WO2022216132A1 - 세포 집합체 배양을 위한 미세유체 현적배양 디바이스 - Google Patents

세포 집합체 배양을 위한 미세유체 현적배양 디바이스 Download PDF

Info

Publication number
WO2022216132A1
WO2022216132A1 PCT/KR2022/005199 KR2022005199W WO2022216132A1 WO 2022216132 A1 WO2022216132 A1 WO 2022216132A1 KR 2022005199 W KR2022005199 W KR 2022005199W WO 2022216132 A1 WO2022216132 A1 WO 2022216132A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
culture
organoids
chip
liver
confirmed
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/005199
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
조승우
김진
김수겸
최보방
Original Assignee
연세대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020220044172A external-priority patent/KR20220140439A/ko
Application filed by 연세대학교 산학협력단 filed Critical 연세대학교 산학협력단
Priority to CN202280027356.7A priority Critical patent/CN117120593A/zh
Priority to EP22785040.1A priority patent/EP4303297A1/en
Priority to JP2023560009A priority patent/JP2024513007A/ja
Publication of WO2022216132A1 publication Critical patent/WO2022216132A1/ko
Priority to US18/479,843 priority patent/US20240026268A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/16—Vibrating; Shaking; Tilting

Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic suspension culture device for culturing cell aggregates.
  • Tissue-specific organoid culture technology is a cutting-edge field that is currently receiving the most spotlight in stem cell research, and has unlimited potential in regenerative medicine and new drug research, such as intractable disease models, patient-specific drug screening platforms, and in vitro models for new drug development. can be expanded.
  • the technology of culturing cells using microfluidic devices is a technology that provides a microenvironment suitable for cells and precisely controls the culture conditions of cells that react sensitively to the surrounding environment. are receiving
  • a culture dish was mounted on an orbital shaker or a bioreactor such as a spinner flask was used, but each organoid
  • the flow of the fluid provided to the organoids is not uniform, which can cause extreme batch-to-batch variation, which is pointed out as the biggest problem in organoid research.
  • the conventional suspension culture technique is performed by placing a microliter volume (20-50 ⁇ l) of cell culture solution on a glass or Petri dish. After that, invert the glass or Petri dish. The droplet is prevented from falling due to surface tension, the cells hanging in the culture medium are settled by gravity, and the cells settled in the culture medium interact with adjacent cells to form a bond, forming a three-dimensional spheroid or three-dimensional micro-organism. to form
  • the greatest difficulty in this technique is the exchange of the culture medium from the droplet.
  • the present inventors developed a microfluidic suspension culture device capable of generating a flow of fluid without a separate facility using a stirring device commonly used in laboratories, and confirmed that the viability, differentiation ability and functionality of organoids can be improved did.
  • the present invention provides a culture chamber comprising one or more wells; one or more reservoirs for storing the culture solution; and a microchannel connecting the culture chamber and the reservoir.
  • the present invention relates to the device; stirrer; And it aims to provide a cell aggregate culture system comprising a; and a culture medium shared through the microchannel.
  • An object of the present invention is to provide a method for culturing a cell aggregate using the culture system.
  • One aspect of the present invention is a culture chamber comprising one or more wells; one or more reservoirs for storing the culture solution; and a microchannel connecting the culture chamber and the reservoir.
  • the culture chamber may further include a microchannel connecting a plurality of wells.
  • the diameter of the well may be 1.5 to 4 mm, and the interval between the wells connected to the microchannel may be 1.5 to 5 mm.
  • the reservoir may be located at both ends of the device.
  • the cell aggregate is any one of mesenchymal stem cells, neural stem cells, vascular endothelial cells, induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells, tissue stem cells, fetal stem cells, cancer stem cells and cardiac cells. It may be a derived spheroid or an organoid.
  • the cell aggregate is brain, optic cup, kidney, liver, pancreas, neural tube, stomach, large intestine, prostate, breast, heart, salivary gland, endometrium, It may be derived from one of the group consisting of mammary gland, thyroid, tongue, small intestine, esophagus, spinal cord, skin, bile duct, lung, blood vessel, muscle, adrenal cortex and thyroid organoids.
  • Another aspect of the present invention is the device; stirrer; and a culture medium shared through a microchannel; provides a cell aggregate culture system comprising.
  • the device may swing motion by the stirrer.
  • Another aspect of the present invention provides a method of culturing a cell aggregate using the culture system.
  • the cell aggregate culture device of the present invention the cell aggregate culture system including the same, and the method for culturing the cell aggregate using the same have the effect of more enhanced stem cell activity and high differentiation compared to the conventional cell aggregate culture technology.
  • the cell aggregate culture device can be reused repeatedly and can be utilized as a platform according to various uses by changing the size and number of wells.
  • the cell aggregate culture system utilizes a stirrer so that the culture solution located in the well in the reservoir and the culture chamber continues to flow through the microchannel, so that the environment of the entire well is maintained so that the cell aggregate can be cultured uniformly and with high efficiency.
  • the cell aggregate culture system can be utilized as a disease research and drug screening model through mass production of cell aggregates in which the disease phenotype is maintained, and also applied to transplantation treatment for disease treatment through mass production of therapeutic cell aggregates. It is possible.
  • FIG. 1 shows the structure of a hanging drop chip (HD chip) of the present invention.
  • FIG 2 and 3 are views showing the structure and culture method of the suspension culture chip (HD chip).
  • HD chip 4 is a photo of spheroid formation and culture using a suspension culture chip (HD chip).
  • FIG. 5 is a view showing the reusability (reusability) of the suspension culture chip (HD chip) made of PDMS.
  • HD chip suspension culture chip
  • FIG. 7 is a photograph showing the results of culturing adipose stem cell spheroids (hADSC spheroids) for comparison with the existing Petri dish suspension culture method.
  • FIG. 8 is a photograph showing the results of culturing adipose stem cell spheroids (hADSC spheroids) for comparison with the conventional U-bottom well-plate culture method.
  • hNSC spheroids neural stem cell spheroids
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of culturing a heart spheroid (cardiac spheroid) as an example of various spheroid / organoid culture application.
  • FIG. 11 is a photograph showing the result of culturing a brain organoid (human iPSC-derived brain organoid) as an example of various spheroid/organoid culture application examples.
  • a brain organoid human iPSC-derived brain organoid
  • liver organoids cultured on HD chip Human iPSC-derived liver organoid
  • HEM 13 is a result of comparing the long-term culture differentiation capacity of human iPSC-derived liver organoids (HEM).
  • HEM 14 and 15 show the results of marker expression analysis of human iPSC-derived liver organoids (HEM).
  • FIG. 16 shows the results of marker expression and functional analysis of liver organoids derived from human iPSC.
  • 17 shows a comparison result of marker expression during long-term culture of human iPSC-derived liver organoids.
  • 21 shows the results of homogeneity analysis of human iPSC-derived liver organoids produced in a 100-well HD chip.
  • 25 shows the results of mass production and ROS quantitative analysis of non-alcoholic steatohepatitis organoids derived from human iPSC.
  • 26 shows the results of mass culture of human iPSC-derived pancreas organoids compared to the conventional Microwell and U-bottom well-plate methods.
  • spheroid human adipose stem cell (hADSC) spheroid
  • Figure 30 shows the results of comparing the heterogeneous organ joining method of human iPSC-derived liver organoid-pancreas organoid (Human iPSC-derived liver-pancreas fused organoid).
  • FIG. 31 shows the high-throughput HD chip fabrication and high-efficiency splicing results between adipose stem cell spheroids (hADSC spheroids) through this.
  • hADSC spheroids adipose stem cell spheroids
  • FIG 33 shows the transplantation results of a mouse steatohepatitis model of a liver organoid cultured on an HD chip (Human iPSC-derived liver organoid).
  • FIG. 34 shows the transplantation results of a mouse steatohepatitis model of a liver organoid cultured on an HD chip (Human iPSC-derived liver organoid).
  • 35 shows the results of on-chip drug screening and fluorescence quantitative analysis (hADSC-human adipose stem cell spheroids) using a plate reader.
  • Figure 37 shows the three-dimensional spheroid / organoid culture results using accessories.
  • ADSC multi-layered three-dimensional adipose stem cell
  • One aspect of the present invention is a culture chamber comprising one or more wells; one or more reservoirs for storing the culture solution; and a microchannel connecting the culture chamber and the reservoir.
  • the culture chamber may include one or more wells, and the wells may be filled with a culture solution to culture a cell aggregate.
  • the wells of the culture chamber may be cultured in one row, or may be configured in multiple rows in consideration of the culture scale or use.
  • the reservoir is a device for supplying and sharing a culture solution to the culture chamber through a microchannel, and may be manufactured in various shapes and numbers in consideration of the purpose of the experiment.
  • the microchannel connects the culture chamber and the reservoir, and as long as the culture solution can flow, its shape, size, length, etc. can be changed without limitation.
  • the culture chamber may further include a microchannel connecting a plurality of wells. Since the culture chamber includes one or more wells, it may further include a microchannel between the wells as well as a microchannel between the culture chamber and the reservoir to share the culture solution between the plurality of wells and the reservoir to maintain a constant environment. . Meanwhile, microchannels between the plurality of wells may be formed only between some wells in consideration of the purpose of some experiments.
  • the diameter of the well may be 1.5 to 4 mm, specifically 2 to 3.1 mm, and the spacing between the wells connected to the microchannel may be 1.5 to 5 mm, specifically 2.5 to 4.5 mm. More specifically, the diameter of the well may be 2.0 mm or 3.1 mm, the spacing of the wells connected to the microchannel may be 2.5 mm or 4.5 mm, and most specifically, when the diameter of the well is 2.0 mm, the spacing of the wells is 2.5 mm, and when the diameter of the wells is 3.1 mm, the spacing between the wells may be 4.5 mm.
  • the reservoir may be located at both ends of the device.
  • the reservoirs are located at both ends of the device, and are connected to one or more wells of the culture chamber and microchannels, and are also connected between each well by microchannels, so that the reservoir-at least one well-reservoir is connected, so that the culture solution is transferred to the whole. can be supplied and shared.
  • the cell aggregate is derived from any one of mesenchymal stem cells, neural stem cells, vascular endothelial cells, induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells, tissue stem cells, fetal stem cells, cancer stem cells, and cardiac cells. spheroids or organoids.
  • the "spheroid" refers to an aggregate of cells having a spherical shape. What is referred to as a substantially spherical shape is not limited to a perfectly spherical one, and a slightly flattened shape may also be included.
  • the "organoid” refers to a micro-organism manufactured in the form of an artificial organ by culturing cells derived from tissues or pluripotent stem cells in a 3D form.
  • the organoids are three-dimensional tissue analogues containing organ-specific cells that arise from stem cells and self-organize (or self-pattern) in a manner similar to the in vivo state, and are specified by limited factor (Ex. growth factor) patterning. organization can develop.
  • the organoid has the intrinsic physiological properties of a cell, and may have an anatomical structure that mimics the original state of a cell mixture (including not only defined cell types, but also residual stem cells, proximal physiological niche). .
  • the organoid may have a shape and tissue-specific function, such as an organ, in which cells and cell functions are better arranged through a three-dimensional culture method, and have functionality.
  • the cell aggregate is brain, optic cup, kidney, liver, pancreas, neural tube, stomach, large intestine, prostate, breast, heart, salivary gland, endometrium, It may be one or more selected from the group consisting of mammary gland, thyroid, tongue, small intestine, esophagus, spinal cord, skin, bile duct, lung, blood vessel, muscle, adrenal cortex and thyroid organoid.
  • Another aspect of the present invention is the device; stirrer; and a culture medium shared through a microchannel; provides a cell aggregate culture system comprising.
  • the “rocker” may impart a dynamic flow to the culture solution by moving the culture device at a certain period.
  • the vibrator is sufficient as long as it can impart a dynamic flow to the culture solution by changing the position of the device, and the range or form of motion is not particularly limited.
  • the "culture medium” is both a culture medium for cells and a transmission medium for nutrients or oxygen.
  • the culture medium may supply nutrients or oxygen necessary for cells and remove wastes.
  • the device may swing motion by the vibrator.
  • the “swing motion” refers to an operating form of a mechanical device, and refers to a motion in which a driving part reciprocates a predetermined section rather than rotating about an axis.
  • the culture medium in the device can reciprocate within the chamber at a predetermined cycle, and an environment in which the cell aggregate can be stably cultured can be established.
  • Another aspect of the present invention provides a method of culturing a cell aggregate using the culture system.
  • the culture refers to a process of maintaining and growing cells under suitable conditions, and suitable conditions include, for example, the temperature at which the cells are maintained, nutrient availability, atmospheric CO 2 content, and cell density.
  • Conditions suitable for the formation of the cell aggregate may be conditions that facilitate or allow cell differentiation and formation of multicellular structures.
  • a chip composed of a culture chamber in which the organoids are to be cultured and a reservoir to contain the culture medium was implemented, and the diameter and spacing of the wells could be selected according to the purpose of the experiment and the characteristics of the organoid. Specifically, if the goal is to form high-efficiency organoids, the culture efficiency can be increased by reducing the size and spacing of the wells. .
  • the HD chip was basically manufactured using a PDMS polymer using a general microfluidic chip manufacturing method.
  • the specific method of manufacturing the HD chip is a soft lithography process in which a desired plate design is designed (FIG. 1), a embossed patterned silicon wafer is manufactured through a lithography process, and then PDMS (Polydimethylsiloxane) is cured using this as a template.
  • fabricate the device pattern PDMS through After shaping with a blade, use a biopsy punch to punch a hole in the well chamber or the inlet of the culture medium.
  • the devices made in this way are activated by irradiating the surface with oxygen plasma at 60W for 1 minute, and then attaching them to each other. For complete bonding, it is placed in an oven over 70 degrees overnight and then sterilized through high-temperature autoclaving and UV irradiation.
  • hADSC human adipose stem cells
  • human adipose stem cells hADSCs
  • hADSCs human adipose stem cells
  • the cells sink by gravity and gather at the end of the culture droplet. Over time, the cells aggregate and confirm the spheroid/organoid morphology at the level of 6000 cells/organoid. ( Figure 2 below).
  • the device of the present invention can exchange the consumed culture solution and the secreted wastes while continuously mixing the culture solution of both culture solution storage reservoirs and the culture solution of each culture chamber using a stirrer (rocker).
  • a stirrer rocker
  • spheroids of uniform size can be formed, and the size of the spheroids can be adjusted according to the number of injected cells, and long-term culture from the initial stage of spheroid formation (long-term culture) ), it was confirmed that stable spheroid culture was possible without attachment or deformation to the device surface.
  • HD chip devices can be produced with various materials, but especially if they are made of PDMS material, they can be recycled through sterilization.
  • the suspension culture chip was fabricated with PDMS, and even when reused more than 10 times for culturing human adipose-derived stem cell (hADSC) spheroids, hADSC spheroids were well formed each time, and high cell viability was confirmed without apoptosis (Fig. 5). .
  • hADSC human adipose-derived stem cell
  • cell spheroid cell spheroid
  • hydrogel gel bed
  • hydrogel gel encapsulation
  • mixed culture combination
  • the hanging drop method using the Petri dish lid which was generally used in the past, requires skill to form uniform culture medium droplets, is very cumbersome to change the culture medium, and has a small total amount of culture medium, so cells and spheroids/organs sensitive to the culture environment In the case of cells that take time to form nodal cells, there is a problem in that viability is greatly reduced.
