JP2020531021A - 細胞増殖 - Google Patents

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Abstract

【課題】【解決手段】細胞増殖システムにおいて細胞を増殖する方法が提供される。細胞は、バイオリアクターにおいて成長され、アクチベーター（例えば、可溶性活性化因子複合体）によって活性化される。自動化された閉鎖系細胞増殖システムの栄養供給及びガス交換機能によって、例えば、少ない播種密度で播種することが可能となる。細胞成長環境のパラメータを操作して、バイオリアクター内の特定の位置に細胞を投入することで、栄養分とガスの効率的な交換が行われる。システムパラメータを調整して、増殖期に形成される可能性のある細胞コロニーがせん断される。細胞の成長と生存率を改善するために、代謝濃度が制御される。バイオリアクター内の細胞の滞留が制御される。実施形態では、細胞はＴ細胞を含む。他の実施形態では、細胞は、例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）やヘルパー、ナイーブ、メモリー又はエフェクターを含むＴ細胞亜集団を含む。【選択図】図２３

Description

本出願は、２０１８年４月２日に出願された米国特許出願第１５／９４３，６１９号明細書（タイトル：細胞増殖）及び２０１８年４月２日に出願された米国特許出願第１５／９４３，５３６号明細書（タイトル：バイオリアクターにおける細胞増殖）の一部継続出願であり、その優先権を主張するものである。該２つの出願は、以下の出願、すなわち、２０１７年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／４７９，７２１号（タイトル：細胞の増殖）、２０１７年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／４７９，７６０号（タイトル：細胞増殖）、２０１７年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／４７９，７８８号（タイトル：バイオリアクターにおける細胞の増殖）、２０１７年８月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／５４９，８７１号（タイトル：細胞の増殖）、２０１８年３月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／６４７，３６１号（タイトル：細胞の増殖）、の優先権を主張するものである。本出願はまた２０１７年８月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／５４９，８８４号（タイトル：細胞増殖）の優先権を主張するものでもある。上記出願の全体は、ここでの開示により明確に本出願に組み込まれる。
細胞増殖システム（ＣＥＳ）は、細胞を増殖させ、分化させるために使用される。細胞増殖システムを使用することにより、様々な接着細胞及び懸濁細胞を増殖（例えば、成長）させることができる。接着性及び非接着性の両タイプの細胞の成長は、細胞増殖システムのバイオリアクターにおいて行われる。
本開示の実施形態は、一般に、細胞増殖システム（ＣＥＳ）における細胞の増殖に関する。実施形態によれば、そのような増殖は、バイオリアクター又は細胞成長チャンバーの使用を通じて行われる。一実施形態では、そのようなバイオリアクター又は細胞成長チャンバーは、中空糸膜を含む。そのような中空糸膜は、毛細管外側（ＥＣ）空間及び毛細管内側（ＩＣ）空間を含む。細胞増殖システムは、種々のタイプの細胞を増殖できる。実施形態では、細胞増殖システムにおいて、接着細胞又は非接着細胞が成長又は増殖される。システム内で増殖される非接着細胞又は懸濁細胞には、例えばＴ細胞やＴリンパ球がある。実施形態では、Ｔ細胞の１又は複数の亜集団又はサブセットが成長される。例えば、実施形態では、Ｔ細胞を増殖するための方法及びシステムが提供される。該Ｔ細胞の非限定的な例としては、ヒトエフェクターＴ細胞等のエフェクターＴ細胞、ヒトヘルパーＴ細胞等のヘルパーＴ細胞、ヒトナイーブＴ細胞等のナイーブＴ細胞、ヒトメモリーＴ細胞等のメモリーＴ細胞及び／又はヒト制御性Ｔ細胞（ｈＴｒｅｇ）等の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が挙げられる。
実施形態では、閉鎖系自動細胞増殖システムにおいて細胞を増殖させるための方法及びシステムが提供される。一実施形態では、そのような細胞増殖システムは、バイオリアクター又は細胞成長チャンバーを含む。さらなる実施形態では、そのようなバイオリアクター又は細胞成長チャンバーは、中空糸膜を含む。
例えば、非接着細胞、例えばＴｒｅｇ細胞等のＴ細胞は、複数の中空糸を有する中空糸バイオリアクターに導入される。一実施形態によれば、中空糸バイオリアクター内の細胞の増殖を刺激又は活性化するために、細胞は、刺激剤（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）又はアクチベーター（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）に曝露される。
バイオリアクター又は細胞成長チャンバーを含む閉鎖系自動細胞増殖システムは、栄養供給及びガス交換能力等の多数の能力を備える。そのような能力により、培養フラスコ又は他の静的培養法で使用される細胞播種密度と比較して、細胞播種密度を低くして細胞を播種することができる。実施形態では、成長する細胞への栄養素及びガスの効率的な交換又は送達のために、細胞がバイオリアクター内の所与の位置に投入又は導入されるように、細胞成長環境のパラメータが調整される。実施形態では、細胞間の通信も促進される。例えば、一実施形態において、バイオリアクター内に細胞を集中させることによって、細胞密度を増加させ、細胞間における化学シグナル伝達のような通信が促進される。
実施形態ではまた、バイオリアクター又は細胞成長チャンバー内の細胞滞留を制御するためにシステムパラメータが管理される。例えば、細胞成長期中にバイオリアクター内の細胞滞留を制御することにより、システムは、増殖する細胞に対して、効率的なガス及び栄養交換が行われる。実施形態では、バイオリアクターは、ガス交換、及びいくつかの実施形態では、栄養交換を成長細胞に対して行うように設計されてもよい。例示的な実施形態では、半透過性中空糸膜を含むバイオリアクターでは、半透過性中空糸膜を通してガス及び栄養交換が行われる。バイオリアクターの半透過性中空糸により、必須栄養素（例：グルコース及び／又は細胞成長用培地）は細胞に到達し、代謝廃棄物（例：乳酸）は、中空糸の壁を介した拡散によりシステムから排出される。しかしながら、実施形態によれば、バイオリアクターのヘッダー又は中空糸の外側の他の領域に存在する細胞は、適切なガス交換及び栄養交換を受けず、細胞凝集及び死をもたらす場合がある。従って、実施形態は、細胞にフィーディングする際に細胞集団（例えば非接着細胞集団）をバイオリアクターの中空糸に保持するための方法を提供することに関する。このように、バイオリアクター内に細胞を保持することによって、細胞間における通信が促進される。何故なら、バイオリアクター内における細胞数を増やしながら、細胞密度が増加し、細胞間通信が改善されるからである。
追加の実施形態では、細胞成長の増殖期中に形成される可能性のある細胞コロニー、マイクロコロニー、又は細胞クラスターをせん断するために、いくつかのシステム機能が利用される。例えば、一実施形態では、一定期間の増殖の後、バイオリアクター中空糸膜を通る細胞群（例えばコロニー、マイクロコロニー、又はクラスター）がせん断される。そのようなせん断は、微小コロニー、コロニー、又はクラスター内の細胞の数を減らすことができる。ここで、マイクロコロニー、コロニー、又はクラスターは、１又は複数の接着細胞のグループである。実施形態において、クラスターはまた細胞増殖を活性化するために使用されるビーズを含んでもよい。実施形態では、成長の増殖期中に、例えば（例えば、内径２１５μｍの中空糸を有する）中空糸毛細管内側（ＩＣ）ループを通して懸濁細胞培養物を循環させることにより、コロニーをせん断するプロトコルが提供される。実施形態では、コロニー、マイクロコロニー、又は細胞のクラスターをせん断して、コロニー、マイクロコロニー、又は細胞のクラスターのサイズを小さくすることができる。一実施形態では、細胞のコロニー、マイクロコロニー、又はクラスターをせん断して、単一細胞の均一な懸濁液を提供し、細胞成長／生存率を改善することができる。そのような能力は、細胞（例えばＴｒｅｇ等のＴ細胞）の継続的な灌流成長に寄与する。
本開示の実施形態はさらに、細胞増殖のための特徴の組み合わせを使用した細胞の成長に関する。例えば、一実施形態では、細胞は、培養フラスコ又は他の静的培養法で使用される細胞播種密度と比較して、低い播種密度で播種され得る。例えば、いくつかの実施形態では、細胞を播種するために使用される流体の体積は、約１０5細胞数／ｍＬのように、約１×１０4細胞数／ｍＬから約１×１０6細胞数／ｍＬを含む。他の実施形態において、細胞を播種するために使用される流体の体積は、約１×１０6細胞数／ｍＬ未満を含む。いくつかの実施形態において、播種細胞総数は、約１０×１０6から約５００×１０6細胞数であってよい。他の実施形態において、播種細胞総数は、５０×１０6細胞数未満であってよい。実施形態によれば、細胞は、細胞増殖システム内のバイオリアクター（例えば中空糸バイオリアクター）内の所望の位置に投入又は導入される。一実施形態では、例えば、中空糸バイオリアクター内の細胞の増殖を活性化するために、細胞はアクチベーターに曝露される。例えば、一実施形態によれば、細胞の増殖中に形成される可能性のある細胞のコロニー又はクラスターは、細胞を循環させて細胞にせん断応力及び／又はせん断力を生じさせることによって、せん断される。そのようなせん断応力及び／又はせん断力は、例えば、１又は複数の細胞を細胞コロニーから分離させ得る。成長中の細胞集団に適切なガス及び栄養交換を提供するために、さらなる実施形態では、例えば、細胞のフィーディング中にバイオリアクターの中空糸内に細胞集団（例えば懸濁細胞集団）を保持する。細胞成長期に細胞をバイオリアクターの中空糸内に集め及び／又は保持することにより、細胞密度が増加し、細胞間通信が向上する。従って、静的培養と比較して、低い細胞播種密度を使用することができる。
実施形態は、細胞を増殖するための細胞増殖システムをさらに提供する。そのようなシステムは、例えば、入口ポートと出口ポートを備える中空糸バイオリアクターと、少なくとも両端部を有し且つ前記バイオリアクターの毛細管内側部分と流体的に関連付けられた第１の流体流路と、前記第１の流体流路と流体的に関連付けられた流体入口路と、前記第１の流体流路及び前記バイオリアクターの毛細管内側部分と流体的に関連付けられた第１の流体循環路と、を備え、前記第１の流体流路の第１の端部は、前記バイオリアクターの入口ポートと流体的に関連付けられ、前記第１の流体流路の第２の端部は、前記バイオリアクターの出口ポートと流体的に関連付けられる。
実施形態はさらに、本明細書で説明及び／又は図示された方法を実行するための命令を実行するためのプロセッサを含む細胞増殖システムを提供する。例えば、本開示の実施形態は、細胞増殖システムと共に使用するための１又は複数のプロトコル又はタスクの使用を通じて、そのような細胞の増殖を実施する。例えば、そのようなプロトコル又はタスクとしては、事前にプログラムされたプロトコル又はタスクが挙げられる。実施形態では、事前にプログラムされたタスク、デフォルトのタスク、又は以前に保存されたタスクが、ユーザ又はシステムオペレーターによって選択され、細胞増殖システムによって特定の機能が実行される。他の実施形態では、そのようなプロトコル又はタスクとしては、カスタムプロトコルやカスタムタスク又はユーザ定義のプロトコルやユーザ定義のタスクが挙げられる。例えば、ユーザーインターフェース（ＵＩ）と１又は複数のグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）要素を使用して、カスタム又はユーザ定義のプロトコル又はタスクを作成できる。タスクは１又は複数のステップを有する。
ここで使用される「少なくとも１つ」、「１以上の」、「及び／又は」は、結合的及び選言的の両方として機能する非限定的表現である。例えば、「Ａ、Ｂ及びＣのうち少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ又はＣのうち少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ及びＣのうち１以上」、「Ａ、Ｂ又はＣのうち１以上」、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」のこれら各表現は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢ、ＡとＣ、ＢとＣ、又は、ＡとＢとＣ、のいずれかであることを意味する。
このセクションは、一連の概念を簡単な形式で提示するために設けられる。これら概念は、以下でより詳細に、詳細な説明で記載される。このセクションは、請求項が定義する主題の範囲を制限するために用いられることを意図されていない。ここで提示される特徴に加えて、等価物及び変更等を含む特徴を含んでよい。
以下では、本発明の実施形態が、添付図面を参照して説明される。図面中、同じ参照符号は、同じ構成要素を示す。図では、要素が任意に選択可能であることを示すために破線が使用される場合がある。
図１Ａは、細胞増殖システム（ＣＥＳ）の一実施形態の図である。 図１Ｂは、バイオリアクター内を通る循環路が示されたバイオリアクターの一実施形態の正面図である。 図１Ｃは、本開示の実施形態に係る、細胞増殖システムの動作中に細胞成長チャンバーを回転方向又は横方向に動かすための揺動装置の図である。 図２は、本開示の実施形態に係る、予め流体移送装置が取り付けられた細胞増殖システムの斜視図である。 図３は、本開示の実施形態に係る、細胞増殖システムのハウジングの斜視図である。 図４は、本開示の実施形態に係る、予め取り付けられる流体移送装置の斜視図である。 図５Ａは、本開示の実施形態による、流体の移動を示す動作構成を含む細胞増殖システムの概略図である。 図５Ｂは、本開示の実施形態による、流体の動きを示す他の動作構成を含む細胞増殖システムの概略図である。 図５Ｃは、本開示の実施形態による、流体の移動を示す他の動作構成を含む細胞増殖システムの概略図である。 図６は、本開示の他の実施形態による細胞増殖システムの概略図である。 図７は、本開示の実施形態による、細胞を増殖するプロセスの動作特性を示すフロー図である。 図８Ａは、本開示の実施形態による、細胞を増殖するプロセスの動作特性を示すフロー図である。 図８Ｂは、本開示の実施形態による、細胞増殖システムの一部の概略図を示す。 図９Ａは、本開示の実施形態による、細胞を増殖するためのプロセスの動作特性を示すフロー図である。 図９Ｂは、本開示の実施形態による、細胞増殖システムにおける酸素消費のグラフを示す。 図１０Ａは、本開示の実施形態による、細胞を増殖するプロセスの動作特性を示すフロー図である。 図１０Ｂは、本開示の実施形態による、細胞増殖システムで使用される例示的なポンプ流量の表を示す。 図１１Ａは、本開示の実施形態による、細胞を増殖するプロセスの動作特性を示すフロー図である。 図１１Ｂは、本開示の実施形態による、細胞増殖の代謝のグラフを示す。 図１１Ｃは、本開示の実施形態による、細胞増殖の代謝のグラフを示す。 図１２は、本開示の実施形態による、細胞を増殖するプロセスの動作特性を示すフロー図である。 図１３は、本開示の実施形態による、細胞を増殖するプロセスの動作特性を示すフロー図である。 図１４は、本開示の実施形態による、細胞を増殖するプロセスの動作特性を示すフロー図である。 図１５Ａは、本開示の実施形態による、細胞を増殖するプロセスの動作特性を示すフロー図を示す。 図１５Ｂは、本開示の実施形態による、細胞増殖中の細胞数対流量のグラフを示す。 図１６は、本開示の実施形態による、細胞を増殖するプロセスの動作特性を示すフロー図である。 図１７Ａは、本開示の実施形態による、細胞を増殖するプロセスの動作特性を示すフロー図を示す。 図１７Ｂは、本開示の実施形態による、細胞増殖システムで増殖する細胞の図を示す。 図１７Ｃは、本開示の実施形態による、細胞解離方法の内径を示すグラフを示す。 図１８は、本開示の実施形態による、細胞増殖中における、培養日に対する細胞数及び流量のグラフを示す。 図１９Ａは、本開示の実施形態による、ポンプを動作させて細胞を増殖するプロセスの動作特性を示すフロー図を示す。 図１９Ｂは、本開示の実施形態による、細胞増殖システムの一部の概略図を示す。 図１９Ｃは、本開示の実施形態による、細胞増殖システムの一部の概略図を示す。 図１９Ｄは、本開示の実施形態による、細胞増殖システムの一部の概略図を示す。 図２０は、本開示の実施形態による、細胞を増殖するプロセスの動作特性を示すフロー図である。 図２１は、本開示の実施形態による、細胞を増殖するプロセスの動作特性を示すフロー図である。 図２２は、本開示の実施形態による、細胞を増殖するプロセスの動作特性を示すフロー図である。 図２３は、本開示の実施形態による、細胞を増殖するプロセスの動作特性を示すフロー図である。 図２４は、本開示の実施形態による、細胞を増殖するプロセスの動作特性を示すフロー図である。 図２５は、本開示の実施形態を実施することができる細胞増殖システムの例示的な処理システムを示す。 図２６は、本開示の実施形態による、細胞増殖中の細胞数対培養日数のグラフを示す。 図２７は、本開示の実施形態による、細胞増殖中の細胞数対培養日数のグラフを示す。 図２８は、本開示の実施形態による、細胞増殖中の細胞数対培養日数のグラフを示す。 図２９は、本開示の実施形態による、細胞増殖中の細胞数対培養日数のグラフを示す。 図３０は、本開示の実施形態による、細胞増殖中の細胞数対培養日数のグラフを示す。 図３１は、本開示の実施形態による、細胞増殖中の細胞数対培養日数のグラフを示す。 図３２は、本開示の実施形態による、細胞表現型を示す棒グラフである。 図３３は、本開示の実施形態による、細胞表現型を示す棒グラフである。 図３４は、本開示の実施形態による、細胞機能性を示す棒グラフである。 図３５は、本開示の実施形態による、細胞機能性を示す棒グラフである。 図３６は、本開示の実施形態による、細胞機能性を示す棒グラフである。
以下の詳細な説明では、例示的な実施形態が、添付図面を参照して、説明される。ここでは特定の実施形態を含むことになるが、本開示を限定又は制限するものと解釈されるべきではない。また、実施形態を記載する際、例えば、特徴、動作、及び／又は構造に対して特有な用語が使用される場合があるが、本開示の請求項の範囲は、これら特徴、動作、及び／又は構造に制限されるものではない。当業者であれば、改良を含む他の実施形態は、本開示の精神及び範囲内にあることは理解できよう。さらに、他の実施形態として挙げられている任意のものを含む任意の代替物又は追加物が、本明細書に記載された他の任意の実施形態と共に使用されても又は組み込まれてもよい。
本開示の実施形態は、一般に、細胞増殖システム（ＣＥＳ）における細胞の増殖のためのシステム及び方法に関する。実施形態によれば、そのような増殖は、バイオリアクター又は細胞成長チャンバーの使用を通じて行われる。一実施形態では、そのようなバイオリアクター又は細胞成長チャンバーは、中空糸膜を含む。そのような中空糸膜は、複数の中空糸膜を含み、毛細管外側（ＥＣ）空間及び毛細管内側（ＩＣ）空間を含む。実施形態では、細胞増殖システムにおいて、接着細胞又は非接着細胞が成長又は増殖される。例えば、非接着細胞又は懸濁細胞（例えばＴ細胞やＴリンパ球）がシステム内で増殖される。実施形態では、Ｔ細胞の１又は複数の亜集団又はサブセットが成長される。例えば、実施形態では、エフェクターＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞及び／又は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）（例えば、ヒト制御性Ｔ細胞（ｈＴｒｅｇ））を増殖するための方法及びシステムが提供される。
実施形態では、閉鎖系自動細胞増殖システムにおいて細胞を増殖させるための方法及びシステムが提供される。一実施形態では、そのような細胞増殖システムは、バイオリアクター又は細胞成長チャンバーを含む。さらなる実施形態では、そのようなバイオリアクター又は細胞成長チャンバーは、中空糸膜を含む。そのようなシステムの能力（例えば、栄養供給及びガス交換機能）により、細胞播種密度を低くして細胞を播種することができる。実施形態では、成長する細胞への栄養素及びガスの効率的な交換のために、細胞がバイオリアクター内の所与の位置に投入又は導入されるように、細胞成長環境のパラメータが調整される。例えば、細胞をバイオリアクター内に集中させることによって、細胞密度が増加する。
実施形態では、非接着細胞集団（例えばＴｒｅｇ細胞等のＴ細胞）は中空糸バイオリアクターに導入又は投入される。ここで、中空糸バイオリアクターは複数の中空糸を含むことができる。実施形態では、中空糸バイオリアクター内の細胞の増殖を活性化するために、細胞は、アクチベーターに曝露される。一実施形態では、例えば、「循環せずに中央に細胞を投入する」タスクを使用して、複数の細胞が細胞増殖システムに導入される。例示的な実施形態によれば、そのようなタスクは、０日目及び４〜８日目に実行される。他の実施形態では、他の日に実行されてもよい。実施形態では、そのような細胞の投入タスクは、バイオリアクター内の細胞の集中化をもたらし、細胞密度を増加させる。他の実施形態では、細胞密度を増加させるために、細胞をバイオリアクターの他の部分又は領域に配置してもよい。実施形態では、バイオリアクターの第１の位置（例えば中央領域）に細胞を配置することにより、細胞は栄養素とガスの効率的な交換を受けることができる。
実施形態では、静置培養法で使用される細胞の数と比較して、比較的少数の初期細胞を播種する。実施形態では、細胞増殖システムを使用して、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、約１００×１０6未満、約９０×１０6未満、約８０×１０6未満、約７０×１０6未満、約６０×１０6未満、約５０×１０6未満、約４０×１０6未満、約３０×１０6未満、又はさらには約２０×１０6未満の初期細胞数から増殖される。他の実施形態では、細胞の初期数は、約８０×１０5よりも多い、又は約９０×１０5よりも多い、又は約１０×１０6よりも多い、又はさらには約２０×１０6よりも多い。いくつかの実施形態では、最初に播種される細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。細胞は、ある量の末梢血又は白血球アフェレーシス製剤から単離される。これらの実施形態では、細胞の初期数は、ある量の末梢血から単離されたＰＢＭＣの数を指す。実施形態では、例えば、培養環境への栄養素の送達におけるシステムの全体的な効率のために、より低い初期細胞播種数を使用することができる。他の実施形態では、培養環境に栄養素を送達するシステムの全体的な効率と組み合わせて増殖中に使用される１又は複数のステップにより、より少ない初期細胞播種数を使用できる。他の実施形態では、約１×１０6〜約５００×１０6の細胞を播種することができる。
実施形態では、静的培養法で使用される細胞播種密度と比較して、低い細胞播種密度を使用することができる。細胞増殖システムを使用する実施形態では、細胞（例えば、Ｔｒｅｇ又はＴｒｅｇ細胞）は、約２．５４×１０5細胞数／ｍＬから約３．６９×１０5細胞数／ｍＬの細胞播種密度で、増殖することができる。他の実施形態では、細胞播種密度は、約１×１０6細胞数／ｍＬ未満である。さらに、Ｔｒｅｇ細胞接種材料は、約１．０×１０5細胞数／ｍＬの細胞播種密度から調製することができる。他の方法（例えば、静的Ｔｒｅｇ細胞培養法）では、インビトロ増殖では、約１．０×１０6Ｔｒｅｇ細胞数／ｍＬの細胞播種密度が使用される。一実施形態では、例えば、培養環境への栄養素の送達におけるシステム全体の効率のために、より低い細胞播種密度を使用することができる。他の実施形態では、培養環境への栄養素の送達におけるシステムの全体的な効率と組み合わせて、増殖中に使用される１又は複数のステップにより、より低い初期細胞播種密度の使用が可能になる。
実施形態において、自動化された細胞（例えば、ＴｒｅｇのようなＴ細胞）の増殖は、活性化因子複合体を用いて実施される。いくつかの実施形態では、例えば、細胞刺激用ビーズが使用される。抗体で機能化できるビーズが使用される。抗体はＴ細胞の増殖を活性化する。使用され得るビーズの一例として、マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手可能なＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）のビーズが挙げられる。いくつかの実施形態におけるビーズは、それらの表面上の抗体で機能化される。抗体のいくつかの非限定的な例としては、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３４、及びそれらの組み合わせが挙げられる。ある実施形態では、ビーズは、１００ＩＵ／ｍＬのサイトカインＩＬ-２の存在下で使用される。他の実施形態では、ビーズベースの刺激を使用せずに、細胞（例えばＴｒｅｇ細胞のようなＴ細胞）を増殖させる。一実施形態において、細胞増殖は、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ可溶性ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）ヒトＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞アクチベーターを使用して、自動化細胞増殖システムで、２００ＩＵ／ｍＬのサイトカインＩＬ-２の存在下で、Ｔｒｅｇ細胞を活性化及び増殖させる。例えば、可溶性活性化因子複合体を使用すると、ビーズベースのプロトコルのコストよりも刺激のためのコストを削減できる。他の実施形態では、他のタイプのアクチベーターが使用されてもよい。さらに、他の実施形態では、他のタイプのサイトカイン又は他の成長因子を使用してもよい。
実施形態ではまた、バイオリアクター又は細胞成長チャンバー内の細胞滞留を制御するために、システムパラメータが調整又は管理される。例えば、細胞成長期中にバイオリアクター中空糸内の細胞滞留を制御することにより、システムは、増殖する細胞への効率的なガス及び栄養交換を提供し得る。実施形態では、バイオリアクターは、成長細胞に対して、ガス交換、及びいくつかの実施形態では、栄養素交換を行えるように設計されてもよい。例示的な実施形態において、半透過性中空糸膜を有するバイオリアクターでは、半透過性中空糸膜を通してガス及び栄養交換が行われる。実施形態では、成長細胞に、膜を通過できない培地成分（例えば種々のサイトカインやタンパク質等）を提供する方法は、細胞が成長しているバイオリアクターの側（例えば、毛細管内側（ＩＣ側））への流体入口を使用してもよい。しかしながら、実施形態によれば、低い、減らされた、又は減少された（例えば最小の）入口流量（例えば０．１ｍＬ／ｍｉｎ）では、バイオリアクターの出口ヘッダーに細胞が集まる可能性がある。バイオリアクターのヘッダーに存在する細胞は、適切なガス交換と栄養交換を受けられず、細胞死と凝集を引き起こす可能性がある。
実施形態は、入口（例えば、ＩＣ入口）の流れを使用して細胞をフィーディングするときに、バイオリアクター内に、細胞（例えば、非接着細胞集団）を保持する方法を提供することに関する。本明細書の実施形態では、フィーディング時に細胞は膜のＩＣ側にあるが、例えば、他の実施形態では、細胞が膜のＥＣ側にあってもよい。実施形態によれば、細胞は、第１の循環路内及び／又は第２の循環路内に含まれてよい。実施形態では、フィーディング方法は、第１の体積の流体（例えば培地又は細胞成長用培地）を、第１の体積流量、体積流量、流体流量、流量、流体流の流量、又は体積速度で、バイオリアクターの第１のポートにポンピングする。例えば、体積流量、流体流量、流量、流体流の流量、又は体積速度の用語は、交換可能に使用される。いくつかの実施形態では、流量は、速度と方向の両方を有するベクトルである。第２の体積の流体は、第２の体積流量、体積流量、流体流量、流量、流体流の流量、又は体積速度で、バイオリアクターの第２のポートにポンピングされる。実施形態では、そのような体積流量、流体流量、流量、流体流の流量、又は体積速度は、１又は複数のポンプ速度及び／又はポンプ流量によって制御される。例えば、ポンプ流量は、ポンプが作用する流体の体積流量又は流量を生成、引き起こし、又は流量に影響を及ぼす。本明細書で使用されるように、ポンプ速度すなわちポンプ流量は、実施形態において、ポンプによって生成され、又は引き起こされ、又は影響が与えられる体積流量又は流体流量として記載される。
実施形態において、バイオリアクターへの流体の第２の流量は、バイオリアクターへの流体の第１の流量の方向と反対である。例えば、図５Ｂ及び図５Ｃは、本開示の実施形態による、ＣＥＳ５００（例えば、図５Ｂ及び図５Ｃ）等の細胞増殖システムで使用される流量及び流れ方向を示す例示的な動作構成を示す。実施形態では、細胞増殖システムポンプ（例えばＩＣポンプ）を使用して、バイオリアクター内の細胞滞留を制御することができる。実施形態において、細胞は、例えば、成長の増殖期の間に、バイオリアクターから失われ、ＩＣ循環路又はＩＣループに入る。実施形態では、例えば、ＩＣ入口ポートの近くに位置するバイオリアクター内の細胞は、最も新鮮な成長培地を受け取り、一方、例えば、バイオリアクターの外側のＩＣ循環路の部分にある細胞は、解糖代謝に影響を与える消費培地又は馴化培地を基本的に受け取っている。さらに、実施形態によれば、バイオリアクター内の細胞は、ＥＣループ循環からの拡散によりガス移送モジュール（ＧＴＭ）から混合ガス（Ｏ2、ＣＯ2、Ｎ2）の入力を受け取るが、バイオリアクター外のＩＣ循環路の部分の細胞は、受け取らない。
実施形態では、中空糸膜（ＨＦＭ）バイオリアクターからの細胞の損失を減らすことは、フィーディング中にＩＣ循環ポンプ流量を、方向は反対であるが、ＩＣ入口ポンプ流量にマッチングさせるか、或いは略又は実質的にマッチングさせることにより、達成することができる。例えば、実施形態では、細胞培養の成長期中（例えば、４日目〜７日目）にバイオリアクター内に細胞を維持するために、＋０．１ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ入口ポンプ流量を、相補的なＩＣ循環ポンプ流量−０．１ｍＬ／ｍｉｎにマッチングさせるか或いは略マッチングさせる。このポンプ調整は、実施形態によれば、ＩＣ出口ポートからの細胞の損失に関連する力を打ち消す。他の実施形態では、他のポンプ流量が使用されてもよい。例えば、他の実施形態では、ポンプ流量は異なってもよい。実施形態では、他のポンプ又は追加のポンプを使用してもよい。一実施形態では、より少ないポンプを使用してもよい。さらに、他の実施形態では、他の期間が使用されてもよい。
実施形態では、細胞集団の代謝活性はフィーディングパラメータに影響を及ぼし得る。例えば、細胞培養乳酸値は、事前に定義されたレベル以下に維持される。一実施形態では、細胞培養乳酸値は、例えば、約７ｍｍｏｌ／Ｌ以下に維持される。他の実施形態では、細胞培養乳酸値は、約３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、約２５ｍｍｏｌ／Ｌ以下、約２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、約１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下、又はさらに約１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であってもよい。実施形態では、細胞増殖システムのグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）を使用して、培地の添加流量を制御することにより、細胞（例えば、制御性Ｔ細胞等のＴ細胞）の増殖中に、解糖からの乳酸代謝老廃物を所定の値以下に維持することができる。他の実施形態では、例えば、培地の添加流量及び／又は他の設定を制御して、例えば細胞増殖及び生存率を改善するために、約５ｍｍｏｌ／Ｌ以下の乳酸レベルを維持するか、或いは維持しようとする試みが行われる。他の実施形態では、他の濃度が使用されてもよい。
追加の実施形態では、細胞成長の増殖期中に形成される細胞コロニー、マイクロコロニー、又は細胞クラスターをせん断するために、いくつかのシステム機能が利用される。例えば、一実施形態では、バイオリアクター中空糸膜を通る細胞コロニー（例えば、マイクロコロニー）がせん断されて、マイクロコロニー、コロニー、又はクラスター内の細胞の数を減らすことができる。ここで、マイクロコロニー、コロニー、又はクラスターは、１又は複数の接着細胞のグループである。実施形態では、細胞増殖システム（ＣＥＳ）バイオリアクターアーキテクチャーを使用して、細胞（例えば、Ｔｒｅｇ細胞等のＴ細胞）マイクロコロニーをせん断することができる。実施形態では、細胞（例えば、Ｔｒｅｇ細胞等のＴ細胞）が成長するにつれて、それらは、マイクロコロニーを形成する傾向がある。そのようなコロニーの中心にある細胞に対しては、栄養素の拡散が制限される。これにより、細胞培養中に壊死等の悪影響が生じる場合がある。実施形態では、成長の増殖期中に、例えば（例えば、内径約２１５μｍの中空糸を有する）中空糸毛細管内側（ＩＣ）ループを通して懸濁細胞培養物を循環させることにより、コロニーをせん断するプロトコルが提供される。実施形態では、コロニー、マイクロコロニー、又は細胞のクラスターをせん断して、コロニー、マイクロコロニー、又は細胞のクラスターのサイズを小さくすることができる。一実施形態では、細胞のコロニー又はクラスターをせん断して、単一細胞の懸濁液を提供し、細胞成長／生存率を改善することができる。そのような能力は、細胞（例えばＴｒｅｇ等のＴ細胞）の継続的な灌流成長に寄与する。いくつかの実施形態では、細胞増殖を活性化するために使用されるビーズを伴ってマイクロコロニーができる。これらの実施形態では、マイクロコロニーの剪断はまた、細胞が増殖するにつれて形成される細胞、ビーズ、又はそれらの組み合わせの凝集体を破壊し得る。
実施形態において、治療量の細胞（例えば、ＴｒｅｇのようなＴ細胞）は、細胞増殖システム内で増殖され、細胞増殖システムから収穫される。実施形態では、収穫時の細胞の数は、約１×１０6個の細胞から約１×１０10個の細胞（例えば１×１０9個の細胞）である。一実施形態では、収穫される細胞の数は、約１×１０8から１×１０10個の細胞であり、一例では、約７．０×１０8から約１．４×１０9細胞の間である。他の実施形態では、収穫される細胞数は、約１×１０9個から約１００×１０9個である。実施形態では、収穫された細胞は、約６０％〜約１００％の生存率を有する。例えば、収穫された細胞の生存率は、約６５％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、又は約９５％超である。
収集された細胞は、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞と一致するバイオマーカー（例えば、ナイーブ、エフェクター、ヘルパー、メモリー、制御性）を発現する。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ３+、ＣＤ４+、及び／又はＣＤ８+バイオマーカーを発現する。ある実施形態では、収集された細胞は、約５０％〜約１００％の頻度でＣＤ３+表現型を含む。収穫された細胞は、約２５％を超える、約３０％を超える、約３５％を超える、約４０％を超える、約４５％を超える、約５０％を超える、約５５％を超える、又は約６０％を超える頻度でＣＤ４+表現型を含む。他の実施形態では、細胞は、約３０％〜約１００％の頻度でＣＤ８+表現型を含む。
他の実施形態では、収穫された細胞は、Ｔｒｅｇと一致するバイオマーカーを発現する。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ４+、ＣＤ２５+、及び／又はＦｏｘＰ３+バイオマーカーを発現する。実施形態では、収穫された細胞は、約５０％〜約１００％の頻度でＣＤ４+ＣＤ２５+表現型を含む。収穫された細胞は、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、又は約９５％超の頻度でＣＤ４+ＣＤ２５+表現型を含む。他の実施形態では、細胞は、約３０％〜約１００％の頻度でＣＤ４+ＦｏｘＰ３+表現型を含む。いくつかの実施形態では、収穫された細胞は、約３０％超こえる、約３５％超、約４０％超、約４５％超、約５０％超、約５５％超、約６０％超、約６５％超、さらには約７０％超の頻度で、ＣＤ４+ＦｏｘＰ３+表現型を含む。
