CN1751118A - 用于在免疫缺陷患者体内恢复免疫响应的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

一般而言，本发明涉及用于刺激、激活、和维持或提高T细胞群中所表达TCR的多克隆性的方法。在多个实施方案中，用附着了一种或多种试剂的表面刺激细胞，所述试剂连接至少一部分T细胞的细胞表面部分并刺激至少一部分T细胞，引起增殖增强、细胞信号传导、和/或细胞表面部分的聚集。在某些方面，通过细胞表面部分连接刺激细胞群诸如T细胞的方法是通过用附着了连接细胞表面部分的一种或多种试剂的表面接触细胞群从而诱导细胞刺激、细胞表面部分聚集、和/或受体信号增强而提供。还提供了生成T细胞的方法，用于诊断和治疗多种指征，包括癌症、病毒感染、和免疫相关疾病。还提供了通过这些方法生成的多克隆性增强的细胞组合物。

Description

用于在免疫缺陷患者体内恢复免疫响应的组合物和方法

发明背景

发明领域

一般而言，本发明涉及用于刺激T细胞的方法，更具体的说，涉及提供T细胞群中所表达的T细胞受体(TCR)的多克隆性的方法，从而恢复所述的T细胞的免疫潜能。本发明还涉及细胞组合物及其用途，所述组合物包括多克隆性增加的受刺激细胞。

相关领域的说明

T细胞识别与多种癌症或传染性生物体相关的全部抗原的能力是由其T细胞抗原受体(TCR)所赋予的，TCR由α链和β链或γ链和δ链组成。为了产生TC R的巨大多样性，组成这些链的蛋白质是由采用独特机制的DNA编码的。TCRα和β或γ和δ链是通过二硫键相连的(Janeway、Travers、Walport，Immunobiology，第四版，第148-159页，Elsevier ScienceLtd/Garland出版社，1999)。α/β或γ/δ异源二聚体在细胞膜上与不变的CD3链复合，且此复合物识别与MHC分子结合的特异抗原肽，或在γδT细胞的情况中可能识别不依赖MHC限制的部分。TCR特异性的巨大多样性的产生与通过体细胞基因重排产生的免疫球蛋白多样性非常相似。β链基因包含超过50个可变(V)、2个多样性(D)、超过10个连接(J)区段、和2个恒定(C)区段。α链基因包含大约70个V区段、超过60个J区段、无D区段、以及1个C区段。在胸腺中T细胞发育的过程中，发生了β链D至J的基因重排，随后是V基因区段重排至DJ。此功能性VDJβ外显子经转录和剪接后连接Cβ。对于α链，Vα基因区段重排至Jα基因区段而生成了功能性外显子，然后经转录和剪接至Cα。

V、D和J基因区段联合在一起的能力在TCR集合中随机引入了组合多样性的大量元素。V、D和J区段连接的准确位点是可变的，从而提高了连接处局部氨基酸的多样性。连接的准确核苷酸位置可以相差多达10个残基，导致由V、D、和J基因区段末端删除核苷酸，从而在这些区段的连接处产生密码子变化。当在相连基因区段之间的连接处添加并非由任一基因区段编码的额外核苷酸时，在重排过程中进一步增加了多样性。(通过此方法产生的可变性称为“N区多样性”。)(Janeway、Travers、Walport，Immunobiology，第四版，第98和150页，Elsevier ScienceLtd/Garland出版社，1999)。

通过评估循环T细胞集合中个别T细胞采用了哪些TCRVβ链以及在Vβ基因之后插入的随机核苷酸的数目，可以部分测量T细胞全集的多样性水平。一般而言，当循环T细胞集合包含表达全部范围TCRVβ链的T细胞时，以及当那些个别Vβ链是由利用插入核苷酸最广泛排列的基因重组事件衍生时，免疫系统的T细胞分支将具有识别潜在抗原全体的最大潜能。当由循环T细胞集合表达的TCRVβ链的范围受到限制或缩小时，以及当所表达TCR利用由具有有限核苷酸插入的重组基因所编码的链时，免疫应答潜能的宽度就相应缩小。其后果是应答于极其多种抗原的能力降低，导致受感染和患癌症的风险升高。

谱型分析是最近发展的用于测量T细胞集合的TCRVβ、Vα、Vγ、或Vδ基因使用率以及T细胞发育的重组过程中核苷酸插入水平的方法(如美国专利号5,837,447中所述)。谱型分析可用于测量T细胞免疫应答潜能的宽度或窄度。

αβTCR与抗原呈递细胞(APC)上MHC分子中所结合的抗原肽的结合是T细胞激活中的中心事件，它发生于T细胞与APC之间接触点的免疫学突触。为了维持T细胞激活，T淋巴细胞通常需要第二个共刺激信号。共刺激通常是T辅助细胞为了生成足够诱发克隆扩增的细胞因子水平所需要的。Bretscher，Immunol.Today 13：74，1992；June等，Immunol.Today15：321，1994。当激活后的抗原呈递细胞(APC)上的B7家族配体(CD80(B7.1)或CD86(B7.2))成员与T细胞上的CD28结合时发生主要的共刺激信号。

刺激某些T细胞子集扩增的方法具有生成可用于免疫治疗的多种T细胞组合物的潜力。通过有效刺激而提高T细胞的多克隆性、反应性、和数量，可能有助于成功的免疫治疗。

可用于扩增人T细胞的多种技术主要依赖辅助细胞和/或外源生长因子诸如白介素-2(IL-2)的使用。已经将IL-2与抗CD3抗体一起用于刺激T细胞增殖、优势扩增T细胞的CD8⁺亚群。认为两种APC信号都是最佳T细胞激活、扩增、和再输注后T细胞长期存活所需要的。对以MHC匹配的APC作为辅助细胞的需求提出了关于长期培养系统的重要问题，因为APC的寿命相对较短。因此，在长期培养系统中，必须不断的由来源获得APC并进行补充。对于辅助细胞受到影响的免疫缺陷的治疗而言，可更新供应辅助细胞的必要性很成问题。另外，在治疗病毒感染时，如果辅助细胞携带病毒，那么细胞可能在长期培养中污染整个T细胞群。

本领域现有方法已经利用抗CD3和抗CD28来扩增T细胞。然而，这些方法都未曾描述使用这些或类似方法来提高T细胞群的多克隆性及其有利结果。此外，经扩增T细胞的适用性只限于一些疾病状态。而且，现有方法倾向于进一步偏转T细胞群的克隆性，而非提高和/或维持T细胞群的多克隆性。为了获得最大的体内功效，理论上，离体或体内生成的、经激活的T细胞群应处于能最大协调(orchestrate)针对癌症、传染性疾病、或其它疾病状态的免疫应答。本发明提供了生成更多数量的更加高度激活且更纯的T细胞的方法，所述T细胞在TCR表达中的多克隆性得到了提高。

发明概述

本发明的一个方面提供了用于恢复来自无免疫应答患者的T细胞群的TCR表达多克隆性的方法，用于恢复患者的免疫响应，其包括：提供一群细胞，其中至少一部分包含T细胞，将细胞群暴露于附着了一种或多种试剂的表面，所述试剂连接至少一部分T细胞的细胞表面部分并刺激至少一部分T细胞，将所述细胞培养一段时间至足以增加TCR表达方面的至少一种TCRVβ、Vα、Vγ、和/或Vδ家族的多克隆性，从而恢复T细胞群的多克隆性。

在本发明的一个实施方案中，根据至少一种Vβ、Vα、Vγ、和/或Vδ家族基因的Vβ、Vα、Vγ、和/或Vδ谱型特征的测量，恢复包括T细胞群由单克隆性转变成寡克隆性、由单克隆性转变成多克隆性、或由寡克隆性转变成多克隆性的转变。在本文提供的另一个实施方案中，转变包括将表达至少一种Vβ、Vα、Vγ、和/或Vδ家族基因的多克隆T细胞数目提高到足以用于治疗。

本发明的另一个方面提供了用于在无免疫应答个体中恢复免疫响应的方法，其中个体T细胞的TCR表达多克隆性相对于有免疫应答个体降低，包括：由个体获得细胞群，其中至少一部分包含T细胞；将细胞群暴露于附着了一种或多种试剂的表面，所述试剂连接至少一部分T细胞的细胞表面部分并刺激至少一部分T细胞；将所述细胞培养一段时间至足以增加至少一种TCRVβ、Vα、Vγ、和/或Vδ家族的多克隆性；并将T细胞的刺激的部分灌输到无免疫应答个体中，由此恢复无免疫应答个体的免疫响应。在某些实施方案中，所灌输T细胞的多克隆性在灌输后在体内维持至少3至6个月至一年。

在一个实施方案中，无免疫应答个体患有癌症。癌症可以是下组之任一种：黑素瘤、非何杰金淋巴瘤、何杰金病、白血病、浆细胞瘤、肉瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肾癌、肾细胞癌、胰腺癌、鼻咽癌、食道癌、脑癌、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CLL)、大颗粒淋巴细胞性白血病(LGL)、和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在一个优选的实施方案中，癌症是B细胞淋巴细胞性白血病。

在另一个实施方案中，无免疫应答个体感染了传染性生物体。传染性生物体可以包括病毒，诸如单链RNA病毒或单链DNA病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、甲型、乙型、或丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、人乳头瘤病毒(HPV)、巨细胞病毒(CMV)、EB(EBV)、寄生虫、细菌、肺结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、肺炎肺囊虫(Pneumocystis carinii)、假丝酵母(Candida)、或曲霉菌(Aspergillus)或其组合。

在另一个实施方案中，无免疫应答个体患有先天遗传病，诸如严重联合免疫缺陷(SCID)或普通易变免疫缺陷(CVID)。在某些实施方案中，个体是由于与癌症有关的治疗而无免疫应答的。在某些实施方案中，个体是由于与造血干细胞移植、骨髓移植、脐带血、同种异体、自体、或异种细胞移植、化疗、放疗、细胞毒性试剂治疗、免疫抑制剂治疗(如环孢霉素、皮质类固醇、等等)有关的治疗而无免疫应答的。在还有一个实施方案中，无免疫应答个体患有免疫缺陷或自身免疫病。在还有一个实施方案中，无免疫应答个体患有影响肾、肝、或胰腺的慢性病。在一个具体的实施方案中，个体患有糖尿病。在一个实施方案中，无免疫应答个体受到老龄的影响。在另一个实施方案中，无免疫应答个体接受过基因治疗或涉及导致T细胞全集偏转的基因转导的其它疗法。

在另一个实施方案中，无免疫应答个体患有与T细胞集改变或偏转有关的疾病，包括但不限于：类风湿性关节炎、多发性硬化、胰岛素依赖型糖尿病、阿狄森病、脂泻病、慢性疲劳综合症、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、局限性回肠炎、Fibromyalgia、系统性红斑狼疮、牛皮癣、Sjogren氏综合症、甲状腺功能亢进/格雷夫斯病、甲状腺功能减退/桥本甲状腺炎、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、重症肌无力、子宫内膜异位、硬皮病、恶性贫血、古德帕斯彻综合症、韦格纳病、肾小球肾炎、再生障碍性贫血、多种血细胞减少症之任一种、阵发性夜间血红蛋白尿、骨髓发育不良综合征、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、范科尼贫血、埃文斯综合症、因子VIII抑制剂综合症、因子IX抑制剂综合症、系统性血管炎、皮肌炎、多肌炎和风湿热。本文所述的方法和组合物可用于治疗特征为血球计数低的血液学疾病。

在另一个实施方案中，无免疫应答个体患有与T细胞集偏转有关的神经学疾病或心血管疾病。

在另一个实施方案中，将本发明的细胞组合物施用于自身免疫病患者。本发明的一个实施方案提供了用于在无免疫应答个体中恢复免疫响应的方法，其中无免疫应答个体患有自身免疫病。在某些实施方案中，自身免疫病包括但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化、胰岛素依赖型糖尿病、阿狄森病、脂泻病、慢性疲劳综合症、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、局限性回肠炎、FibTomyalgia、系统性红斑狼疮、牛皮癣、Sjogren氏综合症、甲状腺功能亢进/格雷夫斯病、甲状腺功能减退/桥本甲状腺炎、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、重症肌无力。在另一个实施方案中，无免疫应答个体接受过化疗的治疗。在还有一个实施方案中，无免疫应答个体接受过细胞毒性试剂的治疗。在另一个实施方案中，无免疫应答个体接受过免疫抑制剂的治疗。在一个实施方案中，无免疫应答个体患有与血细胞减少症有关的血液学疾病，包括但不限于：再生障碍性贫血、骨髓发育不良综合征、范科尼贫血、特发性血小板减少性紫癜和自身免疫性溶血性贫血。

本发明的一个方面提供了包含T细胞群及药用赋形剂的组合物，T细胞群中所述T细胞群的多克隆性依照本文所述方法获得了恢复，所述组合物用于在无免疫应答个体中恢复免疫响应，其中个体的T细胞多克隆性相对于有免疫应答个体降低。

在某些实施方案中，在使用化疗试剂诸如fludarabine、外源束辐射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体诸如OKT3或CAMPATH进行T细胞消融治疗后，对患者施用本发明的组合物。在另一个实施方案中，在B细胞消融治疗诸如与CD20反应的试剂如Rituxan后，对患者施用本发明的组合物。上述治疗中施用于患者的剂量将随着待治疗病状的准确本质和治疗的接受者而变化。可以依照本领域已接受的惯例进行施用于人的剂量的测量。例如，CAMPATH的剂量对于成年患者而言一般是在1至大约100mg的范围内，通常在1-30天之间的时期每天施用。尽管在有些情况中可能使用高达40mg/天的较大剂量，优选的日剂量是1-10mg/天(描述于美国专利号6,120,766)。

一方面，本发明提供了包含T细胞群和药用赋形剂的组合物，T细胞群中TCR表达的多克隆性已经依照本文所述方法得到了恢复，用于在无免疫应答个体中恢复免疫响应，其中个体的T细胞多克隆性相对于有免疫应答个体降低。

另一方面，本发明提供的方法中所述表面上附着了连接T细胞的第一种细胞表面部分的第一种试剂；且同一表面或第二种表面上附着了连接所述T细胞的第二部分的第二种试剂，其中第一种和第二种试剂的连接诱导所述T细胞增殖。在一个实施方案中，第一种试剂包括抗CD3抗体且所述第二种试剂包括结合所述T细胞表面上辅助分子的配体。在另一个实施方案中，所述辅助分子是CD28。在另一个实施方案中，第一种试剂包括抗CD3抗体且所述第二种试剂包括抗CD28抗体。在还有一个实施方案中，所述第一种和第二种试剂通过共价吸附附着于所述表面或所述第二种表面。在其它实施方案中，所述第一种和第二种试剂通过直接吸附或间接吸附附着于所述表面或所述第二种表面。

另一方面，本发明提供的方法中所述表面上附着了连接至少一部分T细胞的细胞表面部分并刺激至少一部分T细胞的一种或多种试剂，其中所述一种或多种试剂的连接诱导所述T细胞激活。在一个实施方案中，本发明中使用了一种或多种表面。在另一个实施方案中，三种或更多试剂以顺式或反式附着于所述表面上。

