11描述了XCELLERATETM过程中第3天的T细胞培养上清中多种细胞因子的浓度。
发明祥述
在阐述本发明之前，先阐明下文用到的某些术语的定义可能有助于对发明的理解。
这里使用的术语“生物相容性”是指对活细胞基本没有毒性的特性。
这里使用的术语“刺激”是指通过细胞表面部分连接诱导的初级应答。例如，对于受体而言，这种刺激需要受体的连接和随后的信号传导事件。关于T细胞的刺激，这种刺激是指T细胞表面部分的连接，在一个实施方案中随后会诱导信号传导事件，比如结合TCR/CD3复合物。另外，刺激事件可能激活一种细胞以及上调或下调一种分子的表达或分泌，比如肿瘤生长因子-β(TGF-β)的下调。这样，即使缺少直接的信号传导事件，细胞表面部分的连接也可能产生细胞骨架结构的重构或细胞表面部分的接合(coalescing)，无论哪种情况都能用于增强、调节或改变随后的细胞应答。
这里使用的术语“活化”是指细胞的一定状态，这种状态是继细胞表面部分充分连接后所诱导出的可测量的形态学的、表型的和/或功能上的变化。对于T细胞而言，该活化是T细胞在受到足够的刺激后所诱导出的细胞增殖的状态。T细胞的活化也能够诱导细胞因子的产生和/或分泌，以及执行调节或细胞裂解效应物的功能。就其它细胞而言，该术语指要么上调要么下调特殊的物理化学过程。
这里使用的术语“靶细胞”是指希望通过细胞表面部分的连接而受到刺激的任何细胞。
这里使用的“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体(mAb)、灵长类化(比如，人源化)、鼠、小鼠-人、小鼠-灵长类、和嵌合的；可能是完整的分子、其片段(比如scFv，Fv，Fd，Fab，Fab’和F(ab)’2片段)，或完整分子和/或片段的多聚体或聚合体；可以是天然产生的也可以是人工制造的，比如通过免疫、合成或基因工程；这里使用的“抗体片段”是指来源于抗体或与抗体相关的片段，它结合抗原，而且在一些实施方案中它还被赋予一定的结构特点以便有利于清除和吸收，比如结合上乳糖残基。它包括，比如Fab、F(ab)’2、scFv，、轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)和其组合。
这里使用的术语“蛋白质”包括蛋白质、糖蛋白和其它细胞来源的修饰蛋白、多肽和肽；而且可以是完整分子、其片段、或完整分子和/或片段的多聚体或聚合体；可以是天然产生的也可以是人工制造的，比如通过合成(包括化学的和/或酶的)或基因工程。
这里使用的术语“物质(agent)”、“配体”、或“结合在细胞表面部分的物质”是指结合确定细胞群的分子。所述的物质可以结合任何细胞表面部分，比如受体、抗原决定簇、或靶细胞群上其它结合位点。该物质可以是蛋白质、肽、抗体和其抗体片段、融合蛋白、合成分子、有机分子(比如小分子)等。在说明书中以及就T细胞刺激而言，抗体被当作这种物质的一个原型实例来使用。
这里使用的术语“细胞表面部分”可以指细胞表面受体、抗原决定簇、或靶细胞群上呈现的任何其它结合位点。
这里使用的术语“结合细胞表面部分的物质”和“细胞表面部分”应该被认为是一组互补性/反互补性分子，该分子表现出一般具有相对较高亲和性的特异性结合。
这里使用的“协同刺激信号”是指一种信号，在结合初级信号比如TCR/CD3连接后导致T细胞增殖和/或活化。
这里使用的“分离”包括将一种成份从另一种成份中基本上纯化出来的任何方法(比如过滤、亲和、浮力密度、或磁吸附)。
这里使用的“表面”是指任何能够附着物质的表面，包括但不限于金属、玻璃、塑料、多聚体、胶体、脂类、细胞表面等。基本上任何能够保留住结合或附着在上面的物质的表面。
这里使用的“前体细胞”或“祖细胞”是指依据体内或体外条件而能分化成多种的、不同类别的成熟细胞的细胞。前体细胞或祖细胞的实例包括但不限于CD34+细胞、单核细胞和前B细胞。
这里使用的“未成熟”是指界于祖细胞或前体细胞和成熟状态之间的一种细胞分化状态。
这里使用的“使成熟(maturing)”是指使前体细胞或祖细胞分化到成熟状态的过程。在祖细胞到成熟细胞的成熟过程中存在着许多阶段，其中包括未成熟的阶段。根据本发明成熟可以发生在体内、体外或两者皆有。例如，可以从组织样本中分离出前体细胞并在体外使之成熟。另外还可以从样本中分离得到未成熟的细胞并在体外进一步使之成熟。可以从样本中分离得到前体细胞在体外使之部分成熟，再输入到个体并在体内继续成熟。
这里使用的“专职(professional)APC”(pAPC)或“抗原提呈细胞”(APC)是指一些通常引发原初和/或记忆T细胞对抗原产生应答的细胞。专职APC包括但不限于DC、巨噬细胞和B细胞。pAPC可能表达高水平的MHCII类分子、ICAM-1和B7-2。
这里使用的“成熟(p)APC”是指APC在适当的刺激物存在下在体内或体外分化之后的状态，。使得成熟的APC具有引发或参加免疫应答的能力。根据本发明，成熟的APC的特征在于具有引发原初T细胞能力。另外，根据mAb染色和流式细胞术分析定量，成熟APC可表达CD40、CD54、CD80、CD83、CD86、CCR7、ICAM-1、CD1a和高水平的MHCII类分子。
这里使用的“未成熟APC”是指APC的一种中间分化状态，其中APC能内吞或吞噬抗原、异物(foreigu body)、坏死的和/或正在凋亡的组织和/或细胞。根据前体细胞的起源未成熟APC可能是CD14-或CD14+。未成熟APC还可能表达CD1a、CD40、CD86、CD54和中等水平的MHCII类分子(样品细胞的标志物表达水平可以通过流式细胞术分析来与MHCII类分子阴性细胞以及已知表达高水平MHCII类分子的细胞的表达水平进行比较)。未成熟APC一般不表达CCR7。
这里使用的“免疫应答”是指免疫系统细胞的活化，包括但不限于T细胞，这样诱导特定细胞的特定效应子功能。效应子功能包括但不限于增殖、细胞因子的分泌、抗体的分泌、调节和/或粘附分子的表达和诱导细胞裂解的能力。
这里使用的“刺激免疫应答”是指能够完成免疫系统细胞效应子功能的活化和诱导的任何刺激。
这里使用的“免疫应答功能障碍”是指免疫系统细胞的不恰当的或缺乏活化和/或增殖、和/或细胞因子不恰当的或缺乏分泌、和/或免疫系统细胞的其它效应子功能(如调节、粘附、和/或归巢受体的表达和细胞裂解诱导)的诱导不恰当或不足。
这里使用的术语“防止”或“抑制”癌症或癌细胞的发展是指防止癌症发生或延迟癌症发作的方法。
这里使用的术语“治疗”或“减少”癌或癌细胞的存在是指抑制癌生长，这可以通过肿瘤体积或恶性细胞的数量来反映。肿瘤体积可以通过各种已知的方法来确定，比如用刻度测径器(caliper)获取二维侧量值。
这里使用的“防止或抑制感染性疾病的发展”是指防止感染性疾病的发生或延迟感染性疾病发作，或逆转现有感染的传播。
这里使用的“改善”定义为：使更好、改善(The American HeritageCollege Dictionary，3rd Edition，Houghton Mifflin Company，2000)。
这里使用的“颗粒”可包括胶体颗粒、微球、纳米颗粒(nanoparticle)、珠等。在多种实施方案中，可以使用商业途径能够得到的表面，如小珠或其它颗粒(比如：Miltenyi Particles，Miltenyi Biotec，Germany；Sepharose bead，Pharmacia FineChemicals，Sweden；DYNABEADSTM，Dynal Inc.，New York；PURABEADSTM，Prometic Biosciences，磁珠，Immunicon，Huntingdon Valley，PA，Bangs Laboratories Inc.，Fisher，IN的微球)。
这里使用的“顺磁颗粒”是指如上所定义的颗粒，该颗粒响应磁场来定位。
这里使用的“抗原”是指任何分子：1)整体或其片段能够被特异性地识别，并被mAb或其衍生物的“独特型”部分(抗原结合区)结合；2)含有能被MHC分子结合的肽序列，而就MHC提呈而言，能够特异性地占用(engage)它的同源T细胞抗原受体。
这里使用的使APC“带有(load)抗原”是指将APC暴露于抗原或抗原性肽中，经过一段足够的时间使APC吸收、加工、并提呈、被MHC分子结合的抗原到T细胞。在某些情况下，不经过APC的吸收和加工，抗原也能被MHC分子结合并提呈给T细胞。
这里使用的术语“动物”或“哺乳动物”包含所有的哺乳动物，也包括人类。本发明的动物优选是人类。
这里使用的术语“暴露于”是指放入非常接近或直接接触的状态或条件中。
这里使用的术语“裂解物”是指细胞裂解产生的上清和不溶性的细胞残片。技术人员应该认识到可以使用本领域中许多已知的裂解缓冲液(例如见：Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，New York.N.Y.)。细胞裂解也可以用冻融法进行。
这里使用的术语“凋亡小体”是指凋亡细胞产生的较小的、完整的、膜结合片段。
这里使用的术语“增殖”是指通过产生新的细胞来生长或繁殖。
这里使用的术语“感染性疾病”是指由感染性生物体引起的任何疾病。感染性生物体可包括病毒(比如单链RNA病毒、单链DNA病毒、HIV、甲、乙、丙型肝炎病毒、HSV、CMV、EBV、HPV)、寄生虫(例如：原生动物和后生动物，如疟原虫种(Plasmodia species)，Leishmania种，Schistsoma种，Trypanosoma种)、细菌(如，分枝杆菌属，特别是，结核分枝杆菌，沙门氏菌属(Salmonella)，链球菌属(Streptococci)，大肠杆菌(E.coli)，葡萄球菌属(Staphylococci))真菌(如：假丝酵母种(Candida species)，曲霉种)、Pneumocystiscarinii和朊病毒(已知的朊病毒感染动物引起瘙痒病，这是一种绵羊或山羊神经系统的可传播的变性病，以及牛海绵状脑病(BSE)或“疯牛病”，还有猫的猫科海绵状脑病。已知四种影响人类的朊病毒病是(1)库鲁病(kuru)，(2)克罗伊茨费尔特一雅各布病(Creutzfeldt-Jakob Disease)(CJD)，(3)Gerstmann-Straussler-Scheinker病(GSS)和(4)致命性家族性失眠症(FFI))。这里使用的“朊病毒”包括，在任何动物，特别是人类和家养的农场动物中引起所有或任何这些疾病或其它疾病的所有形式的朊病毒。
这里使用的术语“消化道相关的淋巴组织”或“GALT”是指同胃肠道密切相关的淋巴组织，包括腭扁桃体、淋巴集结(Peyer’spatches)和上皮内淋巴细胞。
这里使用的术语“粘膜淋巴组织”是指上皮中和位于身体粘膜表面之下的固有膜中的所有淋巴样细胞。
抗原提呈细胞(APC)来源
产生未成熟APC(APC)和成熟APC的方法的原料一般是包括APC前体的组织来源，该前体如果用本发明的方法处理能够在体外增殖并成熟为专职APC(pAPC)。在一个方面，APC前体细胞能够在体外增殖并成熟为DC(DC)。虽然可以应用许多组织来源，但是一般的组织来源包括肾、胸腺、组织活检物、肿瘤、输入淋巴、淋巴结、皮肤、GALT、骨髓、单采血液成分术(apheresis)或白细胞分离法产物、和/或外周血。在某些实施方案中，单采血液成分术产物、骨髓和外周血是优选来源。富含生长因子的胎儿组织、胎儿或脐带血也可以作为获得前体APC的血源。可作为实例的前体细胞可以是但不限于胚胎干细胞、CD34+细胞、单核细胞祖细胞、单核细胞和前B细胞。在另一个实施方案中，有可能去分化的细胞或细胞系也可以作为前体细胞来源。
另外根据本发明的一个方面，前体细胞包括单核细胞或CD34+细胞。