  • Human neural stem cells generally form spheroids while naturally aggregating with each other through suspension culture in a Petri dish. It is known that there is a very large difference between batches in the proliferation and differentiation capacity of the cells constituting the roids.
  • An HD chip culture system was applied for the production of cardiac spheroids using cardiomyocytes induced by direct reprogramming from mouse fibroblasts.
  • the cardiac spheroids formed through HD chip culture were structurally much more developed compared to the conventional suspension culture method in Petri dishes or culture in U-bottom well-plates, and cardiomyocyte markers ( ⁇ -actinin) expression was greatly improved and it was confirmed that it had a clearer ⁇ -actinin pattern.
  • the ⁇ -actinin structure was more clearly formed in the cardiac spheroids cultured on the HD chip, and since it has a more patterned arrangement with adjacent cells, when using the HD chip, the electrophysiology such as heartbeat is compared with the conventional method. It can be seen that cardiac spheroids with higher maturity and functionality can be manufactured from a mechanical point of view.
  • Fig. 11A, B While forming and culturing brain organoids derived from human induced pluripotent stem cells (human iPSC) under each condition (Fig. 11A, B), the observed morphology and (Fig. 11C) qPCR results for analyzing the expression of neuronal differentiation markers were confirmed (Pax6) - culture day 25 and MAP2 - culture day 27).
  • FIG. 11A, B It was confirmed that the size of brain organoids cultured on the HD chip was larger than that of the brain organoids cultured on the U-bottom well-plate as a control, (FIG. 11C) vascular cells in the HD chip ( As a result of checking the gene expression of brain organoids co-cultured with EC), it was confirmed that the expression of the neuronal precursor cell marker (Pax6) and the neuronal cell marker (MAP2) was significantly increased.
  • Pax6 neuronal precursor cell marker
  • MAP2 neuronal cell marker
  • qPCR quantitative PCR
  • HEM Human iPSC-derived liver organoids
  • HD chip can enhance hepatocellular differentiation and vascular maturation of hepatic organoids (HEM) and reduce apoptosis. It was possible to manufacture liver organoids of better quality by confirming.
  • Experimental Example 6-3 Marker expression analysis of human iPSC-derived liver organoids (HEM)
  • HEM human iPSC-derived liver organoids
  • liver organoids cultured on HD chip As a result, as confirmed in FIG. 14 , it was confirmed that the expression level of HNF4A, a marker of liver differentiation, and the expression of CD31, a vascular marker, were further enhanced in liver organoids cultured on HD chip compared to the control group, U-bottom plate and microwell. . It was confirmed that the shape and shape of the formed liver organoids were also uniformly formed compared to the control group.
  • the HD chip can promote hepatocellular differentiation and vascular maturation of liver organoids (HEM), making it difficult to produce high-quality liver organoids. It was confirmed that it is possible.
  • HEM liver organoids
  • HEM human iPSC-derived liver organoids
  • liver organoids cultured on HD chip As a result, as shown in FIG. 15 , it was confirmed that the expression level of ALB, a marker of liver differentiation, and the expression of CD31, a vascular marker, were further enhanced in liver organoids cultured on HD chip compared to the control group, U-bottom plate and microwell. . It was confirmed that the shape and shape of the formed liver organoids were also uniformly formed compared to the control group.
  • the HD chip can promote hepatocellular differentiation and vascular maturation of liver organoids (HEM), making it difficult to produce high-quality liver organoids. It was confirmed that it is possible.
  • HEM liver organoids
  • liver differentiation markers AFP and HNF4A were higher in liver organoids cultured on HD chip compared to the control group U-bottom well-plate and microwell, and F-actin staining showed higher expression of actin.
  • organoids with a uniform shape were formed in the HD chip group.
  • the urea synthesis ability which is a liver functional index
  • the urea synthesis ability of the liver organoids cultured on the HD chip was significantly increased compared to the liver organoids cultured in the control system, as confirmed in FIG. 16B .
  • liver organoids with improved functionality could be manufactured using the HD chip compared to the conventional organoid culture system, U-bottom well-plate and microwell.
  • Human iPSC-derived liver organoids were cultured for 10 days, 15 days, and 30 days in each culture system, and then marker expression was compared through immunostaining.
  • liver organoids cultured on HD chip was maintained uniformly for a long period of time compared to the control group U-bottom plate and microwell, and mature liver differentiation markers (middle and late markers) It was confirmed that phosphorus HNF4A and ALB were also expressed at higher levels.
  • liver organoids cultured in U-bottom plate and microwell died when cultured for more than 30 days, but liver organoids cultured in HD chip form a structure specific to liver tissue (HD chip group high magnification image). It was confirmed that noids were formed.
  • the high-efficiency HD chip can simultaneously culture spheroids/organoids in 100 wells, and like the existing 25 well HD chip, it has a design that can overlap each other in the vertical direction, and it is put on a tray plate for culture. .
  • the HD chip is suitable for culturing delicate organoids because it enables material exchange through smooth culture medium circulation using continuous flow, and at the same time, organoids cannot pass to other chambers or be directly damaged by the flow. .
  • Simulations were performed to compare the oxygen transfer rates from the U bottom plate and the HD chip to the inside of the organoid. It is a simulation result of a steady state state through the average flow, and corresponds to a simulated value of the overall average value of the culture.
  • the oxygen concentration in the HD chip (FIG. 20A) and the oxygen concentration in the U bottom plate well (FIG. 20B) are shown in three-dimensional (left) and cross-sectional (right) images, and the red arrows in each cross-sectional image are shown.
  • a corresponding oxygen concentration numerical graph (FIG. 20C) was derived.
  • the HD chip culture system will be more effective in culturing organoids where mass transfer to the center of organoids where cells are gathered at high density is important.
  • Experimental Example 7-2 Uniformity analysis of human iPSC-derived liver organoids produced on a high-efficiency chip (100-well HD chip)
  • a total of 600,000 cells per chip were seeded (seeding) by adjusting the number of cells to 6000 per well.
  • Ki67 immunostaining In order to confirm whether the additionally formed liver organoids have proliferative ability, this was confirmed through Ki67 immunostaining.
  • the HD chip is more suitable for mass production of uniform liver organoids at the same time compared to the conventional organoid culture system, U-bottom well plate and microwell.
  • liver organoids HEM
  • liver tissue markers cultured in an existing U-bottom well plate while simultaneously culturing 100 human iPSC-derived liver organoids (HEM) produced on a high-efficiency 100-well HD chip. The uniformity was compared.
  • liver organoids As a result, as confirmed in FIG. 22, when quantitative PCR analysis was performed on representative liver differentiation markers AFP, HNF4A, and ALB, compared to the gene expression distribution of liver organoids cultured in the conventional U-bottom well plate, HD chip It was confirmed that the gene expression of liver organoids prepared using Through this, it was verified that the production of liver organoids with uniform expression of major differentiation markers was possible through high-efficiency suspension culture using the HD chip.
  • HEMKS human iPSC-derived liver organoids
  • NASH nonalcoholic steatohepatitis
  • Oleic acid a free fatty acid
  • CYP3A4 activity cytochrome activity
  • liver organoids including immune cells (Kupffer cells) and stromal cells (hepatic astrocytes) constituting the liver tissue microenvironment were prepared.
  • EHM nonalcoholic steatohepatitis
  • Ezetimibe an effective drug for the treatment of fatty liver, is a drug candidate group that was previously used to treat hyperglycemic cholesterol and lipid abnormalities as a cholesterol absorption inhibitor.
  • liver organoids including immune cells (Kupffer cells) and stromal cells (hepatic astrocytes) constituting the liver tissue microenvironment were prepared.
  • an HD chip in which liver organoids are cultured is applied to a commercial plate reader equipment to perform on-chip analysis.
  • the high-efficiency HD chip is designed and manufactured in the same standard as the commercially available 384-well plate, so it can be used interchangeably with existing analysis devices such as plate readers.
  • Human iPSC-derived pancreatic organoids were cultured using the prepared HD chip.
  • the control group used the U-bottom well-plate and microwell, which are most widely used for 3D organoid production.
  • P iPSC-derived pancreatic progenitor cells
  • E vascular endothelial cells
  • M mesenchymal stem cells
  • pancreatic organoids cultured on the HD chip were more uniformly and uniformly formed than the control group.
  • the endoderm differentiation marker SOX17, pancreatic progenitor cell markers PDX1, NKX6.1, and beta cell markers in pancreatic organoids cultured on HD chip compared to the control U-bottom plate and microwell group. It was confirmed that the expression of phosphorus CHGA and Insulin was higher, and the expression of CD31, a vascular marker, was further enhanced.
  • pancreatic differentiation markers PDX1, KRT19
  • vascular markers PECAM1
  • proliferation-related markers KI67
  • the manufactured HD chip is a device capable of improving the uniformity of pancreatic organoids as well as the expression level of pancreatic-specific differentiation markers compared to the existing commercialized platform.
  • PEM Human iPSC-derived pancreatic organoids
  • human iPSC-derived pancreatic organoids like liver organoids, were capable of mass production of uniform pancreatic organoids on a 100-well HD chip, and 100 pancreatic organoids induced by differentiation in beta cell culture medium were possible. It was confirmed that NOD was producing insulin at a uniform and high level.
  • the two spheroids collected on one chip are located at the vertices of the concave part of the culture medium droplets pooling in the well, confirming that fusion between the spheroids is possible (FIG. 29 right side) ).
  • the HD chip can be used for this purpose and applied as a culture system for the production of organoids with multiple tissue structures.
  • liver-pancreatic organoids After culturing human iPSC-derived liver organoids (HEMKS) and pancreatic organoids (PEM) on each HD chip, the two chips are vertically joined 1:1 to move organoids from one chip to another. After fusion, liver-pancreatic junction organoids were prepared.
  • HEMKS human iPSC-derived liver organoids
  • PEM pancreatic organoids
  • each cultured organoid should be transferred one by one in a 1:1 ratio and conjugated (Fig. 30A left).
  • Fig. 30B right bonding is possible by efficiently moving the organoids in all wells at once.
  • liver and pancreatic differentiation markers were compared through qPCR analysis, the expression of hepatic differentiation markers (ALB, HNF4A), pancreatic differentiation markers (NKX6.1, PDX1) and hepato-pancreatic bile duct markers (KRT19) was significantly higher. It was confirmed that the HD chip group significantly increased compared to the control group (U-bottom plate) (FIG. 30D).
  • HEMKS human iPSC-derived liver organoids
  • PEM pancreatic organoids
  • liver organoids As a result, as confirmed in FIG. 32, as a result of moving the liver organoids toward the pancreatic organoid by overlapping two 100-well HD chips in the vertical direction, it was possible to move the liver organoids with a success rate of more than 95%, so that a single It was confirmed that high-efficiency mass production of liver-pancreatic multiple organoids is possible through efficient organoid conjugation as well as mass production of organoids.
  • HNF4A a liver-specific differentiation marker
  • NKX6.1 a pancreatic differentiation marker
  • MCD Methionine-Methionine-Methionine- Liver organoid transplantation was performed in a mouse NASH model induced with steatohepatitis using choline-deficient) feed.
  • MCD diet deficient in methionine and choline induces steatohepatitis, oxidative stress, inflammation and fibrosis, which is a feed that induces lesions of nonalcoholic steatohepatitis (NASH). used
  • the normal group (Normal) was bred for 4 weeks on a normal diet (Normal Chow), and the steatohepatitis induction group (NASH) was bred for 4 weeks using MCD feed, but after the first 2 weeks, through the hepatic portal vein NASH disease was induced by injecting only liver organoid culture medium (100 ⁇ L) and feeding the MCD diet continuously for the remaining 2 weeks.
  • the group (NASH + Organoid) transplanted with liver organoids into steatohepatitis-induced mice were bred for 4 weeks with MCD feed, but after the first 2 weeks, liver organoids produced from HD chip were injected through the portal vein (100 ⁇ m ).
  • NASH disease was continuously induced while feeding MCD feed for the remaining 2 weeks.
  • a total of 400 liver organoids produced by 4 HD chips per mouse were collected in an insulin syringe and transplanted through the portal vein ( FIG. 33A ).
  • ALT and LDH which are indicators of hepatotoxicity
  • the level was measured to be significantly higher in the mice group induced with NASH disease by the MCD diet compared to the normal group.
  • NASH + Organoid transplanted with liver organoids because the factors contained in the culture medium can help restore liver function because the NASH group received the organoid culture medium up to the 3rd day after injecting the culture medium and organoids through the portal vein.
  • ALT and LDH levels gradually recovered immediately after injection.
  • liver function decreased (ALT and LDH levels increased), but in the NASH group transplanted with liver organoids, ALT and LDH levels were reduced to near normal levels, confirming a marked improvement in liver function.
  • ALB level which is an indicator of liver function
  • HEM human iPSC-derived liver organoids
  • NASH mouse steatohepatitis
  • liver organoids function well by engrafting in fatty liver tissue
  • immunostaining for hepatic differentiation markers (ALB, SOX17) and tight junction markers (ZO1) was performed using an antibody that reacts specifically only to human proteins.
  • human protein differentiation markers were expressed only in mouse liver tissue transplanted with human iPSC-derived organoids ( FIG. 34C ). Since liver organoids were injected through the portal vein in this experiment, the transplanted organoids can be evenly distributed in the liver tissue, and therefore it is expected to be effective in restoring the liver function inhibited by steatohepatitis.
  • SMA-positive fibrosis was observed in the liver tissue, but in the NASH model treated with liver organoid transplantation, the fibrosis site in which SMA was expressed was significantly reduced.
  • the high-efficiency high-throughput HD chip can be used as an efficient culture system for mass production of organoid-based cell therapeutics for liver damage treatment.
  • the hADSC spheroids were fluorescently labeled by staining with calcein, which stains live cells, for 10 minutes.
  • hADSC spheroids cultured on one HD chip were labeled to have different fluorescence intensities, and the fluorescence intensity was immediately imaged and analyzed on the chip.
  • the HD chip (25 well ver.) manufactured in the present invention is designed according to the standard of 384 well-plate, it can be directly analyzed using commercially available general-purpose plate reader equipment. That is, after culturing spheroids or organoids in the chip, fluorescence staining can be performed and quantification can be performed by immediately measuring the fluorescence intensity through a plate reader (FIG. 35).
  • the device of the present invention described above is made of a PDMS polymer material, there is a limit in terms of mass mass production. Therefore, it was confirmed whether the device of the present invention of the design to be actually commercialized can be manufactured by 3D printing when the 3D printing process is introduced to overcome this problem.
  • the device of the present invention can be easily manufactured through 3D printing, and design changes are easy because 3D printing is used, and standardization and mass production in material selection are easy. It was found that there is an advantage that it can be produced even with plastic-based materials.
  • a ring-shaped accessory is used to use the viscosity and surface tension of the gel solution even before the gel solution touches the culture solution. Because it can have a specific shape, hydrogels with various properties can be used, and various types of gels used for spheroid/organoid culture can be applied (e.g., low-viscosity gel, culture medium before solidification). gels, etc., which should not be in contact with
  • the accessory is designed to fit the shape of the chip body and can be attached and detached, and when the spheroid/organoid is well formed after time passes, the accessory can be removed and culture can be continued (FIG. 37).
  • This conventional method has a relatively high loss rate and is difficult to apply to the culture of large-sized spheroids or, in particular, cell aggregates at the same level as organoids.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 세포 집합체 배양을 위한 미세유체 현적배양 디바이스에 관한 것으로 종래 오가노이드/스페로이드 배양 기술에 비하여 본 발명 디바이스에서 배양된 오가노이드/스페로이드는 더욱 증진된 줄기세포 활성 및 높은 분화도를 가지게 하는 효과가 있고, 반복 재사용이 가능하고 웰 크기 및 개수를 변경하여 다양한 용도에 따른 플랫폼으로 활용이 가능할 수 있으며, 디바이스에 교반기를 활용함으로써 마이크로 채널을 통해 레저버 및 배양 챔버 내 웰에 위치한 배양액이 계속 흐르게 되어 전체 웰의 환경이 동일하도록 유지되고, 세포 집합체를 고효율로 배양할 수 있다. 또한, 상기 세포 집합체 배양 시스템은 질환 표현형이 유지되는 세포 집합체의 대량생산을 통해 질환 연구 및 약물 스크리닝 모델로서의 활용이 가능하고 또한 치료용 세포 집합체의 대량생산을 통해 질환 치료를 위한 이식 치료에도 적용이 가능하다.

