CN103732733A - 在中空纤维生物反应器中扩增干细胞 - Google Patents

在中空纤维生物反应器中扩增干细胞 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用中空纤维生物反应器技术产生大量细胞。所述细胞是非胚胎干细胞、非生殖细胞，其具有以下一个或多个特征：无需转化而在培养中长期复制、长期复制的标志物例如端粒末端转移酶、多能性标志物和广泛的分化潜能。

Description

在中空纤维生物反应器中扩增干细胞
技术领域
本发明涉及使用中空纤维连续灌注生物反应器技术产生大量细胞。所述细胞是非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可以通过以下一项或多项进行表征：无需转化而在培养中长期复制、长期复制的标志物例如端粒末端转移酶、多能性标志物和广泛的分化潜能。
背景技术
中空纤维生物反应器技术已用于实现细胞的高密度扩增。通常，细胞在许多中空纤维内和/或外扩增。由于这类设计提供的大表面面积，使用所述纤维作为培养基质能够产生大量的细胞，尤其是用于临床应用的细胞。这种技术，首先由Knazek在20世纪70年代开发，已经经历很多的发展和改进。基本概念是提供可透过营养物、气体和其他基础培养基成分以及细胞废物、但不能透过细胞并且所述细胞可在其上扩增的纤维基体。
在半渗透性的管状膜上的细胞培养最初由Knazek在20世纪70年代早期发明。见，例如，U.S.3,821,087；3,883,393；4,220,725；4,184,922；和4,200,689。根据所述发明，使悬浮于营养培养基中的细胞停留在毛细管的外表面，所述毛细管被流经所述毛细管的充氧营养培养基连续灌注。营养物质从所述灌注培养基扩散穿过所述毛细管壁并进入细胞中，而细胞废物从所述细胞扩散穿过所述毛细管壁进入所述灌注液，可从所述灌注液中回收那些产物。
作为对失败的尝试将细胞培养成密度和/或结构接近活组织的那些细胞的反应，开发了所述技术。主要地，在培养活细胞至非常高的密度例如至组织中的密度方面存在问题。第一，当细胞层的厚度增加时，培养基组分必须扩散穿过所述细胞层以到达所有细胞。第二，在细胞培养期间必须维持适当的微环境。因此，紧密靠近生长的细胞的流体随着细胞代谢的进行而不断地改变，并只有当更换或搅动所述培养基时以逐步的方式恢复至其最初的状态。第三，需要在其上培养所述密集细胞的晶格或合适的材料。Knazek的发明通过在细胞群中提供供应大的和小的必需分子的营养物源；在细胞群中的除去代谢产物的槽；合适的微环境；允许以三维生长的晶格；以及大的单层和/或多层细胞培养的表面面积（相对于标准细胞培养技术所需要的体积），而解决了这些问题。
自所述最初的发明以来，已经成功地使用这项技术来扩增多种细胞类型，并且有很多涉及对该基本技术的各种改进的科学和专利文献。这些改进已经进行了多种技术修改，以最优该技术的使用以达到Knazek的最初目标。在工业中，这项技术已经被命名为“中空纤维”细胞培养并且，在生物反应器装置中，提供了中空纤维生物反应器细胞培养。见，例如，美国专利3,997,396；4,184,922；4,200,689；4,220,725；4,804,628；4,999,298；5,126,238;5,162,225；5,627,070；5,656,421；5,712,154；6,001,585；6,680,166；6,911,201；6,933,144；7,534,609；美国公开文本2001/0044413；2003/0224510；2005/0032218；2005/0003530；2006/0205071；2007/0298497；2008/0206733；2008/0213894；2008/0220522；2008/0220523；2008/0227190；2008/248572；2008/254533；2009/0191631；2009/0196901；2010/0042260；2010/0144037；2010/0209403；2010/0233130；2010/0267134；WO91/18972；WO95/13088；WO95/21911；WO01/23520；WO07/012144；WO10/034468；WO10/149597；和Gloeckner等,Biotech Prog17:828-31(2001)。
U.S.2010/0267134公开了使用中空纤维毛细管培养的成年人生殖系干细胞的分离、表征和分化。该参考文献描述了在已经被接种于所述中空纤维毛细管表面的塞托利（Sertoli）细胞的饲养层上培养精原干细胞。
U.S.2007/0298497和2008/0220523公开了适用于间充质干细胞的中空纤维生物反应器技术。描述了细胞扩增系统和使用所述系统培养间充质干细胞的方法。
U.S.2009/0196901涉及用于促进脂肪衍生的干细胞的生长和分化的方法和系统。可使用生物相容的支架结构培养所述细胞，所述支架结构可包括用于细胞生长和分化的中空纤维，所述支架在生物反应器中培养用于所述细胞的生长和分化。所述参考文献表明，其他干细胞类型可用于该方法。然而，在用于在所述生物反应器中培养的编织纤维支架上生长和分化之前，所述细胞已经在细胞培养中被大量地扩增。这产生足够数量的干细胞，使得所述细胞可被浓缩并悬浮于基质（例如凝胶生物材料），并且应用于所述三维支架上。
U.S.2010/0209403公开了在可包含中空纤维的生物反应器中培养附着的胎盘间充质干细胞和脂肪间充质干细胞的方法。
WO95/13088公开了以间充质细胞支持物来培养造血干细胞的中空纤维技术。
WO91/18972公开了用于培养来源于骨髓的造血干细胞的中空纤维生物反应器。
WO07/012144公开了通过将衔接物连接到表面以繁殖胚胎干细胞和其他细胞而改良的中空纤维生物反应器。
WO10/149597公开了用于培养精原生殖细胞和其他生殖系细胞的中空纤维生物反应器。
WO10/034468公开了在没有包被层的情况下培养附着的细胞（例如间充质干细胞）的中空纤维技术。
Antwiler等（"Bioreactor Design and Implementation,"Stem CellBioengineering,Parekkadan and Yarmush,eds.,pp.49-62(2009)）公开了一种使用自动化的中空纤维生物反应器系统离体扩增来源于骨髓单核细胞和全骨髓的间充质干细胞的方法。所述系统包括合成中空纤维生物反应器，其被连接至无菌闭环的计算机控制的培养基和气体交换器。在实验设置中，这使得在相对短的时间内从少量的单次骨髓吸出物培养出治疗剂量的间充质干细胞。
发明内容
本发明涉及在中空纤维生物反应器中扩增本文所述的细胞。用于连续进料营养物和除去代谢废物的连续灌注是本发明的一个方面。收集需要的分泌分子也是一个方面。
所述细胞可从作为未纯化的或部分纯化的制品的组织样品（例如从骨髓、脐带血或胎盘）直接扩增。或者，所述细胞可以是之前已经被分离和扩增或者另外纯化的基本上同质的细胞的纯化制品。因此，起始的细胞制品的纯度可为实际上未纯化的（例如以全骨髓单核细胞起始）或1%-100%纯的。在一些实施方案中，用于给予受试者的细胞的纯度为约100%（基本上同质）。在其他实施方案中，其为95%-100%。在一些实施方案中，其为85%-95%。然而，所述百分比可为约l%-5%、5%-10%、10%-15%、15%-20%、20%-25%、25%-30%、30%-35%、35%-40%、40%-45%、45%-50%、60%-70%、70%-80%、80%-90%或90%-95%。或者，分离/纯度可以以细胞倍增的方式表达，其中所述细胞已经经历例如10-20、20-30、30-40、40-50或更多次细胞倍增。
所述细胞可源自单一供体用于扩增，并返回至该同一供体（自体的）。或者，所述细胞可源自单一供体用于扩增，并给予不同的受试者（异体的）。或者，所述细胞可源自不同的供体。
所述细胞可通过任何所需次数的细胞倍增来扩增（增殖）。范围包括从2倍至1000倍或更多。极限将取决于提供足够营养物和除去有害废物的能力。在一些实施方案中，细胞倍增在约2-约10倍、约10-约50倍和约50-100倍的范围内。使用本申请中描述的技术，从单个供体可产生多于108个细胞。
可将细胞扩增、收获，然后重新接种到生物反应器中，用于进一步扩增。对于本申请的该目的，“运行”是指一轮扩增（从导入所述细胞至收获）。因此，可在一次运行或多于一次运行后收集细胞。“传代”是指运行。可在每次运行中通过不同的细胞倍增来扩增细胞。例如，在单次运行中，细胞可扩增2-10倍。然而，随着重复的运行，总扩增可更高（如上文所论述）。
本发明涉及的细胞可表达多能性标志物，例如oct4。它们还可以表达与长期复制能力相关的标志物，例如端粒末端转移酶。多能性的其他特征可以包括分化为多于一个胚层（例如外胚层胚胎胚层、内胚层胚胎胚层和中胚层胚胎胚层中的两个或三个）的细胞类型的能力。在培养中，这种细胞可以是或可以不是永生化的或转化的。所述细胞可以不转化而高度扩增，并且维持正常的核型。例如，在一个实施方案中，所述非胚胎干细胞、非生殖细胞可以在培养中经历至少10-40次细胞倍增，例如50次、60次或更多次，其中所述细胞没有转化并具有正常核型。所述细胞可以分化为内胚层胚胎谱系、外胚层胚胎谱系和中胚层胚胎谱系中两个的每一个的至少一种细胞类型，并且可以包括分化为所有的三个胚胎谱系。进一步地，所述细胞可以是不致瘤的，例如不会产生畸胎瘤。如果细胞是转化的或致瘤的，并且需要使用它们来侵入，通过阻止细胞增殖形成肿瘤的处理，这种细胞可以是失能的，因此它们不会在体内形成肿瘤。这种处理在本领域内是众所周知的。
细胞包括但不限于以下编号的实施方案：
1.分离的扩增非胚胎干细胞、非生殖细胞，所述细胞已经在培养中经历至少10-40次细胞倍增，其中所述细胞表达oct4、是未转化的并具有正常的核型。
2.如以上1的所述非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达端粒末端转移酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
3.如以上1的所述非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可以分化为内胚层胚胎谱系、外胚层胚胎谱系和中胚层胚胎谱系中至少两个的至少一种细胞类型。
4.如以上3的所述非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达端粒末端转移酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
5.如以上3的所述非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可以分化为内胚层胚胎谱系、外胚层胚胎谱系和中胚层胚胎谱系中每个的至少一种细胞类型。
6.如以上5的所述非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达端粒末端转移酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
