CN116478819B - 一种用于构建三维器官微环境模型的微流控系统及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于构建三维器官微环境模型的微流控系统及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微流控芯片技术领域，具体涉及一种微流控系统及其应用。所述的微流控系统包括微流控芯片和细胞，使用本发明所述的微流控系统，可以模拟体内生理状态微环境，可实现三维器官微环境的构建，尤其是三维仿生生精小管模型或者三维仿生睾丸微环境模型的长期培养及生精微环境的调控，允许持续灌注以提供接近生理条件的流体剪切力，模拟细胞间相互作用和协同发育过程，可作为生理结构建模、分子机制探究、细胞相互作用、药物研发、疾病建模、辅助生殖或临床前研究的基础研究模型。

Description

一种用于构建三维器官微环境模型的微流控系统及其制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术领域，具体涉及一种用于构建三维器官微环境模型的微流控系统及其制备方法和应用。
背景技术
一个多世纪以来，二维（2D）培养技术已成为生物医学研究的基石。但随着研究的深入，传统的二维培养模型难以再现体内组织和器官水平的三维（3D）结构与功能关系，已无法满足细胞培养的需求。在此背景下，三维培养技术可以在体外更好地模拟组织功能的复杂机制，并可作为宝贵的临床前研究工具。尽管多种三维培养模型已被开发，但目前在体外构建三维器官微环境和研究多种细胞类型间相互作用的能力仍然非常有限，多种体外组织器官系统仍缺乏仿生的多尺度结构及微环境内信号传导，如体外实现血管内皮与周围结缔组织和实质细胞的共培养，而这对所有器官的功能都至关重要。因此我们迫切需要体外仿生的三维模型以研究器官在生理或病理情况下的结构与功能关系。
微流控芯片是组织工程领域中迅速发展起来的一项技术，该技术能够在体外同时对细胞或组织的物理、化学和生物微环境进行精确操控，从而更好地模拟细胞或组织的体内生理状况。该技术可以调控多细胞结构、细胞间相互作用、细胞外基质和作用于细胞的机械力等特性，从而模拟器官水平的复杂结构、微环境和生理学功能，具有其他培养技术难以比拟的优势与能力。
生殖健康是人类健康和幸福的源泉，目前男性不育症的发病率不断上升，但是对于导致男性不育的致病机制仍然所知甚少。睾丸是精子发生和雄激素生成的重要场所，其由生精小管以及周围的睾丸间质组织构成。生殖细胞的正常发育受到睾丸微环境的精细调控，但目前仍缺乏仿生的体外模型用于构建三维生精小管结构以及模拟睾丸内细胞相互作用。现有研究尚未建立用于模拟睾丸微环境的体外模型，而相关模型系统的开发对男性不育症的基础研究和临床转化至关重要。
尽管目前已有方法直接利用动物或人体睾丸组织进行体外培养，但在实际应用时，此方法常受到标本稀缺的限制，而且难以进行长期培养。传统的二维细胞培养方法也远非理想，因为细胞在二维环境中培养时，往往会失去一些固有特性，难以进行后续体外睾丸微环境构建。三维培养方法更接近体内的生理环境，目前已有基于水凝胶的三维睾丸类器官的构建方法，但该法存在固有的局限性，其形成的睾丸类器官随机性较高，尺寸分布不均，结构仿生性较差，并缺乏能够有效控制和监测细胞环境的能力。3D生物打印技术也被用于体外构建睾丸结构，虽然该技术允许在规定的三维结构中实现精确的细胞定位，但打印形成的睾丸类器官通量很低，结构无法长期维持，且只具备部分功能，难以有效模拟睾丸内细胞间的相互作用。同时，由于打印的三维组织中缺乏可灌注系统元件，限制了营养物质运输至类器官内部。现有基于微流控技术的睾丸芯片仅实现了对睾丸类器官球状体的灌注培养，并未复现仿生的生精小管结构，且该方案不能生成均一化的睾丸微组织，并无法满足对睾丸微环境的调控作用。
综上所述，目前报道的体外三维睾丸模型大多用于生成睾丸类器官球体，还未实现体外睾丸生精小管结构的重塑以及睾丸微环境的构建，且无法在体外精准调控细胞理化微环境参数。已有的睾丸模型难以作为研究生精小管结构、生殖细胞发育以及细胞间相互作用的生理学模型进行使用，因此亟需更仿生的三维器官微环境模型在体外模拟睾丸微环境，为基础研究和应用研究提供有力工具，加速药物研发进程，为临床前应用提供测试平台。
发明内容
针对现有体外工程化微环境构建器官模型的弊端，本发明基于微加工技术、微流控技术提供了一种可灌注、支持器官来源细胞共培养与三维器官微环境构建的微流控系统，可用于生理结构建模、分子机制探究、细胞相互作用、药物研发、疾病建模、辅助生殖或临床前研究。具体的，
本发明的第一方面，提供了一种微流控系统，所述的微流控系统包括微流控芯片和细胞，所述的微流控芯片包括芯片主体；所述的芯片主体上设置有灌注孔，所述的芯片主体内设置有管状通道，所述的灌注孔的底部覆盖所述的管状通道的全部或部分，所述的灌注孔中填充有水凝胶，所述的管状通道的管壁材料为水凝胶，所述的管状通道为一个或多个。
优选的，所述的微流控芯片还可以包含基底，所述的基底位于芯片主体的底部。
优选的，所述的芯片主体的材料为生物相容性材料。
优选的，微流控芯片根据设计和应用需求，所述的芯片主体的材料包括但不限于硅材料、氟材料、玻璃石英材料、金属材料、陶瓷材料或有机高分子聚合物材料中的一种或多种。更优选的，所述的多种包括两种、三种或者三种以上。
进一步优选的，所述的硅材料包括但不限于聚二甲基硅氧烷（PDMS）等。
进一步优选的，所述的氟材料包括但不限于聚四氟乙烯（PTFE）等。
进一步优选的，所述的玻璃石英材料包括但不限于石英和/或玻璃等。
进一步优选的，所述的金属材料包括但不限于不锈钢和/或钛合金等。
进一步优选的，所述的陶瓷材料包括但不限于氧化铝和/或羟基磷灰石等。
进一步优选的，所述的有机高分子聚合物材料包括但不限于聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚苯乙烯（PS）和/或聚碳酸酯（PC）等。
优选的，所述的管状通道的数目可以为1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
更优选的，所述的管状通道为独立通道，管状通道与外界，或者，管状通道之间可以通过灌注孔中的水凝胶进行物质交换。
更优选的，所述的每个管状通道的排列形式可以是平行的，也可以是交错的，只要相互独立即可。
进一步的，根据具体实施方式的需要，例如模拟不同三维器官微环境之间的相互作用，在彼此相互独立的管道之间，还可以通过外接管路联通。
优选的，所述的管状通道的横截面可以是任意形状的，例如圆形、长方形、正方形或者三角形等等，只要能满足细胞贴壁生长即可。
更优选的，所述的管状通道的长度为0.2-10cm中任一数值，例如0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，管径为100-500μm中任一数值，例如100、150、200、250、300、350、400、450或500μm。
更优选的，当具有多个管状通道时，不同管状通道的长度、形状和/或管径可以是相同的，也可以是不同的，只要能满足细胞培养的需要即可。
优选的，所述的灌注孔的数量可以为一个或多个。
优选的，所述的灌注孔的形状可以为任意形状，只要能使管状通道与外界，或者管状通道之间进行物质交换即可。
更优选的，灌注孔为多个时，不同灌注孔和所覆盖的管状通道形成独立的，和/或联通的微环境。
进一步优选的，灌注孔内可以覆盖多个管状通道，可以根据应用的具体目的来调整灌注孔所覆盖的管状通道的数量。不同灌注孔覆盖于相同的管状通道上。
在本发明的一个具体实施方式中，分别对多个灌注孔、管状通道按顺序编号，微流控芯片上包含两个灌注孔，编号为1号灌注孔和2号灌注孔，还包含三个管状通道，编号为第一管状通道和第二管状通道和第三管状通道。具体的，1号灌注孔覆盖于第一管状通道和第二管状通道上，2号灌注孔也覆盖于第一管状通道和第二管状通道上，形成多个彼此联通的微环境，当然，不同的灌注孔中还可以仅覆盖部分相同的管状通道，例如，1号灌注孔覆盖于第一管状通道、第二管状通道和第三管状通道上，2号灌注孔覆盖于第二管状通道和第三管状通道上，即，2号灌注孔并未与1号灌注孔中的第一管状通道直接相连，但不同的管状通道之间通过水凝胶进行物质交换，以实现不同灌注孔所构建的微环境中细胞的相互作用，形成彼此联通的微环境。
