WO2009151207A1 - 인간 간성장인자를 발현하는 중간엽 줄기세포, 그의 제조방법 및 그의 간질환 치료제로서의 용도 - Google Patents

인간 간성장인자를 발현하는 중간엽 줄기세포, 그의 제조방법 및 그의 간질환 치료제로서의 용도 Download PDF

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mesenchymal stem
stem cells
liver
growth factor
transformed
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남명진
이상구
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한쎌 주식회사
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Definitions

  • the present invention relates to adult stem cells that can be used as a therapeutic agent for liver disease, and a method for preparing the same, and more specifically, recombinant expression comprising a human hepatic growth factor (hereinafter, abbreviated as “hHGF”) gene.
  • hHGF human hepatic growth factor
  • CM Conditioned culture medium with a hepatocyte proliferation effect obtained from the transformed cells
  • Liver disease is one of the high incidences among Koreans. Especially, liver cirrhosis and liver cancer following chronic hepatitis are important diseases to overcome. According to the annual statistics on the cause of death of Koreans, mortality from infectious diseases is gradually decreasing, while mortality from chronic degenerative diseases including cirrhosis is increasing, and mortality from liver cancer is 23.7 per 100,000 people, the world's number one, and cirrhosis. In addition, 28.8 deaths from chronic liver disease are reported in the world's third place. However, cirrhosis and the like, despite many research efforts on chronic liver disease to date there is no satisfactory drug to treat these diseases.
  • liver cirrhosis stages are generally developed into liver cancer.
  • hepatocytes are damaged due to autoimmune or hepatitis virus, the hepatic cells are ingested by macrophages due to tissue reactions during wound regeneration after necrosis of hepatocytes.
  • Fibrosis which is full of fibrous and regenerative nodules, leads to cirrhosis.
  • liver function tests AST, ALT, bilirubin, alkaline phosphatase (ALP), etc.
  • serological marker tests for hepatitis virus, liver ultrasound, laparoscopy, liver biopsy, etc.
  • the blood albumin test or coagulation time is measured to assess the remaining residual liver function.
  • antiviral agents include Ara-A, Ara-Amp, acyclovir and suramine, and lamivudine (3TC) has recently been used in clinical trials as a new treatment for hepatitis B.
  • Lamivudine a nucleic acid derivative, is an oral antiviral agent and a drug used in the Americas since 1995 as a treatment for AIDS that specifically inhibits reverse transcriptase activity of acquired immunodeficiency virus (HIV).
  • Lamivudine was first used experimentally in patients with chronic hepatitis B by Divas et al., And HBV DNA was negative during dosing and ALT levels normalized in 19% of patients, indicating sustained blood HBV DNA negative.
  • lamivudine has the disadvantage of being difficult to use for a long time due to the toxicity of the drug itself, and when the drug is stopped, the virus continues to proliferate and return to its original state. It has been found that HBV mutants with resistance to this drug appear in patients who have recently resisted long-term lamivudine administration for 6-12 months.
  • interferon is used to treat hepatitis B, but its effectiveness is extremely low.
  • administration is standard for three to six months and more useful results are expected for long-term administration, the side effects are high and withdrawal of the drug increases the proliferation of the virus and returns to its original state.
  • the improvement of ALT levels and the negativeness of the HBe antigen become an indication of treatment.
  • the active hepatitis state continues even though the blood HBe antigen is negative. While such adjuvant therapy has a long treatment period and a large burden on cost, it has a disadvantage of low treatment efficiency, high recurrence rate, side effects, or the formation of autoantibodies, leading to thyroid disease.
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • Mesenchymal stem cells are multipotent stem cells capable of differentiating into mesodermal-derived cells and are easily adult from adult bone marrow, peripheral blood, cord blood and fat. Stem cells can be harvested.
  • mesenchymal stem cells isolated from human bone marrow and umbilical cord blood are not difficult to use for various purposes regardless of age. Therefore, in order to increase the level of hepatocyte regeneration promoters present therein by using the mesenchymal stem cells, hepatocyte regeneration promoters may be introduced into the cells directly or by using an appropriate carrier, and the hepatocyte regeneration factor or the active fragment thereof may be introduced.
  • the method of introducing the gene to express into said mesenchymal stem cell, etc. can also be used.
  • the present inventors have continued to develop new therapeutic agents for liver disease.
  • the present inventors have produced recombinant expression vectors containing human liver growth factor (hHGF) genes, isolated mesenchymal stem cells from umbilical cord blood, and cultured each recombinant expression.
  • the transformed mesenchymal stem cells producing human liver growth factor were prepared by transforming the cells with vectors.
  • the transformed mesenchymal stem cells and / or CM culture medium thereof proliferates hepatocytes and apoptosis
  • the present invention was successfully completed by confirming that inhibition and effectively cure cirrhosis lesions can be developed as well as preventive and therapeutic agents for liver disease.
  • the present invention is transformed into a recombinant expression vector containing a human hepatic growth factor (hHGF) gene to express human liver growth factors (mesenchymal stem cells; MSCs ).
  • hHGF human hepatic growth factor
  • the present invention (1) isolating mesenchymal stem cells; (2) passaging the mesenchymal stem cells; (3) transformed with a recombinant expression vector comprising a human liver growth factor (hHGF) gene; And (4) selecting transformed cells expressing human liver growth factor therefrom; It provides a method for producing the mesenchymal stem cells (MSCs) consisting of a process.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • the present invention also provides a method for culturing mesenchymal stem cells using the mesenchymal stem cells to produce a conditioned media (CM) having a hepatocyte proliferation effect.
  • CM conditioned media
  • the mesenchymal stem cells are cultured by 7-9 generation generation, preferably 8 generation passage and cultured to 70-90%, preferably 80%, using serum-added medium. It is preferable to incubate for about 10 hours, preferably 6 hours, and then incubate for about 3 days using a serum-free medium.
  • the present invention also provides an adjusted culture medium (CM) having a hepatocyte proliferation effect prepared according to the method for culturing the mesenchymal stem cells.
  • CM adjusted culture medium
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating liver disease, comprising the mesenchymal stem cells (MSCs) expressing the human liver growth factor (hHGF) as an active ingredient.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • hHGF human liver growth factor
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating liver disease, comprising the adjusted culture medium having the hepatocyte proliferation effect as an active ingredient.
  • CM modified culture medium
  • CM hepatocyte proliferation effect
  • hHGF human liver growth factor
  • the present invention provides a method for treating liver disease that improves the damaged liver by administering the transformed mesenchymal stem cells or the adjusted culture medium having the hepatocyte proliferation effect in vivo.
  • the present invention provides adult stem cells expressing hepatic growth factor (HGF).
  • HGF hepatic growth factor
  • HGF Liver growth factor
  • SF scatter factor
  • HGF is a multifunctional heterodimer polypeptide produced by mesenchymal cells.
  • HGF is composed of a 69 kDa alpha-chain comprising an N-terminal finger domain and four kringle domains and a 34 kDa beta-chain with similarity to the protease domain of the chymotrypsin-like serine protease. It consists of a containing structure.
  • Human HGF is synthesized as a precursor having 728 amino acids in the form of a biologically inactive single chain and the R494 residue is cleaved by specific serum serine proteases to become biologically active HGF.
  • Active HGF is a heterodimer in which the 69-kDa alpha-chain and the 34-kDa beta-chain are linked by disulfide bonds.
  • the nucleotide sequence encoding the preferred hepatocyte growth factor is as described in the sequence listing, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 includes the entire gene, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 includes only the nucleotide sequence of 2.82 kb of the total gene, and the sequence The base sequence of No. 3 includes only the coding sequence of the liver growth factor gene.
  • Adult stem cells are undifferentiated cells that will differentiate into cells of specific tissues when needed.
  • the adult stem cell lines may be derived from bone marrow, blood, cord blood, liver, skin, gastrointestinal tract, placenta, or uterus.
  • the cord blood-derived adult stem cells may be more preferably the cord blood-derived mesenchymal stem cells.
  • Adult stem cells derived from umbilical cord blood (umbilical cord blood) contain a large amount of hematopoietic stem cells, as well as bone marrow cells found in bone marrow in bone, including hematopoietic stem cells, which can produce blood and lymphocytes, and mesenchymal stem cells. It has a kind of adult stem cell. Among them, mesenchymal stem cells are easy to proliferate in vitro and can be differentiated into various cell types (fat cells, chondrocytes, muscle cells and bone cells), which are useful targets for gene therapy and cell therapy. Can be.
  • mesenchymal stem cells are undifferentiated and have the potential for differentiation.
  • mesenchymal stem cells for example, mesenchymal stem cells can differentiate into various cells derived from mesoderm, it is not certain that the mesenchymal stem cells administered are necessarily differentiated into hepatic parenchymal tissue cells. There is a limit to how to treat liver disease using the cells themselves.
  • the present inventors have developed a method to improve the probability of differentiation into liver parenchymal cells. It was confirmed that mesenchymal stem cells were differentiated into hepatic parenchymal tissue cells with a much higher probability than mesenchymal stem cells themselves, and that proteins related to hepatic parenchymal cells were expressed and secreted at high levels.
  • the present invention provides transformed mesenchymal stem cells (MSCs) expressing human hepatic growth factor (hHGF).
  • the mesenchymal stem cells are preferably transformed with a recombinant expression vector comprising a human hepatocyte growth factor (hHGF) gene and active fragments thereof, and the recombinant expression vector preferably includes pMEX-HGF or pMSCV-HGF.
  • hHGF human hepatocyte growth factor
  • the transformed mesenchymal stem cells were deposited on December 11, 2009 to the Korea Cell Line Research Foundation of Seoul National University, an international microbial deposit institution (Accession No .: KCLRF-BP-00196).
  • the present invention also provides the use of the adult stem cells expressing hepatic growth factor (HGF) as a therapeutic agent for liver disease.
  • HGF hepatic growth factor
  • the present invention provides a use of mesenchymal stem cells (MSCs) expressing human liver growth factor (hHGF) as an agent for preventing and treating liver disease.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • hHGF human liver growth factor
  • the liver disease includes cirrhosis of the liver, liver cancer and hepatitis.
  • the present invention provides recombinant expression vectors comprising all or a portion of the human liver growth factor (hHGF) gene.
  • hHGF human liver growth factor
  • the present invention provides a recombinant expression vector pMEX-HGF and an E. coli transformant transformed therein comprising the entire human liver growth factor gene.
  • the present invention also provides a recombinant expression vector pMSCV-HGF and an E. coli transformant transformed therein comprising the entire human liver growth factor (hHGF) gene.
  • Recombinant expression vectors used in the present invention may include various plasmid vectors, cosmid vectors and viral vectors, etc. in addition to pMEX-neo or pMSCV-neo, which are the basis of the recombinant expression vectors, and among them, viral expression vectors may be used. It is preferable to include human immunodeficiency virus (HIV), murine leukemia virus (MLV), avian sarcoma leucosis virus (ASLV), spleen necrosis virus (SNV), Rous sarcoma virus (RSV) and mouse mammary tumor virus (MMTV).
  • HCV human immunodeficiency virus
  • MMV murine leukemia virus
  • ASLV avian sarcoma leucosis virus
  • SNV spleen necrosis virus
  • RSV Rous sarcoma virus
  • MMTV mouse mammary tumor virus
  • retrovirus vectors More preferably, retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated viruses, herpes simplex viruses, and the like are used. All of the active fragments of the human liver growth factor gene inserted into the expression vectors may be included in the scope of the present invention when used for cell transformation including various stem cells.
  • the present invention (1) isolating mesenchymal stem cells; (2) passaging the mesenchymal stem cells; (3) transformed with a recombinant expression vector comprising a human liver growth factor (hHGF) gene; And (4) selecting transformed cells expressing human liver growth factor therefrom; It provides a method for producing the mesenchymal stem cells (MSCs) consisting of a process.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • the mesenchymal stem cells derived from human cord blood in the above (1) process. Specifically, the human cord blood is centrifuged and centrifuged. The cells are washed with DPBS buffer and the like, and then centrifuged again and left at room temperature using ACK buffer and the like. Again 5 times the culture medium of the buffer solution is added and centrifuged. The cells are then treated with LIF buffer or the like and the culture medium is added to stabilize the cells.
  • the mesenchymal stem cells derived from the cord blood thus obtained are preferably subcultured every 5 days, and it is more preferable to use mesenchymal stem cells passaged repeatedly for 7 to 8 generations.
  • the mesenchymal stem cells are preferably used for 7-9 generation generation, preferably 8 generation passage culture, and in the step (3), the recombinant expression vector pMEX- as the recombinant expression vector. It is preferable to include HGF or pMSCV-HGF, and in the above (3) process, all general cell transformation methods can be used, but it is more preferable to transform the recombinant expression vector using nanoparticles or the like. . In addition, in the above (4) process, the transformed cells are preferably selected using an antibiotic marker including neomycin (neomycin).
  • hHGF human liver growth factor
  • the method using an adenovirus is the most preferable. Specifically, the method inserts all or part of the human hepatocyte growth factor (hHGF) gene into an adenovirus expression vector to produce a recombinant expression vector, which is transformed into a packaging virus to transform transformed packaging cells. And then cultured and filtered again to obtain an adenovirus solution, which is used to infect mesenchymal stem cells, and then mesenchymal stem that continuously expresses hepatocyte growth factor using a selection marker included in the recombinant adenovirus expression vector. The process of selecting cells.
  • hHGF human hepatocyte growth factor
  • the present invention also provides an agent for the prevention and treatment of liver disease, wherein the mesenchymal stem cells (MSCs) expressing the human liver growth factor (hHGF) as an active ingredient.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • hHGF human liver growth factor
  • the subject of the liver disease of the present invention means all liver diseases that cause damage to the liver parenchymal cells, phase liver disease is chronic and acute type A, B, hepatitis C, cirrhosis, cirrhosis, liver cancer and fatty liver, etc. It is preferred to include, more preferably used for the treatment of cirrhosis caused by the hepatitis B virus.
  • treatment and prevention refers to any action that inhibits or delays the onset of all diseases related to liver disease by using an adult stem cell line into which the liver growth factor gene has been introduced. By cell line is meant any action that improves or beneficially changes liver disease.
  • the present invention also provides a method for culturing mesenchymal stem cells using the transformed mesenchymal stem cells to produce a conditioned media (CM) having a hepatocyte proliferation effect.
  • CM conditioned media
  • the mesenchymal stem cells are passaged 7 to 9 generations, preferably 8 generations and cultured the cells to 70 to 90%, preferably about 80% using a medium added serum Cell transformation and cultured for 2 to 10 hours, preferably 6 hours, and then cultured for 3 more days using a serum-free media. to provide.
  • the culture method may be used for all stem cells in addition to the mesenchymal stem cells, the mesenchymal stem cells may include both untransformed stem cells and transformed stem cells.
  • the present invention also provides a cultured culture medium (CM) having a hepatocyte proliferation effect isolated from transformed mesenchymal stem cells expressing human liver growth factor (hHGF).
  • CM cultured culture medium
  • hHGF human liver growth factor
  • the present invention also provides a method for producing the CM culture medium prepared by culturing transformed mesenchymal stem cells expressing human liver growth factor (hHGF) in a medium without serum.
  • hHGF human liver growth factor
  • the present invention also provides the use of a cultured culture medium (CM) of transformed mesenchymal stem cells expressing the human hepatocyte growth factor (hHGF) as a hepatocyte therapeutic.
  • CM cultured culture medium
  • HGF human hepatocyte growth factor
  • the adjusted culture medium may be used as a prophylactic and therapeutic agent for various liver diseases including cirrhosis, liver cancer and hepatitis.
  • HGF gene in order to develop genetically modified adult stem cells for the treatment of cirrhosis, HGF gene is transformed using a recombinant expression vector in which human hepatocyte growth factor (hHGF) gene is inserted into mesenchymal stem cells isolated from human cord blood. Only the hMSCs to which the HGF gene is transferred are selectively cultured therefrom. In addition, the efficacy and safety of HGF gene-modified stem cell therapeutics produced through animal experiments of experimental animals causing cirrhosis are investigated.
  • hHGF human hepatocyte growth factor
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating liver disease, comprising the human liver growth factor (hHGF) -expressing mesenchymal stem cells (MSCs) as an active ingredient.
  • hHGF human liver growth factor
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating liver disease, comprising the adjusted culture medium having the hepatocyte proliferation effect as an active ingredient.
  • the liver disease preferably includes all cirrhosis, liver cancer and hepatitis.
  • compositions of the present invention according to the conventional method according to the purpose of use, powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, oral formulations such as aerosols, sterile injectable solutions, ointments, etc.
  • compositions include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate , Gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methyl hydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc. have.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may be formulated by mixing at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin and the like in the composition. Make up. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, lyophilized formulations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • Bases for injectables may include conventional additives such as solubilizers, isotonic agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers and preservatives.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by various methods such as oral, intravenous, subcutaneous, intradermal, intranasal, intraperitoneal, intramuscular, transdermal, and the single dose of the mesenchymal stem cells is to be treated. It can be easily increased or decreased by those skilled in the art in consideration of various factors such as the disease, the severity of the disease, the route of administration, the weight, age and sex of the patient. Therefore, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any aspect.
  • the present invention provides a kit for treating liver disease comprising the recombinant expression vector and the mesenchymal stem cells or the mesenchymal stem cells transformed with the human hepatocyte growth factor gene, and the like, comprising a human liver growth factor (hHGF) gene. to provide.
  • the recombinant expression vector and mesenchymal stem cells may be provided separately or in the form of transfecting mesenchymal stem cells with the expression vector.
  • the liver disease preferably includes cirrhosis, liver cancer and hepatitis.
  • the present invention is a treatment for liver disease comprising a modified culture medium having a hepatocyte proliferation effect in addition to the recombinant expression vector and the mesenchymal stem cells or transformed mesenchymal stem cells comprising the human liver growth factor (hHGF) gene
  • hHGF human liver growth factor
  • the present invention also provides a method for treating liver disease that improves damaged liver or prevents various liver diseases by administering the transformed mesenchymal stem cells or the adjusted culture medium having the hepatocyte proliferating effect in vivo.
  • the liver disease preferably includes cirrhosis, liver cancer and hepatitis.
  • the present invention provides a recombinant expression vector comprising a human hepatocyte growth factor (hHGF) gene, a mesenchymal stem cell transformed thereto to express a human hepatocyte growth factor, and a mesenchymal stem cell derived from umbilical cord blood.
  • hHGF human hepatocyte growth factor
  • the method for producing the mesenchymal stem cells consisting of the step of culturing and transforming with the recombinant expression vector, the culture medium having a hepatocyte proliferation effect obtained from the stem cells, the culture of the mesenchymal stem cells to produce the same.
  • the method and the use of the transformed mesenchymal stem cells as a preventive and therapeutic agent for liver disease.
  • the mesenchymal stem cells producing the human hepatocyte growth factor of the present invention have an excellent effect of effectively proliferating hepatocytes, inhibiting apoptosis, and inhibiting cirrhosis, they can be widely used for preventing and treating various liver diseases.
  • Figure 1 schematically shows a restriction map of the expression vector pMEX-neo used in the present invention.
  • Figure 2 shows and compared the mesenchymal stem cells and normal mesenchymal stem cells transformed with the hHGF gene of the present invention under a microscope.
  • Figure 3 is observed and compared the mesenchymal stem cells and normal mesenchymal stem cells transformed with the hHGF gene of the present invention under a fluorescence microscope.
  • A microtransformation
  • B pGFP3 vector
  • C pGFP3 and pMEX-HGF vectors
  • D Transformation with pGFP3 and pMSCV-HGF vectors.
  • Figure 4 shows the expression of human liver growth factor (hHGF) at the RNA level in mesenchymal stem cells transformed with the hHGF gene of the present invention.
  • hHGF human liver growth factor
  • Figure 5 shows the expression of human liver growth factor (hHGF) in the mesenchymal stem cells transformed with the hHGF gene of the present invention by examining the Western blot (a) and Eliza method (b) at the protein level.
  • hHGF human liver growth factor
  • 6 is a cell culture solution containing the hHGF protein expressed in the present invention treated with normal hepatocytes (NCTC 1469) to investigate the cell viability and compared with the control group.
  • Figure 7 shows the effect of the cell culture medium containing the hHGF protein expressed in the present invention on apoptosis (apoptosis) compared with the control group.
  • FIG. 8 illustrates the therapeutic effect of liver cirrhosis in liver tissue when the mesenchymal stem cells transformed with the hHGF gene of the present invention are administered to a cirrhosis animal model.
  • 9 to 11 show the changes in liver tissue under the microscope when injecting mesenchymal stem cells transformed with the hHGF gene of the present invention.
  • Figure 12 shows the changes in liver tissue under the microscope when phosphate buffer solution (PBS) is administered as a control.
  • PBS phosphate buffer solution
  • mesenchymal stem cells were separated by combining gradient density centrifugation with plastic adherence using human umbilical cord blood (HUCB). Specifically, human umbilical cord blood was centrifuged to remove supernatant, DPBS, cells were released, and centrifuged again. ACK buffer solution was added and allowed to stand at room temperature for 2 minutes, and then culture medium of about 5 times the buffer solution was added, and then the supernatant was removed by centrifugation. Then, LIF buffer was added, and after 1 minute, culture medium was added and filtered. Cells obtained therefrom were centrifuged again and subjected to cell culture as follows.
  • the cord blood-derived mesenchymal stem cells were passaged and 4th passaged cells (HUCB-derived MSCs) were added with 10% fetal bovine serum (FBS), 4 nmol / L L-glutamine (glutamine). , DULbecco modified Eagle medium (DMEM) with 100 IU / mL penicillin and 100 mg / mL streptomycin were incubated in a 37 ° C incubator containing 5% CO 2 . . These cells were incubated for 1-2 weeks, changing to fresh culture every 2 days. When the cells were 70% filled in the culture vessel, the cells were removed from the culture vessel using 0.25% trypsin and 1 mM EDTA, and then subcultured in a new culture vessel. When passaged cells reached passages 7-8, they were used in the various experiments described below. Prior to use in experiments, the cells were slowly frozen in culture containing 10% DMSO and stored at -150 ° C.
  • FBS fetal bovine serum
  • glutamine
  • the HGF gene used a human-derived HGF (hHGF) gene.
  • This hHGF gene was inserted into an existing expression vector pMSCV-neo or pMEX-neo resistant to neomycin to produce recombinant expression vectors pMSCV-HCF and pMEX-HCF of the present invention (see FIG. 1).
  • gene sequencing was performed using primers corresponding to appropriate sites in the gene base sequence, and the base sequence was determined and confirmed.
  • the recombinant expression vectors were transformed into E. coli DH5 ⁇ to make E.
  • the recombinant expression vector pMEX-HGF is nanoparticles (nanoparticle; MNP) in the 7th passage cell of mesenchymal stem cells (HUCB-derived MSCs) derived from human cord blood. @SiO 2 (RITC) _PTMA) was used.
  • MNP mesenchymal stem cells
  • HUCB-derived MSCs mesenchymal stem cells derived from human cord blood. @SiO 2 (RITC) _PTMA
  • the transformed hHGF gene-transferred cord blood-derived mesenchymal stem cells (HUCB-derived MSCs) were selected by fluorescence microscopy to investigate whether the GFP protein genes transfected at the same time during gene transfer were fluorescently expressed (FIG. 2 and See FIG. 3).
  • Figure 2 shows and compared the mesenchymal stem cells and normal mesenchymal stem cells transformed with the hHGF gene of the present invention under a microscope.
  • Figure 3 is observed and compared the mesenchymal stem cells and normal mesenchymal stem cells transformed with the hHGF gene of the present invention under a fluorescence microscope. As a result, it was confirmed that the mesenchymal stem cells of the present invention express the human liver growth factor and at the same time the difference in cell morphology while expressing the fluorescent signal.
  • RT-PCR reverse transcriptase-polymerase chain reaction
  • FIG. 4 shows the expression of human liver growth factor (hHGF) at the RNA level in mesenchymal stem cells transformed with the hHGF gene of the present invention. As a result, it was confirmed that the mesenchymal stem cells of the present invention can effectively express and produce human liver growth factor genes.
  • hHGF human liver growth factor
  • hMSC cells treated with HGF and hMSC cells not treated with HGF were harvested using trypsin EDTA to obtain proteins therefrom.
  • This sample was made to contain 30 ⁇ g of protein, 2x sample buffer [sample buffer; 0.125M Tris, pH 6.8, 6% SDS, 20% Glycerol, 0.02% bromophenol blue, 1.44 mM ß-mercaptoethanol] and then boil at 100 ° C. for 5 minutes and 10% SDS-polyacrylic acid. Separate on amide gel.
  • FIG. 5 shows the human liver growth factor (hHGF) in mesenchymal stem cells transformed with the hHGF gene of the present invention manifestation of Western blot on the protein level (a) and Ella and shows irradiated in a manner (b). As a result, the mesenchymal stem cells of the present invention was confirmed to produce large amounts of growth factors between a human.
  • hHGF human liver growth factor
  • CM Modified Culture Medium
  • hHGF Human Liver Growth Factor
  • hHGF human hepatocyte growth factor
  • the culture medium of the transformed mesenchymal stem cells was collected to determine the effect on the proliferation of normal hepatocytes (NCTC clone 1469) (see Figure 6).
  • the cell culture is specifically produced from the transformed stem cells with a culture medium (CM) without adding fetal bovine serum (FBS).
  • CM culture medium
  • FBS fetal bovine serum
  • mesenchymal stem cells which were subcultured from cord blood, were inoculated with about 1 X 10 4 cells in MEM medium containing 10% FBS and then cultured for 24 hours. The medium was exchanged again with no serum (serum free MEM), and the effect on the cell viability was investigated using the medium obtained therefrom.
  • CM culture medium
  • FBS fetal bovine serum
  • CM medium was centrifuged, concentrated using a 50KD membrane (membrane), and stored at ⁇ 70 ° C. until the next experiment after the incubation time.
  • CM culture medium
  • hHGF human hepatocyte growth factor expressed from the adult stem cells of the present invention compared to the control group was confirmed that the effect of proliferating hepatocytes more excellent than conventional recombinant hepatocyte growth factor (rhHGF) (see Fig. 6).
  • CM culture medium made from the transformed adult stem cells has the effect of inhibiting cell death.
  • Normal hepatocytes NCTC clone 1469) were seeded at a concentration of 1 ⁇ 10 4 cells / ml and then incubated for 24 hours.
  • the culture medium was exchanged with serum free MEM medium and treated with 10 ⁇ l of GCDC, a drug that induces apoptosis, and simultaneously treated with 10 ⁇ l of GCDC and CM medium, and reacted for 24 hours.
  • the results were measured by assay. As a result, it was confirmed that the cell viability was excellently increased when the CM medium was added (see FIG. 7).
  • mesenchymal stem cells (HUCB-derived MSCs) expressing the hHGF gene is neomycin, 10% fetal bovine serum at a concentration of 400 ng / mL (fetal bovine serum; FBS), 5% CO using Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) with 4 nmol / L L-glutamine, 100 IU / mL penicillin, and 100 mg / mL streptomycin It was selectively incubated in a 37 ° C. incubator containing 2 (see FIG. 2). As a result, the mesenchymal stem cells of the present invention was confirmed that the change in the liver tissue of liver-induced liver cirrhosis while expressing human liver growth factor (see Figs. 9 to 12).
  • HGF protein in order to investigate the high secretion of HGF protein from mesenchymal stem cells transformed with hHGF gene, the amount of HGF protein was measured by ELISA method.
  • Umbilical cord blood-derived adult stem cells themselves were used as a control.
  • the result was 240 ng / ml of mesenchymal stem cells transformed with the recombinant expression vector pMEX-HGF, 290 ng / ml for the mesenchymal stem cells transformed with the recombinant expression vector pMSCV-HGF, and 35 ng / ml for the control. It was confirmed to produce recombinant HGF protein.
  • Example 8 Efficacy evaluation through animal experiment of mesenchymal stem cells transformed with hHGF gene
  • mice In order to classify the experimental animals into each experimental group, three experimental groups of 15 rats, namely PBS-treated group (control group) and stem cell-only group, were used for each of 15 rats using 12-week-old mature female Wistar rats (230-300 g) as experimental animals. And stem cell treated groups modified with hHGF gene. Liver cirrhosis was induced in all the experimental groups, and the stem cells modified with PBS, stem cells, and hHGF genes were given night and day rhythms, and food and water were freely supplied.
  • PBS-treated group control group
  • stem cell-only group were used for each of 15 rats using 12-week-old mature female Wistar rats (230-300 g) as experimental animals.
  • stem cell treated groups modified with hHGF gene. Liver cirrhosis was induced in all the experimental groups, and the stem cells modified with PBS, stem cells, and hHGF genes were given night and day rhythms, and food and water were freely supplied.
  • cirrhosis was injected by diluting carbon tetrachloride (CCl 4 ) and / or TTA (1 ml / kg, 3 times / week) in the abdominal cavity of the experimental animal. Liver cirrhosis was induced in the experimental animals of all experimental groups, and prior to this, organs and serum were collected at the expense of randomly selected experimental animals from each experimental group. In addition, it was confirmed that cirrhosis was successfully induced by performing histological and hematological experiments with the samples obtained above.
  • tissue sections were obtained by dipping in paraffin after alcohol dehydration. The resulting tissue sections were hematoxylin and eosin stained and Mason's Trichrome stained for histopathological examination to evaluate the degree of inflammation and liver fibrosis (hardening) of tissues. It was.
  • FIG. 8 illustrates the therapeutic effect of cirrhosis when the mesenchymal stem cells transformed with the hHGF gene of the present invention are administered to a cirrhosis animal model.
  • 9 to 11 show the changes in liver tissue under the microscope when injecting mesenchymal stem cells transformed with the hHGF gene of the present invention.
  • Figure 12 shows the changes in liver tissue under a microscope when phosphate buffer solution (PBS) is administered as a control instead of the mesenchymal stem cells transformed with the hHGF gene of the present invention.
  • PBS phosphate buffer solution
  • the liver tissue was hydrolyzed with hydrochloric acid to take a certain amount and the hydrochloric acid was blown, and then the residue was dissolved in isopropyl alcohol and chloramine-T (chloramine-T). Oxidized.
  • Ehrlich's reagent solution p-dimethylaminobenzaldehyde
  • the absorbance was measured at 558 nm to calculate the total amount of collagen in the tissue. As a result, it was confirmed that the amount of total collagen in the tissue increases.
  • ALT alanine
  • AST aspartate transaminase
  • RA-XT alkaline phosphatase
  • TB total bilirubin
  • TAA drug was administered for 8 weeks, and GOT, GPT measurement showed severe liver damage.
  • the rats were divided into 3 groups, the first group as a control group, and only the solvent, PBS, and the second group were HGF.
  • the stem cells injected with the gene were injected, and the third group was administered only stem cells.
  • PBS and stem cells were administered and TAA was administered for 4 weeks, followed by necropsy after continuous liver injury. Liver destruction continued to progress to cirrhosis in control rats treated with PBS alone, but in mice injected with hHGF gene-expressing stem cells, the progression of lesions was slowed or recovered, resulting in a 50-60% therapeutic effect. It was confirmed that it was shown (see Fig. 8).

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Abstract

본 발명은 간질환 치료제로 사용될 수 있는 성체줄기세포 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간 간성장인자 (human hepatic growth factor; hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이로 형질전환되어 인간 간성장인자를 발현하는 중간엽 줄기세포, 제대혈로부터 유래한 중간엽 줄기세포를 분리, 배양하여 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환시키고 선별하는 과정으로 이루어진 상기 중간엽 줄기세포의 제조방법, 상기 형질전환된 세포로부터 얻은 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양배지 (conditioned media; CM) 및 이를 생산하는 중간엽 줄기세포의 배양방법 그리고 상기 형질전환 중간엽 줄기세포 및 그의 배양배지를 간질환 예방 및 치료제로서 사용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명의 인간 간성장인자 (hHGF)를 생산하는 중간엽 줄기세포는 간세포를 효과적으로 증식시키고 세포사멸 (apoptosis)을 억제하며 간경화도 억제시키는 효과가 탁월하므로, 다양한 간질환들을 예방하고 치료하는 데 널리 사용될 수 있다.

Description

인간 간성장인자를 발현하는 중간엽 줄기세포, 그의 제조방법 및 그의 간질환 치료제로서의 용도
본 발명은 간질환 치료제로 사용될 수 있는 성체줄기세포 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간 간성장인자 (human hepatic growth factor; 이하, “hHGF”라고 약칭함) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이로 형질전환되어 인간 간성장인자를 발현하는 중간엽 줄기세포, 제대혈로부터 유래한 중간엽 줄기세포를 분리, 배양하여 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환시키고 선별하는 과정으로 이루어진 상기 중간엽 줄기세포의 제조방법, 상기 형질전환된 세포로부터 얻은 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양배지 (conditioned media; 이하, “CM”라고 약칭함), 이를 생산하는 상기 중간엽 줄기세포의 배양방법 그리고 상기 형질전환 중간엽 줄기세포를 간질환 예방 및 치료제로서 사용하는 용도에 관한 것이다.
간질환은 한국인에게 발병률이 높은 질환 중의 하나로서, 특히 만성간염 등에 이은 간경변증과 간암은 반드시 극복해야 할 중요한 질환들이다. 한국인의 사망원인 통계연보에 의하면 감염성 질환에 의한 사망률은 점차 감소하는데 반해서 간경화를 포함한 만성 퇴행성 질환으로 인한 사망률은 증가하는 추세에 있으며, 간암에 의한 사망률은 10만 명당 23.7명으로 세계 1위, 간경변증 등 만성 간질환에 의한 사망자도 28.8명으로 세계 3위라고 보고하고 있다. 그러나 간경변증 등은 만성 간질환에 대한 많은 연구 노력에도 불구하고 현재까지 이러한 질환을 치료할 만족할 만한 약물이 없는 실정이다.
또한 만성 간질환은 바이러스성 혹은 알코올성 간염을 앓고 난 후 만성간염으로 진행이 되고, 많은 경우에서 간경변증 단계를 거쳐 일부가 간암으로 발전되는 것이 일반적이다. 간세포가 자가면 역성 또는 간염 바이러스 등의 원인으로 인하여 손상되면, 간세포의 괴사 후의 상처 재생과정의 조직 반응으로 손상된 간세포가 거식세포들에 의해 탐식되면서 그 자리로 섬유세포들이 이주하고 콜라겐 등을 분비하여 섬유질과 재생 결절이 가득차는 섬유화가 진행이 되어 간경변증을 일으킨다.
이러한 간질환을 진단하기 위해서는 혈액검사를 통한 간 기능검사 [AST, ALT, 빌리루빈, 알칼리성 포스파타제 (ALP) 등]와 간염 바이러스에 대한 혈청학적 표지자 검사, 간 초음파검사, 복강경검사, 간 조직검사 등이 이용되며, 남은 잔여 간 기능의 평가를 위해서 혈액의 알부민 검사나 혈액응고시간 (프로트롬빈 시간; PT)을 측정한다.
더욱이, 만성 간질환의 경우 특별한 치료법이 없다. 다만 질환의 원인을 살펴 B형 간염이나 C형 간염으로 인한 사례에서는 항바이러스제를 투여하거나 면역증강제를 이용한 보조적 치료법을 시행하고 있을 뿐이다. 항바이러스 제제에는 Ara-A, Ara-Amp, 아시클로비어 (acyclovir) 및 서라민 (suramin) 등이 있고, 최근 B형 간염에 대한 새로운 치료법으로 라미뷰딘 (lamivudine, 3TC)이 임상시험에 사용되고 있다. 라미뷰딘은 핵산 유도체로서 경구 항바이러스제이며 후천성 면역결핍 바이러스 (HIV)의 역전사 활성을 특이적으로 저해하는 에이즈 치료제로 1995년부터 미주지역에서 사용되는 약물이다. 라미뷰딘은 최초로 디엔스타스 등에 의해 B형 만성간염 환자에게 시험적으로 사용되었고 투여 중 HBV DNA가 음성화하고 19% 환자에서 ALT 수치가 정상화되어 지속적인 혈중 HBV DNA 음성화가 인정되었다. 그러나 라미뷰딘은 약물 자체의 독성 때문에 장기간 사용하기 어려운 단점이 있고 약의 복용을 중지하면 억제되었던 바이러스의 증식이 계속되어 원래의 상태로 되돌아간다. 최근 6 내지 12개월의 장기간의 라미뷰딘 투여에 대한 저항성을 나타낸 환자에서 이 약물에 대한 내성을 가지는 HBV 변이주가 출현한다는 사실이 밝혀졌다.
또한, 면역증강제로는 인터페론이 B형 간염 치료에 사용되고 있으나, 그 유효성은 극히 적다. 그러나 3 내지 6개월 간 투여가 표준으로 되어 있고 장기 투여 시 좀 더 유용한 결과가 예상되지만 부작용이 크고 약물 투여를 중단하면 바이러스의 증식이 다시 증가되어 원래 상태로 되돌아간다. B형 만성간염의 치료에 있어서, ALT 수치의 개선과 동시에 HBe 항원의 음성화가 치료의 지표가 된다. 그러나 그 중에는 혈중 HBe 항원이 음성임에도 불구하고 활동성 간염의 상태가 계속되는 경우도 있다. 이러한 보조적 치료법은 치료 기간이 길뿐만 아니라 비용에 대한 부담이 큰 반면, 치료 효율이 낮고 재발률이 높으며 부작용을 동반하거나 자가 항체가 형성되어 갑상선 질환 등을 유발할 수 있다는 단점이 있다.
특히 만성 간질환 단계를 지나 간암으로 발전한 경우, 수술적 절제법이나, 간동맥 색전술 (TACE), 경피적 에탄올 주입술 (PEIT), 고주파 열치료 (RFA) 등의 비수술적 치료법을 시행할 수 있으나, 이 역시 환자에게 대한 치료에 수반된 고통과 경제적 부담을 더욱 증가시키는 반면 치료효율에 대한 기대치는 더욱 낮춘다. 따라서 지금까지의 만성 간질환 및 간암의 치료법에 대한 이와 같은 문제점을 보안하고, 간암으로 발전하기 전단계인 간경변증 등의 만성 간질환 단계에서의 치료법을 개발하기 위한 새로운 접근법이 필요하며, 이에 최근 각종 질환의 치료법으로 대두되고 있는 줄기세포를 이용한 치료제 개발이 중요하게 제안되고 있다.
중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell; MSCs)는 중배엽 유래의 세포로 분화할 수 있는 다분화능을 갖는 줄기세포로서, 성인의 골수, 말초혈액 (peripheral blood), 제대혈 (cord blood) 및 지방으로부터 쉽게 성체줄기세포를 채취할 수 있다. 특히 인간의 골수 및 제대혈로부터 분리된 간엽 줄기세포는 연령에 상관없이 각종 용도로 사용하기에 큰 어려움이 없다. 따라서, 이 간엽 줄기세포를 이용하여 이에 존재하는 간세포 재생촉진인자의 수준을 높이기 위해서는 간세포 재생촉진인자를 직접 또는 적절한 운반체를 사용하여 세포 내로 도입할 수 있고, 상기 간세포 재생촉진인자 또는 그 활성 절편을 발현하는 유전자를 상기 간엽 줄기세포 내로 도입하는 방법 등도 사용할 수 있다.
이에 본 발명자들은 새로운 간질환 치료제를 개발하기 위하여 노력을 계속한 결과, 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터들을 제작하고 제대혈로부터 중간엽 줄기세포를 분리하여 배양한 다음 각 재조합 발현 벡터로 형질전환하여 세포를 선별하는 과정으로 인간 간성장인자를 생산하는 형질전환된 중간엽 줄기세포를 제조하였다. 또한 상기 형질전환된 세포로부터 조정된 배양배지 (CM)를 생산하도록 상기 중간엽 줄기세포를 배양한 다음, 상기 형질전환된 중간엽 줄기세포 및/또는 그의 CM 배양배지가 간세포를 증식시키고 세포사멸을 억제하며 간경화 병변도 효과적으로 완화시킬 뿐만 아니라 이를 유효성분으로 하는 간질환 예방 및 치료제가 개발될 수 있는 점을 확인함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.
본 발명은 새로운 간질환 치료제 등으로 사용될 수 있는 줄기세포 및 그의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 간성장인자 (human hepatic growth factor; hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환되어 인간 간성장인자를 발현하는 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells; MSCs)를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 중간엽 줄기세포를 분리하고; (2) 상기 중간엽 줄기세포를 계대배양하고; (3) 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환시키고; 및 (4) 이로부터 인간 간성장인자를 발현하는 형질전환된 세포를 선별하는; 과정으로 이루어진 상기 중간엽 줄기세포 (MSCs)의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포를 사용하여 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양배지 (conditioned media; CM)를 생산하는 중간엽 줄기세포의 배양방법을 제공한다.
상기 중간엽 줄기세포는 7 내지 9 세대, 바람직하게는 8세대 계대 배양하고 혈청이 첨가된 배지를 사용하여 70 내지 90%, 바람직하게는 80% 정도에 이르도록 세포를 배양하여 형질전환시키고 다시 2 내지 10 시간, 바람직하게는 6시간 배양한 다음 무혈청 배지를 사용하여 3일 정도 더 배양하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포의 배양방법에 따라 제조된 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양배지 (CM)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 중간엽 줄기세포 (MSCs)를 유효성분으로 하는 간 질환 치료제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양배지를 유효성분으로 하는 간 질환 치료제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 중간엽 줄기세포, 형질전환된 중간엽 줄기세포 및 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양배지 (CM) 중에서 선택된 하나 이상을 조합하여 구성되는 간질환 치료용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 중간엽 줄기세포 또는 상기 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양배지를 생체 내에 투여하여 손상된 간을 개선시키는 간 질환의 치료방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 간성장인자 (hepatic growth factor; HGF)를 발현하는 성체 줄기세포 (adult stem cell)를 제공한다.
간성장인자 (HGF)는 SF (scatter factor; 산란인자)라고도 하며, 중간엽 간세포 (mesenchymal cell)에 의해 생산되는 다기능성 이종이량체 (heterodimer) 폴리펩타이드이다. HGF는 N-말단 핑거 도메인 (finger domain) 및 4개의 크링글 도메인 (kringle domain)을 포함하는 69 kDa의 알파-체인 및 키모트립신-유사 세린 프로테아제의 프로테아제 도메인과 유사성을 갖는 34 kDa 베타-체인을 포함하는 구조로 이루어져 있다. 인간 HGF는 생물학적으로 비활성인 단일 체인 형태의 728개의 아미노산을 갖는 전구체로 합성되고 R494 잔기가 특이적 혈청 세린 프로테아제에 의해 절단되어 생물학적으로 활성인 HGF가 된다. 활성 HGF는 69kDa의 알파-체인과 34 kDa의 베타-체인이 이황화결합으로 연결된 이종이량체이다. 바람직한 간성장인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열목록에 기재된 바와 같으며 서열번호 1의 염기서열은 전체 유전자를 포함하고, 서열번호 2의 염기서열은 상기 전체 유전자 중에서 2.82 kb의 염기서열만을 포함하며 서열번호 3의 염기서열은 상기 간성장인자 유전자의 코딩서열만을 포함하고 있다.
성체 줄기세포는 필요한 때에 특정한 조직의 세포로 분화하게 되는 미분화 상태의 세포로서, 상기 성체 줄기세포주는 골수 유래, 혈액 유래, 제대혈 유래, 간장 유래, 피부 유래, 위장관 유래, 태반 유래 또는 자궁 유래 일 수 있으며, 바람직하게는 제대혈 유래 성체 줄기세포일 수 있고 더욱 바람직하게는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 제대혈 (탯줄 혈액) 유래 성체 줄기세포는 조혈모세포를 다량 함유하고 있을 뿐만 아니라 뼈 속의 골수에서 발견되는 골수세포는 혈액 및 임파구를 생산할 수 있는 조혈모세포 (hematopoietic stem cell)를 비롯하여 중간엽 줄기세포 등 여러 종류의 성체 줄기세포를 가지고 있다. 그 중 중간엽 줄기세포는 체외에서 증식이 용이하며 여러 가지 세포 형태 (지방세포, 연골세포, 근육세포 및 뼈세포)로 분화 가능한 세포로서 유전자 치료와 세포 치료에 있어서 유용한 타깃 (target)으로 이용될 수 있다.
성체 줄기세포는 미분화 상태로서 분화에 대한 잠재능을 갖고 있다. 그러나 중간엽 줄기세포는 예를 들면 중간엽 줄기세포는 중배엽에서 유래된 다양한 세포로 분화할 수 있기 때문에 투여된 중간엽 줄기세포가 반드시 간실질 조직세포로 분화한다고 확신할 수 없는 바, 중간엽 줄기세포 자체를 사용하여 간질환을 치료하는 방법에는 한계가 따른다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 간 실질세포로의 분화 확률을 향상시킬 수 있는 방법을 개발하고자 연구한 결과, 본 발명자들은 간성장인자를 암호화하는 유전자를 중간엽 줄기세포에 도입할 경우, 형질전환된 중간엽 줄기세포가 중간엽 줄기세포 자체보다 훨씬 높은 확률로 간실질 조직세포로 분화되고 간실질 세포와 관련된 단백질이 높은 수준으로 발현 및 분비되는 것을 확인하였다.
본 발명은 인간 간성장인자 (human hepatic growth factor; hHGF)를 발현하는 형질전환된 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells; MSCs)를 제공한다. 상기 중간엽 줄기세포는 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자 및 그의 활성 절편을 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환되는 것이 바람직하고, 상기 재조합 발현 벡터에는 pMEX-HGF 또는 pMSCV-HGF 등이 포함되는 것이 바람직하다.
상기 형질전환된 중간엽 줄기세포는 2009년 12월 11일자로 국제미생물기탁기관인 서울대학교 부설 한국 세포주 연구재단에 기탁하였다 (수탁번호: 제 KCLRF-BP-00196).
또한, 본 발명은 간성장인자 (hepatic growth factor; HGF)를 발현하는 상기 성체줄기세포를 간질환 치료제로서 사용하는 용도를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 중간엽 줄기세포 (MSCs)를 간질환 예방 및 치료제로 사용하는 용도를 제공한다. 상기 간질환에는 간경화, 간암 및 간염 등이 포함된다.
또한, 본 발명은 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자 전체 또는 그 일부 활성절편을 포함하는 재조합 발현 벡터들을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 인간 간성장인자 유전자 전체를 포함하는 재조합 발현 벡터 pMEX-HGF 및 이로 형질전환된 대장균 형질전환체를 제공한다. 또한, 본 발명은 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자 전체를 포함하는 재조합 발현 벡터 pMSCV-HGF 및 이로 형질전환된 대장균 형질전환체를 제공한다.
본 발명에 사용되는 재조합 발현 벡터로는 상기 재조합 발현 벡터의 기본이 되는 pMEX-neo 또는 pMSCV-neo 이외에도 각종 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터 및 바이러스 벡터 등이 포함될 수 있고, 이들 중 바이러스 발현 벡터를 사용하는 것이 바람직하며, HIV (human immunodeficiency virus), MLV (murine leukemia virus), ASLV (avian sarcoma leucosis virus), SNV (spleen necrosis virus), RSV (Rous sarcoma virus) 및 MMTV (mouse mammary tumor virus)를 포함하는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 (adeno-associated virus) 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 등을 사용하는 것은 더욱 바람직하다. 상기 발현 벡터들에 인간 간성장인자 유전자의 전체 또는 그 일부 활성 절편을 삽입하여 각종 줄기세포를 포함한 세포 형질전환에 사용되는 경우 모두 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 중간엽 줄기세포를 분리하고; (2) 상기 중간엽 줄기세포를 계대배양하고; (3) 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환시키고; 및 (4) 이로부터 인간 간성장인자를 발현하는 형질전환된 세포를 선별하는; 과정으로 이루어진 상기 중간엽 줄기세포 (MSCs)의 제조방법을 제공한다.
상기 (1) 과정에서 사람의 제대혈로부터 유래한 중간엽 줄기세포를 분리하는 것이 바람직하다. 구체적으로, 사람의 제대혈을 분리하여 원심분리하고 DPBS 완충용액 등을 사용하여 세포를 세척한 다음 다시 원심분리하고 ACK 완충용액 등을 사용하여 실온에서 적절히 방치한다. 다시 상기 완충용액의 5배 정도의 배양배지를 첨가하고 원심분리한다. 그 다음 LIF 완충용액 등을 사용하여 처리하고 배양 배지를 첨가하여 세포를 안정화시킨다. 이와 같이 얻은 제대혈 유래의 중간엽 줄기세포는 5일 마다 계대 배양하여 사용하는 것이 바람직하고, 이 과정을 7 내지 8세대 반복하여 계대 배양한 중간엽 줄기세포를 사용하는 것은 더욱 바람직하다.
상기 (2) 과정에서, 상기 중간엽 줄기세포는 7 내지 9세대, 바람직하게는 8세대 계대 배양하여 사용하는 것이 바람직하고, 상기 (3) 과정에서는, 상기 재조합 발현 벡터로서 상기 재조합 발현 벡터 pMEX-HGF 또는 pMSCV-HGF를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 (3) 과정에서, 일반적인 세포 형질전환방법은 모두 사용될 수 있으나 상기 재조합 발현 벡터를 나노입자 (nanoparticle) 등을 사용하여 형질전환시키는 것이 더욱 바람직하다. 또한 상기 (4) 과정에서, 상기 형질전환된 세포는 네오마이신 (neomycin)을 포함하는 항생제 마커를 사용하여 선별하는 것이 바람직하다.
또한 상기 과정에서 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자 전체 또는 그 일부 활성절편을 도입하기 위해서는, 레트로바이러스를 이용하는 방법, 아데노바이러스를 이용하는 방법, DNA-칼슘 침전법, 리포좀을 이용하는 방법, 폴리아민 계열을 사용하는 방법, 전기천공법 (electroporation), CaCl2 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용하여 효율을 높인 하나한 (Hanahan) 방법, 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, 폴리에틸렌글리콜 (PEG)을 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환법 등을 포함하여 해당 분야에 이미 공지되어 있는 다양한 유전자 도입방법 모두가 사용될 수 있다.
특히 아데노바이러스를 이용하는 방법이 가장 바람직하다. 구체적으로, 이 방법은 상기 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자의 전체 또는 일부를 아데노바이러스 발현 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제작하고, 이를 포장 세포 (packaging virus) 내에 형질 도입하여 형질전환된 포장 세포를 선별하고 배양한 다음 다시 여과하여 아데노바이러스 용액을 얻고, 이를 이용하여 간엽 줄기세포를 감염시키며 그리고 나서 상기 재조합 아데노바이러스 발현 벡터에 포함된 선발마커를 이용하여 간세포 성장인자를 지속적으로 발현하는 간엽 줄기세포를 선별하는 과정으로 이루어진다.
또한, 본 발명은 상기 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 중간엽 줄기세포 (MSCs)를 유효성분으로 하는 간질환의 예방 및 치료제를 제공한다.
본 발명에서 목적하는 간질환의 대상은 간실질 세포의 손상을 가져오는 모든 간질환을 의미하며, 상 간질환은 만성 및 급성 A형, B형, C형 간염, 간경화, 간경변, 간암 및 지방간 등을 포함하는 것이 바람직하고, B형 간염 바이러스에 의해 유래된 간경화의 치료에 사용되는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 “치료 및 예방”이란 간성장인자 유전자가 도입된 성체 줄기세포주를 이용하여 간질환과 관련된 모든 질병의 발병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 말하며, “치료”란 상기 세포주를 사용하여 간질환을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 중간엽 줄기세포를 이용하여 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양배지 (conditioned media; CM)를 생산하는 중간엽 줄기세포의 배양방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포를 7 내지 9 세대, 바람직하게는 8세대 계대 배양하고 혈청이 첨가된 배지를 사용하여 70 내지 90%, 바람직하게는 80% 정도에 이르도록 세포를 배양하여 세포 형질전환시키며 다시 2 내지 10 시간, 바람직하게는 6시간 정도 배양한 다음 무혈청 배지 (serum-free media)를 사용하여 3일 정도 더 배양하는 과정으로 이루어진 상기 중간엽 줄기세포의 배양방법을 제공한다. 상기 배양방법은 상기 중간엽 줄기세포이외에도 모든 줄기세포에 사용될 수 있으며, 상기 중간엽 줄기세포에는 형질전환되지 않은 줄기세포와 형질전환된 줄기세포가 모두 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 형질전환된 중간엽 줄기세포로부터 분리한 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양배지 (CM)를 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 형질전환된 중간엽 줄기세포를 혈청을 첨가하지 않은 배지로 배양하여 제조하는 상기 CM 배양배지의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 형질전환된 중간엽 줄기세포의 조정된 배양배지 (CM)를 간세포 치료제로 사용하는 용도를 제공한다. 상기 조정된 배양배지는 간경화, 간암 및 간염 등을 포함한 다양한 간질환의 예방 및 치료제로 사용될 수 있다.
본 발명에서는 간경화치료를 위한 유전자 변형된 성체줄기세포를 개발하기 위하여 사람의 제대혈로부터 분리된 중간엽 줄기세포에 인간 간성장인자 (hHGF)유전자가 삽입된 재조합 발현 벡터를 사용하여 HGF 유전자 형질전환하고, 이로부터 HGF 유전자가 전이된 hMSCs만을 선택적으로 배양한다. 또한 간경변증을 유발시킨 실험동물의 동물실험을 통하여 생산된 HGF 유전자 변형된 줄기세포 치료제의 효능 및 안전성 등을 조사한다. 특히 간경변증에 대해 여러 실험동물모델들이 논의되고 있으나, 본 실험에서는 비교적 안정적으로 간경변증을 유도한다고 보고된 사염화탄소(CCl4) 또는 TAA를 실험동물의 복강 내로 투여하여 간경화를 유발시킨 실험동물을 사용한다. 상기 실험동물은 정상군, 간경화군, HGF 유전자 변형된 줄기세포치료제 치료군으로 나누어 실험이 실시되고, 실험동물로부터 얻어진 조직과 혈액을 조직염색, 총 콜라겐 양 측정, 혈청 생화학적 검사 등을 행하여, 항섬유화 정도와 HGF 유전자 변형된 줄기세포 치료제의 효능을 비교 평가한다.
본 발명의 상기 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 중간엽 줄기세포 (MSCs)를 유효성분으로 하는 간질환 치료제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 상기 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양배지를 유효성분으로 하는 간질환 치료제용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 간 질환에는 모두 간경변, 간암 및 간염 등을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 멸균 주사용액의 형태, 연고제 등의 외용제, 좌제 등으로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이러한 조성물에는 포함될 수 있는 부형제, 담체, 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 설룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸리드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 슈크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제형화한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜,, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 주사제의 기제로는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다. 특히 조직 또는 장기에 주입하기에 적합한 주사제 형태로 제형화하는 것이 바람직하며, 등장성 멸균용액 또는 경우에 따라 멸균수 또는 생리식염수를 첨가하여 주사 가능한 용액이 될 수 있는 건조제제 (특히 동결 건조제제)로 제형화한다. 본 발명의 약학적 조성물은 경구, 정맥내, 피하, 피내, 비강내, 복강내, 근육내, 경피 등 다양한 방식을 이용하여 투여할 수 있으며 상기 중간엽 줄기세포의 1회 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 인자를 고려하여 당업자에 의해 용이하게 증감이 가능하다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 상기 재조합 발현 벡터 및 중간엽 줄기세포 또는 상기 인간 간성장인자 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포 등을 포함하는 간질환 치료용 키트를 제공한다. 상기 재조합 발현 벡터와 중간엽 줄기세포는 각각 따로 또는 상기 발현 벡터로 중간엽 줄기세포를 형질감염시킨 형태로 제공될 수 있다. 상기 간질환에는 간경변, 간암 및 간염 등이 포함되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 상기 재조합 발현 벡터 및 중간엽 줄기세포 또는 형질전환된 중간엽 줄기세포에 더하여 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양배지를 포함하는 간질환 치료용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 중간엽 줄기세포 또는 상기 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양배지를 생체 내에 투여하여 손상된 간을 개선시키거나 또는 각종 간 질환을 예방하는 간 질환의 치료방법을 제공한다. 상기 간질환에는 간경변, 간암 및 간염 등이 포함되는 것이 바람직하다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이로 형질전환되어 인간 간성장인자를 발현하는 중간엽 줄기세포, 제대혈로부터 유래한 중간엽 줄기세포를 분리, 배양하여 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환시키고 선별하는 과정으로 이루어진 상기 중간엽 줄기세포의 제조방법, 상기 줄기세포로부터 얻은 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양배지, 이를 생산하는 상기 중간엽 줄기세포의 배양방법 그리고 상기 형질전환 중간엽 줄기세포를 간 질환의 예방 및 치료제로서 사용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명의 인간 간성장인자를 생산하는 중간엽 줄기세포는 간세포를 효과적으로 증식시키고 세포사멸을 억제하며 간경화도 억제시키는 탁월한 효과를 나타내므로, 다양한 간질환들을 예방하고 치료하는 데 널리 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 사용한 발현 벡터 pMEX-neo의 제한효소 지도를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포와 정상 중간엽 줄기세포를 현미경 하에서 관찰, 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포와 정상 중간엽 줄기세포를 형광현미경 하에서 관찰, 비교하여 나타낸 것이다. A: 미형질전환; B: pGFP3 벡터; C: pGFP3 및 pMEX-HGF 벡터; D: pGFP3 및 pMSCV-HGF 벡터로 형질전환.
도 4는 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포에서 인간 간성장인자 (hHGF)의 발현을 RNA 수준에서 조사하여 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포에서 인간 간성장인자 (hHGF)의 발현을 단백질 수준에서 웨스턴 블럿 (a) 및 엘라이자 방법 (b)으로 조사하여 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에서 발현시킨 hHGF 단백질이 포함된 세포 배양액을 정상 간세포 (NCTC 1469)에 처리하여 세포 생존율을 조사하고 대조군과 비교하여 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에서 발현시킨 hHGF 단백질이 포함된 세포 배양액이 세포사멸 (apoptosis)에 미치는 효과를 조사하여 대조군과 비교하여 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포를 간경화 동물모델에 투여하는 경우 간 조직에서 간경화의 치료 효과를 조사하여 나타낸 것이다.
도 9 내지 도 11은 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포를 주사하는 경우에 간조직의 변화를 현미경 하에서 조사하여 나타낸 것이다.
도 12는 대조군으로서 인산완충용액 (PBS)을 투여하는 경우에 간조직의 변화를 현미경 하에서 조사하여 나타낸 것이다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양
본 발명에서는 중간엽 줄기세포 (MSCs)는 사람의 제대혈 (human umbilical cord blood; HUCB)을 사용하여 플라스틱 부착과 밀도 구배 원심분리를 결합시킨 방법 (combining gradient density centrifugation with plastic adherence)에 따라 분리하였다. 구체적으로 사람의 제대혈을 원심분리하여 상층액을 제거하고 DPBS를 넣고 세포를 풀어준 다음 다시 원심분리하였다. ACK 완충용액을 첨가하여 실온에서 2분 동안 방치하고 다시 상기 완충용액의 5배 정도의 배양배지를 첨가한 다음 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 그 다음 LIF 완충용액을 넣고 1분 후에 배양 배지를 첨가하여 필터링하였다. 이로부터 얻은 세포는 다시 원심분리하여 다음과 같이 세포 배양과정을 실시하였다.
이와 같이 분리한 제대혈 유래의 중간엽 줄기세포는 계대 배양하고 4번째 계대배양 세포 (HUCB-derived MSCs)를 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum; FBS), 4 nmol/L L-글루타민 (glutamine), 100 IU/mL 페니실린 (penicillin) 및 100 mg/mL 스트렙토마이신 (streptomycin)이 첨가된 DMEM (Dulbecco modified Eagle medium) 배지를 사용하여 5% CO2를 포함하는 37°C 배양기 (incubator) 안에서 배양하였다. 이들 세포는 매 2일마다 새로운 배양액으로 바꾸어 주면서 1 내지 2주 동안 배양하였다. 세포가 배양용기에 70% 차게 되면 0.25% 트립신 (trypsin) 및 1 mM EDTA를 이용하여 배양용기에서 떼어낸 후, 새로운 배양용기에 다시 계대 배양하였다. 계대 배양된 세포들이 7 내지 8 계대에 이르렀을 때 하기에서 기술한 다양한 실험과정에 사용되었다. 실험에 사용하기 전, 상기 세포는 10% DMSO가 포함된 배양액에서 서서히 냉동시킨 후, -150°C에 보관하였다.
실시예 2. 간성장인자 (HGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터의 제작 및 세포 형질전환
본 발명에서는 간성장인자 (HGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하기 위하여, HGF 유전자는 사람으로부터 유래된 HGF (hHGF) 유전자를 사용하였다. 이 hHGF 유전자를 네오마이신 (neomycin)에 내성을 갖는 기존의 발현 벡터 pMSCV-neo 또는 pMEX-neo 내에 삽입하여 본 발명의 재조합 발현 벡터 pMSCV-HCF 및 pMEX-HCF를 제작하였다 (도 1 참조). 이 때 유전자 증폭 시 발생하는 돌연변이 (mutation) 여부를 확인하기 위하여, 유전자 염기서열 중 적당한 부위에 해당하는 프라이머를 사용하여 유전자 시퀸싱을 실시하고 그 염기서열을 결정하여 확인하였다. 상기 재조합 발현 벡터들은 대장균 E. coli DH5α 에 형질전환시키어 대장균 보존고 (stock)들을 만든 다음 DNA와 함께 보관하였다. 또한 상기 재조합 발현 벡터로 세포를 형질전환시키기 위하여, 사람의 제대혈로부터 유래한 중간엽 줄기세포 (HUCB-derived MSCs)의 7번째 계대배양 세포에 상기 재조합 발현 벡터 pMEX-HGF를 나노입자 (nanoparticle; MNP@SiO2(RITC)_PTMA)를 사용하였다. 이와 같이 형질전환된 상기 hHGF 유전자 전이된 제대혈 유래의 중간엽 줄기세포 (HUCB-derived MSCs)는 유전자 전이 시 동시에 전이된 GFP 단백질 유전자가 형광 발현되는지 여부를 형광현미경 하에서 조사하여 선별하였다 (도 2 및 도 3 참조). 도 2는 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포와 정상 중간엽 줄기세포를 현미경 하에서 관찰, 비교하여 나타낸 것이다. 도 3은 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포와 정상 중간엽 줄기세포를 형광현미경 하에서 관찰, 비교하여 나타낸 것이다. 그 결과, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 인간 간성장인자를 발현하여 형광 시그날을 발현하면서 동시에 세포 형태에 차이가 생기는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 간성장인자 (HGF) 유전자의 발현 조사
본 발명에서는 간성장인자 (HGF) 유전자가 상기 형질전환된 줄기세포에서 발현되는 여부를 조사하기 위하여, 역전사효소-중합효소연쇄반응 (RT-PCR; reverse-transcription polymerase chain reaction)을 다음과 같이 실시하였다. 먼저 세포로부터 트리졸 (Trizol; Tel-Test Inc.)을 이용하여 총 RNA 시료를 얻고 첫 번째 가닥 cDNA 합성 키트 (1st strand cDNA synthesis kit; Roche)를 이용하여 역전사반응으로 cDNA를 얻은 다음 hHGF 유전자 (426 bp)에 특이적인 서열번호 4 (5′-ATGATGATGCTCATGGACCCT-3‘)의 정방향 프라이머 및 서열번호 5 (5′-CTGGCAAGCTTCATTAAAACC-3′)의 역방향 프라이머 (primer)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이 때 시료들은 디네이처 (denaturation; 95°C, 10초), 아닐링 (annealing; 57°C, 30초), 합성 (synthesis; 72°C, 25초)의 조건에서 40회 (cycle) 증폭시켰으며, RT-PCR로 얻어진 증폭된 cDNA는 저분자량 DNA 마커 (lowmolecular weight DNA marker; 100bp, Bioneer)를 사용하여 1.2% 아가로스 젤 상에서 분석, 확인하였다 (도 4 참조). 도 4는 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포에서 인간 간성장인자 (hHGF)의 발현을 RNA 수준에서 조사하여 나타낸 것이다. 그 결과, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 인간 간성장인자 유전자를 효과적으로 발현, 생산할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 인간 간성장인자 (hHGF)의 웨스턴 블럿 분석
본 발명에서 발현시킨 간성장인자를 분석하기 위하여 다음과 같이 웨스턴 블럿을 실시하였다. 먼저 HGF를 처리한 hMSC 세포와 HGF를 처리하지 않은 hMSC세포들을 트립신 EDTA를 이용하여 수확하고 이로부터 단백질을 확보하였다. 이 시료는 30㎍의 단백질이 포함되도록 만들었으며, 시료의 양과 동량으로 2x 시료 완충용액 [sample buffer; 0.125M 트리스 (pH 6.8), 6% SDS, 20% 글리세롤, 0.02% 브로모페놀 블루 (bromophenol blue), 1.44mM ß-머캅토에탄올]를 넣은 다음 100℃에서 5분간 끓이고 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤 상에서 분리하였다. 그 다음 PVDF 멤브레인 (폴리비닐리덴 디플루오라이드 [Polyvinylidene difluoride; Amersham Pharmacia]에 트랜스퍼하고 TBST 완충용액 [50mM 트리스 (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% 트윈 20]에 녹인 5% 스킴 밀크 (skim milk)에 넣어 한 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 그 다음 일차 항체 (primary antibody)를 사용하여 5% 스킴 밀크에 1 : 1000 비율로 희석하고 90분 동안 상온에서 반응시킨 다음, TBST 완충용액으로 15분 동안 4번 세척하였다. 그러고 나서 이차 항체 (secondary antibody)를 사용하여 5% 스킴 밀크에 1 : 2,000 비율로 희석하여 60분 동안 반응시키고, 다시 TBST로 15분 동안 4번 세척하였다. ECL (Amersham Pharmacia)을 사용하여 항원-항체 (antigen-antibody)의 특이적 반응을 관찰 및 확인하였다 (도 5 참조). 도 5는 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포에서 인간 간성장인자 (hHGF)의 발현을 단백질 수준에서 웨스턴 블럿 (a) 및 엘라이자 방법 (b)으로 조사하여 나타낸 것이다. 그 결과 본 발명의 중간엽 줄기세포는 인간 간성장인자를 대량 생산할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 형질전환된 중간엽 줄기세포를 이용한 조정된 배양배지 (CM)의 제조
본 발명에서는 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 형질전환된 중간엽 줄기세포의 특성을 세포 배양액 및 그의 세포 세포사멸 (apoptosis) 억제 효과에 관해 다음과 같이 조사하였다.
먼저 상기 형질전환된 중간엽 줄기세포의 배양액을 수집하여 정상 간세포 (NCTC 클론 1469)의 증식에 미치는 효과를 측정하였다 (도 6 참조). 참고로, 상기 세포 배양액은 우태아혈청 (FBS)를 첨가하지 않은 배양액 (conditioned media; CM)으로 상기 형질전환된 줄기세포에서 특이적으로 생성되는 것이다. 구체적으로 제대혈로부터 분리하여 8세대 계대배양한 중간엽 줄기세포를 약 1 X 104 세포를 10% FBS가 첨가된 MEM 배지에 접종한 다음 24시간 동안 배양하였다. 다시 혈청이 첨가되지 않은 (serum free MEM)으로 배지를 교환해준 다음 이로부터 얻은 배지를 사용하여 세포생존율에 미치는 효과를 조사하였다. 상세한 실험 조건은 하기 표 1 및 표 2에 정리하였다. 또한 상기 배양시간이 끝난 후 실험 전까지 상기 CM 배지는 원심분리하고 50KD 멤브레인 (membrane)을 사용하여 농축시킨 후 다음 실험에 사용되기 전까지 -70℃에 보관하였다. 그 결과, 본 발명의 형질전환된 성체줄기세포로부터 만들어진 배양배지 (CM)가 간세포를 탁월하게 증식시키는 것을 알 수 있었다. 또한 대조군과 비교하여 본 발명의 성체줄기세포로부터 발현되는 인간 간성장인자 (hHGF)도 종래의 재조합 간 성장인자 (rhHGF)보다 간세포를 증식시키는 효과가 탁월한 것을 확인할 수 있었다 (도 6 참조).
또한, 상기 형질전환된 성체줄기세포로부터 만들어진 배양배지 (CM)가 세포사멸을 억제하는 효과가 있음을 다음과 같이 조사하였다. 먼저 정상 간세포 (NCTC 클론 1469)를 1 X 104세포/ml 농도로 접종한 다음 24시간 동안 배양하였다. 다시 배양 배지를 혈청을 첨가하지 않은 (serum free MEM) 배지로 교환하여 준 다음 세포사멸을 유발하는 약물인 GCDC 10μl을 처리하고 이와 동시에 GCDC와 상기 CM 배지를 각각 10μl 처리하여 24시간 동안 반응시키고 MTT 분석방법 (assay)으로 그 결과를 측정하였다. 그 결과 상기 CM 배지를 첨가한 경우 세포 생존율이 탁월하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 7 참조).
표 1 HGF 형질전환된 CM 배양배지
1 MSC 계대 배양 8세대
2 배양 배지 10% FBS MEM
3 CM 배지 4 × 105 개 (10% FBS MEM) 세포를 접종, 약 80%에 이르면 세포형질전환, 6시간 배양 후 무혈청배지로 배지 교환, 3일 동안 세포 배양
4 배지량 (부피) 6ml
표 2 형질전환되지 않은 CM 배양배지
1 MSC 계대 배양 8세대
2 배양 배지 10% FBS MEM
3 CM 배지 4 × 105개(10% FBS MEM)의 세포 접종, 약 70% 자라면 무혈청배지로 배지 교환, 3일 동안 세포배양
4 배지량 (부피) 6ml
실시예 6. hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포의 선별 배양
본 발명에서는 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포를 선별 배양하기 위하여, 상기 hHGF 유전자를 발현하는 중간엽 줄기세포 (HUCB-derived MSCs) 는 400 ng/mL 농도의 네오마이신, 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum; FBS), 4 nmol/L L-글루타민 (L-glutamine), 100 IU/mL 페니실린, 100 mg/mL 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM (Dulbecco modified Eagle medium) 배지를 사용하여 5% CO2를 포함하는 37°C 배양기 안에서 선택적으로 배양되었다 (도 2 참조). 그 결과, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 인간 간성장인자를 발현하면서 간경화가 유발된 실험동물의 간 조직에서 변화가 생기는 것을 확인할 수 있었다 (도 9 내지 도 12 참조).
실시예 7. hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포의 HGF 단백질 분비 조사
본 발명에서는 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포로부터 HGF 단백질이 높은 수준으로 분비되는 것을 조사하기 위하여, 엘라이자 (ELISA) 방법에 의하여 HGF 단백질의 양을 측정하였다. 대조군으로는 제대혈 유래 성체 줄기세포 자체를 사용하였다. 그 결과 재조합 발현 벡터 pMEX-HGF로 형질전환된 중간엽 줄기세포는 240 ng/ml, 재조합 발현 벡터 pMSCV-HGF로 형질전환된 중간엽 줄기세포는 290 ng/ml 그리고 대조군은 35 ng/ml 농도로 재조합 HGF 단백질을 생산하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8. hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포의 동물실험을 통한 효능 평가
본 발명에서는 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포의 효능 및 안전성을 평가하기 위하여 다음과 같이 동물실험을 실시하였다. 구체적으로, 실험동물에 간섬유화(경화)를 유도하고 HGF 유전자로 변형된 줄기세포 치료제를 미정맥으로 투여한 후, 혈청 생화학적 검사, 총 콜라겐 양 측정 및 간 조직의 조직병리학적 검사를 통해 시간의 경과에 따른 HGF량의 변화와 항섬유화 효과를 평가하였다.
(1) 실험동물
먼저 실험동물을 각 실험군으로 분류하기 위하여 12주령의 성숙된 암컷 위스타 랫트를 (230 내지 300g) 실험동물로 사용하여 15마리씩 세 가지 실험군들, 즉 PBS 처리군 (대조군), 줄기세포만 처리군 및 hHGF 유전자로 변형된 줄기세포 처리군으로 구분하였다. 모든 실험군에 간경화를 유발시킨 후 PBS, 줄기세포, hHGF 유전자로 변형된 줄기세포를 투여하면서 밤과 낮의 리듬을 주고 먹이와 물을 자유롭게 공급하였다.
(2) 간섬유화(경화)유도
간섬유화를 유도하기 위하여, 간경화 유발방법으로 실험동물의 복강 내에 사염화탄소 (CCl4) 및/또는 TTA를 희석하여 주사하였다 (1ml/kg, 3회/주 투여). 모든 실험군의 실험동물에 간경화를 유도하였고, 이에 앞서 각 실험군에서 무작위로 선정된 실험동물을 희생시켜 장기와 혈청을 수집하였다. 또한 상기에서 얻은 시료로 조직학적·혈액학적 실험을 시행하여 성공적으로 간경화가 유도된 것을 확인하였다.
(3) 혈액시료의 수집 및 보관
상기 혈액시료를 수집하여 보관하기 위하여, 실험동물을 에테르로 마취시키고 복대정맥에서 채혈한 혈액을 4시간 이상 4℃에서 방치하여 3,000 rpm으로 원심분리하였다. 이로부터 얻은 혈청은 -20℃로 냉동 보관하여 혈청생화학적 측정에 사용하였다.
(4) 간조직의 수집 및 광학현미경적 관찰
상기 실험동물의 간조직을 관찰하기 위하여, 간의 외측 우엽과 후엽의 중간을 절취하여 10% 중성 포르말린 액에 고정시켰다. 그 다음, 알코올 탈수과정을 거쳐 파라핀에 담구어 (embedding) 5μm 크기의 조직절편을 얻었다. 이로부터 얻은 조직 절편은 헤마톡실린 및 에오신 (hematoxylin 및 eosin) 염색과 매이슨 트리크롬 (Masson's Trichrome) 염색을 하여 조직의 염증의 정도 및 간섬유화(경화) 정도를 평가를 위한 조직병리학적 검사를 시행하였다.
도 8은 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포를 간경화 동물모델에 투여하는 경우 간경화의 치료 효과를 조사하여 나타낸 것이다. 도 9 내지 도 11은 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포를 주사하는 경우에 간조직의 변화를 현미경 하에서 조사하여 나타낸 것이다. 도 12는 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포 대신 대조군으로서 인산완충용액 (PBS)을 투여하는 경우에 간조직의 변화를 현미경 하에서 조사하여 나타낸 것이다. 그 결과, 본 발명의 hHGF 유전자로 형질전환된 중간엽 줄기세포는 간경화 동물모델에 투여하는 경우 간경화의 치료 효과가 탁월한 것을 확인할 수 있었다.
(5) 조직 내 총 콜라겐 양 측정
상기 실험동물의 조직 내 총 콜라겐 양을 측정하기 위하여, 염산으로 간조직을 가수분해시켜 일정량을 취하고 염산을 날려 보낸 다음잔류물을 이소프로필 알코올 (isopropyl alcohol)에 녹여 클로라민-T (chloramine-T)로 산화시켰다. 이 때 발색제로는 얼리히 반응용액 [Ehrlich's reagent solution; p-디메틸아미노벤즈알데하이드 (p-dimethylaminobenzaldehyde)]을 사용하였고 558nm에서 흡광도를 측정하여 조직 중의 총 콜라겐 양을 계산하였다. 그 결과, 조직 내 총콜라겐의 양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
(6) 혈청 생화학적 검사
상기 실험동물의 혈청 생화학적 검사를 실시하기 위하여, 10ml 시험관에 채혈한 혈액을 실온에 30분간 방치하여 응고시킨 후 원심분리 (3,000rpm, 30분)하였다. 이로부터 얻은 혈청에서 자동분석 혈청기 (RA-XT, Technicon,Ltd., U.S.A)를 이용하여 알라닌 트랜스아미네이즈 (alanine ; ALT), 아스파테이트 트랜스아미네이즈 (aspartate transaminase; AST), 알칼라인 포스파테이즈 (alkaline; ALP) 및 총 빌리루빈 (total bilirubin; TB)의 양을 측정하였다.
그 결과 TAA 약물을 8주간 투여하고, GOT, GPT 측정을 통해 간에 심한 손상이 발생한 것을 확인하였으며, 쥐를 3그룹으로 나누어 첫 번째 군은 대조군으로 하여 용매인 PBS만을 투여하고, 두 번째 군은 HGF 유전자를 넣어준 줄기세포를 주사하고, 세 번째 군은 줄기세포만을 투여하였다. PBS와 줄기세포를 투여하고, 4주간 TAA를 투여하면서 간 손상을 계속 유발한 후에 부검하였다. PBS만을 투여한 대조군 쥐에서는 간의 파괴가 계속 진행되어 간경화 단계까지 진행되었으나, hHGF 유전자를 발현시킨 줄기세포를 주사한 쥐에서는 병변의 진행이 느려지거나, 회복되는 경향을 나타내어 50 내지 60% 치료 효과를 나타낸 것을 확인하였다 (도 8참조).
(7) 통계 처리
상기 실험 결과로 통계 처리하기 위하여, 스튜던트 t-테스트 (student's t-test)를 시행하였고 메디안 (median) 및 표준편차 (standard deviation)로 표시하였으며 P-값 (value)을 구하여 (p<0.05) 유의성을 검증하였다.
[서열목록]
서열번호 1
1 cacacaacaa acttagctca tcgcaataaa aagcagctca gagccgactg gctcttttag
61 gcactgactc cgaacaggat tctttcaccc aggcatctcc tccagaggga tccgccagcc
121 cgtccagcag caccatgtgg gtgaccaaac tcctgccagc cctgctgctg cagcatgtcc
181 tcctgcatct cctcctgctc cccatcgcca tcccctatgc agagggacat aagaaaagaa
241 gaaatacaat tcacgaattc aaaaaatcag caaagactac cctaatcaaa atagatccag
301 cactgaagat aaaaaccaaa aaagtgaata ctgcagacca atgtgctaat agatgtacta
361 ggaataatgg acttccattc acttgcaagg cctttgtttt tgataaagcg agaaaacaat
421 gcctctggtt ccccttcaat agcatgtcaa gtggagtgaa gaaagaattt ggccatgaat
481 ttgacctcta tgaaaacaaa gactacatta gaaactgcat catcggtaaa ggacgcagct
541 acaagggaac agtatctatc actaagagtg gcatcaaatg tcagccctgg agttccatga
601 taccacacga acacagcttt ttgccttcga gctatcgggg taaagaccta caggaaaact
661 actgtcgaaa tcctcgaggg gaagaagggg gaccctggtg tttcacaagc aatccagagg
721 tacgctacga agtctgtgac attcctcagt gttcagaagt tgaatgcatg acctgcaatg
781 gggagagtta tcgaggtctc atggatcata cagaatcagg caagatttgt cagcgctggg
841 atcatcagac accacaccgg cacaaattct tgcctgaaag atatcccgac aagggctttg
901 atgataatta ttgccgcaat cccgatggcc agccgaggcc atggtgctat actcttgacc
961 ctcacacccg ctgggagtac tgtgcaatta aaacatgcgc tgacaatact gtaaatgata
1021 ctgatgttcc tatggaaaca actgaatgca tccaaggtca aggagaaggc tacaggggca
1081 ctgccaatac catttggaat ggaattccat gtcagcgttg ggattctcag tatcctcaca
1141 agcatgacat gactcctgaa aatttcaagt gcaaggacct acgagaaaat tactgccgaa
1201 atccagatgg gtctgaatca ccctggtgtt ttaccactga tccaaacatc cgagttggtt
1261 actgctccca aattccaaac tgtgatatgt caaatggaca agattgttat cgtgggaatg
1321 gcaaaaatta tatgggcaac ttatcccaaa caagatctgg actaacgtgt tcaatgtgga
1381 acaagaacat ggaagactta caccgtcata tcttctggga accagatgca agtaagctga
1441 atgagaatta ctgccgaaat ccagatgatg atgctcatgg accctggtgc tacacgggaa
1501 atccactcat tccttgggat tattgcccta tttctcgttg tgaaggtgat accacaccta
1561 caatagtcaa tttagaccat cctgtaatat cttgcgccaa aacgaaacaa ctgcgagttg
1621 taaatgggat tccaacacga acaaatgtag gatggatgat tagtttgaga tacagaaata
1681 aacatatctg cggaggatca ttgataaagg aaagttgggt tcttactgca cgacagtgtt
1741 tcccttctcg agacttgaaa gattatgagg cttggcttgg aattcatgat gtccatggaa
1801 gaggagagga gaaacgcaaa caggttctca atgtttccca gctggtatat ggccctgaag
1861 gatcagatct ggttttaatg aagcttgcca gacctgctgt cctggatgat tttgttaata
1921 caattgattt acctaattat ggatgcacaa ttcctgaaaa gaccagttgc agtgtttatg
1981 gctggggcta cactggattg atcaactatg atggtctatt acgagtggca catctctata
2041 aatgggaaa tgagaaatgc agccagcatc accgagggaa ggtgactctg aatgagtctg
2101 aatatgtgc tggggctgag aagattggat caggaccatg tgagggggat tatggtggcc
2161 cacttgtttg tgagcaacat aaaatgagaa tggttcttgg tgtcattgtt cccggccgtg
2221 gatgcgccat tccaaatcgt cctggtattt ttgtccgagt agcatattat gcaaaatgga
2281 tacacaaaat tattttaaca tataaggtac cacagtcata gctgaagtaa gtgtgtctga
2341 agcacccacc aatacaactg tcttttacat gaagatttca gagaatgtgg aattaaaaat
2401 accacttaca acaatcctaa gacaactact ggagagtcat gtttgttaaa attctcatta
2461 atgtttatgg gtgttttctg ttgttttgtt tgtcagtgtt attttgtcaa tgttgaagtg
2521 aattaaggta catgcaagtg tagtaacata tctcctgaag atacttgaat ggattaaaaa
2581 aacacacagg tataattgct ggataaagat tttgtgggga aaaaatcaat taatctctct
2641 aagctgcttt ctgaggttgg tttcttaata atgagtaaac cataaattaa atgttatttt
2701 aacctcacca aaacaattta taccttgtgt ccttaaattg taccctatat taaattatat
2761 tacatttcat atgctatatg ttatagttca ttcatttctc ttcaccatgt atcctgcaat
2821 actggtacac gaacacactt tttacaaaac cacataccca tgtacacatg cctaggtaca
2881 catgtacatg cactacagtt taaattatga tgtacttaat gtaacctcta aatattttag
2941 aagtatgtac ctatagtttt acctcaaaaa aatagaaatc tctaaagacc agtagaaata
3001 ttaaaaaatg atgcaaaatc aaaatgagtg gctaattctc catacgtaat ctgcagatga
3061 tcttctctgg ttgacatttt acgtgtggcc atcaccccgg gttaaataac acctaatcta
3121 ggtgtttaca tgtattcaat atcctagttt gtttcatgta gtttctaatt cttaaaggaa
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3241 acaagatatt tgtatgtcta ctttcctaaa gcatttcttc agtgctcaga tcagtgtcta
3301 attgaagaag attaaaactg ctttggtcat taaaaacgta tttaaatagg ttaattctaa
3361 gacttgctgc tgtgattgac ttctagctca ctgcctttaa attttaaaaa atttaagagg
3421 aaaattttca tgtctccaaa gttttataaa tacccttcat caagtcatgc attaaagtat
3481 atattagaga aaaaaaaata cttttctcaa cctggaagat tttagcctaa taaagttttt
3541 ttgaagtaaa agaaaacttg taaagggaaa gaaactagtt tgtctaaact ctgtattcat
3601 tttttttttt tttgaagtac agtggaatct gttgaatcag atattttatc aagatatctt
3661 tattttttct tatttcattt ttacaaagat cactcccaat gccatatgta atagacattt
3721 aaatttcgtg ttctgtatga cagccaaatg atcatattta tcattgtatt tgtcatgttt
3781 agctaaaaat catgtattgt tgagaaatag aataacaaaa agtaatagga taggctttga
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3961 ccccaaatga ttccctaaca gctctttaga ataccgttta atctggacta aaatggtttt
4021 aagtttatgg agagtttagt ccacagaact aactggactt ctggcggcaa gtccagaaat
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4981 cttttaccta tatgctgtgg gcaggtcctc agtaaaatct attgagtcaa tttctagtat
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5281 aaacttttta aaaaagaaat actggttttg caagatagag atcatgaggt aaataatttt
5341 aataagctct tatactaaaa agccttaaat cgatttactg agattcaaaa catactatta
5401 taatcaatta tatcccatat atgtaggcaa actcatttaa aaaataaaat taattttggt
5461 aaaagtacat agtgtttgtt tttaaaatac ataattttaa aataaatcgc ttgtcatgat
5521 aaagtccaaa aagaagttat ctttcaatat tcaactaagt ttggagctaa gaatttacta
5581 atacaaaaaa aagttaaaat gttttggacc atatatatct tgacagtgta acttttaagt
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서열번호 2
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1021 aaaacatgcg ctgacaatac tatgaatgac actgatgttc ctttggaaac aactgaatgc
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2341 ccacagtcat agctgaagta agtgtgtctg aagcacccac caatacaact gtcttttaca
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서열번호 3
atgtgg gtgaccaaac tcctgccagc cctgctgctg cagcatgtcc
181 tcctgcatct cctcctgctc cccatcgcca tcccctatgc agagggacat aagaaaagaa
241 gaaatacaat tcacgaattc aaaaaatcag caaagactac cctaatcaaa atagatccag
301 cactgaagat aaaaaccaaa aaagtgaata ctgcagacca atgtgctaat agatgtacta
361 ggaataatgg acttccattc acttgcaagg cctttgtttt tgataaagcg agaaaacaat
421 gcctctggtt ccccttcaat agcatgtcaa gtggagtgaa gaaagaattt ggccatgaat
481 ttgacctcta tgaaaacaaa gactacatta gaaactgcat catcggtaaa ggacgcagct
541 acaagggaac agtatctatc actaagagtg gcatcaaatg tcagccctgg agttccatga
601 taccacacga acacagcttt ttgccttcga gctatcgggg taaagaccta caggaaaact
661 actgtcgaaa tcctcgaggg gaagaagggg gaccctggtg tttcacaagc aatccagagg
721 tacgctacga agtctgtgac attcctcagt gttcagaagt tgaatgcatg acctgcaatg
781 gggagagtta tcgaggtctc atggatcata cagaatcagg caagatttgt cagcgctggg
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901 atgataatta ttgccgcaat cccgatggcc agccgaggcc atggtgctat actcttgacc
961 ctcacacccg ctgggagtac tgtgcaatta aaacatgcgc tgacaatact gtaaatgata
1021 ctgatgttcc tatggaaaca actgaatgca tccaaggtca aggagaaggc tacaggggca
1081 ctgccaatac catttggaat ggaattccat gtcagcgttg ggattctcag tatcctcaca
1141 agcatgacat gactcctgaa aatttcaagt gcaaggacct acgagaaaat tactgccgaa
1201 atccagatgg gtctgaatca ccctggtgtt ttaccactga tccaaacatc cgagttggtt
1261 actgctccca aattccaaac tgtgatatgt caaatggaca agattgttat cgtgggaatg
1321 gcaaaaatta tatgggcaac ttatcccaaa caagatctgg actaacgtgt tcaatgtgga
1381 acaagaacat ggaagactta caccgtcata tcttctggga accagatgca agtaagctga
1441 atgagaatta ctgccgaaat ccagatgatg atgctcatgg accctggtgc tacacgggaa
1501 atccactcat tccttgggat tattgcccta tttctcgttg tgaaggtgat accacaccta
1561 caatagtcaa tttagaccat cctgtaatat cttgcgccaa aacgaaacaa ctgcgagttg
1621 taaatgggat tccaacacga acaaatgtag gatggatgat tagtttgaga tacagaaata
1681 aacatatctg cggaggatca ttgataaagg aaagttgggt tcttactgca cgacagtgtt
1741 tcccttctcg agacttgaaa gattatgagg cttggcttgg aattcatgat gtccatggaa
1801 gaggagagga gaaacgcaaa caggttctca atgtttccca gctggtatat ggccctgaag
1861 gatcagatct ggttttaatg aagcttgcca gacctgctgt cctggatgat tttgttaata
1921 caattgattt acctaattat ggatgcacaa ttcctgaaaa gaccagttgc agtgtttatg
1981 gctggggcta cactggattg atcaactatg atggtctatt acgagtggca catctctata
2041 taatgggaaa tgagaaatgc agccagcatc accgagggaa ggtgactctg aatgagtctg
2101 aaatatgtgc tggggctgag aagattggat caggaccatg tgagggggat tatggtggcc
2161 cacttgtttg tgagcaacat aaaatgagaa tggttcttgg tgtcattgtt cccggccgtg
2221 gatgcgccat tccaaatcgt cctggtattt ttgtccgagt agcatattat gcaaaatgga
2281 tacacaaaat tattttaaca tataaggtac cacagtcata g
서열번호 4
5'-ATGATGATGCTCATGGACCCT-3'
서열번호 5
5'-CTGGCAAGCTTCATTAAAACC-3'
[규칙 제26조에 의한 보정 26.05.2009]　
Figure WO-DOC-308
[규칙 제26조에 의한 보정 26.05.2009]　
Figure WO-DOC-310

Claims (18)

  1. 인간 간성장인자 (human hepatic growth factor; hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환되어 인간 간성장인자를 발현하는 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells; MSCs).
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 인간 간성장인자 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터는 pMEX-HGF 인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 (수탁번호: 제 KCLRF-BP-00196호).
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 인간 간성장인자 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터는 pMSCV-HGF 인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
  4. 제 1항에 있어서,
    간경변을 포함한 각종 간 질환을 예방하고 치료하는 데 사용되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
  5. (1) 중간엽 줄기세포를 분리하고; (2) 상기 중간엽 줄기세포를 계대배양하고; (3) 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환시키고; 및 (4) 이로부터 인간 간성장인자를 발현하는 형질전환된 세포를 선별하는; 과정으로 이루어진 제 1항의 중간엽 줄기세포 (MSCs)의 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 (1) 과정에서는, 상기 중간엽 줄기세포는 제대혈 (umbilical blood)로부터 유래한 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 (2) 과정에서는, 상기 중간엽 줄기세포를 7 내지 9세대, 바람직하게는 8세대 계대 배양하여 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제 5항에 있어서,
    상기 (3) 과정에서는, 상기 재조합 발현 벡터는 재조합 레트로바이러스 발현 벡터 또는 재조합 아데노바이러스 발현 벡터를 포함하고, 바람직하게는 재조합 발현 벡터 pMEX-HGF 또는 재조합 발현 벡터 pMSCV-HGF를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제 5항에 있어서,
    상기 (3) 과정에서는, 상기 재조합 발현 벡터는 나노입자 (nanoparticle)를 사용하여 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제 1항의 중간엽 줄기세포를 사용하여 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양배지 (conditioned media; CM)를 생산하는 중간엽 줄기세포의 배양방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    중간엽 줄기세포를 7 내지 9 세대, 바람직하게는 8세대 계대 배양하고 혈청이 첨가된 배지를 사용하여 70 내지 90%, 바람직하게는 80% 정도에 이르도록 세포를 배양하여 세포 형질전환시키고 다시 2 내지 10 시간, 바람직하게는 6시간 배양한 다음 무혈청 배지를 사용하여 3일 동안 더 배양하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
  12. 제 10항의 중간엽 줄기세포의 배양방법에 따라 제조된 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양배지 (conditioned media; CM).
  13. 제 12항에 있어서,
    간경변을 포함한 각종 간 질환을 예방하고 치료하는 데 사용되는 것을 특징으로 하는 조정된 배양배지.
  14. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 인간 간성장인자 (hHGF)를 발현하는 중간엽 줄기세포 (MSCs)를 유효성분으로 하는 간 질환 치료제용 약학적 조성물.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 간 질환은 간경변, 간암 및 간염을 포함하는 것을 특징으로 하는 간 질환 치료제용 약학적 조성물.
  16. 제 12항의 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양배지를 유효성분으로 하는 간 질환 치료제용 약학적 조성물.
  17. 인간 간성장인자 (hHGF) 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 중간엽 줄기세포, 형질전환된 중간엽 줄기세포 및 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양배지 (CM) 중에서 선택된 하나 이상을 조합하여 구성되는 간질환 치료용 키트.
  18. 제 1항의 형질전환된 중간엽 줄기세포 또는 제 12항의 간세포 증식 효과가 있는 조정된 배양배지를 생체 내에 투여하여 손상된 간을 개선시키는 간 질환의 치료방법.
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