WO2024025177A1 - 역-미세둑 구조가 포함된 장기모사칩 및 이의 용도 - Google Patents

역-미세둑 구조가 포함된 장기모사칩 및 이의 용도 Download PDF

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WO2024025177A1
WO2024025177A1 PCT/KR2023/009081 KR2023009081W WO2024025177A1 WO 2024025177 A1 WO2024025177 A1 WO 2024025177A1 KR 2023009081 W KR2023009081 W KR 2023009081W WO 2024025177 A1 WO2024025177 A1 WO 2024025177A1
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WO
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cells
cell
culture medium
simulation chip
chamber
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PCT/KR2023/009081
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백상원
박성빈
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주식회사 휴먼에이스
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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to an organ simulating chip containing a reverse-microbank structure and its use.
  • a biomimetic chip or organ-on-a-chip is a device that imitates the structure of the internal microenvironment of a specific organ in the human body and realizes its characteristics by cultivating the cells that make up that organ in a microchamber. It's a system. Therefore, the organ simulator chip is an effective alternative that can overcome these limitations of animal testing, and is expected to be a pre-clinical new drug development platform by implementing physiological activity at the tissue or organ level.
  • Research using heart simulator chips mainly focuses on myocardial modeling, and several research groups have produced heart simulator chips by imitating the heart structure and microenvironment. Domestic prior research on this is insufficient, and overseas prior research is similar to the present invention, and the most recently published study on a heart simulation chip by A.
  • the main object of the present invention is to provide a human organ simulation chip for evaluating the efficacy and toxicity of drugs, which includes a culture medium supply part for supplying culture medium to cells, a cell supply part containing fixed cells, and a reverse-microbank structure provided between them. It is provided.
  • Another object of the present invention is to provide a method for evaluating the efficacy of a drug on cells using the organ simulation chip.
  • Another object of the present invention is to provide a method for evaluating the toxicity of drugs on cells using the organ simulation chip.
  • Another object of the present invention is to provide the use of an organ simulating chip to evaluate the efficacy of drugs on cells.
  • organ simulation chip for evaluating drug efficacy and toxicity provided by the present invention, more accurate efficacy and toxicity results for cells according to drug treatment can be derived. Accordingly, by using it as an alternative to animal testing, it not only dramatically reduces the cost and time required for new drug development and drug screening, but is also useful for research on the intracellular microenvironment and other organ-on-a-chip research. It can be used effectively.
  • Figure 1 is an overall schematic diagram including a three-dimensional and microstructure diagram of a heart simulation chip, which is an example of an organ simulation chip for evaluating drug efficacy and toxicity provided by the present invention, and components within the chip.
  • Figure 2 is a three-dimensional view of a heart simulation chip, which is an example of an organ simulation chip for evaluating the efficacy and toxicity of drugs provided by the present invention.
  • Figure 3 is a plan view of a heart simulation chip, which is an example of an organ simulation chip for evaluating the efficacy and toxicity of drugs provided by the present invention.
  • Figure 4 is a partial enlarged view of the cell chamber and culture channel of an organ simulation chip containing cardiomyocytes, which is one example of an organ simulation chip for evaluating drug efficacy and toxicity provided by the present invention.
  • Figure 5 is a partial enlarged view of the reverse-microbank structure of the heart simulation chip, which is an example of an organ simulation chip for evaluating the efficacy and toxicity of drugs provided by the present invention.
  • Figure 6 is an actual photograph of an organ simulation chip containing cardiomyocytes, which is an example of an organ simulation chip for evaluating the efficacy and toxicity of a drug provided by the present invention, and a portion showing the results of injecting food coloring into each channel inside the chip and the myocardium. This is an enlarged photo of the cell culture results.
  • Figure 7 is an example of an organ simulation chip for evaluating the efficacy and toxicity of a drug provided by the present invention, in which cardiomyocytes are cultured for 7 days in an organ simulation chip loaded with cardiomyocytes, and a control positive drug that changes myocardial rate is obtained.
  • This is a graph showing the results of comparing the change in heart rate of cardiomyocytes after treatment with isoproterenol with the control group.
  • Figure 8a is a control group that cultured myocardial cells for 7 days using the organ simulation chip of the present invention and was not treated with isoproterenol, a drug that changes myocardial rate, and measured myocardial heart rate, speed, or strength through a motion tracking program. It is a video-based myocardial motion tracking graph that observes changes in shape, etc.
  • Figure 8b shows myocardial cells were cultured for 7 days using the organ simulation chip of the present invention, treated with isoproterenol, a drug that changes myocardial rate, at a concentration of 5 ⁇ M, and 1 hour later, myocardial heart rate was measured through a motion tracking program. It is a video-based myocardial motion tracking graph that observes changes in number, speed or intensity, and shape.
  • Figure 9 is a photograph of an organ simulation chip manufactured while placed on a substrate equipped with MEAs arranged in a multi-array form, which matches the microstructure arrangement of the organ simulation chip (alignment).
  • Figure 10 shows that myocardial cells were cultured for 7 days on an organ simulation chip equipped with MEAs arranged in a multi-array form, treated with isoproterenol and nifedipine, which are control positive drugs that change the electrophysiological signals of myocardial cells, and then treated with 1.
  • This is a graph measuring the field potential after time.
  • One embodiment for achieving the object of the present invention described above is (a) a culture medium supply chamber; Culture recovery chamber; and a culture medium supply unit comprising a culture medium channel communicating with each chamber; (b) a cell inlet provided at one side; a residue outlet provided at another side; and a cell supply unit including a cell chamber provided between the cell inlet and the residue outlet, and extending in the same direction in contact with the culture medium channel; and, (c) an organ simulation comprising a reverse-microbank structure provided at a site selected from the group consisting of a junction between the culture channel and the cell chamber, a junction between the cell chamber and the residue outlet, and combinations thereof. Chips are provided.
  • the "reverse-microbank structure” provided in the present invention refers to a partial blocking member provided at the junction between the culture medium channel and the cell chamber or the junction between the cell chamber and the residue outlet, specifically, the culture medium channel and the cell chamber. It can be used as a partial blocking member in that it prevents the movement of cells and allows the movement of liquid components by blocking a part of the space at the junction or between the cell chamber and the residue outlet.
  • the junction between the culture channel and the cell chamber it extends in the same direction along the junction, its upper end is coupled to the upper end of the junction, and its lower end is provided to be spaced apart from the bottom of the junction, so that it is connected upside down to the ceiling. It was named “reverse-micro-weir structure” in the sense that it is a weir-shaped structure.
  • the reverse-microbank structure included in the organ simulation chip provided by the present invention is provided so that its upper end is coupled to the upper end of the junction, and its lower end is spaced apart from the bottom of the junction, so that it passes through the spaced region. It may be configured so that cells or hardened cells cannot pass through, but liquid components can pass through.
  • the form of the reverse-microbank structure is not particularly limited as long as it exhibits the above-described functionality, but may be a microbarrier structure with a rectangular or arc-shaped cross-section, which prevents cells from escaping outside the cell chamber and only allows the culture medium to flow. This is to allow it to pass.
  • the spacing of the spaced areas provided at the bottom is not particularly limited as long as cells are not allowed to pass through, but as an example, it may be 5 ⁇ m to 40 ⁇ m, and as another example, 7 ⁇ m to 20 ⁇ m It may be, and as another example, it may be 10 ⁇ m.
  • the gap between the spaced parts is smaller than 5 ⁇ m, the liquid component cannot pass between the bottom of the reverse-microbank structure and the bottom of the joint due to surface tension, and if the gap between the spaced parts is wider than 40 ⁇ m, Cells can move through the spaced apart areas.
  • the reverse-microbank structure provided at the junction between the culture medium channel and the cell chamber is provided to extend in the same direction along the junction and prevents the passage of cells through the spaced area at the bottom.
  • it can be configured to allow mutual distribution of the culture medium between the culture medium channel and the cell chamber.
  • the reverse-microdike structure provided at the junction between the cell chamber and the residue outlet is provided in the shape of an arc curved in the direction of the residue outlet, and is provided in the form of an arc curved in the direction of the residue outlet, and is provided at the junction of the cell chamber and the residue outlet. It may be configured to allow discharge of retentate from the cell chamber to the retentate outlet while preventing passage.
  • the reverse-microbank structure which is an improved partial blocking member described above, does not completely open the junction between the culture medium channel and the cell chamber, but partially opens the cell, just like the conventional micropillar structure. It has the same effect in that it plays a role in preventing the movement of .
  • the reverse-microbank structure included in the organ simulation chip provided by the present invention has a simple shape compared to the micropillar structure with an elaborate and complex shape, so the manufacturing cost of the mold used for manufacturing it can be reduced. It has the advantage of being able to improve the yield of results obtained from molds.
  • the conventional perimyocardial membrane-mimicking heart chip was constructed with a hydrogel channel to control the speed of medium flow from the medium channel toward the myocardial cell culture chamber.
  • This hydrogel was injected into the inlet and left in the incubator for more than 1 hour to form a hydrogel.
  • the cardiomyocyte mixture must be injected very slowly into the injection port of the cardiomyocyte cell chamber to prevent collapse of the hydrogel. Therefore, when injecting the cell mixture into the cell chamber, it takes a long time, about 3 hours or more in total, and this causes However, it has the disadvantage of increasing production costs and time.
  • the reverse-microbank structure provided in the present invention not only structurally does not allow cells to pass through, but is also designed to allow control of the speed of medium flow from the medium channel toward the cell culture chamber, and thus hydro Since there is no need to construct a gel channel, there is an advantage that it takes a significantly short time, about 1 to 10 minutes, to inject the cell mixture into the cell chamber.
  • the long-term simulation chip including the reverse-microbank structure provided by the present invention has the advantage of being able to further simplify the manufacturing process, resulting in improved productivity.
  • cardiomyocytes are injected into the organ simulation chip provided by the present invention and used in the form of a heart simulation chip, it is possible to obtain results with reduced deviation in experimental results compared to conventional perimyocardial membrane-imitating heart chips.
  • a number of conventional perimyocardial membrane-mimicking heart window chips were used to measure the heart rate of each cardiomyocyte included therein, the deviation of the heart rate measured by each perimyocardial membrane-mimicking heart window chip was confirmed to be about 15 bpm, whereas in the present invention, When multiple heart simulation chips made by injecting myocardial cells into the organ simulation chip provided are used to measure the heart rate of each heart muscle cell included, the deviation of the heart rate measured from each heart simulation chip is confirmed to be approximately 5 bpm. It has been done.
  • cardiomyocytes when cardiomyocytes are injected into the organ simulation chip provided by the present invention, the deviation in heart rate of myocardial cells is significantly reduced, and it can be used as a high-quality heart simulation chip with higher reproducibility. It has the advantage of being able to expect highly reliable results when evaluating drug efficacy or toxicity.
  • the organ simulation chip may be manufactured in a form placed on a slide glass or an upper part of a substrate provided with electrodes.
  • the organ simulating chip provided by the present invention may be manufactured to additionally include electrodes at its bottom, specifically at the bottom of the culture medium supply portion and the cell supply portion of the organ simulating chip.
  • the electrode provided at the bottom is not particularly limited thereto, but as an example, it may be included in the form of a microelectrode array (MEA) at the bottom of the entire organ simulation chip, and as another example, a reverse-microbank structure. It may be included in the form of a microelectrode array having an electrode pattern that matches.
  • MEA microelectrode array
  • the microelectrode array refers to an electrode manufactured in the form of an array of electrodes having a micro-level size. It is not particularly limited thereto, but is formed by forming a plurality of conductive metal electrodes in the form of an array on a transparent glass substrate through a semiconductor process. It can be produced by array.
  • the microelectrode array can be used to measure changes in electrophysiological signals such as action potential generated from various living cells such as cardiomyocytes and nerve cells.
  • an organ simulation chip manufactured in the form of being placed on the top of a substrate with electrodes at the bottom is used to analyze cells that generate electrophysiological signals.
  • the generated cells are not particularly limited thereto, but as an example, they may be nerve cells or cardiomyocytes, and as another example, they may be cardiomyocytes.
  • the organ simulation chip When cells of interest are cultured on the organ simulation chip provided by the present invention, cell culture is completed within about 7 days, and the characteristics of the cultured cells can be studied. For example, when culturing cardiomyocytes, the pulsation of the cardiomyocytes is confirmed at the time cell culture is completed, and the pulsation of the cardiomyocytes is maintained at a constant level until 7 days have elapsed after culture. Therefore, when the cardiomyocyte cells are cultured and a drug is administered to the culture medium supply chamber after the heartbeat of the cardiomyocyte cells begins, the electrophysiological signal of the cardiomyocyte cell may change due to the effect of the drug.
  • the effect of the drug on the cardiomyocytes can be evaluated. For example, if the heart rate of cardiomyocytes increases after administration of a drug, the drug can be evaluated to play a role as an inotropic or blood pressure enhancer that increases the heart rate in vivo. On the other hand, if the heart rate of myocardial cells decreases after administration of the drug, the drug can be evaluated to function as a blood pressure lowering agent that reduces the heart rate in vivo.
  • the material of the overall structure of the organ simulation chip provided by the present invention is not particularly limited as long as it does not inhibit or adversely affect the fixation and culture of cells, but as an example, polycaprolactone (PCL) , poly(dimethylsiloxane), PDMS, polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), polydioxanone (PDO), etc., and other examples. As such, it can be optically transparent, durable, bio-friendly, and flexible PDMS.
  • PCL polycaprolactone
  • PDA poly(dimethylsiloxane)
  • PDMS polylactic acid
  • PGA polyglycolic acid
  • PDO polydioxanone
  • the culture medium supply chamber included in the organ simulation chip provided by the present invention stores the culture medium for cell culture to be supplied to the cell chamber through a reverse-microbank structure, and serves to supply the stored culture medium to the cells through the culture medium channel. do.
  • the culture medium supply chamber may be used as a culture vessel for culturing hepatocytes.
  • the culture fluid recovery chamber included in the organ simulation chip provided by the present invention is a site where the culture fluid supplied from the culture fluid supply chamber is finally stored after passing through the culture fluid channel, and serves to recover contaminated culture fluid after cell culture. It is used to prevent contamination of the surrounding environment due to culture medium contaminated with various metabolites and waste products secreted from cells after culture.
  • the culture medium channel included in the organ simulation chip provided by the present invention serves as the main flow path for the culture medium through which the culture medium flows from the culture medium supply chamber to the culture medium recovery chamber. It supplies culture medium and recovers the culture medium used for cell culture.
  • the culture medium channel can be interpreted as a component that simulates capillaries for supplying nutrients to cells existing in a living body. Accordingly, the width of the culture medium channel is not particularly limited as long as it can simulate the function of capillaries, but as an example, it may have a width of 20 to 100 ⁇ m, and as another example, it may have a width of 25 to 60 ⁇ m. and, as another example, may have a width of 30 ⁇ m.
  • the cell inlet included in the organ simulation chip provided by the present invention serves to introduce a cell mixture to be supplied to the cell chamber.
  • the cell mixture may include cells and auxiliary components that assist in the distribution and fixation of the cells.
  • the organ simulation chip of the present invention includes cells that are aligned and fixed inside the cell chamber contained therein. In order for the cells to be injected into the cell chamber and the injected cells to be fixed inside the cell chamber, It requires auxiliary ingredients to assist with this.
  • the auxiliary component mimics the extracellular matrix (ECM) present in the microenvironment around cells, is essential for three-dimensional cell culture, and plays a role in maintaining the structure and function of cultured cells similar to those in vivo. It can be done.
  • the auxiliary ingredient is not particularly limited as long as it can assist in the influx and fixation of cells, but as an example, hydrogel can be used, and as another example, collagen hydrogel, alginate hydrogel, and GelMa hydrogel. Gels, etc. can be used.
  • the hydrogel is mixed with cells, assists in three-dimensional culture of cells, and additionally provides fluidity to the cells, allowing the cells to move from the cell inlet to the cell chamber. In addition, the hydrogel can be cured under various conditions.
  • collagen hydrogel can be cured by inducing a temperature increase by placing it in an incubator for more than 1 hour, and alginate hydrogel can be cured by replacing the medium in the culture channel. It can be hardened by injecting CaCl 2 solution, and Zelma hydrogel can be hardened by irradiating ultraviolet rays. After the cell mixture is moved to the cell chamber and the hydrogel contained therein is hardened, the cells contained within the cured hydrogel can be naturally fixed. Due to the inherent porous characteristics of the hydrogel, External culture medium can be delivered to the cells, thereby assisting in the culture of fixed cells.
  • the cell chamber included in the organ simulation chip provided by the present invention not only stores and fixes the cell mixture supplied through the cell inlet, but also functions as a culture vessel for culturing the fixed cells. there is.
  • the cell chamber can be interpreted as a component that simulates the microstructure of cells existing in vivo.
  • the width of the cell chamber is not particularly limited as long as it can perform fixation and culture of cardiomyocytes, but as an example, it may have a width of 20 to 2000 ⁇ m, and as another example, it may have a width of 100 to 1000 ⁇ m. It may have a width of, and as another example, it may have a width of 600 ⁇ m.
  • the cell chamber may be in the form of a passage communicating between the cell inlet and the retentate outlet, wherein the portion communicating with the retentate outlet is provided with a reverse-microbank structure inside, and thus, through the cell inlet. Cells included in the supplied cell mixture do not move to the residue outlet but remain in the cell chamber.
  • the cells that can be injected into the cell chamber are not particularly limited, but examples include cardiomyocytes, smooth muscle cells, rhabdoid cells, kidney cells, hepatocytes, epithelial cells, nerve cells, stem cells, vascular endothelial cells, and scalp. It may be a cell selected from the group consisting of cells, spleen cells, lung cells, oral cells, skin cells, hair follicle cells, brain cells, spinal cord cells, and combinations thereof, and as another example, it may be cardiomyocytes.
  • the residue outlet included in the organ simulation chip provided by the present invention can serve to discharge contaminants such as metabolites or waste products produced from cells while culturing cells fixed in the cell chamber to the outside.
  • the role of discharging contaminants can be performed not only by the residue outlet but also by the cell inlet.
  • the cell inlet which has completed its role of introducing cells into the cell chamber, may also serve to discharge contaminants generated while culturing cells fixed in the cell chamber to the outside.
  • the shape of the residue outlet is not particularly limited as long as it can discharge contaminants such as various metabolites and waste products secreted from cells included in the cell mixture to the outside, similar to the culture medium recovery chamber described above. However, in order to prevent contamination of the cell surrounding environment due to the contaminants, it may be configured in a form that can be combined with a nozzle of a tube or syringe.
  • the organ simulating chip provided by the present invention basically includes at least one culture medium supply unit and one cell supply unit, but depending on the purpose of using the organ simulating chip, it may also include a plurality of culture medium supply units and cell supply units.
  • it may include a plurality of culture medium supply units and one cell supply unit, one culture medium supply unit and a plurality of cell supply units, or a plurality of culture medium supply units and a plurality of cell supply units.
  • each culture medium supply unit when it includes a plurality of culture medium supply units and one cell supply unit, as an example, it may be in the form of each culture medium supply unit being provided on both sides of the cell supply unit.
  • the reverse-microbank structure is It is formed between a plurality of culture channels and one cell chamber, and in order to exclude interference between each culture channel, each culture channel may be configured not to be adjacent, or may be configured to be completely isolated from each other even if adjacent.
  • each of the above The cell supply unit may be connected using a reverse-microbank structure, and may be configured to allow the culture medium to be distributed through the connection portion of this reverse-microbank structure.
  • the organ simulation chip includes two culture medium supply chambers; two culture recovery chambers; Two culture channels; One cell inlet; One residue outlet; One cell chamber adjacent to the culture medium channel; and a reverse-microbank structure provided at the junction between the cell chamber and the culture medium channel and at the junction between the cell chamber and the residue outlet.
  • the organ simulation chip (2) provided by the present invention is in the form of a structure provided on a slide glass (1), centered on a myocardial cell supply section consisting of a cell inlet (5), a residue outlet (6), and a cell chamber (8).
  • a myocardial cell supply section consisting of a cell inlet (5), a residue outlet (6), and a cell chamber (8).
  • two sets of culture medium supply units consisting of a culture medium supply chamber (3), a culture medium recovery chamber (4), and a culture medium channel (7) are provided on each side.
  • the cell chamber (8) and the culture medium channel (7) are each distinguished by a reverse-microbank structure (9) provided at their junction, and the junction between the cell chamber (8) and the residue outlet (6) is A reverse-micro-dike structure (10) is also provided.
  • Another embodiment for achieving the object of the present invention described above provides a method for evaluating the efficacy of a drug on cells using the organ simulation chip.
  • One method for evaluating the efficacy of a drug on cells includes the steps of (a) culturing cells included in a cell chamber included in the organ simulating chip; (b) administering the desired drug to the culture medium supply chamber included in the organ simulation chip; and, (c) measuring changes in the cultured cells.
  • the change in the cell is not particularly limited, but as an example, whether the cultured cell is damaged, whether it grows, whether secretion components change, whether the gene expression level changes, whether the protein level changes, and combinations thereof. It may be selected from the group consisting of, and as another example, the change in the cells may be a change in the heart rate of the cardiomyocytes in the case of cultured cardiomyocytes.
  • Another method of evaluating the efficacy of a drug on cells includes the steps of (a) culturing hepatocytes in a culture medium supply chamber included in the organ simulation chip; (b) cultivating cells contained in a cell chamber contained in the organ simulation chip; (c) administering the desired drug to the culture medium supply chamber containing the cultured hepatocytes; and, (d) measuring changes in the cultured cells.
  • the pulsation of the cardiomyocytes is confirmed about 1 to 2 days after culture, and the pulsation of these cardiomyocytes is stabilized and 7 days after culture. It remains at a constant level until after work has elapsed. Therefore, if the cardiomyocytes are cultured and a drug is administered to the culture medium supply chamber after the cardiomyocytes start beating, a change in the heart rate of the cardiomyocytes can be observed due to the effect of the drug. Therefore, by measuring the heart rate of the cardiomyocytes, the effect of the drug on the cardiomyocytes can be evaluated.
  • Another embodiment for achieving the object of the present invention described above provides a method for evaluating the toxicity of a drug on cells using the organ simulation chip.
  • One method of evaluating the toxicity of a drug on cells includes the steps of (a) culturing cells included in a cell chamber included in the organ simulating chip; (b) administering the desired drug to the culture medium supply chamber included in the organ simulation chip; And, (c) checking whether the cultured cells are dead or weakened.
  • Another method of evaluating the toxicity of a drug on cells includes the steps of (a) culturing hepatocytes in a culture medium supply chamber included in the organ simulation chip; (b) cultivating cells contained in a cell chamber contained in the organ simulation chip; (c) administering the desired drug to the culture medium supply chamber containing the cultured hepatocytes; and, (d) confirming whether the cultured cells are dead or weakened.
  • Another embodiment for achieving the above-described object of the present invention provides the use of an organ simulating chip to evaluate the efficacy of a drug on cells.
  • Example 1 Fabrication of a reverse-microbank structure long-term simulation chip
  • the organ simulation chip of the present invention was manufactured using PDMS (polydimethylsiloxane) elastomer and slide glass.
  • PDMS silicone base elastomer and curing agent (SYLGARD 184 silicone elastomer kit, Dow Corning) were mixed at a ratio of 10:1 on the mold on which photoresist patterning (PR patterning) was completed, and then placed in a plasma processor. Air bubbles generated during mixing were removed using a vacuum system (system, CUTE, FEMTO Science). Afterwards, the mixture was poured onto the SU-8 mold and solidified by heat treatment for 10 hours on a hot plate at 80°C.
  • the inlet and outlet of the cell and hydrogel mixture and the medium storage and inlet and outlet are respectively cut.
  • a microfluidic device was manufactured by punching out to size.
  • the fabricated microfluidic device was cleaned by sonication by immersing the PDMS-based microfluidic device in a sonicator containing isopropyl alcohol, and then using an air gun. completely dried.
  • the washed PDMS-based microfluidic device and slide glass were dried in a dry oven at 80°C for 10 minutes and then sterilized by exposure to ultraviolet light for 30 minutes. Finally, the PDMS-based microfluidic device and the slide glass were placed in a plasma processor and bonded through oxygen plasma treatment to produce an organ simulation chip.
  • the manufactured organ simulating chip was placed in a 35 mm Petri dish, and heat was applied on a hot plate heated to 80°C for 30 minutes to strengthen the adhesion by plasma treatment.
  • the overall size of the organ simulation chip manufactured as above is 2.7 cm wide and 2 cm high, and the height of all channel microstructures in the chip is 50 ⁇ m, and the height except for the inverted micro-bank structure is 5 ⁇ m.
  • the width of the cell channel is 600 ⁇ m, which is about three times the diameter of the myocardial bundle in vivo, which is about 200 ⁇ m.
  • the width of the culture medium channel is 30 ⁇ m, which is about three times the diameter of the capillaries in vivo (about 10 ⁇ m). By placing them at the outermost sides of the cell channel at the center, the capillary network located between the myocardial fibers in vivo is created. Designed to imitate.
  • the reverse-microdike structure located in the direction of the residue outlet of the cell channel has a thickness of 60 ⁇ m and is located in an arc shape in the direction of the outlet just before the width of the cell channel narrows, so that the injected cell-hydrogel mixture flows toward the residue outlet. It was designed to encourage accumulation rather than discharge, and ensured smooth injection and allowed only the pressure generated during injection to escape through the residue outlet.
  • the reverse-microbank structure provided at the junction of the cell channel and the culture medium channel was designed in a rectangular shape with a thickness of 100 ⁇ m, and similarly, it was designed so that the cell-hydrogel mixture was accumulated rather than escaping to the outside of the cell channel.
  • the diameter of each inlet and outlet connected to the cell channel was 1.5 mm, and the diameter of the culture medium channel connected to the culture medium supply chamber and recovery chamber was set to 8 mm.
  • Example 2 Production of an organ simulation chip containing cardiomyocytes
  • Cardiomyocytes (Cardiosight-S) differentiated from NEXEL's human stem cells (hPSCs) are mixed with a hydrogel such as collagen, and then injected into the organ simulation chip of the present invention manufactured in Example 1 above. and cultured for 7 days with Cardiosight-S Media supplemented with Supplement (75X). Additionally, cells were cultured in a humidified incubator at 37°C and 5% CO2.
  • Example 3 Evaluation of drug efficacy and toxicity using an organ simulator chip containing reverse-microdam structure and cardiomyocytes
  • Example 3-1 Functional evaluation of organ simulation chip
  • the red and yellow food coloring Approximately, set the red and yellow food coloring to an appropriate concentration and viscosity, load 200 ⁇ l of the red food coloring solution into the culture medium supply chamber and the recovery chamber, respectively, and use a pipette to add the red food coloring solution to the inside of the culture medium channels located on both sides. After filling the color solution, 200 ⁇ l was loaded into each of the remaining sets of culture solution supply chambers and recovery chambers to connect the flow of the red dye solution between each chamber. Afterwards, the yellow food coloring solution was injected into the cell channel at a rate of 20 ⁇ l/min using a syringe pump (NE-1000, NEWERA) (FIG. 6).
  • a syringe pump NE-1000, NEWERA
  • Figure 6 is an actual photograph of an organ simulation chip containing cardiomyocytes, which is an example of an organ simulation chip for evaluating the efficacy and toxicity of a drug provided by the present invention, and a portion showing the results of injecting food coloring into each channel inside the chip and the myocardium. This is an enlarged photo of the cell culture results.
  • Example 3-2 Evaluation of cell culture and production productivity using an organ simulation chip
  • the organ simulating chip manufactured in this way reduces the time required for the myocardial cell mixture injection process compared to the conventional perimyocardial membrane simulating heart chip. Specifically, when injecting a cardiomyocyte mixture into the cell chamber of a conventional perimyocardial membrane-mimicking heart chip, it took about 3 hours per chip, whereas when injecting the myocardial cell mixture into the cell chamber of a previously manufactured organ simulating chip, it took about 3 hours per chip. It was confirmed that it took about 5 minutes per chip.
  • the hydrogel contained in the injected cardiomyocyte mixture was hardened to fix the cardiomyocytes within the myocardial cell channel.
  • Hardening is performed using different hardening methods depending on the type of hydrogel. In the case of collagen, hardening was performed by temperature changes by leaving it in an incubator for more than 1 hour, and then myocardial cells were continuously cultured in the incubator. By loading 200 ⁇ l of culture medium into both the culture medium supply chamber and the recovery chamber until the 2nd day of culture, the flow of medium was minimized to give cardiomyocytes time to adapt to the environment within the organ simulation chip, and then the culture medium was supplied until the 7th day of culture.
  • culture medium 200 ⁇ l of culture medium was loaded into the chamber, and 125 ⁇ l of culture medium was loaded into the culture medium recovery chamber, creating a difference in the height of the medium to induce medium flow by gravity.
  • the culture medium was replaced with fresh culture medium every day to provide continuous medium flow and fresh nutrients.
  • the existing culture medium in each culture medium supply chamber and recovery chamber was removed to remove waste products.
  • the beating of cardiomyocytes in the organ simulation chip begins to occur as early as 1 to 2 days of culture, and as the culture time passes, the myocardial rate increases, and based on the myocardial beats per minute (BPM), The culture period before drug efficacy and toxicity evaluation was set to 7 days in accordance with the optimal myocardial rate.
  • Example 3-3 Evaluation of drug efficacy and toxicity
  • Example 3-2 the culture medium supply chamber of the organ simulation chip of the present invention was treated with isoproterenol, a drug known to affect myocardial rate, and the resulting change in myocardial cell rate was measured optically. Observed under a microscope, the heart rate and beat interval of cardiomyocytes were measured and then analyzed ( Figure 7).
  • Figure 7 is an example of an organ simulation chip for evaluating the efficacy and toxicity of a drug provided by the present invention, in which cardiomyocytes are cultured for 7 days in an organ simulation chip loaded with cardiomyocytes, and a control positive drug that changes myocardial rate is obtained.
  • This is a graph showing the results of comparing the change in heart rate of cardiomyocytes after treatment with isoproterenol with the control group.
  • the myocardial beats per minute (bpm) before isoproterenol treatment was approximately 60, indicating a normal pulse state.
  • the concentration of the drug was treated at 5 ⁇ M, and when observed at 1-hour intervals for up to 6 hours and then at 3-hour intervals for a total of 12 hours, the overall trend was that the heart rate increased after drug treatment and the highest heart rate was at 1 hour after treatment. Afterwards, it was observed that the heart rate decreased as time passed. In contrast, the control group was confirmed to maintain a constant heart rate of around 60 beats per minute during the 12-hour observation period specified above.
  • the myocardial cell rate increases due to the efficacy of isoproterenol, but when the drug treatment time is prolonged after recording the maximum myocardial rate, the myocardial rate decreases due to a decrease in cell function due to the toxicity of the drug. It was confirmed that the efficacy and toxicity of the drug were observed.
  • Figure 8a shows the number, speed, or number of myocardial beats in a control group that was cultured for 7 days using the organ simulation chip of the present invention and not treated with isoproterenol, a drug that changes myocardial rate, through a motion tracking program. It is a video-based myocardial motion tracking graph that observes changes in intensity and shape, etc., and Figure 8b shows myocardial cells were cultured for 7 days using the organ simulation chip of the present invention and isoproterenol, a drug that changes myocardial rate, was added. This is a video-based myocardial motion tracking graph that observed changes in myocardial beat rate, speed or strength, and shape through a motion tracking program 1 hour after treatment at a concentration of 5 ⁇ M.
  • the myocardial heart rate was recorded at about 140 bpm, and it was confirmed that it was beating at regular intervals. It was also confirmed that the heart rate increased due to drug treatment.
  • the speed or intensity of the beat appears to be maintained at a relatively similar level, although the difference between each beat becomes larger, and the average contraction and relaxation beats are recorded at about 11 ⁇ m/s. By doing so, it was confirmed that it increased compared to the average of the control group, about 7 ⁇ m/s.
  • Example 4 Fabrication of an organ simulating chip using a substrate equipped with electrodes and evaluation of drug efficacy and toxicity
  • Example 4-1 Fabrication of an organ simulation chip using a substrate provided with electrodes
  • An organ simulation chip placed on a substrate with electrodes was produced using the method of Example 1, except that a substrate with electrodes was used instead of a slide glass (FIG. 9).
  • Figure 9 is a photograph of an organ simulation chip manufactured while placed on a substrate equipped with MEAs arranged in a multi-array form, which matches the microstructure arrangement of the organ simulation chip (alignment).
  • cardiomyocytes When cardiomyocytes are cultured in the cell chamber of the organ simulation chip manufactured in the form of FIG. 9, electrophysiological signals transmitted through electrodes provided on the substrate are analyzed to determine the myocardial rate due to the drug treated on the myocardial cells. It is possible to comprehensively and accurately analyze various physiological changes, including
  • Example 4-2 Evaluation of drug efficacy and toxicity using an organ simulating chip containing a substrate equipped with electrodes
  • Figure 10 shows that myocardial cells were cultured for 7 days on an organ simulation chip equipped with MEAs arranged in a multi-array form, treated with isoproterenol and nifedipine, which are control positive drugs that change the electrophysiological signals of myocardial cells, and then treated with 1.
  • This is a graph measuring the magnetic field potential after time.
  • the T-wave amplitude significantly increased compared to the negative control group under the condition treated with 5 ⁇ M isoproterenol, and decreased compared to the negative control group under the condition treated with 20 nM nifedipine. Confirmed.
  • the QT time was reduced in both drug groups, and unlike isoproterenol, nifedipine is a non-QT prolonging drug, so it was confirmed that the drug's characteristics are accurately reflected in actual clinical trials, with the QT time not being prolonged even as the beat interval increases. .
  • Reverse-microbank structure located at the junction of the cell chamber and the retentate outlet.

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Abstract

본 발명은 역-미세둑 구조가 포함된 장기모사칩 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 장기모사칩을 사용하면, 기존 2차원 in-vitro 세포 배양법의 인체 미세환경을 모방하지 못하는 한계점과 동물실험의 이종간의 차이에 따른 부정확성을 극복할 수 있고, 약물처리에 따른 세포에 대한 보다 정확한 효능 및 독성결과를 도출할 수 있다. 이에 따라, 동물실험 대체 시험법으로 이용함으로써 신약 개발 및 약물 스크리닝 시 필요한 비용 및 기간을 획기적으로 감소시킬 뿐 아니라 세포 미세환경 연구 및 다른 장기칩(organ-on-a-chip)의 연구, 신약 개발, 약물 대사 기전 연구 등에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

역-미세둑 구조가 포함된 장기모사칩 및 이의 용도
본 발명은 역-미세둑 구조가 포함된 장기모사칩 및 이의 용도에 관한 것이다.
약물 개발은 많은 시간과 노력을 필요로 하고 비용이 많이 들지만, 개발이 진행된 약들 중 극소수만이 승인을 받는다. 단일 의약품에 대한 규제 승인을 달성하기 위해선 약 25억 달러 이상의 엄청난 고비용과 10-15년 정도의 장 시간이 요구 된다. 이를 극복하기 위해, 많은 동물 또는 세포 기반 실험이 약물 개발의 초기 단계에서 일반적으로 수행되어 왔다.
동물에 기반한 실험은 고비용이고 장 시간이 필요하고 윤리적인 문제에서도 자유로울 수 없었으며, 인간과 다른 이온채널의 존재, 약동학적 차이 등 종간 차이(inter-species differences)라는 한계점을 지니고 있어 동물실험 결과가 인간에게 똑같이 적용되지 않는 경우가 많고, 동물실험을 거쳐 임상실험을 통과한다고 하더라도 부작용으로 다시 퇴출되는 경우가 있는 실정이다. 세포 기반 실험에서 세포는 보통 2차원 조건에서 배양된다. 이러한 2차원 세포 배양 모델은 취급의 용이성과 높은 처리량 면에서 장점이 있지만, 2차원 배양 과정에서 세포가 고유의 기능을 상실하여 잘못된 평가 결과가 나오기 때문에 이를 이용한 약물 효능 및 독성평가에는 한계가 있다. 인체 장기에서 세포는 세포외기질(ECM, Extracellular Matrix)과 함께 3차원 구조 환경에 있고 모세혈관에서 영양소와 산소를 확산으로 계속 공급받고 그 후 생성된 노폐물과 대사산물 그리고 이산화탄소를 혈관을 통해 확산 배출 시킨다. 따라서 실제 장기의 구조적, 생리적, 환경적 특성을 반영하는 효율적인 약물 효능 및 독성평가 플랫폼이 필요하다(Anurag Mathur, et al., Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications, SCIENTIFIC REPORTS, 5:8883, 2015).
생체모사칩 또는 장기모사칩(organ-on-a-chip; OoC)는 인체 특정 장기의 내부 미세환경(microenvironment) 구조를 모방하여 마이크로챔버에 해당 장기를 구성하는 세포를 배양함으로써 그 특성을 구현하는 시스템이다. 따라서 장기모사칩은 이러한 동물실험의 한계점들을 극복할 수 있는 효과적인 대안이며, 조직 또는 장기 수준의 생리활성을 구현함으로써 전 임상 신약개발 플랫폼으로 기대되고 있다. 심장모사칩을 사용하는 연구는 주로 심근 모델링에 초점을 맞추고 있으며, 몇몇 연구그룹들은 심장 구조와 미세환경을 모방하여 심장 모사칩을 제작하였다. 이에 대한 국내 선행연구는 미비한 실정이며, 국외 선행연구에서 본 발명과 유사하며 가장 최근 발표된 심장모사칩 연구인 2015년에 발표된 A. Mathur et al., 그룹의 연구는 미세구조를 가진 칩에 심장 근육세포를 주입하여 약물 효능 및 독성평가를 진행한 유의적인 연구임에 불구하고, 세포외기질의 부재 등 심근세포의 주변 미세환경을 완벽하게 구현했다고는 보기 어렵다.
이에, 실제로 생체내 장기와 동일한 환경 및 기능을 모사할 수 있는 생체모사칩 또는 장기모사칩의 개발의 필요성이 대두되고 있다.
본 발명의 주된 목적은 세포에 배양액을 공급하기 위한 배양액 공급부와 고정된 세포를 포함하는 세포 공급부 및 이들 사이에 구비된 역-미세둑 구조를 포함하는 약물의 효능 및 독성 평가용 인체 장기모사칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 장기모사칩을 이용하여 세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 장기모사칩을 이용하여 세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포에 미치는 약물의 효능을 평가하기 위한 장기모사칩의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 장기모사칩을 사용하면, 약물처리에 따른 세포에 대한 보다 정확한 효능 및 독성결과를 도출할 수 있다. 이에 따라, 동물실험 대체 시험법으로 이용함으로써 신약 개발 및 약물 스크리닝 시 필요한 비용 및 기간을 획기적으로 감소시킬 뿐 아니라 세포 내 미세환경 연구 및 다른 장기칩(organ-on-a-chip)의 연구 등에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 장기모사칩의 일 예인 심장모사칩의 입체도와 미세구조도 및 칩 내 구성요소가 포함된 전체 모식도이다.
도 2는 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 장기모사칩의 일 예인 심장모사칩의 입체도이다.
도 3은 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 장기모사칩의 일 예인 심장모사칩의 평면도이다.
도 4는 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 장기모사칩의 일 실시예의 하나인 심근세포가 포함된 장기모사칩의 세포 챔버와 배양액 채널의 부분 확대도이다.
도 5는 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 장기모사칩의 일 예인 심장모사칩의 역-미세둑 구조의 부분 확대도이다.
도 6은 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 장기모사칩의 일 예인 심근세포가 포함된 장기모사칩의 실제 사진과 칩 내부의 각 채널 내로 식용 색소를 주입한 결과를 나타내는 부분 및 심근세포 배양 결과의 확대사진이다.
도 7은 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 장기모사칩의 일 실시예인 심근세포가 로딩된 장기모사칩에서 심근세포를 7일 동안 배양하고, 심근박동수의 변화를 주는 대조양성약물인 이소프로테레놀을 처리한 다음, 심근세포의 박동수의 변화를 대조군과 비교 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 본 발명의 장기모사칩을 이용하여 심근세포를 7일 동안 배양하고 심근박동수의 변화를 주는 약물인 이소프로테레놀을 처리하지 않은 대조군을 motion tracking program을 통해 심근박동 수, 빠르기 혹은 세기, 형태의 변화 등을 관찰한 비디오 기반 심근 모션 추적 그래프이다.
도 8b는 본 발명의 장기모사칩을 이용하여 심근세포를 7일 동안 배양하고 심근박동수의 변화를 주는 약물인 이소프로테레놀을 5 μM 농도로 처리한 후 1시간 뒤에 motion tracking program을 통해 심근박동 수, 빠르기 혹은 세기, 형태의 변화 등을 관찰한 비디오 기반 심근 모션 추적 그래프이다.
도 9는 본 장기모사칩의 미세구조 배치와 일치하는 (alignment) 멀티어레이 형태로 배열된 MEA가 구비된 기판에 안치된 상태로 제작된 장기모사칩의 사진이다.
도 10은 멀티어레이 형태로 배열된 MEA가 구비된 장기모사칩에서 심근세포를 7일 동안 배양하고 심근세포의 전기생리신호의 변화를 주는 대조양성약물인 이소프로테레놀 및 니페디핀을 처리한 다음 1시간 후에 자기장전위(field potential)를 측정한 그래프이다.
상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태는 (a) 배양액 공급 챔버; 배양액 회수 챔버; 및, 상기 각 챔버와 연통하는 배양액 채널;을 포함하는 배양액 공급부; (b) 일 측단에 구비된 세포 유입구; 다른 일 측단에 구비된 잔류물 유출구; 및, 상기 세포 유입구와 잔류물 유출구 사이에 구비되고, 상기 배양액 채널과 연접하여 동일한 방향으로 연장된 세포 챔버;를 포함하는 세포 공급부; 및, (c) 상기 배양액 채널과 세포 챔버의 연접부, 상기 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 부위에 구비된 역-미세둑 구조를 포함하는, 장기모사칩을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 "역-미세둑 구조"란, 배양액 채널과 세포 챔버의 연접부 또는 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부에 구비된 부분 차단부재를 의미하는데, 구체적으로, 배양액 채널과 세포 챔버의 연접부 또는 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부의 일부 공간을 차단하여 세포의 이동은 방지하면서 액상성분의 이동을 허용한다는 점에서 부분 차단부재로 사용될 수 있다. 또한, 배양액 채널과 세포 챔버의 연접부의 경우 상기 연접부를 따라 동일한 방향으로 연장되고, 그의 상단이 연접부의 상단과 결합되고, 그의 하단이 연접부의 바닥과 이격되도록 구비된 형태이므로, 거꾸로 천정부위에 결합된 둑(weir) 형태의 구조물이라는 의미에서 "역-미세둑 구조"라 명명하였다.
앞서 정의한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 장기모사칩에 포함된 역-미세둑 구조는 그의 상단이 연접부의 상단과 결합되고, 그의 하단이 연접부의 바닥과 이격되도록 구비되어, 상기 이격된 부위를 통해 세포 또는 경화된 세포는 통과하지 못하고, 액상성분은 통과할 수 있도록 구성될 수 있다.
상기 역-미세둑 구조의 형태는 상술한 기능성을 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나 단면이 직방형 또는 호의 형태를 갖는 미세 장벽 구조가 될 수 있는데, 이는 세포가 세포 챔버 외부로 빠져나가지 않고, 배양액만 통과하게 하기 위함이다. 또한, 하단에 구비된 이격된 부위의 간격은 세포의 통과가 허용되지 않는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 5 ㎛ 내지 40 ㎛가 될 수 있고, 다른 예로서, 7 ㎛ 내지 20 ㎛가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 10 ㎛가 될 수 있다.
상기 이격된 부위의 간격이 5 ㎛ 보다 작은 경우에는 표면장력에 의해 역-미세둑 구조의 하단과 연접부의 바닥사이로 액상성분이 통과할 수 없고, 상기 이격된 부위의 간격이 40 ㎛ 보다 넓은 경우에는 상기 이격된 부위를 통해 세포가 이동할 수 있다.
또한, 상기 역-미세둑 구조 중에서, 배양액 채널과 세포 챔버의 연접부에 구비된 역-미세둑 구조는 상기 연접부를 따라 동일한 방향으로 연장되도록 구비되고, 하단의 이격부위를 통해 세포의 통과를 방지하면서도, 배양액 채널과 세포 챔버간에 배양액의 상호유통을 허용하도록 구성될 수 있다.
아울러, 상기 역-미세둑 구조 중에서, 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부에 구비된 역-미세둑 구조는 상기 잔류물 유출구 방향으로 굽어진 호의 형태로 구비되고, 하단의 이격부위를 통해 세포의 통과를 방지하면서도, 세포 챔버로부터 잔류물 유출구로의 잔류물 배출을 허용하도록 구성될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 장기모사칩에 있어서, 앞서 설명한 개량된 부분 차단부재인 역-미세둑 구조는 종래의 미세 기둥 구조물과 동일하게 배양액 채널과 세포 챔버의 연접부를 완전히 개통하지 않고 부분적으로 개통하여 세포의 이동을 방지하는 역할을 수행한다는 점에서 동일한 효과를 나타낸다.
다만, 본 발명에서 제공하는 장기모사칩에 포함된 역-미세둑 구조는 정교하고 복잡한 형태를 갖는 미세 기둥 구조물에 비하여, 단순한 형태를 나타내므로, 이의 제조에 사용되는 주형의 제작비용을 절감할 수 있고, 주형으로부터 얻어진 결과물의 수율을 향상시킬 수 있다는 장점이 있다.
또한, 종래의 심근주막 모방 심장칩에는 배지 채널에서 심근세포 배양챔버 방향으로 배지 흐름의 속도 조절을 위해 하이드로젤 채널을 구성했는데, 이 하이드로젤을 유입구에 주입한 후 인큐베이터 내에 1시간 이상 두어 하이드로젤을 경화 시켜야 할 뿐만 아니라, 하이드로젤의 붕괴를 막기 위해 심근세포 챔버 주입구에 심근세포 혼합물 아주 천천히 주입하여야 하므로, 상기 세포 챔버에 세포 혼합물을 주입할 경우 약 총 3시간 이상의 장시간이 소요되고, 이로 인하여, 생산비용과 시간이 증가된다는 단점이 있다.
이에 반하여, 본 발명에서 제공하는 역-미세둑 구조는 구조적으로 세포가 통과할 수 없을 뿐만 아니라, 이 구조에 의해 배지 채널에서 세포 배양챔버 방향으로 배지 흐름의 속도 조절이 가능하도록 설계되었기 때문에, 하이드로젤 채널을 구축할 필요가 없어서 상기 세포 챔버에 세포 혼합물을 주입하는데 1 내지 10분 정도의 현저히 짧은 시간이 소요된다는 장점이 있다.
이로부터, 본 발명에서 제공하는 역-미세둑 구조를 포함하는 장기모사칩은 제조공정을 보다 단순화 시킬 수 있어, 이에 의한 생산성 향상효과를 나타낼 수 있다는 장점이 있다.
끝으로, 본 발명에서 제공하는 제공하는 장기모사칩에 심근세포를 주입하여 심장모사칩의 형태로 사용할 경우, 종래의 심근주막 모방 심장칩보다도 실험결과의 편차가 감소된 결과를 얻을 수 있다. 구체적으로, 다수의 종래의 심근주막 모방 심창칩을 사용하여 이에 포함된 심근세포의 박동수를 각각 측정하면, 각 심근주막 모방 심창칩에서 측정된 박동수의 편차는 약 15bpm으로 확인된 반면, 본 발명에서 제공하는 제공하는 장기모사칩에 심근세포를 주입하여 제작된 다수의 심장모사칩을 사용하여 이에 포함된 심근세포의 박동수를 각각 측정하면, 각 심장모사칩에서 측정된 박동수의 편차는 약 5bpm으로 확인되었다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 제공하는 장기모사칩에 심근세포를 주입할 경우, 심근세포 박동수의 편차를 현저히 감소시켜서, 보다 재현성이 높은 고품질의 심장모사칩으로 활용할 수 있고, 이러한 심장모사칩을 이용한 약물효능 평가 또는 독성평가시에 신뢰도가 높은 결과를 기대할 수 있다는 장점이 있다.
한편, 본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 장기모사칩은 슬라이드 글라스 또는 전극이 구비된 기판의 상부에 안치된 형태로 제작될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 장기모사칩은 그의 하단, 구체적으로 상기 장기모사칩의 배양액 공급부와 세포 공급부의 하단에 전극을 추가로 포함하도록 제작될 수 있다. 이처럼, 하단에 구비된 전극은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 장기모사칩 전체의 하단에 미세전극배열체 (Microelectrode array, MEA) 형태로 포함될 수 있고, 다른 예로서, 역-미세둑 구조와 합치되는 전극패턴을 갖는 미세전극배열체의 형태로 포함될 수 있다.
상기 미세전극배열체(MEA)는 마이크로 수준의 크기를 갖는 전극들이 어레이 형태로 제작된 전극을 의미하는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 반도체공정에 의해 투명한 유리기판 위에 다수의 전도성 금속 전극을 어레이 형태로 배열하여 제작할 수 있다. 상기 미세전극배열체는 심근세포, 신경세포 등의 다양한 생체유래 세포들로부터 발생된 활동전위(Action potential)와 같은 전기생리신호 변화를 측정하는데 사용될 수 있다.
이처럼, 하단에 전극이 구비된 기판의 상부에 안치된 형태로 제작된 장기모사칩은 전기생리학적인 신호가 발생되는 세포의 분석에 사용될 경우, 더욱 효과적인 분석결과를 얻을 수 있는데, 전기생리학적인 신호가 발생되는 세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 신경세포 또는 심근세포가 될 수 있고, 다른 예로서, 심근세포가 될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 장기모사칩에 목적하는 세포를 배양하게 되면, 약 7일 이내에 세포배양이 종료되고, 배양된 세포의 특징을 연구할 수 있다. 예시적으로, 심근세포를 배양할 경우, 세포배양이 완료된 시점에서 심근세포의 박동이 확인되며, 이러한 심근세포의 박동은 배양 후 7일이 경과될 때까지 일정한 수준으로 유지된다. 따라서, 상기 심근세포를 배양하여, 심근세포의 박동이 시작된 후, 배양액 공급 챔버에 약물을 투여하면, 상기 약물의 효과에 의하여 심근세포의 전기생리학적 신호가 변화될 수 있는데, 상기 전기생리학적 신호는 심근세포 특이적인 신호라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 심근박동의 횟수, 심근박동의 빠르기 혹은 세기, 심근박동의 형태 변화, T 파형의 진폭크기, QT 파형변화 등이 될 수 있다.
따라서, 상기 심근세포의 박동수를 측정하여, 상기 약물이 심근세포에 미치는 효과를 평가할 수 있다. 예를 들어, 약물의 투여 후, 심근세포의 박동수가 증가되면, 상기 약물은 생체 내에서 심장의 박동을 증가시키는 강심제 또는 혈압강화제로서의 역할을 수행할 것으로 평가할 수 있다. 이에 반하여, 약물을 투여한 후, 심근세포의 박동수가 감소되면, 상기 약물은 생체 내에서 심장의 박동을 감소시키는 혈압저하제로서의 역할을 수행할 것으로 평가할 수 있다.
한편, 본 발명에서 제공하는 장기모사칩의 전체적인 구조물의 재질은 세포의 고정 및 배양을 저해하거나 좋지않은 영향을 미치지 않는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS), 폴리락틱산(polylactic acid, PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리디옥사논(polydioxanone, PDO) 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 광학적으로 투명하고, 내구성이 강하며, 생물 친화적이고, 유연한 PDMS 등이 될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 장기모사칩에 포함된 배양액 공급 챔버는 역-미세둑 구조를 통해 세포 챔버에 공급하기 위한 세포 배양용 배양액을 저장하고, 저장된 배양액을 배양액 채널을 통해 세포에 공급하는 역할을 수행한다. 아울러, 약물의 독성을 평가하기 위하여, 상기 배양액 공급 챔버는 간세포를 배양하기 위한 배양용기로서 사용될 수도 있다.
본 발명에서 제공하는 장기모사칩에 포함된 배양액 회수 챔버는 상기 배양액 공급 챔버로부터 공급된 배양액이 배양액 채널을 통과한 후, 최종적으로 저장되는 부위로서, 세포 배양 후 오염된 배양액을 회수하는 역할을 수행하는데, 배양 후 세포로부터 분비된 각종 대사산물, 노폐물 등으로 오염된 배양액으로 인한 주변환경 오염을 방지하기 목적으로 사용된다.
본 발명에서 제공하는 장기모사칩에 포함된 배양액 채널은 배양액 공급 챔버로부터 배양액 회수 챔버로 배양액이 유통하는 배양액의 메인 유로로서의 역할을 수행하는데, 상기 역-미세둑 구조를 통해 세포 챔버에 위치한 세포에 배양액을 공급하고, 세포 배양에 사용된 배양액을 회수하는 역할을 수행한다. 본 발명에 있어서, 상기 배양액 채널은 생체 내에 존재하는 세포에 영양을 공급하기 위한 모세혈관을 모사한 구성요소로서 해석될 수 있다. 이에 따라, 상기 배양액 채널의 폭은 모세혈관의 기능을 모사할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 20 내지 100㎛의 폭을 가질 수 있고, 다른 예로서, 25 내지 60㎛의 폭을 가질 수 있으며, 또 다른 예로서, 30㎛의 폭을 가질 수 있다.
본 발명에서 제공하는 장기모사칩에 포함된 세포 유입구는 세포 챔버에 공급하기 위한 세포 혼합물을 유입하는 역할을 수행하는데, 예를 들어, 세포 혼합물이 로딩된 세포 유입구에 주사기의 노즐이 연결될 수 있는 구조를 갖도록 구성될 수 있다. 상기 세포 혼합물은 세포와 상기 세포의 유통과 고정을 보조하는 보조성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 장기모사칩은 이에 포함된 세포 챔버 내부에 정렬되어 고정된 형태로 존재하는 세포를 포함하게 되는데, 상기 세포 챔버 내부에 세포를 주입하고, 주입된 세포가 상기 세포 챔버 내부에 고정되기 위해서는 이를 보조하는 보조성분을 필요로 한다. 상기 보조성분은 세포 주변의 미세환경에 존재하는 세포외기질(ECM)을 모방한 것으로서, 세포의 3차원 세포배양에 필수적이며, 배양된 세포의 구조 및 기능이 생체 내의 것과 유사하도록 유지하는 역할을 수행할 수 있다. 상기 보조성분은 세포의 유입과 고정을 보조할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 하이드로젤을 사용할 수 있고, 다른 예로서, 콜라겐 하이드로젤, 알지네이트 하이드로젤, 젤마(GelMa) 하이드로젤 등을 사용할 수 있다. 상기 하이드로젤은 세포와 혼합되어, 세포의 3차원 배양을 보조하고, 추가적으로 상기 세포에 유동성을 부여하여, 상기 세포가 세포 유입구로부터 세포 챔버로 이동할 수 있게 한다. 뿐만 아니라, 상기 하이드로젤은 다양한 조건에 의해 경화될 수 있는데, 예를 들어, 콜라겐 하이드로젤은 인큐베이터 내에 1시간 이상 두어 온도상승을 유도하여 경화시킬 수 있고, 알지네이트 하이드로젤은 배양액 채널에 배지를 대체하여 CaCl2 용액을 주입하여 경화시킬 수 있으며, 젤마 하이드로젤은 자외선을 조사하여 경화시킬 수 있다. 상기 세포 혼합물이 세포 챔버로 이동한 후, 이에 포함된 하이드로젤이 경화되면, 상기 경화된 하이드로젤 내에 포함된 세포가 자연스럽게 고정될 수 있는데, 하이드로젤의 내재적인 다공성 특징으로 인하여, 하이드로젤을 통해 외부의 배양액이 세포에 전달될 수 있어, 고정된 세포의 배양을 보조할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 장기모사칩에 포함된 세포 챔버는 상술한 바와 같이, 세포 유입구를 통해 공급된 세포 혼합물이 저장 및 고정될 뿐만 아니라, 고정된 세포를 배양하기 위한 배양용기로서의 역할을 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 챔버는 생체내 존재하는 세포의 미세구조를 모사한 구성요소로서 해석될 수 있다. 이에 따라, 상기 세포 챔버의 폭은 심근세포의 고정 및 배양을 수행할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 20 내지 2000㎛의 폭을 가질 수 있고, 다른 예로서, 100 내지 1000㎛의 폭을 가질 수 있으며, 또 다른 예로서, 600㎛의 폭을 가질 수 있다.
상기 세포 챔버는 세포 유입구와 잔류물 유출구 사이에 연통된 통로의 형태가 될 수 있는데, 상기 잔류물 유출구와 연통된 부위에는 내부에 역-미세둑 구조가 구비되어 있고, 이에 따라, 세포 유입구를 통해 공급된 세포 혼합물에 포함된 세포가 잔류물 유출구로 이동되지 않고, 세포 챔버 내에 잔류하게 된다.
또한, 상기 세포 챔버에 주입될 수 있는 세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 심근세포, 평활근 세포, 횡문근 세포, 신장세포, 간세포, 상피세포, 신경세포, 줄기세포, 혈관내피세포, 두피세포, 비장세포, 폐세포, 구강세포, 피부세포, 모낭세포, 뇌세포, 척수세포 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포가 될 수 있고, 다른 예로서, 심근세포가 될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 장기모사칩에 포함된 잔류물 유출구는 세포 챔버에 고정된 세포를 배양하면서 상기 세포로부터 생성된 대사산물 또는 노폐물 등의 오염물을 외부로 배출하는 역할을 수행할 수 있다. 이처럼 오염물을 배출하는 역할은 잔류물 유출구 뿐만 아니라 세포 유입구도 함께 수행할 수 있다. 즉, 세포를 세포 챔버에 유입하는 역할이 종료된 세포 유입구는 세포 챔버에 고정된 세포를 배양하면서 생성되는 오염물을 외부로 배출하는 역할을 수행할 수도 있다.
상기 잔류물 유출구의 형상은, 앞서 설명한 배양액 회수 챔버와 마찬가지로, 세포 혼합물에 포함된 세포로부터 분비된 각종 대사산물, 노폐물 등의 오염물을 외부로 배출하는 역할을 수행할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 다만, 상기 오염물로 인한 세포 주변환경의 오염을 방지하기 위하여 튜브 또는 주사기의 노즐이 결합될 수 있는 형태로 구성될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 장기모사칩은 적어도 하나의 배양액 공급부와 하나의 세포 공급부를 기본적으로 포함하지만, 상기 장기모사칩을 사용하는 목적에 따라, 다수의 배양액 공급부와 세포 공급부를 포함할 수도 있다.
예를 들어, 복수개의 배양액 공급부와 하나의 세포 공급부를 포함하거나, 하나의 배양액 공급부와 복수개의 세포 공급부를 포함하거나, 또는 복수개의 배양액 공급부와 복수개의 세포 공급부를 포함할 수 있다.
이처럼, 복수개의 배양액 공급부와 하나의 세포 공급부를 포함하는 경우, 일 예로서, 세포공급부를 중심으로 양쪽에 각각의 배양액 공급부가 구비된 형태가 될 수 있는데, 이 경우, 상기 역-미세둑 구조는 복수개의 배양액 채널과 하나의 세포 챔버사이에 형성되고, 각 배양액 채널간의 간섭을 배제하기 위하여, 각 배양액 채널은 인접하지 않도록 구성되거나 또는 인접하더라도 상호 완전 격리되도록 구성될 수 있다.
또한, 하나의 배양액 공급부와 복수개의 세포 공급부를 포함하는 형태인 경우, 복수개의 세포 공급부에 각각 상이한 세포를 주입하고, 이들 세포 공급부에 포함된 복수개의 상이한 세포를 공동배양할 수 있는데, 상기 각각의 세포 공급부는 역-미세둑 구조를 사용하여 연결될 수 있고, 이러한 역-미세둑 구조의 연결부를 통해 배양액이 유통될 수 있도록 구성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 장기모사칩은 두 개의 배양액 공급 챔버; 두 개의 배양액 회수 챔버; 두 개의 배양액 채널; 한 개의 세포 유입구; 한 개의 잔류물 유출구; 상기 배양액 채널과 연접한 한 개의 세포 챔버; 및 세포 챔버와 배양액 채널의 연접부 및 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부에 구비된 역-미세둑 구조가 포함된 형태로 제조될 수 있다.
이하, 본 발명의 도 1 내지 도 5를 참조하여, 본 발명에서 제공하는 장기모사칩의 구조를 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명에서 제공하는 장기모사칩(2)은 슬라이드 글라스(1)위에 구비된 구조물의 형태로서, 세포 유입구(5), 잔류물 유출구(6) 및 세포 챔버(8)로 구성된 심근세포 공급부를 중심으로, 배양액 공급 챔버(3), 배양액 회수 챔버(4) 및 배양액 채널(7)로 구성된 두 세트의 배양액 공급부가 각각 양쪽에 구비된 형태이다. 상기 세포 챔버(8)와 배양액 채널(7)은 이들의 연접부에 구비된 역-미세둑 구조(9)에 의해 각각 구별되고, 상기 세포 챔버(8)와 잔류물 유출구(6)의 연접부에도 역-미세둑 구조(10)가 구비되어 있다.
상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태는 상기 장기모사칩을 이용하여, 세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 하나의 방법은 (a) 상기 장기모사칩에 포함된 세포 챔버에 포함된 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 장기모사칩에 포함된 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및, (c) 상기 배양된 세포의 변화를 측정하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 세포의 변화는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 배양된 세포의 손상여부, 성장여부, 분비성분의 변화여부, 유전자 발현수준의 변화여부, 단백질 수준의 변화여부 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 될 수 있고, 다른 예로서, 상기 세포의 변화는 배양된 심근세포의 경우 심근세포의 박동수의 변화여부가 될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 다른 방법은 (a) 상기 장기모사칩에 포함된 배양액 공급 챔버에서 간세포를 배양하는 단계; (b) 상기 장기모사칩에 포함된 세포 챔버에 포함된 세포를 배양하는 단계; (c) 상기 배양된 간세포를 포함하는 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및, (d) 상기 배양된 세포의 변화를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 배양되는 세포로서 심근세포를 사용할 경우, 배양 후, 약 1 내지 2일이 경과된 시점에서 심근세포의 박동이 확인되며, 이러한 심근세포의 박동은 안정화되어 배양 후 7일이 경과 후까지 일정한 수준으로 유지된다. 따라서, 상기 심근세포를 배양하여, 심근세포의 박동이 시작된 후, 배양액 공급 챔버에 약물을 투여하면, 상기 약물의 효과에 의하여 심근세포의 박동수가 변화를 관찰할 수 있다. 따라서, 상기 심근세포의 박동수를 측정하여, 상기 약물이 심근세포에 미치는 효과를 평가할 수 있다.
상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태는 상기 장기모사칩을 이용하여, 세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 하나의 방법은 (a) 상기 장기모사칩에 포함된 세포 챔버에 포함된 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 장기모사칩에 포함된 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및, (c) 상기 배양된 세포의 사멸 또는 약화여부를 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 제공하는 세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 다른 방법은 (a) 상기 장기모사칩에 포함된 배양액 공급 챔버에서 간세포를 배양하는 단계; (b) 상기 장기모사칩에 포함된 세포 챔버에 포함된 세포를 배양하는 단계; (c) 상기 배양된 간세포를 포함하는 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및, (d) 상기 배양된 세포의 사멸 또는 약화여부를 확인하는 단계를 포함한다.
상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태는 세포에 미치는 약물의 효능을 평가하기 위한 장기모사칩의 용도를 제공한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 역-미세둑 구조 장기모사칩의 제작
본 발명의 장기모사칩은 PDMS(polydimethylsiloxane)탄성중합체와 슬라이드글라스 (slide glass)를 이용하여 제작하였다.
감광액 패터닝(PR patterning)이 완료된 주형(mold) 위에 PDMS 실리콘계 엘라스토머(silicone base elastomer)와 경화제(curing agent, SYLGARD 184 silicone elastomer kit, Dow Corning)의 비율을 10:1로 섞은 후 플라즈마 처리기(plasma processing system, CUTE, FEMTO Science)의 진공 시스템을 이용하여 믹싱 시 발생하는 기포를 제거하였다. 이후 SU-8 주형 위에 상기 혼합물을 부은뒤 80℃의 열판 위에서 10시간 동안 열처리를 가해 고형화 하였다. 이를 주형으로부터 분리해 낸 후, 칩의 적정 크기에 따라 자른 후 원통형 1.2mm 및 8mm 직경의 생검 펀치(biopsy punch)를 이용하여 세포 및 하이드로젤 혼합물 유입구 및 유출구와 배지 저장 및 유입구 및 유출구를 각각의 크기에 맞게 펀치아웃(punch out)하여 미세유체소자를 제작하였다.
상기 제작된 미세유체소자를 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol)이 담겨있는 초음파 발생 장치(sonicator)에 PDMS 기반 미세유체소자를 담가 초음파 처리(sonication)를 수행하여 세척한 후, 에어건(air-gun)으로 완전히 건조시켰다.
세척이 완료 된 PDMS기반 미세유체소자와 슬라이드글라스는 80℃ 드라이 오븐(dry oven) 내에서 10분 동안 건조시킨 뒤 30분 동안 자외선에 노출시켜 멸균시켰다. 최종적으로, PDMS 기반 미세유체소자와 슬라이드 글라스를 플라즈마 처리기에 넣고 산소 플라즈마 처리(oxygen plasma treatment)를 통해 접착시켜 장기모사칩을 제작하였다. 제작된 장기모사칩을 35mm 페트리 디쉬(petri dish)에 넣고, 플라즈마 처리에 의한 접착력을 단단하게 하기 위해 80℃로 가열된 핫플레이트(hot plate) 위에서 30분 동안 열을 가하였다.
상기와 같이 제작된 장기모사칩의 전체 크기는 가로 2.7cm, 세로 2cm 이며 칩 내 모든 채널 미세구조의 높이는 50㎛ 이며, 역 미세 둑 구조 이외의 높이는 5㎛이다. 세포 채널의 폭 사이즈는 600㎛로, 이는 생체 내 심근다발의 직경인 약 200㎛의 3배 정도의 크기이다.
배양액 채널의 폭은 30㎛이며, 이는 생체 내 모세혈관의 직경인 약 10㎛의 3배 정도로, 세포 채널을 중심으로 양쪽 최외각에 배치함으로써 생체내 심근섬유들의 사이사이에 위치하고 있는 모세혈관망을 모방하고자 디자인 하였다.
세포 채널의 잔류물 유출구 방향에 위치한 역-미세둑 구조는 세포 채널의 폭이 좁아지는 직전 부분에 두께 60㎛으로 유출구 방향으로 호 형태로 위치하여 주입되는 세포-하이드로젤 혼합물이 잔류물 유출구 쪽으로 빠져나가지 않고 누적되게끔 유도하기 위한 디자인하였으며, 원활한 주입과 주입 시 발생하는 압력만은 잔류물 유출구 쪽으로 빠져나갈 수 있게 하였다. 또한, 세포 채널과 배양액 채널의 연접부에 구비된 역-미세둑 구조는 두께 100μm의 직사각형 형태로 디자인하였으며, 마찬가지로 세포-하이드로젤 혼합물이 세포 채널의 바깥으로 빠져나가지 않고 누적되게끔 디자인하였다. 세포 채널과 연결되어 있는 각 유입구(inlet)와 유출구(outlet)의 지름은 1.5mm 이며, 배양액 공급챔버 및 회수챔버에 연결된 배양액 채널의 지름은 8mm으로 설정하였다.
실시예 2: 심근세포가 포함된 장기모사칩의 제작
NEXEL 사의 인간 줄기세포(hPSCs)로부터 분화된 심근세포(Cardiosight-S)를 콜라젠(collagen)과 같은 하이드로젤(hydrogel)과 혼합한 다음, 상기 실시예 1에서 제작된 본 발명의 장기모사칩 내로 주입하고, Supplement(75X)를 보충한 Cardiosight-S Media로 7일 동안 배양하였다. 또한 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 조건의 가습한 인큐베이터에 배양하였다.
실시예 3: 역-미세둑 구조와 심근세포를 포함하는 장기모사칩을 이용한 약물의 효능 및 독성평가
실시예 3-1: 장기모사칩의 기능 평가
상기 실시예 2에서 제작한 본 발명의 장기모사칩이 정상적으로 기능을 수행하는지를 평가하였다.
대략적으로, 붉은색 및 노란색 식용색소를 적절한 농도 및 점도로 설정하여 붉은색 식용색소 용액을 배양액 공급 챔버 및 회수 챔버에 각각 200㎕ 로딩하고 파이펫을 이용하여 각 양쪽에 위치한 배양액 채널의 내부에 식용색 소용액을 채운 다음, 나머지 한 세트의 배양액 공급 챔버 및 회수 챔버에도 각각 200㎕을 로딩하여 각 챔버간에 붉은색소 용액의 흐름이 연결되도록 하였다. 이후, 노란색 식용색소 용액을 syringe pump (NE-1000, NEWERA)를 이용하여 20㎕/ min의 속도로 세포 채널에 주입하였다(도 6).
도 6은 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 장기모사칩의 일 예인 심근세포가 포함된 장기모사칩의 실제 사진과 칩 내부의 각 채널 내로 식용 색소를 주입한 결과를 나타내는 부분 및 심근세포 배양 결과의 확대사진이다.
도 6에서 보듯이, 역-미세둑 구조를 경계로 배양액 채널과 세포 채널 사이에 표면장력에 의해 노란색소 용액이 경계를 이루는 것을 확인 함으로써, 성공적으로 선택적 액체가 분리 주입되었음을 확인하였다.
실시예 3-2: 장기모사칩을 이용한 세포 배양 및 제작 생산성 평가
먼저, 상기 실시예 1에서 제작한 본 발명의 장기모사칩에 포함된 한 세트의 배양액 공급 챔버 및 회수 챔버에 각각 200㎕의 배양액을 로딩하고 파이펫을 이용하여 각 챔버간에 배양액의 흐름이 연결되도록 한 뒤 각 양쪽에 위치한 배양액 채널의 내부에 배양액을 채워 최종적으로 배지 흐름을 만들어주었다. 이때 역-미세둑 구조를 경계로 배양액 채널과 세포 채널 사이에 표면장력에 의해 배지가 경계를 이루는 것을 확인하였다. 추가적으로, 심근세포 유입구에 파이펫을 이용하여 심근세포 혼합물(2 x 106개 심근세포/2㎕ 콜라젠의 비율로 제작 후 여러 개 칩에 주입)을 로딩하고, 파이펫팅을 이용하여 세포 채널에 이를 주입하였다. 마찬가지로 역-미세둑 구조에 의해 심근세포 혼합물이 경계를 이루는 것을 확인함으로써, 심근세포 혼합물과 배양액이 각각 성공적으로 분리 주입되었음을 확인하였다.
이처럼 제조된 장기모사칩은 종래의 심근주막 모방 심장칩에 비하여, 심근세포 혼합물 주입과정까지의 소요되는 시간이 절감됨을 확인하였다. 구체적으로, 종래의 심근주막 모방 심장칩의 세포 챔버에 심근세포 혼합물을 주입할 경우 칩 1개당 약 3시간이 소요된 반면, 앞서 제조된 장기모사칩의 세포 챔버에 심근세포 혼합물을 주입할 경우에는 칩 1개당 약 5분이 소요됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 장기모사칩은 세포가 주입된 형태로 제작할 경우, 제작 생산성을 크게 높여주어 시간당 제작 단가를 절감시킬 수 있음을 알 수 있었다.
이어, 주입된 심근세포 혼합물에 포함된 하이드로젤을 경화시켜서, 심근세포 채널 내에 심근세포를 고정시켰다. 하이드로젤의 종류에 따라 경화 방법을 달리하여 경화를 수행하게 되는데 콜라젠의 경우 인큐베이터 내에 1시간 이상 두어 온도변화에 의한 경화를 수행한 후, 지속적으로 인큐베이터에서 심근세포를 배양하였다. 배양 2일까지 배양액 공급 챔버 및 회수 챔버에 모두 200㎕의 배양액을 로딩함으로써, 배지의 흐름을 최소화하여 심근세포가 장기모사칩 내 환경에서 적응할 수 있는 시간을 부여하였고, 이후 배양 7일까지는 배양액 공급 챔버에는 200㎕의 배양액을 로딩하고, 배양액 회수 챔버에는 125㎕의 배양액을 로딩하여 배지의 높낮이 차이를 줌으로써 중력에 의해 배지흐름이 발생하도록 유도하였다. 상기 배양액은 매일 신선한 배양액으로 교체하여 지속적인 배지흐름과 신선한 영양분을 제공하였고, 배지교체 시 각 배양액 공급 챔버 및 회수 챔버에 있는 기존에 있던 배양액을 제거함으로써 노폐물을 제거하면서 배양하였다.
한편, 상기 장기모사칩 내 심근세포의 박동은 빠르면 배양 1~2일쯤에 발생하기 시작하는데, 배양시간이 지나면서 심근박동 수는 증가하고, 1분 내 심근박동수(beat per minute, BPM)를 기준으로 최적 심근박동수에 맞추어 약물효능 및 독성평가 전 배양기간을 7일로 설정하였다.
구체적으로, 심근세포가 주입된 장기모사칩의 경우, 주입 후 1일째에서는 모든 칩에서 박동이 관찰되지 않았으며, 2일째부터 심근 박동이 국지적으로 발생함을 관찰할 수 있었다. 이후 3일째부터 칩 내 심근세포 전체에서 심근 박동이 관찰되었으며 비교적 빠른 박동인 평균값 약 75 bpm을 관찰할 수 있으며, 이 후 6일째에 대부분의 칩이 정상 범주인 약 68 bpm까지 도달하였으며, 7일째에 모든 칩들이 정상범위 안에 들어왔으며, 평균값 약 64 bpm까지 도달하였다.
이에 따라, 최적배양일수로는 7일이 약물 효능 및 독성 평가를 수행하는데 가장 최적기라고 판단하였고, 칩 간의 박동수 차이도 약 5bpm 내외로 대다수의 칩에서 균일한 박동수를 보였으며, 이는 기존 심근주막 모방 심장칩의 칩 간 박동수 차이인 약 15bpm 내외보다 더 재현성있는 결과인 것으로 분석되었다.
상기 분석결과로부터, 본 발명에서 제공하는 제공하는 장기모사칩에 심근세포를 주입할 경우, 심근세포 박동수의 편차를 현저히 감소시켜서, 보다 재현성이 높은 고품질의 심장모사칩으로 활용할 수 있고, 이러한 심장모사칩을 이용한 약물효능 평가 또는 독성평가시에 신뢰도가 높은 결과를 기대할 수 있다는 장점이 있음을 알 수 있었다.
실시예 3-3: 약물의 효능 및 독성 평가
상기 실시예 3-2를 통해 본 발명의 장기모사칩의 배양액 공급 챔버에 심근박동수에 영향을 미치는 것으로 알려져 있는 약물인 이소프로테레놀(isoproterenol)을 각기 처리하였고, 이에 따른 심근 세포 박동 변화를 광학현미경으로 관찰하고, 심근 세포의 박동수 및 박동 간격을 측정한 다음, 이를 분석하였다(도 7).
도 7은 본 발명에서 제공하는 약물의 효능 및 독성 평가용 장기모사칩의 일 실시예인 심근세포가 로딩된 장기모사칩에서 심근세포를 7일 동안 배양하고, 심근박동수의 변화를 주는 대조양성약물인 이소프로테레놀을 처리한 다음, 심근세포의 박동수의 변화를 대조군과 비교 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7에서 보듯이, 이소프로테레놀을 처리하기 전 1분당 심근박동 수(bpm)는 약 60회 정도로 정상 맥박 상태를 나타내었다. 약물의 농도는 5μM로 처리하였고, 1시간 간격으로 6시간까지, 이후 3시간 간격으로 총 12시간 동안 관찰하였을 때, 전체적인 경향은 약물 처리 후 박동수가 증가하고 처리 후 1시간에서 최고 박동수를 나타내었고 이후 시간이 흐를수록 박동수가 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 이에 반해 대조군은 상기 명시한 12시간 관찰 시간 동안 분당 60회 전후의 일정한 박동수를 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 심근세포가 이소프로테레놀의 효능에 의해서 심근박동수가 증가하나 최대 심근박동수를 기록한 후의 약물처리 시간을 오래하였을 때 동 약물의 독성에 의해 세포기능 감소로 오히려 심근박동수가 감소되는 것을 확인 할 수 있었으며, 약물의 효능 및 독성이 관찰됨을 확인할 수 있었다.
한편, 약물에 따른 심근박동수 변화 외에 심근박동의 세기 혹은 빠르기 및 형태 변화 등을 관찰하기 위하여 비디오 기반 motion tracking program을 통해 대조군 및 5μM의 농도의 이소프로테레놀(isoproterenol)을 처리군의 변화를 그래프화하여 관찰하였다(도 8a 및 8b).
도 8a는 본 발명의 장기모사칩을 이용하여 심근세포를 7일 동안 배양하고 심근박동수의 변화를 주는 약물인 이소프로테레놀을 처리하지 않은 대조군을 motion tracking program을 통해 심근박동의 횟수, 빠르기 혹은 세기, 형태의 변화 등을 관찰한 비디오 기반 심근 모션 추적 그래프이고, 도 8b는 본 발명의 장기모사칩을 이용하여 심근세포를 7일 동안 배양하고 심근박동수의 변화를 주는 약물인 이소프로테레놀을 5 μM 농도로 처리한 후 1시간 뒤에 motion tracking program을 통해 심근박동 수, 빠르기 혹은 세기, 형태의 변화 등을 관찰한 비디오 기반 심근 모션 추적 그래프이다.
도 8a 및 8b에서 보듯이, 약물 처리 1시간 후 심근박동은 약 140bpm을 기록하였으며 규칙적인 간격으로 박동하고 있음을 확인할 수 있으며, 약물 처리에 따른 박동 수 증가도 확인할 수 있었다. 박동의 빠르기 혹은 세기는 음성대조군(약물 미처리 군)과 비교하였을 때, 매 박동간의 차이는 좀 더 커지긴 했지만 비교적 비슷한 수준을 유지하고 있다고 보이며 수축 및 이완 박동이 평균적으로 약 11㎛/s을 기록함으로써 대조군의 평균인 약 7㎛/s 비해 증가함을 확인하였다.
실시예 4: 전극이 구비된 기판을 이용한 장기모사칩의 제작 및 약물의 효능과 독성 평가
실시예 4-1: 전극이 구비된 기판을 이용한 장기모사칩의 제작
슬라이드 글라스 대신에, 전극이 구비된 기판을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 방법을 이용하여, 전극이 구비된 기판에 안치된 장기모사칩을 제작하였다(도 9).
도 9는 본 장기모사칩의 미세구조 배치와 일치하는 (alignment) 멀티어레이 형태로 배열된 MEA가 구비된 기판에 안치된 상태로 제작된 장기모사칩의 사진이다.
상기 도 9의 형태로 제작된 장기모사칩의 세포 챔버에 심근세포를 배양하면, 상기 기판에 구비된 전극을 통해 전달되는 전기생리학적 신호를 해석하여, 심근세포에 처리되는 약물에 의한 심근박동수를 비롯한 다양한 생리학적 변화를 종합적으로 보다 정확히 분석할 수 있다.
실시예 4-2: 전극이 구비된 기판이 포함된 장기모사칩을 이용한 약물의 효능 및 독성 평가
상기 실시예 4-1에서 제작된 멀티어레이 형태로 배열된 MEA가 구비된 장기모사칩에서 7일 동안 심근세포를 배양한 뒤, 심근박동수의 변화를 주는 대조양성약물인 5μM 이소프로테레놀과 20nM 니페디핀을 각각 처리하여 1시간 후에 자기장전위를 측정하였다(도 10).
도 10은 멀티어레이 형태로 배열된 MEA가 구비된 장기모사칩에서 심근세포를 7일 동안 배양하고 심근세포의 전기생리신호의 변화를 주는 대조양성약물인 이소프로테레놀 및 니페디핀을 처리한 다음 1시간 후에 자기장전위(field potential)를 측정한 그래프이다.
도 10에서 보듯이, T파형의 진폭크기(T-wave amplitude)의 경우, 5μM 이소프로테레놀을 처리한 조건에서 음성대조군 대비 의미 있게 높아졌으며, 20nM 니페디핀을 처리한 조건에서는 음성대조군 대비 낮아짐을 확인하였다. 또한 두 약물군 모두에서 QT 시간이 줄어들었으며, 이소프로테레놀과는 달리 니페디핀은 non-QT prolonging drug으로써 박동간격이 늘어남에도 QT 시간이 길어지지 않는 실제 임상에서 약물의 특성이 정확하게 반영되는 것을 확인하였다.
이러한 결과는 본 장기모사칩이 임상결과와 유사한 결과를 도출할 수 있음을 시사하는 것으로 분석되었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
[부호의 설명]
1 : PDMS 기반 미세유체 소자
2 : 슬라이드 글라스
3 : 배양액 공급챔버
4 : 배양액 회수챔버
5 : 심근세포 유입구
6 : 잔류물 유출구
7 : 배양액 채널
8 : 세포 챔버
9 : 세포 챔버와 배양액 채널의 연접부에 위치한 역-미세둑 구조
10 : 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부에 위치한 역-미세둑 구조

Claims (38)

  1. (a) 배양액 공급 챔버; 배양액 회수 챔버; 및, 상기 각 챔버와 연통하는 배양액 채널;을 포함하는 배양액 공급부;
    (b) 일 측단에 구비된 세포 유입구; 다른 일 측단에 구비된 잔류물 유출구; 및, 상기 세포 유입구와 잔류물 유출구 사이에 구비되고, 상기 배양액 채널과 연접하여 동일한 방향으로 연장된 세포 챔버;를 포함하는 세포 공급부; 및
    (c) 상기 배양액 채널과 세포 챔버의 연접부, 상기 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 부위에 구비된 역-미세둑 구조를 포함하는, 장기모사칩.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 역-미세둑 구조는 그의 상단이 연접부의 상단과 결합되고, 하단이 연접부의 바닥과 이격되도록 구비되어, 상기 이격된 부위를 통해 세포 또는 경화된 세포는 통과하지 못하고, 액상성분은 통과할 수 있도록 구성되는 것인, 장기모사칩.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 이격된 부위의 간격은 5 내지 40 ㎛인 것인, 장기모사칩.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 역-미세둑 구조의 단면은 직방형 또는 호의 형태인 것인, 장기모사칩.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 배양액 채널과 세포 챔버의 연접부에 구비된 역-미세둑 구조는 상기 연접부를 따라 동일한 방향으로 연장되도록 구비되고, 하단의 이격부위를 통해 배양액 채널과 세포 챔버간에 배양액의 상호유통을 허용하도록 구성되는 것인, 장기모사칩.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부에 구비된 역-미세둑 구조는 상기 잔류물 유출구 방향으로 굽어진 호의 형태로 구비되고, 하단의 이격부위를 통해 세포 챔버로부터 잔류물 유출구로의 잔류물 배출을 허용하도록 구성되는 것인, 장기모사칩.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 배양액 공급 챔버는 배양액 채널 및 역-미세둑 구조를 통해 세포 챔버에 공급하기 위한 세포 배양용 배양액을 저장하는 것인, 장기모사칩.
  8. 제1항에 있어서,
    약물의 효능 및 독성 평가를 위하여, 상기 배양액 공급 챔버에서 간세포를 추가로 배양하는 것인, 장기모사칩.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 배양액 채널은 상기 배양액 공급 챔버로부터 배양액 회수 챔버로 배양액이 유통하는 경로인 것인, 장기모사칩.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 배양액 채널의 폭은 20 내지 100㎛인 것인, 장기모사칩.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 세포 유입구는 세포 챔버에 공급하기 위한 세포 혼합물을 유입하는 역할을 수행하는 것인, 장기모사칩.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 세포 혼합물은 세포 및 세포의 유통과 고정을 보조하는 하이드로젤을 포함하는 것인, 장기모사칩.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 세포 챔버는 세포 유입구를 통해 공급된 세포 혼합물에 포함된 세포가 정렬하여 고정되고, 고정된 세포를 배양하는 배양용기로서의 역할을 수행하는 것인, 장기모사칩.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 세포의 고정은 세포 혼합물에 포함된 하이드로젤의 경화에 의해 수행되는 것인, 장기모사칩.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 세포의 배양은 역-미세둑 구조의 하단부와 연접부의 바닥 사이에 형성된 이격부위를 통해 배양액 채널로부터 공급된 배양액이 세포 챔버에 고정된 세포에 공급되어 수행되는 것인, 장기모사칩.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 배양의 대상이 되는 세포는, 심근세포, 평활근 세포, 횡문근 세포, 신장세포, 간세포, 상피세포, 신경세포, 줄기세포, 혈관내피세포, 두피세포, 비장세포, 폐세포, 구강세포, 피부세포, 모낭세포, 뇌세포, 척수세포 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포인 것인, 장기모사칩.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 배양의 대상이 되는 세포는, 심근세포인 것인, 장기모사칩.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 세포 챔버의 폭은 20 내지 2000㎛인 것인, 장기모사칩.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 잔류물 유출구는 세포 챔버에 고정된 세포를 배양하면서 상기 세포로부터 생성된 오염물을 외부로 배출하는 역할을 수행하는 것인, 장기모사칩.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 장기모사칩은 하나의 배양액 공급부와 하나의 세포 공급부를 포함하는 것인, 장기모사칩.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 장기모사칩은 복수개의 배양액 공급부와 하나의 세포 공급부를 포함하는 것인, 장기모사칩.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 배양액 공급부는 세포 공급부를 중심으로 양쪽으로 정렬된 것인, 장기모사칩.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 장기모사칩은 하나의 배양액 공급부와 복수개의 세포 공급부를 포함하는 것인, 장기모사칩.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 복수개의 세포 공급부에는 각각 상이한 세포가 주입되어 공동배양 할 수 있고, 각각의 세포 공급부는 역-미세둑 구조를 사용하여 연결될 수 있으며, 상기 역-미세둑 구조의 연결부를 통해 배양액이 유통되는 것인, 장기모사칩.
  25. 제1항에 있어서,
    상기 장기모사칩은 복수개의 배양액 공급부와 복수개의 세포 공급부를 포함하는 것인, 장기모사칩.
  26. 제1항에 있어서,
    상기 장기모사칩은 두 개의 배양액 공급 챔버(3); 두 개의 배양액 회수 챔버(4); 두 개의 배양액 채널(7); 한 개의 세포 유입구(5); 한 개의 잔류물 유출구(6); 상기 배양액 채널과 연접한 한 개의 세포 챔버(8); 및, 세포 챔버와 배양액 채널의 연접부 및 세포 챔버와 잔류물 유출구의 연접부에 구비된 역-미세둑 구조(9, 10)를 포함하는 것인, 장기모사칩.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 두 개의 배양액 채널(7)은 세포 챔버(8)를 중심으로 양쪽으로 정렬된 것인, 장기모사칩.
  28. 제1항에 있어서,
    상기 장기모사칩은 슬라이드 글라스 또는 전극이 구비된 기판의 상부에 안치된 형태로 제작되는 것인, 장기모사칩.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 전극은 장기모사칩 전체의 하단에 미세전극배열체 (Microelecorde array, MEA) 형태로 구비되는 것인, 장기모사칩.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 전극은 역-미세둑 구조와 합치되는 전극패턴을 갖는 미세전극배열체의 형태인 것인, 장기모사칩.
  31. 제1항에 있어서,
    상기 장기모사칩의 세포 챔버에 세포혼합물을 주입하는데 소요되는 시간이 1 내지 10분인 것인, 장기모사칩.
  32. (a) 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 장기모사칩에 포함된 세포 챔버에 포함된 세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 장기모사칩에 포함된 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및,
    (c) 상기 배양된 세포의 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 세포의 변화는 배양된 세포의 손상여부, 성장여부, 분비성분의 변화여부, 유전자 발현수준의 변화여부, 단백질 수준의 변화여부 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  34. 제32항에 있어서,
    상기 세포는 심근세포이고, 상기 심근세포의 변화는 심근박동의 횟수, 심근박동의 빠르기 혹은 세기, 심근박동의 형태 변화, T 파형의 진폭크기, QT 파형변화 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 변화인 것인, 방법.
  35. (a) 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 장기모사칩에 포함된 배양액 공급 챔버에서 간세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 장기모사칩에 포함된 세포 챔버에 포함된 세포를 배양하는 단계;
    (c) 상기 배양된 간세포를 포함하는 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및,
    (d) 상기 배양된 세포의 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 세포에 미치는 약물의 효능을 평가하는 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 세포의 변화는 배양된 세포의 손상여부, 성장여부, 분비성분의 변화여부, 유전자 발현수준의 변화여부, 단백질 수준의 변화여부 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  37. (a) 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 장기모사칩에 포함된 세포 챔버에 포함된 세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 장기모사칩에 포함된 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및,
    (c) 상기 배양된 세포의 사멸 또는 약화여부를 확인하는 단계를 포함하는, 세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법.
  38. (a) 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 장기모사칩에 포함된 배양액 공급 챔버에서 간세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 장기모사칩에 포함된 세포 챔버에 포함된 세포를 배양하는 단계;
    (c) 상기 배양된 간세포를 포함하는 배양액 공급 챔버에 목적하는 약물을 투여하는 단계; 및,
    (d) 상기 배양된 세포의 사멸 또는 약화여부를 확인하는 단계를 포함하는, 세포에 미치는 약물의 독성을 평가하는 방법.
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