CN111065728B - 细胞扩增 - Google Patents
细胞扩增 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111065728B CN111065728B CN201880055013.5A CN201880055013A CN111065728B CN 111065728 B CN111065728 B CN 111065728B CN 201880055013 A CN201880055013 A CN 201880055013A CN 111065728 B CN111065728 B CN 111065728B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- fluid
- cell
- bioreactor
- flow rate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 title claims abstract description 412
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 1165
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 88
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims abstract description 44
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 492
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 309
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 258
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 83
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 64
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 55
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 44
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 40
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 40
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 39
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 32
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 32
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 238000004891 communication Methods 0.000 claims description 23
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 claims description 20
- 238000005086 pumping Methods 0.000 claims description 20
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 abstract description 97
- 239000007789 gas Substances 0.000 abstract description 83
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 45
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 abstract description 36
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 abstract description 27
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 16
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 abstract description 14
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 abstract description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 134
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 108
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 61
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 55
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 44
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 42
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 42
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 39
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 34
- 239000000306 component Substances 0.000 description 29
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 28
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 28
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 28
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 26
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 26
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 26
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 24
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 24
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 23
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 23
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 21
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 20
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 20
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 17
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 16
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 16
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 16
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 15
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 13
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 12
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 12
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 12
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 12
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 10
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 9
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 9
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 101001043809 Homo sapiens Interleukin-7 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 8
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 8
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 8
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 8
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 8
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 8
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 8
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 8
- 102100021593 Interleukin-7 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 6
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 6
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 6
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 6
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 5
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 5
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 5
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 4
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 238000013340 harvest operation Methods 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 3
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 3
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 3
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 210000003040 circulating cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 2
- 108010084313 CD58 Antigens Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000008568 cell cell communication Effects 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 2
- -1 for example Substances 0.000 description 2
- 230000006545 glycolytic metabolism Effects 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 101710165425 Alpha-enolase Proteins 0.000 description 1
- 102100038910 Alpha-enolase Human genes 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 1
- 241001573881 Corolla Species 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710184673 Enolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108091052347 Glucose transporter family Proteins 0.000 description 1
- 102000042092 Glucose transporter family Human genes 0.000 description 1
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 1
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001046996 Homo sapiens Histone acetyltransferase KAT5 Proteins 0.000 description 1
- 101000801234 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 108010038498 Interleukin-7 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010782 Interleukin-7 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 102000008135 Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010035196 Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 102000001712 STAT5 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010029477 STAT5 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002334 Spandex Polymers 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100033728 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Human genes 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000008649 adaptation response Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229940030225 antihemorrhagics Drugs 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N benzyl N-[2-hydroxy-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]carbamate Chemical compound OC1=C(NC(=O)OCC2=CC=CC=C2)C=CC(=C1)N1CCOCC1=O FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- UBAZGMLMVVQSCD-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;molecular oxygen Chemical compound O=O.O=C=O UBAZGMLMVVQSCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 230000004129 fatty acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 230000006377 glucose transport Effects 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002874 hemostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002602 induced regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000035992 intercellular communication Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006677 mitochondrial metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000004759 spandex Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003211 trypan blue cell staining Methods 0.000 description 1
- 238000003466 welding Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/10—Hollow fibers or tubes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/10—Hollow fibers or tubes
- C12M25/12—Hollow fibers or tubes the culture medium flowing outside the fiber or tube
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
- C12M27/10—Rotating vessel
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/10—Perfusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/16—Hollow fibers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明描述的实施方案大体上提供用于在细胞扩增系统中扩增细胞。细胞可在生物反应器中生长，并且细胞可被活化剂(例如，可溶性活化剂复合物)活化。封闭的自动细胞扩增系统的营养物和气体交换能力例如可使细胞能以降低的细胞接种密度接种。可以操纵细胞生长环境的参数以将细胞装载到生物反应器中的特定位置，以有效地交换营养物和气体。可以调节系统参数以剪切可能在扩增阶段形成的任何细胞群落。可以控制代谢浓度以改善细胞生长和活力。可以控制在生物反应器中的细胞停留。在一些实施方案中，细胞可以包括T细胞。在又一些实施方案中，细胞可以包括T细胞亚群，例如包括调节性T细胞(Treg)、辅助T细胞、幼稚T细胞、记忆T细胞，或者效应T细胞。
Description
相关申请的交叉引用
本申请是以下申请的部分接续并且要求以下申请的优先权和权益：2018年4月2日提交的题为“细胞扩增”的美国专利申请No.15/943,619，和2018年4月2日提交的题为“生物反应器中扩增细胞”的美国专利申请No.15/943,536，并且上述两件申请都要求下列申请的优先权和权益：2017年3月31日提交的美国临时申请系列号No.62/479,721，并且题为“细胞扩增”；2017年3月31日提交的美国临时申请系列号No.62/479,760，并且题为“细胞扩增”；2017年3月31日提交的美国临时申请系列号No.62/479,788，并且题为“生物反应器内扩增细胞”；2017年8月24日提交的美国临时申请系列号No.62/549,871，并且题为“细胞的扩增”；以及2018年3月23日提交的美国临时申请系列号No.62/647,361，并且题为“细胞的扩增”。本申请还要求2017年8月24日提交的题为“细胞扩增”的美国临时申请系列号No.62/549,884的优先权。上述申请的所有公开内容在此通过引用整体并入本文，如同在本文完整地阐述其所教导的和用于所有目的的所有内容。
背景技术
细胞扩增系统(CES)用于扩增和分化细胞。细胞扩增系统可用于扩增(例如生长)各种贴壁细胞和悬浮细胞。贴壁和非贴壁类型的细胞都可以在细胞扩增系统的生物反应器中生长。
发明内容
本发明的实施方案大体上涉及在细胞扩增系统(CES)中扩增细胞。根据实施方案，这种扩增可以通过使用生物反应器或细胞生长室发生。在一个实施方案中，这种生物反应器或细胞生长室可包括中空纤维膜。这样的中空纤维膜可包括毛细管外(EC)空间和毛细管内(IC)空间。细胞扩增系统可以扩增多种细胞类型。实施方案可提供贴壁和非贴壁细胞以在细胞扩增系统中生长或扩增。可以在系统中扩增的非贴壁或悬浮细胞可以包括例如T细胞或T淋巴细胞。在实施方案中，可以使一个或更多个T细胞亚群或子集生长。例如，实施方案可以提供扩增T细胞，一些非限制性例子包括效应T细胞(诸如人效应T细胞)、辅助T细胞(诸如人辅助T细胞)、幼稚T细胞(诸如人幼稚T细胞)、记忆T细胞(诸如人记忆T细胞)和/或调节性T细胞(Tregs)(诸如人调节性T细胞(hTreg))。
在一些实施方案中，可以提供用于在封闭、自动的细胞扩增系统中扩增细胞的方法和系统。在一个实施方案中，这样的细胞扩增系统可以包括生物反应器或细胞生长室。在又一些的实施方案中，这种生物反应器或细胞生长室可以包括中空纤维膜。
例如，可以将非贴壁细胞(例如T细胞(诸如Treg细胞))，引入中空纤维生物反应器中，其中，中空纤维生物反应器包括多个中空纤维。根据一个实施方案，细胞可以暴露于刺激剂或活化剂以刺激或活化中空纤维生物反应器中细胞的扩增。
含生物反应器或细胞生长室的封闭、自动的细胞扩增系统可以包括许多能力，诸如营养物和气体交换能力。与在培养瓶或其他静态培养方法中使用的细胞接种密度相比，这种能力可以使细胞能以降低的细胞接种密度接种。实施方案提供了要被操纵的细胞生长环境的参数，以将细胞装载或引入到生物反应器中的位置，以有效地将营养物和气体交换或输送到正在生长的细胞中。在实施方案中，还可以促进细胞之间的通信。例如，在一个实施方案中，生物反应器中细胞的集中或居中可以增加细胞密度以促进细胞之间的通讯，诸如化学信号传导。
实施方案还可以提供要管理的系统参数，以控制细胞在生物反应器或细胞生长室中的停留。例如，通过在细胞生长阶段控制细胞在生物反应器中的停留，该系统可以向扩增中细胞提供有效的气体和营养物交换。在实施方案中，可以将生物反应器设计为向生长中的细胞提供气体交换，并且在一些实施方案中，提供营养交换。在一个示例性实施方案中，含半渗透性中空纤维膜的生物反应器通过半渗透性中空纤维膜提供气体和营养物交换。生物反应器的半渗透性中空纤维使得必需的营养物质(例如葡萄糖和/或细胞生长配制的培养基)能够到达细胞，而代谢废物(例如乳酸)则通过在中空纤维壁上扩散而离开系统。然而，根据实施方案，位于生物反应器的集管或中空纤维之外的其他区域中的细胞可能不接受适当的气体交换和营养交换，这可能导致细胞聚集和死亡。因此，实施方案涉及提供在供养细胞时将细胞群体(例如非贴壁细胞群体)保持在生物反应器的中空纤维中的方法。将细胞保留在生物反应器中还可以促进细胞间的通信，因为随着生物反应器本身中细胞的增多，细胞密度可以增加，并因此可以改善细胞间的通信。
额外的实施方案可以提供系统特征，以剪切(shear)在细胞生长的扩增阶段可能形成的任何细胞群落、微群落或细胞簇。例如，一个实施方案提供了在一段时间的扩增之后，通过生物反应器中空纤维膜对细胞群(例如群落、微群落或簇)的剪切。这种剪切可以减少微群落、群落或簇中的细胞数量，其中微群落、群落或簇可以是一组一个或更多个附着的细胞。在实施方案中，簇还可以包括用于激活细胞扩增的珠。实施方案可提供在生长的扩增阶段通过使悬浮细胞培养物循环通过例如中空纤维毛细管内(IC)环(例如具有215μm内径的中空纤维)的循环来剪切任何群落的方案。在实施方案中，可以剪切细胞的群落、微群落或簇以减小细胞的群落、微群落或簇的尺寸。在一个实施方案中，可以剪切细胞的群落、微群落或簇以提供单个细胞均匀的悬浮液并改善细胞生长/活力。这样的能力可有助于细胞(例如T细胞(诸如Treg))的连续灌注生长。
本发明的实施方案进一步涉及使用细胞扩增的特征组合来生长细胞。例如，在一个实施方案中，与培养瓶或其他静态培养方法中使用的细胞接种密度相比，可以以降低的接种密度接种细胞。例如，在一些实施方案中，用于接种细胞的流体的体积可以包括约1×104细胞/mL至约1×106细胞/mL，例如约105细胞/mL。在其他实施方案中，用于接种细胞的流体的体积可包括小于约1×106细胞/mL。在一些实施方案中，接种的细胞总数可以是约10×106至约500×106个细胞。在其他实施方案中，接种的细胞总数可以少于50×106个细胞。根据一些实施方案，可以将细胞装载或引入细胞扩增系统中的生物反应器(例如中空纤维生物反应器)中的期望位置。例如，在一个实施方案中，细胞可以暴露于活化剂以活化细胞在中空纤维生物反应器中的扩增。例如，根据一个实施方案，可通过使细胞循环以使细胞产生剪切应力和/或剪切力来剪切可能在细胞扩增期间形成的任何细胞群落或簇。例如，这种剪切应力和/或剪切力可引起一个或更多个细胞从细胞群落分裂。为了向生长中的细胞群体提供适当的气体和营养物交换，进一步的实施方案提供了例如在细胞供养期间将细胞群(例如悬浮细胞群)保留在生物反应器的中空纤维内。通过在细胞生长阶段将细胞集中和/或保留在生物反应器的中空纤维中，细胞密度可以增加并且细胞间通信可以改善。因此，与静态培养相比，可以使用降低的细胞接种密度。
实施方案进一步提供了用于扩增细胞的细胞扩增系统，其中该系统可包括例如中空纤维生物反应器，该中空纤维生物反应器包括入口端口和出口端口；具有至少相对的端部的第一流体流动路径，其中，第一流体流动路径的第一相对端与生物反应器的入口端口流体相关，并且第一流体流动路径的第二端与生物反应器的出口端口流体相关，其中，第一流体流动路径与生物反应器的毛细管内部分流体连通；与第一流体流动路径流体相关的流体进入路径；以及与第一流体流动路径和生物反应器的毛细管内部分流体相关的第一流体循环路径。
进一步提供了细胞扩增系统的实施方案以包括处理器，该处理器用于执行指令以进行本文描述和/或说明的方法。例如，本发明的实施方案提供了通过使用与细胞扩增系统一起使用的一个或更多个方案或任务来实现这种细胞扩增。例如，这样的方案或任务可以包括预编程的方案或任务。在实施方案中，用户或系统操作员可以选择预编程的，默认的或以其他方式先前保存的任务，以通过细胞扩增系统进行特定功能。在其他实施方案中，这样的方案或任务可以包括自定义或用户定义的方案或任务。例如，通过用户界面(UI)和一个或更多个图形用户界面(GUI)元素，可以创建自定义或用户定义的方案或任务。一项任务可以包括一个或更多个步骤。
如本文所用，“至少一个(种)”、“一个(种)或更多个(种)”以及“和/或”是开放式表达，其在操作中即是连接的又是分隔的。例如，“A、B和C中的至少一个(种)”、“A、B或C中的至少一个(种)”、“A、B和C中的一个(种)或更多个(种)”、“A、B或C中的一个(种)或更多个(种)”和“A、B和/或C”的每个表达是指单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起，或者A、B和C一起。
包括该发明内容以简化形式提供概念的选择，其中在下面的详细描述中进一步描述了这些概念。本发明内容无意以任何方式限制要求保护的主题的范围。除了本文提供的那些特征之外，还可以包括其等效物和变型在内的特征。
