CN116004388A - 一种微流控芯片及体外三维类器官模型构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于人体器官模拟技术领域，提供了一种微流控芯片及体外三维类器官模型构建方法。其中，微流控芯片由下层玻璃基片及上层PDMS材质聚合物层键合而成；所述上层PDMS材质聚合物层中设置有若干个相互平行的直通道，任意两个相邻的直通道之间由若干个分支通道进行连通；所述分支通道用于将不同直通道分隔开以及允许不同细胞分泌的各种细胞因子通过，实现不同细胞间的交流。
Description
技术领域
本发明属于人体器官模拟技术领域，尤其涉及一种微流控芯片及体外三维类器官模型构建方法。
背景技术
本部分的陈述仅仅是提供了与本发明相关的背景技术信息，不必然构成在先技术。
可靠的、接近人体真实情况的体外模型用来模拟器官组织及生理病理状态，是推动基础研究以及临床精准治疗药物研发的重要基础。目前生物医学研究主要依赖动物模型，但是动物模型存在的一定的局限性，如价格昂贵、伦理问题等。另外，某些药物在动物模型中已被充分证明是安全、有效的，但是在真正临床应用中仍有高达90％以上宣布失败，这主要由于动物模型无法完全模拟复杂的人体生理系统造成的。更重要的是，动物模型无法实时观察器官组织在分子水平上的实时动态变化，不利于疾病发生基本机制的深入研究。
近年来，体外类器官模型发展迅速，在疾病建模、药物筛选和精准医疗等领域均有应用。类器官技术主要包括基于基质胶的3D类器官技术、3D打印技术及器官芯片技术等。其中，基于基质胶的3D类器官技术主要通过诱导各种干细胞或祖细胞在基质胶中分化并进一步培养形成与目标组织类似的三维细胞复合体。但是该方法往往无法实现液体动态刺激，不能还原真实的生理环境，还会造成某些与流动刺激相关的分子标志物丢失。3D打印技术虽然能够实现器官的体外初步重建，但是该技术目前可用的材料有限，尤其缺少毒性低且适合细胞长期生长的材料。
目前器官芯片已实现了多种体外器官的构建，如中枢神经系统、心脏、肝脏、胰腺等。这些类器官模型虽然包含了特异性的细胞成分，但是有些方法是静态培养系统，忽略了血管及血液流动的模拟，而血管及血液流动是人体各个器官不可或缺的重要部分，它不仅能为器官输送营养物质，实现各个器官的物质交流，还能带走代谢废物及其他有害物质。因此，血液流动的模拟在体外器官模型构建中至关重要。另外，某些器官芯片模型缺少细胞的三维生长，这与真实的器官空间结构有较大差别。
发明内容
为了解决上述背景技术中存在的技术问题，本发明提供一种微流控芯片及体外三维类器官模型构建方法，其中，微流控芯片中可通过通入不同种类的细胞实现不同器官的模拟。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面提供一种微流控芯片。
在一个或多个实施例中，一种微流控芯片，其由下层玻璃基片及上层PDMS材质聚合物层键合而成；所述上层PDMS材质聚合物层中设置有若干个相互平行的直通道，任意两个相邻的直通道之间由若干个分支通道进行连通；所述分支通道用于将不同直通道分隔开以及允许不同细胞分泌的各种细胞因子通过，实现不同细胞间的交流。
作为一种实施方式，所述上层PDMS材质聚合物层中设置有四个相互平行的直通道；其中，中间两个平行直通道内的细胞共同组成血脑屏障结构；外侧两个直通道用于通入培养基平衡整个微流控系统。
作为一种实施方式，中间两个平行直通道中的一个用于培养血管内皮细胞的生长来模拟血管，另外一个相邻的直通道用于培养星形胶质细胞来模拟大脑。
作为一种实施方式，所述中间两个平行直通道的尺寸为1500μm×600μm×100μm，另外两个平行直通道的尺寸为1500μm×300μm×100μm。
作为一种实施方式，所述分支通道的尺寸为100μm×3μm×1μm。
本发明的第二个方面提供一种体外三维类器官模型构建方法。
在一个或多个实施例中，一种体外三维类器官模型构建方法，其包括：
预处理如上述所述的微流控芯片；
在血管通道内通入设定密度的内皮细胞，放入细胞培养箱正置设定时间使部分细胞在通道底部贴壁后，再将预处理后的微流控芯片倒置，使未贴壁的细胞在通道顶部贴壁；随后在培养箱中正置设定时间，使细胞完全贴壁生长；
获取细胞凝胶混合物并将其通入3D大脑通道中，然后将所述微流控芯片放入细胞培养箱中，凝胶完全聚合，使得星形胶质细胞均匀分布在三维凝胶支架上；
在血液通道中，将细胞培养基持续灌注，经设定时间流动刺激，内皮细胞形成紧密连接的内皮细胞层，得到完整的血脑屏障体外模型；
表征脑屏障体外模型的结构及功能。
作为一种实施方式，预处理微流控芯片的过程为：
在两个中间通道内通入设定浓度的纤维连接蛋白和IV型胶原混合物，将芯片放入细胞培养箱中静置过夜后，用PBS对通道冲洗三次除去过量的混合物。
作为一种实施方式，获取细胞凝胶混合物的过程为：
在冰浴条件下，将I型胶原蛋白加入到NaOH溶液中，混匀后，加入PBS中并混匀，最后再加入星形胶质细胞，即得到细胞凝胶混合物。
作为一种实施方式，在表征脑屏障体外模型的结构及功能的过程中，利用共聚焦荧光成像技术对脑屏障体外模型中的细胞存活率、特异性蛋白表达及荧光小分子物质扩散率进行检测。
作为一种实施方式，细胞存活率利用活死细胞Calcein-AM/PI染色试剂盒检测；特异性蛋白表达利用免疫荧光染色技术检测；荧光小分子物质为FITC标记的葡聚糖，结合菲克第一扩散定律及通道内荧光强度变化，确定渗透率。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一种微流控芯片，其由下层玻璃基片及上层PDMS材质聚合物层键合而成，其中，上层PDMS材质聚合物层中设置有若干个相互平行的直通道，任意两个相邻的直通道之间由若干个分支通道进行连通，这样能够在分支通道中通入不同种类的细胞实现不同器官的模拟；而且本发明的微流控芯片能够结合多种分析方法如荧光成像、ICP-MS以及PCR测序等，为后续的研究提供有力的平台。
(2)本发明所构建的体外三维类器官模型一方面，操作简单、方便，能够快速建立与真实血脑屏障具有相似结构和功能的体外血脑屏障模型；另一方面，所建立的方法不局限于血脑屏障的模拟，更能通过自由变换接种的细胞类型实现任意器官的模拟，具有更广阔的应用范围。
本发明附加方面的优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例的微流控芯片结构明场图；
图2为本发明实施例的微流控芯片结构的局部放大图；
图3(a)为本发明实施例的通道结构示意图；
图3(b)为本发明实施例的体外血脑屏障的构建步骤示意图；
图3(c)为本发明实施例的第4天微流控芯片上细胞的明场图像；
图3(d)为本发明实施例的血液通道和3D大脑通道的活细胞和死细胞3D荧光成像图；
图3(e)为本发明实施例的血液通道和3D大脑通道中活细胞和死细胞局部放大荧光图；
图3(f)为本发明实施例的微流控芯片中内皮细胞和星形胶质细胞的细胞存活率；
图4(a)为本发明实施例的不同视角的血脑屏障模型中特异性蛋白的免疫荧光图；
图4(b)为本发明实施例的内皮细胞免疫荧光成像图局部放大图；
图4(c)为本发明实施例的星形胶质细胞免疫荧光成像图局部放大图；
图5(a)为本发明实施例的空芯片、单独内皮细胞芯片和BBB芯片的FITC-右旋糖酐(4kda)扩散荧光图像；
图5(b)为本发明实施例的空芯片、单独内皮细胞芯片和BBB芯片的FITC-右旋糖酐(40kda)扩散荧光图像；
图5(c)为本发明实施例的4kDa FITC-右旋糖苷在不同芯片中扩散的渗透率；
图5(d)为本发明实施例的40kDa FITC-右旋糖苷在不同芯片中扩散的渗透率。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
实施例一
本实施例提供了一种微流控芯片，可用于模拟体外血管及血管屏障结构，并能够在芯片上完成血脑屏障结构和功能的实时动态分析。
本实施例所提供的一种微流控芯片由下层玻璃基片及上层PDMS材质聚合物层键合而成；所述上层PDMS材质聚合物层中设置有若干个相互平行的直通道，任意两个相邻的直通道之间由若干个分支通道进行连通；所述分支通道用于将不同直通道分隔开以及允许不同细胞分泌的各种细胞因子通过，实现不同细胞间的交流。
如图1所示，本实施例的微流控芯片中的所述上层PDMS材质聚合物层中设置有四个相互平行的直通道；其中，中间两个平行直通道内的细胞共同组成血脑屏障结构；外侧两个直通道用于通入培养基平衡整个微流控系统。
其中，中间两个平行直通道中的一个用于培养血管内皮细胞的生长来模拟血管，另外一个相邻的直通道用于培养星形胶质细胞来模拟大脑。
在图1中，血液通道和3D大脑通道的尺寸为1500μm×600μm×100μm(长×宽×高)，两侧通道为1500μm×300μm×100μm。比例尺：500μm。图2为图1中框选区域的放大图。连接不同通道的分支通道尺寸为100μm×3μm×1μm，分支通道之间间距为50μm。比例尺:100μm。
实施例二
本实施例提供了一种体外三维类器官模型构建方法，其包括：
步骤1：预处理如上述所述的微流控芯片。
具体地，预处理微流控芯片的过程为：
在两个中间通道内通入设定浓度的纤维连接蛋白和IV型胶原混合物，将芯片放入细胞培养箱中静置过夜后，用PBS对通道冲洗三次除去过量的混合物。
例如：为了促进细胞在芯片内的粘附，首先在两个中间通道内通入100μg/mL纤维连接蛋白和IV型胶原混合物，将芯片放入细胞培养箱中静置过夜后，用PBS对通道冲洗三次除去过量的混合物。
步骤2：在血管通道内通入设定密度的内皮细胞，放入细胞培养箱正置设定时间使部分细胞在通道底部贴壁后，再将预处理后的微流控芯片倒置，使未贴壁的细胞在通道顶部贴壁；随后在培养箱中正置设定时间，使细胞完全贴壁生长。
具体地，步骤2为内皮细胞接种步骤，在通入内皮细胞前，首先用细胞培养基冲洗每个通道，然后在血管通道内通入密度为5×105个/mL的内皮细胞，放入细胞培养箱正置30分钟使部分细胞在通道底部贴壁后，再将微流控芯片倒置，使未贴壁的细胞在通道顶部贴壁。随后在培养箱中正置24小时，使细胞完全贴壁生长。
步骤3：获取细胞凝胶混合物并将其通入3D大脑通道中，然后将所述微流控芯片放入细胞培养箱中，凝胶完全聚合，使得星形胶质细胞均匀分布在三维凝胶支架上。
其中，获取细胞凝胶混合物的过程为：
在冰浴条件下，将I型胶原蛋白加入到NaOH溶液中，混匀后，加入PBS中并混匀，最后再加入星形胶质细胞，即得到细胞凝胶混合物。
具体地，步骤3为星形胶质细胞接种步骤。如：在冰浴条件下，将50μL I型胶原蛋白加入到3μL 0.1mol/L的NaOH溶液中，快速混匀后，加入6μL10×PBS中并混匀，最后将190μL密度为1×105个/mL的星形胶质细胞加入上述溶液中，得到细胞凝胶混合物。将上述凝胶混合物通入3D大脑通道中，然后将芯片放入37℃细胞培养箱中，30分钟后，凝胶完全聚合，星形胶质细胞可均匀分布在三维凝胶支架上。
步骤4(模拟流动血液刺激步骤)：在血液通道中，将细胞培养基持续灌注，经设定时间(如：24小时)流动刺激，内皮细胞形成紧密连接的内皮细胞层，得到完整的血脑屏障体外模型。
具体地，如用蠕动泵通过注射器将细胞培养基持续灌注，流速设置为1μL/min。
步骤5：表征脑屏障体外模型的结构及功能。
具体地，为了验证构建的血脑屏障能够还原真实的体内血脑屏障结构及功能，利用共聚焦荧光成像技术对细胞存活率、特异性蛋白表达及荧光小分子物质扩散率进行了检测。
其中，细胞存活率利用活死细胞Calcein-AM/PI染色试剂盒检测。特异性蛋白利用免疫荧光染色技术检测，包括内皮细胞相关的细胞间连接蛋白ZO-1和血管内皮黏附蛋白VE-Cad以及星形胶质细胞相关的胶质纤维酸性蛋白GFAP。荧光小分子物质为FITC标记的葡聚糖，结合菲克第一扩散定律及通道内荧光强度变化，确定渗透率。
在具体实施过程中，微流控芯片的四个通道分别为培养基通道(外侧两通道)、血管通道及3D大脑通道(中间通道)，如图3(a)所示。在体外形成完整血脑屏障结构的步骤如图3(b)所示。为了促进细胞在芯片内的粘附，首先在两个中间通道内通入100μg/mL纤维连接蛋白和IV型胶原混合物进行预包被。然后在血管通道内通入密度为5×105个/mL的内皮细胞，放入细胞培养箱正置15分钟后，将微流控芯片倒置，使未贴壁的细胞在通道顶部贴壁。随后待细胞完全贴壁后，在血管通道通入持续流动的培养基用于模拟血液流动刺激(1μL/min)，24小时后，在大脑通道中通入1×105个/mL的星形胶质细胞和胶原凝胶的混合物，放入细胞培养箱在37℃下大脑通道中可得到凝固的三维凝胶。继续在液体流动的刺激下，使内皮细胞与星形胶质细胞动态共培养1天后，得到完整的功能性血脑屏障。如图3(c)所示，按照该方法最终建立的血脑屏障模型中，内皮细胞和星形胶质细胞均在指定通道内生长良好。
首先，我们对所构建的体外血脑屏障中细胞的存活率利用活死细胞Calcein-AM/PI染色试剂盒进行了检测。如图3(d)和图3(e)所示，血管通道和3D大脑通道中的大部分内皮细胞及星形胶质细胞都显示出强烈的绿色荧光，只有极少数细胞显示出红色荧光，这表示大部分细胞均为活细胞。经过统计，两种细胞在芯片中的存活率都较高，分别为内皮细胞98.25±1.54％，星形胶质细胞97.89±0.69％，图3(f)。以上实验结果表明，细胞在所设计的微流控芯片中能够存活并且正常生长。
在图3(b)中，在微流控芯片上构建体外血脑屏障的步骤示意图。第1天：将5×105个/mL内皮细胞通入血液通道后，将芯片置于细胞培养箱中，静置30min后翻转，使细胞贴壁于血液通道上下面。第2天：将培养液以1μL/min的流速持续灌注血液通道。第3天：1×105个/mL星形胶质细胞与胶原凝胶的混合物注入相邻的3D大脑通道。第4天：星形胶质细胞在胶原凝胶支架上生长成星形形态，形成完整的血脑屏障结构。图3(c)中，第4天微流控芯片上细胞的明场图像。比例尺：100μm。在图3(d)中，血液通道和3D大脑通道的活细胞和死细胞
3D荧光成像图。比例尺:500μm。在图3(e)中，血液通道(上)和3D大脑通道(下)中活细胞和死细胞局部放大荧光图。比例尺：100μm。图3(f)中，微流控芯片中内皮细胞和星形胶质细胞的细胞存活率。
接下来，为了进一步表征该体外血脑屏障模型能够模拟真实的体内血脑屏障，我们利用免疫荧光染色技术对该模型中几种关键蛋白的表达进行了表征，具体包括内皮细胞相关的细胞间连接蛋白ZO-1和血管内皮黏附蛋白VE-Cad以及星形胶质细胞相关的胶质纤维酸性蛋白GFAP。如图4(a)所示，荧光成像图显示，血管通道中，内皮细胞覆盖所有通道壁形成连续的单层细胞。3D大脑通道中均匀分布着生长在支撑胶原凝胶上的星形胶质细胞。三维荧光图像底视图和正视图可见内皮细胞和星形胶质细胞的空间分布情况，如图4(a)所示。内皮细胞呈中空的长方体排列，星形胶质细胞在空间上分散分布。这种微流控芯片的三维细胞结构与实际血脑屏障中细胞的空间分布状态一致。如图4(b)和图4(c)所示，局部放大荧光图清晰可见内皮细胞和星形胶质细胞的标志蛋白。内皮紧密连接蛋白ZO-1和粘附蛋白VE-Cad在抑制微血管通透性中发挥重要作用，在该血脑屏障模型的内皮细胞中均高表达，说明形成了紧密的细胞间连接。此外，星形胶质细胞呈星形形状并表达胶质谱系标记物GFAP，证实了我们设计的微流控芯片中细胞的良好生长状态。
图4(a)给出了不同视角的血脑屏障模型中特异性蛋白的免疫荧光图，比例尺:500μm。图4(b)为内皮细胞免疫荧光成像图局部放大图。图4(c)为星形胶质细胞免疫荧光成像图局部放大图。比例尺:75μm。
血脑屏障是一种高度选择性的生理屏障，能够通过限制神经毒性物质进入中枢神经系统来保护大脑。为了构建的血脑屏障模型具有基本的屏障功能，我们使用不同分子量的FITC标记葡聚糖(4kDa和40kDa)作为示踪剂来监测血脑屏障的通透性。首先将FITC葡聚糖引入血管通道后，
采用共聚焦荧光成像技术记录血管通道和3D大脑通道中的荧光扩散情况。根据平均荧光强度的变化和菲克扩散第一定律计算渗透系数。在没有任何细胞装载的空微流控芯片中，4kDa和40kDa FITC-葡聚糖均在30min内迅速扩散至3D脑通道，如图5(a)和图5(b)所示。相比之下，在有内皮细胞和星形胶质细胞的血脑屏障芯片中，两种FITC-dextrans的泄漏被明显抑制，如图5(c)和图5(d)所示，显示出较低的通透性。另外，血脑屏障芯片的渗透率明显低于单独内皮细胞培养的微流控芯片，表明星形胶质细胞参与在屏障功能中的重要作用。以上结果表明，我们构建的血脑屏障模型具有较高的屏障能力，成功在体外复制了血脑屏障的基本功能。
本实施例提供了一种具有动态刺激，并且能还原器官中细胞真实空间分布的三维类器官模型构建方法，实现了人体中多种器官及血管的同时模拟。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种微流控芯片，其特征在于，由下层玻璃基片及上层PDMS材质聚合物层键合而成；所述上层PDMS材质聚合物层中设置有若干个相互平行的直通道，任意两个相邻的直通道之间由若干个分支通道进行连通；所述分支通道用于将不同直通道分隔开以及允许不同细胞分泌的各种细胞因子通过，实现不同细胞间的交流。
2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述上层PDMS材质聚合物层中设置有四个相互平行的直通道；其中，中间两个平行直通道内的细胞共同组成血脑屏障结构；外侧两个直通道用于通入培养基平衡整个微流控系统。
3.如权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，中间两个平行直通道中的一个用于培养血管内皮细胞的生长来模拟血管，另外一个相邻的直通道用于培养星形胶质细胞来模拟大脑。
4.如权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述中间两个平行直通道的尺寸为1500μm×600μm×100μm，另外两个平行直通道的尺寸为1500μm×300μm×100μm。
5.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述分支通道的尺寸为100μm×3μm×1μm。
6.一种体外三维类器官模型构建方法，其特征在于，包括：
预处理如权利要求1-5中任一项所述的微流控芯片；
在血管通道内通入设定密度的内皮细胞，放入细胞培养箱正置设定时间使部分细胞在通道底部贴壁后，再将预处理后的微流控芯片倒置，使未贴壁的细胞在通道顶部贴壁；随后在培养箱中正置设定时间，使细胞完全贴壁生长；
获取细胞凝胶混合物并将其通入3D大脑通道中，然后将所述微流控芯片放入细胞培养箱中，凝胶完全聚合，使得星形胶质细胞均匀分布在三维凝胶支架上；
在血液通道中，将细胞培养基持续灌注，经设定时间流动刺激，内皮细胞形成紧密连接的内皮细胞层，得到完整的血脑屏障体外模型；
表征脑屏障体外模型的结构及功能。
7.如权利要求6所述的体外三维类器官模型构建方法，其特征在于，预处理微流控芯片的过程为：
在两个中间通道内通入设定浓度的纤维连接蛋白和IV型胶原混合物，将芯片放入细胞培养箱中静置过夜后，用PBS对通道冲洗三次除去过量的混合物。
8.如权利要求6所述的体外三维类器官模型构建方法，其特征在于，获取细胞凝胶混合物的过程为：
在冰浴条件下，将I型胶原蛋白加入到NaOH溶液中，混匀后，加入PBS中并混匀，最后再加入星形胶质细胞，即得到细胞凝胶混合物。
9.如权利要求6所述的体外三维类器官模型构建方法，其特征在于，在表征脑屏障体外模型的结构及功能的过程中，利用共聚焦荧光成像技术对脑屏障体外模型中的细胞存活率、特异性蛋白表达及荧光小分子物质扩散率进行检测。
10.如权利要求9所述的体外三维类器官模型构建方法，其特征在于，细胞存活率利用活死细胞Calcein-AM/PI染色试剂盒检测；特异性蛋白表达利用免疫荧光染色技术检测；荧光小分子物质为FITC标记的葡聚糖，结合菲克第一扩散定律及通道内荧光强度变化，确定渗透率。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116478819A (zh) * | 2023-06-20 | 2023-07-25 | 清华大学 | 一种用于构建三维器官微环境模型的微流控系统及其制备方法和应用 |
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2022
- 2022-12-27 CN CN202211684980.2A patent/CN116004388A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116478819A (zh) * | 2023-06-20 | 2023-07-25 | 清华大学 | 一种用于构建三维器官微环境模型的微流控系统及其制备方法和应用 |
| CN116478819B (zh) * | 2023-06-20 | 2023-09-26 | 清华大学 | 一种用于构建三维器官微环境模型的微流控系统及其制备方法和应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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