可以理解的是，若管状通道足够长，则可包含更多的灌注孔。
进一步的，不同灌注孔覆盖于完全不同的管状通道上，形成多个彼此完全独立的微环境，每个灌注孔都可以模拟单个器官微环境，可以对多个独立的器官微环境进行单独的分析。在本发明的一个具体实施方式中，灌注孔、管状通道的编号方式如上所述。具体的，1号灌注孔覆盖于第一管状通道和第二管状通道上，2号灌注孔覆盖于第三管状通道和第四管状通道上，或者，1号灌注孔覆盖于第一管状通道、第二管状通道和第三管状通道上，2号灌注孔覆盖于第四管状通道上等等。可以根据应用的目的调整灌注孔所覆盖的管状通道的数量。还可以将不同灌注孔覆盖的不同管状通道之间通过外接管路联通，或者，在不同的灌注孔之间通过外接管路联通，或者，还可以在不同的芯片的不同灌注孔上，通过外接管路联通。
即，不同芯片之间，或者，不同灌注孔之间，或者，不同灌注孔内的管状通道也可以进行联通，可以模拟多种器官微环境的相互作用。
在本发明的一个具体实施方式中，多个灌注孔、管状通道的编号方式同上，微流控芯片上包含两个灌注孔，编号为1号灌注孔和2号灌注孔，四个管状通道，编号为第一管状通道、第二管状通道、第三管状通道和第四管状通道。具体的，1号灌注孔覆盖于第一管状通道和第二管状通道上，2号灌注孔覆盖于第三管状通道和第四管状通道上，在后续培养时，使用外接管路联通第一管状通道和第三管状通道，或者，第一管状通道和第四管状通道，或者，第二管状通道和第三管状通道，或者，第二管状通道和第四管状通道等，还可以包含各种连接方式，只要能将不同灌注孔中的不同管状通道连接起来，可以用于模拟不同器官之间的相互作用即可。
优选的，所述的外接管路包括但不限于例如打孔、管道支架、外接管道、连接软管、灌注泵或注射器的一种或两种以上等等。当不同的微环境构建于多个不同的芯片上时，例如，两个不同芯片时，将两个芯片上的至少一条管状通道对齐，并将两个芯片连接起来，以形成联通的微环境。
三维器官微环境模型的成功构建以及多种三维器官微环境之间彼此联通，可以模拟多器官之间的相互作用。例如模拟肝脏与睾丸之间的相互作用以进行药物的生殖毒性预测；模拟肝脏与脑之间的相互作用以进行药物对神经系统的毒性检测，模拟肠道-肝脏-肾脏之间的相互作用以对药物吸收、代谢及排泄过程进行更全面的研究、模拟心脏-骨骼-肝脏-皮肤之间的相互作用以实现相互依赖的器官功能的再现、模拟结直肠癌-肝脏-肺-骨-肌肉之间的相互作用以预测癌症转移和测试抗转移治疗手段。
更优选的，不同灌注孔中的管状通道的数量可以是相同的，也可以是不同的。
更优选的，所述的灌注孔的直径小于管状通道的长度，但大于管状通道的宽度（只有一个管状通道时），或者，大于两外侧管状通道的管壁间的间距（具有多个管状通道时）。
可以理解的是，管状通道经灌注孔分为三部分，位于灌注孔外的两端部分，以及位于灌注孔内的部分，位于灌注孔内的部分的管状通道外覆盖着填充在灌注孔内的水凝胶，位于灌注孔外的两端部分的管状通道外覆盖着芯片主体材料。
管状通道位于灌注孔外的两端部分分别用于注入培养的物质、收集废液和与其他管状通道通过外接管路相连接，灌注孔内的管状通道部分与覆盖其上的水凝胶形成器官微环境。
优选的，所述的微流控芯片还设有顶层储液槽，所述的顶层储液槽的外径大于灌注孔直径，所述的顶层储液槽与芯片主体的灌注孔上部无缝连接。
进一步优选的，所述的顶层储液槽具有一定的高度，所述的高度可以是任意高度，只要高于灌注孔的表面，能够用于储存一定量的培养基，或，细胞和培养基的混合物即可。
更优选的，所述的顶层储液槽可以是任意形状，只要其外径大于灌注孔的直径，顶层储液槽与灌注孔上部无缝连接即可。
更优选的，所述的顶层储液槽可以通过现有技术中任一形式（例如手动补液进行细胞培养，或者，也可以通过泵驱动流体换液的方式进行连续循环培养）进行其内部的液体更换，只要满足营养维持和保湿即可。
在具体应用中，将液体（例如细胞培养基，或者，细胞和培养基的混合物）注入顶层储液槽时，液体会短暂浮在灌注孔中填充的水凝胶上，通过重力作用，逐渐下沉，进入管状通道中。
进一步优选的，根据实际需要，所述的顶层储液槽可以设置为开口的，更优选的，所述的顶层储液槽可以是完全开口的或部分开口的。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的顶层储液槽还可以有盖子，形成封闭的储液环境，还可以连接外部装置，例如加液泵等，形成开放或密闭的循环培养体系。
为了适应不同物种器官几何尺寸特征，可以在所述的范围内调整管状通道长度、管状通道直径、灌注孔直径、灌注孔高度、顶层储液槽的形状和高度以满足不同物种器官体外微环境的构建需求。
更优选的，所述的灌注孔中填充的水凝胶的基质材料只要是由水溶性或亲水性的高分子通过一定的化学交联或物理交联形成，且无细胞毒性，能够保证细胞的定植、生长、允许管道之间进行物质交换即可。优选的，所述的水凝胶的基质材料包括天然的和/或合成的材料，所述的天然的材料包括但不仅限于多糖类和/或多肽类，所述的合成的材料包括但不仅限于醇、丙烯酸、丙烯酰胺及其衍生物类。
优选的，所述的多糖类的水凝胶基质材料包含但不限于糖胺聚糖（可以是任一类型的糖胺聚糖，例如透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素中的一种或者多种）、蛋白聚糖、海藻酸；
所述的多肽类的水凝胶基质材料包含但不限于明胶、MATRIGELTM、基质胶、胶原蛋白（可以是任一类型的胶原蛋白，例如Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型中的一种或者多种，优选为Ⅰ型胶原蛋白）、弹性蛋白、非胶原糖蛋白（可以是任一类型的非胶原糖蛋白，例如纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白中的一种或者多种）；
所述的合成的水凝胶基质材料包含但不限于聚乙二醇、聚丙烯酸及其衍生物、聚乙烯醇、聚氧乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸中的一种或多种。
根据具体实施方式的需要，所述的水凝胶还可以通过溶剂（例如水）和/或溶液（例如NaOH溶液、细胞培养基）进行水凝胶的稀释及其理化性质的调节。
优选的，所述的水凝胶中还可以加入功能组分，所述的功能组分包含但不仅限于氨基酸、肽、蛋白、抗体、核苷酸、DNA、RNA、适配体、多糖、杂多糖、电解质、聚合物、纳米颗粒、小分子、毒素、药物或激素中的一种或多种。
进一步优选的，所述的水凝胶中还可以包含细胞。细胞与水凝胶混合后可以定植在其中，并均匀分散。细胞可以制备成细胞悬液。
在一个具体的实施方式中，所述的芯片主体包括位于底部的底层，位于底层之上的管状通道层，位于管状通道层之上的顶层，所述的灌注孔可以贯穿顶层、管道孔层和底层，或者，所述的灌注孔贯穿顶层和管状通道层；所述的底层和基底连接在一起（优选通过键合连接或粘接（优选采用3M胶粘连）或机械固定（例如使用焊接、铆接等），进一步优选，所述的键合连接包括通过氧等离子体处理将芯片主体和基底键合），从而将芯片主体固定在基底上，所述的管状通道层容纳一个或多个管状通道，所述的顶层上还可以设置有顶层储液槽。
更优选的，所述的基底的材料可以与芯片主体的材料相同，也可以与芯片主体的材料不同，只要能与芯片主体连接在一起即可。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的芯片主体的材料为聚二甲基硅氧烷（PDMS），所述的基底的材料为玻璃。
优选的，所述的细胞根据具体实施方式的需要，可以是任意细胞，进一步优选为任意生理系统的器官中的细胞，所述的生理系统包括神经系统、呼吸系统、消化系统、循环系统、内分泌系统、生殖系统、泌尿系统、免疫系统和/或运动系统。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞为睾丸来源细胞，包括但不限于睾丸生精小管细胞和/或睾丸间质内细胞。
优选的，所述的睾丸生精小管细胞选自睾丸管周肌样细胞、支持细胞、生殖细胞和/或干细胞中的一种或多种，和/或，所述的睾丸间质内细胞选自血管内皮细胞、间质细胞、免疫细胞、成纤维细胞、神经细胞或干细胞中的一种或多种。
本发明的第二方面，提供了一种上述微流控系统的制备方法，所述的制备方法包括：
1）设计芯片主体模板，并按照模板制作芯片主体模具；
2）将用于管状通道成型的材料放置在1）中获得的模具中，将制作芯片主体的材料浇注在模具上，使其固化；
3）将固化的芯片主体从模具中剥离，将用于管状通道成型的材料从芯片主体中抽离，形成管状通道；
4）在具有管状通道的芯片主体上制备灌注孔，所述的灌注孔的底部至少与所述的管状通道的上截面相贯，优选利用打孔器在芯片主体上打孔制备灌注孔，更优选可以选择不同直径、不同形状的打孔器，以适应不同数量的管状通道；
5）配制水凝胶：所述的水凝胶的材料如上第一方面所定义。
6）将5）中配制的水凝胶注入灌注孔中，在3）中形成的管状通道内放置用于管状通道成型的材料，待水凝胶成胶后将用于管状通道成型的材料从水凝胶中抽离，形成管壁材料为水凝胶的管状通道，得到具有三维中空管状结构的管状通道的芯片主体；
7）向6）中所述的管状通道注入细胞。
优选的，若包含基底，所述的制备方法还包括将芯片主体和基底连接的步骤，优选通过键合连接或粘接（优选采用3M胶粘连）或机械固定（例如使用焊接、铆接等），进一步优选，所述的键合连接包括通过氧等离子体处理将芯片主体和基底键合。
优选的，步骤1）中还包括利用激光切割的方法制作模具的底板、用于管状通道成型的材料的放置装置以及模具外框，然后将模具的底板、用于管状通道成型的材料的放置装置、模具外框依次通过3M胶粘合。
优选的，步骤2）中，还包括根据需要，将制作芯片主体的材料与其固化剂按比例混合的步骤，还可以通过控制加入模具的芯片主体的材料与其固化剂的混合溶液的体积来调整芯片主体和/或灌注孔的高度，还可以用于调控芯片主体的理化性质。
优选的，在注入水凝胶前，还包含对芯片主体进行清洗和/或修饰的步骤。经过修饰后的芯片可以更好地与水凝胶贴合。
进一步优选的，所述的清洗包括在芯片主体任意侧的管状通道内依次通入75%乙醇溶液、去离子水清洗芯片主体。
进一步优选的，所述的修饰包括在清洗完成的管状通道内通入1-10×多聚赖氨酸溶液，将芯片置于65℃烘箱中修饰1-3h；然后再在管状通道内通入2-5%多聚甲醛溶液，在室温下修饰30-90min。
优选的，步骤5）中配制水凝胶包括将基质材料，例如明胶、MATRIGELTM、基质胶、胶原蛋白（可以是任一类型的胶原蛋白，例如Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型中的一种或者多种，优选为Ⅰ型胶原蛋白）、弹性蛋白、非胶原糖蛋白（可以是任一类型的非胶原糖蛋白，例如纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白中的一种或者多种）、糖胺聚糖（可以是任一类型的糖胺聚糖，例如透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素中的一种或者多种）、蛋白聚糖、海藻酸、聚乙二醇、聚丙烯酸及其衍生物、聚乙烯醇、聚氧乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸中的一种或多种制成水凝胶（优选还可以通过溶剂和/或溶液进行水凝胶的稀释及其理化性质的调节）。更优选的，配制水凝胶的步骤还包括加入功能组分，例如氨基酸、肽、蛋白、抗体、核苷酸、DNA、RNA、适配体、多糖、杂多糖、电解质、聚合物、纳米颗粒、小分子、毒素、药物或激素中的一种或多种。进一步优选的，配制水凝胶的步骤还包括加入细胞或细胞悬液，例如睾丸间质内细胞悬液。优选的，所述的步骤6）中的用于管状通道成型的材料放置前在BSA溶液中修饰，更优选在1-5%的BSA溶液中修饰10-30min后的用于管状通道成型的材料。
优选的，还可在步骤6）之后向管状通道中加入与制备水凝胶的材料相同或不同的材料，对三维中空管状结构表面进行修饰，以增加细胞外基质的仿生度，利于细胞生长发育。
优选的，所述的制备方法还包括顶层储液槽无缝固定连接到灌注孔上部的周边。优选的，可以直接在设计模具时，同时设计顶层储液槽结构，也可以重新设计顶层储液槽结构的平面设计图，然后利用微加工方法获得顶层储液槽结构。若顶层储液槽为单独设计并雕刻制成，则可以用将其与芯片主体连接在一起（例如键合连接或通过3M胶粘连），并进行灭菌处理，所述的顶层储液槽连接在芯片主体的灌注孔上部，所述的顶层储液槽的外径大于灌注孔的直径。
优选的，所述的芯片主体的材料为本发明第一方面所定义。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的芯片主体的材料为聚二甲基硅氧烷（PDMS）。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的制备方法包括以下步骤：
1）根据微流控芯片主体要求设计模板；
2）按照步骤1）设计的模板雕刻聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），利用激光切割的方法制作模具的底板、用于管状通道成型的材料的放置装置以及模具外框。将模具的底板、用于管状通道成型的材料的放置装置、模具外框依次通过3M胶粘合，得到用于制作模拟器官微环境微流控芯片主体的模具；
3）在步骤2）的基础上，根据平面设计图，得到顶层储液槽结构（优选利用激光雕刻的方法雕刻聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA））。
4）将具有满足使用需求直径的用于管状通道成型的材料放置在步骤2）中得到的模具。
5）将PDMS预聚物与其固化剂按比例混合，浇注在模具上，使其固化；
6）进一步地，在步骤（5）的基础上可通过控制加入模具的PDMS预聚物与其固化剂混合溶液体积来调整芯片主体高度。
7）将固化的PDMS层剥离，用PDMS切割器将芯片区域切割，将用于形成中空管道的用于管状通道成型的材料与PDMS抽离，利用满足使用需求直径的打孔器在芯片主体合适位置打孔（制备灌注孔）以调整所包含的管状通道数目，将芯片主体和玻璃基底仔细清洗后吹干，然后将芯片主体和基底连接在一起（优选通过键合连接或3M胶直接粘连，进一步优选通过氧等离子体处理进行键合连接），形成微流控芯片；
8）配制水凝胶，优选所述的配制水凝胶包括将基质材料，例如明胶、MATRIGELTM、基质胶、胶原蛋白（可以是任一类型的胶原蛋白，例如Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型中的一种或者多种，优选为Ⅰ型胶原蛋白）、弹性蛋白、非胶原糖蛋白（可以是任一类型的非胶原糖蛋白，例如纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白中的一种或者多种）、糖胺聚糖（可以是任一类型的糖胺聚糖，例如透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素中的一种或者多种）、蛋白聚糖、海藻酸、聚乙二醇、聚丙烯酸及其衍生物、聚乙烯醇、聚氧乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸中的一种或多种制成水凝胶（优选还可以通过溶剂和/或溶液进行水凝胶的稀释及其理化性质的调节）。更优选的，配制水凝胶的步骤还包括加入功能组分，例如氨基酸、肽、蛋白、抗体、核苷酸、DNA、RNA、适配体、多糖、杂多糖、电解质、聚合物、纳米颗粒、小分子、毒素、药物或激素中的一种或多种。进一步优选的，配制水凝胶的步骤还包括加入细胞或细胞悬液，例如睾丸间质内细胞悬液。
9）将具有满足实际需要的直径的用于管状通道成型的材料放置于1-5% BSA溶液中修饰10-30min；
10）将配制的水凝胶通过灌注孔加入芯片主体，在管状通道内放置步骤9）中修饰所得用于管状通道成型的材料，待水凝胶成胶后将用于管状通道成型的材料与芯片主体抽离，在灌注孔内部形成管壁材料为水凝胶的管状通道，得到具有三维中空管状结构的管状通道的微流控芯片主体，用于后续体外器官微环境构建；
11）在步骤10）的基础上，将修饰且连接完成的微流控芯片主体与顶层储液槽连接（优选可以通过键合连接或直接通过3M胶粘连），然后进行灭菌处理，优选所述的顶层储液槽连接在芯片主体中的灌注孔的上部，且顶层储液槽的外径大于灌注孔的直径；
12）向10）中所述的管状通道中注入细胞。
优选的，所述的细胞根据具体实施方式的需要，可以是任意细胞。
优选的，在注入水凝胶前，还包含对芯片主体进行清洗和/或修饰的步骤。经过修饰后的芯片可以更好地与水凝胶贴合。
进一步优选的，所述的清洗包括在芯片主体任意侧的管状通道内依次通入75%乙醇溶液、去离子水清洗芯片主体。
进一步优选的，所述的修饰包括在清洗完成的管状通道内通入1-10×多聚赖氨酸溶液，将芯片置于65℃烘箱中修饰1-3h；然后再在管状通道内通入1-5%多聚甲醛溶液，在室温下修饰30-90min。
优选的，还可在步骤10）之后，向管状通道中加入与制备水凝胶的材料相同或不同的材料，对三维中空管状结构表面进行修饰，以增加细胞外基质的仿生度，利于细胞生长发育。
优选的，上述方法中，除有明确顺序的要求外（例如步骤10）需要在步骤8）之后，其余步骤的顺序根据通常的理解可调换，例如步骤11）和步骤12）的顺序可调换，进一步的，各步骤中的操作，除有明确顺序的要求外，也可以根据通常的理解调换，例如步骤7）中的将芯片主体和玻璃基底连接的步骤，也可以在步骤10）后进行，即，只要不影响效果，上述1）、2）、3）……、N）并不表明时间或空间的先后顺序，有另外说明除外。
本领域技术人员也可以理解，在灌注孔内部形成的管状通道和灌注孔外部的管状通道是相通的，因为水凝胶灌注后经灌注孔所覆盖的管状通道向两边流动，用于管状通道成型的材料从灌注孔外的管状通道二次放置，在相同位置形成管壁材料为水凝胶的管状通道。
本发明的第三方面，提供了一种微流控芯片。
优选的，对微流控芯片的结构的限定同本发明的第一方面。
本发明的第四方面，提供了一种微流控芯片的制备方法。
优选的，对微流控芯片的结构的限定同本发明的第一方面。
优选的，对微流控芯片的制备方法的限定同本发明的第二方面。
本发明的第五方面，提供一种上述任一所述的微流控系统在构建三维器官微环境模型中的应用。
本发明的第六方面，提供了一种三维器官微环境模型的构建方法，所述的构建方法包括使用上述的微流控系统或上述的微流控芯片构建三维器官微环境模型。
优选的，所述的构建方法包括将细胞在管状通道中进行培养，管状通道与外界或者管状通道之间通过灌注孔中填充的水凝胶进行物质交换。
更优选的，所述的器官包括来自任意生理系统的器官，所述的生理系统包括神经系统、呼吸系统、消化系统、循环系统、内分泌系统、生殖系统、泌尿系统、免疫系统和/或运动系统。
进一步优选的，所述的构建方法包括将第一种细胞在第一个管状通道中进行培养，构建三维器官微环境模型。
优选的，可以直接在顶层储液槽中添加第一种细胞的细胞培养基，细胞培养基经过水凝胶进入第一个管状通道对细胞培养。
优选的，所述的构建方法还包括将培养材料注入管状通道，所述的管状通道包括第一个管状通道和/或不同于第一个管状通道的其他管状通道，所述的培养材料包括对细胞培养提供支持的材料，或者，包括一种细胞，所述的细胞与第一种细胞相同或不同，所述的注入包括一次或多次注入。
所述的对细胞培养提供支持的材料包括细胞培养基。
进一步优选的，还可以在顶层储液槽中添加与第一种细胞相同或不同的细胞的培养基，用于培养细胞。可以理解的是，芯片中的所有管道均可以注入同种，和/或，不同种的细胞，也均可以混合同时注入，或者，分次注入，以适应不同的应用场景。当然，芯片中的所有管状通道也都可以多次注入所述的培养材料。
进一步优选的，所述的器官包括来自生殖系统的睾丸，所述的构建方法包括如下步骤：
1）将第一种细胞睾丸生精小管细胞悬液注入第一个管状通道构建三维仿生生精小管模型。
优选的，所述的方法还包括步骤2），在不同于第一个管状通道的其他管状通道中，和/或，顶层储液槽中添加睾丸生精小管细胞培养基，经水凝胶进入第一管状通道对睾丸生精小管细胞进行培养。
所述的构建方法即为三维仿生生精小管模型的构建方法。
优选的，所述的构建方法包括：
1）将第一种细胞睾丸生精小管细胞悬液注入第一个管状通道；
2）将培养材料注入管状通道，所述的管状通道包括第一个管状通道和/或不同于第一个管状通道的其他管状通道，所述的培养材料包括对第一种细胞培养提供支持的材料，和/或，包括一种细胞，所述的细胞与第一种细胞睾丸生精小管细胞相同或不同，所述的注入包括一次或多次注入。
优选的，步骤1）中所述的第一种细胞是指一类细胞，例如支持细胞和/或生殖细胞，所述的支持细胞和生殖细胞在注入管状通道时，可以是将两种细胞混合同时注入，即，形成的生精小管结构包含支持细胞和生殖细胞的混合细胞；
也可以是，先将支持细胞注入管状通道，待形成生精小管结构后，再注入生殖细胞，即，形成的生精小管结构只包含支持细胞，生殖细胞为定植于生精小管结构中的细胞。
可以理解的是，芯片中的所有管道均可以注入同种，和/或，不同种的细胞，也均可以混合同时注入，或者，分次注入，以适应不同的应用场景。当然，芯片中的所有管状通道也都可以多次注入所述的培养材料。
优选的，所述的其他管状通道中也可以注入对其他细胞培养提供支持的材料，所述的其他细胞是指不同于第一种细胞的细胞。
优选的，所述的对细胞培养提供支持的材料包括但不限于细胞培养基。
优选的，与第一种细胞睾丸生精小管细胞不同的细胞包括但不限于睾丸间质内细胞。
优选的，所述的构建方法还包括步骤3），顶层储液槽添加第一种细胞和不同于第一种细胞的其他细胞的细胞培养基，经水凝胶进入管状通道内对第一种细胞和不同于第一种细胞的其他细胞进行培养。
所述的构建方法即为三维仿生睾丸微环境模型的构建方法。
优选的，所述不同于第一个管状通道的其他管状通道可注入流体（例如细胞培养基），加速管状通道之间的物质交换。
优选的，所述的睾丸生精小管细胞选自睾丸管周肌样细胞、支持细胞、生殖细胞和/或干细胞中的一种或多种。
优选的，所述的睾丸间质内细胞选自血管内皮细胞、间质细胞、免疫细胞、成纤维细胞、神经细胞或干细胞中的一种或多种。
在优选的实施方式中，所述第一种细胞选自支持细胞，或者，支持细胞和生殖细胞的混合细胞，所述不同于第一种细胞的其他细胞选自血管内皮细胞、肝脏HepaRG细胞。
优选的，所述的细胞培养基中包含药物、小分子、毒素、蛋白和激素中的一种或多种。
在本发明的一个具体实施方式中，提供一种三维仿生生精小管模型的构建方法，所述的构建方法包括：
1）使用上述任一所述的制备方法制备微流控芯片；
2）培养获得生精小管细胞悬液。
3）从微流控芯片的第一个管状通道入口处注入生精小管细胞悬液，接种细胞后10分钟左右倒置芯片，使细胞均匀附着于管状通道表面；
4）生精小管细胞接种完成后，通过显微镜验证生精小管细胞形成三维管腔结构，取出多余的细胞悬液；
5）在顶层储液槽添加新鲜培养基对生精小管模型进行培养；
优选的，将注射泵与第二和/或第三个管状通道的入口处相连接，通过注射泵施加流体，将培养基充满芯片，以进行生精小管的动态培养，并设置收集管，所述的收集管与第二和/或第三个管状通道的出口处相连接，进行废液回收。
在本发明的另一个具体实施方式中，提供一种三维仿生睾丸微环境模型的构建方法，所述的构建方法包括：
1）将DMEM培养基NaOH和胶原蛋白I按照比例混合制成水凝胶；
2）将一种或多种睾丸间质内细胞悬液（优选的，所述的睾丸间质内细胞包括内皮细胞、间质细胞、免疫细胞、成纤维细胞、神经细胞或干细胞中的一种或多种）与水凝胶均匀混合，经灌注孔注入到微流控芯片中；
3）BSA修饰后的用于管状通道成型的材料通过管状通道入口插入芯片主体，在细胞培养箱放置20-60min，使水凝胶固化；待包裹有睾丸间质内细胞的水凝胶成胶后取出用于管状通道成型的材料，得到后续用于种植睾丸来源细胞的微流控芯片；
4）培养获得生精小管细胞悬液。
5）从管状通道入口处注入生精小管细胞悬液，接种细胞后10分钟左右倒置芯片，使细胞均匀附着于管状通道表面；
6）生精小管细胞接种完成后，通过显微镜验证生精小管细胞形成三维管腔结构，取出多余的细胞悬液；
7）在同个灌注孔内，在第二管状通道和/或第三管状通道，接种一种或多种血管内皮细胞悬液；