在本发明的一个发面，制备未成熟APC和成熟APC的原料是单采血液成分术或白细胞分离法产物。通过本领域已知的单采血液成分术方法收集细胞。例如，见Bishop等人，Blood，vol.83，No.2，pp.610-616(1994)。简要地，用常规装置收集细胞，例如HaemoneticsModel V50单采血液成分术装置(Haemonetics，Braintree，Mass.)。单采血液成分术产物一般含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞(RBC)和血小板。在一个实施方案中，通过单采血液成分术收集的细胞可通过洗涤的方法除去血浆部分，并将细胞放在适当的缓冲液或培养基中以进行后续的处理步骤。在本发明的另一个实施方案中，用PBS洗涤细胞。在另一个实施方案中，洗涤溶液缺乏钙，也可能缺乏镁或缺乏许多(如果不是所有的)双价阳离子。本领域中一般技术人员应该容易理解洗涤步骤可以用本领域中一般技术人员已知的方法来完成，比如按照生产商的使用说明使用半自动的“极限沉降”(“flow-through”)离心(如：Cobe2991 cell processor，Gambro BCT，Lakewood，CO)。洗涤之后，用多种生物相容性缓冲液重悬细胞，比如无Ca++/Mg++ PBS。此外，可除去单采血液成分术样品中不需要的成分并将细胞直接重悬于培养基中。
在另一个实施方案中，CD34+细胞可以从新分离到的骨髓或从已经富集了单核细胞的单采血液成分术产物中得到。当直接从血液中分离CD34+细胞时以及从单采血液成分术产物中已经分离得到CD34+细胞时，都可以通过密度离心的方法富集单核细胞。虽然密度离心是优选的，但并不是必需的。如果已经从血液(肝素化的血液样品)中直接分离CD34+细胞，红细胞可能充分裂解，这之后的下一个纯化步骤是用亲和柱或其它富集步骤。如果是直接从单采血液成分术产物中分离CD34+细胞，这些细胞可以只经过一次洗涤而且不用FICOLL分离就上到亲和柱中。可以省略FICOLL梯度富集，特别是在已经出现相对大量的CD34+细胞，比如在与大剂量化疗相关的情况下。CD34+细胞还可以通过使用针对负选细胞上特有的表面标志物的抗体组合的负选方法来富集。优选的方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其使用针对被负选细胞上的细胞表面标志物的mAb的混合物(Cocktail)。
为了富集那些具有CD34表面抗原的细胞，可对单核细胞进行进一步的处理。Berenson等在文章“Engraftment After Infusion of CD34+Marrow Cells in Patients With Breast Cancer or Neuroblastoma”(Blood，Vol.77，No.8(1991)pp.1717-1722)中描述了CD34细胞抗原。这些细胞可以通过将其与CD34抗原特异性单克隆抗体温育、通过抗体缀合比如生物素来富集。这种mAb可以通过商业途径得到，比如从Dianova、Coulter或Becton Dickinson。将这些用单克隆抗体处理过的细胞装入免疫亲和柱中，比如，抗生物素蛋白免疫亲和柱，其中抗生物素蛋白结合mAb，从而结合了抗体的CD34+细胞也被结合。从免疫亲和柱上分离吸附的具有CD34表面抗原的细胞，并引入合适的培养基中。
同样，CD34抗原特异性mAb也能直接结合到固相(如小珠等)上以便固定CD34+细胞并从将其从混合物中分离出来。
另外，用荧光激活细胞分选仪也可能富集CD34+细胞，通过商业途径能够获得该仪器，比如从Becton Dickinson或Cytomation。在该方法中，动员的外周血祖细胞与具有荧光染料标记的抗CD34抗体反应。用荧光激活细胞分选仪可能分离细胞而获得CD34+细胞。用这种方法可以获得高度纯化的细胞。CD34+细胞还可以通过负选方法来富集，该方法使用针对负选细胞特有的表面标志物的抗体组合。优选的方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其使用针对负选细胞上的细胞表面标志物的mAb混合物。另外可通过使用磁珠来分离该CD34+细胞，该磁珠可以从Dynal、Baxter、Miltenyi和其它公司商业途径得到。
然后，富集的CD34+细胞可以用合适的培养基培养。该培养基的一个实例是含有10％人AB血清的补充PRMI1640培养基。该培养基也可以含有肝素化的自体血浆，比如在大约1％的浓度。添加了2mM L-谷氨酰胺、50μM β-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠、50μg/ml链霉素、50U/ml青霉素、MEM维生素和10％人AB血清或FBS的RPMI 1640培养基可以作为培养基使用。其它可以使用的培养基包括添加了合适的血清、维生素和氨基酸的X-Vivo15、X-Vivo20和AIM V。
在本发明的一个方面，前体APC来源是胚胎干细胞(ES细胞)。ES细胞可以如US Patent No 6,200,806(也可见Thomson，等人，Science，Vol.282，pp.1145-1147，Nov.6，1998)所述进行分离和培养。简要地，用于分离胚胎干细胞的优选的培养基是“ES培养基”。ES培养基由80％Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM；无丙酮酸，高葡糖配方，Gibco BRL)和20％血清、0.1mM β-巯基乙醇(Sigma)、1％非必需氨基酸储液(Gibco BRL)组成。组织培养皿优选地用0.1％明胶(type I；Sigma)处理。
根据本发明的某些方法，可以使用含有祖细胞来源的任何组织。该组织来源可以在培养之前进行处理以富集相对其它细胞类型的前体APC部分。这种预处理还可以除去那些与前体细胞增殖相竞争或抑制其增殖或存活的细胞。预处理还可以被用于使组织来源更适合于在体外培养，比如用研磨和/或酶消化。处理方法根据特异的组织来源而可能是组织特异的。例如如果用肾或骨髓作组织来源，就应该首先进行处理以便获得单个细胞，继而用合适的细胞分离技术从其它细胞类型中分离白细胞。血液的处理可以使用细胞分离技术从其它细胞类型包括RBC中分离白细胞。RBC的去除可以通过本领域技术人员已知的标准方法来完成。
在预处理的一种形式中，使那些竞争和阻碍前体APC增殖的细胞失去作用。这种预处理包括杀死表达抗原的细胞，这些抗原在前体细胞上不表达，方法是将细胞源暴露于含有添加物的培养基中的前体细胞上没有的抗原的特异性抗体。另外一种适合本发明使用的去除不需要细胞的预处理形式是将不需要的前体细胞或它们的祖细胞通过抗体吸附到固相支持物上，该抗体特异性地针对在不需要的细胞上表达的抗原。将细胞吸附到多种类型的固相支持物上的几种方法为本领域的技术人员所知并且适合本发明的使用。例如，可以用诸如培养皿的塑料表面进行“选淘(panning)”来去除不需要的细胞。另外其它合适的方法包括将细胞吸附到磁珠上通过磁力分离，或吸附到免疫珠上通过重力分离。未被吸附的细胞中前体细胞的比例增加，然后可以通过已知的方法包括选淘从吸附在固相支持物上的细胞中分离出来。这些预处理步骤能达到双重目的：它们破坏或恢复培养基中非APC细胞的前体，同时增加培养中竞争养料的APC前体的比例。前体细胞还可以通过浮力密度离心或淘析法(elutriation)来分离，例如，使用配备J5.0转头和40ml淘析箱的Beckman J6ME离心机。
还可以使用正选在培养中增加目的APC前体的比例。可以使用本领域技术人员已知的大量的免疫选择方法。例如在Current Protoclsin Immunology，John Wiley & Sons，New York，N.Y.中描述了这些技术。那些可以被用来正选APC前体的细胞表面标志物包括但不限于CD14、CD1a、CD40、CD86、CD54和MHCII类分子。根据一项实施方案，前体APC群可以用不同的方法，包括抗CD14包被珠或包被柱，而从血液制品中分离出来。APC还可以通过针对负选细胞上特有的表面标志物的抗体组合的负选方法进行富集。一种优选的方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其中使用针对负选细胞上的细胞表面标志物的mAb的混合物。
在本发明的一个实施方案中，通过与PBMC的预温育进行前体APC的分离，该PBMC是通过一种或多种无关或非抗体偶联的顺磁颗粒(一批细胞，一般1在大约5×108～2×1010个细胞之间，大约需要1瓶磁珠或4×109个磁珠)从全血或单采血液成分术的外周血中分离，在22℃～37℃温育约30分钟～2小时，然后通过磁性去掉那些已经粘附或吸入到顺磁颗粒上的细胞。本领域中能够得到的标准方法都可以用来进行这种分离。例如，可以使用任何磁性分离方法包括多种商业化产品(比如：DYNALMagnetic Particale Concentrator(DYNALMPC))。多种本领域一般技术人员已知的方法都可以用来监测分离的正确性，包括在该分离之前或之后使用流式细胞术分析CD14+细胞。
当把血液作为组织来源时，用能够维持细胞生存的常规方法可以获得白细胞。按照本发明的一个方面，将血液稀释到培养基中(优选RPMI)，其中可以有也可以没有肝素(约100U/ml)或其它合适的抗凝剂。血液和培养基的体积比为1∶1。在约1000rpm(150g)4℃离心培养基中的血液以浓集细胞。用本领域已知的任何可以裂解红细胞的溶液重悬细胞来去除血小板和RBC，比如氯化铵。例如混合物中培养基和氯化铵(终浓度大约在0.839％)的体积比为1∶1。离心浓集细胞，用所希望的溶液再洗两次直到获得基本没有血小板和RBC的白细胞群。在组织培养中普遍使用的任何等渗溶液都可以作为介质用于从血小板和RBC中分离白细胞。这些等渗溶液的实例是PBS、Hanks平衡盐溶液成完全生长培养基，包括例如RPMI 1640、DMEM、MEM、HAMS F-12、X-Vivo 15或X-Vivo 20。前体细胞还可以用淘析来纯化，比如用配备J5.0转头和40ml淘析箱的Beckman J6ME离心机。
本领域的技术人员应该容易理解这里所描述的细胞分离和培养的方法可以在多种环境中使用(例如容器)。实例包括多种袋子(如Lifecell培养袋)、培养瓶、摇瓶、生物反应器(如CellCube(CorningScience Products)or CELL-PHARM，(CD-Medical，Inc.of Hialeah，Fla.))、培养皿和用于组织培养的多孔板，或任何能够盛载细胞的容器，优选地在无菌环境中。在本发明的一个实施方案中也可以使用生物反应器。例如，几个制造商目前生产的设备就能够被用于生长细胞并且可以结合本发明的方法使用。比如，Celdyne Corp.，Houston，TX；Unisyn Technologies，Hopkinton，MA；Synthecon，Inc.Houston，TX；Aastrom Biosciences，Inc.Ann Arbor，MI；Wave Biotech LLC、Bedminster，N.J。另外，涉及这些生物反应器的专利包括U.S.PatentNos：6,096,532、5,985,653、5,888,807、5,190,878，这些专利在此处引用作为参考。
在本发明的某些方面，这里所描述的APC或活化的T细胞或其上清不要求是来源于自体来源。这样，所述的APC或活化的T细胞或其上清可以是从匹配的或不匹配的供体、或从细胞系、或T细胞系或其它体外生长的细胞中获得。单模标本(haplotype)的配型方法已为本领域所知。而且APC或活化的T细胞或其上清可以从异种来源中获得，例如小鼠、大鼠、非人类灵长类动物和猪细胞都可以使用。
产生未成熟pAPC的方法
通过处理组织来源获得的前体细胞，用添加了适当的细胞因子的培养基在适当的培养容器或器皿中可以培养成为初级培养物。根据本发明，该适当的培养容器或器皿可以是任何有组织培养相容表面的容器。实例包括多种袋子(如Lifecell培养袋)、培养瓶、摇瓶、培养皿和用于组织培养的多孔板。还可以使用用某种物质处理的表面，比如胶原成多聚L-赖氨酸或特异针对特定细胞类型的抗体以促进细胞粘附，只要其能使细胞进行差别粘附(如下所述)。表面也可以进行化学处理，例如离子化。细胞以起始浓度约105～107细胞/cm2铺板培养(plated)。在一个方面，细胞以106细胞/cm2铺板培养(plated)。