附图说明
可以通过参考附图来描述本发明的实施方案。在附图中，相同的标号表示相同的项。在附图中，虚线可以用于指示一个或更多个元件可以是可选的。
图1A描绘了细胞扩增系统(CES)的实施方案。
图1B示出了生物反应器的实施方案的正视图，其示出了通过生物反应器的循环路径。
图1C描绘了根据本发明的实施方案的用于在细胞扩增系统的操作期间旋转地或横向地移动细胞生长室的摇动装置。
图2示出了根据本发明的实施方案的具有预安装的流体输送装置的细胞扩增系统的透视图。
图3描绘了根据本发明的实施方案的细胞扩增系统的壳体的透视图。
图4示出了根据本发明的实施方案的预安装的流体输送装置的透视图。
图5A描绘了根据本发明的实施方案的细胞扩增系统的示意图，其包括示出流体运动的操作配置。
图5B描绘了根据本发明的实施方案的细胞扩增系统的示意图，其包括示出流体运动的另一种操作配置。
图5C描绘了根据本发明的实施方案的细胞扩增系统的示意图，其包括示出流体运动的另一种操作配置。
图6示出了根据本发明的另一实施方案的细胞扩增系统的示意图。
图7描绘了根据本发明的实施方案的示出用于扩增细胞的过程的操作特征的流程图。
图8A示出了根据本发明的实施方案的描绘用于扩增细胞的过程的操作特征的流程图。
图8B描绘了根据本发明的实施方案的细胞扩增系统的一部分的示意图。
图9A描绘了根据本发明的实施方案的示出用于扩增细胞的过程的操作特征的流程图。
图9B示出了根据本发明的实施方案的细胞扩增系统中的氧消耗的图。
图10A示出了根据本发明的实施方案的描绘了用于扩增细胞的过程的操作特征的流程图。
图10B示出了根据本发明的实施方案的具有可在细胞扩增系统中使用的示例性泵速的表格。
图11A描绘了根据本发明的实施方案的示出用于扩增细胞的过程的操作特征的流程图。
图11B示出了根据本发明的实施方案的扩增细胞的代谢的图。
图11C示出了根据本发明的实施方案的扩增细胞的代谢的图。
图12示出了根据本发明的实施方案的描绘用于扩增细胞的过程的操作特征的流程图。
图13描绘了根据本发明的实施方案的示出用于扩增细胞的过程的操作特征的流程图。
图14示出了根据本发明的实施方案的描绘用于扩增细胞的过程的操作特征的流程图。
图15A示出了根据本发明的实施方案的描绘用于扩增细胞的过程的操作特征的流程图。
图15B示出了根据本发明的实施方案的细胞扩增期间的细胞数目对流速的图。
图16描绘了根据本发明的实施方案的示出用于扩增细胞的过程的操作特征的流程图。
图17A描绘了根据本发明的实施方案的示出用于扩增细胞的过程的操作特征的流程图。
图17B描绘了根据本发明的实施方案的在细胞扩增系统中细胞扩增的视图。
图17C示出了根据本发明的实施方案的示出细胞分离(disassociation)方法的内径的图。
图18示出了根据本发明的实施方案的细胞扩增期间的细胞数目和流速对培养天数的图。
图19A示出了根据本发明的实施方案的描绘了用于操作泵以使细胞扩增的过程的操作特征流程图。
图19B描绘了根据本发明的实施方案的细胞扩增系统的一部分的示意图。
图19C描绘了根据本发明的实施方案的细胞扩增系统的一部分的示意图。
图19D描绘了根据本发明的实施方案的细胞扩增系统的一部分的示意图。
图20示出了根据本发明的实施方案的描绘了用于扩增细胞的过程的操作特征的流程图。
图21描绘了根据本发明的实施方案的示出用于扩增细胞的过程的操作特征的流程图。
图22示出了根据本发明的实施方案的描绘了用于扩增细胞的过程的操作特征的流程图。
图23示出了描述根据本发明实施方案的用于扩增细胞的过程的操作特征的流程图。
图24描绘了示出根据本发明实施方案的用于扩增细胞的过程的操作特征的流程图。
图25描绘了细胞扩增系统的示例性处理系统，本发明的实施方案可在该系统上实施。
图26示出了根据本发明实施方案的细胞扩增期间细胞数量对培养天数的图表。
图27示出了根据本发明实施方案的细胞扩增期间细胞数量对培养天数的图表。
图28示出了根据本发明实施方案的细胞扩增期间细胞数量对培养天数的图表。
图29示出了根据本发明实施方案的细胞扩增期间细胞数量对培养天数的图表。
图30示出了根据本发明实施方案的细胞扩增期间细胞数量对培养天数的图表。
图31示出了根据本发明实施方案的细胞扩增期间细胞数量对培养天数的图表。
图32示出了根据本发明实施方案的描绘细胞表型的柱状图。
图33示出了根据本发明实施方案的描绘细胞表型的柱状图。
图34-36示出了根据本发明实施方案的描绘细胞功能的柱状图。
具体实施方式
下面的详细描述参考附图提供了对示例性实施方案的讨论。本文中包括的特定实施例不应被解释为限制或缩限(limiting or restricting)本发明。此外，尽管例如特定于特征、动作和/或结构的语言可以用于描述本文的实施方案，但是权利要求不限于所描述的特征、动作和/或结构。本领域技术人员将理解，包括改进在内的其他实施方案也在本发明的精神和范围内。此外，可以使用包括作为单独的实施方式列出的任何替代或添加，或与本文所述的任何其他实施方式结合。
本发明的实施方案大体上涉及用于在细胞扩增系统(CES)中扩增细胞的系统和方法。根据实施方案，这种扩增可以通过使用生物反应器或细胞生长室发生。在一个实施方案中，这种生物反应器或细胞生长室可包括中空纤维膜。这种中空纤维膜可以包括多个中空纤维，并且可以包括毛细管外(EC)和/或毛细管内(IC)空间。实施方案可提供贴壁或非贴壁细胞在细胞扩增系统中生长或扩增。例如，非贴壁或悬浮细胞(诸如T细胞或T淋巴细胞)，可以在系统中扩增。在实施方案中，可以使一个或更多个T细胞亚群或子集生长。例如，实施方案可以提供用于扩增效应T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞和/或调节性T细胞(Treg)(例如，人调节性T细胞(hTreg))的方法和系统。
在实施方案中，可以提供用于在封闭、自动的细胞扩增系统中扩增细胞的方法和系统。在一个实施方案中，这种细胞扩增系统可以包括生物反应器或细胞生长室。在又一些的实施方案中，这种生物反应器或细胞生长室可以包括中空纤维膜。这种系统的能力(诸如营养物和气体交换能力)，可以使细胞能以降低的细胞接种密度接种。实施方案提供了要被操纵的细胞生长环境的参数以将细胞装载或引入到生物反应器中的位置中，以将营养物和气体有效地交换到生长的细胞中。例如，在一个实施方案中，生物反应器中细胞的集中可增加细胞密度。
在实施方案中，可以将非贴壁细胞群(例如T细胞(诸如Treg细胞))引入或装载到中空纤维生物反应器中，其中，中空纤维生物反应器可以包括多个中空纤维。在实施方案中，可将细胞暴露于活化剂以活化中空纤维生物反应器中细胞的扩增。在一个实施方案中，例如，可以使用“在没有循环的情况下集中装载细胞”任务将多个细胞引入细胞扩增系统。根据示例性实施方案，可以在第0天和第4-8天进行这种任务。在其他实施方案中可以使用其他天数。在实施方案中，这种细胞装载任务可引起细胞在生物反应器中居中以增加细胞密度。在其他实施方案中，细胞可以位于生物反应器的其他部分或区域中以增加细胞密度。在实施方案中，通过将细胞置于例如生物反应器的中心区域附近的第一位置，细胞可以接受有效的营养物和气体交换。
在实施方案中，与静态培养方法使用的细胞数量相比，可以接种相对少量的初始细胞。在实施方案中，使用细胞扩增系统，细胞(例如，T细胞)可以从少于约100×106个细胞、少于约90×106个细胞、少于约80×106个细胞、少于约70×106个细胞、少于约60×106个细胞、少于约50×106个细胞、少于约40×106个细胞、少于约30×106个细胞，或者甚至少于约20×106个细胞的初始细胞数量扩增。在其他实施方案中，细胞的初始数量可以大于约80×105个细胞、大于约90×105个细胞、大于约10×106个细胞，或者甚至大于约20×106个细胞。在一些实施方案中，最初接种的细胞可以包括外周血单核细胞(PBMC)。细胞可以从一定体积的外周血或白细胞分离产物中分离出来。在这些实施方案中，细胞的初始数量可以指从大量外周血中分离的PBMC的数量。在实施方案中，例如，由于系统向培养环境输送营养物的整体效率，可以使用较低的初始细胞接种数。在其他实施方案中，在扩增过程中使用的一个或更多个步骤结合系统向培养环境输送营养物的总体效率可以允许使用较低的初始细胞接种数。在其他实施方案中，可以接种约1×106至约500×106个细胞。
在实施方案中，与静态培养方法所用的细胞接种密度相比，可以使用降低的细胞接种密度。在使用细胞扩增系统的实施方案中，可以将细胞(例如Treg或Treg细胞)从约2.54×105细胞/mL至约3.69×105细胞/mL的细胞接种密度扩增。在其他实施方案中，细胞接种密度可以小于约1×106细胞/mL。另外，可以从约1.0×105细胞/mL的细胞接种密度制备Treg细胞接种物。其他方法，例如静态Treg细胞培养方法，可以使用约1.0×106Treg细胞/mL的细胞接种密度用于体外扩增。在一个实施方案中，例如由于系统在将营养物输送到培养环境中的整体效率，可以使用较低的细胞接种密度。在其他实施方案中，在扩增过程中使用的一个或更多个步骤与系统将营养物输送到培养环境中的整体效率相结合，可以使得能够使用较低的初始细胞接种密度。
在实施方案中，可以使用活化剂复合物进行自动的细胞(例如，诸如Treg的T细胞)扩增。例如，在一些实施方案中，可以使用例如用于刺激细胞的珠子。可以使用可以用抗体功能化的珠子。抗体可以激活T细胞的增殖。可以使用的珠子的一个实例包括可从马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默菲舍科学公司获得的珠。珠子在一些实施方案中，可以用抗体在其表面功能化，抗体的一些非限制性例子包括：抗CD2、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD28、抗CD34及其组合。在实施方案中，珠子可以在100IU/ml细胞因子IL-2的存在下使用。在其他实施方案中，可以在不使用基于珠子的刺激的情况下扩增细胞(例如T细胞(诸如Treg细胞))。在一个实施方案中，可以使用干细胞技术可溶性ImmunoCultTM人CD3/CD28/CD2T细胞活化剂进行细胞扩增，以在200IU/mL细胞因子IL-2存在下用自动细胞扩增系统中激活和扩增Treg细胞。例如，使用可溶性活化剂复合物的刺激成本可以比基于珠子的方案的成本低。在其他实施方案中可以使用其他类型的活化剂。进一步地，在其他实施方式中可以使用其他类型的细胞因子或其他生长因子。
实施方案还可以提供要调整或管理的系统参数，以控制细胞在生物反应器或细胞生长室中的停留。例如，通过在细胞生长阶段控制细胞在生物反应器中空纤维中的停留，该系统可以为扩增细胞提供有效的气体和营养物交换。在实施方案中，可以将生物反应器设计为向生长中的细胞提供气体交换，并且在一些实施方案中，提供营养物交换。在一个示例性实施方式中，包括半渗透性中空纤维膜的生物反应器可以通过半渗透性中空纤维膜提供气体和营养物交换。在实施方案中，用于向不能通过膜的生长细胞提供培养基成分(诸如各种细胞因子，蛋白质等)的方法，可以使用流体进入至细胞正在生长的生物反应器侧(例如毛细管内(IC)侧)。然而，根据实施方案，甚至低的、降低的或减少的，例如最小的进入流速(例如0.1mL/min)也可能导致细胞聚集在生物反应器的出口集管(header)中。停留在生物反应器集管的细胞可能无法进行适当的气体交换和营养物交换，这可能导致细胞死亡和聚集。
实施方式涉及提供当使用进入(例如，IC进入)流供养细胞时将细胞(例如，非贴壁细胞群)保留在生物反应器中的方法。尽管本文中的实施方式可以涉及例如在供养时细胞在膜的IC侧，但是其他实施方式可以规定细胞在膜的EC侧，其中根据实施方案，细胞可以包含在第一循环路径和/或第二循环路径。在实施方案中，供养方法例如可以提供以第一容积流速(volumetric flow rate)、体积流速、流体流速、流速、流体流动速率或体积速度将第一体积的流体(例如培养基或细胞生长配制的培养基)泵入生物反应器的第一端口。例如，容积流速、体积流速、流体流动速率、流速、流体流动的速率，或体积速度可以互换使用。在一些实施方案中，流速可以是既具有速度又具有方向的向量。第二体积的流体可以第二容积流速、体积流速、流体流动速率、流速、流体流动的速率或体积速度泵入生物反应器的第二端口。在实施方案中，例如，这样的容积流速、体积流速、流体流动速率、流速、流体流动的速率或体积速度可以由一个或多个泵速和/或泵流速控制。泵速可产生、引起或影响泵作用于的流体的容积流速或流速。如本文中所使用的，泵速可以在实施方案中描述为由泵产生、引起或影响的容积流速或流体流动速率。
在实施方式中，进入生物反应器的第二流速的流体可以与进入生物反应器的第一流速的流体的方向相反。例如，图5B和5C示出了根据本发明的实施方案的示例性操作配置，其示出了可以与诸如CES 500(例如，图5B和5C)的细胞扩增系统一起使用的流速和流向。在实施方案中，细胞扩增系统泵(例如IC泵)，可用于控制细胞在生物反应器中的停留。在实施方案中，例如，在生长的扩增阶段，细胞可能在从生物反应器到IC循环路径或IC回路中损失。在实施方式中，例如，生物反应器中更靠近IC入口端口的细胞可以接受最新鲜的生长培养基，而例如，IC循环路径中生物反应器之外的部分中的细胞可以基本上接收被消耗或条件培养基，这可能会影响其糖酵解代谢。另外，根据实施方案，生物反应器中的细胞可能会通过来自EC回路循环的扩散而接收从气体传输模块(GTM)输入的混合气体(O2、CO2、N2)，而生物反应器外IC循环路径部分中的细胞可能会接收不到混合气体。
在实施方案中，在供养期间，可以通过使IC循环泵速与IC进入泵速匹配或近似匹配或基本匹配，但是方向相反来减少来自中空纤维膜(HFM)生物反应器的细胞损失。例如，在实施方案中，+0.1mL/min的IC进入泵速可与-0.1mL/min的互补IC循环泵速匹配或近似匹配或基本匹配，以细胞培养物的生长阶段中(可以是第4-7天)在生物反应器中维持细胞。根据实施方案，该泵的调节可以抵消与来自IC出口端口的细胞损失相关的力。在其他实施方案中，可以使用其他泵速。例如，在其他实施方案中，泵速可以是不同的。在实施方案中，可以使用其他泵或额外泵。在一个实施方案中，可以使用更少的泵。进一步地，在其他实施方案中可以使用其他时间段。
在实施方案中，细胞群的代谢活动可以影响供养参数。例如，细胞培养物乳酸值可以维持在预定水平或低于预定水平。在一个实施方案中，细胞培养物乳酸值可以例如维持在或低于约7mmol/L。在其他实施方案中，细胞培养物乳酸值可维持在或低于约30mmol/L、维持在或低于约25mmol/L、维持在或低于约20mmol/L、维持在或低于约15mmol/L，或者甚至维持在或低于约10mmol/L，甚至约10mmol/L或低于约10mmol/L。在实施方案中，通过使用细胞扩增系统图形用户界面(GUI)来控制培养基添加的速率，在细胞(例如，T细胞(诸如调节性T细胞))扩增期间，来自糖酵解的乳酸代谢废物产物可以维持在预定值或低于预定值。在其他实施方案中，例如，可以控制培养基的添加速率和/或其他设置以维持或试图维持≤约5mmol/L的乳酸水平，例如以改善细胞生长和活力。在其他实施方案中可以使用其他浓度。
额外的实施方案可以提供系统特征，以剪切在扩增阶段可能形成的任何细胞群落、微群落或细胞簇。例如，一个实施方案提供了通过生物反应器中空纤维膜剪切细胞的群落(例如微群落)，以减少微群落、群落或簇中的细胞数量，其中群落或簇可以是一组一个或更多个附着细胞。在实施方案中，细胞扩增系统(CES)生物反应器结构可用于剪切细胞(例如，T细胞(诸如调节性T细胞))、微群落。在实施方案中，随着细胞(例如，T细胞(诸如调节性T细胞))的生长，它们可能趋于形成可限制营养物向群落中心的细胞扩散的微群落。这可能导致不良影响，诸如细胞培养过程中的坏死。实施方案可提供在生长的扩增阶段通过使悬浮细胞培养物循环通过例如中空纤维毛细管内(IC)回路(例如具有215μm内径的中空纤维)以剪切细胞的方案。在实施方案中，可以剪切细胞的群落、微群落或簇以减小细胞的群落、微群落或簇的尺寸。在一个实施方案中，可以剪切细胞的群落或簇以提供单个细胞悬浮液并产生细胞生长/活力。在实施方案中，这种能力可以促进细胞(例如，T细胞(诸如调节性T细胞))的连续灌注生长。在一些实施方案中，也可以用可用于激活细胞扩增的珠子形成微群落。在这些实施方案中，微群落的剪切也可以破坏细胞扩增时可能形成的任何细胞、珠子或其组合的聚集体。
在实施方案中，可在细胞扩增系统中扩增并从细胞扩增系统中收获治疗剂量的细胞(例如，T细胞(诸如调节性T细胞))。在实施方案中，收获时的细胞数目可以为约1×106细胞至约1×1010细胞，诸如约1×109细胞。在一个实施方案中，收获的细胞的数目可以为约1×108至约1×1010个细胞，一个实例为约7.0×108至约1.4×109个细胞。在其他实施方案中，收获的细胞数量可以从大约1×109到大约100×109。在实施方案中，收获的细胞可具有约60％至约100％的活力。例如，收获的细胞的活力可以高于约65％，高于约70％，高于约75％，高于约80％，高于约85％，高于约90％或甚至高于约95％。
在一些实施方案中，收获的细胞可以表达与T细胞(例如，幼稚T细胞、效应T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、调节T细胞)一致的生物标志物。例如，在一些实施方案中，细胞可以表达CD3+、CD4+、和/或CD8+生物标志物。在实施方案中，收获的细胞可以以约50％至约100％的频率包括CD3+表型。收获的细胞可包括CD4+表型，其频率高于约25％，高于约30％，高于约35％，高于约40％，高于约45％，高于约50％，高于约55％，或者甚至高于约60％。在其他实施方案中，细胞可以以约30％至约100％的频率包括CD8+表型。
在其他实施方案中，收获的细胞可以表达与Tregs一致的生物标志物。例如，细胞可以表达CD4+、CD25+和/或FoxP3+生物标记物。在实施方案中，收获的细胞可以以约50％至约100％的频率包含CD4+CD25+表型。所收获的细胞可以以高于约75％，高于约80％，高于约85％，高于约90％，或者甚至高于约95％的频率包括CD4+CD25+表型。在其他实施方案中，细胞可以以约30％至约100％的频率包括CD4+FoxP3+表型。在一些实施方案中，收获的细胞可以以高于约30％，高于约35％，高于约40％，高于约45％，高于约50％，高于约55％，高于约60％，高于约65％，或者甚至高于约70％的频率包括CD4+FoxP3+表型。
实施方案针对如上所述的细胞扩增系统。在实施方式中，这种细胞扩增系统是封闭的，其中封闭的细胞扩增系统包括不直接暴露于环境的内容物。这种细胞扩增系统可以是自动化的。在实施方案中，贴壁以及非贴壁或悬浮类型的细胞都可以在细胞扩增系统中的生物反应器中生长。根据实施方案，细胞扩增系统可以包括基础培养基或其他类型的培养基。提供了用于在封闭细胞扩增系统的生物反应器中发生细胞生长的培养基补充方法。在实施方案中，与这种系统一起使用的生物反应器是中空纤维生物反应器。根据本发明的实施方案，可以使用许多类型的生物反应器。
在实施方案中，该系统可以包括生物反应器，该生物反应器与具有至少相对端的第一流体流动路径流体相关，该第一流体流动路径的第一相对端与中空纤维膜的第一端口流体相关，并且第一流体流动路径的第二端与中空纤维膜的第二端口流体相关。在实施方式中，中空纤维膜包括多个中空纤维。该系统可以进一步包括与第一流体流动路径流体相关的流体进入路径，其中多个细胞可以通过第一流体进入路径被引入到第一流体流动路径中。在一些实施方案中，包括用于将毛细管内进入流体从毛细管内培养基袋转移到第一流体流动路径的泵和用于控制泵的操作的控制器。在实施方案中，控制器例如控制泵以将细胞从细胞进入袋转移到第一流体流动路径。还可以包括用于使流体在第一流体循环路径中循环的另一泵，其中该泵还可以包括用于控制泵的操作的控制器。在一个实施方案中，控制器是例如包括处理器的计算系统。在实施方案中，一个或更多个控制器可以被配置为控制一个或更多个泵，诸如以使流体以第一流体循环路径内的流速循环。根据实施方案，可以使用多个控制器，例如，第一控制器、第二控制器、第三控制器、第四控制器、第五控制器、第六控制器等。此外，根据本发明的实施方案，可以使用多个泵，例如，第一泵、第二泵、第三泵、第四泵、第五泵、第六泵等。另外，尽管本发明可以涉及培养基袋、细胞进入袋等，但是在实施方案中可以使用多个袋例如第一培养基袋、第二培养基袋、第三培养基袋、第一细胞进入袋、第二细胞进入袋、第三细胞进入袋等和/或其他类型的容器。在其他实施方案中，可以使用单个培养基袋、单个细胞进入袋等。此外，在实施方案中可以包括另外的或其他流体路径，例如第二流体流动路径、第二流体进入路径、第二流体循环路径等。
在实施方案中，该系统由例如以下项控制：耦合到细胞扩增系统的处理器；显示设备，与处理器通信，并且可操作以显示数据；以及内存，与处理器通信并可由处理器读取，并包含一系列指令。在实施方案中，例如，当指令由处理器执行时，处理器接收指令以启动系统。响应于启动系统的指令，处理器可以进行一系列步骤以启动系统，并且接着可以例如接收指令以进行IC/EC冲洗。例如，响应于装载细胞的指令，处理器可以进行一系列步骤以将细胞从细胞进入袋装载到例如生物反应器中。
根据本发明的实施方案，在图1A中描绘了示例性细胞扩增系统(CES)的示意图。CES10包括第一流体循环路径12和第二流体循环路径14。根据实施方案，第一流体流动路径16至少具有与中空纤维细胞生长室24(在本文中也称为“生物反应器”)流体相关的相对端18和20。具体地，相对端18可以与细胞生长室24的第一入口22流体相关，并且相对端20可以与细胞生长室24的第一出口28流体相关。第一循环路径12中的流体流过设置在细胞生长室24中的中空纤维膜117(见图1B)的中空纤维116(见图1B)的内部。(下文将更详细地描述细胞生长室和中空纤维膜)。进一步地，第一流体流动控制装置30可以可操作地连接到第一流体流动路径16，并且可以控制第一循环路径12中的流体的流动。
第二流体循环路径14包括第二流体流动路径34、细胞生长室24和第二流体流动控制装置32。根据实施方案，第二流体流动路径34具有至少相对端36和38。第二流体流动路径34的相对端36和38可以分别与细胞生长室24的入口端口40和出口端口42流体相关。流过细胞生长室24的流体可以在细胞生长室24中与中空纤维膜117(参见图1B)的外部接触，其中，中空纤维膜包括多个中空纤维。第二流体循环路径14可以可操作地连接到第二流体流控制装置32。
因此，第一和第二流体循环路径12和14可以在细胞生长室24中通过中空纤维膜117(见图1B)分开。第一流体循环路径12中的流体流过细胞生长室24中的中空纤维的毛细管内(“IC”)空间。第一循环路径12可以被称为“IC回路”。第二循环路径14中的流体流过细胞生长腔室24中的毛细管外(“EC”)空间。第二流体循环路径14可称为“EC回路”。根据实施方案，第一流体循环路径12中的流体可以相对于第二流体循环路径14中的流体流动的方向并流(co-current)或逆流的方式流动。
流体进入路径44可以与第一流体循环路径12流体相关。流体进入路径44使得流体能够进入第一流体循环路径12，而流体出口路径46使得流体能够离开CES 10。第三流体流控制装置48可以与流体进入路径44可操作地相关。或者，第三流体流控制装置48可替代地与第一出口路径46相关。
根据实施方案，本文使用的流体流控制装置可包括泵、阀、夹具或其组合。可以任意组合布置多个泵、阀和夹具。在各种实施方案中，流体流控制装置是蠕动泵或包括蠕动泵。在实施方案中，流体循环路径、入口端口和出口端口可以由任何材料的管道构成。
各种组件在本文中被称为“可操作地相关(operably associated)”。如本文中所使用的，“可操作地相关”是指以可操作的方式联系(linked)在一起的组件，并且包括其中组件直接联系的实施方案，以及其中额外组件放置在两个联系的组件之间的实施方案。“可操作地相关”的组件可以是“流体相关”。“流体相关”是指联系在一起的组件，以便可以在它们之间传输流体。“流体相关”涵盖在两个流体相关的组件以及直接连接的组件之间设置额外组件的实施方案。流体相关的部件可以包括不接触流体但接触其他组件以操纵系统的部件(例如，通过压缩管的外部通过柔性管来泵送流体的蠕动泵)。
通常，任何种类的流体(例如包括缓冲液、含蛋白质的流体和含细胞的流体)，都可以流经各种循环路径、进入路径和排出路径。如本文所用，“流体”、“培养基”和“流体培养基”可互换使用。
转向图1B，在前侧正视图中示出了可与本发明一起使用的中空纤维细胞生长室100的实例。细胞生长室100具有纵轴LA-LA，并包括细胞生长室壳体104。在至少一个实施方案中，细胞生长室壳体104包括四个开口或端口：IC入口端口108、IC出口端口120、EC入口端口128和EC出口端口132。
根据本发明的实施方案，第一循环路径中的流体通过细胞生长室100的第一纵向端112处的IC入口端口108进入细胞生长室100，进入并通过含中空纤维膜117的多个中空纤维116的毛细管内侧(在各种实施方案中称为中空纤维膜的毛细管内(“IC”)侧或“IC空间”)，并通过位于细胞生长室100的第二纵向端124的IC出口端口120离开细胞生长室100。IC入口端口108和IC出口端口120之间的流体路径限定细胞生长室100的IC部分126。第二循环路径中的流体通过EC入口端口128流入细胞生长室100中，与中空纤维116的毛细管外侧或外部(称为膜的“EC侧”或“EC空间”)接触，并经由EC出口端口132离开细胞生长室100。在EC入口端口128和EC出口端口132之间的流体路径包括细胞生长室100的EC部分136。经由EC入口端口128进入细胞生长室100的流体可以与中空纤维116的外部接触。小分子(例如离子、水、氧、乳酸等)可能会通过中空纤维116从中空纤维的内部空间或IC空间扩散到外部或EC空间，或从EC空间扩散到到IC空间。大分子量分子(诸如生长因子)，通常可能通常太大而无法穿过中空纤维膜，并且可能保留在中空纤维116的IC空间中。在实施方案中，可以根据需要更换培养基。培养基也可以通过氧合器(oxygenator)或气体传输模块进行循环，以根据需要交换气体。根据实施方案，细胞可以如下所述包含在第一循环路径和/或第二循环路径内，并且可以在膜的IC侧和/或EC侧任意一侧。
用于制造中空纤维膜117的材料可以是能够被制成中空纤维的任何生物相容性聚合物材料。根据本发明的实施方案，一种可以使用的材料是基于合成的聚砜的材料。
在实施方案中，CES(诸如CES 500(参见图5A、5B和5C)和/或CES 600(参见图6))可以包括被配置为移动或“摇动”细胞生长室的装置，所述设备通过将细胞生长室附接到旋转和/或侧向摇动装置而相对于细胞扩增系统的其他部件移动或“摇动”。图1C示出了一个这种装置，根据一个实施方案，其中生物反应器100可以旋转地连接到两个旋转摇动部件和横向摇动部件。
第一旋转摇动组件138使生物反应器100绕生物反应器100的中心轴线142旋转。旋转摇动组件138可以与生物反应器100旋转地相关(rotationally associated)。在实施方案中，生物反应器100可以以顺时针或逆时针方向围绕中心轴线142在单个方向上连续旋转。或者，根据实施方案，生物反应器100可以交替地旋转，例如绕中心轴线142首先顺时针旋转，然后逆时针旋转。
CES还可以包括第二旋转摇摆部件，其使生物反应器100绕旋转轴线144旋转。旋转轴线144可以穿过生物反应器100的中心点并且可以垂直于中心轴142。在实施方案中，生物反应器100可以以顺时针或逆时针方向围绕旋转轴线144在单个方向上连续旋转。或者，生物反应器100可以交替地绕旋转轴线144旋转，例如，生物反应器100可以交替地旋转，例如绕旋转轴144首先顺时针旋转，然后逆时针旋转。在各种实施方案中，生物反应器100也可以绕旋转轴线144旋转并且相对于重力处于水平或垂直取向。
在实施方案中，横向摇动部件140可以与生物反应器100横向相关(laterallyassociated)。在实施方案中，横向的摇动部件140的平面在-x和-y方向上横向移动。根据实施方案，可通过中空纤维内含细胞的培养基的移动来减少生物反应器中细胞的沉降。
摇动装置的旋转和/或横向移动可以减少装置内细胞的沉降，并降低细胞被捕获在生物反应器的一部分内的可能性。根据斯托克斯定律，细胞在细胞生长室中的沉降速度与细胞和悬浮培养基之间的密度差成正比。在某些实施方案中，如上所述重复180度旋转(快速)并具有暂停(例如具有30秒的总组合时间)，使非贴壁红细胞保持例如悬浮。在一个实施方案中，约180度的最小旋转是优选的；但是，人们可以使用高达360度或更大的旋转度。不同的摇动组件可以单独使用，也可以以任何组合来组合使用。例如，使生物反应器100围绕中心轴线142旋转的摇动部件可以与使生物反应器100围绕轴线144旋转的摇动部件组合。类似地，围绕不同轴的顺时针和逆时针旋转可以以任何组合独立地进行。
转到图2，根据本发明的一些实施方案示出了具有预安装的流体运输组件的细胞扩增系统200的实施方案。CES 200包括细胞扩增机202，该细胞扩增机包括用于与细胞扩增机202的后部206接合的舱口或可关闭的门204。细胞扩增机202内的内部空间208包括适于接收和接合预安装的流体运输组件210的特征。预安装的流体运输组件210是可拆卸地附接到细胞扩增机202，以便于在细胞扩增机202处促进在同一细胞扩增机202处使用过的预安装的流体运输组件210相对快速地更换为新的或未使用的预安装的流体运输组件210。可以操作单细胞扩增机202以使用第一预安装的流体运输组件210使第一细胞组生长或扩增第一细胞组，并且然后可以使用第二预安装的流体运输组件210使第二细胞组生长或扩增第二细胞组，而不需要在第一预安装的流体运输组件210到第二预安装的流体运输组件210的更换之间进行消毒。预安装的流体运输组件210包括生物反应器100和氧合器或气体传输模块212(还参见图4)。根据一些实施方案，管道引导槽显示为214，用于接收管接至预安装的流体运输组件210的各种培养基。