Description

세포 집합체 배양을 위한 미세유체 현적배양 디바이스
본 발명은 세포 집합체 배양을 위한 미세유체 현적배양 디바이스에 관한 것이다.
조직 특이적 오가노이드 배양 기술은 현재 줄기세포 연구에서 가장 각광을 받고 있는 최첨단분야로서 난치성 질환 모델, 환자 맞춤형 약물 스크리닝 플랫폼, 신약 개발을 위한 체외 모델 등 재생의학 및 신약 연구 분야에서 활용성이 무한하게 확장될 수 있다.
미세유체 디바이스를 이용하여 세포를 배양하는 기술은 매크로 스케일 배양과 달리 세포에 적합한 미세한 환경을 제공하고 주변 환경에 예민하게 반응하는 세포들의 배양 조건을 정밀하게 조절하는 기술로 최근 세포조직공학 분야에서 각각 받고 있다.
하지만 동적 배양(dynamic culture)은 정적 배양(static culture)과 달리 유체의 흐름이 필요하므로 시린지 펌프나 유압 펌프와 같은 복잡한 설비, 및 사용자의 높은 숙련도가 요구된다.
기존의 오가노이드 연구에서 배양액에 흐름을 주기 위해 사용한 방법으로는 배양접시(culture dish)를 궤도형 쉐이커(orbital shaker)에 탑재하거나 스피너 플라스크(spinner flask)와 같은 바이오리액터를 이용하였으나, 각 오가노이드에 제공되는 유체의 흐름이 균일하지 않아서 오가노이드 연구에서 가장 큰 문제점으로 지적되는 극심한 개체 차이(batch-to-batch variation)를 야기할 수 있다.
기존의 현적 배양 기술은 유리 또는 페트리 접시 위에 마이크로 리터 부피 (20-50 μl)의 세포 배양액을 올리면서 시행된다. 그 후, 유리 또는 페트리 접시를 뒤집는다. 이 물방울은 표면장력 때문에 떨어짐이 방지되며, 배양액 안에 매달려있는 세포들은 중력으로 인해 정착되며, 배양액 내부에 정착되어 있는 세포들은 인접한 세포들과 상호작용하여 결합을 이루면서 3차원 스페로이드 또는 3차원 마이크로 조직을 형성한다. 이러한 기술에서의 가장 큰 어려움은 액적 (Droplet)으로 부터의 배양액 교환이다.
이에, 본 발명자들은 실험실에서 흔히 사용되는 교반 장치를 이용해 별도의 설비 없이 유체의 흐름을 생성할 수 있는 미세유체 현적배양 디바이스를 개발하고, 오가노이드의 생존능, 분화능 및 기능성을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 하나 이상의 웰을 포함하는 배양 챔버; 배양액을 저장하는 하나 이상의 레저버; 및 배양 챔버 및 레저버를 연결하는 마이크로 채널;을 포함하는 세포 집합체 배양 디바이스를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 디바이스; 교반기(rocker); 및 마이크로 채널을 통해 공유되는 배양액;을 포함하는 세포 집합체 배양 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 배양 시스템을 이용하여 세포 집합체를 배양하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 하나 이상의 웰을 포함하는 배양 챔버; 배양액을 저장하는 하나 이상의 레저버; 및 배양 챔버 및 레저버를 연결하는 마이크로 채널;을 포함하는 세포 집합체 배양 디바이스를 제공한다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 배양 챔버는 복수의 웰을 연결하는 마이크로 채널을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 웰의 지름은 1.5 내지 4mm이고, 상기 마이크로 채널로 연결된 웰들의 간격은 1.5 내지 5mm 일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 레저버는 디바이스 양단에 위치하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 세포 집합체는 중간엽줄기세포, 신경줄기세포, 혈관내피세포, 유도만능줄기세포, 배아줄기세포, 조직줄기세포, 태아줄기세포, 암줄기세포 및 심장세포 중 어느 하나의 유래된 스페로이드 또는 오가노이드일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 세포 집합체는 뇌, 안배(optic cup), 신장, 간, 췌장, 신경관, 위장, 대장, 전립선, 유방, 심장, 침샘 (salivary gland), 자궁내막(endometrium), 젖샘(mammary gland), 갑상선, 혀, 소장, 식도, 척수, 피부, 담관, 폐, 혈관, 근육, 부신피질 및 갑상샘 오가노이드로 이루어진 군에서 하나에서 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 디바이스; 교반기(rocker); 및 마이크로 채널을 통해 공유되는 배양액;을 포함하는 세포 집합체 배양 시스템을 제공한다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 디바이스는 상기 교반기에 의해 요동 운동(swing motion)하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 배양 시스템을 이용하여 세포 집합체를 배양하는 방법을 제공한다.
본 발명의 세포 집합체 배양 디바이스, 이를 포함하는 세포 집합체 배양 시스템 및 이를 이용하는 세포 집합체를 배양하는 방법은 종래 세포 집합체 배양 기술에 비하여 더욱 증진된 줄기세포 활성 및 높은 분화도의 효과가 있다.
상기 세포 집합체 배양 디바이스는 반복 재사용이 가능하고 웰 크기 및 개수를 변경하여 다양한 용도에 따른 플랫폼으로 활용이 가능할 수 있다.
또한, 상기 세포 집합체 배양 시스템은 교반기를 활용함으로써 마이크로 채널을 통해 레저버 및 배양 챔버 내 웰에 위치한 배양액이 계속 흐르게 되어 전체 웰의 환경이 동일하도록 유지되고, 세포 집합체를 균일하고, 고효율로 배양할 수 있다.
그리고, 상기 세포 집합체 배양 시스템은 질환 표현형이 유지되는 세포 집합체의 대량생산을 통해 질환 연구 및 약물 스크리닝 모델로서의 활용이 가능하고 또한 치료용 세포 집합체의 대량생산을 통해 질환 치료를 위한 이식 치료에도 적용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 현적배양 칩 (hanging drop chip; HD chip)의 구조를 나타낸 것이다.
도 2 및 3은 현적배양 칩(HD chip)의 구조와 배양 방식을 나타내는 도면이다.
도 4는 현적배양 칩(HD chip)을 이용한 스페로이드 형성 및 배양 사진이다.
도 5는 PDMS로 제작된 현적배양 칩(HD chip)의 재사용 가능성 (reusability)을 나타내는 도면이다.
도 6은 현적배양 칩(HD chip)을 이용한 다양한 세포집합체 형성 방식을 나타내는 사진이다.
도 7은 기존 페트리 디쉬 현적배양 방식 비교를 위하여 지방줄기세포 스페로이드 (hADSC spheroid) 배양한 결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 기존 U-bottom 웰-플레이트 배양 방식과의 비교를 위하여 지방줄기세포 스페로이드 (hADSC spheroid) 배양한 결과를 나타낸 사진이다.
도 9는 다양한 스페로이드/오가노이드 배양 적용 예시로서 신경줄기세포 스페로이드 (hNSC spheroid)를 배양한 결과를 나타낸 사진이다.
도 10은 다양한 스페로이드/오가노이드 배양 적용 예시로서 심장 스페로이드 (cardiac spheroid)를 배양한 결과를 나타낸 사진이다.
도 11은 다양한 스페로이드/오가노이드 배양 적용 예시로서 뇌 오가노이드 (human iPSC-derived brain organoid)를 배양한 결과를 나타낸 사진이다.
도 12는 HD chip에서 배양된 간 오가노이드 (Human iPSC-derived liver organoid)의 세포 구성에 따른 분화능 차이 분석결과를 나타낸 것이다.
도 13은 인간 iPSC 유래 간 오가노이드(Human iPSC-derived liver organoid, HEM)의 장기배양 분화능을 비교한 결과이다.
도 14 및 15는 인간 iPSC 유래 간 오가노이드(Human iPSC-derived liver organoid, HEM)의 마커 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 인간 iPSC 유래 간 오가노이드의 마커 발현 및 기능성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 인간 iPSC 유래 간 오가노이드의 장기 배양 시 마커 발현 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 18 내지 20은 고효율 (high-throughput) HD chip 제작 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 100-well HD chip에서 생산된 인간 iPSC 유래 간 오가노이드 (Human iPSC-derived liver organoid)의 균일성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 고효율 (high-throughput) HD chip에서 배양된 인간 iPSC 유래 간 오가노이드 (Human iPSC-derived liver organoid) 유전자 발현의 균일성 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 인간 iPSC 유래 정상 및 비알콜성 지방간염 오가노이드의 대량생산 및 기능성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 인간 iPSC 유래 비알콜성 지방간염 오가노이드의 대량생산 및 유효약물 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 인간 iPSC 유래 비알콜성 지방간염 오가노이드의 대량생산 및 ROS 정량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 인간 iPSC 유래 췌장 오가노이드 (Human iPSC-derived pancreas organoid) 대량 배양 결과를 기존 Microwell 및 U-bottom 웰-플레이트 방식과 비교하여 나타낸 것이다.
도 27은 인간 iPSC 유래 췌장 오가노이드 (Human iPSC-derived pancreas organoid)의 마커 발현 및 분화능 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 인간 iPSC 유래 췌장 오가노이드 (Human iPSC-derived pancreas organoid)의 인슐린 생산 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 29는 Chip-to-chip transfer를 통한 spheroid (인간 지방줄기세포 (hADSC) 스페로이드) fusion 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 인간 iPSC 유래 간 오가노이드-췌장 오가노이드 (Human iPSC-derived liver-pancreas fused organoid)의 이종장기간 접합방식을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 31은 고효율 (high-throughput) HD chip을 제작하고 이를 통한 지방줄기세포 스페로이드 (hADSC spheroid)간 고효율 접합결과를 나타낸 것이다.
도 32는 HD chip 기반 간-췌장 오가노이드의 고효율 접합 결과를 나타낸 것이다.
도 33은 HD chip에서 배양된 간 오가노이드 (Human iPSC-derived liver organoid)의 마우스 지방간염 모델에 이식결과를 나타낸 것이다.
도 34는 HD chip에서 배양된 간 오가노이드 (Human iPSC-derived liver organoid)의 마우스 지방간염 모델에 이식 결과를 나타낸 것이다.
도 35는 On-chip 약물 스크리닝 및 플레이트 리더를 이용한 형광 정량 분석 (hADSC - 인간 지방줄기세포 스페로이드) 결과를 나타낸 것이다.
도 36은 3D 프린팅을 이용한 HD chip 시제품 제작 결과를 나타낸 것이다.
도 37은 액세서리를 이용한 3차원 스페로이드/오가노이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 38은 액세서리를 이용한 다층 구조의 3차원 지방줄기세포 (ADSC) 스페로이드 배양 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 일 양상은 하나 이상의 웰을 포함하는 배양 챔버; 배양액을 저장하는 하나 이상의 레저버; 및 배양 챔버 및 레저버를 연결하는 마이크로 채널;을 포함하는 세포 집합체 배양 디바이스를 제공한다.
상기 배양 챔버는 하나 이상의 웰을 포함하고, 상기 웰은 배양액으로 채워져 있어 세포 집합체를 배양할 수 있다. 상기 배양 챔버의 웰은 1열로 배양될 수도 있고, 배양 규모나 용도를 고려하여 다열로 구성될 수 있다.
상기 레저버는 배양 챔버에 배양액을 마이크로 채널을 통해 공급, 공유하는 장치로서 실험의 목적을 고려하여 다양한 형태 및 개수로 제작될 수 있다.
상기 마이크로 채널은 배양 챔버 및 레저버를 연결하는 것으로, 배양액이 흐를 수 있다면, 그 형태, 크기, 길이 등은 제한없이 변경이 가능하다.
본 발명의 일 구체예로서 상기 배양 챔버는 복수의 웰을 연결하는 마이크로 채널을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 배양 챔버는 하나 이상의 웰을 포함하기 때문에, 배양 챔버와 레저버 사이의 마이크로 채널뿐만 아니라 웰들 사이의 마이크로 채널을 더 포함하여 복수의 웰과 레저버 사이의 배양액을 공유하여 일정한 환경을 유지할 수 있다. 한편 복수의 웰 사이의 마이크로 채널은 일부의 실험의 목적을 고려하여, 일부의 웰 사이에만 형성될 수도 있다.
본 발명의 일 구체예로서 상기 웰의 지름은 1.5 내지 4mm, 구체적으로 2 내지 3.1mm이고, 상기 마이크로 채널로 연결된 웰들의 간격은 1.5 내지 5mm, 구체적으로 2.5 내지 4.5mm 일 수 있다. 더욱 구체적으로 상기 웰의 지름은 2.0mm 또는 3.1mm이고, 상기 마이크로 채널로 연결된 웰들의 간격은 2.5mm 또는 4.5mm일 수 있고, 가장 구체적으로 상기 웰의 지름이 2.0mm인 경우 웰들의 간격은 2.5mm이고, 웰의 지름이 3.1mm인 경우 웰들의 간격은 4.5mm일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 레저버는 디바이스 양단에 위치하는 것일 수 있다. 상기 레저버는 디바이스 양단에 위치하고, 배양 챔버의 하나 이상의 웰과 마이크로 채널로 연결되어 있으며, 각 웰 사이 또한 마이크로 채널로 연결되어 있어, 레저버-하나 이상의 웰-레저버가 연결되어, 배양액이 전체로 공급, 공유될 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 세포집합체는 중간엽줄기세포, 신경줄기세포, 혈관내피세포, 유도만능줄기세포, 배아줄기세포, 조직줄기세포, 태아줄기세포, 암줄기세포 및 심장세포 중 어느 하나의 유래된 스페로이드 또는 오가노이드 일 수 있다.
상기 "스페로이드"는 구 형상을 한 세포의 응집괴를 의미한다. 실질적으로 구 형상이라고 칭하는 것은 완전한 구 형상의 것에 한정되는 것이 아니라, 약간 편평 형상으로 된 형태도 포함될 수 있다.
상기 "오가노이드(organoid)"는 조직 또는 전분화능줄기세포에서 유래된 세포를 3D 형태로 배양하여 인공장기와 같은 형태로 제작한 초소형 생체기관을 의미한다. 상기 오가노이드는 줄기세포에서 발생하고 생체 내 상태와 유사한 방식으로 자가-조직화(또는 자가-패턴화)하는 장기 특이적 세포를 포함하는 삼차원 조직 유사체로서 제한된 요소(Ex. growth factor) 패터닝에 의해 특정 조직으로 발달할 수 있다. 상기 오가노이드는 세포의 본래 생리학적 특성을 가지며, 세포 혼합물(한정된 세포 유형뿐만 아니라 잔존 줄기 세포, 근접 생리학적 니치(physiological niche)를 모두 포함) 원래의 상태를 모방하는 해부학적 구조를 가질 수 있다. 상기 오가노이드는 3차원 배양 방법을 통해 세포와 세포의 기능이 더욱 잘 배열되고, 기능성을 가지는 기관 같은 형태와 조직 특이적 기능을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 세포 집합체는 뇌, 안배(optic cup), 신장, 간, 췌장, 신경관, 위장, 대장, 전립선, 유방, 심장, 침샘 (salivary gland), 자궁내막(endometrium), 젖샘(mammary gland), 갑상선, 혀, 소장, 식도, 척수, 피부, 담관, 폐, 혈관, 근육, 부신피질 및 갑상샘 오가노이드로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 디바이스; 교반기(rocker); 및 마이크로 채널을 통해 공유되는 배양액;을 포함하는 세포 집합체 배양 시스템을 제공한다.