在本发明的方法中每一步骤所用的细胞生长培养基应该允许前体APC生存并分化为未成熟的以及然后是成熟的APC。只要在培养基中添加了适当的细胞因子，一般用于细胞培养的任何培养基都可以用于本发明的方法。根据本发明，该细胞因子可以是但不限于GM-CSF和白细胞介素4(IL-4)、或IL-13。其它可以加到生长培养基中的细胞因子和生长因子的实例是，但不限于，白细胞介素1α(IL-1α)和β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素3(IL-3)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干细胞因子(SCF)、白细胞介素6(IL-6)和Flt3-L。优选的培养基包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo20，其中加入了氨基酸和维生素，无血清或添加了适当量的血清(或血浆)或一组特定的激素，以及足以促进前体细胞分化为未成熟状态的许多细胞因子。在一个方面，培养基可以包括脂类和/或蛋白质来源。添加了1～5％人AB血清和GM-CSF和IL-4或IL-13的混合物的RPMI1640是优选的培养基，虽然其它细胞因子的混合物也可以使用。在其它血清中，比如胎牛(小牛)血清(FCS/FBS)，以其它血清浓度，或在无血清培养基中细胞也能适应并生长。比如，添加了激素的无血清培养基也适合培养APC前体。培养基可以但不是必须含有抗生素来减少培养中细菌的生长。优选的是青霉素、链霉素或庆大霉素或含有它们的组合物。培养了细胞的培养基或部分培养基应该周期性地补充以提供新鲜养料包括GM-CSF、IL-4、IL-13和/或其它细胞因子。
在一个实施方案中，该培养基可以含有趋化因子，包括但不限于IFN-γ可诱导的蛋白-10(gIP-10)、白细胞介素-8(IL-8)、血小板因子-4(PF4)、嗜中性白细胞活化蛋白(NAP-2)、GRO-α、GRO-β、GRO-γ、嗜中性白细胞活化肽(ENA-78)、粒细胞化学引诱蛋白-2(GCP-2)、基质细胞来源因子-1(SDF-1，或前B细胞刺激因子(PBSF))；和/或一种β(CC)趋化因子，其选自于：活化后可调节的、正常T细胞表达并可能分泌的因子(RANTES)、巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)、巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1β)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、单核细胞趋化蛋白-2(MCP-2)、单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)、单核细胞趋化蛋白-4(MCP-4)、巨噬细胞炎症蛋白-1γ(MIP-1γ)、巨噬细胞炎症蛋白-3α(MIP-3α)、巨噬细胞炎症蛋白-3β(MIP-3β)、eotaxin、Exodus和I-309；和/或γ(C)趋化因子、lymphotactin。根据不同的培养条件，趋化因子可以在不同浓度下使用，浓度范围在1ng/ml-10μg/ml。
根据本发明的一个实施方案，在生长培养基中GM-CSF使用浓度为约10-200ng/ml，或该范围内的任何整数值。一般使用浓度为100ng/ml。从骨髓中得到的细胞要求较高的GM-CSF浓度，因为其中有正在增殖的粒细胞，该细胞竞争可用的GM-CSF，因此优选用约50-400ng/ml的剂量培养从骨髓中获得的细胞，除非该细胞群经过预处理除去了粒细胞。
GM-CSF可以从天然来源中分离得到，用重组DNA技术或化学合成制备。这里使用的GM-CSF包括用任何方法和从任何物种中制备的GM-CSF。“GM-CSF”在此定义为自然产生(原初)的GM-CSF的任何有生物活性的类似物、片段或衍生物。GM-CSF的这些片段或衍生物应该也可以促进培养的APC前体的增殖。另外，有生物活性的GM-CSF肽可以通过它们结合适当的细胞类型上GM-CSF受体的能力来鉴定。
除GM-CSF外还可能需要在培养基中添加其它的细胞因子来进一步增加未成熟APC的产量。这些细胞因子包括但不限于G-CSF、M-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-4、IL6、IL-13、TNF-α、SCF和Flt3-L。细胞因子的用量能够通过增加未成熟APC前体的增殖或存活来有效增加培养物中未成熟APC的比例。在某些方面，细胞因子以下列浓度存在：IL-1α和β，1-100U/ml；TNF-α，5-500U/ml；IL-3，25-500U/ml；M-CSF，100-1000U/ml；G-CSF，25-300U/ml；SCF，10-100ng/ml；IL-4，4-100ng/ml和IL-6，10-100ng/ml。在其它方面，细胞因子的浓度是：IL-1α，50U/ml；TNF-α，50U/ml；IL-3，100U/ml；M-CSF，300U/ml和G-CSF，100U/ml。在相关方面，细胞因子是人类蛋白质。优选的细胞因子是用重组技术从人类基因制备的(rhu)。浓度在大约10-50U/ml的TNF-α可以几倍增加未成熟APC产量。
在一个实施方案中，使来自被选择的组织来源中的初级培养物在37℃，标准组织培养条件下的湿度、CO2和pH下培育，直到细胞群粘附到基质上足以能分离非粘附细胞。与单核细胞不同，血液中一些未成熟APC起初不能粘附在塑料上，特别是未成熟DC，这样所述前体可经过过夜培养后分离。单核细胞和成纤维细胞占粘附细胞的大部分，通常在大约30分钟到24小时内粘附到基质上。在某些方面，在约1-16小时之间将非粘附细胞从粘附细胞中分离出来。可在约1-2小时分离非粘附细胞。任何不会损失大量粘附细胞的方法都可以用于从非粘附细胞中分离粘附细胞。在某些方面，用简单的摇晃或吸打(pipetting)来去除细胞。最优选的是吸打。
根据本发明的方法分离的包括前体APC(如单核细胞)的粘附细胞在37℃，标准组织培养条件下的湿度、CO2和pH下培育，直到细胞群达到未成熟APC阶段。在某些方面，根据本发明，粘附细胞可以培养4小时到7天。然而，本领域的一般技术人员应该容易理解培养时间和条件是可以变化的。
根据本发明的一个方面，可以用活化的T细胞产生的上清来产生未成熟的APC(详述如下)。用这里所述的任何方法所活化的任何来源T细胞的上清都可以用来从前体细胞中产生未成熟APC。例如，用抗-CD3x抗-CD28磁珠刺激所激活的T细胞的培养上清，在第2～4天，优选第3天收集并冻存以便以后使用，或直接用于培养前体细胞。
根据本发明的一个方面，未成熟APC可以从上述选择的组织来源的非粘附群中直接分离出来。
在本发明的另一个方面中，未成熟APC可以用多密度梯度从外周血中直接获取，该多密度梯度产生于单一密度梯度材料，如在USPatent No 6,121,044中所述和如下详述。分离过程可以在两天内完成，而且优选地完全在无血清条件下完成。在富集的分离组分中未成熟APC的百分比可以通过除去污染细胞来进一步增加，比如使用固相基于抗体的负排除。这个方法基于基于密度的细胞类型分离和分化诱导的细胞类型密度的变化的结合。将含有未成熟APC的样品——比如从人类外周血得到的样品(如棕黄层)——在合适的缓冲液(比如无Ca++/Mg++PBS)中稀释，然后放到一种密度梯度材料或分离介质(优选地，密度在约1.0770+/-0.0010和渗透性在约310+/-15)上并离心。该步骤中密度梯度材料的实例包括但不限于“PERCOLL”(PharmaciaLKB，Uppsala，Sweden)制造的硅基Ficoll Equivalent Percoll(FEP)，以及Lymphoprep(Nycomed Laboratories，Oslo，Norway)。用任何适当的管子比如普通的50mL离心管就可以进行分离。
离心管中溶液的界面含有外周血单核细胞(PBMC)，该细胞可以用比如从界面吸取细胞的方法来收集。然后将PBMC重悬在合适的缓冲液中，比如D-PBS，离心去除血小板(留在上清中)。再将去除了血小板的PBMC重悬在合适的缓冲液中，比如D-PBS，然后放在密度梯度材料或分离介质(优选地，密度约1.0650+/-0.0010和渗透性在300+/-15)上并离心。该步骤中密度梯度材料的实例是硅基Monocytedepletion Percoll(MDP)。
在两种溶液界面中的细胞是初级单核细胞，而被浓集的细胞是初级淋巴细胞。单核细胞(界面)部分重悬在合适的培养基中，比如冷的混合的人AB血清，其中滴加等体加的80％AB血清20％二甲亚砜(DMSO)，冻存直到使用。
浓集的细胞包括去除了单核细胞的细胞组分，其中含有外周血淋巴细胞和未成熟APC。收集细胞、洗涤，比如用D-PBS室温离心，然后重悬在合适的培养基中。
按照本发明的方法，未成熟APC的富集组分可以通过以下方法获得：(i)从人血液样品中获取去除了单核细胞的细胞组分，其中含有外周血淋巴细胞和APC前体细胞，(ii)在无血清培养基中培养该细胞组分，经过足够的培养时间，使APC前体细胞发生形态学变化，使细胞具有更加成熟的APC形态，(iii)收集培养得到的非粘附细胞，并(iv)通过密度离心富集收集细胞中的APC部分，从而获得富集了未成熟APC细胞的组分。虽然本示例方法通过密度离心完成步骤(i)，但是本领域的一般技术人员应该理解用其它的方法也可以获得这种去除单核细胞的细胞组分。另外，这里所述的分离、富集和培养过程可以在一种密闭的设备/盒形结构中很方便地进行。在本发明的一个实施方案中，制备未成熟APC的过程可包括下列步骤：a)为了动员细胞，将GM-CSF、IL-4或IL-13结合或单独地按照常用的浓度给予病人。给予的GM-CSF、IL-4或IL-13的有效用量可以为每公斤体重0.1-500μg GM-CSF、IL-4或IL-13。更优选地，给予的有效用量为1μg-100μg，最优选地5-50μg GM-CSF、IL-4或IL-13每公斤体重；b)经过一段合适的时间，取出大约50-100ml的血液；或让病人接受单采血液成分术c)如果CD34+细胞含量低就可以采用Ficoll分离步骤；或洗涤单采血液成分术产物d)红细胞可被裂解；e)可以进行CD34分离程序，在一个实施方案中，该程序是一个免疫亲和步骤。在该方法中获得的未成熟APC可以进行进一步的处理，比如依据一定的目的，如这里所述，在有生长因子和/或细胞因子和/或活化的T细胞存在下成熟，然后重新输回病人体内。当需要相对大量的APC时，可以采用目的在于富集干细胞的单采血液成分术。
根据本发明的另一个方面，通过施用Flt3-L(见US patent Nos6,190,655和5,554,512)和/或可溶性CD40L(见U.S.Ser.No.08/477,733，U.S.Ser.No.08/484,624，US patent No 5,962,406)结合了药物上可接受的赋形剂，可以在体内产生未成熟APC。已经发现Flt3-L调节祖细胞和干细胞的生长和分化。CD40L是一种II型膜多肽，有一个C-末端细胞外区，一个跨膜区和N-末端的细胞内区。可溶性CD40L包括CD40-L的细胞外区域或其片段。Flt3-L和/或CD40L可以单独使用，也可以按顺序结合或共同结合选自上列细胞因子来使用。
Flt3-L和/或CD40L可以根据已知用于制备药物组合物的方法来配制。Flt3-L和/或CD40L可以要么作为单独的活性物质要么与其它已知的活性材料组合成混合物，其中还有药物上适合的溶剂(如Tris-HCl，乙酸盐，磷酸盐)、防腐剂(如Thimerosal、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)、乳化剂、助溶剂、佐剂和/或载体。合适的载体和其制剂在Remington’s Pharmaceutical Sciences，16th ed.1980，Mack Publishing Co.中描述。另外，这种组合物可包含与聚乙二醇(PEG)、金属离子复合的Flt3-L和/或CD40L、或加入多聚物如聚乙酸、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、水凝胶等、或加入脂质体、微乳剂、微胶粒、单层或多层囊泡、红细胞血影或球芽。这种组合物将会影响到Flt3-L和/或CD40L的物理状态、溶解性、稳定性、体内释放率和体内清除率。Flt3-L和/或CD40L还可以与组织特异性受体、配体或抗原的抗体缀合，或与组织特异性受体的配体偶联。
可以局部、肠胃外、或吸入给药Flt3-L和/或CD40L。术语“肠胃外”包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射、脑池内注射或输注技术。这些组和物一般含有有效量的Flt3-L和/或CD40，单独或结合有效量的任何其它活性物质。这种剂量和组合物中所需的药物浓度可依据许多因素而不同，包括使用目的、哺乳动物体重和年龄和用药途径。依据动物试验可以确定初步的剂量，再根据本领域承认的实践经验来计算人类用药的剂量。记住上面的描述，Flt3-L和/或CD40L的一般剂量范围在每平方米约10μg至每平方米约1000μg。优选的剂量范围是每平方米约100μg至每平方米300μg。
包括上述细胞因子、趋化因子、Flt3-L和/或CD40L的组合物可以以有效量给药。“有效量”是指能够在体内动员或产生APC的用量。本领域的技术人员应该清楚细胞因子或趋化因子的有效量取决于病人、剂量、细胞因子或趋化因子的用药程序、细胞因子或趋化因子是单独给药还是结合其它治疗剂给药、组合物的血清半寿期和病人的一般健康状况。优选地使用在包括药物上可接受的载体的组合物中的细胞因子或趋化因子。“药物上可接受的载体”是指不会引起用药病人任何不良作用的载体。这种药物上可接受的载体为本领域所熟知。
这里所述的正选方法可用于分离体内或体外产生的未成熟APC。也可以使用技术人员所知晓的大量的免疫选择方法。这种技术在如Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，New York.N.Y.中有叙述。用于正选未成熟APC的有用的标志物包括但不限于CD1a、CD40、CD86、CD54、MHCII类分子。在一个实施方案中，也可使用荧光激活细胞分选法分离所需的未成熟APC。
在本发明的一个方面，负选不要的细胞可用于富集样品中所需的未成熟APC的数量。本领域技术人员知道大量的免疫选择方法。这种技术在如Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，NewYork.N.Y.中有叙述。一种优选的方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其中使用针对负选细胞上细胞表面标志物的mAb的混合物。
未成熟pAPC的表型和功能
多种技术可以用于组织来源和细胞培养中细胞表型的性质鉴定。这些技术包括形态学分析、用mAb和细胞计数分析检查细胞类型特异性抗原、用氚标记胸腺嘧啶放射自显影确定增殖细胞、检测混合白细胞反应、以及证明细胞归巢。
在本发明的某些实施方案中，根据前体细胞的起源，未成熟APC，比如未成熟DC可以是CD14-或CD14+。未成熟DC也能够表达CD1a、CD40、CD86、CD54和中等水平的MHCII类分子。未成熟DC一般不表达CCR7或CD83。未成熟DC的功能是胞吞或吞噬抗原。随着细胞不断的成熟，抗原提呈也增加。
T细胞组合物
T细胞可以从许多来源中获得，包括PBMC、骨髓、胸腺、组织活检出物、肿瘤、淋巴结组织、消化道相关的淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、肾组织、或任何其它淋巴组织和肿瘤。T细胞可以从T细胞系和自体的或同种异体的来源中获取。T细胞还可以从异种来源物中获得，比如小鼠、大鼠、非人类灵长类和猪。
在本发明的某些实施方案中，本领域中能够得到的任何T细胞系都可以被使用。在本发明的某些实施方案中，T细胞能够用技术人员知晓的任何技术从受试者采集的一单位血液中获得，比如FICOLL分离。在一个优选的实施方案中，通过单采血液成分术或白细胞分离法可以从个体的循环血液中获取细胞。单采血液成分术产物一般含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、RBC和血小板。在一个实施方案中，通过单采血液成分术或白细胞分离法收集的细胞可以通过洗涤去除血浆组分，并将细胞放在一种合适的缓冲液或培养基中以进行后续的处理步骤。在本发明的一个实施方案中，细胞用PBS洗。在另一个实施方案中，洗涤溶液缺乏钙，也可能缺乏镁或许多如果不是所有的二价阳离子。本领域的一般技术人员应该容易理解采用本领域已知的方法可以完成洗涤步骤，比如按照制造商的使用说明使用半自动“极限沉降”离心(例如the Cobe 2991 cellprocessor，Baxter)。洗涤之后可将细胞重悬在不同的生物相容性缓冲液中，比如无Ca++/Mg++PBS中。另外，可以除去单采血液成分术样品中不需要的成分，并将细胞直接重悬在培养基中。
在另一实施方案中，T细胞可以通过前述的裂解RBC、分离并保存单核细胞而从外周血淋巴细胞中分离出来，或者例如用PERCOLLTM梯度离心。T细胞的特定亚群，比如CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD450+T细胞，能够用正选或负选技术进一步分离。例如，CD3+、CD28+T细胞能够用CD3/CD28缀合的磁珠(如DYNABEADSM-450 CD3/CD28TCell Expander)正选出来。例如，在一个优选的实施方案中，通过与抗-CD3/抗-CD28(即3×28)-缀合的磁珠温育，比如DYNABEADSM-450CD3/CD28T，经过足以正选出想要的T细胞的时间来分离T细胞。在一个实施方案中，时间是约30分钟。在另一个实施方案中，时间从30分钟-36小时或更长以及这之间的所有整数值。在另一个实施方案中，时间至少是1、2、3、4、5或6小时。而在另一个优选的实施方案中，时间是10-24小时。在一个优选的实施方案中，温育时间是24小时。为从白血病病人中分离T细胞，使用更长的温育时间，比如24小时，可以增加细胞产量。更长的温育时间可用于分离任何情况中的T细胞，这些状态中同其它类型细胞相比T细胞数量非常少，比如从肿瘤组织或从无免疫应答的个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。另外，用更长的温育时间能够增加俘获CD8+T细胞的效率。
能够用针对负选细胞上特有的表面标志物的抗体组合来通过负选富集T细胞群。优选的方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其中使用针对负选细胞上的细胞表面标志物的mAb混合物。例如为通过负选富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物一般包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。
为用正选或负选来分离所需的细胞群，细胞和表面(比如：颗粒，如小珠)的浓度是可以变化的。在某些实施方案中，可通过显著减少小珠和细胞混合在一起体积(即，增加细胞的浓度)，来保证细胞和小珠的最大接触。例如在一个实施方案中，使用浓度为20亿细胞/ml。在一个实施方案中，使用浓度为10亿细胞/ml。在另一个实施方案中，使用浓度大于1亿细胞/ml。在另一个实施方案中，使用浓度为10、15、20、25、30、35、40、45或50百万细胞/ml。而在另一个实施方案中，使用浓度为75、80、85、90、95或100百万细胞/ml。在另一实施方案中，使用浓度为125或150百万细胞/ml。用高浓度能够增加细胞产量、细胞活化和细胞扩增。另外，使用高细胞浓度可以更有效地俘获那些表达目的抗原能力弱的细胞，比如CD28-阴性T细胞，或从有许多肿瘤细胞存在的样品(即白细胞病血液、肿瘤组织等)中俘获细胞。这种细胞群可能有治疗价值，也是值得获取的。例如，用高浓度的细胞就能够更有效地选择CD8+T细胞，其通常有较弱的CD28表达。
在一个相关的实施方案中，可能采用低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，如小珠的颗粒)的混合物，颗粒和细胞之间的相互作用被减到最小。这种选择用于那些大量表达能够结合该颗粒的目的抗原的细胞，。例如，CD4+T细胞表达高水平的CD28，而且在稀浓度中比CD+8T细胞的俘获效率更高。在一个实施方案中，使用的细胞浓度是5×106/ml。在其它的实施方案中，使用浓度在约1×105/ml-1×106/ml，以及其间的任何整数值。
因此，在一个实施方案中，本发明使用顺磁颗粒，该颗粒大小足以被吞噬单核细胞吞入，继而通过磁场分离去除掉。在某些实施方案中，该顺磁颗粒是商业途径能够得到的珠球，比如Dynal AS制造的产品，商品名为DynabeadsTM。在这点上，可作为实例的DynabeadsTM是M-280、M-450和M-500。在一个方面，其它非特异性细胞可以通过用“无关”蛋白包被顺磁颗粒去除(例如血清蛋白或抗体)。无关蛋白和抗体包括不会特异性地靶向欲被扩增的T细胞的蛋白质和抗体或其片段。在某些实施方案中，该无关小珠包括包被了绵羊抗-小鼠抗体、山羊抗-小鼠抗体和人血清白蛋白的小珠。
另一个制备用于刺激的T细胞的方法是在洗涤步骤后冷冻细胞，该方法不需要去除单核细胞的步骤。不受理论的结束，通过从细胞群中去除粒细胞和在一定程度上去除单核细胞，冷冻和随后的融化步骤能够提供更加一致的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞重悬在冷冻溶液中。本领域已知许多冷冻溶液和参数，而且能够在这里使用，一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HAS)的PBS，或其它适当的细胞冻存介质。然后将该溶液用培养基按1∶1稀释，以使DMSO和HAS的终浓度分别为10％和4％。将细胞以每分钟1°的速率冷冻到-80℃并储存在液氮储存罐的蒸汽相中。也可以用其它可控制冷冻方法以及不控制冷冻直接到-20℃或放到液氮中。
本发明中活化的T细胞是通过诱导活化的细胞表面部分的连接来产生的。通过激活T细胞群和用结合辅助分子的配体刺激T细胞表面的辅助分子来产生活化的T细胞，例如见美国专利申请，题目是Simultaneous Stimulation and Concentration of Cells(2002年4月26日提交)，美国专利申请08/253,694，08/403,253，08/435,816，08/592,711，09/183,055，09/350,202和09/252,150，以及5,858,358和5,883,223，全文在此引用作为参考。
通常，可采用细胞表面部分的连接使T细胞活化，比如刺激T细胞受体(TCR)/CD3复合物或CD2表面蛋白。许多抗-人CD3 mAb能够从商业途径得到，一些实例是克隆BC3(XR-CD3；Fred HutchinsonCancer Research Center，Seattle，WA)、OKT3，由获自American typeCulture Collection的杂交瘤细胞制备，以及单克隆抗体G19-4。相似地，已知并能够得到抗-CD2抗体的刺激形式。用抗-CD2抗体通过CD2进行的刺激一般使用至少两种不同抗-CD2抗体的组合来完成。描述过的抗-CD2抗体的具有刺激作用的组合包括：T11.3抗体结合T11.1或T11.2抗体(Meuer等人，Ce1l 36：897-906，1984)，和9.6抗体(与T11.1抗体识别同样的表位)结合9-1抗体(Yang等人，J.Immnuol.137：1097-1100，1986)。也可以使用与上述任一抗体结合同样表位的其它抗体。另外的抗体或抗体组合能够用标准技术进行制备和鉴定。通过接触抗原、肽、蛋白质、肽-MHC四聚体(见Altman等人，Science 1996 Oct 4；274(5284)：94-6)、超抗原(如葡萄球葡萄肠毒素A(SEA)，葡萄球葡萄肠毒素B(SEB)，中毒性休克综合证毒素1(TSST-1))，内毒素、或通过不同的促分裂原，包括但不限于植物凝集素(PHA)、乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)和离子霉素、脂多糖(LPS)、T细胞促分裂原和IL-2，也可以完成刺激。