8）在灌注孔中注入睾丸间质内细胞悬液；
9）在顶层储液槽添加新鲜适合上述多种细胞培养的细胞培养基对睾丸微环境模型进行培养，从而构建三维仿生睾丸微环境模型。
优选的，将注射泵与第二管状通道和/或第三管状通道的入口处相连接，通过注射泵施加流体，将培养基充满芯片，以进行细胞的动态培养，并设置收集管，所述的收集管与第二管状通道和/或第三管状通道的出口处相连接，进行废液回收。
本发明的第七方面，提供了一种上述的构建方法构建获得的三维器官微环境模型。
优选的，所述的模型为三维仿生生精小管模型或者三维仿生睾丸微环境模型。
本发明的第八方面，提供了一种上述的微流控芯片、微流控系统、上述的构建方法构建获得的三维器官微环境模型应用，所述的应用包括生理结构建模、分子机制探究、细胞相互作用、药物研发（例如药物筛选）、疾病建模、辅助生殖或临床前研究中的一种或多种。
所述的应用不是疾病的诊断和/或治疗方法。
优选的，所述的药物筛选不是治疗方法。所述的药物筛选是对药物的效果进行检测和评价，以确定该药物是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明具有如下至少一种的有益效果：
第一：本发明微流控系统，包含微流控芯片和细胞，所述的微流控芯片具有多个管状通道，当细胞贴附在管状通道内表面时候，彼此互相连接形成三维管腔结构，可构建器官微环境中的管状结构，实现三维仿生培养；
第二：在本发明的微流控芯片的制备方法中，本发明巧妙地将灌注孔中的管状通道至少半挖空，灌注孔的底部覆盖管状通道的部分，水凝胶二次灌注时，经灌注孔所覆盖的管状通道向两边流动，用于管状通道成型的材料从灌注孔外的管状通道二次放置，在相同位置形成管壁材料为水凝胶的管状通道，利用水凝胶可进行物质交换的特性，从而实现管状通道与灌注孔中的水凝胶的物质交换，以及通过灌注孔中的水凝胶实现不同管状通道间的物质交换。同时，本发明的微流控芯片可包含多个灌注孔，从而可实现在一个芯片中制备多个三维仿生器官微环境，作为对照，或者构建生理系统提供结构基础。
第三：本发明微流控系统中，所述的微流控芯片可允许在同个管状通道内、同个灌注孔内的不同管状通道内或灌注孔凝胶中接种一种或多种睾丸来源细胞（例如睾丸生精小管细胞和/或睾丸间质内细胞），同个管状通道内、同个灌注孔内的不同管状通道内和灌注孔中接种的细胞可以是同种细胞也可以是不同种的细胞，可构建包含一种或多种细胞类型的器官微环境体系并可独立控制其接种数量、位置；
第四：利用本发明所述的微流控系统构建的三维器官微环境模型，由于其中的微流控芯片是可灌注芯片，可通过在顶层储液槽内加入培养基通过重力作用对管状通道内部细胞进行灌注，或，在管状通道一侧连接注射泵进行灌注，可排出代谢废物、对芯片内细胞施加生物力学刺激，实现对器官来源细胞的长期、动态培养；
第五：利用本发明所述的微流控系统构建的三维器官微环境模型，其包含的微流控芯片允许同个灌注孔内的管状通道之间的细胞通过水凝胶进行物质交换、水凝胶内的细胞同管状通道内细胞也可以通过水凝胶进行物质交换，即，一个管状通道内的物质可以通过灌注孔内水凝胶扩散至相邻管道内，相邻管状通道内种植的器官来源的其他细胞或形成的组织可进行物质交换、信号分子传递，实现同一器官中的不同细胞的共培养。同时，灌注孔内的水凝胶还可以预先与器官来源细胞（例如睾丸生精小管细胞和/或睾丸间质内细胞）悬液混合后再注入，待成胶后，实现凝胶区域内细胞与其包裹范围内的管状通道内部细胞的共培养，从而获得与有机体器官更为接近的三维仿生器官模型，可以用于生理结构建模、分子机制探究、细胞相互作用、药物研发、疾病建模、辅助生殖或临床前研究等应用上。
第六：在优选的方案中，本发明成功制备出三维仿生生精小管模型，生精小管细胞可以均匀的生长于管状通道内，呈现出连续且中空的管腔结构，而管腔中的睾丸生精小管细胞总体的细胞活力较强，生精小管能在体外进行长期培养与功能结构维持，且芯片无明显细胞毒性。从管腔中的细胞类型上看，睾丸支持细胞主要参与构成生精小管结构，且睾丸支持细胞的定位和排列情况与体内情况相似，本申请所述的微流控系统构建的三维仿生生精小管能够实现连续且完整的管状结构要求。
第七：从获得的三维仿生生精小管功能上看，能够真实模拟血睾屏障结构，为进一步的屏障功能检测提供了良好的基础。生殖细胞可以定植于三维仿生生精小管结构中，生殖细胞可在三维仿生生精小管结构中进一步维持与生长，微流控芯片/系统能成功实现体外睾丸来源的体细胞与生殖细胞的共培养，为后续临床前应用提供了基础。
第八：本发明成功构建了三维仿生睾丸微环境模型，所述的模型中，生成了三维仿生生精小管结构和三维仿生血管结构，呈现出连续且中空的管腔结构，而且，在三维仿生血管结构模拟体内血液流通，同时包含胶原的水凝胶区域允许物质发生相互交换，将三维仿生生精小管结构与生理循环通路有机地联系在一起，形成动态三维仿生睾丸微环境。
总之，本发明制备的微流控芯片克服了目前器官芯片所面临的无法形成三维管状结构、无法模拟不同种类细胞相互作用、无法精准调控器官微环境参数的缺点，具有允许三维仿生管状结构成型、允许器官来源细胞共培养与物质交换、允许调整器官微环境生化及生物力学参数调控等优点，以模拟器官水平的复杂结构、微环境和生理学功能。同时，由于芯片允许选择不同形式的灌注，可实现符合实际需要的长期动态培养，并可在此基础上研究机械力刺激对器官微环境生理及病理的调控作用，为体外三维仿生模型构建、机制探究、临床前药物筛选提供平台。
本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。
本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
本发明所述的“用于管状通道成型的材料”，是指可以在芯片主体中形成管状通道，以及，可以在水凝胶成胶后形成管状通道的任意材料，根据具体实施方式的需要，可以是任意形状，任意直径的材料，例如微针、钢针等；所述的“用于管状通道成型的材料的放置装置”，可以是任意形状、高度和数量，只要能使用于管状通道成型的材料稳定放置即可。
本申请所述的“细胞”的来源，包括但不限于原代细胞、细胞系、存在于多细胞生物的细胞，或任何其它类型的细胞来源。
本发明所述的“睾丸来源细胞”，是指睾丸组织中的各种体细胞和/或生殖细胞，例如睾丸生精小管细胞、睾丸间质内细胞等。
需要说明的是，本发明中的任意形式的编号，例如第一、第二、第三，1）、2）等形式的编号仅仅是为了区分彼此而进行的命名，并不表明时间或空间的先后顺序，有另外说明除外。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1：微流控芯片的结构示意图，其中，a：微流控芯片的立体结构示意图，图中标记：1-芯片主体、2-基底、3-灌注孔、4-顶层储液槽；b：微流控芯片（无基底）的立体结构示意图，图中标记：1-芯片主体、101-第一管状通道、102-第二管状通道、103-第三管状通道、3-灌注孔、4-顶层储液槽；c：微流控芯片的正视图，图中标记：1-芯片主体、101-第一管状通道、102-第二管状通道、103-第三管状通道、2-基底、3-灌注孔、4-顶层储液槽；d：微流控芯片的俯视图，图中标记：1-芯片主体、3-灌注孔、4-顶层储液槽；
图2：第一管状通道壁上内衬以活睾丸生精小管细胞的光学图像，视图中的比例尺为：100μm；
图3：微流控芯片中睾丸生精小管细胞的细胞活力荧光染色图像，其中，所有视图中的比例尺均为：50μm；
图4：微流控芯片中第7天的三维仿生生精小管，其中，a：微流控芯片中第7天的三维仿生生精小管的共焦显微镜图像；b：微流控芯片中第7天的三维仿生生精小管结构的三维Z轴扫描图像；
图5：微流控芯片中第14天的三维仿生生精小管切片免疫荧光染色图，所有视图中的比例尺均为：50μm；
图6：微流控芯片中第7天的紧密连接屏障的免疫荧光图像，所有视图中的比例尺均为：100μm；
图7：微流控芯片中第4天的三维仿生生精小管对生殖细胞维持的三维Z轴扫描图像，所有视图中的比例尺均为：100μm；
图8：三维仿生睾丸生精小管与血管结构的光学图像，图中标记：101-第一管状通道、102-第二管状通道、103-第三管状通道；
图9：微流控芯片中血睾屏障功能的检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
为了更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。但是本发明保护范围不局限于实施例所表达的范围。下述实施例中所述的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述的试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：微流控芯片的制备方法
参考图1中a-d所示，为本发明用于模拟三维睾丸微环境的微流控芯片的三维结构原理示意图，图中包括芯片主体1与基底2，芯片主体1的下表面的四周与基底2的上表面键合为一体。
参考图1中a-d所示，芯片主体1设有第一管状通道101、第二管状通道102以及第三管状通道103，且第二管状通道102、第三管状通道103分别设置于第一管状通道101的两侧。
参考图1中a-d所示，芯片主体1的中间区域构成中空的灌注孔3。向灌注孔3内填充水凝胶，所述的水凝胶包括基质材料，例如明胶、MATRIGELTM、基质胶、胶原蛋白、弹性蛋白、非胶原糖蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、海藻酸、聚乙二醇、聚丙烯酸及其衍生物、聚乙烯醇、聚氧乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸中的一种或多种（优选的，所述的基质材料也可以为如上所述的其他基质材料，进一步优选的，所述的水凝胶还可以通过溶剂和/或溶液进行水凝胶的稀释及其理化性质的调节），优选的，所述的水凝胶中还可以加入功能组分，例如氨基酸、肽、蛋白、抗体、核苷酸、DNA、RNA、适配体、多糖、杂多糖、电解质、聚合物、纳米颗粒、小分子、毒素、药物或激素中的一种或多种（优选的，所述的功能组分也可以为上述的其他功能组分），为了更好地模拟体内环境，所述的水凝胶中还可以加入不同种类的细胞或细胞悬液，所述的细胞可以定植在水凝胶中并均匀分散，模拟睾丸微环境来源细胞的生长环境，该灌注孔3底部可根据实验需要覆盖多条管状通道，为三维睾丸微环境的生成提供空间。灌注孔3直径小于管状通道101、102、103的长度，但大于两外侧的管状通道102和103的管壁间的间距。灌注孔3以及灌注孔3中的水凝胶使第一管状通道101、第二管状通道102和第三管状通道103之间可以发生物质交换，模拟睾丸微环境内部真实体液循环。
参考图1中a-d所示，芯片主体1上方的四周设有顶层储液槽4，顶层储液槽4可存储细胞培养基，达到保湿的作用，且在重力作用下能够达到使细胞培养基灌注进入水凝胶的目的。
结合图1中a-d所示，上述用于模拟三维睾丸微环境的微流控芯片可以采用以下方法制备，按如下步骤进行：
（1）根据所需并行管状通道数目、直径、长度进行平面图设计。
（2）根据图1所示芯片结构，利用激光雕刻的方法分别雕刻厚度为1.5mm、0.2mm、0.2mm、3mm的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，分别作为模具的底板、钢针的放置装置以及模具外框。将模具的底板、钢针的放置装置、模具外框依次通过3M胶粘合，得到用于制作模拟睾丸微环境微流控芯片的模具。
（3）在步骤（2）的基础上，根据平面设计图，利用激光雕刻的方法雕刻厚度为3mm的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，得到顶层储液槽结构。
（4）将具有满足使用需求直径的钢针放置在步骤（2）中得到的模具的钢针放置装置。
（5）利用微铸模工艺，将PDMS预聚物与其固化剂按10:1的比例混合，浇注在模具上，利用真空水泵抽净气泡，65℃烘箱放置2h，使其固化成型。
（6）将固化后的聚二甲基硅氧烷（PDMS）层与模具剥离，用PDMS切割器仔细地将芯片区域切割下来，将用于形成中空管状通道的钢针与固化成型的PDMS分离，形成管状通道，根据所需选取一定直径的打孔器在芯片中部打孔形成灌注孔，所述的灌注孔的底部与所述的管状通道的上截面相贯。将处理过的PDMS芯片主体和基底材料（玻璃）仔细清洗，用氮气吹干，然后用氧等离子体处理将PDMS芯片和玻璃进行键合，键合条件为真空表示数40-70Pa，时间20-90s，将芯片与玻璃按压以形成紧密键合，置于65℃烘箱中加强键合2h，形成微流控芯片。
（7）在键合完成的芯片侧面，从管状通道内，依次通入75%乙醇溶液、去离子水进行清洗。
（8）再从管状通道内，通入1-10×多聚赖氨酸溶液，置于65℃烘箱中修饰1-3h；再从管状通道内通入1-5%多聚甲醛溶液，置于室温修饰30-90min。
（9）将表面修饰后的微流控芯片与顶层储液槽结构通过3M胶粘合，进行灭菌处理，所述的顶层储液槽连接在芯片主体的灌注孔上方，所述的顶层储液槽的外径大于灌注孔的直径。
（10）将满足所需一定直径用于形成中空管状通道的钢针浸泡在1-5% BSA溶液中修饰10-30min。
（11）配制水凝胶，将DMEM培养基、终浓度为0-5mol/L的NaOH和终浓度为1-12mg/mL的I型胶原蛋白按照比例混合制成水凝胶，在此基础上，可以根据需要加入明胶、MATRIGELTM、基质胶、其他类型胶原蛋白、弹性蛋白、非胶原糖蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、海藻酸、聚乙二醇、聚丙烯酸及其衍生物、聚乙烯醇、聚氧乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸中的一种或多种以调整水凝胶成分（优选的，所述的基质材料也可以为如上所述的其他基质材料，进一步优选的，所述的水凝胶还可以通过溶剂和/或溶液进行水凝胶的稀释及其理化性质的调节），优选的，所述的水凝胶中还可以加入功能组分，例如氨基酸、肽、蛋白、抗体、核苷酸、DNA、RNA、适配体、多糖、杂多糖、电解质、聚合物、纳米颗粒、小分子、毒素、药物或激素中的一种或多种（优选的，所述的功能组分也可以为上述的其他功能组分），为了更好地模拟体内环境，还可以在水凝胶中加入细胞，例如睾丸来源细胞。
（12）将水凝胶通过灌注孔3加入芯片主体，在管状通道内也注满水凝胶，将经BSA修饰后的钢针通过管状通道插入芯片主体1，在细胞培养箱中放置20-60min，待水凝胶成胶后将钢针与芯片主体抽离，得到具有三维中空管状结构的微流控芯片。
还可在步骤（12）之后向管状通道中加入与制备水凝胶的材料完全相同或部分相同的材料，对三维中空管状结构表面进行修饰，以增加细胞外基质的仿生度，利于细胞生长发育。
实施例2：利用微流控系统构建三维仿生生精小管模型
利用实施例1所述的方法制备的微流控芯片和细胞构建三维仿生生精小管模型。
（1）获得生精小管细胞悬液（主要由支持细胞组成）：将体外培养生精小管细胞中的培养基移除，并用PBS冲洗一次。添加预热胰蛋白酶(0.05% (wt/vol) + EDTA)，孵育直至细胞解离，约1.5min；使用含有FBS的培养基终止消化反应，离心并重悬溶液以获得生精小管细胞悬液；调整细胞浓度至1×105-108个/mL。
（2）轻轻从芯片侧面第一管状通道101入口处注入生精小管细胞悬液，接种细胞后10分钟左右倒置芯片，使细胞均匀附着于第一管状通道101表面。
（3）生精小管细胞接种完成后，通过显微镜验证生精小管细胞形成三维管腔结构，取出多余的细胞悬液。
（4）在顶层储液槽添加新鲜培养基对生精小管模型进行培养；和/或，将注射泵与第二管状通道102和/或第三管状通道103入口处相连接，通过注射泵施加流体，将培养基充满芯片，以进行生精小管的动态培养。并设置收集管，所述的收集管与第二管状通道和/或第三管状通道出口处相连接，进行废液回收。
三维仿生生精小管模型的构建结果参见图2-5，其中，图2为显微镜下微流控芯片中三维仿生生精小管生长图片，由图2中可见，经过一天的培养，睾丸生精小管细胞在微流控芯片中已贴附并均匀的生长于第一管状通道101内，呈现出连续且中空的管腔结构，生成三维仿生生精小管结构。
为进一步验证在所设计结构内，三维生精小管结构的维持以及在芯片中培养的细胞活力，使用钙黄绿素乙酰氧基甲酯（Calcein-AM）和碘化丙啶（PI）同时对微流控芯片中的活细胞和死细胞进行荧光染色分析，活细胞可被Calcein-AM进行荧光标记，使活细胞的胞质发出荧光，死细胞可被PI进行荧光标记，从而使死细胞的胞核发出荧光。Hoechst染料用于指示细胞核的定位。
在培养第7天，移除微流控芯片顶层储液槽中的培养基，使用PBS对培养有睾丸生精小管细胞的第一管状通道101进行清洗，再将Calcein-AM与PI的工作液从第一管状通道101入口处轻轻注入，染色完成后使用PBS清洗第一管状通道101。然后再将Hoechst染料从第一管状通道101入口处轻轻注入，染色完成后使用PBS清洗第一管状通道101。
结果如图3所示，表示睾丸生精小管细胞在体外培养7天后仍均匀的贴附生长于三维管腔中，三维仿生生精小管结构中绝大部分细胞展现出Calcein-AM指示的荧光信号，比例远远高于PI指示的荧光信号，表明芯片中培养的睾丸生精小管细胞总体的细胞活力较强，生精小管能在体外进行长期培养与功能结构维持，且芯片无明显细胞毒性，可作为进一步模拟体内真实生理环境的培养装置。
使用免疫荧光染色技术和高分辨率共聚焦成像分析技术以研究在微流控芯片中第7 天的三维仿生生精小管组织形态和结构特征，结果如图4 所示。
如图4中a所示，通过对睾丸支持细胞特异性标记物SOX9及细胞骨架蛋白F-actin进行免疫染色，使用DAPI染料指示细胞核的定位，再通过共聚焦显微镜进行三维成像及重构。可以看出，免疫荧光染色证实生精小管结构中SOX9与F-actin的高表达，说明微流控芯片中睾丸支持细胞为参与构成生精小管结构的主要细胞，且睾丸支持细胞的定位和排列情况与体内情况相似；F-actin染色结果显示睾丸生精小管细胞在管状通道表面的分布情况，可以看出使用本申请所述的微流控芯片构建的三维仿生生精小管能够实现连续且完整的管状结构要求。
图4中b为参考图4中a所对应的三维仿生生精小管结构的三维Z轴扫描图片，由图4中b可以看出三维仿生生精小管内部具有连续且完整的空腔结构。
通过对睾丸支持细胞特异性标记物SOX9及细胞紧密连接蛋白ZO-1进行免疫染色，并使用共聚焦显微镜进行三维成像及重构。
结果如图6所示，可以看出，免疫荧光染色证实生精小管结构中SOX9与ZO-1的高表达，说明微流控芯片中紧密连接屏障已形成，且主要由支持细胞参与构成，紧密连接屏障的形成与定位情况与体内相似，表明本实施例构建的三维仿生生精小管结构能够真实模拟血睾屏障结构，为进一步的屏障功能检测提供了良好的基础。
图5为微流控芯片中第14天的三维仿生生精小管切片染色图，在微流控芯片中培养三维仿生生精小管14天后，对组织进行石蜡包埋与切片的免疫荧光染色。
图5结果显示三维仿生生精小管的横切面呈有腔管状结构，进一步对切片进行免疫荧光染色，使用DAPI信号指示细胞核定位，SOX9信号指示睾丸支持细胞的细胞核，可以看出，管壁主要由表达SOX9蛋白的睾丸支持细胞构成，且SOX9与DAPI共定位于细胞核，睾丸支持细胞的细胞核分布均匀且排列整齐，呈现出具有中央空腔的管状结构，进一步表明微流控芯片中三维仿生生精小管细胞组成、定位及结构与体内情况的相似性，仿生度高。
睾丸生精微环境的建立对于生殖细胞的培养与维持至关重要，生殖细胞在体外难以直接贴壁生长，当缺乏与体细胞的相互作用时生殖细胞会迅速凋亡。为进一步验证微流控芯片中体外培养的三维仿生生精小管对生殖细胞的培养及维持作用，待生精小管细胞悬液（主要由支持细胞组成）贴附于管状通道管壁形成生精小管结构后，再将生殖细胞注入第一管状通道，实现生殖细胞与生精小管体细胞（主要由支持细胞组成）在芯片中的共培养。生殖细胞悬液的浓度为1×104-107个/mL。在生精小管体细胞与生殖细胞共培养4天后，使用免疫荧光染色技术对三维仿生生精小管结构中的生殖细胞进行检测，对生殖细胞特异性标记物VASA进行免疫染色，使用DAPI信号指示细胞核定位，VASA蛋白在生殖细胞的细胞质中特异表达。
结果如图7所示，显示三维仿生生精小管结构中具有生殖细胞特异性标志物VASA信号的表达，证实生殖细胞可以定植于三维仿生生精小管结构中，生殖细胞可在三维仿生生精小管结构中进一步维持与生长，微流控芯片能成功实现体外睾丸来源的体细胞与生殖细胞的共培养，构建三维仿生生精小管结构，具有体外维持生殖细胞的能力，为后续临床前应用提供了基础。
实施例3：利用微流控芯片构建三维仿生睾丸微环境模型
利用实施例1所述的方法制备的微流控芯片和不同细胞构建三维仿生睾丸微环境。
（1）将DMEM培养基、终浓度为0-5mol/L的NaOH和终浓度为1-12mg/mL的Ⅰ型胶原蛋白按照比例混合制成水凝胶。
（2）将水凝胶，或者，睾丸来源的细胞悬液与水凝胶均匀混合的混合物，经灌注孔3注入到微流控芯片中。
（3）BSA修饰后的钢针通过芯片侧面第一管状通道101、第二管状通道102和第三管状通道103入口插入芯片主体1，在细胞培养箱放置20-60min，使中央管道处的水凝胶固化。待包裹有睾丸间质内细胞的水凝胶成胶后取出钢针，得到后续用于种植生精小管细胞和内皮细胞的微流控芯片。
（4）从芯片主体1侧面的第一管状通道101入口处注入生精小管细胞悬液，接种细胞后10分钟左右倒置芯片，使细胞均匀附着于第一管状通道101表面。形成生精小管结构后，取出多余的细胞悬液。
（5）从芯片主体1侧面的第二管状通道102和第三管状通道103的入口处注入血管内皮细胞悬液，接种细胞后10分钟左右倒置芯片，使细胞均匀附着于第二管状通道102和第三管状通道103表面。形成血管结构后，取出多余的细胞悬液。
（6）细胞接种完成后，将细胞培养基注入顶层储液槽，通过重力作用将培养基引入灌注孔3、第二管状通道102、第一管状通道101和第三管状通道103中，使得培养基能够与在微流控芯片中培养的细胞充分接触。
（7）将注射泵与第二管状通道102和第三管状通道103入口处相连接，通过控制注射泵施加流体，使得培养基经第二管状通道102和第三管状通道103通过灌注孔3中的水凝胶流向第一管状通道101，构建得到动态的培养环境。同时机械力会进一步刺激内皮细胞的血管化过程，流体在第二管状通道102和第三管状通道103中的血管腔内部形成剪切力，不断刺激内皮细胞的分裂增殖以及内皮屏障的产生，形成更为仿生的三维睾丸微环境系统。
图8为显微镜下微流控芯片中三维仿生睾丸微环境的生长图片，图8中可见，经过一天的培养，睾丸生精小管细胞在微流控芯片中已贴附并均匀的生长于第一管状通道101内，呈现出连续且中空的管腔结构，生成三维仿生生精小管结构；血管内皮细胞在微流控芯片中能够贴附且生长于第二管状通道102和第三管状通道103中，呈现出连续且中空的管腔结构，生成三维仿生血管结构，并与第一管状通道101中的三维仿生生精小管结构相并行。通过自动灌注装置从第二管状通道102和/或第三管状通道103入口自动灌注培养基和/或药物、小分子、毒素、蛋白和激素，能够在微流控芯片内模拟体内血液流通，同时包含胶原的水凝胶区域允许物质发生相互交换，将三维仿生生精小管结构与生理循环通路有机地联系在一起，形成动态三维仿生睾丸微环境。
实施例4：利用微流控芯片构建的三维仿生生精小管模型在血睾屏障功能检测中的应用
按照实施例1所述的方法，制备微流控芯片。
参照实施例2构建三维仿生生精小管。同时，
（1）设置实验组和对照组，实验组中，将生精小管细胞悬液接种至第一管状通道101，得到三维仿生生精小管结构。对照组中，将PBS注入第一管状通道101，得到无细胞通道。实验组与对照组均培养7天后进行渗透性实验检测血睾屏障的形成与功能，每组各设置三个重复。
（2）将自动灌注装置与第一管状通道101入口处连接，向第一管状通道101中灌注荧光葡聚糖，每30秒进行一次数据采集，持续灌注450秒并通过荧光显微镜对生精小管模型进行延时成像。
（3）通过Image J软件统计荧光葡聚糖由管腔扩散至胶原凝胶中的强度，量化扩散渗透性，统计各组荧光渗透率以反映血管屏障的形成与功能。
结果如图9所示，实验组的葡聚糖荧光强度显著低于对照组，实验组和对照组的扩散系数，根据荧光强度以如下公式计算，结果发现，实验组的扩散系数也显著低于对照组。
其中D为三维仿生生精小管的扩散系数，d为管状通道宽度，I 0为初始平均荧光强度，I 1 、I 2分别为t 1 、t 2时刻的平均荧光强度，t 1对应开始向三维仿生生精小管内进行灌注时的时刻、t 2对应三维仿生生精小管内平均荧光强度达到饱和时的时刻。
上述结果证明微流控芯片内的睾丸生精小管细胞间形成了屏障连接，表明三维仿生生精小管中已建立血睾屏障结构并具备血睾屏障功能，为定量检测血睾屏障渗透性系数提供了研究平台。后续可作为用于研究血睾屏障形成分子机制、药物研发和生理病理研究的模型。
实施例5：利用微流控芯片构建的三维仿生睾丸微环境模型在药物筛选中的应用
（1）按照实施例3所提供的方法构建三维仿生睾丸微环境模型，测试药物对生精小管内血睾屏障功能的影响，各组设置三个重复。
（2）通过注射泵将药物注入第二管状通道102与第三管状通道103，与第一管状通道101中的生精小管共培养，观察药物对生精小管结构与屏障功能的影响。
（3）药物处理完成后，使用荧光葡聚糖对生精小管的血睾屏障功能进行量化表征，通过测量扩散系数来评价药物对生精小管内屏障功能的影响。
实施例6：利用微流控芯片构建的多器官芯片模型在肝-睾丸系统相互作用中的应用
按照实施例1所述的方法，制备微流控芯片。
参照实施例3构建三维仿生睾丸微环境。同时，
（1）设置实验组和对照组，实验组中，将肝脏HepaRG细胞悬液接种至第二管状通道102，得到三维仿生肝-睾丸微环境模型。对照组中，将PBS注入第二管状通道102，得到无细胞通道。每组各设置三个重复。
（2）将自动灌注装置与第三管状通道103入口处连接，向第三管状通道103中灌注细胞培养基，持续灌注培养以模拟体内循环系统。每日收集第三管状通道103出口处流出的液体，进行后续睾丸及肝功能检测。
（3）通过酶联免疫吸附技术检测每日收集的流出物中具有代表性的肝脏和/或睾丸分泌物，通过检测白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶以反映模型中肝的状态与功能，检测睾酮和抑制素B以反映模型中睾丸的状态与功能。评估分泌物的释放量随培养天数的变化，并比较实验组与对照组中释放量的差异，反映共培养系统对肝和/或睾丸功能的影响。
（4）实验组与对照组均培养7天后，通过免疫荧光染色和实时定量PCR技术分析细胞增殖、凋亡、代谢情况和细胞特异性标记的表达情况。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (19)

1.一种微流控系统，其特征在于，所述的微流控系统包括微流控芯片和细胞，所述的微流控芯片包括芯片主体；所述的芯片主体的上表面设置有灌注孔，所述的芯片主体内设置有管状通道，所述的灌注孔的底部覆盖所述的管状通道的全部或部分，所述的灌注孔中填充有水凝胶，所述的管状通道的管壁材料为水凝胶，所述的管状通道为一个或多个；
所述的灌注孔直径小于管状通道的长度，但大于管状通道的宽度，或者，大于两外侧的管状通道的管壁间的间距；
所述的管状通道沿长度方向贯穿所述的微流控芯片；
所述的管状通道与外界，或者，管状通道之间可以通过灌注孔中填充的水凝胶进行物质交换。
2.根据权利要求1所述的微流控系统，其特征在于，所述的管状通道为独立通道。
3.根据权利要求1所述的微流控系统，其特征在于，所述的芯片主体的材料包括硅材料、氟材料、玻璃石英材料、金属材料、陶瓷材料或有机高分子聚合物材料中的一种或多种，
所述的材料为生物相容性材料。
4.根据权利要求1所述的微流控系统，其特征在于，所述的水凝胶包括基质材料，所述的基质材料选自天然的，和/或，合成的材料，所述的天然的材料包括但不仅限于多糖类和/或多肽类，所述的合成的材料包括但不仅限于醇、丙烯酸、丙烯酰胺及其衍生物类。
5.根据权利要求4所述的微流控系统，其特征在于，所述的水凝胶中还包括功能组分，所述的功能组分包含但不仅限于氨基酸、肽、蛋白、抗体、核苷酸、DNA、RNA、适配体、多糖、杂多糖、电解质、聚合物、纳米颗粒、小分子、毒素、药物或激素中的一种或多种。
6.根据权利要求4或5所述的微流控系统，其特征在于，所述的水凝胶中还包括细胞。
7.一种权利要求1-6任一所述的微流控系统的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：
1）设计芯片主体模板，并按照模板制作芯片主体模具；
2）将用于管状通道成型的材料放置在1）中获得的模具中，将制作芯片主体的材料浇注在模具上，使其固化；
3）将固化的芯片主体从模具中剥离，将用于管状通道成型的材料从芯片主体中抽离，形成管状通道；
4）在具有管状通道的芯片主体上制备灌注孔，所述的灌注孔的底部至少与所述的管状通道的上截面相贯；
5）配制水凝胶；
6）将5）中配制的水凝胶注入灌注孔中，在3）中形成的管状通道内放置用于管状通道成型的材料，待水凝胶成胶后将用于管状通道成型的材料从水凝胶中抽离，形成管壁材料为水凝胶的管状通道，得到具有三维中空结构的管状通道的芯片主体；
7）向6）中所述的管状通道注入细胞。
8.权利要求1-6任一所述的微流控系统在构建三维器官微环境模型中的应用。
9.一种三维器官微环境模型的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括使用权利要求1-6任一所述的微流控系统构建三维器官微环境模型。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将细胞在管状通道中进行培养，管状通道与外界，或者，管状通道之间可以通过灌注孔中填充的水凝胶进行物质交换。
11.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的器官包括来自任意生理系统的器官，所述的生理系统包括神经系统、呼吸系统、消化系统、循环系统、内分泌系统、生殖系统、泌尿系统、免疫系统或运动系统中的一种或多种。
12.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将第一种细胞在第一个管状通道中进行培养。
13.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括将培养材料注入管状通道，所述的管状通道包括第一个管状通道和/或不同于第一个管状通道的其他管状通道，所述的培养材料包括对细胞培养提供支持的材料，和/或，包括一种细胞，所述的细胞与第一种细胞相同或不同；
所述的注入包括一次或多次注入。
14.根据权利要求12或13所述的构建方法，其特征在于，所述的器官包括来自生殖系统的睾丸，所述的构建方法包括将第一种细胞睾丸生精小管细胞悬液注入第一个管状通道中进行培养。
15.根据权利要求14所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括：
1）将第一种细胞睾丸生精小管细胞悬液注入第一个管状通道中进行培养；
2）将培养材料注入管状通道，所述的管状通道包括第一个管状通道和/或不同于第一个管状通道的其他管状通道，所述的培养材料包括对第一种细胞睾丸生精小管细胞培养提供支持的材料，和/或，包括一种细胞，所述的细胞与第一种细胞睾丸生精小管细胞相同或不同；
所述的注入包括一次或多次注入；
与第一种细胞睾丸生精小管细胞不同的细胞包括睾丸间质内细胞。
16.根据权利要求15所述的构建方法，其特征在于，所述的睾丸生精小管细胞选自睾丸管周肌样细胞、支持细胞、生殖细胞或干细胞中的一种或多种，和/或，所述的睾丸间质内细胞选自血管内皮细胞、间质细胞、免疫细胞、成纤维细胞、神经细胞或干细胞中的一种或多种。
17.权利要求9-16任一所述的构建方法构建获得的三维器官微环境模型。
18.根据权利要求17所述的三维器官微环境模型，其特征在于，所述的三维器官微环境模型包括三维仿生生精小管模型，和/或，三维仿生睾丸微环境模型。
19.一种权利要求1-6任一所述的微流控系统或权利要求17或18所述的三维器官微环境模型的应用，其特征在于，所述的应用包括生理结构建模、分子机制探究、细胞相互作用、药物研发、疾病建模或临床前研究中的一种或多种。
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