7.分离的扩增的非胚胎干细胞、非生殖细胞，是通过培养非胚胎、非生殖组织获得的，所述细胞已经在培养中经历至少40次细胞倍增，其中所述细胞没有转化并具有正常的核型。
8.如以上7的所述非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒末端转移酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
9.如以上7的所述非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可以分化为内胚层胚胎谱系、外胚层胚胎谱系和中胚层胚胎谱系中至少两个的至少一种细胞类型。
10.如以上9的所述非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒末端转移酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
11.如以上9的所述非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可以分化为内胚层胚胎谱系、外胚层胚胎谱系和中胚层胚胎谱系中每个的至少一种细胞类型。
12.如以上11的所述非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒末端转移酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
13.分离的扩增的非胚胎干细胞、非生殖细胞，所述细胞已经在培养中经历至少10-40次细胞倍增，其中所述细胞表达端粒末端转移酶、没有转化并具有正常的核型。
14.如以上13的所述非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达oct4、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
15.如以上13的所述非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可以分化为内胚层胚胎谱系、外胚层胚胎谱系和中胚层胚胎谱系中至少两个的至少一种细胞类型。
16.如以上15的所述非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达oct4、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
17.如以上15的所述非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可以分化为内胚层胚胎谱系、外胚层胚胎谱系和中胚层胚胎谱系中每个的至少一种细胞类型。
18.如以上17的所述非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达oct4、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
19.分离的扩增的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可以分化为内胚层胚胎谱系、外胚层胚胎谱系和中胚层胚胎谱系中至少两个的至少一种细胞类型，所述细胞已经在培养中经历至少10-40次细胞倍增。
20.如以上19的所述非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒末端转移酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
21.如以上19的所述非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可以分化为内胚层胚胎谱系、外胚层胚胎谱系和中胚层胚胎谱系中每个的至少一种细胞类型。
22.如以上21的所述非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒末端转移酶、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
上文所述的细胞可从任何需要的组织源制备，包括但不限于骨髓、脐带血、脐带基质、外周血、胎盘、胎盘血、肌肉、脑、肾和其他实体器官。它们还可源自分泌的流体，例如尿和月经血。
在一个实施方案中，所述细胞源自人组织。
在配置所述中空纤维生物反应器中，有可根据细胞扩增相关的目标而变化的一些设计考虑和一些参数。首先，所述生物反应器中的纤维的数目可变化。通常使用多根或一束纤维来提供所需的表面积和高密度的细胞。纤维数目的实际范围也会根据所述纤维的长度而变化。因而，所述长度也是可变的。通常，所述纤维的长度只受有效移动营养培养基而与所述细胞接触、除去废物或所需细胞产物以及有效地从所述纤维基质上释放所述细胞的能力的限制。因此，所述纤维的长度范围可变化。另一个设计考虑是所述纤维壁的厚度。所述壁厚度是可变的并只受有效地为所述细胞提供营养物和有效地从所述细胞除去废物或有用产物的参数的限制。另一个设计考虑是所述纤维壁中的孔的尺寸。通常这被设计为使营养物通过并到达所述细胞、带走废物、为所述细胞提供所需的产物（例如生长因子）、从所述细胞除去所需的产物等。例如，孔尺寸可设计为排除可存在于例如血清中的特定因子使其不能到达所述细胞。另一设计考虑是所述中空纤维的内部尺寸（例如圆形纤维的直径）。该选择的考虑因素包括培养基充足地到达所述细胞以提供充足的营养物、除去废物并达到所需的细胞密度。另一设计考虑是所述纤维壁的组成。这包括许多种提供细胞可粘附其上的基质的生物相容性材料。在一些实施方案中，可通过使用促进粘附的基质（例如细胞外基质蛋白）包被所述壁材料来改善粘附。
此外，关于上述多个参数，在生物反应器中可以有多于一种类型的纤维。这是有用的，例如需要共培养不同的细胞类型时。对于不同的细胞，最佳的纤维设计可不同。
通常可将多根中空纤维包装进外壳中，所述外壳按需要与入口和出口通道连接，以将培养基灌注进入所述纤维和/或在所述纤维中环绕。在一个实施方案中，这些纤维作为其中灌注（循环）有细胞培养基的生长腔的部分，使得培养基流入所述纤维和/或在所述纤维中环绕。在一个实施方案中，所述纤维位于筒中，所述筒与泵连接用于灌输细胞培养基和补充物。
可制造所述纤维的材料包括许多种生物相容性的半渗透材料。这些材料使得细胞以三维生长，同时使得营养培养基扩散通过所述纤维壁以饲养细胞。
本发明涉及的细胞可与与其共铺板的（co-plated）或单独地附着或要不然在扩增腔中培养的其他细胞类型共培养。在一个实施方案中，可将所述其他细胞附着到所述纤维的内表面（或外表面），然后导入本发明的细胞。因此，本发明的细胞可沉积到需要的细胞类型的单层上。
可以以一种或多种细胞外基质蛋白（例如，基质胶、纤连蛋白或胶原）预包被所述中空纤维，以增强细胞附着。细胞外基质蛋白可附着到所述纤维的内表面和/或外表面。通常，可通过如美国专利No.5,872,094和美国专利No.6,471,689所描述的任何方法，将细胞外基质蛋白附着于所述表面，所述两件美国专利通过引用的方式纳入本文，用于教导这些方法。
流速也可根据所要扩增的细胞和所述方法的平台而变化。例如，完成细胞附着后，接种细胞后，可增加流速到稳态水平。在细胞附着后会增加所述速率并再次增加速率以帮助从所述腔中收获细胞。
使用通过许多不同的厂商容易获得的基于合同的用于哺乳动物细胞培养的材料，可以制造定制设计的中空纤维毛细管培养系统。用于细胞培养的一些类型的中空纤维系统可从公司（例如，FiberCell Systems,Inc.（Frederick,Md.））商购。由FiberCell Systems制造的中空纤维系统由直径约200μm的纤维组成。所述纤维被密封在筒中，所述筒的设计使得通过所述筒的末端泵入的细胞培养基流经所述纤维的内部。所述细胞附着在多孔的支持物上，并且所述培养可维持数月的连续产生。
对细胞扩增/扩增的细胞的分析可包括标志物例如在本申请中所描述的标志物的表达。此外，可分析造血标志物（例如CD34和CD45）的表达缺失。可周期性地监测样品上清液和单层细胞的（a）细胞形态、（b）倍性和（c）细胞标志物的原位杂交。
如上文所指明，可首先分离所述生物反应器中扩增的细胞并使用其他培养条件培养。例如，如下文所述，可首先分离示例性的细胞（命名为“MAPC”）并培养。
附图说明
图1提供了中空纤维细胞扩增系统的示意图。
图2是可用于本发明的生物反应器的示意图。
图3A描述了细胞生长腔的中空纤维细胞生长腔实施方案的侧视图。图3B描述了图3A的实施方案的中空纤维细胞生长腔的剖切侧视图。
图4-细胞扩增系统（CES）流体回路，示出了框图系统和所有袋连接。
图5-用于从骨髓或从细胞库扩增MultiStem的来自Caridian BCT（现为Terumo所有）的Quantum Cell Expansion System的流程图。
图6-将全骨髓抽吸物接种到Quantum中，事前不进行骨髓单核细胞（BMMNC）的选择，以及将来自所述相同供体的BMMNC接种在常规的细胞培养塑料上。对3个独立供体完成所述过程。将T75中的细胞传代至少3次，然后计数细胞数目以计算群体倍增数（PD）。收获Quantum中的细胞、计数并装载到新生物反应器中，6天以后再次收获。在Quantum中从骨髓抽吸物起始的MultiStem的扩增速率与在细胞培养塑料上的扩增没有显著差异。
图7-从骨髓抽吸物起始，有可能在17天内建立MultiStem原始细胞库。
图8-图5的装置的更详细方案。
图9-具有封闭系统、连续灌注、中空纤维生物反应器的扩增实施方案的概述。
图10-所述产生方法的概述，从分离源自合格供体的细胞到建立原始细胞库，然后将所述细胞给予患者。
图11-建立细胞库的方法的示意图。
具体实施方式
应该理解，本发明不受本文所述的具体操作、方法、试剂等限制，因此这些可以变化。本文使用的术语只为描述具体的实施方案，不是意欲限制所公开的发明的范围，所述范围仅由权利要求书限定。
本文使用的段落标题仅出于组织的目的，而不应被解释为任何形式的对所述主题的限制。
除非另外指明，本申请中的方法和技术通常按本领域公知的常规方法和本说明书中引用和论述的多种综合及专业参考文献进行。参见，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)；Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Associates(1992)；和Harlow and Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(1990)。
定义
"一"或"一个"在本文中是指一个或多于一个；至少一个。当本文中使用复数形式时，通常包括单数形式。
术语“生物反应器”是指在封闭无菌的系统中为细胞提供营养物和除去代谢产物，以及提供有益于细胞生长的生理化学环境的细胞培养系统。
当用于本文时，术语“生物反应器”是指在其中在受监控和受控制的环境和操作条件下（例如pH、温度、压力、供应营养物和除去废物），进行生物和/或生物化学过程的任何装置。根据本发明，适合用于本发明的生物反应器的基本类别包括中空纤维生物反应器。
“细胞库”是为将来使用而培养和储存的细胞的工业术语。细胞可以储存为小份。它们可以直接从储存中取用或可以在储存后扩增。这很方便以至有可用的“现成的”细胞用来给予。所述细胞可以是已储存在药用赋形剂中，因此可以直接给予，或者在所述细胞从储存中释放时可以和适当的赋形剂混合。细胞可以是冷冻的或储存为保留活力的形式。在本发明的一个实施方案中，建立了细胞库，其中所述细胞已就增强的对巨噬细胞活化的调节进行了选择。在从储存释放后，给予所述受试者之前，优选再次测定细胞的效能，即对巨噬细胞活化的调节水平。这可以使用本申请描述的或本领域已知的任何直接的或间接的测定来完成。然后，可将具有需要的效能的细胞给予所述受试者用于治疗。可以使用来源于要治疗的个体（来自他们出生前组织例如胎盘、脐带血或脐带基质或在出生后任何时间从所述个体扩增）（自体的）的细胞来建立细胞库。或者，细胞库可以含有用于同种异体用途的细胞。原始细胞库是细胞的贮存器，用于提供可被进一步扩增以提供用于给予受试者的剂量的小份细胞。
“临床有意义的”细胞数是指足以产生临床反应的细胞数；产生临床反应即对受试者中不需要的病理状态的预防、减少、改良等。具体的实施方案涉及足以建立原始细胞库的细胞数。
“共给予”是指彼此结合、一起、配合地给予，包括同时或依次给予两种或多种试剂。
在没有其他限制的情况下，“包含”是指必须包括所述指示物，但不对其他可包括的指示物进行限制或排除。例如，“包含x和y的组合物”涵盖含有x和y的任何组合物，而不管所述组合物中是否存在其他组分。同样，“包含步骤x的方法”涵盖其中进行x（不管x是所述方法中的唯一步骤还是只是步骤之一）的任何方法，不管可能存在多少其他步骤，也不管x与这些步骤相比多么简单或复杂。“包括”和使用词根“含”的类似短语在本文中用作“包含”的同义词，具有相同的含义。
“包括”是“包含”的同义词（见上文）。
“条件细胞培养基”是本领域公知的术语，指细胞已在其中培养的培养基。本文中这是指将细胞培养足够的时间以分泌可有效地达到本申请中描述的任何效果的因子。
条件细胞培养基是指细胞已在其中培养从而将因子分泌到所述培养基中的培养基。出于本发明的目的，可培养细胞历经足够数量的细胞分裂以产生有效量的所述因子，使得所述培养基具有效果。可通过本领域任何已知的方法将细胞从所述培养基中除去，所述方法包括但不限于离心、过滤、免疫耗竭（例如经加标签的抗体和磁性柱）和FACS分选。
“EC细胞”是从对被称为畸胎瘤的癌症类型的分析中发现的。1964年，研究人员注意到畸胎瘤中的单个细胞可被分离并在培养中保持不分化。这种类型的干细胞被称为胚胎癌细胞（EC细胞）。
“有效量”通常指可提供需要的局部或全身效果的量。例如，有效量是足以实现有益或需要的临床效果的量。所述有效量可以在单次给药中一次全部提供，或者以在多次给药中提供所述有效量的分份形式提供。对什么量会被认为是有效量的准确确定可基于每个受试者的个体因素，包括其身材、年龄、损伤和/或待治疗的疾病或损伤以及距损伤发生或疾病开始的时间。本领域技术人员能够基于这些本领域中惯常的考虑确定给予受试者的有效量。当用于本文时，“有效剂量”与“有效量”意义相同。
“有效途径”通常是指提供用于将试剂送递至所需区室、系统或位置的途径。例如，有效途径是给予试剂以在所需的作用位点提供其量足以实现有益或所需的临床效果的所述试剂的途径。
“胚胎干细胞（ESC）”为本领域所熟知并已从多种不同哺乳动物种中制得。胚胎干细胞是源自被称为胚泡的早期胚胎的内细胞团的干细胞。它们能够分化为三种原胚层：外胚层、内胚层和中胚层的所有衍生物。这些包括成体内超过220种细胞类型的每一种。ES细胞可成为体内除胎盘外的任何组织。只有桑椹胚细胞是全能性的，能够成为所有组织和胎盘。类似于ESC的某些细胞可以通过将体细胞核转移到去细胞核的受精卵来产生。
“扩增”是指输出细胞的细胞分裂达到临床有意义的次数。“临床有意义”是指在所述纤维内和/或所述纤维上实现这些细胞的足够的细胞倍增，以提供临床有意义数目的输出细胞。中空纤维生物反应器技术已经用于产生临床有意义数目的输出细胞的实际细胞扩增之外的目的。例如，这类生物反应器已经用于分化输入细胞群、浓缩输入细胞群、通过输入细胞群处理血液和其他液体，等等。在这些实施方案中，与所述纤维相连接的细胞实际上不是输出细胞。它们粘附在所述纤维上，不是使它们扩增，而是为了不同的目的。然而，在用于达到所述其他目的的时间范围内，一些输入细胞事实上可以扩增。该情形与本申请的技术的不同点是，所述细胞扩增没有达到临床有意义数目。细胞倍增是有限的。
术语“中空纤维”意欲包括含有尺寸、形状和密度确定的孔的（任何形状的）中空结构，其用于将（溶液中的）营养物递送至生物反应器中的细胞，以及用于从生物反应器中包含的细胞除去（溶液中的）废料。为了本发明的目的，中空纤维可由可吸收的材料或不可吸收的材料构成。纤维包括但不限于管状结构。
使用术语“包括”并非意图进行限制。
“增加”意指在完全没有预先存在的情况下引入，或者程度增加。
“诱导的多能干细胞（IPSC或IPS细胞）”是被再编程的体细胞，例如通过引入赋予所述体细胞分化程度较低的表型的外源基因的再编程。然后，这些细胞可被诱导分化为分化程度较低的后代。使用首先在2006年公开的方法的改进方法可获得IPS细胞（Yamanaka,S.et al.,Cell Stem Cell,1:39-49(2007)）。例如，在一个实例中，为形成IPS细胞，科学家以皮肤细胞开始，随后通过用反转录病毒将基因插入到细胞DNA中的标准实验室技术对所述皮肤细胞进行了改良。在一个实例中，所插入的基因为Oct4、Sox2、Lif4和c-myc，这些基因已知作为天然调控因子一起作用以使细胞保持在与胚胎干细胞相似的状态。文献已对这些细胞进行了描述。参见，例如，Wernig et al.,PNAS,105:5856-5861(2008);Jaenisch et al.,Cell,132:567-582(2008);Hanna et al.,Cell,133:250-264(2008);和Brambrink et al.,Cell Stem Cell,2:151-159(2008)。这些参考文献以引用的方式纳入以教导IPSC和产生它们的方法。也可通过特定培养条件（暴露于特定试剂）获得这些细胞。
“输入的细胞群”是指被导入生物反应器中的细胞类型，用于扩增该细胞类型并且最终形成输出细胞群。可以以非常小的量将输入细胞群导入到所述生物反应器中。例如，在骨髓中，需要的输入细胞群的细胞数目最初可以低至百万分之一。或者，所述输入群可以是基本上同质的，例如源自细胞库并在生物反应器中进一步扩增。
术语“分离的”指不与一个或多个细胞结合的或者不与在体内与所述一个细胞或多个细胞结合的一种或多种细胞组分结合的一个或多个细胞。“富集群”指需要的细胞相对于体内或原代培养物中一种或多种其他细胞类型的数量上相对增加。
然而，本文所用的术语“分离的”不表示仅干细胞的存在情况。而是，术语“分离的”表示细胞从其天然组织环境中取出并以相对所述正常组织环境更高的浓度存在。因此，“分离的”细胞群可进一步包括干细胞以外的细胞类型并可包括其他组织组分。这还可用例如细胞的倍增来表示。细胞可在体外或离体进行10、20、30、40次或更多次的倍增，从而相对其在体内或在原始组织环境（例如骨髓、外周血、脂肪组织等）中的原始数量被富集。
“MAPC”是“多能成体祖细胞”的首字母缩略词。它是指非胚胎干细胞或非生殖细胞、但具有这两种细胞的某些特征的细胞。MAPC可以以许多替代的描述来表征，每一个描述在被发现时均赋予所述细胞以新特征。因此，它们可以用这些描述中的一个或多个来表征。第一，它们无需转化（发生肿瘤）而具有在培养中长期复制的能力并具有正常核型。第二，它们在分化时可以生成多于一个胚层，例如两个或全部三个胚层（即内胚层、中胚层和外胚层），的细胞后代。第三，虽然它们不是胚胎干细胞或生殖细胞，但它们可以表达这些原始细胞类型的标志物，因此MAPC可以表达Oct3/4（即Oct3A）、rex-1和rox-1中的一种或多种。它们还可以表达sox-2和SSEA-4中的一种或多种。第四，像干细胞一样，它们可以自我更新，也就是无需转化而具有长期复制能力。这意味着这些细胞可表达端粒末端转移酶（即具有端粒末端转移酶活性）。因此，以“MAPC”命名的细胞类型可以由通过若干新性质描述该细胞的替代的基本特征来表征。
MAPC中的术语“成体”是非限制性的。它是指非胚胎体细胞。MAPC核型正常并且在体内不形成畸胎瘤。该首字母缩略词在美国专利No.7,015,037中首次用于描述从骨髓分离的多能细胞。但是，随后发现了具有多能性标志物和/或分化潜能的细胞，为了本发明的目的，这些细胞可以等价于这些首次被命名为“MAPC”的细胞。MAPC类型细胞的基本描述在上文本发明的发明内容中提供。
MAPC代表比MSC更原始的祖细胞群（Verfaillie,CM.,Trends CellBiol12:502-8(2002),Jahagirdar,B.N.,et al.,Exp Hematol,29:543-56(2001);Reyes,M.and CM.Verfaillie,Ann N Y Acad Sci,938:231-233(2001);Jiang,Y.et al.,Exp Hematol,30896-904(2002);和Jiang,Y.et al.,Nature,418:41-9.(2002)）。
术语“”是基于美国专利No.7,015,037的MAPC的细胞制品的商品名称，即如上所述的非胚胎干细胞、非生殖细胞。
Figure BDA0000463865610000142
可按照本专利申请中公开的细胞培养方法制备，特别是低氧和高血清。
Figure BDA0000463865610000143
是高度可扩增的、核型正常的，并且在体内不形成畸胎瘤。它可分化成多于一个胚层的细胞谱系并可表达端粒末端转移酶、oct3/4、rex-1、rox-1、sox-2和SSEA4的一种或多种。
术语“营养液”意欲包括进入生物反应器并且含有培养哺乳动物细胞或脊椎动物细胞所必需的那些营养物质的溶液。营养液还可含有添加剂，所述添加剂影响培养的细胞的表型的特定改变，或者促成在形成的新生骨的基质结构方面的改变，例如矿化作用。
营养物被递送至生物反应器中的细胞，并可影响所述生物反应器中含有的细胞的生长和分化。选择所述营养液以在生物反应器中为所述细胞提供足够的营养物以维持生存力、生长和/或分化。本领域技术人员能够为本发明选择适当的营养液。例如，可使用培养基例如达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium）并可进一步补充以其他适合的营养物。其他适合的营养物包括胎牛血清、L-抗坏血酸、-2-磷酸盐、抗生素、细胞调节剂例如地塞米松、β-甘油磷酸、葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸补充物、细胞凋亡的抑制剂（或活化剂）（例如谷胱甘肽乙基酯）、抗氧化剂、半胱天冬酶抑制剂以及阳离子和阴离子例如镁离子、锰离子、钙离子、磷酸根离子、氯离子、钠离子、钾离子、锌离子和硫酸根离子以及硝酸盐和亚硝酸盐。在所述营养液中的其他组分浓度应该足以促进生物反应器中的生长并维持细胞的生存力。
“输出细胞群”是指在生物反应器中扩增以后希望从所述生物反应器中收获的细胞。收获的细胞被定义为从所述生物反应器中除去的细胞，然后其会被用于临床目的或其他目的，例如研究、临床试验等。