接下来，图3示出了根据本发明的一些实施方案，在可拆卸地附接预安装的流体运输组件210(图2)之前的细胞扩增机202的后部206。图3中省略了可关闭的门204(图2中所示)。细胞扩增机202的后部206包括一些不同的结构，用于与预安装的流体运输组件210的元件配合工作。更具体地，细胞扩增机202的后部206包括多个用于与预安装的流体运输组件210上的泵回路配合的蠕动泵，包括IC循环泵218、EC循环泵220、IC进入泵222和EC进入泵224。此外，细胞扩增机202的后部206包括多个阀，包括IC循环阀226、试剂阀228、IC培养基阀230、空气移除阀232、细胞进入阀234、洗涤阀236、分配阀238、EC培养基阀240、IC废液阀或排出阀242、EC废液阀244和收获阀246。多个传感器也与细胞扩增机202的后部206相关，包括IC出口压力传感器248、IC入口压力和温度组合传感器250、EC入口压力和温度组合传感器252以及EC出口压力传感器254。根据一个实施方案，还示出了用于空气移除室的光学传感器256。
根据一些实施方案，示出了用于旋转生物反应器100的轴或摇杆控制器258。与轴或摇杆控制器258相关的轴配件260允许轴通过孔的合适的对准，参见例如管道组织器的424(图4)、参见例如预安装运输组件210的300(图4)或与细胞扩增机202的后部206一起的400。轴或摇杆控制器258的旋转赋予轴配件260和生物反应器100旋转运动。因此，当CES200的操作者或用户附接新的或未使用的预安装的流体运输组件400(图4)到细胞扩增机202时，对准是相对简单的事，其合适地通过孔424(图4)定向预安装的流体运输组件210或400的轴与配有轴配件260。
转到图4，示出了可拆卸地附接的预安装的流体运输组件400的透视图。预安装的流体运输组件400可以可拆卸地附接到细胞扩增机202(图2和图3)，以便于在细胞扩增机202处促进在同一细胞扩增机202处使用过的预安装的流体运输组件400相对快速地更换为新的或未使用的预安装的流体运输组件400。如图4所示，生物反应器100可以附接到包括轴配件402的生物反应器联轴器(coupling)。轴配件402包括一个或多个轴紧固机械装置，诸如用于接合细胞扩增机202的轴(例如258(在图3示出))的偏置臂或弹簧构件404。
根据一些实施方案，预安装的流体运输组件400包括管道408A、408B、408C、408D、408E等，以及各种管道配件，以提供如下所述如图5A、5B、5C，和6所示的流体路径。还为泵提供泵回路406A、406B和406C。在一些实施方案中，尽管可以在细胞扩增机202所在的位置处提供各种培养基，但是根据一些实施方案，预安装的流体运输组件400可以包括足够的管道长度以延伸到细胞扩增机202的外部并且能够焊接到与培养基袋或容器相关的管道。
接下来，图5A、5B和5C示出了细胞扩增系统500的实施方案的示意图，并且图6示出了细胞扩增系统600的另一个实施方案的示意图。如图5A、5B、5C和6中的实施方案所示，并且如下所述，细胞在IC空间中生长。然而，本发明不限于这些实例，并且在其他实施方案中可以提供细胞在EC空间中生长。
如所指出的，图5A、5B和5C示出了CES 500。而图5A、5B和5C描绘了CES 500的基本相似的结构组件，图5A、5B和5C示出了根据本发明的实施方案的使用CES 500的结构特征在第一流体循环路径中的流体运动的可能的操作配置。如图所示，CES 500包括第一流体循环路径502(也称为“毛细管内回路”或“IC回路”)和第二流体循环路径504(也称为“毛细管外回路”或“EC回路”)。第一流体流动路径506可以与细胞生长室501流体相关以形成第一流体循环路径502。流体通过IC入口端口501A流入细胞生长室501，通过细胞生长室501中的中空纤维，并经由IC出口端口501B离开。压力计510测量离开细胞生长室501的培养基的压力。培养基流过可用于控制培养基流速的IC循环泵512。IC循环泵512可以沿第一方向或与第一方向相反的第二方向泵送流体。出口端口501B可以用作反向的入口。例如，在第一配置中，IC循环泵可以沿正向泵送流体，在该正向上流体进入IC入口端口501A。例如，在第二配置中，IC循环泵可沿负向泵送流体，例如，流体沿该负向进入IC出口端口501B。
进入IC回路的培养基可以通过阀514进入。如本领域技术人员将理解的，可以在各个位置放置额外的阀、压力/温度传感器、端口，和/或其他设备以隔离和/或测量沿着流体路径的多个部分的培养基特征。因此，应该理解，所示的示意图表示CES 500的各种元件的一种可能的配置，并且所示的示意图的修改在一个或更多个现有实施方案的范围内。
关于IC回路502，可以在操作期间从样品端口516或样品线圈518获得培养基样品。设置在第一流体循环路径502中的压力/温度计520允许在操作期间检测培养基压力和温度。然后培养基返回到IC入口端口501A以完成流体循环路径502。在细胞生长室501中生长/扩增的细胞可以通过阀598从细胞生长室501冲洗到收获袋599中，或者在中空纤维内重新分配以进一步生长。
第二流体循环路径504中的流体经由EC入口端口501C进入细胞生长室501，并经由EC出口端口501D离开细胞生长室501。EC回路504中的培养基可以与细胞生长室501中的中空纤维的外侧接触，从而允许小分子扩散进出中空纤维。
根据一个实施方案，设置在第二流体循环路径504中的压力/温度计524允许在培养基进入细胞生长室501的EC空间之前测量培养基的压力和温度。压力计526允许在培养基离开细胞生长室501之后测量第二流体循环路径504中的培养基的压力。关于EC回路，可以在操作期间从样品端口530或样品线圈获得培养基样品。
在一些实施方案中，在离开细胞生长室501的EC出口端口501D之后，第二流体循环路径504中的流体通过EC循环泵528到达氧合器或气体传输模块532。EC循环泵528也可以相反的方向泵送流体。第二流体流动路径522可经由氧合器入口端口534和氧合器出口端口536与氧合器或气体传输模块532流体相关。在操作中，流体培养基经由氧合器入口端口534流入氧合器或气体传输模块532，并且经由氧合器出口端口536离开氧合器或气体传输模块532。例如，氧合器或气体传输模块532向CES 500中的培养基添加氧气并从中移除气泡。在各种实施方案中，第二流体循环路径504中的培养基可以与进入氧合器或气体传输模块532的气体处于平衡。氧合器或气体传输模块532可以是任何适当尺寸的氧合器或气体传输设备。空气或气体经由过滤器538流入氧合器或气体传输模块532，并通过过滤器540流出氧合器或气体传输设备532。过滤器538和540减少或防止氧合器或气体传输模块532和相关培养基的污染。在灌注事件(priming sequence)部分期间从CES 500净化的空气或气体可经由氧合器或气体传输模块532排放到大气中。
根据至少一个实施方案，可以经由第一流体流动路径506将含细胞(来自袋562)的培养基和来自袋546的流体培养基引入第一流体循环路径502。流体容器562(例如，用于将空气引出系统的细胞进入袋或盐水灌注液)可以经由阀564与第一流体流动路径506和第一流体循环路径502流体相关。
流体容器或培养基袋，544(例如，试剂)和546(例如，IC培养基)可分别经由阀548和550与第一流体进入路径542流体相关，或经由阀570和576与第二流体进入路径574流体相关。还提供了第一和第二无菌可密封输入灌注路径508和509。空气移除室(ARC)556可以与第一循环路径502流体相关。空气移除室556可以包括在空气移除室556内的某些测量位置处的一个或更多个超声波传感器，该超声传感器包括上部传感器和下部传感器以检测空气、流体缺乏，和/或气体/流体界面(例如，空气/流体界面)。例如，可以在空气移除室556的底部附近和/或顶部附近使用超声波传感器来检测这些位置处的空气、流体和/或空气/流体界面。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，实施方案提供了许多其他类型的传感器的使用。例如，可以根据本发明的实施方案使用光学传感器。在灌注事件或其他方案的部分期间从CES 500净化的空气或气体可经由管线558排放到空气阀560外的大气，管线558可与空气移除室556流体相关。
可以将EC培养基(例如，来自袋568)或洗涤溶液(例如，来自袋566)添加到第一或第二流体流动路径中。流体容器566可与阀570流体相关，阀570可以经由分配阀572和第一流体进入路径542与第一流体循环路径502流体相关。或者，通过打开阀570并关闭分配阀572，流体容器566可以经由第二流体进入路径574和EC进入路径584与第二流体循环路径504流体相关。同样地，流体容器568可与阀576流体相关，阀576可以经由第一流体进入路径542和分配阀572与第一流体循环路径502流体相关。或者，通过打开阀576并关闭分配阀572，流体容器568可以与第二流体进入路径574流体相关。
可以提供可选的热交换器552用于培养基试剂或冲洗溶液引入。
在IC回路中，流体可以最初由IC进入泵554推进。在EC回路中，流体可以最初由EC进入泵578推进。诸如超声波传感器的空气检测器580也可以与EC进入路径584相关。
在至少一个实施方案中，第一和第二流体循环路径502和504连接到废物管线588。当阀590打开时，IC培养基可以流过废物管线588并流到废物袋或排出袋586。同样，当阀582打开时，EC培养基可以通过废物管线588流到废物袋或排出袋586。
在一些实施方案中，可以通过细胞收获路径596收获细胞。此处，可以经由将含有细胞的IC培养基通过细胞收获路径596和阀598泵送至细胞收获袋599来收获来自细胞生长室501的细胞。
CES 500的各种部件可以包含或容纳在机器或壳体内(诸如细胞扩增机202(图2和3))，其中，例如，该机器在预定温度下维持细胞和培养基。
在一个实施方案中，在针对图5A中的CES 500描绘的配置中，第一流体循环路径502和第二流体循环路径504中的流体培养基沿相同方向(并流配置)流过细胞生长室501。在另一个实施方案中，CES 500还可以被配置为以逆流构造(未示出)流动。在图5A所示的配置中，第一流体循环路径502中的流体在IC入口端口501A处进入生物反应器501，并在IC出口端口501B处离开生物反应器501。根据实施方案，在图5B和5C所示的配置中，第一循环路径502中的流体培养基可以从连接部517沿相反或相对的方向流动，使得流体可以进入IC入口端口(生物反应器的一端上的第一端口501A)，并且流体可以进入IC出口端口(在生物反应器的相对端上的第二端口501B)，以将细胞保留在生物反应器本身中。第一流体流动路径可以通过连接517与第一流体循环路径流体相关。在实施方案中，连接部517可以是例如流体基于IC进入泵和IC循环泵的方向以相反方向流动的点或位置。在一个实施方案中，连接部517可以是T形配件(fitting)或T形接头。在另一个实施方案中，连接部517可以是Y形配件或Y形接头。连接517可以是任何类型的配件、接头、融合件、通路、管道等，从而使得第一流体流动路径能够与第一循环路径流体相关。应该理解的是，图5A，图5B和图5C中所示的示意图和操作配置示出了细胞扩增系统的各种元件的可能配置，并且所示的示意图和操作配置的修改在一个或更多个本实施方案的范围内。
转到图6，示出了细胞扩增系统600的另一个实施方案的示意图。CES 600包括第一流体循环路径602(也称为“毛细管内回路”或“IC回路”)和第二流体循环路径604(也称为“毛细管外回路”或“EC回路”)。第一流体流动路径606可以与细胞生长室601流体相关以形成第一流体循环路径602。流体通过IC入口端口601A、通过细胞生长室601中的中空纤维流入细胞生长室601，并经由IC出口端口601B离开。压力传感器610测量离开细胞生长室601的培养基的压力。除了压力之外，在一些实施方案中，传感器610也可以是在操作期间检测培养基压力和温度的温度传感器。培养基流过可用于控制培养基流速的IC循环泵612。IC循环泵612可以沿第一方向或与第一方向相反的第二方向泵送流体。出口端口601B可以用作反向的入口。进入IC回路的培养基可以通过阀614进入。如本领域技术人员将理解的，可以在各个位置放置额外的阀、压力计、压力/温度传感器、端口，和/或其他设备以隔离和/或测量沿着流体路径的各部分的培养基特征。因此，应当理解，所示的示意图表示CES 600的各种元件的一种可能的配置，并且所示的示意图的修改在一个或更多个本实施方案的范围内。
关于IC循环，可以在操作期间从样品线圈618获得培养基样品。然后培养基返回到IC入口端口601A以完成流体循环路径602。在细胞生长室601中生长/扩增的细胞可以通过阀698和管线697从细胞生长室601冲出到收获袋699中。或者，当阀698关闭后，细胞可以生长室601中重新分配以进一步生长。
第二流体循环路径604中的流体经由EC入口端口601C进入细胞生长室601，并经由EC出口端口601D离开细胞生长室601。根据实施方案，EC回路中的培养基可以与细胞生长室601中的中空纤维的外侧接触，从而允许小分子扩散进入和离开可在室601内的中空纤维。
设置在第二流体循环路径604中的压力/温度传感器624允许在培养基进入细胞生长室601的EC空间之前测量培养基的压力和温度。传感器626允许在第二流体循环路径604中的培养基在离开细胞生长室601之后测量其压力和/或温度。关于EC回路，可以在操作期间从样品端口630或样品线圈获得培养基样品。
在离开细胞生长室601的EC出口端口601D之后，第二流体循环路径604中的流体通过EC循环泵628到达氧合器或气体传输模块632。根据一些实施方案，EC循环泵628也可以沿相反方向泵送流体。第二流体流动路径622可以经由氧合器或气体传输模块632的入口端口632A和出口端口632B与氧合器或气体传输模块632流体相关。在操作中，流体培养基经由入口端口632A流入氧合器或气体传输模块632，并经由出口端口632B离开氧合器或气体传输模块632。例如，氧合器或气体传输模块632将氧气添加到CES 600中的培养基中并从中移除气泡。在各种实施方案中，第二流体循环路径604中的培养基可以与进入氧合器或气体传输模块632的气体相平衡。氧合器或气体传输模块632可以是用于氧合或气体传输的任何适当尺寸的设备。空气或气体经由过滤器638流入氧合器或气体传输模块632，并通过过滤器640流出氧合器或气体传输设备632。过滤器638和640减少或防止氧合器或气体传输模块632和相关培养基的污染。在灌注事件的部分期间从CES 600净化的空气或气体可经由氧合器或气体转移模块632排放到大气中。
在对CES 600描绘的配置中，第一流体循环路径602和第二流体循环路径604中的流体培养基以相同方向(并流配置)流过细胞生长室601。根据实施方案，CES 600还可以配置成以对流构造流动。
根据至少一个实施方案，包括细胞(来自诸如细胞容器(如袋)的源)的培养基可以附接在附接点662，并且来自培养基源的流体培养基可以附接在附接点646。可以经由第一流体流动路径606将细胞和培养基引入第一流体循环路径602。附接点662可以经由阀664与第一流体流动路径606流体相关，并且附接点646可以经由阀650与第一流体流动路径606流体相关。试剂源可以流体地连接到点644并且经由阀648与流体进入路径642流体相关，或经由阀648和672与第二流体进入路径674流体相关。
空气移除室(ARC)656可以与第一循环路径602流体相关。空气移除室656可以包括一个或更多个超声波传感器，该超声传感器包括上部传感器和下部传感器以在空气移除室656内的某些测量位置处的检测空气、流体缺乏，和/或气体/流体界面(例如，空气/流体界面)。例如，可以在空气移除室656的底部附近和/或顶部附近使用超声波传感器来检测这些位置处的空气、流体和/或空气/流体界面。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，实施方案提供了许多其他类型的传感器的使用。例如，可以根据本发明的实施方案使用光学传感器。在灌注事件或其他方案的部分期间从CES 600净化的空气或气体可经由管线658排放到空气阀660外的大气，管线658可与空气移除室656流体相关。
EC培养基源可以附接到EC培养基附接点668，并且洗涤溶液源可以附接到洗涤溶液附接点666，以将EC培养基和/或洗涤溶液添加到第一或第二流体流动路径。附接点666可与阀670流体相关，阀670可以经由阀672和第一流体进入路径642与第一流体循环路径602流体相关。或者，通过打开阀670并关闭阀672，附接点666可以经由第二流体进入路径674和第二流体流动路径684与第二流体循环路径604流体相关。同样地，附接点668可与阀676流体相关，阀676可以经由第一流体进入路径642和阀672与第一流体循环路径602流体相关。或者，通过打开阀676并关闭分配阀672，流体容器668可与第二流体进入路径674流体相关。
在IC回路中，流体可以最初由IC进入泵654推进。在EC回路中，流体可以最初由EC进入泵678推进。诸如超声波传感器的空气检测器680也可以与EC进入路径684相关。
在至少一个实施方案中，第一和第二流体循环路径602和604连接到废物管线688。当阀690打开时，IC培养基可以流过废物管线688流到废物袋或排出袋686。同样，当阀692打开时，EC培养基可以流到废物袋或排出袋686。
当细胞在细胞生长室601中生长之后，可以通过细胞收获路径697收获细胞。此处，可以在阀698打开的情况下，通过将含有细胞的IC培养基通过细胞收获路径697泵送至细胞收获袋699来收获来自细胞生长室601的细胞。
CES 600的各种组件可以包含或容纳在机器或壳体内(诸如细胞扩增机202(图2和3))，其中，例如，该机器在预定温度下维持细胞和培养基。进一步应注意，在一些实施方案中，可以组合CES 600和CES 500的组件。在其他实施方案中，CES可以包括比CES 500和CES600中所示的组件更少或额外的部件，并仍然在本发明的范围内。可以合并本发明的特征的细胞扩增系统的实例是细胞扩增系统，细胞扩增系统由科罗拉多州莱克伍德的Terumo BCT公司制造。
应该理解的是，图6所示的示意图表示细胞扩增系统的各种元件的可能配置，并且对所示的示意图的修改落入一个或更多个本实施方案的范围内。
细胞扩增系统的实例和进一步描述在于美国专利No.8,309,347(“细胞扩增系统和使用方法”，2012年11月13日出版)和2010年12月15日提交的美国专利No.9,057,045号(“在细胞扩增系统的生物反应器中装载和分配细胞的方法”，于2015年6月16日出版)中提供，通过引用将其全文合并与本文中，以用于其所有教导和所有目的。
尽管已经描述了细胞扩增系统及其相关方法的各种示例性实施方案，但是根据本发明的实施方案，图7示出了的用于在诸如CES 500或CES 600的细胞扩增系统中扩增非贴壁或悬浮细胞的过程的示例性操作步骤700。
启动开始操作702，并且过程700进行到细胞的制备704。在实施方案中，细胞的制备704可以涉及许多不同和可选的步骤。例如，细胞可以被收集706。细胞的收集706可以涉及从供体分离和收集细胞。在一些实施方案中，可以进行血液分离术(例如白细胞分离术)程序以从供体的外周血中收集一定量的淋巴细胞。淋巴细胞的体积可以包括将由过程700扩增的靶细胞群。在其他实施方案中，可以从脐带血中收集细胞。
在收集706之后，可选地，可以细胞可以被分离708作为制备704的一部分。在步骤706收集的细胞体积可以包括许多不同的细胞类型，包括作为扩增靶标的细胞。可以进行可选步骤708以分离靶细胞。作为一个实例，靶细胞可以是T细胞，例如幼稚、记忆、辅助、效应和/或调节性T细胞。在一些实施方案中，在步骤706收集的细胞可以在收集后不久(例如，它们可以是新鲜的)被分离708。在其他实施方案中，在706收集的细胞可以被冷冻用于储存。在这些实施方案中，作为步骤708的一部分，可以在分离细胞之前执行解冻步骤。
在一个实施方案中，T细胞可以是调节T细胞，例如，具有包括CD4+、CD25+、FoxP3+和/或其组合的表型的T细胞。在其他实施方案中，T细胞可以是效应、辅助、记忆和/或幼稚T细胞，例如具有包括CD3+、CD4+、CD8+和/或其组合的表型的T细胞。可以使用任何合适的分离技术来分离细胞。例如，可以使用免疫磁分离法分离细胞，其中用抗体功能化的磁珠与在706收集的细胞接触。功能化的磁珠可以优先附着于靶细胞群。然后可以使用磁场将珠子与附着的靶细胞群结合在一起，而其他细胞则可以被除去。在其他实施方案中，可以使用ficoll分离程序分离细胞。还在另一些实施方案中，可以使用淘析法分离细胞，诸如使用由加州莱克伍德的特鲁莫BCT制造的细胞分离系统。
在一些实施方案中，在分离步骤708之后，细胞可以被冷冻用于储存。在实施方案中，分离的细胞可以与冷冻保护剂混合，并在细胞扩增之前储存一段时间。这些实施方案可以包括在步骤708分离细胞后执行的冷冻步骤。
可以在分离708之后将细胞可选地重悬710(和/或如果预先冷冻则解冻)。在实施方案中，可以将细胞重悬在包含多种营养物和/或试剂的培养基中，所述营养物和/或试剂有助于维持细胞的活力。在实施方案中，培养基可以至少包括血清白蛋白和诸如细胞因子的试剂。在实施方案中，细胞因子可以是重组人IL-2细胞因子。在一个实施方案中，培养基可包含浓度为200IU/ml的细胞因子。在另一个实施方案中，培养基可以包括浓度为100IU/ml的细胞因子。还在一个实施方案中，细胞可以与人抗体血清悬浮在PBS中。例如，细胞可以悬浮在含有PBS和5％人抗体血清的流体中。在一些实施方案中(诸如利用珠子作为活化剂的实施方案中)，人抗体血清可以存在于所有步骤中；包括细胞装载步骤。不受理论束缚，据信人血清含有LFA-3(CD58)，其可结合T细胞上的CD2，这可使细胞和珠子的聚集最小化。
在细胞的制备704之后，过程700进行至暴露细胞712以活化细胞来扩增。细胞可以可选地暴露于可溶性活化剂714。可以将可能包括抗体复合物的活化剂加入到细胞重悬的培养基中。在实施方案中，活化剂可以是人抗体CD3/CD28/CD2细胞活化剂复合物。在一些实施方案中，活化剂可以被包括在细胞710的重悬所用的培养基中。可选地，细胞可以暴露于珠716，珠表面上可以具有活化剂。
在实施方案中，将细胞暴露于珠子可包括将预定量的珠子加入重悬的细胞中。可以相对于细胞数量以不同比例添加珠。例如，可以以1个珠:2个细胞的比例添加珠。其他实施方案可提供以不同比例，例如约1个珠子:约1个细胞、约1个珠子:约2个细胞、约1个珠子:约3个细胞、约1个珠子:约4个细胞、约2个珠子:约1个细胞、约3个珠子:约1个细胞、约4个珠子:约1个细胞、约5个珠子:约1个细胞等添加珠子。这些珠子在其表面上可具有抗体以活化细胞扩增。可以使用的珠子的一个实例包括可从马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默菲舍科学公司获得的珠子。在一些实施方案中，珠子可以在其表面上用抗体功能化，抗体的一些非限制性实例包括:抗CD2、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD28、抗CD34及其组合。
过程700进行至扩增细胞718。作为细胞扩增718的一部分，可以将细胞装载到进行细胞扩增的细胞生长室中，例如中空纤维膜生物反应器中。可以给细胞供养720营养物以促进其扩增。例如，可以将培养基递送到细胞生长室中以提供用于扩增的营养。细胞扩增718还可包括定期向细胞生长室添加试剂722以继续促进其扩增。例如，在一些实施方案中，可以将试剂(例如，细胞因子)添加至细胞生长室以促进细胞的扩增。在一个实施方案中，该试剂可以是另外的IL-2细胞因子，例如重组人IL-2细胞因子。
同样作为细胞扩增718的一部分，可以控制细胞生长室内的环境724。例如，气体可以连续地输送和交换以向细胞生长室中扩增的细胞提供例如二氧化碳和氧气的平衡。另外，可以将温度控制在针对细胞扩增而优化的范围内。细胞扩增718还可包括监测代谢物726。例如，可定期监测乳酸和葡萄糖水平。代谢物的上升或下降可以促使变化(例如，额外的供养、额外的试剂添加、额外的气体交换等)以控制细胞生长室内的环境724。
接下来，过程700进行至收获细胞728。可以在步骤730可选地进行对去除的细胞的进一步处理或其他分析。例如，可以表征细胞以确定细胞表型。进一步处理或其他分析730可以包括进行例如流式细胞术以表征细胞表型。然后，过程700可以在结束操作732处终止。如果不希望进行进一步的处理/分析，则过程700在结束操作732处终止。
图8A示出了根据本发明的实施方案的过程的操作步骤800，其可以用于将细胞或其他材料(例如，蛋白质、营养物、生长因子)置于细胞生长室中。在实施方案中，过程800可以作为“在没有循环的情况下集中装载细胞”任务的一部分来实施。启动开始操作802，并且过程800进行到步骤804，其中可以将具有细胞的第一体积的流体装载到细胞扩增系统的细胞生长室中。在实施方案中，细胞可以包含非贴壁细胞，诸如一种或更多种类型的T细胞。在一个实施方案中，多个细胞包含Treg。在其他实施方案中，细胞可以是单核细胞(诸如PBMC细胞)，其包括多种T细胞表型。可以理解的是，可以通过上述的细胞扩增系统(诸如系统CES500(例如，图5A)和CES 600(图6))的组件，来进行对具有细胞的第一体积的流体装载。图8B示出了细胞扩增系统的一部分，其包括第一进入泵840、第一流体流动路径860、第一流体循环泵848、第一流体循环路径852、细胞生长室844和第二流体循环路径854。第一流体流动路径860通过连接部860B与流体循环路径852流体相关。实施方案可以提供利用第一流体进入泵840通过第一流体流动路径860装载具有细胞的第一体积的流体804，并进入第一流体循环路径852。在实施方案中，第一体积的流体被装载而无需启动第一流体循环泵848。
如图8B所示，第一流体循环路径852的体积可以包括其部分的多个体积。例如，该体积的第一部分可以是细胞生长室844的毛细管内空间(当细胞生长室是中空纤维膜生物反应器时)。该体积的第二部分可以从连接部860B到细胞生长室844的入口端口844A。第三部分可以从连接部860B到细胞生长室844的出口端口844A。
过程800进行到第二体积的流体806的装载。第二体积的流体可以包括培养基，并且可以被引入到第一流体流动路径860的一部分中。在实施方案中，可以选择预定量的第二体积以将808第一体积置于细胞生长室844的第一部分中。在实施方案中，流体的第一体积和流体的第二体积可以相同。在其他实施方案中，流体的第一体积和流体的第二体积可以不同。在其他实施方案中，流体的第一体积和流体的第二体积之和可以等于百分比的第一流体循环路径(例如路径852(图8B))的体积。
为了放置第一体积的流体，第二体积的流体必须足以将第一体积推入细胞生长室844中的期望位置。因此，在实施方案中，流体的第二体积可以与连接部860B和入口端口844A之间的第一流体循环路径852的容积大约一样大。可以理解，这会将具有细胞的第一体积的流体推入细胞生长室844内的位置。
在其他实施方案中，第一体积的流体(具有细胞)可以在细胞生长室844的中心区域866附近放置808。在这些实施方案中，第二体积可以与连接部860B和入口端口844A之间的第一流体循环路径852的体积之和一样大，并且由细胞生长室844组成第一流体循环路径的体积(例如，毛细管内空间的体积)，当放置在细胞生长室内时，细胞生长室844不会被第一流体循环路径852占据。例如，在一个实施方案中，流体的第一体积(具有细胞)可以是50ml。细胞生长室可具有例如124ml的体积。当第一体积放置于中心区域866周围时，它将占据中心区域866周围的50毫升，剩下74毫升位于中心区域866的两侧。因此，可以将74毫升的50％(或37毫升)添加到连接860部与入口端口844A之间的体积中，以将第一体积的50ml置于中心区域866周围。
在实施方案中，将第一体积放置808可以包括添加额外体积的流体以将具有细胞的第一体积放置在细胞生长室中。例如，如果用第二体积没有达到第一体积的期望位置，则可以添加额外的流体以放置第一体积808。
过程800进行到问询810，以确定是否应重新放置第一体积。例如，在实施方案中，第一体积可以放置在更靠近入口端口844A。如果期望将第一体积移近细胞生长室844的中心区域866，则过程800可以循环回到步骤808，在此可以向第一流体循环路径添加额外流体以放置第一体积的流体。
如果在问询810确定不需要重新放置第一体积，则过程800进行到细胞供养812。在实施方案中，可以使用包括许多化合物(诸如葡萄糖、蛋白质、生长因子、试剂或其他营养物质)的培养基供养细胞。在实施方案中，细胞供养812可以包括启动进入泵和循环泵(例如，泵840和848)以将具有营养物的培养基输送到细胞生长室844中的细胞。如下所述，一些实施方式提供了在步骤812期间将细胞维持细胞生长室844中。这些实施方案可以涉及启动泵，例如，进入泵和循环泵(例如，如下所述的泵840和848)，从而使流体流入细胞生长室844的方向可以是双向的，诸如从入口端口844A和出口端口844B进入细胞生长室844。
然后，过程800进行到细胞扩增814，其中细胞可以被扩增或生长。根据实施方案，虽然在步骤812之后示出了步骤814，但是步骤814可以在步骤812之前或与步骤812同时发生。然后可以从细胞生长室中去除细胞816并将其收集在储存容器中。在实施方案中，步骤816可以包括多个子步骤。例如，在细胞被收集并存储在容器中之前，细胞可以由循环泵(例如，泵848)循环。处理800在结束操作830处终止。
接下来，图9A示出了根据本发明实施方案的用于将细胞保持在诸如CES 500(例如，图5B和5C)的细胞扩增系统的生物反应器中的过程的示例性操作步骤900。如上所述，停留在生物反应器集管或生物反应器IC回路外侧中的细胞可能无法接受适当的气体交换和营养物交换，这可能导致细胞聚集和死亡。在一个实施方案中，生物反应器通过半透性中空纤维膜提供气体交换和营养物交换。重要的是，这种交换是有效的，因为在包含中空纤维膜的细胞扩增系统中，表面积与体积之比可能比其他细胞培养方法的大得多(例如，约15倍于细胞培养瓶)。这样的效率可以通过使能够通过发生交换的膜表面的培养基成分的扩散距离最小化来实现。