実施形態は、上述のように、細胞増殖システムに関する。実施形態において、細胞増殖システムはクローズドシステムである。クローズド細胞増殖システムは、大気に直接さらされない内容物を含む。そのような細胞増殖システムは自動化されてもよい。実施形態において、接着性又は非接着性の両方のタイプ或いは懸濁タイプの細胞を、該細胞増殖システムのバイオリアクターにおいて成長させることができる。実施形態によれば、細胞増殖システムは、基礎培地又は他のタイプの培地を含んでよい。培地の補充方法は、クローズド細胞増殖システムのバイオリアクターで行われる細胞成長のために提供される。実施形態において、そのようなシステムと共に使用されるバイオリアクターは、中空糸型バイオリアクターである。本発明の実施形態によれば、種々のバイオリアクターが使用されてよい。
実施形態において、該システムは、少なくとも両端部を有する第１の流体流路と流体的に関連付けられたバイオリアクターを有し、前記第１の流体流路の第１の端部は、中空糸膜の第１のポートと流体的に関連付けられ、前記第１の流体流路の第２の端部は、前記中空糸膜の第２のポートと流体的に関連付けられる。実施形態において、中空糸膜は、複数の中空糸を備える。該システムは、前記第１の流体流路と流体的に関連付けられた流体入口路を有し、第１の流体入口路を介して、前記第１の流体流路には、複数の細胞が導入される。いくつかの実施形態において、毛細管内側培地バッグからの毛細管内側投入流体を前記第１の流体流路に移送するポンプと、前記ポンプの動作を制御するコントローラと、をさらに備える。実施形態において、前記コントローラは前記ポンプを制御することによって、例えば、細胞を細胞投入バッグから前記第１の流体流路に移送する。第１の流体循環路において流体を循環させる他のポンプも含まれる。該ポンプは、ポンプ動作を制御するコントローラを有する。一実施形態において、コントローラは、例えば、プロセッサを有するコンピューティングシステムである。実施形態において、１又は複数の前記コントローラは、１又は複数の前記ポンプを制御して、前記第１の流体循環路内において、流体を、ある流量にて循環させる。実施形態において、複数のコントローラ（例えば、第１コントローラ、第２コントローラ、第３コントローラ、第４コントローラ、第５コントローラ、第６コントローラ等）が使用されてもよい。本開示の実施形態において、複数のポンプ（例えば、第１ポンプ、第２ポンプ、第３ポンプ、第４ポンプ、第５ポンプ、第６ポンプ等）が使用されてもよい。さらに、本開示では、培地バッグ、細胞投入バッグ等について述べられるが、複数のバッグ、例えば、第１培地バッグ、第２培地バッグ、第３培地バッグ、第１細胞投入バッグ、第２細胞投入バッグ、第３細胞投入バッグ等、及び／又はその他のタイプの容器、が使用されてもよい。他の実施形態では、単一の培地バッグ、単一の細胞投入バッグ等が使用される。また、実施形態において、追加の又は他の流路（例えば、第２の流体流路、第２の流体入口路、第２の流体循環路等）を設けてもよい。
他の実施形態において、該システムは、例えば、細胞増殖システムに結合されたプロセッサと、該プロセッサと通信を行い、データを表示するディスプレイ装置と、該プロセッサと通信を行い、該プロセッサによって読取可能な、一連の命令を格納するメモリと、によって制御される。実施形態において、プロセッサによって命令が実行されると、プロセッサは、例えば、システムをプライミングする命令を受け取る。その命令に応答して、プロセッサは、システムに対してプライミングを行うための一連のステップを実行し、次に、例えば、ＩＣ／ＥＣ洗浄を行う命令を受け取る。細胞を投入する命令に応答して、プロセッサは、例えば、細胞投入バッグから細胞をバイオリアクター内に導入するための一連のステップを実行する。
本発明の実施形態に係る細胞増殖システム（ＣＥＳ）の一例が、図１Ａに概略的に示される。ＣＥＳ１０は、第１流体循環路１２と第２流体循環路１４とを有する。実施形態によれば、第１流体流路１６は、中空糸型細胞成長チャンバー２４（「バイオリアクター」とも呼ばれる）に流体的に関連付けられた少なくとも両端部１８、２０を有する。詳細には、端部１８は、細胞成長チャンバー２４の第１入口２２と流体的に関連付けられ、端部２０は、細胞成長チャンバー２４の第１出口２８と流体的に関連付けられる。第１循環路１２において、流体は、細胞成長チャンバー２４に配置された中空糸膜１１７（図１Ｂ参照）の中空糸１１６（図１Ｂ参照）の内部を通る（細胞成長チャンバー及び中空糸膜は以下でより詳細に説明される）。また、第１流量制御装置３０が、第１流体流路１６に動作可能に接続され、第１循環路１２における流体の流れを制御する。
第２流体循環路１４は、第２流体流路３４と、細胞成長チャンバー２４と、第２流量制御装置３２と、を有する。実施形態によれば、第２流体流路３４は、少なくとも両端部３６、３８を有する。第２流体流路３４の端部３６は、細胞成長チャンバー２４の入口ポート４０に、端部３８は、出口ポート４２にそれぞれ流体的に関連付けられる。細胞成長チャンバー２４を流れる流体は、細胞成長チャンバー２４の中空糸膜１１７（図１Ｂ参照）の外側と接触する。中空糸膜は、複数の中空糸を備える。第２流体循環路１４は、第２流量制御装置３２と動作可能に接続される。
このように、第１及び第２流体循環路１２、１４は、中空糸膜１１７（図１Ｂ参照）によって、細胞成長チャンバー２４において分離されている。第１流体循環路１２の流体は、細胞成長チャンバー２４において中空糸の毛細管内側（ＩＣ）空間を流れる。従って、第１流体循環路１２は「ＩＣループ」と呼ばれる。第２流体循環路１４の流体は、細胞成長チャンバー２４において中空糸の毛細管外側（ＥＣ）空間を流れる。従って、第２流体循環路１４は「ＥＣループ」と呼ばれる。実施形態によれば、第１流体循環路１２の流体は、第２流体循環路１４の流体の流れに対して、並流方向又は逆流方向のどちらを流れてもよい。
流体入口路４４は、第１流体循環路１２に流体的に関連付けられる。流体入口路４４によって、流体は第１流体循環路１２に導入され、流体出口路４６によって、流体は、ＣＥＳ１０から排出される。第３流量制御装置４８が、流体入口路４４に動作可能に関連付けられる。或いは、第３流量制御装置４８は、第１出口路４６に関連付けられてもよい。
実施形態によれば、ここで使用される流量制御装置としては、ポンプ、バルブ、クランプ、又はそれらの組み合わせが可能である。複数のポンプ、複数のバルブ、複数のクランプを、任意に組み合わせて配置してもよい。種々の実施形態において、流量制御装置は、蠕動ポンプであるか又は蠕動ポンプを含む。他の実施形態において、流体循環路、入口ポート、出口ポートは、任意の材料の配管で構成されてよい。
種々の部材に対して、「動作可能に関連付けられた」と記載されているが、ここで使用される「動作可能に関連付けられた」とは、動作可能な方式で互いに連結された部材を指し、部材が直接連結されている実施形態や、２つの連結された部材の間に別の部材が配置されている実施形態等も包含する。「動作可能に関連付けられた」部材は、「流体的に関連付けられる」ことができる。「流体的に関連付けられた」とは、流体が部材間を移動可能なように互いに連結された部材を指す。「流体的に関連付けられた」という用語は、２つの流体的に関連付けられた部材間に別の部材を配置する実施形態や、部材を直接接続する実施形態等を包含する。流体的に関連付けられた部材は、流体と接触しないが他の部材と接触することにより、システムを操作する部材を含んでもよい（例えば、可撓性の管の外側を圧縮することにより、該管を介して流体をポンピングする蠕動ポンプ等）。
一般に、緩衝液、タンパク質含有流体、細胞含有流体のように、如何なる種類の流体でも、循環路、入口路、出口路を流れることが可能である。本明細書で使用される用語「流体」「培地」「流体培地」は交換可能に使用される。
図１Ｂは、本発明と共に使用される中空糸型細胞成長チャンバー１００の一例を示す正面図である。細胞成長チャンバー１００は、長手方向軸ＬＡ−ＬＡを有し、細胞成長チャンバー筐体１０４を備える。少なくとも１つの実施形態において、細胞成長チャンバー筐体１０４は、４つの開口部又は４つのポート、すなわち、ＩＣ入口ポート１０８、ＩＣ出口ポート１２０、ＥＣ入口ポート１２８、ＥＣ出口ポート１３２を有する。
本発明の実施形態によれば、第１循環路内の流体は、細胞成長チャンバー１００の第１長手方向端１１２におけるＩＣ入口ポート１０８を通って細胞成長チャンバー１００に進入し、中空糸膜１１７を構成する複数の中空糸１１６の毛細管内側（種々の実施形態において、中空糸膜の毛細管内（「ＩＣ」）側又は「ＩＣ空間」と呼ぶ）に進入して通過し、細胞成長チャンバー１００の第２長手方向端１２４に位置するＩＣ出口ポート１２０を通って細胞成長チャンバー１００の外に出る。ＩＣ入口ポート１０８とＩＣ出口ポート１２０との間の流路は、細胞成長チャンバー１００のＩＣ部分１２６を構成する。第２循環路内の流体は、ＥＣ入口ポート１２８を通って細胞成長チャンバー１００に進入し、中空糸１１６の毛細管外側又は外側（該膜の「ＥＣ側」又は「ＥＣ空間」と呼ぶ）に接触して、ＥＣ出口ポート１３２を通って細胞成長チャンバー１００の外に出る。ＥＣ入口ポート１２８とＥＣ出口ポート１３２との間の流路は、細胞成長チャンバー１００のＥＣ部分１３６を構成する。ＥＣ入口ポート１２８を通って細胞成長チャンバー１００に入った流体は、中空糸１１６の外側に接触する。小分子（例えば、イオン、水、酸素、乳酸等）は、中空糸１１６を通じて中空糸の内部すなわちＩＣ空間から外側すなわちＥＣ空間へ、又はＥＣ空間からＩＣ空間へ拡散することができる。成長因子のような高分子量の分子は、通常は、大きすぎるため中空糸膜を通過できず、中空糸１１６のＩＣ空間内にとどまる。実施形態において、培地は、必要であれば交換してもよい。また、必要であれば、培地を酸素供給器（ｏｘｙｇｅｎａｔｏｒ）又はガス移送モジュールを通じて循環させて、ガスを交換してもよい。実施形態において、以下で説明するが、細胞は、第１循環路及び／又は第２循環路内に含有させることができ、膜のＩＣ側及び／又はＥＣ側に存在させることができる。
中空糸膜１１７を作製するために使用される材料は、中空糸になるものであれば、任意の生体適合性高分子材料でよい。本発明の一実施形態によれば、使用される材料の１つとしては、合成ポリスルホン系材料が挙げられる。
実施形態において、ＣＥＳ（例えば、ＣＥＳ５００（図５Ａ、図５Ｂ及び図５Ｃ）及び／又はＣＥＳ６００（図６））は、回転方向及び／又は横方向揺動装置に取り付けることによって、細胞増殖システムの他の部品に対して細胞成長チャンバーを動かす、すなわち「揺らす」ように構成された装置を有する。図１Ｃは、そのような装置の１つを示す。一実施形態では、該装置において、バイオリアクター１００は、２つの回転方向揺動部品と１つの横方向揺動部品とに回転するように接続されている。
第１回転方向揺動装置部品１３８は、バイオリアクター１００を、バイオリアクター１００の中心軸１４２を中心に回転させる。回転方向揺動装置部品１３８は、バイオリアクター１００に、回転するように関連付けられる。実施形態において、バイオリアクター１００は、中心軸１４２を中心に、単一の方向（時計回り方向又は反時計回り方向）に連続して回転することができる。或いは、バイオリアクター１００は、例えば、中心軸１４２を中心に、最初は時計回り、続いて反時計回りのように、交互に回転させることも可能である。
ＣＥＳはまた、バイオリアクター１００を回転軸１４４中心に回転させる第２回転方向揺動部品を有する。回転軸１４４は、バイオリアクター１００の中心点を通り、中心軸１４２に対して垂直である。実施形態において、バイオリアクター１００は、回転軸１４４を中心に、時計回り方向又は反時計回り方向のいずれかの単一方向に連続回転可能である。或いは、バイオリアクター１００は、回転軸１４４を中心に、例えば、最初は時計回り、続いて反時計回りのように、交互に回転させることが可能である。種々の実施形態において、バイオリアクター１００を、回転軸１４４を中心に回転させることが可能であり、重力に対して水平方向姿勢に又は垂直方向姿勢に配置することができる。
実施形態において、横方向揺動部品１４０は、バイオリアクター１００と横方向に動くように関連付けられる。実施形態において、横方向揺動部品１４０の平面は、ｘ方向及びｙ方向に動く。これにより、バイオリアクターにおける細胞の沈殿は、中空糸内の細胞含有培地の動きによって、減らされる。
揺動装置の回転方向及び／又は横方向の動きによって、装置内における細胞の沈殿が減らされ、また、バイオリアクターのある部分に細胞が捕獲される可能性も抑えられる。細胞成長チャンバーにおける細胞の沈殿速度は、ストークスの式に従って、細胞と懸濁培地との密度差に比例する。ある実施形態において、上述のように、１８０°回転（速い）と休止（例えば、合計時間３０秒）を繰り返すことにより、例えば、非接着性の赤血球の懸濁状態が維持される。一実施形態では、約１８０°の最小回転が好ましい。しかしながら、３６０°以上の回転を行うこともできる。異なる揺動部品を別個に又は組み合わせて使用してもよい。例えば、バイオリアクター１００を中心軸１４２中心に回転させる揺動部品を、バイオリアクター１００を軸１４４中心に回転させる揺動部品と組み合わせることができる。同様に、異なる軸を中心に時計回り及び反時計回りを独立に組み合わせて行うこともできる。
図２において、本発明の実施形態に係る、プリマウントタイプの流体輸送組立体を有する細胞増殖システム２００の実施形態が示される。ＣＥＳ２００は、細胞増殖装置２０２を有する。細胞増殖装置２０２は、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６と係合するハッチ又は閉可能なドア２０４を有する。細胞増殖装置２０２内の内部空間２０８は、プリマウントタイプの流体輸送組立体を受容し係合固定するような特徴を有する。プリマウントタイプの流体輸送組立体２１０は、細胞増殖装置２０２に取り外し可能に取り付けられており、細胞増殖装置２０２において、使用された流体輸送組立体２１０を、新しい又は未使用の流体輸送組立体２１０に比較的迅速に交換できるようになっている。単一の細胞増殖装置２０２の動作によって、第１の流体輸送組立体２１０を用いて細胞の第１のセットを成長又は増殖させ、その後、第１の流体輸送組立体２１０を第２の流体輸送組立体２１０に交換する際に細胞増殖装置２０２を殺菌することなく、第２の流体輸送組立体２１０を用いて細胞の第２のセットを成長又は増殖させることができる。プリマウントタイプの流体輸送組立体２１０は、バイオリアクター１００と酸素供給器又はガス移送モジュール２１２（図４参照）を有してよい。流体輸送組立体２１０に接続される種々の培地用配管を受容する実施形態に係る配管案内スロットが２１４として示される。
図３は、本発明の実施形態に係る、プリマウントタイプの流体輸送組立体２１０（図２参照）を取り外し可能に取り付ける前の、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６を示す。閉可能なドア２０４（図２参照）は、図３では省略されている。細胞増殖装置２０２の後側部分２０６には、流体輸送組立体２１０の構成要素と組み合わせて動作する複数の異なる構造が設けられている。詳細には、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６は、流体輸送組立体２１０におけるポンプループと協働する複数の蠕動ポンプ（ＩＣ循環ポンプ２１８、ＥＣ循環ポンプ２２０、ＩＣ入口ポンプ２２２、ＥＣ入口ポンプ２２４）を有する。また、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６は、複数のバルブ（ＩＣ循環バルブ２２６、試薬バルブ２２８、ＩＣ培地バルブ２３０、空気除去バルブ２３２、細胞入口バルブ２３４、洗浄バルブ２３６、分配バルブ２３８、ＥＣ培地バルブ２４０、ＩＣ廃棄又は出口バルブ２４２、ＥＣ廃棄バルブ２４４、収穫バルブ２４６）を有する。さらに、複数のセンサ（ＩＣ出口圧力センサ２４８、ＩＣ入口圧力／温度センサ２５０、ＥＣ入口圧力／温度センサ２５２、ＥＣ出口圧力センサ２５４）が、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６に関連付けられる。一実施形態によれば、さらに、空気除去チャンバーのための光学センサ２５６が示されている。
実施形態によれば、バイオリアクター１００を回転させるための軸又はロッカー制御部２５８が示されている。軸又はロッカー制御部２５８と関連付けられた軸嵌合部２６０によって、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６に対して、流体輸送組立体２１０又は４００の軸アクセス開口部（例えば、配管収納部３００（図４）の開口部４２４（図４））の適切な位置合わせが行える。軸又はロッカー制御部２５８の回転によって、軸嵌合部２６０及びバイオリアクター１００に対して回転運動が付与される。従って、ＣＥＳ２００のオペレータ又はユーザが、新しい又は未使用の流体輸送組立体４００（図４）を、細胞増殖装置２０２に取り付ける際、位置合わせは、軸嵌合部２６０に対して、流体輸送組立体２１０又は４００の軸アクセス開口部（例えば、図４の開口部４２４）を適切に方向付けるといった比較的簡単な作業となる。
図４は、取り付け・取り外し自在のプリマウントタイプの流体輸送組立体４００の斜視図である。プリマウントタイプの流体輸送組立体４００は、細胞増殖装置２０２（図２及び図３）に取り外し可能に取り付けられており、細胞増殖装置２０２において、使用された流体輸送組立体４００を、新しい又は未使用の流体輸送組立体４００に比較的迅速に交換できるようになっている。図４に示されるように、バイオリアクター１００は、軸嵌合部４０２を含むバイオリアクターカップリングに取り付けられる。軸嵌合部４０２は、細胞増殖装置２０２の軸（図３では２５８）を係合させるための１以上の軸締結機構（付勢された腕部又はバネ部材４０４）を有する。
実施形態によれば、流体輸送組立体４００は、配管４０８Ａ、４０８Ｂ、４０８Ｃ、４０８Ｄ、４０８Ｅ等及び管継手を有する。これらにより、以下で説明されるように、図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ及び図６に示されるような流体流路が提供される。ポンプループ４０６Ａ、４０６Ｂ、４０６Ｃもポンプのために設けられる。実施形態において、細胞増殖装置２０２が配置される場所に、種々の培地が設けられてもよいが、実施形態によれば、プリマウントタイプの流体輸送組立体４００は、細胞増殖装置２０２の外部に延在する程度に十分な長さの配管を有することで、培地バッグ又は培地容器に関連付けられた配管が溶着接続されることが可能となる。
次に、図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃは、細胞増殖システム５００の実施形態の概略図である。図６は、他の実施形態である細胞増殖システム６００の概略図である。図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ及び図６に示される実施形態では、以下で説明するように、細胞は、ＩＣ空間で成長される。しかしながら、本発明は、そのような例に限定されない。他の実施形態では、細胞はＥＣ空間で成長されてもよい。
前述のように、図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃは、ＣＥＳ５００を示している。図５Ａ、図５Ｂ、及び図５ＣはＣＥＳ５００の略同様の構成部品を示すと同時に、図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃは、本開示の実施形態による、ＣＥＳ５００の構造的特徴を使用した第１の流体循環路における流体移動の可能な動作構成を示す。図示されるように、ＣＥＳ５００は、第１流体循環路５０２（「毛細管内側ループ」又は「ＩＣループ」とも呼ぶ）と第２流体循環路５０４（「毛細管外側ループ」又は「ＥＣループ」とも呼ぶ）とを有する。第１流体流路５０６は、細胞成長チャンバー５０１に流体的に関連付けられて、第１流体循環路５０２を構成する。流体は、ＩＣ入口ポート５０１Ａを介して細胞成長チャンバー５０１に流入し、細胞成長チャンバー５０１内の中空糸を通って、ＩＣ出口ポート５０１Ｂを介して流出する。圧力測定器５１０は、細胞成長チャンバー或いはバイオリアクター５０１を離れる培地の圧力を測定する。培地は、培地流量を制御するために用いられるＩＣ循環ポンプ５１２を介して、流れる。ＩＣ循環ポンプ５１２は、第１方向又は第１方向の反対の第２方向に、流体をポンピング可能である。出口ポート５０１Ｂは、逆方向では、入口として使用することができる。例えば、第１の構成では、ＩＣ循環ポンプは、流体を正の方向にポンピングすることができ、流体はＩＣ入口ポート５０１Ａに入る。第２の構成では、例えば、ＩＣ循環ポンプは、例えば、流体を府の方向にポンピングすることができ、流体はＩＣ出口ポート５０１Ｂに入る。
ＩＣループに流入する培地は、バルブ５１４を介して流入することができる。当業者であれば理解できるように、追加のバルブ、圧力測定器、圧力／温度センサ、ポート及び／又は他の装置を種々の位置に配置して、流体経路のある部分において、培地を隔離し及び／又は該培地の特性を測定することもできる。従って、示される概略図は、ＣＥＳ５００の複数の要素に対する１つの可能な構成であり、１以上の実施形態の範囲において、変形可能であると理解されるべきである。
ＩＣループ５０２に対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート５１６又はサンプルコイル５１８から得られる。第１流体循環路５０２に配置された圧力／温度測定器５２０によって、動作中において、培地圧力及び温度が測定できる。そして、培地は、ＩＣ入口ポート５０１Ａに戻って、流体循環路５０２を完了する。細胞成長チャンバー５０１で成長／増殖した細胞は、細胞成長チャンバー５０１から流し出され、バルブ５９８を通って収穫バッグ５９９に入るか、中空糸内に再分配され、さらに成長される。
第２流体循環路５０４において、流体は、ＥＣ入口ポート５０１Ｃを介して、細胞成長チャンバー５０１に入り、ＥＣ出口ポート５０１Ｄを介して細胞成長チャンバー５０１を離れる。ＥＣループ５０４では、培地は、細胞成長チャンバー５０１の中空糸の外側と接触し、それによって、小分子の中空糸への及び中空糸からの拡散が可能となる。
実施形態において、培地が細胞成長チャンバー５０１のＥＣ空間に入る前に、第２流体循環路５０４に配置された圧力／温度測定器５２４によって、該培地の圧力及び温度が測定可能である。培地が細胞成長チャンバー５０１を離れた後、圧力測定器５２６によって、第２流体循環路５０４の培地の圧力が測定可能である。ＥＣループに対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート５３０から又はサンプルコイルから得られる。
実施形態において、細胞成長チャンバー５０１のＥＣ出口ポート５０１Ｄを離れた後、第２流体循環路５０４の流体は、ＥＣ循環ポンプ５２８を通って、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に至る。ＥＣ循環ポンプ５２８は、両方向に流体をポンピング可能である。第２流体流路５２２は、酸素供給器入口ポート５３４及び酸素供給器出口ポート５３６を介して酸素供給器又はガス移送モジュール５３２と流体的に関連付けられている。動作中は、流体培地は、酸素供給器入口ポート５３４を介して、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に流入し、酸素供給器出口ポート５３６を介して、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２から流出する。酸素供給器又はガス移送モジュール５３２は、例えば、ＣＥＳ５００における培地に対して、酸素を付加し、気泡を除去する。種々の実施形態において、第２流体循環路５０４における培地は、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に入るガスと平衡状態にある。酸素供給器又はガス移送モジュール５３２は、適当なサイズの任意の酸素供給器又はガス移送装置でよい。空気又はガスは、フィルタ５３８を介して酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に流入し、フィルタ５４０を介して、酸素供給器又はガス移送装置５３２から流出する。フィルタ５３８、５４０は、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２及び関連する培地の汚染を減少又は防止する。プライミング工程の一部を行っている際にＣＥＳ５００からパージされた空気又はガスは、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２を介して大気にベント可能である。
少なくとも１つの実施形態において、（バッグ５６２からの）細胞を含む培地及びバッグ５４６からの流体培地は、第１流体流路５０６を介して第１流体循環路５０２に導入される。流体容器５６２（例えば、細胞投入バッグ又は空気をシステム外にプライミングするための生理食塩水プライミング流体）は、バルブ５６４を介して、第１流体流路５０６及び第１流体循環路５０２に流体的に関連付けられる。
流体容器、又は培地バッグ５４４（例えば、試薬）は、バルブ５４８を介して第１流体入口路５４２に、又はバルブ５７６を介して第２流体入口路５７４に流体的に関連付けられ、流体容器５４６（例えば、ＩＣ培地）は、バルブ５５０を介して第１流体入口路５４２に、又はバルブ５７０を介して第２流体入口路５７４に流体的に関連付けられる。また、滅菌され密封可能な第１及び第２入力プライミング路５０８、５０９が設けられる。空気除去チャンバー（ＡＲＣ）５５６が、第１循環路５０２に流体的に関連付けられる。空気除去チャンバー５５６は、１以上の超音波センサを有してもよい。該センサには、空気除去チャンバー５５６内における特定の測定点において、空気、流体の不足、及び／又はガス／流体境界、例えば、空気／流体境界、を検知するための上部センサ及び下部センサが含まれる。例えば、空気除去チャンバー５５６の底部近傍及び／又は頂部近傍で、超音波センサを用いて、それらの場所における空気、流体、及び／又は空気／流体境界を検知することができる。実施形態において、本開示の範囲を逸脱しない範囲で、他のタイプのセンサを使用することができる。例えば、本開示の実施形態に従って、光学センサを使用してもよい。プライミング工程の一部又はその他のプロトコルを行っている際にＣＥＳ５００からパージされる空気又はガスは、空気除去チャンバー５５６と流体的に関連付けられたライン５５８を通って、エアバルブ５６０から大気中へベント可能である。
（例えば、バッグ５６８からの）ＥＣ培地又は（例えば、バッグ５６６からの）洗浄液が第１流体流路又は第２流体流路に加えられる。流体容器５６６は、バルブ５７０と流体的に関連付けられる。バルブ５７０は、分配バルブ５７２及び第１流体入口路５４２を介して第１流体循環路５０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ５７０を開け、分配バルブ５７２を閉じることにより、流体容器５６６は、第２流体入口路５７４及びＥＣ入口路５８４を介して第２流体循環路５０４と流体的に関連付けることができる。同様に、流体容器５６８は、バルブ５７６と流体的に関連付けられる。バルブ５７６は、第１流体入口路５４２及び分配バルブ５７２を介して第１流体循環路５０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ５７６を開け、分配バルブ５７２を閉じることにより、流体容器５６８は、第２流体入口路５７４と流体的に関連付けることができる。
培地試薬の導入又は洗浄液の導入のために、オプションで熱交換器５５２を設けてもよい。
ＩＣループにおいて、流体はまず、ＩＣ入口ポンプ５５４によって送られる。ＥＣループでは、流体はまず、ＥＣ入口ポンプ５７８によって送られる。超音波センサのようなエア検知器５８０がＥＣ入口路５８４と関連付けられてもよい。
少なくとも１つの実施形態において、第１及び第２流体循環路５０２、５０４は、廃棄ライン５８８と接続される。バルブ５９０を開けると、ＩＣ培地は、廃棄ライン５８８を流れ、廃棄バッグ又は出口バッグ５８６に至る。同様に、バルブ５８２を開けると、ＥＣ培地は、廃棄ライン５８８を介して廃棄バッグ又は出口バッグ５８６に流れる。
実施形態において、細胞は、細胞収穫路５９６を通って収穫される。ここでは、細胞成長チャンバー５０１からの細胞は、細胞収穫路５９６及びバルブ５９８を通るように、細胞を含むＩＣ培地をポンピングして、細胞収穫バッグ５９９へ送ることによって、収穫される。
ＣＥＳ５００の種々の構成要素は、細胞増殖装置２０２（図２、図３参照）のような装置又はハウジング内に収納される。そこでは、該装置が、細胞及び培地を、例えば、所定の温度に維持する。
図５ＡのＣＥＳ５００について示される構成では、第１流体循環路５０２及び第２流体循環路５０４における流体培地は、一実施形態において、同じ方向（並流構成）で細胞成長チャンバー５０１を通って流れる。他の実施形態では、ＣＥＳ５００は、向流構造（図示せず）を流れるように構成されてもよい。図５Ａに示す構成では、第１流体循環路５０２内の流体は、ＩＣ入口ポート５０１Ａでバイオリアクター５０１に入り、ＩＣ出口ポート５０１Ｂでバイオリアクター５０１を出る。図５Ｂ及び図５Ｃに示す構成では、実施形態において、第１流体循環路５０２内の流体培地は、接続部５１７から相対する両方向に流れて、バイオリアクターの一端のＩＣ入口ポート、すなわち第１ポート５０１Ａ、に入り、同時に、バイオリアクターの他端にあるＩＣ出口ポート、すなわち第２のポート５０１Ｂに入り、バイオリアクター自体に細胞を保持する。第１流体流路は、接続部５１７を介して第１流体循環路と流体的に関連付けられてもよい。実施形態において、接続部５１７は、例えば、ＩＣ入口ポンプの方向及びＩＣ循環ポンプの方向に基づいて、流体が相対する両方向に流れる点又は場所であってもよい。一実施形態では、接続部５１７は、Ｔ継手又はＴ結合であってもよい。他の実施形態では、接続部５１７は、Ｙ継手又はＹ結合であってもよい。接続部５１７は、第１の流体流路が第１の循環路と流体的に関連付けられることを可能にする、任意のタイプの継手、カップリング、溶着、経路、管等であってもよい。図５Ａ、図５Ｂ及び図５Ｃに示される概略図及び動作構成は、細胞増殖システムの様々な要素の可能な構成を表していること及び示される概略図及び動作構成に対する修正は１つ以上の本実施形態の範囲内であること、を理解されたい。
図６は、細胞増殖システム６００の他の実施形態の概略図である。ＣＥＳ６００は、第１流体循環路６０２（「毛細管内側ループ」又は「ＩＣループ」とも呼ぶ）と第２流体循環路６０４（「毛細管外側ループ」又は「ＥＣループ」とも呼ぶ）とを有する。第１流体流路６０６は、細胞成長チャンバー６０１に流体的に関連付けられて、第１流体循環路６０２を構成する。流体は、ＩＣ入口ポート６０１Ａを介して細胞成長チャンバー６０１に流入し、細胞成長チャンバー６０１内の中空糸を通って、ＩＣ出口ポート６０１Ｂを介して流出する。圧力センサ６１０は、細胞成長チャンバー６０１を離れる培地の圧力を測定する。圧力の他に、センサ６１０は、作動中において、培地圧力及び培地温度を検知する温度センサであってもよい。培地は、培地流量を制御するために用いられるＩＣ循環ポンプ６１２を介して、流れる。ＩＣ循環ポンプ６１２は、第１方向又は第１方向の反対の第２方向に、流体をポンピング可能である。出口ポート６０１Ｂは、逆方向では、入口として使用することができる。ＩＣループに流入する培地は、バルブ６１４を介して流入することができる。当業者であれば理解できるように、追加のバルブ、圧力測定器、圧力／温度センサ、ポート及び／又は他の装置を種々の位置に配置して、流体経路のある部分において、培地を隔離し及び／又は該培地の特性を測定することもできる。従って、示される概略図は、ＣＥＳ６００の複数の要素に対する１つの可能な構成であり、１以上の実施形態の範囲において、変形可能であると理解されるべきである。
ＩＣループに対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルコイル６１８から得られる。そして、培地は、ＩＣ入口ポート６０１Ａに戻って、流体循環路６０２を完了する。細胞成長チャンバー６０１で成長／増殖した細胞は、細胞成長チャンバー６０１から流し出され、バルブ６９８及びライン６９７を介して収穫バッグ６９９に入る。或いは、バルブ６９８が閉じている場合、細胞は、チャンバー６０１に再分配され、さらに成長される。
第２流体循環路６０４において、流体は、ＥＣ入口ポート６０１Ｃを介して、細胞成長チャンバー６０１に入り、ＥＣ出口ポート６０１Ｄを介して細胞成長チャンバー６０１を離れる。ＥＣループでは、培地は、細胞成長チャンバー６０１の中空糸の外側と接触し、それによって、チャンバー６０１内における小分子の中空糸への及び中空糸からの拡散が可能となる。
培地が細胞成長チャンバー６０１のＥＣ空間に入る前に、第２流体循環路６０４に配置された圧力／温度センサ６２４によって、該培地の圧力及び温度を測定することができる。培地が細胞成長チャンバー６０１を離れた後に、センサ６２６によって、第２流体循環路６０４の培地の圧力及び／又は温度を測定することができる。ＥＣループに対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート６３０から又はサンプルコイルから得られる。
細胞成長チャンバー６０１のＥＣ出口ポート６０１Ｄを離れた後、第２流体循環路６０４の流体は、ＥＣ循環ポンプ６２８を通って、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に至る。実施形態において、ＥＣ循環ポンプ６２８もまた、両方向に流体をポンピング可能である。第２流体流路６２２は、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２の入口ポート６３２Ａ及び出口ポート６３２Ｂを介して酸素供給器又はガス移送モジュール６３２と流体的に関連付けられている。動作中は、流体培地は、入口ポート６３２Ａを介して、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に流入し、出口ポート６３２Ｂを介して、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２から流出する。酸素供給器又はガス移送モジュール６３２は、例えば、ＣＥＳ６００における培地に対して、酸素を付加し、気泡を除去する。種々の実施形態において、第２流体循環路６０４における培地は、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に入るガスと平衡状態にある。酸素供給器又はガス移送モジュール６３２は、酸素供給又はガス移送に有用な、適当なサイズの任意の装置でよい。空気又はガスは、フィルタ６３８を介して酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に流入し、フィルタ６４０を介して、酸素供給器又はガス移送装置６３２から流出する。フィルタ６３８、６４０は、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２及び関連する培地の汚染を減少又は防止する。プライミング工程の一部を行っている際にＣＥＳ６００からパージされた空気又はガスは、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２を介して大気にベント可能である。
ＣＥＳ６００として示された該構成において、第１流体循環路６０２及び第２流体循環路６０４における流体培地は、同じ方向で（並流構成で）細胞成長チャンバー６０１を流れる。実施形態に係るＣＥＳ６００は、対向流で流れるように構成してもよい。
少なくとも１つの実施形態において、（細胞容器、例えばバッグのようなソースからの）細胞を含む培地は、取り付け点６６２に取り付けられ、培地源からの流体培地は、取り付け点６４６に取り付けられる。細胞及び培地は、第１流体流路６０６を介して第１流体循環路６０２に導入される。取り付け点６６２は、バルブ６６４を介して、第１流体流路６０６と流体的に関連付けられる。取り付け点６４６は、バルブ６５０を介して、第１流体流路６０６と流体的に関連付けられる。試薬源を、点６４４に流体的に接続して、バルブ６４８を介して流体入口路６４２に関連付けてもよいし、又はバルブ６４８、６７２を介して第２流体入口路６７４に関連付けてもよい。
空気除去チャンバー（ＡＲＣ）６５６が、第１循環路６０２に流体的に関連付けられる。空気除去チャンバー６５６は、１以上のセンサを有してもよい。該センサには、空気除去チャンバー６５６内における特定の測定点において、空気、流体の不足、及び／又はガス／流体境界、例えば、空気／流体境界、を検知するための上部センサ及び下部センサが含まれる。例えば、空気除去チャンバー６５６の底部近傍及び／又は頂部近傍で、超音波センサを用いて、それらの場所における空気、流体、及び／又は空気／流体境界を検知することができる。実施形態において、本開示の範囲を逸脱しない範囲で、他のタイプのセンサを使用することができる。例えば、本開示の実施形態に従って、光学センサを使用してもよい。プライミング工程の一部又はその他のプロトコルを行っている際にＣＥＳ６００からパージされる空気又はガスは、空気除去チャンバー６５６と流体的に関連付けられたライン６５８を通って、エアバルブ６６０から大気中へベント可能である。
ＥＣ培地源が、ＥＣ培地取り付け点６６８に取り付けられる。洗浄液源が、洗浄液取り付け点６６６に取り付けられる。これにより、ＥＣ培地及び／又は洗浄液が第１流体流路又は第２流体流路に加えられる。取り付け点６６６は、バルブ６７０と流体的に関連付けられる。バルブ６７０は、バルブ６７２及び第１流体入口路６４２を介して第１流体循環路６０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ６７０を開け、バルブ６７２を閉じることにより、取り付け点６６６は、第２流体入口路６７４及び第２流体流路６８４を介して第２流体循環路６０４と流体的に関連付けることができる。同様に、取り付け点６６８は、バルブ６７６と流体的に関連付けられる。バルブ６７６は、第１流体入口路６４２及びバルブ６７２を介して第１流体循環路６０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ６７６を開け、分配バルブ６７２を閉じることにより、流体容器６６８は、第２流体入口路６７４と流体的に関連付けることができる。
ＩＣループにおいて、流体はまず、ＩＣ入口ポンプ６５４によって送られる。ＥＣループでは、流体はまず、ＥＣ入口ポンプ６７８によって送られる。超音波センサのようなエア検知器６８０がＥＣ入口路６８４と関連付けられてもよい。
少なくとも１つの実施形態において、第１及び第２流体循環路６０２、６０４は、廃棄ライン６８８と接続される。バルブ６９０を開けると、ＩＣ培地は、廃棄ライン６８８を流れ、廃棄バッグ又は出口バッグ６８６に至る。同様に、バルブ６９２を開けると、ＥＣ培地は、廃棄バッグ又は出口バッグ６８６に流れる。
細胞が細胞成長チャンバー６０１にて成長した後、該細胞は、細胞収穫路６９７を介して収穫される。細胞成長チャンバー６０１からの細胞は、バルブ６９８を開けた状態において、細胞を含むＩＣ培地をポンピングすることにより、細胞収穫路６９７を介して、細胞収穫バッグ６９９に収穫される。
ＣＥＳ６００の種々の構成要素は、細胞増殖装置２０２（図２、図３参照）のような装置又はハウジング内に収納される。そこでは、該装置が、細胞及び培地を、例えば、所定の温度に維持する。さらに、ＣＥＳ６００及びＣＥＳ５００の構成要素は、組み合わせられてもよい。他の実施形態において、ＣＥＳは、ＣＥＳ５００やＣＥＳ６００に示される構成要素よりも少ない構成要素又は多い構成要素を含んでもよく、その場合も本発明の範囲内にある。本発明の特徴を含む細胞増殖システムの一例としては、Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ社（コロラド州 レイクウッド）によって製造されている、Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）細胞増殖システムが挙げられる。
図６に示される概略図は、細胞増殖システムの様々な要素の可能な構成を表し、示される概略図に対する修正は、１つ以上の本実施形態の範囲内であることを理解されたい。
細胞増殖システムの実施例及び詳細な説明は、米国特許第８，３０９，３４７号明細書（「細胞増殖システム及び使用方法」２０１２年１１月１３日発行）及び２０１０年１２月１５日出願の米国特許第９，０５７，０４５号明細書（「細胞増殖システムのバイオリアクターにおける細胞の投入・分配方法」２０１５年６月１６日発行）に与えられている。該米国特許出願の全体は、ここでの開示により明確に本出願に組み込まれる。
細胞増殖システム及びそれに関連する方法の様々な例示的な実施形態が説明されてきたが、図７は、本開示の実施形態による、ＣＥＳ５００又はＣＥＳ６００等の細胞増殖システムにおいて非接着細胞又は懸濁細胞を増殖するプロセスの例示的な動作ステップ７００を示す。
ＳＴＡＲＴ動作７０２が開始され、プロセス７００は細胞の準備に進む（ステップ７０４）。実施形態では、細胞の準備７０４は、複数の異なる任意のステップを伴う場合がある。例えば、ステップ７０６では、細胞が収集される。細胞の収集ステップ７０６は、ドナーから細胞を分離及び収集することを含み得る。いくつかの実施形態では、アフェレーシス手順を行って、ドナーの末梢血からある量のリンパ球が収集される（例えば白血球分離（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ））。そのようなリンパ球には、プロセス７００によって増殖される標的細胞集団が含まれる。他の実施形態では、細胞は臍帯血から収集されてもよい。
収集ステップ７０６の後、任意選択で、準備ステップ７０４の一部として、ステップ７０８において、細胞は分離される。ステップ７０６で収集された所定量の細胞は、増殖ターゲットとされる細胞を含む多くの異なる細胞タイプを含み得る。ターゲット細胞を単離するために、オプションのステップ７０８が実行されてもよい。一例として、ターゲット細胞は、Ｔ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、エフェクターＴ細胞及び／又は制御性Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態では、ステップ７０６で収集された細胞は、ステップ７０８で収集後すぐに（例えば、新鮮な状態で）単離される。他の実施形態において、ステップ７０６で収集された細胞は、貯蔵のために凍結されてもよい。これらの実施形態では、ステップ７０８の一部として細胞を単離する前に解凍ステップが実行されてもよい。
一実施形態では、Ｔ細胞は、調節されたＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦｏｘＰ３+、及び／又はそれらの組み合わせを含む表現型を有するＴ細胞である。他の実施形態では、Ｔ細胞は、エフェクター、ヘルパー、メモリー、及び／又はナイーブＴ細胞（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及び／又はそれらの組み合わせを含む表現型を有するＴ細胞）である。細胞は、任意の適切な分離技術を使用して分離される。例えば、抗体で機能化された磁気ビーズがステップ７０６で収集された細胞と接触する免疫磁気分離を使用して、細胞を単離することができる。機能化ビーズは、ターゲット細胞集団に優先的に付着する。そして、磁場を使用して、ターゲット細胞集団が付着したビーズを保持する一方で、他の細胞を除去することができる。他の実施形態では、細胞は、フィコール分離手順（ｆｉｃｏｌｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を使用して単離される。さらに他の実施形態では、細胞は、エルトリエーションを使用して、例えば、コロラド州レイクウッドのテルモＢＣＴによって製造されたＥＬＵＴＲＡ（登録商標）細胞分離システムを使用して単離されてもよい。
いくつかの実施形態では、細胞は、単離ステップ７０８後に貯蔵のために凍結される。実施形態では、単離された細胞は、凍結保存剤と混合され、細胞増殖を行うまでの所定の期間中は、貯蔵される。これらの実施形態は、ステップ７０８で細胞を単離した後に実行される凍結ステップを含んでもよい。
細胞は、分離ステップ７０８（及び／又は予め凍結されている場合は解凍）の後、任意選択でステップ７１０において、再懸濁されてもよい。ある実施形態では、細胞は、細胞の生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）の維持を促進する多くの栄養素及び／又は試薬を含む培地に再懸濁される。ある実施形態では、培地は、少なくとも血清アルブミン及びサイトカイン等の試薬を含む。サイトカインは、ある実施形態では、組換えヒトＩＬ−２サイトカインである。一実施形態では、培地は、２００ＩＵ／ｍｌの濃度でサイトカインを含んでもよい。他の実施形態では、培地は、１００ＩＵ／ｍｌの濃度でサイトカインを含む。さらに他の実施形態では、細胞は、ヒトＡＢ血清を含むＰＢＳに懸濁される。例えば、細胞は、ＰＢＳ及び５％ヒトＡＢ血清を含む液体中に懸濁される。ビーズをアクチベーターとして利用する実施形態のようないくつかの実施形態では、ヒトＡＢ血清は、細胞投入ステップを含む全てのステップに存在してもよい。理論に縛られるものではないが、ヒト血清には、Ｔ細胞上のＣＤ２と結合するＬＦＡ−３（ＣＤ５８）が含まれており、細胞とビーズの凝集を最小限に抑えると考えられる。
細胞準備ステップ７０４に続いて、プロセス７００は、細胞を活性化して増殖させる細胞露出ステップ７１２に進む。細胞は、任意選択であるがステップ７１４において、可溶性のアクチベーター（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）に曝露される。抗体複合体を含むアクチベーターは、細胞が再懸濁される培地に添加される。実施形態では、アクチベーターは、ヒト抗体ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２細胞アクチベーター複合体である。いくつかの実施形態では、アクチベーターは、細胞再懸濁ステップ７１０において使用される培地に含まれてもよい。任意選択で、ステップ７１６において、細胞は、表面上にアクチベーターを有するビーズに曝露される。
実施形態では、細胞をビーズにさらすことは、再懸濁細胞に対して所定量のビーズを添加することを含む。ビーズは、細胞の数に関して異なる比率で加えられてもよい。例えば、ビーズは、１ビーズ：２細胞の比で添加されてもよい。他の実施形態は、例えば、約１ビーズ：約１細胞、約１ビーズ：約２細胞、約１ビーズ：約３細胞、約１ビーズ：約４細胞、約２ビーズ：約１細胞、約３ビーズ：約１細胞、約４ビーズ：約１細胞、約５ビーズ：約１細胞、等の異なる比率でビーズが添加される。ビーズは表面に抗体を有することで、細胞を活性化して増殖させることができる。使用され得るビーズの一例としては、マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手可能なＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）のビーズが挙げられる。いくつかの実施形態におけるビーズは、それらの表面上の抗体で機能化される。それら抗体のいくつかの非限定的な例としては、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３４及びそれらの組み合わせが挙げられる。
プロセス７００は、細胞増殖ステップ７１８に進む。細胞増殖ステップ７１８の一部として、細胞は、細胞が増殖される細胞成長チャンバー、例えば、中空糸膜バイオリアクターに投入されてもよい。ステップ７２０において、細胞には、増殖を促進するために栄養素が与えられる。例えば、増殖のための栄養素を供給するために、培地を細胞成長チャンバーに送達してもよい。細胞増殖ステップ７１８は、細胞の増殖を促進し続けるために、細胞成長チャンバーに周期的に試薬を加えることを含み得る（ステップ７２２）。例えば、いくつかの実施形態では、試薬（例えば、サイトカイン）を細胞成長チャンバーに加えて、細胞の増殖を促進してもよい。一実施形態では、試薬は、追加のＩＬ−２サイトカイン、例えば組換えヒトＩＬ−２サイトカインであってもよい。
また、細胞増殖ステップ７１８の一部として、細胞成長チャンバー内部の環境が制御されてもよい（ステップ７２４）。例えば、細胞成長チャンバー内で成長している細胞に、例えば二酸化炭素と酸素のバランスをもたらすために、ガスが連続的に送達・交換される。さらに、温度は、細胞増殖に最適化された範囲内になるように制御されてもよい。細胞増殖ステップ７１８はまた、代謝産物を監視するステップ７２６を含んでもよい。例えば、乳酸及びグルコースのレベルは定期的に監視されてもよい。代謝産物の上昇又は下降は、ステップ７２４における細胞成長チャンバー内の環境の制御に対して変化（例えば、フィーディングの追加、試薬添加の追加、ガス交換の追加等）を促す場合がある。
プロセス７００は次に細胞収穫ステップ７２８に進む。除去された細胞のさらなる処理又は他の分析は、ステップ７３０で任意に実行されてもよい。例えば、細胞表現型を決定するために細胞を特徴付けることができる。さらなる処理又は他の分析を行うステップ７３０は、例えば細胞表現型を特徴付けるためにフローサイトメトリーを実行することを含み得る。プロセス７００は、ＥＮＤ動作７３２で終了する。さらなる処理／分析を実行することが望ましくない場合、プロセス７００はＥＮＤ動作７３２で終了する。
図８Ａは、本開示の実施形態による、細胞又は他の材料（例えば、タンパク質、栄養素、成長因子）を細胞成長チャンバー内に配置するために使用され得るプロセスの動作ステップ８００を示す。実施形態では、プロセス８００は、「循環せずに中央に細胞を投入する」タスクの一部として実施されてもよい。開始動作８０２が開始され、プロセス８００はステップ８０４に進み、ここで、細胞を含む第１の体積の流体が、細胞増殖システムの細胞成長チャンバーに投入される。実施形態では、細胞は、１つ又は複数のタイプのＴ細胞等の非接着細胞を含む。一実施形態では、複数の細胞はＴｒｅｇを含む。他の実施形態では、細胞は、様々なＴ細胞表現型を含む単核細胞（ＰＢＭＣ等）である。理解され得るように、細胞を有する第１の体積の流体の投入は、上述のシステムＣＥＳ５００（例えば、図５Ａ）及びＣＥＳ６００（図６）等の細胞増殖システムの構成要素によって実行され得る。図８Ｂは、第１入口ポンプ８４０、第１流体流路８６０、第１流体循環ポンプ８４８、第１流体循環路８５２、細胞成長チャンバー８４４、及び第２流体循環路８５４を含む細胞増殖システムの一部を示す。第１流体流路８６０は、接続部８６０Ｂを介して流体循環路８５２と流体的に関連付けられている。実施形態では、ステップ８０４において、細胞を有する第１の体積の流体は、第１流体入口ポンプ８４０を利用して第１流体流路８６０を通って第１流体循環路８５２に投入される。実施形態では、第１流体循環ポンプ８４８を作動させずに、第１の体積の流体は投入される。
図８Ｂに示されるように、第１流体循環経路８５２の体積は、複数の部分の体積から構成される。例えば、容積の第１の部分は、細胞成長チャンバー８４４の毛細管内側空間（細胞成長チャンバーが中空糸膜バイオリアクターである場合）である。体積の第２の部分は、接続部８６０Ｂから細胞成長チャンバー８４４の入口ポート８４４Ａまでである。第３の部分は、接続部８６０Ｂから細胞成長チャンバー８４４の出口ポート８４４Ａまでである。
プロセス８００は、第２の体積の流体を投入するステップ８０６に進む。第２の体積の流体は、培地を含んでもよく、第１流体流路８６０の一部に導入される。ある実施形態では、第２の体積は、第１の体積を細胞成長チャンバー８４４の第１の部分に配置する（ステップ８０８）ために選択された所定の量である。実施形態では、流体の第１の体積と流体の第２の体積は同じであってもよい。他の実施形態では、流体の第１の体積と流体の第２の体積は異なっていてもよい。さらに他の実施形態では、流体の第１の体積と流体の第２の体積との合計は、第１流体循環路、例えば経路８５２（図８Ｂ）の体積のあるパーセンテージ分に等しくてもよい。
第１の体積の流体を配置するために、流体の第２の体積は、細胞成長チャンバー８４４内の所望の位置に第１の体積を押し込むのに十分な量でなければならない。従って、実施形態では、流体の第２の体積は、接続部８６０Ｂと入口ポート８４４Ａとの間の第１流体循環路８５２の体積と略同じ大きさである。理解され得るように、これは、細胞を含む第１の体積の流体を細胞成長チャンバー８４４内の位置に押し込むであろう。
他の実施形態では、ステップ８０８において、（細胞を含む）第１の体積の流体は、細胞成長チャンバー８４４の中央領域８６６に配置される。これらの実施形態では、第２の体積は、接続部８６０Ｂと入口ポート８４４Ａとの間の第１流体循環路８５２の体積と、細胞成長チャンバー８４４によって構成される第１流体循環路（例えば、毛細血管内側空間の体積）のうち、細胞成長チャンバーに配置されたときに第１の体積の流体によって占有されない部分の体積との和と略同じである。例えば、一実施形態では、（細胞を含む）流体の第１の体積は５０ｍｌである。細胞成長チャンバーは、例えば、１２４ｍｌの体積を有する。第１の体積が中央領域８６６に配置されると、中央領域８６６辺りを５０ｍｌの体積が占有し、中央領域８６６の両側に７４ｍｌを残す。従って、第１の体積の５０ｍｌを中央領域８６６辺りに配置するため、７４ｍｌの５０％（すなわち３７ｍｌ）が接続部８６０Ｂと入口ポート８４４Ａとの間の容積に追加されてよい。
実施形態では、第１の体積の位置付けステップ８０８は、流体を追加して、細胞成長チャンバー内に、細胞を有する第１の体積の流体を位置付けすることを有する。例えば、第１の体積の所望の位置付けが第２の体積で達成されない場合、流体を追加して第１の体積を位置付け配置することができる（ステップ８０８）。
プロセス８００はクエリステップ８１０に進み、第１の体積を再配置すべきかどうかを判断する。例えば、ある実施形態では、第１の体積は、入口ポート８４４Ａ寄りに配置される場合がある。第１の体積を細胞成長チャンバー８４４の中央領域８６６に近づけることが望まれる場合、プロセス８００は、ステップ８０８に戻り、第１の体積の流体を位置付け配置するために追加の流体を第１流体循環路に追加する。
クエリ８１０で、第１の体積を再配置する必要がないと判定された場合、プロセス８００は細胞フィーディングステップ８１２に進む。実施形態では、グルコース、タンパク質、成長因子、試薬、又は他の栄養素等の複数の要素を含む培地を使用して、細胞にフィーディングが行われる。実施形態では、細胞フィーディングステップ８１２は、入口ポンプ及び循環ポンプ（例えば、ポンプ８４０、８４８）を作動させて、栄養素を含む培地を細胞成長チャンバー８４４内の細胞に送ることを含み得る。いくつかの実施形態では、以下で説明するように、ステップ８１２中に細胞は細胞成長チャンバー８４４内に維持される。これらの実施形態は、細胞成長チャンバー８４４への流体の流れが両方向から（入口ポート８４４Ａ及び出口ポート８４４Ｂから）細胞成長チャンバー８４４へとなるようにポンプ（例えば、入口ポンプ及び循環ポンプ（例えば、以下で述べるポンプ８４０、８４８））を作動させることを含む。
次に、プロセス８００は、細胞増殖ステップ８１４に進み、そこで細胞を増殖又は成長させる。ステップ８１４はステップ８１２の後に示されているが、ある実施形態によれば、ステップ８１４はステップ８１２の前に、又はステップ８１２と同時に行われてもよい。次いで、細胞を細胞成長チャンバーから取り出し（ステップ８１６）、貯蔵容器に収集する。実施形態では、ステップ８１６は、いくつかのサブステップを伴う。例えば、細胞は、収集されて容器に保存される前に、循環ポンプ（例えば、ポンプ８４８）によって循環されてもよい。プロセス８００は、ＥＮＤ動作８３０で終了する。
次に、図９Ａは、本開示の実施形態による、ＣＥＳ５００（例えば、図５Ｂ及び図５Ｃ）等の細胞増殖システムのバイオリアクター内に細胞を保持するためのプロセスの例示的な動作ステップ９００を示す。前述のように、バイオリアクターの管寄せ部分（ヘッダー（ｈｅａｄｅｒ））又はバイオリアクター外側のＩＣループにある細胞は、適切なガス交換と栄養交換を受けず、細胞の凝集と死を招く可能性がある。一実施形態において、バイオリアクターは、半透過性中空糸膜を通してガス交換及び栄養交換を行う。中空糸膜を含む細胞増殖システムの表面積対体積比は、他の細胞培養方法のシステムよりも大幅に大きくなる可能性があるため（例えば、細胞培養フラスコの表面積の約１５倍）、そのような交換は効率的であるということが重要である。そのような効率は、交換が行われる膜表面を通過できる培地成分の拡散距離を最小化することにより達成される。
例えば、図９Ｂは、細胞増殖中（バイオリアクターに約３Ｅ＋０９のＴ細胞が存在する）の、Ｑｕａｎｔｕｍ(登録商標)Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ等の細胞増殖システムにおける酸素消費量のグラフ９３６を示している。図９Ｂは、バイオリアクター出口での酸素（Ｏ2）の割合（％）（９３８）を示す。例えば、一実施形態によれば、酸素レベルを測定するセンサは、バイオリアクターのＥＣ出口ポートに配置することができる。他の実施形態では、酸素供給を測定するセンサをバイオリアクターのＩＣ出口ポートに配置してもよい。Ｏ2の割合は、実行時間（例、分）（９４０）に対して測定される。細胞への酸素供給を最大化するために、ある実施形態では、ＥＣ循環流量、ＱEC Circは３００ｍＬ／ｍｉｎ（９４２）に設定される。図９Ｂは、ＥＣ循環流量は、３００ｍＬ／ｍｉｎ（９４２）から５０ｍＬ／ｍｉｎ（９４４）に低下したときの酸素供給の変化を示している。例えば、培地がバイオリアクターを通過するときに、細胞は培地内の酸素（Ｏ2）を消費する。５０ｍＬ／ｍｉｎ（９４４）の流体は、３００ｍＬ／ｍｉｎ（９４２）の流体よりもバイオリアクターをゆっくりと移動するため、ＥＣ循環流量が５０ｍＬ／ｍｉｎの場合、細胞がより長い時間をかけて、又は細胞が培地から酸素を除去する機会が増える可能性がある。ＥＣ循環流量が３００ｍＬ／ｍｉｎに戻ると、酸素供給は回復する（９４６）。図９Ｂは、バイオリアクターの外側のＩＣ循環経路の部分、例えば細胞から酸素が奪われる可能性がある部分に保持する場合とは対照的に、気体の移動が起こる中空糸自体に細胞を保持する場合において考えられ得る利点を示している。従って、バイオリアクターの両側、例えばＩＣ入口ポートとＩＣ出口ポートに入るように培地の流れを誘導することにより、フィーディング中にバイオリアクターの中空糸内に細胞（例えば、非接着細胞）集団を保持することは有益である。一実施形態では、ＩＣ入口ポート及びＩＣ出口ポートへの流れを均等に分配する手法を使用することができる。他の実施形態では、例えば、バイオリアクター内における細胞の所望される配置場所に応じて、ＩＣ出口ポートに対してＩＣ入口ポートへの流れを大きくしたり、逆に小さくしたりする。
図９Ａに戻ると、開始動作９０２が開始され、プロセス９００は、ディスポーザブルセット又は事前に取り付けられた流体移送アセンブリ（例えば、参照符号２１０、４００で示される）を細胞増殖システムに装填するステップ９０４に進む。ステップ９０６において、ディスポーザブルセットはプライミングされる。ここでは、例えば、Ｌｏｎｚａ Ｃａ2+／Ｍｇ2+を含まないＰＢＳでディスポーザブルセットはプライミングされる。細胞の投入及び播種の準備において、プライミング流体は、ＩＣ／ＥＣ洗浄ステップ９０８を使用して交換される。一実施形態において、システム内のＰＢＳは、例えば、ＴｅｘＭＡＣＳ ＧＭＰ基礎培地と交換される。他の実施形態では、基礎培地は、Ｐｒｉｍｅ ＸＶ、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ＋グルタミン、ＲＰＭＩ１６４０＋グルタミン、及び／又はＩＭＤＭ＋グルタミンである。次に、プロセス９００は、ＩＣ出口弁を閉じるステップ９１０に進む。実施形態において、ＥＣ出口弁は、中空糸膜を含むバイオリアクターの中空糸に加えられた流体の限外濾過を可能にするために開かれる。次に、ステップ９１２において、培地が調整される。次に、プロセス９００は、細胞（例えば、懸濁細胞又は非接着細胞（例えばＴｒｅｇ等のＴ細胞））を投入するステップ９１４に進む。一実施形態では、ステップ９１４において、そのような細胞は、「循環せずに中央に細胞を投入する」タスクによって投入される。他の実施形態では、ステップ９１４において、そのような細胞は、「均一な懸濁で細胞を投入する」タスクによって投入される。他の実施形態では、他の投入タスク及び／又は投入手順が使用されてもよい。
一実施形態では、ステップ９１４において投入中の細胞は、例えば、その投入中及び投入後に細胞にフィーディングを行うための培地を含む溶液に懸濁されてもよい。他の実施形態では、そのような溶液は、細胞フィーディングを行うための培地と、細胞（例えばＴ細胞）を刺激するための可溶性活性化因子複合体の両方を含んでもよい。上記のように、アクチベーターは、いくつかの実施形態ではビーズである。従って、ステップ９１４で投入される細胞はまた、細胞の増殖を刺激するためのアクチベーターを有するビーズを含んでよい。いくつかの実施形態では、ヒトＡＢ血清が存在してもよい。理論に縛られるものではないが、ヒト血清には、Ｔ細胞上のＣＤ２と結合するＬＦＡ−３（ＣＤ５８）が含まれており、細胞とビーズとの凝集が最小限に抑えられると考えられる。投入ステップ９１４は、例えば、０日目に行われる。
細胞投入ステップ９１４に続いて、ステップ９１６において、細胞はさらにフィーディングされる。フィーディングステップ９１６の間、バイオリアクター内に細胞滞留を制御することが望ましい。フロー制御パラメータを調整するステップ９１８により、例えば成長の増殖期の間、細胞がバイオリアクターからバイオリアクター外側のＩＣループ部分に失われずに、細胞をバイオリアクター内に保持することができる。実施形態によれば、細胞をバイオリアクター内に保持することにより、バイオリアクター内の細胞をＩＣ入口ポートに近づけることができ、そのような細胞は最も新鮮な成長培地を受けることができる。一方、ＩＣループ内の細胞は、例えば、解糖代謝に影響を与える可能性のある、消費された又は調整された培地を受け取っている可能性がある。さらに、バイオリアクター内の細胞は、ＥＣループ循環からの拡散によりガス移送モジュール（ＧＴＭ）から入力される混合ガス（例えば、酸素、二酸化炭素、窒素）を受け取るが、ＩＣループの他の部分の細胞はそのような混合ガスを受け取らない。ある実施形態では、細胞はバイオリアクター自体に保持されるが、他の実施形態では、細胞は、栄養送達及び／又はガス交換の改善を可能にする任意の場所に維持されてもよい。従って、実施形態においては、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、細胞を保持するため又は細胞の滞留を制御するために他の場所が使用される。
図９Ａ及びプロセス９００に戻ると、ある実施形態では、中空糸膜バイオリアクターからの細胞の損失は、ＩＣ循環ポンプ流量をＩＣ入口ポンプ流量に（反対方向であるが）マッチングさせるか、或いは略又は実質的にマッチングさせることにより減少させることができる。ステップ９２０において、ＩＣ入口ポンプは、第１の流量又は体積流量を生成するように調整され、ステップ９２２において、ＩＣ循環ポンプは、第２の対向流量又は第２の対向体積流量を生成するように調整される。ここでは、体積流量又は流体流量又は流体のレート又は流量は、単位時間あたりに通過する流体の体積と考えることができる（記号「Ｑ」で表される）。例えば、０．１ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ入口ポンプ流量に対する相補的なＩＣ循環ポンプ流量として−０．１ｍＬ／ｍｉｎをマッチング或いは略マッチングさせて、細胞培養の成長期の間（ある実施形態では、例えば第４日目から第７日目）、バイオリアクター内に細胞を維持する。他の実施形態では、成長期は２〜７日目又は２〜８日目である。ポンプ調整ステップ９１８によって、例えば、バイオリアクターのＩＣ出口ポートからの細胞の損失に関連するあらゆる力に対抗することが可能になる。
次に、ステップ９２４において、細胞を成長又は増殖させる。細胞は、ステップ９２４での成長又は増殖に限定されず、代わりに、例えば、ステップ９１４、９１６、９１８、９２０、９２２中に細胞を増殖させてもよい。プロセス９００は、次に、収穫ステップ９２６に進み、そこでは、細胞を収穫バッグ又は容器に移す。次いで、ディスポーザブルセットを細胞増殖システムからアンロードし（ステップ９３２）、次いでプロセス９００は終了動作９３４で終了する。
或いは、収穫ステップ９２６から、プロセス９００は、さらなる処理／分析ステップ９２８を可能にするために任意選択で進むことができる。そのようなさらなる処理ステップ９２８は、例えば収穫された細胞の表現型の特徴付けを含む。オプションのさらなる処理／分析ステップ９２８から、プロセス９００は、残りの細胞９３０をオプションで再投入するように進行してもよい。次に、プロセス９００は、ディスポーザブルセットのアンロード（ステップ９３２）に進み、プロセス９００は、終了動作９３４で終了する。或いは、プロセス９００は、さらなる処理／分析ステップ９２８から進行して、ディスポーザブルセットをアンロードしてもよい（ステップ９３２）。プロセス９００は、次いで、終了動作９３４で終了する。
次に、図１０Ａは、本開示の実施形態による、ＣＥＳ５００（例えば、図５Ｂ及び図５Ｃ）等の細胞増殖システムと共に使用される細胞に対してフィーディングを行うためのプロセスの例示的な動作ステップ１０００を示す。開始動作１００２が開始され、プロセス１０００は、ディスポーザブルセットを細胞増殖システムに装填し、該セットをプライミングし、ＩＣ／ＥＣ洗浄を実行し、培地を調整し、細胞（例えば、懸濁細胞又は非接着細胞）を投入するステップに進む。次に、プロセス１０００は、第１の期間の間、細胞に対してフィーディングを行うステップ１００４に進む。実施形態では、第１入口流量及び第１循環流量が使用される。一例として、第１のＩＣ入口流量及び第１のＩＣ循環流量が使用され、ここでは、第１のＩＣ入口流量は、ＩＣ入口ポンプ（例えば第１ポンプ）によって制御され、第１のＩＣ循環流量は、ＩＣ循環ポンプ（例えば第２ポンプ）によって制御される。例示的な実施形態では、ＩＣ入口ポンプ（５５４）は、０．１ｍＬ／ｍｉｎの体積流量で、バイオリアクター（５０１）のＩＣ入口ポート（５０１Ａ）に流入させ、ＩＣ循環ポンプ（５１２）は、−０．１ｍＬ／ｍｉｎの相補的なＩＣ循環体積流量又は流量流体流量で、バイオリアクター（５０１）のＩＣ出口ポート（５０１Ｂ）に流入させる。ここで、例えば、−０．１ｍＬ／ｍｉｎで使用される負の記号（「−」）は、細胞培養の成長期の間、細胞がバイオリアクター内に維持されるように、ＩＣ循環ポンプ（５１２）の方向が対向流量を生じさせることを示している。
細胞のフィーディングの間及び正方向−対向流特性によるバイオリアクター内の細胞滞留制御を行いながらのフィーディングにおけるＩＣポンプの使用の間は、細胞は成長及び増殖し続ける。結果として、細胞は、増殖する集団を支援するために、追加の培地（例えばグルコース及び／又は細胞成長用培地）を必要とする。増殖する細胞集団の乳酸値を制御するための処置もなされる。実施形態において、細胞培養乳酸値は、約２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、約１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、又は約７ｍｍｏｌ／Ｌ以下に維持される。他の実施形態では、例えば培地添加レート及び／又は他の設定を制御して、例えば細胞成長及び生存率を改善するために、乳酸レベルを約約５ｍｍｏｌ／Ｌ以下に維持される。さらに他の実施形態では、例えば、培地添加のレート、及び／又は他の設定を制御して、例えば、細胞増殖及び生存率を改善するために、乳酸レベルを約１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下に維持される。他の実施形態では、他の濃度が使用されてもよい。
例示的な実施形態では、複数の期間、例えば数日間（４〜８日目）にわたって中空糸膜の内腔内で、ＩＣ入口（＋）ポンプ流量とＩＣ循環（−）ポンプ流量の両方を±０．１から±０．４ｍＬ／ｍｉｎまで同時に増加させることにより、乳酸値を約７ｍｍｏｌ／Ｌ以下に制御することができる。例えば、図１０Ｂは、例えば細胞増殖システム（例えば、ＣＥＳ５００）で「細胞フィーディング」タスクを使用してフィーディングを行うための例示的なＩＣポンプ流量の表１０１８を示す。表１０１８は、バイオリアクター内に細胞を維持させるようにバイオリアクターの両側への体積流量を生成するための期間１０２０（例えば何日目か）とＩＣポンプ流量１０２２との例示的な関係を示す。例えば、０〜４日目（１０２４）では、０．１ｍＬ／ｍｉｎ（１０２６）のＩＣ入口流量又は入力ポンプ流量を、また−０．１ｍＬ／ｍｉｎ（１０２８）のＩＣ循環ポンプ流量を使用する。５日目（１０３０）は、０．２ｍＬ／ｍｉｎ（１０３２）のＩＣ入口ポンプ流量と−０．２ｍＬ／ｍｉｎ（１０３４）のＩＣ循環ポンプ流量を使用する。６日目（１０３６）は、０．３ｍＬ／ｍｉｎ（１０３８）のＩＣ入口ポンプ流量と−０．３ｍＬ／ｍｉｎ（１０４０）のＩＣ循環ポンプ流量を使用する。７日目（１０４２）は、０．４ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ入口ポンプ流量（１０４４）と−０．４ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ循環ポンプ流量（１０４６）を使用する。図１０Ｂの表１０１８は、細胞培養の成長期に細胞をバイオリアクターに保持しながら、細胞にフィーディングを行うためにポンプ流量を±０．１から±０．４ｍＬ／ｍｉｎにすることを例示しているが、他のポンプ流量とそれによる流量は、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、実施形態に対して使用されてよい。例えば、この例ではフィーディング流量を増やすために±０．１ｍＬ／ｍｉｎの増分が示されているが、他の増分、例えば±０．００５ｍＬ／ｍｉｎ、±０．０５ｍＬ／ｍｉｎ等を使用してフィーディング流量を増やしてもよい。図１０Ｂの表１０１８の期間（例えば日数）、及びポンプ流量は、単に例示目的で提供されており、限定することを意図していない。
他の例示的な実施形態では、細胞増殖の期間にわたって、中空糸膜の管腔内のＩＣ入口（＋）ポンプ速度及びＩＣ循環（−）ポンプ速度の両方を同時に増加させることにより、乳酸値を約１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下になるように制御が行われる。例えば、第１の期間（０〜２日又は０〜４日）では、０．１ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ入口又は入力ポンプ速度と−０．１ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ循環ポンプ速度が使用される。第２の期間（３〜７日目又は５〜８日目）では、０．４ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ入口又は入力ポンプ速度と−０．４ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ循環ポンプ速度が使用される。本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、他のポンプ速度及びその結果として得られる流量を実施形態に従って使用することもできる。例えば、この例では、供給流量を増加させるために±０．１ｍＬ／ｍｉｎ程度の（例えば、±０．１ｍＬ／ｍｉｎ；±０．２ｍＬ／ｍｉｎ；±０．３ｍＬ／ｍｉｎ等）の増分が示されるが、ある実施形態では、他のオーダーの増分（例えば、±０．００５ｍＬ／ｍｉｎ、±０．０５ｍＬ／ｍｉｎ等）を使用して、供給流量を増加させることができる。期間（例えば、日数）及びポンプ速度は、単に例示の目的で提供されており、限定することを意図していない。
図１０Ａに戻ると、プロセス１０００は、第１の期間の間、細胞をフィーディングするステップ１００４から、第１の量だけ第１の入口流量を増加させて第２の入口流量を達成するステップ１００６に進む。上記で説明した図１０Ｂに示された実施形態のように、ＩＣ入口ポンプ流量（＋）は、０．１ｍＬ／ｍｉｎから０．２ｍＬ／ｍｉｎに増加して、０．２ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ入口流量を生成する。さらに、それと同時に、ＩＣ循環ポンプ流量（−）は、−０．１ｍＬ／ｍｉｎから−０．２ｍＬ／ｍｉｎに同時に増加して、−０．２ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ循環流量を生成する。従って、第１循環流量は第１の量だけ増加して、第２循環流量を達成する（ステップ１００８）。次いで、細胞に対して、第２の入口流量及び第２の循環流量で第２の期間、フィーディングが行われ（ステップ１０１０）、バイオリアクター内及びヘッダーの外側及びバイオリアクター外側のＩＣ循環路の一部の外側に細胞が維持される。第２の期間のフィーディング（ステップ１０１０）に続いて、例えば、細胞のフィーディング及び／又は増殖を継続することが望まれない場合、プロセス１０００は、終了動作１０１６で終了する。或いは、任意選択可能であるが、プロセス１０００は、フィーディング流量の増加又はそうでなければ変更を続けることができる（ステップ１０１２）。省略記号１０１４で表されるように、任意の数のフィーディング期間があってもよい。所望の数のフィーディング期間１０１４に続いて、プロセス１０００は終了動作１０１６で終了する。図１０Ａ及び図１０Ｂ及びプロセス１０００は、流量の「増加」を示しているが、流量に対する他の調整を行ってもよい。例えば、流量は、あるフィーディング期間から次のフィーディング期間まで減少させてもよいし、実質的に同じままでもよい。例えば、代謝活動等を考慮することで、流量をどのように調整するかを決定してもよい。図１０Ａ及び図１０Ｂの流量の「増加」は、単に説明の目的で提供されており、限定することを意図したものではない。
次に、図１１Ａは、本開示の実施形態による、ＣＥＳ５００（例えば、図５Ｂ及び図５Ｃ）等の細胞増殖システムと共に使用される細胞に対してフィーディングを行うためのプロセスの例示的な動作ステップ１１００を示す。開始動作１１０２が開始され、プロセス１１００は、ディスポーザブルセットを細胞増殖システムに装填し、該セットをプライミングし、ＩＣ／ＥＣ洗浄を実行し、培地を調整し、細胞（例えば、懸濁細胞又は非接着細胞）を投入するステップに進む。次に、プロセス１１００は、第１の期間の間、細胞に対してフィーディングを行うステップ１１０４に進む。実施形態では、第１入口流量又は流量及び第１循環流量又は流量が使用される。一例として、第１のＩＣ入口流量及び第１のＩＣ循環流量が使用され、ここでは、第１のＩＣ入口流量は、ＩＣ入口ポンプ（例えば第１ポンプ）によって制御され、第１のＩＣ循環流量は、ＩＣ循環ポンプ（例えば第２ポンプ）によって制御される。例示的な実施形態では、ＩＣ入口ポンプ（５５４）は、０．１ｍＬ／ｍｉｎの体積流量又は流量で、バイオリアクター（５０１）のＩＣ入口ポート（５０１Ａ）に流入させ、ＩＣ循環ポンプ（５１２）は、−０．１ｍＬ／ｍｉｎの相補的なＩＣ循環体積流量で、バイオリアクター（５０１）のＩＣ出口ポート（５０１Ｂ）に流入させる。ここで、例えば、−０．１ｍＬ／ｍｉｎで使用される負の記号（「−」）は、細胞培養の成長フェーズの間、細胞がバイオリアクター内に維持されるように、ＩＣ循環ポンプ（５１２）の方向が対向流量を生じさせるすなわち発生させることを示している。
細胞のフィーディングの間及び正方向−対向流特性によるバイオリアクター内の細胞滞留制御を行いながらのフィーディングにおけるＩＣポンプの使用の間は、細胞は成長及び増殖し続ける。結果として、細胞は、増殖する集団を支援するために、追加の培地（例えばグルコース及び／又は細胞成長用培地）を必要とする。増殖する細胞集団の乳酸値を制御するための処置もなされる。例示的な実施形態では、例えば数日間（４〜８日目）にわたって中空糸膜の内腔内で、ＩＣ入口（＋）ポンプ流量とＩＣ循環（−）ポンプ流量の両方を±０．１から±０．４ｍＬ／ｍｉｎまで同時に増加させることにより、乳酸値を約７ｍｍｏｌ／Ｌ以下に制御することが行われる。例えば、図１０Ｂのテーブル及び上述したそれに関する説明（例えば、フィーディングのためのポンプ流量）を参照のこと。上述のように、図１０Ｂの表１０１８は、細胞培養の成長期に細胞をバイオリアクターに保持しながら、細胞にフィーディングを行うためにポンプ流量を±０．１から±０．４ｍＬ／ｍｉｎにすることを例示しているが、他のポンプ流量とそれによる流量は、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、実施形態に対して使用されてよい。他の例示的な実施形態では、複数の日数にわたって、中空糸膜の管腔内のＩＣ入口（＋）ポンプ速度及びＩＣ循環（−）ポンプ速度の両方を同時に増加させることにより、乳酸値を約１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下になるように制御が行われる。上記した及び図１０Ｂの表１０１８に記載した期間（例えば日数）、及びポンプ流量は、単に例示目的で提供されており、限定することを意図していない。
図１１Ａに戻ると、プロセス１１００は、第１の期間の間、細胞をフィーディングするステップ１１０４から、第１の量だけ第１の入口流量を増加させて第２の入口流量又は流量を達成するステップ１１０６に進む。上記で説明した図１０Ｂに示された実施形態のように、ＩＣ入口ポンプ流量（＋）は、０．１ｍＬ／ｍｉｎから０．２ｍＬ／ｍｉｎに増加して、０．２ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ入口流量を生成する。さらに、それと同時に、ＩＣ循環ポンプ流量（−）は、−０．１ｍＬ／ｍｉｎから−０．２ｍＬ／ｍｉｎに同時に増加して、−０．２ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ循環流量を生成する。他の実施形態では、ＩＣ入口ポンプ速度（＋）は、０．１ｍＬ／ｍｉｎから０．４ｍＬ／ｍｉｎに増加して、０．２ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ入口流量を生成することができる。さらに、ＩＣ循環ポンプ速度（−）は同時に−０．１ｍＬ／ｍｉｎから−０．４ｍＬ／ｍｉｎに増加し、−０．４ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ循環流量を生成する。従って、第１循環流量又は流量は第１の量だけ増加して、第２循環流量を達成する（ステップ１１０８）。次いで、細胞に対して、第２の入口流量又は流量及び第２の循環流量又は流量で第２の期間、フィーディングが行われ（ステップ１１１０）、バイオリアクター内及びヘッダーの外側又はバイオリアクター外側のＩＣ循環路の一部に細胞が維持される。第２の期間のフィーディング（ステップ１１１０）に続いて、例えば、細胞のフィーディング及び／又は増殖を継続することが望まれない場合、プロセス１１００は、終了動作１１１６で終了する。
或いは、任意選択で、プロセス１１００は、代謝活動に基づいてフィーディング流量又は流量を調整するかどうかを決定することができる。この場合、プロセス１１００は、任意選択のクエリステップ１１１２に進み、代謝レベルに基づいてフィーディングを調整するかどうかを決定する。グルコース及び／又は乳酸レベルを監視することにより、細胞増殖システムの培地流量（例えばＩＣ培地流量）を調整して、例えば中空糸バイオリアクターのようなバイオリアクターでの細胞（例えばＴｒｅｇ）の増殖を促進することができる。
図１１Ｂ及び図１１Ｃに示すように、実施形態では、Ｔ細胞（例えば非限定的な例としてｈＴｒｅｇ）の増殖を伴う細胞増殖実験又は手順における乳酸値の制御が行われる。グラフ１１１８、１１３２は、グルコース及び乳酸レベルの測定値を使用して、例えば、Ｔ細胞（例えばＴｒｅｇ）の増殖を支援するために、細胞増殖システムの培地流量（例えばＩＣ培地の流量）を調整することを示す。例えば、図１１Ｂは、ｈＴｒｅｇの増殖の代謝を示すグラフ１１１８を提供し、ここでは、細胞増殖は、Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）細胞増殖システムのような細胞増殖システムで行われる。グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）１１２０及び乳酸濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）１１２２は、期間（例えば日数１１２６）にわたる種々の細胞増殖ラン１１２４、１１２５について示されている。これらのＴｒｅｇラン１１２４、１１２５では、例えば、４日目から８日目までの期間で、中空糸膜の内腔内において、ＩＣ入口（＋）ポンプ流量とＩＣ循環ポンプ流量の両方を同時に±０．１から±０．４ｍＬ／ｍｉｎに増やすことにより、増殖する細胞集団の乳酸値を約７ｍｍｏｌ／Ｌ以下の値になるように制御する。他の実施形態では、他のポンプ流量が使用されてもよい。示されているように、実施形態によれば、Ｔｒｅｇ細胞増殖中の最低グルコースレベルは、７日目の２６４ｍｇ／ｄＬの濃度１１２８（Ｑ１５８４）から８日目の２７９ｍｇ／ｄＬの濃度１１３０（Ｑ１５５８）までの範囲である。描かれているように、ラン１１２４の細胞増殖用培地中の開始グルコース濃度は、例えば３２５ｍｇ／ｄＬから３３５ｍｇ／ｄＬの範囲である。他の実施形態では、細胞の成長及び生存率を改善するために、乳酸レベルを約５ｍｍｏｌ／Ｌ以下に維持することが望ましい場合がある。さらに他の実施形態では、成長のための条件は、グルコース濃度を開始濃度のあるパーセンテージ分より上に維持することである。例えば、いくつかの実施形態では、ＩＣ入口（＋）ポンプ速度、ＩＣ循環ポンプ速度、ＥＣ入口（＋）ポンプ速度及び／又はＥＣ循環ポンプ速度は、グルコース濃度を、開始濃度の約２０％、開始濃度の約３０％、開始濃度の約４０％、開始濃度の約５０％、開始濃度の約６０％、開始濃度の約７０％、開始濃度の約８０％、開始濃度の約９０％、又は開始濃度の約１００％、より高く維持するように、増殖中に調整される。いくつかの実施形態では、グルコース濃度は、３００ｍｇ／ｄＬより上に維持される。実施形態では、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）要素を使用して、培地添加のレートを制御し、細胞の増殖中に解糖からの乳酸代謝老廃物を規定レベル未満に維持する。
図１１Ｃに目を向けると、グラフ１１３２は、ｈＴｒｅｇの増殖の代謝を示しており、そのような細胞増殖は、Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）細胞増殖システムのような細胞増殖システムで行われる。グルコース消費（ｍｍｏｌ／ｄａｙ）１１３４及び乳酸生成（ミリモル／日）１１３６は、期間１１４０（例えば日数）にわたる種々の細胞増殖ラン１１３８、１１３９について示されている。一実施形態では、例えば約７ｍｍｏｌ／Ｌ以下に乳酸値を制御するために、ＩＣ入口（＋）ポンプ流量及びＩＣ循環（−）ポンプ流量を±０．１から±０．４ｍＬ／ｍｉｎまで同時に増加させる。例えば、グラフ１１３２は、±０．１ｍＬ／ｍｉｎ（１１４２）、±０．２ｍＬ／ｍｉｎ（１１４４）、±０．３ｍＬ／ｍｉｎ（１１４６）及び±０．４ｍＬ／ｍｉｎ（１１４８）のＩＣ循環流量（ＩＣ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）とＩＣ供給流量（ＩＣ ｆｅｅｄ ｒａｔｅ）を示している。他の実施形態は、他の流量を使用してもよい。例えば、異なるタイプの細胞（例えば、他のＴ細胞）を増殖するとき、他の流量が使用されてもよい。また、いくつかの実施形態では、ＩＣ入口（＋）ポンプ速度及びＩＣ循環（−）ポンプ速度に加えて、ＥＣ入口ポンプ速度及びＥＣ循環速度を使用して、グルコース及び乳酸値を制御してもよい。図１１Ｂ及び図１１Ｃで使用及び表示されている流量は、説明のために提供されており、限定することを意図したものではない。ＩＣ入口ポンプの方向に対して正（＋）が示され、ＩＣ循環ポンプの方向に対して負（−）が示される場合があるが、このような方向は説明のみを目的として示されており、そのような方向は、使用するポンプの構成に依存する。
図１１Ａ及びオプションであるクエリステップ１１１２に戻ると、代謝活動を測定し及び／又はその測定に基づいてフィーディングレベルを調整することが望まれない場合、プロセス１１００は「ｎｏ」に進み、終了動作１１１６においてプロセス１１００は終了する。或いは、代謝活動に基づいてフィーディングレベルを調整することが望まれる場合、プロセス１１００は、「ｙｅｓ」に進み、任意選択のステップ１１１４において培地添加レートを増加して、増殖する細胞集団にフィーディングを続ける。ステップ１１１４は１つのステップとして示されているが、このステップは、例えば、ＩＣ入口流量の増加やＩＣ循環流量の増加やＥＣ入口流量の増加やＥＣ循環流量の増加等、培地添加レートに対して調整を行う複数のステップを含んでよい。ステップ１１１４は、例示目的のみのために１つのステップとして示されているが、限定することを意図していない。培地添加レートの調整に続いて、プロセス１１００は、オプションのクエリステップ１１１２に進み、代謝レベルの測定を継続するか、及び／又はフィーディングを調整するかを決定する。代謝活動の測定及び／又は代謝活動に基づくフィーディングレベルの調整を継続することが望まれない場合、プロセス１１００は「ｎｏ」に進み、終了動作１１１６においてプロセス１１００は終了する。図１１Ａ及びプロセス１１００は、レート又は流量の「増加」を示しているが、流量に対して他の調整が行われてもよい。例えば、あるフィーディング期間から次のフィーディング期間まで、レート又は流量は減少されてもよいし、実質的に同じに維持してもよい。行われる可能性のある調整のタイプは、成長している細胞集団の代謝活性評価に依存する。例えば、図１１Ａの流量の「増加」は、単に説明の目的で提供されており、限定することを意図したものではない。
次に、図１２は、本開示の実施形態による、ＣＥＳ５００（例えば、図５Ｂ及び図５Ｃ）等の細胞増殖システムを使用した細胞フィーディングの間、細胞を所与の位置に保持するためのプロセスの例示的な動作ステップ１２００を示す。開始動作１２０２が開始され、プロセス１２００は、ディスポーザブルセットを細胞増殖システムに装填し、該セットをプライミングし、ＩＣ／ＥＣ洗浄を実行し、培地を調整し、細胞（例えば、懸濁細胞又は非接着細胞）を投入するステップに進む。次に、プロセス１２００は、第１の期間の間、細胞に対してフィーディングを行うステップ１２０４に進む。実施形態では、第１入口流量及び第１循環流量が使用される。一例として、第１のＩＣ入口流量及び第１のＩＣ循環流量が使用され、ここでは、第１のＩＣ入口流量は、ＩＣ入口ポンプ（例えば第１ポンプ）によって生成されて制御され、第１のＩＣ循環流量は、ＩＣ循環ポンプ（例えば第２ポンプ）によって生成されて制御される。例示的な実施形態では、ＩＣ入口ポンプ（５５４）は、０．１ｍＬ／ｍｉｎの体積流量で、バイオリアクターのＩＣ入口ポート（５０１Ａ）に流入させ、ＩＣ循環ポンプ（５１２）は、−０．１ｍＬ／ｍｉｎの相補的なＩＣ循環体積流量又は流量で、バイオリアクター（５０１）のＩＣ出口ポート（５０１Ｂ）に流入させる。ここで、例えば、−０．１ｍＬ／ｍｉｎで使用される負の記号（「−」）は、細胞培養の成長フェーズの間、細胞がバイオリアクター内に維持されるように、ＩＣ循環ポンプの方向が対向流量を生じさせるすなわち発生させることを示している。他の実施形態では、第１のＩＣ循環流量は、第１のＩＣ入口流量のあるパーセンテージ分であってもよい。例えば、第１のＩＣ循環流量は、第１のＩＣ入口流量の約５０パーセント（５０％）すなわち約半分（１／２）、又はある実施形態では、他のパーセンテージ分すなわち他の割合であってよい。
細胞のフィーディング（及び増殖）の間及び正方向−対向流特性によるバイオリアクター内の細胞滞留制御を行うためのＩＣポンプの使用の間は、細胞は成長及び増殖し続ける。結果として、細胞は、増殖する集団を支援するために、追加の培地（例えばグルコース及び／又は細胞成長用培地）を必要とする。実施形態では、増殖する細胞集団に対してフィーディングを行うため、培地添加流量を増加することも行われる。例示的な実施形態では、ＩＣ入口ポンプ流量（＋）の増加は、ＩＣ入口流量を第１の量だけ増加させ、第２のＩＣ入口流量を達成する（ステップ１２０６）。例えば、一実施形態によれば、ＩＣ入口流量は、０．１ｍＬ／ｍｉｎの第１の量だけ増加されて、０．２ｍＬ／ｍｉｎの第２のＩＣ入口流量を達成する。他の実施形態によれば、ＩＣ入口流量に対して他の調整を行ってもよい。
次に、実施形態によれば、第２のＩＣ循環流量は、第２のＩＣ入口流量のあるパーセンテージ分、或いはある割合、或いはある比に等しくなるように設定又は調整又は構成される（ステップ１２０８）。例えば、第２のＩＣ循環流量は、一実施形態によれば、ＩＣ入口流量の値の約５０パーセント（５０％）すなわち約半分（１／２）、又は他の実施形態では、他のパーセンテージ分又は他の割合に等しくなるように設定又は調整又は構成される。一実施形態によれば、第１のＩＣ循環流量の値に応じて、ＩＣ循環ポンプ流量（−）の調整により、第２のＩＣ循環流量は増加される。他の実施形態では、ＩＣ循環ポンプ流量を調整して、第２のＩＣ循環流量を、該ＩＣ循環流量が第２のＩＣ入口流量の所定のパーセンテージ分又は所定の比率に実質的に等しくなるように、減少させる。さらに他の実施形態では、ＩＣ循環ポンプ流量の調整は行われなくてもよい。例えば、第１のＩＣ入口流量が０．１ｍＬ／ｍｉｎに等しく、第１のＩＣ循環流量が−０．１ｍＬ／ｍｉｎに等しい場合、第２のＩＣ入口流量が０．２ｍＬ／ｍｉｎに増加すると、第２のＩＣ循環流量は、（−１／２）＊（第２のＱIC Inlet）（ここでＱIC InletはＩＣ入口流量）すなわち（−１／２）＊（０．２ｍＬ／ｍｉｎ）に設定され、これにより−０．１ｍＬ／ｍｉｎの第２のＱIC Circが与えられる（ここで、ＱIC CircはＩＣ循環流量）。従って、ＩＣ循環ポンプ流量を調整せずに、第２のＱIC Circが達成される。
図５Ｂ及び図５Ｃは、本開示の実施形態による、第１循環路内の流体の動きを示す細胞増殖システム５００の動作構成を示す。図５Ｂ及び図５Ｃの構成は、例えば、細胞成長チャンバー内又はバイオリアクター内に細胞を保持するための、ＩＣ入口ポート（例えば、第１ポート）及びＩＣ出口ポート（例えば、第２ポート）への流量の分割を示す。上記のＣＥＳ５００に関して説明したように、ＩＣループ又は第１の循環路５０２では、流体は最初にＩＣ入口ポンプ５５４によって前進する。このような流体は、第１の方向（例えば正方向）に前進する。流体は、ＩＣ入口ポート５０１Ａを介して細胞成長チャンバー又はバイオリアクター５０１に流入し、細胞成長チャンバー又はバイオリアクター５０１の中空糸を通って流れ、ＩＣ出口ポート５０１Ｂを介して流出する。培地は、培地流量を制御するために使用されるＩＣ循環ポンプ５１２を通って流れる。ＩＣ循環ポンプは、第１の方向又は第１の方向と反対の第２の方向に流体をポンピングする。出口ポート５０１Ｂは、例えば、逆方向における入口として使用されてもよい。一実施形態では、ＩＣ循環ポンプ５１２は、例えば、ＩＣ入口ポンプの方向とは反対の方向に流体をポンピングする。例として、ＩＣ入口ポンプの方向は正（＋）であり、ＩＣ循環ポンプの方向は負（−）であり、従って、バイオリアクターの両側に流体が入るように対向流が発生し、細胞がバイオリアクター内に保持される。
一実施形態では、流体の第１の部分は、接続部５１７で分岐して、バイオリアクター５０１のＩＣ入口ポート（５０１Ａ）に流れ込む。ある実施形態では、ＩＣ循環ポンプ５１２は、流体の第２の部分が、接続部５１７で分岐してバイオリアクター５０１のＩＣ出口ポート（５０１Ｂ）に流入するように、（反対方向であるが）ＩＣ入口ポンプ５５４の流量にマッチングした、或いは略又は実質的にマッチングしたポンプ流量で動作する。例えば、＋０．１ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ入口ポンプ流量に対して、相補的なＩＣ循環ポンプ流量が−０．１ｍＬ／ｍｉｎになるようにマッチングさせるか、略マッチングさせて、細胞培養の増殖期の間、細胞をバイオリアクター内に維持する。フィーディング中のこのようなポンプ調整手法は、ＩＣ出口ポートからの細胞の損失に関連する力に対抗する。一実施形態によれば、ポンプ調整によってバイオリアクターのＩＣ入口ポート（５０１Ａ）への流れとＩＣ出口ポート（５０１Ｂ）への対向流を引き起こすタイプのフィーディングは、修正されたフィーディング方法と呼ばれる。他の例示的な実施形態では、ＩＣ循環ポンプ流量を調整して、ＩＣ出口ポート（５０１Ｂ）への流量を、ＩＣ入口流量の約５０パーセント（５０％）すなわち約半分（１／２）、或いは他の実施形態では他のパーセンテージ分又は他の割合、に等しくする（但し、方向は逆）。例えば、ＩＣ入口ポンプ流量が０．４ｍＬ／ｍｉｎの場合、ＩＣ循環ポンプ流量は、約−０．２ｍＬ／ｍｉｎに設定又は構成又は調整される。他の実施形態では、他のパーセンテージ分又は他の割合を使用してもよい。
図５Ｂ及び図５Ｃは、実施形態に従って、細胞成長チャンバー又はバイオリアクター５０１内に細胞を維持するための正方向流量及び対向流量が示される、ＣＥＳ５００における流体の動きを示す動作構成を示す。例えば、そのような流量は、図５Ｂにおいて、「Ｘ」流量５０３、「（−１／２）Ｘ」流量５０５（負の記号（「−」）は方向を示し、流量５０５の方向は図５Ｂの方向矢印で示されている）、「（１／２）Ｘ」流量５０７、として示されている。ここで、流量の約１／２、すなわち第１の部分は接続部５１７で分岐してバイオリアクター５０１のＩＣ入口ポート（５０１Ａ）に入り、流量の約１／２、すなわち第２の部分は、接続部５１７で分岐して、バイオリアクター５０１のＩＣ出口ポート（５０１Ｂ）に入る。示されるように、第１の部分と第２の部分の合計は、総流量５０３に実質的に等しく、総流量５０３はＩＣ入口ポンプ５５４によってポンピングされる。細胞をバイオリアクター又は細胞成長チャンバー５０１に保持するために使用される正方向流量−対向流量に応じて、ＩＣ入口ポンプ流量の他のタイプの割合又はパーセンテージ分を使用して、ＩＣ循環ポンプを設定又は構成又は調整してもよい。そのような場合として、図５Ｃは、以下のような流量が示されている。すなわち、「Ｘ」流量５１１、「−（ｙ％）＊Ｘ」流量５１３（ここで負の記号（「−」）は方向を示しており、流量５１３の方向は図５Ｃの方向矢印によって示される）、「（１００％−ｙ％）＊Ｘ」流量５１５が示されている。ここで、「ｙ」はあるパーセンテージに等しい。実施形態では、流量５１３と流量５１５との合計は、流量５１１に実質的に等しい。
一実施形態において、第１の流体流路５０６からの流れの全て、又は実質的に全ては、例えば、接続部５１７からバイオリアクター５０１のＩＣ入口ポート（５０１Ａ）に流入する。他の実施形態では、第１の流体流路５０６からの流れの全て、又は実質的に全ては、接続部５１７からバイオリアクター５０１のＩＣ出口ポート（５０１Ｂ）に流入する。さらに他の実施形態では、第１の流体流路５０６からの流れの第１の部分は接続部５１７からＩＣ入口ポート（５０１Ａ）に流入し、第１の流体流路５０６からの流れの第２の部分は接続部５１７からＩＣ出口ポート（５０１Ｂ）に流入する。実施形態では、ＩＣ循環流量が設定され得るＩＣ入口流量のパーセンテージ分は、約０パーセントから約１００パーセントの範囲である。他の実施形態では、そのパーセンテージ分は約２５パーセントから約７５パーセントの間である。他の実施形態では、そのパーセンテージ分は約４０パーセントから約６０パーセントの間である。他の実施形態では、そのパーセンテージ分は約４５パーセントから約５５パーセントの間である。実施形態では、そのパーセンテージ分は約５０パーセントである。図５Ｂ及び図５Ｃに示される動作構成は、細胞増殖システムの様々な動作の可能な構成を表し、示される構成への修正は、１又は複数の本実施形態の範囲内であることを理解されたい。
図１２に戻ると、細胞に対して、第２の入口流量及び第２の循環流量で第２の期間、フィーディング（及び継続的に増殖）が行われ（ステップ１２１０）、バイオリアクター内及びヘッダーの外側及びバイオリアクター外側のＩＣ循環路の一部に細胞が維持される。第２の期間のフィーディング（ステップ１２１０）に続いて、例えば、細胞のフィーディング及び／又は増殖を継続することが望まれない場合、プロセス１２００は、終了動作１２１６で終了する。或いは、任意選択可能であるが、プロセス１２００は、フィーディング流量の増加又はそうでなければ変更を続けることができる（ステップ１２１２）。省略記号１２１４で表されるように、任意の数のフィーディング期間があってもよい。所望の数のフィーディング期間１２１４に続いて、プロセス１２００は終了動作１２１６で終了する。図１２及びプロセス１２００は、流量の「増加」を示しているが、流量に対する他の調整を行ってもよい。例えば、流量は、あるフィーディング期間から次のフィーディング期間まで減少させてもよいし、実質的に同じままでもよい。例えば、代謝活動等を考慮することで、流量をどのように調整するかを決定してもよい。図１２の流量の「増加」は、単に説明の目的で提供されており、限定することを意図したものではない。
次に、図１３は、本開示の実施形態による、ＣＥＳ５００（例えば、図５Ｂ及び図５Ｃ）等の細胞増殖システムを使用した、細胞を第１の位置（例えば、バイオリアクター）に保持しながら細胞へのフィーディングを行うためのプロセスの例示的な動作ステップ１３００を示す。開始動作１３０２が開始され、プロセス１３００は、ディスポーザブルセットを細胞増殖システムに装填し、該セットをプライミングし、ＩＣ／ＥＣ洗浄を実行し、培地を調整し、細胞（例えば、懸濁細胞又は非接着細胞）を投入するステップに進む。次に、プロセス１３００は、第１の期間の間、細胞に対してフィーディングを行うステップ１３０４に進む。実施形態では、第１入口流量及び第１循環流量が使用される。一例として、第１のＩＣ入口流量及び第１のＩＣ循環流量が使用され、ここでは、第１のＩＣ入口流量は、ＩＣ入口ポンプ（例えば第１ポンプ）によって生成されて制御され、第１のＩＣ循環流量は、ＩＣ循環ポンプ（例えば第２ポンプ）によって生成されて制御される。例示的な実施形態では、第１ＩＣ入口ポンプは、０．１ｍＬ／ｍｉｎの体積流量で、バイオリアクターのＩＣ入口ポートに流入させ、−０．１ｍＬ／ｍｉｎである相補的なＩＣ循環ポンプ流量は、−０．１ｍＬ／ｍｉｎの体積流量を引き起こし、その流量でバイオリアクターのＩＣ出口ポート（５０１Ｂ）に流入させる。ここで、例えば、−０．１ｍＬ／ｍｉｎで使用される負の記号（「−」）は、細胞培養の成長期の間、細胞がバイオリアクター内に維持されるように、ＩＣ循環ポンプ（５１２）の方向が対向流量を生じさせるすなわち発生させることを示している。他の実施形態では、第１のＩＣ循環流量は、第１のＩＣ入口流量のあるパーセンテージ分すなわちある割合であってもよい。例えば、第１のＩＣ循環流量は、第１のＩＣ入口流量の約５０パーセント（５０％）すなわち約半分（１／２）、又はある実施形態では、他のパーセンテージ分すなわち他の割合であってよい。
細胞のフィーディング（及び増殖）の間及び正方向流・対向流特性によりバイオリアクター内の細胞滞留を制御するためのＩＣポンプの使用中は、細胞は成長及び増殖し続ける。結果として、細胞は、増殖する集団を支援するために、追加の培地（例えばグルコース及び／又は細胞成長用培地）を必要とする。実施形態では、増殖する細胞集団に対してフィーディングを行うため、培地添加流量を増加することが行われる。例示的な実施形態では、ＩＣ入口ポンプ流量（＋）の増加は、ＩＣ入口流量を第１の量だけ増加させ、第２のＩＣ入口流量を達成する（ステップ１３０６）。例えば、一実施形態によれば、ＩＣ入口流量は、０．１ｍＬ／ｍｉｎの第１の量だけ増加されて、０．２ｍＬ／ｍｉｎの第２のＩＣ入口流量を達成する。他の実施形態によれば、ＩＣ入口流量に対して他の調整を行ってもよい。
次に、実施形態によれば、第２のＩＣ循環流量は、第２のＩＣ入口流量のある割合、ある部分、又はある比に等しくなるように設定又は構成又は調整される（ステップ１３０８）。例えば、第２のＩＣ循環流量は、一実施形態によれば、ＩＣ入口流量の値の約５０パーセント（５０％）すなわち約半分（１／２）、又は他の実施形態では、他のパーセンテージ分又は他の比率に等しくなるように設定又は構成又は調整される。一実施形態において、第１の流体流路５０６からの流れの全て、又は略全ては、例えば、接続部５１７からバイオリアクター５０１のＩＣ入口ポート（５０１Ａ）に流入する。他の実施形態では、第１の流体流路５０６からの流れの全て、又は略全ては、接続部５１７からバイオリアクター５０１のＩＣ出口ポート（５０１Ｂ）に流入する。さらに他の実施形態では、第１の流体流路５０６からの流れの第１の部分は接続部５１７からＩＣ入口ポート（５０１Ａ）に流入し、第１の流体流路５０６からの流れの第２の部分は接続部５１７からＩＣ出口ポート（５０１Ｂ）に流入する。実施形態では、ＩＣ循環流量が設定され得るＩＣ入口流量のパーセンテージ分は、約０パーセントから約１００パーセントの範囲である。他の実施形態では、そのパーセンテージ分は約２５パーセントから約７５パーセントの間である。他の実施形態では、そのパーセンテージ分は約４０パーセントから約６０パーセントの間である。他の実施形態では、そのパーセンテージ分は約４５パーセントから約５５パーセントの間である。実施形態では、そのパーセンテージ分は約５０パーセントである。
一実施形態によれば、第１のＩＣ循環流量の値に応じて、ＩＣ循環ポンプ流量（−）の調整により、第２のＩＣ循環流量は増加される。他の実施形態では、ＩＣ循環ポンプ流量を調整して、第２のＩＣ循環流量を、第２のＩＣ循環流量が第２のＩＣ入口流量の所定の割合又は所定の比率に実質的に等しくなるように、減少させる。さらに他の実施形態では、ＩＣ循環ポンプ流量の調整は行われなくてもよい。例えば、第１のＩＣ入口流量が０．１ｍＬ／ｍｉｎに等しく、第１のＩＣ循環流量が−０．１ｍＬ／ｍｉｎに等しい場合、第２のＩＣ入口流量が０．２ｍＬ／ｍｉｎに増加すると、第２のＩＣ循環流量は、（−１／２）＊（第２のＱIC Inlet）すなわち（−１／２）＊（０．２ｍＬ／ｍｉｎ）に設定され、これにより−０．１ｍＬ／ｍｉｎの第２のＱIC Circが与えられる。従って、ＩＣ循環ポンプ流量を調整せずに、第２のＱIC Circが達成される。
そして、細胞に対して、第２の入口流量及び第２の循環流量で第２の期間、フィーディング（及び継続的に増殖）が行われ（ステップ１３１０）、バイオリアクター内及びヘッダーの外側又はバイオリアクター外側のＩＣ循環路の一部に細胞が維持される。第２の期間のフィーディング（ステップ１３１０）に続いて、例えば、細胞のフィーディング及び／又は増殖を継続することが望まれない場合、プロセス１３００は、終了動作１３１６で終了する。
実施形態では、第１の期間、第２の期間、第３の期間、第４の期間、第５の期間等は、それぞれ１日以上（及び／又は１時間以上及び／又は１分以上）である。例えば、実施形態によれば、期間は１日から１４日である。しかしながら、他の実施形態では、期間は１日未満又は１４日を超えてもよい。一実施形態では、例えば、フィーディングの第１の期間は、０日目、１日目、２日目、３日目、４日目を含み、フィーディングの第２の期間は５日目を含み、フィーディングの第３の期間は６日目を含み、フィーディングの第４の期間は７日目を含む。他の実施形態では、第１の期間は、０日目、１日目、及び２日目（例えば、約３日間の継続時間）を含み、第２の期間は、３日目、４日目、及び５日目（例えば、約３日間の継続時間）を含み、第３の期間は、６日目、７日目、及び８日目（例えば、約３日間の継続時間）を含み、第４の期間は、９日目と１０日目（例えば、約２日の継続時間）を含み、第５の期間は、１１日目、１２日目、及び１３日目（例えば、約３日間の継続時間）を含む。さらに他の実施形態では、第１の期間は、第０日、第１日（例えば、約２日の期間）を含み、第２の期間は、２日目（例えば、約１日の期間）を含み、第３の期間は、３日目の半分（例えば、約０．５日の期間）を含み、第４の期間は、３日目の半分（例えば、約０．５日の期間）を含み、第５の期間は、４日目の半分（例えば、約０．５日の期間）を含み、第６の期間は、４日目の半分（例えば、約０．５日の期間）を含み、第７の期間は、５日目の半分（例えば、約０．５日の期間）を含み、第８の期間は、５日目の半分（例えば、約０．５日の期間）を含み、第９の期間は、６日目の半分（例えば、約０．５日の期間）を含み、第１０の期間は、６日目の半分（例えば、約０．５日の期間）を含み、第１１の期間は、７日目の半分（例えば、約０．５日の期間）を含み、第１２の期間は、７日目の半分（例えば、約０．５日の期間）を含む。実施形態によれば、期間は異なる期間であってよい。各期間は、日、時間、分、及び／又はそれらの一部の単位で測定される。
図１３に戻ると、プロセス１３００は、オプションとしてクエリステップ１３１２に進み、代謝活動又は代謝レベルに基づいてフィーディングレート又は流量を調整するかどうかを決定する。例えば、Ｔｒｅｇの増殖では、増殖する細胞集団の乳酸値を約７ｍｍｏｌ／Ｌ以下の値に制御することが望ましい場合がある。例えば、細胞培養乳酸値を約７ｍｍｏｌ／Ｌ以下に維持することが望ましい場合、細胞（例えば制御性Ｔ細胞）の増殖中に培地添加の流量が制御される。他の実施形態では、細胞の成長及び生存率を改善するために、乳酸レベルを約５ｍｍｏｌ／Ｌ以下に維持することが望ましい場合がある。さらに他の実施形態では、乳酸レベルを約２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下に、又は約１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下に、又は約１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下に維持することが望ましい場合がある。実施形態では、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）要素を使用して、培地添加のレートを制御し、細胞の増殖中に解糖からの乳酸代謝老廃物を規定レベル未満に維持する。
オプションであるクエリステップ１３１２において、代謝活動を測定し及び／又はその測定に基づいてフィーディングレベルを調整することが望まれない場合、プロセス１３００は「ｎｏ」に進み、終了動作１３１６においてプロセス１３００は終了する。或いは、代謝活動に基づいてフィーディングレベルを調整することが望まれる場合、プロセス１３００は、「ｙｅｓ」に進み、任意選択のステップ１３１４において培地添加レートを増加して、増殖する細胞集団にフィーディングを続ける。ステップ１３１４は１つのステップとして示されているが、このステップは、例えば、ＩＣ入口流量の増加やＩＣ循環流量の増加等、培地添加レートに対して調整を行う複数のステップを含んでよい。ステップ１３１４は、例示目的のみのために１つのステップとして示されているが、限定することを意図していない。培地添加レートの調整に続いて、プロセス１３００は、オプションのクエリステップ１３１２に戻り、代謝レベルの測定を継続するか、及び／又はフィーディングを調整するかを決定する。代謝活動に基づくフィーディングレベルの調整が望まれない場合、プロセス１３００は「ｎｏ」に進み、終了動作１３１６においてプロセス１３００は終了する。図１３及びプロセス１３００は、レート又は流量の「増加」を示しているが、流量に対して他の調整が行われてもよい。例えば、あるフィーディング期間から次のフィーディング期間まで、レート又は流量は減少されてもよいし、実質的に同じに維持してもよい。行われる可能性のある調整のタイプは、成長している細胞集団の代謝活性評価に依存する。例えば、図１３の流量の「増加」は、単に説明の目的で提供されており、限定することを意図したものではない。
次に、図１４は、本開示の実施形態による、ＣＥＳ５００（図５Ｂ及び図５Ｃ）等の細胞増殖システムで使用され得る、フィーディング中に細胞を保持するプロセスの例示的な動作ステップ１４００を示す。開始動作１４０２が開始され、プロセス１４００は、ディスポーザブルチューブセット又はプリマウントされた流体移送アセンブリ（例えば、２１０又は４００）を細胞増殖システムに装填するステップ１４０４に進む。次に、ステップ１４０６において、システムに対してプライミングを行う。一実施形態では、例えば、ユーザ又はオペレータは、例えばプライミングのためのタスクを選択することによってプライミングを行うようにシステムに命令を与える。一実施形態では、プライミングのためのそのようなタスクは、例えば、事前にプログラムされたタスクである。次に、ステップ１４０８において、ＩＣ／ＥＣ洗浄タスクが実行される。ここでは、ＩＣ循環ループ及びＥＣ循環ループ上の流体が例えば交換される。一実施形態によれば、交換体積は、交換されるＩＣ容積及びＥＣ容積の数によって決定される。