可培养并刺激“原始胚胎生殖细胞”（PG或EG细胞）以产生很多分化程度较低的细胞类型。
“祖细胞”是在干细胞分化过程中产生的细胞，其具有它们的最终分化子代的一些、但非全部特性。确定的祖细胞例如“心脏祖细胞”可形成细胞谱系，而不形成具体的或终末分化的细胞类型。首字母缩略词“MAPC”中使用的术语“祖”并不将这些细胞限制于具体的细胞谱系。祖细胞可以形成比所述祖细胞分化程度更高的子代细胞。
可以从组织中的细胞进行选择。例如，在这种情况下，将细胞从所需的组织中分离、在培养中扩增、就所需的特征进行选择，并进一步扩增选择的细胞。
“自我更新”是指产生复制子代干细胞的能力，所述子代干细胞具有与产生其的亲代细胞相同的分化潜能。本文中使用的类似术语是“增殖”。
“无血清培养基”是指这样的培养基，其中没有血清，或者，如果有的话，血清组分的水平对细胞的生长或变化没有影响（即实际上是不必要的，例如残留量或痕量）。
“干细胞”是指可以进行自我更新（即子代具有相同的分化潜能）并且也可以产生分化潜能更受限的子代细胞的细胞。在本发明的上下文中，干细胞还可以涵盖分化程度更高的细胞，其已经通过例如以下方式去分化：通过核转移、通过与更原始的干细胞融合、通过导入特定的转录因子或者通过在特定条件下培养。参见，例如，Wilmut et al.,Nature,385:810-813(1997);Ying et al.,Nature,416:545-548(2002);Guan et al.,Nature,440:1199-1203(2006);Takahashi et al.,Cell,126:663-676(2006);Okita et al.,Nature,448:313-317(2007);和Takahashi et al.,Cell,131:861-872(2007)。
去分化还可以通过给予一些化合物或在体内或体外暴露于可以引起去分化的物理环境而引起。干细胞还可以来自异常组织，例如畸胎癌和一些其他来源，例如胚状体（尽管这些可被认为是胚胎干细胞，因为它们来自胚胎组织，尽管不是直接来自于内细胞团）。干细胞还可以通过将与干细胞功能相关的基因导入非干细胞例如诱导的多能干细胞中而产生。
“受试者”是指脊椎动物，例如哺乳动物，例如人。哺乳动物包括但不限于人、狗、猫、马、牛和猪。
术语“废液”意欲包括流出生物反应器并含有细胞代谢的废弃副产物的溶液。所述废液中的废弃副产物（例如氨、乳酸等）的浓度和营养物（例如葡萄糖）的残留水平可用于评估培养在生物反应器中的细胞的代谢活性水平。
生物反应器
生物反应器，特别是用于组织再生过程的生物反应器，是众所周知的。见，例如U.S.6,306,169；6,197,575；6,080,581；5,677,355；5,433,909；5,898,040，所有上述以引用的方式纳入本文。
生物反应器是广义的术语，其基本上涵盖了能够孵育细胞同时为所述细胞的环境提供一定程度保护的任何种类的容器。生物反应器可为静态容器例如烧瓶或培养袋，其中的变量（例如生长培养基的组成、氧气浓度、pH水平和渗透压）非完全受到控制和监控。另一方面，有完全自动化的机电工艺水平的生物反应器，其中的所有变量被监控且可控制。这些实例之间的许多相互结合是细胞生物技术领域的普通技术人员所熟知的。
在文献中已经描述了用于培养分离的造血干细胞或祖细胞的三种不同的传统方法：静态培养、搅拌培养和固定培养。静态培养在非常简单的培养系统例如孔板、组织培养瓶或透气的培养袋中进行。因为所述孔板和组织培养瓶不能以临床规模进行细胞培养，透气的培养袋实际上是最常使用的用于干细胞扩增的技术（Purdy et al.,J Hematother,4:515-525(1995);McNiece et al.,Hematol Cell Ther,4:82-86(1999);和McNiece et al.,Exp Hematol,28:1181-1186(2000a)）。所有这些系统的优势为容易操作且为一次性装置，这使得细胞收获不复杂。然而，使用所有这些系统时，通过控制培养箱环境来进行过程控制调节，也不供应连续进料。因此，在所有三种静态培养的方法中，培养过程中培养条件的改变（例如氧张力、pH、底物、代谢产物和细胞因子浓度）是关键因素。
搅拌生物反应器通常用于动物细胞培养，其提供同质的环境、有代表性的取样、更容易进行过程控制和增加的氧气传递。几种搅拌技术（旋转烧瓶和搅拌容器生物反应器）已经成功应用于造血细胞的培养（Zandstra et al.,Biotechnol,12:909-914(1994)）。
干细胞和祖细胞的固定是在不使用间充质饲养层的情况下，尝试达到局部高细胞密度并模仿组织（例如骨髓）的三维结构。在固定化生物催化剂反应器中，所述细胞可被固定在载体内或载体上，通过互相之间的连接以形成更大颗粒来固定，或限制在膜屏障内。大多数所述反应器可以以分批、分批补料或连续方式运行。固定化生物反应器在本领域是熟知的，例如常规的反应器，例如连续搅拌釜反应器（CSTR）和填充床反应器（PBR），如标准教科书例如Ullmann's Encyclopedia OfIndustrial Chemistry:Fifth edition,T.Campbell,R.Pfefferkom and J.F.Rounsaville Eds,VCH Publishers1985,Vol A4,pp141-170;Ullmann's Encyclopedia Of Industrial Chemistry:Fifth ed.,B.Elvers,S.Hawkins and G.Schulz Eds,VCH Publishers,1992,Vol B4,pp381-433;J.B.Butt"Reaction Kinetics And Reactor Design"Prentice-Hall,Inc.,1980,pp185-241所描述。
因此，可根据一般的分类将生物反应器进行分组，包括：静态生物反应器、搅拌烧瓶（flask）生物反应器、旋转壁容器生物反应器、中空纤维生物反应器和直接灌注式生物反应器。在所述生物反应器内，细胞可为游离的或被固定、接种在多孔三维支架（水凝胶）上。
中空纤维生物反应器可用于增强培养过程中的物质传递。因而，对于本发明，所述生物反应器是中空纤维生物反应器。中空纤维生物反应器可具有装入所述纤维的腔中的干细胞和/或祖细胞，同时培养基灌注于腔外空间，或者可穿过所述中空纤维提供气体和培养基灌注，同时细胞在腔外空间中生长。如本文所述已经公开了适合本发明的这种中空纤维生物反应器，并且一些可商购，例如Caridian(Terumo)BCTQuantum Cell Expansion System。
生物反应器定义为任何可提供细胞的生理需求（例如pH、温度、压力、营养物、供给和废物除去）用于细胞和其产物的标准生产的装置。生物反应器可增强用于细胞增殖的工程生物反应器中的物质传递。存在连续的细胞营养物，并去除废物。对于细胞的自体给予，生物反应器应为相对紧凑的、一次性的和经济的。通常，需要大的腔/体积的比率。最后，为了使细胞保持特定的分化状态，可需要生长因子或血清组分，并且因此需要携带介质的生物反应器。Antwiler等描述的基于中空纤维生物反应器的细胞扩增系统满足了这些需求。
在Antwiler等描述的装置中，所述系统提供约120ml的腔生长体积，但可以提供更大的腔体积。提供了1.7m2的表面积用于生长。因而，附着的细胞和悬浮细胞都可在这个装置中生长，包括共培养。其他物理特征是长度295mm；内径215μm；IC容积104ml；EC容积330ml；纤维数目9000。对于附着的细胞可以使用纤连蛋白作为包被层。所述装置可维持培养目的细胞的所有所需实验条件，例如气体浓度、pH、培养基、温度、对营养物、废物和所需添加剂的管理。为了防止污染，所述系统被设计成具有封闭的无菌的流体区室。数袋培养基试剂和溶液与所述系统相连，使得可根据需要替换、控制和优化进料计划、废物除去和总的细胞培养环境。所述装置可用在工作台上（bench top）。细胞可生长在所述纤维的内部（毛细管内）、外部（毛细管外）或同时在所述纤维的内部和外部。这个中空纤维生物反应器的设计使得能够使用管道来直接连接，以获得封闭的系统，所述管道通过适当的蠕动泵、夹管阀等确定路线。使用中空纤维氧合器来管理气体控制。所述系统还提供添加和收获细胞、置换培养基和添加试剂等的能力。因而，袋子用于所有流体，并且所述袋子连接全部使用无菌连接技术。示意图见图4。
在本申请中的示例性实施方案（实施例1）中，所述连续流动生物反应器具有184ml的内部流体容积和303ml的外部流体容积，含有1.1×104根中空纤维，所述中空纤维具有约2.1m2（3255in2）的总表面积（毛细管内），50μm的壁厚度，215μm的内径和295mm的长度。孔径具有16kDa的截留用于通过组分。
所述中空纤维应适用于所述生物反应器中营养物的递送和废物的除去。所述中空纤维可为任何形状，例如，它们可为圆形和管状或者为同心环的形式。所述中空纤维可由可吸收的或不可吸收的膜制造。例如，适合的中空纤维的组分包括聚二噁烷酮、多乳酸化合物、羟基乳酸聚合物、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙醇酸/三亚甲基碳酸酯、纤维素、甲基纤维素、纤维素聚合物、纤维素酯、再生纤维素、普流尼克（pluronic）、胶原、弹性蛋白及其混合物。许多种适合的材料在本领域中是众所周知的，并且由众多文献描述。这些材料的实例已经在美国专利4,220,725；4,184,922；4,200,689；3,821,087；3,883,393；4,184,922；4,200,689；3,997,396；4,220,725；4,999,298；4,804,628；5,126,238；5,656,421；5,162,225；5,622,857；5,627,070；6,001,585；6,911,201；6,933,144；7,534,609;和美国公开文本2007/0298497；2008/0220523；2001/0044413；2009/0196901；2010/0233130；2009/0191631；2005/0032218；2005/0003530；2003/0224510；2006/0205071；2010/0267134；2008/0206733；2010/0209403；2008/0213894；2008/0220522；2008/0227190；2008/0248572；2008/0254533；2010/0144037；和2010/0042260中描述，所有上述文献以引用的方式纳入本文用于教导这些材料。用于壁材料的标准包括但不限于以下：对细胞无毒；是多孔的，用于除去废物和接纳营养物，以及在需要收集由细胞分泌的组分时可针对该参数调整孔隙度；对温度变化相对不敏感，即是热稳定的；能够保持形状完整性。