例如，图9B示出了在细胞增殖期间(在生物反应器中存在约3E+09个T细胞)在细胞扩增系统(诸如细胞扩增系统)上放置的氧气消耗需求的图表936。图9B描绘了在生物反应器出口938处的氧气(O2)的百分比(％)。例如，根据一个实施方案，可以将用于测量氧水平的传感器放置在生物反应器的EC出口处。在另一个实施方案中，可以在生物反应器的IC出口处放置用于测量氧合作用的传感器。相对于运行时间940(例如，以分钟为单位)测量O2的百分比。根据一个实施方案，为使向细胞的氧气供应最大化，EC循环流速QEC循环可设置为300mL/min(942)。图9B示出了当EC循环速率从300mL/min(942)下降至50mL/min(944)时的氧合作用变化。例如，当培养基穿过生物反应器时，细胞可能会消耗培养基中的氧气(O2)。50mL/min(944)的流体在生物反应器中的移动比300mL/min(942)的流体更慢，因此，当EC循环速率为50mL/min时，细胞可能会有更长的时间或更多的机会剥离培养基的氧气。然后，当EC循环速率恢复至300mL/min(946)时，氧合作用恢复。图9B显示了将细胞保持在发生气体转移的纤维本身中的可能的益处，这与在生物反应器外部的IC循环路径的一部分中(例如，在细胞可能缺乏氧气的地方)相反。因此，通过引导培养基流进入生物反应器的两侧(例如，IC入口端口和IC出口端口)，在供养过程中将细胞群(例如非贴壁细胞)保留在生物反应器的中空纤维内可能是有益的。在一个实施方案中，可以使用到IC入口端口和IC出口端口的流量的相等分配。在另一个实施方案中，例如，取决于期望将细胞放置在生物反应器中的位置，与IC出口端口相比，可以使用更大的流至IC入口端口，反之亦然。
返回图9A，启动开始操作902，并且过程900进行至将一次性套件或预安装的流体输送组件(例如210或400)装载到细胞扩增系统904上。然后，一次性套件可以被灌注906，其中装置可以例如，用Lonza不含Ca2+/Mg2+的PBS灌注906。在准备装载和接种细胞时，可以使用IC/EC冲洗908更换灌注液。例如，在一个实施方案中，可以将系统中的PBS更换为TexMACSGMP基础培养基。在其他实施方案中，基础培养基可以是Prime XV、高级RPMI+谷氨酰胺、RPMI 1640+谷氨酰胺，和/或IMDM+谷氨酰胺。接下来，过程900进行至关闭IC排出阀910。在实施方案中，EC排出阀可以打开以使得添加到包括中空纤维膜的生物反应器的中空纤维的流体的能够超滤。接下来可以对培养基进行调节912。接下来，过程900进行到装载细胞914，例如，悬浮细胞或非贴壁细胞(例如T细胞(诸如Treg))。在一个实施方案中，可以通过“在没有循环的情况下集中装载细胞”任务来装载这些细胞914。在另一个实施方案中，可以通过“在均匀悬浮的情况下装载细胞”任务来装载这些细胞914。在其他实施方案中，可以使用其他装载任务和/或装载过程。
在一个实施方案中，例如，可将被装载的细胞914悬浮在包含培养基的溶液中，以在例如该装载期间和之后供养细胞。在另一个实施方案中，这种溶液可以既包含用于供养细胞的培养基，又包含刺激细胞(例如T细胞)的可溶性活化剂复合物。如上所述，在一些实施方案中，活化剂可以是珠子。因此，被装载的细胞914还可以包括具有用于刺激细胞扩增的活化剂的珠子。在一些实施方案中，也可以存在人抗体血清。不受理论束缚，据信人血清含有LFA-3(CD58)，其可结合T细胞上的CD2，这可使细胞和珠粒的聚集最小化。这种装载914可以发生在第0天。
在装载细胞914之后，可进一步供养细胞916。在这种供养916期间，可能需要控制细胞在生物反应器本身中的停留。通过调节流量控制参数918，在生长的扩增阶段，细胞可以保留在生物反应器本身中，而不是例如从生物反应器到生物反应器外侧的IC回路的部分中损失细胞。根据实施方案，通过将细胞保留在生物反应器中，生物反应器中的细胞可以更靠近IC入口端口，在该IC入口端口中此类细胞可以接受最新鲜的生长培养基。另一方面，IC回路中的细胞可能正在接受可能会影响例如其糖酵解代谢的消耗性或条件性培养基。另外，根据一个实施方案，生物反应器中的细胞可通过来自EC回路循环的扩散而接收从气体传输模块(GTM)输入的混合气体(例如氧气、二氧化碳和氮气)，而IC回路其他部分的细胞可能不会接收这种混合气体。应当注意，尽管实施方案可以提供将细胞保留在生物反应器本身中，但是其他实施方案可以提供将细胞保持在任何位置，以改善营养物递送和/或气体交换。因此，实施方案提供了在不脱离本发明的精神和范围的情况下使用其他位置来保持细胞或控制细胞的停留。
返回图9A和过程900，根据实施方案，可以通过使IC循环泵速率与IC进入泵速率匹配，或近似匹配或基本匹配，但方向相反，来减少中空纤维膜生物反应器的细胞损失。可以调节IC进入泵920以产生第一流速或容积流速，并且可以调节IC循环泵922以产生第二逆流速或第二逆容积流速，其中容积流速或流体流速或流体流动流速或流速可被认为是每单位时间通过的流体体积(可由符号“Q”表示)。在实施方案中，例如，0.1mL/min的IC进入泵速率可以与-0.1mL/min的互补IC循环泵速率匹配或近似匹配或基本匹配，以在细胞培养的生长阶段(例如，可能是4-7天)将细胞维持在生物反应器中。在其他实施方案中，生长阶段可以是2-7天或者2-8天。例如，这种泵调节918可以使得能够抵消与从生物反应器的IC出口端口损失细胞有关的任何力。
接下来，可以使得细胞能够生长或扩增924。细胞不限于在步骤924生长或扩增，相反，细胞还可以在例如步骤914、916、918、920、922扩增。过程900接下来可以进行到收获操作926，在该操作中，可以将细胞转移到收获袋或容器中。然后可以从细胞扩增系统中卸下该一次性套件932，然后过程900在结束操作934处终止。
或者，从收获操作926开始，过程900可以可选地进行以使得能够进一步的处理/分析928。这种进一步的处理928可以包括例如对所收获的细胞的表型的表征。从可选的进一步处理/分析步骤928开始，过程900可以进行以可选地重新装载任何剩余的细胞930。然后，过程900可以进行以卸载一次性套件932，然后过程900可以在结束操作934处终止。或者，过程900可以从进一步的处理/分析步骤928进行，以卸载一次性套件932。然后，过程900可以在结束操作934处终止。
接下来，图10A示出了根据本发明的实施方案的用于供养细胞的过程的示例性操作步骤1000，该过程可以与诸如CES 500(例如，图5B和5C)的细胞扩增系统一起使用。例如，启动开始操作1002，并且过程1000进行到将一次性套件装载到细胞扩增系统上，灌注套件，进行IC/EC冲洗，调节(condition)培养基并装载细胞，例如悬浮或非贴壁细胞。接下来，过程1000进行到在第一时间段1004期间供养细胞。在实施方案中，可以使用第一进入流速和第一循环流速。作为实例，可以使用第一IC进入流速和第一IC循环流速，其中第一IC进入流速可以由IC进入泵(例如，第一泵)控制，并且第一IC循环流速可以由IC循环泵(例如第二泵)控制。在示例性实施方案中，IC进入泵(554)可以使体积流速为0.1mL/min而进入生物反应器(501)的IC入口端口(501A)，以及IC循环泵(512)使互补的IC循环体积流速或流体流速为-0.1mL/min而进入生物反应器(501)的IC出口端口(501B)，其中-0.1mL/min中使用的负号(“-”)指示以在细胞培养物的生长阶段期间引起或产生逆流速率以将细胞保持在生物反应器中的IC循环泵(512)的方向。
在细胞的供养过程中以及在供养过程中使用IC泵通过流动和逆流特性控制细胞在生物反应器中的停留，细胞继续生长和扩增。结果，细胞可能需要额外的培养基，例如葡萄糖和/或细胞生长配制的培养基，以支持不断扩增的群体。还可以努力控制扩增细胞群的乳酸值。在实施方案中，细胞培养物乳酸值可以维持在或低于约20mmol/L，维持在或低于约15mmol/L，维持在或低于约10mmol/L，或甚至维持在或低于约7mmol/L。在其他实施方案中，例如，可以控制培养基的添加速率和/或其他设置，以试图维持例如乳酸水平≤约5mmol/L，以改善细胞生长和活力。还在一些其他实施方案中，可以控制例如培养基添加的速率和/或其他设置，以试图保持乳酸盐水平≤约15mmol/L，例如，以改善细胞生长和生存能力。在其他实施方案中可以使用其他浓度。
在示例性实施方案中，可以通过在多个时间段，根据实施方案，例如几天(第4-8天)中同时将中空纤维膜的内腔内的IC进入(+)泵速和IC循环(-)泵速两者从±0.1增加到±0.4mL/min，努力将乳酸值控制在≤约7mmol/L。例如，图10B提供了示例性IC泵送速率的表1018，该示例性IC泵送速率用于使用“供养细胞”任务，例如通过细胞扩增系统(例如，CES500)进行供养。表1018提供了示例时间段1020(例如，天)比上示例IC泵速1022，以产生到生物反应器两侧的容积流速，以将细胞维持在生物反应器中。例如，第0-4天(1024)可以使用0.1mL/min(1026)的IC进入或输入泵速和-0.1mL/min(1028)的IC循环泵速；第5天(1030)可以使用0.2mL/min(1032)的IC进入泵速和-0.2mL/min(1034)的IC循环泵速；第6天(1036)可以使用0.3mL/min(1038)的IC进入泵速率和-0.3mL/min(1040)的IC循环泵速；和第7天(1042)可以使用0.4mL/min的IC进入泵速(1044)和-0.4mL/min的IC循环泵速(1046)。尽管在图10的表1018中提供了在细胞培养物的生长阶段期间在将细胞保持在生物反应器中的同时供养细胞的示例性泵送速率为±0.1至±0.4mL/min，可以根据实施方案而不违背本发明的精神和范围使用其他泵速和所得流速。例如，尽管在该实例中示出了用于增加供养流速的增量为±0.1mL/min，但是其他增量(例如，±0.005mL/min、±0.05mL/min等)也可以用于增加实施方案中的供养流速。提供在图10B的表1018中的时间段(例如，天)和泵速仅出于说明性目的，而无意于限制。
在另一个示例性实施方案中，可以通过在细胞扩增的一段时间内同时增加中空纤维膜内腔中的IC进入(+)泵速率和IC循环(-)泵速率来努力将乳酸值控制在≤15mmol/L。例如，在第一时间段(第0-2天或第0-4天)期间，可以使用0.1mL/min的IC进入或输入泵速率和-0.1mL/min的IC循环泵速率。在第二时间段期间(第3-7天或第5-8天)，可以使用0.4mL/min的IC进入或输入泵速率和-0.4mL/min的IC循环泵速率。根据实施方案，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以使用其他泵送速率和所得流速。例如，当增量约为0.1mL/min(例如，±0.1mL/min；±0.2mL/min；±0.3mL/min等)为了增加供养流速，在该实施方案中示出了其它顺序的增量(例如，±0.005mL/min、±0.05mL/min等)可用于增加实例中的供养流速。时间周期(例如天数)和泵送速率仅仅是为了说明的目的而提供的，并不旨在进行限制。
返回图10A，过程1000从在第一时间段1004期间供养细胞进行到将第一进入流速增加第一量以实现第二进入流速1006。例如，如上所述的图10B中描绘的实施方案中，IC进入泵送速率(+)可以从0.1mL/min增加到0.2mL/min，以产生0.2mL/min的IC进入流速。此外，IC循环泵速(-)可同时从-0.1mL/min增加到-0.2mL/min，以产生-0.2mL/min的IC循环流速。因此，将第一循环流速增加第一量以达到第二循环流速1008。例如，然后可以在第二时间段内以第二进入流速和第二循环流速1010供养细胞，以维持细胞在生物反应器中以及在集管的外侧和在生物反应器的IC循环路径外侧的一部分的外侧。在第二时间段的供养1010之后，例如，如果不希望继续供养和/或扩增细胞，则过程1000可以在结束操作1016处终止。或者，过程1000可以可选地继续增加或以其它方式改变供养流速1012。可以存在任何数目的供养时间段，如省略号1014所示。在所需数目的供养时间段1014之后，然后过程1000终止在结束操作1016处。尽管图10A和10B以及过程1000示出了流速的“增加”，但是可以对流速进行其他调整。例如，从一个供养时段到下一个供养时段，流速可以减小或基本相同。例如，诸如代谢活动之类的考虑因素可以确定流量的调节方式。提供图10A和图10B中的流速“增加”仅出于说明的目的，而无意于进行限制。
转向图11A，根据本发明的实施方案，提供了可以与诸如CES 500(例如，图5B和5C)的细胞扩增系统一起使用的细胞供养过程的示例操作步骤1100。启动开始操作1102，并且过程1100进行到将一次性套件装载到细胞扩增系统上，对该装置进行灌注，进行IC/EC冲洗，调节培养基，以及装载细胞，例如悬浮或非贴壁细胞。接下来，过程1100进行到在第一时间段1104期间供养细胞。在实施方式中，可以使用第一进入速率或流速以及第一循环速率或流速。作为实例，可以使用第一IC进入流速和第一IC循环流速，其中第一IC进入流速以由IC进入泵(例如，第一泵)控制，并且第一IC循环流速可以由IC循环泵(例如第二泵)控制。在示例性实施方案中，IC进入泵(554)可以使体积流速为0.1mL/min而进入生物反应器(501)的IC入口端口(501A)，以及IC循环泵(512)使互补的IC循环体积流速或流体流速为-0.1mL/min而进入生物反应器(501)的IC出口端口(501B)，其中-0.1mL/min中使用的负号(“-”)指示以在细胞培养物的生长阶段期间引起或产生逆流速率以将细胞保持在生物反应器中的IC循环泵(512)的方向。
在细胞的供养以及使用IC泵通过流动和逆流特性控制细胞在生物反应器中的停留期间，细胞继续生长和扩增。结果，细胞可能需要额外的培养基，例如葡萄糖和/或细胞生长配制的培养基，以支持不断扩增的群体。还可以努力控制扩增细胞群的乳酸值。在示例性实施方案中，可以通过在多个时间段(根据实施方案，例如几天(第4-8天))中同时将中空纤维膜的内腔内的IC进入(+)泵速和IC循环(-)泵速两者从±0.1增加到±0.4mL/min，努力将乳酸值控制在≤约7mmol/L。例如，对于供养的示例性泵速参见图10B，表1018以及如上所讨论的。尽管在图10B的表1018中提供了在细胞培养物的生长阶段期间在将细胞保持在生物反应器中的同时供养细胞的示例性泵送速率为±0.1至±0.4mL/min，可以根据实施方案而不违背本发明的精神和范围使用其他泵速和所得流速。在另一个示例性实施方案中，根据实施方案，可以努力将乳酸值控制在≤约15mmol/L，例如，通过在多天内同时增加中空纤维膜内腔中的IC进入(+)泵送速率和IC循环(-)泵送速率。上述提及，并例如列在图10B的表1018中提供的时间段(例如，天)和泵速仅出于说明性目的，而无意于限制。
返回图11A，过程1100从在第一时间段1104期间供养细胞进行到将第一进入速率或流速增加第一量以实现第二进入速率或流速1106。如上所述的图10B描绘的实施方案中，IC进入泵送速率(+)可以从0.1mL/min增加到0.2mL/min，以产生0.2mL/min的IC进入流速。此外，IC循环泵速(-)可同时从-0.1mL/min增加到-0.2mL/min，以产生-0.2mL/min的IC循环流速。在其他实施方案中，IC进入泵速率(+)可以从0.1mL/min增加到0.4mL/min，以产生0.2mL/min的IC进入流速。此外，IC循环泵速率(-)可以同时从-0.1mL/min增加到-0.4mL/min，以产生-0.4mL/min的IC循环流速。因此，将第一循环速率或流动速率增加第一量以实现第二循环速率或流动速率1108。然后可以在第二时间段期间以第二进入速率或流动速率以及以第二循环速率或流速1110供养细胞，以将细胞例如维持在生物反应器中以及集管或生物反应器的IC循环路径外侧的一部分的外侧。在第二阶段的供养1110之后，例如，如果不需要继续供养和/或扩增细胞，则过程1100可以在结束操作1116处终止。
或者，过程1100可以可选地基于代谢活动来确定是调节供养速率或者流速，其中进行过程1100到可选问询1112，以确定是否基于代谢水平来调节供养。监测葡萄糖和/或乳酸水平可以促进细胞扩增系统培养基流速例如IC培养基流速的调节，以支持细胞例如Treg在生物反应器例如中空纤维生物反应器中的扩增。
如图11B和11C所示，实施方案提供了例如控制细胞扩增运行或涉及T细胞(例如作为非限制性实例的hTreg)扩增的程序的乳酸值。曲线图1118和1132指示葡萄糖和乳酸水平的测量可用于调节细胞扩增系统培养基流速，例如IC培养基流速，以支持T细胞(例如Treg)的扩增。例如，图11B提供了曲线图1118，其显示了扩增的hTreg的代谢，其中这种细胞扩增可以发生在诸如细胞扩增系统的细胞扩增系统中。显示了跨时间段(例如，天数1126)的各种细胞扩增运行1124和1125的葡萄糖浓度(mg/dL)1120和乳酸浓度(mmol/L)1122。在这些Treg运行1124和1125中，可能需要付出很多努力例如，通过同时将在第4至第8天的中空纤维膜腔内的IC进入(+)泵速和IC循环泵速从±0.1升至±0.4mL/min来控制扩增细胞群的乳酸值至≤约7mmol/L。在其他实施方案中，可以使用其他泵速。如图所示，根据所示实施方案，在Treg细胞扩增期间的最低葡萄糖水平可以在第7天(Q1584)的浓度1128为264mg/dL到第8天(Q1558)的浓度1130为279mg/dL。如所描绘的，运行1124的细胞生长配制培养基中的基础葡萄糖浓度可以例如在325mg/dL至335mg/dL的范围内。在其他实施方案中，可能需要保持乳酸水平≤约5mmol/L以改善细胞生长和活力。在又一些实施方案中，生长条件可以提供将葡萄糖水平保持在起始浓度的百分比以上。例如，在一些实施方案中，可以在扩增期间改变IC进入(+)泵速率、IC循环泵速率、EC进入(+)泵速率和/或EC循环泵速率，以将葡萄糖浓度保持在大于起始浓度的约20％、大于起始浓度的约30％、大于起始浓度的约40％、大于起始浓度的约50％，大于约60％的起始浓度，大于约70％的起始浓度，大于约80％的起始浓度，大于约90％的起始浓度，或者甚至大于约100％的起始浓度。在一些实施方案中，葡萄糖浓度可以保持在300mg/dL以上。在实施方案中，图形用户界面(GUI)元件可用于控制培养基添加的速率并在细胞扩增期间将来自糖酵解的乳酸代谢废物产物维持在限定水平以下。
转向图11C，曲线图1132显示了扩增的hTreg的代谢，其中这种细胞扩增可以发生在诸如细胞扩增系统的细胞扩增系统中。对于跨时间段(例如，天1140)的各种细胞扩增运行1138和1139，示出了葡萄糖消耗(mmol/天)1134和乳酸生成(mmol/天)1136。为了将乳酸值控制在≤约7mmol/L，例如，在一个实施方案中，可以同时将IC进入(+)泵送速率和IC循环(-)泵送速率从±0.1增加到±0.4mL/min。例如，曲线图1132显示IC循环和IC供养速度为±0.1mL/min(1142)；±0.2mL/min(1144)；±0.3mL/分钟(1146)；和±0.4mL/min(1148)。其他实施方案可以使用其他流速。例如，当扩增不同类型的细胞时(例如，其他T细胞)，可以使用其他流速。此外，在一些实施方案中，除了IC进入(+)泵速率和IC循环(-)泵速率之外，IC进入泵速率和IC循环速率可用于控制葡萄糖和乳酸盐值。提供在图11B和11C中使用和示出的流速是为了说明的目的，而不是限制性的。注意，尽管对于IC进入泵的方向可以显示为正(+)，而对于IC循环泵的方向可以显示为负(-)，但是这些方向仅出于说明目的而提供，取决于所用泵的配置的方向。
返回图11A和可选问询1112，如果不期望基于这样的测量来测量代谢活动和/或调节供养水平，则过程1100进行“否”到结束操作1116，并且过程1100终止。或者，在期望基于代谢活动来调节供养水平的情况下，过程1100进行“是”至可选步骤1114，以继续增加培养基添加的速率并供养给扩增的细胞群。尽管将步骤1114示为一个步骤，但此步骤可能涉及对培养基添加速率的许多调整，例如，增加IC进入流速、增加IC循环流速、增加EC进入流速，和/或增加EC循环流速。将步骤1114示为一个步骤仅出于说明性目的并且不旨在进行限制。在对培养基添加速率进行任何调整之后，进行过程1100至可选问询1112，以确定是否继续测量代谢水平和/或调整供养。如果不希望继续测量代谢活动和/或基于代谢活动调节进食水平，则过程1100进行“否”到结束操作1116，过程1100终止。尽管图11A和过程1100示出了速率或流速的“增加”，但是可以对流速进行其他调整。例如，速率或流速从一个供养时段到下一个供养时段可以降低或基本相同。可能进行的调整类型可能取决于生长中细胞群的代谢活动评估。例如，提供图11A中流量“增加”仅出于说明目的，而无意于限制。
接下来，图12示出了根据本发明的实施方案的在使用诸如CES 500的细胞扩增系统(例如，图5B和5C)在供养期间将细胞保持在某个位置的过程的示例性操作步骤1200。启动开始操作1202，并且过程1200进行到将一次性套件装载到细胞扩增系统上，灌注装置，进行IC/EC冲洗，调节培养基和装载细胞，例如，悬浮或非贴壁细胞。接下来，过程1200进行到在第一时间段1204期间供养细胞。在实施方案中，可以使用第一进入流速和第一循环流速。作为实例，可以使用第一IC进入流速和第一IC循环流速，其中第一IC进入流速可以由IC进入泵(例如，第一泵)产生和控制以及第一IC循环流速可以由IC循环泵(例如第二泵)产生和控制。在示例性实施方案中，IC进入泵(554)可以使容积流速为0.1mL/min而进入生物反应器(501)的IC入口端口(501A)，以及IC循环泵(512)使互补的IC循环容积流速或流体流速为-0.1mL/min而进入生物反应器(501)的IC出口端口(501B)，其中-0.1mL/min中使用的负号(“-”)指示以在细胞培养物的生长阶段期间引起或产生逆流速率以将细胞保持在生物反应器中的IC循环泵(512)的方向。在另一个实施方案中，第一IC循环流速可以是第一IC进入流速的百分比。例如，根据实施方案，第一IC循环流速可以是第一IC进入流速的约百分之五十(50％)，或约一半(1/2)，或者另一百分比或一部分。
例如，在细胞的供养(和扩增)和使用IC泵以通过流动和逆流性质控制细胞在生物反应器中的停留期间，细胞继续生长和扩增。结果，细胞可能需要额外的培养基，例如葡萄糖和/或细胞生长配制的培养基，以支持不断扩增的群体。在实施方案中，可以作出努力以增加培养基添加的速率来供养正在扩增的细胞群。在示例性实施方案中，IC进入泵速(+)的增加可引起IC进入流速增加第一量以实现第二IC进入流速1206。例如，根据一个实施方案，IC进入流速可增加0.1mL/min的第一量以实现0.2mL/min的第二IC进入流速。根据其他实施方案，可以对IC进入流速进行其他调整。
接下来，根据实施方案，第二IC循环流速可以被设置/调整或配置为等于第二IC进入流速1208的百分比或部分或分数。例如，根据一个实施方案，第二IC循环流速可以被设置、调整或配置为等于IC进入流速的约百分之五十(50％)或约一半(1/2)，或者根据实施方案，IC进入流速的另一百分比或部分。根据一个实施方案，取决于第一IC循环流速的值，对IC循环泵速(-)的调节可引起第二IC循环流速增加。在另一个实施方案中，可以对IC循环泵速进行调整以产生或引起第二IC循环流速的减小，使得IC循环流速可以基本上等于第二IC进入流速的预定的百分比或预定的分数。在又一个实施方案中，可以不对IC循环泵速进行调整。例如，在第一IC进入流速等于0.1mL/min，而第一IC循环流速等于-0.1mL/min的情况下，如果第二IC进入流速增加至0.2mL/min，则第二IC循环流速可以设置为(-1/2)*(第二QIC进入)(其中QIC进入是IC进入流速)或(-1/2)*(0.2mL/min)，其提供-0.1mL/min的第二QIC循环(其中QIC循环为IC循环流速)，并且不对IC循环泵速进行调整以实现这种第二QIC循环。
转向图5B和5C，根据本发明的实施方案，这些图描绘了细胞扩增系统500的操作配置，其示出了流体在第一循环路径中的运动。图5B和5C的配置示出例如流向IC入口端口(例如第一端口)和IC出口端口(例如第二端口)的流速的划分，以将细胞保持在细胞生长室或生物反应器中。如以上关于CES 500所讨论的，在IC回路或第一循环路径502中，流体可以首先由IC进入泵554推进。这种流体可以例如在第一方向，诸如正方向上推进。流体可以通过IC入口端口501A，穿过细胞生长室或生物反应器501中的中空纤维流入细胞生长室或生物反应器501，并且可以通过IC出口端口501B流出。培养基可流经IC循环泵512，其可用于控制培养基流速。IC循环泵可以沿第一方向或与第一方向相反的第二方向泵送流体。出口端口501B例如可以用作反方向上的入口。在一个实施方案中，例如，IC循环泵512可沿与IC进入泵的方向相反的方向泵送流体。作为实例，IC进入泵的方向可以为正(+)，而IC循环泵的方向可以为负(-)以引起逆流，从而使流体可以进入生物反应器的两侧以保持生物反应器中的细胞。
在一个实施方案中，流体的第一部分可以在连接部517处分支以流入生物反应器501的IC入口端口(501A)。在一个实施方案中，IC循环泵512可以以如下的泵速运转：匹配或近似匹配或基本匹配到IC进入泵554的速率，但方向相反，以便流体的第二部分可以在连接部517处分支以流入生物反应器501的IC出口端口(501B)。例如，+0.1mL/min的IC进入泵速率可以与-0.1mL/min的互补IC循环泵速率匹配或近似匹配或基本匹配，以在细胞培养物的生长阶段的生物反应器中维持细胞。在供养期间的这种泵调节策略可以抵消与来自IC出口的细胞损失相关的力。根据一个实施方案，使用泵调节以分别引起流和逆流进入生物反应器的IC入口端口(501A)和IC出口端口(501B)的这种类型的供养可以被称为改进的供养方法。在另一个示例性实施方案中，可以调节IC循环泵速以引起流入IC出口端口501B的流量可以等于IC进入流速的约百分之五十(50％)或约一半(1/2)或在其他实施方案中，IC进入流速的另一百分比，但方向相反。例如，在IC进入泵速为0.4mL/min的情况下，IC循环泵速可以设置为或配置为-0.2mL/min。在其他实施方案中可以使用其他百分比或部分。
根据实施方案，图5B和图5C示出了CES 500中的流体运动的操作配置，其中示出了将细胞保持在细胞生长室或生物反应器501中的流速和逆流速。根据实施方案，例如，这种流速在图5B中以“X”流速503；“(-1/2)X”流速505(其中负号(“-”)表示方向，其中流速505的方向由图5B中的方向箭头示出)；以及(1/2)X”流量507表示，其中流速的约1/2或第一部分在连接部517分支以进入生物反应器501的IC入口端口(501A)，流速的约1/2或第二部分在连接部517处分支以进入生物反应器501的IC出口端口(501B)。如图所示，第一部分和第二部分的总和可以基本上等于总流速503，其中总流速503由IC进入泵554泵送。取决于为了将细胞保持在生物反应器或细胞生长室501中使用的流速和逆流速，可以使用其他类型的IC进入泵速的分数或百分比来设置或配置或调节IC循环泵。这样，根据实施方案，图5C示出诸如“X”流量511的流量；“-(y％)*X”流量513(其中负号(“-”)表示方向，其中流量513的方向由图5C中的方向箭头表示)；以及“(100％-y％)*X”流速515，其中“y”等于数值百分比。在实施方案中，流速513和流速515的总和基本上等于流速511。
在一个实施方案中，例如，来自第一流体流动路径506的全部或基本上全部流可以从连接部517流到生物反应器501的IC入口端口(501A)。在另一实施方案中，来自第一流体流动路径506的全部或基本上全部流可以从连接部517流到生物反应器501的IC出口端口(501B)。在又一实施方案中，来自第一流体流动路径506的流的第一部分可从连接部517流动到IC入口端口(501A)，并且来自第一流体流动路径506的流的第二部分可从连接517流动到IC出口端口(501B)。在实施方案中，可以设定对于IC循环流速的IC进入流速的百分比可以在约0％至约100％的范围内。在其他实施方案中，该百分比可以在约25％至约75％之间。在其他实施方案中，该百分比可以在约40％至约60％之间。在其他实施方案中，该百分比可以在约45％至约55％之间。在实施方案中，该百分比可以是约50％。应当理解的是，图5B和图5C所示的操作配置表示用于细胞扩增系统的各种操作的可能配置，并且所示配置的修改在一个或更多个本实施方案的范围内。
返回图12，可以在第二时间段内以第二进入流速和第二循环流速1210供养(并继续扩增)细胞，以将细胞保持在例如，生物反应器中且在生物反应器集管或IC循环路径外侧的一部分的外侧。在第二阶段的供养1210之后，例如，如果不需要继续供养和/或扩增细胞，则过程1200可以在结束操作1216处终止。或者，过程1200可以可选地继续增加或以其他方式改变供养流速1212。可以存在任何数目的供给时间段，如省略号1214所表示。在期望数目的供给时间段1214之后，然后过程1200可以在结束操作1216处终止。尽管图12和过程1200示出了流速的“增加”，但是可以对流速进行其他调整。例如，从一个供养时段到下一个供养时段，流速可以减小或基本相同。例如，诸如代谢活动之类的考虑因素可以确定流量的调节方式。图12中的流量“增加”仅出于说明性目的提供，并且不旨在限制。
转向图13，根据本发明的实施方案，提供用于供养细胞同时将细胞保持在第一位置(例如，在生物反应器中)的过程的示例性操作步骤1300，其可以与诸如CES 500(例如，图5B和5C)的细胞扩增系统一起使用。启动开始操作1302，并且过程1300进行到将一次性套件装载到细胞扩增系统上，灌注装置，进行IC/EC冲洗，调节培养基和装载细胞，例如，悬浮或非贴壁细胞。接下来，过程1300进行到在第一时间段1304期间供养细胞。在实施方式中，可以使用第一进入流速和第一循环流速。作为实例，可以使用第一IC进入流速和第一IC循环流速，其中第一IC进入流速可以由IC进入泵(例如，第一泵)产生和控制以及第一IC循环流速可以由IC循环泵(例如第二泵)产生和控制。在示例性实施方案中，IC进入泵554可以使体积流速为0.1mL/min而进入生物反应器501的IC入口端口501A，以及IC循环泵512使互补的IC循环体积流速或流体流速为-0.1mL/min而进入生物反应器(501)的IC出口(501B)，其中-0.1mL/min中使用的负号(“-”)指示以在细胞培养物的生长阶段期间引起或产生逆流速率以将细胞保持在生物反应器中的IC循环泵(512)的方向。在另一个实施方案中，第一IC循环流速可以是第一IC进入流速的百分比。例如，根据实施方案，第一IC循环流速可以是第一IC进入流速的约百分之五十(50％)，或约一半(1/2)，或者另一百分比或一部分。
在细胞的供养(和扩增)以及使用IC泵通过流动和逆流特性控制细胞在生物反应器中的停留期间，细胞继续生长和扩增。结果，细胞可能需要额外的培养基，例如葡萄糖和/或细胞生长配制的培养基，以支持不断扩增的群体。在实施方案中，可以作出努力以增加培养基添加的速率来供养正在扩增的细胞群。在示例性实施方案中，IC进入泵速(+)的增加可以使IC进入流速增加第一量以实现第二IC进入流速1306。例如，根据一个实施方案，可以增加0.1mL/min的第一量IC进入流速来达到0.2mL/min的第二IC进入流速。根据其他实施方案，可以对IC进入流速进行其他调整。
接下来，根据实施方案，第二IC循环流速可以被设置、配置或调节为等于第二IC进入流速1308的百分比或部分或分数。根据一个实施方案，例如，第二IC循环流速可以被设置、配置或调整为等于IC进入流速的约百分之五十(50％)或约一半(1/2)，或者根据实施方案的另一百分比或部分。在一个实施方案中，例如，来自第一流体流动路径506的全部或基本上全部的流可以从连接部517流到生物反应器501的IC入口端口(501A)。在另一实施方案中，来自第一流体流动路径506的全部或基本上全部流可以从连接件517部流到生物反应器501的IC出口端口(501B)。在又一实施方案中，来自第一流体流动路径506的流的第一部分可从连接部517流动到IC入口端口(501A)，并且来自第一流体流动路径506的流的第二部分可从连接部517流动到IC出口端口(501B)。在实施方案中，可以设定对于IC循环流速的IC进入流速的百分比可以在约0％至约100％的范围内。在其他实施方案中，该百分比可以在约25％至约75％之间。在其他实施方案中，该百分比可以在约40％至约60％之间。在其他实施方案中，该百分比可以在约45％至约55％之间。在实施方案中，该百分比可以是约50％。
根据一个实施方案，取决于第一IC循环流速的值，对IC循环泵速(-)的调节可导致第二IC循环流速增加。在另一个实施方案中，可以对IC循环泵速进行调整以产生或引起第二IC循环流速的减小，使得IC循环流速可以基本上等于第二IC进入流速的预定的百分比或预定的分数。在又一个实施方案中，可以不对IC循环泵速进行调整。例如，根据一个实施方案，在第一IC进入流速等于0.1mL/min，而第一IC循环流速等于-0.1mL/min的情况下，如果第二IC进入流速增加至0.2mL/min，则第二IC循环流速可以设置为(-1/2)*(第二QIC进入)(其中QIC进入是IC进入流速)或(-1/2)*(0.2mL/min)，其提供-0.1mL/min的第二QIC循环(其中QIC循环为IC循环流速)，并且不对IC循环泵速进行调整以实现这种第二QIC循环。
例如，然后可以在第二时间段内以第二IC进入流速和第二IC循环流速1310供养(并继续扩增)细胞，以将细胞保持在生物反应器中且在生物反应器的集管或IC循环路径外侧的一部分的外侧。例如，在第二时间段的供养1310之后，如果不需要继续供养和/或扩增细胞，则过程1300可以在结束操作1316处终止。
在实施方案中，第一时间段、第二时间段、第三时间段、第四时间段、第五时间段等可以各自包括一天或更多天(和/或小时和/或分钟)。例如，根据实施方案，时间段可以是一(1)天到十四(14)天。但是，在其他实施方案中，例如，时间段可以小于一(1)天或大于十四(14)天。在一个实施方案中，用于供养的第一时间段可以包括第0天、第1天、第2天、第3天、第4天；用于供养的第二时间段可以包括第5天；用于供养的第三时间段可以包括第6天；用于供养的第四时间段可以包括第7天。在另一个实施方案中，第一时间段可以包括第0天、第1天和第2天(例如，约3天的持续时间)；第二时间段可以包括第3天、第4天和第5天(例如，约3天的持续时间)；第三时间段可以包括第6天、第7天和第8天(例如，约3天的持续时间)；第四时间段可以包括第9天和第10天(例如，约2天的持续时间)；并且第五时间段可以包括第11天，第12天和第13天(例如，约3天的持续时间)。还在另一实施方案中，第一时间段可以包括第0天、第1天(例如，持续约2天)；第二时间段可以包括第2天(例如，持续大约1天)；第三时间段可以包括第三天的一半(例如，持续大约0.5天)；第四时间段可以包括第3天的一半(例如，持续大约0.5天)；第五时间段可以包括第4天的一半(例如，持续大约0.5天)；第六时间段可以包括第4天的一半(例如，持续大约0.5天)；第七时间段可以包括第5天的一半(例如，持续大约0.5天)；第八时间段可以包括第5天的一半(例如，持续大约0.5天)；第九时间段可以包括第6天的一半(例如，持续大约0.5天)；第十时间段可以包括第6天的一半(例如，持续大约0.5天)；第十一时间段可以包括第7天的一半(例如，持续大约0.5天)；第十二时间段可以包括第7天的一半(例如，持续大约0.5天)。根据实施方案，时间段可以是不同的持续时间。每个时间段可以以天、小时、分钟和/或其部分来测量。
返回图13，过程1300可以可选地继续至可选问询1312，以基于代谢活动或代谢水平来确定是否调整供养速率或流速。例如，对于Treg的扩增，可能需要将扩增的细胞群的乳酸值控制为≤约7mmol/L的值。例如，当希望将细胞培养物中的乳酸值保持在或低于约7mmol/L时，可以在细胞(例如调节性T细胞)的扩增期间控制培养基的添加速率。在其他实施方案中，可能需要保持乳酸水平≤约5mmol/L以改善细胞生长和活力。在其他实施方案中，可能希望将乳酸水平维持在≤约20mmol/L、≤约15mmol/L，或甚至≤约10mmol/L。在实施方案中，图形用户界面(GUI)元件可用于控制培养基添加速率并在细胞扩增期间将来自糖酵解的乳酸代谢废物产物维持在预定水平以下。
在可选问询1312处，如果不期望基于这样的测量来测量代谢活动和/或调节供养水平，则过程1300进行“否”到结束操作1316，并且过程1300终止。或者，在期望基于代谢活动来调节供养水平的情况下，过程1300进行“是”至可选步骤1314，以继续增加培养基添加的速率并供养给扩增的细胞群。尽管将步骤1314示为一个步骤，但此步骤可能涉及对培养基添加速率的许多调整，例如，增加IC进入流速和增加IC循环流速。将步骤1314示为一个步骤仅出于说明性目的并且不旨在进行限制。在对培养基添加速率进行任何调整之后，过程1300进行至可选问询1312，以确定是否继续测量代谢水平和/或调整供养。如果不希望继续测量代谢活动和/或基于代谢活动调节供养水平，则过程1300进行“否”到结束操作1316，过程1300终止。尽管图13和过程1300示出了速率或流速的“增加”，但是可以对流速进行其他调整。例如，速率或流速从一个供养时段到下一个供养时段可以降低或基本相同。可能进行的调整类型可能取决于生长中细胞群的代谢活动评估。例如，提供图13中流量“增加”仅出于说明目的，而无意于限制。
接下来，图14示出了根据本发明的实施方案，提供用于供养细胞期间保持细胞的示例性操作步骤1400，其可以与诸如CES 500(例如，图5B和5C)的细胞扩增系统一起使用。启动开始操作1402，并且过程1400进行到将一次性管套件或预安装的流体输送组件(例如210或400)1404装载到细胞扩增系统上。接下来，系统可以被灌注1406。在一个实施方案中，例如，用户或操作员可以向系统提供指令以通过例如选择用于灌注的任务来灌注。在一个实施方案中，例如，用于灌注的这种任务可以是预编程的任务。接下来，可以进行1408的IC/EC冲洗任务，其中例如可以替换IC循环回路和EC循环回路上的流体。根据实施方案，替换体积可以由交换的IC体积和EC体积的数量确定。
接下来，为了维持跨生物反应器膜中的纤维的适当或期望的气体浓度，可以执行调节培养基任务1410以使得培养基能够在将细胞装载到生物反应器中之前与所提供的气体供应达到平衡。例如，可以通过调节EC循环速率来提供培养基与气体传输模块(GTM)或氧合器提供的气体供应之间的接触。然后可以将系统维持在适当或期望的状态，直到例如用户或操作员准备将细胞装载到生物反应器中为止。在一个实施方案中，系统可以例如以诸如完全培养基的培养基来调节。完全培养基可以是用于细胞生长的任何培养基来源。在一个实施方案中，该系统可以例如用无血清培养基调节。在一个实施方案中，可以用基础培养基来调节系统。可以使用本领域技术人员理解的任何类型的培养基。
例如，接下来，过程1400进行到从细胞进入袋将细胞1412装载到生物反应器。在一个实施方案中，例如，细胞进入袋中的细胞可以与培养基一起在溶液中以供养1414细胞。在另一个实施方案中，细胞进入袋中的细胞可以与培养基一起在溶液中以供养1414细胞并且还具有可刺激细胞(例如T细胞或Treg)的可溶性活化剂复合物。在实施方案中，可以使用珠子激活细胞以刺激扩增。在这些实施方案中，可在装载细胞之前将珠子在培养基中与细胞混合。在一个实施方案中，可以将细胞(以及实施方案中的供养溶液，和其他实施方案中的珠子)从细胞进入袋装载到生物反应器中，直到袋为空。可以将细胞(以及实施方案中的供养溶液)从空气去除室去除至生物反应器。在一个实施方案中，可以进行“在均匀悬浮的情况下装载细胞”任务以装载细胞(以及实施方案中的供养溶液)。在另一个实施方案中，可以进行“在没有循环的情况下集中装载细胞”任务以将细胞(以及实施方案中的供养溶液)装载到生物反应器的特定例如中央区域中。根据实施方案，可以使用其他装载方法和/或装载任务。
接下来，过程1400进行到问询1416，以确定是否使用改进的供养方法在生物反应器(例如中空纤维生物反应器)中保留细胞(例如非贴壁细胞或悬浮细胞，诸如T细胞或Treg)。例如，可能需要将细胞放置在生物反应器本身中，并位于生物反应器的集管或IC回路的其余部分之外。如果不希望使用改进的供养方法将细胞保留在生物反应器本身中，则过程1400进行“否”以扩增细胞1426，其中例如，细胞可以使用在步骤1414中最初供养的培养基继续生长/扩增。
另一方面，如果期望将细胞保留在生物反应器本身中，则过程1400进行“是”到改进的供养1418，其中可以通过使用进入生物反应器501的IC入口端口(501A)和进入生物反应器501的IC出口端口(501B)的流速供养细胞，以将细胞保持在生物反应器中。这样做，可以将进入容积流速或进入流速引入第一流体流径(506)1420。例如，可以将IC进入流速引入流体流径(506)1420。进入泵(554)，例如第一蠕动泵(在一个实施方案中)，可以以预定的每分钟转数(RPM)运行，以引起第一流体流动路径(506)1420中的流体的预定的IC进入容积流速或IC进入流速。根据一个实施方案，处理器和/或控制器可以引导或控制例如第一泵和/或第二泵以预定的量RPM运行。取决于IC循环泵(512)的速度和方向，改进后的IC进入流速的第一流速或第一部分可进入生物反应器(501)的IC入口端口501A或第一端口1422。泵的泵速可能取决于泵(例如蠕动泵)的直径或泵的配置。也可以使用其他类型的泵，其中泵速可能取决于所用泵的配置。IC循环泵(512)，例如第二蠕动泵(在一个实施方案中)，可以以预定量的RPM并且在与第一泵的方向相反的方向上操作，以引起或产生预定的IC循环流速或IC进入流速的第二流速或第二部分，以进入生物反应器(501)的IC出口端口501B或第二端口1424。例如，实施方案可提供IC进入流速的约一半(约1/2)或第一部分在连接部517处分支以进入生物反应器501的IC入口端口(501A)，IC进入流速的约一半(或1/2)或第二部分在连接部517处分支以进入生物反应器501的IC出口端口(501B)。如图所示，第一部分和第二部分的总和可基本等于IC进入流量503(例如，如图5B)，其中IC进入流速503可以由IC进入泵554泵送。根据实施方案，为了将细胞保持在生物反应器或细胞生长室501中，可以使用其他类型的分数或百分比的IC进入泵速率来设置，或配置或调节IC循环泵。
在向细胞提供了这种流动和逆流特性以将细胞保持在生物反应器中之后，过程1400进行到生长/扩增细胞1426。尽管在步骤1426示出了细胞的扩增，但是细胞也可以例如在一个或更多个其他步骤(诸如1412、1414、1416、1418、1420、1422、1424)中进行生长/扩增。从扩增步骤1426开始，过程1400进行到收获或去除细胞1430。然后过程1400可以在结束操作1432处终止。根据实施方案，如果在收获之前需要任何其他步骤，诸如继续施用第二改进的供养方法或其他类型的供养方法，过程1400进行到可选的“其他”步骤1428。从可选步骤1428开始，进行过程1400以从生物反应器1430收获或去除细胞，并且过程1400然后可以在结束操作1432处终止。
转向图15A，根据本发明的实施方案，提供了用于供养细胞以将细胞保持在例如生物反应器本身的第一位置的过程的示例性操作步骤1500，其可以与诸如CES 500(例如，图5B和5C)的细胞扩增系统一起使用。启动开始操作1502，并且过程1500进行到将一次性管套件或预安装的流体输送组件(例如210或400)1504装载到细胞扩增系统上。接下来，系统可以被灌注1506。在一个实施方案中，例如，用户或操作员可以向系统提供指令以通过例如选择用于灌注的任务来灌注。在一个实施方案中，例如，用于灌注的这种任务可以是预编程的任务。接下来，可以进行1508的IC/EC冲洗任务，其中例如可以替换IC循环回路和EC循环回路上的流体。根据实施方案，替换体积可以由交换的IC体积和EC体积的数量确定。
接下来，为了维持跨生物反应器膜中的纤维的适当或期望的气体浓度，可以执行调节培养基任务1510以使得培养基能够在将细胞装载到生物反应器中之前与所提供的气体供应达到平衡。例如，可以通过调节EC循环速率来提供培养基与气体传输模块(GTM)或氧合器提供的气体供应之间的接触。然后可以将系统维持在适当或期望的状态，直到例如用户或操作员准备将细胞装载到生物反应器中为止。在一个实施方案中，系统可以例如以诸如完全培养基的培养基来调节。完全培养基可以是用于细胞生长的任何培养基来源。在一个实施方案中，该系统可以例如用无血清培养基调节。在一个实施方案中，可以用基础培养基来调节系统。可以使用本领域技术人员理解的任何类型的培养基。
例如，接下来，过程1500进行到从细胞进入袋将细胞1512装载到生物反应器中的操作。在一个实施方案中，例如，细胞进入袋中的细胞可以与培养基一起在溶液中以供养细胞。在另一个实施方案中，细胞进入袋中的细胞可以与培养基一起在溶液中以供养细胞并且还具有可刺激细胞(例如T细胞(诸如Treg))的可溶性活化剂复合物。在实施方案中，可以使用珠子激活细胞以刺激扩增。在这些实施方案中，可在装载细胞之前将珠子在培养基中与细胞混合。在一个实施方案中，可以将细胞(以及如果使用珠子)从细胞进入袋装载到生物反应器中，直到袋为空。可以将细胞从空气去除室去除至生物反应器。在一个实施方案中，可以进行“在均匀悬浮的情况下装载细胞”任务以装载细胞。在另一个实施方案中，可以进行“在没有循环的情况下集中装载细胞”任务以将细胞装载到生物反应器的特定例如中央区域中。根据实施方案，可以使用其他装载方法和/或装载任务。
接下来，过程1500进行到在第一时间段1514内的每个第一过程供养细胞。在一个实施方案中，细胞可以以最小或低的供养速率供养，例如，在细胞群体开始增长/扩增时，最小或低的供养速率就能满足此类群体的供养需求。例如，可以在该第一时间段期间使用+0.1mL/min的IC进入泵速以引起或产生0.1mL/min的第一流体流速。根据实施方案，尽管该实例提供了0.1mL/min的低或最小供养速率，但是低或最小供养速率可以大于或等于约0.01mL/min并且小于或等于约0.1mL/min。在实施方案中，低或最小供养速率可以大于0.1mL/min。如果期望在此第一时间段内减少中空纤维膜生物反应器的细胞损失，在细胞培养物的生长阶段可将+0.1mL/min的IC进入泵速与互补的-0.1mL/min的IC循环泵速匹配或近似或基本匹配，以维持细胞在生物反应器中。在其他实施方案中可以使用其他泵速和所得流体流速。
接下来，根据实施方案，过程1500进行到问询1516，以确定是否调整供养速率以将细胞保留在生物反应器本身中，同时还考虑到细胞群的增长和供养需求的增加。例如，图15B显示响应于增加的细胞群体而增加的供养速率。如图15B所示，曲线图1528示出了在细胞扩增系统例如细胞扩增系统上的运行或程序的细胞数比IC流速。在一个实施方案中，IC流速包括用于供养细胞的培养基，因此也可以称为IC培养基流速。示出了细胞的数量1530相对于IC流速(mL/min)1532。如图所示，根据一个实施方案，随着细胞的增加以及扩增细胞群的生长供养需求，IC流速从0.1mL/min增加至0.2mL/min至0.3mL/min。在所示的实施方案中，如线1534所示，在细胞的数目和IC流速之间可以存在基本线性的关系。
返回图15A和问询1516，如果不期望调节供养速率，则过程1500进行“否”以扩增细胞1520，其中例如细胞可以使用在第一时间段1514供养的培养基继续生长/扩增。尽管在步骤1520示出了细胞的扩增，但是细胞也可以例如在一个或更多个其他步骤(诸如1512、1514、1516、1518)期间生长/扩增。另一方面，如果期望在将细胞保持在生物反应器中的同时调节供养速率，则过程1500进行“是”在第二时间段1518的每个第二过程供养细胞。在一个实施方案中，这种第二过程例如，“供养”可能涉及以与第一时间段基本相同的供养速率供养细胞。在另一个实施方案中，第二过程可以包括与在第一时间段期间使用的供养速率相比以不同的供养速率供养细胞。在一个实施方案中，可以增加IC进入流速，并且可以将IC循环流速设置、配置或调节为等于IC进入流速的百分比或部分或分数。例如，根据一个实施方案，可以将IC循环流速设置为等于IC进入流速值的约百分之五十(50％)或约一半(1/2)，或根据实施方案的另一百分比或一部分。根据一个实施方案，可以基于IC进入流速的值确定是否将IC循环流速设置、配置或调节为IC进入流速的百分比、分数或一部分。例如，一个实施方案提供了以下方法，当使用IC进入流速供养细胞时将细胞保留在生物反应器中(其中QIC循环＝IC循环流速(mL/min)；QIC进入＝IC进入流速(mL/min))：
当QIC进入≥0.2mL/min时，QIC循环＝(-)1/2*QIC进入
以及
当QIC进入＝0.1mL/min时，QIC循环＝(-)QIC进入。
尽管以上等式基于IC进入流速的值(例如0.2mL/min或0.1mL/min)提供了IC循环流速的不同计算，但根据其他实施方案，可以使用进行这种确定的其它的IC进入流速的值。此外，虽然在该实例中使用了约百分之五十(50％)或约一半(1/2)，但是根据实施方案可以使用其他百分比、比例、分数和/或部分。返回到过程1500，在用这种流动和逆流特性向细胞供养作为第二过程1518的一部分以将细胞保持在生物反应器中之后，过程1500继续生长/扩增细胞1520。尽管示出了细胞的扩增在步骤1520，细胞也可以在一个或更多个其他步骤(诸如1512、1514、1516、1518)中生长/扩增。从扩增步骤1520开始，过程1500进行以收获或去除细胞1524。然后过程1500可以在结束操作1526处终止。如果在收获细胞之前需要任何其他步骤，则根据实施方案，过程1500进行到可选的“其他”步骤1522。从可选步骤1522开始，过程1500继续从生物反应器1524收获细胞或取出细胞，然后过程1500可以在结束操作1526处终止。
接下来，图16示出了根据本发明的实施方案的用于供养细胞的过程的示例性操作步骤1600，该过程可以与诸如CES 500(例如，图5B和5C)的细胞扩增系统一起使用。例如，启动开始操作1602，其中将一次性套件装载到细胞扩增系统上，系统被灌注，进行IC/EC冲洗，调节培养基并装载细胞。接下来，过程1600进行到在第一时间段1604期间供养细胞。在一个实施方案中，可以以最小或低的供养速率供养细胞，例如，在细胞群体开始增长/扩增时，最小或低的供养速率就能满足此类群体的供养需求。例如，可以在该第一时间段期间使用+0.1mL/min的IC进入泵速。根据实施方案，尽管该实例提供了0.1mL/min的低或最小供养速率，但是低或最小供养速率可以大于或等于约0.01mL/min并且小于或等于约0.1mL/min。在实施方案中，低或最小供养速率可以大于0.1mL/min。如果期望在此第一时间段内减少中空纤维膜生物反应器的细胞损失，在细胞培养物的生长阶段可将+0.1mL/min的IC进入泵速与互补的-0.1mL/min的IC循环泵速匹配或近似或基本匹配，以在细胞培养物生长阶段维持细胞在生物反应器中。
接下来，过程1600进行到问询1606，以确定是否可以调整供养速率以解决不断增长的细胞数量和/或继续努力将细胞保持在生物反应器中。如果期望在将细胞保持在生物反应器中的同时调节供养速率，则过程1600进行“是”以根据第二时间段1608内第二过程供养细胞。在一个实施方案中，这种第二过程例如，“供养”可能涉及以与第一时间段基本相同的供养速率供养细胞。在另一个实施方案中，第二过程可以包括与在第一时间段期间使用的供养速率相比以不同的供养速率供养细胞。在一个实施方案中，可以增加IC进入流速，并且可以将IC循环流速设置、配置或调节为等于IC进入流速的百分比或部分或分数。例如，根据一个实施方案，可以将IC循环流速设置为等于IC进入流速值的约百分之五十(50％)或约一半(1/2)，或根据实施方案的另一百分比或一部分。根据一个实施方案，可以基于IC进入流速的值确定是否将IC循环流速设置、配置或调节为IC进入流速的百分比、分数或一部分。例如，一个实施方案提供了以下方法，当使用IC进入流速供养细胞时将细胞保留在生物反应器中(其中QIC循环＝IC循环流速(mL/min)；QIC进入＝IC进入流速(mL/min))：
当QIC进入≥0.2mL/min，QIC循环＝(-)1/2*QIC进入
以及
当QIC进入＝0.1mL/min时，QIC循环＝(-)QIC进入。
尽管以上等式基于IC进入流速的值(例如0.2mL/min或0.1mL/min)提供了IC循环流速的不同计算，但根据其他实施方案，可以使用进行这种确定的其它的IC进入流速的值。此外，虽然在该实例中使用了约百分之五十(50％)或约一半(1/2)，但是根据实施方案可以使用其他百分比、比例、分数和/或部分。返回到过程1600，在用这种流动和逆流特性向细胞供养作为第二过程1608的一部分以将细胞保持在生物反应器中之后，处理1600进行到问询1610，以确定是否监测或测量正在生长的细胞群的代谢活动(例如葡萄糖消耗和/或乳酸生成)。如果不希望监测代谢活动，则过程1600进行“否”以扩增细胞1616，在其中细胞可以使用例如在第一时间段1604和/或第二时间段1608供养的培养基继续生长/扩增。尽管在步骤1616示出了细胞的扩增，但是细胞也可以在例如一个或更多个其他步骤(诸如1604、1606、1608、1610、1612、1614)中生长/扩增。
返回到问询1610，如果希望监视或测量正在生长的细胞群的代谢活动，则过程1600进行“是”，以基于其代谢活动和/或测量，每个第二过程继续供养细胞或基于调整供养速率。在一个实施方案中，监测葡萄糖和/或乳酸水平可以促进培养基流速(例如IC流速)的调节，以支持细胞(例如T细胞(诸如Treg))在生物反应器(例如中空纤维生物反应器)中的扩增。在实施方案中，例如，细胞培养物乳酸值可以维持在约7mmol/L以下。在其他实施方案中，例如，细胞培养物中的乳酸值可以维持在约15mmol/L以下。在实施方案中，在细胞(例如调节性T细胞)的扩增期间，例如通过使用细胞扩增系统图形用户界面(GUI)来控制培养基的添加速率，来自糖酵解的乳酸代谢废物产物可以维持在例如约7mmol/L以下，或者例如在其他类型的T细胞扩增期间，维持在约15mmol/L以下。在其他实施方案中，例如，可以控制培养基的添加速率和/或其他设置，以试图维持乳酸水平≤约5mmol/L，例如以改善细胞生长和活力。在其他实施方案中，乳酸可以保持在或低于约30mmol/L，维持在或低于约25mmol/L，维持在或低于约20mmol/L，维持在或低于约15mmol/L，或甚至维持在或低于约10mmol/L。在其他实施方案中可以使用其他浓度。
例如，取决于代谢测量值和所期望的乳酸水平，过程1600进行到继续根据第二过程1612供养细胞或调节供养速率1614。例如，根据一个实施方案，可以根据第二过程1612继续供养细胞，其中第二代谢活动的测量显示例如乳酸水平≤约5mmol/L，或者根据其他实施方案，≤约15mmol/L。在另一个实施方案中，可以根据第二过程1612继续供养细胞，其中第二代谢活动的测量显示例如乳酸水平≤约7mmol/L或≤约15mmol/L。从第二步骤1612继续供养细胞开始，过程1600返回到问询1610，以继续监视生长中的细胞群的代谢活动。
取决于代谢测量及其期望的水平，过程1600进行到调节供养速率1614，其中可以在额外的时间段内根据额外的过程供养细胞。根据实施方案，这样的额外过程和额外时间段可以包括例如第三时间段的第三过程、第四时间段的第四过程、第五时间段的第五过程等。在一个实施方案中，例如，这种额外过程可以涉及以与第一和/或第二时间段期间基本相同的供养速率供养细胞。在另一个实施方案中，该额外过程可以涉及与在第一和/或第二时间段期间使用的供养速率相比以不同的供养速率供养细胞。例如，在一个实施方案中，可以增加IC进入流速，并且可以将IC循环流速与IC进入流速匹配或紧密匹配或基本匹配，但是方向相反。在另一个实施方案中，可以增加IC进入流速，并且可以将IC循环流速设置或配置或调节为等于IC进入流速的百分比或分数或部分，并且方向相反。虽然在步骤1614中调节供养速度1614示出了“额外”过程和“额外”时间段，但是基于代谢活动可以使用任何数量的过程和时间段来调节供养速度。
过程1600从调整供养速度1614返回问询1610。如果不期望调整或进一步调整供养速度，则过程1600进行“否”以扩增细胞1616，其中细胞可以使用在第一时间段1604，第二时间段1608和/或额外的时间段1614期间供给的培养基来继续生长/扩增。尽管在步骤1616示出了细胞的扩增，但是细胞也可以例如在一个或更多个其他步骤(诸如步骤1604、1606、1608、1610、1612、1614)中生长/扩增。从扩增步骤1616开始，进行过程1600以从生物反应器收获或去除细胞1618，并进入例如收获袋或容器。然后，过程1600可以在结束操作1622处终止。或者，从收获操作1618开始，过程1600可以可选地进行以使得能够进一步的处理/分析1620。这种可选的进一步的处理/分析1620可以例如包括表征收获的细胞(例如T细胞或Tregs)的表型。然后，从可选的进一步处理/分析步骤1620，过程1600可以在结束操作1622处终止。
图17A示出了本发明的实施方案中的可以与细胞扩增系统一起使用的细胞扩增过程的操作步骤1700。如下所述，根据本发明的实施方案，过程1700可以包括剪切细胞簇以可形成在细胞生长室中扩增的细胞的步骤。实施方案中的细胞簇还包括可以在它们表面激活并用于激活细胞扩增的珠子。在实施方案中，这些步骤可以被实施为“改进循环”任务的一部分。启动开始操作1702，并且过程1700进行到将具有细胞的流体1704装载到细胞扩增系统中的细胞生长室中。在实施方案中，细胞可以包含非贴壁细胞，诸如一种或更多种类型的T细胞。在一实施方案中，细胞可包括Treg。在其他实施方案中，细胞可包括辅助、效应、幼稚、记忆，和/或其组合。
过程1700进行到将细胞暴露于活化剂1706。可以将可能包括抗体复合物的活化剂添加到步骤1704装载的流体中。在实施方案中，活化剂可以是可溶性人抗体CD3/CD28/CD2细胞活化剂复合物。在其他实施方案中，位于珠子上的活化物用可以激活细胞扩增的抗体(例如CD3/CD28)功能化。珠子可以与细胞混合。过程1700进行到第一时间段扩增细胞1708。步骤1708可以包括向供养1710细胞。可以给细胞补充营养以促进其扩增。例如，具有葡萄糖、蛋白质和试剂的培养基可以被递送到细胞生长室中以提供用于细胞扩增的营养物。
扩增细胞的第一时间段1708可基于形成细胞群落、微群落或簇所需的时间。细胞群落、微群落或簇可以是一个或更多个附着的细胞(以及在一些实施方案中的珠子)的组。在实施方案中，细胞(例如T细胞(诸如Treg))可得益于细胞接触。细胞接触可以刺激促进扩增和生长的信号传导。但是，经过一段时间的扩增后，细胞可能会相互附着，形成细胞群落、微群落或簇。不受理论的束缚，据信在细胞扩增1708的时间段之后，细胞可以形成相对大的继续生长的细胞群落、微群落或簇。细胞群落、微群落或簇可能会造成坏死中心，在此处营养物质(例如葡萄糖)、气体(例如氧气)和试剂(例如活化剂)无法到达细胞群落、微群落或簇中心的细胞。结果，在这些细胞群落、微群落或簇的中心的细胞扩增条件可能使得扩增速率可能减慢(例如，增加倍增时间)，或者这些条件可能导致细胞坏死。在使用珠子的实施方案中，珠子可能也会聚集并且成为细胞群落、微群落或簇的一部分。
在实施方式中，为了使得细胞能够扩增1708，第一时间段可以在约5小时至约48小时之间。在一些实施方案中，第一时间段可以大于约6小时，大于约12小时，大于约24小时，或者甚至大于约48小时。在其他实施方案中，第一时间段可以小于约72小时，小于约60小时，小于约48小时，小于约36小时，小于约24小时或甚至小于约12小时。在第一时间段之后，过程1700进行到循环1712，以在第二时间段内剪切细胞群落、微群落或簇。可以进行步骤1712以减小细胞群落、微群落或簇的尺寸。在实施方案中，第二时间段可以小于约120分钟，小于约100分钟，小于约80分钟，诸如在约60分钟至约0.5分钟之间。在一些实施方案中，第二时间段可以在约50分钟至约1分钟之间，诸如约4分钟。在其他实施方案中，第二时间段可以基于引入到第一循环路径中的流体的体积。也即是，一旦流体的体积被引入，可以停止循环1712至剪切步骤。
图17B示出了作为过程1700的一部分可以在细胞生长室中扩增的一定体积的流体(1752)中的细胞的多个视图1750、1760和1770。例如，在一些实施方案中，细胞生长室可以是中空纤维生物反应器。在这些实施方案中，例如，视图1750、1760和1770可以示出中空纤维生物反应器的纤维中的细胞。1750A、1760A和1770A分别在视图1750、1760和1770的一部分中放大。参照视图1750，可以示出在细胞已经被在装载1704，暴露于活化剂1706并且在例如第一时间段的时间段内扩增1710之后的细胞。如视图1750所示，已经形成了多个细胞群落1754A-E。
为了减少细胞群落、微群落或簇1754A-E中的细胞数目和尺寸，步骤1712可以使流体和细胞通过第一流体循环路径循环。不受理论的束缚，据信循环可产生一些作用于细胞群落的力，包括剪切应力，如放大的部分1760A中的箭头1756所示。剪切应力1756可以提供足够的力以分离细胞群落中的细胞。如视图1760所示，随着循环的继续，细胞群落可能开始分裂成较小的尺寸。视图1770说明了在第二个时间段进行循环后的细胞。如视图1770所示，细胞群落的尺寸减小，其中一些群落被完全分离成单个细胞。在一些实施方案中，可以进行循环剪切步骤1712，直到细胞和流体包括单个细胞悬浮液为止。
在其他实施方案中，在循环以剪切1712之后，可以保留细胞群落、微群落或簇。例如，放大的部分1770A中的群落1754F说明了在步骤1712之后可以保留一些尺寸减小的群落。在实施方案中，剩余的细胞群落、微群落或簇(例如1754F)可以在约25微米至约300微米之间。在其他实施方式中，循环以剪切可以减小细胞群落、微群落或簇(例如1754F)的尺寸，因此细胞群落、微群落或簇可以在约50微米至约250微米之间。还在其他实施方案中，可以将细胞群落、微群落或簇的尺寸减小到约75微米至约200微米之间。在一些实施方案中，在循环至剪切步骤之后，细胞群落、微群落或簇的尺寸可小于约200微米，例如约100微米。
在实施方案中，剩余细胞群落、微群落或簇的尺寸可能是细胞生长室的某些结构特征的函数。如上所述，在一些实施方案中，细胞生长室可以是具有中空纤维的中空纤维生物反应器。可以理解，细胞群落、微群落或簇在它们循环时，每次它们接触中空纤维的侧壁时，都会受到剪切应力的影响。这种接触可以更有效地减小细胞群落的尺寸。当内径较大时，诸如在可能利用移液管引起剪切应力以减小群落尺寸的常规方法中，可能不会经常发生与侧壁的接触。图17C示出了中空纤维(例如，215微米)1772与移液管吸头1774(762微米)的一个实施方案的内径尺寸之间的差异，其可以用于使细胞群落、微群落或簇中的附着细胞解离。在实施方案中，中空纤维的较小内径被认为在循环至剪切步骤1712期间更有效地减小了细胞群落的尺寸。
在实施方案中，循环以剪切1712的第二时间段可以小于约120分钟、小于约90分钟、小于约60分钟、小于约30分钟或甚至小于约15分钟。在一些实施方案中，第二时间段可以在约15分钟至约1分钟之间，诸如约4分钟。
在第二时间段之后，过程1700进行到在第三时间段中将细胞移动到细胞生长室中1714。在步骤1714中，由于循环以剪切步骤1712，未放置在细胞生长室中的细胞在第三时间段被移回细胞生长室。在实施方案中，这可以涉及激活一个或更多个泵以将流体引入流体循环路径。例如，可以从细胞生长室的入口端口和出口端口将流体从流体进入路径引入第一流体流动路径，然后引入细胞生长室。流体从入口端口和出口端口进入细胞生长室的运动可将细胞移回细胞生长室。
在一些实施方案中，在用于将细胞移回细胞生长室1714的步骤中使用的流体可以包括促进细胞生长的试剂。例如，在实施方式中，流体可以是包括葡萄糖、蛋白质或其他试剂的培养基。在一个实施方案中，流体可包括一种或更多种补充剂。在一个实施方案中，流体是完全培养基并且包含细胞因子(例如人IL-2细胞因子补充剂)。流体的添加可以被称为大剂量添加(bolus addition)。在实施方案中，步骤1712和1714的组合可以被称为循环和大剂量添加。
在其他实施方案中，第三时间段可以基于在循环剪切步骤1712期间引入细胞生长室的流体的体积。例如，在实施方案中，可以进行步骤1712直到约300ml、约250ml、约200ml或约150ml已被引入到流体循环路径中。
在第三时间段之后，过程1700进行到在第四时间段期间扩增1716。类似于步骤1708，步骤1716可以包括细胞供养1718。可以给细胞供养营养物以促进其扩增。例如，具有葡萄糖、蛋白质和试剂的培养基可以被递送到细胞生长室中以提供用于细胞扩增的营养。
类似于第一时间段，第四时间段可以基于细胞群落形成所花费的时间。在实施方案中，第四时间段可以为约5小时至约48小时。在一些实施方案中，第四时间段可以大于约6小时、大于约12小时、大于约24小时，或者甚至大于约48小时。在其他实施方案中，第四时间段可以小于约72小时、小于约60小时、小于约48小时、小于约36小时、小于约24小时或甚至小于约12小时。由于在细胞生长室中可能存在更多的细胞，因此在一些实施方案中，第四时间段可以比第一时间段短。在其他实施方案中，第四时间段可以与第一时间段相同。
在第四时间段之后，过程1700进行到步骤1720以循环剪切第五时间段以减少第二细胞群落。在实施方案中，步骤1720可以使用第一循环速率。然而，在其他实施方案中，在步骤1720处使用的循环速率可以大于或小于第一循环速率。
在第五时间段之后，过程1700进行到步骤1722，在步骤1722中，未放置在细胞生长室内的细胞可以在第六时间段内移回到细胞生长室内。可以将流体从流体进入路径引入到第一流体流动路径，并从细胞生长室的入口端口和出口端口引入细胞生长室。流体从入口端口和出口端口进入细胞生长室的运动可将细胞移回细胞生长室。在一些实施方案中，用于将细胞移回细胞生长室的流体可以包括促进细胞生长的试剂。例如，在实施方案中，流体可以是包括葡萄糖、蛋白质或其他试剂的培养基。在一个实施方案中，流体可包括一种或更多种补充剂。在一个实施方案中，流体是完全培养基且包括细胞因子(例如人IL-2细胞因子)。
如可选步骤1724和省略号1726所示，过程1700可以可选地进行将细胞扩增、循环和移动步骤额外的次数。扩增、循环和移动步骤可以依次进行一段时间。例如，在一些实施方案中，步骤可以每四天一次、每三天一次、每两天一次、每天一次、每天两次或每天三次进行，持续约两天至约二十天的时间(诸如约10天、约9天、约8天、约7天、约6天，或甚至约5天)。在一些实施方案中，可以在不同的时间段进行步骤。例如，在一个实施方案中，可以在三天之后进行步骤，然后每隔一天进行步骤。作为另一实例，可以在两天之后进行步骤然后每天两次来进行这些步骤。这些仅是实例，并且其他实施方案可以利用其他时间段。
例如，图18示出了在细胞扩增过程中在不同时间进行循环和大剂量添加的曲线图1800。曲线1808示出了在细胞扩增系统(例如细胞扩增系统)上，细胞数1802与细胞培养天数1804的关系。曲线1806示出了在细胞扩增系统(例如，细胞扩增系统)上IC流速1818与细胞培养天数1804的关系。如曲线1806所示，前三天IC流速保持在0.1mL/min。在第六天，流速增加到0.2mL/min，在第七天后增加到0.3mL/min。随着培养天数1804的增加，流速的增加可以响应于细胞数目的增加。同样，如图18所示的步骤是几个循环和大剂量添加步骤(例如1810、1812、1814和1816)。细胞培养3.5天后进行循环和大剂量添加1810。细胞培养4.5天后进行另一次循环和大剂量添加1812。细胞培养6天后进行另一次循环和大剂量添加1814，而细胞培养6.5天后进行另一次循环和推注添加1816。通过观察曲线1806和1808可以看出，多次循环和大剂量添加(1810-1816)，结合增加的IC流速，可能会对细胞扩增速率(例如细胞数)产生积极影响。
返回参考图17A，过程1700进行到从细胞生长室去除细胞1728。在实施方案中，这可能涉及收获细胞。步骤1728可以包括额外的步骤，诸如在从细胞生长室移出细胞之前或期间的循环步骤(例如1712和1720)。处理1700在结束操作1730处终止。
图19A示出了用于操作可在本发明的实施方案中的细胞扩增系统中使用的泵的过程的操作步骤1900。如下所述，根据本发明的实施方案，过程1900可以包括在减少已经在细胞生长室中扩增的细胞簇中的细胞(以及如果使用珠子作为活化剂)的过程中启动泵的步骤。在实施方案中，这些步骤可以被实现为“改进循环”任务的一部分。在实施方案中，过程1900的步骤可以由计算机处理器进行。启动开始操作1902，并且过程1900进行到步骤1904，在步骤1904，以第一流速启动第一泵，以将包括细胞的流体的第一体积引入细胞扩增系统的生物反应器的毛细管内部分。在使用珠子的实施方案中，珠子可以随着包括细胞的第一流体容积引入。在实施方案中，第一泵可以是进入泵。
在以第一流速激活第一泵之后，过程1900进行到以第二流速激活的第一泵1906，以在第一时间段内将具有营养物的培养基引入生物反应器的毛细管内部分。营养物可以包括例如蛋白质、葡萄糖和用于供养和促进细胞扩增的其他化合物。例如，参照图19B，第一泵1960可以第二流速被激活以将培养基引入生物反应器1962的入口端口1962A。
在实施方案中，第一时间段可以基于细胞群落形成所花费的时间。在实施方案中，第一时间段可以为约5小时至约48小时。在一些实施方案中，第一时间段可以大于约6小时、大于约12小时、大于约24小时，或者甚至大于约48小时。在其他实施方案中，第一时间段可以小于约72小时、小于约60小时、小于约48小时、小于约36小时、小于约24小时，或甚至小于约12小时。
然后，过程1900继续以第三流速启动第二泵，以将流体引导到生物反应器1908中。可以进行可选步骤1908，以启动泵1964，以将在步骤1906中引入的流体的一部分引导到例如，生物反应器1962的出口端口1962B以供养细胞。这可以是用于将流体从生物反应器的IC入口端口和出口端口移至反应器的流逆流供养过程的一部分。
然后，过程1900继续以第四流速1910启动第二泵，以在第二时间段内循环细胞，并减少生物反应器中细胞簇中的细胞数量。在实施方案中，细胞在第一流体循环路径中循环。参考图19C，第二泵1964可在步骤1910被启动以使流体循环通过第一流体循环路径1966，如箭头1968A-D所示。
不受理论的束缚，据信在一段时间后，扩增的细胞可形成细胞群落、微群落或簇。细胞群落可能会造成坏死中心，营养物质和蛋白质(例如活化剂)不会到达群落中心。结果，在这些细胞群落、微群落或簇的中心的细胞扩增条件可能使得扩增速率可能减慢(例如，增加倍增时间)并可能导致细胞坏死。在使用珠子的实施方案中，珠子可能聚集，并成为细胞群落、微群落或簇的一部分。可以进行步骤1910以减小细胞群落、微群落或簇的尺寸。
在实施方案中，第四流速可以足够高以引起剪切。例如，在实施方案中，第四流速可以高达约1000ml/min。在其他实施方案中，第四流速可以为约100mL/min至约600ml/min，例如300mL/min。
在第二时间段之后，过程1900进行到步骤1912，其中以第五流速启动第一泵，以在第三时间段内通过第一流体流动路径引入流体。在实施方案中，引入到第一流体流动路径中的第一部分的流体可以将第一流体流动路径中的第一细胞(由于步骤1910而可能在第一流体流动路径中)通过入口端口1962A移回到细胞生长室中。参考图19D，可以启动泵1960以将流体引入第一流体流动路径1970。如箭头1968A和1968B所示，流体从第一流体流动路径1970流入入口端口1962A。这将生物反应器1962外部的第一细胞移回生物反应器1962。据信，将第一流体流动路径中的细胞移回细胞生长室改善了细胞的总体扩增，因为在细胞生长室中优化了细胞生长条件。
在一些实施方案中，在步骤1912引入第一流体流动路径的流体可以包括一种或更多种促进细胞扩增的材料(例如，试剂)。例如，在实施方案中，流体可以是包含葡萄糖或其他营养物的培养基，用于供养细胞。在一个实施方案中，流体可以包括试剂，其可以包括用于继续活化细胞扩增的另外的活化剂。具有特定试剂或其他材料的流体的使用将细胞移回细胞生长室，并使细胞暴露于其他能够促进扩增的试剂(例如生长因子、蛋白质等)可能会改善细胞扩增。在实施方案中，在步骤1912中使用的额外流体可以被称为大剂量添加。
此外，在第三时间段之后，在步骤1914，可以以第六流速启动第二泵，以将通过第一流体流动路径引入的第二部分的流体和第二细胞通过出口端口1962B移动到细胞生长室中。在实施方案中，流体的第二部分可以通过出口端口将第一流体流动路径中的第二细胞(由于步骤1910而可能在第一流体流动路径中)移回细胞生长室。参考图19D所示，可以启动泵1964以将引入第一流体流动路径1970的流体移动到出口端口1962B。如箭头1968C所示，泵1964将第一流体循环路径中的流体和细胞通过出口端口1962B移动到生物反应器1962中。如图19D所示，第六流速可以为与第四流速相反的方向(图19C)。这种流体运动将生物反应器1962外部的细胞移回到生物反应器1962中。
在实施方案中，第六流速可以小于第五流速，如上所述，这将流体移动到第一流体流路中。可以理解，第五流速可以引起基于第五流速将一定体积的流体引入循环路径1966的一部分中。可以设定第六速率，以使该体积的一部分向出口端口1962B移动。
在实施方案中，第六流速可以设置为百分比的第五流速。例如，第六流速可以小于或等于第五流速的约90％。在一些实施方案中，第六流速可以被设置为小于或等于第五流速的约80％。在其他实施方案中，第六流速可以小于或等于第五流速的约70％。在其他实施方案中，第六流速可以小于或等于第五流速的约60％。在一些实施方案中，第六流速可以小于或等于第五流速的约50％。
在实施方案中，第六流速至少部分地基于介于第二泵和入口端口的第一体积与介于第二泵和出口端口的第二体积之差。参考图19D所示，第一循环路径的部分可以具有不同的体积。例如，在一个实施方案中，第二泵1964与入口端口1962A之间的第一体积可以具有第一体积，并且第二泵1964与出口端口1962B之间的第二体积可以具有与第一体积不同(例如更大)的第二体积。在这些实施方案中，为了将细胞从循环路径移回到生物反应器中，从而使得细胞通常在大约相同的时间到达生物反应器，可以至少部分地基于这些体积中的差异来设置第六流速。
可以理解，当流体从第一流体流动路径1970进入流体循环路径1966时，流体以设置第一泵1960的流速流向入口端口1962A。当泵1964被启动时，它将至少一部分流体重新导向出口端口1962B。在实施方案中，第二体积(1964和出口端口1962B之间的体积)可以大于第一体积。因此，为了将更多的流体移动到第二容积中，可以将第二泵1964设置为百分比的泵1960的速率。
在一个实施方案中，在步骤1912，可以将泵1960设置为100ml/min。在该实施方案中，第二体积(从泵1964到出口端口1962B)可以大于第一体积(从泵1964到入口端口1962A)。为了考虑额外的体积，实施方案可以在步骤1914中将泵1964设置为70ml/min。该实施方案可以在第三时间段内使细胞大致同时到达生物反应器1962。
在实施方案中，如省略号1916和可选步骤1918所示，过程1900可以可选地进行1906-1914的步骤多次。以下启动的步骤：第一泵(以第二速率)1906、第二泵(以第四速率)1910、第一泵(以第五速率)1912和第二泵(以第六速率)1914可以连续进行一段时间。如上所述，可以进行以下步骤以供养细胞，循环细胞以破坏细胞群落、微群落或簇，并将细胞移回到细胞生长室中。例如，在一些实施方案中，步骤可以每三天、每两天、每天、每天两次或每天三次进行，持续约两天至约二十天(诸如约10天、约9天、约8天、约7天、约6天，或甚至约5天)的时间。在一些实施方案中，可以在不同的时间段进行步骤。例如，在一个实施方案中，可以在三天之后进行步骤然后每隔一天进行步骤。作为另一实例，可以在两天之后进行步骤然后每天两次来进行这些步骤。这仅是一些实例，并且其他实施方案可以利用其他时间段。处理1900在结束操作1920处终止。
注意，在一些实施方案中，过程1900可以包括额外步骤。例如，摇动装置可以连接到生物反应器，并且在第一时间段之后(以及在第二时间段期间)，当在步骤1910中启动第一泵时，摇动装置可以被启动以旋转生物反应器作为循环细胞的一部分以减少细胞簇中的细胞数量。这仅是一个实例，并且过程1900的其他实施方案不限于此。
图20示出了根据本发明的实施方案的，可与诸如CES 500(例如，图5A)或CES 600(图6)的细胞扩增系统一起使用的细胞扩增过程的示例性操作步骤2000。启动开始操作2002，并且过程2000进行到将一次性管套件2004装载到细胞扩增系统上。接下来，系统可以被灌注2006。在一个实施方案中，例如，用户或操作员可以例如通过选择用于灌注的任务来向系统提供指令以进行灌注。在一个实施方案中，用于灌注的这种任务可以是预编程的任务。然后，过程2000进行到IC/EC冲洗任务2008，在该任务中，替换IC循环回路和EC循环回路上的流体。替换的体积取决于所交换的IC体积和EC体积的数量。
接下来，为了在整个生物反应器膜中的纤维上维持适当或期望的气体浓度，可以进行调节培养基任务2010，以使得能够在将细胞装载到生物反应器中之前，培养基与提供的气体供应达到平衡。例如，通过使用高EC循环速率，可以使培养基与气体传输模块或充氧器提供的气体供应之间快速接触。然后可以将系统维持在适当或期望的状态，直到例如用户或操作员准备将细胞装载到生物反应器中为止。在一个实施方案中，例如，系统可以用完全培养基来调节。完全培养基可以是用于细胞生长的任何培养基源。在一个实施方案中，例如，完全培养基可以包含α-MEM(α-MEM)和胎牛血清(FBS)。在其他实施方案中，完全培养基可能包括例如IL-2和人血清。可以使用本领域技术人员理解的任何类型的培养基。
接下来，进行过程2000，例如，将没有循环2012的细胞从细胞进入袋集中装载到生物反应器中。在实施方案中，可以使用“在没有循环的情况下集中装载细胞”的任务，其中可以将包括多个细胞的流体的第一体积以第一流速装载到细胞扩增系统中，其中细胞扩增系统包括细胞生长室。然后可以以第二流速将包括培养基的流体的第二体积装载到第一流体循环路径的一部分中，例如，以将流体的第一体积放置在细胞生长室的第一部分中。在一个实施方案中，细胞生长室或生物反应器的第一部分可包括生物反应器的大约中心区域。在一个实施方案中，第一体积与第二体积相同。在一个实施方案中，第一流速与第二流速相同。在另一个实施方案中，第一体积不同于第二体积。在另一个实施方案中，第一流速不同于第二流速。在一个实施方案中，例如，第一体积和第二体积的总和可以等于第一流体循环路径的体积的百分比或比例，例如总体积。例如，第一体积和第二体积之和可以是例如第一流体循环路径的体积(例如，总体积)的约50％。在一个实施方案中，第一流体循环路径中的流体流过生物反应器或细胞生长室的毛细管内(IC)空间。在一个实施方案中，第二流体循环路径中的流体流过例如细胞生长室或生物反应器的毛细管外(EC)空间。在一个实施方案中，例如，第一体积和第二体积的总和可以是毛细管内(IC)回路的体积的约50％，或根据实施方案的另一百分比或比例。在一个实施方案中，第一体积和第二体积的总和可为适用的另一流体路径，回路等的体积的约50％，或根据实施方案的另一百分比或比例。根据实施方案，可以使用其他百分比或比例，包括例如在约1％至约100％并且包括约1％至约100％的任何百分比。
在细胞的装载2012之后，接下来过程2000进行至供养细胞2014。根据实施方案，细胞可以生长/扩增2016。虽然在步骤2014之后显示了步骤2016，但是步骤2016可以在步骤2014之前或与之同时发生。接下来，过程2000进行到问询2018，以确定是否已经形成了任何细胞群落、微群落或簇。细胞群落、微群落或簇可以是一组一个或更多个附着的细胞。如果已经形成细胞群落、微群落或簇，则过程2000进行“是”以剪切2020任何细胞群落、微群落或簇。例如，在第一时间段内扩增多个细胞之后，可以在第二时间段内以第一循环速率循环细胞，以减少细胞群落、微群落或簇中的细胞数量。在实施方案中，以第一循环速率循环细胞可引起细胞群落产生剪切应力，其中细胞群落中的一个或更多个细胞可与细胞群落分开。在一个实施方案中，例如，减少细胞群落、微群落或簇中的细胞数目可以提供单个细胞悬液。在实施方案中，循环细胞以剪切任何群落、微群落或簇2020可以例如在细胞培养期间每两(2)天使用以维持均匀的细胞密度和营养物扩散。根据实施方案，也可以使用其他时间段。在一个实施方案中，例如，任何微群落、群落或簇的剪切可以在第4天或之后开始。在一些实施方案中，剪切可以在三天之后进行，以及然后的任何每一天。作为另一个实例，步骤可以在2天之后并然后每两天进行。根据实施方案，可以使用其他日期或时间段开始这种剪切。在剪切2020之后，过程2000可接着返回到供养细胞2014。
如果在问询2018处确定不剪切任何细胞群落或簇，或者如果不存在任何细胞群落或簇，则过程2000进行“否”以重悬细胞2022。在实施方案中，可以使用循环细胞以均匀地重悬在培养过程中可能松散粘附的细胞。在实施方案中，步骤2022可包括循环细胞以均匀地重悬那些在开始收获任务或其他任务以从生物反应器去除细胞之前可能松散粘附的细胞。在细胞2022重新悬浮之后，过程2000接下来进行至收获细胞2024。可以可选地在步骤2026进行对去除的细胞的进一步处理或其他分析，然后过程2000可以在结束操作2028处终止。如果希望进行进一步的处理/分析，则过程2000在结束操作2030处终止。
根据实施方案，转到图21和过程2100中，启动开始操作2102，并且过程2100进行到将一次性套件装载1204到细胞扩增系统上。然后一次性套件可以被灌注2106，并且可以发生IC/EC清洗步骤2108。接下来可以调节培养基2110。接下来过程2100进行至装载细胞2112，例如，悬浮细胞或非贴壁细胞，诸如T细胞(例如Treg)。在一个实施方案中，可以通过“在没有循环的情况下集中装载细胞”任务来装载这种细胞2112。在另一个实施方案中，可以通过“在均匀悬浮情况下的装载细胞”任务来装载这种细胞2112。
接下来，根据实施方案，过程2100开始进行供养细胞2114，其可以在第0天开始。细胞可以生长和扩增2116，并且例如，到第3天，可能需要向IC回路添加大剂量的流体并重新分配细胞2118。在一个实施方案中，这种大剂量的流体可以包括试剂，诸如细胞因子或其他生长因子。在另一个实施方案中，这种大剂量的流体可以例如包括试剂和基础培养基。
在这种大剂量添加和重新分配细胞之后，过程2100接下来进行到再次供养2120细胞，其中例如这种供养可以发生在第3天，或者其他实施方案在第2天。利用这种供养2120，可以控制2122系统的参数(诸如控制流速的一个或更多个泵)，以实现互补的流量和逆流设置，以使流体从生物反应器的IC入口端口和IC出口端口进入生物反应器。例如，IC进入泵2124可以被调节或引导以产生流，而IC循环泵可以被调节或引导2126以产生逆流。例如，0.1mL/min的IC进入泵速率可以与-0.1mL/min的互补IC循环泵速率匹配或近似匹配或基本匹配，以在细胞培养的生长阶段(例如，在实施方案中，可能是4-7天，以及在其他实施方案中，1-7天)将细胞维持在生物反应器中。设置2122的这种控制可以使得能够抵消与从生物反应器的IC出口端口丢失细胞相关的任何力。
过程2100接下来进行至问询2128，在该问询中，例如确定是在其他日期或其他时间间隔继续添加试剂还是进行其他大剂量添加。如果期望添加额外的试剂或其他大剂量并重新分配细胞，则过程2100分支至“是”以添加试剂并重新分配细胞2118。根据实施方案，例如，这种大剂量添加和细胞的重新分配可能在随后第6天和第9天发生。在其他实施方案中，大剂量添加和重新分配可能在两天之后，并且然后每两天发生。
如果不希望或一旦不希望继续添加大剂量(例如试剂)并重新分配细胞，则过程2100进行“否”以收获细胞2130，在其中可以将细胞转移到收获袋或容器。然后，过程2100在结束操作2136处终止。
或者，从收获操作2130开始，过程2100可以可选地进行以使得能够进一步的处理/分析2132。这种进一步的处理2132可以包括表征例如收获的细胞(例如T细胞(诸如Treg))的表型。从可选的进一步处理/分析步骤2132，过程2100可以继续进行以可选地重新装载任何剩余的细胞2134。然后，过程2100可以在结束操作2136处终止。
过程2200示出了根据本发明的实施方案的用于在细胞扩增系统中扩增细胞的过程的操作步骤。在某些实施方案中，过程2200可用于扩增T细胞(例如Treg)。如图所示，可以在14天方案的过程中进行各种步骤以扩增细胞。启动开始操作2202，过程2200进行到第0天，其中将一次性套件装载到细胞扩增系统2206上。然后可以对一次性套件进行灌注2208，其中可以使用PBS(例如Lonza不含Ca2+/Mg2+)灌注2208组件。在准备装载细胞时，可以使用IC/EC冲洗液2210来交换灌注液。例如，根据一个实施方案，可以将系统中的PBS交换为TexMACS GMP基础培养基。接下来可以调节培养基2212。可以进行调节培养基2212以在将细胞装载到生物反应器中之前使培养基能够与提供的气体供应达到平衡。
接下来，在第0天，过程2200进行至装载细胞2214，例如，悬浮细胞或非贴壁细胞，诸如T细胞(例如Treg)。在一个实施方案中，可以通过“在没有循环的情况下集中装载细胞”任务装载这样的细胞2214。在另一个实施方案中，可以通过“在有均匀悬浮的情况下的装载细胞”任务来装载这样的细胞2214。
在第3天2216，可在细胞重新分配2218时添加大剂量的细胞因子。在实施方案中，可与大剂量添加组合进行细胞的重分配以混合细胞并使细胞更彻底地暴露于可能在大剂量添加中的细胞因子(例如，IL-2)。在实施方案中，重新分配还可以破坏可能已经形成的细胞的群落或簇。在实施方案中，重新分配可以首先通过使细胞在流体循环路径中循环而发生。然后可以在将细胞推回到生物反应器的过程中添加大剂量添加，诸如通过将流体引入流体循环路径以将细胞推回到生物反应器中。在重新分配和大剂量添加2218之后，过程2000进行到供养细胞2220。
在第6天2222，细胞可用另一次大剂量添加再次进行重新分配2224。重新分配可破坏在第3-5天期间可能形成的细胞群落或簇。大剂量添加可以使细胞暴露于促进扩增的其他试剂。过程2000进行到在第6天给细胞2226供养。在第9天2228，可用大剂量添加再次将细胞重新分配2230。重新分配可能会破坏在第6-8天形成的细胞群落或簇。大剂量添加可以使细胞暴露于促进扩增的其他补充剂。过程2000进行到在第9天给细胞2232供养。
在第11-13天2234，可用大剂量添加来再次重新分配细胞2236。重新分配可能会破坏第9-10天期间形成的细胞群落或簇。大剂量添加可以使细胞暴露于促进扩增的其他试剂。然后，过程2000进行到细胞2238供养。在实施方案中，可以在第11天、第12天和第13天的每一天进行步骤2236和2238。这可能是由于细胞在第0-10天扩增的结果以及生物反应器中有大量细胞。进行细胞的重新分配和大剂量添加可通过更频繁地破坏细胞的群落和簇并将它们与大剂量添加中的试剂混合以促进细胞扩增。处理2200在结束操作2240处终止。
过程2300示出了根据本发明的实施方案的用于在细胞扩增系统中扩增细胞的过程的操作步骤。在一些实施方案中，过程2300可以用于扩增T细胞(例如，效应、辅助、记忆、幼稚或其组合等)。如图所示，各种步骤可以以8天的方案进行以扩增细胞。启动开始操作2302，并且过程2300进行到第0天，其将一次性套件装载到细胞扩增系统2306上。然后，一次性套件可以被灌注2308，其中例如可以用PBS(例如，不含Ca2+/Mg2+的Lonza)将组件灌注2308。在准备装载细胞时，可以使用IC/EC冲洗2310来交换灌注流体。例如，根据一个实施方案，可以将系统中的PBS交换为TexMACS GMP基础培养基。在其他实施方案中，PBS可以交换为Prime XV基础培养基、改进RPMI+谷氨酰胺基础培养基、RPMI1640+谷氨酰胺基础培养基，或者IMDM+谷氨酰胺。接下来可以调节培养基2312。可以进行调节培养基2312以在将细胞装载到生物反应器中之前使培养基与提供的气体供应达到平衡。
接下来在第0天，过程2300进行到装载细胞2314，例如，悬浮细胞或非贴壁细胞(诸如T细胞)。在一个实施方案中，可以通过“在没有循环的情况下集中细胞”任务来装载这样的细胞2314。在另一个实施方案中，可以通过“具有均匀悬浮的装载细胞”任务来装载这样的细胞2314。在一些实施方案中，可以将细胞与珠子(诸如人T-活化剂珠子)混合。在实施方案中，珠子可以以诸如约1个珠子:约1个细胞、约2个珠子:约1个细胞、约3个珠子:约1个细胞，或者甚至约4个珠子:约1个细胞的比例存在。在一些实施方案中，细胞可以是单核细胞(例如，PBMC)。
在第2天2316，可以在重新分配细胞2318时添加大剂量的细胞因子。在实施方案中，可以进行与大剂量添加相结合的细胞的重新分配以混合细胞并使细胞更彻底地暴露于大剂量添加中可能存在的细胞因子(例如IL-2)。在实施方案中，重新分配还可以破坏可能已经形成的细胞的群落或簇。在实施方案中，重新分配可以首先通过使细胞在流体循环路径中循环而发生。然后可以在将细胞推回到生物反应器的过程中(诸如通过将流体引入流体循环路径以将细胞推回到生物反应器中)添加大剂量添加物。在重新分配和大剂量添加2318之后，过程2300进行到供养细胞2320。
可以在第3天2322用另一个大剂量添加来再次重新分配细胞2324。重新分配可以破坏在0-2天期间可能形成的细胞群落或簇。大剂量添加可以使细胞暴露于促进扩增的其他试剂。过程2300接着在第3天供养细胞2326。在第3天2322，可以在第3天再次用另一个大剂量添加重新分配细胞2328。如上所述，大剂量添加可以使细胞暴露于继续促进它们的扩增的其他试剂。过程2300可在第3天再次进行供养细胞2330。
可以在第4天2332用另一个大剂量添加来再次重新分配细胞2334。重新分配可能破坏在第3天形成的细胞的群落或簇。大剂量添加可以使细胞暴露于促进扩增的其他试剂中。过程2300在第4天供养细胞2336。在第4天2332，可以在第4天再次用另一个大剂量添加重新分配细胞2338。如上文所述，大剂量添加可以使细胞细胞暴露于继续促进它们的扩增的其他试剂。过程2300可在第4天再次进行供养细胞2340。在实施方案中，可以在第5天，第6天和第7天的每一天执行步骤2334、2336、2338和2340。这可作为细胞在第0-4天扩增的结果而发生，并且生物反应器中的细胞数量更多。进行细胞的重新分配和大剂量添加可以通过更频繁地破坏细胞的群落和簇并将其与大剂量添加中促进细胞扩增的试剂混合以促进细胞的扩增。处理2300在结束操作2342处终止。
过程2400示出了根据本发明实施方案的用于在细胞扩增系统中扩增细胞(例如，悬浮细胞或非贴壁细胞)的过程的操作步骤。在一些实施方案中，过程2400可以用于扩增T细胞，诸如Treg。过程2400的步骤的组合可以使得能够使用初始的低接种密度将细胞扩增至有用的临床量。
启动开始操作2402，并且进行过程2400以将一次性套件2404装载到细胞扩增系统上。然后，一次性套件可以被灌注2406，其中例如可以用PBS(例如，不含Ca2+/Mg2+的Lonza)将组件灌注2406。在准备装载细胞时，可以使用IC/EC冲洗2408来交换灌注流体。例如，根据一个实施方案，可以将系统中的PBS更换为TexMACS GMP基础培养基。在其他实施方案中，PBS可以交换为Prime XV基础培养基、改进RPMI+谷氨酰胺基础培养基、RPMI1640+谷氨酰胺基础培养基，或者IMDM+谷氨酰胺。接下来可以调节培养基2410。可以进行调节培养基2410以在将细胞装载到生物反应器中之前使培养基与提供的气体供应达到平衡。
过程2400进行到2412，装载具有细胞的流体的进入体积。在实施方案中，细胞可以包含非贴壁细胞，诸如一种或更多种类型的T细胞，例如Treg。在一个实施方案中，细胞包含Treg。实施方案可提供利用IC进入泵通过IC进入路径将带有细胞的流体的进入体积装载并进入到IC循环路径中。在实施方案中，在不启动IC循环泵的情况下将装载进入体积装载2412。
过程2400进行到将进入体积置于生物反应器2414的第一部分中。在实施方案中，可以通过引入第二体积的流体来进行放置，该流体可以包括培养基并且可以被引入到IC循环路径的一部分中以将细胞的进入体积推入生物反应器的第一位置。在实施方案中，流体的进入体积和流体的第二体积可以相同。在其他实施方案中，流体的进入体积和流体的第二体积可以不同。在其他实施方案中，流体的进入体积和第二流体的体积之和可以等于百分比的IC循环路径的体积。
在放置进入体积2414之后，过程2400进行到将细胞暴露于活化剂2416，以活化细胞扩增。在一些实施方案中，细胞可以暴露于可溶性活化剂2416。在一些实施方案中包括抗体复合物的活化剂可以被添加到培养基中，并且可以被包括在进入体积中，或者随后诸如与第二体积一起被添加。在实施方案中，活化剂可以是例如人抗体CD3/CD28/CD2细胞活化剂复合物。在其他实施方案中，活化剂可以是具有CD3/CD28抗体的珠子。在实施方案中，细胞可以在装载2412之前暴露于活化剂。
过程2400进行到在第一时间段每个第一过程内供养细胞2418。在实施方案中，可以以最小或低的供养速率供养细胞，例如，在第一时间段开始生长/扩增细胞群2420，并且最小或低供养速率能够满足该群体的需求。例如，可以在该第一时间段内使用+0.1mL/min的IC进入泵速。如果希望在此第一时间段内减少中空纤维膜生物反应器的细胞损失，可将+0.1mL/min的IC进入泵速与互补的-0.1mL/min的IC循环泵速匹配或近似匹配或基本匹配以在细胞培养物的生长阶段维持细胞在生物反应器中。
从2420开始，过程2400在第二时间段中进行细胞扩增2422。在第二时间段中进行细胞扩增2422还可能涉及在第二时间段中按照第二过程供养细胞2424。在一个实施方案中，这种第二过程可能涉及例如，以与第一时间段基本相同的供养速率供养细胞。在另一个实施方案中，第二过程可以涉及与在第一时间段期间使用的供养速率相比以不同的供养速率供养细胞。例如，由于在第一时间段中细胞的扩增，供养速率可能增加。
在第二时间段中使细胞扩增2422的同时，也可以将细胞循环以剪切细胞群落或细胞簇2426。步骤2426可以包括在IC循环路径中循环细胞以剪切可能在第一时间段形成的细胞群落或簇。剪切群落或簇2426步骤可减少细胞群落或细胞簇中的细胞数量。在实施方案中，循环以剪切2426可引起细胞群落产生剪切应力，引起细胞集落中的一个或更多个细胞与细胞群落分离。
接下来过程2400进行至收获操作2428，其中可以将细胞转移到收获袋或容器中。在实施方案中，可以收获治疗剂量的细胞。在实施方案中，在操作2428处收获的细胞可以在1×109个细胞的数量级上。在实施方案中，所收获的细胞可具有约75％至约95％之间的活力。
过程2400然后可以可选地进行至使得能够进一步的处理/分析2430。这种进一步的处理可以包括表征例如收获的细胞(例如T细胞(诸如Treg))的表型。在一个实施方案中，收获的细胞可以表达与Treg一致的生物标志物。例如，细胞可以表达CD4+、CD25+和/或FoxP3+生物标志物。在实施方案中，收获的细胞可以以高于约80％的频率包括CD4+CD25+表型。在其他实施方案中，细胞可以以高于约55％的频率包括CD4+FoxP3+表型。在其他实施方案中，细胞可以表达与效应、辅助、记忆和/或幼稚T细胞一致的生物标志物。例如，细胞可以表达CD3+、CD4+和/或CD8+生物标志物。在实施方案中，收获的细胞可以以约50％至约100％之间的频率包含CD3+表型。收获的细胞可以以高于约25％、高于约30％、高于约35％、高于约40％、高于约45％、高于约50％、高于约55％，或者甚至高于约60％频率包括CD4+表型。在其他实施方案中，细胞可以以约30％至约100％之间的频率包括CD8+表型。然后，过程2400可以在结束操作2432处终止。
根据本发明的实施方案，提供在以上附图中描绘的操作步骤是为了说明的目的，并且可以被重新布置，组合成其他步骤，与其他步骤并行使用等。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在实施方案中使用更少或额外的步骤。而且，在一些实施方案中，诸如灌注、调节培养基、装载细胞之类的步骤(和任何子步骤)可以自动进行，诸如通过存储在存储器中的预编程任务的处理器来进行，提供这些步骤仅出于说明目的。进一步地，图10B描绘了出于说明的目的而提供的例如用于供养细胞的示例泵速设置。根据本发明的实施方案，可以使用其他泵速、流速、方向等。
在美国专利申请系列号13/269,323美国专利(“中空纤维生物反应器系统中生长和收获细胞的可配置方法和系统”，2011年10月7日提交)和美国专利申请系列号13/269,351(“中空纤维生物反应器系统中生长和收获细胞的可自定义方法和系统”，2011年10月7日提交)中提供了与细胞扩增系统一起使用的包括自定义任务和预编程任务的任务和方案的实例和进一步描述，其全部内容通过引用并入本文。
接下来，图25示出了可以在其上实现本发明实施方案的计算系统2500的示例性组件。例如，计算系统2500可以在实施方案中使用，其中细胞扩增系统使用处理器来执行任务(诸如自定义任务或预编程任务)作为诸如在本文示出和/或描述的过程的一部分。在实施方案中，预编程的任务例如可以包括遵循“IC/EC冲洗”和/或“供养细胞”。
计算系统2500可以包括用户界面2502、处理系统2504，和/或存储器2506。如本领域技术人员所理解的，用户界面2502可以包括输出设备2508和/或输入设备2510。输出设备2508可以包括一个或更多个触摸屏，其中，触摸屏可以包括用于提供一个或更多个应用窗口的显示区域。触摸屏还可以是输入设备2510，其可以例如接收和/或捕获来自用户或操作者的物理触摸事件。如本领域技术人员所理解的，触摸屏可以包括具有电容结构的液晶显示器(LCD)，该电容结构使得处理系统2504能够推断出触摸事件的位置。然后，处理系统2504可以将触摸事件的位置映射到在应用窗口的预定位置中呈现的UI元素。根据实施方案，触摸屏还可以通过一个或更多个其他电子结构来接收触摸事件。如本领域技术人员所理解的，其他输出设备2508可以包括打印机、扬声器等。其他输入设备2510可以包括键盘、其他触摸输入设备、鼠标、语音输入设备等。
根据本发明的实施方案，处理系统2504可以包括处理单元2512和/或内存2514。处理单元2512可以是通用处理器，其可操作以执行存储在内存2514中的指令。根据实施方案，处理单元2512可以包括单个处理器或多个处理器。进一步地，在实施方案中，每个处理器可以是具有一个或更多个核心以读取和执行单独的指令的多核处理器。如本领域技术人员所理解的，处理器可以包括通用处理器、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)、其他集成电路等。
根据实施方案，内存2514可以包括用于数据和/或处理器可进行指令的任何短期或长期存储器。如本领域技术人员所理解的，内存2514可以包括例如随机存取内存(RAM)、只读内存(ROM)或电可擦除可编程只读内存(EEPROM)。如本领域技术人员所理解的，其他存储介质可以包括例如CD-ROM、磁带、数字多功能盘(DVD)或其他光学存储、磁带、磁盘存储器、磁带，其他磁存储设备等。
存储器2506可以是任何长期数据存储设备或组件。根据实施方案，存储器2506可以包括结合内存2514描述的一个或更多个系统。存储器2506可以是永久的或可移动的。在实施方案中，存储器2506存储由处理系统2504生成或提供的数据。
实施例
以下描述包括可以与诸如CES 500(例如，图5A、5B、5C)和/或CES 600(图6)的细胞扩增系统一起使用的方案/方法/过程的一些实施例。例如，其实现了实施方案的各方面。尽管可以在实例中描述特定特征，但是仅出于说明和描述目的提供此类实例。例如，尽管实例可以提供T细胞和/或Treg细胞的扩增，但是在其他实施方式中可以使用其他和/或额外细胞类型和/或其组合。尽管根据一些实施方案描述了特定的参数、特征和/或值，例如使用CES，例如细胞扩增系统，但是这些参数、特征和/或值等仅出于说明性目的。本发明不限于本文提供的实例和/或具体细节。
进一步地，本文提供的实例并非旨在限制其他实施方案，其可以包括不同或额外的步骤、参数或其他特征。在一些实施方案中，包括步骤(和任何子步骤)的示例性方法或方案可以自动进行，诸如通过进行存储在内存中的预编程任务的处理器。在其他实施方案中，可以通过自动和手动进行操作的组合来进行步骤(和任何子步骤)。在进一步的实施方案中，步骤(和任何子步骤)可以由操作员或用户或通过其他手动方式进行。
尽管可以在这样的实例中提供示例性数据，但是提供这些示例性数据仅用于说明目的，并不旨在限制其他实施方案，其可以包括不同的步骤、参数、值、材料或其他特征。
实施例1
方法
普通Treg细胞培养
免疫磁分离的CD4+CD25+Treg可以通过白细胞分离术从健康的成年供体外周血(HemaCare Corporation,Van Nuys,CA)中获得，然后可以随后在Terumo BCT中以无菌过滤的TexMACSTMGMP培养基中1.0×105细胞/mL的浓度扩增，培养使用三个T25烧瓶(7mL/瓶)补充200IU/mL的重组人IL-2IS特级细胞因子(Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach)和Gibco PSN 100X抗生素混合物(ThermoFisher Scientific,Waltham，MA)。活跃生长的Treg细胞悬浮液可随后在三(3)个“细胞扩增系统”实验运行的每一个中用作接种物。在不存在微珠的情况下，可以使用可溶性四聚体ImmunocultTM人类抗体CD3/CD28/CD2细胞活化剂复合物(Stem Cell Technologies，Vancouver，BC)以25μL/mL共同刺激接种物和Quantum系统扩增的Treg。对于Treg接种物，可以在第0和9天进行共刺激，对于Quantum系统Treg扩增，可以在第0天进行共刺激。Quantum系统HFM生物反应器的特征是毛细管内环体积为177.1mL，表面积为21000cm2。
Quantum系统Treg扩增
根据实施方案，可以使用Quantum培养基袋4L Set(Cat.21021)准备两(2L)袋无菌过滤培养基，用于Treg在Quantum系统中按比例扩增。包含TexMACS GMP、IL-2和PSN抗生素的一个2L完全培养基袋可用于供给IC隔室，而包含TexMACS GMP和PSN抗生素的一个2L基础培养基可用于供给生物反应器的EC进入隔室。在用PBS灌注Quantum系统(Lonza Cat.17-516Q，Walkersville,MD)后，可以使用TSCD-Q Terumo无菌焊机将培养基袋连接到适当的IC和EC进入管线。可以保护完全培养基，使其免受光线照射。
可以使用无菌技术将每次运行的总细胞装载量(4.5-6.5×107Treg)重悬在50mL完全培养基中，该培养基用Quantum细胞进入袋(Cat.21020)，以引入到Quantum系统生物反应器中。在Treg扩大扩增运行期间，也可以使用其他一次性袋子，诸如Quantum CES培养基袋4L(Cat.21021)和废物袋4L(Cat.21023)。
完成“在无需循环的情况下集中装载细胞”任务后，可以在177mL完全培养基中以2.5-3.7×105个细胞/mL的浓度或中空纤维膜生物反应器的内腔或毛细血管内腔(IC)内的平均2.1-3.1×103细胞/cm2，将Treg接种在Quantum系统运行系统(n＝3)上。
第0-4天
示例性Quantum系统自定义任务
供养细胞，改进的
针对调节性T细胞的IC/EC交换和调节培养基，实施例
使用Terumo BCT TSCD-Q无菌焊机将带有IL-2补充剂(200IU/mL)的TexMACS GMP完全培养基附接到Quantum系统的IC培养基管线。将TexMACS基础培养基附接到EC培养基管线。分别进行IC/EC冲洗和调节培养基任务。完全培养基可用于IC交换或冲洗，而基础培养基可用于EC交换或冲洗，以节省IL-2和活化剂复合物的量。
在引入细胞之前，将系统放在(place)经过改进的“供养细胞”上。在第5、6和7增大IC进入速率(Q1)和IC循环速率(Q2)以将速率匹配到0.2、0.3和0.4mL/min，但在第4、5、6天其方向相反或者根据需要以保持乳酸水平在5-8mmol/L。
表1：供养细胞，改进的，实施例
示例性Quantum系统自定义任务：
在没有循环的情况下集中装载细胞，实施例。
目的：该任务使得悬浮细胞能够在生物反应器膜内集中分布，同时使得能够在毛细血管外(EC)循环回路上流动。到IC回路的泵流速可以设置为零。
在使用没有循环的情况下集中装载细胞将细胞装载到Quantum系统之前，输入对任务的修改。
表2：没有循环的情况下集中装载细胞，修改，实施例
表3：没有循环的情况下集中装载细胞，实施例
根据需要返回默认的细胞供养任务，并继续使用供养细胞任务扩增方案。
表4：供养细胞，改进，实施例。
第4天或以后：
在细胞培养期间或收获之前，重悬Treg细胞，实施例。
改进后的循环任务的目的是使细胞在培养过程中或启动“收获任务”之前松散粘附的细胞均匀悬浮。
此外，此任务可用于在细胞培养过程中每两(2)天剪切Treg细胞群落，以保持从第4天或之后开始的均匀细胞密度和营养物质扩散。如果此任务用于培养期间剪切群落，Quantum系统可能会返回到修改后的“供养细胞”任务。
表5：细胞的循环和重悬浮，将细胞返回生物反应器以及供养，实施例
具有改进的收获Quantum系统收获任务，实施例
表6：收获，改进，实施例
可以通过RF焊接将收获的细胞从Quantum系统中去除，以进行进一步的评估和分析。
收获后分析
可用Vi-CELL XR 2.04细胞活力分析仪(Beckman Coulter)在5-50μm的范围内计数收获的细胞，并通过台盼蓝染料排除法定量膜完整性。
代谢
可以通过i-STAT手持式分析仪(Abbott Point of Care,NJ,Princeton,NJ)从每日Quantum系统的EC样品端口监测调控T细胞的代谢，针对葡萄糖和乳酸浓度分别使用i-STAT G盒(Cat.03P83-25)和i-STAT CG4+盒(Cat.03P85-50)。
细胞表面生物标志物表达
人调节性T细胞(天然的和诱导的)构成人脐带血和外周血中所有T细胞的一小部分(2-10％)。在功能上，Treg负责维持免疫稳态，包括先天和适应性响应中免疫耐受的调节。此外，已知转录调节叉头盒P3(FoxP3)基因产物的表达与CD4+CD25+FoxP3+CD127lo/-Treg表型以及抗原呈递细胞(APC)和效应T细胞(Teff)的免疫抑制相关。IL-2与CD25/IL-2受体(Rα)的结合以及STAT5转录因子的激活用于Foxp3诱导。FoxP3抑制通过与组蛋白乙酰化酶KAT5和组蛋白脱乙酰基酶HDAC7的结合而上调几个基因(诸如CTLA-4、TNFRSF18和IL2RA)的活性，并下调IL-2。
收获的细胞表面生物标志物的Treg表型频率可以通过流式细胞术定量。为此，可以使用以下抗体偶联物对细胞进行染色，并针对未染色的活细胞进行门控：FixableViability780(eBioscience 65-0865)、小鼠抗人CD4-PE(BD Pharmingen561844)、抗CD4-Alexa Fluor 647(BD Pharmingen 557707)，抗CD4-FITC(BD Pharmingen561842)、抗CD4-FITC(BD Pharmingen 555346)，抗CD25-PE(BD Pharmingen 555432)、抗CD127-PE(BD Pharmingen 557938)，抗CD45RO-PE(BD Pharmingen 347967)和抗FoxP3-Alexa Fluor 647(BD Pharmingen 560045)。样本数据可在配备FACSDiva v6.1.3软件的珠子补偿BD Canto II流式细胞仪上获取，每个样本使用1×106细胞和总共20000个事件。
实验流程图，实施例
可能的结果
在静态培养物中对Treg的初步研究可能表明，这些细胞倾向于形成直径约100μm的微群落。每两天在培养基交换过程中分离这些细胞可能有助于限制细胞坏死，并通过使用ID为762μm的1000μL移液器吸头将细胞恢复为高密度单细胞悬液。或者，在预编程每日循环任务的帮助下，在纤维腔ID约为200μm的自动HFM生物反应器(例如在Quantum系统中)中更高效地完成维持单细胞悬液的过程。另外，由于可以在功能上封闭的系统中进行，因此这种自动供养任务可以减少污染的可能性，同时保持营养物持续流向Treg培养物。
可能的Treg细胞密度和活力
表7：T25瓶可能的收获
| 细胞密度 | 3.11×106细胞/mL |
| 8.71×105细胞/cm2 | |
| 活力 | 81.90％ |
| 刺激周期 | 2 |
| 倍增 | 4.9 |
表8：Quantum系统可能收获
| 细胞密度 | |
| 收获袋 | 3.61×106细胞/m |
| 生物反应器 | 1.24×107细胞/mL |
| ≥7.33×104细胞/cm2 | |
| 活力 | 84.80％ |
| 刺激周期 | 1 |
| 倍增 | 4.6 |
| 倍增时间 | 41.6小时 |
初步的细胞接种密度实验
在自动生物反应器中准备来自供体的免疫磁性选择的细胞扩增时，可以进行一系列静态生长实验，以确定是否可以以小于1.0×106细胞/mL的接种密度培养受刺激的Treg。可以通过在24孔组织培养板的18孔中接种1.0×105细胞/mL或在补充有IL-2(200IU/mL)和PSN抗生素的TexMACS GMP培养基的孔中进行该部分研究。这些细胞还可以在第0天和第9天用25μL/mL的可溶性抗CD3/CD28/CD2mAb复合物共同刺激。可以手动收集细胞并在第14天通过Vi-CELL XR进行计数。
表9：可能的Treg细胞接种静态平板测试的总结。
缩写：倍增(DS)，倍增时间(DT)。
收获后，可将细胞样品合并以通过流式细胞术进行Treg生物标志物分析。可能的结果可能表明，在静态培养中，CD4+C25+、CD4+CD127-和CD4+FoxP3+表型的频率分别为90.9％、79.7％和31.6％。CD4+C25+表型(>70％)通常是Treg生物标志物鉴定最可靠的决定因素，因为FoxP3+检测高度依赖于通透性方法和细胞活力。
在可溶的共刺激抗CD3/CD28/CD2mAb复合物和无血清培养基存在下培养时，该静态平板测试的数据可能表明人Treg在细胞接种密度约为105个细胞/mL时可能会扩增。
Treg代谢
调节性T细胞依赖于线粒体的代谢，并具有氧化多种碳源，即脂质或葡萄糖的能力。众所周知，由于mTOR调节糖酵解和脂肪酸代谢，Treg进入高度增殖状态时，它们的代谢会从脂肪酸氧化(FAO)转变为糖酵解。此外，已经显示，通过IL-2/STAT5/烯醇酶-1启动子信号通路和2-脱氧-D-葡萄糖抑制研究调节FoxP3变体的表达，糖酵解对于人类诱导型Treg的产生和抑制功能可能是必需的。因此，监测葡萄糖和乳酸水平可以促进Quantum系统培养基流速的调节以支持Treg在中空纤维生物反应器中的扩增。最初，可认为Treg在进入细胞周期并增殖之前会暂时降低其代谢率。在TCR刺激之前，新鲜分离的人Treg中糖酵解和mTOR活性的瞬时降低可能支持这一点。具体而言，由于mTOR通路上调，mTORC1可能被认为可以增加葡萄糖转运蛋白(诸如Glut-1介导的葡萄糖转运)的表达。
来自三个单独的Treg细胞等分试样的三(3)个扩增的可能结果可能表明，在每次Quantum系统运行中，葡萄糖消耗和乳酸生成似乎相互关联。所有三个离体扩增试验均可能表明，Treg中的葡萄糖消耗量可能在第1天增加到本底水平以上，而3个试验中的2个可能表明，到第2天，乳酸生成水平可能会增加到本底水平以上。细胞在融化时的活力降低可能会产生滞后的乳酸生成速率，这可能反映在细胞收获量中。在生长最活跃的Treg培养物中，三个试验中的两个的最大葡萄糖消耗速率在第8天和第7天分别可能为1.618和2.342mmol/天。在相同的时间点，最大乳酸生成速率可能为2.406和3.156mmol/天。
在整个Treg扩增过程中，可通过同时将第4-8天在中空纤维膜内腔的IC输入(+)和IC循环(-)泵速从(±0.1增至±0.4)来努力乳酸值控制在≤7mmol/L。Treg细胞扩增过程中的最低葡萄糖水平可能为第7天(Q1584)的264mg/dL至第8天(Q1558)的279mg/dL。用于这些可行性扩增的细胞生长配制培养基中的基础葡萄糖浓度可以为325至335mg/dL，当与Quantum系统流速调节配合使用时，可以发现是支持的。
调节性T细胞生物标志物表达
在该可行性研究中，通过流式细胞术对Treg细胞收获的评估可能集中在CD4+CD25+FoxP3+T细胞亚群上。在T淋巴细胞中，第12号染色体上的人CD4基因编码膜糖蛋白，该膜糖蛋白与II类主要组织相容性复合物相互作用，并起着启动T细胞活化早期作用。在调节性T细胞中，第10号染色体上的人CD25(IL2R)基因编码IL-2受体，并通过隔离细胞因子IL-2发挥功能。在调节性T细胞中，染色体X上的前叉/有翼螺旋框P3人类基因编码FoxP3转录因子，这可能是Treg抑制子功能所必需的。FoxP3基因产物与CD25、CTLA-4和IL-2、IL7R、IFN-γ基因的启动子区域结合，从而上调CD25和CTLA-4并抑制IL-2、IL7R和IFN-γ基因的转录。CD127基因编码IL-7受体，与常规T细胞相比，Tregs的特征通常是CD127(IL-7R)表达低。但是，已知某些Treg亚群在体外和体内激活过程中表达高CD127水平，这可能与将细胞与IL-7孵育时更高的Treg存活率有关。CD45RO基因产物在幼稚胸腺来源的Tregs上表达，该Tregs在激活后失去CD45RA并表达CD45RO。
表10：可能的调节性T细胞生物标志物表达占亲本群体的百分比。*对FoxP3+频率，Q1567细胞融化(thaw)/收获时细胞活力低以及不完全通透性。
根据一个实施方案，从Quantum系统收获的细胞中CD4+CD25+Treg表型频率的平均表达可能为85.5％，这可以与已发表的CD4+CD25+释放标准>70％相比更好。在Q1567Treg扩增中，CD4+CD127低群体的频率升高(74.2％)可能反映了该特定融化细胞样品中低细胞活力，因为这些细胞只能与IL-2作为细胞因子补充物一起培养。在通过接种和收获活力均高于80％的两个Quantum系统运行的细胞中，CD4+FoxP3+表达频率可能为61.6％。这一发现可能与FoxP3+的发布版本规范≥60％一致。此外，这二十亿个细胞扩增的结果与可能从HemaCare BioResearch Products获得的原始供体Treg细胞样本中的CD4+CD25+(87.30％)、CD25+(47.76％)和FoxP3+(59.64％)生物标志物表达相比更好。
可以使用荧光Minus One(FMO)门控、不同的染色剂和不同的仪器，对由第三方实验室运行的Q1584扩增液中冷冻保存的Treg细胞进行其他流式细胞仪分析。FMO对照是一种门控对照，用于通过考虑数据图中所有荧光染料的分布减去用于量化特定标记物频率的荧光染料的扩散来解释细胞群体。例如，来自第三方实验室的流量结果可能表明，从Q1584运行开始，CD4+CD25+Treg细胞群体的频率可能是95.4％，与Terumo BCT CES实验室发现的90.5％相比是有利的。用替代的抗FoxP3-PE克隆染色剂进行的不完全染色可能会限制第三方实验室对该内部生物标志物的定量，但点状图可能表明Q1584标本中可能存在高表达FoxP3+Treg的亚群，但可能不在对照Treg细胞参考样品中观察到。尽管有趣，但可能需要进行额外研究以确认这些观察结果。
收获产量
在每次运行的50个样品中定义的在5-50μm范围内Q1558、Q1567和Q1584运行时，Quantum系统中存活(台盼蓝除外)Treg细胞的平均直径可能分别为10.89、11.04和11.06μm。这可以与生物反应器接种时瓶中的平均细胞直径分别为11.91、12.40和7.83μm进行比较。
这些可能的细胞直径数据可能表明，从Quantum系统中收获的细胞直径可能比在接种瓶中扩增的细胞直径更均匀。
Treg Quantum系统可能的收获数据汇总在表11中。此外，当将Q1554/1584收获与Q1567收获的结果进行比较时，CD4+CD25+细胞活力的影响在接种生物反应器时可能会很明显。Q1554/1584扩增实验的生物反应器接种物中的活力可能比Q1567运行的生物反应器接种物中的活力高32-41％。这可能是由于原始细胞分离，冷冻保存技术或保存时间的变化所致，因为本研究中可能使用的细胞等分试样(HemaCare PB425C-2；Lot14034019)可能源自2014年2月11日的同一供体。
表11：Treg细胞从接种瓶到Quantum系统收获物的可能扩增。缩写：DS–群体倍增，DT–群体倍增时间(小时)。A.收获数据可能基于带有台盼蓝的Vi-Cell XR计数，以确保膜的完整性。B.注意：瓶中的Treg细胞接种物可能在第0天和9天接受两(2)轮共刺激；而从Quantum系统收获的Treg可能会在第0天收到一(1)轮的共刺激。
该可行性研究的目的可能是确定Quantum系统是否可以使用市售的补充剂来支持Treg在7.0×107～1.4×109细胞范围内的扩增。使用可溶性抗CD3/CD28/CD2mAb共刺激物复合物，在接种密度小于1.0×106细胞/mL不超过八(8)天，从Q1554和Q1584获得的三个生物反应器中的两个可以平均产生1.56×109Treg。在Q1554/1584运行期间，Quantum系统生物反应器的IC回路中的平均收获细胞密度为8.81×106细胞/mL或7.43×104细胞/cm2。
可能的结论
该可行性研究的结果本质上可能是探索性的，不一定设计成涵盖所有技术选择。例如，可以考虑将接种Treg共刺激从两(2)次激活减少到一(1)次激活事件。这样，在免疫磁性分离的调节性T细胞的自动Quantum系统扩增中使用的方法可以进行改进。我们在这里的尝试可能是定义培养过程的某些技术方面，这些方面可能有助于进一步研究Quantum系统平台内Treg的扩增。在这种情况下，可能的研究结果可能表明这些可能的结论或观察可能是合理的，并且可能有助于生产用于研究、开发或生产目的的调节性T细胞。
当在Quantum系统自动中空纤维生物反应器中补充了细胞因子IL-2时，可以培养鉴定为FoxP3+/CD25+的人Treg，并且可以在不存在共刺激mAb包被的磁珠的情况下，用可溶性共刺激抗CD3/CD28/CD2单克隆抗体(mAb)T细胞复合物进行扩增。
可从小于1×106细胞/mL或小于6.6×104细胞/cm2的细胞接种密度在Quantum系统中有效扩增人Treg。为此，可以在不到14天的时间内收集范围在7.0×108至1.4×109个细胞之间的Treg的目的可以达到平均(n＝3)为1.09×109个总细胞。平均85.5％的细胞可以表达Treg CD4+CD25+表型，平均42.9％的细胞可以表达CD4+FoxP3+表型(n＝3)。在二(2)十亿个细胞的Quantum系统扩增中，平均总细胞的61.6％可表达CD4+FoxP3+表型。由于细胞数量的限制，可以通过第三方实验室人类IMSR验证三个Quantum系统Treg细胞扩增运行之一的CD4+CD25+表达。
通过在自动中空纤维生物反应器的管腔(IC环)内集中接种细胞，可以在Quantum系统中对成功地培养人Treg，并扩增。
可以并行调节培养基的IC输入(+0.1至+0.4mL/min)和IC循环(-0.0至-0.4mL/min)，以支持Treg细胞扩增过程，以保持乳酸水平≤7mmol/L以及通过在功能封闭条件下以300mL/min的IC循环速率通过Quantum系统HFM生物反应器内腔剪切细胞微群落来维持Treg培养物的单细胞悬液。
实施例2
下表提供了为了进行若干天T细胞扩增的示例性方案，细胞扩增系统的不同组件(例如，泵、摇杆、阀门等)的示例性任务设置(例如，流速、角度旋转、出口等)。该方案可以遵循以下顺序：
第0天：装载套件、灌注、添加培养基、装载细胞并开始供养
第3天：在重新分配细胞的同时向IC环添加大剂量的细胞因子。再次开始供养。
第6天：在重新分配细胞的同时向IC环添加大剂量的细胞因子。再次开始供养。
第9天：在重新分配细胞的同时向IC环添加大剂量的细胞因子。再次开始供养。
第11-13天：收获；重新装载剩余的细胞。收获(第14天)
设置表：与示例性工厂设置相比所做的更改以粗体和下划线突出显示
表12：完全培养基中的IL-2浓度和数，实施例
表13：大剂量添加的体积和IL-2的量，实施例
表14：第0-2天设置，实施例
表15：第3-5天设置，实施例
表16：第6-8天设置，实施例
表17：第9-10天设置，实施例
表18：第11天设置，实施例
表19：第12天设置，实施例
表20：第13天设置，实施例
表21：第14天设置，实施例
实施例3
使用Quantum系统扩增T细胞的第一方案可以通过使用CD3+/CD28+Dynabeads(Gibco)刺激CD3+T细胞来实现。Dynabeads可以通过利用两个激活信号CD3和CD28来模拟抗原呈递细胞(APC)的体内T细胞激活，该信号与大小类似于APC的三维珠子结合。Dynabeads可与未经处理的单采血液分离产物的100E+06淋巴细胞混合。
细胞可以在Quantum系统上用无血清培养基(TexMACS,Miltenyi Biotech)扩增12-13天，共扩增7次，并有3个不同的供体。在无血清培养基中，细胞因子IL-2和IL-7可以加入到供养培养基中，并在第3、6和9天加入到系统中。
细胞扩增结果可能平均为10E+09±4E+09T细胞；代表261±188倍的扩增和40±4小时的细胞倍增时间。
扩增后的细胞表型可以是CD3+＝98±3％，CD3+/CD4+＝38±13％，CD3+/CD8+＝60±12％。
下面是第二方案的一些特征的描述，相对于第一方案进行了改变(例如，如上所述)，以扩增T细胞。根据一些实施方案，第二方案中的改变可以增强细胞增殖。图26示出了比较第一方案与第二方案的培养天数的细胞数量的图。
在扩增之前，分离外周血单核细胞(PBMC)。分离PBMC可以使得能够将新鲜或冷冻的细胞用作起始细胞产物。在细胞转导过程中，可以发现PBMC分离的另一个好处。制造CAR-T细胞(嵌合抗原受体-T细胞)可能需要使用逆转录病毒载体转导活化的T细胞。对于此过程而言，最大程度地减少“污染”细胞群可能很重要。污染细胞可以包括不是CD3+T细胞的任何细胞；包括红细胞、血小板、单核细胞、粒细胞等。
在细胞供养期间将细胞保持在生物反应器纤维中。中空纤维生物反应器可以被设计成使得所有的气体转移和营养物转移都通过中空纤维的半透膜进行。将细胞群体保持在该位置以最大程度地提高这种高效设计的好处可能是一种改进。像T细胞一样，非贴壁细胞也可以利用流体动力学保持在该空间中。流体可能会不断以相等的速度流入生物反应器的IC入口集管和IC出口集管。
改善供养策略。供养策略的改善可能有两方面。首先，传统的细胞培养方法可能要求以特定的时间间隔更换培养基或以指定的速率连续灌注培养基，以便为细胞群体提供足够的营养并清除代谢废物。特别是乳酸。第一方案可使得乳酸浓度能够超过20mmol/L，并且葡萄糖水平降至低于起始浓度的1/3。通过大多数标准的细胞培养方法，这可能远低于最佳条件。第二方案增加供养速率以保持乳酸水平低于15mmol/L并保持葡萄糖水平大于起始浓度的50％，诸如高于300mg/dL。
这些供养速率的增加可以进一步指定为独立的IC和EC供养速率的方法。确定IC供养速率，既要考虑分子质量>12kDa的培养基成分的细胞培养需求，并且又要影响细胞在生物反应器纤维中的物理位置。由于中空纤维膜可以是半渗透性的，并且可以使用超滤供养来将细胞保持在纤维中，因此包含在IC培养基中的较大分子量的成分保留在生物反应器的IC侧。至于细胞的位置，IC供养速率越大，细胞群体朝着反应器中心的集中程度就越高。EC供养速率可以由细胞培养群体的葡萄糖需求和乳酸去除需求来确定。这种方法具有潜在的成本优势。昂贵的培养基添加剂(诸如细胞因子和蛋白质)(可能需要以最低浓度存在)只能添加到IC培养基中；使得葡萄糖供应和去除乳酸的要求通常会更高。
在细胞扩增的整个持续时间内每天重新分配细胞。这可以最小化在T细胞扩增过程中通常观察到的细胞聚集体的形成。这些聚集体可形成坏死中心(聚集体中心的细胞可能缺乏氧气和营养物)。
当起始产品是新鲜的(未冷冻保存)时，可以观察到另外的改善。见图27。在没有由于冷冻保存引起的压力源的情况下，大多数细胞类型可能会更好地增殖。通常，冷冻保存的细胞在迟缓期的停留时间可能比新鲜的细胞长，然后以相似的速度增殖。图27示出了使用新鲜和冷冻细胞将第一方案与第二方案相比较的培养天数的细胞数的图。
附加的方案增强可以包括将刺激珠与细胞的比例从1:2增加到2:1，并改变无血清培养基的类型。增加珠与细胞的比例可以增加刺激期间细胞/珠相互作用的可能性，并且可以使得改善的增殖一致性。图28示出了使用两个供体和1个珠子：1个细胞和2个珠子：1个细胞的珠子比例将第一方案与第二方案进行比较的培养天数的细胞数的图。与TexMACS相比，使用Prime XV(Irvine Scientific)无血清培养基可以使细胞增殖更好。图29示出了使用不同培养基比较第一方案与第二方案的培养天数的细胞数量的图。由于两种培养基配方都是专有的，因此可能无法确定确切原因。
下面是一些实例，这些实例展示了细胞扩增系统的多功能性。
多功能性的第一个证明可能是减少用于接种Quantum系统的细胞数量。如果PBMC供不应求(例如，患者收集不良)，这可能会使T细胞能够扩增，而无需另外的设备或培养瓶来进行接种物的初始扩增。
多功能性的第二个证明可以是使用多种细胞培养基类型。无血清培养基可能在细胞疗法生产方案中变得越来越流行。最小化变化(化学定义)并消除异种和人类补充物。
可能的数据
PBMC可以通过健康的供体血液单采产品(AllCells或Key Biologics)或在Trima单血小板收集期间从LRS室收集。
所有Quantum系统的T细胞扩增实验都可以用从两种分离方法(流体梯度分离(ficoll)或淘析(Elutra))之一中分离出的冷冻保存的PBMC接种。
表22中总结了用(80-120)E+06PBMC接种的Quantum系统扩增运行。图30示出了使用不同培养基比较第一方案与第二方案的培养天数的细胞数量的图。
使用TexMACS(Miltenyi Biotech)基础培养基，细胞扩增平均可以达到28E+09±2E+09个细胞；代表～550倍的扩增和26个小时的倍增时间。
使用改进RPMI(Gibco)基础培养基，细胞扩增平均可以达到37E+09±8E+09个细胞；代表～750倍的扩增和20个小时的倍增时间。
注意：改进RPMI包含从FBS衍生的Albumax。
使用Prime XV(Irvine Scientific)基础培养基，细胞扩增平均可以达到26E+09±2E+09个细胞；代表～525倍的扩增和21个小时的倍增时间。
使用新方案将细胞培养倍增时间从原始方案中的37小时改变为21小时可能非常重要，例如，参见表22。为说明这一点，可以使用在Quantum系统上使用实际收获次数的实例。
给定37小时作为细胞培养的倍增时间，将需要6.6天才能将50E+06细胞扩增为1E+09细胞。
如果将细胞培养倍增时间设为21小时，则在相同的6.6天内，可以从50E+06细胞扩增10E+09细胞。这可能是细胞增殖能力提高了10倍。
表22：细胞繁殖(80-120M接种)
表23总结了用30E+06PBMC接种的Quantum系统扩增运行。图31示出了使用不同培养基比较第二方案的培养天数的细胞数的图。
使用RPMI 1640基础培养基细胞扩增可能会得到10E+09±3E+09细胞；代表～850倍的扩增和22个小时的倍增时间。
使用TexMACS基础培养基细胞扩增可能会得到11E+09细胞；代表约～725倍的扩增和22个小时的倍增时间。
使用改进RPMI基础培养基细胞扩增可能会得到25E+09细胞；代表～1675倍的扩增和20小时的倍增时间。
使用Prime XV基础培养基细胞扩增可能会得到平均15E+09±1E+09个细胞；代表～1000倍的扩增和22个小时的倍增时间。
使用IMDM(Lonza)基础培养基细胞扩增可能会得到平均15E+09±6E+09个细胞；代表～1000倍的扩增和22个小时的倍增时间。
表23：细胞繁殖(第二方案，30M接种)
图32和33示出了使用Prime XV培养基(Irvine Scientific)，接种30E+09PBMC，并按照实施例4中所述的方案扩增的细胞的细胞表型。对于每个供体，“之前(pre)”可以表示扩增前的细胞群的表型以及“之后(post)”可以表示扩增后细胞群的表型。
第二方案中的细胞表型遵循与使用第一方案T细胞扩增的细胞相同的总体趋势：在扩增过程中CD3+的CD4+的百分比降低，在扩增过程中CD3+的CD8+的百分比升高。
基于CD54RA/RO染色的记忆或幼稚表型的CD4+和CD8+T细胞的百分比是表型特征，其可能无法通过第一方案获得，并且可以提供描述细胞的更多粒度(图33)。
此时，可能没有用于表型特征的接受标准。
图34-36显示了使用Prime XV培养基(Irvine Scientific)，接种的30E+09PBMC并遵循实施例4中所述的方案扩增的T细胞的功能。
对于每个供体，“PBMC”可表示扩增前的细胞群以及“Harv”可表示扩增后的细胞群。
通常通过产生细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的能力来测量与Th1/效应子表型相关的T细胞功能。这些结果可能证明，T细胞群体在扩增和再刺激后产生更高水平的这些细胞因子。
目前，尚无针对特定细胞因子生产水平的接受标准。
可能的结果
通过修改工艺(诸如保持生物反应器中空纤维中不断扩增的细胞群)，维持乳酸浓度水平<15mmol/L以及增加刺激珠与细胞的比例，可以显著增强Quantum系统中的T细胞扩增。
使用相似的起始细胞数量，通过三种因素中的一种，平均T细胞收获量可以减少40％的时间。这是细胞增殖能力的10倍增加(基于比较细胞培养物倍增时间的结果)。
使用第二方案扩增的T细胞可能具有与从第一方案收获的T细胞相似的表型特征，并且可能是功能上可行的细胞。
可以使用多种细胞培养基选择在Quantum系统上扩增T细胞。所有这些都可能导致相似的增殖模式。
可以从小型PBMC起始产物在Quantum系统上扩增T细胞。30E+06PBMC可以从健康捐献者的平均20mL全血中分离出来(白血病和淋巴瘤群体(Leukemia&Lymphoma Society))。可以假设在分离过程中细胞损失了50％，在过程期间中损失了另外50％。
实施例4
该示例性过程的目的可以是制备用于在根据实施方案的Quantum系统中扩增的T细胞。
装置
1、层流生物安全柜
2、水浴
3、细胞计数设备(显微镜、自动计数器)
4、离心机
5、章动器(Nutator)(温和的细胞混合装置)
材料
1、50mL离心管，聚丙烯，无菌
2、具有公鲁尔锁(male leur lock)的60mL注射器
3、0.5升细胞进入袋，附件套件
试剂
1、人AB血清(hSER)
2、磷酸盐缓冲盐水(PBS)
3、Dynabeads(CD3+/CD28+)。
4、外周血单核细胞(PBMC)
5、完整培养基(见下文)
6、基础培养基(见下文)
程序
多种培养基可用于在Quantum系统上扩增T细胞(参见表24)。该表并非暗示这些是可以在Quantum系统上使用的唯一可能的培养基配方。
表24：培养基选择
注意：所有打开事件必须发生在生物安全柜中。
Dynabeads
1、对于(80-120)E+06PBMC，可以以珠子与PBMC的比例为2:1使用Dynabeads。
1a、对于30E+06PBMC，可以以珠子与PBMC的比例为3:1使用Dynabeads。
2、可根据产品说明书洗涤Dynabeads。
3、可将珠子重悬浮在所期望的基础培养基中。
解冻PBMC
注意：对于新鲜的PBMC，请从步骤7开始。
4、解冻期望数量的PBMC。
5、从液氮中移除冷冻管瓶后，在37℃的水浴中解冻瓶。
6、立即将每瓶解冻细胞无菌地转移至含有10mL PBS+5％hSER的50mL离心管中。
7、以300xg离心7分钟。
8、丢弃液体并将细胞重悬于10mL PBS+5％hSER中并进行细胞计数。
9、在50mL离心管中，将悬浮在PBS中的细胞和悬浮在基础培养基中的珠子合并至每mL(4-6)E+06细胞和珠子的浓度。
注意：使用基础培养基将细胞/珠子混合物稀释至适当浓度。
10、将细胞/珠子混合物在室温下轻轻混合(搅拌、章动、振荡等)10分钟。
11、使用基础培养基将细胞/珠子混合物稀释至50mL。
12、在生物安全柜中，打开细胞进入袋包装。
13、打开60mL注射器包装。
14、移除注射器柱塞并且无菌地放在一旁。
15、从细胞进入袋管线上取下蓝色鲁尔帽，并将带有鲁尔锁尖端的60mL注射器牢固地连接到细胞进入袋管线上。
16、如果使用注射器作为测量手段，将止血剂附接到注射器下方的细胞进入袋管线上。
17、在将注射器保持在细胞进入袋上方的同时，将细胞或试剂倒入注射器中。
18、使得细胞能够通过重力流进入细胞进入袋。
19、通过将柱塞轻轻推入注射器中，将至少40mL的空气引入袋中。
20、将柱塞和注射器附接到细胞进入袋管线上。
21、对于(80-120)E+06PBMC接种，在实施例5中使用Quantum系统方案设置。
22、对于30E+06PBMC接种，在实施例6中使用Quantum系统方案设置。
实施例5
下表提供执行几天的T细胞扩增的细胞扩增系统的不同组件(例如泵、摇杆、阀门等)的示例任务设置(例如流速、角度旋转、出口等)。该方案可以遵循以下顺序：
第0天：装载套件，灌注，添加培养基，装载细胞，并开始供养
第2天：在重新分配细胞的同时，向IC回路添加大剂量的细胞因子。重新开始供养。
第3天：在重新分配细胞的同时，向IC回路添加大剂量的细胞因子。重新开始供养。在重新分配细胞的同时，向IC回路添加另一大剂量细胞因子。重新开始供养。
第4天：在IC回路中添加大剂量的细胞因子，同时重新分配细胞。重新开始供养。在重新分配细胞的同时，向IC回路添加另一大剂量细胞因子。重新开始供养。
第5天：在重新分配细胞的同时，向IC回路添加大剂量的细胞因子。重新开始供养。在重新分配细胞的同时，向IC回路添加另一大剂量细胞因子。重新开始供养。
第6天：在重新分配细胞的同时，向IC回路添加大剂量的细胞因子。重新开始供养。在重新分配细胞的同时，向IC回路添加另一大剂量细胞因子。重新开始供养。
第7天：在IC回路中添加大剂量的细胞因子，同时重新分配细胞。重新开始供养。在重新分配细胞的同时，向IC回路添加另一大剂量细胞因子。重新开始供养。
第8天：收获细胞。
表25：第0天设置，实施例
表26：第0-2天设置，实施例
表27：第2天设置，实施例
表28：第3天设置，实施例
表29：第4天设置，实施例
表30：第5天设置，实施例
表31：第6天设置，实施例
表32：第7天设置，实施例
表33：第8天设置，实施例
实施例6
下表提供执行几天的T细胞扩增的另一个示例性方案的细胞扩增系统的不同组件(例如泵、摇杆、阀门等)的示例任务设置(例如流速、角度旋转、出口等)。该方案可以遵循以下顺序：
第0天：装载套件，灌注，添加培养基，装载细胞，并开始供养
第2天：在重新分配细胞的同时，向IC回路添加大剂量的细胞因子。重新开始供养。
第3天：在重新分配细胞的同时，向IC回路添加大剂量的细胞因子。重新开始供养。
第4天：在重新分配细胞的同时，向IC回路添加大剂量的细胞因子。重新开始供养。
第5天：在重新分配细胞的同时，向IC回路添加大剂量的细胞因子。重新开始供养。
第6天：在重新分配细胞的同时，向IC回路添加大剂量的细胞因子。重新开始供养。在重新分配细胞的同时，向IC回路添加另一大剂量细胞因子。重新开始供养。
第7天：在重新分配细胞的同时，向IC回路添加大剂量的细胞因子。。重新开始供养。在重新分配细胞的同时，向IC回路添加另一大剂量细胞因子。重新开始供养。
第8天：在IC回路中添加大剂量的细胞因子，同时重新分配细胞。重新开始供养。在重新分配细胞的同时，向IC回路添加另一大剂量细胞因子。重新开始供养。
第9天：收获细胞。
表34：第0天设置，实施例
表35：第0-2天设置，实施例
表36：第2天设置，实施例
表37：第3天设置，实施例
表38：第4天设置，实施例
表39：第5天设置，实施例
表40：第6天设置，实施例
表41：第7天设置，实施例
表42：第8天设置，实施例
表43：第9天设置，实施例
对本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明范围的情况下，可以对本发明的方法和结构进行各种修改和变化。因此，应当理解，本发明不限于所给出的具体实例。相反，本发明旨在覆盖所附权利要求及其等同物的范围内的修改和变化。
Claims (20)
1.一种在细胞扩增系统中扩增细胞的方法，所述方法包括：
将含多个细胞的第一体积的流体装载到所述细胞扩增系统的第一流体流动路径，其中，生物反应器与所述第一流体流动路径流体相关；
将含培养基的第二体积的流体装载到所述第一流体流动路径的一部分以将所述第一体积的流体置于所述生物反应器的第一部分中；
将所述多个细胞暴露于活化剂；
在第一时间段内根据第一过程供养所述细胞；
在所述第一时间段内扩增所述多个细胞；
在所述第一时间段扩增所述多个细胞之后，在第二时间段内以第一循环速率循环所述多个细胞以减少第一细胞簇中的细胞数量；
根据第二过程供养所述细胞；
在第三时间段内扩增所述多个细胞，其中，所述第三时间段少于二十四小时；
在所述第三时间段扩增所述多个细胞之后，在第四时间段内以第二循环速率循环所述多个细胞以减少第二细胞簇中的细胞数量；以及
收获经扩增的细胞。
2.权利要求1所述的方法，其中，所述第一过程包括：
将含培养基的第三体积的流体以第一流速泵入所述生物反应器的第一端口；以及
将含培养基的第四体积的流体以第二流速泵入所述反应器的第二端口，其中，进入所述生物反应器的所述第二流速的流体的方向与进入所述生物反应器的所述第一流速的流体的方向相反。
3.权利要求2所述的方法，其中，所述第二过程包括：
将含培养基的第五体积的流体以第三流速泵入所述生物反应器的第一端口；以及
将含培养基的第六体积的流体以第四流速泵入所述生物反应器的第二端口，其中，进入所述生物反应器的所述第四流速的流体的方向与进入所述生物反应器的所述第三流速的流体的方向相反。
4.权利要求3所述的方法，其中，所述多个细胞包括T细胞。
5.权利要求4所述的方法，其中，所述活化剂位于珠子上。
6.权利要求5所述的方法，其中，所述多个细胞包括外周血单核细胞(PBMC)。
7.权利要求6所述的方法，其中，所述多个细胞包括1×106至500×106个PBMC。
8.权利要求7所述的方法，其中，所述第一体积的流体包括人血清。
9.权利要求8所述的方法，其中，所述经扩增的细胞包括1×109至100×109个细胞。
10.权利要求9所述的方法，其中，在所述方法期间，乳酸水平维持在或低于15mmol/L。
11.一种细胞扩增系统，包括：
生物反应器，其中，所述生物反应器包括第一端口和第二端口，并且其中，所述第一端口和所述第二端口位于生物反应器的相对端；
第一流体流动路径，其具有至少相对端，其中，所述第一流体流动路径的第一相对端与所述生物反应器的第一端口流体相关，而所述第一流体流动路径的第二相对端与所述生物反应器的第二端口流体相关；
流体进入路径，其与所述第一流体流动路径流体相关；
第一流体循环路径，其与所述第一流体流动路径流体相关并且与所述生物反应器流体相关；
第一泵，其使流体在所述第一流体流动路径中循环；
第二泵，其使所述流体在所述第一流体循环路径中循环；
处理器；
内存，其与所述处理器通信并可由所述处理器读取，并且包含一系列指令，这些指令在由所述处理器执行时使所述处理器：
引导将细胞装载到所述生物反应器中；
引导所述流体对所述生物反应器中的细胞的第一供养，其中，所述流体包括培养基，并且其中，所述第一供养包括：
引导所述第一泵以第一流体流速移动第一部分的所述流体，其中，所述第一泵沿第一方向移动所述流体；以及
引导所述第二泵以第二流体流速移动第二部分的所述流体，其中，所述第二泵沿第二方向移动所述流体，并且其中，所述第二方向与所述第一方向相反；
在所述供养后，通过引导所述第二泵使所述细胞在第一时间段内以第一循环速率循环，引导所述细胞的第一重新分配；
引导所述流体对所述生物反应器中的细胞的第二供养，其中，所述第二供养包括：
引导所述第一泵以第三流体流速移动第三部分的所述流体，其中，所述第一泵沿所述第一方向移动所述流体；以及
引导所述第二泵以第四流体流速移动第四部分的所述流体，其中，所述第二泵沿所述第二方向移动所述流体，并且其中，所述第二方向与所述第一方向相反；
在所述第二供养后，通过引导所述第二泵使所述细胞在第二时间段内以所述第一循环速率循环，引导所述细胞的第二重新分配；
引导所述流体对所述生物反应器中的细胞的第三供养；以及
引导经扩增的细胞的收获。
12.权利要求11所述的系统，其中，所述细胞包括外周血单核细胞(PBMC)。
13.权利要求12所述的系统，其中，所述经扩增的细胞包括一个或更多个T细胞亚群，所述T细胞亚群包括效应T细胞、记忆T细胞、辅助T细胞、幼稚T细胞以及它们的组合。
14.权利要求13所述的系统，其中，大于90％的经扩增细胞包括表达CD3+的细胞。
15.权利要求14所述的系统，其中，大于50％的经扩增细胞包括表达CD4+的细胞。
16.权利要求15所述的系统，其中，大于30％的经扩增细胞包括表达CD8+的细胞。
17.权利要求11所述的系统，其中，在将所述细胞装载到所述生物反应器之前，将所述细胞暴露于活化剂。
18.权利要求17所述的系统，其中，所述活化剂位于珠子上。
19.权利要求11所述的系统，其中，所述流体包括葡萄糖。
20.权利要求19所述的系统，其中，所述流体中的葡糖糖维持在所述流体中起始浓度的至少50％的水平。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762549871P | 2017-08-24 | 2017-08-24 | |
| US62/549,871 | 2017-08-24 | ||
| PCT/US2018/048019 WO2019040915A1 (en) | 2017-08-24 | 2018-08-24 | CELL EXPANSION |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111065728A CN111065728A (zh) | 2020-04-24 |
| CN111065728B true CN111065728B (zh) | 2023-12-12 |
Family
ID=63490788
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201880055013.5A Active CN111065728B (zh) | 2017-08-24 | 2018-08-24 | 细胞扩增 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP4015618A1 (zh) |
| JP (1) | JP7114693B2 (zh) |
| CN (1) | CN111065728B (zh) |
| WO (1) | WO2019040915A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4444847A1 (en) * | 2021-12-09 | 2024-10-16 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Automated hollow fiber system |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104540933A (zh) * | 2012-08-20 | 2015-04-22 | 泰尔茂比司特公司 | 在细胞扩增系统的生物反应器中加载和分配细胞的方法 |
| CN105793411A (zh) * | 2013-11-16 | 2016-07-20 | 泰尔茂比司特公司 | 生物反应器中的细胞扩增 |
| CN106232800A (zh) * | 2014-03-25 | 2016-12-14 | 泰尔茂比司特公司 | 介质的被动替代 |
| WO2017040548A1 (en) * | 2015-08-31 | 2017-03-09 | I Peace, Inc. | Pluripotent stem cell manufacturing system and method for producing induced pluripotent stem cells |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008109674A2 (en) * | 2007-03-05 | 2008-09-12 | Caridianbct, Inc. | Cell expansion system and methods of use |
| WO2011090605A2 (en) | 2009-12-29 | 2011-07-28 | Caridianbct, Inc. | Method of loading and distributing cells in a bioreactor of a cell expansion system |
| WO2016183350A1 (en) * | 2015-05-13 | 2016-11-17 | Terumobct, Inc. | Cell expansion |
-
2018
- 2018-08-24 JP JP2020511233A patent/JP7114693B2/ja active Active
- 2018-08-24 WO PCT/US2018/048019 patent/WO2019040915A1/en unknown
- 2018-08-24 EP EP21202660.3A patent/EP4015618A1/en active Pending
- 2018-08-24 CN CN201880055013.5A patent/CN111065728B/zh active Active
- 2018-08-24 EP EP18765343.1A patent/EP3673042B1/en active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104540933A (zh) * | 2012-08-20 | 2015-04-22 | 泰尔茂比司特公司 | 在细胞扩增系统的生物反应器中加载和分配细胞的方法 |
| CN105793411A (zh) * | 2013-11-16 | 2016-07-20 | 泰尔茂比司特公司 | 生物反应器中的细胞扩增 |
| CN105992816A (zh) * | 2013-11-16 | 2016-10-05 | 泰尔茂比司特公司 | 生物反应器中的细胞扩增 |
| CN106232800A (zh) * | 2014-03-25 | 2016-12-14 | 泰尔茂比司特公司 | 介质的被动替代 |
| WO2017040548A1 (en) * | 2015-08-31 | 2017-03-09 | I Peace, Inc. | Pluripotent stem cell manufacturing system and method for producing induced pluripotent stem cells |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4015618A1 (en) | 2022-06-22 |
| EP3673042A1 (en) | 2020-07-01 |
| CN111065728A (zh) | 2020-04-24 |
| WO2019040915A1 (en) | 2019-02-28 |
| EP3673042B1 (en) | 2021-11-24 |
| JP7114693B2 (ja) | 2022-08-08 |
| JP2022141915A (ja) | 2022-09-29 |
| JP2020531021A (ja) | 2020-11-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7421602B2 (ja) | 細胞増殖方法 | |
| US11624046B2 (en) | Cell expansion | |
| CN110612344B (zh) | 细胞扩增 | |
| AU2017261348A1 (en) | Automated production and collection | |
| CN111065728B (zh) | 细胞扩增 | |
| US20210047602A1 (en) | Cell expansion | |
| US12043823B2 (en) | Cell capture and expansion | |
| JP7571089B2 (ja) | 細胞増殖 | |
| US20240101946A1 (en) | Expanding Cells | |
| US20240060030A1 (en) | Cell expansion system | |
| CN117120595A (zh) | 细胞捕获和扩增 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |