CN1419597A - 细胞的同步刺激和富集 - Google Patents

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C·劳
M·邦尼哈迪
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A·哈德威克
D·麦克米伦
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Abstract

本发明一般涉及刺激细胞的方法，尤其涉及富集和刺激细胞以使该细胞最大程度刺激和/或增殖的新方法。在多种实施方案中，利用可增强增殖、细胞信号转导和/或细胞表面成分聚集的表面来刺激和富集细胞。在某些方面，通过将该细胞群体与表面相接触提供了用于通过同步富集以及细胞表面成分连接来刺激细胞群体(例如T细胞)的方法，该表面另外附着有可连接细胞表面成分的一种或多种因子，并施加可显著驱使细胞富集以及细胞表面成分连接的作用力，从而诱导细胞刺激、细胞表面成分聚集和/或受体信号增强。还提供了用于产生包括T细胞在内的表型定制细胞的方法，用于诊断、药物发现以及治疗各种适应症，包括癌症、病毒感染以及免疫相关病症。此外，还提供了利用这些方法产生的、具有特定表型特性的细胞组合物。

Description

细胞的同步刺激和富集
技术领域
本发明一般涉及刺激细胞的方法，尤其涉及富集和刺激细胞以使该细胞最大程度刺激的方法。本发明还涉及细胞组合物，包括具有特定表型特征的刺激T细胞。
发明背景
许多细胞通过嵌入细胞表面膜脂质筏中的受体进行活化或调节。见K.Simons和D.Toomre，Nature Rev.1：31，2000。脂质筏形成由配基结合活化的各受体的富集平台。脂质筏参与细胞的信号过程，包括变态免疫反应中的免疫球蛋白E信号，对神经系统的发育和维持重要的神经胶质细胞源性神经营养因子信号，RAS信号，许多信号转导过程的核心，以及T细胞抗原受体(TCR)信号。
T细胞抗原受体(TCR)是一种多亚基免疫识别受体，它和CD3复合物相关，并与抗原呈递细胞(APCs)表面的主要组织相容性复合体(MHC)I类和II类蛋白质呈递的肽相结合。TCR与APC上抗原肽的结合，发生在T细胞和APC连接处的免疫突触处，是T细胞活化中的重要事件。此外，资料表明，脂质浮桥的群集对形成免疫突触是必要的。Krawczyk等，Immunity 13(4)：463-73，2000。
为维持T细胞活化，T淋巴细胞一般需要第二共刺激信号。共刺激一般对T辅助细胞产生足够的诱导克隆扩增的细胞因子水平是必需的。Bretscher，Immunol Today 13：74，1992；June等，ImmunolToday15：321，1994。活化的抗原呈递细胞(APC)上B7家族配基(CD80(B7.1)或CD86(B7.2))中的成员与T细胞上的CD28结合时，出现主要的共刺激信号。
刺激某些T细胞亚群扩增的方法，有可能产生多种在免疫治疗中有用的T细胞组合物。通过有效刺激，增加T细胞的反应性和数量，有助于成功的免疫治疗。
各种用于扩增人的T细胞的方法，主要依靠利用辅助细胞和/或外源生长因子，如白细胞介素-2(IL-2)。现已将IL-2和抗CD3抗体联用，以刺激T细胞增殖，主要是扩增T细胞CD8+亚群。认为，对于最佳T细胞活化、扩增和T细胞再输注后长期存活，两种APC信号都是必需的。由于APCs相对短命，因此对于长期培养体系来说要求MHC相匹配的APCs作为辅助细胞，出现了明显问题。因此，在长期培养体系中，必须连续不断地由来源获得和补充APCs。对于治疗辅助细胞受到影响的免疫缺陷，要求重复供给辅助细胞是困难的。另外，治疗病毒感染时，如果辅助细胞携带病毒，长期培养期间该细胞则可能污染全部的T细胞群体。
缺少外源生长因子或辅助细胞时，共刺激信号可以传递给T细胞群体，例如，通过将细胞暴露于附于固相表面，如小珠上的CD3配基和CD28配基。见C.June等(美国专利No.5,858,358)；C.June等WO 99/953823。虽然这些方法能够获得治疗上有用的T细胞群体，但增中的T细胞制剂的强壮性和便利方面仍不理想。
另外，本领域现行方法尚未关注T细胞的短期扩增，或获得更强壮的T细胞群体及其益处，和/或特定的T细胞亚类/表型的扩增。此外，扩增T细胞的应用局限于仅少数病状。为获得体内的最大有效性，理论上离体或体内产生的活化T细胞群体应该处于可最大限度产生针对癌症、传染病或其它病状的免疫应答的状态。本发明提供产生更多、更高度活化和更纯T细胞的方法，该T细胞具有表面受体和产细胞因子特征，看来比其它扩增方法更健康和自然。
此外，本发明提供任意靶细胞的表型定制细胞群体的组合物，包括T细胞群体和产生该群体的参数，也提供其它相关的益处。
发明概述
本发明一般提供刺激细胞的方法，尤其提供富集和刺激细胞以最大程度刺激该细胞的新方法。一方面，本发明提供通过T细胞的同步富集以及细胞表面成分连接来刺激T细胞群体的方法，包括提供至少其中一部分含有T细胞的细胞群体，将该细胞群体同表面相接触，其中该表面上附着一种或多种因子，其与至少一部分T细胞的细胞表面成分相连接，并刺激至少该部分T细胞或其亚群，施加主要驱使T细胞富集以及T细胞表面成分连接的作用力，从而诱导T细胞刺激。
在该方法的一个实施方案中，这种表面上附着第一因子，其与T细胞的第一细胞表面成分相连接；该表面或第二表面上具有第二因子，其连接该T细胞的第二成分，其中通过第一和第二因子的这种连接，诱导了该T细胞增殖。在相关实施方案中，该表面可能是生物相容性的、天然的或合成的，包含聚合物，包含胶原、纯化的蛋白质、纯化的肽、多糖、氨基葡聚糖、或细胞外基质成分。在某些实施方案中，该多糖选自脱乙酰壳多糖、藻酸盐、葡聚糖、透明质酸和纤维素，并且该聚合物选自聚苯乙烯、聚酯、聚醚、聚酐、聚烷基腈基丙烯酸酯(polyalkylcyanoacrylates)、聚丙烯酰胺、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚磷腈(polyphosphazenes)、聚乙酸乙烯酯、嵌段共聚物、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)或聚氨基甲酸乙酯。在其它实施方案中，该聚合物还可以包含乳酸或共聚物。而在再其它实施方案中，该聚合物可能是一种共聚物，这种共聚物可以是多种已知的共聚物，而且可以包含乳酸和/或羟基乙酸(PLGA)。
至于生物相容性表面，该表面可以是生物可降解的或不能生物降解的。在相关实施方案中，不能生物降解的表面可以包含但并不局限于聚(二甲基硅氧烷)和/或聚(乙烯-乙酸乙烯酯)。此外，生物相容性表面可以包含但并不局限于胶原、金属、羟基磷灰石、玻璃、铝酸盐、生物陶瓷材料、透明质酸聚合物、藻酸盐、丙烯酸酯聚合物、乳酸聚合物、羟基乙酸聚合物、乳酸/羟基乙酸聚合物、纯化的蛋白质、纯化的肽、和/或细胞外基质成分。
在另外的实施方案中，生物相容性表面与一种可植入的装置有关。该可植入装置可以是希望使用的任意一种可植入装置，并可以包含支架、导管、纤维、中空纤维、贴片、或缝线。在相关的实施方案中，该表面可以是玻璃、二氧化硅、硅、胶原、羟基磷灰石、水凝胶、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龙、或聚丙烯酰胺。另外的实施方案还包括，其中该表面包含脂类、平板、袋、杆、片、纤维、或网(mesh)。其它的实施方案包括，其中该表面是一种微粒，加之其中微粒包含小珠、微球、纳米微粒、或胶体粒子。微粒和小珠的大小也可以选择，可以有多种大小，包括其中小珠直径为大约5纳米到大约500微米。
在其它实施方案中，该方法所用的因子可以独立地选自蛋白质配基、天然配基、或合成的配基。此外，该因子也可能包含抗体、抗体片段、肽、多肽、糖肽、可溶性受体、类固醇、激素、有丝分裂原、抗原、超抗原、生长因子、细胞因子、凝集素、病毒蛋白质、粘附分子或趋化因子。在特定的实施方案中，至少一种因子是抗体或抗体片段。在其它的实施方案中，第一因子是抗体及其片段，并且第二因子是抗体或其片段。自然应理解第一和第二因子可以是或相同或不同的抗体。
在选择的实施方案中，第一因子是抗-CD3抗体、抗-CD2抗体、或者抗-CD3抗体或抗-CD2抗体的抗体片段。另外选择的实施方案包括，其中第二因子是抗CD28抗体或其抗体片段。另外的实施方案包括，其中第二因子包含CD28的天然配基，例如B7-1或B7-2。此外，可以使用其它的刺激因子。
在某些实施方案中，用于驱动细胞的作用力包括多种功能相似的力，并包括大于重力的作用力、液压力、由跨膜压产生的渗透力、离心力、或磁力。利用磁力时，一些实施方案利用磁铁产生的磁力，在该磁铁表面其磁场强度为大约200-大约12,000高斯。
另一个实施方案包括表面，其中该表面是顺磁颗粒的表面。而在利用包括顺磁颗粒表面在内的表面的实施方案中，附着到该表面的因子可以是共价的、非共价的、静电的、分子内附着、或疏水性的。
在另外的实施方案中，将连接的T细胞与非连接的T细胞分开。而在其它的实施方案中，该T细胞改善免疫应答的功能障碍。
可以与上述实施方案相结合的其它方面包括，例如通过同步的细胞表面成分连接以及T细胞聚集而刺激T细胞的方法，其包括提供包含T细胞的细胞群体，使所述细胞群体与表面相接触，其中所述表面上附着有特异于细胞表面成分的一种或多种配基，施加作用力驱动T细胞和表面富集，以及将所述细胞温育足够长的一段时间，以获得所要求的刺激。在相关的实施方案中，足以获得所要求的刺激的时间，可以为1分钟-10天，以及其间的所有整数值。在某些实施方案中，该时间范围可能是大约1-8天，而在另外的实施方案中，该时间范围可能是大约3-5天，或大约1-5天。在相关的实施方案中，温育温度可以是大约2-38℃。
能够使用全部所述方法的另外的实施方案包括，其中的表面选自玻璃、二氧化硅、硅、胶原、羟基磷灰石、水凝胶、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龙、葡聚糖、或聚丙烯酰胺或其中任意的混合物。此外，实施方案包括，在上述任何步骤之前或同时，将用表面富集的T细胞同非富集细胞分开。
在其它方面，提供了诱导T细胞体内活化的方法，包括给予动物以顺磁颗粒，所述颗粒上附着有可诱导T细胞活化的、T细胞表面成分特异的配基；在该动物分散区域施加磁场，并从而诱导与所述颗粒结合的T细胞在所述分散区域的定位和活化。
另一方面，提供包括通过同步的靶细胞集聚和靶细胞表面成分连接而刺激靶细胞群体的方法，包括提供细胞群体，其中至少一部分包含靶细胞，使所述细胞群体与表面相接触，其中所述表面附着有一种或多种因子，使至少一部分所述靶细胞的细胞表面成分相连接并刺激至少所述部分靶细胞，施加主要驱使靶细胞集聚以及靶细胞表面成分连接的作用力，从而诱导靶细胞刺激。
在某些实施方案中，此处描述的方法利用附着了第一因子的表面，使靶细胞的第一细胞表面成分连接；该表面或第二表面附着第二因子，连接所述靶细胞的第二成分，其中所述第一和第二因子的连接诱导所述靶细胞信号转导。
如前所述，此表面可以包含多种组分，包括胶原、纯化的蛋白质、纯化的肽、多糖、氨基葡聚糖、和/或细胞外基质成分。特定实施方案中使用的一些多糖，可包含脱乙酰壳多糖、藻酸盐、葡聚糖、透明质酸、和/或纤维素。此外，如上提及并适用于所有方法的聚合物可以选自聚酯、聚醚、聚酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚原酸酯、聚磷腈、聚乙酸乙烯酯、嵌段共聚物、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、和/或聚氨基甲酸乙酯及其混合物。
在其它方面，提供了通过细胞表面成分连接以及靶细胞富集来刺激靶细胞的方法，包括提供包含靶细胞的细胞群体，使所述细胞群体与表面接触，其中所述表面上附着了细胞表面成分特异的一种或多种配基，施加驱动靶细胞富集以及所述细胞在所述表面上富集的作用力，并将所述细胞温育足够时间，使达到所要求的刺激。
在相关实施方案中，靶细胞可以是T细胞、B细胞、或干细胞。
其它方面，提供了体内诱导靶细胞刺激的方法，包括给予动物以顺磁颗粒，所述颗粒上附着了可诱导靶细胞刺激的、靶细胞表面成分特异的配基；在该动物的分散区域施加磁场；并从而诱导在所述分散区域与所述颗粒结合的靶细胞的定位和刺激。
提供的其它方面还包括诱导携有受体的细胞上受体极化的方法，包括提供细胞群体，将所述细胞群体与固相表面相接触，其中所述固相表面附着了一种或多种对存在于至少部分所述细胞群体的细胞表面受体特异的配基，并施加驱动细胞富集及细胞表面受体连接的作用力。
其它方面包括诱导细胞表面分子富集的方法，包括提供具有靶细胞表面分子的细胞群体，使所述细胞群体与固相表面相接触，其中所述固相附着了针对至少一种靶细胞表面分子的配基，施加驱动被靶向的细胞表面分子富集的作用力。
某些实施方案中的细胞群体包括淋巴细胞。
另外的某些实施方案中，受体或细胞表面成分的结合，引起细胞事件的下调或抑制。相关实施方案包括，其中受体结合引起细胞事件的上调或活化，其中可以包括例如受体介导的信号转导。
本发明的另一个实施方案展望了驱动细胞表面成分富集或定位的作用力的应用。
本发明另外的实施方案还提供了表型定制的靶细胞群体和/或包括T细胞成分的组分物。此外，提供了通过连接细胞表面成分使这些细胞活化的方法。还提供了诱导T细胞群体增殖的方法，包括使T细胞与固相表面接触大约2小时-9天的一段时间，该固相表面上固定了第一因子和第二因子，其中对所述T细胞，第一因子提供活化信号，第二因子提供共刺激信号。
参照下列详述和附图，本发明所述的和其它方面显而易见。
附图简述
图1是第8天测量的、从大约0.5×109T细胞开始，经过(XCELLERATEIITM)或不经(XCELLERATE ITM)磁性富集和刺激的活化和扩增T细胞总数的比较示意图。
图2是第8天测量的、经过(XCELLERATE IITM)或不经(XCELLERATEITM)磁性富集和刺激的活化和扩增T细胞扩增倍数比较示意图。
图3是比较预先培养8天的、经磁性富集和刺激(XCELLERATE IITM)或不经磁性富集和刺激(XCELLERATE ITM)的T细胞再刺激后CD154表达的流式细胞术分析结果示意图。
图4是比较培养3天后经过磁性富集和刺激的(XCELLERATE IITM)及不经磁性富集和刺激(XCELLERATE ITM)的活化细胞CD154表达的流式细胞术分析结果示意图。
图5A-5B是经过XCELLERATE ITM PBMC(5A)或冷冻和融化过的PBMC(5B)处理，以起始XCELLERATE ITM过程的T细胞活化和扩增示意图。
图6A-6B是一个供体样本(PC071)中，T细胞活化以后，在XCEllERATE I或IITM过程中CD25表达的时程分析示意图。在第8天点上进行再再刺激，以模拟体内活化。图6A描述CD4+细胞上CD25的表达，图6B则描述CD8+细胞上CD25的表达。
图7A-7B是一个供体样本(PC071)中，T细胞活化以后，在XCEllERATE I或IITM过程中CD154表达的时程分析示意图。在第8天点上进行再刺激，以模拟体内活化。图7A描述CD4+细胞上CD154的表达，图7B则描述CD8+细胞上CD154的表达。
图8A和8B是经利用实施例IX阐述的方法用抗CD3和抗CD28共固定小珠刺激后，人外周血T细胞的生长示意图。
图9是经抗CD3和抗CD28共固定小珠+/-10u/ml重组人IL-2+/-去除单核细胞进行刺激以后，人外周血T细胞的生长示意图。全部细胞在Baxter Lifecell瓶(300ml)中培养。“Scale-up”是按比例放大到Baxter Lifecell 3L培养瓶中的300ml瓶培养情况(没有IL-2/去除单核细胞)。
图10是利用前向散射流式细胞术-时间曲线测定的细胞大小的动力学分析示意图。
图11A和11B是经过抗CD3和抗CD28共固定小珠起始刺激以后，CD25随时间表达的情况示意图。图11A代表CD4+细胞上CD25的表达曲线，图11B则代表CD8+细胞上CD25的表达曲线。
图12是在初级和次级刺激以后，利用前向散射流式细胞术随时间测定的细胞大小变化示意图。
图13A和13B是在初级和次级刺激以后，CD25随时间表达的情况示意图。图13A代表CD4+细胞上CD25的表达曲线，图13B则代表CD8+细胞上CD25的表达曲线。
图14A和14B是在次级刺激以后，CD154表达的流式细胞术数据图，其中初级和次级刺激来源不同。图14A代表CD4+细胞上CD154的表达曲线，图14B则代表CD8+细胞上CD154的表达曲线。
图15是次级刺激后样本中扩增的全部T细胞上CD137表达的流式细胞术数据图。
图16A和16B是在次级刺激以后，CD54表达的流式细胞术数据图，其中次级刺激来源不同。图16A表示CD4+细胞上CD54的表达曲线，图16B则表示CD8+细胞上CD54的表达曲线。
图17A-17D是表示一名B细胞慢性淋巴细胞性白血病病人的T细胞，在经过抗CD3和抗CD28偶联的小珠次级刺激后，细胞表型以及CD154和CD137表达的流式细胞术数据图。图17A和17B表示经过抗CD3和抗CD28偶联小珠刺激后13天(17A)，以及经过抗CD3和抗CD28偶联小珠初级刺激后18天、次级刺激后7天(17B)的样本中存在的CD4+和CD8+细胞。图17C和17D是一名B细胞慢性淋巴细胞性白血病病人的细胞，经过次级刺激后，CD154和CD137表达的流式细胞术数据图。
图18A-18C是来自正常供体的T细胞，经初级和次级刺激后，IL-2(18A)、γ-干扰素(IFN-)(18B)、和IL-4(18C)随时间表达的示意图。
图19A-19B是经过抗CD3和抗CD28偶联小珠刺激以后，CD62L随时间表达的示意图。
图20是经抗CD3和抗CD28共固定小珠刺激以后，CD4或CD8细胞百分比示意图。
图21A-21B是用平均荧光强度表示的分别经抗CD3和抗CD8共固定小珠刺激以及+/-利用实施例IX方法再刺激以后，CD25和CD154的表达情况的流式细胞术数据示意图。
图22A-22B是在经抗CD3和抗CD28共固定小珠刺激以前，兼有CD4和CD8亚群(22A)或CD4富集的群体(22B)细胞中，与对照染色(例如，背景)比较，CD154染色情况的流式细胞术分析结果示意图。
图23A-23B是外周血淋巴细胞经抗CD3和抗CD28共固定小珠刺激以后，培养基中TNF-(23A)和IFN-(23B)的ELISA分析结果示意图。
图24A-24B是外周血淋巴细胞经抗CD3和抗CD28共固定小珠刺激以后，培养基中IL-4(24A)和IL-2(24B)的ELISA分析结果示意图。
图25是外周血淋巴细胞经抗CD3和抗CD28共固定小珠刺激以后，利用前向散射分析的T细胞的大小增加的示意图。
图26A-26L是CD62L表达(平均荧光强度，MFI)(26A)、CD49d(MFI)(26B)、CD25(MFI)(26C)、CD69(MFI)(26D)、CD154(MFI)(26E)、正向光散射(大小)(26F)、存活力(％有效通道)(26G)的流式细胞术数据的柱形图；全部经抗CD3和抗CD28共固定小珠刺激，并在第8天经相同方法再刺激。图26H-26L分别描述了在刺激后4和18小时的CD62L、CD69、CD49d、CD154、和CD25。
发明详述
在陈述本发明之前，陈述下文将要使用的某些术语的定义，会对理解有所帮助。
此处所用术语″生物相容的″，是指对活细胞没有明显毒性的特性。
此处所用术语″刺激″，是指通过细胞表面成分的连接而诱导的初级应答。例如，就受体而言，此种刺激必然伴有受体连接以及随后的信号转导事件。就T细胞刺激而言，此种刺激是指T细胞表面成分的连接，在一个实施方案中随后诱导了信号转导事件，例如结合TCR/CD3复合物。此外，刺激事件可以活化细胞，并上调或下调分子的表达或分泌，例如下调TGF-B。因此，细胞表面成分的连接，即使无直接的信号转导事件，也可引起细胞骨架结构重组或细胞表面成分结合，其中每种都可以增强、修饰或改变后续的细胞反应。
此处所用术语″活化″，是指经足够的细胞表面成分连接以诱导显著的形态变化后的细胞状态。就T细胞而言，此种活化是指T细胞已经充分刺激而诱导细胞增殖的状态。T细胞的活化也可以诱导细胞因子的产生，以及发挥调节或细胞溶解效应物的功能。就其它细胞而言，此术语意指或上调或下调特定的物理化学过程。
此处所用术语″作用力″，是指人工或外部作用力，其施于待刺激细胞以诱导细胞富集，并利用结合细胞表面成分的因子富集细胞。例如，术语″作用力″包括任何一种大于重力的作用力(即，除重力之外，并不仅仅是重力)，其可诱导细胞富集和/或细胞表面成分连接。此种作用力包括跨膜压(例如过滤)、液压力、电力、声学作用力、离心力或磁力。理想地，所用作用力驱使目的靶细胞富集连接细胞表面成分的因子。在多种情况下，作用力可以是脉冲的，即作用与再作用(例如，磁力可以开关，脉冲顺磁颗粒和细胞群体)。
此处所用术语″同步″，是指在附着有细胞表面成分结合因子的表面上富集细胞后，引起细胞互相之间以及细胞与表面因此与配基(即因子)之间富集。然而，使用术语″同步″并不排除上述靶细胞与附着有细胞表面成分结合因子的表面事先结合，因为富集以及进一步配基结合在富集表面同时发生。例如，就T细胞活化而言，T细胞可暴露于诸如附着抗CD3和抗CD28抗体的顺磁小珠的表面，随后通过磁场富集。因此在这种情况下，虽然细胞和小珠具有事先接触和连接，但在细胞富集期间发生了另外的连接。
此处所用术语″靶细胞″，是指欲通过细胞表面成分连接而刺激的任何细胞。
此处所用″抗体″，包括多克隆和单克隆抗体两种；灵长类来源的(例如人源的)；鼠源的；鼠-人的；鼠-灵长类的；以及嵌合的；并可以是完整分子、其片段(诸如scFv、Fv、Fd、Fab、Fab’和F(ab)’2片段)、或完整分子和/或片段的多聚体或聚集物；可以是天然存在或通过诸如免疫、合成或遗传工程生产的；此处所用″抗体片段″是指源自抗体的或与抗体相关的片段，其可与抗原结合，并且在一些实施方案中，它们可被衍生化以显示促进清除和吸收的结构特征，例如通过掺入半乳糖残基。这包括，例如F(ab)、F(ab)’2、scFv、轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)、及其组合。
此处所用术语″蛋白质″，包括蛋白质、多肽和肽；可以是完整的分子、其片段或完整的分子和/或片段的多聚体或聚集物；可以是天然存在或通过诸如合成(包括化学的和/或酶学的)或遗传工程生产的。
此处所用术语″因子″、″配基″、或″结合细胞表面成分的因子″，是指结合确定细胞群体的分子。该因子可以结合任何细胞表面成分，例如受体、抗原决定簇、或靶细胞群体上存在的其它结合位点。因子可以是蛋白质、肽、抗体及其抗体片段、融合蛋白质、合成分子、有机分子(例如小分子)等等。在本说明书中，以及就T细胞刺激而言，用抗体作为这种因子的典型实施例。
此处所用术语″结合细胞表面成分的因子″和″细胞表面成分″，用于配基/抗配基对的上下文中。相应地，这些分子应视为补体/抗补体分子对，表现为特异性结合，通常亲合力比较高。
此处所用″共同刺激信号″，是指与原始信号，例如TCR/CD3连接相结合时，引起T细胞增殖的信号。
此处所用″配基/抗配基对″，是指补体/抗补体类分子，其表现为特异性结合，通常亲合力比较高。典型的配基/抗配基对，酶/抑制剂、半抗原/抗体、凝集素/糖类、配基/受体、以及生物素/亲和素或链亲和素。在本发明说明书上下文中，受体和其它细胞表面成分是抗配基，而与其作用的因子(例如抗体和抗体片段)被认为是配基。
此处所用″分离″，包括将一个组分从另一组分中基本纯化出来的任何方法(例如经过滤或磁性吸引)。
此处所用″静止″，是指细胞没有积极增殖的细胞状态。
此处所用“表面”，是指能够附着因子的任何表面，包括而不局限于金属、玻璃、塑料、共聚物、胶体、脂类、细胞表面等等，基本上是能够保持因子结合成附着其上的任何表面。
本发明一方面涉及惊人的发现，即诱导细胞富集以及细胞表面成分连接的作用力组合，引起该细胞激活高度增强。此处陈述的典型实施例中利用T细胞，然而本领域技术人员很容易推断，本发明对任何希望有其细胞表面成分连接或聚集或者这种结合引起随后的细胞信号事件(例如受体)的细胞类型都适用。虽然本发明希望不受理论约束，但有可能是通过利用包括脂质筏和/或受体极化在内的现象起作用。这些现象的相似之处在于，它们都表明或者通过包含细胞表面成分的脂质筏聚集来启动/增强信号转导，或者因受体在细胞的一个甚至几个区域的定位(即极化)来增强信号转导。因此，这种细胞表面成分的连接不仅引起T细胞意想不到地强烈活化和增殖，也可用于放大许多细胞类型的信号转导事件。因而本发明能与可植入装置联用，用于诱导身体特定位置的信号转导事件，本发明也可用于离体激活细胞，随后输给病人，并可用于通过放大信号转导的信号，来实质性加强对细胞信号转导事件的研究，从而有助于筛选影响该转导事件的药物(例如，与精神分裂症、睡眠及其它神经学适应症相关的G蛋白偶联受体；与变态反应相关的肥大细胞和嗜碱性细胞上的Fc片段受体)。相应地，就T细胞而言，本发明提供了多种出乎意料的优点，首先它不需要利用“未包裹”颗粒来分离去除单核细胞的步骤，而只需要较少的细胞转移和较少试剂，从而简化了T细胞扩增，而在活化过程中提高了T细胞的活化水平，减少了处理细胞的时间和人力，降低了生产成本，提高了病人处理和给药日程安排的灵活性。
本发明另一方面利用了有或没有配基/因子结合的第一和第二或更多的表面。在本实施方案中，各种表面上可附着相同或不同的、用以结合靶细胞的细胞表面成分的因子。例如，顺磁小珠上可附着靶细胞的受体的抗体，这种小珠可与包含靶细胞的细胞群体混合一起。另外，此细胞群体可混合第二或更多其上附着有相同或不同细胞表面成分结合因子的小珠。在诱导富集的作用力作用下，小珠和细胞汇集于小体积中，从而放大了信号。另一个实施例中，将附着有特异性针对糖类或其它非受体类细胞表面成分的因子的顺磁小珠与包含靶细胞的细胞群体混合。然后用磁场使附着细胞的小珠移向另一个其上附着有受体连接因子的表面。这样，信号转导诱导因子位于第二表面上。再一个实施例中，与靶细胞的细胞表面成分结合的因子可以附着在一种颗粒上，该种颗粒大到足以滞留于其上可附着有配基的网或滤器上。
如上所述，本发明提供了通过同步富集以及连接群体中细胞表面上的成分，来刺激细胞群体的方法。用结合细胞表面成分的因子(例如配基)，与细胞群体接触，能够刺激该细胞群体。配基可以在溶液中，也可附着在表面上。细胞表面成分(例如受体)的连接，通常可诱导特定的信号途径。最近研究提示，为了发生信号传导，包含必要受体的关键浓度的脂质筏必须聚集。例如，可以促进体内或体外的筏聚集，方法为：在顺磁颗粒表面附着针对特定细胞表面成分的配基，将带有配基的颗粒与细胞接触，其后即刻或同时施加作用力，例如磁场以帮助连接的成分(如受体)极化，并在小体积内富集细胞。应用磁力富集细胞，以及利用其上附着可连接细胞表面成分的因子的表面来富集细胞，从而使细胞与配基的接触更大，可加快并更有效活化。本发明的许多应用是可能的，例如，如果细胞的受体数量少和/或功能缺陷，此方法足以在脂质筏中富集这些受体，以克服这些缺陷，允许适当的信号活性。这种修正细胞表面组份的例子见于某些类型的白血病病人，其中在用因子，诸如抗CD3和抗CD28抗体，激活细胞表面成分之前，几种正常的细胞表面标志极低，如CD3/TCR复合物。利用因子(如抗CD3和抗CD28抗体)激活这些细胞群体，这些细胞的细胞表面标志回复到看来正常的水平，回输给病人后，它们可提供更强的产物，用于癌症治疗。本发明的其它应用中，可以有效地富集和活化细胞，包括诱导受体极化，从而达到最大的受体信号事件。这些应用的用途广泛，包括用于针对受体的筛选分析，或者通过在细胞表面聚集细胞筏来诱导活化，例如通过连接肿瘤细胞的Fas或类似分子诱导调亡。
在所述筛选分析的实施例中，能够利用带有G蛋白偶联受体的细胞，使之与可与其相结合的因子接触，这些因子结合在允许作用力诱导富集的表面上。相应地，随着受体筏聚集，信号转导事件将会被放大。这对一般实验中很低水平的信号转导事件的研究是重要的，从而筛选药物化合物，以抑制或设法修饰该信号转导事件。
A.细胞群体的刺激
本发明的方法涉及通过引入结合细胞成分的配基或因子，刺激靶细胞，诱导细胞事件。细胞与配基或因子的结合，可触发信号途径，继而活化细胞内特定的表型或生物学变化。细胞活化可以增强正常的细胞功能，或启动异常细胞内的正常细胞功能。此处所述方法提供了通过驱使细胞连同联接细胞表面成分的配基或因子一起富集，来激活细胞。通过引入与第二种细胞表面成分连接的第二配基或因子，可以加强细胞激活，或激活特定的细胞事件。该方法可适用于细胞表面成分的连接将引发信号事件的任何细胞。本发明还提供了选择或培养激活细胞的方法。所述的一般实施例是T细胞的活化，但本领域一般技术人员应当理解，该方法可适用于其它，细胞类型。例如，可激活和选择的细胞类型包括成纤维细胞、成神经细胞、造血干细胞和造血祖细胞(CD34+细胞)、间充质干细胞、树突状细胞、溶细胞性T细胞(CD8+细胞)、其它白细胞群体、多能干细胞、多种潜能干细胞、岛细胞等等。相应地，本发明也提供该方法学产生的细胞群体，以及具有显著表型特征的细胞群体，包括具有特定表型特征的T细胞。
如上所述，本发明可以利用多种细胞类型。例如，可利用如B细胞、T细胞、NK细胞、其它血细胞、神经元细胞、腺(内分泌)细胞、成骨细胞(骨细胞等)、生殖细胞(如卵母细胞)、生殖器官内层上皮细胞及其它细胞类型。细胞表面成分-配基对包括(但不排除其它)：T细胞抗原受体(TCR)和抗CD3mAb、TCR和主要组织相容性复合物(MHC)+抗原、TCR和超抗原(如葡萄球菌肠毒素B(SEB)、中毒性休克综合症毒素(TSST)等等)、B细胞抗原受体(BCR)和抗Ig、BCR和LPS、BCR和特异性抗原(单价或多价)、NK受体和抗NK受体抗体、FAS(CD95)受体和FAS配基、FAS受体和抗FAS抗体、CD54和抗CD54抗体、CD2和抗CD2抗体、CD2和LFA-3(淋巴细胞功能相关抗原-3)、细胞因子受体及其相应细胞因子、细胞因子受体和抗细胞因子受体抗体、TNF-R(肿瘤坏死因子受体)家族成员及其抗体、TNF-R家族成员及其相应配基、粘附/归巢受体及其配基、粘附/归巢受体及其抗体、卵母细胞或受精卵母细胞受体及其配基、卵母细胞或受精卵母细胞及其抗体、子宫内层子宫内膜上的受体及其配基、激素受体及其相应激素、激素受体及其抗体、及其它。
受体与配基结合的本质将导致或者受体的多聚化，或者受体的聚集/定位，以致于加速、改善或者改变信号或者细胞反应，以赋予特殊的好处，例如细胞分裂、细胞因子分泌、细胞迁移、提高的细胞间相互作用等。
以下提供两个实施例，表明细胞表面成分的这种多聚化、聚集、或可控的重定位，如何具有实际的好处。
一个实施例中，由抗原和抗原呈递细胞引起的正常T细胞激活，通常引起例如TCR筏富集、细胞骨架重组、″活化″信号的极化和细胞分裂。在体内没有″正常″T细胞活化的情况下，利用如此处所述的人工方法，特别是通过加速的、受控的、和空间定位的连接TCR和CD28，可以促进、改善、或反之影响上述功能。好处可以是改善体外细胞扩增，产生可输注的更多、更强的细胞，应用于治疗。其它好处可以是改善缺陷细胞(例如细胞表面上TCR密度低于正常)的受体″富集″。同样地，可能有利于需要活化特异性T细胞群体的体内应用，例如在肿瘤位点活化肿瘤特异性T细胞。改善的受体富集和定位，能够提供活化信号，而这种活化信号对于功能尚可的T细胞。另外，这种活化能够用于抗原特异性T细胞难于获得。关于这一点，能够从肿瘤中分离T细胞，扩增并输注给病人。同样，利用本方法能够扩增在体内或体外与抗原接触的T细胞。
另一个实施例中，改善了通过FAS途径诱导的细胞死亡：加速FAS多聚化、在靶细胞表面空间上定位″活化″的FAS、或者促进累积的FAS连接(原本无法获得)的能力，在体内能够提供明显益处，特别是对于治疗癌症、自身免疫反应、或移植物抗宿主病。例如，肿瘤细胞可能在体内表达低水平FAS，宿主可能在肿瘤位点表达低水平的FAS-L(因为抑制性细胞因子等等原因)。由于所述低水平，不能产生足够的FAS信号，因而容许肿瘤存活和生长。克服FAS/FAS配基缺陷的可能方法是，用FAS的单价或多价配基(FAS-L、抗体等等)结合顺磁颗粒，来靶向肿瘤/肿瘤位点。在肿瘤位点(例如，黑素瘤、Kaposi氏肉瘤、鳞状细胞颈癌等等)处施加强磁场，由于该顺磁颗粒可结合肿瘤细胞上的FAS，能够空间定位在肿瘤位点处，适合于受体活化和/或T细胞活化及扩增。伴随信号极化的FAS富集增强，能提供足够的信号，从而在肿瘤细胞中诱导细胞死亡。
本发明的一个特定的实施方案中，可以通过T细胞的同步富集及其表面连接来刺激T细胞群体。一方面，本发明在一种表面上共固定针对CD3和CD28的抗体。优选的固定表面包括颗粒，以及某些方面包括小珠，例如顺磁小珠。另一方面，本发明可利用结合TCR/CD3复合物并启动初级刺激信号的任何配基，作为固定在表面上的初级活化因子。在本发明中，与CD28结合并启动CD28信号转导途径、从而共刺激带有CD3配基的细胞、并增强T细胞群体活化的任何配基是CD28配基，相应地，是共刺激因子。再一方面，本发明施加作用力给T细胞以及抗CD3和抗CD28包被表面的混合物，以富集T细胞，从而使T细胞表面连接最大化。在一个特定的实施方案中，富集的作用力是磁力，抗CD3和抗CD28包被的表面是顺磁小珠。本领域中有以富集方式集合细胞和配基的其它方法可供利用。刺激T细胞群体的该方法，提供了小珠-细胞和/或细胞-细胞的明显接触，诱导了T细胞意想不到的强活化和/或增殖。此外，本发明的方法改变了细胞表面标志的特征，其中活化T细胞表达，与从病人中首次分离的T细胞相比显示更为正常的表型和较少变化的终产物的细胞表面标志。
1.初级信号
以下简述引起离体T细胞刺激的生物化学事件。TCR/CD3复合物与抗原呈递细胞上同MHC I类或II类分子一起呈递的抗原之间的相互作用，启动一系列生物化学事件，称为抗原特异性T细胞活化。因此，通过刺激T细胞TCR/CD3复合物或刺激CD2表面蛋白质，能够实现T细胞活化。抗CD3单克隆抗体可用于通过TCR/CD3复合物活化T细胞群体。许多抗人CD3单克隆抗体市场上可买到，例如可以由从美国典型培养物保藏中心获得的杂交瘤细胞制备的OKT3，以及单克隆抗体G19-4。抗CD2抗体的刺激形式同样是已知并可得到的，用抗CD2抗体通过CD2的刺激，一般通过联用至少二个不同的抗CD2抗体来实现。已知的抗CD2抗体的刺激组合，包括下列：T11.3抗体与T11.1或T11.2抗体组合(Meuer等人，Cell 36：897-906，1984)，以及9.6抗体(与T11.1抗体识别相同的表位)与9-1抗体组合(Yang等人，J.Immunol.137：1097-1100，1986)。还可用与上述任何抗体结合同一表位的其它抗体。可以通过标准技术制备和鉴定其它抗体或抗体组合。
还可以通过其它机制传递初级活化信号给T细胞，例如，可利用的组合包括蛋白激酶C(PKC)活化剂，比如佛波酯(如乙酸肉豆蔻酸佛波醇)，以及钙离子载体(例如离子霉素，它可提高细胞质中钙的浓度)，等等。利用此类因子可绕过TCR/CD3复合物，但将刺激信号传递给T细胞。其它充当初级信号的因子包括天然及合成的配基。天然配基包括有或没有呈递肽的MHC。其它配基包括但不局限于肽、多肽、生长因子、细胞因子、趋化因子、糖肽、可溶性受体、甾类、激素、有丝分裂原如植物凝集素(PHA)、或其它超抗原。在本发明中，利用富集和刺激可以引起受体高度极化，以至于诱导T细胞增殖不需要次级信号。
在其它实施方案中，利用本发明可以放大或分析任何种类的信号转导事件。例如，可以利用本发明的富集方法刺激和测量G蛋白质偶联受体。
2.次级信号
在T细胞中传递初级活化信号，似乎需要刺激TCR/CD3复合物或CD2分子，而T细胞表面上的许多分子，称为辅助或共同刺激分子，涉及调节由静止T细胞到转化母细胞的转变以及后续的增殖和分化。因而除初级活化信号之外，诱导T细胞应答需要次级共同刺激信号。这样的一个共同刺激或辅助分子CD28被认为可启动或调节不同于任何通过TCR复合物刺激的信号转导途径。
因此，为了在缺少外源生长因子或辅助细胞的情况下增强T细胞群体的活化和增殖，T细胞表面上的辅助分子例如CD28，用结合该辅助分子的配基刺激。一个实施方案中，通过T细胞群体与表面接触(表面上附着有可结合CD3的配基和可结合CD28的配基)，使附属分子CD28的刺激和T细胞活化同时发生。用例如抗CD3抗体进行的T细胞的活化，以及CD28辅助分子的刺激，导致CD4+T细胞选择性增殖。
因此，本领域一般的技术人员应当知道，包括抗DC28抗体或其能够交联CD28分子的片段或者CD28的天然配基在内的任何因子，可用于刺激T细胞。用于本发明的典型抗CD28抗体或其片段包括，单克隆抗体9.3(IgG2a)(Bristol-Myers Squibb，Princeton，NJ)、单克隆抗体KOLT-2(IgG1)、15E8(IgG1)、248.23.2(IgM)、以及EX5.3D10(IgG2a)(ATCC HB11373)。典型的天然配基包括B7蛋白质家族，例如B7-1(CD80)和B7-2(CD86)(Freedman等人，J.Immunol.137：3260-3267，1987；Freeman等人，J.Immunol.143：2714-2722，1989；Freeman等人，J.Exp.Med.174：625-631，1991；Freeman等人，Science 262：909-911，1993；Azuma等人，Nature 366：76-79，1993；Freeman等人，J.Exp.Med.178：2185-2192，1993)。此外，依照本发明，还可以利用天然配基的结合同系物，不论其是天然的还是通过化学或重组技术合成的。充当次级信号的其他因子包括天然及合成的配基，因子可以包括但不局限于其它的抗体或其片段、肽、多肽、生长因子、细胞因子、趋化因子、糖肽、可溶性受体、甾类、激素、有丝分裂原如植物凝集素(PHA)、或其它超抗原。
本发明的另一个实施方案中，可以通过共同刺激其它的T细胞膜整合蛋白质，来增强T细胞群体的活化。例如，T细胞整合素LFA-1与其天然配基ICAM-1的结合，可以增强细胞的活化。可以充当T细胞共同刺激物的另一种细胞表面分子是VCAM-1(CD106)，其可与T细胞上的甚晚期抗原-4(very-late-antigen-4，VLA-4)结合。
本领域技术人员应该理解，可以通过连接细胞表面成分和诱导该成分富集的因子的结合，继而引起信号途径活化，来刺激除T细胞以外的细胞。其它诸如此类的细胞表面成分包括但不局限于，GPI锚定的叶酸受体(CD59)、人IgE受体(FcεRi受体)、BCR、EGF受体、胰岛素受体、ephrin B1受体、神经营养因子、神经胶质细胞源性中性粒细胞因子(glial-cell derived neutrophic factor，GNDF)、hedgehog、及其它连接胆固醇和棕榈酰化的蛋白质、H-Ras、整合素、内皮氧化氮合成酶(eNOS)、FAS、TNF受体家族成员、GPI锚定蛋白质、双重酰化的蛋白质例如Src激酶家族、异源三聚体G蛋白的α-亚基、以及细胞骨架蛋白质。
B.T细胞群体的扩增
一方面，本发明通过T细胞分离以及随后刺激，完成T细胞的离体扩增。本发明的一个实施方案中，利用单个因子刺激T细胞。另一个实施方案中，用两个因子刺激T细胞，一个诱导初级信号，第二是共同刺激信号。可用于刺激单个信号或初级信号的配基以及刺激第二信号的辅助分子，可以可溶形式、附着于细胞表面、或固定在此处所述表面上的方式使用。附着于表面的配基或因子充当抗原递呈细胞(APC)的″代用品″。优选的实施方案中，初级和次级因子都共固定在表面上。在一个实施方案中，提供初级活化信号的分子，例如CD3配基，以及共同刺激分子，例如CD28配基，偶联在同一表面，例如颗粒上。另外，如前所述，可以使用位于相同或不同的表面上的一个、两个、或更多的刺激分子。
扩增之前，从受实验者处获得T细胞来源。术语″受实验者″意图包括可诱导免疫应答的活有机体(例如哺乳动物)。受实验者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、及其转基因物种。可以从许多来源获得T细胞，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组织、以及肿瘤。优选地，通过单采血液成分术法或白细胞提取法从个体循环血中获得细胞。单采血液成分术法的产物一般包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白血球、红血球、以及血小板。在一个实施方案中，用单采血液成分术法收集的细胞可以经洗涤除去血浆部份，并放入适当的缓冲液或培养基中，以供后续加工步骤。本发明的一个实施方案中，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞。另一个实施方案中，洗涤溶液缺钙，并可以缺镁，或可以缺许多、甚至所有二价阳离子。再者，令人惊讶的是，在没有钙的情况下，开始的活化步骤引起活化放大。本领域一般技术人员当易理解，可以利用本领域所共知的方法完成洗涤步骤，例如按照厂家说明书使用半自动化″连续流″离心机(如Cobe 2991细胞处理机，Baxter)。洗涤以后，可将细胞再悬浮于多种生物相容性的缓冲液中，例如，无钙无镁的PBS。替代地，可以除去单采血液成分术法样本中不合需要的成分，而直接将细胞再悬浮于培养基中。
另一个实施方案中，通过溶解红细胞、去除单核细胞，从外周血淋巴细胞中分离T细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心。可以利用正向或负向选择技术，进一步分离特定的T细胞亚群，例如CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、和CD45RO+T细胞。例如，可以利用针对负向选择细胞特有表面标志的抗体组合，通过负向选择富集T细胞群体。优选的方法是，使用针对负向选择细胞上存在的细胞表面标志的单克隆抗体组合，通过负向的磁性免疫细胞附着或流式细胞术进行细胞的分拣和/或选择。例如，为通过负向选择富集CD4+细胞，单克隆抗体组合一般包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、以及CD8的抗体。
就上述的单核细胞去除而言，可在离体扩增之前，从血制品中去除单核细胞群体(即CD14+细胞)，可以通过多种方法，包括抗CD14包被的小珠或柱子，或者利用这些细胞的吞噬活性促进去除。因此，在本发明的一个实施方案中，利用了大小足以被吞噬性单核细胞吞没的顺磁颗粒。在某些实施方案中，顺磁颗粒是市场上买得到的小珠，如DynalAS生产的商标名为DynabeadsTM的产品，在这方面典型的DynabeadsTM有M-280、M-450、和M-500。一方面，利用包被″无关″蛋白质(例如血清蛋白或抗体)的顺磁颗粒，去除其它的非特异性细胞。无关蛋白质和抗体包括那些不特异性针对待扩增T细胞的蛋白质和抗体或片段。在某些实施方案中，无关小珠包括包被有绵羊抗小鼠抗体、山羊抗小鼠抗体、和人血清白蛋白的小珠。
简言之，这种单核细胞的去除是如下进行的：利用一种或更多种无关的或非抗体偶联的顺磁颗粒预先温育经聚蔗糖分离的全血或单采血液成分术的外周血(每批细胞(一般大约5×108-2×1010细胞)约1瓶或4×109小珠)在22-37℃温育约30分钟-2小时，继之以磁性去除附着或吞噬了顺磁颗粒的细胞。可利用本领域应用的标准方法完成这种分离，例如，可利用任何磁力分离方法，包括多种商品化的方法(如DYNAL磁性颗粒富集器(DYNAL MPC)。可以通过本领域一般技术人员所熟知的多种方法，包括流式细胞术分析CD14阳性细胞，在去除前后监测，以保证必要的去除。
制备供刺激用T细胞的另一方法是，于洗涤步骤后冷冻细胞，不需要去除单核细胞的步骤。但愿不受理论约束，冷冻及随后的融化步骤去除了细胞群体中的粒细胞和一定程度上的单核细胞，从而提供了更为均一产物。经过洗涤步骤除去血浆和血小板后，将细胞悬浮在冷冻液中。许多冷冻液及其参数为本领域所共知并可在本文中应用，方法之一包括，利用含20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS、或其它合适的细胞冷冻剂，然后按每分钟1℃的速率将细胞冷冻至-80℃，并保存在液氮贮罐的气相中。
如此处所述，可以通过诸如接触固定于表面上的抗-CD3抗体或抗CD2抗体，或者接触连有钙离子载体的蛋白激酶C活化剂(如苔藓抑素)，来刺激细胞群体。利用结合辅助分子的配基，来共同刺激T细胞表面上的辅助分子。例如，在适于刺激T细胞增殖的条件下，用抗CD3抗体和抗CD28抗体接触CD4+细胞群体。同样，可以利用抗CD3抗体和单克隆抗体ES5.2D8(ATCC)以及本领域所共知的其它方法刺激CD8+T细胞的增殖(Berg等人，Transplant Proc.30(8)：3975-3977，1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9)：1319-1328，1999；Garland等人，J.Immunol Meth.227(1-2)：53-63；1999)。
可通过不同方案提供T细胞的初级刺激信号和共同刺激信号。例如，提供各信号的因子可在溶液中或与表面偶联。与表面偶联时，因子可能偶联同一表面(即″顺式″形式)或分开的表面(即″反式″形式)。或者，可能一个因子偶联表面，另一个因子在溶液中。在一个实施方案中，提供共同刺激信号的因子结合细胞表面，提供初级的活化信号的因子处于溶液中或与表面偶联。优选的实施方案中，两个因子固定在小珠上，其或是相同的小珠，即″顺式″，或是分开的小珠，即″反式″。例如，提供初级活化信号的因子是抗CD3抗体，提供共同刺激信号的因子是抗CD28抗体；并且两个因子均以相等的分子数量共固定在相同的小珠上。在一个实施方案中，为了CD4+T细胞的扩增和T细胞生长，每种抗体以1∶1比率与小珠结合。然而，用来刺激T细胞或其它靶细胞的颗粒与细胞的比率，可以使用1∶500-500∶1以及两者之间的任何整数值。  正如本领域一般技术人员容易理解的，颗粒与细胞的比率取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，小珠子只能结合几个细胞，大珠子则能结合许多。在某些实施方案中，细胞与颗粒的比率为1∶100-100∶1以及其间的任何整数值，在另外的实施方案中，包含1∶9-9∶1以及其间的任何整数值的比率，也可以用来刺激T细胞。引起T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联小珠与T细胞的比率，如上所述可能不同，但某些优选的数值至少包括1∶4、1∶3、1∶2、2∶1、3∶1、4∶1-6∶1，一个优选的比率是至少2∶1(小珠/T细胞)。
使用某些方法时，在初始活化和刺激后，经过大约12-14天的一段时间后将T细胞与刺激物分开，以维持T细胞群体的长期刺激可能是有利的。例如，利用诸如库尔特计数器检查T细胞大小或测量其体积，定期(例如每天)监测T细胞增殖率。在这点上，静止T细胞的平均直径大约6.8微米，受到初始活化和刺激后，在存在刺激配基的情况下，第4天T细胞平均直径会增加到超过12微米，大约第6天开始降低。T细胞平均直径降到约8微米时，可以重新活化和再刺激T细胞，以诱导T细胞再次增殖。或者，通过分析在活化的T细胞上诱导出现的细胞表面分子，诸如B7-1、B7-2，来监测T细胞增殖速率和T细胞再刺激时间。
为诱导CD4+和/或CD8+T细胞群体的长期刺激，可能必需用刺激因子，诸如抗CD3抗体和抗CD28抗体或单克隆抗体ES5.2D8，多次重新活化和再刺激该T细胞，产生的CD4+或CD8+细胞群体数量增加到原始T细胞群体的大约10-1,000倍。利用本方法，有可能获得大约100-100,000倍的T细胞。此外，如实施例XII所述，利用本发明方法扩增的T细胞分泌高水平细胞因子(例如IL-2、IFN-γ、IL-4、GM-CSF和TNF-a)到培养上清液中。例如，与利用IL-2刺激相比，利用抗CD3和抗CD28共刺激而扩增的CD4+T细胞，向培养基中分泌高水平的GM-CSF和TNF-a。可以从培养上清液中纯化这些细胞因子，或该上清液可以直接用于维持细胞培养。同样，利用本发明方法扩增的T细胞，连同培养上清和细胞因子，可注入体内支持细胞生长。
一个实施方案中，利用共固定在小珠(3x28小珠)上的抗CD3和抗CD28抗体刺激T细胞足够长的一段时间，使细胞回到静止状态(低增殖或者不增殖)(约初始刺激后8-14天)。然后从细胞中除去刺激信号，洗涤细胞，回输病人。利用本发明方法，可使刺激末期的细胞具有应答抗原以及表现记忆样表型的能力，呈现″超可诱导化″，如实施例所证明。因此，经或外源性或输注体内后抗原再刺激，活化的T细胞表现为独特表型特性的强应答性特征，例如持续性CD154表达、细胞因子产生增加等等。
本发明另外的实施方案中，细胞，例如T细胞，与因子包被的小珠混合，随后分开小珠和细胞，然后培养该细胞。在选择的实施方案中，培养之前不分离因子包被的小珠和细胞，而是共同培养。进一步的实施方案中，通过施加作用力，首先富集小珠和细胞，引起细胞表面成分连接，从而诱导细胞刺激。
例如，当T细胞是靶细胞群体时，通过使附着抗CD3和抗CD28的顺磁小珠(CD3xCD28小珠)与制备的T细胞接触，从而使细胞表面成分连接。一个实施方案中，将细胞(例如每毫升104-109T细胞)和小珠(例如1.5×109个CD3×CD28顺磁小珠)在缓冲液中混合，优选地是PBS(无二价阳离子例如钙和镁)。本领域一般技术人员也容易理解可以使用任何细胞浓度。例如，样品中靶细胞可能非常少，仅包含样品的0.01％，或者全部样本(即100％)包含目的靶细胞。因此，任何细胞数量都在本发明范围之内。
悬浮细胞的缓冲液可以是适于特定细胞类型的任何缓冲液。使用某些细胞类型时，缓冲液可以包含为维持处理期间细胞完整所必需的其它组分，例如1-5％血清。另一实施方案中，细胞和小珠可以在细胞培养基中混合。通过例如旋转、振荡或任何一种混合方法，混合细胞和小珠1分钟-几个小时的时间。  然后靠作用力，例如置于磁场中，富集小珠和细胞的容器。除去培养基和未结合细胞，洗涤附着于小珠上的细胞，例如通过蠕动泵泵送，然后再悬浮于适合细胞培养的培养基中。
本发明的一个实施方案中，混合物可能培养几个小时(大约3小时)到14天，或两者之间以小时计的任何整数值。本发明的一个实施方案中，小珠和T细胞共同培养大约8天。另一个实施方案中，小珠和T细胞共同培养2-3天。适于T细胞培养的条件包括，适当的培养基(例如最低必需培养基、或RPMI培养基1640、或X-vivo 15(BioWhittaker))，其中可包含为增殖和存活所必需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、或白细胞介素-2(IL-2)。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包含在实验培养物中，在输给受实验者的细胞培养物中不存在。在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和气体(例如空气加5％CO2)，培养靶细胞。
以磁场作为富集作用力时，在细胞培养前施加于细胞的磁场强度，可以是在磁性表面为200-12,000高斯。磁铁的形状和大小适应于混合或细胞培养容器的大小和形状，或者适应于促进或提高细胞-细胞接触以及细胞富集的其它参数。通过在磁铁和细胞混合物内含的顺磁小珠之间放置作为缓冲物质或者隔离物的材料，可以扩散磁力。通常认为，强磁力是表面上至少7500高斯，而弱磁力是在表面上为2000-2500高斯范围之内。通过磁铁施加给顺磁小珠的近似磁力，取决于顺磁小珠的体积和磁场强度，公式如下：
Fmag＝(ν)(ψ)(B)dB/dx).
其中Fmag为磁力，ν为顺磁小珠的体积，ψ为顺磁小珠的磁化率(由制造商提供数值)，B为磁场强度，而(dB/dx)为场强梯度。本领域技术人员应当理解，可以获得或测量公式右手边的因子，以计算施加的磁力。
利用本发明方法刺激的细胞被激活，这可以由诱导信号转导、表达细胞表面标志和/或增殖显示。CD154是适合T细胞的这样一种标志，它是重要的免疫调节分子，CD154的表达对放大免疫应答非常有利。CD154与在许多B细胞、树突状细胞、单核细胞、和一些内皮细胞上表达的CD40分子相互作用。因此，CD154表达的这种意想不到的并惊人的增加，很可能引发更有效的T细胞成分。此处所述CD3+细胞的刺激提供了刺激后第1、2、3、或4天某些细胞表面标志(例如CD154)的表达水平提高1.1-20倍的T细胞(见实施例5、表2和图4)。经过富集并刺激，T细胞上另一细胞表面标志CD25的表达也高于培养前细胞或通过其它方法刺激的细胞(见表2)。
本领域技术人员应当理解，可通过细胞表面成分连接而刺激的任何靶细胞，可以与因子包被的表面，例如小珠联合。此外，因子包被的表面，例如小珠，可以在培养前、培养期间任一时间点、或培养结束时与细胞分开。另外，与靶细胞连接的因子包被的表面可以在培养前与未结合细胞分离，或者这些其它细胞也可以留在培养基中。一个实施方案中，培养之前不分开因子包被的小珠和靶细胞，而是共同培养。进一步的实施方案中，通过施加作用力，首先富集小珠和靶细胞，引起靶细胞表面成分连接，从而诱导刺激及后续活化。
本发明也包括可增加靶细胞浓度的其它方法，例如与包被有初级和次级刺激分子的表面相结合的T细胞部份。除施加磁力外，可以施加其它大于重力的作用力，例如而不局限于离心力、跨膜压、和液压力。也可利用过滤进行富集。
本领域技术人员容易理解，可以利用其它作用力进行富集，以加强因子包被的小珠与待刺激细胞间的接触。因此，利用细胞表面成分与配基结合来富集细胞的任何方法都是足够的，只要该富集作用能够以大于重力或扩散的方式将细胞和因子汇集在一起即可。
应当理解，在各个实施方案中，因子包被的表面可能是颗粒，例如与细胞混合并在磁场中富集在小体积中的小珠，从而将全部颗粒以及结合颗粒的细胞带到明确而集中的区域之中。某些实施方案中，因子包被的表面可在暴露于靶细胞的30秒-4小时之内，因作用力而富集。其它实施方案中该时间可能是1分钟-2小时、或介于其间的所有整数。施加作用力于具有受体生成细胞的细胞群体(该细胞群体混合了附着有至少一种细胞表面配基的表面)，可以诱导细胞受体极化，细胞表面分子富集。这种诱导细胞表面极化的方法可通过聚集包含脂类筏的细胞表面分子来增强细胞内信号。这种聚集可以诱导引起细胞事件下调或抑制的信号途径。或者，细胞表面分子的这种聚集可以引起细胞事件的上调或活化。
细胞事件包括，例如受体介导的信号转导，其可诱导或抑制包含凋亡在内的特定途径，或者诱导蛋白质磷酸化，或者刺激或抑制生长信号。一个实施方案中，细胞可以是淋巴细胞，特别是T细胞，细胞表面配基可以是附着于表面例如颗粒上的抗CD3抗体；该颗粒可以是顺磁小珠，施加的作用力是磁力。给淋巴细胞和顺磁小珠抗CD3包被表面的混合物施加磁力，可引起T细胞CD3受体极化，其速度快于没有外力的情况下。这种刺激T细胞的方法，促使T细胞免疫应答途径迅速活化，并促进细胞增殖。
另一实施方案中，可以改变或定制暴露于刺激因子例如抗CD3/抗-CD28(即CD3xCD28)包被的小珠的时间，以获得所需的T细胞表型。因为辅助T细胞(TH)的扩增能够改善或者恢复全面的免疫应答，故可能需要更多的辅助T细胞(TH)群体，一般是CD4+细胞，与CD8+细胞毒性或抑制性T细胞(Tc)相反。许多特定的免疫应答是由CD8+抗原特异性T细胞介导的，其可直接溶解或杀死靶细胞，但多数免疫应答需要CD4+T细胞的帮助，其表达重要的免疫调节分子，例如GM-CSF、CD40L、和IL-2。当优选CD4介导的辅助时，此处所述的可保持或提高CD4∶CD8的比率的方法，是极其有利的。CD4+T细胞数量的增加可以提高输给病人的细胞表达的CD40L量，潜在地改善了靶细胞的可见度(改善APC功能)。提高表达GM-CSF或IL-2(均主要由CD4+T细胞表达)细胞的输注数量，可以看到类似的效果。或者，对于较少需要CD4辅助而希望增加CD8+T细胞数量的情况下，还可以利用此处所述XCELLERATE方法，例如在刺激和/或培养之前预先选择CD8+细胞。在需要升高IFN-水平或者加强靶细胞的细胞溶解作用时，可能存在这种情况。
为完成不同T细胞群体的分离，暴露于富集作用力的时间可以是可变的或者脉冲的。例如作用力是磁铁时，可以改变暴露的磁铁或者磁场强度，和/或改变扩增时间，以获得特定的目的表型。多种表型标志的表达随时间而改变；所以为获得特定的T细胞群体，可以选择特定的时间点。因此，根据待刺激的细胞类型，刺激和/或扩增的时间可能是4周或更少、2周或更少、10天或更少、或者8天或更少(4周或更少包括从4周到1天(24小时)的所有时间范围)。一些实施方案中，刺激和扩增可以进行6天或更少、4天或更少、2天或更少，而在其它实施方案中，可以少到24小时或更少，优选地4-6小时或更少(此范围包括其间任何整数值)。T细胞刺激进行的时间较短时，有可能不能显著增加T细胞群体的数量，但是该群体会提供更强、更健康的活化T细胞，其可以继续在体内增殖，并更类似于正常的效应T细胞集合。在对蛋白质抗原的抗体反应中T细胞辅助的获得经常是限制因素，因此能够选择性扩增或选择性输注给受实验者以富集CD4+的T细胞群体，是非常有利的。这种富集群体的另外的好处显然是，可识别B淋巴细胞呈递的抗原的活化辅助T细胞会传递物理接触和细胞因子产生两种类型刺激信号，引起B细胞增殖和分化。
处于不同激活时间的T细胞可显示不同的特征，例如，一般血液或经单采血液成分的外周血单核细胞产物具有辅助T细胞群体(TH，CD4+)，其量大于细胞毒或抑制性T细胞群体(Tc，CD8+)。通过激活CD3和CD28受体离体扩增T细胞而产生的T细胞群体，其在大约第8-9天前主要由TH细胞组成，而大约第8-9天以后，该T细胞群体包含的Tc细胞群体日益增多。因此，根据治疗目的，用主要包含TH细胞的T细胞群体输注给受实验者，是有利的。同样，如果已分离到Tc细胞的抗原特异性亚群，则在更大程度上扩增该亚群可能是有利的。
另外，除CD4和CD8标志以外，其它表型标志也差异显著，但很大程度上可在细胞扩增过程中再现。因而这种可再现性可以为特定目的而定制活化的T细胞产物。
这样的一个实施例中，可随时间再现性改变的重要表型标志中有高亲合力的IL-2受体(CD25)、CD40配基(CD154)、和CD45RO(通过优先结合TCR，可提高TCR对抗原结合敏感性的分子)。本领域一般技术人员容易理解，这种分子的重要性在于多种原因。例如，在容许T细胞迅速分裂的自分泌环路中，CD25构成重要部分。CD154在下列过程中显示关键作用：激活抗原呈递树突状细胞的成熟过程；活化B细胞用于产生抗体；调节TH细胞增殖；增强Tc细胞分化；调节TH细胞和抗原呈递细胞的细胞因子分泌；以及激活共刺激配基，包括CD80、CD86、和CD154的表达。
细胞因子生成高峰位于离体扩增过程的前几天，相应地，因为已知细胞因子对于介导T细胞活化和功能以及免疫应答调节是重要的，所以这种细胞因子对开发治疗性T细胞产物非常重要，其可在受到其它抗原攻击时进行重激活。在这方面重要的细胞因子，包括但不局限于IL-2、IL-4、TNF-、以及IFN-。因而，通过在扩增的前几天获得T细胞群体，并输注给受试验者，可以产生治疗性有益效果，其中发生了进一步的体内T细胞活化和扩增。
除前述细胞因子及标志以外，在离体扩增过程中，已知对介导T细胞活化和免疫应答调节重要的粘附分子的表达也发生巨大且可再现的变化。例如，CD62L对于T细胞归巢到淋巴组织以及运送到炎症位点是重要的。在某些疾病和伤害的情况下，在这些位点存在活化的T细胞可能是不利的。因为在活化后较早出现CD62L的下调，因此这样的T细胞扩增较短时段。相反，较长时段培养会产生具有高水平CD62L的T细胞群体，因而在其它优选条件下将活化T细胞靶向到这些位点的能力更强。另一个表达随时间变化的多肽例子是CD49d，它是一种粘附分子，其参与将淋巴细胞从血液运送到炎症位点的组织间隙。CD49d配基与CD49d的结合可使T细胞通过与VCAM-1或纤连蛋白配基的结合接受活化和增殖的共激活信号。粘附分子CD54(其参与T细胞-APC和T细胞-T细胞相互作用，以及到炎症位点的归巢)的表达也在扩增过程中发生改变。因此，可在与目的标志分布一致的选择的时段内激活T细胞，随后收集并输注。因此可定制T细胞群体，以表达据信可对预治疗的适应症具有最大疗效的标志。
在各个实施方案中，本领域一般技术人员理解，从细胞中去除刺激信号取决于所利用的表面类型。例如，如果利用顺磁小珠，那么磁性分离是可用的选项。顺磁小珠制造商的说明书(例如DYNAL Inc.，Oslo，Norway)详述了分离技术。此外，如果该表面是大到足以与细胞分开的珠，则可以利用过滤。再有，市场上可买到多种输血滤器，包括20微米和80微米输血滤器(Baxter)。因此，只要小珠大于滤器的网尺寸，则这种过滤效率很高。相关实施方案中，小珠可以透过滤器，但细胞保留，因而使其分开。
尽管此处所述方法利用的抗体，可以从公共来源例如ATCC轻易获得，但针对T细胞辅助分子以及CD3复合物的抗体可以通过标准技术生产。本发明方法所用抗体的产生方法为本领域所熟知，此处进行了更详尽的描述。
C.在表面上固定配基
如上所述，本发明方法优选地利用结合表面的配基。该表面可以是具有结合其上或整合其中的配基的任何表面，并且是生物相容性的，即基本上对所要激活的靶细胞无毒。生物相容性表面可以是可生物降解的，或是不可生物降解的。表面可以是天然的或合成的，合成的表面可以是聚合物。表面可以包含胶原、纯化的蛋白质、纯化的肽、多糖、糖胺聚糖、或细胞外基质成分。多糖可以包括，例如纤维素、琼脂糖、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸或藻酸盐。其它聚合物包括聚酯、聚醚、聚酐、聚烷基腈基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚原酸酯、聚磷腈、聚乙酸乙烯酯、嵌段共聚物、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、或聚氨基甲酸乙酯。聚合物可以是乳酸或共聚物。共聚物可以包含乳酸和羟基乙酸(PLGA)。不可生物降解的表面可以包括，例如聚(二甲基硅氧烷)和聚(乙烯-乙酸乙烯酯)。生物相容性表面包括，例如玻璃(如生物玻璃)、胶原、金属、羟基磷灰石、铝酸盐、生物陶瓷材料、透明质酸聚合物、藻酸盐、丙烯酸酯聚合物、乳酸聚合物、羟基乙酸聚合物、乳酸/羟基乙酸聚合物、纯化的蛋白质、纯化的肽、或细胞外基质成分。其它含有表面的聚合物包括玻璃、二氧化硅、硅、羟基磷灰石、水凝胶、胶原、丙烯醛、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龙、或许多塑料或合成的有机聚合物等等。表面可以包含生物学结构，例如脂质体。表面可以是脂类、平板、囊、片、纤维、网、或颗粒形式。颗粒可包括胶体粒子、微球、纳米微粒、小珠等等。各个实施方案中，可以利用市场上能买到的表面，例如小珠或其它颗粒(如Miltenyi颗粒，Miltenyi Biotec，德国；琼脂糖小珠，Pharmacia FineChemicals，瑞典；DYNABEADSTM，Dynal Inc.，纽约；PURABEADSTM，Prometic Biosciences)。
使用的小珠可以是能够实现靶细胞激活的任何大小的小珠。一个实施方案中，小珠大小优选地为大约5纳米-500μm。因此，小珠大小的选择取决于小珠适合的特定应用。例如，如果小珠用于去除单核细胞，选择小型的以促进单核细胞摄入(例如直径为2.8μm和4.5μm，或者可被吞噬的任何大小，如纳米大小)；然而，若想要通过过滤分离小珠时，利用的小珠大小一般不小于50μm。此外，利用顺磁小珠时，小珠大小一般为大约2.8μm-500μm，更优选地为大约2.8-50μm。最后，可以选择小到大约10nm的超顺磁纳米微粒。因此，从上述讨论可轻易看出，事实上可以使用任何的颗粒大小。
利用本领域内共知和可用的多种方法，可将因子附着或偶联或整合到表面中。因子可以是天然配基、蛋白质配基、或合成配基。附着可以是共价的或非共价的、静电的、或疏水性的，可以利用多种附着方法进行，包括例如化学的、机械的、酶的、或配基能够激活细胞的其它方法。例如，针对配基的抗体首先附着于表面，或者亲和素或链亲和素附着于用于结合生物素酰基化配基的表面。针对配基的抗体可以通过抗独特型抗体附着于表面。另一个例子包括利用蛋白A或蛋白G，或者其它非特异性抗体结合分子，其附着于结合抗体的表面。或者，配基可以通过化学方法附着于表面，例如利用商品化的交联剂(Pierce，Rockford，IL)交联到表面，或者其它方法。某些实施方案中，配基共价结合到表面上。另外，一个实施方案中，将商品化的带有环氧表面活性基团的甲苯磺酰活化DYNABEADSTM或DYNABEADSTM，按照厂家说明书，与目的多肽配基孵育。简要地，这种条件一般包括在pH4-pH9.5的磷酸盐缓冲液中、于4-37℃温度范围内温育。
一方面，因子例如某些配基可以是单起源或多起源的，可以是抗体或其片段，另一方面，应用T细胞时，共刺激配基是B7分子(例如B7-1、B7-2)。通过上述的任何不同的附着方法，将这些配基与表面偶联。可以从表达共刺激分子的细胞中分离用于偶联表面的B7分子，或者利用如此处所述标准重组DNA技术及可产生和分离共刺激分子的表达系统，获得B7分子。还可以利用在偶联到细胞表面时保持触发T细胞共刺激信号能力的B7分子的片段、突变体、或变异体。此外，本领域一般技术人员应知道，可用于活化和诱导T细胞亚群增殖的任何配基，同样可以固定于小珠或培养容器表面或任何表面。再有，尽管优选的方法之一是将配基共价连接到表面，但也可以利用第二单克隆抗体吸附或捕获。例如，如果表面是小珠表面，附着于表面的特定配基的量可经流式细胞术(FACS)分析轻易测定，或者如果表面是组织培养皿、网、纤维、囊，可通过酶联免疫吸附分析(ELISA)测定。
特定实施方案中，B7分子的刺激形式或抗CD28抗体或其片段与刺激TCR/CD3复合物的因子例如抗CD3抗体附着于相同固相表面。除抗CD3抗体之外，可以利用与模拟抗原信号的受体结合的其它抗体。例如，小珠或其它表面可以被抗CD2抗体和B7分子、特别是抗CD3抗体和抗CD28抗体联合包被。
D.因子
本发明意图利用的因子包括蛋白质配基、天然配基、和合成配基。可以结合细胞表面成分、并在一定条件下引起连接和聚集、导致信号发生的因子包括而不局限于植物凝集素(例如PHA、扁豆植物凝集素、伴刀豆凝集素A)、抗体、抗体片段、肽、多肽、糖肽、受体、B细胞受体和T细胞受体的配基、细胞外基质成分、类固醇、激素(例如生长激素、皮质甾类、前列腺素、甲状腺素、细菌成分(例如脂多糖)、有丝分裂原、抗原、超抗原及其衍生物、生长因子、细胞因子、病毒蛋白质(例如HIV gp-120)、粘附分子(例如L-选择素、LFA-3、CD54、LFA-1)、趋化因子和小分子。因子可以分离自天然来源，例如细胞、血液产品和组织，或分离自体外增殖的细胞，或重组方法，或通过本领域技术人员已知的其它方法制备。
一方面，本发明在需要激活T细胞时，可利用的因子包括能够结合CD3/TCR复合物、CD2、和/或CD28，并分别启动活化或增殖的配基。相应地，术语配基包括作为细胞表面蛋白质的″天然″配基的蛋白质(例如针对CD28的B7分子)，以及人工配基，例如细胞表面蛋白质的抗体。可以按照传统方法生产这些抗体及其片段，例如杂交瘤方法以及重组DNA和蛋白质表达技术。有用的抗体和片段可以来源于包括人在内的任何物种，或者是具有多个物种序列的嵌合蛋白质形式。
可以利用本领域熟知的方法产生针对配基的特异性抗体、多克隆抗血清、或单克隆抗体。也可以生产按目的特性设计的抗体，例如基因工程化免疫球蛋白(Ig)或者Ig片段。例如，作为说明而不是限制，抗体可以包括重组IgG，其是嵌合的融合蛋白，含有至少一个来源于第一哺乳动物物种的可变(V)区结构域，以及至少一个来源于第二不同的哺乳动物物种的恒定区结构域。最常见的是，嵌合抗体含有鼠的可变区序列以及人的恒定区序列。通过将补体决定区(CDRs)(来源于鼠抗体，赋予与抗原结合的特异性)，移植入人源V区结构区域以及人源恒定区，可以使这样的鼠/人嵌合免疫球蛋白“人源化”。该分子片段可通过蛋白水解消化，或任选地，通过蛋白水解消化后二硫键温和还原和烷基化，或者通过重组基因工程技术产生。
如果抗体特异性地结合配基，其亲合常数Ka大于或等于约104M-1，优选地大于或等于约105M-1，更优选地大于或等于约106M-1，更加优选地大于或等于约107M-1，则定义抗体为″免疫特异性″的。利用常规方法，例如Scatchard等人描述的方法(Ann.N.Y.Acid.Sci.USA 51：660，1949)，或者通过表面胞质团共振(BIAcore，Biosensor，Piscataway，NT，参见Wolff等人，Cancer Res.，53：2560-2565，1993))，很容易测定结合配偶体或抗体的亲合力。
通常利用本领域一般技术人员已知的多种技术中的任何一种制备抗体(参见，例如Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，1988，Cold Spring Harbor Laboratory)。这样的一个技术中，用配基作为抗原免疫动物，以产生多克隆抗血清。适合的动物包括兔、绵羊、山羊、猪、牛，并可以包括较小的哺乳动物物种，例如小鼠、大鼠和仓鼠。
免疫原可以包含表达配基的细胞、纯化的或者部分纯化的配基多肽或变异体或其片段、或配基肽。可以通过蛋白水解断裂、或者化学合成产生配基肽。可以按照本领域技术人员已知的方法，通过分析配基的初级、二级、或三级结构选择用于免疫的肽，以确定更有可能在宿主动物中产生抗原反应的氨基酸顺序(参见，例如Novotny，Mol.Immunol.28：201-207，1991；Berzoksky，Science 229：932-40，1985)。
制备免疫原可包括，配基多肽或变异体或其片段、或肽共价偶联另一个免疫原性蛋白质，例如匙孔血蓝素或牛血清白蛋白。此外，可在佐剂中乳化肽、多肽、细胞(参见Harlew等人，Antibodies：ALaboratory Manual，1988 Cold Spring Harber Laboratory)。按照动物物种的优选方案，通常在第一次注射以后，动物接受一次或多次加强免疫。通过对动物定期取血，分离血清，并免疫测定分析血清，例如Ouchterlony分析，监测免疫应答，以评定特异性抗体的滴度。一旦确定了抗体滴度，对动物定期取血，积累多克隆抗血清。然后从该抗血清中纯化可特异性结合配基多肽或肽的多克隆抗体，例如通过蛋白质A或者偶联合适固体支持物的配基多肽或肽的亲合层析。
可以利用如Kohler和Milstein的技术(Nature，256：495-497，1975；Bur.J.Immunol.6：511-5I9，1976)及其改进的技术，制备特异性结合配基多肽或片段或其变异体的单克隆抗体。可以产生永生化真核细胞系杂交瘤，生产对配基多肽或变异体或其片段具有所需特异性的抗体。用如上所述制备的配基免疫原，免疫动物，例如大鼠、仓鼠、或优选地小鼠。可通过将从免疫动物获得的淋巴样细胞，最通常是脾细胞，与药物致敏的骨髓瘤细胞融合配偶体，优选地与该免疫动物同源的融合配偶体相融合，使其永生化。用膜融合促进剂，例如聚乙二醇或非离子型去污剂使脾细胞和骨髓瘤细胞结合几分钟，然后低密度接种于支持杂交瘤细胞、而非骨髓瘤细胞生长的选择培养基中。优选的选择培养基是HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)。经过足够时间，通常约1-2周后，观察细胞集落。分离单个集落，并检验细胞产生的抗体对配基多肽或变异体或其片段的结合活性。优选可生产对配基抗原具有高亲合力和特异性的抗体的杂交瘤。本发明涵盖生产特异性结合配基多肽或变异体或其片段的单克隆抗体的杂交瘤。
可以从杂交瘤培养的上清液中分离单克隆抗体。另一种生产鼠单克隆抗体的方法是将杂交瘤细胞注射到同源小鼠的腹膜腔。小鼠产生包含该单克隆抗体的腹水液。通过常规技术，例如层析法、凝胶过滤、沉淀、或萃取，从抗体中除去污染物。
可以通过多种技术生产人单克隆抗体。方法包括而不局限于，Epstein Barr病毒(EBV)转化人外周血细胞(参见美国专利No.4,464,456)，体外免疫人B细胞(参见例如Boerner等人，J.Immunol.147：86-95，1991)，融合免疫的携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠的脾细胞以及融合免疫的携带插入酵母人工染色体(YAC)的免疫球蛋白基因之转基因小鼠的脾细胞(参见例如美国专利No.5,877,397；Bruggemann等人，Curr.Opin.Biotechnol.8：455-58，1997；Jakobovits等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.764：525-35，1995)，或从人免疫球蛋白V区噬菌体文库中分离。
可以产生本发明所用的嵌合抗体和人源化抗体。嵌合抗体具有至少一个来源于第一种哺乳动物物种的恒定区结构域，以及至少一个来源于第二种不同的哺乳动物物种的可变区结构域(参见例如Morrisen等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA，81：6851-55，1984)。最通常的是，可通过将编码至少一个来源于非人单克隆抗体的可变区结构域(例如来源于小鼠、大鼠、或仓鼠单克隆抗体的可变区)的多聚核苷酸序列克隆进包含编码至少一个人恒定区的序列的载体中，构建嵌合抗体。(参见例如Shin等人，Methods Enzymol.178：459-76，1989；Walls等人，Nucleic Acids Res.21：2921-29，1993)。人恒定区的选择取决于针对特定抗体所希望的效应器功能。本领域已知的另一产生嵌合抗体的方法是同源重组(美国专利No.5,482,856)。优选地，将载体转染真核细胞，稳定表达嵌合抗体。
非人/人嵌合抗体可以进一步遗传工程改造为″人源化″抗体。这样的抗体具有多个来源于非人哺乳动物物种免疫球蛋白的CDRs、至少一个人可变结构区域、以及至少一个人免疫球蛋白恒定区。与非人单克隆抗体或嵌合抗体比较，人源化产生的抗体结合亲合力降低。因此，本领域技术人员可以利用一种或多种策略设计人源化抗体。
在某些实施方案中，优选使用抗体的抗原结合片段。这样的片段包括Fab片段或F(ab’)2片段，其可以分别利用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶进行蛋白水解消化而制备。通过亲合层析使抗原结合片段与Fc片段分离，例如利用固定化的蛋白质A，或者固定化的配基多肽或变异体或其片段。产生Fab片段的另一方法包括温和还原F(ab’)2片段，随后烷基化(参见例如Weir，Handbook of Experimental Immunology，1986，Blackwell Scientific，Boston)。
上述任何Ig分子的非人、人、或人源化的重链和轻链可变区，可以构建为单链Fv(sFv)片段(单链抗体)。参见例如Bird等人，Science242：423-426，1988；Huston等人，Proc.Nat！.Acad.Sci.USA85：5879-5883，1988。通过框架内连接编码sFv的多聚核苷酸序列和编码多种效应器蛋白质的多聚核苷酸序列，可产生多功能融合蛋白质。这些方法为本领域已知，并公开于例如EP-B1-0318554、美国专利No.5,132,405、美国专利No.5,091,513、以及美国专利No.5,476,786。
特异性与配基多肽或变异体或其片段结合的抗体的其它选择方法，是通过噬菌体展示(参见例如Winter等人，Annul.Rev.Immunol.12；433-55，1994；Burton等人，Adv.Immunol.57：191-280，1994)。可以在可筛选与配基多肽或变异体或其片段特异性结合的Ig片段(Fab、Fv、sFv、或其多聚体)的噬菌体载体中，建立人或鼠的免疫球蛋白可变区基因组合文库(参见例如美国专利No.5,223,409；Huse等人，Science 246：1275-81，1989；Kang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4363-66，1991；Hoogenboom等人，J Molec.Biol.227：381-388，1992；Schlebusch等人，Hybridoma 16：47-52，1997及其引用的参考文献)。
细胞群体
如上所述，本发明适用于带有希望连接的细胞表面成分的任何细胞类型。在这方面，利用本发明方法可以增强许多细胞信号事件。这样的方法可以用于离体环境中的治疗应用，以活化和刺激输入病人的细胞，或者用于体内，以诱导靶细胞群体的细胞信号事件。然而，仍如上所述，此处提供的一般实施例是指T细胞，但决不限于此。
关于T细胞，此处所述各种扩增方法产生的T细胞群体可以具有取决于应用条件的多种特定表型特征。这样的表型特征包括提高CD25、CD154、IFN-、和GM-CSF的表达，以及改变CD137、CD134、CD62L、和CD49d的表达。能够区别控制这些成分的表达是非常重要的。例如，通过接触抗原呈递细胞(例如树突状细胞、单核细胞、以及甚至白血病B细胞或淋巴瘤)上表达的CD40分子，在″定制的T细胞″表面高水平表达CD154，会加强抗原呈递和免疫功能。当前许多公司应用这样的策略，通过抗体或重组CD40L连接CD40。此处所述方法允许以更生理学的方式例如通过T细胞传递相同的信号。通过定制T细胞活化(XCELLERATE)方法增加分泌IFN-的能力，能够帮助促进产生TH1型免疫应答，它对抗肿瘤和抗病毒反应是重要的。与CD154类似，增加GM-CSF表达可以提高APC功能，特别是通过促进APC祖细胞成熟为功能更强的APC，例如树突状细胞。改变CD137和CD134的表达，可以影响T细胞对凋亡信号表现抗性或敏感的能力。控制粘附/归巢受体的表达，例如CD62L和/或CD49d，可以决定输入的T细胞归巢到淋巴器官、感染位点、或肿瘤位点的能力。
本发明另一方面提供了于扩增前去除了CD8+或CD4+细胞的T细胞群体或组合物。一个实施方案中，利用针对CD8+标志的抗体去除CD8+细胞。本领域一般技术人员能够轻易确定用于从样品中去除CD8+或CD4+细胞的或反之富集CD8+或CD4+细胞含量的多种特定方法。关于富集CD4+细胞，本发明的一个方面集中在当激活已去除Tc(CD8+)细胞的T细胞群体时，识别极强的CD154表达分布。如上所述，CD154是重要的免疫调节分子，其表达非常有利于放大免疫应答。因此，增强CD154表达很可能产生更有效的T细胞组合物。
可以通过多种方法监测本发明T细胞群体的表型特性，包括本领域技术人员已知的标准流式细胞术方法和ELISA方法。
本领域一般技术人员容易理解，此处所述的细胞刺激方法可以在多种环境(即容器)中实现。例如，这样的容器可以是培养瓶、培养袋、或能够容纳细胞的任何容器，优选无菌环境。本发明的一个实施方案还利用了生物反应器。例如，目前几个厂家制造的装置，可用于细胞生长并可与本发明方法联合使用。参见例如CeldyneCorp.，Houston，TX；Unisyn Technologies，Hopkinton，MA；Synthecon，Inc.Heuston，TX；Aastrom Biosciences，Inc.Ann Arbor，MI；Wave Biotech LLC，Bedminster，NJ。此外，包括这种生物反应器的专利包括美国专利号：6096,532；5,985,653；5,888,807；5,190,878，此处引入作为参考。
使用方法
除如上所述方法之外，可以在许多情况下应用通过此处所述方法刺激和/或活化的细胞。关于T细胞的一般实施例，此处所述方法可以用于选择性扩增CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、或CD45RO+T细胞群体，以供治疗传染性疾病、癌症、以及免疫治疗之用。因而可以产生独特表型的T细胞群体，其就抗原反应性而言是多克隆的，但就CD4+或CD8+而言基本上是均一的。另外，本方法可用于扩增足够量的T细胞群体，允许重建个体的全部CD4+或CD8+T细胞群体(个体的淋巴细胞群体大约1011)。产生的T细胞群体还可以经遗传转导并用于免疫治疗，或者可用于感染物的体外分析方法。例如，可从罹患癌症个体获得肿瘤浸润的淋巴细胞群体，激活其T细胞，增殖到足够数量。产生的T细胞群体可以经遗传转导，使之表达肿瘤坏死因子(TNF)或其它蛋白质，并输给该个体。
本发明CD4+T细胞群体的一项特定应用是，治疗个体的HIV感染。HIV长期感染最后引起CD4+T淋巴细胞数目显著下降。这种下降随后导致深度免疫缺陷状态，病人表现出对一系列危急生命的机会感染敏感。补充CD4+数量到正常水平，可以期望明显修复免疫功能。因此，此处所述方法提供了选择性扩增CD4+T细胞到足够数量的办法，以便在HIV感染病人中重建该群体。长期刺激期间还必需避免T细胞感染，或者希望能使T细胞对HIV感染永葆抗性。有许多技术可以使T细胞或者对HIV感染有抗性，或在感染个体的T细胞恢复之前不能产生病毒。例如，CD4+T细胞在扩增之前，与一个或多个抗逆转录病毒因子一起培养，以抑制HIV复制或病毒产生(例如，针对逆转录酶和/或病毒结构的其它组分的药物，参见例如Chow等人Nature 361：650-653，1993)。
几种方法可用于遗传转导T细胞，以产生抑制HIV感染或复制的分子。例如，在多个实施方案中，可以遗传转导T细胞，以产生transdominant抑制剂、″分子诱饵″、反义分子、或毒素。此方法进一步详述于美国专利申请号08/253,751、08/253,964以及PCT公开号WO 95/33823，此处全文引入作为参考。
在希望给予受实验者以T细胞后上调免疫应答的治疗情况下(例如诱导应答或增强现有应答)，激活和扩增抗原特异性T细胞群体的方法非常有用。例如，本方法可用于增强对肿瘤相关抗原的T细胞应答。受实验者的肿瘤细胞一般表达肿瘤相关抗原，而可能不能刺激T细胞的共同刺激信号(例如，由于它们缺少共同刺激分子的表达)。因而，肿瘤细胞可以接触体外的受实验者T细胞，按照本发明方法扩增抗原特异性T细胞，并将该T细胞回输给受实验者。
因此，一个实施方案中，可以治疗恶性肿瘤例如非何杰金氏淋巴瘤(NHL)和B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)。初期研究利用扩增T细胞在NHL中进行过试验(参见Liebowitz等人Curr.Opin.Onc.10：533-541，1998)，而本发明的T细胞群体提供独特表型特征，其可通过提供增加的移入(可能通过刺激CD28信号提供)和反应性，而显著增强免疫治疗的成功率。然而，B-CLL病人具有特别的困难，包括外周血中具有高白血病细胞负荷，但T细胞数量相对较低，并伴有普遍的T细胞免疫抑制。本发明的T细胞群体在治疗这种疾病时能够提供显著改善的效能，特别是在联合使用干细胞(CD34+)移植疗法时。因此，利用抗CD3x抗CD28共固定小珠提高T细胞功能以及抗CLL T细胞活性，将是有利的。
例如，考虑到B-CLL病人T细胞上CD40配基即CD154表达缺陷已经被认为是该疾病主要的免疫学缺陷，本发明的T细胞群体重输注后可以提供持续高水平的CD154表达，因而可有助于其治疗。研究者报道，如同白血病B细胞表达CD80和CD86的能力一样，CLL病人T细胞表达CD154的能力是有缺陷的。CLL中白血病B细胞无法足够地表达CD28的配基，导致不能完全活化肿瘤反应性T细胞，因此其可能代表了T细胞表观耐受状态的机理。或通过可溶性抗CD40抗体或通过CD154转导的白血病B细胞进行的CLL B细胞上CD40的研究表明，似乎改正了CD80和CD86的表达缺陷，并上调了MHC在表面的表达。Kato等人，J Clin.Invest.101：1133-1141，1998；Ranheim和Kipps，J.Exp.Med.177：925-935，1993。用这种方法处理的细胞能刺激特异性的T细胞抗肿瘤反应。
随着在本发明T细胞群体的表面上CD154表达的提高，这些T细胞可期望与自体B-CLL细胞相互作用，并将通过提高MHC、CD80、和CD86的表达从而提高肿瘤的免疫原性。随后这将引起强烈的抗肿瘤反应。此外，本领域一般技术人员容易理解，利用本发明离体扩增的T细胞治疗病人，可以联合使用传统的癌症疗法例如化学疗法。在这方面，例如可以用药物如氟达拉滨(fludarabine)或坎帕斯(campath)治疗病人，继之输注本发明的T细胞群体或两者同时。
或者，如此处所述刺激并扩增T细胞，以诱导或增强对病原体的反应性，例如病毒(如人类免疫缺陷性病毒)、细菌、寄生虫和真菌。
本发明另外提供从T细胞混合群体中选择性扩增特定T细胞亚群的方法。特别是，本发明提供了特异性富集的T细胞群体，其具有更高比率的CD4+和CD8+双阳性T细胞。
本发明另一个实施方案提供从CD4+T细胞群体中选择性扩增TH1细胞群体的方法。此方法中，利用抗CD28抗体，例如单克隆抗体9.3共同刺激CD4+T细胞，诱导分泌TH1特异性的细胞因子，包括IFN-γ，引起TH1细胞富集多于TH2细胞。
此处观察到活化T细胞的表型特性在扩增过程中随时间变化，连同已证明T细胞可在几小时之内被活化的事实(Iezzi等人，Immunity8：89-95，1998)。相应地，结合此处描述方法，本发明提供了短期内扩增T细胞群体的定制亚群的能力。一个实施方案中，此技术能够使用于受实验者床边、门诊病人形式、或受实验者家中，与肾透析的使用类似。例如在一种方法或装置中，通过与活化信号(例如抗CD3和抗CD28抗体，等等)接触而温育T细胞，并以连续流方式立刻或者在几小时的扩增期后返回到病人。一方面，这样的扩增技术能够利用具有过滤器元件的隔离室，从而使3x28小珠或类似的包被微粒与连续流动的血液/富集的细胞混合。另一个实施方案中，装置内的固相表面可以包被或者直接(包括共价地)或者间接(例如链亲和素/生物素等等)缀合抗体或者其它的组分，以刺激T细胞活化和扩增。例如可利用一个连续的液体通路，从病人通过血液/细胞收集装置，和/或包含两个或更多固定抗体(例如抗CD3和抗CD28)或其它组分的一次性装置，以在细胞返回受实验者之前刺激T细胞活化所需受体(固定于塑料表面或者可分离的微粒上)。这样的系统可包括白细胞去除设备，其带有一次性无菌装置，与现有的厂家一次性装置对接，或者改进厂家一次性装置(例如其上固定/包含抗体/活化组分的表面平台位于在单采血液成分期间用于收集外周血单核细胞的袋子/容器内)。另外，该固相表面/表面平台可以是可移去插件的一部分，该插件插在该装置的一个腔内，或者物理上存在于一个一次性元件内。在上述关于连续流的另一个实施方案中，系统可以包括，利用血液收集装置的小室或与病人流路串联的孵化小室，在室温或生理温度下使细胞接触活化组分。
另一个实施例中，血液直接从病人引入一个独立的一次性装置，该装置包含两个或更多固定的抗体(例如抗CD3和抗CD28)或其它组分，以在将细胞给予受实验者之前刺激T细胞活化所需受体(例如固定在塑料表面或者可分离的微粒上)。一个实施方案中，该一次性装置可以包括经合适管道连接的容器(例如，塑料袋或瓶子)，其适合于连接/对接注射器和无菌对接装置。该装置包含固定T细胞活化组分(例如抗CD3和抗CD28抗体)的固相表面；其可以是容器自身或插件的表面，一般是一个平面、蚀刻平面、不规则表面、多孔的垫片、纤维、临床上可接受的/安全的含铁液体、小珠、等等)。另外，使用独立装置时，受实验者可保持与该装置连接，或者该装置是与病人分离的。此外，该装置可以在室温下使用，或者利用便携保温箱在生理温度下温育。
由于采集和加工血液及其制品的装置和方法众所周知，本领域技术人员容易认识此处提供的教导，可以容易地设计满足上述需要的许多装置，或者改造现有装置。因此，这些装置和方法并不局限于此处所述特定实施方案，而可包括能够维持无菌和维持血液的流体形式(其中补体激活降低)的任何装置或方法，并且其中可以固定或者在给予受实验者之前从血液或血液制品中分离T细胞活化所必需的组分(例如抗CD3和抗CD28抗体或其配基)。此外，如同本领域一般技术人员能够容易理解的，许多血液制品能够和此处所述装置和方法一起使用。例如，该方法和装置可用于在给予受实验者之前，从融化的低温保存的全血、外周血单核细胞、其它低温保存的血液来源细胞、或低温保存的T细胞系中提供快速活化的T细胞。另一个实施例中，该方法和装置可用于在给予受实验者之前，提高预先离体扩增的T细胞产物活性，从而提供高度活化的T细胞产物。最后，正如容易理解的，上述方法和装置可以用于自体或者受实验者和供体同时的异体细胞疗法。
本发明的方法也可以同疫苗一起使用，以提高抗原的反应性并增强体内效果。此外，鉴于本发明扩增的T细胞在体内半衰期相对较长，通过携带所需的目的核酸序列，并有可能归巢到癌症、疾病、或感染位点，这些细胞能够用作理想的基因治疗载体。因此，本发明扩增的细胞可以结合疫苗、一种或多种细胞因子、一种或多种治疗用抗体、等等，投递给病人。事实上，任何得益于更强T细胞群体的疗法，都在此处所述使用方法的范围之内。
药物组合物
靶细胞群体，例如本发明的T细胞群体，可以或单独给药，或结合稀释剂和/或连同其它组分，例如IL-2或其它细胞因子或细胞群体，作为药物组合物给药。简要地，本发明的药物组合物可以包括例如此处所述的靶细胞群体，结合一种或多种药物学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可包括缓冲液，例如中性缓冲液、磷酸盐缓冲液等等；糖类，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽、或氨基酸例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。优选地，本发明的组合物配制为静脉内给药。
本发明的药物组合物以适合于待治疗(或预防)疾病的方式给药。给药的数量和频率将由这样的因素决定，如病人的状况、以及病人疾病的类型和严重程度，虽然可以通过临床试验确定适合的剂量。
本文引用的所有参考文献，在此全文引入作为参考。此外，此处使用的全部数值范围，明确地包括该范围内的全部整数值以及该范围内依特定的应用选择的特定数值。另外，提供以下实施例作为说明，而不是为了限制。
                         实施例I
                        T细胞刺激
此处所述的某些实验中使用称为XCELLERATE ITM的方法。简言之，该方法中，由外周血单核细胞(PBMC)单采血液成分产物制备XCELLERATED T细胞。从临床病人收集以后，洗涤单采血液成分的的PBMC，然后与″未包被″的DYNABEADSM-450环氧树脂T温育。此时巨噬细胞例如单核细胞摄取小珠。温育以后，通过MaxSep磁力分离器处理细胞和小珠，以除去小珠和附着于小珠的任何单核细胞/巨噬细胞。在单核细胞去除步骤之后，取出包含总共5×108 CD3+T细胞的体积，产生1.5×109 DYNABEADSM-450 CD3/CD28 T，启动XCELLERATETM过程(小珠与T细胞之比近似3∶1)。细胞和DYNABEADSM-450 CD3/CD28 T的混合物然后在37℃、5％CO2温育大约8天，以产生XCELLERATED T细胞，用于首次输注。低温保存剩余的去除单核细胞的PBMC，直到第二次或另外的细胞产物扩增(大约21天后)，到时融化、洗涤细胞然后取包含总共5×108 CD3+T细胞，产生1.5×109 DYNABEADSM-450 CD3/CD28T，启动XCELLERATE过程，用于二次输注。在37℃、5％CO2温育≈8天期间，CD3+T细胞活化和扩增。从Ortho.Biotech.(Raritan，NJ)获得抗CD3 mAb(OKT3)，从Bristol-Myers Squibb(Stamford，Conn.)获得抗CD28 mAb(9.3)。
利用上述称为XCELLERATE IITM方法修改的方法，其中没有利用单独的单核细胞去除步骤，某些方法中，于初次接触小珠之前冷冻细胞，并进行进一步富集和刺激(参见图5A和5B)。此方法的一个版本是，通过单采成分的血液从供体或病人的循环血中获得T细胞。单采成分的血液产物的组分一般包含淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核细胞(白细胞)、红细胞、以及血小板。一般的单采血液成分术产物包含1-2×1010个有核细胞。用无钙、无镁的磷酸盐缓冲液洗涤细胞，以去除血浆蛋白质和血小板。通过离心细胞并除去上清液，然后代之以PBS，完成洗涤步骤。利用半自动化″连续流″离心机完成该方法(COBS2991 System，Baxter)。处理期间细胞维持在封闭系统中。
可以通过去除未结合细胞，包括单核细胞，(富集活化细胞)，然后继续刺激，以进一步处理细胞。或者，洗涤的细胞可以冷冻、保存、及以后处理，于此证明了这可提高增殖强度以及去除粒细胞。一个实施例中，为冷冻细胞，将35ml细胞悬液置于带有35ml冷冻液的250ml
Cryocyte冷冻袋中。35ml细胞悬液一般在PBS中包含3.5×109-5.0×109细胞。加入等量冷冻液(含20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS)。细胞终浓度为50×106细胞/ml。Cryocyte袋可以包含的体积为30-70ml，细胞浓度为10-200×106细胞/ml。一旦Cryocyte袋充满细胞和冷冻液，将袋子置于可控速率冰箱，冷冻细胞按1℃/分钟降到-80℃。冷冻的细胞然后置于液氮贮存系统，直到需要。
从液氮贮存系统取出细胞，37℃融化。为去除DMSO，在COBE 2991System中用无钙、无镁的PBS洗涤融化的细胞。洗过细胞然后通过80微米滤网。
将融化的细胞以大约0.5×109 CD3+细胞置于包含100ml无钙、无镁PBS的1L Lifecell塑料袋中。PBS中包含1％-5％人血清。将1.5×109CD3xCD28小珠(Dynabeads M-450)也同细胞一起置于袋中(3∶1DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T：CD3+T细胞)。在室温下1转/分(颠倒转动)以混合小珠和细胞，约30分钟。包含小珠和细胞的袋子置于MaxSep磁力分离器(Nexell Therapeutics，Irvine，CAb)。在袋子和MaxSep之间放置塑料隔离物(厚度大约6mm)。(为提高磁场强度，可移去隔离物)。小珠及附着于小珠的任何细胞保留在磁铁上，而泵走PBS和未结合细胞。
用细胞培养基(1升包含X-Vivo 15，BioWhittaker；以及50ml加热灭活的混合人血清，20ml 1M Hepes，10ml 200mM L-谷氨酰胺，有或者没有大约100,000 I.U.IL-2)，将CD3xCD28小珠和结合小珠的富集细胞冲洗到3LLifecell培养袋中。将CD3xCD28小珠和阳性选择细胞转移到Lifecell袋中之后，加入培养基直到袋中含有1000ml。将含有细胞的袋子置于保温箱(37℃和5％CO2)，让细胞扩增。
在每个第3天和第5天按1比4分开细胞。培养3天和8天后采集细胞，测量T细胞活化和增殖。在培养第3天，通过测量细胞大小、细胞表面标志表达水平、特别是CD25和CD154的表达，评定T细胞的活化。在第8天，让细胞在MaxSep磁铁上于重力作用下流动(近似150ml/分钟)，以除去磁性颗粒，使用上述COBE装置洗涤并富集细胞，并重悬浮于适于静脉内给药的平衡电解质溶液，例如Plasma-LyteA(Baxter-Healthcare)中。
如说明书所述，除了没有进行刺激和富集以及在刺激之前进行单核细胞去除以外，XCELLERATE ITM涉及与以上所述相似的情况。
进行XCELLERATE ITM和IITM方法两者，并于培养8天后测量T细胞增殖。当细胞培养之前富集CD3+细胞时，扩增的T细胞产量较高(参见表1)。另外，细胞群体具有90％以上的CD3+细胞。
                表1.扩增第8天的T细胞产量
    试验     非CD3+浓度(XCELLERATE ITM)    CD3+浓度(XCELLERATE IITM)
    NDa079NDa081NDa082     33×10938×10928×109    36×10942×10938×109
    平均     33±5×109    39±3×109
在这方面进行了进一步实验，描述了扩增细胞的总数，以及9批无CD3+富集情况下刺激的细胞和5批有CD3+富集情况下刺激的细胞的扩增倍数。(参见图1和2)。
通过在培养之前施加磁力富集细胞，有效地提高了CD3+细胞的纯度以及CD154水平。(表2、图3和4用用图表方式描述了CD154的水平)。此外，比较T细胞群体暴露于不同强度磁铁时的T细胞增殖，表明暴露于更强的磁铁，导致CD3+细胞产量更大。(表2.)
                表2.比较利用弱和强磁铁富集后的T细胞增殖和细胞表面标志
  试验     磁铁     天     CD3％     大小     CD25    CD154     CD3#
    (FSC)     (MFI)    (MFI)     ×109
  NDa087
  选择前     0     47％     318     8    4     0.5
  选择后     弱     0     56％     0.37
  选择后     强     0     61％     0.35
  无选择     无     3     533     758    19
  选择后     弱     3     90％     570     846    41
  选择后     强     3     92％     558     1006    45
  培养后     无
  培养后     弱     8     92％     412     110    9     17.7
    强     8     93％     413     89    7     37.8
  NDa089
  选择前     0     44％     312     6    4     0.5
  选择后     弱     0     46％     0.39
  选择后     强     0     55％     0.3
  选择后     弱     3     83％     589     685    67
  选择后     强     3     83％     600     720    115
  培养后     弱     8     89％     409     58    18     25.3
    强     8     87％     371     65    13     42.1
                                      表2.(续)
    试验   磁铁     CD25第0天     CD25第3天     CD154第0天     CD154第3天     CD3细胞#第8天
    (MFI)     (MFI)     (MFI)     (MFI)     ×109
    NDa087
    无选择   无     8     758     4     19     31
    选择   弱     8     846     4     41     18
    选择   强     8     1006     4     45     38
    NDa089
    无选择   无     6     309     4     12     26
    选择   弱     6     685     4     67     25
    选择   强     6     720     4     115     42
进行了另外5次实验，以比较XCELLERATE ITM和XCELLERATE IITM方法。按照这两种方法活化并培养扩增的细胞，其培养第3天和第8天的细胞活化标志(细胞大小、CD25表达、以及CD154表达)如下表3和图6-7所示。
                                          表3.第3天的细胞活化标志
  实验号(供者)   方法         细胞大小(FSC)        CD25(MFI)        CD154(MFI)-
  第0天    第3天    第0天     第3天     第0天     第3天
  NDa104(PC071)   XCELLERATE I   282    526    7     625     5     50
  XCELLERATE II   315    531    7     750     5     162
  NDa107(PC074)   XCELLERATE I   243    578    5     287     4     23
  XCELLERATE II   272    587    6     311     5     120
  NDa110(PC076)   XCELLERATE I   262    588    6     497     4     59
  XCELLERATE II   284    615    6     580     5     197
  NDa113(PC060)   XCELLERATE I   271    662    5     726     4     54
  XCELLERATE II   291    660    6     741     5     177
  NDa115(PC073)   XCELLERATE I   253    560    6     202     6     25
  XCELLERATE II   252    582    6     448     6     83
  平均值±标准误差 XCELLERATE I   262±15 583±50 6±1     467±221 5±1 42±17
XCELLERATE II 283±23 595±47 6±1     566±189 5±1 148±17
         表3中全部培养开始于冷冻/融化细胞。
表3和图6-7的数据表明，XCELLERATE IITM方法所产生细胞，在第3天的细胞大小和CD25表达活化标志平均起来相似，但一般较高，并随刺激持续较高。然而，T细胞在第3天的CD154活化标志，在XCELLERATEIITM方法中的比XCELLERATE ITM方法中的更高许多。另外，如上证明，XCELLERATE IITM方法产生的CD25和CD154水平，每个供体均一致高于其它方法。
实际上，在CELLERATE IITM方法第3天的CD154表达，比XCELLERATEITM更高许多。这些观察表明，较之XCELLERATE ITM方法，XCELLERATEIITM方法中的T细胞处于较高的活化状态。可以预计，体内给药时会转变为更有效的产物。
测定了5个病人标本在培养第3天的CD3+细胞纯度、CD4细胞/CD8细胞比率、以及细胞存活力。利用流式细胞术或台盼蓝染色，测量经XCELLERATE ITM方法和XCELLERATE IITM方法的细胞表型和存活力，如下表4所示。
                                                    表4
  NDa#    第0天CD3+细胞纯度*(％)  第0天细胞存活力(％)   第0天CD4∶CD8ψ比率    第3天CD3+细胞纯度(％)   第3天细胞存活力(％)     第3天CD4∶CD8比率
  103XCELLERATE I    70   92   1.91    79   82     1.3
  103XCELLERATE II    85   99   2.3    91   95     2.4
  104XCELLERATE I    67   95   3.2    84   78     2.7
  104XCELLERATE II    110   99   3.7    93   87     2.9
  107XCELLERATE I    69   99   2.3    85   82     2.3
  107XCELLERATE II    119   99   2.7    95   92     2.8
  110XCELLERATE I    63   99   2.9    91   82     2.6
  110XCELLERATE II    83   99   3.9    93   92     4.5
  115XCELLERATE I    60   99   1.9    92   91     2.7
  115XCELLERATE II    72   99   2.2    96   94     2.8
*＝XCELLERATE.I方法中单核细胞去除以后，或者XCELLERATE.II方法中磁力富集以后，第0天的CD3+T细胞纯度。
ψ＝XCELLERATE.I方法中单核细胞去除以后，或者XCELLERATE.II方法中磁力富集以后，第0天的CD4+∶CD8+T细胞比率。
                      实施例II
    CD3+T细胞富集、单核细胞去除及粒细胞去除的效率
为了本研究目的，在Xcyte治疗开发实验室接收到时，将新来的PBMC单采血液成分术产物洗涤、分开以及：
1.对于XCELLERATE I方法，进行单核细胞去除步骤，并且将去除CD14+单核细胞的PBMC冷冻保存于LN2冰箱的汽相中(如实施例I所述)。如实施例I所述，开始XCELLERATE I方法的当天，融化去除CD14+单核细胞的PBMC，用DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T启动XCELLERATE方法。在起始步骤时N＝5供体的CD3+T细胞富集、CD14+单核细胞去除和粒细胞去除的平均细胞组成和平均效率列于表5.1，每个供体个体的数据列于表5.2。
2.对于XCELLERATE II方法，PBMC单采血液成分术产物低温保存于LN2冰箱的汽相中。如实施例I所述，开始XCELLERATE II方法的当天，融化低温保存的PBMC单采血液成分术产物，磁性富集CD3+T细胞，并用DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T启动XCELLERATE II方法。在起始步骤时，N＝5供体的CD3+T细胞富集、CD14+单核细胞去除和粒细胞去除的平均细胞组成和平均效率，列于表5.1，每个供体个体的数据列于表5.2。
如表5.1和5.2所证明，在XCELLERATE II方法设置(configuration)中，综合PBMC单采血液成分术产物的冷冻/融化，继之以直接从融化的PBMC单采血液成分术产物中磁性富集CD3+T细胞，可以有效去除CD14+单核细胞和粒细胞(表5.1和表5.2)。XCELLERATEII方法去除CD14+单核细胞和粒细胞的效率，和XCELLERATE I方法一样好，另外好处在于不需利用另外的″未包被″DYNABEADS M-450 T试剂单独去除步骤，并一致地引起较高的CD4/CD8比率。
表5.1：在XCELLERATE I和XCELLERATE II设置方法的起始步骤，富集CD3+T细胞、去除CD14+单核细胞和去除粒细胞的平均(N＝5)效率
细胞制品                 平均值±标准误差细胞组成(％)
  CD3+     CD14+   粒细胞   CD4/CD8*
新进PBMC单采血液成分术产物   49±6     16±3   8±7   2.2±0.3
XCELLERATE I
去除单核细胞的PBMC   51±6     5.5±3   5.7±5   2.4±0.6
冷冻/融化的去除单核细胞的PBMC   64±4     6±3   0.4±0.5   2.4±0.6
XCELLERATE II
冷冻/融化的PBMC单采血液成分术产物 56±5 11±2 0.4±0.5 2.4±0.8
CD3+磁性富集后   92±22     2.4±3.7   0±0   2.86±0.86
按照标准方法利用流式细胞术测定细胞组成表5.2.在XCELLERATE I和XCELLERATE II设置方法的起始步骤，富集
CD3+T细胞、去除CD14+单核细胞和去除粒细胞效率的比较
实验号(供者) 细胞制备                 细胞组成(％)
  CD3+   CD14+   粒细胞   CD4/CD8+
NDa104(PC071) 新进PBMC单采血液成分术产物   43％   11％   14％   2.2
XCELLERATE I
去除单核细胞的PBMC   54％   5％   12.5％   3.2
冷冻/融化的去除单核细胞的PBMC   67％   4％   0％   3.2
XCELLERATE II
冷冻/融化的PBMC单采血液成分术产物   64％   7％   0％   3.1
CD3+磁性富集后   110％   1％   0％   3.7
NDa107(PC074) 新进PBMC单采血液成分术产物   51％   16％   1％   2.1
XCELLERATE I
去除单核细胞的PBMC   64％   5％   1％   2.3
冷冻/融化的去除单核细胞的PBMC   69％   3％   0％   2.3
XCELLERATE II
冷冻/融化的PBMC单采血液成分术产物   55％   11％   0％   2.0
CD3+磁性富集后   120％   0％   0％   2.7
NDa110(PC076) 新进PBMC单采血液成分术产物   44％   18％   15％   2.5
XCELLERATE I
去除单核细胞的PBMC   63％   3.5％   10％   2.9
冷冻/融化的去除单核细胞的PBMC   63％   7％   0％   2.9
XCELLERATE II
冷冻/融化的PBMC单采血液成分术产物   55％   13％   0％   3.2
CD3+磁性富集后   83％   1％   0％   3.8
NDa113(PC060) 新进PBMC单采血液成分术产物   47％   17％   6％   2.3
XCELLERATE I
去除单核细胞的PBMC   61％   4％   3％   1.8
冷冻/融化的去除单核细胞的PBMC   63％   4％   1％   1.8
XCELLERATE II
冷冻/融化的PBMC单采血液成分术产物   51％   13％   1％   1.5
CD3+磁性富集后   76％   1％   0％   1.9
NDa115(PC073) 新进PBMC单采血液成分术产物   59％   17％   2％   1.7
XCELLERATE I
去除单核细胞的PBMC   60％   10％   2％   1.8
冷冻/融化的去除单核细胞的PBMC   60％   11％   1％   1.9
XCELLERATE II
冷冻/融化的PBMC单采血液成分术产物   53％   12％   1％   2.0
CD3+磁性富集后   72％   9％   0％   2.2
        按照标准方法利用流式细胞术测定细胞组成
通过免去CD14+单核细胞去除步骤和相关试剂使该方法简单化并合理化之外，在T细胞活化开始时，XCELLERATE IITM方法的磁性富集步骤也提供了较高纯度的CD3+T细胞以及较高比率的CD3+CD4+∶CD3+CD8+T细胞(表5.1和表5.2)。
还比较了XCELLERATE ITM方法和XCELLERATE IITM方法的活化CD3+T细胞在第8天收获之前的产量、纯度、存活力以及组成。
如表5.3所示，XCELLERATE IITM方法的CD3+T细胞，在第8天收获之前的平均产量、纯度和存活力，较之XCELLERATE ITM方法明显地得到改善。表5.3.XCELLERATE ITM方法和CELLERATE IITM方法的活化CD3+T细胞，
     在第8天收获前的产量、纯度、存活力以及组成。
    实验号(供者) XCELLERATE方法设置                        收获前CD3+T细胞产物特性
    #CD3+T细胞    CD3+T细胞纯度(％)     存活力(％)     CD4/CD8比率*
    NDa104(PC071) XCELLERATE I     65×109    95     97     1.2
XCELLERATE II     50×109    97     97     1.7
    NDa107(PC074) XCELLERATE I     57×109    98     98     0.8
XCELLERATE II     52×109    98     98     1.5
    NDa110(PC076) XCELLERATE I     41×109    96     96     1.6
XCELLERATE II     41×109    99     99     2.4
    NDa113(PC060) XCELLERATE I     41×109    96     96     1.3
XCELLERATE II     43×109    98     98     2.0
    NDa115(PC073) XCELLERATE I     31×109    96     96     1.3
XCELLERATE II     48×109    97     97     1.4
    平均值±标准误差 XCELLERATE I     47±14    96±2     97±1     1.2±0.3
XCELLERATE II     45±6    98±1     98±1     1.8±0.4
         *＝CD3+CD4+∶CD3+CD8+T细胞的比率
同样如表5.3所示，XCELLERATE IITM方法自始至终维持较高CD3+CD4+∶CD3+CD8+比率的T细胞。这可能由于磁性富集过程中优先富集CD3+CD4+细胞(表5.1和5.2)。
″新来的″是指新来的新鲜、经洗涤的单采血液成分的细胞。表5.2所列XCELLERATE ITM方法的起始细胞是已经洗涤、去除单核细胞、和/或冷冻/融化的单采血液成分的细胞。表5.2所列XCELLERATE IITM方法的起始细胞是已经洗涤并冷冻/融化的单采血液成分的细胞。
        *＝CD3+CD4+∶CD3+CD8+T细胞的比率
表5.3表明，XCELLERATE IITM方法产生的细胞产物，较之XCELLERATE ITM方法更纯(就％CD3+而言)。也就是说，XCELLERATE IITM方法的细胞产物，其平均(±标准误差)CD3+细胞纯度为96％±1％，而XCELLERATE ITM方法的细胞，其平均纯度为93％±2％。
另如表5.3所示，XCELLERATE IITM方法维持较高比率的CD4/CD8细胞。新来的细胞其平均CD4/CD8细胞比率为2.2，XCELLERATE IITM方法的细胞产物，其CD4/CD8比率为1.8，而XCELLERATE ITM方法的细胞产物，其CD4/CD8比率为1.2。
表5.3数据还表明，XCELLERATE IITM方法产生的细胞产物，其平均存活力为98％，而XCELLERATE ITM方法产生的细胞产物，其平均存活力为97％。
                       实施例III
                      单核细胞去除
利用多种″无关的″(即，非抗体包被或非靶抗体包被)Dynal小珠，通过磁性去除，从T细胞制品中除去单核细胞(CD14+巨噬细胞)。将或经ficol分离的全血，或单采血液成分的外周血，按小珠与细胞比率大致2∶1，与Dynal绵羊抗小鼠M-450小珠、或Dynal人血清白蛋白包被的小珠(M-450)、或者用Dynal环氧树脂(M-450)小珠预先温育，进行去除。细胞和小珠于22-37℃温育1-2小时，继之以磁性去除那些附着于小珠或吞噬小珠的细胞。把剩余细胞与未处理细胞中一起置于培养基中。用流式细胞术鉴定去除前后细胞的表型特征。
                      实施例IV
                   流式细胞术设置
将Becton Dickinson FACSCALIBUR血细胞计数器用于收集和提交的全部数据。有经验的操作者可以使用任何能够进行3色分析的流式细胞光度计，获得相同的数据。例如，FACSCAN、Vantage细胞分选仪、或其它BD产品能够用于收集类似的数据。还有Coulter产品，例如Coulter Epic分选仪也行。
如下仪器设置可以用作仪器构造一般指南，以收集数据，如本研究中所示。这些设置用于此处提供的实施例；然而，有经验的仪器操作者可以并应该修改这些设置，以适当地调整补偿及探测器电压。此外，使用带有不同荧光标记的不同检测抗体，要求对特定仪器进行个别调整，以给出最佳信号分离(电压)及其它信道″流过″最小(例如，补偿)。能熟练应用补偿对照、同型对照，并且对T细胞生物学具有一般了解的熟练流式操作者，将能重复以下提交的任何数据。
另外应当注意，许多的设置，特别是电压设置，可能依该仪器激光效率而不同。例如，与新激光器相比，旧的激光器产生信号需要更多电压。然而，无论用或多或少电压获得的数据，将反映相似的生物学形式。
用于FACSCALIBURTM(Becton Dickinson)的设置：
检波器/Amps：
  参数       探测器        电压        Amp/Gain       方式
  P1         FSC           E00         1.30           Lin
  P2         SSC           370         1.00           Lin
  P3         FL1           610         1.00           Log
  P4         FL2           550         1.00           Log
  P5         FL3           520         1.00           Log
尽管电压参数通常是常数，但为了获得最大的信号分离，可以稍向上或向下调整P3、P4、和P5，并在对数形式信号强度的第一十位内(0-10)或其附近维持一个阴性对照信号值。
阈值：
一级参数：FSC(前向散射)
数值：52
二级参数：没有
补偿：
FL1-4.0％FL2
FL2-21.4％FL1
FL2-2.6％FL3
FL3-15.2％FL2
提供的设置接近于收集以下递交的大部分数据所用设置，可以改变该设置，所形成的关于刺激T细胞的数据应该大致相等。在以上所列电压下，一般可接受的补偿范围如下所示：
FL1-FL2 0.4-4％
FL2-FL1 18-27％
FL2-FL3 2-8％
FL3-FL2 10-16％
必须由有经验的流式细胞仪操作者确定具体的补偿或电压数值，以达到以下目标：
1)电压：介于阳性和阴性信号之间的信号分离最大化(例如，无表面抗原标志对比低水平表面抗原对比高水平表面抗原)。
2)补偿：利用补偿对照使信道间干扰(流过)最小。
电压设置改变时，也改变补偿设置。
                       实施例V
                细胞增殖和存活力分析
利用标准的台盼蓝染色并用血细胞计数器计数细胞，测量细胞增殖和存活力。参见图5A-5B。
                      实施例VI
                    活化标志分析
在活化的T细胞上以瞬时方式表达CD154，已经证明是T细胞通过APCs上CD40相互作用的要素。阻断这两个受体的相互作用，可以有效地改变并甚至关闭免疫应答。在第3、5、和8天从细胞培养物中取部分通过CD3xCD28顺磁小珠富集而刺激的T细胞，分析CD154的表达水平。与去除单核细胞但未同CD3xCD28顺磁小珠温育的T细胞(即在培养开始时未磁性富集该T细胞)，比较CD154的表达水平。利用抗CD3和抗CD28小珠通过磁性富集刺激的T细胞，在培养第三天的CD154表达水平，与培养开始时未受类似刺激的细胞相比，增加三倍，表明活化显著。(参见图4和7)。类似方法测量CD25水平，显示较高的活化倾向(图6)。
通常多次监测标志的表达。在这方面，使用抗人CD4(Immunotech，Fullerton，CA)、FITC偶联的抗人CD11a(Pharmingen)、FITC偶联的抗人CD26(Pharmingen)、FITC偶联的抗人CD49d(Coulter)、FITC偶联的抗人CD54(Pharnaingen和Becton Dickinson)、FITC偶联的抗人CD95(Pharmingen)、FITC偶联的抗人CD134(Pharmingen)、FITC偶联的抗人CD25 Ab(Becton Dickinson，Fullerton，CA)、FITC偶联的抗人CD69 Ab(Becton Dickinson)、FITC或PE偶联的抗人CD154Ab(Becton Dickinson)、或者FITC或PE偶联的IgG1同型对照Ab标记细胞。用每种抗体2μl，在终体积30μl中，4℃标记2×105细胞20分钟，洗涤细胞并重悬于1％低聚甲醛(Sigma，St.Louis，MO)中。
可以通过多种方法比较细胞表面标记分子的表达水平，因而其绝对值可能不同。但是，比较两个数值时，则很容易计算出相对倍数数值。例如，由不同″活化″方法产生的T细胞上的CD154表达水平，能够通过流式细胞术方法以相对准确度测量。利用试剂，例如BectonDickinson的抗CD154-PE偶联物(目录#340477)，可以使处于静止的或者活化状态的T细胞染色，并利用为有经验的流式细胞仪操作者所熟知的方法，计量这个(或其它)标志的表达水平。此处所述为提高CD4+和CD8+T细胞上CD154表达的方法。如此处所述，通过在开始培养时同步刺激并富集T细胞，能够使表达水平提高到超过利用标准3x28活化获得的数值，水平增加大概20％到超过100％，这是利用流式细胞术(BDFACSCalibur以及如上所述抗体)测量平均荧光强度(MFI)得到的。例如，未刺激的CD4+T细胞可能是CD154阴性，并因而产生MFI数值为1-10。利用XCELLERATE ITM活化的情况下，在活化后第3天，CD4+T细胞上CD154的MFI值可能为20-40之间，而XCELLERATE IITM方法产生MFI值为60-200的CD154。就T细胞上表达的CD154分子的数量而言，这些不是绝对值，但足以确定表达提高的相对水平。因此，可以证实活化后1-4天内，XCELLERATE IITM方法与XCELLERATE ITM方法相比，CD154水平提高大约1.1-20倍。
                      实施例VII
                     细胞因子分析
如上所述制备细胞。按照厂家说明书(Biosource International，Sunnyvale，CA)，ELISA测定多次刺激的细胞上清液中IL-2、IL-4、INF-γ或者TNF-a。
另一分析中，利用流式细胞术通过CD4 T细胞的胞内染色测量IL-2。对于胞内标记IL-2或者IFN-γ，分析前首先与1ug/ml莫能星(Monensin)(Calbiochem)温育4小时。随后如上所述染色细胞表面蛋白质，利用Becton Dickinson胞内染色试剂盒固定并透化，用PE偶联的抗人IL-2Ab和FITC偶联的抗人IFN-γ或者相应的对照Abs，如厂家描述方法标记细胞。在Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪上，利用Cellquest软件按照厂家规程(Becton Dickinson)完成数据获取和流式细胞术分析。
与XCELLERATE ITM相反，利用XCELLERATE IITM方法时，第3天的IFN-γ浓度高约2、3、4、有时5倍(数据略)。另外，与XCELLERATE ITM相比，直到刺激后第5天，TNF-α的水平仍明显较高(高出1.5-3倍)(数据略)。
                    实施例VIII
               再刺激后的细胞表型分析
为分析再刺激，终止日从培养物中取约5×106细胞。在几个实施例中，培养第8天是终止日。把细胞放入5mL含血清以及含或不含IL-2的上述X-vivo 15培养基中，置于六孔板的一个孔。向含细胞孔中加入约5×106 Dynabeads M-450 CD3/CD28 T小珠，将细胞和小珠置于37℃、5％CO2保温箱。两天后取样品，测试存活力，FACS分析测定细胞大小和细胞标志和/或细胞因子表达水平，例如CD25表达水平、CD154表达水平。下表6显示了使用XCELLERATE ITM和XCELLERATE IITM方法的五个病人标本的结果。表6：利用XCELLERATE ITM和XCELLERATE IITM方法产生的XCELLERATED T
                                        细胞的再刺激分析结果
    实验号(供者)     方法设置        细胞大小(FSC)         CD25(MFI)        CD154(MFI)
   T＝0    T＝48hr     T＝0   T＝48hr     T＝0    T＝48hr
    NDa104(PC071)     XCELLERATEIXCELLERATEII    393404    607659     104115   478544     612    3770
    NDa107(PC074)     XCELLERATEI    386    596     59   585     6    121
    XCELLERATEII    380    607     62   721     10    109
    NDa110(PC076)     XCELLERATEI    425    501     111   600     10    39
    XCELLERATEII    390    445     97   434     15    36
    NDa113(PC060)     XCELLERATEI    399    630     66   659     8    32
    XCELLERATEII    411    633     113   816     12    145
    NDa115(PC073)     XCELLERATEI    433    514     105   247     13    10
    XCELLERATEII    408    569     81   369     20    36
    平均值±标准误差(n＝5)     XCELLERATEI    407±21    570±58     89±24   514±163     9±3    48±43
    XCELLERATEII    399±13    583±84     94±22   577±189     14+4    79±48
                      实施例IX
              另外的细胞收集和培养规程
                    XCELLERATETM
将从人血液分离的细胞在X-vivo培养基(Biowhittaker Inc.，Walkersville，MD)中生长，根据用途补加或不补加20U/mlIL-2(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，并补加5％人血清(Biowhittaker)、2mM谷氨酰胺(Life Technologies，Rockville，MD)和20mM HEPES(Life Technology)。Jurkat E6-1细胞(ATCC，Manassas，VA)生长在RPMI 1640(Life Technologies)中，其中补加10％FBS(Biowhittaker)、2mM谷氨酰胺(Life Technologies)、2mM青霉素(Life Technologies)和2mM链霉素(Life Technologies)。
从健康志愿者供体获得暗黄色层(美国红十字会，Portland，OR)。按照厂家说明书，利用淋巴细胞分离液(ICN Pharmaceuticals，CostaMesa，CA)获得外周血单核细胞(PBMC)。
通过在培养瓶中(Costar，Pittsburgh，PA)与未包被的Dynabeads(Dynal，Oslo，Norway)，108细胞/ml，2小珠/细胞，37℃温育2小时，从PBMC成分获得外周血淋巴细胞(PBL)。单核细胞和巨噬细胞因附着到培养瓶上而去除。或者，按照厂家说明书(Dynal)，使细胞吞噬顺磁小珠，然后利用磁细胞分离法而除去这些细胞。通过与10μg/ml的抗CD8(克隆G10-1)、CD20(克隆IF5)、CD14(克隆F13)和CD16(Coulter)单克隆抗体，108细胞/ml，4℃温育20分钟，从PBL成分纯化CD4+细胞。细胞洗涤后，利用绵羊抗小鼠Ig偶联的Dynabeads(106细胞/ml，6小珠/细胞，4℃20分钟)处理细胞，然后经由磁细胞分离法两次而去除。流式细胞术测量的CD4+细胞纯度通常为91-95％。
通过108细胞/毫升，37℃2小时(无Dynabeads)，首先将PBMC粘附到培养瓶(Costar)上而产生树突状细胞。彻底洗涤后，在包含500U/mlGM-CSF(Boehringer Mannheim)和12.5U/ml IL-4(BoehringerMannheim)的培养基中，培养贴壁细胞7天。产生的细胞群体贴壁较弱，表达树突状细胞特征性的表面标志(例如表达HLA-DR、CD86、CD83、CD11c并缺少CD4的表达)。(全部抗体来自Becton Dickinson，SanJose，CA)。
在组织培养皿和/或组织培养瓶(Baxter袋)、或者其它常见的培养容器的培养基中(含有RPMI、X-Vivo 15、或者其它的一些T细胞培养基)中培养的包含T细胞的人外周血淋巴细胞，能够为其它技术所利用。尽管在T细胞的活化和生长中不需要谷氨酰胺和HEPES，但仍在培养基中加入。培养基中加入胎牛血清(10％终浓度)、人A/B血清(5％)、或者自体人血清(5％)。血清的百分比可以改变，而对T细胞生物学或者培养结果没有太大影响。在有些情况下，培养物中加入重组人IL-2。某些情况下，利用下文所述磁性去除方法，去除CD14+吞噬细胞及其他吞噬细胞。以3∶1的小珠/细胞比率，加入表面上共固定抗CD3和抗CD28的小珠(3x28小珠)。在37℃、5-7％CO2条件下维持培养物。14天期间，在几个时间点上取出细胞，以测定细胞密度(细胞数量)、细胞大小，并利用流式细胞术分析多种表面抗原，以测定细胞表面表型。从培养物中收集上清液，测定分泌细胞因子的概况，包括但不限于IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α。随着活化细胞的生长和分裂，培养物维持在0.2-2×106CD3+T细胞/ml。T细胞密度大致超过1.5×106/毫升时，分开培养物，供给新鲜培养基，使细胞密度在0.2-1.4×106/ml范围内。开始刺激后大约2小时-14天，当活化T细胞显示进入更静止的时期(例如CD25水平降低、前向散射测定的细胞大小变小、细胞分裂速率降低)时，可将细胞或者输入给受实验者，或者用下列刺激物之一进行再刺激：
1)无刺激物
2)植物凝集素(PHA)2μg/ml
3)(3x28小珠)小珠/细胞比率为1∶1
重新随时间分析细胞表型以及活化/功能状态。重新收集上清液，分析所分泌的细胞因子。
用三种不同方法刺激细胞1)共价偶联抗CD3(OKT-3)和抗CD28(9.3)抗体的Dynabeads(M-450)(3x28小珠)，按照厂家说明书(Dynal)，为3个小珠/细胞，2)离子霉素(Calbiochem，La Jolla，CA)(100ng/ml)和12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(PMA)(Calbiochem)(10ng/ml)，3)同种异体树突状细胞(25,000树突状细胞/200,000 CD4细胞)。在106细胞/ml的浓度下刺激所有细胞。在96孔平底培养板，进行一式四份增殖分析。在106细胞/ml、200μl终体积条件下刺激细胞。在第3天(刺激方法1和2)或者第6天(刺激方法3)，用MTT分析法测量增殖(MTT分析试剂盒，Chemicon International Inc.，Temecula，CA)，结果以四次重复的平均值表示。利用3x28小珠、离子霉素/PMA、或者同种异体的树突状细胞，刺激PBL培养物或者纯化的CD4+细胞培养物。
如图8A-8B所证明，利用PHA、附着绵羊抗小鼠(SAM)的3x28小珠(小珠上共固定抗CD3和抗CD28)、抗体共价附着其上的3x28小珠、或者单个或者双重固定在平板上的抗体刺激以后，细胞数量(Coulter计数器)显著增加。图9还表明，利用共价固定抗CD3和抗CD28的小珠+/-去除单核细胞以及+/-20U IL-2刺激以后，细胞数量增加。
                        实施例X
              利用磁性去除方法去除单核细胞
利用多种″无关的″(即，无抗体包被或无靶抗体包被)Dynal小珠，通过磁性去除，从T细胞制剂中除去单核细胞(CD14+吞噬细胞)。将ficoll分离的全血、或者单采血液成分的外周血，与Dynal绵羊抗小鼠M-450小珠、或Dynal人血清白蛋白包被的小珠(M-450)、或者用Dynal环氧树脂(M-450)小珠，按小珠细胞比率大致2∶1，预先22-37℃温育1-2小时，随后磁性去除附着于小珠或吞噬小珠的细胞，进行了去除。把剩余细胞与未处理细胞一起培养。利用流式细胞术鉴定去除前后的细胞表型。图9证明无单核细胞时，细胞增殖增强。
                      实施例XI
               活化前后时程动力学研究
在多种条件下培养分离自全血或者单采血液成分的外周血的人T细胞，进行一系列实验。这些培养条件包括：
1)无刺激
2)用2μg/ml植物凝集素(PHA)刺激。
3)用3x28 Dynabeads(其上偶联有抗CD3和抗C28的小珠)刺激，小珠与T细胞比率为3∶1或1∶1。
4)在有或没有外加10U/ml(5ng/ml)重组人IL-2情况下，刺激或培养。
5)存在单核细胞(CD14+吞噬细胞)情况下培养，或者利用多种″无关的″Dynabeads通过磁性去除除去前述细胞后培养。如实施例2所示进行去除。
用流式细胞术分析下列细胞表面标志，测定细胞表型和活化状态：CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD20、CD25、CD45RA、CD45RO、CD54、CD62L、CDw137(41BB)、CD154。也利用流式细胞术经前向散射分布图测定细胞大小。
标志，例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD20、CD45RA、和CD45RO用于测定T、B、和单核细胞谱系以及亚群，而前向散射CD25、CD62L、CD54、CD137、CD154用于测定细胞的激活状态和功能特性。
如实施例IX所述制备包含T细胞的人外周血淋巴细胞。随时间分析细胞表型以及活化/功能状态。收集上清液，分析分泌的细胞因子。图8和9表明了利用3x28小珠+/-10u/ml重组人IL-2以及+/-单核细胞去除活化以后的人T细胞的一般生长特征。在Baxter Lifecell瓶(300ml)中培养全部细胞。图上标的″按比例放大″，是指300ml玻瓶培养(无IL-2/去除单核细胞)扩增到Baxter Lifecell 3L培养瓶中。该图表明在各种条件下，人T细胞扩增约2-4对数倍。
图10表示利用前向散射流式细胞术-时间曲线测定细胞大小进行的动力学分析。可以发现，T细胞的大小在活化之后不久增大，随后减小，在第14天显示的前向散射分布更小，表明处于更静止的状态。
图11表示在3x28小珠刺激以后，IL-2受体(CD25)随时间的表达情况。CD4+和CD8+T细胞都显示出受体水平早期增加。到第14天，大多数T细胞的CD25表达水平大大降低，表明处于更静止的状态。
当3x28刺激的T细胞变得更静止时(CD25低，前向散射低)，如下所示再刺激：
1)无刺激
2)2ug/mlPHA
3)3x28(Xcellerate)小珠，按1小珠/CD3+T细胞刺激
然后进行细胞大小(前向散射)、表面表型、活化标志表达、和细胞因子分泌的动力学分析。图12显示初级和次级刺激以后前向散射(细胞大小)的动力学。图13表示初级和次级刺激以后CD25(IL-2受体)的表达动力学。图16显示次级刺激以后，CD4+T细胞(A)和CD8+T细胞(B)上CD54(I-CAM)的表达情况，其中初级刺激是PHA或CD3xCD28小珠，再刺激是：无刺激、PHA、或3x28小珠。CD4和CD8阳性细胞的标志也用于测定3x28抗体小珠活化期间两者的相对比例(图19和22)。
                      实施例XII
          共刺激T细胞的细胞因子表达模式的分析
已经广泛地研究了多种细胞因子有关T细胞维持、扩增和分化的作用，其中包括IL-2、IFN-γ、TNF-、和IL-4。值得注意的是，已经表明IL-2支持T细胞的维持和扩增。已经应用IFN-γ促使T细胞分化为TH1型免疫效应器，应用IL-4促使T细胞发生TH2型反应。通过按实施例IX方法刺激T细胞，分析用PHA或者CD3xCD28小珠活化的取代T细胞细胞因子释放水平，包括初级刺激反应和再刺激反应的动力学研究。图18A-C和图23-24所示数据表明CD3xCD28小珠刺激的独特特点。开始刺激后的第2天和第4天之间(第1天没有测定)，观察到IL-2和IFN-γ的水平都非常高。观察到与PHA刺激的细胞相比，3x28小珠刺激的T细胞，其分泌IL-2的绝对水平提高了几乎5倍。还观察到3x28刺激的T细胞，比较相应PHA，其IFN-γ水平增加约7倍。至于IL-4，初级刺激后提高不显著。令人感兴趣并可能意义重大的是，细胞经初级刺激变静止(不再分裂或分泌上述3种细胞因子)以后，用CD3xCD28小珠、PHA再刺激，或者不刺激。通过CD3xCD28小珠接受初始活化/扩增信号的T细胞，分泌的IFN-γ水平甚至比初级刺激后观察到的更高。相反，经PHA起始刺激的细胞，分泌的IFN-γ水平比相应3x28观察到的更低许多。也注意到IL-4水平有类似差异。
这些数据提示，经过CD3xCD28小珠介导的活化/扩增所获得的细胞，功能上不同于其它扩增方法获得的细胞，例如PHA方法。获得的细胞似乎具有改变了的细胞因子分泌反应，即使TH1和TH2细胞因子水平大大提高，并可能倾向于TH1型模式(IFN-γ)。细胞培养物中分泌如此高水平的细胞因子具有许多效果，包括促使T细胞进入TH1分化途径，这有利于抗肿瘤和抗病毒反应；以及改变所得T细胞的基本功能(例如降低活化和抑制细胞程序性死亡途径的阈值)。
                    实施例XIII
            共刺激T细胞的CD54表达的分析
图16显示次级刺激以后，CD4+T细胞(A)和CD8+T细胞(B)上CD54(I-CAM)的表达情况，其中初级刺激是PHA或CD3xCD28小珠，再刺激是：无、PHA、或3x28小珠。
                     实施例XIV
                  短期活化标志分析
如实施例IX所述，通过多个时间点监测标志的表达情况。在这方面，使用抗人CD4(Immunotech，Fullerton，CA)、FITC偶联的抗人CD11a(Pharmingen)、FITC偶联的抗人CD26(Pharmingen)、FITC偶联的抗人CD49d(Coulter)、FITC偶联的抗人CD54(Pharmingen和BectonDickinson)、FITC偶联的抗人CD95(Pharmingen)、FITC偶联的抗人CD134(Pharmingen)、FITC偶联的抗人CD25抗体(Becton Dickinson，Fullerton，CA)、FITC偶联的抗人CD69抗体(Becton Dickinson)、FITC或PE偶联的抗人CD154抗体(Becton Dickinson)、或者FITC或PE偶联的IgG1同型对照抗体标记细胞。每种抗体2μl，在终体积30μl中，将2×105细胞于4℃标记20分钟，细胞洗涤并重悬于1％低聚甲醛(Sigma，St.Louis，MO)。参见图21-22和26A-26L，这些图形表明随活化时间以及在CD4+和CD8+细胞之间呈现显著差别。
从上文所述可以理解，尽管为说明起见，此处描述了本发明的特定实施方案，但在不背离本发明精神和范围的前提下，可以对其做各种修改。  因此，除所附权利要求之外，本发明不受限制。以上引用的所有参考文献、专利、专利申请、等等，此处全文引入。此外，此处所述所有数值范围明确地包括该范围内的全部整数值。

Claims (171)

1.利用同步T细胞富集和细胞表面成分连接刺激T细胞群体的一种方法，包括：
(a)提供细胞群体，其中至少其一部分包含T细胞；
(b)将所述细胞群体与表面接触，其中所述表面上附着一种或多种因子，所述因子可连接至少一部分所述T细胞的细胞表面成分，并刺激至少所述部分的T细胞；
(c)施加主要驱使T细胞富集以及T细胞表面成分连接的作用力，从而诱导T细胞刺激。
2.权利要求1的方法，其中所述表面上附着第一因子，其可连接T细胞的第一细胞表面成分；并且同一或第二表面上附着第二因子，其可连接所述T细胞的第二成分，其中所述通过第一和第二因子的连接可诱导所述T细胞增殖。
3.权利要求1的方法，其中所述表面是生物相容性的。
4.权利要求3的方法，其中所述表面是天然的或者合成的。
5.权利要求4的方法，其中所述表面包含聚合物。
6.权利要求5的方法，其中所述表面选自胶原、纯化的蛋白质、纯化的肽、多糖、糖胺聚糖、以及细胞外基质成分。
7.权利要求6的方法，其中该多糖选自脱乙酰壳多糖、藻酸盐、葡聚糖、透明质酸、以及纤维素。
8.权利要求5的方法，其中聚合物选自聚苯乙烯、聚酯、聚醚、聚酐、聚烷基腈基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚原酸酯、聚磷腈、聚乙酸乙烯酯、嵌段共聚物、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、以及聚氨基甲酸乙酯。
9.权利要求8的方法，其中聚合物包括乳酸。
10.权利要求5的方法，其中聚合物是共聚物。
11.权利要求10的方法，其中共聚物包括乳酸和羟基乙酸(PLGA)。
12.权利要求3的方法，其中生物相容性表面是可生物降解的。
13.权利要求3的方法，其中生物相容性表面是不可生物降解的。
14.权利要求13的方法，其中不可生物降解的物质包含选自聚(二甲基硅氧烷)和聚(乙烯-乙酸乙烯酯)的聚合物。
15.权利要求3的方法，其中生物相容性表面选自胶原、金属、羟基磷灰石、玻璃、铝酸盐、生物陶瓷材料、透明质酸聚合物、藻酸盐、丙烯酸酯聚合物、乳酸聚合物、羟基乙酸聚合物、乳酸/羟基乙酸聚合物、纯化的蛋白质、纯化的肽、和/或细胞外基质成分。
16.权利要求3的方法，其中生物相容性表面与一种可植入装置有关。
17.权利要求16的方法，其中装置选自：支架、导管、纤维、中空纤维、小片、和缝线。
18.权利要求4的方法，其中所述表面选自玻璃、二氧化硅、硅、胶原、羟基磷灰石、水凝胶、PTFE、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龙和聚丙烯酰胺。
19.权利要求4的方法，其中所述表面选自脂类、平板、碟、袋、杆、丸、纤维和网。
20.权利要求4的方法，其中所述表面是颗粒。
21.权利要求20的方法，其中颗粒选自小珠、微球、纳米微粒、和胶体粒子。
22.权利要求21的方法，其中所述小珠直径约为5纳米-约500微米。
23.权利要求1的方法，其中所述因子独立地选自蛋白质配基、天然的配基和合成配基。
24.权利要求23的方法，其中所述因子独立地选自抗体、抗体片段、肽、多肽、糖肽、受体、类固醇、激素、有丝分裂原、抗原、超抗原、生长因子、细胞因子、凝集素、病毒蛋白质、粘附分子和趋化因子。
25.权利要求24的方法，其中至少一个因子是抗体或抗体片段。
26.权利要求24的方法，其中第一因子是抗体及其片段，并且第二因子是抗体或者其片段。
27.权利要求26的方法，其中所述第一和所述第二因子是不同的抗体。
28.权利要求24的方法，其中所述第一因子是抗-CD3抗体、抗-CD2抗体、或者抗CD3抗体或抗CD2抗体的抗体片段。
29.权利要求24或者27的方法，其中所述第二因子是抗CD28抗体或其抗体片段。
30.权利要求24或者27的方法，其中所述第二因子是CD28的天然配基。
31.权利要求30的方法，其中所述天然配基包括B7-1或B7-2。
32.权利要求1的方法，其中所述作用力选自大于重力的一种作用力、液压力、跨膜压产生的渗透力、离心力以及磁力。
33.权利要求32的方法，其中磁力是利用磁铁产生的，在磁铁表面的磁场强度介于大约200-约12,000高斯。
34.权利要求1的方法，其中所述表面是顺磁颗粒的表面。
35.权利要求1的方法，其中所述因子对表面的附着是共价的、非共价的、静电的、或疏水性的。
36.权利要求1的方法，其中连接的T细胞与未连接的T细胞分开。
37.权利要求1的方法，其中所述T细胞改善免疫应答功能障碍。
38.一种利用同步细胞表面成分连接和T细胞聚集而刺激T细胞的方法，包括：
(a)提供包括T细胞的细胞群体；
(b)使所述细胞群体与表面接触，其中所述表面上附着一种或多种特异性针对细胞表面成分的配基；
(c)施加驱动T细胞和表面富集的作用力；以及
(d)温育所述细胞一段时间，使足以获得所要求的刺激。
39.权利要求38的方法，其中所述足以获得所要求刺激的时间为从1分钟到8天。
40.权利要求39的方法，其中所述足以获得所要求刺激的时间为从1天到5天。
41.权利要求38的方法，其中所述表面是生物相容性的。
42.权利要求41的方法，其中所述表面是天然的或者合成的。
43.权利要求42的方法，其中表面选自玻璃、二氧化硅、硅、胶原、羟基磷灰石、水凝胶、PTFE、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龙、葡聚糖和聚丙烯酰胺。
44.权利要求38的方法，其中所述表面选自平板、碟、袋、杆、丸、纤维和网。
45.权利要求38的方法，其中所述表面是颗粒。
46.权利要求45的方法，其中颗粒选自小珠、微球、纳米微粒、和胶体粒子。
47.权利要求46的方法，其中所述小珠直径约为5纳米-约500微米。
48.权利要求38的方法，其中所述因子选自蛋白质、天然配基和合成配基。
49.权利要求38的方法，其中所述配基选自抗体、抗体片段、肽、多肽、糖肽、可溶性受体、类固醇、激素、有丝分裂原、抗原、配基、超抗原、生长因子、细胞因子、凝集素和趋化因子。
50.权利要求49的方法，其中至少一个配基是抗体或其片段。
51.权利要求49的方法，其中至少两个配基是抗体或其片段。
52.权利要求49的方法，其中存在至少两个配基，并且是不同的抗体或其片段。
53.权利要求49的方法，其中至少一个配基是抗-CD3抗体、抗-CD2抗体、或者抗-CD3抗体或抗-CD2抗体的抗体片段。
54.权利要求49或者53的方法，其中至少一个配基是抗CD28抗体或其抗体片段。
55.权利要求49或者53的方法，其中至少一个配基是CD28的天然配基。
56.权利要求55的方法，其中所述天然配基包括B7-1或B7-2。
57.权利要求38的方法，其中所述作用力选自大于重力的作用力、液压力、跨膜压产生的渗透力、离心力以及磁力。
58.权利要求57的方法，其中磁力是利用磁铁产生的，在磁铁表面的磁场强度介于大约200-约12,000高斯。
59.权利要求38的方法，其中所述表面是顺磁颗粒的表面。
60.权利要求38的方法，其中所述配基对表面的附着是共价的、非共价的、静电的、或疏水性的。
61.权利要求38的方法，进一步包括在步骤(d)之前或同时，将用表面富集的T细胞与未富集的细胞分开。
62.一种适于体内诱导T细胞激活的方法，包括给予动物以顺磁颗粒，所述颗粒上附着可诱导T细胞活化的、特异性针对T细胞表面成分的配基；施加磁场到动物的分散区域；并从而诱导在所述分散区域与所述颗粒结合的T细胞定位和活化。
63.一种利用同步靶细胞富集和靶细胞表面成分连接刺而激靶细胞群体的方法，包括：
(a)提供细胞群体，其中至少其一部分包含靶细胞；
(b)使所述细胞群体与表面接触，其中所述表面上附着一种或多种因子，该因子可连接至少一部分所述靶细胞的细胞表面成分，并刺激至少所述部分的靶细胞；和
(c)施加主要驱使靶细胞富集以及靶细胞表面成分连接的作用力，从而诱导靶细胞刺激。
64.权利要求63的方法，其中所述表面上附着第一因子，其连接靶细胞的第一细胞表面成分；以及同一或第二表面附着第二因子，其连接所述靶细胞的第二成分，其中所述第一和第二因子的连接可诱导所述靶细胞中的信号转导。
65.权利要求63的方法，其中所述表面是生物相容性的。
66.权利要求65的方法，其中所述表面是天然的或者合成的。
67.权利要求66的方法，其中所述表面包含聚合物。
68.权利要求67的方法，其中所述表面选自胶原、纯化的蛋白质、纯化的肽、多糖、糖胺聚糖、以及细胞外基质成分。
69.权利要求68的方法，其中多糖选自脱乙酰壳多糖、藻酸盐、葡聚糖、透明质酸、以及纤维素。
70.权利要求67的方法，其中聚合物选自聚酯、聚醚、聚酐、聚烷基腈基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚原酸酯、聚磷腈、聚乙酸乙烯酯、嵌段共聚物、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、以及聚氨基甲酸乙酯。
71.权利要求70的方法，其中聚合物包括乳酸。
72..权利要求67的方法，其中聚合物是共聚物。
73.权利要求72的方法，其中共聚物包括乳酸和羟基乙酸(PLGA)。
74.权利要求65的方法，其中的生物相容性表面是可生物降解的。
75.权利要求65的方法，其中的生物相容性表面是不可生物降解的。
76.权利要求75的方法，其中不可生物降解的物质包括选自聚(二甲基硅氧烷)和聚(乙烯-乙酸乙烯酯)的聚合物。
77.权利要求65的方法，其中生物相容性表面选自胶原、金属、羟基磷灰石、生物玻璃、铝酸盐、生物陶瓷材料、透明质酸聚合物、藻酸盐、丙烯酸酯聚合物、乳酸聚合物、羟基乙酸聚合物、乳酸/羟基乙酸聚合物、纯化的蛋白质、纯化的肽、和/或细胞外基质成分。
78.权利要求65的方法，其中生物相容性表面与一种可植入装置有关。
79.权利要求78的方法，其中装置选自：支架、导管、纤维、中空纤维、小片、和缝线。
80.权利要求66的方法，其中所述表面选自玻璃、二氧化硅、硅、胶原、羟基磷灰石、水凝胶、PTFE、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龙和聚丙烯酰胺。
81.权利要求66的方法，其中所述表面选自脂类、平板、碟、袋、杆、丸、纤维和网。
82.权利要求66的方法，其中所述表面是颗粒。
83.权利要求82的方法，其中颗粒选自小珠、微球、纳米微粒、和胶体粒子。
84.权利要求83的方法，其中所述小珠直径约为5纳米-约500微米。
85.权利要求63的方法，其中所述因子独立地选自蛋白质配基、天然配基和合成配基。
86.权利要求85的方法，其中所述因子独立地选自抗体、抗体片段、肽、多肽、糖肽、受体、类固醇、激素、有丝分裂原、抗原、超抗原、生长因子、细胞因子、凝集素、病毒蛋白质、粘附分子和趋化因子。
87.权利要求86的方法，其中至少一个因子是抗体或抗体片段。
88.权利要求86的方法，其中第一因子是抗体或其片段，并且第二因子是抗体或其片段。
89.权利要求86的方法，其中所述第一和所述第二因子是不同的抗体或其片段。
90.权利要求63的方法，其中所述作用力选自大于重力的作用力、液压力、离心力、跨膜压产生的渗透力、以及磁力。
91.权利要求32的方法，其中磁力是利用磁铁产生的，在磁铁表面的磁场强度介于大约200-约12,000高斯。
92.权利要求63的方法，其中所述表面是顺磁颗粒的表面。
93.权利要求63的方法，其中所述因子对表面的附着是共价的、非共价的、静电的、或疏水性的。
94.一种利用细胞表面成分连接和靶细胞富集而刺激靶细胞的方法，包括：
(a)提供包括靶细胞的细胞群体；
(b)使所述细胞群体与表面接触，其中所述表面附着一种或多种特异性针对细胞表面成分的配基；
(c)施加可驱动靶细胞富集以及所述细胞在所述表面富集的作用力；并且
(d)温育所述细胞足够长的一段时间，以达到所要求的刺激。
95.权利要求94的方法，其中所述足以获得所要求刺激的时间从大约1分钟到大约30天。
96.权利要求95的方法，其中所述足以获得所要求刺激的时间是从大约1天到大约5天。
97.权利要求94的方法，其中所述表面是生物相容性的。
98.权利要求97的方法，其中所述表面是天然的或者合成的。
99.权利要求98的方法，其中所述表面选自玻璃、二氧化硅、硅、胶原、羟基磷灰石、水凝胶、PTFE、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龙、葡聚糖和聚丙烯酰胺。
100.权利要求94的方法，其中所述表面选自平板、袋、碟、杆、丸、纤维和网。
101.权利要求94的方法，其中所述表面是颗粒。
102.权利要求101的方法，其中颗粒选自小珠、微球、纳米微粒、和胶体粒子。
103.权利要求102的方法，其中所述小珠直径约为5纳米-约500微米。
104.权利要求94的方法，其中所述配基选自蛋白质、天然配基和合成配基。
105.权利要求94的方法，其中所述配基选自抗体、抗体片段、肽、多肽、糖肽、受体、类固醇、激素、有丝分裂原、抗原、配基、超抗原、生长因子、细胞因子、凝集素和趋化因子。
106.权利要求105的方法，其中至少一个配基是抗体或其片段。
107.权利要求105的方法，其中至少两个配基是抗体或其片段。
108.权利要求105的方法，其中至少两个配基存在，并且是不同的抗体或其片段。
109.权利要求63或94的方法，其中所述靶细胞选自T细胞、B细胞、或者干细胞。
110.权利要求94的方法，其中所述作用力选自大于重力的作用力、液压力、跨膜压产生的渗透力、离心力、以及磁力。
111.权利要求110的方法，其中磁力是利用磁铁产生的，在磁铁表面的磁场强度介于大约200-大约12,000高斯。
112.权利要求94的方法，其中所述表面是顺磁颗粒的表面。
113.权利要求94的方法，其中所述配基对表面的附着是共价的、非共价的、静电的、或疏水性的。
114.权利要求94的方法，进一步包括在步骤(d)之前或同时，将富集的靶细胞与未富集细胞分开。
115.一种体内诱导靶细胞刺激的方法，包括给予动物以顺磁颗粒，所述颗粒上附着可诱导靶细胞刺激的、特异性针对靶细胞表面成分的配基；施加磁场到动物的分散区域；并从而诱导在所述分散区域与所述颗粒结合的靶细胞定位和刺激。
116.一种诱导携带受体的细胞中发生受体极化的方法，
包括：
a)提供细胞群体；
b)将所述细胞群体与固相表面接触，其中所述固相表面上附着存在于至少一部分所述细胞群体上、特异性针对细胞表面受体的一种或多种配基；并且
c)施加可驱动细胞富集和细胞表面受体连接的作用力。
117.一种诱导细胞表面分子聚集的方法，包括：
a)提供具有靶细胞表面分子的细胞群体；
b)使所述细胞群体与固相表面接触，其中所述固相表面上附着了针对至少一种靶细胞表面分子的配基；和
(c)施加可驱动靶细胞表面分子聚集的作用力。
118.权利要求117的方法，其中所述细胞群体包括淋巴细胞。
119.权利要求116或者117的方法，其中所述固相表面选自平板、袋、碟、杆、丸、纤维、微球和小珠。
120.权利要求116或者117的方法，其中所述配基选自抗体、天然配基和合成配基。
121.权利要求120的方法，其中所述配基包括抗体、肽、多肽、生长因子、细胞因子、或趋化因子。
122.权利要求116或者117的方法，其中所述作用力选自大于重力的作用力、液压力、跨膜压产生的作用力、离心力、以及磁力。
123.权利要求122的方法，其中磁力是利用磁铁产生的，在磁铁表面的磁场强度介于大约200-大约12,000高斯。
124.权利要求116或者117的方法，其中所述固相表面是顺磁性的。
125.权利要求116或者117的方法，其中所述受体结合引起细胞事件的下调或抑制。
126.权利要求116或者117的方法，其中所述受体结合引起细胞事件的上调或活化。
127.权利要求116的方法，其中所述细胞事件是受体介导的信号转导。
128.权利要求94的方法，其中所述作用力驱动细胞表面成分的富集或定位。
129.一种诱导T细胞群体增殖的方法，包括使T细胞与固相表面接触介于大约2小时-9天之间的一段时间，所述固相表面上固定了第一因子和第二因子，其中所述第一因子向所述T细胞提供活化信号，并且所述第二因子提供共刺激信号。
130.权利要求129的方法，其中所述一段时间介于大约2-大约48小时之间。
131.权利要求130的方法，其中所述一段时间介于大约2-大约12小时之间。
132.权利要求129的方法，其中所述一段时间介于大约2-大约8天之间。
133.权利要求129的方法，其中所述一段时间介于大约3-大约6天之间。
134.权利要求129的方法，其中所述第一和第二因子固定于相同的固相表面。
135.权利要求134的方法，其中所述固相表面选自平面、不规则表面、球面。
136.权利要求129的方法，其中所述固相表面是小珠。
137.权利要求135的方法，其中所述不规则表面是塑料表面。
138.权利要求129的方法，其中所述第一因子包括结合CD3的抗体或其片段，并且所述第二因子包括结合CD28的抗体或其片段。
139.根据129-138的任一方法生产的T细胞群体。
140.一种组合物，其包括根据权利要求139的T细胞群体以及药学上可接受的赋形剂。
141.一种诱导T细胞群体增殖的方法，包括：
a.通过将所述T细胞与小珠上固定的第一因子接触，以活化T细胞群体，其中所述小珠直径介于约20微米-约1毫米；以及
b.利用可结合辅助分子的第二因子刺激所述T细胞表面上的辅助分子，其中所述第二因子固定在小珠上，并从而诱导T细胞增殖。
142.权利要求141的方法，其中所述小珠直径介于约80微米和约500微米之间。
143.权利要求142的方法，其中所述小珠直径介于约100微米和约400微米之间。
144.权利要求143的方法，其中所述小珠直径介于约250微米和300微米之间。
145.权利要求141-144任一项的方法，其中所述小珠是顺磁小珠。
146.权利要求141的方法，其中第一因子包括抗CD3抗体，并且第二因子包括抗CD28抗体。
147.权利要求146的方法，其中T细胞群体包括辅助T细胞。
148.权利要求141-144任一项的方法，进一步包括利用过滤将小珠和T细胞分开。
149.权利要求148的方法，其中第一因子包括抗CD3抗体，并且第二因子包括抗CD28抗体。
150.权利要求149的方法，其中T细胞群体包括辅助T细胞。
151.活化的T细胞群体，其中至少一个细胞亚群具有这样的表型，即刺激后约1-约4天之间CD154水平达到峰值。
152.活化的T细胞群体，其中所述群体包括超过约60％的CD4+T细胞。
153.活化的T细胞群体，其中所述群体包括至少约70％的CD4+T细胞。
154.活化的T细胞群体，其通过与抗CD3和抗CD28抗体或其片段接触大约2小时-大约9天时间而预先刺激，从而增殖。
155.权利要求154的群体，其中所述接触时间为大约4小时-约8天。
156.权利要求154的群体，其中所述接触时间为大约4小时-8天。
157.活化的T细胞群体，其中所述T细胞已通过与固定的第一因子和第二因子接触介于大约2小时-约9天之间的一段时间而预先诱导发生增殖，其中所述第一因子向所述T细胞提供活化信号，并且所述第二因子提供共刺激信号。
158.权利要求157的群体，其中所述T细胞产生的白细胞介素-4水平，于初级和次级信号活化后约2-约7天之间达到峰值。
159.权利要求157的群体，其中所述T细胞产生的白细胞介素-2水平，于初级和次级信号活化后约2-约7天之间达到峰值。
160.权利要求157的群体，其中所述T细胞产生的肿瘤坏死因子-α或干扰素-γ水平，于初级和次级信号活化后约2-约7天之间达到峰值。
161.一种组合物，包括根据权利要求151-160中任何一项的T细胞以及药学上可接受的赋形剂。
162.从包含T细胞和单核细胞的悬浮液中去除单核细胞的方法，包括使悬浮液与顺磁小珠接触，其中所述小珠直径为约2.8μm-约10μm，并随后利用磁力吸引从悬浮液中分离单核细胞。
163.权利要求162的方法，其中悬浮液是全血细胞悬液。
164.权利要求162和163中任何一项的方法，其中的小珠上附着至少一种抗体。
165.权利要求164的方法，其中抗体是一种非特异性抗体。
166.一种治疗病人肿瘤的方法，包括给予该病人以权利要求161的药物组合物。
167.权利要求166的方法，其中病人在给药之前去除内源的淋巴细胞。
168.权利要求166的方法，其中T细胞取自活化前的病人。
169.权利要求166的方法，其中T细胞群体已经去除了单核细胞。
170.刺激的T细胞群体，其CD154表达水平，较之用抗CD3和抗CD28抗体刺激而没有同步富集和刺激的T细胞，高出至少10％，其中所述水平是在T细胞刺激后1-4天内通过流式细胞术测定的。
171.刺激的T细胞群体，其CD25表达水平，较之用抗CD3和抗CD28抗体刺激而没有同步富集和刺激的T细胞，高出至少10％，其中所述水平是在T细胞刺激后1-4天内通过流式细胞术测定的。
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