为了进一步地激活T细胞群，使用结合辅助分子的配体来刺激诸如CD28的T细胞表面上的协同刺激或辅助分子。因此，本领域的一般技术人员应该认识到，任何物质，包括能够交联CD28分子的抗-CD28抗体或其片段，或CD28的天然配体都能够被用于刺激T细胞。本发明中举例使用的抗-CD28抗体或其片段包括单克隆抗体9.3(IgG2a)(Bristol-Myers Squibb，Princeton NJ)、单克隆抗体KOLT-2(IgG1)、15E8(IgG1)、248.23.2(IgM)、克隆B-T3(XR-CD28；Diaclone，Besancon，France)和EX5.3D10(IgG2a)(ATCC HB11373)。实例天然配体包括B7家族蛋白质，比如B7-1(CD80)和B7-2(CD86)(Freedman等人，J.Immunol.137：3260-3267，1987；Freeman等人，J.Immunol.143：2714-2722，1989；Freeman等人，J.Exp.Med.174：625-631，1991；Freeman等人，Science 262：909-911，1993；Azuma等人，Nature 366：76-79，1993；Freeman等人，J.Exp.Med.178：2185-2192，1993)。
另外，天然配体的结合同源物，无论是天然的还是通过化学或重组技术合成的，也能用于本发明。其它物质可能包括天然的和合成的配体。所述物质可以包括但不限于其它抗体或其片段、肽、多肽、生长因子、细胞因子、趋化因子、糖肽、可溶性受体、类固醇、激素、促分裂原，比如PHA、或其它超抗原。
产生pAPC的方法
本发明的成熟APC是通过将活化的T细胞暴露于未成熟的APC中来制备的，其中可以有抗原也可以没有抗原，可以在体外也可以在体内，该未成熟的APC是按照本发明的方法制备的。在一个实施方案中，将未成熟APC铺在培养皿中，并暴露于足够量的抗原和经过足够的时间以使抗原结合APC和/或被APC吸收。在某些方面，活化的T细胞和抗原暴露于未成熟APC中，时间为24小时到4天。使APC完成抗原结合和吸收所需的用量和时间可用免疫测定和结合测定来确定。本领域技术人员已知的其它方法也可以用来检测APC接触抗原后在APC上MHC抗原的存在。
根据本发明，抗原来源可以是但不限于蛋白质，包括糖蛋白、肽、超抗原(比如：SEA、SEB、TSST-1)抗体/抗原复合物、肿瘤裂解物、不溶性细胞残片、凋亡小体、坏死细胞、从肿瘤中得到的完整肿瘤细胞或细胞系，该细胞经过处理以使它们不能继续分裂、经处理不能继续分裂的同种异体细胞、辐射的肿瘤细胞、辐射的同种异体细胞、天然的或合成的复合碳水化和物、脂蛋白、LPS、RNA或该RNA的翻译产物、和DNA或由该DNA编码的多肽。非转化细胞一般用约3000-3600拉德(rad)的γ射线照射，更优选约3300拉德。类淋巴母细胞或肿瘤细胞系一般用约6000-10,000拉德的γ射线照射，更优选约8000拉德。用物理、化学或生物的方法可以产生坏死和凋亡细胞。坏死细胞一般用冻融法来制备，而凋亡细胞采用UV照射来制备。UV和γ射线照射以及冻融法为本领域所知晓，并在文献如Current Protocols inMolecular Biology or Current Protocols in Immunology，John Wiley& Sons，New York.N.Y.中有叙述。
本发明的APC可以通过基因修饰来带有抗原。基因修饰可以包括使用本领域已知的任何技术进行的RNA或DNA转染，例如电穿孔(如使用the Gene Pulser II，BioRad，Richmond CA)、多种阳离子脂质(LIPOFECTAMINETM，Life Technologies，Carlsbad，CA)，或其它技术如在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，New York.N.Y.中叙述的磷酸钙转染。例如，将溶在500μlOpti-MEM中的5-50μg的RNA或DNA与浓度10-100μg的阳离子脂质混合，并在室温中温育20-30分钟。其它合适的脂质包括LIPOFECTINTM和LIPOFECTAMINETM。将形成的核酸-脂质复合物加到总体积约2ml(如在Opti-MEM中)1-3×106细胞，优选地是2×106的APC中，在37℃中温育2-4小时。该APC还可以用下述病毒转导的方法进行转导。
抗原来源也可以包括非转化的、转化的、转染的或转导的细胞或细胞系。可以使用从事表达重组抗原的本领域一般技术人员已知的多种的表达载体或逆转录病毒载体中的任一种来进行细胞的转化、转染或转导。还可以用任何适当的宿主细胞来实现表达，该宿主细胞已经用含有编码重组抗原的DNA分子的表达载体或逆转录病毒载体进行了转化、转染或转导。可以使用本领域技术人员已知的任何转染、转化和转导方案，例如在Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，New York.N.Y.中或在商业上能够得到的大量试剂盒(如Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)中所述。在本发明的一个实施方案中，重组牛痘载体和用该牛痘载体感染的细胞可以用作抗原来源。重组抗原可以包括任何下述确定肿瘤抗原。
根据本发明的某些方法，抗原可以包括确定的肿瘤抗原，诸如黑色素瘤抗原Melan-A(也指T细胞或MART-1识别的黑色素瘤抗原)、黑色素瘤抗原编码基因1、2和3(MAGE-1、-2、-3)、黑色素瘤GP100、癌胚抗原(CEA)、乳腺癌抗原、Her-2/Neu、血清前列腺特异性抗原(PSA)、Wilm’s Tumor(WT-1)、粘蛋白抗原、MUC-1、-2、-3、-4和B细胞淋巴瘤独特型。
在本发明的一个方面，活化的T细胞(或其上清)，如在全文在此引用作为参考的、题目为Simultaneous Stimulation andConcentration of Cells(2004年4月26提交)的美国专利申请、美国专利申请08/253,694、08/403,253、08/435,816、08/592,711、09/183,055、09/350,202和09/252,150以及5,858,358和5,883,223中描述的，可以单独或结合细胞因子直接加到前体APC中，并用于pAPC的成熟，从前体APC阶段经过未成熟APC阶段到成熟pAPC阶段。在未成熟APC阶段可以加也可以不加抗原。活化的T细胞一般以约0.1T细胞/APC至约20T细胞/APC和该范围中任何整数值的比率来添加。优选地，活化的T细胞以1T细胞/APC-10T细胞/APC的比率添加。本领域的一般技术人员应该理解理想的比率可以用本领域已知的技术来确定。
在本发明的一个实施方案中，活化的T细胞可以在加入抗原同时或之后添加。
根据本发明的一个方面，成熟APC可以只用活化的T细胞的上清来制备。用这里所述的任何方法激活的任何来源的T细胞的上清都可以用于从前体细胞中制备未成熟的APC。例如，可以在第1-4天，优选地第2-3天，收集用抗-CD3x抗-CD28磁珠刺激激活的T细胞的培养上清并冻存为以后使用，或直接用于培养前体细胞，或同抗原一起或在没有抗原时加入到未成熟的APC中。
在本发明的一个实施方案中，通过给予活化的T细胞在体内产生成熟的pAPC，所述细胞要么单独给予要么结合细胞因子或趋化因子或在给予细胞因子或趋化因子后给予，细胞因子成趋化因子包括但不限于GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、CD40L MIP1-α和RANTES。在本发明的一个实施方案中，通过给予一种药物组合物在体内动员APC，该组合物包括有效量(即足以动员APC的量)的一种成多种上述趋化因子和细胞因子，其包括但不限于IL-8、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、lymphotactin、G-CSF、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L和CD40L。优选地，该趋化因子和细胞因子已经被纯化。药物组合物的给予方法在“药物组合物”部分中进行了叙述。
在本发明的一个实施方案中，APC的体内成熟是通过活化的T细胞和APC(在体内产生或在体外产生)的共定位(co-localization)来完成的，而共定位是通过使用顺磁珠和在靶组织内部或外部应用磁力完成的(例如在美国专利No 6,203,487中所述，全文在此引用作为参考)。简要地，在体内或体外或两者结合的情况下，将活化的T细胞和正在成熟或成熟的APC暴露于缀合了适当表面标志物的顺磁珠中以使细胞结合顺磁颗粒。如果在体外进行，给予哺乳动物包括结合于顺磁颗粒的细胞和药物上可接受的赋形剂的组合物。可将磁体放在靶组织附近，即，身体或被选组织或器官的区域，该区域要求有局部的细胞传输。磁体可以置于体表表面或通过手术安放在身体内部，或经皮的方法在靶组织内部或外部，用于局部传输。将结合了细胞的磁性颗粒，要么通过直接注射传输到被选组织，要么传输到输远的位置，并被动地循环到靶位置或用磁体或靶向配体主动地导向靶位置。
根据本发明，成熟的APC的特征在于能激活原初T细胞。另外，如用mAb染色和流式细胞术分析所测量的，成熟的APC可以表达CD40、CD54、CD80、CD83、CD86、CCR7、ICAM-1、CD1a和高水平的MHCII类分子。在本发明的一个方面，APC成熟时不表达CD14。
本发明中细胞群的表型特性可以用许多不同的方法监测，包括显微镜、原位杂交、原位聚合酶链式反应(PCR)、标准流式细胞术、酶联免疫吸附沉淀(ELISA)和本领域技术人员已知的其它方法。
在本发明的一个方面，任何成熟阶段的APC都可以用本领域已知的方法进行基因修饰。APC可以用许多本领域一般技术人员已知的RNA或DNA表达载体进行转染。基因修饰包括用本领域已知的任何技术进行的RNA或DNA转染，例如电穿孔(使用如the Gene Pulser II，BioRad，Richmond CA)、各种阳离子脂质(LIPOFECTAMINETM，Life Technologies，Carlsbad，CA)，或其它技术如在Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York.N.Y.中所述的磷酸钙转染。例如，将溶在500μl Opti-MEM中的5-50μg的RNA或DNA与浓度为10-100μg的阳离子脂质混合，并在室温中温育20-30分钟。其它合适的脂质包括LIPOFECTINTM和LIPOFECTAMINETM。将形成的核酸-脂质复合物加到总体积约2ml(如在Opti-MEM中)1-3×106细胞，优选2×106的APC中，在37℃温育2-4小时。该APC还可以用下述病毒转导的方法进行转导。
APC还可以用逆转录病毒转导技术进行基因修饰。在本发明的一个方面，逆转录病毒载体可以是兼嗜性逆转录病毒载体，优选地是有长末端重复序列(LTR)的载体，如来自莫洛尼鼠类白血病毒(MoMLV)、骨髓组织增殖肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾脏病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AVV)的逆转录病毒。大多数的逆转录病毒载体来源于鼠逆转录病毒。然而，根据本发明，适合使用的逆转录病毒可以来源于任何禽类或哺乳动物细胞来源。这些逆转录病毒优选地是兼嗜性的，意思是它们能够感染几个物种的宿主细胞，包括人类。在一个实施方案中，用待表达的基因替代逆转录病毒的gag、pol和/或env序列。已经报道过许多例证性的逆转录病毒系统(例如，U.S.Pat.Nos.5,219,740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7：980-990；Miller，A.D.(1990)Human Gene Therapy 1：5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180：849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3：102-109).
在本发明的另一个方面，成熟的APC是用这里所述的正选或负选方法从活化的T细胞中分离出来。同样地，活化的T细胞可以用正选或负选方法从成熟的APC中分离出来。
药物组合物
本发明的另一个方面提供正在成熟和/或成熟的pAPC群或组合物。在一个相关的实施方案中，本发明提供了正在成熟和/或成熟pAPC和/或活化的T细胞群或组合物。
本发明进一步提供了一种药物组合物，包括正在成熟的和/或成熟的APC以及药物上可接受的载体。本发明的组合物可以单独给药，也可以作为一种药物组合物结合稀释剂和/或其它成分比如IL-2或其它细胞因子或细胞群给药。简要地，本发明的药物组合物可以包括这里所述的靶细胞群，并结合一种或多种药物或生理上能够接受的载体、稀释剂或赋形剂。这种组合物可以包括缓冲液诸如中性缓冲的盐水、PBS等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸比如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂比如乙二胺四乙酸(EDTA)或谷光甘肽；佐剂(比如氢氧化铝)；和防腐剂。在某些方面，配制适于静脉给药的本发明的组合物。
本发明的一个相关的实施方案进一步地提供了一种药物组合物，包括正在成熟的和/或成熟的APC、活化的T细胞和药物上可接受的载体。该药物上可接受的载体应该用本领域技术人员已知的技术灭菌。
本发明的药物组合物可以用适合被治疗(或预防)的疾病的方式给药。虽然临床实验可以确定合适的用量，但是给药的用量和频率仍然要依据一些因素而定，比如病人的状况、病人所患疾病的类型和严重程度。
本发明还提供了预防、抑制或减少动物体内癌或恶性细胞的存在的方法，包括给予动物抗癌有效量的成熟的和/或正在成熟的APC，其中可以有也可以没有活化的T细胞。
本发明所考虑的癌症可以包括但不限于黑色素瘤、非-何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病、白血病、浆细胞瘤、肉瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肾癌、肾细胞癌、胰腺癌、食管癌、脑癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、鼻咽癌、ALL、AML、CML、CLL和其它本领域已知的肿瘤，针对这些癌可以诱导免疫应答、或使癌得到预防、抑制、或减少。
另外，这里所述的组合物可以被用于诱导或增强对病原生物体的应答，诸如病毒(如单链RNA病毒、单链DNA病毒、双链DNA病毒、HIV、甲、乙、丙型肝炎病毒、HSV、CMV、EBV、HPV)、寄生虫(例如：原生动物和后生动物，如疟原虫种，Leishmania种，Schistsoma种，Trypanosoma种)，细菌(如，分枝杆菌属，沙门氏菌属，链球菌属，大肠杆菌，葡萄球菌属)，真菌(如：假丝酵母种，曲霉种)和Pneumocystis carinii。
通过给予本发明的组合物在动物体内诱导的免疫应答可以包括由细胞毒T细胞介导的细胞免疫应答，它能杀死肿瘤和被感染的细胞，以及辅助T细胞应答。还可以诱导由B细胞起始介导的体液免疫应答，该B细胞能够在被辅助T细胞活化后产生抗体。可用许多技术分析由本发明的组合物诱导的免疫应答的类型，这些技术在本领域中有详细的描述，比如Coligan等人，Current Protocols in Immunology，JohnWiley & Sons Inc.(1994)。
当在使用“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗有效量”时，本发明组合物给药的精确用量可以由医生根据个体的不同情况来确定，包括年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的范围以及病人的状况。一般规定包含本发明的正在成熟和/或成熟pAPC以及有或没有活化的T细胞的药物组合物的给药剂量为104-107APC/kg体重，优选地105-106APC/kg体重，包括这些范围内的所有整数值。APC组合物也可以以该剂量多次给药。用免疫治疗中普遍知晓的输注技术给药这些细胞(见，比如Rosenberg等人，New Eng.J.ofMed.319：1676，1988)。本医药领域的技术人员通过监测病人的病征并相应调整治疗，可以容易地确定特定病人最佳的剂量和治疗方案。
一般地，在过继免疫治疗研究中，给予病人活化的T细胞大约2×109-2×1011细胞(如见，U.S.Pat.No.5,057,423)。在本发明的一些方面，特别是使用同种异源或异种细胞时，给予低数量的细胞，106/公斤(106-1011每人)。可以该范围内剂量多次给药T细胞组合物。基于正在成熟的或成熟的APC的治疗方法可以结合其它的方法，比如直接给予本发明中活化的T细胞。活化的T细胞和正在成熟的和/或成熟的APC对于正在接受治疗的病人可以是自体的也可以是异体的。如果需要，治疗还可以包括给予这里所述的促分裂原(如PHA)或淋巴因子、细胞因子和/或趋化因子(如GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1-α等)来增强免疫应答的诱导。
可以用任何方便的方法给予本发明的药物组合物，包括气溶胶吸入、注射、摄食、输液、植入或移植。本发明的组合物可以采用皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射或腹膜内注射等方式为病人给药。本发明的APC组合物优选地采用皮内或皮下注射给予病人。本发明T细胞组合物优选地使用静脉注射给药。该正在成熟的或成熟的APC或活化的T细胞组合物可以直接注射到肿瘤或淋巴结。
然而在另一个实施方案中，可以在一种可控的释放系统中传递药物组合物。在一个实施方案中，可以使用一种泵(见Lange，1990，Science 249：1527-1533；Sefton 1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald等人，1980；Surgery 88：507；Saudek等人，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一个实施方案中，可以使用多聚体材料(见Medical Application of ControlleolRelease，1974，Langer and Wise(eds.)，CRC Pres.，BocaRaton，Fla.；Controlled Drug Bioavailability，Drug ProductDesign and Performance，1984，Smolen和Ball(eds.)，Wiley，NewYork；Range和Peppas，1983；J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；也见Levy等人，1985，Science 228：190；During等人，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等人，1989，J.Neurosurg.71：105)。在另一个实施方案中，可以将可控制的释放系统置于治疗靶点的近旁，这样只需要全身剂量的一部分(如见，MedicalApplications of Controlled Release，1984，Langer和Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，Fla.，vol.2，pp.115-138)。
本发明的正在成熟和/或成熟APC和T细胞组合物还可以用任何基质给药。在组织工程中基质已经使用了很多年(如见Principles ofTissue Engineering，Lanza，Langer，和Chick(eds.)，1997)。本发明在作为人工淋巴样器官的新的情况内利用该基质，一般通过T细胞的调节支持、维持或调节免疫系统。因此，本发明可以利用那些在组织工程中已经使用的基质组合物和制剂。因此，在本发明的这些组合物、装置和方法中可能使用的基质类型基本上是没有限制的，而且可能包括生物的和合成的基质。在一个具体的实例中，使用了美国专利5,980,889；5,913,998；5,902,745；5,843,069；5,787,900；或5,626,561中所阐述的组合物和装置，这些专利全文在此引用作为参考。基质所包含的特点一般与给予哺乳动物宿回主时的生物相容性有关。基质可以由天然或合成的材料形成。在希望在动物体内留下持久或可移动的结构如移植体情况下基质可以是非生物可降解的；或基质也可是生物可降解的。该基质可以具有海绵、移植体、管、telfa pads、纤维、空心纤维、冻干成分、凝胶、粉末、有孔组合物或纳米颗粒等形状。另外，基质能够被设计为可以持续释放接种的细胞或制备的细胞因子或其它活性剂。在某些实施方案中，本发明的基质是柔韧的和有弹性的，而且可以被描述为一种半固体支架，该支架对诸如无机盐、水性流体和溶体的气体物质包括氧气等物质是可渗透的。
此处所用的基质是是生物相容性物质。然而，本发明并不限制基质，而且无论术语基质在哪里出现，该术语都应该被理解为包括允许细胞贮留或细胞往返移动的装置和其它物质，是生物相容性的，而且能够允许大分子物质往返移动，该大分子要么是直接穿过为半渗透膜的物质要么与特殊的半渗透物质结合使用。
在本发明的一个方面，正在成熟的和/或成熟的APC可以与肿瘤细胞融合而形成杂交细胞组合物在这里称为“杂合细胞”、“树突/肿瘤细胞融合体”或“APC/肿瘤细胞融合体”(如见Kugler，等人，2000，Nature Medicine，6(3)：332-336；PCT专利申请WO9630030)。用本领域已知的技术可以从原始肿瘤样品中制备单细胞悬液。也可以使用这里描述的任何肿瘤细胞系或任何癌来源的细胞。例如，肿瘤细胞和正在成熟的和/或成熟的APC可以重悬在适当浓度的葡萄糖溶液并用Gene Pulser II electroporator(BioRad，Richmond，CA)进行电穿孔。在大约100V/cm下作用5～10秒，排列细胞形成细胞-细胞缀合体(Conjugates)，可以完成电融合。在第二个步骤中，用约1,200V/cm，25μF的脉冲融合排列的细胞。本领域技术人员容易认识可能有必要优化电穿孔的条件，包括电穿孔缓冲液、电压、电容和衰减时间。本发明可使用这种融合细胞组合物，单独地或者结合正在成熟的和/或成熟的APC，和/或活化的T细胞，而在体内或体外产生免疫应答。
在本发明的一个实施方案中，正在成熟的和/或成熟的APC可以用于在体外或体内产生抗原特异性的T细胞。T细胞可以用如前所述的带有抗原的APC来刺激。在能够产生特异性地针对目的抗原的T细胞的条件和足够的时间下来进行这种刺激。例如，可将T细胞(5×106细胞/ml)和带有抗原APC(2.5×105细胞/ml)在96孔U形底培养板中以20∶1的比率、用这里描述的常规培养基培养(其中添加了5-10％血清、1mM丙酮酸钠、加或不加100IU/ml青霉素、加或不加100μg/ml链霉素、以及5×10-5Mβ-巯基乙醇)。5天后，用标准的4小时铬释放测定可以检验细胞抗原特异性。用本领域已知的技术可以进一步等增抗原特异性T细胞(如美国专利5,827,642所述)。T细胞在用带有抗原的APC刺激后再用如实施例中所描述的抗-CD3/抗-CD28磁珠进行刺激，可以进一步增加所需的抗原特异性T细胞的扩增。
本文中所有提到的参考文献都在此全文引用以作参考。而且，这里使用的所有数值范围都明确地包括所有位于该范围的整数值，同时根据特殊的用途选择该范围的特异性数值。另外，下面的实施例用来说明而绝非限制本发明。
实例1
T细胞刺激
在这里所描述的某些实验中，使用称为XCELLERATE I TM的方法。简单来说，在该方法中，由外周血单核细胞(PBMC)单采血液成分术产物制备该XCELLERATED T细胞。在从临床病人中收集PBMC单采血液成分术产物后洗涤，然后与“未包被”的DYNABEADS M-450 Epoxy一起温育。在这期间吞噬细胞如单核细胞摄入小珠。温育后，将该细胞和小珠用MaxSep Magnetic Separator处理以便去除小珠和任何附着在小珠上的单核细胞/巨噬细胞。在该单核细胞去除步骤之后，取出总量5×108CD3+的T细胞并与1.5×109 DYNABEADSM-450 CD3/CD28 TCell Expander来起始XCELLERATETM过程(小珠与T细胞的比约3∶1)。将细胞和DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T Cell Expander的混合物在37℃，5％CO2中培育约8天来制备XCELLERATED T细胞以进行第一次输入。剩下的去除单核细胞PBMC冷藏直到第二次或进一步的细胞产物扩增(约21天后)，此时将其融化、洗涤然后取出总量5×108CD3+的T细胞并与1.5×109DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T Cell Expander来起始XCELLERATE过程以进行第二次输入。在约8天、37℃、5％CO2条件下的培育期间，CD3+T细胞活化并扩增。抗-CD3 mAb(克隆BC3；XR-CD3)是从Fred Hutchinson Cancer Research Center，Seattle，WA处获得，抗-CD28 mAb(克隆B-T3；XR-CD28)是从Diaclone(Besancon，France)处获得。
将上述方法进行一些修饰后来使用，即称为XCELLERATE II TM的修改方法，其中没有使用分离单核细胞去除步骤，而且在某些过程中细胞在开始接触小珠之前就冷冻，然后进行进一步的浓集和刺激。在该方法的一种形式中，T细胞从供体或病人的循环血中用单采血液成分术获得。单采血液成分术产物的成分一般包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核细胞(白细胞)、RBC和血小板。一般的单采血液成分术产物包括1-2×1010个有核细胞。该细胞用无钙、无镁PBS洗涤来除去血浆蛋白和血小板。通过离心细胞去上清然后更换PBS来进行洗涤步骤。用半自动“极限沉降”离心(COBE 2991 System，Gambro BCT，Lakewood，CO)来完成该过程。在操作过程中细胞保持在一种密闭的系统中。
对细胞进行进一步的处理去除未结合的细胞包括单核细胞，(富集活化的细胞)然后继续进行刺激。另外，可将洗涤后的细胞冷冻、保存并在以后处理，此处表明可以增加增殖和去除粒细胞的能力。在一个实施例中，将35ml细胞悬液和35ml冻存液放在一个250mlCryocyteTM冷冻袋(Baxter)中来冷冻细胞。该35ml细胞悬液一般包括在PBS中的3.5×109-5.0×109个细胞。加入等体积的冻存液(20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS)。细胞终浓度为50×106细胞/ml。细胞冻存袋(Cryocyto bag)可以容纳的体积为30-70ml，细胞浓度为10-200×106细胞/ml。一旦细胞冻存袋充满了细胞和冻存液，就将袋子放入可控速率冷冻器中，以每分钟1℃的速度下降到-80℃冷冻细胞。然后将冷冻细胞置于液氮储存体系中直到需要。
将细胞从液氮储存系统中取出在37℃下融化。在COBE 2991系统中用无钙无镁的PBS洗涤融化的细胞以除去DMSO。然后让洗涤过的细胞通过80微米网孔滤器。
将融化的细胞，约0.5×109个CD3+细胞，放入塑料的1L Lifecell袋中，其中装有100ml无钙无镁的PBS。该PBS含有1％-5％人血清。1.5×109个CD3xCD28小珠(Dynabeads M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)也被放入装有细胞的袋子中(3∶1 DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T CellExpander：CD3+T细胞)。室温1rpm(立式旋转(end-over-endrotation))约30分钟，混合小珠和细胞。将装有小珠和细胞的袋子置于MaxSep Magnetic Separator(Nexell Therapeutics，Irvine，CA)上。在袋子和MaxSep之间放置一个塑料间隔物(约6mm厚)(可以去掉该间隔物来增加磁力的强度)。小珠和任何附着在小珠上的细胞都保留在磁体上，而PBS和未结合的细胞都被泵走。
该CD3xCD28小珠和结合在珠球上被浓集的细胞在一个3L的Lifecell培养袋中用细胞培养基漂洗(1升含有X-Vivo 15，BioWhittake；50ml热灭活混合人血清，20ml 1M Hepes，10ml 200mML-谷氨酰胺，有或没有约100,000 I.U.IL-2)。将CD3xCD28小珠和正选的细胞转移到Lifecell袋后，加入培养基直到袋中含有1000ml。将装有细胞的袋子放在孵箱中(37℃和5％CO2)扩增细胞，必要时分开(Splitting)细胞。
培养3和8天后，通过收集细胞测定T细胞的活化和增殖。通过测量细胞的大小、细胞表面标志物的表达水平，特别是培养第3天CD25和C154的表达，可以评价T细胞的活化。让第8天的细胞在重力作用下(约150ml/min)流过MaxSep磁体来去除磁性颗粒，用前面提到的COBE装置洗涤并浓集细胞，再重悬在一种适合静脉给药的平衡电解质溶液中，比如Plasma-Lyte A(Baxter-Healthcare)。
可见，XCELLETATE I TM是指与上面的相似的反应条件，除了不进行刺激和浓集，而再刺激之前进行单核细胞的去除。
从4名供体得来的单核细胞去除的PBMC用偶联CD3xCD28小珠(Dynabeads M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)刺激。上清中IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ的浓度按表1-4所列时间用ELISA进行测定。IL-4、TNF-α和IFN-γ的浓度还可以在第12天用新的DynabeadsM-450 CD3/CD28 T Cell Expander重新接种细胞后测定(再刺激)。
如表1、表2和表3所示，在Xcellerate和再刺激的过程中，在不同天数中用ELISA测定IFN-γ、IL-4和TNF-α的浓度。
表1：Xcellerate处理第3天以及Xcellerate激活的T细胞再刺激的第2天T细胞产生的干扰素-γ
 Xcellerate处理第3天[IFN-γ]ng/mL 再刺激第2天[IFN-γ]ng/mL
 平均     13.61     31.59
 范围     7.99-27.11     10.8-95.5
 标准Dev.     5.64     22.98
 中值     11.95     26.4
 N     24     24
用抗-CD3和抗-CD28偶联的Dynabeads M-450 Epoxy(Dynabeads CD3/CD28 T Cell Expander)刺激来自3名供体的吞噬细胞去除的PMBC(Xcellerate)。在第二天用ELISA测定上清中IFN-γ的浓度。第12天，用新的抗-CD3和抗-CD28偶联的Dynabeads M-450 Epoxy重新接种细胞(再刺激)并在两天后测定IFN-γ的浓度。
表2：Xcellerate处理第3天以及Xcellerate激活的T细胞再刺激的第2天T细胞产生的IL-4
 Xcellerate处理第3天[IL-4]pg/ml 再刺激第2天[IL-4]pg/ml
  平均      310     274
  范围      170-460     50-500
  标准Dev.      143     224
  中值      297     268
   N      3     3
用抗-CD3和抗-CD28偶联的Dynabeads M-450 Epoxy刺激来自3名供体的吞噬细胞去除的PMBC(Xcellerate)。在第3天用ELISA测定上清中IL-4的浓度。第12天，用新的抗-CD3和抗-CD28偶联的Dynabeads M-450 Epoxy重新接种细胞(再刺激)并在两天后测定IL-4的浓度。
表3：Xcellerate处理第2天和第4天以及Xcellerate激活的T细胞再刺激的第2天和第4天T细胞产生的TNF-α
                第2天                第4天
  Xcellerate[TNF-α]ng/mL     再刺激[TNF-α]ng/mL     Xcellerate[TNF-α]ng/mL     再刺激[TNF-α]ng/mL
    平均     1.710     0.594     1.635     0.252
    范围     1.11-2.81     0.299-0.782     1.09-2.5     0.21-0.288
  标准Dev.     0.762     0.211     0.534     0.036
    中值     1.460     0.647     1.55     0.255
    N     4     4     4     4
用抗-CD3和抗-CD28偶联的Dynabeads M-450 Epoxy刺激来自4名供体的吞噬细胞去除的PMBC。上清中TNF-α的浓度在第2天和第4天用ELISA测定。第12天，用新的抗-CD3和抗-CD28偶联的Dynabeads M-450 Epoxy重新接种细胞(再刺激)并在2天和4天后测定TNF-α的浓度。
用流式细胞术分析Xcellerated的T细胞上CDw137(41BB)、CD154(CD40L)和CD25的表达水平，以平均荧光作图，分别如图5、图6和图7所示。如图5所示，CDw137(4-1BB)的表达水平增加并在第4天达到峰值，然后逐渐降低。在再刺激之后，CDw137的表达迅速增加。图6证实CD40L的表达逐渐增加直到第7天然后降低。然而在再刺激之后，CD40L的表达迅速增加并且达到比起始刺激期间更高的水平。CD25的水平增加到第3天然后逐渐降低直到第8天(分析的最后时间点)(图7)。
                         实例2
    用标准方法和XCELLERATE方法制备的成熟树突细胞的形
                        态学比较
方法：将新鲜的白细胞分离法产物用含有5％人血清的RPMI洗涤两次。将PBMC重悬并培养在RPMI中，其中添加了5％人AB血清、L-谷氨酰胺和1×pen-strep，用组织培养瓶以1×106细胞/cm2在37℃和5％CO2下培养约1-2个小时或直到单核细胞粘附到培养瓶。这之后，温和地除去未粘附细胞并换如上的新鲜RPMI，其中加有100ng/mlGM-CSF和60ng/ml IL-4。其后每两天更换一次培养基。在培养的第6天，设立3个不同的培养条件：一个培养瓶中，将从同样白细胞分离法产物中制备的第2或第3天(day 2/3)XCELLERATETM激活的T细胞(见专利申请09/794/230)加到未成熟DC中，比率为5T细胞/DC，培养基中含有GM-CSF和IL-4。在另一个培养瓶中含有未成熟DC，其培养基只含有GM-CSF、IL-4，将CD40L 1ng/mL加到第3个培养瓶中含有GM-CSF和IL-4的培养基。在24和48小时之后，在光学显微镜下检查细胞。在有day2/3 XCELLERATETM T细胞存在下培养的未成熟DC出现明显更为显著的树突进程——成熟的一种重要的形态学指标。用GM-CSF+IL-4或GM-CSF+IL-4+CD40L的标准方法培养的未成熟DC表现出的树突进程却不显著。因此，XCELLERATETM激活的T细胞相对当前使DC成熟的标准方法明显促进未成熟DC成熟。
                      实例3
          未成熟树突细胞的无细胞因子制备
如下详述，通过在Xcellerated的T细胞上清存在下温育从单核细胞(如实例2所述分离)中产生未成熟DC。
制备细胞
用PBS洗涤冻存的PBMC 3次并调节到5％人血清，然后在室温温育1小时。用80μM网孔滤器过滤细胞，记数并在1000ml Lifecell袋中进行正选。将细胞(1,000×106个细胞)悬浮在50ml PBS中，并调节到5％人血清。将10ml洗过的Xcellerate小珠(DynabeadsCD3/CD28 T Cell Expander)(用同样的培养基漂洗)加入到细胞中，然后使袋子以边缘向外(edgewise)的方式旋转30分钟。加入150mlPBS(5％人血清)。把袋子放在Maxsep装置上，以30ml/min(settingof 12)的速率将未结合的细胞排到300ml的袋子里。将1000ml的BASIC MEDIUM(XCELLERATE；见下)+100 IU/ML IL-2加入培养袋，并把结合小珠的细胞排到3000ml Lifecell培养袋中。细胞在37℃孵箱中培养3天来制备刺激的T细胞上清。
记数未被选择(未结合)的流过细胞，用于单核细胞培养，简要叙述如下。
在72小时收集T细胞培养上清，冻存以备后用。
基本培养基
X-Vivo 15，添加5％人血清、2mM L-glut(2mM)、20mMHEPES
第一部分  收集培养上清
收集用Xcellerate 3×28小珠正选并刺激的T细胞第3天培养上清(实验NDa-171-Bag A)。3000rpm离心10分钟去除细胞和小珠。上清在-85℃冻存。
第二部分  建立单核细胞
离心浓集流过组分(未结合)的细胞并用培养基重悬。基于流式细胞术分析估计单核细胞浓度(％)大约为20％。在每个T-25培养瓶中接种4ml总数10×106个细胞，放于CO2孵箱在37℃培养。
时间点#1.1小时后，冲洗培养瓶去除未粘附细胞，并加入7.0ml的Xcellerate激活的T细胞上清或只加培养基(见下)。
时间点#2.次日重复上述步骤。
第三部分  染色和流式细胞术
在活化的T细胞上清存在下培养48-72小时后，染色单核细胞染色(如下所示)通过流式细胞术进行表型分析。
             FITC*             PE*              三色(Tricolor
1            抗-CD3             抗-CD19+抗-CD20   抗-CD14
3            抗-谱系(lineage)   抗-CD83           抗-HLA-DR
4            抗-谱系            抗-CD86           抗-HLA-DR
*FITC：异硫氰酸荧光素
**PE：藻红素
如图8所示，在活化的T细胞上清存在时，HLA-DR和CD86表达增加而谱系(Lineage)和CD14表达降低，表达特征(profile)指示了未成熟DC的产生。
                      实例4
       用标准方法与XCELLERATE T细胞诱导DC成熟
方法：白细胞法分离产物用PBS洗3次。立即将细胞以0.5-1×106细胞/cm2置于组织培养瓶中，用添加了1％人AB血清的RPMI1640，在37℃ 5％CO2中培养1-2小时。用培养基温和漂洗组织培养瓶除去非粘附细胞。粘附细胞在有100ng/ml GM-CSF和60ng/ml IL-4存在的培养基中进一步培养6天。在培养的第2和4天，用含有200ng/mlGM-CSF和120ng/ml IL-4的新鲜培养基更换一半的培养基。在第6天，收集疏松粘附的未成熟DC。将细胞重悬在含有100ng/ml GM-CSF、60ng/ml IL-4和100U/ml IL-2的新鲜培养基中，并以0.5-1×105/cm2在第3天的Xcellerate T细胞存在下进行培养，T细胞∶未成熟DC之比为4∶1。作为DC成熟过程的阳性和阴性对照，在有或没有100ng/ml CD40L加1,000U/ml IFN-γ无T细胞存在下培养细胞。24小时后收集细胞，用FACS分析细胞表型。
结果：图9显示，与Xcellerate T细胞共培养获得的DC细胞，其细胞表面CD80、CD83、CD86和HLA-DR的上调明显高于没有加入T细胞培养得到的DC(阴性对照)。通过与Xcellerate激活的T细胞共培养的标志物的上调与联合使用CD40L和IFN-γ(阳性对照)产生的上调类似。与Xcellerate T细胞共培养产生的DC还表达DC-LAMP。与Xcellerate T细胞共培养产生的成熟DC的别构刺激(allostimulatory)活性与在CD40L/IFN-γ存在下产生的成熟DC的另构刺激活性类似。结果表明未成熟DC用第3天Xcellerate T细胞的共培养诱导了DC的成熟。抗-CD154抗体部分地阻断由Xcellerate T细胞的共培养诱导的DC成熟，暗示在活化的T细胞表面表达的CD40L有指导DC成熟的作用。
                          实例5
    用XCELLERATE T细胞和单核细胞的共培养来产生多核细胞
方法：新鲜的白细胞法分离产物用添加了1％人血清的X-Vivo 15洗两次。PBMC重悬并培养于添加了1％人AB血清、2mM L-谷氨酰胺、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的X-Vivo中，在组织培养瓶中以1×106细胞/cm2、37℃、5％CO2中培养1-2小时或直到单核细胞粘附到培养瓶。之后，温和除去未粘附细胞，并用如上新鲜培养基更换培养基。在培养的第1或2天，以T细胞∶单核细胞为1∶1的比率将第2-3天的Xcellerate T细胞加到培养物中。细胞再另外培养3-4天。如图10所示，多核细胞出现在培养物中。没有理论的约束，这些多核细胞的组合物可能是正在成熟的单核细胞，该单核细胞已经吞入了凋亡的/正在凋亡的Xcellerated T细胞。另外，这些细胞可以是破骨细胞。
                       实施例6
  用第3天XCELLERATETM T细胞上清(TCS)培养单核细胞来产生树
                        突细胞
如实施例1所述，XCELLERATETM T细胞产生IL-4、IFN-γ、IL-2、TNF-α，并表达CDw137和CD154。XCELLERATETM T细胞还产生GM-CSF、IL-10、IL-13、IL-1β和IL-6(图11)和中等水平的TGF-β。如下所述，当在第3天XCELLERATETM T细胞上清(TCS)或XCELLERATETM T细胞中培养时，单核细胞成熟为DC。
方法：新鲜的白细胞分离法产物用添加了5％人血清的X-Vivo 15洗涤两次。将PBMC等体积分装并冻存。在第3天，融化一份等分试样，如实施例1所述起始T细胞的Xcellerate激活。在第2天，融化另一份等分试样，将PBMC重悬并培养于添加了1％人AB血清、2mM L-谷氨酰胺、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的X-Vivo中，在组织培养瓶中以1×106细胞/cm2、37℃、5％CO2中培养1-2小时或直到单核细胞粘附到培养瓶。之后，温和除去未粘附细胞，并用上述的新鲜培养基更换培养基。在第0天，收集第3天的Xcellerate T细胞上清并等体积分装。将一份等分试样加到第2天的粘附单核细胞培养物中，剩余的等分试样冻存。在第1-8天，融化一份等分试样并用于替换粘附的单核细胞培养的培养基。这些天的每一天，都取出一等份细胞并用流式细胞术和显微术分析。还平行建立单核细胞对照培养体系，其只使用培养基、添加GM-CSF和IL-4的培养基以及添加GM-CSF和IL-4并在第5天加入IFN-γ和CD40L的培养基。
该实验显示在T细胞活化的第3天收集的Xcellerate TCS，诱导单核细胞分化为具有Lin-/CD80-/CD83-/CD86+/DR+表型的未成熟DC。在Xcellerate TCS存在下产生的未成熟DC的别构刺激活性比用GM-CSF/IL-4产生的未成熟DC的别构刺激活性小，但是明显高于只使用培养基培养的单核细胞的别构刺激活性。
根据前面的叙述，应当理解虽然为了说明的目的在这里描述了本发明具体的实施方案，但是可以进行多种不偏离本发明的精神和范围的修改。因此，本发明只由附加的权力要求来限制。

Claims (81)

1.使树突细胞成熟的方法，包括：
(a)提供了一种细胞群，其中至少一部分包括未成熟树突细胞；以及
(b)将该细胞群暴露于活化的T细胞或其上清，从而诱导成熟。
2.权利要求1的方法，其中未成熟树突细胞产生于前体细胞来源，该前体细胞来源选自白细胞分离法产物、外周血、淋巴结、皮肤、GALT、扁桃体、胸腺、组织活检物、肿瘤、肾、皮肤、骨髓、脐带血、CD34+细胞、单核细胞和粘附细胞。
3.权利要求2的方法，其中未成熟树突细胞是通过将前体细胞暴露于活化的T细胞或其上清中产生的。
4.权利要求1的方法，其中未成熟树突细胞包括树突/肿瘤细胞融合体。
5.权利要求4的方法，其中用于产生树突状/肿瘤细胞融合体的肿瘤细胞来源于癌。
6.权利要求5的方法，其中癌选自
7.权利要求1的方法，其中未成熟树突细胞产生于前体细胞来源，该前体细胞来源选自白细胞分离法产物、外周血、淋巴结、皮肤、GALT、扁桃体、胸腺、组织活检物、肿瘤、肾、骨髓、脐带血、CD34+细胞、单核细胞和粘附细胞，通过将所说的前体细胞暴露于一种或多种的细胞因子而产生的。
8.权利要求7的方法，其中细胞因子包括GM-CSF。
9.权利要求7的方法，其中细胞因子包括IL-4。
10.权利要求7的方法，其中细胞因子包括GM-CSF和IL-4。
11.权利要求7的方法，其中细胞因子包括IL-13。
12.权利要求7的方法，其中细胞因子包括GM-CSF和IL-13。
13.权利要求7的方法，其中前体细胞来源包括白细胞分离法产物。
14.权利要求7的方法，其中前体细胞来源包括外周血。
15.权利要求7的方法，其中前体细胞来源包括骨髓。
16.权利要求7的方法，其中前体细胞来源包括脐带血。
17.权利要求7的方法，其中前体细胞来源包括CD34+细胞。
18.权利要求7的方法，其中前体细胞来源包括单核细胞。
19.权利要求7的方法，其中前体细胞来源包括粘附细胞。
20.权利要求1的方法，其中未成熟树突细胞产生于前体细胞来源，该前体细胞来源选自白细胞分离法产物、外周血、淋巴结、皮肤、GALT、扁桃体、胸腺、组织活检物、肿瘤、肾、皮肤、骨髓、脐带血、CD34+细胞、单核细胞和粘附细胞，通过将所说的前体细胞暴露于一种或多种的细胞因子和活化的T细胞或其上清中而产生。
21.权利要求1的方法，其中未成熟树突细胞通过基因修饰或将未成熟树突细胞暴露于选自蛋白质、肽、肿瘤溶解产物和凋亡小体的抗原来源而带有抗原。
22.权利要求21的方法，其中抗原来源包括蛋白质。
23.权利要求21的方法，其中抗原来源包括肽和/或多肽。
24.权利要求21的方法，其中抗原来源包括肿瘤溶解产物。
25.权利要求21的方法，其中抗原来源包括凋亡小体。
26.权利要求21的方法，其中抗原来源包括辐射的肿瘤细胞，该细胞来自肿瘤或细胞系。
27.权利要求1的方法，其中树突细胞被基因修饰。
28.权利要求1的方法，其中活化的T细胞包括T细胞系。
29.权利要求1的方法，其中活化的T细胞通过细胞表面部分的连接而产生，包括：
(a)提供了一个细胞群，其中至少一部分包括T细胞；而且
(b)将该细胞群暴露于可诱导所说的T细胞活化的物质中。
30.权利要求29的方法，其中所述物质包括抗-T细胞受体抗体。
31.权利要求29的方法，其中所述物质包括抗-CD3抗体。
32.权利要求29的方法，其中所述物质包括抗-CD28抗体。
33.权利要求29的方法，其中所述物质包括抗-CD3和抗-CD28抗体。
34.权利要求1的方法，其中活化的T细胞通过同时进行T细胞的浓集和细胞表面部分的连接产生，包括：
(a)提供了一个细胞群，其中至少一部分包括T细胞；
(b)将该细胞群暴露于一种表面，其中该表面已经附着了一种或多种物质，该物质结合至少一部分T细胞的细胞表面部分并刺激至少一部分的T细胞；
(c)施加主要驱使T细胞浓集和T细胞表面部分连接的力，从而诱导T细胞兴奋。
35.根据权利要求1的方法产生的成熟树突细胞群。
36.权利要求35的成熟树突细胞群，其中树突细胞与肿瘤细胞融合形成了树突/肿瘤细胞融合体。
37.组合物，包括权力要求36的树突/肿瘤细胞融合体和药物可接受的赋形剂。
38.刺激哺乳动物免疫应答的方法，包括给予哺乳动物权利要求37的组合物。
39.减少哺乳动物癌细胞存在的方法，包括将细胞暴露于权利要求37的组合物。
40.抑制哺乳动物癌症发展的方法，其包括给予哺乳动物权利要求37的组合物。
41.组合物，包括权利要求35的树突细胞和药物可接受的赋形剂。
42.权利要求41的组合物，其中树突细胞经过基因修饰。
43.刺激哺乳动物免疫应答的方法，包括给予哺乳动物权利要求41的组合物。
44.权利要求43的方法，其中免疫应答包括哺乳动物中T细胞的活化。
45.改善哺乳动物免疫应答功能障碍的方法，包括给予哺乳动物权利要求41的组合物。
46.减少哺乳动物癌细胞存在的方法，包括将这些细胞暴露于权利要求41的组合物。
47.权利要求46的方法，其中癌细胞来自选自黑色素瘤、非-何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病、白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病的癌症。
48.权利要求46的方法，其中的癌症包括白血病。
49.减少哺乳动物感染性生物体存在的方法，包括给予哺乳动物权利要求41的组合物。
50.抑制哺乳动物癌症发展的方法，包括给予哺乳动物权利要求41的组合物。
51.权利要求50的方法，其中癌症选自黑色素瘤、非-何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病、白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病。
52.权利要求50的方法，其中癌症包括白血病。
53.抑制哺乳动物感染性疾病发展的方法，包括给予哺乳动物权利要求41的组合物。
54.组合物，包括树突细胞和活化的T细胞，其中树突细胞通过在体外暴露于活化的T细胞或其上清而成熟。
55.权利要求54的组合物，进一步包括药物可以接受的赋形剂。
56.刺激哺乳动物免疫应答的方法，包括给予哺乳动物权利要求55的组合物。
57.抑制哺乳动物癌症发展的方法，包括给予哺乳动物权利要求55的组合物。
58.权利要求57的方法，其中癌症选自黑色素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病、白血病、浆细胞瘤、肉瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肾细胞癌、胰腺癌、食管癌、脑癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病。
59.权利要求57的方法，其中癌症包括白血病。
60.抑制哺乳动物感染性疾病发展的方法，包括给予哺乳动物权利要求55的组合物。
61.减少哺乳动物癌细胞存在的方法，包括给予哺乳动物一种药物组合物，该组合物包括通过体外活化的T细胞或其上清成熟的树突细胞、活化的T细胞和药物可接受的赋形剂。
62.权利要求61的方法，其中癌症选自黑色素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病、白血病、浆细胞瘤、肉瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肾细胞癌、胰腺癌、食管癌、脑癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病。
63.权利要求61的方法，其中癌细胞包括白血病。
64.在体内产生成熟的树突细胞的方法，包括给予哺乳动物包括活化的T细胞的组合物。
65.产生成熟的树突细胞的方法，包括：
(a)在体外通过选自下列的方法从前体细胞来源中产生未成熟的树突细胞：
i.将前体细胞暴露于GM-CSF和IL-4；
ii.将前体细胞暴露于GM-CSF和IL-13；
iii.将前体细胞暴露于活化的T细胞或其上清；
iv.将前体细胞暴露于GM-CSF和IL-4以及活化的T细胞或其上清；
v.将前体细胞暴露于GM-CSF和IL-13以及活化的T细胞或其上清；
(b)给予哺乳动物部分(a)中的未成熟树突状细胞，以及；
(c)给予哺乳动物活化的T细胞，由此在体内诱导未成熟树突细胞的成熟。
66.权利要求65的方法，其中前体细胞来源选自白细胞分离法产物、外周血、淋巴结、皮肤、GALT、扁桃体、胸腺、组织活检物、肿瘤、肾、皮肤、骨髓、脐带血、CD34+选择细胞、单核细胞和粘附细胞。
67.权利要求65的方法，其中前体细胞来源是白细胞分离法产物。
68.权利要求65的方法，其中前体细胞来源是外周血。
69.权利要求65的方法，其中前体细胞来源是骨髓。
70.权利要求65的方法，其中前体细胞来源是脐带血。
71.权利要求65的方法，其中前体细胞来源是CD34+细胞。
72.权利要求65的方法，其中前体细胞来源是单核细胞。
73.权利要求65的方法，其中前体细胞来源是粘附细胞。
74.产生成熟树突细胞的方法，包括：
(a)获得哺乳动物细胞群，其中至少一部分包括前体树突细胞；
(b)在体外将该部分细胞暴露于GM-CSF和IL-4或IL-13中产生未成熟的树突细胞；以及
(C)在体外将该未成熟树突细胞暴露于活化的T细胞群或其上清，经过足够的时间来达到所需的成熟。
75.权利要求65的方法，其中前体细胞分离自外周血。
76.权利要求65的方法，其中前体细胞分离自白细胞分离法产物。
77.权利要求76的方法，其中活化的T细胞通过下列方法产生，该方法包括在适于T细胞活化的条件下将T细胞群暴露于抗-CD3抗体和结合T细胞表面上的辅助分子的配体。
78.权利要求76的方法，其中所说的活化的T细胞通过下列方法产生，该方法包括：
(a)将T细胞群暴露于抗-CD3抗体，该抗体固定在固相表面上；以及；
(b)用抗-CD28抗体刺激T细胞表面的辅助分子，其中所述抗-CD28抗体与抗-CD3抗体固定在同一固相表面上，由此诱导T细胞的活化和增殖。
79.权利要求78的方法，其中产生的活化T细胞包括已经增殖的T细胞。
80.权利要求78的方法，其中产生的活化的T细胞包括分泌细胞因子的T细胞。
81.扩增树突/肿瘤细胞融合体的方法，包括将树突/肿瘤细胞融合体暴露于活化的T细胞或其上清。
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