CN114107197A - 细胞扩增 - Google Patents

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Abstract

本发明描述的实施方式涉及在中空纤维生物反应器中生长细胞的方法和系统。在实施方式中，细胞可暴露于激活细胞扩增的激活剂。在实施方式中，细胞可包括T细胞，且激活剂可为不同形式，包括例如抗原递呈细胞或经抗体功能化的珠子。

Description

细胞扩增
本申请是2016年05月12日递交的申请号为201680026705.8，发明名称为“细胞扩增”的分案申请。
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2015年5月13日递交名称为“细胞扩增(CELL EXPANSION)”美国临时专利申请号62/161,128的优先权，该美国临时专利申请通过引用整体并入本文中，如同全文在本文中示出一样。
背景技术
细胞扩增系统(CES)可用于扩增多种细胞类型并且使多种细胞类型分化，这些细胞类型可用于研究和治疗目的。作为一个实例，T细胞疗法(例如自体T细胞疗法)是用于治疗很多疾病的新兴技术。经基因工程处理过且经离体扩增的T细胞例如可示出有希望治疗一些白血病(例如B细胞)和其它癌症。目前，T细胞的扩增可在袋状系统，或不完全自动化且还未功能性封闭的系统中进行。
鉴于这些和其它考虑，进行了实施方式。但是，上面讨论的相对具体的问题不限制本公开的实施方式的适用性。
发明内容
本公开提供了简要描述，来以特定形式引入一些实施方式的各方面，这并不旨于确定关键或必要元素，也不旨于限制权利要求书的范围。
实施方式涉及细胞扩增系统(CES)和使细胞扩增系统的生物反应器中的细胞生长的方法。实施方式提供了用于使生物反应器，如中空纤维生物反应器，中的细胞扩增的方法。实施方式可提供将细胞(例如T细胞)引入到中空纤维生物反应器中，其中所述中空纤维生物反应器包括多个中空纤维。实施方式可提供将第一多个细胞暴露于激活剂，以激活在所述中空纤维生物反应器中的细胞的扩增。在实施方式中，所述激活剂可以是细胞、经固定的抗原(例如固定在珠子上)或可溶性抗原。在将细胞暴露于所述激活剂之后，细胞可扩增，以生成第二经扩增的多个细胞。然后，可从生物反应器中移出所述第二经扩增的多个细胞。
其它实施方式提供了用于扩增细胞的细胞扩增系统。在实施方式中，所述系统包括中空纤维生物反应器，所述中空纤维生物反应器包括具有至少相对端部的第一流体流动路径，其中所述第一流体流动路径的第一相对端部与所述中空纤维生物反应器的第一端口流体相连，并且所述第一流体流动路径的第二端部与所述中空纤维生物反应器的第二端口流体相连，其中所述第一流体流动路径包括所述中空纤维生物反应器的毛细管内部。与所述第一流体流动路径流体相连的流体输入路径可用于将多个细胞引入到所述第一流体流动路径。实施方式可进一步包括用于使流体在所述第一流体流动路径中循环的泵。
系统可包括用于执行指令的处理器，以便在所述处理器执行指令时，进行包括以下步骤的方法：将含第一多个细胞的第一流体引入到所述中空纤维生物反应器的毛细管内部中，所述第一多个细胞包含白细胞。所述处理器可进一步执行指令，该指令用于将所述第一多个细胞暴露于毛细管内部中的第一激活剂，以激活所述中空纤维生物反应器中的细胞的扩增。所述处理器可执行指令，该指令用于将含培养基的第二流体引入到所述毛细管内部，以使所述第一多个细胞的至少一部分扩增，并且生成第二经扩增的多个细胞。所述处理器可执行指令，该指令用于从所述生物反应器移出所述第二经扩增的多个细胞。
附图说明
参照下列附图，描述了非限制性和非详尽的实施方式。
图1描绘了根据实施方式的中空纤维生物反应器的透视图。
图2示出了根据实施方式的具有预安装的流体输送装置的细胞扩增系统的透视图。
图3描绘了根据实施方式的细胞扩增系统的壳体的透视图。
图4示出了根据实施方式的预安装的流体输送装置的透视图。
图5描绘了根据实施方式的细胞扩增系统的简图。
图6示出了细胞扩增系统的另一实施方式的简图。
图7示出了根据实施方式的用于扩增细胞的程序的流程图。
图8示出了可用于实施实施方式的计算系统的组件。
图9示出了根据实施方式，示出在培养期间的多个时间点处的总细胞计数的柱状图。
图10示出了根据实施方式，示出在培养期间的多个时间处的细胞存活率的柱状图。
图11示出了根据实施方式，示出对于经纯化的和未经纯化的初始细胞加载的树突细胞计数的柱状图。
图12示出了根据实施方式，示出在培养期间的多个时间点处(且使用多种初始细胞加载纯度)的总细胞计数的柱状图。
图13示出了根据实施方式，示出在培养期间的多个时间点处(且使用多种初始细胞加载纯度)的细胞存活率的柱状图。
图14示出了根据实施方式，示出细胞表型分布的柱状图。
图15示出了根据实施方式，对比了多种细胞因子组合和递送方法的柱状图。
图16示出了根据实施方式，示出在不同循环速率和反应器移动的情况下的细胞存活率的柱状图。
图17示出了根据实施方式，示出在以不同细胞因子组合进行培养期间的多个时间点处收获的总细胞的柱状图。
图18示出了根据实施方式，示出使用不同激活剂的细胞产量的柱状图。
图19示出了根据实施方式，示出使用不同激活剂的细胞表型的柱状图。
图20示出了根据实施方式，示出细胞因子产生的柱状图。
图21示出了根据另一实施方式，示出细胞因子产生的柱状图。
具体实施方式
通过参考下面的详细描述和在附图中描绘的实施方式，可以进一步理解本公开的原理。应理解，尽管下文相对于具体实施方式示出和描述了特定的特征，但本公开并不局限于下文描述的实施方式。
现在将详细参考附图示出的和下文描述的实施方式。在附图和说明书中尽可能使用相同的附图标记来表示相同或相似的部件。
参照图1，示出了可用于本公开的中空纤维生物反应器100的实例的正面立视图。中空纤维生物反应器100具有纵轴线LA-LA，且包括腔室壳体104。在至少一个实施方式中，腔室壳体104包括四个开口或端口：IC入口108、IC出口120、EC入口128和EC出口132。
根据本公开的实施方式，第一循环路径中的流体通过位于中空纤维生物反应器100的第一纵向末端112的IC入口108进入中空纤维生物反应器100，进入且穿过多个中空纤维116的毛细管内侧(在多个实施方式中被称为中空纤维膜的毛细管内(“IC”)侧或“IC空间”)，且通过位于中空纤维生物反应器100的第二纵向末端124的IC出口120流出中空纤维生物反应器100。IC入口108和IC出口120之间的流体路径界定了中空纤维生物反应器100的IC部126。第二循环路径中的流体通过EC入口128流入中空纤维生物反应器100，与中空纤维116的毛细管外侧或外部(被称为膜的“EC侧”或“EC空间”)接触，且经由EC出口132离开中空纤维生物反应器100。EC入口128和EC出口132之间的流体路径包括中空纤维生物反应器100的EC部136。经由EC入口128进入中空纤维生物反应器100的流体可与中空纤维116的外部接触。小分子(例如离子、水、氧、乳酸盐等)可穿过中空纤维116从中空纤维的内部或IC空间扩散至外部或EC空间，或从EC空间扩散至IC空间。大分子量的分子，如生长因子，通常太大而不能穿过中空纤维膜，从而留在中空纤维116的IC空间中。在实施方式中，可根据需要更换培养基。培养基也可循环穿过氧合器或气体转移模件，以根据需要交换气体(参见例如细胞扩增系统500(图5)和600(图6))。如下文所述，细胞可被包含在第一循环路径和/或第二循环路径内，并且根据实施方式，细胞可处于膜的IC侧和/或EC侧。
用于制作中空纤维膜的材料可以是能制成中空纤维的任意生物相容性聚合材料。根据本公开的实施方式，可使用的一种材料是合成的聚砜类材料。为了使细胞附着至中空纤维的表面，该表面可以某些方式，通过使用蛋白如纤连蛋白或胶原蛋白至少涂敷细胞生长表面，或通过将表面暴露于辐射进行改性。伽马处理膜表面允许贴壁细胞的附着，且不需要额外使用纤连蛋白等来涂敷膜。由经伽马处理的膜制成的生物反应器可重复使用。根据本公开的实施方式，可使用用于细胞附着的其它涂层和/或处理。