还已知，这类材料对细胞是不可透过的，但对多种所需的物质是可透过的。因而，所述中空纤维包括孔以使得营养物和废物通过其进出。所述中空纤维的孔的直径足以允许分子从所述中空纤维的一侧扩散到所述中空纤维的另一侧。优选地，可以通过所述中空纤维孔的分子为约0.002-约50kDa，更优选约5-约25kDa，或最优选约2-约16kDa。因此，所述纤维壁的孔尺寸可根据需要通过所述壁的组分而改变。例如，孔尺寸可允许仅小分子通过，或者可能更大以允许大的蛋白质分子（包括生长因子（包括但不限于，表皮生长因子和血小板衍生生长因子））通过。本领域普通技术人员会理解如何根据需要通过所述纤维壁到达所述细胞或从所述细胞带走物质的组分来改变所述孔尺寸。例如，可能需要收集由细胞产生的组分以备后用。例如，所述细胞可表达和分泌细胞因子、生长因子、免疫调节因子和其他有其他用途的组分。可从所述细胞带走的物质还包括需要从所述细胞除去的废物。因此，该技术可用于产生含有有用组分的被所述细胞条件化的培养基。
存在许多生物反应器构造用于培养附着依赖性细胞，例如本发明的那些细胞。但是，本发明不依赖任何具体构造。美国公开文本No.2007/0298497提供了一个实例，其公开了一种已经用于培养间充质干细胞的构造。
U.S.2007/0298497中的一个实例（不意欲进行限制）是在图2示出的中空纤维生物反应器。可用于本发明的细胞扩增模块或生物反应器10由包在壳体14中的一束中空纤维膜12构成。所述中空纤维束总体称作膜。所述壳体或模块14形状可为筒状，并且可由任何类型的生物相容的聚合材料制造。
使用端盖或顶盖16、18封闭模块14的每个末端。端盖16、18可由任何适合的材料（例如聚碳酸酯）制造，只要所述材料与生物反应器中培养的细胞是生物相容的。
可有至少4个通道进出所述模块。两个通道与毛细管外空间（EC空间）流体相连，一个通道34用于使新鲜的毛细管外培养基进入所述中空纤维周围的空间，一个通道44用于使用过的毛细管外培养基流出所述模块。两个通道还与毛细管内空间（IC空间）流体相连，一个通道26用于使新鲜的毛细管内培养基进入所述中空纤维的腔内和用于导入待扩增的细胞，一个通道42用于使用过的毛细管内培养基流出以及从生物反应器移出扩增的细胞。
生物反应器中待扩增的细胞可流入所述IC空间或EC空间。所述生物反应器可使用注射器装载细胞或者可以直接从细胞分离器将细胞分布于所述IC空间或EC空间中。还可以从可无菌接入生物反应器的细胞输入袋或烧瓶（显示为元件5）将细胞导入所述培养模块或生物反应器中。
在一个实施方案中，可使用的中空纤维壁材料包括但不限于两种类型：以商品名Desmopan.RTM（可购自Bayer MaterialScience AG,DE）销售的0.5%热塑性聚氨酯，以及商品名为Polyflux.RTM.的具有Polyamix.RTM膜（聚酰胺、聚芳醚砜和聚乙烯吡咯烷酮的混合物）的透析膜（可购自Gambro Dialysatoren,GmBH,Hechingen,Del.）（Hoenich,et al.(2000)ASAIO J.,46:70-75，其以引用的方式纳入本文）。
U.S.2008/0220523提供了一种细胞扩增系统和使用所述系统的方法，在一个具体的实施方案中，所述系统适用于培养如本文所述的细胞。所述细胞扩增系统通常包括中空纤维细胞生长腔以及分别与中空纤维的内部和中空纤维的外部相连接的第一和第二循环回路（毛细管内回路和毛细管外回路）。还提供了可拆卸的流动回路和扩增细胞的方法。所述细胞生长腔如下所述并也示出于图3。
细胞生长腔（U.S.2008/0220523）
所述细胞扩增系统的细胞生长腔通常包括包含多根半透性的中空纤维的中空纤维膜，所述中空纤维膜分隔出第一和第二流体循环通路。
示例性细胞生长腔在图3中描绘，图3描绘了中空纤维细胞生长腔200的剖切侧视图。细胞生长腔200由细胞生长腔壳体202围成。细胞生长腔壳体202还包括4个开口或通道：入口通道204、出口通道206、入口通道208和出口通道210。
在所述第一循环通路中的流体通过入口通道204进入细胞生长腔200，进入并通过多根中空纤维的毛细管内侧（在多个实施方案中称作中空纤维膜的毛细管内（“IC”）侧或“IC空间”），通过出口通道206流出细胞生长腔200。术语“中空纤维”、“中空纤维毛细管”和“毛细管”可互换使用。多根中空纤维总体称作“膜”。所述第二循环通路中的流体经过入口通道208流入所述细胞生长腔，与所述中空纤维的外部（称作所述膜的“EC侧”或“EC空间”）接触，然后经过出口通道210流出细胞生长腔200。细胞可包含在所述第一循环通路或第二循环通路中，并且可在所述膜的IC侧或EC侧。
虽然将细胞生长腔壳体202描绘成形状为筒状，但其可具有本领域已知的任何其他形状。细胞生长腔壳体202可由任何类型的生物相容性的聚合材料制造。多种其他的细胞生长腔壳体可在形状和尺寸上有差异。
本领域技术人员会认识到，术语“细胞生长腔”不意指细胞扩增系统中培养或扩增的所有细胞都在所述细胞生长腔中培养。附着的细胞可粘附到排列在所述生长腔中的膜上，或可在相连接的管道中生长。也可培养非附着细胞（也称为“悬浮细胞”）。可将细胞培养在所述第一或第二流体循环通路中的其他区域。
例如，可通过连接材料（在本文中也称为“铸封剂”或“铸封材料”）将中空纤维212的末端铸封到所述细胞生长腔的侧面。所述铸封剂可为用于粘合中空纤维212的任何合适的材料，条件是培养基和细胞流入所述中空纤维时不阻塞的并且经过所述IC入口通道流入所述细胞生长腔的液体仅流入所述中空纤维。示例性铸封材料包括但不限于聚氨酯或其他合适的粘合或胶粘组分。在多个实施方案中，可在每个末端通过垂直于所述中空纤维的中心轴线将所述中空纤维和铸封剂切通，以允许流体流入和流出所述IC侧。端盖214和216排列在所述细胞生长腔的末端。
经入口通道208进入细胞生长腔200的流体与中空纤维的外侧接触。所述中空纤维细胞生长腔的这个部分称为“毛细管外（EC）空间”。小分子（例如水、氧气、乳酸盐等）可穿过所述中空纤维从所述中空纤维的内部扩散到所述EC空间，或从所述EC空间扩散到所述IC空间。通常大分子量的分子太大而不能穿过所述中空纤维，并保留在所述中空纤维的IC空间中。所述培养基可根据需要替换。也可根据需要将培养基循环通过氧合器以交换气体。
在多个实施方案中，可通过多种方法的任何一种（包括通过注射器）将细胞装载入所述中空纤维中。还可将细胞从可与所述细胞生长腔流体连接的流体容器（例如袋）中导入所述细胞生长腔中。
配置中空纤维以允许细胞在所述纤维的毛细管内空间内（即在所述中空纤维腔内）生长。中空纤维足够大以允许细胞粘附在所述腔内，而基本不阻碍培养基流过所述中空纤维腔。在多个实施方案中，所述中空纤维的内径可大于或等于10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000、1000、900、800、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150或100微米。同样，所述中空纤维的外径可少于或等于10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000、1000、900、800、700、650、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150或100微米。所述中空纤维壁的厚度足以允许小分子的扩散。
任何数目的中空纤维可用于细胞生长腔中，条件是所述中空纤维可以与所述细胞生长腔的入口和出口通道流体连接。在多个实施方案中，所述细胞生长腔可包括许多大于或等于1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000或12000的中空纤维。在其他实施方案中，所述细胞生长腔可包括许多少于或等于12000、11000、10000、9000、8000、7000、6000、5000、4000、3000或2000的中空纤维。在其他多个实施方案中，所述中空纤维的长度可大于或等于100、200、300、400、500、600、700、800或900毫米。在某些实施方案中，所述细胞生长腔含有约9000根具有295mm的平均长度、215微米的平均内径和315微米的平均外径的中空纤维。
中空纤维可以用能够形成以下尺寸的任何材料构造，所述尺寸足以形成能够将液体从所述细胞生长腔入口通道运送到所述细胞生长腔出口通道的纤维。在多个实施方案中，所述中空纤维可由能够结合某些类型的细胞（例如附着干细胞）的塑料粘附材料构造。在多个其他实施方案中，可用化合物（例如纤连蛋白）处理中空纤维以形成粘附表面。
在某些实施方案中，所述中空纤维可由半透的生物相容的聚合材料制造。可使用的一种这类聚合材料是聚酰胺、聚芳醚砜和聚乙烯吡咯烷酮的混合物（“PA/PAES/PVP”）。所述半透膜允许营养物、废物和溶解的气体转移穿过所述EC空间和IC空间之间的膜。在多个实施方案中，选择所述中空纤维膜的分子转移特性，以使细胞生长所必需的昂贵试剂（例如生长因子、细胞因子等）从所述中空纤维的损失最小化，同时使代谢废物穿过所述膜扩散进所述中空纤维腔侧以被除去。
在某些变化中，每个PA/PAES/PVP中空纤维的一个外层的特征为具有确定的表面粗糙度的同质开孔结构。所述孔的开口在0.5-3μm的尺寸范围内，并且所述纤维的外表面上的孔的数目在10000-150000个孔/mm2的范围内。该外层具有约1-10μm的厚度。每个中空纤维的下一层为具有海绵状结构的形式的第二层，在另一实施方案中其具有约1-15μm的厚度。该第二层作为所述外层的支持物。紧邻所述第二层的第三层具有手指状结构的形式。该第三层提供机械稳定性和高空隙体积，所述高空隙体积使所述膜具有非常低的阻力以运送分子通过所述膜。在使用过程中，所述手指状空隙充满流体，并且所述流体与使用具有更低空隙体积的海绵填充结构的基质相比，赋予了更低的阻力用于扩散和对流。该第三层具有20-60μm的厚度。
在另外的实施方案中，所述中空纤维膜可包括65-95重量%的至少一种疏水性聚合物和5-35重量%的至少一种亲水性聚合物。所述疏水性聚合物可选自：聚酰胺（PA）、聚芳基酰胺（PAA）、聚芳基醚砜（PAES）、聚醚砜（PES）、聚砜（PSU）、聚芳砜（PASU）、聚碳酸酯（PC）、聚醚、聚氨酯（PUR）、聚醚酰亚胺和任何上述聚合物的共聚物混合物，例如聚醚砜或聚芳基醚砜和聚酰胺的混合物。在其他实施方案中，所述亲水性聚合物可选自聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙二醇（PEG）、聚乙二醇单酯、水溶性纤维素衍生物、聚山梨酯和聚环氧乙烷聚环氧丙烷共聚物（polyethylene-polypropylene oxide copolymer）。
根据待在所述细胞生长腔中扩增的细胞的类型，可以以物质（例如纤连蛋白）处理所述聚合纤维，以增强细胞生长和/或细胞与所述膜的粘附。
U.S.2008/0220523和U.S.2008/0248572中还有其他详细的反应器实施方案的示例，包括详细的流程图方法。例如，这些不同的实施方案可见于U.S.2008/0220523的图1B、1C和1D。所述流程图方法示于图1D。任何这些均适合于实施本发明。还可查阅U.S.2008/0220522中公开的实施方案。该文献的全文因为公开了这些实施方案而以引用的方式纳入本文，用于与本发明的细胞一起使用。
WO/2010/034468提供了另一示例性装置，所述装置包括由安装在外壳内的半透膜分开的两个区室，第一内部区室安装有两个通路（access），第二外部区室包括一个或两个通路，两个区室还被基于适当的胶粘剂化合物的铸封化合物分开，意欲形成适用的（i）分开所述装置的两个区室的圆柱状隔板，其含有如上定义的中空纤维束类型的半透膜或（ii）所述装置中的密封层，其包括如上文定义的薄层膜类型的半透膜。
另一示例性装置包含多根中空纤维膜，其包含在外壳中，其被配置使得所述中空纤维外空间（即毛细管外区室）内的流体与通过所述中空纤维及其相应孔口的流体分开。此外，所述装置包括在所述装置的相对末端的外壳内的两个多支管末端腔（manifold end chamber）。中空纤维的两个孔口的每个与不同的末端腔相连。所述末端腔和所述毛细管外区室由所述中空纤维的半透膜分开。在一定程度上，可通过中空纤维膜的截留分子量或孔尺寸控制所述毛细管外区室内的组成。
在操作所述装置的一种模式中，将细胞培养在所述毛细管外区室中，而使营养培养基通过所述中空纤维。在操作所述装置的另一种模式中，将细胞培养在所述中空纤维的毛细管内空间（即内腔）中，而使营养培养基通过所述毛细管外区室和/或所述毛细管内区室。所述中空纤维的半透特性允许营养物和细胞废物通过所述中空纤维的壁，而阻拦细胞通过。
壳管式生物反应器提供了几种优势。对于附着的细胞，若干中空纤维的使用在相对小的容积内提供了其上可生长细胞的巨大表面积。这种巨大表面积还有助于营养培养基集中分布于所述生长的细胞，并使得容易地收集细胞废物。与其他细胞培养装置可能达到的相比，壳管式生物反应器使细胞在更高密度下生长。它们可支持大于108个细胞/毫升的细胞密度，而其他细胞培养装置通常限于约106个细胞/毫升的密度。
干细胞
本发明可以优选地使用脊椎动物物种的干细胞进行，所述脊椎动物物种例如人、非人灵长类、驯养动物、家畜和其他非人哺乳动物。这些包括但不限于下文所述的那些细胞。
胚胎干细胞
研究最透彻的干细胞是胚胎干细胞（ESC），因为它具有无限的自我更新和多能分化潜能。这些细胞可以源自胚泡的内细胞团，或者可以源自植入后胚胎的原始生殖细胞（胚胎生殖细胞或EG细胞）。ES和EG细胞最初是从小鼠中得到，之后从很多不同的动物中得到，最近还从非人灵长类和人中得到。当ESC被导入小鼠胚泡或者其他动物的胚泡中时，ESC可以成为所述动物的所有组织。ES和EG细胞可通过用抗SSEA1（小鼠）和SSEA4（人）的抗体阳性染色来鉴别。参见，例如，美国专利No.5,453,357、5,656,479、5,670,372、5,843,780、5,874,301、5,914,268、6,110,739、6,190,910、6,200,806、6,432,711、6,436,701、6,500,668、6,703,279、6,875,607、7,029,913、7,112,437、7,145,057、7,153,684和7,294,508，其各自以引用的方式纳入本文，用于教导胚胎干细胞以及制备和扩增胚胎干细胞的方法。因此，ESC及其分离和制备方法是本领域中公知的。
已经鉴定了许多影响胚胎干细胞在体内的效能状态的转录因子和外源性细胞因子。被描述涉及干细胞多能性的首个转录因子是Oct4。Oct4属于POU（Pit-Oct-Unc）转录因子家族，是能够活化基因转录的DNA结合蛋白，在启动子或增强子区域内包含被称为“八聚体基序”的八聚序列。Oct4在受精卵的分裂期时表达，直到卵圆柱形成。Oct3/4的功能是抑制分化诱导基因（即FoxaD3、hCG）、活化促进多能性的基因（FGF4、Utf1、Rex1）。Sox2——高迁移率族（high mobility group，HMG）盒转录因子的成员——与Oct4协作活化内细胞团中表达的基因的转录。Oct3/4在胚胎干细胞中的表达维持在某些水平之间是必要的。Oct4表达水平>50%的过表达或者下调将改变胚胎干细胞命运，分别为形成原始内胚层/中胚层或滋养外胚层。在体内，Oct4缺陷的胚胎可发育至胚泡期，但是内细胞团细胞不是多能的。相反，它们沿着胚胎外滋养层谱系分化。Sall4——一种哺乳动物Spalt转录因子——是Oct4的上调调节子，因此对于在胚胎早期维持合适的Oct4水平是重要的。当Sall4水平下降至低于某一阈值时，滋养外胚层细胞将异位扩增至内细胞团中。多能性所需要的另一个转录因子是Nanog，是以Celtic部族“Tir Nan Og”：永远年轻的土地，命名的。在体内，Nanog从致密桑葚胚期表达，之后被限制在内细胞团中，并且在植入期下调。Nanog的下调对于在原肠胚形成过程中避免多能细胞的不受控扩增和允许多向分化可能是重要的。第5.5天分离的Nanog无效胚胎由无序胚泡构成，主要包含胚胎外内胚层和无法辨认的上胚层。
非胚胎干细胞
已在大部分组织中鉴别到干细胞。可能最清楚表征的是造血干细胞（HSC）。HSC是来自中胚层的细胞，其可以使用细胞表面标志物和功能特性来纯化。它们已经被从骨髓、外周血、脐带血、胎肝和卵黄囊中分离到。它们起始造血作用并且产生多种造血谱系。当它们被移植进入致死量放射线照射的动物中时，它们能够再造红系嗜中性粒细胞-巨噬细胞（erythroid neutrophil-macrophage）、巨核细胞和淋巴造血细胞库。它们还能被诱导进行一些自我更新的细胞分裂。参见，例如，美国专利No.5,635,387、5,460,964、5,677,136、5,750,397、5,681,599和5,716,827。美国专利No.5,192,553报道了用于分离人新生儿或胎儿造血细胞或祖细胞的方法。美国专利No.5,716,827报道了作为Thy-1+祖细胞的人造血细胞，以及在体外再生它们的合适生长培养基。美国专利No.5,635,387报道了一种用于培养人造血细胞和它们的前体的方法和装置。美国专利No.6,015,554描述了一种重建人淋巴和树突细胞的方法。因此，HSC及其分离和扩增方法是本领域中公知的。
本领域熟知的另一种干细胞是神经干细胞（NSC）。这些细胞可在体内增殖并且连续地再生至少一些神经元细胞。当离体培养时，神经干细胞可被诱导增殖以及分化为不同类型的神经元和神经胶质细胞。当神经干细胞被移植至脑时，其能够植入并且产生神经细胞和神经胶质细胞。参见，例如Gage F.H.,Science,287:1433-1438(2000),Svendsen S.N.et al,BrainPathology,9:499-513(1999),和Okabe S.et al.,Mech Development,59:89-102(1996)。U.S.5,851,832报道了从脑组织中得到的多能神经干细胞。U.S.5,766,948报道了由新生儿大脑半球产生神经母细胞。U.S.5,564,183和5,849,553报道了哺乳动物神经嵴干细胞的用途。U.S.6,040,180报道了在体外由哺乳动物多能CNS干细胞的培养物产生分化的神经元。WO98/50526和WO99/01159报道了神经上皮干细胞、少突星型胶质细胞前体和谱系受限的神经元前体的产生和分离。U.S.5,968,829报道了从胚胎前脑得到的神经干细胞。因此，神经干细胞及其制备和扩增方法是本领域熟知的。
本领域已经大量研究的另一种干细胞是间充质干细胞（MSC）。MSC来自于胚胎中胚层，可从多种来源分离，包括成体骨髓、外周血、脂肪、胎盘、脐带血等。MSC能够分化成为很多中胚层组织，包括肌肉、骨、软骨、脂肪和腱。关于这些细胞有大量的文献。参见，例如，U.S.5,486,389、5,827,735、5,811,094、5,736,396、5,837,539、5,837,670和5,827,740。还参见Pittenger,M.et al,Science,284:143-147(1999)。
成体干细胞的另一个实例是脂肪来源的成体干细胞（ADSC），其通常已被通过以下方式从脂肪分离：吸脂术，之后使用胶原酶释放ADSC。ADSC在很多方面类似于源自骨髓的MSC，不同的是能够从脂肪中分离更多细胞。已经报道这些细胞可以分化成为骨、脂肪、肌肉、软骨和神经元。U.S.2005/0153442描述了一种分离方法。
本领域已知的其他干细胞包括胃肠干细胞、表皮干细胞和肝脏干细胞，其也被称作“卵形细胞”(Potten,C.,et al.,Trans R Soc Lond B Biol Sci,353:821-830(1998),Watt,F.,Trans R Soc Lond B Biol Sci,353:831(1997);Alison et al.,Hepatology,29:678-683(1998))。
据报道能够分化成为超过一种胚胎胚层的细胞类型的其他非胚胎细胞包括但不限于来自脐带血的细胞（参见美国公布文本No.2002/0164794）、来自胎盘的细胞（参见美国公布文本No.2003/0181269）、来自脐带基质的细胞(Mitchell,K.E.et al.,Stem Cells,21:50-60(2003))、来自小胚胎样干细胞的细胞(Kucia,M.et al.,J Physiol Pharmacol,57Suppl5:5-18(2006))、来自羊水干细胞的细胞(Atala,A.,J Tissue Regen Med,1:83-96(2007))、来自皮肤来源的前体的细胞(Toma et al.,Nat Cell Biol,3:778-784(2001))和来自骨髓的细胞(参见美国公布文本No.2003/0059414和2006/0147246)，其各自因对这些细胞的教导以引用的方式纳入本文。
重编程体细胞的方法
已经使用了一些不同的策略，例如核移植、细胞融合和培养诱导的重编程，来诱导分化的细胞转化为胚胎状态。核移植包括将体细胞核注射进入去核卵母细胞，其当起被移植进入代理母亲时，可以形成克隆（“生殖性克隆”），或者当在培养中扩增时，可以形成遗传匹配的胚胎干（ES）细胞（“体细胞核移植”，SCNT）。体细胞与ES细胞的细胞融合致使产生显示多能ES细胞的全部特性的杂合体。培养中的体细胞外植可选择用于可以是多能（pluripotent or multipotent）的无限繁殖细胞系。目前，精原细胞干细胞是可衍生自出生后动物的多能细胞的唯一来源。用规定的因子转导体细胞可以起始重编程至多能状态。对这些实验方法有大量综述(Hochedlinger and Jaenisch,Nature,441:1061-1067(2006)and Yamanaka,S.,Cell Stem Cell,1:39-49(2007))。
核移植
核移植（NT），也被称作体细胞核移植（SCNT），是指将来自供体体细胞的核导入去核卵母细胞以产生克隆动物，例如多莉羊(Wilmut et al.,Nature,385:810-813(1997))。通过NT产生活的动物证明了体细胞的表观遗传状态，包括终末分化的细胞的表观遗传状态，尽管稳定，不是不可逆地固定的，而是可以重编程至胚胎状态，其能够指导新生物体的发育。除了对阐释胚胎发育和疾病中涉及的基本表观遗传机制提供令人兴奋的实验方法外，核克隆技术具有用于患者特异移植医学的潜在益处。
体细胞和胚胎干细胞的融合
将体细胞核表观遗传重编程至未分化状态已经在通过胚胎细胞和体细胞融合产生的小鼠杂合体中被证明。多种体细胞和胚胎癌细胞之间的杂合体(Solter,D.,Nat Rev Genet,7:319-327(2006))、胚胎生殖细胞（EG）或ES细胞(Zwaka and Thomson,Development,132:227-233(2005))有很多与亲本胚胎细胞相同的特性，表明多能表型在这样的融合产物中是主要的。对于小鼠(Tada et al.,Curr Biol,11:1553-1558(2001))，人ES细胞具有在融合之后重编程体细胞核的潜能(Cowan et al.,Science,309:1369-1373(2005));Yu et al.,Science,318:1917-1920(2006))。沉默多能标志物例如Oct4的活化，或者失活体细胞X染色体的再活化为体细胞基因组在杂合细胞中重编程的分子证据。已经提出DNA复制对于在融合后2天首次观察到的多能标志物的活化是必要的(Do and Scholer,Stem Cells,22:941-949(2004))，并且当与神经干细胞融合时，Nanog在ES细胞中的强制过表达可促进多能性(Silva et al.,Nature,441:997-1001(2006))。
培养诱导的重编程
已经从胚胎源得到了多能细胞，所述胚胎源例如卵裂球和胚泡的内细胞团（ICM）（ES细胞）、上胚层（EpiSC细胞）、原始生殖细胞（EG细胞）和出生后精原细胞干细胞（“maGSCsm”，“ES-样”细胞）。以下的多能细胞，与它们的供体细胞/组织一起，描述如下：单性生殖ES细胞（parthogenetic ES cell）来自小鼠卵母细胞(Narasimha et al.,Curr Biol,7:881-884(1997))；胚胎干细胞来自卵裂球(Wakayama et al.,Stem Cells,25:986-993(2007))；内细胞团细胞(来源不适用)(Eggan et al.,Nature,428:44-49(2004))；胚胎生殖细胞和胚胎癌细胞来自原始生殖细胞(Matsuiet al.,Cell,70:841-847(1992))；GMCS、maSSC和MASC来自精原细胞干细胞(Guan et al.,Nature,440:1199-1203(2006);Kanatsu-Shinohara etal.,Cell,119:1001-1012(2004);和Seandel et al.,Nature,449:346-350(2007))；EpiSC细胞来自上胚层(Brons et al.,Nature,448:191-195(2007);Tesar et al.,Nature,448:196-199(2007))；单性生殖ES细胞来自人卵母细胞(Cibelli et al.,Science,295L819(2002);Revazova et al.,Cloning StemCells,9:432-449(2007))；人ES细胞来自人胚泡(Thomson et al.,Science,282:1145-1147(1998))；MAPC来自骨髓(Jiang et al.,Nature,418:41-49(2002);Phinney and Prockop,Stem Cells,25:2896-2902(2007))；脐带血细胞(来自脐带血)(an de Ven et al.,Exp Hematol,35:1753-1765(2007))；神经球（neurosphere）衍生的细胞来自神经细胞(Clarke et al.,Science,288:1660-1663(2000))。来自生殖细胞系的供体细胞，例如PGC或精原细胞干细胞已知在体内是单能性的，但是已证明多能ES样细胞(Kanatsu-Shinohara et al.,Cell,119:1001-1012(2004))或maGSC(Guan etal.,Nature,440:1199-1203(2006))在体外长时间培养后可被分离。尽管大部分这些多能细胞类型能够在体外分化和形成畸胎瘤，但依据更严格的标准，仅ES、EG、EC和精原细胞干细胞衍生的maGCS或ES样细胞是多能的，因为它们能够形成出生后嵌合体并且成为生殖细胞系。最近，多能成体精原细胞干细胞（MASC）可从成体小鼠的睾丸精原细胞干细胞中得到，并且这些细胞具有与ES细胞不同(Seandel et al.,Nature,449:346-350(2007))、但与EpiSC细胞类似的表达谱，所述EpiSC细胞来自小鼠胚胎移植后的上胚层(Brons et al.,Nature,448:191-195(2007);Tesar et al.,Nature,448:196-199(2007))。
通过规定的转录因子进行重编程
Takahashi和Yamanaka已经报道了将体细胞重编程回ES样状态(Takahashi and Yamanaka,Cell,126:663-676(2006))。在将4种转录因子Oct4、Sox2、c-myc和Klf4进行病毒介导的转导，之后针对Oct4靶基因Fbx15的活化进行选择之后，他们成功地将小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和成体成纤维细胞重编程为多能ES样细胞（图2A）。具有活化的Fbx15的细胞是制造的iPS（诱导性多能干）细胞并且通过它们形成畸胎瘤的能力显示是多能的，但是它们不能产生活的嵌合体。这种多能状态依赖于转导的Oct4和Sox2基因的连续病毒表达，而内源Oct4和Nanog基因或者不表达，或者以比ES细胞中低的水平表达，并且发现它们各自的启动子大量甲基化。这与以下结论一致，即Fbx15-iPS细胞与ES细胞并不一致，但是可能代表了重编程的不完全状态。尽管遗传实验已经确定了Oct4和Sox2对于多能性是必要的(Chambers and Smith,Oncogene,23:7150-7160(2004);Ivanona et al.,Nature,442:5330538(2006);Masui et al.,Nat CellBiol,9:625-635(2007))，但是两种癌基因c-myc和Klf4在重编程中的作用仍不清楚。一些这些癌基因实际上对于重编程是可省去的，因为已经在不存在c-myc转导的情况下得到了小鼠和人iPS细胞，尽管效能较低(Nakagawa et al.,Nat Biotechnol,26:191-106(2008);Werning et al.,Nature,448:318-324(2008);Yu et al.,Science,318:1917-1920(2007))。
MAPC
人MAPC描述于美国专利7,015,037。已经在其他哺乳动物中鉴定了MAPC。例如，鼠MAPC描述于美国专利7,015,037。大鼠MAPC还描述于美国专利No.7,838,289。
这些参考文献因描述MAPC由Catherine Verfaillie首次分离出来而以引用的方式纳入本文。
MAPC的分离和培养
MAPC分离方法是本领域已知的。参见例如美国专利7,015,037，并且这些方法连同MAPC（表型）的表征以引用的方法纳入本文。MAPC可从多个源分离，所述源包括但不限于骨髓、胎盘、脐带和脐带血、肌肉、脑、肝脏、脊髓、血液或皮肤。因此，可能获得骨髓抽吸物、脑或肝脏活检组织和其他器官，并且使用本领域技术人员可获得的阳性或阴性选择技术，依赖这些细胞表达（或者不表达）的基因（例如，通过功能性或形态学测定，例如上文参考的申请中公开的那些，所述申请以引用的方式纳入本文）分离所述细胞。
MAPC还可以通过在Breyer et al.,Experimental Hematology,34:1596-1601(2006)和Subramanian et al.,Cellular Programming andReprogramming:Methods and Protocols;S.Ding(ed.),Methods inMolecular Biology,636:55-78(2010)中描述的改进方法来获得，所述文献因为这些方法以引用的方式纳入本文。
美国专利7.015.037中描述的来自人骨髓的MAPC
MAPC不表达共有的白细胞抗原CD45或成红血细胞特异的血型糖蛋白-A（Gly-A）。将细胞的混合群进行Ficoll Hypaque分离。然后，以使用抗CD45的抗体和抗Gly-A的抗体的阴性选择对细胞进行处理，耗尽CD45+和Gly-A+细胞的群，然后回收剩余的约0.1%的骨髓单核细胞。还可将细胞铺板于纤连蛋白包被的孔中，并且如下文所述培养2-4周以耗尽CD45+和Gly-A+细胞。在附着的骨髓细胞（adherent bonemarrow cell）的培养中，很多附着基质细胞在细胞倍增约30次时发生复制衰老，更同质的细胞群继续扩增并且保持长的端粒。
或者，可以经细胞特异性标志物的组合使用阳性选择来分离细胞。阳性和阴性选择技术都是本领域技术人员可以得到的，并且本领域中可得到适于阴性选择目的的很多单克隆和多克隆抗体（参见，例如，Leukocyte Typing V,Schlossman,et al.,Eds.(1995)Oxford UniversityPress），其可从许多来源市购得到。
从细胞群混合物中分离哺乳细胞的技术也已经由Schwartz et al.在美国专利5,759,793中（磁性分离）、Basch et al.,1983（免疫亲和层析）和Wysocki and Sato,1978（荧光激活的细胞分选）记载。
细胞可在低血清或无血清培养基中培养。用于培养MAPC的无血清培养基记载于美国专利7,015,037中。通常使用的生长因子包括但不限于血小板衍生的生长因子和表皮生长因子。参见，例如，美国专利No.7,169,610、7,109,032、7,037,721、6,617,161、6,617,159、6,372,210、6,224,860、6,037,174、5,908,782、5,766,951、5,397,706和4,657,866；全部以引用的方式纳入本文用于教导在无血清培养基中培养细胞。
另外的培养方法
在另外的实验中，培养MAPC的密度可以是从约100个细胞/cm2或约150个细胞/cm2至约10000个细胞/cm2变化，包括约200个细胞/cm2至约1500个细胞/cm2至约2000个细胞/cm2。所述密度可随种类的不同而变化。此外，最佳密度可依赖于培养条件和细胞来源而变化。本领域普通技术人员能够确定对于给定培养条件和细胞的组合的最佳密度。
同样，在培养中，在MAPC的分离、生长和分化过程中的任何时间都可以使用低于约10%，包括约1-5%，尤其是3-5%的有效大气氧浓度。
可在多种血清浓度下（例如约2-20%）培养细胞。可以使用胎牛血清。更高的血清可以与更低的氧张力结合使用，例如约15-20%。不必在附着至培养皿之前选择细胞。例如，在Ficoll梯度后，可以将细胞以例如250000-500000/cm2直接铺板。可以挑出附着集落，可以将其合并并且扩增。
在一个实施方案中，在实施例的实验方法中使用的高血清（约15-20%）和低氧（约3-5%）条件被用于细胞培养。特别地，将来自集落的附着细胞以约1700-2300个细胞/cm2的密度在18%血清和3%氧下（含PDGF和EGF）中铺板并传代。
在特异针对MAPC的实施方案中，补充物是允许MAPC保持分化为多于一个胚胎谱系例如所有三个谱系的细胞类型的能力的细胞因子或组分。这可以通过未分化状态的特定标志物例如Oct3/4（Oct3A）和/或高扩增能力标志物（例如端粒末端转移酶）的表达来指示。
细胞培养
对于下文列出的全部组分，参见U.S.7,015,037，其因对这些组分的教导而以引用的方式纳入本文。
总的来说，可以在本领域熟知并且可以得到的培养基中维持并且扩增用于本发明的细胞。还考虑含哺乳动物血清的细胞培养基的补充物。还可以有利地使用其他补充物来为细胞提供必需微量元素用于最优地生长和扩增。还可以有利地将激素用于细胞培养。还可以依赖于细胞类型和分化细胞的命运来使用脂质和脂质载体以补充细胞培养基。还考虑使用饲养细胞层。
干细胞经常需要促进其附着于固体支持物的额外因子，例如层粘连蛋白、I型和II型胶原、硫酸软骨素、纤连蛋白、“超纤连蛋白(superfibronectin)”和纤连蛋白样聚合物、明胶、聚-D-和聚-L-赖氨酸、血小板反应蛋白和玻连蛋白。可使用基于或包含基底膜来源的蛋白质混合物的其他适合的包被层材料。这些中的一些可商购，例如基质胶（Matrigel）。包被层可使用细胞外基质蛋白及其合适的衍生物，以及这些蛋白的混合物。本发明的一个实施方案利用了纤连蛋白。参见，例如Ohashi et al.,Nature Medicine,13:880-885(2007);Matsumoto et al.,J Bioscience and Bioengineering,105:350-354(2008);Kirouac et al.,Cell Stem Cell,3:369-381(2008);Chua et al.,Biomaterials,26:2537-2547(2005);Drobinskaya et al.,Stem Cells,26:2245-2256(2008);Dvir-Ginzberg et al.,FASEB J,22:1440-1449(2008);Turner et al.,JBiomed Mater Res Part B:Appl Biomater,82B:156-168(2007);和Miyazawa et al.,Journal of Gastroenterology and Hepatology,22:1959-1964(2007)。
一旦在培养中建立，细胞可被新鲜使用或者使用例如含20%-40%FCS和10%DMSO的DMEM冷冻并储存为冷冻储液。在一个实施方案中，使用20%FCS。对于培养的细胞制备冷冻储液的其他方法也是本领域技术人员可获得的。
为了本申请的目的，关于上述的培养基组分和条件，另外的培养方法以及其他的培养方法也适用于所述生物反应器方法。例如，在一个示例性实施方案中，氧气的浓度为5%，血清为约19%并将EGF和PDGF加入到培养基中。
药物制剂
U.S.7,015,037因为对药物制剂的教导而以引用的方式纳入本文。在一些实施方案中，细胞群存在于组合物中，所述组合物被改造适合且适于递送，即是生理学相容的。
在一些实施方案中，用于给予受试者的细胞（或条件培养基）的纯度是约100%（基本上同质）。在其他实施方案中，纯度是95%至100%。在一些实施方案中，纯度是85%至95%。特别地，对于与其他细胞的混合物的情况，所述百分比可以是约10%-15%、15%-20%、20%-25%、25%-30%、30%-35%、35%-40%、40%-45%、45%-50%、60%-70%、70%-80%、80%-90%或90%-95%。或者，分离/纯度可以细胞倍增的方式表示，其中所述细胞已经经历了例如10-20、20-30、30-40、40-50或更多次的细胞倍增。
对于给定应用，用于给予所述细胞的制剂的选择将依赖于多种因素。其中主要的因素是受试者的种类；待治疗的病症的性质、其状态和在所述受试者中的分布；正给予的其他疗法和试剂的性质；给药的最佳途径；经所述途径的存活力；剂量方案；和对于本领域技术人员来说明显的其他因素。例如，合适载体和其他添加剂的选择将依赖于确切的给药途径和具体剂型的性质。
细胞/培养基的水性悬液的最终制剂一般包括将所述悬液的离子强度调节至等渗（即约0.1至0.2）并且至生理pH（即约pH6.8至7.5）。最终制剂一般还会包含流体润滑剂。
在一些实施方案中，细胞/培养基被配制为单位剂量的可注射形式的制剂，所述的可注射形式例如溶液剂、悬液剂或乳剂。适于注射细胞/培养基的药物制剂一般是无菌的水性溶液和分散液。用于可注射制剂的载体可以是包含例如以下物质的溶剂或分散介质：水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇（例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等）及其合适的混合物。
本领域技术人员可以容易地确定本发明方法中给予的组合物中的细胞和任选的添加剂、赋形物和/或载体的量。一般地，任意添加剂（除所述细胞之外）的存在量为在溶液中（例如在磷酸盐缓冲盐水中）0.001至50wt%。活性成分以微克至毫克的量级存在，例如为约0.0001至约5wt%，优选约0.0001至约1wt%，最优选为约0.0001至约0.05wt%或者约0.001至约20wt%，优选约0.01至约10wt%，最优选为约0.05至5wt%。
实施例
实施例1.借助中空纤维生物反应器细胞扩增系统扩增来自细胞库 的MultiStem
使用基本上如U.S.2008/0220523和Antwiler等所述的细胞扩增系统扩增MultiStem的输入群（基本为同质群）。所述系统命名为QuantumCES。它提供了尤其可用于自体扩增的台式扩增系统。（但是它也可用于异体扩增。）基于本申请中示出的结果，可从单个供体获得多于108个细胞。
Multi-Stem被储存在冷冻细胞库中后，将所述Multi-Stem解冻。对于两个实验，将10×106个MultiStem接种到连续流生物反应器中，所述生物反应器具有184ml的内部流体容积和303ml的外部流体容积，含有1.1×104根中空纤维，所述中空纤维具有约2.1m2(3255in2)的总表面积（毛细管内），50μm的壁厚度，215μm的内径和295mm的总长度（平均每个纤维30mm，范围10-50mm）。孔尺寸具有约16kDa的截留。所述细胞附着到所述中空纤维的内部。将培养细胞6天。从相同的接种原液开始的三个独立实验产生了752×l06、753×106和782×106个细胞。
流速是可变的，但是通常随着细胞增殖增加，使得提供足够量的营养物并以足够的量除去废物。通常，流速可以增加约10倍。但是，这个参数是通过监控培养基中的废物（例如乳酸和葡萄糖水平）来调整。
所述壁材料是PA/PAES/PVP复合材料。
并且，在这个具体的实施方案中，所述纤维包被有纤连蛋白。
对于已建立细胞（即来源于预先分离、扩增、基本纯化的培养物的细胞），使用5mg的纤连蛋白并包被过夜。然后洗去包被物，并替换为培养基。接种后，装置内环路无流动的情况下，细胞附着24小时。然后以约0.1ml/分钟的进料速率起始。基于乳酸水平和细胞的倍增速率，约每24小时将进料速率加倍。在最初三天中，发明人尝试将乳酸水平保持在约0.5g/l。在最后三天中，将乳酸水平保持在约1g/l，最大为1.5g/l。最后一天（即当所述细胞扩增到其最大值时）进料速率为约3mL/分钟。
使用约200ml2.5%的胰蛋白酶以2.5分钟的孵育时间和约500ml的收获体积收获细胞。
当使用骨髓抽吸物时，使用约10mg纤连蛋白以48小时的附着时间包被毛细管内表面。这样调整进料速率，使得如果乳酸水平上升到0.4-0.5g/l，就将进料速率加倍。与从已经建立细胞库的细胞开始的培养相比，所述速率通常不那么高。在一个实施方案中，使用约25-30ml的骨髓抽吸物，产生约4×106个来自总BMMC的细胞。因此，对骨髓进行蔗聚糖梯度以除去无核细胞。
详情见于图5。该流程图包括2个环路：毛细管内（IC）环路和毛细管外（EC）环路。所述IC环路具有3个入口管线：细胞管线、试剂管线和IC培养基管线。袋子与这些管线连接用于加入细胞、包被剂、胰蛋白酶和培养基。每个管线由具有开或关两种状态的阀控制。入口速率由IC入口泵（1）控制。所述系统内的循环由IC循环泵（2）控制。所述IC回路含有150mL。所述EC环路具有2个入口管线：洗涤（溶液）管线和EC培养基管线。袋子与这些管线连接用于以PBS洗涤和将培养基加入所述EC环路。所述EC入口速率由EC入口泵（3）控制，这个回路中的循环由EC循环泵（4）控制。EC环路中存在氧合器。该氧合器与外部气瓶（对于MultiStem这为90%N2；5%O2；5%CO2）连接，并为EC培养基维持气体浓度。由于气体通过所述生物反应器中膜的扩散，IC培养基达到平衡状态。所述EC回路含有约250ml。溶液/细胞有两种方式离开所述系统：在废物袋中或在收获袋中。所述IC及EC环路与由阀控制的废物袋连接。所述收获袋仅与所述IC环路相连，并且也由阀控制。
比较了输入群和输出群。具体地，评价了所述输入群的某些选定的基因的基因表达，并将其与所述输出群比较。此外，比较了形态学和倍性。就所测量的参数而言，所述输出群与所述输入群基本上相同。
实施例2.在中空纤维生物反应器细胞扩增系统中从骨髓产生 MultiStem
上述的细胞扩增系统用于从骨髓单核细胞产生MultiStem。扩增结果示于图6。在一个可能的方案中，从骨髓抽吸物开始，可以在17天内建立MultiStem原始细胞库。这进行了一次从骨髓到15次群体倍增的运行、到该收获物的扩增运行以达到18.5次的群体倍增和平均10次运行以产生原始细胞库（200管，每管2000万个细胞）。然后，这200管可用于产生工作细胞库。示意图示于图7。然而，可增加或减少所述原始细胞库，例如最高达10倍的细胞或最低至十分之一的细胞。
扩增之后，输出细胞具有与MultiStem相关的免疫调节性质，并表达端粒末端转移酶。

Claims (13)

1.一种扩增离体细胞的方法，所述方法包括如下步骤：a)将所述细胞接种在中空纤维基质上，使得所述细胞附着在所述基质上；b)扩增所述基质上附着的细胞；和c)从所述基质取下所扩增的细胞，其中所述细胞是非胚胎干细胞、非生殖细胞，其中所述细胞表达端粒末端转移酶、未被转化并具有正常核型。
2.权利要求1的方法，还包括d)将所述取下的细胞重新接种在相同或不同的基质上；和e)重复步骤b)-d)直到达到需要的扩增细胞数。
3.权利要求2的方法，还包括将所述取下的细胞给予受试者。
4.权利要求1的方法，其中所述中空纤维基质在封闭的连续灌注生物反应器中。
5.权利要求3的方法，其中将所述细胞扩增约10-100倍。
6.权利要求1-5的方法，其中所述中空纤维被包被。
7.权利要求6的方法，其中所述包被物是纤连蛋白。
8.权利要求7的方法，其中纤维中的壁材料是PA/PAES/PVP。
9.权利要求1-8的方法，其中在步骤(a)中的细胞包括基本上同质的群。
10.权利要求1-8的方法，其中步骤(a)包括接种来自组织的细胞，所述组织选自骨髓、脐带血、脐带基质、外周血、胎盘、胎盘血、肌肉、脑、肾或其他实体器官。
11.权利要求1的方法，其中所述非胚胎干细胞、非生殖细胞还表达oct4、rex-1、rox-1或sox-2中的一种或多种。
12.权利要求1和权利要求11的方法，其中所述非胚胎干细胞、非生殖细胞可分化成内胚层胚胎谱系、外胚层胚胎谱系和中胚层胚胎谱系的至少两个中的至少一种细胞类型。
13.权利要求12的方法，其中所述非胚胎干细胞、非生殖细胞可分化成内胚层胚胎谱系、外胚层胚胎谱系和中胚层胚胎谱系的每个中的至少一种细胞类型。
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