次に、バイオリアクター膜の中空糸にわたって適切な又は所望のガス濃度を維持するために、培地調整ステップ１４１０を実行して、細胞がバイオリアクターに投入される前に培地がガス供給と平衡に達するようにする。例えば、ＥＣ循環流量を調整することにより、ガス移送モジュール（ＧＴＭ）又は酸素供給器によって提供されるガス供給と培地との接触を行うことができる。次いで、例えば、ユーザ又はオペレータが細胞をバイオリアクターに投入する準備ができるまで、システムは適切な状態又は望ましい状態に維持される。一実施形態では、システムは、例えば完全培地等の培地で調整されてもよい。完全培地は、細胞成長に使用される任意の培地源であってよい。一実施形態では、システムは、例えば、無血清培地で調整される。一実施形態では、システムは基礎培地で調整される。当業者によって理解される任意のタイプの培地が使用されてよい。
プロセス１４００は、次に、例えば、細胞投入バッグからバイオリアクターに細胞を投入するステップ１４１２に進む。一実施形態では、細胞投入バッグ内の細胞は、例えば、細胞フィーディングステップ１４１４を行うための培地を含む溶液中にある。他の実施形態では、細胞投入バッグ内の細胞は、細胞フィーディングステップ１４１４を行うための培地と、細胞（例えばＴ細胞又はＴｒｅｇ）を刺激する可溶性アクチベーター複合体との両方を含む溶液中にある。実施形態において、細胞は、増殖を刺激するため、ビーズを使用して活性化される。これらの実施形態では、ビーズは、細胞を投入する前に、培地中で細胞と混合されてもよい。一実施形態では、細胞（及びある実施形態ではフィーディング溶液）は、細胞投入バッグが空になるまで、細胞投入バッグからバイオリアクターに投入される。細胞（及びある実施形態ではフィーディング溶液、他の実施形態ではビーズ）は、空気除去チャンバーからバイオリアクターに移動させてもよい。一実施形態では、「均一な懸濁で細胞を投入する」タスクを実行して、細胞（及び実施形態ではフィーディング溶液）を投入する。他の実施形態では、「循環なしで細胞を中央に投入する」タスクを実行して、バイオリアクターの特定の領域（例えば中央）に細胞（及び実施形態ではフィーディング溶液）を投入する。実施形態によれば、他の投入方法及び／又は投入タスクを使用してもよい。
次に、プロセス１４００はクエリステップ１４１６に進み、バイオリアクター（例えば中空糸バイオリアクター）で、細胞（例えばＴ細胞又はＴｒｅｇ）の非接着細胞又は懸濁細胞を保持するために修正されたフィーディング方法を使用するかどうかを決定する。例えば、細胞を、バイオリアクター自体及びバイオリアクターのヘッダーの外部又はＩＣループの残りの部分の外部に配置することが望ましい場合がある。バイオリアクター自体に細胞を保持するために修正されたフィーディング方法を使用することが望まれない場合、プロセス１４００は「ｎｏ」に進み、ステップ１４２６において細胞を増殖する。そこで、細胞は、ステップ１４１４において最初に細胞と共に供給された培地を使用して成長／増殖し続ける。
他方、細胞をバイオリアクター自体に保持することが望まれる場合、プロセス１４００は「ｙｅｓ」に進み、修正されたフィーディングステップ１４１８を行う。そこでは、バイオリアクター（５０１）のＩＣ入口ポート（５０１Ａ）への流量及びバイオリアクター（５０１）のＩＣ出口ポート（５０１Ｂ）への流量を使用して細胞をバイオリアクターに保持することによって、細胞へのフィーディングを行う。そうすることで、入口体積流量又は入口流量を第１の流体流路（５０６）に導入することができる（ステップ１４２０）。例えば、ＩＣ入口流量を流体流路（５０６）に導入することができる（ステップ１４２０）。ＩＣ入口ポンプ（５５４）（例えば第１蠕動ポンプ（一実施形態））は、所定の回転数（ＲＰＭ）で動作して、所定のＩＣ入口体積流量又はＩＣ入口流量を第１の流体流路（５０６）に生じさせることができる（ステップ１４２０）。一実施形態によれば、プロセッサ及び／又はコントローラは、例えば、所定の数のＲＰＭで動作するように、第１ポンプ及び／又は第２ポンプを指示又は制御する。ＩＣ循環ポンプ（５１２）の流量と方向に応じて、修正された第１の流量又はＩＣ入口流量の第１の部分が、バイオリアクター（５０１）のＩＣ入口ポート（５０１Ａ）又は第１のポートに入る（ステップ１４２２）。ポンプ（例えば蠕動ポンプ）のポンプ流量は、ポンプの直径又はポンプの構成に依存する。他のタイプのポンプを使用してもよい。この場合、ポンプ流量は使用するポンプの構成に依存する。ＩＣ循環ポンプ（５１２）（例えば第２蠕動ポンプ（一実施形態））は、所定の回転数（ＲＰＭ）で、第１のポンプの方向とは反対の方向に作動して、所定のＩＣ循環流量、又は第２流量、又はＩＣ入口流量の第２の部分を発生或いは生成し、バイオリアクター（５０１）のＩＣ出口ポート（５０１Ｂ）すなわち第２ポートに入る（ステップ１４２４）。例えば、実施形態では、ＩＣ入口流量の約１／２、すなわち第１の部分は接続部５１７で分岐してバイオリアクター５０１のＩＣ入口ポート（５０１Ａ）に入り、ＩＣ入口流量の約１／２、すなわち第２の部分は、接続部５１７で分岐して、バイオリアクター５０１のＩＣ出口ポート（５０１Ｂ）に入る。示されるように、第１の部分と第２の部分の合計は、ＩＣ入口流量５０３（例えば、図５Ｂ）に実質的に等しく、ＩＣ入口流量５０３はＩＣ入口ポンプ５５４によってポンピングされる。細胞をバイオリアクター又は細胞成長チャンバー５０１に保持するために使用される正方向流量及び対向流量に応じて、ＩＣ入口ポンプ流量の他のタイプの割合又は他のパーセンテージ分を使用して、ＩＣ循環ポンプを設定又は構成又は調整してもよい。
細胞をバイオリアクター内に保持するためのそのような正方向流・対向流特性を使用して細胞にフィーディングした後、プロセス１４００は細胞成長／増殖ステップ１４２６に進む。細胞の増殖はステップ１４２６に示されているが、細胞は、例えばステップ１４１２、１４１４、１４１６、１４１８、１４２０、１４２２、１４２４のような１又は複数の他のステップ中に成長／増殖してもよい。増殖ステップ１４２６から、プロセス１４００は、細胞の収穫又は除去のステップ１４３０に進む。そして、プロセス１４００は終了動作１４３２で終了する。実施形態によれば、収穫前に他のステップ（例えば、第２の修正されたフィーディング方法又は他のタイプのフィーディング方法を継続する等）が望まれる場合、プロセス１４００は、オプションの「その他」ステップ１４２８に進む。オプションのステップ１４２８から、プロセス１４００はバイオリアクターから細胞を収穫又は除去するステップ１４３０に進み、プロセス１４００は終了動作１４３２で終了する。
次に、図１５Ａは、本開示の実施形態による、ＣＥＳ５００（図５Ｂ及び図５Ｃ）等の細胞増殖システムで使用され得る、細胞にフィーディングを行って細胞を第１の位置（例えばバイオリアクター）に保持するプロセスの例示的な動作ステップ１５００を示す。開始動作１５０２が開始され、プロセス１５００は、ディスポーザブルチューブセット又はプリマウントされた流体移送アセンブリ（例えば、２１０又は４００）を細胞増殖システムに装填するステップ１５０４に進む。次に、ステップ１５０６において、システムに対してプライミングを行う。一実施形態では、例えば、ユーザ又はオペレータは、例えばプライミングのためのタスクを選択することによってプライミングを行うようにシステムに命令を与える。一実施形態では、プライミングのためのそのようなタスクは、例えば、事前にプログラムされたタスクである。次に、ステップ１５０８において、ＩＣ／ＥＣ洗浄タスクが実行される。ここでは、ＩＣ循環ループ及びＥＣ循環ループ上の流体が例えば交換される。一実施形態によれば、交換体積は、交換されるＩＣ容積及びＥＣ容積の数によって決定される。
次に、バイオリアクター膜の中空糸にわたって適切な又は所望のガス濃度を維持するために、培地調整ステップ１５１０を実行して、細胞がバイオリアクターに投入される前に培地がガス供給と平衡に達するようにする。例えば、ＥＣ循環流量を調整することにより、ガス移送モジュール（ＧＴＭ）又は酸素供給器によって提供されるガス供給と培地との接触を行うことができる。次いで、例えば、ユーザ又はオペレータが細胞をバイオリアクターに投入する準備ができるまで、システムは適切な状態又は望ましい状態に維持される。一実施形態では、システムは、例えば完全培地等の培地で調整されてもよい。完全培地は、細胞成長に使用される任意の培地源であってよい。一実施形態では、システムは、例えば、無血清培地で調整される。一実施形態では、システムは基礎培地で調整される。当業者によって理解される任意のタイプの培地が使用されてよい。
プロセス１５００は、次に、例えば、細胞投入バッグからバイオリアクターに細胞を投入するステップ１５１２に進む。一実施形態では、細胞投入バッグ内の細胞は、例えば、細胞フィーディングを行うための培地を含む溶液中にある。他の実施形態では、細胞投入バッグ内の細胞は、細胞フィーディングを行うための培地と、細胞（例えばＴｒｅｇのようなＴ細胞）を刺激する可溶性アクチベーター複合体との両方を含む溶液中にある。実施形態において、細胞は、増殖を刺激するため、ビーズを使用して活性化される。これらの実施形態では、ビーズは、細胞を投入する前に培地中で細胞と混合されてもよい。一実施形態では、細胞は、細胞投入バッグが空になるまで、細胞投入バッグからバイオリアクターに投入される。細胞（及び使用される場合はビーズ）は、空気除去チャンバーからバイオリアクターに移動させてもよい。一実施形態では、「均一な懸濁で細胞を投入する」タスクを実行して、細胞を投入する。他の実施形態では、「循環なしで細胞を中央に投入する」タスクを実行して、バイオリアクターの特定の領域（例えば中央）に細胞を投入する。実施形態によれば、他の投入方法及び／又は投入タスクを使用してもよい。
次に、プロセス１５００は、第１の期間の間に第１のプロセスに従って細胞をフィーディングするステップ１５１４に進む。一実施形態では、例えば、細胞集団が成長／増殖し始めであり、最小又は低いフィーディングレートでもそのような細胞集団のフィーディング要求を満たすことができる場合、細胞は最小又は低いフィーディングレートでフィーディングされる。例えば、０．１ｍＬ／ｍｉｎの第１の流体流量を引き起こす又は生成する＋０．１ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ入口ポンプ流量が、そのような第１の期間中に使用されてもよい。この例では、０．１ｍＬ／ｍｉｎのような低い又は最小のフィーディングレートを用いているが、実施形態によれば、低い又は最小のフィーディングレートは、約０．０１ｍＬ／ｍｉｎ以上且つ約０．１ｍＬ／ｍｉｎ以下であってよい。実施形態において、低い又は最小のフィーディングレートは、０．１ｍＬ／ｍｉｎより大きくてもよい。そのような第１の期間中に中空糸膜バイオリアクターからの細胞の損失を減らすことが望ましい場合、＋０．１ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ入口ポンプ流量を、相補的な−０．１ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ循環ポンプ流量にマッチングさせるか、略マッチングさせて、細胞培養の成長期において細胞をバイオリアクター内に維持する。他の実施形態では、他のポンプ流量及びその結果として生じる流体流量を使用してもよい。
次に、プロセス１５００はクエリステップ１５１６に進み、実施形態に従って、成長する細胞集団及び増加するフィーディング要求も考慮しながら、フィーディングレートを調整してバイオリアクター自体に細胞を保持するかどうかを決定する。例えば、図１５Ｂは、増加する細胞集団に応じて増加するフィーディングレートを示す。図１５Ｂでは、グラフ１５２８は、例えば、Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）細胞増殖システムのような細胞増殖システムでのラン又は手順のＩＣ流量に対する細胞数を示している。一実施形態では、ＩＣ流量は、細胞にフィーディングするための培地を含み、従って、ＩＣ培地流量とも呼ばれる。細胞の数１５３０は、ＩＣ流量（ｍＬ／ｍｉｎ）１５３２に対して示されている。示されるように、実施形態によれば、ＩＣ流量は、細胞の増加及び増殖する細胞集団の増加するふぃー要求と共に、０．１ｍＬ／ｍｉｎから０．２ｍＬ／ｍｉｎに、さらに０．３ｍＬ／ｍｉｎに増加する。示される実施形態では、線１５３４によって示されるように、細胞の数とＩＣ流量との間には略線形の関係がある。
図１５Ａ及びクエリステップ１５１６に戻って、フィーディングレートの調整が望まれない場合、プロセス１５００は「ｎｏ」に進み、ステップ１５２０において細胞を増殖する。この場合、ステップ１５１４における第１の期間のフィーディングで用いられた培地を使用して細胞の成長/増殖が継続される。ステップ１５２０に細胞の増殖が示されているが、細胞は、例えばステップ１５１２、１５１４、１５１６、１５１８等の１又は複数の他のステップ中に成長／増殖してもよい。一方、細胞をバイオリアクター内に保持しながらフィーディングレートを調整することが望ましい場合、プロセス１５００は「ｙｅｓ」に進み、ステップ１５１８において第２の期間中に第２のプロセスに従って細胞をフィーディングする。一実施形態では、そのような第２のプロセスは、例えば、第１の期間中と略同じフィーディングレートで細胞をフィーディングすることを含む。他の実施形態では、第２のプロセスは、第１の期間中に使用されるフィーディングレートと比較して異なるフィーディングレートで細胞をフィーディングすることを含む。一実施形態では、ＩＣ入口流量を増加させ、ＩＣ循環流量は、そのＩＣ入口流量のあるパーセンテージ分又はある割合又はある比率に等しくなるように設定、構成又は調整される。例えば、ＩＣ循環流量は、実施形態によれば、ＩＣ入口流量の値の約５０パーセント（５０％）すなわち約半分（１／２）、又は他のパーセンテージ又は割合に等しく設定されてよい。一実施形態によれば、ＩＣ循環流量を、ＩＣ入口流量のあるパーセンテージ分又はある割合又はある比率に設定又は構成又は調整するべきかどうかの決定は、ＩＣ入口流量の値に基づいて行われる。例えば、実施形態では、ＩＣ入口流量を使用して細胞をフィーディングするときにバイオリアクター内に細胞を保持するための以下の方法が提供される（ここで、ＱIC Circ＝ＩＣ循環流量（ｍＬ／ｍｉｎ）；ＱIC Inlet＝ＩＣ入口流量（ｍＬ／ｍｉｎ））。：
ＱIC Inlet ≧ ０．２ｍＬ／ｍｉｎの場合、
ＱIC Circ＝（−）ｌ／２＊ＱIC Inlet
及び
ＱIC Inlet ＝ ０．１ｍＬ／ｍｉｎの場合、
ＱIC Circ＝（−）ＱIC Inlet
上記の式は、ＩＣ入口流量の値（例：０．２ｍＬ／ｍｉｎ又は０．１ｍＬ／ｍｉｎ）によってＩＣ循環流量の計算が異なるが、他の実施形態では、そのような計算において、異なるＩＣ入口流量の値を使用してもよい。さらに、この例では約５０パーセント（５０％）すなわち約半分（１／２）が使用されているが、他のパーセンテージ、他の比率、他の分数及び／又は他の割合が、実施形態に従って使用されてもよい。プロセス１５００に戻り、ステップ１５１８の第２のプロセスの一部として、細胞をバイオリアクター内に保持するためのそのような正方向流・対向流特性を使用して細胞にフィーディングした後、プロセス１５００は細胞成長／増殖ステップ１５２０に進む。細胞の増殖はステップ１５２０に示されているが、細胞は、例えばステップ１５１２、１５１４、１５１６、１５１８のような１又は複数の他のステップ中に成長／増殖してもよい。増殖ステップ１５２０から、プロセス１５００は、細胞の収穫又は除去のステップ１５２４に進む。そして、プロセス１５００は終了動作１５２６で終了する。実施形態によれば、収穫前に他のステップが望まれる場合、プロセス１５００は、オプションの「その他」ステップ１５２２に進む。オプションのステップ１５２２から、プロセス１５００はバイオリアクターから細胞を収穫又は除去するステップ１５２４に進み、プロセス１５００は終了動作１５２６で終了する。
次に、図１６は、本開示の実施形態による、ＣＥＳ５００（例えば、図５Ｂ及び図５Ｃ）等の細胞増殖システムと共に使用され得る細胞をフィーディングするためのプロセスの例示的な動作ステップ１６００を示す。ＳＴＡＲＴ動作１６０２が開始され、ディスポーザブルセットが細胞増殖システムに装填され、該システムはプライミングされ、ＩＣ／ＥＣ洗浄が実行され、培地が調整され、細胞が投入される。次に、プロセス１６００は、第１の期間の間に第１のプロセスに従って細胞をフィーディングするステップ１６０４に進む。一実施形態では、例えば、細胞集団が成長／増殖し始めであり、最小又は低いフィーディングレートでもそのような細胞集団のフィーディング要求を満たすことができる場合、細胞は最小又は低いフィーディングレートでフィーディングされる。例えば、＋０．１ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ入口ポンプ流量が、そのような第１の期間中に使用されてもよい。この例では、０．１ｍＬ／ｍｉｎのような低い又は最小のフィーディングレートを用いているが、実施形態によれば、低い又は最小のフィーディングレートは、約０．０１ｍＬ／ｍｉｎ以上且つ約０．１ｍＬ／ｍｉｎ以下であってよい。実施形態において、低い又は最小のフィーディングレートは、０．１ｍＬ／ｍｉｎより大きくてもよい。そのような第１の期間中に中空糸膜バイオリアクターからの細胞の損失を減らすことが望ましい場合、＋０．１ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ入口ポンプ流量を、相補的な−０．１ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ循環ポンプ流量にマッチングさせるか、略マッチングさせて、細胞培養の成長期において細胞をバイオリアクター内に維持する。
次に、プロセス１６００はクエリステップ１６０６に進み、成長する細胞集団を考慮するため及び／又は細胞をバイオリアクターに継続維持させるため、フィーディングレートを調整すべきかどうかを決定する。細胞をバイオリアクター内に保持しながらフィーディングレートを調整することが望ましい場合、プロセス１６００は「ｙｅｓ」に進み、ステップ１６０８において第２の期間中に第２のプロセスに従って細胞をフィーディングする。一実施形態では、そのような第２のプロセスは、例えば、第１の期間中と略同じフィーディングレートで細胞をフィーディングすることを含む。他の実施形態では、第２のプロセスは、第１の期間中に使用されるフィーディングレートと比較して異なるフィーディングレートで細胞をフィーディングすることを含む。一実施形態では、ＩＣ入口流量を増加させ、ＩＣ循環流量は、そのＩＣ入口流量のあるパーセンテージ分又はある割合又はある比率に等しくなるように設定、構成又は調整される。例えば、ＩＣ循環流量は、実施形態によれば、ＩＣ入口流量の値の約５０パーセント（５０％）すなわち約半分（１／２）、又は他のパーセンテージ分又は他の割合に等しく設定されてよい。一実施形態によれば、ＩＣ循環流量を、ＩＣ入口流量のあるパーセンテージ分に設定するべきかどうかの決定は、ＩＣ入口流量の値に基づいて行われる。例えば、実施形態では、以下の方法が提供される（ここで、ＱIC Circ＝ＩＣ循環流量（ｍＬ／ｍｉｎ）；ＱIC Inlet＝ＩＣ入口流量（ｍＬ／ｍｉｎ））。：
ＱIC Inlet ≧ ０．２ｍＬ／ｍｉｎの場合、
ＱIC Circ＝（−）ｌ／２＊ＱIC Inlet
及び
ＱIC Inlet ＝ ０．１ｍＬ／ｍｉｎの場合、
ＱIC Circ＝（−）ＱIC Inlet
上記の式は、ＩＣ入口流量の値（例：０．２ｍＬ／ｍｉｎ又は０．１ｍＬ／ｍｉｎ）によってＩＣ循環流量の計算が異なるが、他の実施形態では、そのような計算において、異なるＩＣ入口流量の値を使用してもよい。さらに、この例では約５０パーセント（５０％）すなわち約半分（１／２）が使用されているが、他のパーセンテージ、他の比率、他の分数及び／又は他の割合が、実施形態に従って使用されてもよい。プロセス１６００に戻り、ステップ１６０８の第２のプロセスの一部として、細胞をバイオリアクター内に保持するためのそのような正方向流・対向流特性を使用して細胞にフィーディングした後、プロセス１６００は成長する細胞集団の代謝活動（例えば、グルコース消費及び／又は乳酸生成）をモニター又は測定するかどうかを決めるステップ１６１０に進む。代謝活動をモニターすることが望まれない場合、プロセス１６００は「ｎｏ」に進み、ステップ１６１６において細胞を増殖する。そこで、細胞は、第１の期間（ステップ１６０４）及び／又は第２の期間（ステップ１６０８）の間のフィーディング中に供給された培地を使用して成長／増殖を続けることができる。ステップ１６１６に細胞の増殖が示されているが、細胞は、例えば、１６０４、１６０６、１６０８、１６１０、１６１２、１６１４等の１又は複数の他のステップ中に成長／増殖してもよい。
クエリステップ１６１０に戻って、成長中の細胞集団の代謝活動をモニター又は測定することが望まれる場合、プロセス１６００は「ｙｅｓ」に進み、代謝活動及び／又はその測定に基づいて、第２のプロセスに従った細胞のフィーディングの継続又はフィーディングレートの調整に進む。一実施形態では、グルコース及び／又は乳酸レベルのモニターは、培地流量（例えばＩＣ流量）の調整を促進して、細胞（例えばＴｒｅｇのようなＴ細胞）のバイオリアクター（例えば中空糸バイオリアクター）での増殖を支援することができる。実施形態において、細胞培養乳酸値は、例えば約７ｍｍｏｌ／Ｌ未満に維持される。他の実施形態において、細胞培養乳酸値は、例えば、約１５ｍｍｏｌ／Ｌ未満に維持される。実施形態では、例えば、細胞増殖システムのグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）を使用して、培地添加の流量を制御することにより、解糖からの乳酸代謝老廃物を、細胞（例えば制御性Ｔ細胞）の増殖の間、例えば約７ｍｍｏｌ／Ｌ未満に、或いは、他のタイプのＴ細胞の増殖の間、約１５ｍｍｏｌ／Ｌ未満に維持する。他の実施形態では、例えば培地添加の流量及び／又は他の設定を制御して、例えば細胞成長及び生存率を改善するために、乳酸レベルは約５ｍｍｏｌ／Ｌに維持される。他の実施形態では、乳酸は、約３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、約２５ｍｍｏｌ／Ｌ以下、約２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、約１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下、又はさらには約１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下に維持されてもよい。他の実施形態では、他の濃度が使用されてもよい。
例えば、代謝測定値及び乳酸の所望のレベルに応じて、プロセス１６００は、第２のプロセスに従って細胞の供給を続けるか（ステップ１６１２）、フィーディングレートを調整するか（ステップ１６１４）のいずれかに進む。例えば、ある実施形態では、代謝活動の測定が約５ｍｍｏｌ／Ｌ以下の乳酸レベルを示す場合、或いは他の実施形態では、約１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下の乳酸レベルを示す場合、第２のプロセスに従って、細胞フィーディングが続けられる（ステップ１６１２）。他の実施形態では、代謝活動の測定が約７ｍｍｏｌ／Ｌ以下或いは約１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下の乳酸レベルを示す場合、第２のプロセスに従って、細胞フィーディングが続けられる（ステップ１６１２）。第２のプロセス１６１２に従って細胞をフィーディングし続けるステップ１６１２から、プロセス１６００はクエリステップ１６１０に戻り、成長中の細胞集団の代謝活動のモニターを続ける。
代謝測定値及びその所望のレベルに応じて、プロセス１６００は、フィーディングレートを調整するステップ１６１４に進む。ここでは、追加の期間の間、追加のプロセスに従って細胞をフィーディングする。そのような追加のプロセス及び追加の期間は、例えば、第３の期間の第３のプロセス、第４の期間の第４のプロセス、第５の期間の第５のプロセス等を含む。一実施形態では、そのような追加のプロセスは、例えば、第１及び／又は第２の期間中と略同じフィーディングレートで細胞をフィーディングすることを含む。他の実施形態では、追加のプロセスは、第１及び／又は第２の期間中に使用されるフィーディングレートと比較して、異なるフィーディングレートで細胞をフィーディングすることを含む。例えば、一実施形態では、ＩＣ入口流量を増加させ、ＩＣ循環流量を、反対方向であるが、ＩＣ入口流量に一致させるか、或いは略又は実質的に一致させる。他の実施形態では、ＩＣ入口流量を増加させ、ＩＣ循環流量を設定、構成、又は調整して、ＩＣ入口流量のあるパーセンテージ又はある割合又はある部分に等しく且つ反対方向に設定する。フィーディングレートの調整ステップ１６１４は、ステップ１６１４で「追加の」プロセス及び「追加の」期間を示しているが、代謝活動に基づいて、フィーディングレートを調整するために、任意の数のプロセス及び期間を使用できる。
フィーディングレートの調整ステップ１６１４から、プロセス１６００はクエリステップ１６１０に戻る。フィーディングレートを調整する、又はさらに調整することが望まれない場合、プロセス１６００は「ｎｏ」に進み、ステップ１６１６において細胞を増殖し、そこで、細胞は、第１の期間（１６０４）、第２の期間（１６０８）、及び／又は追加の期間（１６１４）においてフィーディングを行う際に供給された培地を使用して成長／増殖し続けることができる。ステップ１６１６に細胞の増殖が示されているが、細胞は、例えば、ステップ１６０４、１６０６、１６０８、１６１０、１６１２、１６１４等の１又は複数の他のステップ中に成長／増殖してもよい。増殖ステップ１６１６から、プロセス１６００は、例えば、バイオリアクターから収穫バッグ又は容器に細胞を収穫又は除去するステップ１６１８に進む。そして、プロセス１６００は、終了動作１６２２で終了する。或いは、収穫ステップ１６１８から、プロセス１６００は、オプションとして、さらなる処理／分析ステップ１６２０に進んでもよい。そのような任意のさらなる処理／分析ステップ１６２０は、例えば、収穫された細胞（例えば、Ｔ細胞又はＴｒｅｇ）の表現型を特徴付けることを含む。次に、オプションのさらなる処理／分析ステップ１６２０から、プロセス１６００はＥＮＤ動作１６２２で終了する。
図１７Ａは、本開示の実施形態において細胞増殖システムと共に使用され得る細胞を増殖するためのプロセスの動作ステップ１７００を示す。以下に記載されるように、プロセス１７００は、本開示の実施形態に従って、細胞成長チャンバー内で細胞が増殖されるつれて形成される細胞クラスターをせん断するステップを含む。細胞クラスターはまた、実施形態において、それらの表面上にアクチベーターを有し、細胞増殖を活性化するために使用されるビーズを含む。実施形態では、これらのステップは、「修正された循環」タスクの一部として実行されてもよい。ＳＴＡＲＴ動作１７０２が開始され、プロセス１７００は、細胞を有する流体を細胞増殖システム内の細胞成長チャンバーに投入するステップ１７０４に進む。実施形態では、細胞は、１又は複数のタイプのＴ細胞等の非接着細胞を含む。一実施形態では、細胞はＴｒｅｇを含む。他の実施形態では、細胞は、ヘルパー、エフェクター、ナイーブ、メモリー及び／又はそれらの組み合わせを含む。
プロセス１７００は、細胞をアクチベーター１７０６にさらすことに進む。抗体複合体を含み得るアクチベーターは、ステップ１７０４で投入される流体に添加される。実施形態において、アクチベーターは、可溶性ヒト抗体ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２細胞活性化因子複合体である。他の実施形態では、アクチベーターは、細胞増殖を活性化する抗体（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８）で機能化されたビーズ上に配置される。ビーズは細胞と混合されてもよい。プロセス１７００は、第１の期間の細胞増殖ステップ１７０８に進む。ステップ１７０８は、細胞フィーディングステップ１７１０を含む。細胞に栄養が与えられて、細胞の増殖が促進される。例えば、グルコース、タンパク質、及び試薬を含む培地を細胞成長チャンバーに送達して、細胞増殖のための栄養素を提供する。
細胞を増殖するための第１の期間（ステップ１７０８）は、細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターの形成にかかる時間に基づいてもよい。細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターは、１又は複数の付着細胞（及びいくつかの実施形態ではビーズ）のグループである。実施形態において、細胞（例えば、ＴｒｅｇのようなＴ細胞）は、細胞接触からメリットを得る。細胞接触は、増殖と成長を促進するシグナル伝達を刺激する。しかしながら、一定期間の増殖後、細胞は互いに付着して、細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターを形成する場合がある。理論に束縛されるものではないが、細胞増殖期間（１７０８）の後、細胞は、成長し続ける比較的大きな細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターを形成すると考えられる。細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターは、壊死中心を形成する場合がある。そこでは、栄養素（例えば、グルコース）、ガス（例えば、酸素）、及び試薬（例えば、アクチベーター）は、細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターの中心にある細胞に到達しない。結果として、これらの細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターの中心での細胞増殖の状態は、増殖率が遅くなる（例えば、倍加時間が増える）か、或いは、該状態は細胞壊死につながる可能性がある。ビーズを利用する実施形態では、ビーズはまた凝集して、細胞コロニー、微小コロニー、又はクラスターの一部となる場合がある。
実施形態では、細胞の増殖（ステップ１７０８）を可能にするために、第１の期間は約５時間から約４８時間の間である。いくつかの実施形態では、第１の期間は、約６時間より長く、又は約１２時間より長く、又は約２４時間より長く、又は約４８時間より長い。他の実施形態では、第１の期間は、約７２時間未満、約６０時間未満、約４８時間未満、約３６時間未満、約２４時間未満、又は約１２時間未満である。第１の期間の後、プロセス１７００は、第２の期間の間、細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターをせん断するために循環させるステップ１７１２に進む。ステップ１７１２を実行して、細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターのサイズを小さくする。第２の期間は、ある実施形態では、約１２０分未満、約１００分未満、約８０分未満、約６０分と約０．５分との間であってよい。いくつかの実施形態では、第２の期間は、約４分のように、約５０分から約１分の間であってもよい。他の実施形態では、第２の期間は、第１の循環経路に導入される流体の量に基づいてもよい。すなわち、ある体積の流体が導入されると、循環剪断ステップ１７１２が停止される。
図１７Ｂは、プロセス１７００の一部として細胞成長チャンバー内で増殖され得る流体の体積（１７５２）内の細胞の複数のビュー１７５０、１７６０、１７７０を示す。例えば、いくつかの実施形態では、細胞成長チャンバーは中空糸バイオリアクターである。これらの実施形態では、ビュー１７５０、１７６０、１７７０は、例えば、中空糸バイオリアクターの１つの糸内の細胞を示している。１７５０Ａ、１７６０Ａ、１７７０Ａは、それぞれビュー１７５０、１７６０、１７７０の部分を拡大したものである。ビュー１７５０は、細胞が投入され（ステップ１７０４）、アクチベーターにさらされ（ステップ１７０６）、ある期間（例えば、第１の期間）、増殖された（ステップ１７１０）後の細胞を示している。ビュー１７５０に示されるように、多数の細胞コロニー１７５４Ａ〜１７５４Ｅが形成されている。
細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスター１７５４Ａ〜１７５４Ｅ内の細胞の数及びそれらコロニー又はクラスターのサイズを減らすために、ステップ１７１２は、流体及び細胞を第１の流体循環路を通して循環させる。理論に束縛されるものではないが、拡大された部分１７６０Ａの矢印１７５６で示されるように、この循環は、細胞コロニーに作用する（せん断応力を含む）力を生成すると考えられる。せん断応力１７５６は、細胞コロニー内の細胞を分割分離するのに十分な力を与える。循環が続くと、ビュー１７６０に示すように、細胞コロニーは、小さなサイズに分裂し始める。ビュー１７７０は、第２の期間にわたって循環を行った後の細胞を示している。ビュー１７７０に示すように、細胞コロニーのサイズは小さくなり、いくつかのコロニーは個々の細胞に完全に分割分離されている。いくつかの実施形態では、循環せん断ステップ１７１２は、細胞及び流体が単一細胞懸濁液を含むまで実行される。
他の実施形態では、細胞コロニー、マイクロコロニー、又は細胞のクラスターは、循環せん断ステップ１７１２の後に残る場合がある。例えば、拡大部分１７７０Ａのコロニー１７５４Ｆは、ステップ１７１２の後にサイズが縮小されたいくつかのコロニーが残っていることを示している。実施形態では、残存する細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスター（例えば、１７５４Ｆ）は、約２５μｍから約３００μｍの間である。他の実施形態では、循環せん断ステップによって、細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスター（例えば、１７５４Ｆ）のサイズは小さくなり、細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターは約５０μｍから約２５０μｍの間になる。さらに他の実施形態では、細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターのサイズは、約７５μｍから約２００μｍの間になる。いくつかの実施形態では、細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターのサイズは、循環せん断ステップの後、約２００μｍ未満（例えば約１００μｍ）、になる。
実施形態では、残っている細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターのサイズは、細胞成長チャンバーのいくつかの構造的特徴の、幾分かは、関数となっている。上述のように、細胞成長チャンバーは、いくつかの実施形態では中空糸を備えた中空糸バイオリアクターであってもよい。理解されるように、細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターは、それらが循環するときに、中空糸の側壁に接触するたびにせん断応力によって影響を受ける。この接触により、細胞コロニーのサイズがより効率的に減少する。ピペットを使用してせん断応力を誘発してコロニーのサイズを小さくする従来のプロセスのように内径が大きい場合、側壁との接触はそれほど頻繁に起こらない可能性がある。図１７Ｃは、一実施形態に係る中空糸（例えば、２１５ミクロン）１７７２と、細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターの付着細胞を分割分離するために使用されるピペットチップ１７７４（７６２ミクロン）の内径サイズの違いを示している。実施形態では、中空糸のより小さな内径は、循環せん断ステップ１７１２において細胞コロニーのサイズをより効率的且つ効果的に減少させると考えられる。
循環せん断ステップ１７１２の第２の期間は、実施形態では、約１２０分未満、約９０分未満、約６０分未満、約３０分未満、又は約１５分未満である。いくつかの実施形態では、第２の期間は、約４分のように、約１分から約１５分の間とすることができる。
第２の期間の後、プロセス１７００は、第３の期間にわたって細胞を細胞成長チャンバーに移動させるステップ１７１４に進む。ステップ１７１４において、循環せん断ステップ１７１２の結果として、細胞成長チャンバー内に位置していない細胞は、第３の期間中に細胞成長チャンバーに戻される。実施形態では、これは、１又は複数のポンプを作動させて、流体を流体循環路に導入することを含む。例えば、流体は、流体入口路から第１の流体流路に導入され、細胞成長チャンバーの入口ポート及び出口ポートの両方から、細胞成長チャンバーに導入される。入口ポート及び出口ポートから細胞成長チャンバーへの流体の移動によって、細胞は細胞成長チャンバーに戻される。
いくつかの実施形態では、細胞を細胞成長チャンバーに戻すステップ１７１４で使用される流体は、細胞成長を促進する試薬を含む。例えば、実施形態では、流体は、グルコース、タンパク質、又は他の試薬を含む培地である。一実施形態では、流体は１又は複数のサプリメントを含んでもよい。一実施形態では、流体は完全培地であり、サイトカイン（例えば、ヒトＩＬ−２サイトカインサプリメント）を含む。流体の添加は、ボーラス添加（ｂｏｌｕｓ ａｄｄｉｔｉｏｎ）と呼ばれる場合がある。ステップ１７１２と１７１４の組み合わせは、実施形態において、循環ボーラス添加と呼ばれる場合がある。
他の実施形態では、第３の期間は、循環せん断ステップ１７１２中に細胞成長チャンバーに導入される流体の体積に基づいてもよい。例えば、実施形態では、ステップ１７１２は、約３００ｍｌ、約２５０ｍｌ、約２００ｍｌ、又は約１５０ｍｌが流体循環経に導入されるまで実行される。
第３の期間の後、プロセス１７００は、第４の期間の増殖ステップ１７１６に進む。ステップ１７０８と同様に、ステップ１７１６は細胞フィーディングステップ１７１８を含んでよい。細胞に栄養を与えて、細胞の増殖が促進される。例えば、グルコース、タンパク質、及び試薬を含む培地を細胞成長チャンバーに送達して、細胞増殖のための栄養素を与える。
第１の期間と同様に、第４の期間は、細胞コロニーが形成するのにかかる時間に基づいてもよい。実施形態では、第４の期間は約５時間から約４８時間の間である。いくつかの実施形態では、第４の期間は、約６時間より長く、又は約１２時間より長く、又は約２４時間より長く、又は約４８時間より長い。他の実施形態では、第４の期間は、約７２時間未満、約６０時間未満、約４８時間未満、約３６時間未満、約２４時間未満、又は約１２時間未満である。より多くの細胞が細胞成長チャンバー内にある可能性が高いため、いくつかの実施形態では、第４の期間は第１の期間よりも短くてもよい。他の実施形態では、第４の期間は、第１の期間と同じであってもよい。
第４の期間の後、プロセス１７００はステップ１７２０に進み、第５の期間にわたって循環してせん断し、第２の細胞コロニーを減少させる。実施形態では、ステップ１７２０は第１循環レートを使用してもよい。しかしながら、他の実施形態では、ステップ１７２０で使用される循環レートは、第１循環レートより大きい或いは小さいといように、異なってもよい。
第５の期間の後、プロセス１７００は、ステップ１７２２に進み、細胞成長チャンバー内に位置していない細胞は、第６の期間中に細胞成長チャンバーに戻される。流体は、流体入口路から第１の流体流路に導入され、細胞成長チャンバーの入口ポート及び出口ポートの両方から、細胞成長チャンバーに導入される。入口ポート及び出口ポートから細胞成長チャンバーへの流体の移動によって、細胞は細胞成長チャンバーに戻される。いくつかの実施形態では、細胞を細胞成長チャンバーに戻すステップで使用される流体は、細胞成長を促進する試薬を含む。例えば、実施形態では、流体は、グルコース、タンパク質、又は他の試薬を含む培地である。一実施形態では、流体は１又は複数のサプリメントを含んでもよい。一実施形態では、流体は完全培地であり、サイトカイン（例えば、ヒトＩＬ−２サイトカイン）を含む。
プロセス１７００は、オプションのステップ１７２４及び省略記号１７２６によって示されるように、細胞を増殖、循環、及び移動させるステップを、回数を追加して、オプションで実行してもよい。増殖、循環、及び移動の各ステップは、ある期間連続して実行されてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、それらステップは、約２日から約２０日間の期間（例えば約１０日間、約９日間、約８日間、約７日間、約６日間、又は約５日間）にわたって、４日に１回、３日に１回、２日に１回、１日１回、１日２回、又は１日に３回実行されてもよい。いくつかの実施形態では、それらステップは種々の期間で実行されてもよい。例えば、一実施形態では、それらステップは３日後に実行され、その後１日おきに実行されてもよい。他の例として、それらステップは２日後に実行され、その後１日２回実行されてもよい。これらは単なる例であり、他の実施形態においては、他の期間を利用してもよい。
例えば、図１８は、細胞を増殖するプロセスにおいて、異なる期間で循環ボーラス（ｂｏｌｕｓ）添加を実行するグラフ１８００を示す。曲線１８０８は、例えばＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）細胞増殖システムのような細胞増殖システムにおける、細胞培養日数１８０４に対する細胞数１８０２を示している。曲線１８０６は、例えば、Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）細胞増殖システムのような細胞増殖システムにおける、細胞培養日数１８０４に対するＩＣ流量１８１８を示している。曲線１８０６に示すように、ＩＣ流量は最初の３日間は０．１ｍＬ／ｍｉｎに維持される。６日目において流量は０．２ｍＬ／ｍｉｎに増加し、７日後に０．３ｍＬ／ｍｉｎに増加する。流量の増加は、培養日数１８０４の増加に伴う細胞数の増加に対応している。また、図１８に示されるように、いくつかの循環ボーラス添加ステップ（１８１０、１８１２、１８１４、１８１６）が行われる。細胞培養の３．５日後に循環ボーラス添加ステップ１８１０が行われる。細胞培養の４．５日後に他の循環ボーラス添加ステップ１８１２が行われる。細胞培養の６日後に他の循環ボーラス添加ステップ１８１４が行われ、細胞培養の６．５日後に他の循環ボーラス添加ステップ１８１６が行われる。曲線１８０６、１８０８を見るとわかるように、ＩＣ流量の増加と組み合わせた複数の循環ボーラス添加ステップ（１８１０−１８１６）は、細胞の増殖レート（例えば、細胞数）にプラスの影響を与えている。
図１７Ａに戻ると、プロセス１７００は、細胞成長チャンバーから細胞を除去するステップ１７２８に進む。実施形態では、これは、細胞の収穫を含んでもよい。ステップ１７２８は、細胞成長チャンバーからの細胞の除去の前又は除去中に、循環ステップ（例えば、１７１２、１７２０）のような追加のステップを含んでもよい。プロセス１７００は、終了動作１７３０で終了する。
図１９Ａは、本開示の実施形態における細胞増殖システムで使用され得るポンプを動作させるためのプロセスの動作ステップ１９００を示している。以下に説明するように、プロセス１９００は、本開示の実施形態に従って、細胞成長チャンバー内で増殖された細胞クラスター内の細胞（及び、ビーズがアクチベーターとして使用される場合は、ビーズ）を減少させるプロセスにおいてポンプを作動させるステップを含む。実施形態では、これらのステップは、「修正された循環」タスクの一部として実行されてもよい。実施形態では、プロセス１９００のステップは、コンピュータプロセッサによって実行されてもよい。ＳＴＡＲＴ動作１９０２が開始され、プロセス１９００は、ステップ１９０４に進み、そこで、第１ポンプが第１流量で作動されて、細胞を含む第１体積の流体を細胞増殖システムのバイオリアクターの毛管管内側部分に導入する。ビーズを利用する実施形態では、ビーズは、細胞を含む第１の体積の流体と共に導入されてもよい。実施形態では、第１のポンプは入口ポンプである。
第１の流量で第１のポンプを作動させた後、プロセス１９００は、第２の流量で第１のポンプを作動させて、栄養分を含む培地をバイオリアクターの毛細管内側部分に、第１の期間の間、導入するステップ１９０６に進む。栄養素には、例えば、タンパク質、グルコース、及び細胞の増殖を増大促進するために使用される他の化合物が含まれる。例えば、図１９Ｂに示されるように、第１のポンプ１９６０は第２の流量で動作されて、培地をバイオリアクター１９６２の入口ポート１９６２Ａに導入する。
実施形態では、第１の期間は、細胞コロニーが形成されるのにかかる時間に基づいてもよい。実施形態では、第１の期間は約５時間から約４８時間の間である。いくつかの実施形態では、第１の期間は、約６時間より長く、又は約１２時間より長く、又は約２４時間より長く、又は約４８時間より長い。他の実施形態では、第１の期間は、約７２時間未満、約６０時間未満、約４８時間未満、約３６時間未満、約２４時間未満、又は約１２時間未満である。
次に、プロセス１９００は、バイオリアクターに流体を導くために、第３の流量で第２のポンプを作動させるステップ１９０８に進む。オプションのステップ１９０８を実行してポンプ１９６４を起動し、ステップ１９０６で導入された流体の一部をバイオリアクター１９６２の出口ポート１９６２Ｂに向けて移送し、細胞に対してフィーディングを行う。これは、バイオリアクターのＩＣ入口ポートとＩＣ出口ポートの両方から流体をバイオリアクターに移動させるための、フローカウンターフローフィーディングプロセスの一部であってもよい。
次に、プロセス１９００は、第４の流量で第２のポンプを作動させて、第２の期間にわたって、細胞を循環させ、バイオリアクター内の細胞クラスター内の細胞の数を減らすステップ１９１０に進む。実施形態では、細胞は第１の流体循環路を循環する。図１９Ｃを参照すると、ステップ１９１０で第２のポンプ１９６４を作動させて、矢印１９６８Ａ〜矢印１９６８Ｄで示されるように、第１の流体循環路１９６６において流体を循環させる。
理論に束縛されるものではないが、ある期間の後、増殖細胞は、細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターを形成すると考えられる。細胞コロニーは、壊死中心を形成する場合がある。そこでは、栄養素及びタンパク質（例えば、アクチベーター）は、細胞コロニーの中心における細胞に到達しない。結果として、これらの細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターの中心での細胞増殖の状態は、増殖率が遅くなる（例えば、倍加時間が増える）か、或いは、細胞壊死につながる可能性がある。ビーズを利用する実施形態では、ビーズはまた、凝集して、細胞コロニー、微小コロニー、又はクラスターの一部となる場合がある。ステップ１９１０を実行して、細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターのサイズが低減される。
実施形態では、第４の流量は、せん断を誘発するのに十分高い。例えば、実施形態では、第４の流量は約１０００ｍｌ／ｍｉｎに達する。他の実施形態では、第４の流量は、例えば３００ｍＬ／ｍｉｎのように、約１００ｍＬ／ｍｉｎから約６００ｍＬ／ｍｉｎの間であってもよい。
第２の期間の後、プロセス１９００はステップ１９１２に進み、そこにおいて、第１のポンプを第５の流量で作動して、第３の期間にわたって第１の流体流路を通して流体を導入する。実施形態では、第１の流体流路に導入される流体の第１の部分は、第１の流体流路内の第１の細胞（ステップ１９１０のために第１の流体流路内にあり得る）を、入口ポート１９６２Ａを通って細胞成長チャンバーに戻す。図１９Ｄを参照すると、ポンプ１９６０を作動させて、流体を第１の流体流路１９７０に導入する。矢印１９６８Ａ、１９６８Ｂによって示されるように、流体は、第１の流体流路１９７０から入口ポート１９６２Ａに流入する。これにより、バイオリアクター１９６２の外側にある第１の細胞がバイオリアクター１９６２に戻る。第１の流体流路にある細胞を細胞成長チャンバーに戻すことで、細胞成長チャンバー内で細胞成長の条件が最適化されるため、細胞の全体的な増殖が改善されると考えられる。
いくつかの実施形態では、ステップ１９１２で第１の流体流路に導入される流体は、細胞増殖を促進する１又は複数の材料（例えば、試薬）を含んでもよい。例えば、実施形態において、流体は、グルコース又は細胞にフィーディングするため他の栄養素を含む培地である。一実施形態では、流体は、細胞の増殖を活性化し続けるための追加のアクチベーターを含む試薬を含む。特定の試薬又は他の材料を含む流体を使用して、細胞を細胞成長チャンバーに戻し、細胞を追加の試薬（例えば、増殖を促進する成長因子、タンパク質等）にさらすと、細胞増殖が改善される。実施形態では、ステップ１９１２で使用される流体の追加は、ボーラス添加と呼ばれる場合がある。
第３の期間の後、ステップ１９１４において、第２のポンプを第６の流量で作動して、第１の流体流路を通して導入された流体の第２の部分及び第２の細胞を、出口ポート１９６２Ｂを介して、細胞成長チャンバーに移送する。実施形態では、流体の第２の部分は、第１の流体流路内の第２の細胞（ステップ１９１０のために第１の流体流路内にあり得る）を、出口ポートを通って細胞成長チャンバーに戻す。図１９Ｄを参照すると、ポンプ１９６４を作動させて、第１の流体流路１９７０に導入された流体は出口ポート１９６２Ｂに移送される。矢印１９６８Ｃによって示されるように、ポンプ１９６４は、第１の流体循環路の流体及び細胞を、出口ポート１９６２Ｂを介してバイオリアクター１９６２に移送する。図１９Ｄによって示されるように、第６の流量は、第４の流量と反対の方向である（図１９Ｃ）。この流体の動きによって、バイオリアクター１９６２の外側にある細胞は、バイオリアクター１９６２に戻る。
実施形態では、第６の流量は第５の流量よりも少なく、上記のように、流体を第１の流体流路に移動させる。理解され得るように、第５の流量は、第５の流量に基づく所与の体積の流体の循環経路１９６６の一部への導入をもたらす。第６の流量は、該体積のあるパーセンテージ分が出口ポート１９６２Ｂに向かって移動するように設定される。
実施形態では、第６の流量は、第５の流量の所定のパーセンテージ分として設定されてもよい。例えば、第６の流量は、第５の流量の約９０％以下である。いくつかの実施形態では、第６の流量は、第５の流量の約８０％以下に設定されてもよい。他の実施形態では、第６の流量は、第５の流量の約７０％以下である。さらに他の実施形態では、第６の流量は、第５の流量の約６０％以下である。いくつかの実施形態では、第６の流量は、第５の流量の約５０％以下であってもよい。
実施形態では、第６の流量は、少なくとも部分的に、第２のポンプと入口ポートの間の第１の体積と、第２のポンプと出口ポートの間の第２の体積との差に基づく。図１９Ｄを参照すると、第１の循環路の複数の部分は、異なる体積を有する。例えば、一実施形態では、第２のポンプ１９６４と入口ポート１９６２Ａとの間の第１の体積は第１の体積を有し、第２のポンプ１９６４と出口ポート１９６２Ｂとの間の第２の体積は、第１の体積とは異なる（例えば、より大きい）第２の体積を有する。これらの実施形態では、細胞を循環路からバイオリアクターに戻すために、細胞が略同時にバイオリアクターに到達するように、第６の流量は、これらの体積差に少なくとも部分的に基づいて設定されてもよい。
理解されるように、流体が第１の流体流路１９７０から流体循環路１９６６に入ると、流体は、第１のポンプ１９６０が設定される流量で入口ポート１９６２Ａに向かって移動する。ポンプ１９６４が作動すると、流体の少なくとも一部は、出口ポート１９６２Ｂに向けて移送される。実施形態では、第２の体積（１９６４と出口ポート１９６２Ｂとの間の体積）は、第１の体積より大きい。従って、より多くの流体を第２の体積に移動させるために、第２のポンプ１９６４は、ポンプ１９６０の流量のあるパーセンテージ分に設定される。
一実施形態では、ステップ１９１２で、ポンプ１９６０を１００ｍｌ／ｍｉｎに設定する。この実施形態では、第２の体積（ポンプ１９６４から出口ポート１９６２Ｂまで）は、第１の体積（ポンプ１９６４から入口ポート１９６２Ａまで）より大きい。その付加体積分のために、実施形態では、ステップ１９１４において、ポンプ１９６４を７０ｍｌ／ｍｉｎに設定する。この実施形態では、細胞は、第３の期間の間は、略同時にバイオリアクター１９６２に到達する。
実施形態において、プロセス１９００は、ステップ１９０６〜１９１４を、省略記号１９１６によって示されるように、複数回数追加して、またオプションのステップ１９１８を、任意に選択で実行してもよい。第１ポンプ（第２流量）動作ステップ１９０６、第２ポンプ（第４流量）動作ステップ１９１０、第１ポンプ（第５流量）動作ステップ１９１２、及び第２ポンプ（第６流量）動作ステップ１９１４は、所定期間連続して実行されてもよい。上記のように、細胞をフィーディングし、細胞を循環させて細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターを分割分離し、細胞を細胞成長チャンバーに戻すためのステップを実行してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、それらステップは、約２日から約２０日間の期間（例えば約１０日間、約９日間、約８日間、約７日間、約６日間、約５日間）にわたって、３日に１回、２日に１回、１日１回、１日２回、又は１日に３回実行されてもよい。いくつかの実施形態では、それらステップは種々の期間で実行されてもよい。例えば、一実施形態では、それらステップは３日後に実行され、その後１日おきに実行されてもよい。他の例として、それらステップは２日後に実行され、その後１日２回実行されてもよい。これらは単なる例であり、他の実施形態においては、他の期間を利用してもよい。プロセス１９００は、終了動作１９２０で終了する。
いくつかの実施形態では、プロセス１９００は追加のステップを含む場合があることに留意されたい。例えば、揺動装置をバイオリアクターに接続し、第１の期間の後（及び第２の期間中）、ステップ１９１０で第１のポンプを起動する際、細胞を循環させて細胞クラスター内の細胞の数を減らすステップの一部として、揺動装置を起動して、バイオリアクターを回転させることもできる。これは単なる一例であり、プロセス１９００の他の実施形態はそれに限定されない。
次に、図２０は、本開示の実施形態による、ＣＥＳ５００（例えば、図５Ａ）又はＣＥＳ６００（図６）のような細胞増殖システムで使用され得る、細胞増殖プロセスの例示的な動作ステップ２０００を示す。開始動作２００２が開始され、プロセス２０００は、ディスポーザブルチューブセットを細胞増殖システムに装填するステップ２００４に進む。次に、ステップ２００６において、システムに対してプライミングを行う。一実施形態では、例えば、ユーザ又はオペレータは、例えばプライミングのためのタスクを選択することによってプライミングを行うようにシステムに命令を与える。一実施形態では、プライミングのためのそのようなタスクは、例えば、事前にプログラムされたタスクである。次に、プロセス２０００は、ＩＣ／ＥＣ洗浄タスク２００８に進む。ここでは、ＩＣ循環ループ及びＥＣ循環ループ上の流体が交換される。交換体積は、交換されるＩＣ容積及びＥＣ容積の数によって決定される。
次に、バイオリアクター膜の中空糸にわたって適切な又は所望のガス濃度を維持するために、培地調整ステップ２０１０を実行して、細胞がバイオリアクターに投入される前に培地がガス供給と平衡に達するようにする。例えば、高いＥＣ循環流量を用いることにより、ガス移送モジュール又は酸素供給器によって提供されるガス供給と培地との接触を急速に達成することができる。次いで、例えば、ユーザ又はオペレータが細胞をバイオリアクターに投入する準備ができるまで、システムは適切な状態又は望ましい状態に維持される。一実施形態では、システムは、例えば完全培地で調整されてもよい。完全培地は、細胞成長に使用される任意の培地源であってよい。一実施形態では、完全培地は、例えば、アルファ−ＭＥＭ（α−ＭＥＭ）及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む。他の実施形態では、完全培地は、例えば、ＩＬ−２及びヒト血清を含む。当業者によって理解される任意のタイプの培地が使用される。
プロセス２０００は、次に、例えば、細胞投入バッグからバイオリアクター中央に、循環無しで、細胞を投入するステップ２０１２に進む。実施形態では、「循環無しで細胞を中央に投入する」タスクを使用することができ、このタスクでは、複数の細胞を含む第１の体積の流体を第１の流量で細胞増殖システムに投入する。ここで、細胞増殖システムは細胞成長チャンバーを含む。次に、培地を含む第２の体積の流体を第２の流量で第１の流体循環路の一部に投入して、例えば、細胞成長チャンバーの第１の部分に第１の体積の流体を配置する。一実施形態では、細胞成長チャンバー又はバイオリアクターの第１の部分は、バイオリアクターの略中央領域である。一実施形態では、第１の体積は第２の体積と同じである。一実施形態では、第１の流量は第２の流量と同じである。他の実施形態では、第１の体積は第２の体積と異なる。他の実施形態では、第１の流量は第２の流量とは異なる。一実施形態では、第１の体積と第２の体積の合計は、例えば、第１の流体循環路の体積（例えば総体積）のあるパーセンテージ分又はある割合に等しい。例えば、第１の体積と第２の体積の合計は、例えば、第１の流体循環路の体積（例えば総体積）の約５０％である。一実施形態では、第１の流体循環路内の流体は、バイオリアクター又は細胞成長チャンバーの毛細管内側（ＩＣ）空間を通って流れる。一実施形態では、第２の流体循環路内の流体は、例えば細胞成長チャンバー又はバイオリアクターの毛細管外側（ＥＣ）空間を通って流れる。一実施形態では、第１の体積と第２の体積の合計は、例えば、毛細管内側（ＩＣ）ループの体積の約５０％、又は他のパーセンテージ分又は他の割合であってよい。一実施形態では、第１の体積と第２の体積の合計は、適用可能な場合は、他の流体経路、他のループ等の体積の約５０％、又は他のパーセンテージ分又は他の割合であってよい。実施形態では、他のパーセンテージ分又は他の割合が使用されてもよく、例えば、約１％から約１００％までの間の任意のパーセンテージである。
細胞投入ステップ２０１２に続いて、プロセス２０００は次に細胞フィーディングステップ２０１４に進む。ステップ２０１６はステップ２０１４の後に示されているが、実施形態によれば、ステップ２０１６はステップ２０１４の前に、又はステップ２０１４と同時に行われてもよい。次に、プロセス２０００はクエリステップ２０１８に進み、細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターが形成されているかどうかを判断する。細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターは、１以上の付着細胞のグループである。細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターが形成された場合、プロセス２０００は「ｙｅｓ」に進み、細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスターをせん断するステップ２０２０に進む。例えば、複数の細胞を第１の期間、増殖した後、細胞を第２の期間にわたって第１の循環流量で循環させて、細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスター内の細胞数を減らす。実施形態では、第１の循環流量で細胞を循環させることにより、細胞コロニーにせん断応力が生じ、細胞コロニー内の１つ以上の細胞が細胞コロニーから分割分離する。一実施形態では、例えば、細胞コロニー、マイクロコロニー、又はクラスター内の細胞の数を減らすことにより、単一の細胞懸濁液を提供することができる。実施形態では、細胞を循環させてコロニー、マイクロコロニー、又はクラスターをせん断するステップ２０２０を、細胞培養中に例えば２日ごとに使用して、均一な細胞密度及び栄養拡散を維持することができる。実施形態によれば、他の期間も使用されてよい。一実施形態では、任意のマイクロコロニー、コロニー、又はクラスターのそのようなせん断は、例えば４日目以降に開始してもよい。いくつかの実施形態では、剪断は３日後に行われ、その後隔日で行われる。他の例では、それらステップは２日後に実行され、その後１日２回実行される。実施形態によれば、そのようなせん断を開始する日や期間は、上記とは異なる日や期間を使用してよい。せん断ステップ２０２０の後、プロセス２０００は次に細胞フィーディングステップ２０１４に戻る。
クエリステップ２０１８において、細胞コロニー又はクラスターをせん断しないと決定された場合、又は、例えば、存在しない場合、プロセス２０００は「ｎｏ」に進み、ステップ２０２２において細胞を再懸濁する。実施形態において、細胞の循環を行うことによって、培養中に軽く付着している可能性のある細胞を均一に再懸濁する。実施形態では、ステップ２０２２は、収穫タスク、又はバイオリアクターから細胞を取り出すための他のタスクを開始する前に、軽く付着している可能性がある細胞を均一に再懸濁するために細胞を循環させることを含んでもよい。細胞再懸濁ステップ２０２２に続いて、プロセス２０００は次に細胞収穫ステップ２０２４に進む。除去された細胞のさらなる処理又は他の分析は、ステップ２０２６においてオプションとして実行されてもよく、プロセス２０００は、終了動作２０２８で終了する。さらなる処理／分析を実行することが望まれない場合、プロセス２０００は終了動作２０３０で終了する。
図２１及びプロセス２１００に目を向けると、実施形態によれば、開始動作が開始され（ステップ２１０２）、プロセス２１００は、ディスポーザブルセットを細胞増殖システムに装填するステップ２１０４に進む。次いで、ステップ２１０６において、ディスポーザブルセットはプライミングされ、ＩＣ／ＥＣ洗浄ステップ２１０８が行われる。次に、ステップ２１１０において、培地が調整される。次に、プロセス２１００は、細胞（例えば、Ｔ細胞（例えばＴｒｅｇ）のような、懸濁細胞又は非接着細胞）投入ステップ２１１２に進む。一実施形態では、そのような細胞は、「循環無しで中央に細胞を投入する」タスクによって投入される（ステップ２１１２）。他の実施形態では、そのような細胞は、「均一な懸濁による細胞投入」タスクによって投入される（ステップ２１１２）。
次に、プロセス２１００は、実施形態に従って、ステップ２１１４に進んで、細胞フィーディングを開始する（０日目に開始する）。細胞は、ステップ２１１６において成長及び増殖され、例えば、３日目までに、ステップ２１１８において、ＩＣループに流体をボーラス添加し、細胞を再分配することが望まれる場合がある。一実施形態では、そのような流体のボーラスは、サイトカイン又は他の成長因子のような試薬を含んでもよい。他の実施形態では、そのような流体のボーラスは、例えば、試薬及び基礎培地を含む。
そのようなボーラス添加及び細胞の再分配に続いて、プロセス２１００は次に細胞を再びフィーディングするステップ２１２０に進む。そのようなフィーディングは例えば３日目に行われる（或いは、いくつかの実施形態では２日目に行われる）。フィーディングステップ２１２０では、ステップ２１２２において、システムのパラメータ（例えば、１又は複数のポンプ制御流量）を制御して、バイオリアクターのＩＣ入口ポート及びＩＣ出口ポートの両方から流体をバイオリアクターに移動させるための相補的な正方向流・対向流設定を達成することができる。例えば、ステップ２１２４において、ＩＣ入口ポンプを調整して又は方向付けして、所定の流れを生成し、ステップ２１２６において、ＩＣ循環ポンプを調整して又は方向付けして、それに対する対向流を生成する。例えば、０．１ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ入口ポンプ流量に対して、相補的なＩＣ循環ポンプレートが−０．１ｍＬ／ｍｉｎになるようにマッチングさせるか、略マッチングさせて、細胞培養の増殖期（例えば実施形態では４〜７日目、他の実施形態では１〜７日目）の間、細胞をバイオリアクター内に維持する。設定制御ステップ２１２２のそのような制御によって、バイオリアクターのＩＣ出口ポートからの細胞の損失に関連するあらゆる力に対抗することが可能になる。
プロセス２１００は次にクエリステップ２１２８に進み、例えば、他の日又は他の時間間隔で試薬又は他のボーラス添加を追加し続けるかどうかが決定される。追加の試薬又は他のボーラスを追加して細胞を再分配することが望まれる場合、プロセス２１００は「ｙｅｓ」に分岐して、ステップ２１１８において、試薬を追加し、細胞を再分配する。例えば、実施形態によれば、そのようなボーラス添加及び細胞の再分布は、６日目及び９日目に行われる。他の実施形態では、ボーラス添加及び再分配は、２日後に１回、その後１日２回であってもよい。
ボーラス（例えば試薬）の追加及び細胞の再分配を継続することが望まれない場合、プロセス２１００は「ｎｏ」に進み、ステップ２１３０において細胞は収穫され、そこで細胞は収穫バッグ又は容器に移される。プロセス２１００は、終了動作２１３６で終了する。
或いは、収穫ステップ２１３０から、プロセス２１００は、オプションとして、さらなる処理／分析ステップ２１３２に進んでもよい。そのようなさらなる処理ステップ２１３２は、収穫された細胞（例えばＴｒｅｇ等のＴ細胞）の表現型の特徴付けを含んでもよい。オプションであるさらなる処理／分析ステップ２１３２から、プロセス２１００は、任意選択で、残存する細胞を再投入するステップに進んでもよい。そして、プロセス２１００は、終了動作２１３６で終了する。
プロセス２２００は、本開示の実施形態による細胞増殖システムにおいて細胞を増殖させるプロセスの動作ステップを示している。いくつかの実施形態では、プロセス２２００を使用してＴ細胞（例えばＴｒｅｇ）を増殖することができる。図示されているように、１４日間用のプロトコルの過程で種々のステップを実行して、細胞増殖が行われる。ＳＴＡＲＴ動作２２０２が開始され、プロセス２２００は０日目に進み、ディスポーザブルセットが細胞増殖システムに装填される（ステップ２２０６）。次いで、ディスポーザブルセットは、プライミングされる（ステップ２２０８）。ここで、該セットは、例えば、ＰＢＳ（例えば、ロンザＣａ2+／Ｍｇ2+フリー）でプライミングされる。細胞の投入に備えて、ＩＣ／ＥＣ洗浄（ステップ２２１０）を使用してプライミング液は交換される。例えば、一実施形態によれば、システム内のＰＢＳは、ＴｅｘＭＡＣＳ ＧＭＰ基礎培地と交換されてもよい。次に、培地が調整される（ステップ２２１２）。培地調整ステップ２２１２は、細胞がバイオリアクターに投入される前に、培地が、提供されたガス供給と平衡に達することを可能にするために実行される。
次に、０日目に、プロセス２２００は、細胞（例えば、Ｔ細胞（例えばＴｒｅｇ等）の懸濁細胞又は非接着細胞）を投入するステップ２２１４に進む。一実施形態では、ステップ２２１４において、そのような細胞は、「循環せずに中央に細胞を投入する」タスクによって投入される。他の実施形態では、ステップ２２１４において、そのような細胞は、「均一な懸濁で細胞を投入する」タスクによって投入される。
３日目（２２１６）において、細胞が再分配されている間にサイトカインがボーラス添加されてもよい（ステップ２２１８）。実施形態では、細胞の再分配をボーラス添加と組み合わせて行うことで、細胞を混合し、細胞をボーラス添加中のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）に、より完全にさらすことができる。実施形態では、再分配によって、形成された細胞のコロニー又はクラスターを分割分離することができる。実施形態では、再分配は、流体循環路に細胞を循環させることによって、まず行われる。次いで、細胞をバイオリアクターに押し戻すプロセス（例えば、流体を流体循環路に導入して細胞をバイオリアクターに押し戻すこと等）において、ボーラス添加が行われる。再分配及びボーラス添加ステップ２２１８の後、プロセス２０００は細胞フィーディングステップ２２２０に進む。
６日目（２２２２）に、細胞は再び別のボーラス添加しながら再分配される。再分配により、３日目から５日目に形成された細胞のコロニー又はクラスターが分割分離される。ボーラス添加により、細胞は、増殖を促進する追加の試薬にさらされる。プロセス２０００は、６日目に、細胞フィーディングステップ２２２６に進む。９日目（２２２８）に、細胞は再びボーラス添加しながら再分配される（ステップ２２３０）。再分布により、６〜８日目に形成された細胞のコロニー又はクラスターが分割分離される。ボーラス添加によって、細胞は、増殖を促進する追加のサプリメントにさらされる。プロセス２０００は、９日目に、細胞フィーディングステップ２２３２に進む。
１１〜１３日目（２２３４）において、細胞は再びボーラス添加しながら再分配される（ステップ２２３６）。再分配により、９日目から１０日目に形成された細胞のコロニー又はクラスターが分割分離される。ボーラス添加により、細胞は、増殖を促進する追加の試薬にさらされる。プロセス２０００は次に、細胞フィーディングステップ２２３８に進む。実施形態では、ステップ２２３６、２２３８は、１１日目、１２日目、及び１３日目のそれぞれにおいて実行されてもよい。これは、０〜１０日目に細胞を増殖し、バイオリアクター内により多くの細胞が存在する結果として起こり得る。細胞の再分配とボーラス添加では、細胞のコロニー及びクラスターをより頻繁に細かく分離し、それらをボーラス添加の試薬と混合して細胞の増殖を促進することにより、細胞の増殖が促進される。プロセス２２００はＥＮＤ動作２２４０で終了する。
プロセス２３００は、本開示の実施形態による、細胞増殖システムにおいて細胞を増殖するプロセスの動作ステップを示す。プロセス２３００は、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞（例えば、エフェクター、ヘルパー、メモリー、ナイーブ、それらの組み合わせ等のＴ細胞）を増殖するために使用される。示されるように、細胞を増殖するために、８日間のプロトコルの過程でさまざまなステップが実行される。開始操作２３０２が開始され、プロセス２３００は０日目に進み、そこで、ディスポーザブルセットがセル増殖システムに装填される（ステップ２３０６）。次に、ディスポーザブルセットがプライミングされる（ステップ２３０８）。ここでは、該セットはＰＢＳ（例えば、ロンザＣａ２＋／Ｍｇ２＋フリー）でプライミングされる（ステップ２３０８）。細胞の投入の準備において、プライミング流体は、ＩＣ／ＥＣ洗浄ステップ２３１０を使用して交換されてよい。例えば、一実施形態によれば、システム内のＰＢＳは、ＴｅｘＭＡＣＳ ＧＭＰ基礎培地と交換される。他の実施形態では、ＰＢＳは、Ｐｒｉｍｅ ＸＶ基礎培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ＋グルタミン基礎培地、ＲＰＭＩ１６４０＋グルタミン基礎培地、又はＩＭＤＭ＋グルタミンと交換されてもよい。次に、培地は調整される（ステップ２３１２）。培地調整ステップ２３１２によって、細胞がバイオリアクターに投入される前に、培地は、提供されたガス供給との平衡に達することが可能になる。
次の０日目に、プロセス２３００は、細胞投入ステップ２３１４に進む（例えば、Ｔ細胞等の懸濁液又は非接着細胞の投入）。一実施形態では、そのような細胞は、「循環無しで細胞を中央に投入する」タスクによって投入される（ステップ２３１４）。他の実施形態では、そのような細胞は、「均一な懸濁で細胞を投入する」タスクによって投入されてもよい（ステップ２３１４）。いくつかの実施形態では、細胞は、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ−アクチベータービーズ等のビーズと混合されてもよい。実施形態では、ビーズは、約１ビーズ：約１細胞、約２ビーズ：約１細胞、約３ビーズ：約１細胞、又はさらに約４ビーズ：約１細胞等の比率で存在する。いくつかの実施形態では、細胞は単核細胞（例えば、ＰＢＭＣ）である。
２日目（２３１６）において、細胞が再分配されながら、サイトカインがボーラス追加される（ステップ２３１８）。実施形態において、細胞の再分配は、ボーラス添加と組み合わせて行われ、それによって、細胞は混合され、ボーラス添加に含まれるサイトカイン（ＩＬ−２等）に対して、より完全に曝露される。ある実施形態では、再分配は、形成される得る細胞のコロニー又はクラスターを破壊する。ある実施形態において、再分配は、流体循環経路において細胞を循環させることによって、行われる。次いで、流体を流体循環経路に導入すること等により細胞をバイオリアクターに押し戻すプロセスにおいて、ボーラス添加を加える。再分配及びボーラス添加ステップ２３１８の後、プロセス２３００は、細胞フィーディングステップ２３２０に進む。
細胞は、第３日（２３２２）において、さらにボーラス添加を用いて再び再分配される（ステップ２３２４）。再分配は、０日目〜２日目に形成された細胞のコロニー又はクラスターを破壊する。ボーラス添加によって、細胞は、増殖を促進する追加の試薬にさらされる。プロセス２３００は、３日目における、細胞フィーディングステップ２３２６に進む。細胞は、３日目にもう一度、３日目（２３２２）におけるステップ２３２８において、さらなるボーラス添加で再分配される。上述のように、ボーラス添加により、細胞は、増殖を促進し続けるための追加の試薬に曝露される。プロセス２３００は、３日目において、再び細胞フィーディングを行うため、ステップ２３３０に進む。
細胞は、４日目（２３３２）において、さらにボーラス添加を用いてで再び再分配される（ステップ２３３４）。再分配は、３日目に形成された可能性のある細胞のコロニー又はクラスターを破壊する。ボーラス添加によって、細胞は、増殖を促進する追加の試薬にさらされる。プロセス２３００は、４日目における細胞フィーディングステップ２３３６に進む。細胞は、４日目にもう一度、４日目（２３３２）におけるステップ２３３８において、さらなるボーラス添加で再分配される。上述のように、ボーラス添加によって、細胞は、増殖を促進し続けるための追加の試薬にさらされる。プロセス２３００は、４日目において、再び細胞フィーディングを行うためステップ２３４０に進む。実施形態では、ステップ２３３４、２３３６、２３３８、及び２３４０は、５日目、６日目、及び７日目のそれぞれに実行される。これは、０〜４日目に細胞が増殖し、バイオリアクター内に多数の細胞が存在する結果として、行われる。細胞の再分配とボーラス添加を実行すると、細胞のコロニーとクラスターがより頻繁に分解され、ボーラス添加における試薬との混合によって細胞増殖が促進されることにより、細胞の増殖を促進することができる。プロセス２３００は、終了操作２３４２で終了する。
プロセス２４００は、本開示の実施形態による細胞増殖システムにおいて細胞（例えば、懸濁細胞又は非接着細胞）を増殖させるプロセスの動作ステップを示す。いくつかの実施形態では、プロセス２４００を使用してＴｒｅｇのようなＴ細胞を増殖することができる。プロセス２４００のステップの組み合わせにより、初期の低い播種密度を使用して、有用な臨床量への細胞の増殖が可能になる。
ＳＴＡＲＴ動作２４０２が開始され、プロセス２４００は、ディスポーザブルセットが細胞増殖システムに装填されるステップ２４０４に進む。次いで、ディスポーザブルセットは、プライミングされる（ステップ２４０６）。ここで、該セットは、例えば、ＰＢＳ（例えば、ロンザＣａ2+／Ｍｇ2+フリー）でプライミングされる。細胞の投入に備えて、ＩＣ／ＥＣ洗浄（ステップ２４０８）を使用してプライミング液は交換される。例えば、一実施形態によれば、システム内のＰＢＳは、ＴｅｘＭＡＣＳ ＧＭＰ基礎培地と交換されてもよい。他の実施形態では、基礎培地は、Ｐｒｉｍｅ ＸＶ、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ＋グルタミン、ＲＰＭＩ１６４０＋グルタミン、及び／又はＩＭＤＭ＋グルタミンである。次に、培地が調整される（ステップ２４１０）。培地調整ステップ２４１０は、細胞がバイオリアクターに投入される前に、培地が、提供されたガス供給と平衡に達することを可能にするために実行される。
プロセス２４００は、細胞を含む入口体積の流体を投入するステップ２４１２に進む。実施形態では、細胞は、例えばＴｒｅｇ等の１又は複数のタイプのＴ細胞のような非接着細胞を含む。一実施形態では、細胞はＴｒｅｇを含む。実施形態では、細胞を含む入口体積の流体は、ＩＣ入口ポンプを利用して、ＩＣ入口路を介してＩＣ循環路に投入される。実施形態では、ステップ２４１２において、投入入口体積は、ＩＣ循環ポンプを作動させることなく投入される。
プロセス２４００は、バイオリアクターの第１の部分に入口体積を配置するステップ２４１４に進む。実施形態において、配置ステップは、培地を含む第２の体積の流体を、ＩＣ循環路の一部に導入して、細胞を有する入口体積の流体をバイオリアクターの第１の位置に押し動かすことによって、行うことができる。実施形態では、流体の入口体積と流体の第２の体積は同じであってもよい。他の実施形態では、流体の入口体積と流体の第２の体積は異なっていてもよい。さらに他の実施形態では、流体の入口体積と流体の第２の体積との合計は、ＩＣ循環路の体積のあるパーセンテージ分に等しくてもよい。
入口体積配置ステップ２４１４に続いて、プロセス２４００は、細胞を活性化して増殖させる細胞をアクチベーターに曝露するステップ２４１６に進む。いくつかの実施形態では、細胞は、ステップ２４１６において、可溶性のアクチベーターに曝露される。いくつかの実施形態では、抗体複合体を含むアクチベーターは、培地に添加して入口体積に含ませるか、或いは第２の体積のように後で添加される。実施形態では、アクチベーターは、ヒト抗体ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２細胞アクチベーター複合体である。他の実施形態では、アクチベーターは、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を有するビーズである。実施形態では、細胞は、投入ステップ２４１２の前にアクチベーターに曝露される。
プロセス２４００は、第１の期間の間に第１のプロセスに従って細胞をフィーディングするステップ２４１８に進む。一実施形態では、例えば、ステップ２４２０で第１の期間において細胞集団が成長／増殖し始めであり、最小又は低いフィーディングレートでもそのような細胞集団のフィーディング要求を満たすことができる場合、細胞は最小又は低いフィーディングレートでフィーディングされる。例えば、＋０．１ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ入口ポンプ流量が、そのような第１の期間中に使用されてもよい。そのような第１の期間中に中空糸膜バイオリアクターからの細胞の損失を減らすことが望まれる場合、＋０．１ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ入口ポンプ流量に対して、相補的なＩＣ循環ポンプ流量を−０．１ｍＬ／ｍｉｎにマッチングさせるか、略マッチングさせて、細胞培養の成長期において細胞をバイオリアクター内に維持する。
ステップ２４２０から、プロセス２４００は、第２の期間にわたって、細胞を増殖するステップ２４２２に進む。第２の期間の増殖ステップ２４２２は、第２の期間２４２４に第２のプロセスに従って細胞をフィーディングすることを含んでもよい。一実施形態では、そのような第２のプロセスは、例えば、第１の期間中と略同じフィーディングレートで細胞をフィーディングすることを含む。他の実施形態では、第２のプロセスは、第１の期間中に使用されるフィーディングレートと比較して異なるフィーディングレートで細胞をフィーディングすることを含む。例えば、フィーディングレートは、第１の期間にわたる細胞増殖を受けて、増加する。
第２の期間で細胞を増殖しながら（２４２２）、細胞を循環させて細胞コロニー又は細胞クラスターをせん断してもよい（ステップ２４２６）。ステップ２４２６は、ＩＣ循環路内で細胞を循環させて、第１の期間中に形成されたコロニー又はクラスターをせん断することを含んでもよい。コロニー／クラスターせん断ステップ２４２６は、細胞コロニー又は細胞クラスター内の細胞の数を減らす。実施形態では、循環してせん断を行うステップ２４２６により、細胞コロニーにせん断応力が生じ、細胞コロニー内の１又は複数の細胞が細胞コロニーから分割分離する。
プロセス２４００は、次に、収集ステップ２４２８に進む。そこで、細胞は、収穫バッグ又は容器に移される。実施形態では、治療量の細胞を収穫することができる。実施形態では、ステップ２４２８で収穫された細胞は、１×１０9個程度の細胞である。収穫された細胞は、実施形態において、約７５％から約９５％の間の生存率を有する。
次いで、プロセス２４００は、オプションとして、さらなる処理／分析を行うステップ２４３０に進む。そのようなさらなる処理は、例えば、収穫された細胞（例えばＴ細胞又はＴｒｅｇ）の表現型の特徴付けを含んでもよい。一実施形態では、収穫された細胞は、Ｔｒｅｇと一致するバイオマーカーを発現する。例えば、細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、及び／又はＦｏｘＰ３＋バイオマーカーを発現する。ある実施形態では、収穫された細胞は、約８０％を超える頻度でＣＤ４＋ＣＤ２５＋表現型を含む。他の実施形態では、細胞は、約５５％を超える頻度でＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋表現型を含む。他の実施形態では、細胞は、エフェクター、ヘルパー、メモリー、及び／又はナイーブＴ細胞と一致するバイオマーカーを発現する。例えば、細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、及び／又はＣＤ８＋バイオマーカーを発現する。実施形態では、収穫された細胞は、約５０％〜約１００％の頻度でＣＤ３＋表現型を含む。収穫された細胞は、約２５％を超える、約３０％を超える、約３５％を超える、約４０％を超える、約４５％を超える、約５０％を超える、約５５％を超える、又はさらに約６０％を超える頻度でＣＤ４＋表現型を含む。他の実施形態では、細胞は、約３０％〜約１００％の頻度でＣＤ８＋表現型を含む。そして、プロセス２４００はＥＮＤ動作２４３２で終了する。
本開示の実施形態によれば、上記図において示された動作ステップは、あくまで例示の目的であり、再編成されてもよく、他のステップと組み合わせてもよく、又他のステップと並行に行われてもよい。実施形態では、本開示の精神及び範囲から逸脱しなければ、ステップを減らしてもよいし、ステップを追加してもよい。また、例えば、プライミング、培地の調整、細胞の投入のようなステップ（及びサブステップ）は、いくつかの実施形態では、例えば、メモリに記憶された予めプログラムされたタスクを実行するプロセッサによって、自動的に行ってもよい。ここでは、そのようなステップは、あくまでも例示の目的で提示されている。さらに、例えば図１０Ｂに描かれている細胞をフィーディングするための例示的なポンプ流量設定は、例示の目的で提供されている。本開示の実施形態に従って、他のポンプ流量、流量、方向等を使用してもよい。
細胞増殖システムと共に用いられるカスタムタスクや予めプログラムされたタスク等のタスク及びプロトコルの例や詳細な説明は、米国特許出願公開第１３／２６９，３２３号明細書（２０１１年１０月７日出願 タイトル「中空糸バイオリアクターシステムにおける細胞成長及び細胞収穫の設定可能な方法及びシステム」）及び米国特許出願公開第１３／２６９，３５１号明細書（２０１１年１０月７日出願 タイトル「中空糸バイオリアクターシステムにおける細胞成長及び細胞収穫のカスタマイズ可能な方法及びシステム」）に提示される。該米国特許出願の全体は、ここでの開示により明確に本出願に組み込まれる。
次に、図２５は、本発明の実施形態を実行するコンピューティングシステム２５００の構成要素の一例を示す。コンピューティングシステム２５００は、例えば、本明細書で示され及び／又は記載されたプロセスのようなプロセスの一部として、カスタムタスクや予めプログラムされたタスクのようなタスクを実行するために、細胞増殖システムがプロセッサを使用する実施形態において使用される。実施形態において、予めプログラムされたタスクは、例えば、ＩＣ／ＥＣ洗浄及び／又は細胞フィーディングを含んでよい。
コンピューティングシステム２５００は、ユーザインターフェース２５０２、処理システム２５０４、及び／又は記憶装置２５０６を有する。ユーザインターフェース２５０２は、当業者であればわかるように、出力装置２５０８、及び／又は入力装置２５１０を有する。出力装置２５０８は、１以上のタッチスクリーンを有してよい。タッチスクリーンは、１以上のアプリケーションウィンドウを提供するためのディスプレイ領域を有してよい。タッチスクリーンはまた、例えば、ユーザやオペレータからの物理的な接触を受容及び／又は取り込み可能な入力装置２５１０であってもよい。タッチスクリーンは、当業者であれば理解できるように、処理システム２５０４による接触位置の推定を可能とする静電容量構造の液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）でもよい。この場合、処理システム２５０４は、接触位置を、アプリケーションウィンドウの所定位置に表示されるＵＩ要素にマッピングすることができる。また、タッチスクリーンは、本発明において、１以上のその他の電子構造を介して接触を受容してもよい。他の出力装置２５０８としては、プリンター、スピーカ等が挙げられる。その他の入力装置２５１０としては、当業者であれば理解できるように、キーボード、その他のタッチ式入力装置、マウス、音声入力装置等が挙げられる。
本発明の実施形態において、処理システム２５０４は、処理ユニット２５１２、及び／又はメモリ２５１４を有してもよい。処理ユニット２５１２は、メモリ２５１４に記憶された命令を実行するために動作可能な汎用プロセッサであってよい。処理ユニット２５１２は、本発明の実施形態では、単一のプロセッサ又は複数のプロセッサを含んでよい。さらに、実施形態では、各プロセッサとしては、別個に命令を読み込んで実行するための１以上のコアを有するマルチコアプロセッサが可能である。プロセッサは、当業者であれば理解できるように、汎用プロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、その他の集積回路を含んでよい。
本発明の実施形態において、メモリ２５１４は、データ及び／又はプロセッサ実行可能命令を短期に又は長期に記憶する任意の記憶装置を含んでよい。メモリ２５１４は、当業者であれば理解できるように、例えば、ランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）、リード・オンリ・メモリ（ＲＯＭ）、又は電気的消去・プログラム可能型リード・オンリ・メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）を含む。他の記憶媒体としては、例えば、当業者であれば理解できるように、ＣＤ−ＲＯＭ、テープ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、又は、他の光学記憶装置、テープ、磁気ディスク記憶装置、磁気テープ、その他の磁気記憶装置等がある。
記憶装置２５０６は、任意の長期データ記憶装置又は部品である。本発明の実施形態において、記憶装置２５０６は、メモリ２５１４と関連して記載されたシステムのうちの１以上を含んでよい。記憶装置２５０６は、常設してもよいし、取り外し可能でもよい。一実施形態において、記憶装置２５０６は、処理システム２５０４によって生成された又は与えられたデータを記憶する。
［実施例］
以下の説明は、例えば、実施形態の態様を実装するＣＥＳ５００（例えば、図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ）及び／又はＣＥＳ６００（図６）のような細胞増殖システムで使用できるプロトコル／方法／プロセスのいくつかの例を含む。実施例では特定の特徴が説明されているが、そのような実施例は単に例示及び説明の目的で提供されている。例えば、実施例では、Ｔ細胞及び／又はＴｒｅｇ細胞の増殖が行われるが、他の及び／又は追加の細胞タイプ及び／又はそれらの組み合わせが他の実施形態で使用されてもよい。特定のパラメータ、機能、及び／又は値が説明されているが（いくつかの実施形態では、例えばＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）細胞増殖システムのようなＣＥＳの使用）、これらのパラメータ、機能、及び／又は値等は、単に例示目的で提供される。本開示は、本明細書で提供される実施例及び／又は特定の詳細に限定されない。
さらに、本明細書で示される実施例等は、異なるステップや追加のステップ、異なるパラメータや追加のパラメータ又は他の特徴を含む他の実施形態を制限するものではない。ステップ（及びサブステップ）を含む例示される方法又はプロトコルは、いくつかの実施形態では、例えば、メモリに記憶された予めプログラムされたタスクを実行するプロセッサによって、自動的に行われる。他の実施形態では、ステップ（及びサブステップ）は、自動操作及び手動操作を組み合わせることによって行われる。さらに他の実施形態では、ステップ（及びサブステップ）は、オペレータ又はユーザによって、或いは他の手動手段によって、行われる。
そのような実施例においてデータ例が提供されているが、そのような例示されるデータは例示目的で提供されており、異なるステップ、パラメータ、値、材料、又は他の特徴を含む他の実施形態を制限することを意図しない。
実施例１
方法
一般的なＴｒｅｇ細胞培養
免疫磁気分離されたＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔｒｅｇｓは、健康な成人ドナーの末梢血から白血球分離（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）（ＨｅｍａＣａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｖａｎ Ｎｕｙｓ、ＣＡ）から取得でき、その後、３本のＴ２５フラスコ（７ｍＬ／フラスコ）を用いて、２００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−２ ＩＳプレミアムグレードサイトカイン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、ベルギッシュグラッドバッハ）及びＧｉｂｃｏ ＰＳＮ １００Ｘ抗生物質混合物（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）を補充した滅菌ろ過されたＴｅｘＭＡＣＳ（商標）ＧＭＰ培地で、１．０×１０5細胞数／ｍＬの濃度で、テルモＢＣＴにおいて増殖される。続いて、活発に成長しているＴｒｅｇ細胞懸濁液は、３回のＱｕａｎｔｕｍ細胞増殖システムの各実験ランにおいて、接種材料として使用される。接種材料とＱｕａｎｔｕｍシステムの増殖の両方のためのＴｒｅｇは、マイクロビーズなしで、２５μＬ／ｍＬの可溶性四量体Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ（商標）ヒト抗体ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２細胞活性化複合体（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、ＢＣ）を使用して共刺激される。Ｔｒｅｇ接種の場合は０日目と９日目に、ＱｕａｎｔｕｍシステムＴｒｅｇ増殖の場合は０日目に共刺激が行われる。ＱｕａｎｔｕｍシステムＨＦＭバイオリアクターは、１７７．１ｍＬの毛細管内側ループ容量と２１，０００ｃｍ2の表面積によって特徴付けられる。
ＱｕａｎｔｕｍシステムＴｒｅｇ増殖
実施形態によれば、Ｑｕａｎｔｕｍ培地バッグ４Ｌセット（Ｃａｔ．２１０２１）を使用して、ＱｕａｎｔｕｍシステムでのＴｒｅｇ大規模増殖（ｓｃａｌｅ ｕｐ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）のために、２つの滅菌濾過された培地の入ったバッグ（２Ｌ）が準備される。ＴｅｘＭＡＣＳ ＧＭＰ、ＩＬ−２及びＰＳＮ抗生物質を含む完全培地が入った１つの２Ｌバッグを使用して、ＩＣコンパートメントに供給し、ＴｅｘＭＡＣＳ ＧＭＰ及びＰＳＮ抗生物質を含む基礎培地が入ったもう１つの２Ｌバッグを使用して、バイオリアクターのＥＣ入口コンパートメントに供給する。ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ Ｃａｔ．１７−５１６Ｑ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）でＱｕａｎｔｕｍシステムをプライミングした後、ＴＳＣＤ−Ｑ テルモ滅菌溶着機を使用して、培地バッグを適切なＩＣ及びＥＣ入口ラインに接続する。完全培地は、光への曝露から保護されている。
Ｑｕａｎｔｕｍシステムのバイオリアクターに導入するために、Ｑｕａｎｔｕｍ細胞投入バッグ（Ｃａｔ．２１０２０）で、５０ｍＬの完全培地に、無菌法を使用して、各ランの投入総細胞（４．５〜６．５×１０7個のＴｒｅｇ）を再懸濁する。Ｑｕａｎｔｕｍ ＣＥＳ培地バッグ４Ｌ（Ｃａｔ．２１０２１）や廃棄バッグ４Ｌ（Ｃａｔ．２１０２３）等の追加のディスポーザブルバッグも、Ｔｒｅｇ大規模増殖ラン中に使用される。
「循環なしで細胞を中央に投入する」タスクの完了時に、Ｑｕａｎｔｕｍシステムラン（ｎ＝３）に対して、１７７ｍＬの完全培地において２．５〜３．７×１０5細胞数／ｍＬの濃度で、又は中空糸膜バイオリアクターの内腔又は毛細管内側（ＩＣ）コンパートメント内において平均２．１〜３．１×１０3細胞数／ｃｍ2の濃度で、Ｔｒｅｇｓを播種する。
０日目〜４日目
Ｑｕａｎｔｕｍシステムカスタムタスク例
修正された細胞フィーディング
制御性Ｔ細胞のためのＩＣ／ＥＣ交換及び培地調整例
ＩＬ−２サプリメント（２００ＩＵ／ｍＬ）を含むＴｅｘＭＡＣＳ ＧＭＰ完全培地バッグを、テルモＢＣＴ ＴＳＣＤ−Ｑ滅菌溶着機を使用してＱｕａｎｔｕｍシステムのＩＣ培地ラインに取り付ける。ＴｅｘＭＡＣＳ基礎培地をＥＣ培地ラインに取り付ける。それぞれに対して、ＩＣ／ＥＣ洗浄タスク及び培地調整タスクを実行する。ＩＬ−２及び活性化因子複合体の量を節約するために、ＩＣ交換又は洗浄には完全培地が使用され、ＥＣ交換又は洗浄には基礎培地が使用される。
細胞を投入する前に、修正された「細胞フィーディング」をシステムに設定する。ＩＣ入口流量（Ｑ1）及びＩＣ循環流量（Ｑ2）を、５日目、６日目及び７日目に、４日目、５日目及び６日目は反対方向であるが、必要であれば乳酸レベルを５〜８ｍｍｏｌ／Ｌに維持しながら、０．２ｍＬ／ｍｉｎ、０．３ｍＬ／ｍｉｎ及び０．４ｍＬ／ｍｉｎに、マッチングさせた流量で増やす。
Figure 2020531021
Ｑｕａｎｔｕｍシステムカスタムタスク例
循環無しで細胞を中央に投入するタスク例
目的：このタスクにより、懸濁細胞をバイオリアクター膜内の中央に分布させながら、毛細管外側（ＥＣ）循環ループでのフローを可能にする。ＩＣループへのポンプ流量はゼロに設定される。
循環無しの細胞投入を使用して、細胞をＱｕａｎｔｕｍシステムに投入する前に、タスクの変更を入力する。
Figure 2020531021
Figure 2020531021
必要に応じてデフォルトの細胞フィーディングタスクに戻り、細胞フィーディングタスクを使用して増殖プロトコルを続行する。
Figure 2020531021
４日目以降
細胞培養中又は収穫前におけるＴｒｅｇ細胞の再懸濁例
この修正された循環タスクの目的は、培養中又は収穫タスクの開始前に緩く付着している可能性のある細胞を均一に再懸濁することである。
さらに、４日目以降に均一な細胞密度と栄養拡散を維持するために、このタスクを使用して、細胞培養中に２日ごとにＴｒｅｇ細胞コロニーをせん断する。該タスクが培養プロセス中にコロニーをせん断するために使用される場合、Ｑｕａｎｔｕｍシステムは、修正された「細胞フィーディング」タスクに戻される。
Figure 2020531021
修正を伴うＱｕａｎｔｕｍシステム収穫タスク例
Figure 2020531021
収穫された細胞は、さらなる評価と分析のために、ＲＦ溶着によりＱｕａｎｔｕｍシステムから取り出される。
収穫後分析
収穫した細胞は、Ｖｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ ２．０４ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して５〜５０μｍの範囲で列挙され、トリパンブルー染色排除により、膜の完全性が定量化される。
代謝作用
制御性Ｔ細胞代謝は、Ｇカートリッジを使用して（グルコースにはｉ−ＳＴＡＴ Ｇカートリッジ（Ｃａｔ．０３Ｐ８３−２５）、乳酸にはｉ−ＳＴＡＴ ＣＧ４＋カートリッジ（Ｃａｔ．０３Ｐ８３−５０）をそれぞれ使用して）、ｉ−ＳＴＡＴハンドヘルドアナライザー（Ａｂｂｏｔｔ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ、ニュージャージー州プリンストン）によって、毎日、ＱｕａｎｔｕｍシステムのＥＣサンプルポートからモニターされる。
細胞表面バイオマーカー発現（Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）
ヒト制御性Ｔ細胞（天然及び誘導）は、ヒト臍帯血及び末梢血の全てのＴ細胞の小さなサブセット（２〜１０％）を構成する。機能的には、Ｔｒｅｇは、先天性免疫応答と後天性免疫応答の両方における免疫寛容の調節を含む免疫恒常性の維持に関与している。さらに、転写制御因子フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）遺伝子産物の発現は、ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦｏｘＰ３+ＣＤ１２７lo/-Ｔｒｅｇ表現型及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）及びエフェクターＴ細胞（Ｔeff）の免疫抑制と相関することが知られている。ＩＬ−２のＣＤ２５／ＩＬ−２受容体（Ｒα）への結合とＳＴＡＴ５転写因子の活性化は、Ｆｏｘｐ３の誘導に使用される。ＦｏｘＰ３抑制は、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＩＬ２ＲＡ等のいくつかの遺伝子の活性を上方制御し、ヒストンアセチラーゼＫＡＴ５及びヒストンデアセチラーゼＨＤＡＣ７との関連を介してＩＬ−２を下方制御する。
収穫した細胞の表面バイオマーカーのＴｒｅｇ表現型頻度は、フローサイトメトリーにより定量化される。この目的のために、細胞を以下の抗体コンジュゲートで染色され、未染色の生存細胞に対してゲーティングされる：ＦｉｘａｂｌｅＶｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ６５−０８６５）、マウス抗ヒトＣＤ４−ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５６１８４４）、抗ＣＤ４−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５５７７０７）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５６１８４２）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５５５３４６）、抗ＣＤ２５−ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５５５４３２）、抗ＣＤ１２７−ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５５７９３８）、抗ＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ３４７９６７）、及び抗ＦｏｘＰ３−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５６００４５）。標本データは、ＦＡＣＳＤｉｖａ ｖ６．１．３ソフトウェアを装備したビーズ補正ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターで取得できる。これには、１ｘ１０6個の細胞と一サンプルあたり２０，０００個のイベントが使用される。
Figure 2020531021
結果
静的培養におけるＴｒｅｇの予備研究により、これらの細胞は直径１００μｍ程度のマイクロコロニーを形成する傾向があることが示されている。培地交換プロセス中に２日ごとにこれらの細胞を分割分離すると、細胞壊死を制限することに役立ち、また７６２μｍのＩＤ（内径）を持つ１，０００μＬピペット先端を使用して、細胞を高密度の単一細胞懸濁液に戻すことができる。或いは、単一細胞懸濁液を維持するプロセスは、事前にプログラムされたデイリー循環タスクによって、Ｑｕａｎｔｕｍシステムのような、中空糸内腔ＩＤ（内径）が２００μｍ程度である自動ＨＦＭバイオリアクターで、より効率的に達成することができる。さらに、この自動フィーディングタスクは、機能的に閉鎖されたシステムで実行できるため、Ｔｒｅｇ培養への継続的な栄養の流れを維持しながら、汚染の可能性を減らすことができる。
Ｔｒｅｇ細胞密度及び生存率
Figure 2020531021
Figure 2020531021
細胞播種密度予備実験
自動バイオリアクターにおけるドナーから免疫磁気選択された細胞の増殖の準備において、一連の静態的な成長実験を実行して、刺激されたＴｒｅｇが１．０×１０6細胞数／ｍＬ未満の播種密度で培養できるかどうかを判断する。該研究のこの部分は、２４ウェル組織培養プレートの１８ウェルに１．０×１０5細胞数／ｍＬで播種することで、又はＩＬ−２（２００ＩＵ／ｍＬ）及びＰＳＮ抗生物質を添加したＴｅｘＭＡＣＳ ＧＭＰ培地ウェルに１．０×１０5細胞数／ｍＬで播種することで、実行される。これらの細胞は、０日目と９日目に２５μＬ／ｍＬで可溶性抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ ｍＡｂ複合体で共刺激されてもよい。細胞は、Ｖｉ−ＣＥＬＬ ＸＲにより１４日目に、手動で収穫され、カウントされる。
Figure 2020531021
収穫後、フローサイトメトリーによるＴｒｅｇバイオマーカー分析用に、細胞サンプルはプールされる。結果は、ＣＤ４+Ｃ２５+、ＣＤ４+ＣＤ１２７-、及びＣＤ４+ＦｏｘＰ３+表現型の頻度は、静態的培養において、それぞれ９０．９％、７９．７％、３１．６％であることを示す。ＦｏｘＰ３＋の検出は透過法と細胞生存率に大きく依存しているため、ＣＤ４+ＣＤ２５+表現型（＞７０％）は、一般的に、Ｔｒｅｇバイオマーカーの同定において最も信頼できる決定要因である。
この静態的プレートテストのデータは、可溶性共刺激抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ ｍＡｂ複合体及び無血清培地の存在下で培養すると、１０5細胞数／ｍＬ程度の細胞播種密度で、ヒトＴｒｅｇを増殖できる可能性があることを示唆している。
Ｔｒｅｇ代謝作用
制御性Ｔ細胞はミトコンドリアの代謝に依存しており、複数の炭素源、すなわち脂質又はグルコース、を酸化する能力を持っている。解糖と脂肪酸代謝のｍＴＯＲ調節の結果として、高度に増殖性の状態になると、Ｔｒｅｇは代謝を脂肪酸酸化（ＦＡＯ）から解糖にシフトすることが知られている。さらに、ＩＬ−２／ＳＴＡＴ５／エノラーゼ−１プロモーターシグナル伝達及び２−デオキシ−Ｄ−グルコース阻害の研究を通じて、ＦｏｘＰ３バリアントの発現を調節することにより、解糖は、ヒト誘導性Ｔｒｅｇの生成及び抑制機能に必要であることが示されている。従って、グルコースと乳酸のレベルをモニターすることで、Ｑｕａｎｔｕｍシステムの培地流量の調整が容易になり、中空糸バイオリアクターでのＴｒｅｇ増殖を支援する。最初、Ｔｒｅｇは、細胞周期に入り増殖する前に、代謝率を一時的に低下させると考えられる。これは、ＴＣＲ刺激の前に新たに単離されたヒトＴｒｅｇの解糖とｍＴＯＲ活性の一時的な減少によって支持される。具体的には、ｍＴＯＲＣ１は、ｍＴＯＲ経路の上方制御の結果として、Ｇｌｕｔ−１を介したグルコース輸送のようなグルコース輸送体の発現を増加させると考えられる。
３つの別々のＴｒｅｇ細胞アリコートからの３つの増殖の結果は、グルコース消費と乳酸生成が各Ｑｕａｎｔｕｍシステムラン内で相関するであろうことを示している。生体外での３回の増殖ランは全て、Ｔｒｅｇのグルコース消費が１日目までにバックグラウンドレベルを超え、３回のランのうち２回のランは、乳酸生成レベルが２日目までにバックグラウンドレベルを超えて増加することを示す。解凍時の細胞生存率が低下した１つの実行ランでは、乳酸生成速度が遅れることがあり、これは細胞収穫量に反映される可能性がある。最も活発に成長しているＴｒｅｇ培養において、３回のラン中の２回のランの最大グルコース消費率は、それぞれ８日目と７日目に１．６１８ｍｍｏｌ／ｄａｙと２．３４２ｍｍｏｌ／ｄａｙである。最大乳酸生成率は、同じ時点で２．４０６ｍｍｏｌ／ｄａｙ及び３．１５６ｍｍｏｌ／ｄａｙである。
Ｔｒｅｇ増殖の実行の間中、４〜８日目の中空糸膜の内腔内において、ＩＣ入力（＋）及びＩＣ循環（−）のポンプ流量の両方を（±０．１から±０．４ｍＬ／ｍｉｎ）に同時に増加させることにより、乳酸値を７ｍｍｏｌ／Ｌ以下に制御する。Ｔｒｅｇ細胞増殖の過程での最低グルコースレベルは、７日目（Ｑ１５８４）の２６４ｍｇ／ｄＬから８日目（Ｑ１５５８）の２７９ｍｇ／ｄＬの範囲である。これらの実行可能性の増殖のための細胞増殖用培地中において、基本グルコース濃度は、３２５〜３３５ｍｇ／ｄＬであり、これはＱｕａｎｔｕｍシステムの流量調整と組み合わせて使用すると増殖を支援することがわかる。
制御性Ｔ細胞バイオマーカー発現
フローサイトメトリーによるＴｒｅｇ細胞収穫の評価は、この実行可能性研究では、ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦｏｘＰ３+Ｔ細胞サブセットに重点が置かれる。Ｔリンパ球では、１２番染色体上のヒトＣＤ４遺伝子は、主要組織適合性複合体クラスＩＩと相互作用する膜糖タンパク質をコードして、Ｔ細胞活性化の初期段階を開始するように機能する。制御性Ｔ細胞では、第１０染色体上のヒトＣＤ２５（ＩＬ２Ｒ）遺伝子は、ＩＬ−２受容体をコードし、サイトカインＩＬ−２を隔離することにより機能する。制御性Ｔ細胞では、染色体Ｘのフォークヘッド／翼状ヘリックスボックスＰ３ヒト遺伝子は、Ｔｒｅｇサプレッサー機能に不可欠なＦｏｘＰ３転写因子をコードする。ＦｏｘＰ３遺伝子産物は、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ−４及びＩＬ−２、ＩＬ７Ｒ、ＩＦＮ−γ遺伝子のプロモーター領域に結合し、ＣＤ２５及びＣＴＬＡ−４を上方制御し、ＩＬ−２、ＩＬ７Ｒ、及びＩＦＮ−γ遺伝子の転写を抑制する。ＣＤ１２７遺伝子は、ＩＬ−７受容体をコードし、Ｔｒｅｇは、一般に、従来のＴ細胞と比較した場合、低ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）の発現によって特徴付けることができる。但し、特定のＴｒｅｇサブセットは、体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及び体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での活性化中に高いＣＤ１２７レベルを発現することが知られており、細胞をＩＬ−７とインキュベートする場合、Ｔｒｅｇの高い生存率と相関がある。ＣＤ４５ＲＯ遺伝子産物は、活性化するとＣＤ４５ＲＡを失い、ＣＤ４５ＲＯを発現するナイーブ胸腺由来のＴｒｅｇ上で発現される。
Figure 2020531021
ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔｒｅｇ表現型頻度の平均発現は、Ｑｕａｎｔｕｍシステムから収穫された細胞で８５．５％であり、公表されているＣＤ４+ＣＤ２５+放出基準＞７０％に比べて有利である。Ｑ１５６７ Ｔｒｅｇ増殖では、ＣＤ４+ＣＤ１２７low集団の頻度の増加（７４．２％）は、この特定の解凍された細胞サンプルにおける低い細胞生存率の反映である。一実施形態によれば、これらの細胞はサイトカインサプリメントとしてＩＬ−２のみで培養されるためである。播種及び収穫生存率が８０％を超える２つのＱｕａｎｔｕｍシステムの実行によって増殖された細胞では、ＣＤ４+ＦｏｘＰ３+の発現頻度は６１．６％である。この結論は、ＦｏｘＰ３+の６０％以上の公開されたリリース仕様と一致する。さらに、２０億個の細胞増殖の結果は、ＨｅｍａＣａｒｅＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ製品から入手できるオリジナルドナーＴｒｅｇ細胞標本におけるＣＤ３+ＣＤ４５+（８７．３０％）、ＣＤ２５+（４７．７６％）、及びＦｏｘＰ３+（５９．６４％）バイオマーカーの発現と比較して有利である。
追加のフローサイトメトリー解析は、例えば蛍光マイナス１（ＦＭＯ）ゲーティング、異なる染色、異なる機器を使用して、サードパーティの研究所が運営するＱ１５８４増殖からの凍結保存Ｔｒｅｇ細胞で実行される。ＦＭＯコントロールは、データプロット内の全ての蛍光色素に対して、特定のマーカーの頻度を定量化するために使用される１種のみを減らした蛍光色素の広がりを考慮して、細胞集団を解釈するために使用されるゲーティングコントロールの一種である。例えば、サードパーティの実験室からのフローの結果は、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔｒｅｇ細胞の集団頻度がＱ１５８４実行から９５．４％であり、テルモＢＣＴ ＣＥＳ研究所で検出される９０．５％に比べて有利であることを示す。代替抗ＦｏｘＰ３−ＰＥクローン染色による不完全な染色は、この内部バイオマーカーのサードパーティの実験室での定量化を制限する可能性があるが、ドットプロットは、コントロールＴｒｅｇ細胞参照サンプルでは観察されない、Ｑ１５８４標本に高発現ＦｏｘＰ３+Ｔｒｅｇの亜集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）があることを示唆している。これら観察結果は興味深いが、該観察結果を確認するには追加の研究が必要であろう。
収穫率
各実験に対して５０サンプルで定義される５〜５０μｍの範囲にわたるＱ１５５８、Ｑ１５６７、及びＱ１５８４の実験で、Ｑｕａｎｔｕｍシステムの収穫時の生存（トリパンブルー除外された）Ｔｒｅｇ細胞の平均直径は、それぞれ１０．８９μｍ、１１．０４μｍ、及び１１．０６μｍである。これは、バイオリアクターの播種時の各フラスコからの１１．９１μｍ、１２．４０μｍ、及び７．８３μｍである平均細胞直径と同じ程度である。
これらの細胞直径データは、接種フラスコで増殖される細胞の直径よりも、Ｑｕａｎｔｕｍシステムから収穫された細胞の直径の方がより均一であることを示唆している。
Ｔｒｅｇ Ｑｕａｎｔｕｍシステムの収穫データを表１１にまとめる。さらに、Ｑ１５５４／１５８４収穫の結果をＱ１５６７収穫の結果と比較すると、バイオリアクターへの播種時点でのＣＤ４+ＣＤ２５+細胞の生存率の影響が明らかになる。Ｑ１５５４／１５８４増殖ランのバイオリアクター接種材料の生存率は、Ｑ１５６７ランの生存率に対して３２〜４１％高い。これは、元の細胞分離、凍結保存技術、又は保存期間においてばらつきが原因である可能性がある。これは、この研究（ＨｅｍａＣａｒｅ ＰＢ４２５Ｃ−２； Ｌｏｔ １４０３４０１９）で使用される細胞アリコートは２０１４年２月１１日の同じドナーコレクションから得られたためである。
Figure 2020531021
この実行可能性調査の目的は、Ｑｕａｎｔｕｍシステムが市販のサプリメントを用いて７．０×１０7〜１．４×１０9個の細胞の範囲でＴｒｅｇの増殖をサポートできるかどうかを判断することである。Ｑ１５５４及びＱ１５８４からの３つのバイオリアクター収穫のうち２つは、可溶性抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ ｍＡｂ共刺激複合体を使用して、８日未満で、１．０×１０6細胞数／ｍＬの播種密度から平均１．５６×１０9のＴｒｅｇを生成可能である。これは、Ｑ１５５４／１５８４ランにおいては、ＱｕａｎｔｕｍシステムバイオリアクターのＩＣループでの平均収穫細胞密度８．８１×１０6細胞数／ｍＬ又は７．４３×１０4細胞数／ｃｍ2になる。
結論
この実行可能性調査の結果は、本質的に調査的なものであり、必ずしも全ての技術的オプションを網羅するように設計されているとは限らない。例えば、接種Ｔｒｅｇ共刺激を２回から１回の活性化イベントへ低減することを検討できる。従って、免疫磁気分離された制御性Ｔ細胞の自動化されたＱｕａｎｔｕｍシステム増殖で使用され得る方法は、修正されてもよい。ここでの私たちの試みは、培養プロセスの特定の技術的側面を明確にすることであり、これは、Ｑｕａｎｔｕｍシステムプラットフォーム内でのＴｒｅｇｓの大規模な増殖のさらなる研究に役立つ。このような文脈において、上記の研究結果は、これらの結論又は観察結果が合理的であり、研究、開発、又は生産目的の制御性Ｔ細胞の生産に役立つことを示唆する。
Ｑｕａｎｔｕｍシステム自動中空糸バイオリアクターにおいてサイトカインＩＬ−２を補充した場合、ＦｏｘＰ３+／ＣＤ２５+として識別されるヒトＴｒｅｇは、共刺激ｍＡｂでコーティングされたビーズが存在しない状態において、可溶性の共刺激抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｔ細胞複合体で培養及び増殖される。
Ｑｕａｎｔｕｍシステムでは、１×１０6細胞／ｍＬ未満又は６．６×１０4細胞／ｃｍ2未満の細胞播種密度からヒトＴｒｅｇを効率的に増殖できる。この目的のために、１４日未満で７．０×１０8〜１．４×１０9個の範囲の細胞を収穫するという目的は、合計１．０９×１０9個の細胞平均数（ｎ＝３）によって達成される。細胞の平均８５．５％はＴｒｅｇ ＣＤ４+ＣＤ２５+表現型を発現し、平均４２．９％はＣＤ４+ＦｏｘＰ３+表現型を発現する（ｎ＝３）。２０億個細胞のＱｕａｎｔｕｍシステムでの増殖では、総細胞の平均６１．６％がＣＤ４+ＦｏｘＰ３+表現型を発現する。３種類のＱｕａｎｔｕｍシステムＴｒｅｇ細胞増殖ランの１つは、細胞数が限られているため、サードパーティの実験室ヒトＩＭＳＲによってＣＤ４+ＣＤ２５+発現について検証される。
Ｑｕａｎｔｕｍシステムにおいては、自動中空糸バイオリアクターの内腔（ＩＣループ）内の中央に細胞を播種することによって、ヒトＴｒｅｇは好適に培養され増殖される。
乳酸レベルを７ｍｍｏｌ／Ｌ以下に維持し、且つ機能的閉鎖条件下にあるＱｕａｎｔｕｍシステムＨＦＭバイオリアクターの内腔を通って３００ｍＬ／ｍｉｎのＩＣ循環流量で細胞マイクロコロニーをせん断することによりＴｒｅｇ培養において単一細胞懸濁液を維持するため、培地ＩＣ入力（＋０．１〜＋０．４ｍＬ／ｍｉｎ）及びＩＣ循環（−０．０〜−０．４ｍＬ／ｍｉｎ）を並行して調整して、Ｔｒｅｇ細胞増殖プロセスをサポートする。
実施例２
以下の表は、Ｔ細胞の増殖のためのプロトコル例を実行する数日間にわたる細胞増殖システムの種々のコンポーネント（例えば、ポンプ、揺動装置、バルブ等）のタスク設定（例えば、流量、角回転、出力等）の例を示している。プロトコルは以下のシーケンスに従う。
０日目：セット装填、プライミング、培地添加、細胞投入、フィーディング開始。
３日目：細胞を再分配しながらサイトカインをＩＣループにボーラス添加。フィーディングを再度開始。
６日目：細胞を再分配しながらサイトカインをＩＣループにボーラス添加。フィーディングを再度開始。
９日目：細胞を再分配しながらサイトカインをＩＣループにボーラス添加。フィーディングを再度開始。
１１〜１３日目：収穫；残存細胞の再投入。収穫（１４日目）。
設定表：工場出荷時設定に対する変更は太字且つ下線で強調される。
Figure 2020531021
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実施例３
Ｑｕａｎｔｕｍシステムを使用してＴ細胞を増殖するための第１のプロトコルは、ＣＤ３＋／ＣＤ２８＋Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ）を使用してＣＤ３＋Ｔ細胞を刺激することによって行う。Ｄｙｎａｂｅａｄｓは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と同様のサイズの３次元ビーズにバインドされた２つの活性化信号ＣＤ３及びＣＤ２８を利用して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）からの生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）Ｔ細胞活性化を模倣する。Ｄｙｎａｂｅａｄｓは、未処理のアフェレーシス製剤からの１００Ｅ＋０６のリンパ球と混合される。
細胞は、合計７回のラン実行及び３つの異なるドナーによって、無血清培地（ＴｅｘＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、Ｑｕａｎｔｕｍシステムで１２〜１３日間増殖される。無血清培地においては、サイトカインＩＬ−２及びＩＬ−７が、フィーディング培地に添加され、３、６、及び９日目にシステムに添加される。
細胞増殖の結果は、平均で、１０Ｅ＋０９±４Ｅ＋０９の数のＴ細胞となり、２６１±１８８倍の増殖及び４０±４時間の細胞倍加時間を示す。
増殖後の細胞表現型は、ＣＤ３＋＝９８±３％、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋＝３８±１３％、ＣＤ３＋／ＣＤ８＋＝６０±１２％である。
以下は、Ｔ細胞を増殖するために、（例えば、上記のように）第１のプロトコルに関して行われた変更を伴う、第２のプロトコルのいくつかの特徴の説明である。第２のプロトコルの変更は、いくつかの実施形態に従って、細胞増殖を増強する。図２６は、第１のプロトコルと第２のプロトコルとを比較する、培養日数に対する細胞数のグラフを示す。
増殖前に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離する。ＰＢＭＣの分離によって、新鮮な細胞又は凍結した細胞を出発細胞産物として使用できる。ＰＢＭＣ分離の追加の利点は、細胞形質導入の過程にもある。ＣＡＲ−Ｔ細胞（キメラ抗原受容体Ｔ細胞）の製造には、レトロウイルスベクターを使用した活性化Ｔ細胞の形質導入が必要な場合がある。「汚染」細胞集団を最小限に抑えることは、このプロセスにとって重要である。汚染細胞としては、ＣＤ３＋Ｔ細胞ではない任意の細胞（赤血球、血小板、単球、顆粒球等を含む）が挙げられる。
細胞フィーディングの間、細胞をバイオリアクターの中空糸内に維持する。中空糸バイオリアクターは、全てのガス移動及び栄養素移動が中空糸の半透膜を介して行われるように設計される。この効率的な設計の利点を最大化するために、細胞集団をそのような場所に維持することは改善につながる。Ｔ細胞のような非接着細胞は、流体力学を用いて、この空間に保持することができる。流体は、バイオリアクターのＩＣ入口ヘッダーとＩＣ出口ヘッダーの両方に、同じ流量でコンスタントに流れ込む。
フィーディング戦略を改善する。フィーディング戦略の改善は２つある。まず、従来の細胞培養方法では、細胞集団に十分な栄養素を供給し、代謝廃棄物（特に乳酸）を除去するために、特定の時間間隔で培地を交換するか、或いは指定の流量で連続的に灌流する必要がある。第１のプロトコルでは、乳酸濃度は２０ｍｍｏｌ／Ｌを超え、グルコースレベルは開始濃度の１／３未満に下がる。ほとんどの標準的な細胞培養方法では、これは最適な条件をはるかに下回る可能性がある。第２のプロトコルでは、フィーディングレートを上げて、乳酸レベルを１５ｍｍｏｌ／Ｌ未満に維持し、グルコースレベルを開始濃度の５０％より上に（例えば３００ｍｇ／ｄＬ）に保つ。
これらのフィーディングレートの増加は、独立したＩＣ及びＥＣフィーディングレート方法に対して、さらに設定されてもよい。ＩＣフィーディングレートは、分子量が１２ｋＤａを超え且つバイオリアクター中空糸内の細胞の物理的な位置に影響を与える培地成分の細胞培養要求に対して決定される。中空糸膜は半透過性であり、限外濾過によるフィーディングを使用して細胞を中空糸内に保持できるため、ＩＣ培地に含まれるより大きな分子量の成分がバイオリアクターのＩＣ側に保持される。細胞の位置については、ＩＣのフィーディングレートが大きい程、細胞集団はリアクターの中心に向かって集中する。ＥＣフィーディングレートは、細胞培養集団のグルコース需要と乳酸除去の必要性によって決定される。このアプローチは、潜在的なコスト上の利点を提供する。サイトカインやタンパク質等の高価な培地添加物（それらは最低限の濃度が必要になる）は、ＩＣ培地にのみ追加される。グルコース供給や乳酸除去要件が通常、より高くなるので、それら培地添加物は節約される。
細胞増殖の全期間にわたって毎日細胞は再分配される。これにより、Ｔ細胞の増殖中に一般的に観察される細胞凝集体の形成が最小限に抑えられる。これらの凝集体は壊死中心を形成する可能性がある（凝集体の中心にある細胞は、酸素と栄養素が奪われる）。
開始製剤が新鮮である（凍結保存ではない）場合、さらなる改善が観察される。図２７を参照。ほとんどの細胞型は、凍結保存によって引き起こされるストレッサーがない場合、より好適に増殖する。典型的には、凍結保存された細胞は、新鮮な細胞の場合よりも長く遅滞期にとどまり、その後同様の速度で増殖する。図２７は、新鮮な細胞と凍結細胞の両方を使用して、第１のプロトコルと第２のプロトコルとを比較した、培養日数に対する細胞数のグラフを示す。
追加のプロトコルによる改良は、刺激ビーズ対細胞比を１：２から２：１に増加させること、及び無血清培地のタイプを変更することを含む。ビーズと細胞の比率を上げると、刺激中に細胞／ビーズが相互作用する確率が高まり、増殖の一貫性が向上する。図２８は、２つのドナーを使用し且つ１ビーズ：１細胞及び２ビーズ：１細胞のビーズ比率を使用して、第１のプロトコルと第２のプロトコルとを比較した、培養日数に対する細胞数のグラフを示す。ＴｅｘＭＡＣＳと比較して、Ｐｒｉｍｅ ＸＶ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の無血清培地を使用した場合、細胞は、より好適に増殖する。図２９は、異なる培地を使用して、第１のプロトコルと第２のプロトコルとを比較した、培養日数に対する細胞数のグラフを示す。両方の培地の製法は製造販売の権利で機密であるため、正確な理由は特定されない場合がある。
以下は、Ｑｕａｎｔｕｍ（登録商標）細胞増殖システムの多用途性を実証するいくつかの例である。
多用途性の第１の実証は、Ｑｕａｎｔｕｍシステムに播種するために使用される細胞の数が減少することである。これにより、ＰＢＭＣ供給が不足している場合（例えば、患者からの収集が不十分な場合）に、及び接種材料のための初期増殖を行うために別の装置や別のフラスコを追加で必要とせずに、Ｔ細胞を増殖させることができる。
多用途性の第２の実証は、様々な細胞培養培地タイプが使用されることである。無血清培地は、細胞療法の製造プロトコルで使用することが、より一般的になっており、（化学的に定義された）変動を最小限に抑え、異種由来（ｘｅｎｏ）及びヒト由来のサプリメントを排除する。
データ
ＰＢＭＣは、健康なドナーのアフェレーシス製剤（ＡｌｌＣｅｌｌｓ又はＫｅｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を介して、又はＴｒｉｍａ単一血小板収集におけるＬＲＳチャンバーから収集される。
全てのＱｕａｎｔｕｍシステムＴ細胞増殖ランでは、２つの分離方法（流体勾配分離（ｆｉｃｏｌｌ）及びエルトリエーション（Ｅｌｕｔｒａ））のうちの１つから分離された凍結保存ＰＢＭＣで播種される。
（８０〜１２０）Ｅ＋０６のＰＢＭＣが播種されたＱｕａｎｔｕｍシステム増殖ランは、表２２に要約される。図３０は、異なる培地を使用した、第１のプロトコルと第２のプロトコルとを比較した、培養日数に対する細胞数のグラフを示す。
ＴｅｘＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の基礎培地を使用すると、細胞増殖は平均して２８Ｅ＋０９±２Ｅ＋０９細胞数であり、〜５５０倍の増殖と２６時間の倍加時間を示す。
ＲＰＭＩ Ａｄｖａｎｃｅｄ（Ｇｉｂｃｏ）基礎培地を使用すると、細胞増殖は平均して３７Ｅ＋０９±８Ｅ＋０９細胞数であり、〜７５０倍の増殖と２０時間の倍加時間を示す。
ここで、ＲＰＭＩ Ａｄｖａｎｃｅｄには、ＦＢＳから派生したＡｌｂｕｍａｘが含まれていることに留意されたい。
Ｐｒｉｍｅ ＸＶ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）基礎培地を使用すると、細胞増殖は平均２６Ｅ＋０９±２Ｅ＋０９細胞数であり、〜５２５倍の増殖と２１時間の倍加時間を示す。
細胞培養倍加時間を元のプロトコルの３７時間から新しいプロトコルを使用して２１時間に変化することは非常に重要である。例えば、表２２を参照。これを説明するために、Ｑｕａｎｔｕｍシステムにおける実際の収穫数の例を使用する。
細胞培養倍加時間が３７時間の場合、５０Ｅ＋０６の細胞を１Ｅ＋０９の細胞に増殖するのに６．６日必要であろう。
細胞培養倍加時間が２１時間の場合、同じ６．６日間で、５０Ｅ＋０６細胞は、１０Ｅ＋０９の細胞に増殖される。これは、細胞増殖能力の１０倍の増加になる。
Figure 2020531021
３０Ｅ＋０６のＰＢＭＣが播種されたＱｕａｎｔｕｍシステム増殖ランは、表２３に要約される。図３１は、異なる培地を使用した第２のプロトコルを比較する、培養日に対する細胞数のグラフを示す。
ＲＰＭＩ１６４０基礎培地を用いた細胞増殖では、１０Ｅ＋０９±３Ｅ＋０９の細胞となり、〜８５０倍の増殖と２２時間の倍加時間を示す。
ＴｅｘＭＡＣＳ基礎培地を用いた細胞増殖では、１１Ｅ＋０９の細胞となり、〜７２５倍の増殖と２２時間の倍加時間を示す。
ＲＰＭＩ Ａｄｖａｎｃｅｄ基礎培地を用いた細胞増殖では、２５Ｅ＋０９の細胞となり、〜１６７５倍の増殖と２０時間の倍加時間を示す。
Ｐｒｉｍｅ ＸＶ基礎培地を用いた細胞増殖では、平均して１５Ｅ＋０９±１Ｅ＋０９の細胞となり、〜１０００倍の増殖と２２時間の倍加時間を示す。
ＩＭＤＭ（ロンザ）基礎培地を用いた細胞増殖では、平均して１５Ｅ＋０９±６Ｅ＋０９の細胞となり、〜１０００倍の増殖と２２時間の倍加時間を示す。
Figure 2020531021
図３２及び図３３は、Ｐｒｉｍｅ ＸＶ培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い且つ３０Ｅ＋０９のＰＢＭＣを播種し且つ実施例４に記載されているプロトコルに従って増殖した細胞の細胞表現型を示す。各ドナーについて、「Ｐｒｅ」は増殖前の細胞集団の表現型を示し、「Ｐｏｓｔ」は増殖後の細胞集団の表現型を示す。
第２のプロトコルにおける細胞表現型は、第１のプロトコルによるＴ細胞増殖の細胞増殖と同様の一般的な傾向に従う。すなわち、増殖におけるＣＤ３＋中のＣＤ４＋のパーセンテージは減少し、ＣＤ３＋中のＣＤ８＋のパーセンテージは増加する。
ＣＤ５４ＲＡ／ＲＯ染色に基づくメモリー表現型又はナイーブ表現型であるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、第１のプロトコルでは得られなかった表現型の特徴であり、細胞の記載において追加の粒度（ｇｒａｎｕｌｒｉｔｙ）を提供する（図３３）。
この時、表現型の特徴付けの許容基準はない。
図３４〜図３６は、Ｐｒｉｍｅ ＸＶ培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い且つ３０Ｅ＋０９のＰＢＭＣを播種し且つ実施例４で説明されるプロトコルに従って増殖されたＴ細胞の機能性を示す。
各ドナーについて、「ＰＢＭＣ」は増殖前の細胞集団を示し、「Ｈａｒｖ」は増殖後の細胞集団を示す。
Ｔｈ１／エフェクター表現型に関連するＴ細胞機能性は一般的に、サイトカインＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２を産生する能力によって測定される。これらの結果は、Ｔ細胞集団が増殖及び再刺激後においてこれらのサイトカインのより高いレベルの産生を示している。
この時、特定のサイトカイン産生レベルに対する許容基準はない。
結果
ＱｕａｎｔｕｍシステムでのＴ細胞の増殖は、バイオリアクターの中空糸内における増殖する細胞集団の維持、乳酸濃度レベル＜１５ｍｍｏｌ／Ｌの維持、刺激ビーズと細胞の比率の増加等のプロセスの変更によって大幅に向上する。
同様の開始細胞数を使用した場合、平均Ｔ細胞収穫率は４０％少ない時間で３倍に増加する。これは、細胞の増殖能力において１０倍の増加である（細胞培養の倍加時間の比較に基づく）。
第２のプロトコルを使用して増殖されたＴ細胞は、第１のプロトコルから収集されたものと同様の表現型の特徴を持ち、機能的に生存可能な細胞である。
Ｔ細胞は、様々な細胞培養培地オプションを使用して、Ｑｕａｎｔｕｍシステムで増殖することができ、全てが同様の増殖パターンである。
Ｔ細胞は、少量のＰＢＭＣ開始製剤からＱｕａｎｔｕｍシステムで増殖できる。３０Ｅ＋０６のＰＢＭＣは、健康なドナー（白血病及びリンパ腫協会）からの平均２０ｍＬの全血から分離することができる。これは、分離中に細胞の５０％が失われ、処理中に別の５０％が失われることが想定される。
実施例４
この例における手順の目的は、実施形態に係る、Ｑｕａｎｔｕｍシステムにおける増殖のためにＴ細胞を準備することである。
装置
１．層流バイオセーフティキャビネット
２．ウォーターバス
３．細胞係数装置（顕微鏡、自動計数装置）
４．遠心分離機
５．揺動装置（Ｎｕｔａｔｏｒ）（細胞混合装置）
器具
１．５０ｍｌ遠心分離管：ポリプロピレン製、殺菌済
２．６０ｍｌシリンジ：オス型ルアーロック付き
３．０．５Ｌ細胞投入バッグ、アクセサリセット
試薬
１．ヒトＡＢ血清（ｈＳＥＲ）
２．リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
３．ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（ＣＤ３＋／ＣＤ２８＋）
４．末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
５．完全培地（下記参照）
６．基礎培地（下記参照）
手順
様々な培養培地を使用して、ＱｕａｎｔｕｍシステムでＴ細胞を増殖させる（表２４を参照）。この表は、これらがＱｕａｎｔｕｍシステムで使用できる唯一可能な培地であることを示すものではない。
Figure 2020531021
開放して行うイベントは、バイオセーフティキャビネット内で行われなければならないことに留意されたい。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ
１．（８０〜１２０）Ｅ＋０６のＰＢＭＣについて、２：１のビーズ対ＰＢＭＣ比のＤＹＮＡＢＥＡＤＳが使用される。
１ａ．３０Ｅ＋０６のＰＢＭＣについて、３：１のビーズ対ＰＢＭＣ比のＤＹＮＡＢＥＡＤＳが使用される。
２．ＤＹＮＡＢＥＡＤＳは、製品説明書に従って洗浄される。
３．ビーズは、所望の基礎培地に再懸濁される。
ＰＢＭＣの解凍
新鮮なＰＢＭＣの場合、以下のステップ７から始まることに留意された。
４．所望の数のＰＢＭＣを解凍する。
５．クライオチューブバイアルを液体窒素から取り出し、そのバイアルを３７°Ｃのウォーターバスで解凍する。
６．直ちに、解凍したバイアルあたり１０ｍＬのＰＢＳ＋５％ｈＳＥＲを含む５０ｍＬ遠心分離管に細胞を無菌状態で移す。
７．３００ｘｇで７分間遠心分離を行う。
８．液体を捨て、１０ｍＬ ＰＢＳ＋５％ｈＳＥＲに細胞を再懸濁し、細胞計数を実行する。
９．ＰＢＳに懸濁した細胞と基礎培地に懸濁したビーズを合わせて、５０ｍＬ遠心分離管において１ｍＬあたり（４〜６）Ｅ＋０６の細胞及びビーズの濃度にする。
ここでは、基礎培地を用いて、細胞／ビーズの混合物は適切な濃度に希釈される。
１０．細胞／ビーズの混合物を１０分間室温で穏やかに混合する（攪拌、揺動（ｎｕｔａｔｅ）、振動等）。
１１．基礎培地を使用して、細胞／ビーズ混合物を５０ｍＬに希釈する。
１２．バイオセーフティキャビネット内で、細胞投入バッグを開封する。
１３．６０ｍＬシリンジを開封する。
１４．シリンジプランジャーを取り外し、無菌状態で配置する。
１５．細胞投入バッグラインから青いルアーキャップを取り外し、ルアーロック端付きの６０ｍＬシリンジを細胞投入バッグラインに取り付ける。
１６．測定手段としてシリンジを使用する場合は、シリンジの下の細胞投入バッグラインに止血鉗子（ｈｅｍｏｓｔａｔ）を取り付ける。
１７．細胞投入バッグの上にシリンジを保持しながら、細胞又は試薬をシリンジに注ぐ。
１８．重力流によって細胞は細胞投入バッグに入る。
１９．プランジャーをシリンジ内に静かに押し込んで、最低４０ｍＬの空気をバッグに導入する。
２０．プランジャーとシリンジを細胞投入バッグラインに取り付けたままにする。
２１．（８０〜１２０）Ｅ＋０６のＰＢＭＣの播種のため、実施例５のＱｕａｎｔｕｍシステムプロトコル設定を使用する。
２２．３０Ｅ＋０６のＰＢＭＣの播種のため、実施例６のＱｕａｎｔｕｍシステムプロトコル設定を使用する。
実施例５
以下の表は、Ｔ細胞増殖プロトコルを実施する期間における、細胞増殖システムの様々なコンポーネント（ポンプ、揺動装置、バルブ等）のタスク設定（例えば、流量、角回転、出口等）例を示す。該プロトコルは以下のシーケンスに従う。
０日目：ディスポーザブルセット装填、プライミング実施、培地添加、細胞投入、フィーディング開始。
２日目：細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにボーラス添加する。再度フィーディング開始。
３日目：細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにボーラス添加する。再度フィーディング開始。細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにさらにボーラス添加する。再度フィーディング開始。
４日目：細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにボーラス添加する。再度フィーディング開始。細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにさらにボーラス添加する。再度フィーディング開始。
５日目：細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにボーラス添加する。再度フィーディング開始。細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにさらにボーラス添加する。再度フィーディング開始。
６日目：細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにボーラス添加する。再度フィーディング開始。細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにさらにボーラス添加する。再度フィーディング開始。
７日目：細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにボーラス添加する。再度フィーディング開始。細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにさらにボーラス添加する。再度フィーディング開始。
８日目：細胞収穫。
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実施例６
以下の表は、他の例のＴ細胞増殖プロトコルを実施する期間における、細胞増殖システムの様々なコンポーネント（ポンプ、揺動装置、バルブ等）のタスク設定（例えば、流量、角回転、出口等）例を示す。該プロトコルは以下のシーケンスに従う。
０日目：ディスポーザブルセット装填、プライミング実施、培地添加、細胞投入、フィーディング開始。
２日目：細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにボーラス添加する。再度フィーディング開始。
３日目：細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにボーラス添加する。再度フィーディング開始。
４日目：細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにボーラス添加する。再度フィーディング開始。
５日目：細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにボーラス添加する。再度フィーディング開始。
６日目：細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにボーラス添加する。再度フィーディング開始。細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにさらにボーラス添加する。再度フィーディング開始。
７日目：細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにボーラス添加する。再度フィーディング開始。細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにさらにボーラス添加する。再度フィーディング開始。
８日目：細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにボーラス添加する。再度フィーディング開始。細胞を再分配しながら、サイトカインをＩＣループにさらにボーラス添加する。再度フィーディング開始。
９日目：細胞収穫
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本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の方法及び構造に様々な修正及び変更を加えることができることは、当業者にとって明らかであろう。従って、本発明は、与えられた特定の例に限定されるものではないと理解されるべきである。むしろ、本発明は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内の修正及び変形を網羅することを意図している。

Claims (20)

  1. 細胞増殖システムにおいて細胞を増殖する方法であって、該方法は、
    複数の細胞を含む第１の体積の流体を、前記細胞増殖システムの第１の流体流路に投入するステップであって、前記第１の流体流路にはバイオリアクターが流体的に関連付けられているステップと、
    培地を含む第２の体積の流体を、前記第１の流体流路の一部に投入して、前記第１の体積の流体を、前記バイオリアクターの第１の部分に位置付けるステップと、
    前記複数の細胞をアクチベーターにさらすステップと、
    第１の期間の間、第１のプロセスに従って、前記細胞に対してフィーディングを行うステップと、
    前記第１の期間の間、前記複数の細胞を増殖するステップと、
    前記第１の期間の間、前記複数の細胞を増殖する前記ステップの後、第２の期間の間、第１の循環流量で前記複数の細胞を循環させて、第１の細胞クラスターにおける細胞の数を減らすステップと
    第２のプロセスに従って、前記細胞に対してフィーディングを行うステップと、
    第３の期間の間、前記複数の細胞を増殖するステップであって、前記第３の期間は２４時間未満であるステップと、
    前記第３の期間の間、前記複数の細胞を増殖する前記ステップの後、第４の期間の間、第２の循環流量で前記複数の細胞を循環させて、第２の細胞クラスターにおける細胞の数を減らすステップと、
    前記細胞を収穫するステップと、
    を有する、
    方法。
  2. 請求項１記載の方法において、前記第１のプロセスは、
    培地を含む第３の体積の流体を、第１の流量で、前記バイオリアクターの第１のポートにポンプで移動させるステップと、
    培地を含む第４の体積の前記流体を、第２の流量で、前記バイオリアクターの第２のポートにポンプで移動させるステップと、
    を有し、
    前記流体を前記第２の流量で前記バイオリアクターに移動させる方向は、前記流体を前記第１の流量で前記バイオリアクターに移動させる方向と反対である、
    方法。
  3. 請求項２記載の方法において、前記第２のプロセスは、
    培地を含む第５の体積の流体を、第３の流量で、前記バイオリアクターの前記第１のポートにポンプで移動させるステップと、
    培地を含む第６の体積の流体を、第４の流量で、前記バイオリアクターの前記第２のポートにポンプで移動させるステップと、
    を有し、
    前記流体を前記第４の流量で前記バイオリアクターに移動させる方向は、前記流体を前記第３の流量で前記バイオリアクターに移動させる方向と反対である、
    方法。
  4. 請求項３記載の方法において、前記複数の細胞は、Ｔ細胞を含む、
    方法。
  5. 請求項４記載の方法において、前記アクチベーターは、ビーズ上に配置される、
    方法。
  6. 請求項５記載の方法において、前記複数の細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む、
    方法。
  7. 請求項６記載の方法において、前記複数の細胞は、約１×１０6個から約５００×１０6個のＰＢＭＣを含む、
    方法。
  8. 請求項７記載の方法において、前記第１の体積の流体は、ヒト血清を含む、
    方法。
  9. 請求項８記載の方法において、前記増殖された細胞は、約１×１０9から約１００×１０9個の細胞を含む、
    方法。
  10. 請求項９記載の方法において、該方法を行っている間は、乳酸レベルは約１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下に維持される、
    方法。
  11. 第１のポートと第２のポートとを備えるバイオリアクターと、
    少なくとも両端部を有する第１の流体流路と、
    前記第１の流体流路と流体的に関連付けられた流体入口路と、
    前記第１の流体流路及び前記バイオリアクターと流体的に関連付けられた第１の流体循環路と、
    流体を前記第１の流体流路に循環させるための第１のポンプと、
    前記流体を前記第１の流体循環路に循環させるための第２のポンプと、
    プロセッサと、
    前記プロセッサと通信可能であり且つ前記プロセッサによって読み出し可能であるメモリと、
    を備えた、
    細胞増殖システムであって、
    前記第１のポートと前記第２のポートは、前記バイオリアクターの両端部に位置付けられ、
    前記第１の流体流路の第１の端部は、前記バイオリアクターの前記第１のポートと流体的に関連付けられ、前記第１の流体流路の第２の端部は、前記バイオリアクターの前記第２のポートと流体的に関連付けられ、
    前記メモリは一連の命令を有し、前記命令が前記プロセッサによって実行されると、前記プロセッサは、
    細胞を前記バイオリアクターへ投入することを指示し、
    培地を含む前記流体を前記バイオリアクターにおける前記細胞にフィーディングする第１のフィーディングを指示し、
    前記第１のフィーディングは、
    前記第１のポンプを動作させて、前記流体の第１の部分を、第１の流量で、第１の方向に、移動させることと、
    前記第２のポンプを動作させて、前記流体の第２の部分を、第２の流量で、前記第１の方向と反対の第２の方向に、移動させることと、
    を含み、
    前記プロセッサはさらに、
    前記第１のフィーディングの後、第１の期間の間、前記第２のポンプを動作させて前記細胞を第１の循環流量で循環させることによって、前記細胞の第１の再分配を行うことを指示し、
    前記流体を前記バイオリアクターにおける前記細胞にフィーディングする第２のフィーディングを指示し、
    前記第２のフィーディングは、
    前記第１のポンプを動作させて、前記流体の第３の部分を、第３の流量で、前記第１の方向に、移動させることと、
    前記第２のポンプを動作させて、前記流体の第４の部分を、第４の流量で、前記第１の方向と反対の前記第２の方向に、移動させることと、
    を含み、
    前記プロセッサはさらに、
    前記第２のフィーディングの後、第２の期間の間、前記第２のポンプを動作させて前記細胞を前記第１の循環流量で循環させることによって、前記細胞の第２の再分配を行うことを指示し、
    前記流体を前記バイオリアクターにおける前記細胞にフィーディングする第３のフィーディングを指示し、
    増殖した細胞の収穫を指示する、
    細胞増殖システム。
  12. 請求項１１記載の細胞増殖システムにおいて、前記細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む、
    細胞増殖システム。
  13. 請求項１２記載の細胞増殖システムにおいて、前記増殖された細胞は、１又は複数の、Ｔ細胞の亜集団を含み、該Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、及びそれらの組み合わせを含む、
    細胞増殖システム。
  14. 請求項１３記載の細胞増殖システムにおいて、前記増殖された細胞のうちの約９０％を超える細胞は、ＣＤ３＋を発現する細胞である、
    細胞増殖システム。
  15. 請求項１４記載の細胞増殖システムにおいて、前記増殖された細胞のうちの約５０％を超える細胞は、ＣＤ４＋を発現する細胞である、
    細胞増殖システム。
  16. 請求項１５記載の細胞増殖システムにおいて、前記増殖された細胞のうちの約３０％を超える細胞は、ＣＤ８＋を発現する細胞である、
    細胞増殖システム。
  17. 請求項１１記載の細胞増殖システムにおいて、前記細胞は、前記細胞を前記バイオリアクターに投入する前に、アクチベーターにさらされる、
    細胞増殖システム。
  18. 請求項１７記載の細胞増殖システムにおいて、前記アクチベーターはビーズ上に配置される、
    細胞増殖システム。
  19. 請求項１１記載の細胞増殖システムにおいて、前記流体はグルコースを含む、
    細胞増殖システム。
  20. 請求項１９記載の細胞増殖システムにおいて、前記流体中のグルコースは、前記流体における開始濃度の少なくとも５０％のレベルに維持される、
    細胞増殖システム。
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