JP7112736B2 - 半透膜及びその使用 - Google Patents
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Description
本願は、2017年1月18日に、日本に出願された特願2017-006741号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
また、上述の「組織型培養モデル」に関連した従来技術では、細胞を長期的に培養下で維持することが難しく、培養モデルを構築後、即座に使用しなければならず、時間的制約がある。
本発明の第1態様に係る半透膜は、液相中で半透性を有し、且つ、格子構造を有する低吸水性の保持体を含む。
一実施形態において、本発明は、液相中で半透性を有し、且つ、格子構造を有する低吸水性の保持体を含む半透膜を提供する。
[第1実施形態]
図1は、本発明の第1実施形態に係る半透膜を模式的に示す平面図である。
ここに示す半透膜10は、格子構造を有する低吸水性の保持体1を含む。保持体1は、半透膜表面の少なくとも一部に接着していてもよく、半透膜内に少なくとも一部が包埋された状態であってもよい。
なお、本明細書において、「半透性」とは、一定の分子量以下の分子又はイオンのみを透過可能な性質を意味し、「半透膜」とは、当該性質を有する膜である。本実施形態の半透膜を備える細胞培養用デバイスにおいて、例えば、細胞を含む該細胞培養用デバイスを、培養液を含む容器内に浸した場合に、前記半透膜は、細胞を細胞培養用デバイスの外部に透過させず、一方、培養液に溶解している栄養分を細胞培養用デバイスの内部に透過させるとともに、細胞培養用デバイスの内部の培養液に溶解した老廃物を含む細胞生産物を細胞培養用デバイスの外部に透過させることができる。このため、本実施形態の細胞培養用デバイスは、細胞の長期間培養に用いることができる。
より具体的には、本実施形態の半透膜は、例えば、分子量約100万以下の高分子化合物を透過することができるものとすることができ、例えば、分子量約20万以下の分子化合物を透過することができるものとすることができる。
[保持体]
本実施形態における保持体は、格子状であって低吸水性であることが好ましい。
本実施形態の半透膜において、保持体以外の構成材料としては、細胞毒性のないものを用いることができ、天然高分子化合物であってもよく、合成高分子化合物であってもよい。また、前記性質を有する材料としては、生体適合性を有する材料であることが好ましい。
なお、本明細書において、「生体適合性」とは、生体組織と材料との適合性を示す評価基準を意味し、「生体適合性を有する」とは、材料それ自体が毒性を有さず、内毒素等の微生物由来の成分を有さず、生体組織を物理的に刺激することなく、生体組織を構成するタンパク質や細胞等と相互作用しても拒絶されない状態を意味する。
1.生体適合性を有する合成高分子化合物を用いた半透膜の製造方法
例えば、半透膜の構成材料が生体適合性を有する合成高分子化合物である場合は、公知の方法(例えば、特開2001-149763号公報等参照。)を利用して、半透膜を製造することができる。
また、例えば、半透膜の構成材料がハイドロゲルである場合は、公知の方法(例えば、特開平8-228768号公報、国際公開第2012/026531号、特開2012-115262号公報、及び特開2015-35978号公報等参照。)を利用して、半透膜を製造することができる。
ゾルがコラーゲンゾルである場合、コラーゲンゾルは至適な塩濃度を有するものとして、生理食塩水、PBS(Phosphate Buffered Saline)、HBSS(Hank’s Balanced Salt Solution)、基礎培養液、無血清培養液、血清含有培養液等を用いて、調製したものを用いることができる。また、コラーゲンのゲル化の際の溶液のpHは、例えば6以上8以下とすることができる。
一実施形態において、本発明は、上述の半透膜を少なくとも一部に備える細胞培養用デバイスを提供する。
[第1実施形態]
図2は、本発明の第1実施形態に係る細胞培養用デバイスを模式的に示す斜視図である。
ここに示す細胞培養用デバイス100は、半透膜10を天面及び底面に備え、部材11により側面を封止された円柱の形状をしている。図2において、半透膜を天面及び底面に備えるものを例示したが、天面、底面又は側面等の一部に備えるものでもよく、天面、底面、及び側面等の全体が半透膜からなるものでもよい。中でも、本実施形態の細胞培養用デバイスは、培養モデルとして用いる場合には、半透膜を天面及び底面に備えるものが好ましい。
図3は、本発明の第2実施形態に係る細胞培養用デバイスを模式的に示す斜視図である。
図4は、本発明の第3実施形態に係る細胞培養用デバイスを模式的に示す斜視図である。
図5A及び図5Bは、本発明の第4実施形態に係る細胞培養用デバイスを模式的に示す斜視図である。図5Aに示す細胞培養用デバイス400aは、デバイス内部と外部とが注入孔14を介して連通している。一方、図5Bに示す細胞培養用デバイス400bはデバイス内部と外部とが不通である。
図6A及び図6Bは、本発明の第5実施形態に係る細胞培養用デバイスを模式的に示す断面図である。図6Aに示す細胞培養用デバイス500aは、デバイス内部と外部とが注入孔14を介して連通している。一方、図6Bに示す細胞培養用デバイス500bはデバイス内部と外部とが不通である。
図7は、本発明の第6実施形態に係る細胞培養用デバイスを模式的に示す斜視図である。
[半透膜]
本実施形態の細胞培養用デバイスに用いられる半透膜は、気相中で液密性を有するため、例えば、本実施形態の細胞培養用デバイスの内部に培養液等の液体を含んでいる場合に、気相中において、半透膜から液体が漏れることなく、内部に保つことができる。この液密性は、半透膜上での表面張力によるものである。一方、気体を通すことができるため、内部に液体を含む場合、内部の液体は経時的に蒸発する。
本実施形態の細胞培養用デバイスにおいて、半透膜以外の部分を構成する部材は、液密性を有するものを用いることができる。また、本実施形態の細胞培養用デバイスにおいて、半透膜以外の部分を構成する部材は、通気性を有するものであってもよく、通気性を有さないものであってもよい。
本実施形態における部材は、用いる材料に応じて、公知の方法を用いて製造することができる。
本実施形態の細胞培養用デバイスにおいて、部材が注入孔を備える場合に、用いられる埋め込み型の栓は、部材よりも硬い材質のものが好ましい。具体的には、例えば、鉄、ステンレス鋼等の金属等が挙げられ、これらに限定されない。また、部材の突起部に注入孔を備える場合には、用いられる栓は、埋め込み型であっても、被覆型であってもよい。
本実施形態の細胞培養用デバイスに用いられる支持体の材料としては、例えば、有機材料であってもよく、無機材料であってもよい。
本実施形態における支持体は、用いる材料に応じて、公知の方法を用いて製造することができる。
本実施形態の細胞培養用デバイスに用いられるチューブの材料としては、特別な限定はなく、上記生体適合性を有する材料であってもよく、又は細胞の培養に適した材料であってもよい。前記生体適合性を有する材料としては、上述の「半透膜」の「構成材料」の「その他」において例示されたものと同様のものが挙げられる。前記細胞の培養に適した材料としては、上述の「部材」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
本実施形態におけるチューブは、用いる材料に応じて、公知の方法を用いて製造することができる。
気密性を有するフィルムの厚さは、例えば10μm以上500μm以下とすることができ、例えば30μm以上300μm以下とすることができ、例えば50μm以上150μm以下とすることができる。
気密性を有するフィルムは、用いる材料に応じて、公知の方法を用いて製造することができる。
本実施形態の細胞培養用デバイスは、所望の形状となるように、半透膜のみ、又は、半透膜と部材とを組み立てることにより製造することができる。また、必要に応じて、支持体及びチューブを備え付けることができる。
まず、部材11の天面及び底面と同じ大きさ、又は、部材11の天面及び底面よりも一回り大きい半透膜10を2枚準備する。次いで、準備した半透膜10をそれぞれ部材11の天面及び底面となるように、接合させる。
本実施形態の細胞培養用デバイスは後述に示すとおり、例えば、細胞の培養、細胞の運搬、組織型チップ、器官型チップ、器官型チップシステム等に使用することができる。
一実施形態において、本発明は、上述の細胞培養用デバイスを用いる細胞の培養方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、上述の細胞培養用デバイスを用いる細胞数の測定方法を提供する。
C = N × 102 ・・・[1]
上記式[1]において、「102」は1cm2に対する容量の変換値を意味する。
A = C × S ・・・[2]
一実施形態において、本発明は、1種類の細胞を含む上述の細胞培養用デバイスを備える組織型チップを提供する。
一実施形態において、本発明は、少なくとも2種類の細胞を含む上述の細胞培養用デバイスを備える器官型チップを提供する。
一実施形態において、本発明は、多細胞構造体を提供するためのキットであって、上述の組織型チップ、又は上述の器官型チップと培養液とを含む開閉可能な密封容器を備えるキットを提供する。
一実施形態において、本発明は、上述の組織型チップ、又は、上述の器官型チップを少なくとも2つ備え、前記組織型チップ、又は、前記器官型チップが密閉性を保ちながら連結された器官型チップシステムを提供する。
図8Aは、本発明の第1実施形態に係る器官型チップシステムを模式的に示す斜視図である。
図8Bは、本発明の第2実施形態に係る器官型チップシステムを模式的に示す斜視図である。
図8Cは、本発明の第3実施形態に係る器官型チップシステムを模式的に示す斜視図である。
図8Dは、本発明の第4実施形態に係る器官型チップシステムを模式的に示す斜視図である。
1.保持体の準備
まず、ポリエステル製メッシュ(T80-70;株式会社ヤマニ製、線径70μm、目開き248μm×248μm)を保持体として使用するために、ハサミで直径34mmの円形に切り出した。次いで、直径60mmペトリディッシュ(BD Falcon、Cat#351007)に、70%エタノールを入れた。次いで、ペトリディッシュ中に、保持体として使用する直径34mmの円形メッシュを10分程度浸し、殺菌した。次いで、70%エタノールをペトリディッシュから取り除き、代わりに5mLのPBS(SIGMA、D8537)を入れ、保持体を洗浄した。このPBSによる洗浄は計3回繰り返した。洗浄後、保持体1枚を直径35mmディッシュ(BD Falcon、Cat#353001)に移し入れ、10% FBS、20mM HEPES、100units/mL ペニシリン、100μg/mL ストレプトマイシン含有DMEM(以下、「培養液」と称する場合がある。)2mLを加えて10分間浸漬した。
半透膜の製造は、保持体包埋ネイティブコラーゲンビトリゲル(登録商標)膜(ネイティブコラーゲンの単位面積あたりの含有量:0.5mg/cm2)(以下、「半透膜1」と称する場合がある。)を公知の方法(参考文献:特開平8-228768号公報)に準じて調製した。なお、半透膜1は2枚製造した。
1.半透膜(コントロール)の製造
(1)まず、ナイロン膜 (Amersham Pharmacia Cat#RPN1782B)をくり抜き機(森下製版、刃:直径24mm~33mm)でくり抜き、外径33mm、内径24mmの環状ナイロン膜支持体を作製した。次いで、直径60mmペトリディッシュ(BD Falcon、Cat#351007)に、70%エタノールを入れた。このペトリディッシュ中に、環状ナイロン膜支持体を10分程度浸し、殺菌した。次いで、70%エタノールをペトリディッシュから取り除き、代わりに5mLのPBS(SIGMA、D8537)を入れ、環状ナイロン膜支持体を洗浄した。このPBSによる洗浄は計3回繰り返した。洗浄後、環状ナイロン膜支持体1枚を直径35mmディッシュ(BD Falcon、Cat#353001)に移し入れ、培養液2mLを加えて10分間浸漬した。
1.保持体の準備
ポリエステル製メッシュ(T80-70;株式会社ヤマニ製、線径70μm、目開き248μm×248μm)を保持体として使用するために、ハサミで直径13mmの円形に切り出した。まず、直径35mmペトリディッシュ(BD Falcon、Cat#351008)に、70%エタノールを入れた。次いで、ペトリディッシュ中に、保持体として使用する直径13mmの円形メッシュを10分程度浸し、殺菌した。次いで、70%エタノールをペトリディッシュから取り除き、代わりに2mLのPBS(SIGMA、D8537)を入れ、保持体を洗浄した。このPBSによる洗浄は計3回繰り返した。洗浄後、PBSを除去し、培養液2mLを加えて10分間浸漬した。
半透膜の製造は、公知の方法(参考文献:特開2015-203018号公報)に準じて0.25%コラーゲンゾルを接着剤として使用し、2枚のネイティブコラーゲンビトリゲル(登録商標)膜(ネイティブコラーゲンの単位面積あたりの含有量:0.5mg/cm2)の間に保持体を挟み結合することで調製した(以下、「半透膜2」と称する場合がある。)。なお、半透膜2は2枚製造した。
1.細胞培養用デバイスの製造
アクリル樹脂リング(外径13mm、内径7.98mm、厚さ2.0mm、注入孔径0.7mm)の両面に保持体を含む半透膜を貼り付けることで、以下の3種類の細胞培養用デバイスを製造した。また、コントロールとして、アクリル樹脂リングの両面に保持体なしの半透膜のみを貼り付けた細胞培養用デバイスを製造した。なお、本実施例では、保持体を含む半透膜をアクリル樹脂リングの両面に貼り付けたが、保持体を含む半透膜をアクリル樹脂リングの片面のみに貼り付けて、もう一方の面には保持体なしの半透膜を貼り付けてもよい。
まず、アクリル樹脂リングの片面に、ポリウレタン系接着剤を塗布し、製造例1で製造した半透膜1を貼り付けた。次いで、アクリル樹脂リングを裏返したもう一方の面にも同様にポリウレタン系接着剤を塗布して、製造例1で製造した半透膜1を貼り付けた(以下、「細胞培養用デバイス1」と称する場合がある。)。
まず、アクリル樹脂リングの片面に、ポリウレタン系接着剤を塗布し、製造例3で製造した半透膜2を貼り付けた。次いで、アクリル樹脂リングを裏返したもう一方の面にも同様にポリウレタン系接着剤を塗布して、製造例3で製造した半透膜2を貼り付けた(以下、「細胞培養用デバイス2」と称する場合がある。)。
(3-1)まず、製造例2で製造した2枚の半透膜(コントロール)を再水和した後、公知の方法(参考文献:特開2007-185107号公報)に準じて、2枚の環状ゴム磁石の間に挟持させて磁力で固定した後に再乾燥することで、しわの無い半透膜(コントロール)の乾燥体を得た。
(4-1)まず、上記「(3)細胞培養用デバイス(コントロール)の製造」と同様の方法を用いて、細胞培養用デバイス(コントロール)を得た。
(1)細胞培養用デバイスの膜のたわみ具合の確認
まず、細胞培養用デバイス1、細胞培養用デバイス2、細胞培養用デバイス3、及び細胞培養用デバイス(コントロール)の注入孔から、それぞれPBSを注入し、細胞培養用デバイス1、細胞培養用デバイス2、細胞培養用デバイス3、及び細胞培養用デバイス(コントロール)内をPBSで満たし、ステンレス剛製の球を用いて、注入孔を塞いだ。次いで、細胞培養用デバイス1、細胞培養用デバイス2、細胞培養用デバイス3、及び細胞培養用デバイス(コントロール)を縦置きにて静置した。細胞培養用デバイス1及び細胞培養用デバイス(コントロール)の様子を図10B及び図11Bにそれぞれ示す。
次いで、PBSで満たされた細胞培養用デバイス1、細胞培養用デバイス2、細胞培養用デバイス3、及び細胞培養用デバイス(コントロール)を、ピンセットを用いて、半透膜の面を摘まみ上げた。細胞培養用デバイス1及び細胞培養用デバイス(コントロール)の様子を図10A及び図11Aにそれぞれ示す。
(1)予め培養したHepG2細胞(理化学研究所バイオリソースセンターより購入、RCB1648)を回収し、1.0×105細胞/mLとなるように培養液と混合し、HepG2細胞の懸濁液を調製した。
Claims (14)
- 血球計算盤として機能する格子構造を有する低吸水性の保持体を含むビトリゲル膜を少なくとも一部に備える多細胞構造体培養用デバイスであって、
前記ビトリゲル膜は、ハイドロゲル膜をガラス化した後に再水和して得られるゲル膜である、多細胞構造体培養用デバイス。 - 前記保持体の格子構造において、格子を形成する縦の線及び横の線のそれぞれの間隔が、100μm以上500μm以下である、請求項1に記載の多細胞構造体培養用デバイス。
- 前記保持体がポリエステル又はポリスチレンからなる請求項1又は2に記載の多細胞構造体培養用デバイス。
- ネイティブコラーゲン、又はアテロコラーゲン由来である、請求項1~3のいずれか一項に記載の多細胞構造体培養用デバイス。
- 培養液に懸濁された細胞を注入可能であり、内部容積が10mL以下である請求項1~4のいずれか一項に記載の多細胞構造体培養用デバイス。
- 全体が前記ビトリゲル膜からなる請求項1~5のいずれか一項に記載の多細胞構造体培養用デバイス。
- 1種類の細胞を含む請求項1~6のいずれか一項に記載の多細胞構造体培養用デバイスを備える組織型チップ。
- 前記細胞の密度が、2.0×103細胞/mL以上1.0×109細胞/mL以下である請求項7に記載の組織型チップ。
- 少なくとも2種類の細胞を含む請求項1~6のいずれか一項に記載の多細胞構造体培養用デバイスを備える器官型チップ。
- 前記細胞の密度が、2.0×103細胞/mL以上1.0×109細胞/mL以下である請求項9に記載の器官型チップ。
- 多細胞構造体を提供するためのキットであって、
請求項7若しくは8に記載の組織型チップ、又は、請求項9若しくは10に記載の器官型チップと培養液とを含む開閉可能な密封容器を備えるキット。 - 請求項7若しくは8に記載の組織型チップ、又は、請求項9若しくは10に記載の器官型チップを少なくとも2つ備え、前記組織型チップ又は前記器官型チップが密閉性を保ちながら連結されている器官型チップシステム。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の多細胞構造体培養用デバイスを用いる細胞の培養方法。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の多細胞構造体培養用デバイスを用いる細胞数の測定方法。
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