转向图2，示出了根据本公开的实施方式的具有预安装的流体输送组合件的细胞扩增系统200。CES 200包括细胞扩增仪202，其中细胞扩增仪202包括用于与细胞扩增仪202的后部206接合的舱口(hatch)或可关闭的门204。细胞扩增仪202的内部空间208包括适于接收和接合预安装的流体输送组合件210的特征，其中预安装的流体输送组合件210包括生物反应器100。预安装的流体输送组合件210可拆卸地附接到细胞扩增仪202，以便于使用在细胞扩增仪202处的新的或未使用的预安装的流体输送组合件210相对快速地更换同一细胞扩增仪202处的使用过的预安装的流体输送组合件210。单个细胞扩增仪202可经操作以使用第一预安装的流体输送组合件210来生长或扩增第一组细胞，之后可用于使用第二预安装的流体输送组合件210来生长或扩增第二组细胞，而不需要在将第一预安装的流体输送组合件210更换为第二预安装的流体输送组合件210之间进行消毒。预安装的流体输送组合件包括生物反应器100和氧合器或气体转移模件212。根据实施方式，管道引导槽示为214，其用于接收与预安装的流体输送组合件210连接的各培养基管道。
接下来，图3示出了根据本公开的实施方式，在可拆卸地附接预安装的流体输送组件210(图2)之前的细胞扩增仪202的后部206。图3中省略了可关闭的门204(图2中所示)。细胞扩增仪202的后部206包括用于与预安装的流体输送组合件210的元件组合工作的若干不同的结构。更具体地，细胞扩增仪202的后部206包括用于与预安装的流体输送组合件210上的泵回路配合的多个蠕动泵，包括IC循环泵218、EC循环泵220、IC输入泵222以及EC输入泵224。此外，细胞扩增仪202的后部206包括多个阀，包括IC循环阀226、试剂阀228、IC培养基阀230、排气阀232、细胞输入阀234、清洗阀236、分配阀238、EC培养基阀240、IC废液阀242、EC废液阀244和收获阀246。几个传感器也与细胞扩增机202的后部206相关联，包括IC输出压力传感器248、组合IC输入压力和温度传感器250、组合EC输入压力和温度传感器252以及EC输出压力传感器254。还示出了用于排气腔室的光学传感器256。
根据实施方式，图3示出了用于使生物反应器100旋转的轴或摇杆控件258。与轴或摇杆控件258关联的轴配件260能使轴接入孔与细胞扩增仪202的后部206适当对准，其中轴接入孔参见例如管道组织器的424(图4)，参见例如预安装的输送组合件210或400的300(图4)。轴或摇杆控件258的旋转将旋转运动传递给轴配件260和生物反应器100。因此，当CES200的操作者或使用者将新的或未使用的预安装的流体输送组合件400(图4)附接到细胞扩增仪202时，对准是适当确定预安装流体输送组合件210或400的轴接入孔424(图4)与轴配件260的方向的相对简单的事情。
转向图4，示出了可拆卸附接的预安装的流体输送组合件400的透视图。预安装的流体输送组合件400可拆卸地附接到细胞扩增仪202，以便于使用细胞扩增仪202处的新的或未使用的预安装的流体输送组合件400相对快速地更换同一细胞扩增机202处的使用过的预安装的流体输送组合件400。如图4所示，生物反应器100可附接到包括轴配件402的生物反应器联接件。轴配件402包括一个或多个轴紧固机构，例如用于接合轴，如细胞扩增仪202的258(图3中所示)，的斜臂或弹簧构件404。
在实施方式中，轴配件402和弹簧构件404连接至使生物反应器100旋转的细胞扩增系统的机构。例如，在一些实施方式中，细胞扩增系统可以是由Lakewood公司的TerumoBCT,Inc.制造的
Figure BDA0003353827660000071
细胞扩增系统(CES)的一部分，其使生物反应器旋转。使生物反应器旋转的细胞扩增系统的实例至少如下专利所述：于2013年3月19日递交的名称为“细胞扩增系统的细胞生长腔室的旋转系统及其使用方法(ROTATION SYSTEM FOR CELLGROWTH CHAMBER OF A CELL EXPANSION SYSTEM AND METHOD OF USE THEREFOR)”的美国专利第8,399,245号；于2013年2月13日递交的名称为“细胞扩增系统的细胞生长腔室的旋转系统及其使用方法(ROTATION SYSTEM FOR CELL GROWTH CHAMBER OF A CELLEXPANSION SYSTEM AND METHOD OF USE THEREFOR)”的美国专利第8,809,043号；以及于2015年6月16日递交的名称为“将细胞加载和分布在细胞扩增系统的生物反应器中的方法(METHOD OF LOADING AND DISTRIBUTING CELLS IN A BIOREACTOR OF A CELL EXPANSIONSYSTEM)”的美国专利第9,057,045号，这三篇专利通过引用整体并入本文中，如同全文在本文中示出一样。
根据实施方式，预安装的流体输送组合件400包括管道408A、408B、408C、408D、408E等，以及提供如下所述的图5至图9中示出的流体路径的各管道配件。还可为泵提供泵回路406A、406B和406C。在实施方式中，尽管可在细胞扩增仪202所在的位置设置各种培养基，但根据实施方式，预安装的流体输送组合件400可包括足够的管道长度以延伸到细胞扩增仪202的外部，并能够焊接至与培养基袋关联的管道。
图5示出了细胞扩增系统500的实施方式的简图，图6示出了细胞扩增系统600的另一实施方式的简图。在图5和图6所示的实施方式中，且如下所述，细胞生长在IC空间中。然而，本公开不局限于这些实施例，在其它实施方式中可提供要在EC空间中生长的细胞。
根据实施方式，图5示出了CES 500，其包括第一流体循环路径502(也称为“毛细管内回路”或“IC回路”)和第二流体循环路径504(也称为“毛细血管外回路”或“EC回路”)。第一流体流动路径506可与中空纤维生物反应器501流体相连，以至少部分地形成第一流体循环路径502。流体通过IC入口501A流入中空纤维生物反应器501，流过中空纤维生物反应器501中的中空纤维，并经由IC出口501B离开。压力计510测量离开中空纤维生物反应器501的培养基的压力。培养基流过可用于控制培养基流动速率/流体循环速率的IC循环泵512。IC循环泵512可沿第一方向(例如顺时针方向)或与第一方向相反的第二方向(例如逆时针方向)泵送流体。出口501B可用作反方向的入口。然后，进入IC回路502的培养基可穿过阀514进入。如本领域技术人员应理解的，额外的阀和/或其它装置可放置于各位置，以沿流体路径的多个部分分离培养基和/或测量培养基的特征。相应地，应理解所示简图表示CES 500的各元件的一种可能的配置，对所示简图的修改在一个或多个本公开的实施方式的范围内。
对于IC回路502，可在操作期间从样本口516或样本圈518获得培养基的样本。设置在第一流体循环路径502中的压力/温度计520允许在操作期间检测培养基的压力和温度。然后，培养基返回到IC入口501A以完成流体循环路径502。在中空纤维生物反应器501中生长/扩增的细胞可从中空纤维生物反应器501中冲洗出来，穿过阀598进入收获袋599中，或者在中空纤维内重新分布以进一步生长。下文将对此进行更详细地描述。
第二流体循环路径504中的流体经由EC入口501C进入中空纤维生物反应器501，并且经由EC出口501D离开中空纤维生物反应器501。EC回路504中的培养基可与中空纤维生物反应器501中的中空纤维的外部接触，从而能使小分子扩散进入和离开中空纤维。
设置在第二流体循环路径504中的压力/温度计524允许在培养基进入中空纤维生物反应器501的EC空间之前测量培养基的压力和温度。压力计526允许在第二流体循环路径504中的培养基离开中空纤维生物反应器501之后测量其压力。对于EC回路，可在操作期间从样本口530或样本圈获得培养基的样本。
在实施方式中，在离开中空纤维生物反应器501的EC出口501D之后，第二流体循环路径504中的流体穿过EC循环泵528到达氧合器或气体转移模件532。EC循环泵528还可沿相反的方向泵送流体。第二流体流动路径522可经由氧合器入口534和氧合器出口536与氧合器或气体转移模件532流体相连。在操作中，流体培养基经由氧合器入口534流入氧合器或气体转移模件532，并且经由氧合器出口536离开氧合器或气体转移模件532。氧合器或气体转移模件532向CES 500中的培养基添加氧，并从中除去气泡。在各实施方式中，第二流体循环路径504中的培养基可与进入氧合器或气体转移模件532的气体处于平衡状态。氧合器或气体转移模件532可是任何适当尺寸的氧合器或气体转移装置。空气或气体经由过滤器538流入氧合器或气体转移模件532，并通过过滤器540流出氧合器或气体转移装置532。过滤器538和过滤器540减少或防止氧合器或气体传递模件532和相关的培养基发生污染。在准备顺序部分中，从CES 500清除的空气或气体可经由氧合器或气体传递模件532排放到大气中。
在CES 500所描绘的配置中，第一流体循环路径502和第二流体循环路径504中的流体培养基以相同方向(并流配置)流过中空纤维生物反应器501。CES 500还可被配置为以逆流形式流动。
根据至少一个实施方式，含细胞(来自袋562)的培养基和来自袋546的流体培养基可经由第一流体流动路径506被引入到第一流体循环路径502中。流体容器562(例如，用于将空气引出系统的细胞输入袋或盐水准备流体)可经由阀564与第一流体流动路径506和第一流体循环路径502流体相连。
流体容器或培养基袋，544(例如，试剂)和546(例如，IC培养基)可分别经由阀548和阀550与第一流体输入路径542流体相连，或经由阀548、阀550和阀570与第二流体输入路径574流体相连。还提供了第一和第二无菌可密封的输入准备路径508和509。排气腔室(ARC)556可与第一循环路径502流体相连。排气腔室556可包括一个或多个超声波传感器，包括上传感器和下传感器，以在排气腔室556内某些测量位置处检测空气，流体缺乏，和/或气体/流体界面，例如空气/流体界面。例如，超声波传感器可用于排气腔室556的底部附近和/或顶部附近，以检测这些位置的空气、流体和/或空气/流体界面。在不脱离本公开的精神和范围的情况下，实施方式使用了许多其它类型的传感器。例如，光学传感器可用于本公开的实施方式中。在准备事件部分或其它方案期间，从CES 500清除的空气或气体可经由可与排气腔室556流体相连的管线558从空气阀560排放到大气中。
可将EC培养基(例如，来自袋568)或清洗溶液(例如，来自袋566)添加到第一流体流动路径或第二流体流动路径中。流体容器566可与阀570流体相连，阀570可经由分配阀572和第一流体输入路径542与第一流体循环路径502流体相连。或者，通过打开阀570且关闭分配阀572，流体容器566可经由第二流体输入路径574和EC输入路径584与第二流体循环路径504流体相连。同样，流体容器568可与阀576流体相连，阀576可经由第一流体输入路径542和分配阀572与第一流体循环路径502流体相连。或者，通过打开阀576且关闭分配阀572，流体容器568可与第二流体输入路径574流体相连。可设置可选的热交换器552，用于培养基试剂或洗涤溶液的引入。
在IC回路中，流体最初可由IC输入泵554推进。在EC回路中，流体最初可由EC输入泵578推进。空气检测器580，例如超声波传感器，也可与EC输入路径584相连。
在至少一个实施方式中，第一流体循环路径502和第二流体循环路径504连接到废物管线588。当阀590打开时，IC培养基可流过废物管线588并流到废物或输出袋586。同样，当阀582打开时，EC培养基可流过废物管线588流到废物或输出袋586。
在实施方式中，可经由细胞收获路径596收获细胞。此时，来自中空纤维生物反应器501的细胞可通过将含细胞的IC培养基经细胞收获路径596和阀598泵送到细胞收获袋599中来进行收获。
CES 500的各组件可被包含或容纳在诸如细胞扩增仪202(图2和图3)的仪器或壳体内，其中所述仪器例如将细胞和培养基保持在预定温度下。
转向图6，其示出了细胞扩增系统600的另一个实施方式的简图。CES 600包括第一流体循环路径602(也称为“毛细管内回路”或“IC回路”)和第二流体循环路径604(也称为“毛细血管外回路”或“EC回路”)。第一流体流动路径606可与中空纤维生物反应器601流体相连以形成第一流体循环路径602。流体通过IC入口601A流入中空纤维生物反应器601，穿过中空纤维生物反应器601中的中空纤维，并经由IC出口601B离开。压力传感器610测量离开中空纤维生物反应器601的培养基的压力。除了压力之外，在实施方式中，传感器610还可以是在操作期间检测培养基压力和温度的温度传感器。
培养基流过可用于控制培养基流动速率或循环速率的IC循环泵612。IC循环泵612可沿第一方向(例如逆时针方向)或与第一方向相反的第二方向(例如顺时针方向)泵送流体。出口601B可用作反向的入口。进入IC回路的培养基可通过阀614进入。如本领域技术人员应理解的，额外的阀和/或其它装置可放置于不同位置，以沿流体路径的多个部分分离培养基和/或测量培养基的特征。可在操作期间从样本圈618获得培养基的样本。然后培养基返回到IC入口601A以完成流体循环路径602。
在中空纤维生物反应器601中生长/扩增的细胞可从中空纤维生物反应器601中冲洗出来，通过阀698和管线697进入收获袋699中。或者，当阀698关闭时，细胞可在中空纤维生物反应器601内重新分布以进一步生长。应当理解，所示简图表示CES 600的各元件的一种可能的配置，对所示简图的修改在本公开的一个或多个实施方式的范围内。
第二流体循环路径604中的流体经由EC入口601C进入中空纤维生物反应器601，并且经由EC出口601D离开中空纤维生物反应器601。根据实施方式，EC回路中的培养基可与中空纤维生物反应器601中的中空纤维的外部接触，从而允许小分子扩散进入和离开可在腔室601内的中空纤维。
设置在第二流体循环路径604中的压力/温度传感器624允许在培养基进入中空纤维生物反应器601的EC空间之前测量培养基的压力和温度。传感器626允许在第二流体循环路径604中的培养基离开中空纤维生物反应器601之后测量其压力和/或温度。对于EC回路，可在操作期间从样本口630或样本圈获得培养基的样本。
在离开中空纤维生物反应器601的EC出口601D之后，第二流体循环路径604中的流体通过EC循环泵628到达氧合器或气体转移模件632。根据实施方式，EC循环泵628还可在相反的方向上泵送流体。第二流体流动路径622可经由氧合器或气体转移模件632的入口632A和出口632B与氧合器或气体转移模件632流体相连。在操作时，流体培养基经由入口632A流入氧合器或气体转移模件632，并且经由出口632B离开氧合器或气体转移模件632。氧合器或气体转移模件632向CES 600中的培养基添加氧，且从中除去气泡。
在各实施方式中，第二流体循环路径604中的培养基可与进入氧合器或气体转移模件632的气体处于平衡状态。氧合器或气体转移模件632可以是对氧合或气体转移有用的任何适当大小的装置。空气或气体经由过滤器638流入氧合器或气体转移模件632，并通过过滤器640流出氧合器或气体转移装置632。过滤器638和过滤器640减少或防止对氧合器或气体传递模件632和相关培养基的污染。在准备事件部分期间，从CES 600清除的空气或气体可经由氧合器或气体传递模件632排放到大气中。
在CES 600所描绘的配置中，第一流体循环路径602和第二流体循环路径604中的流体培养基以相同方向(并流配置)流过中空纤维生物反应器601。CES 600还可被配置为以逆流形式流动。
根据至少一个实施方式，含细胞(来自例如细胞容器(例如袋子)的来源)的培养基可附接在附接点662处，并且来自培养基源的流体培养基可附接在附接点646处。细胞和培养基可以经由第一流体流动路径606被引入到第一流体循环路径602中。附接点662可经由阀664与第一流体流动路径606流体相连，并且附接点646可经由阀650与第一流体流动路径606流体相连。试剂源可流体关联到点644，并且经由阀648与流体输入路径642相连，或经由阀648和阀672与第二流体输入路径674相连。
排气腔室(ARC)656可与第一循环路径602流体相连。排气腔室656可包括一个或多个传感器，包括上传感器和下传感器，以检测在排气腔室656内某些测量位置处的空气，流体缺乏，和/或气体/流体界面，例如空气/流体界面。例如，超声波传感器可用在排气腔室656的底部附近和/或顶部附近，以检测这些位置处的空气，流体，和/或空气/流体界面。在不脱离本公开的精神和范围情况下，实施方式使用了许多其它类型的传感器。例如，光学传感器可用于根据本公开的实施方式中。在准备事件部分或其它方案期间从CES 600清除的空气或气体可经由可与排气腔室656流体相连的管线658，从空气阀660排放到大气中。
EC培养基源可附接到EC培养基附接点668，清洗溶液源可附接到清洗溶液附接点666，以将EC培养基和/或清洗溶液添加到第一流体流动路径或第二流体流动路径中。附接点666可与阀670流体相连，阀670可经由阀672和第一流体输入路径642与第一流体循环路径602流体相连。或者，通过打开阀670且关闭阀672，附接点666可经由第二流体输入路径674和第二流体流动路径684与第二流体循环路径604流体相连。同样，附接点668可与阀676流体相连，阀676可经由第一流体输入路径642和阀672与第一流体循环路径602流体相连。或者，通过打开阀676且关闭分配阀672，流体容器668可与第二流体输入路径674流体相连。
在IC回路中，流体最初可由IC输入泵654推进。在EC回路中，流体最初可由EC输入泵678推进。空气检测器680，例如超声波传感器，也可与EC输入路径684相连。
在至少一个实施方式中，第一流体循环路径602和第二流体循环路径604连接到废物管线688。当阀690打开时，IC培养基可流过废物管线688并流到废物或输出袋686。同样，当阀692打开时，EC培养基可流到废物或输出袋686。
细胞在中空纤维生物反应器601中生长后，可经由细胞收获路径697进行收获。此时，来自中空纤维生物反应器601的细胞可通过打开阀698，将含细胞的IC培养基经细胞收获路径697泵送到细胞收获袋699中来进行收获。
CES 600的各组件可被包含或容纳在诸如细胞扩增仪202(图2和图3)的仪器或壳体内，其中，所述仪器将细胞和培养基保持在预定温度下。在实施方式中，还应注意，可组合CES 600和CES 500(图5)的组件。在其它实施方式中，CES可包括比图5和图6所示更少的或额外的组件，且其仍然在本公开的范围内。在实施方式中，CES 500和CES 600的多个部分可由Lakewood公司的Terumo BCT,Inc.制造的
Figure BDA0003353827660000141
细胞扩增系统(CES)的一个或多个特征来实施。
在使用CES 600的一个具体实施方式中，T细胞可在CES 600的实施方式中扩增。在该实施方式中，可使用白细胞去除术收集的T细胞可被引入到生物反应器601中。T细胞可被引入到生物反应器601，且进入路径602中。
在一些实施方式中，可在引入生物反应器601之前对T细胞进行纯化。纯化程序可涉及使用离心和/或纯化柱。纯化程序的一些实例包括使用Bergisch Gladbach(德国)的Miltenyi Biotec的珠子(例如功能化珠子)和/或LS柱。
但是，在一个实施方式中，可在白细胞去除术收集之后，不进行任何额外的纯化的情况下，将T细胞直接添加至生物反应器601中。在一些实施方式中，相信通过将一些其它细胞与T细胞一起引入到生物反应器中，能提高T细胞的生长。因此，可不对T细胞进行纯化，而将T细胞与一些残留的红细胞、血小板粒细胞和/或其它白细胞一起添加到生物反应器中。在一个实施方式中，添加未经纯化的T细胞可引起大部分T细胞扩增，以便在扩增之后从生物反应器移出的大于约90％、大于约95％、大于约98％或甚至大于约99％的细胞包含T细胞和残留的细胞，其中残留的细胞包括红细胞、血小板、粒细胞、其它白细胞和/或其组合。在一个实施方式中，添加未经纯化的T细胞可导致大部分T细胞扩增，以便在扩增之后从生物反应器移出小于约100％、小于约99％、小于约98％、小于约97％、小于约96％、小于约95％、小于约94％、小于约93％、小于约92％、小于约91％或甚至小于约90％的细胞包含T细胞。
应注意，在一些实施方式中，在准备步骤之后，可将T细胞添加到生物反应器601中。可以理解的是，一些T细胞不贴壁，因此可以不需要使它们附着至生物反应器601的中空纤维壁上来扩增/增殖。在这些实施方式中，可以没有必要使用涂层，例如纤连蛋白，涂敷中空纤维的内侧来促进贴壁。在这些实施方式中，可在没有生物反应器涂敷步骤的情况下，在准备步骤之后，将(经纯化的或未经纯化的)T细胞引入到生物反应器601中。
一旦在生物反应器601中，细胞就可暴露于激活细胞增殖的激活剂。在一个实施例中，之前可能已经在生物反应器601中生长/引入了抗原递呈细胞。在一个具体实施方式中，来源于单核细胞的树突细胞可以在添加T细胞之前生长在生物反应器601中。在一些实施方式中，抗原递呈细胞的使用可涉及在为抗原递呈细胞增殖所优化的条件下初始进行的生长过程。
在其它实施方式中，可将经抗体功能化的珠子添加至生物反应器601。在其它实施方式中，在将细胞引入生物反应器中之前，可将珠子添加至含细胞的容器，例如具有T细胞的袋子。抗原可以激活T细胞的增殖。可用的珠子的一个实例包括可获自马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific的DYNABEADS珠。一些实施方式中的珠子可在其表面上经抗体功能化，该抗体的一些非限制性实例包括：抗CD2、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD28和抗CD34。
在其它实施方式中，激活剂可以为流体形式，例如为溶液形式。含激活剂的流体可包括一种或多种激活剂，例如抗原。除抗原之外，流体还可包括其它组分，一些非限制性实例包括蛋白、表面活性剂、试剂、缓冲剂等。含可溶性共刺激信号的流体的一个实例是IMMUNOCULTTM人CD3/CD28 T细胞激活剂(STEMCELL Technologies Inc.,加拿大)。
在细胞暴露于激活剂之后(和在持续暴露期间)，细胞可在生物反应器601中扩增。在扩增期间，可存在可以向生物反应器601添加或从生物反应器601移出的一些材料。作为一个实例，可使用细胞因子来刺激T细胞的增殖。在一些实施方式中，可使用单一细胞因子，一些非限制性实例包括白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素1(IL-7)、白介素15(IL-15)及它们的组合。在其它实施方式中，IL2可单独使用或与IL-7一起使用。IL-7可单独使用或与IL-15一起使用。在其它实施方式中，IL-2可与IL-15一起使用。在又一实施方式中，IL-2、IL-7和IL-15可一起使用。在一些实施方式中，当使用多于一种细胞因子时，细胞因子可单独、同时、在不同时间添加，或者可以组合并以组合的形式添加。
应注意，一些实施方式可提供例如通过开口618，将细胞因子更直接地添加到生物反应器601中。而在其它实施方式中，可例如通过路径606，将细胞因子添加到位置中，以便细胞因子可以更缓慢地灌注到生物反应器601中。相信在一些实施方式中，允许细胞因子灌注到生物反应器601中可提高T细胞的生长。
除刺激T细胞之外，还可例如通过添加可含一些营养物的培养基来培养细胞。在一些实施方式中，所述培养基可以是市售的培养基。例如，在一个实施方式中，用于培养T细胞的培养基可以是获自德国Bergisch Gladbach的Miltenyi Biotec的TexMACS培养基的版本(所制造的流体经改进或未经改进)。在其它实施方式中，培养基可以是获自德国Freiburg的Cellgenix的CELLGRO培养基的版本(所制造的流体经改进或未经改进)。培养基可经添加其它材料来进行改进，一些非限制性实例包括盐、血清、蛋白等。
作为T细胞扩增的一部分，其它条件例如温度、pH、氧浓度、二氧化碳浓度、废物浓度、代谢物浓度等也可在生物反应器601中进行控制。在一些实施方式中，EC侧例如路径604的流速可用于控制各种参数。例如，如果希望降低细胞在其中生长的IC侧的废物或代谢物浓度，可增加EC侧上的流速，以确保通过穿过中空纤维从IC侧至EC侧的移动从IC侧去除废物和/或代谢物。
在T细胞已经扩增之后，可从生物反应器601中移出细胞。可将T细胞收集在容器699中。
在一些实施方式中，CES 600的使用可提供(在T细胞生长方面)胜过传统程序的优点。例如，中空纤维的使用允许细胞与细胞的紧密交流，这可提高T细胞的激活和刺激以起始和保持增殖。另外，中空纤维生物反应器，例如生物反应器601的使用可为T细胞生长提供巨大的表面积，这可产生更高浓度或更高体积的T细胞。
进一步地，生物反应器601中的条件可受到CES 600的若干不同组件的控制，包括IC流速和EC流速。另外，CES 600提供了添加细胞因子的不同位置，这允许使细胞因子更直接或间接例如灌注到生物反应器601中。
此外，CES 600提供了封闭的系统。也就是说，T细胞生长的步骤可在不直接暴露于周围环境的情况下进行，而周围环境可能使T细胞污染，或者被用于T细胞生长的T细胞或材料污染。还相信一些实施方式可提供使用比其它方法/系统小的起始浓度的T细胞来进行扩增。在这些实施方式中，T细胞还可经扩增以得到比其它方法/系统大的产量。
还相信一些实施方式可提供缩短有效量(effective dose)的T细胞的生长时间。相信又一实施方式提供了T细胞生长，同时利用了比其它方法/系统少的材料，例如细胞因子(其可能是昂贵的)。
图7示出了可在实施方式中实施使细胞生长的流程700。尽管下文描述了以流程700实施步骤的具体装置，但实施方式并不局限于此。例如，一些步骤可能被描述为由细胞扩增系统或处理器的部件来实施，其中细胞扩增系统或处理器可基于作为处理器可执行指令提供的软件来执行步骤。这仅是为了说明的目的，流程700不局限于由任意特定的装置来实施。
流程700起始于步骤704，继续进行至可选步骤708，可在可选步骤708处收集细胞。作为一个实例，步骤708可涉及单采程序(apheresis process)。在一个具体实施方式中，白细胞去除术作为步骤708的一部分来进行。能收集细胞的一种装置包括科罗拉多州莱克伍德(Lakewood)的Terumo BCT公司的
Figure BDA0003353827660000171
光谱单采系统(
Figure BDA0003353827660000172
Spectra ApheresisSystem)。
流程700从步骤708转到步骤712，细胞可在步骤712处被引入细胞扩增系统，尤其是细胞扩增系统的生物反应器中。如上所述，在一些实施方式中，流程700可在步骤712处开始。在实施方式中，生物反应器可为中空纤维生物反应器，例如生物反应器100(图1)。在这些实施方式中，步骤712可涉及使细胞流入一个或多个独立的中空纤维。步骤712可涉及使用处理器、泵、阀、流体通道等以将细胞引入生物反应器。在一个实施方式中，步骤712可涉及打开阀(例如564、514、664和/或614)和启动泵(例如554和654)。
在步骤712之后，流程700转到步骤716，细胞在步骤716处暴露于激活剂。可以理解的是某些细胞类型需要激活，例如在对其进行激活以增殖之前暴露于某些蛋白。这类细胞的一个实例包括T细胞。步骤716提供了将细胞暴露于可激活细胞以扩增或生长的任意必要的激活剂。
步骤716可涉及可作为步骤716的一部分或在步骤716之前实施的一些步骤。例如，在一些实施方式中，可实施步骤720以使抗原递呈细胞生长，抗原递呈细胞可递呈必要的激活剂以激活细胞的增殖。在一个实施方式中，步骤720可在步骤716之前或甚至在步骤708之前实施。在一个具体实施例中，可使抗原递呈细胞例如树突细胞生长。在这些实施方式中，步骤720可涉及一些步骤(例如收集单核细胞作为抗原递呈细胞的前体细胞)，这样使抗原递呈细胞存在于生物反应器中。可包括主要组织相容性复合体(MHC)的抗原递呈细胞的表面可包括抗原，当递呈至其它细胞例如T细胞时，该抗原可诱导细胞的增殖。
在其它实施方式中，步骤716可涉及步骤724，珠子可在步骤724处被添加至生物反应器。可以理解地是，在一些实施方式中，珠子例如磁珠、聚合物珠、玻璃珠或陶瓷珠可经改性，以在其表面上包含用于激活细胞增殖的特定激活剂。作为一个实例，磁珠可经一种或多种抗体功能化，一些非限制性实例包括抗CD2、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD28和抗CD34。在其它材料的存在下，当细胞暴露于抗体时，细胞可被激活而进行增殖。可适用于一些实施方式中的一些珠子包括马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific的
Figure BDA0003353827660000181
珠子。
在步骤716之后，流程可转到步骤728，细胞可在步骤728处扩增，即增殖。步骤728可涉及一些子步骤。例如，在子步骤732处，细胞可例如使用细胞因子进行刺激。该刺激可使细胞继续增殖。
在实施方式中，步骤728可在几小时、几天或甚至几周的时间段内发生。在该时间段内，各子步骤(例如732、736和/或740)可在该时间段的不同时间处实施。例如，在该时间段内，可将额外的物质，例如细胞因子如白介素灌注或直接注射到生物反应器中，以持续刺激细胞的增殖。可使用的细胞因子的一些非限制性实例包括白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素3(IL-3)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素6(IL-6)、白介素1(IL-7)、白介素1(IL-8)、白介素1(IL-9)、白介素10(IL-10)、白介素12(IL-12)、白介素13(IL-13)、白介素15(IL-15)、白介素17(IL-17)、白介素18(IL-18)、白介素23(IL-23)及它们的组合。细胞因子可单独使用或组合使用，例如在一个实施方式中，IL-7可与IL-15组合使用。在另一实施方式中，IL-2和IL-7可一起使用。在又一实施方式中，IL-2和IL-15可一起使用。
步骤728还可涉及培养细胞的步骤736。步骤736可涉及添加各营养物，包括葡萄糖、磷酸盐、盐等。步骤736在实施方式中可涉及检测营养物的浓度，并且响应于相对低的浓度读数，向生物反应器添加营养物。步骤736可涉及使用处理器、泵、阀、流体通道等添加营养物来培养细胞。或者，营养物例如葡萄糖的添加可基于预定的计划来添加。
步骤740可涉及控制生物反应器的生长环境。可以理解的是，除营养物之外，为细胞生长优化的环境可涉及许多不同的参数。例如，可作为步骤740的一部分监测和控制温度、pH、氧浓度、二氧化碳浓度、废物浓度、代谢物浓度等。在一个具体实施方式中，穿过生物反应器的毛细管外空间(EC)侧流动的流体流速可用于控制细胞在其中扩增的毛细管内空间中的pH、氧浓度、二氧化碳浓度、废物浓度、代谢物浓度等。
流程700从步骤740进行到步骤744，细胞在步骤744中从生物反应器中移出。步骤744可涉及许多子步骤。例如，可作为步骤744的一部分实施收获过程，其中收获过程自身包括许多步骤。在实施方式中，步骤744可涉及改变生物反应器的毛细管内空间(IC)和EC侧上的循环速率。在其它实施方式中，步骤744可涉及使各种材料循环，以确保从生物反应器中释放和移出自身可能已经附着至纤维内表面的任何细胞。作为一个实例，可添加蛋白酶来分解蛋白，例如可帮助细胞结合至纤维的糖蛋白。流程700在步骤752处终止。
对于在图7中示出的流程700，出于说明目的提供了所示的可选步骤，按照本公开的实施方式，这些可选步骤可以不同方式排列，组合到其它步骤中，与其它步骤并列使用等。在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可在实施方式中使用较少或额外的步骤。另外，在一些实施方式中可例如通过执行储存在内存(memory)中的预编程任务的处理器，自动实施步骤(和任意子步骤)，其中仅出于说明目的提供了这些步骤。
另外，应注意，尽管上文以特定顺序的各步骤描述了流程700，但本发明并不局限于此。在其它实施方式中，各步骤和子步骤可以与图7中示出的顺序不同的顺序，平行的，部分以图7中示出的顺序来实施，和/或以图7中示出的顺序来实施。另外，上文指示步骤或子步骤由特定特征或结构来实施的描述不旨在限制本发明。这些描述仅出于说明目的而提供。上文没有描述的其它结构或特征也可用于其它实施方式中，来实施流程700的一个或多个步骤。进一步地，流程700可包括一些可选步骤。但是，上文没有指出为可选的那些步骤不应被认为对于本发明来说是必需的，而是可在本发明的一些实施方式中实施，而在其它实施方式中不实施。
图8示出了计算系统800的组件，在计算系统800上可实施本公开的实施方式。计算系统800可用于实施方式中，如其中细胞扩增系统使用处理器来执行任务，例如作为程序如流程700和上文所示程序的一部分实施的自定义任务或预编程任务。
计算系统800可包括用户界面802、处理系统804和/或储存器(storage)806。如本领域技术人员所理解的，用户界面802可包括输出设备808和/或输入设备810。输出设备808可包括一个或多个触摸屏，其中，触摸屏可包括用于提供一个或多个应用窗口的显示区域。触摸屏还可以例如是可以从用户或操作者接收和/或捕获物理触摸事件的输入设备810。如本领域技术人员所理解的，触摸屏可包括具有电容结构的液晶显示器(LCD)，其能使处理系统804推断触摸事件的位置。然后处理系统804可将触摸事件的位置映射到呈现在应用窗口的预定位置中的用户界面(UI)元件。根据实施方式，触摸屏还可通过一个或多个其它电子结构接收触摸事件。其它输出设备808可包括打印机、扬声器等。如本领域技术人员所理解的，其它输入设备810可包括键盘、其它触摸输入设备、鼠标、语音输入设备等。
根据本公开的实施方式，处理系统804可包括处理单元812和/或内存814。处理单元812可以是可操作以执行存储在内存814中的指令的通用处理器。根据实施方式，处理单元812可包括单个处理器或多个处理器。此外，在实施方式中，每个处理器可以是具有一个或多个核以读取和执行独立指令的多核处理器。如本领域技术人员所理解的，处理器可包括通用处理器、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)、其它集成电路等。
根据实施方式，内存814可包括用于数据和/或处理器可执行指令的任何短期或长期存储器。如本领域技术人员所理解的，内存814可包括例如随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)或电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)。如本领域技术人员所理解的，其它存储介质可包括例如CD-ROM、磁带、数字多功能盘(DVD)或其它光存储设备、磁带、磁盘存储器、磁性带(magnetic tape)、其它磁存储设备等。
存储器806可是任何长期数据存储设备或组件。根据实施方式，存储器806可包括与内存814结合描述的一种或多种系统。存储器806可是永久的或可移除的。在实施方式中，存储器806存储由处理系统804生成或提供的数据。
实施例
下文描述了可实现实施方式的各方面的方法/程序/方案的一些实施例。尽管在这些实施例中可能描述了特定特征(细胞类型、细胞因子、抗原递呈者等)，但它们仅是出于说明和描述目的而提供的。本发明并不局限于下文提供的实施例。
实施例1
为了生成
Figure BDA0003353827660000211
细胞扩增系统(CES)对比的基线，遵循
Figure BDA0003353827660000212
和Greenberg(Nature Protocols Vol.9No.4,2014)(其通过引用整体并入本文)方案，使从白细胞去除术产物中淘选出的单核细胞成熟为树突细胞，并且(从白细胞去除术产物冷藏保存的)与供体匹配的T细胞组合。
将供体1的细胞培养23天(5天DC成熟，18天共培养)，以确定优选的培养期。观察细胞扩增，持续至细胞培养的第20天。如图9和图10所示，在第20天之后，细胞计数和存活率降低。
供体2用于确定优化的单核细胞的纯度和接种密度。将单核细胞直接从淘选程序的第5级份以约50％的纯度接种到六孔培养板上，在使用穿过两个LS柱(Miltenyi)的CD14微珠进行磁珠纯化后具有99％的纯度。两种细胞纯度条件均以10E+06细胞/mL的浓度起始接种，并且经连续稀释两倍降低至3.13E+05细胞/mL。观察到对于纯化的单核细胞来说优化接种密度为2.5E+06细胞/mL，对于未经纯化的细胞来说优化接种密度为1.25E+06细胞/mL(参见图11)。
在与T细胞共培养之前，通过置于适当条件来汇集来源于单核细胞的树突细胞。T细胞以4:1的比率与来源于单核细胞的树突细胞共培养，培养19天。与经纯化的单核细胞相比，观察到直接来自淘选程序的细胞在扩增T细胞方面即使没有更好也已经很好了(参见图12)。与第一位供体一样，细胞存活率可能随着细胞扩增开始趋向平稳而降低(参见图13)。
实施例2
T细胞通过两种策略在
Figure BDA0003353827660000221
CES中成功扩增：通过经抗体功能化的顺磁珠(DynaBeads T细胞激活剂)(Q1070)进行CD3和CD28的共刺激，和通过单核细胞来源的树突细胞(DC)(Q1069)进行抗原呈递，其是由原始白细胞去除术产物中存在的单核细胞成熟的专业的抗原呈递细胞(APC)。这两种方法都显示出在
Figure BDA0003353827660000222
CES中扩增T细胞培养物的初步前景(参见图14)。
为了验证概念，图15示出了在QUANTUM系统中扩增的细胞的表型分布。对于经DC和珠子刺激的扩增，在来自起始产物和在T175培养瓶中扩增的细胞中都观察到表型分布(CD4:CD8的比率)上的变化。不管刺激方法如何，该早期数据都暗示
Figure BDA0003353827660000223
CES有利于CD8T细胞的扩增。
下面的表1示出加载的细胞数量和从进行的概念验证收获的细胞数量。
表1：
Figure BDA0003353827660000224
CES中的T细胞扩增
Figure BDA0003353827660000225
Figure BDA0003353827660000231
实施例3
很多细胞因子帮助T细胞扩增，包括IL-2；以及IL-7与IL-15的组合。用于递送这些细胞因子的两种候选方法是弹丸式注射(bolus injection)和持续灌注预配制的含适当细胞因子浓度的培养基。为了进行直接对比，使用7组(arm)研究对此进行了测定，其中使用前述两种方法将IL-2单独；IL-7与IL-15一起；和所有三种细胞因子组合供应到
Figure BDA0003353827660000232
CES中。该研究的对照是没有细胞因子的单组。从该测定，观察到IL-7与IL-15一起灌注获得了更高的倍数扩增(参见图15)。图15示出了
Figure BDA0003353827660000233
CES运行的收获量，其将细胞因子组合和递送手段(delivery vehicle)进行了对比。
实施例4
我们下一步是研究在细胞扩增期间，提高IC循环速率和向生物反应器添加6度摇摆运动。我们发现培养环境的这些新条件对T细胞扩增具有不利影响(参见图16)。图16示出了柱状图，该柱状图示出对照(静态生物反应器；5ml/min循环)的收获量vs.提高的IC循环同时摇摆(+/-6度摇摆；20ml/min循环)的收获量的对比。
实施例5
使用补充有重组人白介素2改进序列(IL-2IS)(Miltenyi Biotec GmbH，德国)和重组人白介素7(IL-7)(Miltenyi Biotec GmbH，德国)的TexMACS GMP级培养基(MiltenyiBiotec GmbH，德国)来促进T细胞的扩增。使用结合共刺激信号
Figure BDA0003353827660000234
人T-激活剂CD3/CD28(Life Technologies,Grand Island,NY)或可溶性共刺激信号ImmunoCultTM人CD3/CD28 T细胞激活剂(STEMCELL Technologies Inc.，加拿大)，来起始T细胞的扩增。使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Lonza,瑞士)来准备
Figure BDA0003353827660000235
CES(Terumo BCT,Lakewood,CO)，以去除系统中的所有空气。遵循准备顺序，使用TexMACS GMP培养基来更换PBS。
使用
Figure BDA0003353827660000241
光谱单采系统(
Figure BDA0003353827660000242
Spectra Apheresis System，TerumoBCT,Lakewood,CO)，从单一供体(AllCells,LLC,Alameda,CA and HemaCare Corp,VanNuys,CA)获得新鲜的正常外周血白细胞去除术产物(LeukoPak)。当抵达实验室时，通过Vi-Cell XR细胞存活率分析仪(Beckman Coulter Inc,Brea,CA)确定细胞浓度和存活率，并且在Coulter Ac-T diff2(Beckman Coulter Inc,Brea,CA)血液分析仪上量化淋巴细胞的百分比。
将等份的来自白细胞去除术产物的1.0×108淋巴细胞以2:1细胞比珠子的比率与
Figure BDA0003353827660000243
组合，或以2.5μl/1.0×106淋巴细胞与1.0×105IU IL-2和2.5×103ng IL-7的浓度与ImmunoCultTM组合，并且在无菌储存瓶中的TexMACS GMP培养基中达到100mL的体积。然后，将细胞/细胞因子/刺激载剂溶液处理到Cell Inlet Bag(Terumo BCT,Lakewood,CO)中，并且通过培养基循环加载在生物反应器的IC侧上，以实现溶液在中空纤维间的均匀分布。
在细胞加载之后，TexMACS培养基在IC侧以1mL/min的速率循环，在EC侧以100mL/min的速率循环，同时在生物反应器的IC入口处以0.1mL/min的速率持续灌注含IL-2(200IU/mL)和IL-7(5ng/mL)的培养基。除了第3、6、9天之外，在扩增的前6天都使生物反应器取向静止在0°，其中在第3、6、9天，将150mL含IL-2和IL-7(
Figure BDA0003353827660000244
扩增)的培养基，或150mL含IL-2和IL-7和可溶性共刺激信号(ImmunoCultTM扩增)的培养基的弹丸式添加物以30mL/min的速率添加至生物反应器的IC侧，同时IC和EC循环被各自设置为100mL/min，且生物反应器处于从-90°至180°的持续摇动，其间有1秒停顿的运动。一旦弹丸式添加完成，就将生物反应器返回至静止的0°，并且输入和循环泵的设置也返回至扩增开始时所规定的数值。
从第6天开始，生物反应器每24小时在0°和180°之间翻动180°。弹丸式添加中的IL-2和IL-7的浓度在每次添加时都有变动，参见表2。在各弹丸式添加之后，当细胞处于均匀悬浮时，使用
Figure BDA0003353827660000245
II无菌管道焊接件(
Figure BDA0003353827660000246
II Sterile Tubing Welder，TerumoBCT,Lakewood,CO)切掉一部分IC样本回路。该样本用于检测扩增期间的细胞浓度、存活率、细胞表型和分泌的细胞因子。
表2：弹丸式添加的数值
Figure BDA0003353827660000251
在扩增的第7、10或12天，使用高密度冲刷(High Density Washout)自动化任务从
Figure BDA0003353827660000252
CES中收获细胞。为了便于该收获方法进行，培养基在生物反应器的IC侧上循环以100mL/min的速率循环五(5)分钟，同时生物反应器处于运动(从-90°至180°的持续摇动，其间有1秒停顿)中，以实现混合良好的细胞悬浮液。在培养基循环之后，将收获袋结合至废物管线上来取代废物袋。High Density Washout的任务设置被设置如下：IC输入＝200mL/min，EC循环＝300mL/min和终止条件＝1000mL。不含细胞因子的培养基用于该任务。在收获之后，通过流式细胞术测定细胞的存活率和绝对计数和表型特征。
细胞通过表达CD3而被表征为T细胞，通过分别表达CD4和CD8而表征了辅助性子集和细胞毒性子集。缀合PerPC-Cy5.5的CD3的UCHT1克隆(BD Biosciences,San Jose,CA)用于对样本中的表面和细胞内的CD3受体进行染色。缀合PE的CD4的SK3克隆(BDBiosciences,San Jose,CA)用于对样本中的表面CD4受体进行染色。缀合VioBright FITC的CD8的BW135/80克隆(Miltenyi Biotec GmbH,德国)用于对样本中的表面CD8受体进行染色。使用
Figure BDA0003353827660000253
780可固定的存活力染料(
Figure BDA0003353827660000254
780Fixable Viability Dye，eBioscience,San Diego,CA)，根据分析辨别出非存活的细胞。使用FIX&
Figure BDA0003353827660000255
细胞透化试剂盒(FIX&
Figure BDA0003353827660000256
Cell Permeabilization Kit，Life Technologies,Grand Island,NY)，对细胞进行表面和细胞内的染色。在FACSCanto II(BD Biosciences,San Jose,CA)上获得样本，并且使用FACSDiva软件v6.1.3(BD Biosciences,San Jose,CA)进行分析。FACSCanto II经BD FACSDiva CS&T Beads(BD Biosciences,San Jose,CA)校准，并且使用BD CompBeads(BD Biosciences,San Jose,CA)和ArCTM氨反应性补偿珠子试剂盒(ArCTMAmine Reactive Compensation Bead Kit，Life Technologies,Grand Island,NY)计算补偿。每个样本记录10000个事件。
在成熟期间从生物反应器的IC侧和EC侧定期采集样本，并且储存在-20℃。样本之后在室温融合，并且使用Th1/Th2/Th17 Human Magnetic 8-Plex Panel for LuminexTM测定(Life Technologies,Grand Island,NY)测定IL-2、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17和IFNγ。使用运行xPONENT(Luminex,Austin,TX)采集和分析软件的MAGPIX分析仪(Luminex,Austin,TX)，对该测定进行分析。
参见图17，在
Figure BDA0003353827660000261
CES中，与单独的IL-2相比，IL-7与IL-2结合使用示出显著提高了T细胞扩增。参见图18，示出在使用结合CD3和CD28共刺激抗体的珠子的
Figure BDA0003353827660000262
CES中的T细胞扩增优于我们实验中在
Figure BDA0003353827660000263
CES中的可溶性共刺激抗体。参见图19，在珠子结合的扩增中，7天之后的扩增产物均约95％的CD3+细胞，具有与大部分可溶性类扩增类似的百分比。参见下面的表3，对于所有供体来说，与配对的可溶性扩增相比，扩增后的细胞产物的存活率在珠子结合的扩增中均更好。在表3中，***表示由于系统污染，不能获得那些扩增的数据。**表示对相应的配对扩增进行的分析。参见图20和图21，所有实验的细胞因子分析都示出与Th1和细胞毒性子集相关的细胞因子增加，同时IL-9增加(已知IL-9刺激细胞增殖并且防止凋亡)，这归因为通过向培养基中添加IL-7刺激了IL-2受体家族。
从血液分离采集的级份中，
Figure BDA0003353827660000264
CES可使T细胞扩增超过500倍。自动化和功能化的封闭系统的制造程序控制可有助于减少T细胞成熟中所涉及的劳动和打开事件，这样可更有效地生产细胞产物。
表3：扩增数据
Figure BDA0003353827660000271
对于本领域技术人员来说显而易见的是，可在不偏离其范围的情况下，对本发明的方法和结构进行各种修改和变化。因此，应当理解本发明并不局限于所给出的特定实施例。本发明旨于涵盖在所附权利要求书及其等同物的范围内的修改和变化。
虽然已经例示和描述了本发明的示例性实施方式和应用，但应理解本发明不局限于上述精确的配置和来源。在不脱离本发明范围的情况下，可对本文公开的本发明的方法和系统的布置、操作和细节进行对本领域技术人员来说显而易见的各种修改、改变和变化。

Claims (20)

1.一种扩增细胞的方法，所述方法包括：
将含白细胞的第一多个细胞引入到中空纤维生物反应器中，其中，所述中空纤维生物反应器包括多个中空纤维；
将所述第一多个细胞暴露于激活剂，以激活在所述中空纤维生物反应器中的细胞的扩增；
使在所述生物反应器的多个中空纤维中的所述第一多个细胞的至少一部分扩增，以生成第二经扩增的多个细胞；以及
从所述生物反应器中移出所述第二经扩增的多个细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一多个细胞的一部分包含T细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，使用白细胞去除术生成所述第一多个细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，在没有额外纯化的情况下，将所述第一多个细胞添加到所述中空纤维生物反应器中。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述第一多个细胞包含红细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第一多个细胞包含血小板。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述第一多个细胞包含粒细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述暴露包括将所述第一多个细胞暴露于珠子，所述珠子在它们的表面上包含所述激活剂。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述暴露包括将所述第一多个细胞暴露于含所述激活剂的树突细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述激活剂包含一种或多种抗原。
11.根据权利要求8所述的方法，其中，所述激活剂包含选自由抗CD2的抗体、抗CD3的抗体、抗CD28的抗体和它们的组合组成的组中的一种或多种抗体。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，在封闭的系统中进行各步骤。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述扩增包括使培养基在所述中空纤维生物反应器中循环。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述培养基包含白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素7(IL-7)、白介素15(IL-15)和它们的组合中的一种或多种。
15.一种用于扩增细胞的细胞扩增系统，所述系统包括：
中空纤维生物反应器，所述中空纤维生物反应器包括具有至少相对端部的第一流体流动路径，其中所述第一流体流动路径的第一相对端部与所述中空纤维生物反应器的第一端口流体相连，并且所述第一流体流动路径的第二端部与所述中空纤维生物反应器的第二端口流体相连，其中所述第一流体流动路径包括所述中空纤维生物反应器的毛细管内部；
与所述第一流体流动路径流体相连的流体输入路径，其中多个细胞通过第一流体输入路径被引入到所述第一流体流动路径中；
第一泵，所述第一泵用于使流体在所述第一流体流动路径中循环；
处理器，所述处理器用于执行处理器可执行指令；
内存，所述内存用于储存指令，在所述处理器执行所述指令时，所述指令进行包括以下步骤的方法：
将含第一多个细胞的第一流体引入到所述中空纤维生物反应器的毛细管内部中，所述第一多个细胞包含白细胞；
将所述第一多个细胞暴露于所述毛细管内部中的第一激活剂，以激活所述中空纤维生物反应器中的细胞的扩增；
将含培养基的第二流体引入到所述毛细管内部中，以使所述第一多个细胞的至少一部分扩增，并且生成第二经扩增的多个细胞；以及
从所述生物反应器中移出所述第二经扩增的多个细胞。
16.根据权利要求15所述的系统，其中，所述系统是封闭的系统。
17.根据权利要求16所述的系统，其中，所述第二经扩增的多个细胞包含T细胞。
18.根据权利要求14所述的系统，其中，所述第一流体包含珠子，所述珠子在它们的表面上包含所述第一激活剂。
19.根据权利要求18所述的系统，其中，所述激活剂包含选自由抗CD2的抗体、抗CD3的抗体、抗CD28的抗体和它们的组合组成的组中的一种或多种抗体。
20.根据权利要求19所述的系统，其中，所述培养基包含选自由白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素7(IL-7)、白介素15(IL-15)和它们的组合中的一种或多种细胞因子。
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