附图简述

图1是TCRVβ链谱型分析的示意图，例示了多克隆、寡克隆、和单克隆T细胞群的典型谱型特征。

图2显示了通过谱型分析测量的未激活T细胞、用OKT3和IL-2激活的T细胞和使用XCELLERATE^TM方法激活的T细胞的T细胞集合比较。

图3是来自B-CLL患者的T细胞在XCELLERATE^TM激活之前和之后的谱型分析，显示了XCELLERATE^TM方法矫正在患者中观察到的T细胞缺乏。

图4是用Goroshov扰动指数(Gorochov G.，Neumann A.U.、KereveurA.、Parizot C.、Li T.，、Katlana，C.，、Karmochkine M-，、Raguin G.，、AutranB.，和Debre P.，Ned.Med.4：215-221，1998)图解8名供体的T细胞集合“扰动”总水平的图。

图5a和5b的柱形图显示了来自2名正常供体的未处理CD4⁺和CD8⁺T细胞上几种Vβ家族的TCRVβ细胞表面表达的流式细胞术分析，并与来自2名B-CLL供体的未处理和经XCELLERATED^TM处理的CD4⁺和CD8⁺T细胞进行比较。该图显示了在其表面上表达代表性TCRVβ家族蛋白质的CD8(5a)和CD4(5b)细胞的百分比。

图6的线性图显示了XCELLERATE^TM方法在接受移植的骨髓瘤病人中改善了淋巴细胞恢复。

发明详述

在阐述本发明之前，认识到对下文将要用到的某些术语阐明定义可能是有帮助的。

术语“生物相容的”在用于本文时指对存活细胞完全无毒的特性。

术语“刺激”在用于本文时指通过细胞表面部分的连接而诱导的初级应答。例如，在受体的内容中，这种刺激需要受体的连接及随后的信号转导事件。至于T细胞刺激，这种刺激指在一个实施方案中随后诱导信号转导事件的T细胞表面部分的连接，诸如结合TCR/CD3复合物。此外，刺激事件可能激活细胞并上调或下调细胞表面分子诸如受体或粘附分子的表达，或者上调或下调分子的分泌，诸如下调β-肿瘤生长因子(TGF-β)。因此，即使在缺乏直接信号转导事件时，细胞表面部分的连接仍可能导致细胞骨架结构的重新组织，或细胞表面部分的合并，其中每种部分都可用于增强、修饰、或改变随后的细胞应答。

术语“激活”在用于本文时指在足够的细胞表面部分连接后诱导可测量的形态学、表型、和/或功能变化的细胞状态。在T细胞的内容中，这种激活可以是T细胞已经充分刺激以诱导细胞增殖的状态。T细胞激活还可能诱导细胞因子的生成和/或分泌，并上调或下调细胞表面分子诸如受体或粘附分子的表达，或者上调或下调某些分子的分泌，并执行调节或溶细胞效应物功能。在其它细胞的内容中，此术语指特定物理化学过程的上调或下调。

术语“靶细胞”在用于本文时指意欲通过细胞表面部分连接来刺激的任何细胞。

“抗体”在用于本文时包括多克隆和单克隆抗体(mAb)、灵长类化的(如人源化的)、鼠的、鼠-人的、鼠-灵长类的、和嵌合的；而且可以是完整分子、其片段(诸如scFv、Fv、Fd、Fab、Fab’和F(ab)’₂片段)、或完整分子和/或片段的多聚物或聚集物；而且可以是天然存在的或可以是产生的，如通过免疫、合成或遗传工程产生；“抗体片段”在用于本文时指由抗体衍生或与抗体有关的片段，所述抗体结合抗原且在一些实施方案中可以被衍化而展示便于清除和摄取的结构特征，如通过掺入半乳糖残基。这包括如Fab’、F(ab)’₂、scFv、轻链可变区(V_L)、重链可变区(V_H)及其组合。

术语“蛋白质”在用于本文时包括蛋白质、糖蛋白和其它细胞衍生的经修饰的蛋白质、多肽和肽；而且可以是完整分子、其片段、或完整分子和/或片段的多聚物或聚集物；而且可以是天然存在的或可以是产生的，如通过合成(包括化学和/或酶促)或遗传工程产生。

术语“试剂”、“配体”、或“结合细胞表面部分的试剂”在用于本文时指结合指定细胞群的分子。试剂可以结合任何细胞表面部分，诸如受体、抗原决定簇、或靶细胞群上存在的其它结合位点。试剂可以是蛋白质、肽、抗体及其抗体片段、融合蛋白、合成分子、有机分子(如小分子)、等等。在说明书中及T细胞刺激的内容中，抗体被用作这种试剂的原型范例。

术语“细胞表面部分”在用于本文时可以指细胞表面受体、抗原决定簇、或靶细胞群上存在的任何其它结合位点。

术语“结合细胞表面部分的试剂”和“细胞表面部分”在用于本文时应理解为通常以较高亲合力展示特异结合的一套互补/抗互补分子。

“共刺激信号”在用于本文时指与初级信号一起引起T细胞增殖和/或激活的信号，诸如TCR/CD3连接。

“分离”在用于本文时包括将一种组分与另一种组分充分纯化的任何手段(如通过过滤、亲和力、浮力密度、或磁吸引)。

“表面”在用于本文时指能够有试剂附着其上的任何表面，包括但不限于：金属、玻璃、塑料、共聚物、胶体、脂类、细胞表面、等等。本质上任何表面都能保持试剂结合或附着其上。

“单克隆性”在用于本文时在T细胞群的内容中指根据谱型分析(测量TCRβ、Vα、Vγ、或Vδ链超变区全集)的定义而具有单一特异性的T细胞群。当指定的TCRVβ、Vα、Vγ、和/或Vδ家族的Vβ、Vα、Vγ、和/或Vδ谱型表征具有单一优势峰(见图1)时，认为T细胞群是单克隆的(或单特异的)。谱型分析辨别特定大小而非序列的重排可变基因。因此，可以理解单一的峰可能代表表达有限数目重排TCR可变基因(Vβ、Vα、Vγ、或Vδ)中任一种的T细胞群，所述重排TCR可变基因在接合区包含4种可能核苷酸(腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、或胸腺嘧啶(t))中的任一种或4种核苷酸的组合。在本发明的某些实施方案中，可能期望克隆和测序特定条带以测定代表特定长度的条带中存在的重排可变基因的序列。

“寡克隆性”在用于本文时在T细胞群的内容中指根据谱型分析(测量TCRβ链超变区全集)的定义而具有多重但是窄的抗原特异性的T细胞群。当指定的TCRVβ家族的Vβ谱型表征具有大约2个和大约4个之间的优势峰(见图1)时，认为T细胞群是寡克隆的。

“多克隆性”在用于本文时在T细胞群的内容中根据谱型分析(测量TCRβ链超可变区全集)的定义而具有多重且宽的抗原特异性的T细胞群。当指定的TCRVβ家族的Vβ谱型特征具有多个峰，典型地是5个或更多优势峰而且在大部分情况下具有高斯分布时(参见例如图1、2、和3)时，认为T细胞群是多克隆的。

“恢复或增强多克隆性”在用于本文时指根据谱型分析或相似分析诸如流式细胞术或序列分析所定义的，在T细胞群所表达的TCRVβ、Vα、Vγ、和/或Vδ基因中，由单克隆表征转变成寡克隆表征或多克隆表征(换言之，由单克隆性转变成寡克隆性或多克隆性)，或由寡克隆表征转变成多克隆表征(换言之，由寡克隆性转变成多克隆性)。通常在至少一种TCRVβ、Vα、Vγ、和/或Vδ家族中观察到T细胞群由单克隆Vβ、Vα、Vγ、和/或Vδ表达表征转变成寡克隆表征或多克隆表征。在本发明的一个实施方案中，在2、3、4、或5种Vβ家族中观察到这种转变。在本发明的某些实施方案中，在6、7、8、9、或10种Vβ家族中观察到这种转变。在本发明的另一个实施方案中，在11、12、13、或14种Vβ家族中观察到这种转变。在本发明的另一个实施方案中，在15-20种Vβ家族中观察到这种转变。在本发明的还有一个实施方案中，在20-24种Vβ家族中观察到这种转变。在另一个实施方案中，在所有Vβ家族中观察到这种转变。恢复或增加T细胞群多克隆性的功能意义在于T细胞群的免疫潜力或应答全部抗原的能力得到恢复或提高。在本发明的某些方面，群落中一些T细胞的TCR可能不会参与本文提出的方法(如TCR表达下调的T细胞)。然而，通过极端接近通过本文所述方法激活的T细胞和它们分泌的因子，这些T细胞可以继而上调其TCR表达，从而导致T细胞群的多克隆性进一步增加。

术语“动物”或“哺乳动物”在用于本文时涵盖所有哺乳动物，包括人。优选的是，本发明的动物是人受试者。

术语“暴露”在用于本文时指使其处于极其接近或直接接触的状态或状况。

术语“增殖”在用于本文时指通过生成新细胞而生长或繁殖。

“免疫应答或响应”在用于本文时指免疫系统细胞的激活，包括但不限于T细胞，从而诱导特定细胞的特定效应物功能。效应物功能可以包括但不限于增殖、分泌细胞因子、分泌抗体、表达调节和/或粘附分子、和诱导细胞溶解的能力。

“刺激免疫应答”在用于本文时指实现免疫系统细胞效应物功能的激活和诱导的任何刺激。

“免疫应答机能失调”在用于本文时指免疫系统细胞的不适当激活和/或增殖或缺乏，和/或细胞因子的不适当分泌或缺乏，和/或免疫系统细胞的其它效应物功能的不适当或不充分诱导，诸如调节表达、粘附、和/或归巢受体、以及细胞溶解的诱导。

术语“预防”或“抑制癌症或癌症细胞的发展”在用于本文时指癌症的发生得到预防或癌症的发作得到迟滞。

术语“治疗或减少癌症或癌症细胞的存在”或“治疗或减少肿瘤或肿瘤细胞的存在”在用于本文时指癌症或肿瘤的生长得到抑制，这是通过如肿瘤体积或恶性细胞数目来反映的。可以使用本领域许多技术来测定癌症的缩小，包括M-蛋白的测量、以PCR为基础的检测、RNA和DNA杂交检测、或原位PCR或杂交、等。可以通过多种已知方法来测定肿瘤体积，如用表盘测径仪(dial caliper)获得二维尺寸。

“预防或抑制传染性疾病的发展”在用于本文时指传染性疾病的发生得到预防或传染性疾病的发作得到迟滞，或已有感染的蔓延得到逆转或稳定。

“改善”在用于本文时定义为使其更好、改进(The American HeritageCollege Dictionary，第三版，Houghton Mifflin公司，2000)。

“颗粒”或“表面”在用于本文时可以包括胶状颗粒、微球体、纳米微粒、珠粒、等等。表面可以是能够使配体结合其上或整合其中的任何表面，包括细胞表面(例如K562细胞)，而且是生物相容的，即对待刺激的靶细胞完全无毒。在多个实施方案中，可商购的表面诸如珠粒或其它颗粒都是可用的(如Miltenyi颗粒，Miltenyi Biotec，德国；琼脂糖珠粒，PharmaciaFine Chemicals，瑞典；DYNABEADS^TM，Dynal公司，纽约；PURABEADS^TM，Prometic Biosciences，来自Immunicon的磁珠，Huntington Valley，PA，来自Bangs Laboratories公司的微球体，Fishers，IN)。

“顺磁性颗粒”在用于本文时指上文定义的适应磁场而定位的颗粒。

术语“传染性疾病”在用于本文时指由传染性生物体引起的任何疾病。传染性生物体可以包括病毒(如单链RNA病毒、单链DNA病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、甲型、乙型、和丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、人乳头瘤病毒(HPV))、寄生虫(如原生动物和后生动物病原体，诸如疟原虫物种(Plasmodias pecies)、利什曼原虫属物种(Leishmania species)、血吸虫属物种(Schistosoma species)、锥虫属物种(Trypanosoma species))、细菌(如分枝杆菌(Mycobacteria)，特别是结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、沙门氏菌属(Salmonella)、链球菌属(Streptococci)大肠杆菌(E.coli)、葡萄球菌(Staphylococci))、真菌(如假丝酵母物种、曲霉菌物种)、肺炎肺囊虫、和朊病毒(已知朊病毒感染动物而引起痒病，即绵羊和山羊神经系统的一种可传播的退化性疾病，以及牛海绵状脑病(BSE)或“疯牛病”、和猫的猫科海绵状脑病。已知感染人的四种朊病毒疾病是(1)库鲁病、(2)克罗伊茨费尔特一雅各布病(CJD)、(3)格-施-沙病(GSS)、和(4)致命的家族性失眠症(FFI)。在用于本文时“朊病毒”包括在所用任何动物-特别是人和驯养牲畜中引起所有或任何一种这些或其它疾病的所有形式的朊病毒。

刺激、活化、和恢复T细胞的多克隆性

本发明中多克隆性增加的经刺激和经激活的T细胞是通过诱导激活的细胞表面部分连接而生成的。多克隆性增加的经刺激和经激活的T细胞是通过激活T细胞群并用结合辅助分子的配体刺激T细胞表面的辅助分子而生成的，正如美国专利申请号08/253,694、08/435,816、08/592,711、09/183,055、09/350,202、和09/252,150以及专利号6,352,694、5,858,358和5,883,223中所述。

一般而言，可以通过细胞表面部分连接来实现T细胞激活和多克隆性恢复，诸如刺激T细胞受体(TCR)/CD3复合物或CD2表面蛋白质。许多抗人CD3单克隆抗体已经实现商品化，例如克隆BC3(XR-CD3；FredHutchinson癌症研究中心，西雅图，华盛顿州)、由得自美国典型培养物保藏中心的杂交瘤细胞制备的OKT3、和单克隆抗体G19-4。类似地，抗CD2抗体的刺激形式是已知且可获得的。通常使用至少两种不同抗CD2抗体的组合来实现用抗CD2抗体经CD2的刺激。已有描述的抗CD2抗体的刺激组合包括：T11.3抗体联合T11.1或T11.2抗体(Meuer等人，Cell 36：897-906，1984)，以及9.6抗体(与T11.1识别相同表位)联合9-1抗体(Yang等人，J.Immunol.137：1097-1100，1986)。还可使用与任何上文所述抗体结合相同表位的其它抗体。可以通过标准技术来制备和鉴定其它抗体或抗体组合。还可以通过接触下列试剂来实现刺激：超抗原(如葡萄球菌肠毒素A(SEA)、葡萄球菌肠毒素B(SEB)、中毒性休克综合症毒素1(TSST-1))、内毒素、或通过多种促细胞分裂剂，包括但不限于植物凝集素(PHA)、佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)和离子霉素、脂多糖(LPS)、T细胞促细胞分裂剂、和IL-2。

为了进一步激活和增加T细胞群的多克隆性，用结合辅助分子的配体刺激T细胞表面的共刺激或辅助分子，诸如CD28。因此，本领域普通技术人员将认识到能够与CD28分子交联的任何试剂包括抗CD28抗体或其片段或者CD28的天然配体都可用于刺激T细胞。可用于本发明内容中的示例性抗CD28抗体或其片段包括单克隆抗体9.3(IgG2_a)(Bristol-MyersSquibb，普林斯顿，新泽西州)、单克隆抗体KOLT-2(IgG1)、15E8(IgG1)、248.23.2(IgM)、克隆B-T3(XR-CD28；Diaclone，Besancon，法国)和EX5.3D10(IgG2_a)(ATCC HB 11373)。示例性的天然配体包括B7蛋白质家族，诸如B7-1(CD80)和B7-2(CD86)(Freedman等人，J.Immunol.137：3260-3267，1987；Freedman等人，J.Immunol.143：2714-2722，1989；Freedman等人，J.Exp.Med.174：625-631，1991；Freedman等人，Science262：909-911，1993；Azuma等人，Nature 366：76-79，1993；Freedman等人，J.Exp.Med.178：2185-2192，1993)。

