CN105754948A - 结肠癌细胞的体外拟组织化培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种结肠癌细胞的体外拟组织化培养方法,依次进行如下步骤:中空纤维的灭菌;中空纤维预先铺被胶原;将Caco?2细胞悬液注入至中空纤维内腔置于37±0.2℃培养箱中,使用驱动装置使中空纤维沿轴向旋转,转速为转90度/小时,旋转时间为4h,从而便于细胞的均匀贴附;然后将培养有细胞的中空纤维置于培养板中,在培养板的每孔加入2~3mL培养基,将培养板放入37±0.2℃培养箱中进行培养;每1~2天更换一次培养基。本发明公开了一种能够模拟人体组织微观形态的小肠细胞中空纤维膜反应器的构建方法,使其能够适用于研究功能性成分转运吸收行为的研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种动物细胞的体外培养方法,特别地,涉及一种结肠癌细胞的体外组织化培养方法;涉及一种用于功能性成分研究的Caco-2细胞中空纤维反应器的构建方法。
背景技术
Caco-2细胞是人源结肠腺癌细胞,其同源性好,生命力强,经过3周左右的培养后,可形成连续的细胞单层,并在形态和功能上分化出接近成熟小肠上皮细胞的状态[1],也相应表达出小肠的水解酶(如麦芽糖酶、乳糖酶、氨基肽酶等)的作用。
作为附着依赖性细胞,单层贴壁培养模型是Caco-2细胞最常见的培养模型。为了改善极性细胞培养情况,研究者们将Caco-2细胞培养在覆有透过性微孔滤膜的插入式嵌套培养板上。被培养在半透性滤膜上的Caco-2细胞单层将整个培养体系分成了顶膜侧(apicalside)和底膜侧(basolateralside),化学物质由顶膜侧进入体系,通过检测基底膜侧被测物质的浓度即可进行物质吸收、转运及代谢的研究[2]。较为经典的产品有等。
尽管单层模型具有操作简便、重复性好和成本低等优点,但由于接触抑制原理,此法很难大规模培养细胞。单层模型属于二维培养模型,它无法为细胞研究提供类似于体内的微环境,造成细胞形态和信号传导结果与体内有较大差异。研究中发现,传统的单层细胞模型培养的细胞需要21天的培养才能够充分分化并且表达出较为接近人体小肠上皮的功能,无疑增加了人力、物力和时间的投入。近年来,研究者们通过采用多种细胞混合培养、反应器构建、生物材料表面改性等方法来优化Caco-2细胞模型。
Tapia等人[3]将Caco-2细胞与浓度为1.2%的藻朊酸盐(alginate)溶液封装(encapsulate)混合培养在搅动型生物反应器中,通过台盼蓝染色观察和检测乳酸的产生和葡萄糖的消耗来评价细胞的生长和代谢状态。研究结果表明,用藻朊酸盐封装Caco-2细胞并通过悬浮搅动培养的方法具有一定的可行性,但仍需要通过大量实验来优化生物反应器的设计从而获得更具竞争力的细胞产出。Piana等人[4]通过亲疏水改性材料来研究其对Caco-2细胞粘附生长的影响。研究发现亲水改性的材料有助于细胞的贴附生长,但疏水材料表面上生长的细胞的刷状缘酶系的表达水平相对升高。
在生物反应器构建方面,三维动态构型在模拟小肠上皮的微环境方面显得更有优势。本发明所使用的中空纤维是一种微滤膜材料制成的细微管状结构,管壁是极薄的半透膜。每根纤维具有很高的比表面积,其构造类似于动物的毛细血管,可以为贴壁细胞提供类似体内的微环境[5]。中空纤维膜上的微孔结构使离子和营养物质可以穿过膜到达细胞单层的两侧,避免了培养液流动而产生的不良应力影响,从而使细胞以更为自然的方式进行代谢。同时,通过中空纤维膜构建的细胞培养环境温和,培养细胞密度较高(107~108个细胞/mL)[6]。
Caco-2细胞模型常被应用于口服药物的摄取、吸收转运以及毒性研究[7 , 8],近年来也被大量应用于氨基酸、核苷、微量元素等营养素的小肠吸收机理研究[9],以及丙烯酰胺等毒性成分的研究[10]。研究中发现,传统的单层细胞模型与正常肠道存在较大差异,而采用中空纤维构建的生物反应器在形态上更为接近小肠的管腔结构,可以为Caco-2细胞提供大量中空纤维间的孔隙作为生长空间,增加了Caco-2细胞与培养基的接触面积,有利于物质交换[11],进而可以缩短细胞的培养分化周期,从而可以更好地应用于口服药物以及功能性成分的小肠吸收机制研究。
参考文献:
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发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可用于食品功能性成分转运研究的三维体外细胞培养模型,区别于需要21天分化的单层培养模型,以三维培养的方式可使细胞快速增殖分化,并长期维持动物细胞功能,从而应用于功能性成分的吸收转运研究。
为了解决上述技术问题,本发明提供一种结肠癌细胞的体外拟组织化培养方法,依次进行如下步骤:
1)、中空纤维的灭菌:
将中空纤维切成2~4cm(较佳为3cm)长的小段,浸泡于PBS缓冲溶液(pH=7.4)中,然后一同置于蒸汽高压(1.1个大气压,121℃)灭菌锅灭菌20min;
待灭菌完毕,在超净台中取出中空纤维置于平皿上铺开风干(一般需要放置过夜);
2)、中空纤维预先铺被胶原:
首先将I型鼠尾胶原(鼠尾胶原蛋白Ⅰ型)稀释配制成浓度为0.7~0.8mg/mL(较佳为0.75mg/mL)鼠尾胶原溶液(利用体积浓度为0.1%乙酸溶液进行配制),然后将上述鼠尾胶原溶液注满(基本注满即可,可通过10μL枪头注入)平躺(水平)状态下的步骤1)所得的灭菌后中空纤维的内腔;接着静置20~40min;
可将中空纤维静置于6孔板中备用;
3)、将Caco-2细胞悬液计数后稀释到5×106cells/mL注入(可用微量进样器注入)至步骤2)所得的中空纤维内腔(仍处于平躺状态),直至该中空纤维内腔充满Caco-2细胞悬液(此时,原鼠尾胶原溶液会被挤排出中空纤维的内腔),置于37±0.2℃培养箱中,使用驱动装置使中空纤维沿轴向旋转(如图1所述),转速为转90度/小时(即,每小时转1/4周),旋转时间为4h;从而便于细胞的均匀贴附;
4)、旋转4h后,将培养有细胞的中空纤维置于培养板(例如为6孔板)中,在培养板的每孔加入2~3mL培养基,将培养板放入37±0.2℃培养箱中进行培养;每1~2天更换一次培养基(每天需轻微晃动培养板)。
备注说明:培养时间视实际实验所需而定。
作为本发明的结肠癌细胞的体外拟组织化培养方法的改进:
所述步骤4)中,培养板(细胞培养板)的每孔中设置2~3根中空纤维。
备注说明:当6孔板的每孔放3根中空纤维时,其提供的内表面积与24孔Transwell培养板每孔面积接近;这样就能与对照的Transwell形成有效相比。
作为本发明的结肠癌细胞的体外拟组织化培养方法的进一步改进:所述中空纤维为PES中空纤维膜或PVDF中空纤维膜;
所述PES(聚醚砜)中空纤维膜为:孔径0.1μm,0.1MPa下纯水通量1000L/m2h,内/外径0.8/1.4mm;
所述PVDF(聚偏氟乙烯)中空纤维膜为:孔径0.2μm,0.1MPa下纯水通量800L/m2h,内/外径0.7/1.3mm。
备注说明:在选用上述规格的中空纤维的前提下,一般而言,每3cm长的中空纤维,步骤2)中加18~22μL(即20μL左右)的鼠尾胶原溶液能基本注满中空纤维的内腔,同理,步骤3)中加18~22μL(即20μL左右)的细胞悬液能基本注满中空纤维的内腔。
作为本发明的结肠癌细胞的体外拟组织化培养方法的进一步改进:
所述步骤3)中使用步进电机驱动装置使中空纤维沿轴向旋转(步进电机驱动装置的使用与细胞单层融合状态有关)。
备注说明:在细胞接种前4小时里,细胞处于慢慢贴壁状态。由于中空纤维是管状结构,如果在接种大量细胞后只是静置,细胞会大量沉淀在底部,导致分布不均匀,既影响细胞的生长状态,也不利于后续实验的开展。步进电机的极低速旋转可以帮助中空纤维转起来,又不至于影响细胞的贴壁,最后能够达到细胞均匀贴壁的效果,并大量增殖形成细胞单层。
作为本发明的结肠癌细胞的体外拟组织化培养方法的进一步改进:
所述步骤4)中的培养基为:将DMEM基础培养基(高糖)与胎牛血清按照9:1的体积比混合,得培养基。
本发明接种细胞前添加胶原,把含有0.1%乙酸的胶原涂覆在中空纤维内表面;且通过使用成套步进电机驱动装置,促进细胞均匀贴壁,形成融合的细胞单层,可以长期保持其生物学活性及特异性功能。从而构建出相比于单层培养模型更能模拟人体小肠构型和功能的中空纤维反应器。
综上所述,本发明公开了一种能够模拟人体组织微观形态的小肠细胞中空纤维膜反应器的构建方法,使其能够适用于研究功能性成分转运吸收行为的研究。本发明构建了一种新型的Caco-2细胞生物反应器,将Caco-2细胞培养于中空纤维膜内表面,优化了实验条件,完善了细胞功能分析,证明该拟组织化细胞培养模型可用于物质的吸收转运研究。本发明首次在食品研究领域构建了Caco-2细胞中空纤维反应器,验证了中空纤维的三维培养结构可以促进Caco-2细胞的快速分化。为食品有害物质及功能性食品的研究提供一个新的模型。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是步进电机的使用状态示意图;
图2是Caco-2细胞在Transwell、PES和PVDF上培养的MTT结果;
图3是Caco-2细胞培养在PES中空纤维膜内表面的扫描电镜图。A-H分别表示接种细胞后第2,5,7,9,11,14,17,19天的生长情况。Bar=1mm。
图4是Caco-2细胞培养在PVDF中空纤维膜内表面的扫描电镜图。A-H分别表示接种细胞后第2,5,7,9,11,14,17,19天的生长情况。Bar=1mm。
图5是培养在PES,PVDF和Transwell板上的Caco-2细胞的ALP活性检测结果。
图6是培养在PES,PVDF和Transwell板上的Caco-2细胞的γ-GT活性检测结果。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明具体实施。
实施例1、一种结肠癌细胞的体外拟组织化培养方法(用于功能性成分研究的Caco-2细胞中空纤维反应器的构建方法),依次进行如下步骤:
1)、中空纤维的灭菌:
将中空纤维切成3cm长的小段,浸泡于PBS缓冲溶液(pH=7.4)中,置于蒸汽高压(1.1个大气压,121℃)灭菌锅灭菌20min;
待灭菌完毕,在超净台中取出中空纤维置于平皿上铺开风干,一般需要放置过夜;
上述中空纤维为PES中空纤维膜或PVDF中空纤维膜;
所述PES(聚醚砜)中空纤维膜为:孔径0.1μm,0.1MPa下纯水通量1000L/m2h,内/外径0.8/1.4mm;
所述PVDF(聚偏氟乙烯)中空纤维膜为:孔径0.2μm,0.1MPa下纯水通量800L/m2h,内/外径0.7/1.3mm。
2)、中空纤维预先铺被胶原:首先根据I型鼠尾胶原(鼠尾胶原蛋白Ⅰ型)的密度稀释配制成浓度为0.75mg/mL鼠尾胶原溶液(利用体积浓度为0.1%乙酸溶液进行配制),然后将上述鼠尾胶原溶液约20μL注入(通过10μL枪头注入)平躺状态下的步骤1)所得的灭菌后中空纤维的内腔;接着室温静置越30min;
可将中空纤维静置于6孔板中备用;
3)、将Caco-2细胞悬液计数后稀释到5×106cells/mL,取20μL注入(可用微量进样器注入)至步骤2)所得的中空纤维内腔(仍处于平躺状态),此时该中空纤维内腔充满Caco-2细胞悬液(此时,原鼠尾胶原溶液会被挤排出中空纤维的内腔),置于37℃培养箱中,使用步进电机使中空纤维沿轴向旋转(如图1所述),步进电机设定为1脉冲/秒(即,控制转速为转90度/小时,即,每小时转1/4周),旋转时间为4h,便于细胞的均匀贴附;
4)、总计旋转4h后,将培养有细胞的中空纤维置于6孔板中,细胞板的每孔中设置3根中空纤维(此时,中空纤维呈水平状态)。在细胞板的每孔加入2~3mL培养基,将6孔板放入37℃培养箱中进行培养;每天需轻微晃动培养板,每1~2天更换一次新鲜的培养基。
上述培养基的制备方法为:将DMEM基础培养基(高糖)与胎牛血清按照9:1的体积比混合,得培养基。
说明:Caco-2培养周期为21天。
实验1、细胞琥珀酸脱氢酶染色及酶活测定
将置于5%CO2培养箱的6孔板取出,按照实验需求在一定天数(第2、6、8、10、14、18、21天)取出若干根中空纤维(实施例1所得)放入新的6孔板(每个孔放3根中空纤维),弃去培养基用PBS漂洗一到两次,用微量进样器为每根中空纤维注入配好的1.2g/L的MTT溶液(溶于PBS中),每孔加300ul,然后将该6孔板置于37℃恒温培养箱反应3~4h,待MTT还原为蓝紫色甲臜结晶并沉积在细胞中。配好含有0.1%盐酸的异丙醇溶液用于萃取甲臜。约3.5h后将6孔板取出,弃去多余的MTT溶液,用PBS漂洗2次,将中空纤维剖开观察结晶情况,并于细胞板每孔加入750μL盐酸异丙醇溶液萃取约10min,得到蓝紫色萃取液。设置波长为570nm测其吸光值。
通过MTT实验表征了不同材料的中空纤维反应器和Transwell单层培养模型中的Caco-2细胞琥珀酸脱氢酶活性,其结果如图2所示。接种细胞3天后,MTT实验表明中空纤维内表面出现蓝紫色甲臜结晶。图2说明中空纤维反应器和Transwell单层模型(美国康宁公司生产)呈现出相似的变化趋势,在前9到10天的时间里,细胞的总琥珀酸脱氢酶活性在不断增长中,而在随后一周内基本维持稳定的总体水平,细胞增长分化末期呈现出一定的缩减。
出现该现象的主因是细胞在大量增长并融合后基本丧失生长繁殖能力,随后其细胞内的大量营养物质和能量被用在功能分化上,使代表线粒体功能的琥珀酸脱氢酶减弱,进而令单个细胞的线粒体活性下降。
该实验1证明了本发明培养的细胞在促进细胞增殖方面与已经非常经典成熟的Transwell培养模型的细胞较为一致,体现了中空纤维培养模型的稳定性和可行性。
实验2、扫描电子显微镜观察
接种有细胞的样品(实施例1所得的培养第2,5,7,9,11,14,17,19天的“中空纤维”)用于扫描电镜观察之前需进行细胞的固定和梯度脱水处理。具体方法如下:1.将样品(实施例1所得的培养第2,5,7,9,11,14,17,19天的“中空纤维”)浸没在2.5%的戊二醛溶液中4℃保存过夜以固定细胞。2.倒掉固定液,用浓度为0.1M、pH=7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次,每次15min。3.在通风橱中,用1%的锇酸固定样品1~2h。4.小心吸弃锇酸废液至密闭容器中,再用0.1M、pH=7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次,每次15min。5.用不同浓度梯度的乙醇溶液(包括30%、50%、70%、80%、90%和95%五种浓度)从低浓度到高浓度对样品进行脱水处理,每种浓度处理15min,再用100%的乙醇处理两次,每次20min。6.用乙醇与乙酸异戊酯的混合液(V/V=1/1)对样品处理30min,再利用纯乙酸异戊酯处理样品1h或放置过夜。7.临界点干燥。8.镀膜,观察。9.将处理好的样品置于扫描电镜中观察。
Caco-2细胞的培养周期约为21天。在培养前期,Caco-2细胞增殖明显,逐渐覆盖中空纤维膜内表面,形成细胞单层。而在培养后期,细胞数目显著增加,不但覆盖了膜材料表面,甚至出现了复层生长,并出现了部分球形死亡细胞。
从接种培养9天的扫描电镜图(图3和4)中可以观察到,Caco-2细胞在中空纤维膜表面黏附和铺展良好,细胞均伸出了伪足,细胞的轮廓也比较清晰,表现为良好的梭形或者不规则多边形的上皮样细胞形态,并逐步汇合成片从而形成细胞单层。在PVDF中空纤维膜上可观察到部分细胞向材料空隙内迁移生长。
将两种中空纤维材料表面的细胞形态对比发现,在PES中空纤维膜表面,Caco-2细胞的形态更为清晰,轮廓更为清楚。而Caco-2细胞在PVDF膜内培养达到21天左右形成的细胞密度明显更大,完全覆盖膜材料表面。
该实验2证明了本发明的中空纤维的空腔结构为细胞生长提供了三维空间,更接近体内的微环境。中空纤维可以促进细胞均匀贴壁,形成融合的细胞单层,可以长期保持其生物学活性及特异性功能。
实验3、碱性磷酸酶活性检测
在PES和PVDF中空纤维中接种Caco-2细胞,1天左右待细胞贴附融合后,在第1,3,8,11,14,17,21天取出若干根中空纤维(实施例1所得的培养的“中空纤维”)置于新的6孔板中,用PBS漂洗两次,将中空纤维剖开剪碎,每孔加入500μL0.5%的TritionX-100溶液(用PBS稀释)进行裂解,必要时可加以超声或震荡处理。30min后收集裂解液,若不能及时检测可将其保存于-80℃冰箱待测,但需避免反复冻融。统一测试时,根据试剂盒说明书操作并测得标准品和样品的吸光值,根据酶活性的定义计算出样品中的碱性磷酸酶活性。
在Caco-2细胞接种培养后,前期稳定增长融合形成细胞层,后期开始分化出现肌动蛋白和刷状缘。刷状缘酶系中最具代表性的就是碱性磷酸酶(ALP)和谷氨酰基转移酶(γ-GT)。在Caco-2细胞的培养周期中碱性磷酸酶活性会不断增长,可以由此验证单细胞层的分化情况。本发明在21天的培养时间内通过测定特异性底物的水解反应速率来确定酶活性,对比PES、PVDF中空纤维膜和Transwell插入式滤膜之间的差别。
如图5所示,PES和PVDF中空纤维膜上培养的Caco-2细胞的碱性磷酸酶活性在培养周期内快速且持续地增长并在两周左右达到峰值,增长了约12倍,两者都与Transwell的结果存在显著性差异。在培养8天后,Caco-2细胞中空纤维反应器中碱性磷酸酶活性维持较为稳定的变化。而Transwell嵌套小室上培养的细胞的酶活增长缓慢,在培养10天后较快增长,与酶活性已有下降的中空纤维膜上培养的细胞形成显著性差异(P<0.05)。
该实验4证明了本发明培养的细胞在快速增殖后,在一周左右就进入分化状态。相比于Transwell培养模型的细胞,则培养两周左右才进行分化。
实验4、γ-谷氨酰转肽酶活性检测
在PES和PVDF中空纤维中接种Caco-2细胞,1天左右待细胞贴附融合后,在第1,2,4,6,8,10,13,16,18,21天取出若干根中空纤维(实施例1所得的“中空纤维”)置于新的6孔板中,用PBS漂洗两次,将中空纤维剖开剪碎,按照试剂盒说明书操作并测得标准品和样品的吸光值变化,根据公式计算出样品中谷氨酰转肽酶的活性。通过样品中的蛋白含量,对每个样品得到的数据计算结果进行标准化。通过BCA(Bicinchoninicacid)蛋白浓度测定试剂盒对样品的蛋白含量进行测定。
对于谷氨酰基转移酶,从图6可以看出,在21天的培养周期内中空纤维内表面培养的细胞的相对活性高于Transwell嵌套小室上培养的细胞。经过显著性差异分析,在前期的培养时间中,中空纤维培养模型显著优于Transwell模型(P<0.05),而三者在培养后期的酶活水平则趋于一致。
实验3和实验4一起证明从刷状缘酶系活性的角度证明,本发明培养的Caco-2细胞能够快速进入分化状态,极大地缩短分化时间,可以在一定程度上降低由于过长的培养时间Caco-2细胞受到污染等原因导致的实验失败。
通常情况下,在Caco-2细胞模型构建以后,需要通过Caco-2细胞单细胞层的紧密性和完整性来评价模型构建是否成功。本发明通过扫描电镜观察细胞形态、测定刷状缘酶系活性,以及荧光染色等方法考察了Caco-2单细胞层的完整性和细胞分化情况。结果表明,聚醚砜和聚偏氟乙烯中空纤维膜能有效促进细胞增殖,缩短细胞分化周期,从而形成高效稳定的三维细胞模型。因此,本发明构建的中空纤维膜Caco-2细胞三维反应器已经具备甚至高于传统的Transwell单层模型所具有的功能。
对比例1、将实施例1中的中空纤维改用聚丙烯腈中空纤维(孔径1μm,0.1MPa下纯水通量1000L/m2h,内/外径08/1.2mm);其余等同于实施例1。
对比例2-1、取消实施例1的步骤2),即,在步骤3)中将Caco-2细胞悬液直接注入步骤1)所得的灭菌后中空纤维中,其余同实施例1。
对比例2-2、将“I型鼠尾胶原”改成藻朊酸盐;浓度不变,其余同实施例1。
对比例2-3、将鼠尾胶原溶液中I型鼠尾胶原的浓度由0.75mg/mL改成0.3mg/mL;其余同实施例1。
对比例2-4、将鼠尾胶原溶液中I型鼠尾胶原的浓度由0.75mg/mL改成1.5mg/mL;其余同实施例1。
对比例3-1、将实施例1中的转速改成360度/小时;其余同实施例1。
对比例3-2、将实施例1中的转速改成45度/小时;其余同实施例1。
对比试验、将上述所有的对比例按照上述实验1的方法进行检测,且,为了简化实验,上述对比例2和对比例3中仅选择PVDF进行实验,所得结果如下:
表1
通过对比例1可以发现,聚丙烯腈中空纤维材料上培养的细胞生长极为缓慢,在培养5天后通过MTT实验观察未出现大量片状蓝紫色结晶,表示细胞未呈现融合的趋势。相比而言,PES中空纤维材料更为适合Caco-2细胞贴壁与生长。
通过对比例2-1可以发现,MTT实验的吸光值极低,表明不加鼠尾胶原溶液无法起到铺被中空纤维内表面的作用,细胞无法适应并贴壁生长于中空纤维略为粗糙的内表面。
通过对比例2-2,藻朊酸盐作为改善中空纤维材料表面性能的物质,其效果不如鼠尾胶原I型,因此在细胞接种第5天时测得的MTT实验吸光值略低。
通过对比例2-3和例2-4对比发现,太高或者太低的胶原浓度都会影响胶原发挥其改善膜表面性质的作用,使细胞无法达到快速增殖的状态。
通过对比实验的筛选和比较,证明本发明所设定的PES中空纤维是最适合Caco-2细胞贴壁与生长。另外,0.75mg/mL的I型鼠尾胶原的生物相容性较好,能够在一定程度上帮助细胞更好地贴壁生长。
根据对比例3-1和3-2发现:转速过高会影响Caco-2的贴壁,使细胞在流动的状态下难以贴壁生长;转速过低使细胞仍大量积聚在纤维膜底侧,无法均匀分布在纤维人表面,从而形成接触抑制,无法大量生长。
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
Claims (5)
1.结肠癌细胞的体外拟组织化培养方法,其特征是依次进行如下步骤:
1)、中空纤维的灭菌:
将中空纤维切成2~4cm长的小段,浸泡于PBS缓冲溶液中,然后一同置于蒸汽高压灭菌锅灭菌20min;
待灭菌完毕,在超净台中取出中空纤维置于平皿上铺开风干;
2)、中空纤维预先铺被胶原:
首先将I型鼠尾胶原稀释配制成浓度为0.7~0.8mg/mL鼠尾胶原溶液,然后将上述鼠尾胶原溶液注满平躺状态下的步骤1)所得的灭菌后中空纤维的内腔;接着静置20~40min;
3)、将Caco-2细胞悬液计数后稀释到5×106cells/mL注入至步骤2)所得的中空纤维内腔,直至该中空纤维内腔充满Caco-2细胞悬液,置于37±0.2℃培养箱中,使用驱动装置使中空纤维沿轴向旋转,转速为转90度/小时,旋转时间为4h;
4)、旋转4h后,将培养有细胞的中空纤维置于培养板中,在培养板的每孔加入2~3mL培养基,将培养板放入37±0.2℃培养箱中进行培养;每1~2天更换一次培养基。
2.根据权利要求1所述的结肠癌细胞的体外拟组织化培养方法,其特征是:
所述步骤4)中,培养板的每孔中设置2~3根中空纤维。
3.根据权利要求1或2所述的结肠癌细胞的体外拟组织化培养方法,其特征是:所述中空纤维为PES中空纤维膜或PVDF中空纤维膜;
所述PES中空纤维膜为:孔径0.1μm,0.1MPa下纯水通量1000L/m2h,内/外径0.8/1.4mm;
所述PVDF中空纤维膜为:孔径0.2μm,0.1MPa下纯水通量800L/m2h,内/外径0.7/1.3mm。
4.根据权利要求3所述的结肠癌细胞的体外拟组织化培养方法,其特征是:
所述步骤3)中使用步进电机驱动装置使中空纤维沿轴向旋转。
5.根据权利要求3所述的结肠癌细胞的体外拟组织化培养方法,其特征是:
所述步骤4)中的培养基为:将DMEM基础培养基(高糖)与胎牛血清按照9:1的体积比混合,得培养基。
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