상기 "교반기(rocker)"는 상기 배양 디바이스를 일정 주기로 운동시킴으로써 상기 배양액에 동적 흐름 (flow)을 부여할 수 있다. 상기 진동기는 상기 디바이스의 위치를 변화시켜 상기 배양액에 동적 흐름을 부여할 수 있으면 족하고, 운동의 범위나 형태가 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 "배양액(culture medium)"은 세포에 대한 배양매체인 동시에 영양분이나 산소 등의 전송매체이다. 상기 배양액은 세포에게 필요한 영양분이나 산소 등을 공급하고 노폐물을 제거할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 디바이스는 상기 진동기에 의해 요동 운동(swing motion)하는 것일 수 있다.
상기 "요동 운동(swing motion)"은 기계 장치의 작동 형태를 의미하는 것으로 구동 부분이 축을 중심으로 회전하는 것이 아니라 일정 구간을 왕복하는 운동을 의미한다.
상기 디바이스는 일정한 주기로 요동 운동하므로 상기 디바이스 내 배양액이 챔버 내에서 일정 주기로 왕복 운동할 수 있으며, 상기 세포 집합체가 안정적으로 배양할 수 있는 환경이 구축될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 배양 시스템을 이용하여 세포 집합체를 배양하는 방법을 제공한다.
상기 배양은 적합한 조건에서 세포를 유지 및 성장시키는 과정을 의미하며, 적합한 조건은 예컨대, 세포가 유지되는 온도, 영양소 가용성, 대기 CO2 함량 및 세포 밀도를 의미할 수 있다.
서로 다른 유형의 세포를 유지, 증식, 확대 및 분화시키기 위한 적절한 배양 조건은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 문서화 되어있다. 상기 세포 집합체 형성에 적합한 조건은 세포 분화 및 다세포 구조의 형성을 용이하게 하거나 허용하는 조건일 수 있다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 오가노이드 배양 디바이스의 제조
오가노이드가 배양될 배양 챔버와 배양액을 담을 레저버로 구성된 칩을 구현하였고, 실험 목적과 오가노이드의 특성에 따라 웰의 지름 및 간격을 선택할 수 있도록 구현하였다. 구체적으로 고효율 오가노이드 형성이 목표일 경우 웰의 크기와 간격을 줄여 배양 효율을 높일 수 있고, 오가노이드의 형성뿐만 아니라 분석까지 목표일 경우 기존의 플레이트와 규격을 맞춰 상용화된 플레이트 리더를 이용할 수 있다.
한편, 배양액의 표면장력을 이용하여 배양액 흐름 및 세포를 가둘 배양액 물방울을 유지할 수 있으며, HD chip은 기본적으로 PDMS 고분자를 이용하여 일반 microfluidic chip 제작 방식으로 제작하였다.
HD chip 제작의 구체적인 방법은 목적하는 플레이트 도안을 디자인 (도 1) 한 뒤 리소그래피 공정을 통해 양각 패턴 된 실리콘 웨이퍼를 제작하고, 이를 주형으로 이용해 PDMS (Polydimethylsiloxane)를 경화시키는 소프트 리소그래피 (soft lithography) 공정을 통해 디바이스 패턴 PDMS를 제작한다. 블레이드로 정형하고 바이옵시펀치 (biopsy punch)를 이용해 웰 챔버나 배양액 주입구에 구멍을 뚫어준다. 이렇게 만들어진 소자들은 표면에 산소 플라즈마를 60W로 1분간 조사해 활성화시킨 뒤 서로 붙여준다. 완전한 결합을 위해 70도 이상의 오븐에 하룻밤 둔 뒤 고온 고압 멸균 및 UV 조사를 통해 멸균한다.
그 결과, 도 2 상단과 같이 96 웰 디바이스 및 25 웰 디바이스를 제조하였다.
또한, 제작된 디바이스에 인간 지방줄기세포 (hADSC)를 배양하였을 때 하루 이내에 세포들이 뭉쳐 스페로이드를 형성할 수 있음 (hADSC의 경우 6시간 이내)을 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1에서 제조된 25 웰 디바이스에 인간 지방 줄기세포 (hADSC)를 넣고 이를 배양하였다.
25 웰 디바이스에 세포 현탁액을 주입하면, 중력에 의해 세포들이 가라앉으며 배양액 방울의 끝점에 모이게 되고, 시간이 지남에 따라 세포들이 서로 뭉치며 6000 cell/organoid 수준의 스페로이드/오가노이드 형태를 확인하였다 (도 2 아래).
한편, 본 발명의 디바이스는 교반기(rocker)를 이용해 양쪽 배양액 저장 레저버의 배양액과 각 배양 챔버의 배양액을 지속적으로 섞어주면서 소모된 배양액과 분비된 노폐물을 교환할 수 있다.
이를 통해 교반기 상에서도 HD chip 내에 배양액 물방울 구조가 안정적으로 유지되며, 양쪽의 레저버를 통해 손쉽게 배양액을 교체할 수 있음을 확인하였다 (도 3)
실험예 1: 현적배양 칩(HD chip)을 이용한 스페로이드 형성 및 배양 결과 확인
배양 챔버 수를 늘려 (96 well) 고효율 스페로이드/오가노이드 형성 플랫폼으로 사용이 가능함을 확인하였다 (도 4 좌측). 이러한 결과를 통해 한 번에 손쉽게 세포를 주입하여 스페로이드/오가노이드를 대량으로 형성할 수 있다.
도 4 우측에서 확인되는 바와 같이 HD chip을 이용하면 크기가 균일한 스페로이드를 형성할 수 있으며 주입하는 세포수에 따라 스페로이드 크기 조절이 가능하고, 스페로이드 형성 초기부터 장기 배양 (long-term culture) 하는 동안 디바이스 표면에 붙거나 변형없이 안정적인 스페로이드 배양이 가능함을 확인하였다.
실험예 2: PDMS로 제작된 현적배양 칩(HD chip)의 재사용 가능성 (reusability)의 확인
PDMS로 제작된 현적배양 칩(HD chip)의 재사용 가능성 (reusability)을 확인하였다.
HD chip 디바이스는 다양한 재료로 생산이 가능하지만 특히 PDMS 재질로 제작된 경우 멸균을 통한 재활용이 가능하다.
현적배양칩을 PDMS로 제작하였고, 실제로 인간 지방유래 줄기세포 (hADSC) 스페로이드 배양을 위해 10번 이상 재사용했을 때에도 hADSC 스페로이드가 매번 잘 형성되었으며 세포 사멸 없이 높은 세포 생존율을 확인하였다 (도 5).
실험예 3: 현적배양 칩(HD chip)을 이용한 다양한 세포집합체 형성 방식 확인 (다양한 방식의 On-chip cell/gel loading을 통한 3차원 스페로이드 및 오가노이드 형성 가능)
기존 스페로이드/오가노이드 배양 시스템은 단순 3차원 배양인 경우가 대부분인데 본 발명에서 개발된 HD chip 시스템을 이용하면 기존의 배양 시스템들로는 구현하기 어려운 다양한 방식의 on-chip 3차원 배양이 가능하다.
구체적으로 (1) 세포 스페로이드 (cell spheroid), (2) 하이드로젤 위에서의 배양 (gel bed), (3) 하이드로젤 내에서의 배양 (gel encapsulation), (4) 이를 혼합한 복합적 배양 (combination), (5) 이종의 하이드로젤 접합 (gel + gel fusion) 등 다양한 형태의 삼차원 세포집합체 배양이 가능함을 확인하였다 (도 6).
그 외에도 배양 과정 중 추가적으로 세포 주입이 가능하여 다양한 종류의 세포들로 구성된 고도화된 스페로이드 및 오가노이드 제작이 가능할 것으로 기대된다.
실험예 4: 기존 배양 방식과의 비교
실험예 4-1. 기존 페트리 디쉬 현적배양 방식과의 비교 (지방줄기세포 스페로이드 (hADSC spheroid) 배양)
기존에 일반적으로 사용되던 페트리 디쉬 뚜껑을 이용한 현적배양 방식(hanging drop)은 균일한 배양액 물방울 형성을 위해 숙련도가 요구되며 배양액 교체가 매우 번거롭고 배양액의 총량이 적어 배양환경에 민감한 세포 및 스페로이드/오가노이드 형성에 시간이 소요되는 세포의 경우 생존능이 크게 감소되는 문제점을 가지고 있다.
이와 달리 마이크로 채널을 통해 안정적으로 배양액이 공급되는 HD chip을 이용할 경우 도 7에서 확인된 바와 같이 향상된 세포 생존율과 활성을 가진 균일한 스페로이드/오가노이드를 형성할 수 있다.
실험예 4-2. 기존 U-bottom 웰-플레이트 배양 방식과의 비교 (지방줄기세포 스페로이드 (hADSC spheroid) 배양)
현재 널리 사용되는 U-bottom 웰-플레이트의 경우, 앞서 비교한 배양접시 현적배양과는 달리 높은 세포 생존능을 보였지만, 6일간의 배양 후 Live/dead assay를 진행한 결과, 스페로이드의 형태가 불규칙하고 비교적 성긴 구조를 띄는데, 이는 바닥면과의 접촉 때문으로 판단된다. 이와 달리 세포가 접촉하거나 붙을 수 있는 바닥면이 존재하지 않는 HD chip에서 배양한 지방줄기세포 스페로이드의 경우 균일한 구 형태의 모양과 세포 밀도가 높고 세포간 접합이 우수한 형태로 형성됨을 확인하였다 (도 8A).
U-bottom 플레이트의 각 웰에서 배양한 스페로이드와 HD chip 내의 각 웰에서 배양된 스페로이드에서 mRNA를 추출하여 줄기세포 유전자(Oct4, stemness marker)에 대한 qPCR을 진행한 결과, U-bottom 그룹과 비교하여 HD chip 그룹에서 Oct4 발현양이 크게 증진되었을 뿐 아니라 (도 8B) 발현의 균일성이 크게 향상되었음을 확인하였다 (도 8C)
따라서 이러한 결과를 통해 HD chip 배양 시스템을 이용하면 기존 방식에 비해 더욱 우수한 품질의 줄기세포 스페로이드 제작이 가능함을 알 수 있음.
실험예 5: 다양한 스페로이드/오가노이드 배양
실험예 5-1. 신경줄기세포 스페로이드 (hNSC spheroid) 배양
인간 신경줄기세포(hNSC)는 일반적으로 페트리 디쉬에서 부유 배양을 통해 자연스럽게 서로 뭉치면서 스페로이드를 형성하는데, 페트리 디쉬에서는 스페로이드가 무작위로 형성되기 때문에 다양한 크기 및 형태를 가지게 되어 균일성이 낮고 각 스페로이드를 구성하는 세포들의 증식 및 분화능에 있어 배치 간 차이가 매우 크다고 알려져 있다.
같은 페트리 디쉬에서 배양된 신경줄기세포 스페로이드와 같은 HD chip에서 배양된 신경줄기세포 스페로이드를 비교 분석한 결과, HD chip에서 배양된 스페로이드의 크기가 훨씬 균일하게 형성됨을 확인하였다 (도 9A). 줄기세포 유전자 (Oct4, stemness marker) 발현 분석을 위해 배양 6일차에 qPCR을 진행했을 때 HD chip에서 형성된 개별 스페로이드에서의 Oct4 유전자 발현이 페트리 디쉬에서 형성된 스페로이드보다 균일함을 확인하였다 (도 9B).
실험예 5-2. 심장 스페로이드 (cardiac spheroid) 배양
마우스 섬유아세포(fibroblast)로부터 직접교차분화(direct reprogramming) 방법으로 유도된 심근세포를 이용한 심장 스페로이드 제작을 위해 HD chip 배양 시스템을 적용하였다. 그 결과 도 10에서 확인되는 바와 같이 기존의 페트리 디쉬에서의 현적배양 방식이나 U-bottom 웰-플레이트에서의 배양과 비교하여 HD chip 배양을 통해 형성된 심장 스페로이드가 구조적으로 훨씬 발달했으며 심근세포 마커(α-actinin) 발현이 크게 향상되고 더욱 선명한 α-actinin 패턴을 가지고 있음을 확인하였다.
또한, HD chip에서 배양된 심장 스페로이드에서 더 명확하게 α-actinin 구조가 형성되었으며 근접한 세포들과 보다 패턴화된 배열을 가지고 있는 것으로 보아 HD chip을 이용하면 기존 방식과 비교해서 심장 박동 등 전기생리학적 측면에서 더욱 높은 성숙도와 기능성을 가지는 심장 스페로이드를 제작할 수 있음을 알 수 있다.
실험예 5-3. 뇌 오가노이드 (human iPSC-derived brain organoid) 배양
인간 유도만능줄기세포(human iPSC) 유래 뇌 오가노이드를 각 조건에서 형성하고 배양하면서 (도 11A, B) 관찰한 형태 및 (도 11C) 신경분화 마커 발현을 분석하기 위한 qPCR 결과를 확인하였다 (Pax6 - 배양 25일 및 MAP2 - 배양 27일).
(도 11A, B) 대조군인 U-bottom 웰-플레이트에서 배양된 뇌 오가노이드에 비해 HD chip에서 배양된 뇌 오가노이드의 크기가 더 큰 것을 확인할 수 있었으며, (도 11C) HD chip에서 혈관세포(EC)와 공배양된 뇌 오가노이드의 유전자 발현을 확인한 결과, 신경전구세포 마커(Pax6) 및 신경세포 마커(MAP2)의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 6: 간 오가노이드 (Human iPSC-derived liver organoid) 배양 확인
실험예 6-1. HD chip에서 배양된 간 오가노이드의 세포 구성에 따른 분화능 차이 분석
HD chip에서 배양된 인간 iPSC 유래 두 종류의 간 오가노이드(HM - iPSC 유래 간세포(H):중간엽줄기세포(M)=10:2, HEM - iPSC 유래 간세포(H):혈관내피세포(E):중간엽줄기세포(M)=10:7:2)의 분화능 차이를 분석하기 위해 배양 5일차와 7일차에 면역염색과 정량적 PCR (qPCR) 방법으로 마커 발현을 비교 분석하였다.
그 결과 도 11A에서 확인되는 바와 같이 HD chip에서 배양된 HM, HEM 간 오가노이드 모두 간 특이적 분화 마커인 HNF4A, ALB을 잘 발현하며 HEM의 경우 혈관 마커인 CD31 또한 잘 발현하는 것을 확인하였다.
또한, 도 11B에서 확인되는 바와 같이 배양 7일차에 HM, HEM 그룹 간 유전자 발현을 비교하였을 때, 혈관내피세포가 포함된 HEM 그룹에서 간 분화 마커(AFP, FOXA2, HNF4A, ALB)의 발현이 증가하는 경향을 관찰하여 혈관내피세포가 포함된 간 오가노이드가 더욱 성숙한 간 오가노이드로 발달됨을 확인하였다.
이러한 결과를 통해 HD chip을 이용하면 다양한 세포로 구성된 간 오가노이드의 효율적인 배양이 가능함을 알 수 있다.
실험예 6-2. 인간 iPSC 유래 간 오가노이드(HEM)의 장기배양 분화능 비교
혈관내피세포가 포함된 인간 iPSC 유래 간 오가노이드(HEM)를 각 배양 시스템에서 20일간 장기배양한 뒤 다양한 마커에 대한 유전자 발현을 비교하였다.
그 결과 도 13에서 확인되는 바와 같이 대조군 그룹인 U-bottom plate와 microwell에 비해 HD chip에서 배양된 간 오가노이드의 분화 마커가 유의미하게 증가하는 경향을 확인하였다. 간 분화 관련 마커(AFP, ALB)와 혈관 마커(PECAM1, CD34, CDH5) 모두 HD chip 그룹에서 발현이 증가하고 세포사멸 마커인 CASP3는 HD chip 그룹에서 다소 감소하는 경향을 확인하였다.
따라서, 기존의 오가노이드 배양 시스템인 U-bottom well-plate 및 microwell과 비교하여 HD chip을 이용하면 간 오가노이드(HEM)의 간세포 분화 및 혈관 성숙을 증진시킬 수 있고 세포 사멸을 감소시킬 수 있음을 확인하여 보다 우수한 품질의 간 오가노이드 제작이 가능하였다.
실험예 6-3. 인간 iPSC 유래 간 오가노이드(HEM)의 마커 발현 분석
혈관내피세포가 포함된 인간 iPSC 유래 간 오가노이드(HEM)를 각 배양 시스템에서 15일간 배양한 뒤, 면역염색을 통해 그룹간 간 분화 마커 및 혈관 마커 발현을 비교하였다.
그 결과 도 14에서 확인된 바와 같이 대조군 그룹인 U-bottom plate와 microwell에 비해 HD chip에서 배양된 간 오가노이드에서 간 분화 마커인 HNF4A 발현량이 더 높으며 혈관 마커인 CD31의 발현도 더 증진되었음을 확인하였다. 형성된 간 오가노이드의 모양 및 형태 또한 대조군 그룹들에 비해 균일하게 형성되는 것을 확인하였다.
따라서, 기존의 오가노이드 배양 시스템인 U-bottom well-plate 및 microwell과 비교하여 HD chip을 이용하면 간 오가노이드(HEM)의 간세포 분화 및 혈관 성숙을 증진시킬 수 있으므로 우수한 품질의 간 오가노이드 제작이 가능함을 확인하였다.
혈관내피세포가 포함된 인간 iPSC 유래 간 오가노이드(HEM)를 각 배양 시스템에서 15일간 배양한 뒤, 면역염색을 통해 그룹간 간 분화 마커 및 혈관 마커 발현을 비교하였다.
그 결과 도 15에서 확인된 바와 같이 대조군 그룹인 U-bottom plate와 microwell에 비해 HD chip에서 배양된 간 오가노이드에서 간 분화 마커인 ALB 발현량이 더 높으며 혈관 마커인 CD31의 발현도 더 증진되었음을 확인하였다. 형성된 간 오가노이드의 모양 및 형태 또한 대조군 그룹들에 비해 균일하게 형성되는 것을 확인하였다.
따라서, 기존의 오가노이드 배양 시스템인 U-bottom well-plate 및 microwell과 비교하여 HD chip을 이용하면 간 오가노이드(HEM)의 간세포 분화 및 혈관 성숙을 증진시킬 수 있으므로 우수한 품질의 간 오가노이드 제작이 가능함을 확인하였다.
실험예 6-4. 인간 iPSC 유래 간 오가노이드의 마커 발현 및 기능성 분석
인간 iPSC 유래 간 오가노이드를 각 배양 시스템에서 15일간 배양한 뒤, 면역염색을 통해 그룹간 마커 발현을 비교하고 간 기능의 중요한 지표 중 하나인 요소합성 능력을 비교하였다.
그 결과 도 16A에서 확인된 바와 같이 대조군 그룹인 U-bottom well-plate와 microwell에 비해 HD chip에서 배양된 간 오가노이드에서 간 분화 마커인 AFP와 HNF4A의 발현이 더욱 높으며 F-actin 염색을 통해 액틴 섬유구조를 확인해 보았을 때 HD chip 그룹에서 모양이 균일한 오가노이드가 형성된 것을 확인할 수 있다.
간 기능성 지표인 요소합성 능력을 비교했을 때, 도 16B에서 확인된 바와 같이 HD chip에서 배양된 간 오가노이드의 요소합성 능력이 대조군 시스템에서 배양된 간 오가노이드에 비해 유의미하게 증가한 것을 확인할 수 있다.
따라서, 기존의 오가노이드 배양 시스템인 U-bottom well-plate 및 microwell과 비교하여 HD chip을 이용하면 기능성이 향상된 간 오가노이드 제작이 가능함을 확인하였다.
실험예 6-5. 인간 iPSC 유래 간 오가노이드의 장기 배양 시 마커 발현 비교
인간 iPSC 유래 간 오가노이드를 각 배양 시스템에서 10일, 15일, 30일간 배양한 뒤 면역염색을 통해 마커 발현을 비교하였다.
그 결과 도 17에서 확인된 바와 같이 대조군 그룹인 U-bottom plate와 microwell에 비해 HD chip에서 배양된 간 오가노이드의 모양이 장기간 균일하게 유지되는 것을 확인하였으며, 성숙한 간 분화 마커(중기와 후기 마커)인 HNF4A와 ALB도 더 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다. 또한, 30일 이상 장기배양시 U-bottom plate와 microwell에서 배양된 간 오가노이드는 사멸하였으나 HD chip에서 배양된 간 오가노이드는 간 조직 특이적인 구조를 형성하며 (HD chip 그룹 고배율 이미지) 보다 성숙한 오가노이드가 형성되는 것을 확인하였다.
실험예 7: 고효율 (high-throughput) HD chip 제작
실험예 7-1. 고효율 (high-throughput) HD chip 제작
25 well HD chip의 배양 효율을 증진시키기 위해, 기존 25 well HD chip과 같이 384 well 플레이트 규격을 가지고 배양 챔버의 수를 늘린 고효율 HD chip을 제작하였다 (도 18).
고효율 HD chip은 100개 웰에서 스페로이드/오가노이드를 동시에 현적배양 할 수 있으며, 기존의 25 well HD chip과 같이 서로 수직 방향으로 겹치는 것이 가능한 디자인으로 제작되고 tray plate에 담아 배양이 가능하도록 제작하였다.
고효율 HD chip에서의 유체 흐름 양상을 확인하기 위한 시뮬레이션을 진행하였고, 구체적으로, 10 rpm 조건으로 time-dependent study로 시뮬레이션을 진행하였다.
채널 근방에서는 유체의 유동성이 상대적으로 높은데 비해 오가노이드 표면은 shear stress가 낮은 것을 확인할 수 있다 (도 19).
이는 HD chip이 지속적인 흐름을 이용해 원활한 배양액 순환을 통한 물질 교환이 가능하게 함과 동시에 오가노이드가 다른 챔버로 넘어가거나 흐름에 의해 직접적인 손상을 입지 않을 수 있기 때문에 섬세한 오가노이드 배양에 적합하다는 것을 보여주는 것이다.
U bottom plate와 HD chip에서 오가노이드 내부로의 산소 전달율을 비교하기 위해 시뮬레이션을 진행하였다. 평균 흐름을 통한 steady state 상태의 시뮬레이션 결과로, 배양 전반적인 평균 수치를 시뮬레이션 한 값에 해당한다.
HD chip에서의 산소 농도 (도 20A) 및 U bottom plate well에서의 산소 농도 (도 20B)를 3차원(좌) 및 단면(우)으로 표현한 이미지를 나타내었고, 각각의 단면 이미지에서의 빨간 화살표에 해당하는 산소 농도 수치 그래프 (도 20C)를 도출하였다.
시뮬레이션 결과 HD chip에서 배양할 때 U bottom plate에서 배양할 때 보다 오가노이드 중심부의 산소 농도가 높은 것으로 확인된다. 따라서 세포가 고밀도로 모여 있는 오가노이드 중심부로의 물질 전달이 중요한 오가노이드 배양에 있어 HD chip 배양 시스템이 더욱 효과적일 것으로 예측된다.
실험예 7-2. 고효율 칩(100-well HD chip)에서 생산된 인간 iPSC 유래 간 오가노이드의 균일성 분석
고효율 100-well HD chip에서 인간 iPSC 유래 간 오가노이드의 균일한 대량생산이 가능한지 확인하기 위해 iPSC 간세포(H):혈관내피세포(E):중간엽줄기세포(M)=10:7:2 비율로 well 당 6000개의 세포수를 맞추어 칩 당 총 600,000 세포를 파종하였다 (seeding). 추가적으로 형성된 간 오가노이드가 증식 능력을 가지는지 확인하기 위해 Ki67 면역염색을 통해 이를 확인하였다.
그 결과, 도 21A에서 확인되는 바와 같이 600,000개의 세포를 HD chip에 파종하였을 때, 모든 웰 내부의 배양액 방울에 균일하게 세포가 모여 뭉치면서 24시간 이내에 100개의 오가노이드가 모두 균일한 크기로 형성된 것을 확인할 수 있었다.
각 well 당 1개씩 형성된 총 100개의 오가노이드에 대하여 세포 증식 마커인 Ki67을 염색해 보았을 때, 오가노이드 내부에서 활발하게 세포 증식이 균일한 수준으로 일어남을 확인할 수 있다 (도 21B).
따라서, HD chip은 기존의 오가노이드 배양 시스템인 U-bottom well plate 및 microwell과 비교하여 균일한 간 오가노이드를 동시에 대량 제작하는데 보다 더 적합할 것으로 예상할 수 있다.
실험예 7-3. 고효율 (high-throughput) HD chip에서 배양된 인간 iPSC 유래 간 오가노이드 유전자 발현의 균일성 비교
고효율 100-well HD chip에서 제작된 100개의 인간 iPSC 유래 간 오가노이드(HEM)를 동시에 현적배양하면서 기존의 U-bottom well plate에서 배양된 간 오가노이드(HEM)와 간 조직 마커에 대한 유전자 발현의 균일성을 비교하였다.
그 결과 도 22에서 확인된 바와 같이, 대표적인 간 분화 마커 AFP, HNF4A, ALB에 대하여 정량적 PCR 분석을 진행했을 때, 기존의 U-bottom well plate에서 배양한 간 오가노이드의 유전자 발현 분포에 비해 HD chip을 이용하여 제작한 간 오가노이드의 유전자 발현이 편차가 적고 유의미하게 균일한 것을 확인하였다. 이를 통해 HD chip을 이용한 고효율 현적배양을 통해 주요 분화 마커의 발현이 균일한 간 오가노이드 생산이 가능함이 검증되었다.
실험예 7-4. 인간 iPSC 유래 정상 및 비알콜성 지방간염 오가노이드의 대량생산 및 기능성 분석
고효율 100-well HD chip에서 인간 iPSC 유래 간 오가노이드(HEMKS)를 제작한 뒤, 정상(Normal) 그룹은 7일간 정상 배양액에 배양하고, 비알콜성 지방간염(NASH) 그룹은 정상 배양 5일 뒤 유리지방산인 올레산(Oleic acid)을 500 μM 농도로 배양액에 혼합하여 2일간 추가 배양하여 지방간염을 유발하였다. 이렇게 총 7일 동안 배양한 후 정상 및 지방간염 그룹간 지방 축적 정도를 비교하고 간 기능의 중요한 지표 중 하나인 시토크롬 활성 (CYP3A4 activity)을 비교하였다. 보다 정확한 지방간염 모델링 및 약물 스크리닝을 위해 간 조직 미세환경을 구성하는 면역세포 (쿠퍼세포) 및 기질세포 (간성상세포)를 포함하여 간 오가노이드를 제작하였다. 이를 위해 인간 iPSC 유래 간 오가노이드는 iPSC 유래 간세포(H): 혈관내피세포(E): 중간엽줄기세포(M): iPSC 유래 쿠퍼세포(K): iPSC 유래 간성상세포(S) = 10:7:2:2:1의 비율(HEMKS)로 제작하였다.
그 결과 도 23A에서 확인된 바와 같이, 대량 생산된 정상 간 오가노이드의 경우 액틴 필라멘트 (F-actin)가 오가노이드에 잘 분포하고 있으며 lipid를 표지하는 BODIPY 형광 신호는 거의 관찰되지 않는 것을 확인하였다. 반면 NASH 오가노이드의 경우 F-actin 구조가 비정상적으로 관찰되며 오가노이드 내부에 lipid 축적이 일어난 것을 확인하였다.
간 기능성 지표인 시토크롬 활성을 비교했을 때, 도 23B에서 확인된 바와 같이, NASH를 유발한 오가노이드 그룹에 비해 정상 오가노이드 그룹이 약 2배 정도 높게 활성을 보이는 것을 확인함으로써 지방간염 유발로 인해 간 기능성이 저해된 NASH 오가노이드 제작에 성공하였음을 확인하였다.
따라서, 고효율 HD chip을 이용하면 정상 간 오가노이드 뿐만 아니라 질환 표현형을 나타내는 비알콜성 지방간염 오가노이드의 대량생산 역시 가능함을 확인하였다.
실험예 7-5. 인간 iPSC 유래 비알콜성 지방간염 오가노이드의 대량생산 및 유효약물 테스트
고효율 100-well HD chip에서 인간 iPSC 유래 간 오가노이드(HEMKS)를 제작한 뒤, 정상(Normal) 그룹은 7일간 정상 배양액에 배양하고, 비알콜성 지방간염(NASH) 그룹은 정상 배양 5일 뒤 유리지방산인 올레산(Oleic acid)을 500 μM 농도로 배양액에 혼합하여 2일간 추가 배양하여 지방간염을 유발하였다. 지방간 치료 유효약물인 Ezetimibe(Eze)는 콜레스테롤 흡수 억제제로서 기존에 고혈당 콜레스테롤 및 지질 이상 치료에 사용되던 약물후보군이다. 정상 배양 5일 뒤에 올레산(Oleic acid, 500 μM)과 Ezetimibe(50 μM)를 배양액에 혼합하고 2일간 추가 배양하여 지방간염의 약물 테스트를 진행하였다. 총 7일간의 배양 후 지방 축적 정도를 비교하고 면역염색 및 정량적 PCR 분석을 통해 그룹간 주요 마커 발현 및 유전자 발현을 비교하였다. 보다 정확한 지방간염 모델링 및 약물 스크리닝을 위해 간 조직 미세환경을 구성하는 면역세포 (쿠퍼세포) 및 기질세포 (간성상세포)를 포함하여 간 오가노이드를 제작하였다. 이를 위해 인간 iPSC 유래 간 오가노이드는 iPSC 유래 간세포(H): 혈관내피세포(E): 중간엽줄기세포(M): iPSC 유래 쿠퍼세포(K): iPSC 유래 간성상세포(S) = 10:7:2:2:1의 비율(HEMKS)로 제작하였다.
그 결과, 도 24A에서 확인되는 바와 같이, HD chip에서 배양한 Normal, NASH, NASH + Eze 각 오가노이드 그룹에 대하여 정량적 PCR 분석을 통해 유전자 발현을 확인했을 때, 지방산 축적 마커인 PLIN2, 염증 마커인 TNF-α, 간 섬유화 마커인 SMA, VIM의 발현량이 NASH 그룹에서 증가하고 Eze 약물을 처리한 그룹에서는 감소하는 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 24B에서 확인되는 바와 같이, 정상 오가노이드 그룹의 경우 액틴 필라멘트 마커인 F-actin이 오가노이드 내에 잘 분포하고 있으며 lipid를 표지하는 BODIPY 형광 신호는 거의 관찰되지 않는 것을 확인하였다. NASH 오가노이드의 경우 손상된 F-action 구조가 관찰되며 오가노이드 내부에 lipid 축적이 많이 일어난 것을 확인하였다. 유효약물(Eze)를 처리한 그룹에서는 지방산 축적이 감소하여 기능성이 회복된 것을 확인하였다. 간 분화 마커인 ALB 발현량의 경우에도 정상그룹에 비해 NASH 오가노이드에서는 발현량이 감소하는데 Eze 약물을 처리한 그룹에서는 일정 수준 회복되는 양상이 관찰되었다. 간 섬유화 마커인 Vimentin의 경우 NASH 오가노이드 그룹에서 유의미하게 발현이 증가한 것을 확인할 수 있는데, 특히 간 오가노이드 제작 시 포함된 간 성상세포가 활성화되면서 섬유화를 유발하는 myofibroblast 세포가 오가노이드 내부에 분포하는 것을 면역염색을 통해 확인할 수 있다.
따라서, 고효율 HD chip 기반으로 제작된 인간 간 오가노이드를 이용하여 질환 표현형이 유지되는 비알콜성 지방간염 모델링이 가능함을 확인하였으며 약물의 유효성 스크리닝도 가능함을 추가적으로 검증하였다.
실험예 7-6. 인간 iPSC 유래 비알콜성 지방간염 오가노이드의 대량생산 및 ROS 정량 분석
앞서 설명한 방식과 동일한 배양방법으로 고효율 100-well HD chip에서 제작한 인간 iPSC 유래 간 오가노이드(HEMKS)의 Normal, NASH, NASH + Eze 그룹에 대하여 oxidative stress(산화 스트레스)에 의한 활성산소종 ROS 축적량을 확인하기 위해 산화스트레스 검출 분석법인 CM-H2DCFDA 염색을 통해 그룹간 ROS 활성 및 정량 분석을 진행하였다.
그 결과 도 25A에서 확인되는 바와 깉이, 대량생산된 정상 (Normal) 오가노이드 그룹의 경우 ROS에 의한 산화 스트레스가 100개의 오가노이드에서 거의 나타나지 않는 반면, NASH 오가노이드에서는 ROS 관련 산화 스트레스가 크게 증가한 것을 확인하였다. 유효약물(Eze)을 처리한 NASH 오가노이드 그룹에서는 이러한 산화 스트레스도 일정 수준 이하로 감소함을 확인함으로써 지방간염 치료 약물의 유효성 평가를 위한 HD chip 간 오가노이드 기반 고효율 스크리닝 가능성을 확인하였다.
또한, 도 25B에서 확인되는 바와 같이, 각각의 오가노이드에 대한 ROS 산화스트레스 정량 평가를 위해 간 오가노이드가 배양되는 HD chip을 상용화된 플레이트 리더(plate reader)장비에 적용하여 on-chip 분석을 진행하였다. 고효율 HD chip의 경우 상업적으로 판매되고 있는 기존의 384-well 플레이트와 동일한 규격으로 디자인되고 제작되었기 때문에 플레이트 리더와 같은 기존의 분석 장치와 호환 사용이 가능하다. 정량 분석을 진행했을 때, NASH 오가노이드에서 형광 세기가 크게 증가하였으며 Eze 약물을 처리한 오가노이드 그룹에서는 형광 세기가 감소함을 확인하여 약물 처리를 통해 지방간염 오가노이드 내 산화 스트레스를 감소할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 기존 384-well 플레이트와 동일한 규격으로 제작된 고효율 HD chip을 이용하면 대량생산된 비알콜성 지방간염 오가노이드 기반의 대규모 약물 스크리닝 및 유효성 정량 평가가 가능함을 확인하였다.
실험예 8: Human iPSC-derived pancreas organoid 췌장 오가노이드 배양 연구 결과
실험예 8-1. 인간 iPSC 유래 췌장 오가노이드 대량 배양 (기존 Microwell 및 U-bottom 웰-플레이트 방식과의 비교)
제작한 HD chip을 이용하여 인간 iPSC 유래의 췌장 오가노이드 배양을 실시하였다. 대조군 그룹은 3D 오가노이드 제작에 가장 널리 이용되고 있는 U-bottom well-plate와 Microwell을 이용하였다.
췌장 오가노이드의 경우, iPSC 유래 췌장전구세포 (P) : 혈관내피세포 (E) : 중간엽줄기세포 (M) = 10:7:2의 비율로 혼합하여 well 당 6000개의 세포수를 맞추어 세포를 파종하였다 (seeding). 오가노이드가 형성된 뒤, 베타세포 분화 배양액에서 췌장 오가노이드로 추가 분화를 유도하였다.
그 결과 도 26A에서 확인된 바와 같이, HD chip에서 배양된 췌장 오가노이드가 대조군 그룹보다 더 균일하고 일정한 형태로 오가노이드가 형성되는 것을 확인하였다.
또한, 도 26B에서 확인된 바와 같이, 오가노이드 형성 2일차에 각 배양환경에서 형성된 오가노이드의 크기를 측정하였을 때, 대조군 그룹과 비교하여 HD chip에서 제작된 췌장 오가노이드의 경우 개체 간 편차가 가장 적음을 확인하였다. 이를 통해 HD chip 배양을 통해 크기가 더욱 균일한 췌장 오가노이드 제작이 가능함을 알 수 있다.
실험예 8-2. 인간 iPSC 유래 췌장 오가노이드의 마커 발현 및 분화능 비교
혈관내피세포가 포함된 인간 iPSC 유래 췌장 오가노이드(PEM)를 각 배양 시스템에서 5일간 배양한 뒤 면역염색과 qPCR을 통한 유전자 발현 분석을 통해 그룹간 췌장 분화 마커 및 혈관 마커 발현을 비교하였다.
그 결과 도 27A에서 확인되는 바와 같이, 대조군인 U-bottom plate와 microwell 그룹에 비해 HD chip에서 배양된 췌장 오가노이드에서 내배엽 분화 마커인 SOX17, 췌장 전구세포 마커인 PDX1, NKX6.1 및 베타세포 마커인 CHGA, Insulin의 발현이 더 높으며 혈관 마커인 CD31의 발현도 더 증진되었음을 확인하였다.
그리고 도 27B에서 확인되는 바와 같이, 대조군 그룹과 HD chip에서 배양된 췌장 오가노이드의 유전자 발현량을 비교하였을 때, 췌장 분화 마커(PDX1, KRT19), 혈관 마커(PECAM1) 및 증식능 관련 마커(KI67)가 모두 HD chip 그룹에서 발현이 가장 증가하는 경향을 확인하였다.
이를 통해, 제작한 HD chip이 췌장 오가노이드의 균일성뿐만 아니라 췌장 특이적 분화 마커의 발현량 또한 기존 상용화된 플랫폼에 비해 증진시킬 수 있는 디바이스임을 확인하였다.
실험예 8-3. 인간 iPSC 유래 췌장 오가노이드의 인슐린 생산 비교
인간 iPSC 유래 췌장 오가노이드(PEM)를 고효율 100-well HD chip에서 제작하고 베타세포 유도 배양액으로 5일간 추가 배양한 뒤 면역염색을 통해 오가노이드 균일성과 베타세포 특이적인 인슐린 생산을 확인하였다.
그 결과 도 28에서 확인되는 바와 같이, 인간 iPSC 유래 췌장 오가노이드도 간 오가노이드와 마찬가지로 100-well HD chip에서 균일한 췌장 오가노이드의 대량생산이 가능하였으며 베타세포 배양액에서 분화 유도한 100개의 췌장 오가노이드는 균일하고 높은 수준으로 인슐린을 생산하고 있음을 확인하였다.
이는 고효율 HD chip 배양을 통해 당뇨 치료에 있어 가장 중요한 인슐린 생산/분비 능력을 가진 균일한 인간 췌장 오가노이드의 대량 생산이 가능함을 보여준다.
실험예 9: HD chip 고효율 접합을 통한 다중 오가노이드 제작
실험예 9-1. Chip-to-chip transfer를 통한 spheroid fusion
위쪽으로 열려 있는 HD chip(25 well ver.)은 서로 수직으로 겹칠 수 있게 고안되어 있어 서로의 수직 좌표로 접합이 가능함을 확인하였다.
서로 다른 스페로이드들을 각각의 HD chip에서 배양한 뒤, 2개 칩을 한 번에 1:1로 접합하여 하나의 칩에서 다른 칩으로 바로 스페로이드 이동을 유도할 수 있다 (도 29 좌측).
HD chip에서 HD chip으로의 이동이기 때문에 한 칩에 모인 두 스페로이드는 well에 고이는 배양액 물방울의 오목한 부분의 꼭지점에 위치하게 되어 효율적으로 스페로이드 간 접합(fusion)이 가능함을 확인하였다 (도 29 우측).
최근 서로 다른 오가노이드의 fusion을 통해 보다 고도화된 장기 유사체를 제작하고자 하는 연구가 활발히 진행 중이므로 HD chip은 이러한 용도로 활용되어 다중 조직 구조를 가진 오가노이드 생산을 위한 배양 시스템으로 적용될 수 있다.
실험예 9-2. U-bottom 웰-플레이트 접합 방식과의 비교
인간 iPSC 유래 간 오가노이드(HEMKS)와 췌장 오가노이드(PEM)를 각각의 HD chip에서 배양한 뒤, 2개 칩을 수직 방향으로 1:1로 접합하여 하나의 칩에서 다른 칩으로 오가노이드를 이동시킨 후 오가노이드 간 접합(fusion)을 통해 간-췌장 접합 오가노이드를 제작하였다.
대조군 그룹인 U-bottom plate를 이용한 오가노이드 접합의 경우, 각각 배양된 오가노이드를 1:1로 하나씩 옮겨 접합시켜야 한다(도 30 A왼쪽). 반면에 HD chip을 이용한 접합의 경우 모든 웰에 있는 오가노이드를 효율적으로 한 번에 이동하여 접합이 가능하다 (도 30 B 오른쪽).
HD chip에서 배양된 간-췌장 오가노이드의 경우 이동 후 24시간 이내에 접합 오가노이드를 형성함을 확인하였다 (도 30 B).
대조군 그룹인 U-bottom plate와 HD chip 모두에서 간-췌장 오가노이드가 형성되는 것을 확인하였다 (도 30 C).
간, 췌장 관련된 분화 마커의 유전자 발현량을 qPCR 분석을 통해 비교해 보았을 때, 간 분화 마커(ALB, HNF4A), 췌장 분화 마커(NKX6.1, PDX1)와 간-췌장 담관마커 (KRT19)의 발현이 대조군(U-bottom plate) 그룹에 비해 HD chip 그룹에서 유의미하게 증가한 것을 확인하였다 (도 30 D).
실험예 9-3. 고효율 (high-throughput) HD chip 기반 스페로이드 접합 결과 확인
고효율 HD chip에서 ADSC를 이용해 스페로이드를 형성한 결과 균일한 사이즈를 가지는 100개의 스페로이드를 한번에 형성하고 배양할 수 있음을 확인하였다 (도 31 왼쪽).
기존의 25 well HD chip과 같이 100 well HD chip 두개를 서로 수직 방향으로 겹쳐 스페로이드를 한 쪽으로 이동시킨 결과 80% 이상의 성공률로 스페로이드를 이동시킬 수 있었으며, 추후 칩을 제작하는 소재를 바꾸면 효율이 더 증진될 것으로 예상된다 (도 31 오른쪽).
실험예 9-4. HD chip 기반 간-췌장 오가노이드의 고효율 접합
고효율 100-well 기반 HD chip에서 인간 iPSC 유래 간 오가노이드(HEMKS)를 균일하게 대량생산하고, 또 다른 HD chip에서 인간 iPSC 유래 췌장 오가노이드(PEM)를 균일 대량생산한 뒤, 두 HD chip을 서로 수직으로 겹치는 칩-칩 접합(Chip-to-chip fusion)을 통해 간 오가노이드와 췌장 오가노이드를 1:1로 접합 유도하였다.
그 결과 도 32에서 확인된 바와 같이, 100-well HD chip 두 개를 서로 수직 방향으로 겹쳐 간 오가노이드를 췌장 오가노이드 쪽으로 이동시킨 결과 95% 이상의 성공률로 간 오가노이드를 이동시킬 수 있었으며, 따라서 단일 장기 오가노이드의 대량생산뿐 아니라 효율적인 오가노이드 접합을 통해 간-췌장 다중 오가노이드의 고효율 대량생산도 가능함을 확인하였다.
형성된 간-췌장 접합 다중 오가노이드의 각 장기 특이적 분화 마커를 분석하기 위해 면역염색을 진행했을 때, 간 오가노이드 부분에만 간 특이적 분화 마커인 HNF4A가 발현하며, 췌장 부분에는 발현하지 않는 것을 확인하였다. 간 면역세포인 쿠퍼세포 마커 (CD68) 역시 간 오가노이드에서만 발현하며 췌장 분화 마커인 NKX6.1은 췌장 오가노이드 부분에서만 특이적으로 발현하는 것을 확인하였다. 간과 췌장 모두에서 발현하는 내배엽 마커인 SOX17과 혈관 마커인 CD31도 HD chip에서 접합된 다중 오가노이드에서 잘 발현하는 것을 확인하였다.
실험예 10: HD chip에서 배양된 간 오가노이드의 마우스 지방간염 모델에 이식
HD chip에서 대량생산된 인간 iPSC 유래 간 오가노이드(HEM - 간세포:혈관내피세포:중간엽줄기세포=10:7:2)의 생체 내 이식 가능성 및 지방간염 치료 효과를 확인하기 위해 MCD (Methionine-choline-deficient) 사료를 이용하여 지방간염을 유발한 마우스 NASH 모델에 간 오가노이드 이식을 진행하였다. 메티오닌(Methionine)과 콜린(Choline)이 결핍된 MCD 식이는 지방간염, 산화 스트레스, 염증 및 섬유화를 유발하여 비알콜성 지방간염(NASH)의 병변을 잘 유발하는 사료로서 마우스 지방간염 모델 유발에 많이 이용된다.
정상 그룹(Normal)은 정상 식이(Normal Chow)로 4주 동안 사육하였고 지방간염 유발 그룹(NASH)은 MCD 사료를 이용하여 4주 동안 사육하되, 처음 2주 이후에 간문맥(Hepatic portal vein)을 통해 간 오가노이드 배양액(100 μL)만을 주입하고 나머지 2주 동안 MCD 사료를 계속 먹이면서 NASH 질환을 유발하였다. 지방간염이 유발된 마우스에 간 오가노이드를 이식한 그룹(NASH + Organoid)은 MCD 사료로 4주 동안 사육하되, 처음 2주 이후에 간문맥을 통해 HD chip에서 생산된 간 오가노이드를 주입(100 μL 배양액에 포함하여 이식)한 뒤 나머지 2주 동안 MCD 사료를 먹이면서 NASH 질환을 계속 유발하였다. 마우스 한 마리 당 4개의 HD chip에서 생산된 총 400개의 간 오가노이드를 인슐린 시린지에 모아 간문맥을 통해 이식하였다 (도 33A).
그 결과 도 33B에서 확인된 바와 같이, 모델 유발 후 그룹별로 혈액 분석을 진행했을 때, 모델 유발 2주차 오가노이드 이식하기 전날(Post-operative day (POD) -1일)에 간독성 지표인 ALT와 LDH 수치는 정상 그룹에 비해 MCD 식이 요법으로 NASH 질환을 유발한 마우스 그룹들에서 유의미하게 높은 수준으로 측정되었다. 간문맥을 통해 배양액 및 오가노이드를 주입한 후 3일차까지는 NASH 그룹의 경우에도 오가노이드 배양액을 주입 받았기 때문에 배양액에 포함된 인자들이 간 기능 회복에 도움을 줄 수 있어 간 오가노이드를 이식한 NASH + Organoid 그룹과 마찬가지로 주입 직후에는 ALT, LDH 수치가 점점 회복되는 양상을 보였다. 하지만, 주입 7일 후부터는 배양액에 의한 간 기능성 회복 효과는 크지 않아 배양액만 주입된 NASH 그룹에서는 간 기능이 점점 더 확연히 감소하였으나(ALT, LDH 수치 증가), 간 오가노이드를 이식한 NASH 그룹에서는 ALT 및 LDH 수치가 거의 정상 수준으로 감소하여 간 기능의 뚜렷한 개선이 확인되었다. 간 기능성의 지표인 ALB 수치의 경우에도 NASH 그룹에서는 배양액 주입 3일 이후부터는 점점 감소하여 간 기능이 감소하는데 비해 간 오가노이드를 이식한 NASH 그룹에서는 ALB 수치가 정상 수준과 비슷하게 회복되는 것을 확인하였다.
이러한 결과를 통해 HD chip을 통해 대량생산된 균일한 간 오가노이드는 비알콜성 지방간염 마우스 모델에 적용되었을 때 간 손상을 줄이고 간 기능성 회복에 기여할 수 있음을 확인하였다. 즉 고효율 high-throughput HD chip은 간 손상 치료를 오가노이드 기반 세포 치료제의 대량생산을 위한 효율적인 배양 시스템으로 활용될 수 있음을 확인하였다.
HD chip에서 대량생산된 인간 iPSC 유래 간 오가노이드(HEM)를 마우스 지방간염 (NASH) 모델의 간문맥을 통해 이식한 뒤 지방간염 치료효과를 유도할 수 있는지 확인하기 위해 이식 2주 후 조직학 분석 및 면역염색을 진행하였다.
그 결과 도 34A에서 확인된 바와 같이, MCD 사료로 4주 동안 지방간염(NASH)을 유발하면서 2주 차에 배양액을 주입한 그룹은 정상 간에 비해 심한 지방간 병변을 나타내는 것을 확인하였고, 반면 HD chip에서 생산된 간 오가노이드를 이식한 그룹에서는 병변이 일부 회복된 것을 육안적으로 확인하였다.
또한, 도 34B에서 확인된 바와 같이, H&E 염색을 통해 조직학 분석을 진행했을 때에도 정상 간에 비해 NASH 유발 모델에서 지방이 다량 축적된 것을 확인하였다. 간 오가노이드를 주입한 그룹에서는 이식된 간 오가노이드가 지방이 축적되어 있는 부위에 생착되어 지방 축적이 감소하고 손상된 부분이 줄어든 것을 확인하였다. MT (Masson's Trichrome) 염색을 통해 섬유화로 인해 축적된 콜라겐 염색을 진행했을 때에도 배양액만 주입된 NASH 그룹에서는 일부 간 조직에 섬유화가 진행된 것을 확인하였으나 간 오가노이드가 이식된 그룹은 콜라겐 축적이 감소하고 섬유화 진행이 저해된 것을 확인하였다.
이식한 간 오가노이드가 지방간 조직에 잘 생착하여 기능하는지를 확인하기 위해, 인간 단백질에만 특이적으로 반응하는 항체를 이용하여 간 분화 마커(ALB, SOX17)와 밀착연접 마커(ZO1)에 대한 면역염색을 진행하였을 때, 인간 iPSC 유래 오가노이드가 이식된 마우스 간 조직에서만 인간 단백질 분화 마커들이 발현하는 것을 확인하였다 (도 34C). 본 실험에서는 간 오가노이드를 간문맥을 통해 주입하였기 때문에 이식된 오가노이드가 간 조직 내 고르게 분포할 수 있으며 따라서 지방간염으로 저해된 간 기능성을 회복하는데 효과적일 것으로 기대된다. 배양액만 주입된 NASH 모델에서는 간 조직 내 SMA 양성인 섬유화가 일어난 조직이 관찰되었으나 간 오가노이드 이식 치료를 받은 NASH 모델에서는 SMA가 발현되는 섬유화 부위가 크게 감소하였다.
이식 2주 뒤 각 그룹의 마우스 몸무게를 측정했을 때, 배양액만 주입한 NASH 마우스 그룹은 기존에 알려진 바와 같이 몸무게가 크게 감소하였으나 그에 비해 간 오가노이드를 이식한 NASH 마우스 그룹에서는 몸무게가 일정수준 이상으로 회복되었다. 또한, 배양액만 주입된 NASH 그룹의 경우 간:몸무게의 비율이 정상 그룹 보다 낮게 측정되었는데 간 오가노이드를 이식한 NASH 그룹에서는 간:몸무게의 비율이 일정 수준 회복되었다 (도 34D). 따라서 이식된 간 오가노이드에 의해 NASH 유발로 저해된 간 기능성이 어느 정도 회복되고 간 손상이 감소된 것을 확인하였다.
이러한 결과를 통해 HD chip에서 대량생산된 균일한 간 오가노이드가 비알콜성 지방간염 (NASH) 마우스 모델에 이식되었을 때 간 기능성 회복을 유도하고 섬유화를 저해하는 효과를 보여줌을 확인하였다. 즉 고효율 high-throughput HD chip은 간 손상 치료를 오가노이드 기반 세포 치료제의 대량생산을 위한 효율적인 배양 시스템으로 활용될 수 있다.
실험예 11: HD chip 추가 응용
실험예 11-1. On-chip 약물 스크리닝 및 플레이트 리더를 이용한 형광 정량 분석
살아있는 세포를 염색하는 calcein을 10분간 염색해 hADSC 스페로이드를 형광으로 표지하였다.
한 칩 내에 각 라인마다 다른 농도의 calcein을 주입하여 하나의 HD chip에서 배양된 hADSC 스페로이드들이 다른 형광 intensity를 가지도록 표지하고 바로 칩에서 형광 세기를 이미징 하여 분석하였다.
본 발명에서 제작된 HD chip(25 well ver.)은 384 웰-플레이트의 규격에 맞추어 디자인하였기 때문에 상업적으로 판매하는 범용적인 플레이트 리더 장비를 이용하여 바로 분석이 가능하다. 즉, 칩 내에서 스페로이드 또는 오가노이드를 배양한 후 형광 염색하고 바로 플레이트 리더를 통해 형광 세기를 측정하여 정량할 수 있다 (도 35).
실제로 형광 이미지를 통해 분석한 결과와 플레이트 리더를 이용하여 형광 세기를 측정한 결과를 비교해 보면 높은 상관성을 가짐을 알 수 있다.
실험예 11-2. 3D 프린팅을 통한 디바이스 제작 가능성의 확인
전술된 본 발명의 디바이스는 PDMS 고분자 소재로 제작하였으나 대량 양산 측면에서 한계가 있다. 따라서, 이러한 문제점을 극복하고자 3D 프린팅 공정을 도입했을 때 실제 상품화될 디자인의 본 발명 디바이스를 3D 프린팅하여 제작할 수 있는지를 확인하였다.
그 결과, 도 36에서 확인되는 바와 같이, 3D 프린팅을 통해 본 발명의 디바이스를 쉽게 제작할 수 있음을 확인하였고, 3D 프린팅을 이용하기 때문에 디자인 변경이 용이하며 재료 선정에 있어 규격화 및 대량 생산이 용이한 플라스틱 계열의 소재로도 생산이 가능한 장점이 있음을 알 수 있었다.
또한, 배양 시 외부 연결 장치 없이도 교반기(rocker) 상에서 지속적인 배양액 혼합을 통해 현적배양 디바이스 내 오가노이드 개체간 차이를 감소하면서 배양하는 것이 가능하지만 실험 목적이나 분석 종류에 따라 필요한 경우에는 튜브를 추가로 연결하여 시린지 펌프를 이용할 수도 있다.
실험예 11-3. 본 발명 디바이스에 적용가능한 액세서리의 활용
본 발명 디바이스의 활용 가능성을 높일 수 있는 액세서리를 제작, 활용 가능성을 확인하였다.
구체적으로, 단순히 배양액에 젤 용액을 추가하여 젤화를 유도하는 본 발명의 디바이스 배양 방식(도 6)에서 더 나아가 링 형태의 액세서리를 이용해 젤 용액이 배양액에 닿기 전에도 젤 용액의 점성 및 표면장력을 이용해 특정 형태를 갖도록 할 수 있기 때문에 다양한 특성을 가진 하이드로젤을 이용할 수 있게 되어 스페로이드/오가노이드 배양에 사용되는 젤의 종류를 다양하게 적용할 수 있다(예; 점성이 낮은 젤, 고체화되기 전에 배양액에 닿으면 안 되는 종류의 젤 등).
액세서리는 칩 본체의 형태에 맞게 디자인되어 탈부착이 가능하며, 시간이 지난 뒤 스페로이드/오가노이드가 잘 형성이 되면 액세서리는 제거하여 배양을 계속할 수 있다 (도 37).
기존의 방식으로 다층 구조 3D 스페로이드 제작 시 중심 부분과 외층 부분을 따로 형성하기 위해서는 일반적으로 추가적인 미세유체 장비가 필요하며 대부분 작은 크기의 다층 구조 스페로이드를 제작하는 수준에 불과하다.
이러한 기존 방식은 손실율이 비교적 높으며 크기가 큰 스페로이드나 특히 오가노이드 같은 수준의 세포집합체 배양에는 적용하기 어렵다.
본 발명에서 개발된 HD chip에서는 추가 액세서리 장착을 통해 중심 부분과 외층 부분을 나누어 주입함으로써 다층 구조를 가진 캡슐 형태의 스페로이드를 매우 손쉽고 효율적으로 형성할 수 있음을 확인하였다 (도 38).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

  1. 하나 이상의 웰을 포함하는 배양 챔버;
    배양액을 저장하는 하나 이상의 레저버; 및
    배양 챔버 및 레저버를 연결하는 마이크로 채널;을 포함하는 세포 집합체 배양 디바이스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 배양 챔버는 복수의 웰을 연결하는 마이크로 채널을 더 포함하는 세포 집합체 배양 디바이스.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 웰의 지름은 1.5 내지 4mm이고,
    상기 마이크로 채널로 연결된 웰들의 간격은 1.5 내지 5mm 인 세포 집합체 배양 디바이스.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 레저버는 디바이스 양단에 위치하는 것인 세포 집합체 배양 디바이스.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 세포 집합체는 중간엽줄기세포, 신경줄기세포, 혈관내피세포, 유도만능줄기세포, 배아줄기세포, 조직줄기세포, 태아줄기세포, 암줄기세포 및 심장세포 중 어느 하나의 유래된 스페로이드 또는 오가노이드인 세포 집합체 배양 디바이스.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 세포 집합체는 뇌, 안배(optic cup), 신장, 간, 췌장, 신경관, 위장, 대장, 전립선, 유방, 심장, 침샘 (salivary gland), 자궁내막(endometrium), 젖샘(mammary gland), 갑상선, 혀, 소장, 식도, 척수, 피부, 담관, 폐, 혈관, 근육, 부신피질 및 갑상샘 오가노이드로 이루어진 군에서 하나에서 유래된 세포 집합체 배양 디바이스.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 디바이스;
    교반기(rocker); 및
    마이크로 채널을 통해 공유되는 배양액;을 포함하는 세포 집합체 배양 시스템.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 디바이스는 상기 진동기에 의해 요동 운동(swing motion)하는 세포 집합체 배양 시스템.
  9. 제7항의 배양 시스템을 이용하여 세포 집합체를 배양하는 방법.
PCT/KR2022/005199 2021-04-09 2022-04-11 세포 집합체 배양을 위한 미세유체 현적배양 디바이스 WO2022216132A1 (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202280027356.7A CN117120593A (zh) 2021-04-09 2022-04-11 用于培养细胞聚集体的微流控悬滴培养装置
EP22785040.1A EP4303297A1 (en) 2021-04-09 2022-04-11 Microfluidic hanging drop culture device for culturing cell aggregates
JP2023560009A JP2024513007A (ja) 2021-04-09 2022-04-11 細胞集合体の培養のための微細流体の懸滴培養デバイス
US18/479,843 US20240026268A1 (en) 2021-04-09 2023-10-03 Microfluidic hanging drop culture device for culturing cell aggregate

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20210046483 2021-04-09
KR10-2021-0046483 2021-04-09
KR10-2022-0044172 2022-04-08
KR1020220044172A KR20220140439A (ko) 2021-04-09 2022-04-08 세포 집합체 배양을 위한 미세유체 현적배양 디바이스

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US18/479,843 Continuation US20240026268A1 (en) 2021-04-09 2023-10-03 Microfluidic hanging drop culture device for culturing cell aggregate

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022216132A1 true WO2022216132A1 (ko) 2022-10-13

Family

ID=83546544

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/005199 WO2022216132A1 (ko) 2021-04-09 2022-04-11 세포 집합체 배양을 위한 미세유체 현적배양 디바이스

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20240026268A1 (ko)
EP (1) EP4303297A1 (ko)
JP (1) JP2024513007A (ko)
WO (1) WO2022216132A1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101825458B1 (ko) * 2017-06-28 2018-02-05 부산대학교 산학협력단 줄기세포 분화 유도용 파지-기반 매트릭스 및 이의 제작 방법
KR20190143698A (ko) * 2018-06-21 2019-12-31 연세대학교 산학협력단 고효율 오가노이드 배양 디바이스 및 배양 시스템

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101825458B1 (ko) * 2017-06-28 2018-02-05 부산대학교 산학협력단 줄기세포 분화 유도용 파지-기반 매트릭스 및 이의 제작 방법
KR20190143698A (ko) * 2018-06-21 2019-12-31 연세대학교 산학협력단 고효율 오가노이드 배양 디바이스 및 배양 시스템

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KARIMI FATEMEH, ANDREA J O'CONNOR, GREG G QIAO, DANIEL E HEATH : "Integrin clustering matters: a review of biomaterials functionalized with multivalent integrin-binding ligands to improve cell adhesion, migration, differentiation, angiogenesis, and biomedical device integration", ADVANCED HEALTH CARE MATERIALS, vol. 7, no. 12, 25 March 2018 (2018-03-25), pages e1701324, XP055975839, DOI: 10.1002/adhm.201701324 *
KIM, ET AL: "96- well format-based microfluidic platform for parallel interconnection of multiple multicellular spheroids", JOURNAL OF LABORATORY AUTOMATION SOCIETY FOR LABORATORY AUTOMATION AND SCREENING, vol. 20, no. 3, 1 January 2015 (2015-01-01), pages 274 - 282, XP055512179 *
STAQUICINI, F.I. ; SIDMAN, R.L. ; ARAP, W. ; PASQUALINI, R.: "Phage display technology for stem cell delivery and systemic therapy", ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS, ELSEVIER, AMSTERDAM , NL, vol. 62, no. 12, 30 September 2010 (2010-09-30), Amsterdam , NL , pages 1213 - 1216, XP027509890, ISSN: 0169-409X, DOI: 10.1016/j.addr.2010.09.014 *
YOO SO YOUNG, OH JIN-WOO, LEE SEUNG-WUK: "Phage-Chips for Novel Optically Readable Tissue Engineering Assays", LANGMUIR, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 28, no. 4, 31 January 2012 (2012-01-31), US , pages 2166 - 2172, XP055975842, ISSN: 0743-7463, DOI: 10.1021/la203840n *

Also Published As

Publication number Publication date
EP4303297A1 (en) 2024-01-10
US20240026268A1 (en) 2024-01-25
JP2024513007A (ja) 2024-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018088856A2 (ko) 마이크로유체칩, 삼차원 채널 구조물, 이를 이용한 세포 배양 방법 및 이를 이용한 생리활성 물질의 활성평가 방법
WO2021187758A1 (ko) 심장 오가노이드, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 약물 독성 평가 방법
Luce et al. Advanced techniques and awaited clinical applications for human pluripotent stem cell differentiation into hepatocytes
WO2021034107A1 (ko) 약물의 심장 효능 및 독성 시험을 위한 심근내막 수준 생체모방 심장칩
NZ551832A (en) Neural stem cells
CN107142240A (zh) 将消化道来源上皮细胞重编程为内胚层干/祖细胞的方法及应用
WO2021101313A1 (ko) 심근주막 수준 생체모방 심장칩 및 이의 용도
WO2021112638A1 (ko) 신경에 대한 효능 및 독성평가를 위한 생체모방 신경칩 및 이의 용도
WO2017155166A1 (ko) 물리적 자극에 의한 환경유입을 이용한 세포 리프로그래밍 방법
WO2019083281A2 (ko) 신규한 근골격계 줄기세포
WO2021086063A1 (ko) 3차원 뇌 오가노이드를 이용한 뇌신경계질환 치료용 줄기세포 스크리닝 방법
WO2022216132A1 (ko) 세포 집합체 배양을 위한 미세유체 현적배양 디바이스
WO2022250406A1 (ko) 비알코올성 지방간 인공 조직 모델
WO2012047037A2 (ko) 배아줄기세포 유래 심근세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 세포치료제
WO2016052769A1 (ko) 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법, 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 미세유체소자 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법
CN104946581B (zh) 一种培养猪滋养层干细胞的专用培养基及方法
Siddiqui et al. Amniotic fluid-derived pluripotential cells
WO2011126177A1 (ko) 인간 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법
WO2023085812A1 (ko) 탈세포 자궁 조직 유래 세포외기질을 포함하는 조성물 및 이의 용도
JPWO2004106502A1 (ja) 間葉系幹細胞
KR20220140439A (ko) 세포 집합체 배양을 위한 미세유체 현적배양 디바이스
WO2009151207A1 (ko) 인간 간성장인자를 발현하는 중간엽 줄기세포, 그의 제조방법 및 그의 간질환 치료제로서의 용도
WO2011037416A2 (ko) 세포이식술을 위한 혼합세포복합체인 세포스페로이드의 제조방법 및 이의 이용방법
WO2021261621A1 (ko) 하이드로젤을 사용하지 않는 줄기세포 대량 증식방법
WO2024025177A1 (ko) 역-미세둑 구조가 포함된 장기모사칩 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22785040

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023560009

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022785040

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022785040

Country of ref document: EP

Effective date: 20231005

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE