WO2023043278A1 - 항암제 효능 평가 또는 스크리닝 방법 - Google Patents

항암제 효능 평가 또는 스크리닝 방법 Download PDF

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WO2023043278A1
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이보은
김사랑
신유리
김은정
이희라
김동현
김지효
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    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the efficacy of an anti-cancer drug or anti-cancer drug candidate, which includes treating a mixture of cancer organoids and immune cells with the anti-cancer drug or candidate anti-cancer drug. It also relates to an anticancer drug efficacy evaluation system or an anticancer drug screening system including cancer organoids and immune cells.
  • Organoids are organ analogues prepared by 3-dimensional culture of cells derived from tissues or organs. Organoids have the advantages of long-term culture, cryopreservation, and easy manipulation and observation. At the same time, it is an experimental model that can study physiological phenomena at a higher level than cells by reproducing the cell hierarchical and histological structure that could only be seen in vivo as well as maintaining the original characteristics of the cell as it does not require immortalization. Due to these characteristics, organoids can be used for drug evaluation with high accuracy compared to immortalized cell lines in which the intrinsic characteristics of cells are changed or animal models that have a different structure from the human body. It has the advantage of being able to check the safety as well as efficacy of the drug in advance. However, since cancer organoids previously developed as drug evaluation models have limitations in not reflecting the tumor microenvironment, efforts have been made to develop organoids with various tumor microenvironments and use them as drug evaluation models. need to be
  • the tumor microenvironment is a cellular environment in which blood vessels, immune cells, fibroblasts, lymphocytes, signal transduction molecules, and extracellular matrix (ECM) surround cancer cells.
  • cancer cells affect the microenvironment by inducing extracellular signal release, cancer cell angiogenesis promotion, and peripheral immune tolerance. Therefore, cancer cells change the microenvironment, and the microenvironment affects the growth or metastasis of cancer cells.
  • the tumor microenvironment related to lymphocytes is highly related not only to cancer development and metastasis, but also to cancer's immune system evasion. It affects the treatment response by anticancer drugs and is a major target for anticancer immunotherapy.
  • cytotoxic T cells CD8+ T cells
  • regulatory T cells Tregs
  • myeloid-derived suppressor cells MDSCs
  • dendritic cells present in the tumor microenvironment.
  • Cells such as dendritic cell (DC), tumor-associated macrophage (TAM), tumor-infiltrating lymphocyte (TIL), and cancer-associated fibroblast (CAF) is known to affect the efficacy of immuno-anticancer agents, and they not only limit T cell infiltration into cancer tissues, but also inhibit the therapeutic effect of immuno-anticancer agents by reducing the proliferation and survival of tumor-infiltrating lymphocytes.
  • DC dendritic cell
  • TAM tumor-associated macrophage
  • TIL tumor-infiltrating lymphocyte
  • CAF cancer-associated fibroblast
  • the present inventors developed cancer organoids equipped with a tumor microenvironment and conducted various studies to use them as a platform for drug evaluation. As a result, a system for co-cultivating immune cells and cancer organoids, one of various cells constituting the tumor microenvironment, at a specific ratio was established. In addition, it was experimentally demonstrated that the system can accurately confirm the efficacy of drugs as cancer organoids grow properly, thereby completing the present invention.
  • One aspect of the present invention provides a method for evaluating the efficacy of an anticancer drug candidate, comprising the following steps:
  • step (b) treating the mixture of step (a) with an anticancer drug candidate
  • step (c) determining that the efficacy of the candidate substance is excellent when growth inhibition or death of cancer organoids is increased in the group treated with the candidate anticancer drug in step (b) compared to the positive control group or the group not treated with the candidate anticancer drug .
  • an evaluation platform for evaluating their efficacy must simulate the immune environment in the body.
  • an evaluation platform capable of co-cultivating cancer organoids and various immune cells was constructed in order to simulate such an in vivo immune environment in vitro.
  • all types of immune cells must be co-cultured, but since the ratio of immune cells is different for each patient, there is a limit to replicating them in vitro, especially immune cells included in drug evaluation platforms. As the ratio of cells changes, the efficacy of the drug also changes, which makes it rather difficult to predict the efficacy.
  • each platform was constructed by classifying the type of immune cells.
  • a platform was constructed using various immune cells so that an appropriate efficacy evaluation platform could be selected in consideration of the immune cells targeted by the drug.
  • step (a) is a step of co-cultivating a mixture of cancer organoids and immune cells, and is a step of reproducing an in vivo tumor microenvironment in vitro.
  • the immune cells may be at least one selected from the group consisting of cytotoxic T cells, M1 macrophages, M2 macrophages, TILs, regulatory T cells, and dendritic cells.
  • organs refers to a mass of cells having a three-dimensional three-dimensional structure, and refers to organ analogues prepared by three-dimensional culture of cells isolated from organs or tissues. Since organoids contain specific cell populations constituting an organ or tissue and are structurally organized in a form similar to an actual tissue or organ, the specific form and function of each tissue or organ can be reproduced.
  • cancer organoid refers to organoids derived from cells isolated from tumors.
  • cytotoxic T cell Cytotoxic T cell, CD8+ T cell
  • lymphocytes that perform antigen-specific acquired immunity (acquired immunity, adaptive immunity). Cytotoxic T cells kill cancer cells, cells infected with pathogens such as viruses and bacteria, and produce cytokines such as TNF- ⁇ and IFN- ⁇ . Cytotoxic T cells according to the present invention may be infiltrated into tumor tissue or isolated from tumor tissue. In the present specification, the cytotoxic T cell may be termed interchangeably with "differentiated T cell", “post-differentiation T cell”, “activated T cell”, “activated T cell” or "CD8+ T cell”.
  • M1 is a type of tumor-associated macrophage (TAM), and includes LPS, IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , and TLR. It refers to macrophages activated by cytokines such as engagement. M1 secretes pro-inflammatory cytokines or chemokines such as IL-6, IL-12, and TNF- ⁇ , and functions as an antigen-presenting cell (APC) to activate T cells or tumor-infiltrating lymphocytes ( It can induce pathogen death or cancer cell death by activating tumor infiltrating lymphocyte (TIL) or NK cells, or it can directly kill cancer cells through phagocytosis. In the present specification, the M1 macrophage may be named interchangeably with "M1".
  • M2 macrophage is a type of tumor-associated macrophage (TAM), and is a type of cytokines such as IL-4, IL-13, and IL-10.
  • TAM tumor-associated macrophage
  • cytokines such as IL-4, IL-13, and IL-10.
  • enzymes secreted by M2 destroy tissues around tumors to promote tumor cell proliferation and metastasis, or induce tumor growth by participating in the initiation and maintenance of angiogenesis.
  • the M2 macrophage may be named interchangeably with "M2".
  • TIL Tumor-infiltrating lymphocyte
  • TILs may be a population of lymphocytes composed of various types of immune cells.
  • the TIL according to the present invention may be a TIL that expresses the CD8 protein on the cell surface, and specifically expresses the CD8 protein on the cell surface, and may be a population of lymphocytes present near or infiltrating the tumor tissue, preferably. It may be a CD8+ T cell, but is not limited thereto.
  • regulatory T cell plays a role in maintaining homeostasis and immune tolerance by suppressing the immune response, suppressing T cell proliferation and cytokine production, It refers to lymphocytes that play an important role in preventing autoimmunity.
  • Regulatory T cells may be infiltrated into tumor tissue or isolated from tumor tissue.
  • the regulatory T cells may be termed interchangeably with “Treg cells” or “Treg”.
  • dendritic cell is an antigen-presenting cell, and means a lymphocyte that processes antigenic substances and presents them to T cells. Specifically, dendritic cells activate helper T cells (CD4+ T cells) and cytotoxic T cells (CD8+ T cells), which are immune cells capable of suppressing tumor growth, and promote their functions, thereby preventing tumor progression. can play a regulatory role. Dendritic cells according to the present invention may be isolated from blood. In the present specification, the dendritic cells may be termed interchangeably with “DC cells” or "DC”.
  • cancer organoids, cytotoxic T cells and M1 macrophages are mixed at a cell number ratio of 1 : 0.5 : 0.5 to 3. Mixing can be done.
  • the tumor microenvironment in vivo can be simulated only when the cancer organoids, cytotoxic T cells, and M1 macrophages are mixed and co-cultured in the above ratio. In the case of co-culture at a ratio other than the above, cancer organoids do not grow even before drug treatment, so the anticancer effect of the drug cannot be confirmed, or M1 macrophages naturally die and the tumor microenvironment cannot be reproduced. occurs.
  • cancer organoids, cytotoxic T cells, and M1 macrophages are cell number ratios as described above. It is important to mix with
  • step (a) when the immune cells are M1 macrophages and M2 macrophages, co-culture in step (a) is performed by mixing cancer organoids, M1 macrophages and M2 macrophages at a cell number ratio of 1: 1 to 3: 0.5 to 5.
  • the tumor microenvironment in vivo can be simulated only when the cancer organoids, M1 macrophages and M2 macrophages are mixed and co-cultured in the above ratio.
  • M1 macrophages exhibit tumor cell death-promoting properties
  • M2 macrophages exhibit tumor cell growth-promoting properties
  • cancer organoids do not grow or grow excessively even before drug treatment. Since a problem occurs and the anticancer effect of the drug cannot be accurately confirmed, it is important to mix cancer organoids, M1 macrophages and M2 macrophages at the cell number ratio as described above.
  • co-culture in step (a) can be performed by mixing cancer organoids and TILs at a cell number ratio of 1:1 to 2, specifically 1:1.5 cells. It can be performed by mixing in water ratio.
  • the tumor microenvironment in vivo can be simulated only when the cancer organoid and TIL are mixed and co-cultured in the above ratio.
  • co-cultivated at a ratio other than the above ratio the growth of cancer organoids significantly increases even before drug treatment, resulting in a problem that does not respond to the drug or cancer organoids do not grow, making it impossible to confirm the anticancer effect of the drug. do.
  • the efficacy of drugs acting by different mechanisms does not appear evenly, so it is important to mix cancer organoids and TILs at the cell number ratio as described above. .
  • the co-culture in step (a) is performed by culturing cancer organoids, cytotoxic T cells, and regulatory T cells at a cell number of 1: 3: 0.5 to 3. It may be performed by mixing in a ratio, specifically 1: 3: a cell number ratio of 1 to 3, more specifically 1: 3: may be performed by mixing in a cell number ratio of 3.
  • the tumor microenvironment in vivo can be simulated only when the cancer organoids, cytotoxic T cells, and regulatory T cells are mixed and co-cultured in the above ratio.
  • the co-culture in step (a) is performed with cancer organoids, cytotoxic T cells and dendritic cells at a cell number ratio of 1: 3: 0.5 to 5. It may be performed by mixing, and specifically, it may be performed by mixing at a cell number ratio of 1: 3: 0.5 to 1.
  • the tumor microenvironment in vivo can be simulated only when the cancer organoids, cytotoxic T cells, and dendritic cells are mixed and co-cultured in the above ratio.
  • cancer organoids do not grow properly or the death rate of cancer organoids by drugs is significantly low, making it impossible to confirm the anticancer effect of drugs.
  • co-cultivated at a ratio other than the above ratio there is a problem in that the efficacy of drugs acting by different mechanisms does not appear evenly. It is important to mix with
  • the anticancer drug candidate is treated with a mixture of cancer organoids and immune cells in the above ratio. That is, the efficacy of anticancer drug candidates is evaluated through a system that similarly reproduces the tumor microenvironment, which is the form in which cancer cells exist in vivo. Therefore, the efficacy of anticancer drug candidates when administered in vivo can be accurately predicted.
  • step (b) is a step of treating the cancer organoid and immune cells co-cultured mixture with the anticancer drug candidate according to the step (a).
  • anti-cancer agent refers to a substance that exhibits a preventive or therapeutic effect on cancer, and specifically means a substance capable of killing cancer cells, cancer organoids, or tumors, or inhibiting their growth.
  • cancer agent candidate refers to a substance expected to exhibit a preventive or therapeutic effect on cancer, and specifically, can kill cancer cells, cancer organoids, or tumors, or inhibit their growth. material that is expected to be
  • the 'anti-cancer agent' may be used interchangeably with 'drug', and the 'treatment' may be used interchangeably with 'addition' or 'administration'.
  • the anticancer drug or anticancer drug candidate may target cancer organoids and/or immune cells.
  • the anticancer drug or anticancer drug candidate may target only cancer organoids, only immune cells, or both target cancer organoids and immune cells.
  • the anticancer agent targeting immune cells may be atezolizumab, pembrolizumab, anti-TIGIT antibody or anti-CD47 antibody.
  • the "anti-CD47 antibody” can improve phagocytosis of cancer cells by macrophages by directly blocking the binding between CD47 expressed in cancer cells and SIRP ⁇ expressed by macrophages.
  • the anticancer drug or anticancer drug candidate is a compound, protein, fusion protein, compound-protein complex, drug-protein complex, antibody, compound-antibody complex, drug-antibody complex, amino acid, peptide, virus, carbohydrate, lipid, Nucleic acids, extracts, fractions and the like are included without limitation.
  • the anticancer drug or anticancer drug candidate may include a compound, peptide, peptide mimetics, fusion protein, antibody, aptamer, antibody-drug conjugate (ADC), etc., but is not limited thereto.
  • the anti-cancer agent or candidate anti-cancer agent may be an antibody or an immuno-anticancer agent.
  • antibody includes monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, bispecific antibodies, multispecific antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies, other than novel antibodies already known in the art. Also included are commercially available or commercially available antibodies.
  • the antibodies include functional fragments of antibody molecules as well as full-length forms comprising two heavy chains and two light chains.
  • the functional fragment of the antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen-binding function, which may include Fab, F(ab'), F(ab') 2 , Fv, etc., but is not limited thereto. .
  • Peptide Mimetics refers to peptides, or modified peptides, that biologically mimic the active ligands of hormones, cytokines, enzyme substrates, viruses or other biological molecules.
  • Aptamer refers to a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) that has a stable tertiary structure and is capable of binding to a target molecule with high affinity and specificity.
  • the anticancer agent may include an antisense nucleic acid, siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, etc. that complementarily bind to DNA or mRNA, but is not limited thereto.
  • the term "antisense nucleic acid” refers to DNA, RNA, or fragments or derivatives thereof containing a nucleic acid sequence complementary to a sequence of a specific mRNA, and binds or hybridizes complementary to the sequence of an mRNA. It acts to inhibit the translation of mRNA into protein.
  • small interfering RNA refers to a short double-stranded RNA capable of inducing RNA interference (RNAi) through cleavage of a specific mRNA.
  • siRNA includes a sense RNA strand having a sequence homologous to the mRNA of a target gene and an antisense RNA strand having a sequence complementary thereto.
  • siRNA can suppress the expression of a target gene, it is used in a gene knockdown method or a gene therapy method.
  • short hairpin RNA shRNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • RNA single-stranded RNA, which is divided into a stem portion forming a double-stranded portion by hydrogen bonding and a loop portion having a ring shape. It is processed by proteins such as Dicer and converted into siRNA and can perform the same function as siRNA.
  • miRNA micro RNA
  • micro RNA refers to a non-coding RNA of 21 to 23 nt that regulates gene expression after transcription by promoting degradation of target RNA or inhibiting their translation.
  • ribozyme refers to an RNA molecule having an enzyme-like function that recognizes a specific nucleotide sequence and cleave it itself.
  • a ribozyme is composed of a region that binds with specificity to a complementary nucleotide sequence of a target messenger RNA strand and a region that cleaves the target RNA.
  • Anticancer drugs or anticancer drug candidates whose efficacy is evaluated or screened according to the method of the present invention are, for example, biliary tract cancer, gastric cancer, lung cancer, liver cancer, colorectal cancer, colon cancer, small intestine cancer, pancreatic cancer, brain cancer, bone cancer, melanoma, breast cancer, Sclerosing adenosis, uterine cancer, cervical cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, kidney cancer, sarcoma, prostate cancer, urethral cancer, bladder cancer, blood cancer, leukemia, lymphoma, fibroadenoma, etc. may be prevented or treated, It is not limited thereto.
  • step (c) inhibits the growth of cancer organoids in the group treated with the anticancer drug candidate in step (b) compared to the positive control group or the group not treated with the anticancer drug candidate.
  • the killing is increased, it is a step of determining that the efficacy of the candidate substance is excellent.
  • positive control group refers to a group treated with a drug used as an anticancer agent in the art.
  • growth inhibition or death of the cancer organoid may be confirmed by increasing or decreasing the area of the cancer organoid.
  • the area of the cancer organoid decreases, it may be determined that growth inhibition or death of the cancer organoid is increased.
  • the increase or decrease in the area of the cancer organoid can be confirmed by a method known in the art, and for example, it can be confirmed through an analysis method such as HCS (High-Content Screening) or flow-cytometer. it is not going to be
  • Another aspect of the present invention is an anticancer drug efficacy evaluation system for using the method for evaluating the efficacy of the anticancer drug candidate, and provides an anticancer drug efficacy evaluation system including cancer organoids and immune cells.
  • each term is as described above unless otherwise specified.
  • the anticancer drug efficacy evaluation system of the present invention mimics the tumor microenvironment, cancer organoids as tumors constituting the tumor microenvironment in vivo, and cytotoxic T cells, M1 macrophages, M2 macrophages, TILs, and regulatory T cells as immune cells. and at least one selected from the group consisting of dendritic cells.
  • the anticancer drug efficacy evaluation system when the immune cells are cytotoxic T cells and M1 macrophages, includes cancer organoids, cytotoxic T cells and M1 macrophages at a cell number ratio of 1: 0.5: 0.5 to 3 can
  • the tumor microenvironment in vivo can be simulated only when the cancer organoids, cytotoxic T cells, and M1 macrophages are mixed and co-cultured in the above ratio.
  • co-culture at a ratio other than the above cancer organoids do not grow even before drug treatment, so the anticancer effect of the drug cannot be confirmed, or M1 macrophages naturally die and the tumor microenvironment cannot be reproduced. occurs.
  • cancer organoids, cytotoxic T cells, and M1 macrophages are cell number ratios as described above. It is important to mix with
  • the anticancer drug efficacy evaluation system may include cancer organoids, M1 macrophages and M2 macrophages at a cell number ratio of 1: 1 to 3: 0.5 to 5 when the immune cells are M1 macrophages and M2 macrophages.
  • the tumor microenvironment in vivo can be simulated only when the cancer organoids, M1 macrophages and M2 macrophages are mixed and co-cultured in the above ratio.
  • M1 macrophages exhibit tumor cell death-promoting properties
  • M2 macrophages exhibit tumor cell growth-promoting properties
  • cancer organoids do not grow or grow excessively even before drug treatment. Since a problem occurs and the anticancer effect of the drug cannot be accurately confirmed, it is important to mix cancer organoids, M1 macrophages and M2 macrophages at the cell number ratio as described above.
  • the anticancer drug efficacy evaluation system when the immune cells are TILs, may include cancer organoids and TILs at a cell number ratio of 1: 1 to 2, specifically at a cell number ratio of 1: 1.5 it could be
  • the tumor microenvironment in vivo can be simulated only when the cancer organoid and TIL are mixed and co-cultured in the above ratio.
  • co-cultivated at a ratio other than the above ratio the growth of cancer organoids significantly increases even before drug treatment, resulting in a problem that does not respond to the drug or cancer organoids do not grow, making it impossible to confirm the anticancer effect of the drug. do.
  • the efficacy of drugs acting by different mechanisms does not appear evenly, so it is important to mix cancer organoids and TILs at the cell number ratio as described above. .
  • the anticancer drug efficacy evaluation system includes cancer organoids, cytotoxic T cells and regulatory T cells at a cell number ratio of 1: 3: 0.5 to 3 when the immune cells are cytotoxic T cells and regulatory T cells. It may be one, specifically 1: 3: it may include a cell number ratio of 1 to 3, more specifically 1: 3: 3 of the number of cells.
  • the tumor microenvironment in vivo can be simulated only when the cancer organoids, cytotoxic T cells, and regulatory T cells are mixed and co-cultured in the above ratio. In the case of co-cultivation at a ratio other than the above ratio, the death rate of cancer organoids caused by the drug is remarkably low, resulting in a problem in which the anticancer effect of the drug cannot be confirmed. In addition, when co-cultivated at a ratio other than the above ratio, the efficacy of drugs acting by different mechanisms does not appear evenly, so cancer organoids, cytotoxic T cells, and regulatory T cells are counted as described above. It is important to mix in proportion.
  • the anticancer drug efficacy evaluation system may include cancer organoids, cytotoxic T cells and dendritic cells at a cell number ratio of 1: 3: 0.5 to 5 when the immune cells are cytotoxic T cells and dendritic cells. And, specifically, it may be mixed and included in a cell number ratio of 1: 3: 0.5 to 1.
  • the tumor microenvironment in vivo can be simulated only when the cancer organoids, cytotoxic T cells, and dendritic cells are mixed and co-cultured in the above ratio. In the case of co-cultivation at ratios other than the above ratios, cancer organoids do not grow properly or the death rate of cancer organoids by drugs is significantly low, making it impossible to confirm the anticancer effect of drugs.
  • co-cultivated at a ratio other than the above ratio there is a problem in that the efficacy of drugs acting by different mechanisms does not appear evenly. It is important to mix with
  • the anticancer drug efficacy evaluation system according to the present invention includes a mixture in which cancer organoids and immune cells are mixed in the above ratio, it is possible to similarly reproduce a tumor microenvironment in which cancer cells exist in vivo. Therefore, since the efficacy of an anticancer agent when administered in vivo can be accurately predicted, it can be usefully used for evaluating the efficacy of an anticancer agent.
  • Another aspect of the present invention is an anticancer drug screening system for using the method for evaluating the efficacy of the anticancer drug candidate, and provides an anticancer drug screening system including cancer organoids and immune cells.
  • each term is as described above unless otherwise specified.
  • the anti-cancer drug screening system when the immune cells are cytotoxic T cells and M1 macrophages, may include cancer organoids, cytotoxic T cells and M1 macrophages at a cell number ratio of 1: 0.5: 0.5 to 3. there is.
  • the tumor microenvironment in vivo can be simulated only when the cancer organoids, cytotoxic T cells, and M1 macrophages are mixed and co-cultured in the above ratio. In the case of co-culture at a ratio other than the above, cancer organoids do not grow even before drug treatment, so the anticancer effect of the drug cannot be confirmed, or M1 macrophages naturally die and the tumor microenvironment cannot be reproduced. occurs.
  • cancer organoids, cytotoxic T cells, and M1 macrophages are cell number ratios as described above. It is important to mix with
  • the anticancer drug screening system may include cancer organoids, M1 macrophages and M2 macrophages at a cell number ratio of 1: 1 to 3: 0.5 to 5 when the immune cells are M1 macrophages and M2 macrophages.
  • the tumor microenvironment in vivo can be simulated only when the cancer organoids, M1 macrophages and M2 macrophages are mixed and co-cultured in the above ratio.
  • M1 macrophages exhibit tumor cell death-promoting properties
  • M2 macrophages exhibit tumor cell growth-promoting properties
  • cancer organoids do not grow or grow excessively even before drug treatment. Since a problem occurs and the anticancer effect of the drug cannot be accurately confirmed, it is important to mix cancer organoids, M1 macrophages and M2 macrophages at the cell number ratio as described above.
  • the anti-cancer drug screening system may include cancer organoids and TIL at a cell number ratio of 1:1 to 2, specifically at a cell number ratio of 1:1.5.
  • the tumor microenvironment in vivo can be simulated only when the cancer organoid and TIL are mixed and co-cultured in the above ratio.
  • co-cultivated at a ratio other than the above ratio the growth of cancer organoids significantly increases even before drug treatment, resulting in a problem that does not respond to the drug or cancer organoids do not grow, making it impossible to confirm the anticancer effect of the drug. do.
  • the efficacy of drugs acting by different mechanisms does not appear evenly, so it is important to mix cancer organoids and TILs at the cell number ratio as described above. .
  • the anticancer drug screening system when the immune cells are cytotoxic T cells and regulatory T cells, includes cancer organoids, cytotoxic T cells and regulatory T cells at a cell number ratio of 1: 3: 0.5 to 3. It may be, specifically, 1: 3: 1 to 3 cell number ratio, more specifically 1: 3: may include a cell number ratio of 3.
  • the tumor microenvironment in vivo can be simulated only when the cancer organoids, cytotoxic T cells, and regulatory T cells are mixed and co-cultured in the above ratio. In the case of co-cultivation at a ratio other than the above ratio, the death rate of cancer organoids caused by the drug is remarkably low, resulting in a problem in which the anticancer effect of the drug cannot be confirmed.
  • the efficacy of drugs acting by different mechanisms does not appear evenly, so cancer organoids, cytotoxic T cells, and regulatory T cells are counted as described above. It is important to mix in proportion.
  • the anti-cancer drug screening system when the immune cells are cytotoxic T cells and dendritic cells, may include cancer organoids, cytotoxic T cells and dendritic cells at a cell number ratio of 1: 3: 0.5 to 5, , Specifically, it may include mixing at a cell number ratio of 1: 3: 0.5 to 1.
  • the tumor microenvironment in vivo can be simulated only when the cancer organoids, cytotoxic T cells, and dendritic cells are mixed and co-cultured in the above ratio.
  • cancer organoids do not grow properly or the death rate of cancer organoids by drugs is significantly low, making it impossible to confirm the anticancer effect of drugs.
  • co-cultivated at a ratio other than the above ratio there is a problem in that the efficacy of drugs acting by different mechanisms does not appear evenly. It is important to mix with
  • the anticancer drug screening system of the present invention mimics the tumor microenvironment, cancer organoids as tumors constituting the tumor microenvironment in vivo, and cytotoxic T cells, M1 macrophages, M2 macrophages, TILs, regulatory T cells and immune cells as immune cells. contains dendritic cells.
  • the mixture of cancer organoids and immune cells according to the present invention can be mixed in a specific ratio to similarly reproduce a tumor microenvironment in which cancer cells exist in vivo. Therefore, when using this, the efficacy of the drug when administered in vivo can be accurately predicted.
  • 1A is a graph showing the degree of apoptosis of cancer organoids according to the ratio of cytotoxic T cells (hereinafter referred to as 'CD8+ T cells') and M1 macrophages (hereinafter referred to as 'M1').
  • Figure 1b is a graph showing the degree of death of M1 according to the ratio of cytotoxic T cells and M1 macrophages.
  • 2 is a graph showing the degree of growth inhibition of cancer organoids according to the ratio of CD8+ T cells and M1, and relates to the results of co-culture for 0 hour, 24 hours, 48 hours, and 72 hours.
  • 3 is a graph showing the degree of phagocytosis activation by anti-CD47 antibody treatment.
  • 4 is a graph showing the overall efficacy of drugs for killing cancer organoids according to an increase in the percentage of CD8+ T cells.
  • 5 is a graph showing the overall efficacy of drugs for killing cancer organoids according to an increase in the M1 ratio.
  • 6 is a graph showing the overall efficacy of drugs for killing cancer organoids.
  • Figure 7a is a graph showing the growth rate of cancer organoids according to the co-culture ratio of cancer organoids, M1 and M2 macrophages (alternatively activated macrophages, hereinafter referred to as 'M2'), under conditions in which M1 is not included ("1:3:0 ”) or the result of co-cultivation under conditions that do not contain M2 ("1:0:5").
  • 7B is a graph showing the growth rate of cancer organoids according to the co-culture ratio of cancer organoids, M1 and M2, and results of co-cultivation under mixed conditions in which cancer organoids and M1 were fixed at a cell number ratio of 1:0.5. It is about.
  • 7C is a graph showing the growth rate of cancer organoids according to the co-culture ratio of cancer organoids, M1 and M2, and results of co-cultivation under mixed conditions in which cancer organoids and M1 were fixed at a cell number ratio of 1:1. It is about.
  • 7D is a graph showing the growth rate of cancer organoids according to the co-culture ratio of cancer organoids, M1 and M2, and results of co-cultivation under mixed conditions in which cancer organoids and M1 were fixed at a cell number ratio of 1:3. It is about.
  • 8A is a graph showing the growth rate of cancer organoids according to the co-culture ratio of cancer organoids, M1 and M2, under a condition without M1 ("1:3:0") or without M2 (" 1:0:5").
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'CD47' means a drug-treated group treated with an anti-CD47 antibody as an exemplary drug.
  • the mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • 8B is a graph showing the death rate of cancer organoids according to the co-cultivation ratio of cancer organoids, M1 and M2, under a condition without M1 ("1:3:0") or without M2 ( It relates to the result of co-culture in "1:0:5").
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'CD47' means a drug-treated group treated with an anti-CD47 antibody as an exemplary drug.
  • the mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • 9A is a graph showing the growth rate of cancer organoids according to the co-culture ratio of cancer organoids, M1 and M2, and results of co-cultivation under mixed conditions in which cancer organoids and M1 were fixed at a cell number ratio of 1:0.5. It is about. 'Non' means a drug-untreated group, and 'CD47' means a drug-treated group treated with an anti-CD47 antibody as an exemplary drug. The mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • 9B is a graph showing the death rate of cancer organoids according to the co-culture ratio of cancer organoids, M1 and M2, in which cancer organoids and M1 were co-cultured at a fixed cell number ratio of 1:0.5 under mixed conditions. It's about results.
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'CD47' means a drug-treated group treated with an anti-CD47 antibody as an exemplary drug. The mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • 10A is a graph showing the growth rate of cancer organoids according to the co-culture ratio of cancer organoids, M1 and M2, and results of co-cultivation under mixed conditions in which cancer organoids and M1 were fixed at a cell number ratio of 1:1. It is about. 'Non' means a drug-untreated group, and 'CD47' means a drug-treated group treated with an anti-CD47 antibody as an exemplary drug. The mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • 10B is a graph showing the death rate of cancer organoids according to the co-culture ratio of cancer organoids, M1 and M2, in which cancer organoids and M1 were co-cultured at a fixed cell number ratio of 1:1 under mixed conditions. It's about results.
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'CD47' means a drug-treated group treated with an anti-CD47 antibody as an exemplary drug. The mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • 11A is a graph showing the growth rate of cancer organoids according to the co-culture ratio of cancer organoids, M1 and M2, and results of co-cultivation under mixed conditions in which cancer organoids and M1 were fixed at a cell number ratio of 1:3. It is about. 'Non' means a drug-untreated group, and 'CD47' means a drug-treated group treated with an anti-CD47 antibody as an exemplary drug. The mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • 11B is a graph showing the death rate of cancer organoids according to the co-culture ratio of cancer organoids, M1 and M2, in which cancer organoids and M1 were co-cultured at a fixed cell number ratio of 1:3 under mixed conditions. It's about results.
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'CD47' means a drug-treated group treated with an anti-CD47 antibody as an exemplary drug. The mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • Figure 12 shows tumor-infiltrating lymphocyte (Tumor-infiltrating lymphocyte, hereinafter 'TIL') single culture; Alternatively, it relates to the results of FACS analysis on TILs prepared through co-culture of TILs and cancer organoids, and shows the ratio of TILs expressing CD8 protein on the cell surface to total TILs.
  • Tumor-infiltrating lymphocyte hereinafter 'TIL'
  • 13A is a graph showing the growth rate of lung cancer organoids according to the co-culture ratio of lung cancer organoids and TILs.
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group
  • atezolizumab was treated as an exemplary drug.
  • the growth rate was measured immediately after drug treatment (0h), after 24 hours (24h), after 48 hours (48h), and after 72 hours (72h).
  • 13B is a graph showing the death rate of lung cancer organoids according to the co-culture ratio of lung cancer organoids and TILs.
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group
  • atezolizumab was treated as an exemplary drug.
  • the mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate immediately after drug treatment (0h), after 24 hours (24h), after 48 hours (48h), and after 72 hours (72h).
  • 14A is a graph showing the growth rate of colon cancer organoids according to the co-culture ratio of colon cancer organoids and TILs.
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group
  • atezolizumab was treated as an exemplary drug.
  • the growth rate was measured immediately after drug treatment (0h), after 24 hours (24h), after 48 hours (48h), and after 72 hours (72h).
  • 14B is a graph showing the death rate of colon cancer organoids according to the co-culture ratio of colon cancer organoids and TILs.
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group
  • atezolizumab was treated as an exemplary drug.
  • the mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate immediately after drug treatment (0h), after 24 hours (24h), after 48 hours (48h), and after 72 hours (72h).
  • FIG. 15 is a graph showing growth rates of colorectal organoids according to co-culture ratios of colorectal cancer organoids, CD8+ T cells, and regulatory T cells (hereinafter referred to as 'Treg').
  • “1:3:0” described in the figure means that colon cancer organoids, CD8+ T cells, and Tregs were mixed at a cell number ratio of 1:3:0.
  • the growth rate was analyzed immediately after co-culture (0h), after 24 hours (24h), after 48 hours (48h), and after 72 hours (72h).
  • 16 is a graph showing growth rates of lung cancer organoids according to co-culture ratios of lung cancer organoids, CD8+ T cells, and Tregs.
  • “1:3:0” described in the figure means that lung cancer organoids, CD8+ T cells, and Treg were mixed at a cell number ratio of 1:3:0.
  • the growth rate was analyzed immediately after co-culture (0h), after 24 hours (24h), after 48 hours (48h), and after 72 hours (72h).
  • 17 is a graph showing the death rate of colon cancer organoids according to the co-culture ratio of colon cancer organoids, CD8+ T cells and Tregs, under conditions without Treg ("1:3:0") or CD8+ T cells. It relates to the result of co-cultivation under conditions that do not contain ("1:0:3").
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group treated with atezolizumab as an example drug
  • 'TIGIT' means a drug-treated group treated with an anti-TIGIT antibody as an example drug. do.
  • the mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • FIG. 18 is a graph showing the apoptosis rate of colon cancer organoids according to the co-culture ratio of colon cancer organoids, CD8+ T cells, and Tregs.
  • Colon cancer organoids and CD8+ T cells were fixed at a cell count ratio of 1:1 It relates to the result of co-cultivation in mixed conditions.
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group treated with atezolizumab as an example drug
  • 'TIGIT' means a drug-treated group treated with an anti-TIGIT antibody as an example drug. do.
  • the mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • FIG. 19 is a graph showing the apoptosis rate of colon cancer organoids according to the co-culture ratio of colon cancer organoids, CD8+ T cells, and Tregs.
  • Colon cancer organoids and CD8+ T cells were fixed at a cell number ratio of 1:3. It relates to the result of co-cultivation in mixed conditions.
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group treated with atezolizumab as an example drug
  • 'TIGIT' means a drug-treated group treated with an anti-TIGIT antibody as an example drug. do.
  • the mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group treated with atezolizumab as an example drug
  • 'TIGIT' means a drug-treated group treated with an anti-TIGIT antibody as an example drug. do.
  • the mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • 21 is a graph showing the death rate of lung cancer organoids according to the co-culture ratio of lung cancer organoids, CD8+ T cells, and Tregs, under a condition in which lung cancer organoids and CD8+ T cells were fixed and mixed at a cell number ratio of 1:1. It is about the result of co-culture in .
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group treated with atezolizumab as an example drug
  • 'TIGIT' means a drug-treated group treated with an anti-TIGIT antibody as an example drug. do.
  • the mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group treated with atezolizumab as an example drug
  • 'TIGIT' means a drug-treated group treated with an anti-TIGIT antibody as an example drug. do.
  • the mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • 'DC' dendritic cells
  • FIG. 24 is a graph showing the growth rate of colon cancer organoids according to the co-culture ratio of colon cancer organoids, CD8+ T cells, and DCs, wherein colon cancer organoids and CD8+ T cells were fixed and mixed at a cell number ratio of 1:1. It is about the result of co-cultivation under the given conditions.
  • “1:1:0.5” in the figure means that colon cancer organoids, CD8+ T cells, and DCs were mixed at a cell number ratio of 1:1:0.5.
  • the growth rate was analyzed immediately after co-culture (0h), after 24 hours (24h), after 48 hours (48h), and after 72 hours (72h).
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group treated with atezolizumab as an exemplary drug.
  • 25 is a graph showing the growth rate of colon cancer organoids according to the co-culture ratio of colon cancer organoids, CD8+ T cells, and DCs, wherein colon cancer organoids and CD8+ T cells were fixed and mixed at a cell number ratio of 1:3. It is about the result of co-cultivation under the given conditions.
  • "1:3:0.5" described in the figure means that colon cancer organoids, CD8+ T cells, and DCs were mixed at a cell number ratio of 1:3:0.5.
  • the growth rate was analyzed immediately after co-culture (0h), after 24 hours (24h), after 48 hours (48h), and after 72 hours (72h).
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group treated with atezolizumab as an exemplary drug.
  • 26 is a graph showing the apoptosis rate of colon cancer organoids according to the co-culture ratio of colon cancer organoids, CD8+ T cells, and DCs.
  • Colon cancer organoids and CD8+ T cells were fixed at a cell count ratio of 1:0.5. It relates to the result of co-cultivation in mixed conditions.
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group treated with atezolizumab as an exemplary drug.
  • the mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • FIG. 27 is a graph showing the death rate of colon cancer organoids according to the co-culture ratio of colon cancer organoids, CD8+ T cells, and DCs, wherein colon cancer organoids and CD8+ T cells were fixed at a cell number ratio of 1:1. It relates to the result of co-cultivation in mixed conditions.
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group treated with atezolizumab as an exemplary drug.
  • the mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • FIG. 28 is a graph showing the death rate of colon cancer organoids according to the co-culture ratio of colon cancer organoids, CD8+ T cells, and DCs, wherein colon cancer organoids and CD8+ T cells were fixed at a cell number ratio of 1:3. It relates to the result of co-cultivation in mixed conditions.
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group treated with atezolizumab as an exemplary drug.
  • the mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • FIG. 29 is a graph showing the growth rate of lung cancer organoids according to the co-culture ratio of lung cancer organoids, CD8+ T cells, and DCs, in a mixed condition where lung cancer organoids and CD8+ T cells were fixed at a cell number ratio of 1:0.5. It is about the result of co-cultivation.
  • “1:0.5:0.5” described in the figure means that lung cancer organoids, CD8+ T cells, and DCs were mixed at a cell number ratio of 1:0.5:0.5.
  • the growth rate was analyzed immediately after co-culture (0h), after 24 hours (24h), after 48 hours (48h), and after 72 hours (72h).
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group treated with atezolizumab as an exemplary drug.
  • FIG. 30 is a graph showing the growth rate of lung cancer organoids according to the co-culture ratio of lung cancer organoids, CD8+ T cells, and DCs, in a mixed condition where lung cancer organoids and CD8+ T cells were fixed at a cell number ratio of 1:1. It is about the result of co-cultivation.
  • “1:1:0.5” in the figure means that lung cancer organoids, CD8+ T cells and DCs were mixed at a cell number ratio of 1:1:0.5.
  • the growth rate was analyzed immediately after co-culture (0h), after 24 hours (24h), after 48 hours (48h), and after 72 hours (72h).
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group treated with atezolizumab as an exemplary drug.
  • FIG. 31 is a graph showing the growth rate of lung cancer organoids according to the co-culture ratio of lung cancer organoids, CD8+ T cells, and DCs, in a mixed condition where lung cancer organoids and CD8+ T cells were fixed at a cell number ratio of 1:3. It is about the result of co-cultivation.
  • “1:3:0.5” in the figure means that lung cancer organoids, CD8+ T cells, and DCs were mixed at a cell number ratio of 1:3:0.5.
  • the growth rate was analyzed immediately after co-culture (0h), after 24 hours (24h), after 48 hours (48h), and after 72 hours (72h).
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group treated with atezolizumab as an exemplary drug.
  • FIG. 32 is a graph showing the death rate of lung cancer organoids according to the co-cultivation ratio of lung cancer organoids, CD8+ T cells, and DCs, under a condition in which lung cancer organoids and CD8+ T cells were fixed and mixed at a cell number ratio of 1:0.5. It is about the result of co-culture in .
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group treated with atezolizumab as an exemplary drug.
  • the mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • FIG 33 is a graph showing the death rate of lung cancer organoids according to the co-culture ratio of lung cancer organoids, CD8+ T cells, and DCs, under a condition in which lung cancer organoids and CD8+ T cells were fixed at a cell number ratio of 1:1 and mixed. It is about the result of co-culture in .
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group treated with atezolizumab as an exemplary drug.
  • the mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • FIG. 34 is a graph showing the death rate of lung cancer organoids according to the co-culture ratio of lung cancer organoids, CD8+ T cells, and DCs, under a mixed condition in which lung cancer organoids and CD8+ T cells were fixed at a cell number ratio of 1:3. It is about the result of co-culture in .
  • 'Non' means a drug-untreated group
  • 'Atez' means a drug-treated group treated with atezolizumab as an exemplary drug.
  • the mortality rate was analyzed based on the results of measuring the growth rate after 72 hours of drug treatment (72h).
  • Anticancer drug efficacy evaluation and screening system including cancer organoids, cytotoxic T cells and M1 macrophages
  • cytotoxic T cells Cytotoxic T cells
  • M1 macrophages classically activated macrophages
  • the number of organoids or cells was set to 5.0 ⁇ 10 3 as 1, and the specific number of organoids or cells according to the ratio is as follows:
  • Example 1.1 Establishment of conditions in which cancer organoids, cytotoxic T cells, and M1 macrophages coexist
  • cancer organoids Specifically, cancer organoids, CD8+ T cells and M1 derived from colorectal cancer patients were used.
  • Table 1 after cancer organoids were fixed at a ratio of 1, CD8+ T cells were co-cultured at a ratio of 0.1 to 10 and M1 at a ratio of 0.1 to 5 for 2 hours, respectively.
  • the degree of death of cancer organoids or cells according to the ratio was analyzed. At this time, the analysis was performed by flow-cytometer, and CFSE (+) was used as a marker for cancer organoids and CD11B (+) was used as a marker for M1 macrophages.
  • Example 1.2 Confirmation of cancer organoid growth inhibition and apoptosis according to co-culture time
  • Example 1.1 in the screening system composed of cancer organoids, CD8+ T cells, and M1, the proportion of cells in which growth inhibition and death of cancer organoids were not observed was confirmed. Accordingly, after setting different co-culture times (24 hours, 48 hours, and 72 hours), the degree of cancer organoid growth was analyzed.
  • cancer organoids were fixed at a ratio of 1, CD8+ T cells were co-cultured at a ratio of 0.2 to 3, and M1 was set at a ratio of 0.1 to 3, respectively.
  • the phagocytosis was analyzed.
  • the ratio of the CD8 + T cells and M1 was tested in a narrower range than the ratio applied in Example 1.1, the analysis was performed by HCS (High-Content screening), the area of the initial organoid was set to 100%, , the change in area according to the reaction time was expressed as a ratio.
  • Example 1.3 Establish conditions under which phagocytosis is activated
  • Example 1.1 In order to confirm that the screening system composed of cancer organoids, CD8+ T cells, and M1 as identified in Example 1.1 can be used to evaluate the efficacy of a drug targeting M1, the system is treated with anti-CD47 antibody. After that, the degree of death of cancer organoids according to phagocytosis was confirmed.
  • cancer organoids and CD8+ T cells derived from colorectal cancer patients were used, and CHA15 cell line was used for M1.
  • CD8+ T cells were co-cultured at a ratio of 0.2 to 3 and M1 at a ratio of 0.1 to 3, respectively. Phagocytosis was analyzed. At this time, the ratio of the CD8+ T cells and M1 was tested in a narrower range than the ratio applied in Example 1.1, the analysis was performed by flow-cytometer, and the cancer organoid marker was EpCAM (+), CD11B(+) was used as a marker for M1. In the case of phagocytosis, the cancer organoid marker and the M1 marker were confirmed as a double positive ratio.
  • phagocytosis was observed in all conditions except for group 2 in which M1 did not exist, and in particular, in groups 3, 4, 6, and 7, when the anti-CD47 antibody binding to M1 was treated. It was confirmed that phagocytosis was activated compared to the untreated group.
  • Example 1.4 Establishment of conditions to evaluate the efficacy of drugs exhibiting different MoA (Mode of Action) characteristics
  • CD8+ T cells and M1 can be used to evaluate the efficacy of a drug, the anti-PD- After treatment with the L1 antibody, atezolizumab, anti-CD47 antibody, and a combination thereof, the degree of death of cancer organoids by phagocytosis was confirmed.
  • Atezolizumab binds to PD-L1 of cancer cells and blocks the PD-1/PD-L1 mechanism to activate CD8+ T cells, and anti-CD47 antibody binds to CD47 of M1 and blocks the SIRP-a/CD47 mechanism to activate macrophages. activate Therefore, it was attempted to confirm whether the screening system of the present invention can evaluate the efficacy of both types of drugs acting in different mechanisms.
  • cancer organoids and CD8+ T cells derived from colorectal cancer patients were used, and CHA15 cell line was used for M1.
  • CD8+ T cells were co-cultured at a ratio of 0 to 3 and M1 at a ratio of 0 to 3, and the co-culture After treatment with 10 nM of anti-PD-L1 antibody atezolizumab (Atezolizumab, Selleck, #A2004) and/or 10 nM of anti-CD47 antibody, the degree of apoptosis of cancer organoids or M1 at each ratio was analyzed.
  • the ratio of the CD8+ T cells and M1 was tested in a narrower range than the ratio applied in Example 1.1, and the analysis was performed by analyzing the change in organoid area for 72 hours after drug treatment using HCS (High-Content Screening) equipment. analyzed using Thereafter, the overall efficacy was evaluated by calculating the area change of the drug-treated group compared to the organoid area of the non-treated group after 72 hours of drug treatment.
  • HCS High-Content Screening
  • the ratio of cancer organoids, CD8+ T cells and M1 which can show similar overall efficacy when different drugs are treated alone or in combination, is 1 : 0.5 : 0.5 in group 5 and 1 : 0.5 : 1 in group 6 , and 1: 0.5: 3 of Group 7.
  • Anticancer drug efficacy evaluation and screening system including cancer organoids, M1 macrophages and M2 macrophages
  • M1 macrophages classically activated macrophages, hereinafter referred to as 'M1'
  • M2 macrophages hereinafter referred to as 'M2'
  • Cancer organoids were prepared to have a 3D structure by isolating lung cancer tissues obtained from patients into single cells and culturing them together with ECM (extracellular matrix). The formed cancer organoids were confirmed to be tumors through pathological analysis, and used after being isolated into single cells using Tryp-LE. M1 and M2 were differentiated from iPSCs, and differentiated into M1 or M2 from H9 cell line using a general method known in the art.
  • Cancer organoid growth rate (%) (cancer organoid area after 24, 48 or 72 hours of co-culture) / (cancer organoid area immediately after co-culture begins) ⁇ 100
  • M1 and M2 for the co-cultures of cancer organoids, M1 and M2 according to the mixing ratio in Table 3, those not treated with the drug were set as the control group (hereinafter referred to as 'drug-untreated group'), and the experimental group (hereinafter referred to as 'drug-treated group') ) was treated with an anti-CD47 antibody targeting M1 as an exemplary drug. After co-cultivating them for 72 hours, the growth rate was measured 72 hours after drug treatment (72h), respectively, and the mortality rate was analyzed by the following method through the measured growth rate.
  • Cancer organoid death rate (%) [1 - (cancer organoid growth rate of drug-treated group * )/(cancer organoid growth rate of drug-untreated group ** )] ⁇ 100
  • Cancer organoid growth rate (%) of drug-treated group (cancer organoid area after 72 hours of drug treatment) / (cancer organoid area immediately after the start of co-culture (0h)) ⁇ 100
  • 'TIL' tumor-infiltrating lymphocytes
  • TILs are cells that infiltrate or surround tumor tissue, and play a role in recognizing and killing cancer cells.
  • TILs contain various types of immune cells, but among them, CD8+ T cells capable of attacking tumors account for the majority.
  • CD8+ T cells contained therein are already activated and are characterized in that they are in a state capable of recognizing and attacking cancer cells.
  • the activation process of CD8+ T cells was omitted by using TIL isolated from tissues.
  • a condition in which activated CD8+ T cells are maintained longer was derived, and this was applied to this system.
  • CD56 and CD8 were used as markers.
  • CD56 was used to analyze total immune cells present in TIL
  • CD8 was used to analyze CD8+ T cells among total immune cells present in TIL.
  • Table 4 below relates to the percentage of CD8+ T cells present in total TIL.
  • the percentage of CD8+ T cells was about 37.9%, which rapidly decreased to more than half compared to the 14th day (about 97.1%).
  • cancer organoids were prepared using cancer cells isolated from tumor tissues of lung cancer or colorectal cancer patients, and TILs obtained by co-culture with cancer organoids for 14 days according to Example 1.1 were used.
  • the TILs were set at a ratio of 0.5 to 3, and the number of organoids or TILs was set at 5.0 ⁇ 10 3 at a ratio of 1.
  • cancer organoid death rate (%) [1 - (cancer organoid growth rate of drug-treated group * )/(cancer organoid growth rate of drug-untreated group ** )] ⁇ 100
  • Cancer organoid growth rate (%) of drug treatment group (cancer organoid area after 24, 48 or 72 hours of drug treatment) / (cancer organoid area at 0 hour) ⁇ 100
  • Cancer organoid growth rate (%) of drug-untreated group (cancer organoid area after 24, 48 or 72 hours without drug treatment) / (cancer organoid area at 0 hour) ⁇ 100
  • lung cancer organoids and TILs were co-cultured at a ratio of 1:0.5, the lung cancer organoids did not respond to the drug, and accordingly, lung cancer organoids in the control and experimental groups.
  • the growth rate and death rate were similar.
  • the death rate of lung cancer organoids in the drug-treated group was only about 5%, making it impossible to accurately determine the efficacy of the drug.
  • lung cancer organoids and TILs were co-cultured at a ratio of 1:1.5, the anticancer effect of atezolizumab, such as inhibition of lung cancer organoid growth and increased apoptosis, was shown in the drug-treated group.
  • the death rate of lung cancer organoids in the drug-treated group was about 20%, and it was confirmed that atezolizumab exhibited a high level of lung cancer organoid death rate compared to other mixing ratios.
  • the anticancer effect of atezolizumab such as inhibition of growth of colon cancer organoids and increased apoptosis, was shown in the drug-treated group.
  • the mortality rate of colorectal cancer organoids in the drug-treated group was about 10%, and it was confirmed that atezolizumab exhibited a high level of colorectal cancer organoid death rate compared to other mixing ratios.
  • Anticancer drug efficacy evaluation and screening system including cancer organoids, cytotoxic T cells and regulatory T cells
  • cytotoxic T cells hereinafter referred to as 'CD8+ T cells
  • regulatory T cells hereinafter referred to as 'Treg'
  • a mixing ratio was derived that satisfies the conditions that (1) cancer organoids grow properly during co-culture and (2) drug efficacy is high.
  • Table 6 shows that after cancer organoids were fixed at a ratio of 1, CD8+ T cells and Tregs were set at a ratio of 0 to 3. At this time, the number of each organoid or cell was 5.0 ⁇ 10 3 and set to 1.
  • Cancer organoids were prepared using stem cells isolated from tumor tissue of colorectal cancer or lung cancer patients.
  • the isolated stem cells were mixed with ECM (Extracellular matrix) to grow into a 3D structure to make a dome, and then organoids were formed and used through culture.
  • ECM Extracellular matrix
  • CD8+ T cells and Tregs were obtained from blood obtained from colorectal cancer or lung cancer patients.
  • Immune cells present in the blood were differentiated, and CD8+ and Treg cells were isolated from the differentiated immune cells using a magnetic activated cell sorting (MACS) method.
  • MCS magnetic activated cell sorting
  • Cancer organoid growth rate (%) (cancer organoid area after 24, 48 or 72 hours of co-culture) / (cancer organoid area immediately after co-culture begins) ⁇ 100
  • a mixture ratio of cancer organoids, CD8+ T cells, and Tregs was derived so that the efficacy of the anticancer agent targeting CD8+ T cells and the anticancer agent targeting Treg was high.
  • Cancer organoid death rate (%) [1 - (cancer organoid growth rate of drug-treated group * )/(cancer organoid growth rate of drug-untreated group ** )] ⁇ 100
  • Cancer organoid growth rate (%) of drug-treated group (cancer organoid area after 72 hours of drug treatment) / (cancer organoid area immediately after the start of co-culture (0h)) ⁇ 100
  • lung cancer organoids CD8+ T cells and Tregs, except for Tregs, only lung cancer organoids and CD8+ T cells are co-cultured at a mixing ratio of 1 : 3, cancer caused by atezolizumab.
  • the death rate of organoids was as high as about 27%, the death rate of cancer organoids by the anti-TIGIT antibody was only about 6%, making it impossible to accurately determine the efficacy of the drug.
  • lung cancer organoids CD8+ T cells, and Tregs
  • a mixing ratio of 1:3 excluding CD8+ T cells
  • cancer organoids by atezolizumab and anti-TIGIT antibody As the death rate of about 1% appeared at a remarkably low level, it was confirmed that the efficacy of the drug could not be accurately determined.
  • Anticancer drug efficacy evaluation and screening system including cancer organoids, cytotoxic T cells and dendritic cells
  • cytotoxic T cells hereinafter referred to as 'CD8+ T cells
  • dendritic cells hereinafter referred to as 'DC'
  • Cancer organoids were prepared to have a 3D structure by separating colorectal or lung cancer tissues obtained from patients into single cells and culturing them together with an extracellular matrix (ECM). The formed cancer organoids were confirmed to be tumors through pathological analysis, and used after being isolated into single cells using Tryp-LE.
  • ECM extracellular matrix
  • CD8+ T cells were isolated from PBMCs and used. PBMCs were isolated from blood obtained from donors using Ficoll, and CD8+ T cells were isolated through MACS after a T cell activation process.
  • DCs differentiated from iPSCs were used, and DCs were differentiated from the H9 cell line using a general method known in the art.
  • Cancer organoid death rate (%) [1 - (cancer organoid growth rate of drug-treated group * )/(cancer organoid growth rate of drug-untreated group ** )] ⁇ 100
  • Cancer organoid growth rate (%) of drug treatment group (cancer organoid area after 24, 48 or 72 hours of drug treatment) / (cancer organoid area immediately after drug treatment (0h)) ⁇ 100
  • Cancer organoid growth rate (%) of drug-untreated group (cancer organoid area after 24, 48, or 72 hours of drug-free treatment) / (cancer organoid area immediately after co-culture (0h)) ⁇ 100

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Abstract

본 발명은 암 오가노이드 및 면역세포의 혼합물에 항암제 또는 항암제 후보물질을 처리하는 단계를 포함하는 항암제 또는 항암제 후보물질의 효능 평가 방법에 관한 것이다. 또한, 암 오가노이드 및 면역세포를 포함하는 항암제 효능 평가 시스템 또는 항암제 스크리닝 시스템에 관한 것이다. 본 발명에 따른 암 오가노이드 및 면역세포의 혼합물은 특정 비율로 혼합되어 암세포가 생체 내에서 존재하고 있는 형태인 종양 미세 환경을 유사하게 재현할 수 있다. 따라서, 이를 활용하는 경우 약물이 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있다.

Description

항암제 효능 평가 또는 스크리닝 방법
본 발명은 암 오가노이드 및 면역세포의 혼합물에 항암제 또는 항암제 후보물질을 처리하는 단계를 포함하는 항암제 또는 항암제 후보물질의 효능 평가 방법에 관한 것이다. 또한, 암 오가노이드 및 면역세포를 포함하는 항암제 효능 평가 시스템 또는 항암제 스크리닝 시스템에 관한 것이다.
오가노이드는 조직 또는 기관에서 유래한 세포를 3차원 배양하여 제조한 장기 유사체이다. 오가노이드는 장기배양, 동결보존이 가능하고 조작과 관찰이 용이하다는 장점을 가진다. 동시에 불멸화가 필요 없어 그에 따른 세포의 본래 특성이 유지됨은 물론 생체 내에서만 볼 수 있었던 세포 계층적, 조직학적 구조를 재현함으로써 세포보다 한 단계 높은 차원의 생리현상을 연구할 수 있는 실험모델이다. 이러한 특성으로 인해 오가노이드는 세포의 내재적 특성이 변화된 불멸화된 세포주, 인체와 구조가 다른 동물 모델에 비해 높은 정확도로 약물 평가를 할 수 있고, 특히 환자 유래 조직을 이용하므로 사람을 대상으로 한 임상에 앞서 약물의 안전성은 물론 효능까지 미리 확인할 수 있는 장점이 있다. 다만, 기존에 약물 평가 모델로서 개발된 암 오가노이드는 종양 미세 환경을 반영하지 못하는 한계점을 지니고 있었던바, 다양한 종양 미세 환경을 갖춘 오가노이드를 개발하고, 이를 약물 평가 모델로서 사용하기 위한 노력이 수행될 필요가 있다.
종양 미세 환경은 암세포 주위에 혈관, 면역세포, 섬유아세포(fibroblast), 림프구, 신호전달분자, 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 등이 둘러 싸여 있는 세포환경이다. 종양 미세 환경에서 암세포는 세포외 신호 방출, 암세포 신생혈관 촉진, 말초 면역관용 등을 유도하여 미세환경에 영향을 준다. 따라서 암세포는 미세환경을 변화시키기도 하고 미세환경이 암세포의 성장 또는 전이에 영향을 미치기도 하는데, 특히 림프구 등과 관련된 종양 미세 환경은 암의 발생 및 전이 뿐만 아니라, 암의 면역 시스템 회피와도 관련이 높아 항암제에 의한 치료 반응에 영향을 미치며, 항암 면역 요법의 주요 표적이 된다.
예를 들어, 종양 미세 환경에 존재하는 세포 독성 T 세포(cytotoxic T cell, CD8+ T cell), 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg), 골수유래 억제세포(myeloid-derived suppressor cell, MDSC), 수지상 세포(Dendritic cell, DC), 종양 관련 대식세포(tumor-associated macrophage, TAM), 종양-침투 림프구(Tumor-infiltrating lymphocyte, TIL), 암-연관 섬유아세포(cancer-associated fibroblast, CAF) 등의 세포가 면역항암제의 효능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 이들은 암 조직 내로의 T 세포 침투를 제한할 뿐만 아니라, 종양 침투 림프구의 증식과 생존을 감소시킴으로써 면역항암제의 치료 효과를 저해한다.
본 발명자들은 종양 미세 환경을 갖춘 암 오가노이드를 개발하고, 이를 약물 평가의 플랫폼으로 사용하기 위한 다양한 연구를 진행하였다. 그 결과, 종양 미세 환경을 구성하는 다양한 세포 중 하나인 면역세포와 암 오가노이드를 특정 비율로 공배양하는 시스템을 확립하였다. 또한, 상기 시스템에서는 암 오가노이드가 적절히 성장함에 따라 약물의 효능을 정확하게 확인할 수 있음을 실험적으로 입증하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 본 명세서에서 특별히 정의되지 않은 용어들에 대해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 이해되어야 할 것이다. 또한, 문맥상 특별히 정의하지 않은 경우라면, 단수는 복수를 포함하며, 복수는 단수를 포함한다.
본 발명의 하나의 양태는 하기 단계를 포함하는, 항암제 후보물질의 효능 평가 방법을 제공한다:
(a) 암 오가노이드 및 면역세포를 1 : 0.5 내지 5의 비율로 혼합하여 공배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 혼합물에 항암제 후보물질을 처리하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 항암제 후보물질이 처리된 군에서 양성 대조군 또는 항암제 후보물질 미처리군에 비해 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가한 경우, 상기 후보물질의 효능이 우수한 것으로 결정하는 단계.
항암제, 특히 면역항암제의 경우 환자가 가지고 있는 면역세포를 이용하여 암을 사멸시키므로, 이의 효능을 평가하는 평가 플랫폼은 체내의 면역환경을 모사해야 한다. 본 발명에서는, 이러한 체내 면역환경을 in vitro에서 모사하기 위하여 암 오가노이드와 다양한 면역세포를 공배양할 수 있는 평가 플랫폼을 구축하였다. 환자의 면역 환경을 완벽하게 모사하기 위해서는 모든 종류의 면역세포를 공배양해야 하지만, 각 환자별로 면역세포의 비율이 다르기 때문에 이를 in vitro에서 모사하는 것에 한계가 있으며, 특히 약물 평가 플랫폼에 포함되는 면역세포의 비율이 달라지면 약물의 효능도 달라지게 되어 효능의 예측이 오히려 어려워지는 단점이 있었다. 따라서 약물에 대한 효능을 정확하게 확인하기 위한 목적에서 면역세포의 종류를 분류하여 각각의 플랫폼을 구축하였다. 또한, 약물이 타겟하는 면역세포를 고려하여 적절한 효능 평가 플랫폼을 선택할 수 있도록 다양한 면역세포를 이용하여 플랫폼을 구축하였다.
구체적으로, 상기 단계 (a)는 암 오가노이드 및 면역세포를 혼합하여 공배양하는 단계로서, 생체 내 종양 미세 환경을 인비트로(in vitro)에서 재현하는 단계이다.
본 발명에서, 상기 면역세포는 세포독성 T 세포, M1 마크로파지, M2 마크로파지, TIL, 조절 T 세포 및 수지상 세포로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "오가노이드"는 3차원 입체구조를 가지는 세포의 덩어리를 의미하며, 기관 또는 조직에서 분리한 세포를 3차원 배양을 통해 제조한 장기 유사체를 의미한다. 오가노이드는 기관 또는 조직을 구성하는 특이적 세포 집단들을 포함하고 있고, 실제 조직 또는 기관과 유사한 형태로 구조적 조직화가 이루어져 있으므로, 각 조직 또는 기관이 갖는 특수한 형태 및 기능을 재현할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "암 오가노이드"는 종양에서 분리한 세포로부터 유래된 오가노이드를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "세포독성 T 세포(Cytotoxic T cell, CD8+ T 세포)"는 항원 특이적 후천 면역(acquired immunity, adaptive immunity)을 수행하는 림프구를 의미한다. 세포독성 T 세포는 암세포, 바이러스, 박테리아 등 병원체에 감염된 세포를 사멸시키고, TNF-α, IFN-γ와 같은 사이토카인을 생성한다. 본 발명에 따른 세포독성 T 세포는 종양 조직 내에 침윤한 것이거나, 종양 조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 본 명세서에서, 상기 세포독성 T 세포는 "분화된 T 세포", "분화 후 T 세포", "활성화된 T 세포", "활성화 T 세포" 또는 "CD8+ T 세포"와 혼용되어 명명될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "M1 마크로파지(classically activated macrophage, M1)"는 종양-관련 마크로파지(Tumor-associated macrophage, TAM)의 일종으로, LPS, IFN-γ, IL-1β, TNF-α, TLR engagement 등의 사이토카인에 의해 활성화된 마크로파지를 의미한다. M1은 IL-6, IL-12 및 TNF-α와 같은 전염증성 사이토카인 또는 케모카인을 분비하며, 항원제시세포(Antigen-presenting cell, APC)로서 기능하여 T 세포를 활성화하거나, 종양-침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte, TIL) 또는 NK 세포를 활성화함으로써 병원체 사멸 또는 암세포 사멸을 유도하거나, 식균작용(phagocytosis)을 통해 암세포를 직접 사멸시킬 수 있다. 본 명세서에서, 상기 M1 마크로파지는 "M1"과 혼용되어 명명될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "M2 마크로파지(alternatively activated macrophage, M2)"는 종양-관련 마크로파지(Tumor-associated macrophage, TAM)의 일종으로, IL-4, IL-13, IL-10 등의 사이토카인에 의해 활성화된 마크로파지를 의미한다. M2는 MMP 또는 COX-2와 같은 효소, 또는 IL-10, TGF-β와 같은 항염증성 사이토카인을 분비하며, 이에 따라 염증 감소, 상처 치유, 조직 회복과 관련된 면역 반응을 수행한다. 그러나, M2가 분비하는 효소는 종양 주변 조직을 파괴하여 종양 세포의 증식과 전이를 촉진시키거나, 혈관신생의 시작 및 유지에 관여하여 종양의 성장을 유도하기도 한다. 본 명세서에서, 상기 M2 마크로파지는 "M2"와 혼용되어 명명될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "TIL(Tumor-infiltrating lymphocyte)"은 "종양-침투 림프구"로도 불리는, 종양 조직 근처에 존재하거나 종양 조직 내로 침윤한 림프구를 의미한다. 또한, TIL은 다양한 종류의 면역세포로 구성되어 있는 림프구의 집단일 수 있다. 본 발명에 따른 TIL은 세포 표면에 CD8 단백질을 발현하는 TIL일 수 있고, 구체적으로 세포 표면에 CD8 단백질을 발현하며, 종양 조직 근처에 존재하거나 종양 조직 내로 침윤한 림프구의 집단일 수 있고, 바람직하게 CD8+ T 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "조절 T 세포(regulatory T cell, Treg)"는 면역 반응을 억제하여 항상성과 면역관용(immune tolerance)을 유지하는 역할을 하며, T 세포 증식 및 사이토카인 생성을 억제하여 자가면역을 예방하는데 중요한 역할을 수행하는 림프구를 의미한다. 본 발명에 따른 조절 T 세포는 종양 조직 내에 침윤한 것이거나, 종양 조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 본 명세서에서, 상기 조절 T 세포는 "Treg 세포" 또는 "Treg"와 혼용되어 명명될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "수지상 세포(Dendritic cell, DC)"는 항원 제시 세포로서, 항원 물질을 처리하여 이를 T 세포에 제시하는 역할을 수행하는 림프구를 의미한다. 구체적으로, 수지상 세포는 종양 성장을 억제할 수 있는 면역 세포인 도움 T 세포(CD4+ T 세포)와 세포독성 T 세포(CD8+ T 세포)를 활성화하여 이들의 기능을 촉진하며, 이에 따라 종양의 진행을 조절하는 역할을 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 수지상 세포는 혈액에서 분리된 것일 수 있다. 본 명세서에서, 상기 수지상 세포는 "DC 세포" 또는 "DC"와 혼용되어 명명될 수 있다.
본 발명에서, 상기 면역세포가 세포독성 T 세포 및 M1 마크로파지인 경우, (a) 단계의 공배양은 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 M1 마크로파지를 1 : 0.5 : 0.5 내지 3의 세포수 비율로 혼합하여 수행할 수 있다. 상기 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 M1 마크로파지가 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 약물 처리 전임에도 불구하고 암 오가노이드가 성장하지 않아 약물의 항암 효과를 확인할 수 없으며, 또는 M1 마크로파지가 자연적으로 사멸하여 종양 미세 환경을 재현해낼 수 없는 문제가 발생한다. 또한, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 약물의 효능이 고르게 나타나지 않는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 M1 마크로파지를 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
본 발명에서, 상기 면역세포가 M1 마크로파지 및 M2 마크로파지인 경우, (a) 단계의 공배양은 암 오가노이드, M1 마크로파지 및 M2 마크로파지를 1 : 1 내지 3 : 0.5 내지 5의 세포수 비율로 혼합하여 수행할 수 있다. 상기 암 오가노이드, M1 마크로파지 및 M2 마크로파지가 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. M1 마크로파지는 종양 세포 사멸 촉진 특성, M2 마크로파지는 종양 세포 성장 촉진 특성을 나타냄에 따라, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 약물 처리 전임에도 불구하고 암 오가노이드가 성장하지 않거나 과도하게 성장하는 문제가 발생하며, 또한 약물의 항암 효과를 정확하게 확인할 수 없는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드, M1 마크로파지 및 M2 마크로파지를 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
본 발명에서, 상기 면역세포가 TIL인 경우, (a) 단계의 공배양은 암 오가노이드 및 TIL을 1 : 1 내지 2의 세포수 비율로 혼합하여 수행할 수 있고, 구체적으로 1 : 1.5의 세포수 비율로 혼합하여 수행할 수 있다. 상기 암 오가노이드 및 TIL이 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 약물 처리 전임에도 불구하고 암 오가노이드의 성장이 현저히 증가하여 약물에 반응하지 않거나, 암 오가노이드가 성장하지 않아 약물의 항암 효과를 확인할 수 없는 문제가 발생한다. 또한, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 약물의 효능이 고르게 나타나지 않는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드 및 TIL을 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
본 발명에서, 상기 면역세포가 세포독성 T 세포 및 조절 T 세포인 경우, (a) 단계의 공배양은 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 조절 T 세포를 1 : 3 : 0.5 내지 3의 세포수 비율로 혼합하여 수행할 수 있고, 구체적으로 1 : 3 : 1 내지 3의 세포수 비율, 더욱 구체적으로 1 : 3 : 3의 세포수 비율로 혼합하여 수행할 수 있다. 상기 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 조절 T 세포가 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 약물에 의한 암 오가노이드의 사멸률이 현저히 낮아 약물의 항암 효과를 확인할 수 없는 문제가 발생한다. 또한, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 약물의 효능이 고르게 나타나지 않는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 조절 T 세포를 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
본 발명에서, 상기 면역세포가 세포독성 T 세포 및 수지상 세포인 경우, (a) 단계의 공배양은 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 수지상 세포를 1 : 3 : 0.5 내지 5의 세포수 비율로 혼합하여 수행할 수 있고, 구체적으로 1 : 3 : 0.5 내지 1의 세포수 비율로 혼합하여 수행할 수 있다. 상기 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 수지상 세포가 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 암 오가노이드가 적절히 성장하지 않거나, 약물에 의한 암 오가노이드의 사멸률이 현저히 낮아 약물의 항암 효과를 확인할 수 없는 문제가 발생한다. 또한, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 약물의 효능이 고르게 나타나지 않는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 수지상 세포를 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
본 발명에 따른 항암제 후보물질의 효능 평가 방법은 암 오가노이드 및 면역세포를 상기 비율로 혼합한 혼합물에 항암제 후보물질을 처리한다. 즉, 암세포가 생체 내에서 존재하고 있는 형태인 종양 미세 환경을 유사하게 재현한 시스템을 통해 항암제 후보물질의 효능을 평가한다. 따라서, 항암제 후보물질이 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있다.
본 발명에 따른 항암제 후보물질의 효능 평가 방법에서, 상기 단계 (b)는 상기 (a) 단계에 따라 암 오가노이드 및 면역세포가 공배양된 혼합물에 항암제 후보물질을 처리하는 단계이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "항암제"는 암의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 물질로서, 구체적으로 암세포, 암 오가노이드 또는 종양 등을 사멸시키거나, 또는 이의 성장을 억제할 수 있는 물질을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "항암제 후보물질"은 암의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 것으로 예상되는 물질을 의미하며, 구체적으로 암세포, 암 오가노이드 또는 종양 등을 사멸시키거나, 또는 이의 성장을 억제할 것으로 예상되는 물질을 의미한다.
본 명세서에서, 상기 '항암제'는 '약물'과 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 또한 상기 '처리'는 '첨가' 또는 '투여'와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 항암제 또는 항암제 후보물질은 암 오가노이드 및/또는 면역세포를 타겟하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 항암제 또는 항암제 후보물질은 암 오가노이드만을 타겟하는 것이거나, 면역세포만을 타겟하는 것이거나, 암 오가노이드 및 면역세포를 동시에 타겟하는 것일 수 있다. 예를 들어, 면역세포를 타겟하는 항암제는 아테졸리주맙(atezolizumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 항-TIGIT 항체 또는 항-CD47 항체일 수 있다. 상기 "항-CD47 항체"는 암세포에서 발현하는 CD47과 마크로파지가 발현하는 SIRPα의 결합을 직접적으로 차단함으로써, 대식세포에 의한 암세포의 식균작용(phagocytosis)을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 항암제 또는 항암제 후보물질은 화합물, 단백질, 융합 단백질, 화합물-단백질 복합체, 약물-단백질 복합체, 항체, 화합물-항체 복합체, 약물-항체 복합체, 아미노산, 펩티드, 바이러스, 탄수화물, 지질, 핵산, 추출물, 분획물 등을 제한 없이 포함한다.
예로서, 상기 항암제 또는 항암제 후보물질은 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 융합 단백질, 항체, 앱타머, 항체-약물 복합체(ADC; Antibody Drug Conjugate) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게, 상기 항암제 또는 항암제 후보물질은 항체이거나, 또는 면역항암제일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "항체"는 단일클론 항체, 다클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체를 포함하며, 신규 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지되거나 시판되는 항체들도 포함된다. 상기 항체는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 포함하는 전체 길이의 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편은 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 여기에는 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 용어, "펩티드 미메틱스(Peptide Mimetics)"는 호르몬, 사이토카인, 효소 기질, 바이러스 또는 다른 생물학적 분자의 활성 리간드를 생물학적으로 모사하는 펩티드, 또는 변형된 펩티드를 의미한다. 용어, "앱타머(Aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)을 의미한다.
또 다른 예로서, 상기 항암제는 DNA 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "안티센스 핵산"은 특정 mRNA의 서열에 대해 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA, RNA, 또는 이들의 단편 또는 유도체를 의미하며, mRNA의 서열에 상보적으로 결합 또는 혼성화하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 용어, "siRNA(small interfering RNA)"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통해 RNAi(RNA interference)를 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. siRNA는 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 갖는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 갖는 안티센스 RNA 가닥을 포함한다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있으므로, 유전자 넉다운 방법 또는 유전자치료 방법 등에 사용된다. 용어, "shRNA(short hairpin RNA)"는 단일가닥 RNA로서 수소결합에 의해 이중가닥 부분을 형성하는 줄기(stem) 부분과 고리 형태를 띄는 루프(loop) 부분으로 구분되는 RNA를 의미한다. 다이서(Dicer) 등의 단백질에 의해 프로세싱되어 siRNA로 변환되고 siRNA와 동일한 기능을 수행할 수 있다. 용어, "miRNA(micro RNA)"는 표적 RNA의 분해를 촉진시키거나 또는 이들의 번역을 억제시킴으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21 내지 23 nt의 비코딩 RNA를 의미한다. 용어, "리보자임(ribozyme)"은 특정 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 구성된다.
본 발명의 방법에 따라 효능이 평가되거나 스크리닝되는 항암제 또는 항암제 후보물질은 예를 들면, 담도암, 위암, 폐암, 간암, 대장암, 결장암, 소장암, 췌장암, 뇌암, 뼈암, 흑색종, 유방암, 경화성선증, 자궁암, 자궁경부암, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 혈액암, 백혈병, 림프종, 섬유선종 등을 예방 또는 치료하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 항암제 후보물질의 효능 평가 방법에서, 상기 단계 (c)는 상기 (b) 단계의 항암제 후보물질이 처리된 군에서 양성대조군 또는 항암제 후보물질 미처리 군에 비해 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가한 경우, 상기 후보물질의 효능이 우수한 것으로 결정하는 단계이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "양성 대조군"은 당업계에서 항암제로 사용되고 있는 약물을 처리한 군을 의미한다.
구체적으로, 상기 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸은 암 오가노이드의 면적 증감을 통해 확인하는 것일 수 있다. 또한, 상기 암 오가노이드의 면적이 감소하는 경우, 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가된 것으로 판단하는 것일 수 있다. 또한, 상기 암 오가노이드의 면적 증감은 당업계에 공지된 방법으로 확인할 수 있으며, 예로서 HCS(High-Content Screening), 유세포 분석(Flow-cytometer) 등의 분석 방법을 통해 확인할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 항암제 후보물질의 효능 평가 방법을 사용하기 위한 항암제 효능 평가 시스템으로서, 암 오가노이드 및 면역세포를 포함하는 항암제 효능 평가 시스템을 제공한다.
본 발명에 따른 항암제 효능 평가 시스템에서, 각 용어는 특별히 언급하지 않는 한 전술한 바와 같다.
본 발명의 항암제 효능 평가 시스템은 종양 미세 환경을 모사한 것으로, 생체 내 종양 미세 환경을 구성하는 종양으로서 암 오가노이드, 및 면역세포로서 세포독성 T 세포, M1 마크로파지, M2 마크로파지, TIL, 조절 T 세포 및 수지상 세포로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상을 포함한다.
구체적으로, 상기 항암제 효능 평가 시스템은 상기 면역세포가 세포독성 T 세포 및 M1 마크로파지인 경우, 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 M1 마크로파지를 1 : 0.5 : 0.5 내지 3의 세포수 비율로 포함하는 것일 수 있다. 상기 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 M1 마크로파지가 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 약물 처리 전임에도 불구하고 암 오가노이드가 성장하지 않아 약물의 항암 효과를 확인할 수 없으며, 또는 M1 마크로파지가 자연적으로 사멸하여 종양 미세 환경을 재현해낼 수 없는 문제가 발생한다. 또한, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 약물의 효능이 고르게 나타나지 않는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 M1 마크로파지를 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
또한, 상기 항암제 효능 평가 시스템은 상기 면역세포가 M1 마크로파지 및 M2 마크로파지인 경우, 암 오가노이드, M1 마크로파지 및 M2 마크로파지를 1 : 1 내지 3 : 0.5 내지 5의 세포수 비율로 포함하는 것일 수 있다. 상기 암 오가노이드, M1 마크로파지 및 M2 마크로파지가 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. M1 마크로파지는 종양 세포 사멸 촉진 특성, M2 마크로파지는 종양 세포 성장 촉진 특성을 나타냄에 따라, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 약물 처리 전임에도 불구하고 암 오가노이드가 성장하지 않거나 과도하게 성장하는 문제가 발생하며, 또한 약물의 항암 효과를 정확하게 확인할 수 없는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드, M1 마크로파지 및 M2 마크로파지를 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
또한, 상기 항암제 효능 평가 시스템은 상기 면역세포가 TIL인 경우, 암 오가노이드 및 TIL을 1 : 1 내지 2의 세포수 비율로 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 1 : 1.5의 세포수 비율로 포함하는 것일 수 있다. 상기 암 오가노이드 및 TIL이 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 약물 처리 전임에도 불구하고 암 오가노이드의 성장이 현저히 증가하여 약물에 반응하지 않거나, 암 오가노이드가 성장하지 않아 약물의 항암 효과를 확인할 수 없는 문제가 발생한다. 또한, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 약물의 효능이 고르게 나타나지 않는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드 및 TIL을 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
또한, 상기 항암제 효능 평가 시스템은 상기 면역세포가 세포독성 T 세포 및 조절 T 세포인 경우, 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 조절 T 세포를 1 : 3 : 0.5 내지 3의 세포수 비율로 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 1 : 3 : 1 내지 3의 세포수 비율, 더욱 구체적으로 1 : 3 : 3의 세포수 비율로 포함하는 것일 수 있다. 상기 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 조절 T 세포가 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 약물에 의한 암 오가노이드의 사멸률이 현저히 낮아 약물의 항암 효과를 확인할 수 없는 문제가 발생한다. 또한, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 약물의 효능이 고르게 나타나지 않는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 조절 T 세포를 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
또한, 상기 항암제 효능 평가 시스템은 상기 면역세포가 세포독성 T 세포 및 수지상 세포인 경우, 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 수지상 세포를 1 : 3 : 0.5 내지 5의 세포수 비율로 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 1 : 3 : 0.5 내지 1의 세포수 비율로 혼합하여 포함하는 것일 수 있다. 상기 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 수지상 세포가 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 암 오가노이드가 적절히 성장하지 않거나, 약물에 의한 암 오가노이드의 사멸률이 현저히 낮아 약물의 항암 효과를 확인할 수 없는 문제가 발생한다. 또한, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 약물의 효능이 고르게 나타나지 않는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 수지상 세포를 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
본 발명에 따른 항암제 효능 평가 시스템은 암 오가노이드 및 면역세포를 상기 비율로 혼합한 혼합물을 포함하므로, 암세포가 생체 내에서 존재하고 있는 형태인 종양 미세 환경을 유사하게 재현할 수 있다. 따라서, 항암제가 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있으므로, 항암제 효능 평가에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 항암제 후보물질의 효능 평가 방법을 사용하기 위한 항암제 스크리닝 시스템으로서, 암 오가노이드 및 면역세포를 포함하는 항암제 스크리닝 시스템을 제공한다.
본 발명에 따른 항암제 스크리닝 시스템에서, 각 용어는 특별히 언급하지 않는 한 전술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 항암제 스크리닝 시스템은 상기 면역세포가 세포독성 T 세포 및 M1 마크로파지인 경우, 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 M1 마크로파지를 1 : 0.5 : 0.5 내지 3의 세포수 비율로 포함하는 것일 수 있다. 상기 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 M1 마크로파지가 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 약물 처리 전임에도 불구하고 암 오가노이드가 성장하지 않아 약물의 항암 효과를 확인할 수 없으며, 또는 M1 마크로파지가 자연적으로 사멸하여 종양 미세 환경을 재현해낼 수 없는 문제가 발생한다. 또한, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 약물의 효능이 고르게 나타나지 않는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 M1 마크로파지를 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
또한, 상기 항암제 스크리닝 시스템은 상기 면역세포가 M1 마크로파지 및 M2 마크로파지인 경우, 암 오가노이드, M1 마크로파지 및 M2 마크로파지를 1 : 1 내지 3 : 0.5 내지 5의 세포수 비율로 포함하는 것일 수 있다. 상기 암 오가노이드, M1 마크로파지 및 M2 마크로파지가 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. M1 마크로파지는 종양 세포 사멸 촉진 특성, M2 마크로파지는 종양 세포 성장 촉진 특성을 나타냄에 따라, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 약물 처리 전임에도 불구하고 암 오가노이드가 성장하지 않거나 과도하게 성장하는 문제가 발생하며, 또한 약물의 항암 효과를 정확하게 확인할 수 없는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드, M1 마크로파지 및 M2 마크로파지를 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
또한, 상기 항암제 스크리닝 시스템은 상기 면역세포가 TIL인 경우, 암 오가노이드 및 TIL을 1 : 1 내지 2의 세포수 비율로 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 1 : 1.5의 세포수 비율로 포함하는 것일 수 있다. 상기 암 오가노이드 및 TIL이 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 약물 처리 전임에도 불구하고 암 오가노이드의 성장이 현저히 증가하여 약물에 반응하지 않거나, 암 오가노이드가 성장하지 않아 약물의 항암 효과를 확인할 수 없는 문제가 발생한다. 또한, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 약물의 효능이 고르게 나타나지 않는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드 및 TIL을 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
또한, 상기 항암제 스크리닝 시스템은 상기 면역세포가 세포독성 T 세포 및 조절 T 세포인 경우, 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 조절 T 세포를 1 : 3 : 0.5 내지 3의 세포수 비율로 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 1 : 3 : 1 내지 3의 세포수 비율, 더욱 구체적으로 1 : 3 : 3의 세포수 비율로 포함하는 것일 수 있다. 상기 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 조절 T 세포가 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 약물에 의한 암 오가노이드의 사멸률이 현저히 낮아 약물의 항암 효과를 확인할 수 없는 문제가 발생한다. 또한, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 약물의 효능이 고르게 나타나지 않는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 조절 T 세포를 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
또한, 상기 항암제 스크리닝 시스템은 상기 면역세포가 세포독성 T 세포 및 수지상 세포인 경우, 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 수지상 세포를 1 : 3 : 0.5 내지 5의 세포수 비율로 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 1 : 3 : 0.5 내지 1의 세포수 비율로 혼합하여 포함하는 것일 수 있다. 상기 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 수지상 세포가 상기 비율로 혼합되어 공배양되는 경우에만 생체 내 종양 미세 환경을 모사할 수 있다. 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 암 오가노이드가 적절히 성장하지 않거나, 약물에 의한 암 오가노이드의 사멸률이 현저히 낮아 약물의 항암 효과를 확인할 수 없는 문제가 발생한다. 또한, 상기 비율 이외의 비율로 공배양되는 경우에는 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 약물의 효능이 고르게 나타나지 않는 문제가 발생하므로, 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 수지상 세포를 전술한 바와 같은 세포수 비율로 혼합하는 것이 중요하다.
본 발명의 항암제 스크리닝 시스템은 종양 미세 환경을 모사한 것으로, 생체 내 종양 미세 환경을 구성하는 종양으로서 암 오가노이드, 및 면역세포로서 세포독성 T 세포, M1 마크로파지, M2 마크로파지, TIL, 조절 T 세포 및 수지상 세포를 포함한다.
본 발명에 따른 암 오가노이드 및 면역세포의 혼합물은 특정 비율로 혼합되어 암세포가 생체 내에서 존재하고 있는 형태인 종양 미세 환경을 유사하게 재현할 수 있다. 따라서, 이를 활용하는 경우 약물이 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있다.
도 1a는 세포독성 T 세포(Cytotoxic T cell, 이하 'CD8+ T 세포') 및 M1 마크로파지(classically activated macrophage, 이하 'M1') 비율에 따른 암 오가노이드의 사멸 정도를 보여주는 그래프이다.
도 1b는 세포독성 T 세포 및 M1 마크로파지 비율에 따른 M1의 사멸 정도를 보여주는 그래프이다.
도 2는 CD8+ T 세포 및 M1 비율에 따른 암 오가노이드의 성장 저해 정도를 보여주는 그래프로서, 0시간, 24시간, 48시간 및 72시간 동안 공배양한 결과에 관한 것이다.
도 3은 항-CD47 항체 처리에 의한 대식작용(Phagocytosis) 활성화 정도를 보여주는 그래프이다.
도 4는 CD8+ T 세포 비율 증가에 따른 암 오가노이드 사멸에 대한 약물의 전반적인 효능(overall efficacy)을 보여주는 그래프이다.
도 5는 M1 비율 증가에 따른 암 오가노이드 사멸에 대한 약물의 전반적인 효능(overall efficacy)을 보여주는 그래프이다.
도 6은 암 오가노이드 사멸에 대한 약물의 전반적인 효능(overall efficacy)을 보여주는 그래프이다.
도 7a는 암 오가노이드, M1 및 M2 마크로파지(alternatively activated macrophage, 이하 'M2')의 공배양 비율에 따른 암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프로서, M1이 포함되지 않은 조건("1:3:0") 또는 M2가 포함되지 않은 조건("1:0:5")에서 공배양한 결과에 관한 것이다.
도 7b는 암 오가노이드, M1 및 M2의 공배양 비율에 따른 암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프로서, 암 오가노이드 및 M1이 1:0.5의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다.
도 7c는 암 오가노이드, M1 및 M2의 공배양 비율에 따른 암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프로서, 암 오가노이드 및 M1이 1:1의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다.
도 7d는 암 오가노이드, M1 및 M2의 공배양 비율에 따른 암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프로서, 암 오가노이드 및 M1이 1:3의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다.
도 8a는 암 오가노이드, M1 및 M2의 공배양 비율에 따른 암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프로서, M1이 포함되지 않은 조건("1:3:0") 또는 M2가 포함되지 않은 조건("1:0:5")에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'CD47'는 예시 약물로서 항-CD47 항체를 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 8b는 암 오가노이드, M1 및 M2의 공배양 비율에 따른 암 오가노이드의 사멸률을 보여주는 그래프로서, M1이 포함되지 않은 조건("1:3:0") 또는 M2가 포함되지 않은 조건("1:0:5")에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'CD47'는 예시 약물로서 항-CD47 항체를 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 9a는 암 오가노이드, M1 및 M2의 공배양 비율에 따른 암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프로서, 암 오가노이드 및 M1이 1:0.5의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'CD47'는 예시 약물로서 항-CD47 항체를 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 9b는 암 오가노이드, M1 및 M2의 공배양 비율에 따른 암 오가노이드의 사멸률을 보여주는 그래프로서, 암 오가노이드 및 M1이 1:0.5의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'CD47'는 예시 약물로서 항-CD47 항체를 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 10a는 암 오가노이드, M1 및 M2의 공배양 비율에 따른 암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프로서, 암 오가노이드 및 M1이 1:1의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'CD47'는 예시 약물로서 항-CD47 항체를 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 10b는 암 오가노이드, M1 및 M2의 공배양 비율에 따른 암 오가노이드의 사멸률을 보여주는 그래프로서, 암 오가노이드 및 M1이 1:1의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'CD47'는 예시 약물로서 항-CD47 항체를 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 11a는 암 오가노이드, M1 및 M2의 공배양 비율에 따른 암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프로서, 암 오가노이드 및 M1이 1:3의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'CD47'는 예시 약물로서 항-CD47 항체를 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 11b는 암 오가노이드, M1 및 M2의 공배양 비율에 따른 암 오가노이드의 사멸률을 보여주는 그래프로서, 암 오가노이드 및 M1이 1:3의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'CD47'는 예시 약물로서 항-CD47 항체를 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 12는 종양-침투 림프구(Tumor-infiltrating lymphocyte, 이하 'TIL') 단독배양; 또는 TIL 및 암 오가노이드의 공배양을 통해 제조된 TIL에 대하여 FACS 분석을 수행한 결과에 관한 것으로서, 전체 TIL에 대하여 세포 표면에 CD8 단백질을 발현하는 TIL의 비율을 보여준다.
도 13a는 폐암 오가노이드와 TIL의 공배양 비율에 따른 폐암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 약물 처리군을 의미하며 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리하였다. 성장률은 약물 처리 직후(0h), 24시간 후(24h), 48시간 후(48h), 72시간 후(72h)에 각각 측정하였다.
도 13b는 폐암 오가노이드와 TIL의 공배양 비율에 따른 폐암 오가노이드의 사멸률을 보여주는 그래프이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 약물 처리군을 의미하며 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리하였다. 약물 처리 직후(0h), 24시간 후(24h), 48시간 후(48h), 72시간 후(72h)에 각각 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 사멸률을 분석하였다.
도 14a는 대장암 오가노이드와 TIL의 공배양 비율에 따른 대장암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 약물 처리군을 의미하며 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리하였다. 성장률은 약물 처리 직후(0h), 24시간 후(24h), 48시간 후(48h), 72시간 후(72h)에 각각 측정하였다.
도 14b는 대장암 오가노이드와 TIL의 공배양 비율에 따른 대장암 오가노이드의 사멸률을 보여주는 그래프이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 약물 처리군을 의미하며 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리하였다. 약물 처리 직후(0h), 24시간 후(24h), 48시간 후(48h), 72시간 후(72h)에 각각 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 사멸률을 분석하였다.
도 15는 대장암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 조절 T 세포(regulatory T cell, 이하 'Treg')의 각 공배양 비율에 따른 대장암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프이다. 대표적인 예로서, 도면에 기재된 "1:3:0"은 대장암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 Treg가 1:3:0의 세포수 비율로 혼합된 것을 의미한다. 상기 성장률은 공배양 시작 직후(0h), 24시간 후(24h), 48시간 후(48h), 72시간 후(72h)에 각각 분석하였다.
도 16은 페암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 Treg의 각 공배양 비율에 따른 폐암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프이다. 대표적인 예로서, 도면에 기재된 "1:3:0"은 폐암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 Treg가 1:3:0의 세포수 비율로 혼합된 것을 의미한다. 상기 성장률은 공배양 시작 직후(0h), 24시간 후(24h), 48시간 후(48h), 72시간 후(72h)에 각각 분석하였다.
도 17은 대장암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 Treg의 공배양 비율에 따른 대장암 오가노이드의 사멸률을 보여주는 그래프로서, Treg이 포함되지 않은 조건("1:3:0") 또는 CD8+ T 세포가 포함되지 않은 조건("1:0:3")에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 약물 처리군을 의미하며, 'TIGIT'은 예시 약물로서 항-TIGIT 항체를 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 18은 대장암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 Treg의 공배양 비율에 따른 대장암 오가노이드의 사멸률을 보여주는 그래프로서, 대장암 오가노이드 및 CD8+ T 세포가 1:1의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 약물 처리군을 의미하며, 'TIGIT'은 예시 약물로서 항-TIGIT 항체를 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 19는 대장암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 Treg의 공배양 비율에 따른 대장암 오가노이드의 사멸률을 보여주는 그래프로서, 대장암 오가노이드 및 CD8+ T 세포가 1:3의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 약물 처리군을 의미하며, 'TIGIT'은 예시 약물로서 항-TIGIT 항체를 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 20은 폐암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 Treg의 공배양 비율에 따른 폐암 오가노이드의 사멸률을 보여주는 그래프로서, Treg이 포함되지 않은 조건("1:3:0") 또는 CD8+ T 세포가 포함되지 않은 조건("1:0:3")에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 약물 처리군을 의미하며, 'TIGIT'은 예시 약물로서 항-TIGIT 항체를 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 21은 폐암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 Treg의 공배양 비율에 따른 폐암 오가노이드의 사멸률을 보여주는 그래프로서, 폐암 오가노이드 및 CD8+ T 세포가 1:1의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 약물 처리군을 의미하며, 'TIGIT'은 예시 약물로서 항-TIGIT 항체를 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 22는 폐암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 Treg의 공배양 비율에 따른 폐암 오가노이드의 사멸률을 보여주는 그래프로서, 폐암 오가노이드 및 CD8+ T 세포가 1:3의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 약물 처리군을 의미하며, 'TIGIT'은 예시 약물로서 항-TIGIT 항체를 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 23은 대장암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 수지상 세포(regulatory T cell, 이하 'DC')의 공배양 비율에 따른 대장암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프로서, 대장암 오가노이드 및 CD8+ T 세포가 1:0.5의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 대표적인 예로서, 도면에 기재된 "1:0.5:0.5"는 대장암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC가 1:0.5:0.5의 세포수 비율로 혼합된 것을 의미한다. 상기 성장률은 공배양 시작 직후(0h), 24시간 후(24h), 48시간 후(48h), 72시간 후(72h)에 각각 분석하였다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 약물 처리군을 의미한다.
도 24는 대장암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC의 공배양 비율에 따른 대장암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프로서, 대장암 오가노이드 및 CD8+ T 세포가 1:1의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 대표적인 예로서, 도면에 기재된 "1:1:0.5"는 대장암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC가 1:1:0.5의 세포수 비율로 혼합된 것을 의미한다. 상기 성장률은 공배양 시작 직후(0h), 24시간 후(24h), 48시간 후(48h), 72시간 후(72h)에 각각 분석하였다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 약물 처리군을 의미한다.
도 25는 대장암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC의 공배양 비율에 따른 대장암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프로서, 대장암 오가노이드 및 CD8+ T 세포가 1:3의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 대표적인 예로서, 도면에 기재된 "1:3:0.5"는 대장암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC가 1:3:0.5의 세포수 비율로 혼합된 것을 의미한다. 상기 성장률은 공배양 시작 직후(0h), 24시간 후(24h), 48시간 후(48h), 72시간 후(72h)에 각각 분석하였다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 약물 처리군을 의미한다.
도 26는 대장암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC의 공배양 비율에 따른 대장암 오가노이드의 사멸률을 보여주는 그래프로서, 대장암 오가노이드 및 CD8+ T 세포가 1:0.5의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 27은 대장암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC의 공배양 비율에 따른 대장암 오가노이드의 사멸률을 보여주는 그래프로서, 대장암 오가노이드 및 CD8+ T 세포가 1:1의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 28은 대장암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC의 공배양 비율에 따른 대장암 오가노이드의 사멸률을 보여주는 그래프로서, 대장암 오가노이드 및 CD8+ T 세포가 1:3의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 29는 폐암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC의 공배양 비율에 따른 폐암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프로서, 폐암 오가노이드 및 CD8+ T 세포가 1:0.5의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 대표적인 예로서, 도면에 기재된 "1:0.5:0.5"는 폐암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC가 1:0.5:0.5의 세포수 비율로 혼합된 것을 의미한다. 상기 성장률은 공배양 시작 직후(0h), 24시간 후(24h), 48시간 후(48h), 72시간 후(72h)에 각각 분석하였다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 약물 처리군을 의미한다.
도 30은 폐암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC의 공배양 비율에 따른 폐암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프로서, 폐암 오가노이드 및 CD8+ T 세포가 1:1의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 대표적인 예로서, 도면에 기재된 "1:1:0.5"는 폐암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC가 1:1:0.5의 세포수 비율로 혼합된 것을 의미한다. 상기 성장률은 공배양 시작 직후(0h), 24시간 후(24h), 48시간 후(48h), 72시간 후(72h)에 각각 분석하였다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 약물 처리군을 의미한다.
도 31은 폐암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC의 공배양 비율에 따른 폐암 오가노이드의 성장률을 보여주는 그래프로서, 폐암 오가노이드 및 CD8+ T 세포가 1:3의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 대표적인 예로서, 도면에 기재된 "1:3:0.5"는 폐암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC가 1:3:0.5의 세포수 비율로 혼합된 것을 의미한다. 상기 성장률은 공배양 시작 직후(0h), 24시간 후(24h), 48시간 후(48h), 72시간 후(72h)에 각각 분석하였다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 약물 처리군을 의미한다.
도 32는 폐암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC의 공배양 비율에 따른 폐암 오가노이드의 사멸률을 보여주는 그래프로서, 폐암 오가노이드 및 CD8+ T 세포가 1:0.5의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 33은 폐암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC의 공배양 비율에 따른 폐암 오가노이드의 사멸률을 보여주는 그래프로서, 폐암 오가노이드 및 CD8+ T 세포가 1:1의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
도 34는 폐암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC의 공배양 비율에 따른 폐암 오가노이드의 사멸률을 보여주는 그래프로서, 폐암 오가노이드 및 CD8+ T 세포가 1:3의 세포수 비율로 고정되어 혼합된 조건에서 공배양한 결과에 관한 것이다. 'Non'은 약물 미처리군을 의미하고, 'Atez'는 예시 약물로서 아테졸리주맙을 처리한 약물 처리군을 의미한다. 상기 사멸률은 약물 처리 72시간 후(72h)에 성장률을 측정한 결과를 바탕으로 분석하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.
실시예 1. 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 M1 마크로파지를 포함하는 항암제 효능 평가 및 스크리닝 시스템
암이 생체 내 존재하고 있는 환경을 유사하게 재현함으로써, 약물이 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있는 인비트로(in vitro) 스크리닝 시스템을 확립하고자 하였다.
구체적으로, 암 오가노이드, 세포독성 T 세포(Cytotoxic T cell, 이하 'CD8+ T 세포') 및 M1 마크로파지(classically activated macrophage, 이하 'M1')가 공존하는 공배양(co-culture) 시스템을 이용하였고, 공배양 시 아래의 3개 조건을 충족시키는 각 오가노이드 또는 세포의 비율을 확인하였다:
(1) 암 오가노이드 및 M1 사멸이 낮은 조건 (상기 오가노이드, CD8+ T 세포 및 M1의 공배양 시, 약물 미처리군에서 암 오가노이드 또는 M1의 사멸이 높게 관찰되는 경우에는 약물의 효능을 정확하게 분석할 수 없음)
(2) 대식작용(Phagocytosis)이 활성화되는 조건
(3) 서로 다른 MoA (Mode of Action) 특성을 나타내는 약물의 효능을 평가할 수 있는 조건.
또한, 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 M1의 비율에서, 오가노이드 또는 세포의 수가 5.0×103개인 것을 1로 설정하였으며, 비율에 따른 오가노이드 또는 세포의 구체적인 수는 아래와 같다:
0.2 = 1.0×103개의 오가노이드 또는 세포
0.5 = 2.5×103개의 오가노이드 또는 세포
1 = 5.0×103개의 오가노이드 또는 세포
3 = 15.0×103개의 오가노이드 또는 세포
5 = 25.0×103개의 오가노이드 또는 세포
10 = 50.0×103개의 오가노이드 또는 세포
전술한 바와 같은 조건을 모두 충족하는 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 M1의 비율은 아래 실시예 1.1 내지 1.3을 통해 확인하였다.
실시예 1.1. 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 M1 마크로파지가 공존하는 조건 확립
암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 M1으로 구성된 세포를 공배양하는 경우에서, 1종류의 세포라도 사멸된다면 약물의 효능을 정확하게 평가하기 어려운 문제점이 발생한다. 따라서, 본 실시예 1.1에서는 약물을 처리하지 않은 상태에서 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 M1을 공배양하였을 때 상기 세포가 모두 생존하는 조건을 확립하고자 하였다.
구체적으로, 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 M1은 대장암 환자 유래의 것을 사용하였다. 또한, 아래 표 1에 나타낸 바와 같이, 암 오가노이드를 1의 비율로 고정한 후, CD8+ T 세포는 0.1 내지 10의 비율, 및 M1은 0.1 내지 5의 비율로 설정하여 2시간 동안 공배양하였고, 각 비율에 따른 암 오가노이드 또는 세포의 사멸 정도를 분석하였다. 이때, 분석은 유세포 분석(Flow-cytometer)으로 수행하였으며, 암 오가노이드의 마커는 CFSE(+), M1 마크로파지의 마커는 CD11B(+)를 사용하였다.
Figure PCTKR2022013919-appb-img-000001
그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 그룹 11 및 12의 CD8+ T 세포 비율이 높은 조건(5 이상)과 그룹 9의 M1 비율이 높은 조건(5이상)에서 암 오가노이드의 높은 사멸이 관찰되었다. 또한, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 그룹 11 및 12의 CD8+ T 세포의 비율이 높은 조건(5 이상)에서도, M1 마크로파지의 높은 사멸이 발생하는 것을 확인하였다.
이를 종합하면, 약물을 처리하지 않은 상태에서는 그룹 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 10의 조건이 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 M1이 균형을 이루며 생존할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 암 오가노이드의 비율이 1일 때, CD8+ T 세포의 비율을 3 이내 및 M1의 비율을 3 이내로 설정하는 것이 항암제의 스크리닝 시스템에 가장 최적화된 비율임을 알 수 있었다.
실시예 1.2. 공배양 시간에 따른 암 오가노이드 성장 저해 및 사멸 정도 확인
상기 실시예 1.1에서 확인한 바와 같은, 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 M1으로 구성된 스크리닝 시스템에서는, 암 오가노이드의 성장 저해 및 사멸이 관찰되지되지 않는 세포의 구성비율을 확인하였다. 이에, 공배양 시간을 다르게 설정한 후(24시간, 48시간, 72시간), 암 오가노이드의 성장 정도를 분석하였다.
구체적으로, 아래 표 2에 나타낸 바와 같이, 암 오가노이드를 1의 비율로 고정한 후, CD8+ T 세포는 0.2 내지 3의 비율, 및 M1은 0.1 내지 3의 비율로 설정하여 공배양하였고, 각 비율에 따른 대식작용을 분석하였다. 이때, 상기 CD8+ T 세포 및 M1의 비율은 상기 실시예 1.1에서 적용한 비율보다 더 좁은 범위로 테스트하였고, 분석은 HCS (High-Content screening)로 수행하였으며, 초기 오가노이드의 면적을 100%으로 설정하고, 반응 시간에 따른 면적의 변화를 비율로 나타내었다.
Figure PCTKR2022013919-appb-img-000002
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 세포 비율에 따라 성장 정도에 차이는 있지만, 상기 비율에서는 72시간 이상 공배양하더라도 암 오가노이드의 성장이 저해되는 영향은 나타나지 않음을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 M1을 1 : 0.2 내지 3 : 0.1 내지 3의 비율로 설정하는 것이 항암제의 스크리닝 시스템에 가장 최적화된 비율임을 알 수 있었다.
실시예 1.3. 대식작용(Phagocytosis)이 활성화되는 조건 확립
상기 실시예 1.1에서 확인한 바와 같은, 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 M1으로 구성된 스크리닝 시스템이 M1을 타겟으로 하는 약물의 효능을 평가하는데 사용될 수 있는지 확인하기 위하여, 상기 시스템에 항-CD47 항체를 처리한 후 대식작용에 따른 암 오가노이드의 사멸 정도를 확인하였다.
구체적으로, 암 오가노이드 및 CD8+ T 세포는 대장암 환자 유래의 것을 사용하였고, M1은 CHA15 세포주를 사용하였다.
또한, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 암 오가노이드를 1의 비율로 고정한 후, CD8+ T 세포는 0.2 내지 3의 비율, 및 M1은 0.1 내지 3의 비율로 설정하여 공배양하였고, 각 비율에 따른 대식작용을 분석하였다. 이때, 상기 CD8+ T 세포 및 M1의 비율은 상기 실시예 1.1에서 적용한 비율보다 더 좁은 범위로 테스트하였고, 분석은 유세포 분석(Flow-cytometer)으로 수행하였으며, 암 오가노이드의 마커는 EpCAM(+), M1의 마커는 CD11B(+)를 사용하였다. 대식작용의 경우, 암 오가노이드 마커와 M1 마커가 중복으로 나타나는(double positive) 비율로 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, M1이 존재하지 않는 그룹 2를 제외한 모든 조건에서 대식작용이 관찰되었고, 특히 그룹 3, 4, 6 및 7에서 M1에 결합하는 항-CD47 항체를 처리하는 경우에는 미처리군에 비하여 대식작용이 활성화됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 M1을 1 : 0.2 내지 0.5 : 0.1 내지 3의 비율로 설정하는 것이 항암제의 스크리닝 시스템에 가장 최적화된 비율임을 알 수 있었다.
실시예 1.4. 서로 다른 MoA (Mode of Action) 특성을 나타내는 약물의 효능을 평가할 수 있는 조건 확립
상기 실시예 1.1에서 확인한 바와 같은, 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 M1으로 구성된 스크리닝 시스템이 약물의 효능을 평가하는데 사용될 수 있는지 확인하기 위하여, 상기 시스템에 기존에 면역항암제로 사용되고 있던 항-PD-L1 항체인 아테졸리주맙(Atezolizumab), 항-CD47 항체, 및 이들의 병용을 처리한 후 대식작용에 의한 암 오가노이드의 사멸 정도를 확인하였다.
아테졸리주맙은 암세포의 PD-L1과 결합하여 PD-1/PD-L1 기작을 막아 CD8+ T 세포를 활성화시키고, 항-CD47 항체는 M1의 CD47과 결합하여 SIRP-a/CD47 기작을 막아 마크로파지를 활성화시킨다. 이에, 본 발명의 스크리닝 시스템이 서로 다른 메커니즘으로 작용하는 두 종류의 약물 모두에 대해 효능을 평가할 수 있는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, 암 오가노이드 및 CD8+ T 세포는 대장암 환자 유래의 것을 사용하였고, M1은 CHA15 세포주를 사용하였다.
또한, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 암 오가노이드를 1의 비율로 고정한 후, CD8+ T 세포는 0 내지 3의 비율, 및 M1은 0 내지 3의 비율로 설정하여 공배양하였고, 상기 공배양물에 항-PD-L1 항체인 아테졸리주맙(Atezolizumab, Selleck, #A2004) 10 nM 및/또는 항-CD47 항체 10 nM를 처리한 후, 각 비율에 따른 암 오가노이드 또는 M1의 사멸 정도를 분석하였다. 이때, 상기 CD8+ T 세포 및 M1의 비율은 상기 실시예 1.1에서 적용한 비율보다 더 좁은 범위로 테스트하였고, 분석은 약물 처리 후 72시간 동안의 오가노이드 면적의 변화를 HCS (High-Content Screening) 장비를 이용하여 분석하였다. 이후, 전반적인 효능(Overall efficacy)을 약물 처리 72시간 후 비처리군의 오가노이드 면적에 대비하여, 약물 처리군의 면적 변화를 산출함으로써 약물의 효능성을 평가하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 암 오가노이드 및 M1의 비율이 1 및 1로 고정되고, CD8+ T 세포의 비율이 달라지는 그룹 1, 3, 6 및 8의 결과에서는, CD8+ T 세포의 비율이 높아질수록 전반적인 효능이 증가하며, 특히 아테졸리주맙 처리군에서 암 오가노이드의 높은 성장 저해 및 사멸 효과가 나타남을 확인하였다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 암 오가노이드 및 CD8+ T 세포의 비율이 1 및 0.5로 고정되고, M1의 비율이 달라지는 그룹 2, 4, 5, 6 및 7의 결과에서는, M1의 비율이 높아질수록 전반적인 효능이 증가하며, 특히 항-CD47 항체 처리군에서 암 오가노이드의 높은 성장 저해 및 사멸효과가 나타남을 확인하였다.
다만, 도 6에 나타낸 바와 같이, 아테졸리주맙 단독, 항-CD47 항체 단독 및 이들의 병용에 대한 암 오가노이드의 사멸 효과가 유사함과 동시에 높게 나타나는 그룹은 그룹 5, 6 및 7임을 확인하였다.
따라서, 상기 실시예 1.1 내지 1.3의 결과를 종합하면, 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 M1을 공배양하였을 때, 암 오가노이드의 성장을 저해하지 않으면서, 암 오가노이드 및 M1의 사멸을 야기하지 않고, 서로 다른 약물이 단독으로 또는 병용으로 처리되었을 때 전반적인 효능을 유사하게 나타낼 수 있는 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 M1의 비율은 그룹 5의 1 : 0.5 : 0.5, 그룹 6의 1 : 0.5 : 1, 및 그룹 7의 1 : 0.5 : 3임을 확인하였다.
실시예 2. 암 오가노이드, M1 마크로파지 및 M2 마크로파지를 포함하는 항암제 효능 평가 및 스크리닝 시스템
암이 생체 내 존재하고 있는 환경을 유사하게 재현함으로써, 약물이 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있는 인비트로(in vitro) 효능 평가 및 스크리닝 시스템을 확립하고자 하였다.
구체적으로, 암 오가노이드, M1 마크로파지(classically activated macrophage, 이하 'M1') 및 M2 마크로파지(alternatively activated macrophage, 이하 'M2')가 공존하는 공배양(co-culture) 시스템을 확립하기 위하여, 공배양 시 (1) 암 오가노이드가 적절히 성장하고, (2) 약물의 효능은 높게 관찰되는 조건을 충족시키는 이들의 혼합 비율을 도출하였다. 아래 표 3에 나타낸 바와 같이, 암 오가노이드를 1의 비율로 고정한 후, M1을 0.5 내지 3의 비율로 설정하였고, M2를 0.5 내지 5의 비율로 설정하였다. 이때, 각 오가노이드 또는 세포의 수가 5.0×103개인 것을 1로 설정하였다.
Figure PCTKR2022013919-appb-img-000003
암 오가노이드는 환자에서 얻은 폐암 조직을 단일 세포(single cell)로 분리하여 이를 ECM(extracellular matrix)과 함께 배양함으로써 3D 구조를 갖도록 제조하였다. 형성된 암 오가노이드는 병리 분석을 통해 종양임을 확인하였고, Tryp-LE 사용을 통해 단일 세포로 분리한 후 사용하였다. M1 및 M2는 iPSC로부터 분화된 것을 사용하였고, 당업계에 알려진 일반적인 방법을 사용하여 H9 세포주로부터 M1 또는 M2로 분화시켰다.
실시예 2.1. 암 오가노이드가 적절히 성장하는 조건
암 오가노이드가 면역세포와 공배양되는 경우에도 적절히 성장할 수 있도록 하는, 암 오가노이드, M1 및 M2의 혼합 비율을 도출하였다.
구체적으로, 상기 표 3에 따른 혼합 비율로 공배양한 후, 공배양 시작 직후(Oh), 24시간 후(24h), 48시간 후(48h), 72시간 후(72h)에 암 오가노이드의 면적을 각각 측정하여 다음과 같은 수식으로 성장률을 분석하였다.
*암 오가노이드 성장률 (%) = (공배양 24, 48 또는 72시간 후의 암 오가노이드 면적)/(공배양 시작 직후의 암 오가노이드 면적) × 100
그 결과, 도 7a 내지 7c에서 볼 수 있듯이, 모든 혼합 비율에서 암 오가노이드의 성장은 저해되지 않았고, M2의 비율이 높아질수록 암 오가노이드의 성장률이 증가하는 경향을 나타내었다.
실시예 2.2. 약물의 효능이 높게 나타나는 조건
항암제의 효능이 높게 나타나도록 하는, 암 오가노이드, M1 및 M2의 혼합 비율을 도출하였다.
구체적으로, 상기 표 3의 혼합 비율에 따른 암 오가노이드, M1 및 M2의 공배양물에 대하여 약물을 처리하지 않은 것을 대조군(이하 '약물 미처리군')으로 설정하였고, 실험군(이하 '약물 처리군')으로는 M1을 타겟하는 항-CD47 항체를 예시 약물로서 처리한 것을 설정하였다. 이들을 72시간 동안 공배양한 후, 약물 처리 72시간 후(72h)에 각각 성장률을 측정하고, 측정한 성장률을 통해 아래의 방법으로 사멸률을 분석하였다.
암 오가노이드 사멸률 (%) = [1 - (약물 처리군의 암 오가노이드 성장률*)/(약물 미처리군의 암 오가노이드 성장률**)] × 100
*약물 처리군의 암 오가노이드 성장률 (%) = (약물 처리 72시간 후의 암 오가노이드 면적)/(공배양 시작 직후(0h)의 암 오가노이드 면적) × 100
**약물 미처리군의 암 오가노이드 성장률 (%) = (약물 미처리 72시간 후의 암 오가노이드 면적)/(공배양 시작 직후(0h)의 암 오가노이드 면적) × 100
그 결과, 도 8a 및 8b에서 볼 수 있듯이, 암 오가노이드, M1 및 M2 중에서, M2를 제외하고 암 오가노이드 및 M1만 1 : 3의 혼합 비율로 공배양되는 경우, 항-CD47 항체에 의한 암 오가노이드의 사멸률은 약 25%로서 높게 나타났다. 반면, 암 오가노이드, M1 및 M2 중에서, M1을 제외하고 암 오가노이드 및 M2만 1 : 5의 혼합 비율로 공배양되는 경우, 항-CD47 항체에 의한 암 오가노이드의 사멸률은 약 5% 정도로 현저히 낮은 수준으로 나타났다.
한편, 도 9a 및 9b에서 볼 수 있듯이, 암 오가노이드 및 M1이 1 : 0.5의 비율로 공배양되는 경우, M2의 비율 증가에 따른 암 오가노이드의 사멸률은 혼합 비율 간에 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 항-CD47 항체를 처리한 약물 처리군 모두에서 암 오가노이드의 사멸률은 최대 약 10%에 불과하여, 약물의 효능이 높게 나타나지는 않음을 확인하였다.
반면, 도 10a 및 10b에서 볼 수 있듯이, 암 오가노이드 및 M1이 1 : 1의 비율로 공배양되는 경우, M2가 0.5 내지 5의 비율로 혼합된 모든 경우에서 약물에 의한 암 오가노이드의 사멸률이 증가하여 최대 약 23%의 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.
아울러, 도 11a 및 11b에서 볼 수 있듯이, 암 오가노이드 및 M1이 1 : 3의 비율로 공배양되는 경우, M2가 0.5 내지 5의 비율로 혼합된 모든 경우에서 약물에 의한 암 오가노이드의 사멸률이 증가하여 최대 약 25%의 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.
상기 결과는, 암 오가노이드, M1 및 M2의 공배양 비율이 1 : 1 내지 3 : 0.5 내지 5인 것이 항암제 효능 평가 또는 스크리닝 시스템에 가장 최적화된 비율이며, 본 시스템은 약물 작용에 마크로파지가 관여하는 항암제의 효능 평가 또는 스크리닝에 적합함을 시사한다.
실시예 3. 암 오가노이드 및 TIL을 포함하는 항암제 효능 평가 및 스크리닝 시스템
암이 생체 내 존재하고 있는 환경을 유사하게 재현함으로써, 약물이 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있는 인비트로(in vitro) 효능 평가 및 스크리닝 시스템을 확립하고자 하였다.
구체적으로, 암 오가노이드 및 종양-침투 림프구(Tumor-infiltrating lymphocyte, 이하 'TIL')가 공존하는 공배양(co-culture) 시스템을 이용하였다.
실시예 3.1. TIL의 수득
TIL은 종양 조직에 침윤하거나 이를 둘러싸는 세포로서, 암세포를 인식하고 사멸시키는 역할을 수행한다. TIL에는 다양한 종류의 면역세포가 포함되어 있으나, 그 중에서도 종양을 공격할 수 있는 CD8+ T 세포가 대부분을 차지한다. 또한, TIL은 종양 조직에서 분리되기 때문에 여기에 포함되는 CD8+ T 세포는 이미 활성화되어 있으며 암세포를 인식 및 공격할 수 있는 상태인 것이 특징이다.
즉, 본 발명에 따른 항암제 효능 평가 및 스크리닝 시스템에는 조직에서 분리한 TIL을 사용함으로써 CD8+ T 세포의 활성화 과정을 생략하였다. 또한, 활성화된 CD8+ T 세포가 더욱 오래 유지되는 조건을 도출하였고, 이를 본 시스템에 적용하였다.
구체적으로, 종양 조직을 잘게 자른 후 분리되어 나오는 면역세포 및 조직을 모아서 CD8+ T 세포 배양액에 배양함으로써 면역세포만 성장하도록 하여 TIL을 수득하였다. 이후, TIL을 단독배양하거나, 또는 TIL과 암 오가노이드를 20 : 1의 세포수 비율(TIL : 암 오가노이드 = 1×105개 : 5.0×103개)로 혼합하여 공배양하였고, 각 과정을 거친 TIL을 FACS를 통해 분석하였다. 이때, 마커로는 CD56 및 CD8을 사용하였으며, CD56은 TIL에 존재하는 전체 면역세포를 분석하는 용도, CD8은 TIL에 존재하는 전체 면역세포 중 CD8+ T 세포를 분석하는 용도로 사용하였다. 이러한 FACS 분석 결과에서는 CD8+의 비율이 20% 이상인 경우 해당 면역세포를 약물의 효능 평가에 사용이 가능하다고 간주한다. 하기 표 4는 전체 TIL에 존재하는 CD8+ T 세포의 비율에 관한 것이다.
Figure PCTKR2022013919-appb-img-000004
그 결과, 도 12 및 상기 표 4에서 볼 수 있듯이, 배양 시작 1일차부터 7일차까지는 단독배양과 공배양의 결과에 유의한 차이가 나타나지 않았다. 그러나, 배양 시작 14일차부터는 상당한 차이를 나타내었는데, 단독배양 방법의 경우 CD8+ T 세포의 비율이 약 23.9%로서 7일차(약 90.3%)에 비하여 절반 이상으로 급격히 감소한 반면, 공배양 방법의 경우 CD8+ T 세포의 비율은 전체 세포 비율 중에서 약 97.1%로서 7일차(약 91.4%)에 비하여 오히려 증가하였다.
다만, 배양 21일차부터는 공배양 방법의 경우에도 CD8+ T 세포의 비율이 약 37.9%로서 14일차(약 97.1%)에 비하여 절반 이상으로 급격히 감소하였다.
상기 결과는, 암 오가노이드와의 공배양을 통해 수득한 TIL은 활성화된 CD8+ T 세포를 장기간 유지하고 있으므로, 이를 사용할 경우 정확도가 향상되고, 재현성이 높은 더욱 우수한 품질의 항암제 효능 평가 및 스크리닝 시스템을 확립할 수 있음을 시사한다.
실시예 3.2. 암 오가노이드 및 TIL의 공배양 비율
암 오가노이드 및 TIL의 공배양 시스템을 활용한 약물 효능 평가 및 스크리닝 시스템을 확립하기 위하여, 암 오가노이드 및 TIL의 최적 혼합 비율을 도출하였다.
구체적으로, 공배양 시 (1) 암 오가노이드가 적절히 성장하고, (2) 약물의 효능은 높게 관찰되는 조건을 충족시키는 암 오가노이드 및 TIL의 비율을 확인하였다. 암 오가노이드는 폐암 또는 대장암 환자의 종양조직에서 분리한 암세포를 이용하여 제조한 것을 사용하였고, TIL은 상기 실시예 1.1에 따라 암 오가노이드와 14일간 공배양하여 수득한 것을 사용하였다.
아래 표 5에 나타낸 바와 같이, 암 오가노이드를 1의 비율로 고정한 후, TIL을 0.5 내지 3의 비율로 설정하였고, 오가노이드 또는 TIL의 수가 5.0×103개인 것을 1로 설정하였다.
Figure PCTKR2022013919-appb-img-000005
또한, 상기 비율에 따른 암 오가노이드 및 TIL의 공배양물에 대하여 약물을 처리하지 않은 것을 대조군(이하 '약물 미처리군')으로 설정하였고, 실험군(이하 '약물 처리군')으로는 현재 암 치료제로 시판되어 사용되고 있는 아테졸리주맙(atezolizumab)을 예시 약물로서 처리한 것을 설정하였다. 이들을 72시간 동안 공배양한 후, 약물 처리 직후(0h), 24시간 후(24h), 48시간 후(48h), 72시간 후(72h)에 각각 성장률을 측정하고, 측정한 성장률을 통해 아래의 방법으로 사멸률을 분석하였다. 암 오가노이드 사멸률 (%) = [1 - (약물 처리군의 암 오가노이드 성장률*)/(약물 미처리군의 암 오가노이드 성장률**)] × 100
*약물 처리군의 암 오가노이드 성장률 (%) = (약물 처리 24, 48 또는 72시간 후의 암 오가노이드 면적)/(0시간의 암 오가노이드 면적) × 100
**약물 미처리군의 암 오가노이드 성장률 (%) = (약물 미처리 24, 48 또는 72시간 후의 암 오가노이드 면적)/(0시간의 암 오가노이드 면적) × 100
그 결과, 도 13a 및 13b에서 볼 수 있듯이, 폐암 오가노이드 및 TIL이 1 : 0.5의 비율로 공배양되는 경우, 폐암 오가노이드는 약물에 대하여 반응하지 않았으며, 이에 따라 대조군과 실험군에서 폐암 오가노이드의 성장률 및 사멸률이 유사하게 나타났다. 특히, 약물 처리군에서 폐암 오가노이드의 사멸률은 약 5%에 불과하여, 약물의 효능을 정확하게 판단할 수 없음을 확인하였다.
또한, 폐암 오가노이드 및 TIL이 1 : 3의 비율로 공배양되는 경우, 약물 처리군에서 암 오가노이드의 사멸률은 약 5%에 불과하여, 약물의 효능을 정확하게 판단할 수 없음을 확인하였다.
반면, 폐암 오가노이드 및 TIL이 1 : 1.5의 비율로 공배양되는 경우, 약물 처리군에서는 폐암 오가노이드의 성장이 저해되고 사멸이 증가하는 등의 아테졸리주맙의 항암 효과가 나타났다. 특히, 약물 처리군에서 폐암 오가노이드의 사멸률은 약 20%로서, 다른 혼합 비율에 비하여 아테졸리주맙은 높은 수준의 폐암 오가노이드 사멸률을 나타냄을 확인하였다.
아울러, 도 14a 및 14b에서 볼 수 있듯이, 대장암 오가노이드 및 TIL이 1 : 0.5의 비율로 공배양되는 경우, 대장암 오가노이드는 약물에 대하여 반응하지 않았으며, 이에 따라 대조군과 실험군에서 대장암 오가노이드의 성장률 및 사멸률이 유사하게 나타났다. 특히, 약물 처리군에서 대장암 오가노이드의 사멸률은 약 5%에 불과하여, 약물의 효능을 정확하게 판단할 수 없음을 확인하였다.
또한, 대장암 오가노이드 및 TIL이 1 : 3의 비율로 공배양되는 경우, 약물 처리군에서 암 오가노이드의 사멸률은 약 5%에 불과하여, 약물의 효능을 정확하게 판단할 수 없음을 확인하였다.
반면, 대장암 오가노이드 및 TIL이 1 : 1.5의 비율로 공배양되는 경우, 약물 처리군에서는 대장암 오가노이드의 성장이 저해되고 사멸이 증가하는 등의 아테졸리주맙의 항암 효과가 나타났다. 특히, 약물 처리군에서 대장암 오가노이드의 사멸률은 약 10%로서, 다른 혼합 비율에 비하여 아테졸리주맙은 높은 수준의 대장암 오가노이드 사멸률을 나타냄을 확인하였다.
상기 결과는, 암 오가노이드 및 TIL의 공배양 비율을 1 : 1.5로 설정하는 것이 항암제 효능 평가 또는 스크리닝 시스템에 가장 최적화된 비율임을 시사한다.
실시예 4. 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 조절 T 세포를 포함하는 항암제 효능 평가 및 스크리닝 시스템
암이 생체 내 존재하고 있는 환경을 유사하게 재현함으로써, 약물이 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있는 인비트로(in vitro) 효능 평가 및 스크리닝 시스템을 확립하고자 하였다.
구체적으로, 암 오가노이드, 세포독성 T 세포(Cytotoxic T cell, 이하 'CD8+ T 세포) 및 조절 T 세포(regulatory T cell, 이하 'Treg')가 공존하는 공배양(co-culture) 시스템을 확립하기 위하여, 공배양 시 (1) 암 오가노이드가 적절히 성장하고, (2) 약물의 효능은 높게 관찰되는 조건을 충족시키는 이들의 혼합 비율을 도출하였다. 아래 표 6에 나타낸 바와 같이, 암 오가노이드를 1의 비율로 고정한 후, CD8+ T 세포 및 Treg은 0 내지 3의 비율로 설정하였다. 이때, 각 오가노이드 또는 세포의 수가 5.0×103개인 것을 1로 설정하였다
Figure PCTKR2022013919-appb-img-000006
암 오가노이드는 대장암 또는 폐암 환자의 종양 조직에서 분리한 줄기세포를 이용하여 제조하였다. 분리한 줄기세포를 3D 구조로 성장할 수 있도록 ECM (Extracellular matrix)과 섞어서 dome을 제작한 뒤, 배양을 통해 오가노이드를 형성시켜 사용하였다. CD8+ T 세포 및 Treg은 대장암 또는 폐암 환자에서 얻은 혈액으로부터 수득하였다. 혈액에 존재하는 면역세포를 분화시켰고, 분화된 면역세포에서 CD8+ 및 Treg 세포를 MACS (magnetic activated cell sorting) 방법을 이용하여 분리하였다.
실시예 4.1. 암 오가노이드가 적절히 성장하는 조건
암 오가노이드가 면역세포(CD8+ T 세포 및 Treg)와 공배양되는 경우에도 적절히 성장할 수 있도록 하는, 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 Treg의 혼합 비율을 도출하였다.
구체적으로, 상기 표 6에 따른 혼합 비율로 공배양한 후, 공배양 시작 직후(Oh), 24시간 후(24h), 48시간 후(48h), 72시간 후(72h)에 암 오가노이드의 면적을 각각 측정하여 다음과 같은 수식으로 성장률을 분석하였다.
*암 오가노이드 성장률 (%) = (공배양 24, 48 또는 72시간 후의 암 오가노이드 면적)/(공배양 시작 직후의 암 오가노이드 면적) × 100
그 결과, 도 15 및 16에서 볼 수 있듯이, 모든 혼합 비율에서 대장암 또는 폐암 오가노이드의 성장은 저해되지 않고 적절히 성장하였으며, 각 혼합 비율 간에 유의적인 차이가 나타나지는 않았다.
실시예 4.2. 약물의 효능이 높게 나타나는 조건
CD8+ T 세포를 타겟하는 항암제 및 Treg를 타겟하는 항암제의 효능이 높게 나타나도록 하는, 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 Treg의 혼합 비율을 도출하였다.
구체적으로, 상기 표 6의 혼합 비율에 따른 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 Treg의 공배양물에 대하여 약물을 처리하지 않은 것을 대조군(이하 '약물 미처리군')으로 설정하였고, 실험군(이하 '약물 처리군')으로는 CD8+ T 세포를 타겟하는 아테졸리주맙, 또는 CD8+ T 세포 및 Treg를 타겟하는 항-TIGIT 항체를 예시 약물로서 처리한 것을 설정하였다. 이들을 72시간 동안 공배양한 후, 약물 처리 72시간 후(72h)에 각각 성장률을 측정하고, 측정한 성장률을 통해 아래의 방법으로 사멸률을 분석하였다.
암 오가노이드 사멸률 (%) = [1 - (약물 처리군의 암 오가노이드 성장률*)/(약물 미처리군의 암 오가노이드 성장률**)] × 100
*약물 처리군의 암 오가노이드 성장률 (%) = (약물 처리 72시간 후의 암 오가노이드 면적)/(공배양 시작 직후(0h)의 암 오가노이드 면적) × 100
**약물 미처리군의 암 오가노이드 성장률 (%) = (약물 미처리 72시간 후의 암 오가노이드 면적)/(공배양 시작 직후(0h)의 암 오가노이드 면적) × 100
그 결과, 도 17에서 볼 수 있듯이, 대장암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 Treg 중에서, Treg를 제외하고 대장암 오가노이드 및 CD8+ T 세포만 1 : 3의 혼합 비율로 공배양되는 경우, 아테졸리주맙에 의한 암 오가노이드의 사멸률은 약 26%로서 높게 나타나지만, 항-TIGIT 항체에 의한 암 오가노이드의 사멸률은 약 5%에 불과하여, 약물의 효능을 정확하게 판단할 수 없음을 확인하였다. 또한, 대장암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 Treg 중에서, CD8+ T 세포를 제외하고 대장암 오가노이드 및 Treg만 1 : 3의 혼합 비율로 공배양되는 경우, 아테졸리주맙 및 항-TIGIT 항체에 의한 암 오가노이드의 사멸률은 약 2% 정도로 현저히 낮은 수준으로 나타남에 따라, 약물의 효능을 정확하게 판단할 수 없음을 확인하였다.
또한, 도 18에서 볼 수 있듯이, 대장암 오가노이드 및 CD8+ T 세포를 1 : 1의 혼합 비율로 공배양하는 경우, Treg의 혼합 비율이 증가할수록 항-TIGIT 항체에 의한 암 오가노이드의 사멸률은 증가하지만 그 최대 수준은 약 6%에 불과하고, 아테졸리주맙에 의한 암 오가노이드의 사멸률 또한 최대 약 10% 수준에 불과하여, 약물의 효능을 정확하게 판단할 수 없음을 확인하였다.
반면, 도 19에서 볼 수 있듯이, 대장암 오가노이드 및 CD8+ T 세포를 1 : 3의 혼합 비율로 공배양하는 경우, Treg의 혼합 비율이 증가할수록 항-TIGIT 항체에 의한 암 오가노이드의 사멸률은 증가하여 그 최대 수준은 약 10%에 도달하였고, 아테졸리주맙에 의한 암 오가노이드의 사멸률 또한 약 25%로서 높게 나타났다. 즉, 상기 혼합 비율에서는 다른 혼합 비율에 비하여 아테졸리주맙 및 항-TIGIT 항체와 같은 모든 약물의 효능이 높은 수준으로 나타나며, 그 효능은 최대 2배 이상 증가함을 확인하였다.
아울러, 도 20에서 볼 수 있듯이, 폐암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 Treg 중에서, Treg를 제외하고 폐암 오가노이드 및 CD8+ T 세포만 1 : 3의 혼합 비율로 공배양되는 경우, 아테졸리주맙에 의한 암 오가노이드의 사멸률은 약 27%로서 높게 나타나지만, 항-TIGIT 항체에 의한 암 오가노이드의 사멸률은 약 6%에 불과하여, 약물의 효능을 정확하게 판단할 수 없음을 확인하였다. 또한, 폐암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 Treg 중에서, CD8+ T 세포를 제외하고 폐암 오가노이드 및 Treg만 1 : 3의 혼합 비율로 공배양되는 경우, 아테졸리주맙 및 항-TIGIT 항체에 의한 암 오가노이드의 사멸률은 약 1% 정도로 현저히 낮은 수준으로 나타남에 따라, 약물의 효능을 정확하게 판단할 수 없음을 확인하였다.
또한, 도 21에서 볼 수 있듯이, 폐암 오가노이드 및 CD8+ T 세포를 1 : 1의 혼합 비율로 공배양하는 경우, Treg의 혼합 비율이 증가할수록 항-TIGIT 항체에 의한 암 오가노이드의 사멸률은 증가하지만 그 최대 수준은 약 6%에 불과하고, 아테졸리주맙에 의한 암 오가노이드의 사멸률 또한 약 10% 수준에 불과하여, 약물의 효능을 정확하게 판단할 수 없음을 확인하였다.
반면, 도 22에서 볼 수 있듯이, 폐암 오가노이드 및 CD8+ T 세포를 1 : 3의 혼합 비율로 공배양하는 경우, Treg의 혼합 비율이 증가할수록 항-TIGIT 항체에 의한 암 오가노이드의 사멸률은 증가하여 그 최대 수준은 약 10%에 도달하였고, 아테졸리주맙에 의한 암 오가노이드의 사멸률 또한 약 25%로서 높게 나타났다. 즉, 상기 혼합 비율에서는 다른 혼합 비율에 비하여 아테졸리주맙 및 항-TIGIT 항체의 모든 약물의 효능이 높은 수준으로 나타나며, 그 효능은 최대 2배 이상 증가함을 확인하였다.
상기 결과는, 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 Treg의 공배양 비율을 1 : 3 : 0.5 내지 3으로 설정하는 것이 항암제 효능 평가 또는 스크리닝 시스템에 가장 최적화된 비율임을 시사한다.
실시예 5. 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 수지상 세포를 포함하는 항암제 효능 평가 및 스크리닝 시스템
암이 생체 내 존재하고 있는 환경을 유사하게 재현함으로써, 약물이 생체 내 투여되었을 때의 효능을 정확하게 예측할 수 있는 인비트로(in vitro) 효능 평가 및 스크리닝 시스템을 확립하고자 하였다.
구체적으로, 암 오가노이드, 세포독성 T 세포(Cytotoxic T cell, 이하 'CD8+ T 세포) 및 수지상 세포(regulatory T cell, 이하 'DC')가 공존하는 공배양(co-culture) 시스템을 확립하기 위하여, 공배양 시 (1) 암 오가노이드가 적절히 성장하고, (2) 약물의 효능은 높게 관찰되는 조건을 충족시키는 이들의 혼합 비율을 도출하였다. 아래 표 7에 나타낸 바와 같이, 암 오가노이드를 1의 비율로 고정한 후, CD8+ T 세포를 0 내지 3의 비율로 설정하였고, DC를 0.5 내지 5의 비율로 설정하였다. 이때, 각 오가노이드 또는 세포의 수가 5.0×103개인 것을 1로 설정하였다.
Figure PCTKR2022013919-appb-img-000007
암 오가노이드는 환자에서 얻은 대장암 또는 폐암 조직을 단일 세포(single cell)로 분리하여 이를 ECM(extracellular matrix)과 함께 배양함으로써 3D 구조를 갖도록 제조하였다. 형성된 암 오가노이드는 병리 분석을 통해 종양임을 확인하였고, Tryp-LE 사용을 통해 단일 세포로 분리한 후 사용하였다.
CD8+ T 세포는 PBMC로부터 분리하여 사용하였다. 기증자로부터 얻은 혈액에 대하여 Ficoll을 이용하여 PBMC를 분리하였으며, T 세포 활성화 과정을 거쳐 MACS을 통해 CD8+ T 세포를 분리하였다.
DC는 iPSC로부터 분화된 것을 사용하였고, 당업계에 알려진 일반적인 방법을 사용하여 H9 세포주로부터 DC로 분화시켰다.
실시예 5.1. 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC의 공배양 비율
구체적으로, 상기 표 7의 혼합 비율에 따른 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC의 공배양물에 대하여 약물을 처리하지 않은 것을 대조군(이하 '약물 미처리군')으로 설정하였고, 실험군(이하 '약물 처리군')으로는 CD8+ T 세포를 타겟하는 아테졸리주맙을 예시 약물로서 처리한 것을 설정하였다. 약물은 공배양 시작 직후에 처리하였으며, 공배양 시작 직후(Oh), 24시간 후(24h), 48시간 후(48h), 72시간 후(72h)에 각각 암 오가노이드의 성장률을 측정하고, 측정한 성장률을 통해 아래의 방법으로 사멸률을 분석하였다.
암 오가노이드 사멸률 (%) = [1 - (약물 처리군의 암 오가노이드 성장률*)/(약물 미처리군의 암 오가노이드 성장률**)] × 100
*약물 처리군의 암 오가노이드 성장률 (%) = (약물 처리 24, 48 또는 72시간 후의 암 오가노이드 면적)/(약물 처리 직후(0h)의 암 오가노이드 면적) × 100
**약물 미처리군의 암 오가노이드 성장률 (%) = (약물 미처리 24, 48 또는 72시간 후의 암 오가노이드 면적)/(공배양 시작 직후(0h)의 암 오가노이드 면적) × 100
그 결과, 도 23 내지 도 25에서 볼 수 있듯이, 약물을 처리하지 않았을 때 모든 혼합 비율에서 대장암 오가노이드의 성장은 저해되지 않고 적절히 성장하였으며, 각 혼합 비율 간에 유의적인 차이가 나타나지는 않았다.
다만, 대장암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC를 1 : 0.5 : 0.5 내지 5의 혼합 비율로 공배양하는 경우에는 약물에 의한 암 오가노이드의 성장 저해 효과가 유의적으로 나타나지는 않았으나(도 23), 대장암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC를 1 : 1 내지 3 : 0.5 내지 5의 혼합 비율로 공배양하는 경우에는 약물에 의한 암 오가노이드의 성장 저해 효과가 나타났다(도 24 및 25).
특히, 도 26에서 볼 수 있듯이, 대장암 오가노이드 및 CD8+ T 세포를 1 : 0.5의 혼합 비율로 공배양하는 경우, DC의 혼합 비율이 증가할수록 아테졸리주맙에 의한 암 오가노이드의 사멸률은 증가하지만 그 최대 수준은 약 5%에 불과하여, 약물의 효능을 정확하게 판단할 수 없음을 확인하였다.
또한, 도 27에서 볼 수 있듯이, 대장암 오가노이드 및 CD8+ T 세포를 1 : 1의 혼합 비율로 공배양하는 경우, 아테졸리주맙에 의한 암 오가노이드의 사멸률의 최대 수준은 약 10%에 불과하여, 약물의 효능을 정확하게 판단할 수 없음을 확인하였다.
반면, 도 28에서 볼 수 있듯이, 대장암 오가노이드 및 CD8+ T 세포를 1 : 3의 혼합 비율로 공배양하는 경우, DC가 어느 비율로 혼합되던지 간에 아테졸리주맙에 의한 암 오가노이드의 사멸률은 약 20% 내지 25%로서 높게 나타났다. 즉, 상기 혼합 비율에서는 다른 혼합 비율에 비하여 약물의 효능이 높은 수준으로 나타나며, 그 효능은 2.5배 내지 5배 이상 증가함을 확인하였다.
아울러, 도 29 내지 도 31에서 볼 수 있듯이, 약물을 처리하지 않았을 때 모든 혼합 비율에서 폐암 오가노이드의 성장은 저해되지 않고 적절히 성장하였으며, 각 혼합 비율 간에 유의적인 차이가 나타나지는 않았다.
다만, 폐암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC를 1 : 0.5 : 0.5 내지 5, 또는 1 : 1 : 0.5 내지 1의 혼합 비율로 공배양하는 경우에는 약물에 의한 암 오가노이드의 성장 저해 효과가 유의적으로 나타나지는 않았으나(도 29 및 30), 폐암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC를 1 : 1 : 5, 또는 1 : 3 : 0.5 내지 5의 혼합 비율로 공배양하는 경우에는 약물에 의한 암 오가노이드의 성장 저해 효과가 나타났다(도 30 및 31).
특히, 도 32에서 볼 수 있듯이, 폐암 오가노이드 및 CD8+ T 세포를 1 : 0.5의 혼합 비율로 공배양하는 경우, DC의 혼합 비율이 증가할수록 아테졸리주맙에 의한 암 오가노이드의 사멸률은 증가하지만 그 최대 수준은 약 5%에 불과하여, 약물의 효능을 정확하게 판단할 수 없음을 확인하였다.
또한, 도 33에서 볼 수 있듯이, 폐암 오가노이드 및 CD8+ T 세포를 1 : 1의 혼합 비율로 공배양하는 경우, 아테졸리주맙에 의한 암 오가노이드의 사멸률의 최대 수준은 약 10%에 불과하여, 약물의 효능을 정확하게 판단할 수 없음을 확인하였다.
반면, 도 34에서 볼 수 있듯이, 폐암 오가노이드 및 CD8+ T 세포를 1 : 3의 혼합 비율로 공배양하는 경우, DC가 어느 비율로 혼합되던지 간에 아테졸리주맙에 의한 암 오가노이드의 사멸률은 약 28% 내지 40%로서 높게 나타났다. 즉, 상기 혼합 비율에서는 다른 혼합 비율에 비하여 약물의 효능이 높은 수준으로 나타나며, 그 효능은 5배 내지 8배 이상 증가함을 확인하였다.
상기 결과는, 암 오가노이드, CD8+ T 세포 및 DC의 공배양 비율을 1 : 3 : 0.5 내지 5로 설정하는 것이 항암제 효능 평가 또는 스크리닝 시스템에 가장 최적화된 비율임을 시사한다.

Claims (12)

  1. 하기 단계를 포함하는, 항암제 후보물질의 효능 평가 방법:
    (a) 암 오가노이드 및 면역세포를 1 : 0.5 내지 5의 비율로 혼합하여 공배양하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 혼합물에 항암제 후보물질을 처리하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 항암제 후보물질이 처리된 군에서 양성대조군 또는 항암제 후보물질 미처리군에 비해 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸이 증가한 경우, 상기 후보물질의 효능이 우수한 것으로 결정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 면역세포는 세포독성 T 세포, M1 마크로파지, M2 마크로파지, TIL, 조절 T 세포 및 수지상 세포로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 면역세포가 세포독성 T 세포 및 M1 마크로파지인 경우,
    (a) 단계의 공배양은 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 M1 마크로파지를 1 : 0.5 : 0.5 내지 3의 세포수 비율로 혼합하여 수행하는 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 면역세포가 M1 마크로파지 및 M2 마크로파지인 경우,
    (a) 단계의 공배양은 암 오가노이드, M1 마크로파지 및 M2 마크로파지를 1 : 1 내지 3 : 0.5 내지 5의 세포수 비율로 혼합하여 수행하는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 면역세포가 TIL인 경우,
    (a) 단계의 공배양은 암 오가노이드 및 TIL을 1 : 1 내지 2의 세포수 비율로 혼합하여 수행하는 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 면역세포가 세포독성 T 세포 및 조절 T 세포인 경우,
    (a) 단계의 공배양은 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 조절 T 세포를 1 : 3 : 0.5 내지 3의 세포수 비율로 혼합하여 수행하는 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 면역세포가 세포독성 T 세포 및 수지상 세포인 경우,
    (a) 단계의 공배양은 암 오가노이드, 세포독성 T 세포 및 수지상 세포를 1 : 3 : 0.5 내지 5의 세포수 비율로 혼합하여 수행하는 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 항암제는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 융합 단백질, 항체, 앱타머, 항체-약물 복합체(ADC; Antibody Drug Conjugate), DNA 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산, siRNA, shRNA, miRNA 및 리보자임으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 암은 담도암, 위암, 폐암, 간암, 대장암, 결장암, 소장암, 췌장암, 뇌암, 뼈암, 흑색종, 유방암, 경화성선증, 자궁암, 자궁경부암, 두경부암, 식도암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 혈액암, 림프종 및 섬유선종으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상인, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 암 오가노이드의 성장 저해 또는 사멸은 암 오가노이드의 면적 증감을 통해 확인하는 것인, 방법.
  11. 제1항에 따른 항암제 효능 평가 방법을 사용한 항암제 효능 평가 시스템으로서, 암 오가노이드 및 면역세포를 포함하는 항암제 효능 평가 시스템.
  12. 제1항에 따른 항암제 효능 평가 방법을 사용한 항암제 스크리닝 시스템으로서, 암 오가노이드 및 면역세포를 포함하는 항암제 스크리닝 시스템.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180094883A (ko) * 2015-11-11 2018-08-24 젱룬 주 대식세포 분화 및 면역의 변형 방법
KR20180115236A (ko) * 2017-04-12 2018-10-22 한국생명공학연구원 In vitro에서 성숙된 인간 장관 오가노이드의 제조 방법 및 이의 용도
KR20200105852A (ko) * 2017-12-21 2020-09-09 코닌클리즈케 네덜란드세 아카데미 반 베텐샤펜 면역세포 오가노이드 공-배양물
KR20200116944A (ko) * 2018-02-02 2020-10-13 웨이크 포리스트 유니버시티 헬스 사이언시즈 면역요법 관련 오가노이드 및 그의 제조 및 사용 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180094883A (ko) * 2015-11-11 2018-08-24 젱룬 주 대식세포 분화 및 면역의 변형 방법
KR20180115236A (ko) * 2017-04-12 2018-10-22 한국생명공학연구원 In vitro에서 성숙된 인간 장관 오가노이드의 제조 방법 및 이의 용도
KR20200105852A (ko) * 2017-12-21 2020-09-09 코닌클리즈케 네덜란드세 아카데미 반 베텐샤펜 면역세포 오가노이드 공-배양물
KR20200116944A (ko) * 2018-02-02 2020-10-13 웨이크 포리스트 유니버시티 헬스 사이언시즈 면역요법 관련 오가노이드 및 그의 제조 및 사용 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAKRAHARTI, J. ET AL.: "Hedgehog signaling induces PD-L1 expression and tumor cell proliferation in gastric cancer", ONCOTARGET, vol. 9, no. 100, 2018, pages 37439 - 37457, XP055888152, DOI: 10.18632/oncotarget.26473 *

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