KR20120118444A - 생체 외 혈관 생성 장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생체 외에서 3차원으로 혈관을 생성하기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 혈관 생성 장치는 싱크유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하는 싱크 채널; 소스유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고 상기 싱크 채널과 병렬로 위치한 소스 채널;혈관 형성 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고, 상기 싱크 채널 및 소스 채널 사이에서 싱크 채널 및 소스 채널의 일측면과 접하며, 상기 소스 채널 및 싱크 채널과 병렬로 위치한 혈관 형성 채널;제1 배양 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고, 상기 싱크 채널의 타측면과 접하며, 상기 싱크 채널과 병렬로 위치한 제1 배양 채널; 및 제2 배양 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고, 상기 소스 채널의 타측면과 접하며, 상기 소스 채널과 병렬로 위치한 제2 배양 채널을 포함하고,상기 각 채널들이 서로 접하는 경계에는 각 채널에 포함된 생화학물질들간의 상호작용을 허용하는 복수의 미세구조물이 틈을 두고 배열된다.
본 발명은 또한 상기 혈관 생성 장치의 혈관 형성 채널에 세포외기질 및 혈관형성세포를 주입하는 단계; 상기 혈관 생성 장치의 제1 배양 채널 및/또는 제2 배양 채널에 ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 공동배양세포를 주입하는 단계; 및 상기 혈관 생성 장치의 싱크 채널 및/또는 소스 채널에 혈관형성인자(angiogenesis factor) 및/또는 세포배양액을 주입하여 상기 혈관형성세포 및 공동배양세포를 배양하는 단계를 포함하는 혈관 생성 방법을 제공한다.

Description

생체 외 혈관 생성 장치{Device and Method of Generating In Vitro Blood Vessels}
본 발명은 생체 외에서 혈관을 생성하기 위한 생체 외 혈관 생성 장치 및 이를 이용한 생체 외 혈관 생성 방법에 관한 것이다.
혈관의 형성과 기능은 수많은 생리 및 병리학적 현상을 매개하는 중요한 과정이다. 암의 발생과 전이, 당뇨병에 의한 실명, 노인황반변성, 건선, 류마티스 관절염을 포함한 70종 이상의 질병이 혈관의 생성 및 기능에 대한 이상에 의해 발생 혹은 악화되는 것으로 알려져 있다. 따라서 이러한 과정의 기작을 이해하고 이를 조절하는 약물 및 치료법을 개발하는 연구는 다양한 질병에 대한 극복으로 이러질 수 있다. 이는 최근의 암 극복 노력이 혈관 신생의 억제를 통한 암세포의 사멸 유도에 집중되어 온 연구 경향을 통해서도 엿볼 수 있다. 앞서 언급한 혈관 관련 질병의 극복을 위한 기초연구와 신약의 개발은 혈관의 형성과 기능, 그리고 병리학적 현상 등을 체외에서 모사하는 실험 플랫폼의 구현을 필요로 한다.
종래의 혈관신생 관련 연구 방법 또는 약물 테스트 방법 중 대표적이라 할 수 있는 반 투과막(semi-permeable membrane) 위에 세포를 부착시켜 배양하는 시스템(Gastroenterology 96(3), 736-749,1989)은 시간과 노동력 그리고 비용이 많이 드는 단점이 있었으며, 특히 생체 내에서 혈관이 가지는 3차원적 구조를 지니지 않으며 모사된 기능이 실제 혈관에 비해 제한적인 특성을 지니는 것으로 알려져 있다. 또한 collagen, Matrigel 혹은 fibrin gel을 이용한 3차원 배양은 혈관의 구조적 특성 구현과 혈관내피세포의 형태변이를 관찰하기에 용이하나 기존의 실험 방법은 관류를 허용하는 3차원 혈관의 생성이 어려웠다. 이는 혈관의 기능적 특성과 다양한 환경 조건에 대한 반응을 관찰하는데에 제한적인 도구만을 제공하는 한계를 가져왔다.
실험용 쥐를 이용하여 쥐의 생체 내에서 혈관 내에 약물을 투여하고 약물을 테스트 하는 실험 방법(J. Pharm . Pharmacol . 53, 1007-1013, 2001)은 쥐를 해부하고 특정 장기를 판별하여 튜브를 연결하는 등 실험 과정이 복잡하고 시간과 비용이 많이 든다는 단점이 있었다.
이에 동물 실험을 하지 않고서도 in vitro 상에서 실제 생체 내 환경과 유사한 환경에서 혈관과 관련된 연구 또는 약물 테스트를 수행할 수 있도록 생체 외에서 실제 혈관과 유사한 혈관을 생성하는 기술의 개발이 절실히 요구되고 있다.
본 발명은 생체 외에서 혈관을 생성하기 위한 생체 외 혈관 생성 장치 및 이를 이용한 생체 외 혈관 생성 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 a) 싱크유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하는 싱크 채널; b) 소스유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고 상기 싱크 채널과 병렬로 위치한 소스 채널; c) 혈관 형성 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고, 상기 싱크 채널 및 소스 채널 사이에서 싱크 채널 및 소스 채널의 일측면과 접하며, 상기 소스 채널 및 싱크 채널과 병렬로 위치한 혈관 형성 채널; d) 제1 배양 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고, 상기 싱크 채널의 타측면과 접하며, 상기 싱크 채널과 병렬로 위치한 제1 배양 채널; 및 e) 제2 배양 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고, 상기 소스 채널의 타측면과 접하며, 상기 소스 채널과 병렬로 위치한 제2 배양 채널을 포함하고, 상기 각 채널들이 서로 접하는 경계에는 각 채널에 포함된 생화학 물질들 간의 상호작용을 허용하는 복수의 미세구조물이 틈을 두고 배열된 혈관 생성 장치를 제공한다.
또한 본 발명은 a) 혈관 생성 장치의 혈관 형성 채널에 세포외기질 및 혈관형성세포를 주입하는 단계; b) 혈관 생성 장치의 제1 배양 채널 및/또는 제2 배양 채널에 ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 공동배양세포를 주입하는 단계; 및 c) 혈관 생성 장치의 싱크 채널 및/또는 소스 채널에 혈관형성인자(angiogenesis factor) 및/또는 세포배양액을 주입하여 상기 혈관형성세포 및 공동배양세포를 배양하는 단계를 포함하는 혈관 생성 방법을 개시한다.
본 발명은 생체 외에서 3차원적으로 혈관을 생성할 수 있는 생체 외 혈관 생성 장치 및 이를 이용한 생체 외 혈관 생성 방법을 제공한다.
도 1는 혈관 생성 장치의 일 실시예를 나타낸다.
도 2은 본 발명의 일 실시예에 따른 혈관 생성 장치의 혈관 형성 채널에 세포외기질이 충전되는 기작을 보여주는 모식도이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 혈관 생성 장치에 순차적으로 세포외기질과 세포배양액을 정해진 채널에 주입하여 혈관 형성을 개시할 수 있음을 보여주는 모식도이다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 혈관 생성 장치 및 방법을 이용하여 vasculogenesis 과정을 모사하는 실험 방법 및 세포 배양 형태를 보여주는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따른 혈관 생성 장치 및 방법을 이용하여 vasculogenesis 과정을 모사함으로써 생성된 혈관 네트워크의 사진을 나타낸다.
도 6는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 혈관 생성 장치 및 방법을 이용하여 angiogenesis 과정을 모사하는 실험 방법 및 세포 배양 형태를 보여주는 모식도이다.
도 7은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 혈관 생성 장치 및 방법을 이용하여 angiogenesis 과정을 모사함으로써 생성된 또 다른 혈관 네트워크의 사진을 나타낸다.
도 8은 혈관 생성 장치의 다른 실시예를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 소스 채널 및 싱크 채널과 연통되고, 관류할 수 있는 혈관 네트워크 내에 유입시킨 7 μm 직경의 형광입자와 70 kDa의 FITC(fluorescein isothiocyanate) 용액을 보여주는 형광현미경 사진을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 다른 실시예에서 관류할 수 있는 혈관 네트워크 내에 염증반응을 유도하는 cytokine인 TNF-α 혹은 IL-1α를 처리하여 혈관내벽에 ICAM-1의 발현을 유도하는 현상을 모사하는 형광 사진이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서 암세포를 혼합한 배양액을 주입함으로써 혈류를 타고 전이되는 암세포가 혈관내벽에 부착하여 조직으로 침투하는 현상을 모사하는 형광 사진이다.
본 발명은 생체 외에서 3차원으로 혈관을 생성하기 위한 장치 및 방법을 제공한다.
본 발명은 a) 싱크(sink)유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하는 싱크 채널; b) 소스(source)유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고 상기 싱크 채널과 병렬로 위치한 소스 채널; c) 혈관 형성 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고, 상기 싱크 채널 및 소스 채널 사이에서 싱크 채널 및 소스 채널의 일측면과 접하며, 상기 소스 채널 및 싱크 채널과 병렬로 위치한 혈관 형성 채널; d) 제1 배양 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고, 상기 싱크 채널의 타측면과 접하며, 상기 싱크 채널과 병렬로 위치한 제1 배양 채널; 및 e) 제2 배양 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고, 상기 소스 채널의 타측면과 접하며, 상기 소스 채널과 병렬로 위치한 제2 배양 채널을 포함하고, 상기 각 채널들이 서로 접하는 경계에는 각 채널에 포함된 생화학물질들간의 상호작용을 허용하는 복수의 미세구조물이 틈을 두고 배열된 혈관 생성 장치를 제공한다.
혈관 생성 장치의 일 실시예는 도 1에 나타내었다. 혈관 생성 장치 400은 베이스 145와 연결된 기판 160을 포함한다.
기판 160은 싱크 채널 110 과 연통되어 싱크 채널 110 내로 유체를 주입할 수 있는 싱크유입구 105 및 소스 채널 120과 연통되어 소스 채널 120 내로 유체를 주입할 수 있는 소스유입구 115를 포함한다. 또한 기판 160은 싱크 채널 110과 연통되어 싱크 채널 110의 외부로 주입 유체를 배출할 수 있는 싱크유출구 141 및 소스 채널 120과 연통되어 소스 채널 120의 외부로 주입 유체를 배출할 수 있는 소스유출구 142를 포함한다. 도 1은 싱크 채널 110과 소스 채널 120이 각각의 유입구와 유출구를 포함하는 것을 도시하고 있지만 이는 개념적인 도시로서, 상기 싱크 채널 110과 소스 채널 120은 연통되어 하나의 채널을 형성할 수도 있으며, 이 경우에는 싱크유입구 105 및 소스유입구 115가 하나의 유입구를 형성할 수도 있고, 싱크유출구 141 및 소스유출구 142가 하나의 유출구를 형성할 수도 있다. 또한 별도의 싱크유출구 141 및 소스유출구 142를 구비하지 않고, 싱크유입구 105 및 소스유입구 115를 통해 유체의 주입 및 배출을 모두 수행할 수도 있다.
또한 상기 기판 160은 싱크 채널 110 및 소스 채널 120 사이에서 싱크 채널 110 및 소스 채널 120의 일측면과 접하고, 상기 싱크 채널 110 및 소스 채널 120과 병렬로 위치한 혈관 형성 채널 320을 포함한다. 또한 기판 160은 상기 싱크 채널 110의 타측면과 접하고 싱크 채널 110과 병렬로 위치한 제1 배양 채널 410 및 상기 소스 채널 120의 타측면과 접하고 소스 채널 120과 병렬로 위치한 제2 배양 채널 420을 포함한다. 도 1은 혈관 형성 채널 320 및 제1, 제2 배양 채널 410, 420이 각각의 유입구 305, 405, 415와 유출구 143, 441, 442를 포함하는 것을 도시하고 있지만 이는 개념적인 도시로서, 별도의 유출구를 구비하지 않고, 유입구를 통해 유체의 주입 및 배출을 모두 수행할 수도 있다.
상기 싱크 채널 110, 소스 채널 120, 혈관 형성 채널 320, 제1 배양 채널 410 및 제2배양 채널 420이 서로 접하는 경계는 각 채널 내의 생화학물질들이 상호작용 할 수 있도록 복수의 미세구조물 450이 틈을 두고 배열됨으로써 구획된다. 상기 미세구조물 450은 길이와 높이가 수십 내지 수백 마이크로미터(μm)인 미세한 기둥 형상의 구조물로서, 상기 복수의 미세구조물 450은 500 μm 이하의 간격으로 틈을 두고 배열될 수 있으며 실험의 목적 및 조건에 따라 유동적으로 결정될 수 있다.
상기 혈관 형성 채널 320은 내부에 ⅰ)세포외기질(Extracellular matrix; ECM) 또는 ⅱ)세포외기질 및 혈관형성세포가 충전됨으로써 3차원의 혈관 형성 영역 335를 형성한다. 상기 혈관 형성 영역 335는 혈관형성세포가 3차원으로 증식 및 분화하여 혈관을 형성할 수 있는 공간을 제공한다. 혈관 형성 채널 320이 싱크 채널 110 및 소스 채널 120과 접하는 경계에는 복수의 미세구조물 450이 틈을 두고 배열되어 있기 때문에, ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 혈관형성세포를 혈관 형성 채널 320에 주입했을 때 ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 혈관형성세포가 표면장력에 의해 미세구조물 450 사이로 빠져나가지 않고 혈관 형성 채널 320 내에서 혈관 형성 영역 325을 형성한다. 반면 각 채널에 포함된 각종 생화학물질들은 상기 복수의 미세구조물 450 사이의 틈을 통해 이동할 수 있기 때문에, 싱크 채널 110 및 소스 채널 120 내에 포함된 다양한 혈관형성인자, 영양성분 등을 혈관 형성 채널 320으로 공급할 수 있다. 또한 혈관 형성 영역 335에서 생성된 혈관이 상기 복수의 미세구조물 450이 만들어낸 틈을 향해 뻗어 나오면서 싱크 채널 110 및 소스 채널 120과 연통되어 혈관의 출입구를 형성할 수 있기 때문에, 복수의 미세구조물들 450 사이의 틈과 연통된 싱크 채널 110 및 소스 채널 120을 통해 혈관의 관 내부로 다양한 생화학적, 생물리학적 물질과 신호를 직접 전달함으로써 혈관의 반응을 실시간으로 관찰하고 이미징화 할 수 있다. 따라서 혈관형성채널 320과 제1 및 제2 배양채널 410, 420 사이에 배치된 미세구조물의 형상, 길이, 개수 등의 변화를 통해 생성하고자 하는 혈관 네트워크의 입구와 출구의 개수를 조절 가능하다. 따라서 미세구조물의 형상 등의 파라미터(parameter)는 도 1에 표시된 예에 한정되지 않고 실험의 목적 및 구성에 따라 조절할 수 있다.
도 2은 혈관 형성 채널에 ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 혈관형성세포가 충전되는 기작을 보여주는 모식도이다. 본 발명에 있어서 기판 160은 소수성 재료로 이루어진다. 혈관 형성 채널 320으로 주입된 경화 이전의 액상의 ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 혈관형성세포 330은 복수의 미세구조물들 450 사이에서 메니스커스(meniscus)를 형성하는데, 상기 메니스커스는 일정 수준의 압력(threshold pressure level) 이하에서는 표면 장력에 의해 측면의 싱크 채널 110 및 소스 채널 120으로 전진하지 못한다. 이 때 복수의 미세구조물 사이에서 메니스커스가 측면의 싱크 채널 110 및 소스 채널 120으로 전진하지 않고 정지할 수 있는 압력의 범위는 미세구조물들 사이의 간격과 높이에 영향을 받는다. 따라서 이 두 파라미터(미세구조물들 사이의 간격 및 미세구조물의 높이)를 최적화함으로써 threshold pressure level을 조절할 수 있으며, 구체적인 threshold pressure level의 조절 방법은 Carlos P. Huang et al. (Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures, Lab Chip, 2009, 9, 1740-1748)에 개시된 내용을 참고한다. 이렇게 미세구조물들 사이의 간격 및 미세구조물의 높이를 조절하여 혈관 형성 채널에 ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 혈관형성세포가 주입될 때 메니스커스가 효과적으로 구조물 사이에서 정지할 수 있도록 함으로써, 서로 완전히 물리적으로 분리되지 않은 채널과 채널 사이에서 세포외기질의 충전을 정밀하게 조절할 수 있다. 이는 제1 및 제2 배양 채널에 ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 공동배양세포가 충전되는 경우에도 마찬가지이다.
상기 제1 및 제2 배양 채널 410, 420은 내부에 ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 공동배양세포가 충전됨으로써 3차원의 세포 배양 영역 435, 445를 형성한다. 제1 및 제2 배양 채널 410, 420이 싱크 채널 110 및 소스 채널 120과 접하는 경계에도 복수의 미세구조물 450이 틈을 두고 배열되어 있기 때문에, ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 공동배양세포를 제1 및 제2 배양 채널 410, 420에 주입했을 때, ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 공동배양세포는 표면장력에 의해 미세구조물 450 사이로 빠져나가지 않고 제1 및 제2 배양 채널 410, 420 내에서 세포 배양 영역 435, 445를 형성한다. 상기 세포 배양 영역 435, 445는 공동배양세포가 3차원으로 배양될 수 있는 공간을 제공한다. 이러한 3차원 다세포 공동 배양(multicellular co-culture)을 통해 생체 내 환경을 보다 생리학적으로 모사할 수 있으며, 공동배양세포로부터 각종 신호물질의 생산 및 분비를 촉진시킬 수 있다. 반면 제1 및 제2 배양 채널 410, 420에서 생산된 각종 신호물질과 싱크 채널 110 및 소스 채널 120 내에 포함된 혈관형성인자 등의 각종 생화학물질들은 상기 복수의 미세구조물 450 사이의 틈을 통해 이동할 수 있기 때문에, 제1 배양 채널 410과 싱크 채널 110, 제2 배양 채널 420과 소스 채널 120 사이에서 생화학물질의 활발한 상호작용이 이루어질 수 있다.
상기 싱크 채널 110과 소스 채널 120은 유체의 흐름을 허용하는 통로를 제공하며, 여기서 유체는 세포배양액, 각종 혈관형성인자 등을 포함할 수 있다. 상기 싱크 채널 110 및 소스 채널 120은 각각 혈관 형성 채널 335와 제1 및 제2 배양 채널 410, 420 사이에 위치함으로써, 혈관 형성 채널 335와 제1 및 제2 배양 채널 410, 420 채널에 세포배양액, 혈관형성인자 등을 공급한다. 이를 통해 혈관형성세포와 공동배양세포의 장기간의 세포 배양을 가능케 함과 동시에, 혈관 형성 채널 335와 배양 채널 410, 420 내의 두 세포군(혈관형성세포와 공동배양세포)이 근거리분비(paracrine)를 통해 상호작용할 수 있는 통로를 제공한다. 혈관형성세포와 공동배양세포 간의 근거리분비를 통한 상호작용은 혈관형성세포의 형태형성(morphogenesis)을 혈관네트워크로 촉진하며 형성된 혈관의 특이적 성질 발현 및 기능에도 중요한 영향을 미친다. 또한 상기 싱크 채널 110 및 소스 채널 120은 혈관형성세포와 공동배양세포를 물리적으로 분리시킴으로써 혈관형성세포와 공동배양세포를 독립적으로 관찰하고 분석하기 용이하게 하며, 특히 복수의 미세구조물 450 틈으로 싱크 채널 110 및 소스 채널 120과 연통된 혈관의 내부로 다양한 생화학적, 생물리학적 물질과 신호를 주입할 수 있는 공간을 제공한다. 이로써 다양한 생화학적, 생물리학적 물질과 혈관 사이의 상호작용을 모사할 수 있으며, 다양한 자극에 대한 혈관의 반응을 관찰하고 이를 실시간으로 이미징 및 정량화 할 수 있다.
본 발명에 따른 혈관 생성 장치 400을 이용하여 혈관을 생성함에 있어서 사용 가능한 세포외기질, 혈관형성세포, 세포배양액, 공동배양세포의 종류 및 특성은 다음과 같다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포외기질은 예를 들어 콜라겐 젤(collagen gel), 피브린 젤(fibrin gel), 마트리젤(Matrigel), 자가조립 펩타이드 젤(self-assembled peptide gel), 폴리에틸렌글리콜 젤(polyethylene glycol gel) 및 알지네이트 젤 (alginate gel) 중 적어도 하나일 수 있으며, 본 실시예에서는 피브린 젤을 사용하였다. 상기 세포외기질은 혈관형성 및 기능의 효과와 효능을 정량 측정하거나 angiogenesis를 촉진 또는 억제하는 특성의 신약 스크리닝의 목적을 위해, 약물(drug compound), 가용성인자(soluble factor), 불용성인자(insoluble factor), 생체분자(biomolecule), 단백질(protein), 나노소재(nanomaterial) 및 siRNA 중 적어도 하나를 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 혈관형성세포는 예를 들어 내피세포 (endothelial cell), 외피세포(epithelial cell), 암세포(cancer cell), 줄기세포(stem cell), 줄기세포 유래세포(stem cell-derived cell) 및 혈관전구세포(endothelial progenitor cell) 중 적어도 하나일 수 있다. 또한 상기 세포들의 유전변이된 세포(mutated cell) 및/또는 형질감염된 세포(transfected cell)일 수 있다. 본 실시예에서는 HUVEC(Human Umbilical Vain Endothelial Cell)를 사용하였다. 본 명세서에서 혈관형성세포란 혈관형성인자, 세포배양액에 포함된 혈관형성유도물질, 공동배양세포 등과 상호작용에 의해 혈관을 형성하는 세포를 의미한다. 상기 혈관형성세포는 vasculogenesis 혹은 angiogenesis을 통해 혈관을 형성할 수 있다. 예를 들어 혈관형성세포로서 human umbilical vein endothelial cell, human microvascular endothelial cell, human brain microvascular endothelial cell, human lymphatic endothelial cell 등 다양한 신체 부위에서 분리된 혈관내피세포가 사용될 수 있으며, 암의 성장과 전이 기전 등을 연구하기 위해 암세포가 사용될 수도 있다. 또한 배양 세포는 human이외의 종 porcine endothelial cell, murine endothelial cell, bovine endothelial cell 등의 다양한 종에서 유래된 혈관내피세포일 수 있으며 실험의 목적에 맞게 선택이 가능하다. 이처럼 혈관형성세포의 종류는 실험의 목적에 맞게 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 세포 배양액은 당업계에 공지된 어떤 세포배양액이라도 사용할 수 있으며, 본 실시예에서는 EGM-2 배지(LONZA)를 사용하였다 상기 세포외기질은 혈관형성 및 기능의 효과와 효능을 정량 측정하거나 angiogenesis를 촉진 혹은 억제하는 특성의 신약 스크리닝의 목적을 위해, 약물(drug compound), 가용성인자(soluble factor), 불용성인자(insoluble factor), 생체분자(biomolecule), 단백질(protein), 나노소재(nanomaterial) 및 siRNA 중 적어도 하나를 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 공동배양세포는 혈관 형성 세포와의 상호작용을 통해 혈관 형성 유도물질 등 혈관 형성에 필요한 생화학물질을 분비하는 세포일 수 있으며, 예를 들어 성상세포(astrocyte), 아교세포(glial cell), 중피세포 (mesothelial cell), 섬유아세포(fibroblast), 평활근세포(smooth muscle cell), 암세포(cancer cell), 주피세포(pericyte), 신경교세포(neuroglial cell), 줄기세포(stem cell), 줄기세포 유래세포(stem-cell derived cell) 및 혈관 내피와 상호작용하는 세포 중 적어도 하나일 수 있다. 또한 상기 세포들의 유전변이된 세포(mutated cell) 및/또는 형질감염된 세포(transfected cell)일 수 있다. 생성하고자 하는 혈관이 뇌혈관인 경우 공동배양세포는 성상세포, 아교세포, 주피세포 또는 섬유아세포인 것이 바람직하고, 생성하고자 하는 혈관이 뇌혈관 이외의 혈관인 경우에는 섬유아세포 또는 평활근세포인 것이 바람직하다. 또한 암과 혈관신생과의 관련성 등을 연구하기 위하여 암세포를 공동배양세포로 사용할 수도 있다. 또한 배양되는 세포의 종류와 조합, 그리고 배양 방식은 실험의 목적에 맞게 선택될 수 있으며 본 실시예에서는 Human Lung Fibroblast를 HUVEC과 공동배양하였다.
상기 혈관형성인자, 세포배양액 및 공동배양세포의 추가는 혈관형성세포의 성장, 증식 및 형태형성에 적절한 환경을 제공하기 위한 것으로서 그 종류 및 조성은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 a) 상기 혈관 생성 장치의 혈관 형성 채널에 세포외기질 및 혈관형성세포를 주입하는 단계; b) 상기 혈관 생성 장치의 제1 배양 채널 및/또는 제2 배양 채널에 ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 공동배양세포를 주입하는 단계; 및 c) 상기 혈관 생성 장치의 싱크 채널 및/또는 소스 채널에 혈관형성인자(angiogenesis factor) 및/또는 세포배양액을 주입하여 상기 혈관형성세포 및 공동배양세포를 배양하는 단계를 포함하는 혈관 생성 방법을 제공한다.
본 발명의 실시예는 angiogenesis 과정 및/또는 vasculogenesis 과정일 수 있다. 도 3는 본 발명의 혈관 생성 장치 400을 이용하여 혈관을 생성하는 과정 중에서, 혈관 형성 채널 320에 ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)혈관형성세포 및 세포외기질 330을 주입하고, 제1 및 제2 배양 채널 410, 420에 ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)공동배양세포 및 세포외기질 230을 주입하며, 싱크 채널 110 및 소스 채널 120에 세포배양액, 각종 혈관형성인자 등을 포함한 유체 130을 주입하는 과정을 나타낸다. 각 채널에 세포외기질, 세포, 세포배양액, 각종 혈관형성인자 등을 주입할 때에는 별도의 외부 실험기기를 필요로 하지 않으며, 간단히 파이펫 조작을 통해 주입할 수 있다. 또한 상기 혈관형성세포와 공동배양세포는 세포외기질과 혼합해 주입할 수 있으나 실험의 목적에 따라 세포외기질만을 주입할 수 있다. 도 3는 세포외기질 등을 혈관 형성 채널 320에 주입한 후 제1 및 제2 배양 채널 410, 420에 주입하는 것을 도시하고 있으나, 이는 개념적인 도시로서, 세포외기질 등을 각 채널에 주입하는 순서는 혈관의 형성에 영향을 미치지 않는다. 따라서 각 채널에 세포외기질 등을 주입하는 순서는 실험자의 편의 및 실험의 특성에 따라 변경될 수 있다. 각각의 채널에 주입된 세포외기질은 그 종류에 따라 온도의 상승, 화학적 작용, 빛의 조사에 의해 경화된다. 이러한 경화 과정 이후에 세포배양액 등을 싱크 및 소스 채널에 주입함으로써 혈관 형성 채널 320과 제1 및 제2 배양 채널 410, 420에 영양 성분, 혈관형성인자 등을 공급하고 각 채널 사이에 근거리분비를 유도함으로써 장기적인 세포의 배양과 혈관의 형성을 가능케 한다. 혈관형성세포가 혈관 형성 채널 내에 주입된 세포외기질의 측면에 부착되는 경우에, 세포배양액 내 함유된 혈관형성세포가 싱크채널 또는 소스채널 내로 주입되고, 혈관생성장치를 10 내지 15분 동안 90도 정도 기울이므로써, 혈관형성세포가 의도한 자리에 부착할 수 있도록 한다.
도 4은 본 발명의 혈관 생성 장치에 내피세포에 해당하는 HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell)과 섬유아세포에 해당하는 NHLF(Normal human lung fibroblast)를 피브린 젤에 혼합하여 각각 혈관형성채널 320과 제1 및 제2 배양채널 410, 420에 주입하고, 싱크 채널 110 및 소스 채널 120에 세포배양액 EGM-2(Endothelial cell growth medium-2)를 주입하여 배양함으로써 vasculogenesis 과정을 모사하는 실험 구성을 나타낸다. 배양세포 종류 및 실험의 목적에 따라, 혈관형성세포의 배양 및 형태형성을 촉진하거나 조절하기 위하여 혈관형성인자 또는 세포 반응에 영향을 미치는 다른 인자를 피브린 젤 또는 EGM-2와 함께 혼합할 수 있다.
도 5은 도 4의 vasculogenesis 과정을 통해 형성된 혈관 네트워크의 사진이다. 이는 혈관형성의 개시 이후 4일 동안의 혈관 형성 과정을 24시간마다 현미경으로 관찰한 결과로서, 혈관 네트워크는 피브린 내 함유된 HUVEC 세포로부터 혈관 형성 채널 내에 형성되며 복잡하게 연결된 패턴을 나타내었다. 혈관은 미세구조물 450 사이의 틈으로 확장하여, 싱크채널 110 및 소스채널 120 내 세포배양액과 유체간 상호작용하고 관류할 수 있는 혈관 내 공간을 형성한다. 따라서, 혈관의 내부는 소스채널 및 싱크채널 내 세포배양액과 직접적으로 연결되며, 혈관은 내부의 공간은 관류할 수 있는 혈관네트워크를 형성할 수 있다. 또한 피브린 젤과 세포배양액 사이의 경계에까지 혈관이 뻗어, 결과적으로 혈관의 내부와 세포배양액의 유체 환경이 연속상으로 존재하게 됨을 알 수 있다. 관류를 형성하는 혈관 네트워크의 혈관형성의 개시 이후 특정한 실험 조작의 필요 없이 자발적인 세포군 사이의 상호작용을 통해 높은 재현성을 가지고 형성된다.
본 발명은 또한 a) 혈관 생성 장치의 혈관 형성 채널에 세포외기질을 주입하는 단계; b) 혈관 생성 장치의 싱크 채널 및/또는 소스 채널에 혈관형성세포를 주입하여, 혈관형성세포를 혈관 형성 채널의 측면에 배열된 복수의 미세구조물 사이에서 노출된 세포외기질에 부착하는 단계; c) 혈관 생성 장치의 제1 배양 채널 및/또는 제2 배양 채널에 ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 공동배양세포를 주입하는 단계; 및 d) 혈관 생성 장치의 싱크 채널 및/또는 소스 채널에 혈관형성인자(angiogenesis factor) 및/또는 세포배양액을 주입하여 상기 혈관형성세포 및 공동배양세포를 배양하는 단계를 포함하는 혈관 생성 방법을 제공한다.
본 발명의 실시예는 angiogenesis 과정일 수 있다. 도 6은 혈관 형성 채널 320에 피브린 젤을 충전시켜 혈관 형성 영역 335를 형성한 후, 상기 혈관 형성 채널 320의 좌측에 있는 싱크 채널 110에 내피세포인 HUVEC 세포를 주입하여 미세구조물 450 사이의 틈으로 노출된 피브린 젤에 HUVEC 세포를 부착시키고, 섬유아세포인 NHLF를 상기 혈관 형성 채널 320의 우측에 있는 제2 배양채널 420에 주입하며, 세포배양액, EGM-2를 싱크채널 110 및 소스채널 120에 주입하여 3차원 배양함으로써 angiogenesis 과정을 모사하는 실험 구성도이다. 배양세포 종류 및 실험의 목적에 따라, 혈관형성세포의 배양 및 형태형성을 촉진하거나 조절하기 위하여 혈관형성인자 또는 세포 반응에 영향을 미치는 다른 인자를 피브린 젤 또는 EGM-2와 함께 혼합할 수 있다. 신생혈관(angiogenic sprout)은 HUVEC 세포가 부착된 혈관 형성 영역 335의 좌측으로부터 섬유아세포 NHLF가 배양되고 있는 우측의 제2 배양 채널 420을 향해 성장하며 혈관 형성 영역 335를 통해 성장한 후 관류할 수 있는 혈관을 형성한다. 도 7(a)는 성장 개시 48시간이 지난 이후의 신생혈관을 보여주며, 도 7(b)는 성장 개시 4일 후에 관통된 혈관의 네트워크를 형성한 사진이다.
혈관형성세포의 신생혈관형성을 안내하는 혈관형성인자(pro-angiogenic factor)의 방향성있는 농도구배를 제공하기 위하여, 혈관형성세포를 부착하는 위치, 공동배양세포의 주입 및 싱크채널 및 소스채널로의 혈관형성인자의 유입은 목적에 맞게 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 a) 제1 배양 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하는 제1 배양 채널 채널; b) 혈관 형성 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고, 상기 제1 배양 채널의 일측면과 접하며, 제 1배양 채널과 병렬로 위치한 혈관 형성 채널; c) 싱크 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고, 상기 제1 배양 채널의 타측면과 접하며, 상기 제1 배양 채널과 병렬로 위치한 싱크 채널; 및 d) 소스 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고, 상기 혈관 형성채널의 타측면과 접하며, 상기 제1 배양 채널과 병렬로 위치한 소스 채널을 포함하고, 상기 각 채널들이 서로 접하는 경계에는 각 채널에 포함된 생화학물질들간의 상호작용을 허용하는 복수의 미세구조물이 틈을 두고 배열된 혈관 생성 장치를 제공한다.
또한 본 발명은 a) 상기의 혈관 생성 장치의 혈관 형성 채널에 세포외기질을 주입하는 단계; b) 상기 혈관 생성 장치의 소스 채널에 혈관형성세포를 주입하여, 혈관형성세포를 혈관 형성 채널의 측면에 배열된 복수의 미세구조물 사이에서 노출된 세포외기질에 부착하는 단계; c) 상기 혈관 생성 장치의 제1 배양 채널에 ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 공동배양세포를 주입하는 단계; 및 d) 상기 혈관 생성 장치의 싱크 채널 및/또는 소스 채널에 혈관형성인자(angiogenesis factor) 및/또는 세포배양액을 주입하여 상기 혈관형성세포 및 공동배양세포를 배양하는 단계를 포함하는 혈관 생성 방법을 개시한다.
도 8은 본 발명의 다른 구체예로서, 혈관 형성 채널의 측면에 직접적으로 접하는 제1 배양 채널을 지닌 혈관 생성 장치의 정면도이다. 혈관 형성 채널과 공동배양세포가 3차원적으로 세포외기질에 함유되어 있는 제1 배양채널이 직접적으로 상호작용하므로, 본 혈관 생성 장치는 신생혈관의 형성 및 신생혈관이 혈관형성인자(pro-angiogenic factor)를 향한 성장을 관찰 및 조절하는 목적을 가지는 실험에서는 보다 간편한 실험 구성을 제공할 수 있다. 도 8의 파랑색 부분은 혈관형성채널, 녹색 부분은 공동배양세포를 주입할 수 있는 채널이며 분홍색 부분은 세포배양액 및/또는 혈관형성인자가 들어가는 채널일 수 있다.
생성된 혈관 네트워크는 관류를 허용하며, 싱크채널 및 소스채널과 연통될 수 있다. 본 발명은 또한 angiogenesis 또는 vasculogenesis에 의해 생성된 혈관에 유체 흐름의 유입을 허용하도록 하는 유체를 관류시키는 방법을 제공한다. 상기 유체는 가용성인자, 불용성인자, 생화학물질, 생화학자극제 및 세포 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 상기 세포는 암세포, 면역세포, 줄기세포, 줄기세포 유래세포, 혈구세포 및 혈관전구세포 중 적어도 하나일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 혈관 생성 장치 400은 혈관 형성 채널 320을 기준으로 각각 좌측과 우측에 배치된 제1 및 제2 배양 채널 410, 420에 배양하는 공동배양세포들 간의 상대적인 밀도를 조절하거나 서로 다른 종류의 세포를 배양함으로써, 공동배양세포가 분비하는 각종 신호물질의 농도구배(concentration gradient)를 형성할 수 있다. 뿐만 아니라 공동배양세포와 혈관형성세포간의 상대적인 밀도를 조절함으로써 공동배양세포가 분비하는 각종 신호물질의 분비량도 제어할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 혈관 생성 장치 400은 혈관 형성 채널 320을 기준으로 각각 좌측과 우측에 배치된 싱크 채널 110과 소스 채널 120간의 상대적인 유량 또는 생화학물질의 종류 및 농도를 조절함으로써 각종 혈관형성인자와 영양성분 등의 농도구배를 형성할 수도 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 혈관형성세포, 공동배양세포, 혈관생성인자 등의 기원과 종류를 조절함으로써 생성되는 혈관이 신체의 특정 부위나 신체의 특정 생리, 병리학적 상태에서 나타나는 혈관의 특성을 가지도록 유도할 수 있다. 또한 세포외기질 및/또는 세포배양액을 포함하는 유체는 가용성인자, 불용성인자, 생화학물질, 생화학자극제 및 세포 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 예를 들어 혈관형성채널에 혈관내피세포와 함께 암세포를 혼입하면 암세포에 의해 다양한 혈관형성인자 및 염증유발요소가 분비됨으로써 혈관 네트워크의 투과성을 증가시킬 수 있으며, 공동배양세포로서 성상세포(astrocyte)를 주입하면 이와 반대로 혈관을 구성하는 세포간의 접합을 강화함으로써 투과성을 저하시킬 수 있다. 또한 생성된 혈관의 인접한 외부에 신경교세포를 공동배양함으로서 혈관네트워크에 뇌혈관과 유사한 특성을 부여할 수 있으며 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell) 혹은 주위세포(pericyte)를 공동배양함으로써 다양한 혈관-주피세포 상호작용을 유발하고 이를 연구할 수 있는 세포미세환경을 구현 할 수 있다. 이 경우, 상기의 특정 세포들이 angiogenesis 과정 또는 vasculogenesis 과정에서 혈관내피세포와 물리적으로 상호작용하도록 하기 위해서 혈관 형성 채널 내에 주입되는 ECM과 혼합하여 주입될 수도 있다.또한 상기 특정 세포는 혈관형성세포와 비접촉 상태로써 용해성 분자의 교환을 통한 상호작용을 위하여, 제 1배양채널 또는 제 2배양채널 내 주입할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 혈관 네트워크의 투과성(permeability)을 조절하는 경우, 혈관의 투과성은 형광마커(fluorescent marker)와 같은 물질을 유입하고 혈관벽을 통하여 확산된 형광의 강도(intensity)를 정량하여 측정할 수 있다. 또한 투과성은 혈관의 내부에 전극을 삽입하고 혈관의 외부에 다른 전극을 삽입하여, 혈관벽 간의 transendothelial electrical resistance(TEER) 수치를 정량하여 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 혈관의 생성을 암세포를 통해서 유도하거나 암세포를 혈관의 내부 혹은 외부에 위치시킴으로써 암의 성장과 전이 기작을 이해할 수 있는 체외 모델을 제공할 수 있다. 암세포에서 분비된 혈관형성인자가 혈관내피세포의 형태변형 혹은 방향성 성장을 유도하는 과정을 모사하기 위해 암세포를 제1 및 제2 배양채널에 세포외기질과 혼입할 수 있으며, 혈관내피세포를 혈관형성채널에 주입할 때 세포외기질에 암세포를 함께 혼입하거나 싱크 및 소스 채널과 연통된 혈관 내부로 싱크 및 소스 채널을 통해 암세포를 유체와 함께 흘려줌에 따라 암세포가 혈관벽을 통해 혈류로 편입하거나 혈류에서 특정 조직으로 침투하는 과정을 모사할 수 있다. 또한 상기의 구체예에서 혈관벽을 통해 혈류에서 조직으로 또는 조직에서 혈류로 침투하는 세포는 암세포에 한정되지 않는다. 혈관벽을 통해 조직과 혈류 사이를 이동하는 다른 세포군의 대표적인 예로서 대식세포, 호중성백혈구 등을 포함하는 면역세포, 줄기세포 및 줄기세포 유래세포, 그리고 혈관전구세포 가 있으며, 본 발명의 또 다른 구체예에 따르면 이러한 면역세포를 각 채널 내에 주입함으로써 면역세포와 혈관의 상호작용을 모사할 수도 있다.
본 발명에 따른 혈관 생성 장치 400을 이용하여 혈관 형성 영역 335에 형성된 혈관은 도 5 및 도 7에 나타난 바와 같이 복수의 미세구조물 450이 만들어낸 틈을 통하여 싱크 채널 110 및 소스 채널 120과 연통될 수 있다. 도5 및 도7은 vasculogenesis 혹은 angiogenesis 과정을 모사함으로써 혈관 형성 채널 내에 형성된 혈관의 네트워크를 통해 소스채널 및 싱크채널이 연속된 유체환경으로 직접적으로 통해 있음을 보여준다. 이 경우 싱크 채널 110 및 소스 채널 120을 통해 생성된 혈관의 관 내부로 다양한 생화학적, 생물리학적 물질과 신호를 직접 전달하여 혈관의 반응을 실시간으로 관찰하고 이미징화 할 수 있다.
본 발명의 또 다른구체예에서, 혈관형성채널 320을 기준으로 좌측과 우측에 배치된 싱크 채널 110 및 소스 채널 120에 주입되는 세포배양액의 양(volume)을 조절함으로써 싱크 채널 110 및 소스 채널 120 사이에 정수력압을 유도할 수 있고, 이렇게 유도된 정수력압의 차이를 통해 미세구조물 450의 틈을 통해 싱크 채널 110 및 소스 채널 120과 연통된 혈관 네트워크 내부로 관류를 흐르게 할 수 있다. 이때 주입하는 유체에 혈관의 특성을 제어할 수 있는 다양한 생화학물질을 혼입함으로써 혈관의 직경, 길이, 투과성, 형태 및 장벽기능(barrier function) 등과 같은 기능적 특성 또는 유전자 및 단백질 발현 등을 조절하고 측정할 수 있다. 또한 정수력압의 정량적 차이를 통해 혈관을 통해 흐르는 유량의 제어가 가능해지고 유동에 의해 유발된 전단력을 혈관내부에 전달함으로써 3차원 혈관의 생물리학적 자극에 의한 혈관의 반응 혹은 재구성을 유도할 수 있다.
도 9는 소스 및 싱크 채널과 연통된 혈관 내에 용해성 또는 비용해성 형광 마커를 주입시킬 수 있음을 보여주는 형광현미경 사진이며, 7 μm 직경의 형광입자와 70 kDa의 FITC(fluorescein isothiocyanate) 용액이 혈관의 내부에 위치함을 보여준다. 도 10은 혈관 내부에 염증반응을 유도하는 cytokine인 TNF-α 또는 IL-1α를 처리하여 혈관내벽에 ICAM-1의 발현을 유도할 수 있음을 보여주는 형광 사진이다. 대조군과는 달리 TNF-α 혹은 IL-1α처리된 혈관에서 형광 반응이 유도되었음을 보여준다.
관류는 기계적인 수단에 의하여 유도되고 조절될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 혈관을 통한 유체 흐름을 일정한 수준으로 유지하기 위하여, 시린지 펌프(syringe pump) 및 유체 전달 튜브(fluid-delivering tube)를 혈관 생성 장치에 연결 할 수 있다. 또한 정수압, 또는 외부 펌프를 이용하여 혈관 및 혈관의 네트워크에 다양한 생리학 및 병리학적 현상에서 관찰되는 혈류량과 유사한 수준의 유동을 허용함으로써 혈액 유동을 모사할 수 있다. 또한 관류할 수 있는 3차원 혈관 네트워크는 생리적, 병리적 현상에서 관찰되는 혈관 내벽과 blood-borne cell 과의 상호작용을 모사하기 위한 새로운 체외 모델을 제공한다.
도 11은 혈관의 내벽에 암세포를 혼합한 배양액을 주입함으로써 혈류를 타고 전이되는 암세포의 특성을 모사하며 암세포가 혈관내벽에 부착하여 혈관벽을 통해 조직으로 침투하는 현상을 모사할 수 있음을 보여주는 형광이미지를 나타낸다.
상기의 '병렬로'는 평면상에서 채널 간에 서로 교차하지 않고 균일한 거리를 유지하는 것 뿐만 아니라 유사한 거리를 유지하는 것을 포함한다.
이상에서는 본 발명에 따른 생체 외 혈관 생성 장치 및 이를 이용한 생체 외 혈관 생성 방법을 첨부한 도면들을 참조로 하여 설명하였으나,　본 발명은 본 명세서에 개시된 실시예와 도면에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술사상의 범위 내에서 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
400: 혈관 생성 장치
105: 싱크유입구 115: 소스유입구
305: 혈관형성채널 유입구
110: 싱크채널 120: 소스채널
141: 싱크유출구 142: 소스유출구
143: 혈관형성채널 유출구
145: 베이스 160: 기판
320: 혈관형성채널 335: 혈관형성영역
230: ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 공동배양세포
330: ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 혈관형성세포
405: 제1배양채널 유입구 415: 제2배양채널 유입구
410: 제1배양채널 420: 제2배양채널
435: 세포배양영역 445: 세포배양영역
441: 제1배양채널 유출구 442: 제2배양채널 유출구
450: 미세구조물

Claims (18)

  1. a) 싱크유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하는 싱크 채널;
    b) 소스유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고 상기 싱크 채널과 병렬로 위치한 소스 채널;
    c) 혈관 형성 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고, 상기 싱크 채널 및 소스 채널 사이에서 싱크 채널 및 소스 채널의 일측면과 접하며, 상기 소스 채널 및 싱크 채널과 병렬로 위치한 혈관 형성 채널;
    d) 제1 배양 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고, 상기 싱크 채널의 타측면과 접하며, 상기 싱크 채널과 병렬로 위치한 제1 배양 채널; 및
    e) 제2 배양 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고, 상기 소스 채널의 타측면과 접하며, 상기 소스 채널과 병렬로 위치한 제2 배양 채널을 포함하고, 상기 각 채널들이 서로 접하는 경계에는 각 채널에 포함된 생화학물질들 간의 상호작용을 허용하는 복수의 미세구조물이 틈을 두고 배열된 혈관 생성 장치.
  2. a) 제1 배양 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하는 제1 배양 채널;
    b) 혈관 형성 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고, 상기 제1 배양 채널의 일측면과 접하며, 제 1배양 채널과 병렬로 위치한 혈관 형성 채널;
    c) 싱크 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고, 상기 제1 배양 채널의 타측면과 접하며, 상기 제1 배양 채널과 병렬로 위치한 싱크 채널; 및
    d) 소스 채널 유입구와 유체간 상호작용(fluid communication)하고, 상기 혈관 형성채널의 타측면과 접하며, 상기 제1 배양 채널과 병렬로 위치한 소스 채널을 포함하고, 상기 각 채널들이 서로 접하는 경계에는 각 채널에 포함된 생화학물질들 간의 상호작용을 허용하는 복수의 미세구조물이 틈을 두고 배열된 혈관 생성 장치.
  3. a) 제1항에 따른 혈관 생성 장치의 혈관 형성 채널에 세포외기질 및 혈관형성세포를 주입하는 단계;
    b) 상기 혈관 생성 장치의 제1 배양채널 및/또는 제 2 배양 채널에 ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 공동배양세포를 주입하는 단계; 및
    c) 상기 혈관 생성 장치의 싱크 채널 및/또는 소스 채널에 혈관형성인자(angiogenesis factor) 및/또는 세포배양액을 주입하여 상기 혈관형성세포 및 공동배양세포를 배양하는 단계를 포함하는 혈관 생성 방법.
  4. a) 제1항에 따른 혈관 생성 장치의 혈관 형성 채널에 세포외기질을 주입하는 단계;
    b) 상기 혈관 생성 장치의 싱크채널 및/또는 소스 채널에 혈관형성세포를 주입하여, 혈관형성세포를 혈관 형성 채널의 측면에 배열된 복수의 미세구조물 사이에서 노출된 세포외기질에 부착하는 단계;
    c) 상기 혈관 생성 장치의 제1 배양 채널 및/또는 제2 배양 채널에 ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 공동배양세포를 주입하는 단계; 및
    d) 상기 혈관 생성 장치의 싱크 채널 및/또는 소스 채널에 혈관형성인자(angiogenesis factor) 및/또는 세포배양액을 주입하여 상기 혈관형성세포 및 공동배양세포를 배양하는 단계를 포함하는 혈관 생성 방법.
  5. a) 제2항에 따른 혈관 생성 장치의 혈관 형성 채널에 세포외기질을 주입하는 단계;
    b) 상기 혈관 생성 장치의 소스 채널에 혈관형성세포를 주입하여, 혈관형성세포를 혈관 형성 채널의 측면에 배열된 복수의 미세구조물 사이에서 노출된 세포외기질에 부착하는 단계;
    c) 상기 혈관 생성 장치의 제1 배양 채널에 ⅰ)세포외기질 또는 ⅱ)세포외기질 및 공동배양세포를 주입하는 단계; 및
    d) 상기 혈관 생성 장치의 싱크 채널 및/또는 소스 채널에 혈관형성인자(angiogenesis factor) 및/또는 세포배양액을 주입하여 상기 혈관형성세포 및 공동배양세포를 배양하는 단계를 포함하는 혈관 생성 방법.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 혈관형성세포는 내피세포, 외피세포, 암세포, 줄기세포, 줄기세포 유래세포, 혈관전구세포 중 적어도 하나인 혈관 생성 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 혈관형성세포는 유전변이된 세포 및/또는 형질감염된 세포인 혈관 생성 방법.
  8. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 세포외기질은 콜라겐 젤, 피브린 젤, 마트리 젤, 자가조립 펩타이드 젤, 폴리에틸렌글리콜 젤 및 알지네이트 젤 중 적어도 하나인 혈관 생성 방법.
  9. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 공동배양세포는 성상세포, 아교세포, 중피세포, 섬유아세포, 평활근세포, 암세포, 주피세포, 신경교세포, 줄기세포, 줄기세포 유래세포 및 혈관 내피와 상호작용하는 세포 중 적어도 하나인 혈관 생성 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 공동배양세포는 유전변이된 세포 및/또는 형질감염된 세포인 혈관 생성 방법.
  11. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 세포외기질 또는 세포배양액은 약물, 가용성인자, 불용성인자, 생체분자, 단백질, 나노소재 및 siRNA 중 적어도 하나를 포함하는 혈관 생성방법.
  12. 제3항 또는 제4항에 의하여 생성된 혈관에 유체 흐름의 유입을 허용하도록 하는 유체를 관류시키는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 관류는 기계적인 수단으로 유도 및 조절함으로써 유체를 관류시키는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 유체는 가용성인자, 불용성인자, 생화학물질, 생화학자극제 및 세포 중 적어도 하나를 포함하는 유체를 관류시키는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 세포는 암세포, 면역세포, 줄기세포, 줄기세포 유래세포, 혈구세포 및 혈관전구세포 중 적어도 하나인 유체를 관류시키는 방법.
  16. 제 3항 또는 제4항에 의하여 생성된 혈관 내에 형광 마커를 주입하여 혈관의 장벽기능(barrier function)을 측정하는 방법.
  17. 제 3항 또는 제4항에 의하여 생성된 혈관 내에 형광 마커를 주입하여 혈관의 투과성을 측정하는 방법.
  18. 제 3항 또는 제4항에 의하여 생성된 혈관의 transendothelial electrical resistance(TEER) 수치를 측정함으로써 혈관의 투과성을 측정하는 방법.
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