本发明中可以用结合辅助分子的配体刺激的T细胞表面辅助分子的其它示例包括但不限于CD54、Ox-40、LFA-1、ICOS、41-BB、和CD40。

另外，天然配体的结合同系物，无论是天然的或是通过化学或重组技术合成的，都可依照本发明进行使用。其它试剂可以包括天然和合成的配体。试剂可以包括但不限于其它抗体或其片段、生长因子、细胞因子、趋化因子、可溶性受体、类固醇、激素、促细胞分裂剂诸如PHA、或其它超抗原。

扩增T细胞群

在本发明的一个方面，可以通过刺激其中至少一部分包含T细胞的细胞群来进行离体T细胞扩增。在本发明的一个实施方案中，可以用单一试剂刺激T细胞。在另一个实施方案中，可以用两种或更多试剂刺激T细胞，一种诱导初级信号，而其它试剂诱导一种或更多共刺激信号。可以以可溶形式、附着于细胞表面、或固定于本文所述表面来使用可用于刺激单一信号或刺激初级信号的配体和刺激次级信号的辅助分子。附着于表面上的配体或试剂用作“代理”抗原呈递细胞(APC)。在一个优选的实施方案中，初级和次级试剂共同固定于表面上。在一个实施方案中，提供初级激活信号的分子诸如CD3配体和共刺激分子诸如CD28配体偶联于同一表面上，例如颗粒。另外，如上文所述，可以将一种、两种、或更多刺激分子用于相同或不同表面。

在扩增前，由受试者获得T细胞来源。术语“受试者”意欲包括能够在其中引起免疫应答的存活生物体(如哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、及其转基因物种。可以由许多来源获得T细胞，包括外周血单核细胞、骨髓、胸腺、活组织切片、肿瘤、淋巴结组织、消化道相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾组织、或任何其它淋巴组织、和肿瘤。可以由T细胞系以及由自体或同种异体来源获得T细胞。还可以由异种来源获得T细胞，例如小鼠、大鼠、非人灵长类、和猪。在本发明的某些实施方案中，可以使用熟练技术人员知道的许多技术诸如聚糖体分离由采集自受试者的一个单位血液获得T细胞。在一个优选的实施方案中，通过单采血液成分术或白细胞提取法由个体的循环血获得细胞。单采血液成分术离产物通常包括淋巴细胞，其包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞、和血小板。在一个实施方案中，可以漂洗通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆部分并将细胞置于适当缓冲液或培养基中用于随后的加工步骤。在本发明的一个实施方案中，用磷酸缓冲液(PBS)清洗细胞。在备选的实施方案中，清洗液不含钙，而且可能不含镁，或者不含即使不是全部也是许多二价阳离子。正如本领域普通技术人员将容易认识到的，可以通过本领域技术人员知道的方法来实现清洗步骤，诸如依照制造商的说明书使用半自动“流经”离心机(例如Cobe2991细胞处理器，Baxter)。清洗后，可以将细胞重悬于多种生物相容缓冲液，诸如例如无钙、无镁的PBS。或者，可以除去单采血液成分术样品中不想要的部分并将细胞直接重悬于培养基。

在另一个实施方案中，通过裂解或消除红细胞并消除单核细胞而由外周血淋巴细胞分离T细胞，例如通过PERCOLL^TM梯度离心。可以通过正或负选择技术进一步分离特定T细胞亚群诸如CD28⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD45RA⁺、和CD45RO⁺T细胞。例如，在一个优选的实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28(即3×28)缀合珠粒诸如DYNABEADS M-450CD3/CD28 T一起保温来分离T细胞，时间足以正选择期望的T细胞。在一个实施方案中，时间是大约30分钟。在另一个实施方案中，时间范围为30分钟至36小时或更长时间及其中所有整数值。在另一个实施方案中，时间是至少1、2、3、4、5、或6小时。在另一个优选的实施方案中，时间是10至24小时。在一个优选的实施方案中，保温时间是24小时。为了由白血病患者分离T细胞，使用较长保温时间诸如24小时能够提高细胞产量。在与其它细胞类型相比T细胞较少的任何情况中，可以使用较长保温时间来分离T细胞，诸如由肿瘤组织或由无免疫应答个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。此外，使用较长保温时间能够提高捕捉CD8⁺T细胞的效率。例如，可以使用CD3/CD28缀合磁珠粒(如DYNABEADS M-450CD3/CD28 T Cell Expander)正选择CD3⁺、CD28⁺T细胞。在本发明的一个方面，可以使用针对负选择细胞独特表面标记的抗体组合来实现通过负选择T细胞群的富集。一种优选方法是通过使用针对负选择细胞上存在的细胞表面标记的单克隆抗体混合物的负磁免疫吸附或流式细胞术而进行的细胞分拣和/或选择。例如，为了通过负选择来富集CD4⁺细胞，单克隆抗体混合物典型地包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。

本发明的另一个方面提供了在扩增前已经消除或富集表达多种标记的细胞群的T细胞群或组合物，所述标记诸如CD62L、CD45RA或CD45RO、细胞因子(如IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10)、细胞因子受体(如CD25)、穿孔素、粘附分子(如VLA-1、VLA-2、VLA-4、LPAM-1、LFA-1)、和/或归巢分子(如L-选择蛋白)。在一个实施方案中，通过针对标记的抗体或其它配体/结合试剂，消除或正选择表达任何这些标记的细胞。本领域普通技术人员将容易的鉴定用于消除或正选择表达期望标记的细胞样品的多种具体方法学。

对于上文所述的单核细胞消除，可以通过多种方法在离体扩增前由血液制剂消除单核细胞群(即CD14⁺细胞)，包括用抗CD14包被的珠粒或柱子，或者利用这些细胞的吞噬活性以便于消除或通过粘附于塑料上。因此，在一个实施方案中，本发明使用大小足以被吞噬性单核细胞所吞噬的顺磁颗粒。在某些实施方案中，顺磁颗粒是商品化的珠粒，例如由Dynal AS生产的商品名为Dynabeads^TM。在这方面的示例性Dynabeads^TM是M-280、M-450、和M-500。一方面，通过用“无关”蛋白质(如血清蛋白质或抗体)包被顺磁颗粒来消除其它非特异细胞。无关蛋白质和抗体包括不会特异性靶向待扩增T细胞的那些蛋白质和抗体或其片段。在某些实施方案中，无关珠粒包括用绵羊抗小鼠抗体、山羊抗小鼠抗体、和人血清清蛋白包被的珠粒。

简而言之，这种单核细胞消除可如下进行：将使用聚糖体由全血分离的PBMC或经单采血液成分术的外周血与任何量能够消除单核细胞的一种或多种无关或非抗体偶联的顺磁颗粒一起(珠粒∶细胞比率约为20∶1)于22-37℃一起预保温大约30分钟-2小时，随后磁性消除附着于或吞噬顺磁颗粒的细胞。也可于低至3-4℃的温度下进行预保温。可以使用本领域标准方法来进行这种分离。例如，可以使用任何磁分离方法，包括多种商品(如DYNAL磁颗粒浓缩仪(DYNALMPC))。可以通过本领域普通技术人员知道的多种方法学来监测确认必需的消除，包括所述消除之前和之后CD14阳性细胞的流式细胞术分析。

还可以在清洗步骤之后冷冻用于刺激的T细胞，这不需要单核细胞消除步骤。希望不受理论所限制，冷冻及随后的解冻步骤通过消除细胞群中的粒细胞或某种程度的单核细胞而提供了更一致的产品。在消除血浆和血小板的清洗步骤之后，可以将细胞悬浮于冷冻液。尽管许多冷冻液和参数在本领域是已知的且在本内容中是有用的，一种方法包括使用含20％DMSO和8％人血清清蛋白的PBS或其它合适的细胞介质，然后将细胞以1℃/分钟的速率冷冻至-80℃并保存于液氮储存罐的气相中。

可以如本文所述刺激细胞群，诸如通过接触固定于表面的抗CD3抗体或抗CD2抗体，或者通过接触联合钙离子载体的蛋白激酶C激活剂(如苔藓抑制素(bryostatin))。为了共刺激T细胞表面的辅助分子，使用了结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下用抗CD3抗体和抗CD28抗体接触CD4⁺细胞群。类似地，为了刺激CD8⁺T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，法国)，正如本领域普遍知道的其它方法(Berg等人，TransplantProc.30(8)：3975-3977，1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9)：1319-1328，1999；Garland等人，J.Immunol Meth.227(1-2)：53-63，1999)。

可以通过不同方案来提供T细胞的初级刺激信号和共刺激信号。例如，提供各种信号的试剂可以存在于溶液中或偶联于表面上。当偶联于表面时，可以将试剂偶联于同一表面(即以“顺式”方式)或不同表面(即以“反式”方式)。或者，可以将一种试剂偶联于表面上，而另一种试剂存在溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的试剂结合于细胞表面上，而提供初级激活信号的试剂则存在溶液中或偶联于表面上。在某些实施方案中，两种试剂可以都存在溶液中。在另一个实施方案中，试剂可以是可溶性形式，然后与表面交联，诸如表达FC受体的细胞或抗体或将结合试剂的其它结合试剂。在一个优选的实施方案中，将两种试剂固定于球形或半球形表面，原型范例是珠粒或细胞，或是同一珠粒即“顺式”，或是不同珠粒即“反式”。举例而言，提供初级激活信号的试剂是抗CD3抗体，而提供共刺激信号的试剂是抗CD28抗体；两种试剂以相等分子数量共固定于同一珠粒上。在一个实施方案中，为了T细胞的扩增和T细胞的生长，使用1∶1的比率将每种抗体结合于珠粒上。在本发明的某些方面，与使用1∶1比率时所观察到的扩增相比，在使用某个比率将抗CD3∶CD28抗体结合于珠粒上时观察到T细胞扩增增加。在一个具体的实施方案中，与使用1∶1比率时所观察到的扩增相比，观察到大约0.5至大约3倍的增加。在一个实施方案中，结合于珠粒的抗CD3∶CD28抗体比率范围为100∶1至1∶100，且覆盖其中所有整数值。在本发明的一个方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体结合于颗粒上，即CD3∶CD28比率小于1。在本发明的某些实施方案中，结合于珠粒上的抗CD28抗体对抗CD3抗体的比率大于2∶1。在一个具体的实施方案中，使用了1∶100的与珠粒结合的CD3∶CD28抗体比率。在另一个实施方案中，使用了1∶75的与珠粒结合的CD3∶CD28抗体比率。在还有一个实施方案中，使用了1∶50的与珠粒结合的CD3∶CD28抗体比率。在另一个实施方案中，使用了1∶30的与珠粒结合的CD3∶CD28抗体比率。在一个优选的实施方案中，使用了1∶10的与珠粒结合的CD3∶CD28抗体比率。在另一个实施方案中，使用了1∶3的与珠粒结合的CD3∶CD28抗体比率。在还有一个实施方案中，使用了3∶1的与珠粒结合的CD3∶CD28抗体比率。

可以使用1∶500至500∶1及两者之间任何整数值的颗粒对细胞比率来刺激T细胞或其它靶细胞。正如本领域普通技术人员所容易认识到的，颗粒对细胞的比率可能取决于颗粒相对于靶细胞的大小。例如，小尺寸珠粒只能结合少数细胞，而较大珠粒能结合许多。在某些实施方案中，也可以使用1∶100到100∶1及两者之间任何整数值的细胞对颗粒比率来刺激T细胞，而在其它实施方案中，所述比率包括1∶9至9∶1及两者之间任何整数值。导致T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联颗粒对T细胞的比率可以如上文所述发生变化，然而某些优选值包括至少1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1至6∶1，一个优选比率是至少1∶1颗粒/T细胞。在一个实施方案中，使用了1∶1或更低的颗粒对细胞比率。在另一个实施方案中，颗粒对细胞比率可以根据刺激天数而变化。例如，在一个实施方案中，第一天的颗粒对细胞比率是1∶1至10∶1，并且每天或隔天向细胞中添加额外颗粒达10天，终比率为1∶1至1∶10(根据添加日的细胞计数)。在一个具体的实施方案中，刺激第一天的颗粒对细胞比率是1∶1，并且在刺激第三天和第五天调整至1∶5。在另一个实施方案中，每天或隔天添加颗粒至刺激第一天的终比率为1∶1且刺激第三天和第五天为1∶5。在另一个实施方案中，刺激的第一天的颗粒对细胞比率是2∶1，并且在刺激第三天和第五天调整至1∶10。在另一个实施方案中，每天或隔天添加颗粒至刺激第一天的终比率为1∶1且刺激第三天和第五天为1∶10。本领域技术人员将认识到多种其它比率也可能适用于本发明。具体而言，比率将根据颗粒大小以及细胞大小和类型而变化。

使用某些方法在大约12至大约14天后将T细胞与刺激物分离对于在初始激活和刺激后保持T细胞群长期刺激可能是有利的。例如，通过诸如使用库尔特粒度仪(coulter counter)检查T细胞大小或测量T细胞体积，定期(如每天)监测T细胞增殖速率。在这方面，休眠T细胞的平均直径为大约6.8微米，而在初始激活和刺激后，在存在刺激配体时，T细胞的平均直径将在第四天增加至超过12微米，并在大约第六天开始下降。当T细胞平均直径下降到大约8微米时，可以再次激活和再次刺激T细胞以诱导进一步的T细胞增殖。或者，可以通过测定细胞表面分子诸如在激活T细胞上诱导的CD154、CD54、CD25、CD137、CD134的存在来监测T细胞增殖速率和T细胞再刺激时间。

为了诱导CD4⁺和/或CD8⁺T细胞群的长期刺激，可能必需用刺激剂诸如抗CD3抗体和抗CD28抗体(B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，法国))或单克隆抗体ES5.2D8再激活或再刺激T细胞数次以生成与原始T细胞群相比数量增加大约10倍至大约1000倍的CD4⁺和/或CD8⁺细胞群。例如，在本发明的一个实施方案中，如实施例1中所述刺激T细胞2-3次。在另一个实施方案中，如实施例1中所述刺激T细胞4或5次。使用本发明的方法，有可能使与刺激前相比多克隆性增加的T细胞数目达到大约100倍至大约100,000倍。此外，通过本发明方法扩增的T细胞向培养物上清液中分泌大量(substantial)水平的细胞因子(如IL-2、IFN-γ、IL-4、GM-CSF和TNF-α)。例如，与IL-2刺激相比，通过使用抗CD3和抗CD28共刺激扩增的CD4⁺T细胞向培养基中分泌高水平的GM-CSF和TNF-α。可以由培养物上清液纯化这些细胞因子，或者可以将上清液直接用于在培养中维持细胞。类似地，通过本发明方法扩增的T细胞与培养物上清液和细胞因子一起可用于支持细胞的体内生长。

在一个实施方案中，用例如共同固定于珠粒(3×28珠粒)上的抗CD3和抗CD28抗体进行T细胞刺激，时间足以使细胞回复静止状态(低或无增殖)(初始刺激后大约8-14天)。然后由细胞除去刺激信号，清洗细胞并将其灌输回患者体内。正如实施例所证明的，通过本发明的方法使刺激期结束时的细胞变成“超级可诱导的”，如通过这些细胞应答抗原的能力及其展示记忆样表型的能力所证实。因此，通过灌输后外源或体内抗原的再刺激后，经激活的T细胞展示以独特表型特性为特征的强烈应答，诸如保持CD154表达、增加细胞因子产量、等等。

在本发明其它实施方案中，将细胞诸如T细胞联合经试剂包被或缀合的珠粒，随后分离珠粒和细胞，然后培养细胞。在备选的实施方案中，在培养前，不分离经试剂包被或缀合的珠粒和细胞而是一起培养。在另一个实施方案中，首先应用压力浓缩珠粒和细胞，导致细胞表面部分连接，从而诱导细胞刺激和/或激活信号的极化。

举例而言，当T细胞是靶细胞群时，通过允许附着了抗CD3和抗CD28的顺磁珠粒(3×28珠粒)接触待制备T细胞接触，可以连接细胞表面部分。在一个实施方案中，在缓冲液优选PBS(无二价阳离子诸如钙和镁)中合并细胞(例如10⁴至10⁹个T细胞)和珠粒(例如DYNABEADSM-450CD3/CD28 T顺磁珠粒，比率1∶1)。此外，本领域普通技术人员可以容易的认识到可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可能非常稀少，而且只占样品的0.01％，或者整个样品(即100％)可能包含目的靶细胞。因此，任何细胞数目都属于本发明的范围内。在某些实施方案中，可能期望显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即提高细胞浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用的浓度是大约2×10⁹个细胞/ml。在另一个实施方案中，使用的浓度超过1×10⁸个细胞/ml。在另一个实施方案中，使用的细胞浓度是10、15、20、25、30、35、40、45、或50×10⁶个细胞/ml。在还有一个实施方案中，使用的细胞浓度是75、80、85、90、95或100×10⁶个细胞/ml。在其它实施方案中，可使用的浓度是125或150×10⁶个细胞/ml。高浓度的使用会导致细胞产量、细胞激活、和细胞扩增的增加。另外，高细胞浓度的使用能够更有效的捕捉可能微弱表达目的靶抗原的细胞，诸如CD28阴性T细胞。这些细胞群可能具有治疗价值而且将期望获得。例如，高细胞浓度的使用能够更有效的选择通常具有较弱CD28表达的CD8⁺T细胞。

在一个相关实施方案中，可能希望使用较低细胞浓度。通过显著稀释T细胞和颗粒的混合物，颗粒和细胞之间的相互作用被最小化。这能够选择大量表达将结合颗粒的预期抗原的细胞。例如，与CD8⁺T细胞相比，CD4⁺T细胞在稀释的浓度中表达较高水平的CD28且得到更有效的捕捉和刺激。在一个实施方案中，使用的细胞浓度是大约5×10⁶/ml。在其它实施方案中，所用浓度可以是大约1×10⁵/ml至大约1×10⁶/ml及两者之间任何整数值。

用于悬浮细胞的缓冲液可以是适用于特定细胞类型的任何缓冲液。在使用某些细胞类型时，缓冲液可以包含在处理过程中维持细胞完整所必需的其它组分，如1-5％血清。在另一个实施方案中，可以在细胞培养基中合并细胞和珠粒。例如可以通过旋转、搅动或任何混合手段混合细胞和珠粒，时间范围为1分钟至数小时。然后通过压力诸如置于磁场中来浓缩珠粒和细胞的容器。例如通过蠕动泵抽吸除去培养基和未结合的细胞，并清洗附着于珠粒或其它表面的细胞，然后重悬于适合于细胞培养的培养基。

在本发明的一个实施方案中，可以将混合物培养30分钟至数小时(达约3小时)至大约14天或两者之间任何整数值(以小时和分钟计)。在另一个实施方案中，将混合物培养21天。在本发明的一个实施方案中，将珠粒和T细胞一起培养大约8天。在另一个实施方案中，将珠粒和T细胞一起培养2-3天。如上文所述，可能需要数个刺激循环使得T细胞的培养时间可以达到60天或更多。适合于T细胞培养的条件包括可能包含增殖和生存所必需的因子的合适培养基(如最低限度基本培养基(MinimalEssential Media)或RPMI培养基1640或X-vivo15，(Bio Whittaker))，包括血清(如胎牛或人血清)或白介素-2(IL-2)、胰岛素、或本领域技术人员知道的任何其它细胞生长添加剂。培养基可以包括RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、和X-Vivo 20，并添加氨基酸和维生素，或者不含血清或者补充适量血清(或血浆)或限定的一组激素、和/或T细胞生长和扩增足够量的细胞因子。只有实验性培养基包含抗生素如青霉素和链霉素，而将要灌输到受试者体内的细胞培养基则不含。在支持生长所必需的条件下维持靶细胞，例如合适的温度(如37℃)和气氛(如空气加5％的CO₂)。

在另一个实施方案中，可以如此改动或调整暴露于刺激剂诸如经抗CD3/抗CD28(即3x28)包被珠粒的时间以获得期望的T细胞表型。或者，可以在刺激前使用许多选择技术来选择期望的T细胞群。可能需要较多的辅助T细胞群(T_H)，典型地CD4⁺而非CD8⁺细胞毒性或调节性T细胞，因为T_H细胞的扩增能够改善或恢复整个免疫响应。尽管许多特异性免疫应答是由CD8⁺抗原特异性T细胞介导的，它能够直接裂解或杀死靶细胞，然而大多数免疫应答需要CD4⁺T细胞的帮助，它表达重要的免疫调节分子，诸如例如GM-CSF、CD40L、和IL-2。在优选由CD4介导的辅助的情况中，保持或提高CD4∶CD8比率的方法诸如本文所述可能是特别有利。提高CD4⁺T细胞的数量能够增加导入患者体内的由细胞表达的CD40L的量，潜在的提高靶细胞的可见度(改善APC功能)。通过增加表达GM-CSF或IL-2(所有主要由CD4⁺T细胞表达)的灌输细胞的数目可以观察到相似效果。或者，在不太需要CD4辅助且需要增加CD8⁺T细胞数目的情况中，也可以使用本文所述的XCELLERATE^TM方法(见实施例1)，通过例如在刺激和/或培养前预选择CD8⁺细胞。这些情况可能存在于优选IFN-γ水平增加或靶细胞细胞裂解增加的情况中。还可以改变暴露于刺激剂的时间和类型以扩增具有期望的TCR全集如表达期望的Vβ家族基因的T细胞。

为了完成不同T细胞群的分离，可以改变暴露于颗粒的时间。例如，在一个优选的实施方案中，通过与3×28珠粒诸如Dynabeads M-450一起保温来分离T细胞，时间足以正选择期望的T细胞。在一个实施方案中，保温时间是大约30分钟。在另一个实施方案中，时间是至少1、2、3、4、5、或6小时。在还有一个优选的实施方案中，时间是10-24小时或更多。在一个优选的实施方案中，保温时间是24小时。为了由癌症患者分离T细胞，使用较长保温时间诸如24小时能够提高细胞产量。

在某些实施方案中，刺激和/或扩增时间可以是10周或以下、8周或以下、4周或以下、2周或以下、10天或以下、8天或以下(4周或以下包括4周至1天(24小时)的范围内所有时间或这两个数字之间的所有值)。在一些实施方案中，可能需要使用例如有限稀释或细胞分拣来克隆T细胞，其中较长刺激时间可能是必需的。在一些实施方案中，刺激和扩增可以进行6天或以下、4天或以下、2天或以下，而在其它实施方案中是少至24小时或更少时间，且优选4-6小时或更少时间(这些范围包括两个数字之间的任何整数值)。当T细胞刺激进行较短时间时，T细胞群的数目可能不会显著增加，但群落将提供更强劲和健康的激活后T细胞，它们能够继续在体内增殖而且更加紧密类似于天然效应物T细胞集合。由于T细胞辅助的可用性常常是针对蛋白质抗原的抗体应答中的限制因素，选择性扩增富含CD4⁺的T细胞群或将其选择性灌输到受试者体内的能力是极其有利的。这些富集群的其它优势是显而易见的，原因在于识别B淋巴细胞所呈递抗原的激活的辅助T细胞释放两类刺激一物理接触和细胞因子生成，这导致B细胞增殖和分化。

在多个实施方案中，本领域普通技术人员能够理解由细胞中消除刺激信号取决于所用表面类型。例如，若使用顺磁珠粒，则磁性分离是可行的选择。分离技术详细描述于顺磁珠粒制造商的说明书中(例如DYNAL公司，奥斯陆，挪威)。此外，若表面是大到足以与细胞分离的珠粒，则可以使用过滤。另外，多种灌输滤器已经商品化，包括20微米和80微米灌输滤器(Baxter)。因此，只要珠粒大于滤器的网眼尺寸，这种过滤就是高度有效的。在一个相关实施方案中，珠粒可以穿过滤器，但细胞可以保留，这样就能够进行分离。在一个具体的实施方案中，所用生物相容表面在暴露期间在培养物中降解(即是生物可降解的)。

尽管可以容易的由公开来源诸如ATCC获得本文所述方法中所使用的抗体，还是可以通过标准技术生成针对T细胞辅助分子和CD3复合物的抗体。用于生成本发明方法中所用抗体的方法学在本领域是众所周知的并在本文中有更为详细的描述。

表面上的配体固定

正如上文所述，本发明的方法优选使用结合表面的配体。表面可以是能够使配体结合其上或整合其中的任何表面，而且是生物相容的，即对待刺激的靶细胞完全无毒。生物相容表面可以是生物可降解的或非生物可降解的。表面可以是天然的或合成的，而合成表面可以是聚合物。表面可以包括胶原、纯化的蛋白质、纯化的肽、多糖、糖胺聚糖、细胞外基质组合物、脂质体、或细胞。多糖可以包括例如纤维素、琼脂糖、右旋糖苷、脱乙酰壳多糖，透明质酸、或藻酸盐。其它聚合物可以包括聚酯、聚醚、聚酐、聚烷基氰基丙烯酸酯(盐)、聚丙烯酰胺、聚原酸酯、聚磷腈、聚乙酸乙烯酯、嵌段共聚物、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、或聚氨基甲酸酯。聚合物可以是乳酸或共聚物。共聚物可以包括乳酸和乙醇酸(PLGA)。非生物可降解的表面可以包括聚合物诸如聚(二甲基硅氧烷)和聚(乙烯-乙酸乙烯酯)。生物相容表面包括例如玻璃(如生物玻璃)、胶原、几丁质、金属、羟磷灰石、铝酸盐、生物陶瓷材料、透明质酸聚合物、藻酸盐、丙烯酸酯聚合物、乳酸聚合物、乙醇酸聚合物、乳酸/乙醇酸聚合物、纯化的蛋白质、纯化的肽、或细胞外基质组合物。包含其它聚合物的表面可以包括玻璃、硅石、硅、羟磷灰石、水凝胶、胶原、丙烯醛、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龙、或许多塑料或合成有机聚合物、等等。表面可以包括生物学结构，诸如脂质体或细胞表面。表面可以是脂质、板、袋、丸、纤维、筛网、或颗粒的形式。颗粒可以包括胶粒、微球体、纳米微粒、珠粒、等等。在多个实施方案中，可以使用商品化表面诸如珠粒或其它颗粒(如Miltenyi颗粒，Miltenyi Biotec，德国；琼脂糖珠粒，Pharmacia FineChemicals，瑞典；DYNABEADS^TM，Dynal公司，纽约；PURABEADS^TM，Prometic Biosciences)。

在使用珠粒时，珠粒可以是能够实现靶细胞刺激的任何大小。在一个实施方案中，珠粒的大小优选大约5纳米至大约500微米。因此，珠粒大小的选择取决于珠粒的具体用途。例如，若将珠粒用于消除单核细胞，则选择小尺寸以便于单核细胞摄入(如直径2.8μm和4.5μm或可被吞没的任何大小，诸如纳米尺寸)；然而，在期望通过过滤分离珠粒时，典型使用大小不小于50μm的珠粒。此外，在使用顺磁珠粒时，珠粒大小范围典型为大约2.8μm至大约500μm，更优选大约2.8μm至大约50μm。最后，可以选择使用可以小至大约10nm的超顺磁纳米微粒。因此，正如上文讨论中显而易见的，事实上可以采用任何颗粒大小。

可以通过本领域已知且和可获得的多种方法将试剂附着或偶联或整合到表面中。试剂可以是天然配体、蛋白质配体、或合成配体。附着可以是共价或非共价的、静电的、或疏水的，而且可以通过多种附着手段来实现，包括例如化学的、机械的、酶促的、静电的、或使得配体能够刺激细胞的其它方式。试剂的附着可以是直接的或间接的(如受束缚)。例如，首先可以将针对配体的抗附着于表面(直接附着)，或者可以将亲和素或链霉亲和素或结合第一抗的第二抗附着于表面，用于结合生物素化的配体(间接附着)。可以通过抗独特型抗体将针对配体的抗体附着于表面。另一个范例包括使用附着于表面的蛋白A或蛋白G或其它非特异性抗体结合分子来结合抗体。或者，可以通过化学手段将配体附着于表面，诸如使用商品化交联剂(Pierce，罗克福德，伊利诺斯州)或其它手段与表面交联。在某些实施方案中，将配体共价结合到表面上。另外，在一个实施方案中，依照制造商的说明书将商品化的经甲苯磺酰基活化的DYNABEADS^TM或含有环氧表面反应基团的DYNABEADS^TM与目的多肽配体一起保温。简而言之，这些条件典型涉及在pH4至pH9.5的磷酸盐缓冲液中于4至37℃温度范围保温。

一方面，试剂诸如某些配体可以是单一来源或多重来源的而且可以是抗体或其片段，而另一方面，在使用T细胞时，共刺激配体是B7分子(如B7-1、B7-2)。这些配体通过上文讨论的任何不同附着手段偶联于表面上。待偶联于表面上的B7分子可以分离自表达共刺激分子的细胞，或使用能够生成并分离本文所述共刺激分子的标准重组DNA技术和表达系统而获得。还可使用在偶联于细胞表面时保留了在T细胞中触发共刺激信号的能力的B7分子片段、突变体、或变体。此外，本领域普通技术人员将认识到还可以将在激活和诱导T细胞子集增殖中有用的任何配体固定于珠粒或培养容器表面或任何表面。另外，当配体与表面的共价结合是一种优选方法时，还可以使用通过二级单克隆抗体的吸附或捕捉。例如若表面是珠粒，则可以通过流式细胞术分析而容易的测定表面上附着的特定配体的量；若表面是组织培养皿、筛网、纤维、袋，则可以通过酶联免疫吸附检测法(ELISA)进行测定。

在一个具体的实施方案中，B7分子的刺激形式或抗CD28抗体或其片段与刺激TCR/CD3复合物的试剂诸如抗CD3抗体附着于相同的固相表面。除了抗CD3抗体，还可以使用结合模仿抗原信号的受体的其它抗体。例如，可以用抗CD2抗体与B7分子组合，特别是抗CD3抗体与抗CD28抗体组合包被珠粒或其它表面。

在偶联于表面时，可以将试剂偶联于同一表面(即以“顺式”方式)或不同表面(即以“反式”方式)。或者，可以将一种试剂偶联于表面上，而另一种试剂存在溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的试剂结合于细胞表面上，而提供初级激活信号的试剂则存在溶液中或偶联于表面上。在一个优选的实施方案中，两种试剂固定于珠粒上，或是同一珠粒即“顺式”，或是不同珠粒即“反式”。举例而言，提供初级激活信号的试剂是抗CD3抗体，而提供共刺激信号的试剂是抗CD28抗体；两种试剂以相等分子数量共固定于同一珠粒上。在一个实施方案中，为了CD4⁺T细胞的扩增和T细胞的生长，使用1∶1的比率将每种抗体结合于珠粒上。在本发明的某些方面，与使用1∶1比率时所观察到的扩增相比，在使用某个比率将抗CD3∶CD28抗体结合于珠粒上时观察到T细胞扩增增加。在一个具体的实施方案中，与使用1∶1比率时所观察到的扩增相比，观察到大约0.5至大约3倍的增加。在一个实施方案中，抗CD3∶CD28抗体结合于珠粒的比率范围为100∶1至1∶100，且覆盖其中所有整数值。在本发明的一个方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体结合于颗粒上，即CD3∶CD28比率小于1。在本发明的某些实施方案中，结合于珠粒上的抗CD28抗体对抗CD3抗体的比率大于2∶1。在一个具体的实施方案中，使用了1∶100的与珠粒结合的CD3∶CD28抗体比率。在另一个实施方案中，使用了1∶75的与珠粒结合的CD3∶CD28抗体比率。在还有一个实施方案中，使用了1∶50的与珠粒结合的CD3∶CD28抗体比率。在另一个实施方案中，使用了1∶30的与珠粒结合的CD3∶CD28抗体比率。在一个优选的实施方案中，使用了1∶10的与珠粒结合的CD3∶CD28抗体比率。在另一个实施方案中，使用了1∶3的与珠粒结合的CD3∶CD28抗体比率。在还有一个实施方案中，使用了3∶1的与珠粒结合的CD3∶CD28抗体比率。

试剂

本发明关注的试剂包括蛋白质配体、天然配体、和合成配体。能够结合细胞表面部分且在某些条件下引起连接和聚集继而产生信号的试剂包括但不限于凝集素(例如植物凝集素(PHA)、扁豆凝集素(lentil lectin)、伴刀豆球蛋白A)、抗体、抗体片段、肽、多肽、糖肽、受体、B细胞受体和T细胞受体配体、细胞外基质组分、类固醇、激素(例如生长激素、皮质类固醇、前列腺素、tetra-iodo thyronine)、细菌部分(诸如脂多糖)、促细胞分裂剂、超抗原及其衍生物、生长因子、细胞因子、粘附分子(诸如L-选择蛋白、LFA-3、CD54、LFA-1)、趋化因子、和小分子。可以由天然来源诸如细胞、血液制品、和组织或者由体外繁殖的细胞分离试剂，重组制备、化学合成、或通过本领域技术人员知道的其它方法。

在本发明的一个方面，当希望刺激T细胞时，有用的试剂包括分别能够结合CD3/TCR复合物、CD2、和/或CD28并启动激活或增殖的配体。因此，术语配体包括作为细胞表面蛋白质的“天然”配体的那些蛋白质，诸如对于CD28的B7分子，以及人工配体诸如针对细胞表面蛋白质的抗体。可以依照常规技术来生成这些抗体及其片段，诸如杂交瘤法和重组DNA和蛋白质表达技术。有用的抗体和片段可以衍生自任何物种，包括人，或者可以是采用来自超过一种物种的序列的嵌合蛋白的形式。

本领域众所周知的方法可用于生成对配体特异的抗体、多克隆抗血清、或单克隆抗体。还可以作为经遗传改造的免疫球蛋白(Ig)或Ig片段而生成设计具有期望特性的抗体。例如，作为示例而非限制，抗体可以包括作为嵌合的融合蛋白而具有至少一个来自第一种哺乳动物物种的可变(V)区结构域和至少一个来自第二种不同哺乳动物物种的恒定区结构域的重组IgG。最常见的是，嵌合抗体具有鼠可变区序列和人恒定区序列。可以通过将衍生自鼠抗体的、赋予抗原结合特异性的互补决定区(CDR)移植到衍生自人的V区框架区和衍生自人的恒定区中而将这种鼠/人嵌合免疫球蛋白“人源化”。还可以合并包含不同特异性CDR的抗体而生成多重特异性(双重或三重特异性等)抗体。可以通过蛋白水解消化或任选的蛋白水解消化后继以温和还原二硫键和烷化或者通过重组遗传工程技术而生成这些分子的片段。

若抗体以高于或等于大约10⁴M^-1、优选高于或等于大约10⁵M^-1、更优选高于或等于大约10⁶M^-1、且仍然更优选高于或等于大约10⁷M^-1的亲合力常数Ka特异结合抗原，则将它们定义为“免疫特异性的”。使用常规技术例如Scatchard等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 51：660，1949)所描述的或者通过表面激元共振(surface plasmon resonance)(BIAcore，Biosensor，皮斯卡塔韦，新泽西州)可以容易的测定结合配偶体或抗体的亲合力。参阅如Wolff等人，Cancer Res.53：2560-2565，1993。

一般可以通过本领域普通技术人员知道的任何多种技术来制备抗体(参阅如Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，1988，冷泉港实验室)。在这样的一种技术中，用作为抗原的配体免疫动物以生成多克隆抗血清。合适的动物包括兔、绵羊、山羊、猪、牛，而且可以包括较小的哺乳动物物种，诸如小鼠、大鼠、和仓鼠。还可以如美国专利号6,150,584、6,130,364、6,114,598、5,833,985、6,071,5 17、5,756,096、5,736,137、和5,837,243中所述来生成本发明的抗体。

免疫原可以包括表达配体的细胞、纯化或部分纯化的配体多肽或其变体或片段、或配体肽。可以通过蛋白水解切割或化学合成来生成配体肽。可以通过依照本领域熟练技术人员知道的方法分析配体的一级、二级、或三级结构选择适于免疫的肽以确定更有可能在宿主动物中产生抗原应答的氨基酸序列，从而选择用于免疫的肽(参阅如Novotny，Mol.Immunol.28：201-207，1991；Berzoksky，Science 229：932-40，1985)。

免疫原的制备可以包括将配体多肽或其变体或片段或者肽共价偶联另一种免疫原性蛋白质，诸如匙孔血蓝蛋白或牛血清清蛋白。另外，可以将肽、多肽、或细胞在佐剂中乳化(参阅Harlow等人，Antibodies：ALaboratory Manual，1988，冷泉港实验室)。一般而言，第一次注射后，依照动物物种的优选计划，动物接受一次或多次加强免疫。可以通过定期采血动物、分离血清、并在免疫测定诸如Ouchterlony测定中分析血清以评估特定抗体滴度来监测免疫应答。一旦确定抗体滴度，可以定期采血动物以积累多克隆抗血清。然后可以由这些抗血清纯化特异结合配体多肽或肽的多克隆抗体，例如通过使用偶联了合适固相支持物的蛋白A或配体多肽或肽的亲和层析。

例如，可以使用Kohler和Milstein的技术(Nature 256：495-497，1975；Eur.J.Immunol.6：511-519，1976)及其改进来制备特异结合配体多肽或其片段或变体的单克隆抗体。可以生成杂交瘤即永生真核细胞系，其生成的抗体对配体多肽或其变体或片段具有预期特异性。用如上文所述制备的配体免疫原免疫动物，例如大鼠、仓鼠、或优选小鼠。可以通过融合经药物敏化的骨髓瘤细胞融合配偶体(优选与免疫的动物是同源的)而将获自免疫动物的淋巴细胞-最常见的是脾细胞-永生化。可以将脾细胞和骨髓瘤细胞与膜融合促进剂诸如聚乙二醇或非离子去污剂一起混合几分钟，然后以低密度接种于支持杂交瘤细胞而非骨髓瘤细胞生长的选择性培养基。优选的选择培养基是HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)。足够时间后，通常是大约1至2周，观察到细胞群落。分离单群落，并对由细胞生成的抗体测试对配体多肽或其变体或片段的结合亲合力。优选所生成抗体对配体抗原具有高亲合力和特异性的杂交瘤。本发明关注所生成单克隆抗体特异结合配体多肽或其变体或片段的杂交瘤。

可以由杂交瘤培养物的上清液分离单克隆抗体。用于生成鼠单克隆抗体的另一种方法是将杂交瘤细胞注射到同系小鼠的腹膜腔内。小鼠生成含有单克隆抗体的腹水。可以通过常规技术诸如层析、凝胶过滤、沉淀、或抽提从抗体消除杂质。

可以通过许多技术来生成人单克隆抗体。方法包括但不限于EB病毒(EBV)转化人外周血细胞(参阅美国专利号4,464,456)、体外免疫人B细胞(参阅如Boemer等人，J.Immunol.147：86-95，1991)、融合来自经免疫的携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠的脾细胞和融合来自经免疫的携带免疫球蛋白基因(通过酵母人工染色体(YAC)插入)的转基因小鼠的脾细胞(参阅如美国专利号5,877,397；Bruggemann等人，Curr.Opin.Biotechnol.8：455-58，1997；Jakobovits等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.764：535-35，1995)、或分离自人免疫球蛋白V区噬菌体文库。

可以生成本发明中使用的嵌合抗体和人源化抗体。嵌合抗体具有至少一个衍生自第一种哺乳动物物种的恒定区结构域和至少一个衍生自第二种不同哺乳动物物种的可变区结构域(参阅如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-55，1984)。更常见的是，可以通过将编码至少一个衍生自非人单克隆抗体的可变区结构域诸如衍生自鼠、大鼠、或仓鼠单克隆抗体的可变区的多核苷酸序列克隆到包含编码至少一个人恒定区的序列的载体中来构建嵌合抗体(参阅如Shin等人，Methods Enzymol.178：459-76，1989；Walls等人，Nucleic Acids Res.21：2921-29，1993)。选择的人恒定区可能依赖具体抗体所期望的效应物功能。本领域已知用于生成嵌合抗体的另一种方法是同源重组(美国专利号5,482,856)。优选的是，将载体转染到真核细胞中用于稳定表达嵌合抗体。

可以进一步遗传改造非人/人嵌合抗体以生成“人源化”抗体。这种抗体具有衍生自非人哺乳动物物种的免疫球蛋白的众多CDR、至少一个人可变框架区、和至少一个人免疫球蛋白恒定区。与非人单克隆抗体或嵌合抗体相比，人源化可能生成结合亲合力降低的抗体。因此，本领域技术人员可以使用一种或多种策略来设计人源化抗体。

在某些实施方案中，可能优选使用抗体的抗原结合片段。这些片段包括Fab片段或F(ab’)₂片段，分别可以通过木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的蛋白水解消化来制备。可以通过亲和层析将抗原结合片段与Fc片段分开，例如使用固定化蛋白A或固定化配体多肽或其变体或片段。用于生成Fab片段的另一种方法包括温和还原F(ab’)₂片段并随后烷化(参阅如Weir，Handbook of Experimental Immunology，1986，Blackwell Scientfic，波士顿)。

可以将任何上文所述Ig分子的非人、人、或人源化重链和轻链可变区构建成单链Fv(sFv)片段(单链抗体)。参阅如Bird等人，Science 242：423-426，1988；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883，1988。可以通过在同一读码框内连接编码sFv的多核苷酸序列与编码多种效应蛋白的多核苷酸序列而生成多功能融合蛋白。这些方法在本领域是已知的且公开的，例如EP-B1-0318554、美国专利号5,132,405、美国专利号5,091,513、和美国专利号5,476,786。

用于选择特异结合配体多肽或其变体或片段的另一种方法是噬菌体展示(参阅如Winter等人，Annul.Rev.Immunol.12：433-55，1994；Burton等人，Adv.Immunol.57：191-280，1994)。可以在能够进行筛选的噬菌体载体中构建人或鼠免疫球蛋白可变区基因组合库以选择特异结合配体多肽或其变体或片段的Ig片段(Fab、Fv、sFv、或其多聚体)(参阅如美国专利号5,223,409；Huse等人，Science 246：1275-81，1989；Kang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4363-66，1991；Hoogenboom等人，J.Molec.Biol.227：381-388，1992；Schlebusch等人，Hybridoma 16：47-52，1997及其引用的参考文献)。

使用方法

除了上文所述方法，通过本文所述方法刺激和/或激活的细胞可用于多个领域。可以将本发明的多克隆性增加的T细胞灌输到怀疑或观察到T细胞集合偏转的任何个体体内。可以将本发明的多克隆性增加的T细胞灌输到供体体内以提供广泛且有效的免疫保护。在本发明的内容中，本文所述组合物和方法可用于治疗无免疫应答个体，如具有免疫学缺陷或本文所述偏转的T细胞集合(或是天然发生的或是由药物或治疗人工诱导的)的个体。

在某些实施方案中，无免疫应答个体是天生无免疫应答的，即归咎于先天存在的原因，诸如本文所述任何疾病或紊乱。在其它实施方案中，个体是通过诱导达到无免疫应答状态的，例如针对本文所述任何疾病的许多治疗的结果。在此背景中，个体可能无免疫应答，或者换言之，可能具有免疫学缺陷或偏转的T细胞集合，是因为化疗、通常在移植领域施行的治疗、细胞毒性试剂、免疫抑制剂或导致本文所述改变或偏转的T细胞集合的任何其它治疗的结果。在某些实施方案中，个体无免疫应答是化疗、辐射、或诸如环孢霉素、硝基咪唑硫嘌呤、氨甲蝶呤、mycophenolate、和FK506等试剂的治疗、抗体、或其它免疫消融剂诸如CAMPATH、抗CD3抗体、细胞毒素、fludaribine、环孢霉素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228、和照射的结果。这些药物或是抑制依赖钙的磷酸酶钙神经素(环孢霉素和FK506)，或是抑制对生长因子诱导的信号而言重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人，Cell 66：807-815，1991；Henderson等人，Immun.73：316-321，1991；Bierer等人，Curr.Opin.Immun.5：763-773，1993；Isoniemi(见上文))。

天然发生的免疫应答为任何给定抗原挑选一些免疫显著表位，对这些表位具有特异性的T细胞得到激活、扩增、并介导免疫应答。不幸的是，许多其它潜在表位未能在体内T细胞激活过程中参与竞争，而是在免疫应答中保持未激活/不参与，从而提高了病原体/肿瘤制服免疫监督的可能性。通过激活和提高供体T细胞的多克隆性，这些具有能够应答靶抗原的TCR的不太显著的T细胞能够得到驱使而达到响应改善的状态，使得它们成为免疫应答中潜在的玩家。这扩宽了免疫系统中具有不同特异性的全套T细胞以挑战任何免疫学损伤。这种方法因而用于帮助针对窄免疫应答作为作用模式时发生的逃逸变体的保护。

本文所述的方法学可用于选择性扩增在TCR表达方面多克隆性增加的CD28⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD45RA⁺、和/或CD45RO⁺T细胞群，从而用于治疗传染性疾病、自身免疫性疾病、许多癌症、血液学疾病(如血细胞减少症)、与移植共存(如造血干细胞移植)或多种免疫缺陷状态或状况之任一，和用于免疫治疗。结果，可以生成表达TCR的T细胞群，所述TCR在抗原反应性方面是多克隆的，但在CD4⁺或CD8⁺方面本质上是同源的。另外，此方法容许将T细胞数目扩增至足以重建个体的总CD4⁺或CD8⁺T细胞群(个体淋巴细胞总数是大约5×10¹¹)。还可以遗传转导由此生成的T细胞群并用于免疫治疗，或者可用于体外分析传染性试剂的方法。例如，可以由患有癌症的个体获得肿瘤浸润的淋巴细胞群，并刺激T细胞扩增至足够数目。可以遗传转导由此生成的T细胞群以表达肿瘤坏死因子(TNF)或其它蛋白质(例如许多细胞因子、凋亡抑制剂(如Bcl-2)、保护细胞免于HIV感染的基因诸如RevM10或intrakines等、靶向分子、粘附和/或归巢分子和多种抗体或其片段之任一(如scFv))并给予个体。

本发明CD4⁺T细胞群的一种具体用途是治疗个体的HIV感染。长期HIV感染最终导致CD4⁺T淋巴细胞数目显著下降。这种下降继而引起深切的免疫缺陷状态，使得患者易于遭受一系列危急生命的机会感染。将CD4⁺T细胞数目补充至正常水平可能能够将免疫功能恢复至有效水平。因此，本文所述的方法提供了扩增CD4⁺T细胞数目至足以在HIV感染患者中重建该群体并增加其多克隆性的手段。可能还必需在长期刺激过程中避免感染T细胞，或者可能希望使得T细胞永久抵抗HIV感染。存在许多技术能够使得T细胞抵抗HIV感染或在将T细胞归还受感染个体前不能生成病毒。例如，可以在扩增前将CD4⁺T细胞与一种或多种抗逆转录病毒试剂一起培养以抑制HIV复制或病毒生成(如靶向逆转录酶和/或病毒机制其它部分的药物，参阅如Chow等人，Nature 361：650-653，1993)。

几种方法可用于遗传转导T细胞以生成抑制HIV感染或复制的分子。例如，在多个实施方案中，可以遗传转导T细胞以生成transdominant抑制剂、“分子假目标”、反义分子、或毒素。这些方法学更为详细的描述于美国专利申请号08/253,751、08/253,964、和PCT公布号WO95/33823。

在一个实施方案中，可以治疗恶性肿瘤诸如非何杰金淋巴瘤(NHL)和B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)。虽然已经在NHL中测试了使用扩增后T细胞的初步研究(参阅Liebowitz等人，Curr.Opin.Onc.10：533-541，1998)，本发明的T细胞群提供了能够显著增强免疫治疗和反应性成就的增强多克隆特征。如图3所示，对几种Vβ家族，B-CLL患者在T细胞群中具有TCR的单克隆或寡克隆表达。在12天XCELLERATE^TM方法后，对这些T细胞群恢复了TCR表达的多克隆性。另外，B-CLL患者存在特殊困难，包括外周血中相对T细胞数目低及白血病细胞负担高，伴随着普通的T细胞免疫抑制。本发明的T细胞群能够在治疗这种疾病尤其联合干细胞(CD34⁺)移植疗法时提供显著改善的功效。因此，用抗CD3x抗CD28共固定化珠粒增加T细胞功能和抗CLL T细胞活性将是有利的。

本发明还提供了用于在动物中预防、抑制、或减少癌症或恶性细胞存在的组合物和方法，包括对动物施用抗癌有效量的受试者激活后多克隆T细胞。

本发明所关注的、诱导的免疫应答所针对的、或者待预防、抑制、或减少存在的癌症可以包括但不限于黑素瘤、非何杰金淋巴瘤、何杰金病、白血病、浆细胞瘤、肉瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肾癌、肾细胞癌、胰腺癌、鼻咽癌、食道癌、脑癌、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、急性成淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、大颗粒淋巴细胞性白血病(LGL)、和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在一个实施方案中，癌症是B细胞慢性淋巴细胞性白血病。

本发明的组合物和方法还可用于在已经接受了化疗、细胞毒性试剂、或本文所述和本领域技术人员知道的任何免疫抑制剂治疗的个体中恢复免疫响应。在另一个实施方案中，本发明的组合物和方法可用于治疗(即恢复免疫响应)已经接受了造血干细胞移植的个体。在某些实施方案中，将要用本发明组合物治疗的个体已经接受了脐带血、同种异体、自体、或异种细胞移植。

在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物可用于在已经接受了基因治疗或涉及能够引起T细胞集合偏转的基因转导的任何疗法的个体中恢复免疫响应。更具体的说，原代T淋巴细胞中的由逆转录病毒介导的基因转移能够在基因得到修改的细胞中诱导激活和转导/选择依赖性TCRVβ偏转。然而，使用本文所述方法修改基因后的细胞激活和刺激(如本文所述CD3/CD28共刺激)在CD4和CD8两种T细胞子集中预防TCRVβ集合的改变(偏转)。

在某些实施方案中，本发明的组合物和方法可用于在患有许多疾病的个体中恢复或以其它方式改善免疫响应，所述疾病与免疫机能失调有关，包括改变的T细胞集合，包括但不限于疾病诸如类风湿性关节炎、多发性硬化、胰岛素依赖型糖尿病、阿狄森病、脂泻病、慢性疲劳综合症、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、局限性回肠炎、Fibromyalgia、系统性红斑狼疮、牛皮癣、Sjogren氏综合症、甲状腺功能亢进/格雷夫斯病、甲状腺功能减退/桥本甲状腺炎、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、重症肌无力、子宫内膜异位、硬皮病、恶性贫血、古德帕斯彻综合症、韦格纳病、肾小球肾炎、再生障碍性贫血、多种血细胞减少症之任一、阵发性夜间血红蛋白尿、骨髓发育不良综合征、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、范科尼贫血、埃文斯综合症、因子VIII抑制剂综合症、因子IX抑制剂综合症、系统性血管炎、皮肌炎、多肌炎和风湿热。本文所述的方法和组合物可用于治疗特征为血球计数低的血液学疾病。

在某些实施方案中，本发明的组合物和方法可用于治疗与T细胞集合偏转有关的神经学疾病。在另一个实施方案中，本文所述组合物被用于治疗心血管疾病。

可以如本文所述刺激并扩增T细胞以诱导或增强对致病剂诸如病毒(如人免疫缺陷病毒)、细菌、寄生虫和真菌的响应。致病剂包括由传染性生物体引起的任何疾病。传染性生物体可以包括病毒(如单链RNA病毒、单链DNA病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、甲型、乙型、或丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、人乳头瘤病毒(HPV))、寄生虫(如原生动物和后生动物病原体，诸如疟原虫物种、利什曼原虫属物种、血吸虫属物种、锥虫属物种)、细菌(如分枝杆菌，特别是结核分枝杆菌、沙门氏菌属、链球菌属、大肠杆菌、葡萄球菌)、真菌(如假丝酵母物种、曲霉物种)、肺炎肺囊虫、和朊病毒(已知朊病毒感染动物而引起痒病，即绵羊和山羊神经系统的一种可传播的退化性疾病，以及牛海绵状脑病(BSE)，或“疯牛病”，和猫的猫科海绵状脑病。已知影响人的四种朊病毒疾病是库鲁病、克罗伊茨费尔特一雅各布病(CJD)、格-施-沙病(GSS)、和致命的家族性失眠症(FFI)。在用于本文时，“朊病毒”包括在所用任何动物-特别是人和驯养牲畜中引起所有或任何一种这些或其它疾病的所有形式的朊病毒。

可以如本文所述刺激和扩增T细胞从而在无免疫应答个体中诱导或增强响应，例如患有先天遗传病的个体，诸如严重联合免疫缺陷(SCID)或普通易变免疫缺陷(CVID)。在一个实施方案中，可以如本文所述刺激和扩增T细胞从而在由于与骨髓移植、化疗、放疗或其它癌症治疗有关的治疗而无免疫应答的个体中诱导或增强响应。在一个实施方案中，可以如本文所述刺激和扩增T细胞从而在患有免疫缺陷或自身免疫病的无免疫应答个体中诱导或增强响应。在还有一个实施方案中，可以刺激和扩增T细胞从而在患有影响肾、肝、或胰的慢性病的无免疫应答个体中诱导或增强响应。在一个特别的实施方案中，本发明的T细胞被用于在患有糖尿病的个体中诱导或增强响应。在另一个实施方案中，本发明的T细胞被用于在受老龄影响的个体中诱导和增强响应。

本发明还提供了由混合T细胞群选择性扩增T细胞特定子群的方法。具体而言，本发明提供了经特异性富集后CD4⁺和CD8⁺双阳性T细胞比率高得多的T细胞群。

本发明的另一个实施方案提供了由CD4⁺T细胞群选择性扩增T_H1细胞群的方法。在此方法中，用抗CD28抗体诸如单克隆抗体9.3共刺激CD4⁺T细胞而诱导T_H1特异细胞因子包括IFN-γ的分泌，导致T_H1细胞相对于T_H2细胞的富集。

本发明还提供了由CD4⁺T细胞群选择性扩增T_H2细胞群的方法。在此方法中，用抗CD28抗体诸如单克隆抗体B-T3、XR-CD28共刺激CD4⁺T细胞而诱导T_H2特异细胞因子的分泌，导致T_H2细胞相对于T_H1细胞的富集(参阅例如Fowler等人，Blood 84(10)：3540-9，1994年11月15日；Cohen等人，Ciba Found Symp 187：179-93，1994)。

本发明还提供了用于选择性扩增表达特定Vβ、Vα、Vγ、或Vδ基因的T细胞群的方法。例如，在此方法中，正或负选择表达特定Vβ、Vα、Vγ、或Vδ基因的T细胞，然后依照本发明的方法进一步扩增/刺激。或者，可以正或负选择表达特定目的Vβ、Vα、Vγ、或Vδ基因的经刺激扩增的T细胞，并进一步刺激和扩增。

在另一个实例中，直接将血液由患者抽取至独立的一次性装置，其中装有两种或多种固定化抗体(如抗CD3和抗CD28)或其它组分，从而在将细胞施用于受试者之前刺激T细胞激活所需要的受体(如固定在塑料表面或可分的微粒上)。在一个实施方案中，一次性装置可以包括具有适当管道连接的容器(如塑料袋或瓶)，适用于用注射器和无菌锚定装置combing/锚定。此装置将具有用于固定T细胞激活组分(如抗CD3和抗CD28抗体)的固体表面；可以是容器自身或插件的表面，通常是平面、蚀刻平面、不规则表面、多孔垫、纤维、临床可接受的/安全的含铁流体、珠粒、等。另外，在使用独立装置时，受试者与装置可以保持连接，或者装置与患者可以是可分开的。另外，可以在室温使用装置，或者使用可移动保温器在生理温度下温育。

既然用于采集和处理血液和血液制品的装置和方法是众所周知的，本领域技术人员将容易的认识到借助本文提供的技术，可以容易的设计满足上文所提出的要求的多种装置或改装现有装置。因此，正如这些装置和方法不受本文提出的特定实施方案的限制，而是包括能够维持无菌且将血液保持在流体形式的任何装置或方法，所述血液中补体激活降低，且在施用于受试者之前由血液或血液制品固定或分离T细胞激活所必需的组分(如抗CD3和抗CD28抗体或其配体)。另外，本领域普通技术人员能够容易的认识到多种血液制品可用于联合本文所述的装置和方法。例如，方法和装置将用于在解冻之后、施用于受试者之前快速活化来自冷冻保存的全血、外周血单核细胞、其它冷冻保存的血衍生细胞、或冷冻保存的T细胞系的T细胞。在另一个实例中，装置和方法可用于在施用于受试者之提高预选经过离体扩增的T细胞产品或T细胞系的活性，从而提供高度激活的T细胞产品。最后，正如将易于认识到的，上述方法和装置可同时用于受试者和供体的自体或同种异体的细胞治疗。

本发明的方法还可与疫苗一起使用以增强抗原反应性和增强体内效果。另外，考虑到通过本发明扩增的T细胞在体内具有相对较长的半衰期，这些细胞可以作为基因治疗的完美载体，携带预期的目的核酸序列并潜在的返回癌症、疾病、或感染部位。因此，通过本发明扩增的细胞可以联合疫苗、一种或多种细胞因子、一种或多种治疗性抗体、等而投递给患者。事实上，将受益于更强健的T细胞群的任何疗法都属于本文所述使用方法的范围内。

本发明提供了TCR表达的多克隆性增加的T细胞的组合物和方法，用于预防、抑制、或降低诸如但不限于下列癌症的存在：黑素瘤、非何杰金淋巴瘤、何杰金病、鼻咽癌、白血病、浆细胞瘤、肉瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肾癌、肾细胞癌、胰腺癌、食道癌、脑癌、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、大颗粒淋巴细胞性白血病(LGL)、和本领域已知的其它瘤。

或者，本发明的多克隆T细胞组合物可用于诱导或增强针对传染性生物体的响应。传染性生物体可以包括病毒，诸如单链RNA病毒或单链DNA病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、甲型、乙型、或丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、人乳头瘤病毒(HPV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、寄生虫、细菌、结核分枝杆菌、肺炎肺囊虫、假丝酵母、或曲霉或其组合。

在本发明的另一个实施方案中，本文所述的多克隆T细胞组合物可用于诱导或增强响应以矫正先天遗传病或免疫缺陷病诸如严重联合免疫缺陷(SCID)或常见易变免疫缺陷(CVID)。在某些实施方案中，本文所述的多克隆T细胞组合物可用于诱导或增强响应以矫正因与骨髓移植、化疗、放疗或其它癌症治疗有关的治疗而导致的免疫缺陷。在另一个实施方案中，本文所述的多克隆T细胞组合物可用于诱导或增强响应以矫正免疫缺陷或自身免疫病。在还有一个实施方案中，本文所述的多克隆T细胞组合物可用于诱导或增强响应以矫正影响肾、肝、或胰的慢性病。在还有一个实施方案中，本文所述的多克隆T细胞组合物可用于诱导或增强响应以治疗糖尿病。在某一个实施方案中，本文所述的多克隆T细胞组合物可用于诱导或增强响应以矫正与衰老有关的免疫缺陷。

在另一个实施方案中，本发明的显示TCR表达多克隆性增加的T细胞组合物可用于联合传统用于治疗这些传染性疾病和癌症的其它疗法。药物组合物

本发明的T细胞群可以单独施用，或者作为联合稀释剂和/或其它组分诸如IL-2或其它细胞因子或细胞群的药物组合物。简而言之，本发明的药物组合物可以包含本文所述靶细胞群，并联合一种或多种药用或生理学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这些组合物可以包含缓冲剂诸如中性缓冲盐、磷酸缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖苷、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(如氢氧化铝)；和防腐剂。优选将本发明的组合物配制成用于静脉内施用。

可以以适合于待治疗(或预防)疾病的方式施用本发明的药物组合物。施用的数量和频率将由诸如患者状况、以及患者疾病的类型和严重程度等因素决定，然而适当的剂量可能是由临床试验确定的。

通过施用本发明的受试组合物在动物体内诱导的免疫应答可能包括由能够杀死肿瘤和受感染细胞的细胞毒性T细胞介导的细胞免疫应答和辅助T细胞应答。也可能诱导主要由能够激活B细胞从而导致抗体生成的辅助T细胞介导的体液免疫应答。多种技术可用于分析通过本发明组合物恢复或诱导的免疫应答的类型，本领域对此已有详细描述；如Coligan等人，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons Inc.，1994。

在指示“免疫学有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”、或“治疗量”时，医生在考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度、以及患者状况的个体差异后可以确定待施用的本发明组合物的精确数量。典型的，在过继免疫治疗研究中，给患者施用大约2×10⁷至2×10¹¹个激活后抗原特异性T细胞(参阅如美国专利号5,057,423)。在本发明的有些方面，特别是在使用同种异体或异种细胞时，可以施用较少数目的细胞，范围为10⁶/kg(每名患者10⁶-10¹¹)。在本发明的一个实施方案中，给患者施用大约1×10⁸个T细胞。可以以这些范围内的剂量多次施用T细胞组合物。对于接受治疗的患者而言激活后的T细胞可以是自体的或异源的。如本文所述，如果需要，治疗还可以包括施用促细胞分裂剂(如PHA)或淋巴因子、细胞因子、和/或趋化因子(如GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1α、等)以增强对免疫应答的诱导。

在本发明的某些方面，施用的T细胞至少在施用后2周和1年之间在体内维持它们的多克隆性。在其它实施方案中，施用的T细胞在施用后3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20周维持多克隆性。在还有一些实施方案中，施用的T细胞在施用后至少5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12个月、或更久维持多克隆性。

受试药物组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括气溶胶吸入法、注射、摄食、灌输、植入或移植。可以给患者皮下、皮内、肌肉内、静脉内(i.v.)注射、肿瘤内、或腹膜内施用本发明组合物。优选的是通过i.v.注射来施用本发明的T细胞组合物。可以直接将激活后T细胞组合物注射到肿瘤或淋巴结内。

在还有一个实施方案中，可以在受控释放系统中投递药物组合物。在一个实施方案中，可以使用泵(参阅Langer，Science 249：1527-1533，1990；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201，1987；Buchwald等人，Surgery 88：507，1980；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321：574，1989)。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料(参阅Medical Applications ofControlled Release，1974，Langer和Wise编，CRC出版社，伯克莱屯，佛罗里达州；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance，1984，Smolen和Ball编，Wiley，纽约；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61，1983；还可参阅Levy等人，Science 228：190，1985；During等人，Ann.Neurol.25：351，1989；Howard等人，J.Neurosurg.71：105，1989)。在还有一个实施方案中，可以将受控释放系统置于治疗靶的附近，从而只需要全身剂量的小部分(参阅如Medical Applications of Controlled Release，1984，Langer和Wise编，CRC出版社，伯克莱屯，佛罗里达州，第2卷，第115-138页)。

还可以使用许多基质来施用本发明的T细胞组合物。基质已经在组织工程学领域中使用了许多年(参阅如Priciples of Tissue Engineering，Lanza、Langer、和Chick编，1997)。本发明在全新领域中使用这些基质，作为人造淋巴器官来支持、维持、或调控免疫系统，通常是通过调控T细胞。因此，本发明可以使用已经在组织工程学中证明了效用的那些基质组合物和制剂。因此，可用于本发明组合物、装置和方法的基质类型事实上没有限制，可以包括生物学和合成两类基质。在一个具体实例中，使用了由美国专利号5,980,889、5,913,998、5,902,745、5,843,069、5,787,900、或5,626,561提出的组合物和装置。基质所具有的特性通常与在施用于哺乳动物宿主时具有生物相容性有关。可以由天然或合成两类材料构成基质。在希望将永久结构或可消除结构留在动物体内诸如植入物的情况中，基质可以是非生物可降解的；或者是生物可降解的。基质可以采取海绵体、植入物、管、tel伍垫、纤维、中空纤维、冻干组分、凝胶、粉末、多孔组合物、脂质体、细胞、纳米微粒的形式。另外，基质可以设计成能够持续释放所接种细胞或所生成细胞因子或其它活性试剂。在某些实施方案中，本发明的基质是柔软有弹性的，而且可以描述成诸如无机盐、水性流体和溶解的气体试剂包括氧等物质可渗透的半固体支架。

在本文中基质是作为生物相容性物质的范例而使用的。然而，本发明不限于基质，因而在术语基质出现的任何地方，这些术语应当理解为包括装置和其它物质，其容许细胞延伸或细胞横穿、是生物相容的、并能够容许高分子直接穿过物质的横穿(因为物质自身是半透膜，或是联合特定半渗透物质一起使用)。

在此引用的所有参考文献全文结合于此作为参考。此外，本文使用的所有数字范围明确包括范围内的所有整数值，而且范围内具体数值的选择是根据具体用途而考虑得出的。另外，通过举例说明而非限制性地提供下列实施例。

                        实施例1

                        T细胞刺激

在本文描述的某些实验中，采用了称为XCELLERATE I^TM的方法。简而言之，在该方法中，由外周血单核细胞(PBMC)单采血液成分术产物制备XCELLERATED T细胞。由患者临床采集后，清洗PBMC单采血液成分术产物，然后与“未包被”的DYNABEADSM-450 Epoxy一起温育。在这段时间里，吞噬细胞诸如单核细胞摄取珠粒。温育后，用MaxSepMagnetic Separator(磁力分离器)处理细胞和珠粒以除去珠粒和珠粒上附着的任何单核/吞噬细胞。在此消除单核细胞的步骤后，取出含合计5×10⁸个CD3⁺T细胞的体积，与1.5×10⁹个DYNABEADSM-450 CD3/CD28 TCell Expander一起装配，以启动XCELLERATE^TM过程(大约3∶1珠粒∶T细胞)。然后将细胞与DYABEADSM-450 CD3/CD28 T Cell Expander的混合物于37℃、5％CO₂温育大约8天以生成XCELLERATED T细胞而用于第一次灌输。将剩余的消除了单核细胞的PBMC冷冻保存直至第二次或进一步细胞产物扩增(大约21天后)，那时将其融化，清洗，然后取出含合计5×10⁸个CD3⁺T细胞的体积，与1.5×10⁹个DYNABEADSM-450CD3/CD28 T Cell Expander一起装配以启动XCELLERATE方法而用于第二次灌输。在于37℃、5％CO₂温育大约8天的阶段中，CD3⁺T细胞得到激活和扩增。由Fred Hutchinson癌症研究中心(西雅图，华盛顿州)获得抗CD3 nAb(克隆BC3；XR-CD3)，由Diaclone(Besancon，法国)获得抗CD28 mAb(克隆B-T3；XR-CD28)。

称为XCELLERATE II^TM的改进方法采用上文所述方法并作出一些修改，其中不进行分开消除单核细胞的步骤，而且在某些方法中，在初次接触珠粒之前将细胞冷冻并进行进一步浓缩和刺激。在这种方法的一个版本中，通过单采血液成分术由供体或患者的循环血获得T细胞。单采血液成分术产物的组分通常包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核细胞(白细胞)、红细胞、和血小板。典型的单采血液成分术产物含1-2×10¹⁰个有核细胞。用无钙、无镁磷酸盐缓冲盐水清洗细胞以除去血浆蛋白质和血小板。清洗步骤是如下进行的，将细胞离心，除去上清液，然后替换以PBS。使用半自动“流经”离心机(COBE 2991系统，Gambro BCT，雷克伍德，科罗拉多州)完成该过程。在进行处理时在密闭系统中维持细胞。

可以通过消除未结合细胞包括单核细胞(富集激活的细胞)并继以刺激而进一步处理细胞。或者，稍后可以将清洗后的细胞冷冻、保存、和处理，本文证明这能够提高增殖强度以及消除粒细胞。在一个实例中，为了冷冻细胞，将35ml细胞悬浮液与35ml冷冻液一起置于250ml Cryocyte^TM冷冻袋(Baxter)中。35ml细胞悬浮液通常在PBS中含3.5×10⁹至5.0×10⁹个细胞。添加等体积的冷冻液(溶于PBS的20％DMSO和8％人血清清蛋白)。细胞终浓度为50×10⁶个细胞/ml。Cryocyte袋容纳体积的范围可以是30-70ml，而细胞浓度的范围可以是10-200×10⁶个细胞/ml。一旦Cryocyte袋装满了细胞和冷冻液，将袋置于控速冻结机中，并以1℃/min冷冻细胞降至-80℃。然后将冻结细胞置于液氮保存系统中直至需要。

由液氮保存系统取出细胞并于37℃解冻。为了除去DMSO，在COBE2991系统上用无钙、无镁PBS清洗融化后的细胞。然后使清洗后的细胞流过80微米筛网过滤器。

将融化后的细胞约0.5×10⁹个CD3⁺细胞置于塑料的1升Lifecell袋中，袋中装有100ml无钙、无镁PBS。PBS含1％至5％人血清。同样将1.5×10⁹个3×28珠粒(DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)置于装有细胞的袋中(3∶1 DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T Cell Expander：CD3⁺细胞)。于室温在1rpm(颠倒旋转)混合珠粒和细胞大约30分钟。将装有珠和细胞的袋置于MaxSep Magnetic Separator(Nexell Therapeutics，欧文，加利福尼亚州)上。在袋与MaxSep之间放置塑料间隔物(大约6mm厚)。(为了提高磁场强度，可以除去间隔物。)珠粒和珠粒上附着的任何细胞被保留在磁体上，而PBS和未结合的细胞被抽走。

用细胞培养基(1升，含X-Vivo 15，Bio Whittaker；及50ml热灭活的混合人血清、20ml 1M Hepes、10ml 200mM L-谷氨酰胺，含或不含大约100,000 I.U.IL-2)将3×28珠粒和珠粒上结合的浓缩细胞漂洗到3升Lifecell培养袋中。在将3×28珠粒和正选择细胞转移到Lifecell袋中后，添加培养基直至袋中装有1000ml。将装有细胞的袋置于温箱中(37℃，5％ CO₂)，并使细胞扩增，根据需要将细胞传代。

通过在培养第3天和第8天收获细胞而测量了T细胞激活和增殖。T细胞激活是通过在培养第3天测量细胞大小、细胞表面标记表达水平、特别是CD25和CD154的表达来评定的。第8天使细胞在重力下(大约150ml/min)流过MaxSep磁体以除去磁性颗粒，使用上文所述COBE装置清洗和浓缩细胞，并重悬于为适合于静脉内施用而平衡好的电解液中，诸如Plasma-Lyte A(Baxter-Healthcare)。此时同样将细胞在适当冷冻液中冷冻。

如上文所述，XCELLERATE I^TM指与上文相似的条件，只是在刺激前没有进行刺激和浓缩而进行了单核细胞消除。

用3×28偶联珠粒(DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)刺激来自4名供体消除了单核细胞的PBMC。通过ELISA测定了上清液中的IL-2、IL-4、TNF-α、和IFN-γ浓度。还在第12天用新的DYNABEADSM-450 CD3/CD28 T Cell Expander再次接种细胞(再次刺激)后测量了IL-4、TNF-α、和IFN-γ浓度。

如表1、表2、和表3所示，在XCELLERATE^TM和再次刺激过程的各个天数通过ELISA测量了IFN-γ、IL-4、和TNF-α浓度。

表1：XCELLERATE^TM方法的T细胞在第3天和XCELLERATE^TM激活且再次刺激的T细胞在第3天的γ-干扰素生成

	XCELLERATETM方法第2天[IFN-γ]ng/ml	再次刺激第2天[IFN-γ]ng/ml
			平均值	13.61	31.59
范围	7.99-27.11	10.8-95.5
			标准偏差	5.64	22.98
中值	11.95	26.4
			N	24	24

用偶联DYNABEADS M-450 Epoxy的抗CD3和抗CD28(DYNABEADSCD3/CD28 T Cell Expander)刺激来自3名供体消除了吞噬细胞的PMBC(XCELLERATE^TM)。第2天通过ELISA测定上清液中的IFN-γ浓度。第12天，用新的偶联DYNABEADS M-450 Epoxy的抗CD3和抗CD28再次接种细胞(再次刺激)，并在2天后测定IFN-γ浓度。

表2：XCELLERATE^TM方法的T细胞在第2天和XCELLERATE^TM激活且再次刺激的T细胞在第2天的IL-4生成

	XCELLERATETM方法第2天[IL-4]pg/ml	再次刺激第2天[IL-4]pg/ml
			平均值	310	274
范围	170-460	50-500
			标准偏差	143	224
中值	297	268
			N	3	3

用偶联DYNABEADS M-450 Epoxy的抗CD3和抗CD28刺激来自3名供体消除了吞噬细胞的PMBC(XCELLERATE^TM)。第2天和第4天通过ELISA测定上清液中的IL-4浓度。第12天，用新的偶联DYNABEADSM-450 Epoxy的抗CD3和抗CD28再次接种细胞(再次刺激)，并在2天后测定IL-4浓度。

表3：XCELLERATE^TM方法的T细胞在第2天和第4天和XCELLERATE^TM激活且再次刺激的T细胞在第2天和第4天的TNF-α生成

	第2天		第4天
						XCELLERATETM[TNF-α]ng/ml	再次刺激[TNF-α]ng//ml	XCELLERATETM[TNF-α]ng/ml	再次刺激[TNF-α]ng/ml
平均值	1.710	0.594	1.635	0.252
					范围	1.11-2.81	0.299-0.782	1.09-2.5	0.21-0.288
标准偏差	0.762	0.211	0.534	0.036
					中值	1.460	0.647	1.55	0.255
N	4	4	4	4

用偶联DYNABEADS M-450 Epoxy的抗CD3和抗CD28刺激来自4名供体消除了吞噬细胞的PMBC。第2天和第4天通过ELISA测定上清液中的TNF-α浓度。第12天，用新的偶联DYNABEADS M-450 Epoxy的抗CD3和抗CD28再次接种细胞(再次刺激)，并在2和4天后测定TNF-α浓度。

通过流式细胞术分析Xcellerated T细胞上的CDw137(41BB)、CD154(CD40L)、和CD25表达水平，并将平均荧光作图。CDw137(41BB)表达水平升高并在第4天达到最高峰，然后逐渐降低。再次刺激后，CDw137表达迅速升高。CD154表达逐渐升高直至大约第7天，然后降低。然而，再次刺激后，CD154水平迅速升高，达到比初次刺激高得多的水平。CD25水平升高直至大约第3天，然后逐渐降低直至第8天(分析的最后时间点)。

                        实施例2

                        T细胞谱型分析

此实施例描述了使用谱型分析测定使用XCELLERATE^TM方法刺激之前和之后T细胞群中所表达TCR的克隆性。本文描述了重排Vβ基因的分析。熟练技术人员将容易的认识到可以以相似方式分析Vα、Vγ、和Vδ TCR基因。

本质上如美国专利号5,837,447和C.Ferrand等人(C.Ferrand、E.Robinet、Emmanuel Contassot、J-M Certoux、Annick Lim、P.Herve、和P.Tiberghien，Human Gene Therapy 11：1151-1164，2000)所述进行谱型分析。简而言之，起始细胞悬浮液来自PBMC、细胞系、消除了CD8⁺细胞的PBMC、和/或XCELLERATED T细胞。使用Trizol(Gibco-BRL)分离总RNA，取2μg在标准cDNA合成反应中用随机六聚物(PharmaciaBiotech)进行逆转录。

如先前所述(Puisieux等人，J.Immunol.153：2807-2818，1994；Pannetier等人，Immunol.Today 16：176-181，1995)，用24种TCR BV亚族特异性引物之一和识别TCRβ链两个恒定区Cβ1和Cβ2的Cβ引物扩增每一种TCRBV区段。Cβ引物偶联了6-Fam荧光染料(Gibco-BRL)。对于定量分析，将cDNA与内部标准(PTZ-δCD3质粒)共扩增。

在热循环仪中在25μl反应中用24种TCRBV寡核苷酸之一和未标记Cβ引物扩增cDNA合成反应的等分试样。

TCRBV转录本长度模式的PCR扩增。在热循环仪(PTC-200；MJ Research，沃特敦，马萨诸塞州)中在25μl反应中用24种TCRBV寡核苷酸之一和未标记C_β引物扩增cDNA合成反应的等分试样。每个反应含1x Taq聚合酶缓冲液(Promega，Charbormiere，法国)、1.5mM MgCl₂、每种dNTP浓度0.2μM、引物每种浓度0.5μM、和0.5UTaq聚合酶(Promega)。使用如下程序在饱和状态下进行PCR：预变性94℃3min；40个循环变性(94℃25sec)、退火(60℃45sec)、和聚合(72℃45sec)；随后是最终延伸72℃5min。取一些TCRBV/C_β PCR产物进行2％琼脂糖电泳，实验中包括阴性对照(缺cDNA)以检查扩增和可能的污染。对24种TCRBV/C_β-40个循环PCR产物每种取2微升在相同条件下进行两个循环的延长(失控)，除了在10μl中C_β荧光引物的终浓度是0.1μM。

细胞群中TCRBV亚族表征的量化

竞争性δCD3PCR。对每个样品，通过加入连续稀释的确定数量的DNA质粒(删除了4bp的δCD3链)扩增合成的cDNA，竞争物的范围为10¹¹-10⁷个拷贝(Garderet等人，1998)。最佳滴定点定义为PCR产物对标准和天然cDNA产生可比强度的信号时的标准浓度。简而言之，使用1x Taq聚合酶缓冲液(Promega)、1.5mM MgCl₂、每种dNTP浓度0.2μM、引物每种浓度0.5μM、和0.5U Taq聚合酶(Promega)，在25μl反应中进行δCD3 PCR。使用如下程序在饱和状态下进行PCR：预变性94℃3min；40个循环的变性(94℃1min)、退火(60℃1min)、和聚合(72℃45sec)；随后是最终延伸72℃5min。在相同条件下两个循环的延长中对2微升第一轮PCR进行染色，除了在10μl体积中3’δCD3荧光引物的终浓度是0.1μM。将荧光PCR产物在变性6％丙烯酰胺凝胶上进行分离，并在配有Genescan 1.2.1版(Applied Biosystems，福斯特城，加利福尼亚州)分析软件的自动DNA测序仪上进行分析。

定量TCRBV/C_β PCR。为了量化全集合的TCRBV亚族表征，在PCR线性阶段过程中(26-28个循环)由cDNA(相当于5×10⁷个拷贝的δCD3RNA)进行24个TCRBV/C_β反应(15μl)，条件与关于40个扩增循环所述相似，除了对于每种TCRBV亚族引物，C_β荧光引物的使用浓度是0.1μM。为了全集合中TCRBV表征，通过将TCRBV亚族所有峰的总和除以所有TCRBV亚族的总和计算每种TCRBV亚族的相对百分比。因为在所有TCRBV PCR中δCD3拷贝的起始数目是相等的，所以所有样品彼此可以进行比较。

电泳和CDR3片段大小分析。将40个循环和26-28个循环的PCR扩增反应物与等体积(分别为10或15μl)20mM EDTA-去离子甲酰胺混合，将Rox-1000大小标准用作分子量标记(Applied Biosystems)。将2.5μl体积的混合液加到24cm 6％丙烯酰胺测序胶上，并在自动373A DNA测序仪(Applied Biosystems)上用Immunoscope软件对大小和荧光强度测定进行分析。

使用这种技术的聚合酶链式反应(PCR)产物长度反映输入的TCRRNA的CDR3长度，它取决于连接(J)和多样性(D)基因片段的使用以及核酸外切酶活性和末端转移酶的N核苷酸添加在连接区的平衡。检测到对应于框内转录本的峰。优势峰的出现说明存在寡克隆或克隆T细胞群，而没有峰或整个亚族谱型分别说明不存在指定CDR3长度或Vβ亚族的T细胞，或者具有产生性TCR基因重排的T细胞中不存在TCR转录本。

如图2所示，使用XCELLERATE^TM方法维持T细胞集合，与用OKT3/IL-2激活T细胞时看到的集合偏转相比较。在XCELLERATE^TM激活处理之前和之后分析来自B-CLL患者的T细胞。如图3所示(特别是第4行的图，Vβ4、9、15、和22)，B-CLL患者显示偏转的T细胞集合，即显示表达众多Vβ家族基因(包括Vβ4、9、11、13、14、15、和22)的T细胞的多克隆性降低。XCELLERATE^TM方法第12天的T细胞谱型分析显示这些T细胞的多克隆性恢复了。

图4使用Gorochov分析(G.Gorochov等人，Nat.Med.4：215-221，1998)归结于加和每个供体在XCELLERATE^TM扩增之前和之后集合“扰动”总水平得到的数值。图4a反映了由8名不同B-CLL供体在小规模XCELLERATE^TM扩增之前和之后获得的数值，而图4b反映了由5名不同供体在临床规模XCELLERATE^TM扩增之前和之后获得的数值。有一名供体是例外，其早就偏转的集合变得更加偏转，最初偏转的所有其他供体倾向于正常化(高斯分布)。所分析13份样品中的8份由高水平的集合扰动恢复到正常水平。13份样品之一展示扰动降低，但未达到视为正常的水平，开始时未偏转的3份供体样品贯穿扩增过程保持正常分布。

还通过分析各种TCRVβ家族的表面表达而检查了TCRVβ使用，所述分析借助流式细胞术，使用标准技术并采用对不同Vβ家族成员具有特异性的抗体。如图5a和5b所示，测定了在其表面表达代表性TCRVβ家族蛋白质的CD4 T细胞和CD8 T细胞的百分比(Vβ1、2、5、8、14、17、和21.3)。分析了由2名正常供体分离的T细胞和由2名CLL供体分离的T细胞。在B-CLL样品的案例中，图反映了XCELLERATE^TM之前和之后的模式。根据这些数据，显然每份B-CLL样品演示了特定Vβ家族表征的过度和不足，特别是在CD8群中。例如，在激活和扩增前，在CD8 T细胞群中，CLL供体1具有很高百分比的表达Vβ2和Vβ21.3的T细胞，而CLL供体2具有高百分比的表达Vβ14的T细胞。相反，同样是这2名供体，供体1显示极低百分比的Vβ5、8、14表达者，而供体2显示极低百分比的Vβ1、2、8表达者。与谱型研究中的观察结果相似，经XCELLERATE^TM方法扩增后，这些百分比倾向于更正常的水平，过度表达者的百分比降低，而展示不足Vβ的百分比升高。

为了评估对白血病B细胞具有特异性的T细胞的频率，将XCELLERATED^TMT细胞与自体白血病B细胞靶混合而进行了γ-干扰素(IFNγ)ELISPOT分析。如表4所示，在1∶167至1∶2,500的范围内能够检测到肿瘤特异性T细胞。XCELLERATE^TM前的频率＜1∶10,000(灵敏度的界限)，说明肿瘤特异性T细胞的数目得到了选择性扩大，或者，更有可能的是，肿瘤特异性T细胞在激活和扩增前是无变应性的，而XCELLERATE^TM方法恢复了响应。所报告的肿瘤反应性T细胞的频率反映了缺乏CLL刺激细胞时IFNγ阳性细胞背景频率的减少。

表4：XCELLERATE^TM扩增后肿瘤反应性T细胞的频率

试验	规模	供体	通过ELISPOT测量的肿瘤反应性T细胞频率(IFNγ)
				CLL-3CLL-4CLL-5CLL-6CLL-7CLL-8CLL-18CLL-20CLL-23CLL-30CLL-31CLL-32CLL-33CLL-34CPDCLL-12CPDCLL-13	小规模小规模小规模小规模小规模小规模小规模小规模小规模小规模小规模小规模小规模小规模WaveWave	OHSU-10OHSU-11OHSU-12OHSU-17OH-CL-101BOH-CL-103BRCLL-1OH-CL-105LOHSU-16RCLL-7RCLL-14RCLL-14RCLL-8RCLL-7RCLL-8RCLL-7	1∶2561∶5561∶3331∶6811∶2841∶8501∶16671∶2001∶25001∶11111∶10001∶9091∶11111∶5551∶1671∶833
平均数(N＝16)			1∶813

表4。对来自14次小规模扩增和2次大规模扩增的16份Xcellerated T细胞中的13份通过ELISPOT评估了抗肿瘤特异性T细胞的频率。组织来自13名不同供体。

因此，如本文所示，不仅能够恢复降低的TCR表达以及由此而生的对抗原的响应，而且能够通过个体T细胞的离体Xcelleration而扩宽免疫应答的宽度。XCELLERATE^TM方法可用于维持或恢复T细胞的多克隆性。本发明的具有增加的多克隆性的Xcellerated T细胞可用作预防措施或用于治疗现有疾病，诸如B-CLL。使用这种方法生成的激活和扩增后的T细胞因而可用于在无免疫应答个体中恢复免疫响应。

                       实施例3

XCELLERATE方法在接受移植的骨髓瘤患者中改善了淋巴细胞恢复

此实施例描述了多发性骨髓瘤患者的初步临床试验的资料，指示XCELLERATED T细胞改善了接受移植的骨髓瘤患者的恢复。

在注册了临床试验后、在采集干细胞前由患者采集的leukapheresed细胞，本质上如实施例1中所述对其进行XCELLERATE II处理。在灌输干细胞后3天灌输XCELLERATED T细胞。如图6所示，XCELLERATE^TM方法在接受移植的骨髓瘤患者中改善了淋巴细胞恢复。另外，CD4和CD8T细胞在XCELLERATED T细胞灌输后增加了。

因此，此临床资料显示XCELLERATED T细胞在接受移植的骨髓瘤患者中改善了恢复，并支持可以将本文描述的T细胞组合物灌输到供体体内以提供广泛和有效的免疫保护的观念。

Claims (33)

1.一种恢复T细胞群多克隆性的方法，包括：

(a)提供一群细胞，其中其至少一部分包含T细胞；

(b)将所述细胞群暴露于一种或多种试剂，所述试剂连接至少一部分T细胞的细胞表面部分并刺激至少一部分T细胞，

其中将所述细胞暴露于所述一种或多种试剂的时间足以增加多克隆性；

由此恢复T细胞群的多克隆性。

2.权利要求1的方法，其中所述恢复包括选自有下述转变组成的转变：

(a)由单克隆性转变成寡克隆性；

(b)由单克隆性转变成多克隆性；和

(c)由寡克隆性转变成多克隆性；

其中所述转变包括通过至少一种Vβ、Vα、Vγ、或Vδ家族基因的Vβ、Vα、Vγ、或Vδ谱型特征测量的T细胞群转变。

3.权利要求2的方法，其中所述转变包括将表达至少一种Vβ、Vα、Vγ、或Vδ家族基因的多克隆T细胞数目增加到足以用于治疗。

4.依照权利要求1的方法，其中所述一种或多种试剂附着于表面。

5.依照权利要求4的方法，其中所述表面具有附着其上的第一种试剂，所述第一种试剂连接T细胞的第一种细胞表面部分；且相同或第二种表面具有附着其上的第二种试剂，所述第二种试剂连接所述T细胞的第二种部分，其中所述通过第一种和第二种试剂的连接诱导所述T细胞增殖。

6.权利要求5的方法，其中所述第一种试剂包括抗CD3抗体且所述第二种试剂包括结合所述T细胞表面上辅助分子的配体。

7.权利要求6的方法，其中所述辅助分子是CD28。

8.权利要求5的方法，其中所述第一种试剂包括抗CD3抗体且所述第二种试剂包括抗CD28抗体。

9.权利要求5的方法，其中所述第一种和第二种试剂通过共价吸附附着于所述表面或所述第二种表面。

10.权利要求5的方法，其中所述第一种和第二种试剂通过直接吸附附着于所述表面或所述第二种表面。

11.权利要求5的方法，其中所述第一种和第二种试剂通过间接吸附附着于所述表面或所述第二种表面。

12.一种用于在无免疫应答个体中恢复免疫响应的方法，包括：

(a)由个体获得细胞群，其中其至少一部分包含T细胞；

(b)将所述细胞群暴露于一种或多种试剂，所述试剂连接至少一部分T细胞的细胞表面部分并刺激至少一部分T细胞，其中将所述细胞暴露于所述一种或多种试剂的时间足以增加多克隆性；

(c)将T细胞中得到刺激的部分施用于无免疫应答个体；

由此恢复无免疫应答个体的免疫响应。

13.权利要求12的方法，其中所述一种或多种试剂附着于表面。

14.依照权利要求13的方法，其中所述表面具有附着其上的第一种试剂，所述第一种试剂连接T细胞的第一种细胞表面部分；且相同或第二种表面具有附着其上的第二种试剂，所述第二种试剂连接所述T细胞的第二种部分，其中所述通体第一种和第二种试剂的连接诱导所述T细胞增殖。

15.权利要求12的方法，其中施用的T细胞的多克隆性在施用后在体内维持至少3个月。

16.权利要求12的方法，其中施用的T细胞的多克隆性在施用后在体内维持至少6个月。

17.权利要求12的方法，其中施用的T细胞的多克隆性在施用后在体内维持至少1年。

18.权利要求12的方法，其中所述无免疫应答个体患有癌症。

19.权利要求18的方法，其中所述癌症选自由下述癌症组成的组：黑素瘤，非何杰金淋巴瘤，何杰金病，鼻咽癌，白血病，浆细胞瘤，肉瘤，神经胶质瘤，胸腺瘤，乳腺癌，前列腺癌，结直肠癌，肾癌，肾细胞癌，胰腺癌，食道癌，脑癌，肺癌，卵巢癌，子宫颈癌，多发性骨髓瘤，肝细胞癌，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，急性骨髓性白血病(AML)，慢性骨髓性白血病(CML)，大颗粒淋巴细胞性白血病(LGL)，和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。

20.权利要求18的方法，其中所述癌症是B细胞慢性淋巴细胞性白血病。

21.权利要求12的方法，其中所述无免疫应答个体感染了病毒。

22.权利要求21的方法，其中所述病毒选自由下式病毒组成的组：单链RNA病毒，单链DNA病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)，甲型、乙型、或丙型肝炎病毒，单纯疱疹病毒(HSV)，人乳头瘤病毒(HPV)，巨细胞病毒(CMV)，和EB病毒(EBV)。

23.权利要求12的方法，其中所述无免疫应答个体患有先天遗传病。

24.权利要求12的方法，其中所述无免疫应答个体患有影响肾脏，肝脏，或胰脏的慢性病。

25.权利要求12的方法，其中所述无免疫应答个体患有与衰老有关的免疫缺陷。

26.权利要求12的方法，其中无免疫应答个体患有自身免疫病。

27.权利要求26的方法，其中所述自身免疫病选自由下述疾病组成的组：类风湿性关节炎，多发性硬化，胰岛素依赖型糖尿病，阿狄森病，脂泻病，慢性疲劳综合症，炎症性肠病，溃疡性结肠炎，局限性回肠炎，Fibromyalgia，系统性红斑狼疮，牛皮癣，Sjogren氏综合症，甲状腺功能亢进/格雷夫斯病，甲状腺功能减退/桥本甲状腺炎，胰岛素依赖型糖尿病(I型)，和重症肌无力。

28.权利要求12的方法，其中所述无免疫应答个体已经经过化疗处理。

29.权利要求12的方法，其中所述无免疫应答个体已经经过细胞毒性试剂处理。

30.权利要求12的方法，其中所述无免疫应答个体已经经过免疫抑制性试剂处理。

31.权利要求12的方法，其中所述无免疫应答个体患有与血细胞减少症有关的血液学疾病。

32.权利要求31的方法，其中所述疾病选自由下述疾病组成的组：再生障碍性贫血，骨髓发育不良综合征，范科尼贫血，特发性血小板减少性紫癜和自身免疫性溶血性贫血。

33.一种组合物，其包含已经依照权利要求1恢复了多克隆性的T细胞群和药用赋形剂，其用于在无免疫应答个体中恢复免疫响应，其中所述个体的T细胞多克隆性相对于有免疫应答个体已经降低。

Images